CN102676569A

CN102676569A - 一种新型噬菌粒展示载体pCANTAB5M

Info

Publication number: CN102676569A
Application number: CN2012101421475A
Authority: CN
Inventors: 尹琪; 白先宏; 王康; 马金伟; 刘方杰; 刘志刚
Original assignee: Biotech Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Biotech Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2012-05-08
Filing date: 2012-05-08
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明公开了一种新型噬菌粒展示载体pCANTAB5M及其制备方法和应用。该载体对商用载体pCANTAB5E进行了改进，在Sfi I和Not I酶切位点之间插入了Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn I 4个常用的内切酶克隆位点，同时在载体中引入了Myc标签和His标签及通用测序引物BGH。这样的改进简化了外源基因的定向克隆操作，提高了库容量与克隆效率，使得阳性噬菌粒克隆的鉴定更为准确，极大地方便了阳性克隆的测序验证工作。本发明适用于展示各种随机肽库，抗体库和各种功能靶蛋白。

Description

一种新型噬菌粒展示载体pCANTAB5M

技术领域

本发明涉及抗体工程技术领域，特别涉及一种应用于噬菌体展示技术的新型噬菌粒展示载体。

背景技术

噬菌体展示技术是目前应用得最为广泛的分子展示技术，是利用细菌的病毒，如丝状噬菌体M13作为载体，将基因和基因产物有机的结合起来。由此衍生的其它展示系统的基本原理都是一样的，只是载体和宿主细胞不同而已。

1985年，美国Missouri大学的Smith GP第一次将外源基因插入丝状噬菌体(Filamentousbacteriophage，fd)的基因组，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示，从而创建了噬菌体展示技术(Smith G P，Science，1985，228(4705)：1315-1317)。1994年McCaffery等最先构建了噬菌体抗体展示文库，开始了噬菌体展示技术应用的新时代(McCafferty J，et al，Nature，1990，348：552-554)。如今噬菌体展示技术已被广泛用于抗体库的展示以及多肽和酶的制备中。

噬菌体展示抗体库通过直接将特定分子的基因型与表型相连接，统一于同一病毒颗粒内，这样通过“吸附-洗脱-扩增”的富集过程，就可以筛选到有特定结合功能的蛋白，同时可有效地从抗体库中筛选出特异性抗体的可变区基因。

噬菌体抗体库的用途主要有两个方面：一是可以制备人源抗体；二是可以优化抗体结构，提高抗体的高通量表达。这对抗体的制备和应用有着深远的意义。

到目前为止，研究人员已开发出数种常用的噬菌体展示系统，根据研究的侧重点可选用相应的展示系统。如丝状噬菌体展示系统，可以筛选出以分泌形式释放的高亲和力和高拷贝数的配体，并且丝状噬菌体具有很好的免疫原性，在进行生物疫苗研制开发方面具有重要价值；λ噬菌体展示系统和T4噬菌展示体系统容量较大，不易筛选高亲和力配体；T7噬菌体展示系统是目前最为理想的展示系统(徐洁，顾东生等.中国生物工程杂志，2009，29(2)：11-16)，能以多种拷贝展示不同分子量的蛋白，如将目的基因与10B的T7外壳蛋白的基因融合，可在T7噬菌体表面展示高达400拷贝的大分子蛋白。

噬菌体展示的载体主要分为噬菌粒展示载体和噬菌体展示载体两大类。噬菌粒载体是一类带有噬菌体复制起始点的质粒载体。它巧妙的组合了质粒和噬菌体的特征，是一种人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。噬菌粒需要辅助噬菌体(helper phage)来提供复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白。它在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬菌粒，可以像噬菌体或质粒一样复制。

噬菌粒具有以下令人瞩目的特征：1.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征；2.免除了将外源DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤；3.由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。其中Lerner实验室以pBluescript为基础构建的载体pCBAKS，pComb3，plomb8，主要用于Fab抗体库的构建，以PUC为基础构建的pHEN载体，用于构建scFv抗体库，Winter实验室以PUC119为基础构建了pCANTAB系列载体。

pCANTAB5E载体是由Pharmacia的Jackson等人于1992年构建的一种噬菌粒载体，其中含有氨苄抗性基因(Amp)，Plac启动子及M13噬菌体间隔区片段，用于克隆ScFv基因的Sfi I，Not I克隆位点及Etag序列和瑚珀终止码TAG，该载体被广泛地应用于噬菌体抗体库的构建过程中。

1999年，潘卫、戚中田首次对PCANTAB5E进行了改造，通过PCR技术将限制酶切点Xba I和HGV C片段引入新的噬菌体展示载体pCANTAB5X中，在一定程度上提高了克隆效率(潘卫，戚中田，第二军医大学学报，1999，Oct，20(10)，723-725)。但是在使用过程中发现，pCANTAB5X展示随机肽库时有些重组噬菌体的库容及滴度较低，很少筛选到插入800bp以上插入片段，于是沈毅等对pCANTAB5X进行了改进，构建了新的载体pCANTAB5L，将常用内切酶位点增加到5个，并引入了柔性多肽接头[G4S]3与大肠杆菌稀有密码子，不仅改善了库容量较低的问题，并且对形成和维持活性功能起到促进作用(沈毅、潘卫等，第二军医大学学报，2003Mar，24(3)，298-302)。2004年，徐容等对pCANTABL载体的限制性内切酶位点进行了阅读框的校正，进一步得到了改进后的载体pCANTAB5S，并成功应用该载体展示了葡萄球菌A蛋白的5个抗体结合结构域及大消化链球菌属蛋白L的B3结构域，显示了该载体广阔的应用前景。

但是，该载体仍然存在一些缺陷，pCANTAB5E载体本身使用的限制性内切酶位点为Not I和Sfi I，这为后续的抗体库构建和库容量提高带来了很多不利影响。首先，因为两种限制性内切酶的最佳作用温度不同，所以导致在操作过程中增加了操作步骤，不利于抗体库库容的提高，而且带来不必要的浪费；其次，Not I的酶切位点是一种G(鸟苷酸)、C(胞嘧啶)含量比较高的限制性内切酶位点，因此在酶切时需要过量的酶和较长的时间才能达到理想的效果；最后，Sfi I是一种具有位点优势效应的酶，酶切效率不高，因此对pCANTAB5E载体进行改造，使其更加适用于噬菌体抗体库的构建是具有非常重要的应用价值的。

我们改造后的pCANTAB5M载体，引入了Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn

I等4个常用的限制性内切酶位点，这些酶的最佳工作温度均为37℃，而且基本上都可以使用双酶切系统，简化了后续的试验操作，为更好的提高库容提供了可能性。此外，我们还在新的噬粒载体上引入了His和Myc两种常用的蛋白标签，可以用来鉴定展示的噬菌体中是否有目标蛋白的表达。最后，我们引入的BGH序列，也为噬菌体抗体库后期的阳性克隆测序鉴定提供了方便的测序引物。

发明内容

本发明通过使用分子生物学技术，在pCANTAB5E载体的Sfi I和Not I酶切位点之间插入了Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn I 4个常用内切酶克隆位点，为噬菌体展示技术提供了改进的新型噬菌粒载体pCANTAB5M，如图1所示。

该载体不仅可以方便地进行多位点克隆，提高克隆效率与库容量，而且可以用来鉴定展示的噬菌体中是否含有目标蛋白表达，方便阳性克隆测序鉴定工作。

针对pCANTAB5E载体存在的上述问题，本发明引入了Xba I、Stu I、EcoR V和Kpn I等常用的限制性内切酶位点，这些酶的最佳工作温度均为37℃，而且基本上都可以使用双酶切系统，简化了后续的实验操作，进一步提高了克隆效率与库容能力。

除此之外，改进后的载体pCANTAB5M还增加了一些新的功能。本发明在载体中引入了His和Myc两种常用的蛋白标签，这两种标签可以用来鉴定展示的噬菌体中是否有目标蛋白的表达，为阳性噬菌粒克隆的鉴定工作提供一种更为准确的检测工具。同时，本发明还在新的噬菌粒载体中引入了BGH序列，BGH序列是通用引物，它的引入极大地简化了噬菌体抗体库后期的阳性克隆的测序鉴定工作。

改良后的噬菌粒载体pCANTAB5M适用于展示各种抗体库，随机肽片段和功能蛋白。应用pCANTAB5E噬菌粒己成功地展示了抗跨膜糖蛋白CD22抗原的抗体库。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种新型的噬菌粒展示载体pCANTAB5M，该载体是由噬菌粒pCANTAB5E及其Sfi I和Not I酶切位点之间插入的linker核苷酸片段组成，所述的linker核苷酸片段包含

a.Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn I酶切位点；

b.序列为GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG的myc标签；

c.序列为CATCATCATCATCATCAT的His标签；

d.序列为CCTCGACTGTGCCTTCTA的通用测序引物BGH。

所述的pCANTAB5E载体，是由pCANTAB5E载体先后经过限制性内切酶Not I、Sfi I酶切后回收而得。

所述的linker核苷酸片段，来源于载体pCDNA^TM3.1/myc-His(-)，即以载体pCDNA^TM3.1/myc-His(-)为模板，通过PCR扩增而得。

所述的linker核苷酸片段，包含Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn I 4个常用内切酶克隆位点，其中Stu I酶切位点通过在引物中引入Stu I酶切位点核苷酸序列后PCR扩增而得。除上述4个酶切位点，该多克隆位点区还包含Xho I、BstX I、EcoR I、BstX I、BamH I、Asp718 I、Hind III和Apa I酶切位点。

本发明提供了一种新型噬菌粒展示载体pCANTAB5M，其linker核苷酸片段具有SEQ ID NO 1所示的序列。

本发明提供了噬菌粒展示载体pCANTAB5M用于展示抗体库、随机肽库和功能靶蛋白的用途。

本发明提供了噬菌粒展示载体pCANTAB5M用于展示CD22抗体的用途。

附图说明

图1：新型噬菌粒载体pCANTAB5M。

图2：Linker序列PCR扩增结果。

图3：pCANTAB5M阳性克隆菌液PCR鉴定结果。

图4：pCANTAB5M阳性克隆酶切鉴定结果。

图5：应用pCANTAB5M噬粒载体构建的CD22抗体库ELISA标签检测结果。

具体实施方式

本发明的实施方案通过下列实施例举例说明。然而本发明的实施方案不限于这些实施例的特定细节，因为对于本领域的普通技术人员来说，其它的变化是已知的，或根据直接公开的内容和附属的权利要求是显而易见的。因此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本文引用的参考文献以其全文通过引用并入本文。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：pCANTAB5M重组载体的构建

1、linker序列的引物设计

依据pCANTAB5E载体与pCDNA^TM3.1/myc-His(-)载体的序列设计linker序列PCR扩展引物如下：

MH-Sense

GCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCCTCTAGACTCGAGAGGCCTCC

MH-Antisense

TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAGAAGGCACAGTCGAGGCTGATCAGCGGT

2、linker序列的扩增

以pcDNA^TM3.1/myc-His(-)质粒为模板，以MH-Sense、MH-Antisense为引物扩增linker序列。在扩增的同时，由于引物中Stu I酶切位点基因序列的引入，pcDNA^TM3.1/myc-His(-)载体原有的Not I酶切位点被突变成为Stu I酶切位点，通过扩增，从而得到了包含Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn I四个酶切位点，myc、His标签和BGH通用测序引物的linker序列。扩增体系为：pcDNA^TM3.1/myc-His(-)质粒模板0.5μL，MH-Sense11μl，MH-Antisense 1μl，dNTP 4μl，10x buffer 5μl，Taq聚合酶0.5μl，ddH₂O 38μl。扩增条件为：95℃ 5min，一个循环；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min，一个循环。

电泳结果如图2所示，1号泳道是天根生化科技有限公司DNA marker III，2号泳道是linker序列PCR扩增的结果。电泳结果表明扩增得到的linker条带单一、清晰、位置正确。

3、linker序列的回收

使用Axygen公司DNA胶回收Kit回收linker序列，并进行DNA含量测定，检测结果显示linker DNA浓度为70ng/ul。

4、pCANTAB5E载体和linker序列的双酶切

使用限制性内切酶Not I(购自New England Biolabs Inc.)分别过夜酶切pCANTAB5E载体和linker序列，然后回收酶切后的载体和linker序列片段。使用限制性内切酶Sfi I(购自New England Biolabs Inc.)再次过夜酶切回收后的载体和linker序列片段，然后二次回收双酶切的载体和linker片段，定量备用。

5、双酶切片段的连接与转化

将经过Not I和Sfi I双酶切的载体序列与linker序列连接过夜，转化TG1大肠杆菌感受态细胞，涂2YTAG培养基平板，37℃，静置，过夜培养。

6、阳性克隆的鉴定

从连接产物的转化平板上挑取12个克隆分别进行酶切鉴定和菌液PCR鉴定。扩增体系为：菌液1μl，MH-Sense 1μl，MH-Antisense 1μl，dNTP 4μl，10x buffer 5μl，Taq聚合酶0.5μl，ddH₂O 38μl。扩增条件为：95℃5min，一个循环；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min，一个循环。

鉴定结果如图3所示，1号和14号泳道为天根生化科技有限公司DNA marker III，2号泳道到11号泳道分别为克隆12到克隆3，12号泳道为克隆1，13号泳道为克隆2。菌液PCR结果表明只有克隆1为阳性克隆。提取12个阳性克隆中的质粒，用限制性内切酶EcoRI与EcoRV(购自New England Biolabs Inc.)进行双酶切，37℃，过夜酶切。酶切结果如图4所示，1号泳道为天根生化科技有限公司DNA marker III，2号泳道到13号泳道分别为克隆12到克隆1。酶切结果表明只有1号克隆为阳性克隆，可以切出大小正确的两条目标条带。

7、测序验证pCANTAB5M重组载体

将pCANTAB5M质粒的阳性克隆C1送英俊公司进行核苷酸序列测定，检测采用BGH和S1两种引物并双向测通，检测结果表明C1与目标序列完全匹配。序列匹配结果如下所示，所插入的linker序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2：pCANTAB5M载体标签的鉴定

为了验证pCANTAB5M载体上标签的可用性，我们采用ELISA实验对应用该噬菌粒展示的抗体库进行了标签检测，实验过程如下：

1、应用pCANTAB5M噬粒载体构建抗CD22抗原的抗体库

使用Xba I/Kpn I(购自New England Biolabs Inc.)双酶切系统分别过夜酶切pCANTAB5M噬粒载体和抗CD22抗体库DNA。使用Axygen DNA胶回收试剂盒分别回收酶切后的载体片段和CD22抗体库片段。将回收后的抗体库片段与噬粒载体片段进行定量，并按照1∶8的摩尔比例进行连接。连接反应条件为：4℃，过夜。连接产物转化TG1平板，得到CD22抗体库菌液。

2、将CD22抗体库进行噬菌体展示

(1)从CD22抗体库菌液中取20ul接种到50ml 2YTAG中，摇菌到OD值大约0.8左右，加入终浓度为10¹²/ml的M13噬菌体，37℃培养30min。

(2)4000rpm离心15min，将沉淀重悬于100ml 2YTAK中，28℃过夜培养。

(3)收集菌液，6000rpm离心15min，收集上清。

(4)加入PEG沉淀噬菌体，冰上放置1小时。

(5)6000rpm离心15min，弃上清，将沉淀溶解于1ml无菌PBS中。

(6)加入250ul PEG，冰上放置半小时。

(7)6000rpm离心15min，弃上清，将沉淀溶解于1ml无菌PBS中。

3、ELISA检测噬菌体抗体库上的不同标签

用CD22抗原包被ELISA板子，包被抗原浓度为0.5ug/孔。4℃过夜包被。将噬菌体展示的CD22抗体库以1∶10的比例经行稀释，每孔加入50ul噬菌体经行ELISA检测。实验结果如图5所示，我们分别检测了抗Myc-HRP(辣根过氧化物酶标记的抗Myc标签抗体，购自GenScript(南京)corporation)、抗His-HRP辣根过氧化物酶标记的抗His标签抗体，购自北京天恩泽基因科技有限公司)和山羊抗人IgG-HRP(辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG，购自北京中杉金桥生物技术有限公司)三种不同二抗。结果表明，我们构建的噬菌体抗体库中可以成功的检测到Myc标签与His标签的表达，而其检测值明显高于对照山羊抗人IgG。同时，在不包被抗原的ELISA板子上不能检测到OD值的升高，进而验证了Myc标签与His标签的作用。

Claims

1.一种新型的噬菌粒展示载体pCANTAB5M，由噬菌粒pCANTAB5E及其Sfi I和Not I酶切位点之间插入的linker核苷酸片段组成，所述的linker核苷酸片段包含：

a.Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn I酶切位点；

b.序列为GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG的myc标签；

c.序列为CATCATCATCATCATCAT的His标签；

d.序列为CCTCGACTGTGCCTTCTA的通用测序引物BGH。

2.根据权利要求1所述的噬菌粒展示载体pCANTAB5M，其特征在于，所述的linker序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1、2任一所述的噬菌粒展示载体pCANTAB5M用于展示抗体库、随机肽库和功能靶蛋白的用途。

4.根据权利要求3所述的噬菌粒展示载体pCANTAB5M用于展示CD22抗体的用途。