ES2438783T3

ES2438783T3 - Exposición de pIX en fagos independiente de secuencia de señal

Info

Publication number: ES2438783T3
Application number: ES10707493.2T
Authority: ES
Inventors: Geir Åge LØSET
Original assignee: Nextera AS
Current assignee: Nextera AS
Priority date: 2009-02-25
Filing date: 2010-02-24
Publication date: 2014-01-20
Anticipated expiration: 2030-02-24
Also published as: CA2753782C; KR101698884B1; EP2401373B1; PL2401373T3; WO2010097411A1; KR20110119820A; CA2753782A1; JP2012518423A; DK2401373T3; CN104017778A; RU2540010C2; US8946128B2; PT2401373E; SI2401373T1; JP5745432B2; CN102361980A; EP2401373A1; CN102361980B; AU2010217551A1; RU2011135624A

Abstract

Un genoma de fago o un fagémido que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína pIX de fusiónprocedente de un fago filamentoso, en el que la proteína de fusión no comprende una secuencia de señal de N-terminal de procariota.

Description

Exposición de pIX en fagos independiente de secuencia de señal

5 Antecedentes de la invención

El uso de enfoques combinatorios para la identificación de proteínas, su caracterización y modificación, ha tenido un gran éxito tanto en la investigación académica como en el desarrollo comercial. A este respecto, la tecnología de exposición en bacteriófagos filamentosos, o fagos, ha allanado el camino, por ser la primera plataforma de biblioteca y, aún, reinar como tecnología dominante. De este modo, la exposición en fagos se aplica ampliamente tanto en el descubrimiento de proteínas básicas como en el de proteínas aplicadas, así como en el desarrollo tanto de los nuevos diagnósticos basados en proteínas como en el terapéutico, que son la clase de compuestos de más rápido crecimiento en todo el mundo.

15 El principio de la tecnología combinatoria de exposición en fagos se basa en la vinculación genotipo-fenotipo ofrecida por la propiedad de que cada virión sólo expondrá visualmente en su superficie las mismas auténticas proteínas que son codificadas por el genoma encapsulado por su capa de proteína. La propia partícula de fago es muy resistente a una variedad de condiciones fisicoquímicas; por lo tanto, la exposición en fagos ofrece una versatilidad superior en muchos regímenes de selección en comparación con las tecnologías combinatorias que compiten con aquél.

La exposición en fagos de polipéptidos heterólogos se ha logrado usando las cinco proteínas estructurales de la cubierta del fago filamentoso, pero sólo la exposición de la pIII-y, en cierta medida, la de la pVIII-han ganado uso generalizado (véase la figura 1).

25 Cuando la fusión heteróloga es sólo un péptido corto, se prefieren los sistemas de exposición multivalentes que usan vectores basados en genoma de fagos, mientras que, para las fusiones más grandes, que requieren dominios plegados, la mayoría de las aplicaciones se beneficiarán de los sistemas de fagémido. En este último caso, la exposición en fagos de anticuerpos pIII es, con mucho, la que domina el campo, pero van saliendo a la luz andamiajes alternativos, que alimentan la necesidad de expansión de las herramientas de ingeniería de proteínas para el mañana. Una aplicación muy deseada consiste en obtener efectivamente un péptido de alta afinidad específica o aglutinantes de proteínas a partir de una biblioteca de exposiciones en fagos simplemente mediante la infección de bacterias con viriones de fagos cuando todavía están unidos a su objetivo.

35 Endemann y Model, 1995 (PMID: 7616570), informó de que la cubierta menor de pIX no era funcional con otra proteína fusionada con su N-terminal. Por lo tanto, este informe concluía que pIX no se puede usar para la exposición en fagos.

Tanto Gao et al. (PMID: 10339535, 12239343 y WO 0071694) como Khalil et al. (PMID: 17360403) han demostrado más tarde que la exposición de fusión de pIX de N-terminal se permite cuando se expresa a partir de fagémidos y se usa en combinación con orientación periplásmica dependiente de secuencia de señal. En estos sistemas, la complementación tiene lugar cuando la wt pIX es donada desde el genoma del fago auxiliar sobre el rescate de fagémido.

45 El fagémido, como se describe en la figura 2A del documento WO 0071694 (sin proteína de fusión insertada) y en la figura 2B del documento WO 0071694 (con proteína de fusión insertada), comprende claramente una secuencia de señal pelB (con el texto de la figura en la página 7, líneas 2-14).

Como se mencionó anteriormente, había sido sugerido previamente que pIX no era funcional con otra proteína fusionada con el extremo N-terminal, y Gao et. al. dio dos posibles razones de su éxito, ya fuera por sí solo o por la combinación de ambos.

Una posible razón era que una secuencia líder procariota (secuencia de señal) se unía al N-terminal de las proteínas de fusión, asegurando, de este modo, la orientación de la proteína recombinante al espacio periplásmico, y, por ello,

55 prevenía la acumulación en el citoplasma.

Otra posible razón era que las proteínas recombinantes fueran expresadas desde un fagémido, no desde un genoma de fago, como en Endemann y Model; por lo tanto, un pIX de tipo salvaje del fago auxiliar necesitaba inevitablemente que un rescate de fagémido fuera complementando las proteínas recombinantes pIX de fusión, preservando, de este modo, la funcionalidad de tipo salvaje que, de otro modo, podría haber perdido debido a la modificación recombinante. Es decir, los fagos comprenderían una mezcla de proteínas de tipo salvaje y de fusión.

Khalil et al. (PMID: 17360403) describe una aplicación que explota la característica de un virión de fago filamentoso biespecífico en el que se expone un péptido exógeno en cada punta distal del mismo virión. Esto se logró usando 65 una combinación de un vector de genoma de fago pIII común complementando a un fagémido procariota de exposición de pIX dependiente de secuencia de señal. En esta configuración, el vector genoma de fago sirvió como

fago auxiliar en el rescate del fagémido.

Sumario de la invención

5 Un objeto de la presente invención es proporcionar un andamiaje alternativo para péptidos expuestos en fagos filamentosos.

Un primer aspecto de la invención es el de unas proteínas pIX de fusión que se originan en un fago filamentoso, dichas proteínas de fusión no comprenden una secuencia de señal de N-terminal de procariota y, por lo tanto, es una fusión directa con un péptido exógeno.

Otro aspecto de la invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión de la invención.

Un aspecto de la invención se refiere a fagos filamentosos que comprenden las proteínas de fusión de la invención.

15 Otro aspecto de la invención se refiere a una biblioteca de fagos filamentosos.

Otro aspecto de la invención se refiere a un sistema de exposición en fagos que comprende un fagémido y un fago auxiliar, en el que el fagémido comprende un ácido nucleico que codifica las proteínas pIX de fusión de la invención.

Un aspecto se refiere a un estuche que comprende un sistema de exposición en fagos y un fago auxiliar, en el que el fagémido comprende un ácido nucleico que codifica las proteínas pIX de fusión de la invención.

Breve descripción de las figuras

25 Figura 1. Dibujo esquemático de la estructura de un fago filamentoso. El virión está constituido por cinco proteínas estructurales que recubren una molécula de cadena sencilla de ADN. En el fago de tipo salvaje (wt) hay alrededor de

2.700 copias de pVIII y aproximadamente 3-5 copias de cualquiera de las cuatro proteínas pIII, pVI, pVII y pIX, que se encuentran en cada punta del virión. El tamaño del virión depende del tamaño del genoma en aproximadamente 2,3 nucleótidos por proteína de pVIII de la cubierta y, de este modo, la longitud de la partícula se acomoda a un aumento o disminución de las copias insertadas de pVIII. De manera notable, las estructuras de pIII y pVIII se han caracterizado por difracción de fibra por rayos X, cristalografía y RMN. La proteína de capa menor de pIII contiene tres dominios distintos, separados por regiones ricas en glicina: N1 (que se une a ToIA), N2 (que se une al pilus F) y CT (que, integrado en el virión, es importante para el montaje normal del virión).

35 Figura 2. Dibujos esquemáticos de los nuevos fagémidos pGALD9 (A) y pGALD97!L (B) de exposición de pIX. La columna vertebral del vector de ambos fagémidos se basa en el fagémido pSEX81 (SEC ID N º: 2) de exposición de pIII, a cuya secuencia se puede acceder desde el acceso de GenBank Nº: Y14584, y cuyos detalles sobre la construcción se describen en Material and Methods. Ambos fagémidos pueden acomodar segmentos de secuencias exógenas en marco (denominados E1 y E2) a través de un fácil intercambio de casetes de las porciones de NcoI/HindIII y MluI/NotI, respectivamente. Los casetes están conectados por una secuencia de enlazador sintético que varía entre las diferentes construcciones descritas en este documento. Abreviaturas: lacPO, promotor lac; sd, secuencia de Shine-Dalgarno; pelB, secuencia de señal de pectato liasa bacteriana; TP, sitio de proteasa tripsina; t, T7 terminador de la transcripción.

45 Figura 3. Títulos de fagémidos de (A) scFv anti-phOx (SEC ID Nº: 11) y (C) scFv anti-NIP expuestos a partir de pGALD9!L, pGALD9, pSEX81. Todos los fagémidos albergan un marcador de resistencia a ampicilina; por lo tanto, los títulos se muestran como unidades de formación de colonia resistente a la ampicilina por mililitro de solución (cfuampR/ml). La relación entre fagémido y fago auxiliar de (B) scFv anti-phOx (SEQ ID Nº: 11) y (D) scFv anti-NIP, expuestos a partir de pGALD9!L, pGALD9, pSEX81, se muestra como la relación entre el título de fagémido (cfuampR/ml) dividido por el título del fago auxiliar (cfukanR/ml). El empaquetamiento de los viriones se hizo mediante rescate de fagémidos estándar, como se describe en materiales y métodos sin (expresión basal), o con una concentración final de 0,1 mM de IPTG presente (inducción de IPTG) después de la superinfección.

55 Figura 4. ELISA de antígeno específico que compara la exposición funcional de (A) scFv anti-phOx (SEQ ID Nº: 11) y (B) scFv anti-NIP (SEC ID N º: 3) entre pIX y pIII, y con y sin secuencia de señal (!L). El ELISA se llevó a cabo como se describe en materiales y métodos usando 100 μl/ sobrenadante bien aclarado conteniendo virión. El anti-M13HRP es un control negativo en adsorción inespecífica de la detección del virión MAb al antígeno y bloqueo. (C y D) El ELISA en A y B se repitieron, pero el desarrollo se detuvo antes de la saturación de la señal y los niveles relativos de exposición se determinaron usando la reactividad al antígeno como una función de título.

Figura 5. El aparente enriquecimiento del objetivo específico en selección de afinidad depende del andamiaje de la exposición de la cápside, de la expresión de la proteína de interés (PDI) y de las condiciones de elución. Se evaluaron volúmenes iguales de sobrenadante no titulado que contiene virión de cada una de las 8 bibliotecas phOx

65 /NIP agregadas después de las rondas 1 y 2 de selección para determinar la reactividad de antígeno mediante ELISA. La ronda 0 corresponde a la entrada agregada de 1x1010 cfuampR. Para estimar la respuesta máxima posible, se incluyeron los sobrenadantes clonales de los que se derivaban los concentrados agregados de la ronda 0, y los resultados representados vienen dados por las señales de fondo restadas como una fracción de la respuesta máxima posible indicada con la forma de cono.

5 Descripción detallada de la invención

Se debe observar que las realizaciones y características descritas en el contexto de uno de los aspectos de la presente invención también se aplican a los otros aspectos de la invención.

Todas las referencias de patentes y de no patente citadas en la presente solicitud se incorporan aquí mediante referencia en su totalidad.

En este documento se presenta un concepto novedoso, en el que la proteína pIX de la capa estructural del virión de fago filamentoso es alterada genéticamente de tal manera que la versión modificada codifica un péptido del N

15 terminal o dominio de proteína.

Proteína pIX de fusión

En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína pIX de fusión que se origina en un fago filamentoso, comprendiendo dicha proteína de fusión la fusión de un péptido exógeno del N-terminal de pIX. Tal proteína de fusión es útil, por ejemplo, en el contexto de la exposición en fagos.

Cuando se hace referencia a un “péptido exógeno”, lo que se ha de entender es un péptido no originalmente parte de la proteína pIX con o sin aminoácidos de enlazador al extremo N-terminal de la parte de aminoácidos de pIX de la

25 proteína de fusión.

En una realización preferida, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión no comprende una secuencia de señal de N-terminal de procariota.

Como se usa en este documento, el término “péptido” abarca tanto péptidos cortos como polipéptidos, proteínas y fragmentos de ellos.

El término “proteína pIX” se refiere a la secuencia de aminoácidos descrita en (SEC ID Nº 1 (MSVLVYSFASFVLGWCLRSGITYFTRLMETSS)

35 En una realización, la proteína pIX comprende el aminoácido con una identidad de secuencia de al menos un 70 % a la de la SEC ID N º 1, tal como de un 75 % de identidad, tal como de un 80 % de identidad, tal como de un 81 % de identidad, tal como de un 82 % de identidad, tal como de un 83 % de identidad, tal como de un 84 % de identidad, tal como de un 85 % de identidad, tal como de un 86 % de identidad, tal como de un 87 % de identidad, tal como de un 88 % de identidad, tal como de un 89 % de identidad, tal como de un 90 % de identidad, tal como de un 91 % de identidad, tal como de un 92 % de identidad, tal como de un 93 % de identidad, tal como de un 94 % de identidad, tal como de un 95 % de identidad, tal como de un 96 % de identidad, tal como de un 97 % de identidad, tal como de un 98 % de identidad, tal como de un 99 % de identidad.

45 Identidad de la secuencia

Al igual que se define comúnmente "identidad", se define aquí como la identidad de la secuencia de genes o de proteínas a nivel de nucleótidos o de aminoácidos, respectivamente.

De este modo, en el presente contexto, “identidad de secuencia” es la medida de identidad entre proteínas a nivel de aminoácidos y la medida de identidad entre ácidos nucleicos a nivel de nucleótidos. La identidad de secuencia de proteínas se puede determinar al comparar la secuencia de aminoácidos en una posición dada en cada secuencia cuando las secuencias están alineadas. De manera similar, la identidad de secuencia de ácidos nucleicos se puede determinar al comparar la secuencia de nucleótidos en una posición dada en cada secuencia cuando las secuencias

55 están alineadas.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en la secuencia de una Cebadora secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para la alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos). Los residuos de aminoácidos o de nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos se comparan después. Cuando una posición de la Cebadora secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o de nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por

65 las secuencias (es decir, % de identidad = # de posiciones idénticas / # total de posiciones (por ejemplo, posiciones de superposición) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud.

Se pueden alinear manualmente las secuencias y contar el número de aminoácidos idénticos. Alternativamente, la alineación de dos secuencias para la determinación del porcentaje de identidad se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático. Tal algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST (véase Altschul et al. 1990). 5 Las búsquedas BLAST de nucleótidos se pueden efectuar con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las de la molécula de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas BLAST de proteínas se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las de la molécula de proteína de la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, se puede usar Gapped BLAST. Alternativamente, se puede usar PSI-Blast para efectuar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Cuando se utilizan los programas NBLAST, XBLAST, y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos. Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Alternativamente, la identidad de secuencia se puede calcular después de que las secuencias se hayan alineado, por ejemplo, mediante el programa BLAST en la base de datos EMBL (véase www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST). En general, se puede usar

15 para la alineación la configuración por defecto con respecto a, por ejemplo la “matriz de puntuación” y la “penalización por hueco”. En el contexto de la presente invención, las configuraciones por defecto de BLAST y de PSI BLASTN pueden resultar ventajosas.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando técnicas similares a las descritas anteriormente, con o sin dejar huecos. Al calcular el porcentaje de identidad, se cuentan sólo las coincidencias exactas.

Proteínas plegadas

25 En una realización preferida, el término “péptido” se refiere exclusivamente a las proteínas plegadas tales como dominios derivados de anticuerpos. El experto en la técnica reconocerá que las proteínas plegadas pueden ser anticuerpos o fragmentos de ellos, cubriendo Fv, scFv, Fab, dominios individuales, dominio Z de la proteína A o fragmentos de él (affibody), ankyrin o fragmentos de ella, DARPin o fragmentos de ella, receptor de células T o fragmentos de los mismos, CMH de clase I o II o fragmentos de él, fibronectina o fragmentos de ella, Anticalins o fragmentos de ellas, dominios PDZ o fragmentos de ellos, IgNAR o fragmentos de él, CTLA4 o fragmentos de él, ImmE7 o fragmentos de ella, knottins o fragmentos de ellos, avimer o fragmentos de ella, GFP o fragmentos de ella y otros fluoróforos biológicos codificados por genes.

En principio, se puede hacer una biblioteca de cualquier cosa, siempre y cuando se exponga; por lo tanto, en su

35 forma más simple, se pueden sólo separar cosas que tienen una configuración no estructurada, en comparación con una estructura ordenada, que es un pliegue.

En otra realización preferida, el término péptido se refiere exclusivamente a péptidos cortos de entre 2 a 50 aa. A una cierta longitud, un péptido corto de espiral al azar será lo suficientemente largo para adoptar un pliegue secundario o terciario definido y, por lo tanto, entrar en la definición de dominio plegado. Obviamente, esto dependerá de la composición química; por lo tanto, un péptido de 20 aa podría seguir siendo espiral al azar mientras que otro péptido de 20 aa podría estar plegado y caer en la definición de dominio plegado.

En otra realización preferida, la proteína pIX de fusión de la invención comprende una secuencia seleccionada del

45 grupo que consiste en las posiciones 1-32, 2-32, 3-32, 4-32, 5-32, 6-32, 7-32, 8-32, 9-32, 10-32, 11-32 y 12-32 de la SEC ID N º: 1. En principio, en el contexto de los fagémidos, se puede prever cualquier modificación de N-terminal de pIX, dado que la porción trans-membrana se conserva y permite la incorporación normal del virión y el montaje.

SEC ID Nº: 1. (MSVLVYSFASFVLGWCLRSGITYFTRLMETSS) es la secuencia de aminoácidos de la cubierta estructural de la proteína pIX del fago filamentoso (pIX tipo salvaje). Lo más preferiblemente, la proteína pIX de fusión comprende las posiciones 1-32 de la SEC ID N º: 1.

SEQ ID Nº: 1. No debe confundirse con la secuencia de señal/líder que se describe posteriormente.

55 Secuencia de señal

Preferiblemente, el péptido exógeno se fusiona directamente con o sin los aminoácidos de enlazador al extremo Nterminal de la secuencia de la proteína pIX de fusión.

Aún en otra realización preferida, la proteína pIX de fusión no comprende una secuencia líder de N-terminal de procariota.

El término “secuencia líder” se usa de manera intercambiable con los términos "péptido de señal” y “secuencia de señal ", y se refiere a una secuencia de aminoácidos que orienta la proteína (de la que la secuencia líder es parte) 65 hacia el espacio periplasmático de membrana de bacterias gram negativas. Ejemplos de secuencias líder de uso frecuente son pelBss, OmpAss, TorAss, malEss, phoAss, lamBss, Blass y DspAss, mglBss, sfmCss, tolBss y TorTss.

Tales secuencias de señal son conocidas para orientar la proteína completa hacia la maquinaria de secreción de E. coli, que se sabe que incluye al menos translocación de SRP-dependiente, SEC-dependiente, TatABC-dependiente

o YidC-dependiente desde el citosol hasta el espacio periplásmico (Baneyx. et al. PMID: 15529165). Por lo tanto, el

término “secuencia de señal de N-terminal” se refiere a una secuencia de señal que está en la parte de N-terminal 5 de la proteína.

Las secuencias de señal que albergan la propiedad de orientar una proteína (de la que son parte) hacia la maquinaria de secreción de E. coli, y por ello también la de translocarla desde el citosol hasta el compartimento periplásmico, se pueden identificar en parte a través de firmas, o motivos, definidos por sus propiedades químicas o por su composición de aminoácidos.

La variedad de secuencias funcionales de señal existente hasta el momento, sin embargo, excede los conocimientos actuales para su identificación, por lo tanto, en el estado actual de la técnica, la definición de un péptido como unas secuencias cognadas de señal se hace típicamente a través de minería de datos usando el conocimiento basado en

15 datos basados como en plantilla mediante, por ejemplo, la red neuronal o la metodología heurística. Hay varias de tales herramientas disponibles para la comunidad a través de canales de acceso abierto en la actualidad, tales como SignalP, PPSEARCH de PROSITE (EMBL-EBI), SecretomeP o TatP.

El reto es aún mayor con la clase de las proteínas secretoras, en el sentido de que se exportan desde el compartimiento citosólico, lo que las desvía de las normas de tal manera que no se puede identificar el motivo de secuencia de señal, pero a través de la minería de datos se pueden también aquí definir las características de la secuencia de señal o conseguir la probabilidad de la capacidad de secreción de la proteína eucariótica en cuestión. Hasta el momento, no existe tal herramienta para el taxón procariótico.

25 El único método actualmente disponible que irrevocablemente identificó un péptido como una secuencia de señal es, por lo tanto, validar la propiedad de un péptido por medios experimentales para establecer si es o no es una secuencia real de señal. También está claro que se puede efectuar ingeniería en tales péptidos tal que las posiciones de los aminoácidos dadas en la secuencia de señal se pueden alterar, conservando sin embargo su función de péptido de señal, ya sea por funcionalidad nativa o por funcionalidad alterada, tal como una capacidad de transporte aumentada. También se puede emplear la supresión o la adición de aminoácidos. Tal análisis e ingeniería se han hecho realmente con la secuencia Ff de señal de pVIII, orientando g8pss a la vía de sección (Sec-vía) y orientando el TorAss a la Tat-vía. Especialmente, los resultados de Shen et al. pueden servir como bien fundadas líneas de guía para la ingeniería de mutantes funcionales, pero alterados, de la secuencia de señal de pIII y de la secuencia bacteriana de señal de pectato liasa.

35 La funcionalidad de una secuencia de señal puede dividirse, adicionalmente, en las dos propiedades siguientes:

1.: Orientación de una proteína (de la que es parte) hacia la maquinaria de secreción de E. coli y por ello translocarla desde el citosol hasta el compartimento periplásmico, y, en el curso de este proceso, ser proteolíticamente separada de la proteína restante mediante proteasas específicas, tales como peptidasa de señal de lipoproteína, o peptidasas líder.

2.: Orientación de una proteína (de la que es parte) hacia la maquinaria de secreción de E. coli y, por ello,

translocarla desde el citosol hasta el compartimento periplásmico, y, después de la translocación, todavía 45 permanecer como parte de la proteína.

A pesar de que una vasta mayoría de secuencias de señal se mapea para la situación dada anteriormente, 1) es evidente que estas proteínas pueden ser fácilmente diseñadas en situación. 2) Por lo tanto, cualquiera de las secuencias de señal conocidas en la actualidad, por ejemplo una pelBss mutante y otras que originalmente pertenecen a esa situación, 1) pero que se alteran en esa situación, 2) todavía se consideran como secuencias de señal cognadas.

Lo que es más, es concebible o bien 1) alterar una secuencia de señal de situación en situación, o bien 2) elegir directamente una secuencia de señal que se mapea para la situación 2) y, entonces, después de la translocación,

55 retirar la secuencia de señal. Esto se puede hacer ya sea mediante proteasas endógenas del huésped y/o, en el caso de, por ejemplo, exposición en fagos, cuando la proteína se fusiona con una proteína de la cápside. Se podría después diseñar, en la región apropiada de la secuencia de señal, o de la proteína de la que es una parte, un sitio artificial de proteasa, tal que se pueda efectuar una escisión definida. Por aquí se pueden visualizar dos tipos diferentes de sitios seleccionados de proteasa:

A. El sitio de proteasa no escinde la proteína de interés, sólo el sitio previsto, como por ejemplo, carboxipeptidasa A,

o el sitio de proteasa de rinovirus 3C en combinación con anticuerpos u otros andamiajes de interés, tales como moléculas del complejo principal de histocompatibilidad o receptores de células T. Usando este enfoque se puede visualizar, por ejemplo, una exposición en fagos de la proteína de interés mediante el uso de un mapeo de

65 secuencia de señal para la situación, 2) anteriormente y antes de usar en la selección, etc., retirar artificialmente el péptido señal para obtener la funcionalidad y la homogeneidad de la fusión de la cápside.

B. El sitio de proteasa escinde la proteína de interés además del sitio diseñado, tal como, por ejemplo, tripsina.

Ambas situaciones seguirán siendo consideradas como exposición en fagos dependiente de secuencia de señal.

5 Péptido exógeno

En una realización preferida, el péptido exógeno de la proteína pIX de fusión se selecciona de entre el grupo que consiste en anticuerpos o fragmentos de los mismos, cubriendo Fv, scFv, Fab, dominios individuales, dominio Z de la proteína A o fragmentos de él (affibody), ankyrin o fragmentos de ella, DARPin o fragmentos de ella, receptor de células T o fragmentos de los mismos, CMH de clase I o II o fragmentos de él, fibronectina o fragmentos de ella, Anticalins o fragmentos de ellas, dominios PDZ o fragmentos de ellos, IgNAR o fragmentos de él, CTLA4 o fragmentos de él, ImmE7 o fragmentos de ella, knottins o fragmentos de ellos, avimer o fragmentos de ella, GFP o fragmentos de ella y otros fluoróforos biológicos codificados por genes.

15 En una realización preferida, el péptido exógeno de la proteína pIX de fusión es un miembro de la biblioteca.

Una biblioteca, tal como se usa en el presente contexto, se refiere a una colección de diferentes péptidos. Los péptidos pueden ser dominios plegados o péptidos cortos de, por ejemplo, 2-50 aminoácidos. Tales bibliotecas son de interés porque se pueden usar para identificar nuevos ligandos que se unen a un objetivo dado.

Existen varias ventajas al usar pIX para exponer una biblioteca en comparación con bibliotecas expuestas usando pIII o pVIII. La exposición de pIX contiene los mismos activos de la exposición de pIII con respecto a la direccionalidad y la valencia, pero no afectará a la infectividad, un fenómeno que se sabe que ocurre con la exposición de pIII, que introduce heterogeneidad incontrolada e indeseada en el sistema sobre, por ejemplo, el

25 rescate después de la selección por afinidad.

Lo que es más, la exposición de pIX puede lograrse sin la necesidad de una secuencia de señal de N-terminal de procariota, que son requisitos previos para la exposición tanto de pIII como de pVIII. Finalmente, cualquier especie objetivo inmovilizada en la exposición de pIII requiere normalmente la interrupción (normalmente por competitivo, o por alto o bajo pH de elución) de esta unión objetivo-fago. De esto se conoce, por ejemplo, que obstaculiza gravemente la recuperación de alta afinidad, o las uniones estables en la exposición de pIII. Como la pIII requerida para la infección está inalterada y es fácilmente disponible para interacciones alternativas en la exposición de pIX, incluso después de la interacción fago-objetivo, esto elimina completamente la necesidad de interrupción de uniones, por ejemplo elución ácida, ya que los fagos inmovilizados conservan plena infectividad y, por lo tanto,

35 pueden ser recuperados simplemente por infección mientras se unen al objetivo.

Acido nucleico

Un segundo aspecto de la invención es un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la invención. El ácido nucleico de la invención puede ser parte de un plásmido, de un vector, de un genoma de fago, de un fagémido o de un fásmido.

El término “ácido nucleico” se refiere a una macromolécula compuesta de cadenas de nucleótidos monoméricos. En bioquímica, estas moléculas llevan información genética o forman estructuras dentro de las células. Los ácidos

45 nucleicos más comunes son el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). Además, el término “ácidos nucleicos” incluyen ácidos nucleicos artificiales tales como el ácido péptido nucleico (APN), morfolina y ácido nucleico bloqueado (ANB), así como el ácido nucleico glicol (GNA) y el ácido nucleico de treosa (TNA). Cada uno de éstos se distingue en su naturaleza del ADN o del ARN por cambios en la columna vertebral de la molécula.

Un fagémido o fásmido es un tipo de vector de clonación desarrollado como un híbrido de los fagos filamentosos Ff y los plásmidos para producir un vector que se puede propagar como un plásmido, y también ser empaquetado como ADN monocatenario en partículas virales. De manera similar a un plásmido, un fagémido se puede usar para clonar fragmentos de ADN y ser introducido en un huésped bacteriano mediante una variedad de técnicas (transformación, electroportación). Sin embargo, la infección de un huésped bacteriano que contiene un fagémido, con un fago

55 'auxiliar', por ejemplo VCSM13 o M13K07, proporciona los componentes virales necesarios para permitir la replicación del ADN monocatenario y el empaquetado del ADN fagémido en partículas de fago.

De este modo, un aspecto de la presente invención se refiere a un genoma de fago o a un fagémido que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína pIX de fusión originada a partir de un fago filamentoso, en el que la proteína de fusión no comprende una secuencia de señal de N-terminal de procariota.

En una realización de la presente invención, el genoma de fago o el fagémido comprende un ácido nucleico que codifica una proteína pIX de fusión originada a partir de un fago filamentoso, en la que la proteína de fusión no comprende una secuencia de señal de N-terminal de procariota y en la que la proteína pIX de fusión comprende una

65 secuencia seleccionada de entre el grupo que consistente en la posición 1-32, 2-32, 3-32, 4-32 y 5-32 de la SEC ID Nº: 1 (MSVLVYSFASFVLGWCLRSGITYFTRLMETSS).

En otra realización de la presente invención, el péptido exógeno está directamente fusionado con el extremo Nterminal de la secuencia de pIX.

Una realización de la presente invención se refiere al genoma de fago o al fagémido de la presente invención, en el

5 que el péptido exógeno fusionado con pIX se selecciona de entre el grupo consistente en anticuerpos o fragmentos de ellos, cubriendo Fv, scFv, Fab, dominios individuales, dominio Z de la proteína A o fragmentos de él (affibody), ankyrin o fragmentos de ella, DARPin o fragmentos de ella, receptor de células T o fragmentos de los mismos, CMH de clase I o II o fragmentos de él, fibronectina o fragmentos de ella, Anticalins o fragmentos de ellas, dominios PDZ o fragmentos de ellos, IgNAR o fragmentos de él, CTLA4 o fragmentos de él, ImmE7 o fragmentos de ella, knottins o fragmentos de ellos, avimer o fragmentos de ella, GFP o fragmentos de ella y otros fluoróforos biológicos codificados por genes.

En otra realización de la presente invención, el péptido exógeno fusionado con pIX es un miembro de la biblioteca.

15 Fago filamentoso

Un tercer aspecto de la invención es un fago filamentoso que comprende la proteína de fusión de la invención. El virión del fago filamentoso puede albergar un fagémido.

Por “fago”, a menudo llamado bacteriófago, se entiende en este documento un virus que infecta, que se replica y que es secretado a partir de bacterias. Un bacteriófago filamentoso, o fago filamentoso, es un fago con una molécula de ADN monocatenario (ADNss) que está empaquetada con proteínas de cubierta de fago. La partícula secretada de fago filamentoso tiene una estructura fenotípicamente filamentosa.

25 El término “fago filamentoso”, tal como se usa en este documento, abarca tanto viriones derivados del genoma de fagos como viriones derivados de fagémidos.

El término “fago auxiliar” se refiere a un virus que ayuda a un virus defectuoso, separado y sin relación definido como, por ejemplo, un fagémido que en sí mismo no es un genoma de fago ni un virus funcional, sino simplemente un plásmido que contiene uno o varios elementos derivados de un genoma de fago, para reproducirse infectando la misma célula huésped que ya está ocupada por el virus defectuoso y proporcionar las proteínas que le faltan al virus defectuoso y necesita para formar viriones que contienen el fagémido.

En una realización, el fago filamentoso comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la

35 invención. Se prefiere, en particular, un fago que comprenda un fagémido que comprenda el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la invención.

Una biblioteca de fagos es una colección de fagos filamentosos que exponen péptidos o proteínas como parte de una o más de las proteínas de la cubierta de fago filamentoso. Tales bibliotecas pueden comprender dos o más fagos que exponen diferentes péptidos o proteínas.

De este modo, en una realización de la presente invención, los fagos filamentosos están expponiendo péptidos o proteínas como parte de una o más de las proteínas de cubierta de fago filamentoso.

45 En una realización, el fago filamentoso comprende adicionalmente una proteína pIII de fusión, una proteína pVII de fusión o una proteína pVIII de fusión.

Un aspecto de la invención es una biblioteca de fagos filamentosos de la invención, exponiendo dichos fagos filamentosos péptidos exógenos o proteínas como fusiones con una o más de las proteínas pIII, pVII, pVIII o pIX.

Una biblioteca es una colección de fagos filamentosos que exponen péptidos o proteínas como parte de una o más de las proteínas de cubierta de fagos filamentosos.

Tales bibliotecas pueden comprender dos o más fagos que exponen diferentes péptidos o proteínas.

55 Un aspecto de la presente invención se refiere a una biblioteca de fagos que comprende dos o más fagos filamentosos que exponen diferentes proteínas, en el que al menos una de estas proteínas es una proteína pIX de fusión expresada a partir del genoma de fago o del fagémido de la presente invención.

Una realización de la presente invención se refiere a una biblioteca de fagos que comprende dos o más fagos filamentosos que exponen diferentes péptidos o proteínas.

En una realización particular, al menos uno de estos péptidos o proteínas es de la proteína pIX de fusión de la invención.

65 En una realización, los péptidos se exponen simultáneamente en pIX y o bien pIII, pVII o pVIII.

En otra realización, los péptidos se exponen simultáneamente en pIX y dos o tres formas seleccionadas del grupo que consiste en pIII, pVII o pVIII.

5 El término “tipo salvaje”, a veces escrito “wt”, es la forma típica de un organismo, una cepa, un gen o una característica que tiene lugar en la naturaleza. De “tipo salvaje” se refiere al fenotipo más común en la población natural. “Tipo salvaje” también se refiere al alelo en cada locus requerido para producir el fenotipo de tipo salvaje. “Tipo salvaje” es el estándar de referencia para el genotipo y el fenotipo. En biología, se refiere específicamente a la diferencia entre un organismo natural y uno que ha sido mutado deliberadamente. La mutagénesis dirigida es una

10 técnica de investigación que permite la mutación de nucleótidos específicos en la secuencia genética de un gen de tipo salvaje. Las proteínas de tipo salvaje se escriben como wt-(nombre de la proteína); por ejemplo, una proteína pIX de tipo salvaje se escribe wt pIX, wt-pIX o pIX de tipo salvaje.

De este modo, un aspecto de la invención se refiere al fago filamentoso de la presente invención que no comprende 15 un gen que codifica wt pIX y/o la proteína de wt pIX.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al fago filamentoso de la invención que comprende adicionalmente un gen que codifica wt pIX y/o la proteína de wt pIX.

20 Otro aspecto de la presente invención se refiere a un fago filamentoso que comprende el genoma de fago o el fagémido de la presente invención.

En una realización de la presente invención, el fago filamentoso, que comprende el genoma de fago o el fagémido de la presente invención, comprende adicionalmente un gen que codifica wt pIX y/o la proteína de wt pIX.

25 En otra realización de la presente invención, el fago filamentoso, que comprende el genoma de fago o el fagémido de la presente invención, no comprende un gen que codifica wt pIX ni/o la proteína de wt pIX.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a proteínas pIX de fusión que son funcionales en una

30 exposición en fagos sin complementación mediante proteína wt pIX. Un aspecto de la presente invención se refiere a un fago filamentoso que comprende el genoma de fago o el fagémido de la presente invención, y que comprende adicionalmente uno o más elementos del grupo seleccionado de entre la proteína pIII de fusión, la proteína pVII de fusión y la proteína pVIII de fusión.

35 Sistema de exposición en fagos

Un quinto aspecto de la invención es un sistema de exposición en fagos que comprende un fagémido y un fago auxiliar, en el que el fago auxiliar comprende un ácido nucleico que codifica la proteína pIX de fusión de la invención.

40 El “sistema de exposición en fagos”, la “técnica de exposición en fagos”, la “tecnología de exposición en fagos” o, simplemente, la “exposición en fagos” se refiere a un método para el descubrimiento y el estudio de las interacciones proteína-proteína, proteína-péptido y proteína-ADN, que utiliza bacteriófagos para conectar proteínas con la información genética que los codifica.

45 “Exponer una proteína” o una “proteína expuesta” se refiere a una proteína fusionada con una proteína de la cubierta del fago que es accesible para la detección o la inmovilización por un ligando.

Un sexto aspecto de la invención es un sistema de exposición en fagos que comprende un fagémido y un fago auxiliar, en el que el fagémido comprende un ácido nucleico que codifica la proteína pIX de fusión de la invención.

50 Un aspecto de la presente invención se refiere a un sistema de exposición en fagos que comprende un genoma de fago o un fagémido de la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un sistema de exposición en fagos que comprende un genoma de 55 fago o un fagémido de la presente invención, y un fago auxiliar.

Un aspecto de la presente invención se refiere a una biblioteca de fagos que comprende dos o más fagos filamentosos que exponen diferentes proteínas, en el que al menos una de estas proteínas es la proteína pIX de fusión expresada a partir del genoma de fago o del fagémido de la presente invención.

60 En una realización de la presente invención, la biblioteca de fagos de la presente invención comprende una o más proteínas de fusión adicionales seleccionadas de entre la proteína pIII de fusión, la proteína pVII de fusión y la proteína pVIII de fusión.

65 Estuches Un séptimo aspecto de la invención es un estuche que comprende un sistema de exposición en fagos compuesto de un fagémido y un fago auxiliar, en el que el fagémido comprende el ácido nucleico que codifica la proteína pIX de fusión de la invención. El estuche debe incluir un fagémido con un gen que codifica pIX con un sitio de N-terminal de clonación múltiple en la región de codificación y un fago auxiliar (por ejemplo, M13K07, VCSM13 u otro). El estuche

5 debe ser complementado con protocolos para infección, expresión, inmovilización, selección y detección de clones de fagos. Los estuches también deben estar acompañados con las recetas necesarias para tampones y medios para efectuar los ensayos específicos.

Con “estuche” se hace referencia, en este documento, a una colección de reactivos para generar partículas de fago con una única o biespecíficas proteínas de fusión, ya sea como una biblioteca de exposición en fagos o como una única partícula de fagos. El estuche puede incluir fagémidos, fagos auxiliares, cepas bacterianas, el protocolo con recetas para los reactivos y la descripción del ensayo. El estuche puede ser usado para el desarrollo de la investigación, de diagnóstico y para reactivos terapéuticos.

15 Un aspecto de la presente invención se refiere a un estuche que comprende la exposición en fagos que comprende el genoma de fago o el fagémido de la presente invención, y un fago auxiliar.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un estuche que comprende el genoma de fago o el fagémido de la presente invención.

Todavía otro aspecto de la presente invención se refiere a un estuche que comprende un fago filamentoso que comprende el genoma de fago o el fagémido de la presente invención.

La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes. 25

Ejemplos

Ejemplo 1: Exposición de fagémido en pIX

Reactivos

Todos los medios y tampones se prepararon esencialmente como se describe en Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. El anticuerpo anti-M13-HRP se adquirió en GE Healthcare Bio-Sciences AB (Uppsala, Suecia). Las enzimas de restricción (RE) se 35 adquirieron en New England Biolabs (Ipswich, MA, EE.UU.), con la excepción de DpnI, que se obtuvo de Stratagene (La Jolla, CA, EE.UU.). Los oligos de ADN se adquirieron en MWG Biotech AG (Ebersberg, Alemania). Albúmina de suero bovino (BSA) y Tween 20 se adquirió en forma de Sigma-Aldrich (Oslo, Noruega). La polimerasa de ADN Pfu Turbo fue adquirida en Stratagene (La Jolla, CA, EE.UU.). Los haptenos 2-feniloxazol-5-ona (phOx) y 5-nitrofenacetil (NIP) conjugados con BSA se prepararon esencialmente como se describe en otro lugar (véanse Nakela et al., PMID; 722243 y Michaelsen et al., PMID: 2125362). El isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) se adquirió en Fermentas (Burlington, Canadá). La trietilamina (TEA) y la tripsina/EDTA se adquirieron en Sigma-Aldrich (Oslo, Noruega) y en BioWhittaker (Lonza Group Ltd., Visp, Suiza), respectivamente. La cepa de E. coli XL1-Blue se adquirió en Stratagene (La Jolla, CA, EE.UU.). El fago auxiliar M13K07 se adquirió en GE Healthcare Bio-Ciencias AB (Uppsala, Suecia). El fagémido pSEX81 (SEC ID Nº: 2) (exposición de pIII) que alberga un Fv de cadena sencilla

45 (scFv) con especificidad frente a phOx-BSA fue proporcionado amablemente por Affitech AS (Oslo, Noruega). El vector pSG1 de expresión procariota que alberga el anti-NIP de scFv (SEQ ID Nº: 3) (no publicado) se basa en pHOG21 (véase Kiprianov et al., PMID: 9005945) y se ha hecho internamente a partir de los genes variables de anticuerpos derivados de pLNOH2 y pLNOK (véase Norderhaug et al., PMID: 9202712).

Construcción de los nuevos vectores pGALD9 y pGALD9!L de fagémidos de exposición de pIX. A modo de plantilla de partida para la columna vertebral del vector, se ha elegido el fagémido pSEX81 (SEC ID Nº: 2) que fue descrito anteriormente (véase GenBank adhesión Nº: Y14584). En Cebador lugar, para retirar la secuencia pelB de señal de procariota (N-MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA-C) (SEQ ID Nº: 4) que codifica la escisión en este vector, se introdujo un sitio NcoI RE en el extremo N-terminal por mutagénesis in vitro de QuikChange™ usando la pareja de cebadores 55 a41g frwd/a41g--rev (5'-AGAGGAGAAATTAACCATGGAATACCTATTGCCTACG-GC-3 '/5-GCCGTAGGCAATAGGTATTCCATGGTTAATTTCTCCTCT-3') (SEQ ID Nº: 5 y SEQ ID Nº: 6, respectivamente), cambiando por ello el Cebador nucleótido en el segundo codón del ORF de pelB de A a G. A continuación de la mutagénesis, el vector fue digerido con NcoI, religado y usado como plantilla en una segunda PCR recuperando la parte relevante del vector usando la pareja de cebadores pHOG_ EcoRI_ FRWD/scTCR_ rev (5'-TAGCTCACTCATTAGGCACCC-3'/5'-TTTGGATCCAGCG-GCCGC-3') (SEQ ID Nº: 7 y SEQ ID Nº: 8, respectivamente). Este fragmento de PCR fue movido después al pSEX81 original (SEQ ID Nº: 2) en los sitios compatibles con EcoRI/HindIII RE usando técnicas estándar y confirmando por secuenciación del ADN. Este paso retira por completo la porción de pelB de secuencia de señal de codificación, pero preserva el codón de inicio y su posición relativa hacia la secuencia de Shine-Dalgarno (SD) y lacPO, importante para la transcripción y la traducción 65 normales, así como que añade sólo un residuo de Ala antes de la secuencia exógena definido por los sitios NcoI/NotI RE que se encuentran en el pSEX81 original (SEC ID N º: 2). La nueva construcción se denotó pSEX81!L.

En segundo lugar, la secuencia de codificación de pXI se amplificó a partir de M13K07 usando la pareja de cebadores del extremo 5' reetiquetada de pIX_ EcoRV/pIX_NheI (5'-ATATGATAT-CAGAATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTCGCC-3 '/5 '-ATATGCTAGCTTATCATGAGGAAGTTTCCATTAAACGGG3') (SEC ID Nº: 9 y SEQ ID Nº: 10). Este fragmento de PCR se movió después a los fagémidos pSEX81 (SEC ID Nº:

5 2) y pSEX81!L de los sitios RE compatibles, intercambiando por ello la región de pIII de codificación en ambos, y dando como resultado una fusión de N-terminal en marco de pIX del casete de NcoI/NotI definido en el pSEX81 original (SEC ID Nº: 2). Las nuevas construcciones fueron confirmadas por secuenciación de ADN y designadas pGALD9 y pGALD9!L respectivamente. Para conmutar la unidad de anti-phOx (SEC ID Nº: 11) de scFv de los diversos fagémidos descritos anteriormente, con la unidad de anti-NIP (SEC ID Nº: 3) de scFv de pSG1, esto se hizo como intercambio de casete definido NcoI/NotI RE usando técnicas estándar. Todos los fagémidos que se describen en este documento se introdujeron en E. coli XL1-Blue mediante electroportación usando técnicas estándar.

Preparación de partículas de fago

15 Rescate de fagémido a partir de E. coli XL1-Blue usando fagos auxiliares M13K07, y el montaje de viriones se controló mediante titulación de una sola dilución como se ha descrito (véanse Welschof et al., PMID: 9050877 y Koch et al., PMID: 11126120).

Ensayos de inmunoabsorción de enzima de captura de fagos enlazadas con (ELISA)

phOx-BSA o NIP-BSA fueron absorbidos a pocillos de placas de microtitulación MaxiSorp™ (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 5 μg/ml en PBS, pH 7,4 durante la noche a 4 ° C. Los pocillos se bloquearon con BSA al 2% en PBS (w/v) durante 1 h a TA, donde después las preparaciones de virión se añadieron y se dejaron reaccionar de 1 a 2 horas a TA antes de que los viriones capturados fueran detectados con anti-M13-HRP (1:5.000) durante 1 h a TA.

25 Entre cada paso, los pocillos se lavaron 3 veces con PBST (PBS/0,05% de Tween 20). Los pocillos se desarrollaron con sustrato soluble TMB, y se detuvieron con HCl de 1M después de 30 min y se leyó la absorbancia a A450nm. Para cuantificar la reactividad de Ag como una función de las proteínas de fusión de exposición por virión, el desarrollo ELISA se detuvo antes de que se observara la saturación de la señal para cualquier muestra mediante la adición de HCl de 1M y las lecturas de absorbencia se transformaron de acuerdo con la siguiente fórmula: nivel relativo de exposición = (A450nm/ título de fagémido) x 1012.

Selección agregada de phOx-/NIP-BSA

Se prepararon muestras frescas de virión, ya sea con o sin inducción de IPTG de 1 mM, PEG precipittado y titulado 35 como se ha descrito.

Se agregó después la entidad específica del objetivo en un fondo irrelevante a un nivel 1:107 dando una diversidad conocida de 107, correspondiente a una biblioteca combinatoria de tamaño mediano.

Para la selección de NIP-BSA, se agregó el anti-NIP de scFv a al homólogo del anti-phOx de scFv y viceversa. La entrada inicial fue 1x 1010 cfuampR, resultando en un nivel de complejidad de 103 en ronda panorámica 1 para la totalidad de las 12 bibliotecas de modelos.

En resumen, el objetivo se inmovilizó sobre pocillos de placas de microtitulación MaxiSorp™ (Nunc, Roskilde,

45 Dinamarca) por triplicado en la misma placa usando volúmenes de 100 μl, de 1 μg/ml y de 0.1μg/ml para mover panorámicamente las rondas 1 y 2, respectivamente.

Antes del movimiento panorámico, los pocillos se bloquearon con PBSTM por 1-2 h a TA, antes de que 100 μl de las respectivas preparaciones de virión prebloqueado (en PBSTM) se añadieran y se dejaran reaccionar durante 1,5 h a TA con agitación.

Los pocillos se lavaron 9 veces en PBST seguido de 5 veces en dH2O usando un lavador de microtitulación antes de que el objetivo unido a los viriones (en pocillos, por triplicado) se eluyeran ya fuera mediante 1) la adición de 100 μl/pocillo de 100 mM de TEA (pH 12) durante 5 min a TA seguida de la neutralización por transferencia del pocillo

55 fresco que contiene 100 μl/pocillo de Tris-HCl, pH 6,8; 2) la adición de 100 μl/pocillo de tripsina/EDTA durante 10 min/TA seguida por transferencia a los pocillos frescos; 3) la adición de 200 μl/pocillo de E. coli XL1-Blue de fase de registro (A600nm ~ 0,5, que corresponde a ≥ 5 x 107 células) durante 30 min a 37 ° C con agitación, seguida por transferencia a 10 ml de YT-TAG precalentado (2 x YT que contiene 30 μg/ml de tetraciclina, 100 μg/ml de ampicilina y 0,1 M de glucosa) complementado con fago auxiliar M13K07 en MOI10.

La incubación se continuó durante 15 min a 37 ° C con agitación bajo, seguida por 30 min a 37 ° C con alta agitación. Paralelamente, se usaron muestras eluidas de TEA y tripsina para infectar los cultivos XL1 -Blue de la fase de registro de E. coli en 9 ml de YT-TAG , se incubaron con baja agitación durante 15 minutos a 37 º C, y se añadió antes 1 ml de YT-TAG complementado con el fago auxiliar M13K07 en MOI10.

65 La incubación se continuó durante 15 min a 37 ° C con agitación bajo seguida por 30 min a 37 ° C con alta agitación.

Todas las muestras fueron después centtrifugadas a 3000-g/10 min/TA, los sobrenadantes fueron descartados y los pellets se resuspendieron suavemente en 10 ml de 2x YT precalentado conteniendo 100 μg/ml de ampicilina y 50 μg/ml de kanamicina.

5 Las muestras adecuadas se complementaron con 1 mM de IPTG y todas las muestras se incubaron en ON a 30 ° C con alta agitación. El día después, los cultivos se centrifugaron a 4000-g/10 min/TA y el sobrenadante se filtró estéril en tubos frescos de 15 ml a través de filtros 0,2 μm.

Estos sobrenadantes fueron después canalizados en la siguiente ronda de movimiento panorámico como se ha descrito, usando 50 μl de volumen/muestra correspondientes a una entrada de al menos 109 cfuampR/muestra. A continuación de la segunda ronda de selección, el virión que contiene los sobrenadantes se canaliza en un ELISA específico de antígeno como se describió anteriormente.

RESULTADOS

15 Se sabe que la totalidad de las cinco proteínas de la cubierta estructural del fago filamentoso (fd, M13 y f1) son proteínas integrales de membrana que se encuentran en la membrana interna del huésped gram negativo antes de incorporarse al virión que sobresale (véase Endeman y Model, PMID: 7616570). Este informe también concluye que a pesar de que pIX no permitía ninguna modificación del N –terminal de fusión, la propia proteína de la cápside era solvente accesible en el virión intacto. Tanto Gao et al. (PMID: 10339535 y 12239343) como Khalil et al. (PMID: 17360403) han demostrado más tarde que la exposición de N-terminal de pIX de fusión se permite cuando se expresa a partir de fagémidos y se usa en combinación con la secuencia de señal dependiente de orientación periplásmico. En estos sistemas, la complementación tiene lugar a medida que se dona wt pIX desde el genoma del fago auxiliar en el rescate de fagémido. Para probar si dicha exposición también se permitiría sin ninguna secuencia

25 de señal dependiente de la orientación al periplasma, hemos construido dos fagémidos nuevos denominados pGALD9 y pGALD9!L, lo que permite la exposición del N-terminal de pIX, ya sea con o sin tal secuencia de de señal, respectivamente (véase la figura 2).

Se eligieron dos fusiones de pIX diferentes para analizar usando estos nuevos fagémidos y compararlas con sus homólogas usando exposición estándar de pIII. Ambas fusiones eran de fragmentos de anticuerpos scFv, basados o bien en segmentos de anticuerpos humanos de genes variables específicos para el hapteno conjugado phOx-BSA (anti-phOx de scFv), o en segmentos de anticuerpos murinos de genes variables específicos para el hapteno conjugado NIP-BSA (anti-NIP de scFv). En especial, el anti-phOx de scFv (SEQ ID Nº: 11) ha sido seleccionado de una biblioteca de anticuerpos humanos de scFv y se sabe que se expresa bastante bien en E. coli (véase Marks et

35 al., PMID: 1.748.994). Por el contrario, es bien sabido que muchos genes variables de hibridoma murino no se expresan bien en E. coli y tampoco en la exposición en fagos (véase Krebber et al., PMID: 9032408).

La exposición de pIX de los scFv no debe interferir con el montaje normal de virión. Por lo tanto, comparamos la efectividad de estos fagémidos de exposición de scFv con y sin secuencia de señal, y también con exposición estándar de pIII (que tiene un requisito absoluto para la señal secuenciada dependiente de la orientación periplásmica), usando rescate y titulación estándar de fagémido como se describe en materiales y métodos (véase la figura 3).

El resultado de la titulación mostró de sobra que los viriones que contenían fagémido fueron hechos en todos los

45 casos (véanse las figuras 3A y 3C). Cuando las fusiones de scFv se expresan a partir del lac PO sin inducción de promotor (expresión basal), ambas versiones de exposición de pIX y el control de pIII producen títulos comparables para el anti-phOx de scFv (véase la figura 2A). Por el contrario, hay un título de 5 a 10 veces más alto de doblado en la exposición de señal de secuencia independiente de pIX de anti-NIP de scFv en comparación con el de pIII y con el de la exposición dependiente de secuencia de señal de pIX, respectivamente (véase la figura 3C). Cuando la expresión aumentada de fusión de scFv se ve obligada a inducción de IPTG de la lacPO, se adosa una reducción de 10 veces de doblado en los títulos de ambas exposiciones dependientes de secuencia de señal de pIX y pIII. Por el contrario, hubo sólo efectos menores en ambas variantes de exposición dependiente de secuencia de señal de pIX (véanse las figuras 3A y 3C). Como la complementación wt de pIX está presente a partir del fago auxiliar en este sistema, este hallazgo fue tan sorprendente como importante, porque muestra que las exposiciones dependientes de

55 secuencia de señal de pIX y pIII interfieren con el proceso de montaje del virión, mientras que este efecto es sólo menor en el caso de la exposición independiente de secuencia de señal de pIX incluso bajo inducción de IPTG. El efecto es más notable cuando se compara el resultado del anti-NIP de scFv expuesto en pIX con o sin la secuencia de señal, donde el anterior exhibe una reducción de 100 veces de doblado en el título. También es digno de mención el hecho de ver que para ambos scFvs, el montaje del virión es tan bueno o mejor que en pIII cuando se hace en la versión independiente de secuencia de señal de pIX.

El núcleo de cualquier plataforma de selección combinatoria es el acoplamiento físico fenotípico-genotípico que permite la recuperación del genotipo través de la selección fenotípica. Si este enlace físico se ve comprometido o se pierde, el sistema se vuelve no funcional. Traducido para la exposición de fagémido, significa que es vital para 65 cualquier selección que sea el fagémido, y no el genoma de fago auxiliar, el que se encapsule en los viriones en el rescate de fago auxiliar. Como el fagémido y el fago auxiliar albergan diferentes marcadores de selección de

antibióticos, esta noción puede ser fácilmente evaluada durante la titulación infecciosa mediante el cálculo de la relación entre el fagémido y el fago auxiliar sobre la base de sus respectivas unidades formadoras de colonias (ufc) resultantes del crecimiento selectivo apropiado (ampicilina (ampR), o kanamicina (kanR)). La relación debe entonces estar por encima de 1 para que cualquier selección eficiente corriente abajo sea viable.

5 Al evaluar las proporciones de fagémido y fago auxiliar en las preparaciones de viriones descritos anteriormente (véanse las figuras 3B y 3D), se revelaron diferencias significativas entre las tres rutas de exposición. Usando empaquetamiento estándar de viriones sin inducción de promotor (expresión basal), la totalidad de las tres rutas son viables para el anti-phOx de scFv (véase la figura 2B), mientras que para el anti-NIP de scFv (véase la figura 3D) esto sólo fue cierto para la variante independiente de secuencia de pIX. Tras la inducción de promotor (inducción de IPTG), ambas variantes de pIII y de dependientes de señal de pIX exhibían pérdida severa de la vinculación fenotipo-genotipo, y el efecto era más notable en la fusión de anti-NIP de scFv. Por el contrario, este efecto no estaba presente (anti-phOx de scFv) o era leve (anti-NIP de scFv) para ambas variantes de la exposición independiente de secuencia de señal de pIX. De este modo, los resultados muestran claramente que la exposición

15 independiente de secuencia de señal de pIX alberga una vinculación fenotípica-genotípica superior en comparación tanto con la pIII estándar como con la exposición dependiente de secuencia de señal de pIX.

Sobre la base de las muestras anteriores, evaluamos después la exposición funcional de scFv en estos viriones en un ELISA de antígeno específico (véase la figura 4). El resultado mostró claramente la exposición funcional de scFv a partir de las tres rutas de exposición (véanse las figuras 4A y 4B). Como las muestras no se normalizaron de acuerdo con el título de fagémido, las intensidades de señal no son directamente comparables. Lo que es más, se observó saturación de la señal en varias muestras. Para evaluar adecuadamente las diferencias funcionales entre las tres rutas de exposición, se determinaron los niveles relativos de exposición (unidades funcionales de exposición por virión) en un nuevo ELISA de antígeno específico como se describe en materiales y métodos (véanse las figuras

25 4C y 4D). Mientras que el nivel de exposición era comparable entre pIII y la variante dependiente de secuencia de señal de pIX, la exposición independiente de secuencia de señal de pIX era significativamente menor. Esto es cierto para ambos scFvs y tanto en la expresión basal como tras la inducción de IPTG. Como era de esperar, la totalidad de las tres rutas de exposición, y para ambos scFvs, exhibieron una exposición más alta con la inducción de IPTG. Sin embargo, es de la máxima importancia ver los resultados de la las figuras 4C y 4D a la luz de las relaciones indicadas en las figuras 3B y 3D. Por ejemplo, está claro que tanto pIII como la exposición dependiente de secuencia de señal de pIX de la unidad anti-NIP de scFv exhibe de unas 10 a 20 (expresión basal) y ~ 25 (inducción de IPTG) veces de plegado más altas de exposición en comparación con su homóloga independiente de secuencia de señal de pIX. Sin embargo, las dos rutas anteriores tienen ambas un enlace fenotípico-genotípico muy débil o perdido, lo que en un régimen de selección combinatoria las haría no funcionales ya que su genotipo se perdería tras la

35 selección fenotípica. Este efecto es también cierto para la unidad de anti-phOx de scFv, pero sólo con la inducción de IPTG. Lo que es más, el nivel de exposición de la unidad anti-phOx en la variante independiente de secuencia de señal de pIX con IPTG inducida es comparable al de las variantes pIII y dependiente de secuencia de señal de pIX en la expresión basal. A la vista de estos datos, es interesante ver que el único informe que explota la pIX (dependiente de secuencia de señal) para la exposición de scFv (véase Gao, PMID: 12239343) siempre usa la inducción de IPTG con empaquetamiento de viriones, pero nunca ha informado de las relaciones entre fagémido y fago auxiliar.

Aunque el formato de scFv se usa a menudo debido a los perfiles favorables de expresión en E. coli (véase Bradbury y Marks, PMID: 15261570), varios informes señalan la ventaja de los formatos de exposición de nivel más

45 bajo, como, por ejemplo, fragmentos fab de anticuerpos, en la recuperación de ligantes de alta afinidad en la selección por afinidad (véanse de Haard et al., PMID: 10373423, Hoogenboom, PMID: 16151404 y Rothe y col, PMID: 18191144).

De este modo, a pesar incluso de que exposición independiente de secuencia de señal de scFv-pIX parezca producir una exposición de bajo nivel, este efecto, esto puede de hecho tornarse altamente ventajoso cuando se aplica para la selección de alta afinidad.

Por lo tanto, para evaluar cómo la exposición independiente de secuencia de señal de pIX actúa en la selección de afinidad, la comparamos con la exposición convencional de pIII.

55 Los viriones se produjeron en presencia o ausencia de inducción de IPTG, y las proteínas de interés fueron o bien anti-NIP o bien anti-phOx de scFv.

De este modo, se evaluaron un total de 4 poblaciones de fagos para los dos objetivos phOx-y NIP-BSA, respectivamente. En cada caso, el objetivo específico de scFv se mezcló con el scFv irrelevante de especificidad en una proporción de 1:107.

Es importante destacar que los dos scFvs no reaccionan de forma cruzada. Dos rondas de selección por afinidad se llevaron después a cabo.

65 Se emplearon tres diferentes estrategias de elución, ya fuera infección directa, de alto pH o proteolítica. El enriquecimiento fue verificado mediante ELISA de antígeno específico policlonal de fago a continuación de la segunda ronda de selección (véase la figura 5).

Cuando la proteína de interés fue expuesta en pIX, la selección fue aproximadamente igual de eficiente y, en la

5 mayoría de los casos, más eficiente que cuando el POI se muestra en PIII. En particular, la ruta estándar de exposición de pIII que emplea un pH alto (TEA) o una elución proteolítica (tripsina) exhibió un enriquecimiento pobre en comparación con la de pIX.

La selección fue más eficiente sin que con inducción de IPTG, independientemente de la ruta de exposición y de las condiciones de elución, y el efecto negativo aparecido resultó ser más grave para la ruta de exposición de pIII.

De este modo, la baja propensión a la exposición independiente de secuencia de señal de pIX no se tradujo en una selección pobre. Al dejar pIII inalterada y expuesta totalmente a la solvencia, se pudo efectivamente efectuar el rescate de virión seguido del paso de selección de biblioteca sin romper la unión virión-objetivo, convirtiendo el paso

15 de elución en redundante y acelerando altamente los protocolos establecidos.

Lo último puede también facilitar el aislamiento de ligantes de alta afinidad, la elución de los cuales puede ser resistente a una variedad de estrategias (véase Balass et al., PMID: 8954559).

Referencias

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25 2. Gao, C. et al. Making artificial antibodies: A format for phage display of combinatorial heterodimeric arrays. PNAS 96, 6025-6030 (1999) (PMID: 10339535).

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65 15. Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G. By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol. 1991 Dic 5; 222 (3): 581-97 (PMID: 1748994).

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20. Rothe C, Urlinger S, Löhning C, Prassler J, Stark Y, Jäger U, Hubner B, Bardroff M, Pradel I, Boss M, Bittlingmaier R, Bataa T, Frisch C, Brocks B, Honegger A, Urban M. The human combinatorial antibody library HuCAL GOLD combines diversification of all six CDRs according to the natural immune system with a novel display

20 method for efficient selection of high-affinity antibodies. J Mol Biol. 2008 Feb 29; 376 (4): 1182-200. Epub 2007 Dic 15 (PMID: 18191144).

Listado de secuencias

25 <110> Bio-Medisinsk Innovasjon AS Løset, Geir Åge

<120> Exposición en fagos independiente de secuencia de señal de pIX

<130> 45365PC01

<150> 61/155437

<151> 2009-02-25 30 <160> 11

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 32

<212>: PRT 35 <213> Bacteriófago M13

<400> 1

<211> 4860

<212>: ADN 40 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fagémido

<400> 2

<210> 3

<211> 249

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> fragmento de scFv

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia de señal

<400> 4

<210> 5

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> Cebador

<400> 5 agaggagaaa ttaaccatgg aatacctatt gcctacggc 39

<210> 6

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5 <223> Cebador

<400> 6 gccgtaggca ataggtattc catggttaat ttctcctct 39

<210> 7

<211> 21 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 7 15 tagctcactc attaggcacc c 21

<210> 8

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 20 <220>

<223> Cebador

<400> 8 tttggatcca gcggccgc 18

<210> 9 25 <211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

30 <400> 9 atatgatatc agaatgagtg ttttagtgta ttctttcgcc 40

<210> 10

<211> 39

<212> ADN 35 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 10

atatgctagc ttatcatgag gaagtttcca ttaaacggg 39 40 <210> 11

<211> 253

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 45 <223> scFv

<400> 11

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un genoma de fago o un fagémido que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína pIX de fusión

procedente de un fago filamentoso, en el que la proteína de fusión no comprende una secuencia de señal de N5 terminal de procariota.
2. El genoma de fago o el fagémido de la reivindicación 1, en el que la proteína pIX de fusión comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la posición 1-32, 2-32, 3-32, 4-32 y 5-32 de la SEC ID Nº: 1 (MSVLVYSFASFVLGWCLRSGI-TYFTRLMETSS).
3.

El genoma de fago o el fagémido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el péptido exógeno está fusionado directamente con el extremo N-terminal de la secuencia de pIX.
4.

El genoma de fago o el fagémido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el péptido exógeno

15 se selecciona de entre el grupo que consiste en anticuerpos o fragmentos de ellos, que cubre Fv, scFv, Fab, dominios individuales, dominio Z de la proteína A o fragmentos de él (affibody), ankyrin o fragmentos de ella, DARPin o fragmentos de ella, receptor de células T o fragmentos de él, CMH de clase I o II o fragmentos de él, fibronectina o fragmentos de ella, Anticalins o fragmentos de ellas, dominios PDZ o fragmentos de ellos, IgNAR o fragmentos de él, CTLA4 o fragmentos de él, ImmE7 o fragmentos de ella, knottins o fragmentos de ellos, avimer o

20 fragmentos de ella, GFP o fragmentos de ella y otros fluoróforos biológicos codificados por genes.
5. El genoma de fago o el fagémido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el péptido exógeno es un miembro de la biblioteca.

25 6. Un fago filamentoso que comprende un genoma de fago o un fagémido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. El fago filamentoso de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende adicionalmente un gen que codifica wt pIX

y/o proteína de wt pIX. 30
8.

El fago filamentoso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el fago no comprende un gen que codifica wt pIX y/o proteína de wt pIX.
9.

El fago filamentoso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, que comprende adicionalmente uno o

35 más del grupo seleccionado a partir de la proteína pIII de fusión, de la proteína pVII de fusión y de la proteína pVIII de fusión.
10. Un sistema de exposición en fagos que comprende un genoma de fago o un fagémido de acuerdo con

cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un fago auxiliar. 40
11.

Un estuche que comprende el sistema de exposición en fagos de la reivindicación 10.
12.

Una biblioteca de fagos que comprende dos o más fagos filamentosos que exponen diferentes proteínas, en la

que al menos una de estas proteínas es la proteína pIX de fusión expresada a partir del genoma de fago o de un 45 fagémido de acuerdo con la reivindicación 1.