JPS63263085A - ヒトインスリン様成長因子ｉを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 この発明は、ヒトインスリン様成長因子Ｉ（以下、ＩＧ
Ｆ−Ｉという）の改良された製造法に関する。

［従来技術］ ＩＧＦ−１を遺伝子組み換え法で製造する方法として、
保護ペプチドと融合したＩＣ；Ｆ−Ｉをコードする遺伝
子を含有する発現プラスミドを用いて宿主微生物を形質
転換して得られる形質Ｖ、換体を培地に培養し、得られ
る培養液から保ｇ（ペプチド融合ＩＧＦ−Ｉ（以下、出
合１ｃ、Ｆ−■という）を回収し、該融合ＩＧＦ−Ｉを
保護ペプチドの脱離反応に付してＩＧＦ−■を分離採取
する方法がある。

［発明が解決しようとｒる問題点コ この発明は上記方法において、保護ペプチドを選択する
ことによって、融合ペプチドの発現効率を高めたところ
にある。

［問題点を解決するための手段］ この発明の発明者は、次の各工程を用いることにより、
ＩＧＦ−Ｉを好収率で製造することに成功した： 工程１ 融合ＩＧＦ−ｒをコード増”る遺伝子（以下融合ＩＧＦ
−■遺伝子という）を製造する工程。

工程２ 適当なプラスミドに、該融合ＩＧＦ−ｒ遺伝子およびブ
ロモ−クー遺伝子を、プロモーター遺伝子が融合ＩＧＦ
−ｒ遺伝子の上流となるように、挿入することからなる
発現プラスミドを製造する工程。

工程、３ 該発現プラスミドを用いて宿主微生物を形質転換するこ
とからなる形質転換体を製造する工程。

工８４ 該形質転換体を適当な培地中で培養する工程。

工程５ 工８！４で得られる培養液から融合ＩＧＦ−１を単能す
る工程。

工程６ 卯合ＩＧＦ−Ｉを保護ペプチド脱離反応に付すことから
なるＩＧＦ−Ｉを製造する工程。

保護ペプチドは、形質転換体の細胞中のプロテアーゼに
よる分解からＩＧＦ−Ｉを保護するために使用きれ、前
記融合ＩＧＦ−Ｉの保護ペプチド脱離反応によって除去
きれる。

すなわち、融合ＩＧＦ−Ｉは脱離反応によってＩＧＦ−
■を製造するための中間体である。

この目的のために用いられる保護ペプグ・ドとしては、
天然または合成のペプチドから、あるいはそれらの断片
から誘導きれた任意の説な可能なペプチドが挙げられる
が、この発明の発明者は、これらのうち、下記アミノ酸
配列を有するペプチドであるペプチドＣｄを選択するこ
とによって、上記工程４における融合ペプチドの発現効
率が著しく高まることを見出し、この発明を完成した。

ペプチドＣｄのアミノ酸配列は次のでりである。

Ｓｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｖａｌ−八５ｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｉｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅ仁ペプチド
Ｃｄと融合したＩＧＦ−Ｉ（以下、Ｃｄ融合ＩＧＦ−■
という）のアミノ酸配列は次の通りである。

Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｇ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅ　ｒ−Ｓ
ｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｖａ　ｌ−Ａｓ　ｐ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓ　ｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈ　ｅ−
Ｍｅ　ｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ｃｙｓ　−Ｇ　１ｙ−Ａ　１ａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖ
ａ　１−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌｎ−Ｐｈｅ
−Ｖａ　１−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−八５ｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−９ｅｒ−５ｅｒ−８
ｅｒ−Ａｒｇ−八ｒｇ−Ａ］、ａ−Ｐｒｏ−Ｇ１ｎ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｖａｌ−Ａｓ　ｐ−Ｇ　ｌｕ−
Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓ　５ｒ−Ｃｙｓ　
−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−
Ｍａｔ−Ｔ１０１Ｇｌｕ−八１ａ−ＰｒＯ−Ｌｅｕ−Ｌ
　ｙＳ−ＰｔＯ−Ａ１ａ７Ｘ、ｒ　ｙＳ−８ｅｒ−へ１
ａＣｄｉ合ＩＧＦ−Ｉをフードする遺伝子（以下Ｃｄ融
合ＩＧＦ−１遺伝子という）は次の通りである。

１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｎｏ　　。

Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａ、ｓｎ　Ｌｙｓ　
Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ５’−ＡＴＧ−ＴＴＣ
−ＴＡＣ−ＴＴＣ−ＡＡＣ−ＡＡＡ−ＣＣＧ−ＡＣＣ−
ＧＧＣ−ＴＡＴ−３’−ＴＡＣ−ＡＡＧ−ＡＴＧ−ＭＧ
−ＴＴＧ−ＴＴＴ−ＧＧＣ−ＴＧＧ−ＣＣＧ−Ａ、ＴＡ
−Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　
Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　工１ｅ　Ｖ
ａｌＥｃｏＲＸ　　３０　　　　ＡｖａＩ工Ａｓｐ　Ｇ
ｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｍｅ
ｔ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ　ＴｈｒＬｅｕ　Ｃｙｇ　
Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａ
ｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｖａ１Ｃｙｓ　　Ｇｌ
ｙ　Ａｓｐ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　　Ｔｙｒ　
　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　
　ＧｌｙＴｙｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａ
ｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｙ　ｌ１ｅＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−へＧＣ−ＴＣＴ−
ＣＧＴ−ＣＧＣ−ＧＣへ−ＣＣＧ−ＣＡＧ−へＣＴ−Ｇ
ＧＴ−へＴＣ−ＡＴＡ−ＣＣＧ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−ＡＧ
Ａ−Ｇ　ＣＡ−ＧＣＧ−Ｃに；Ｔ−ＧＧＣ−ＧＴＣ−Ｔ
ＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡＧ−Ｖａｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｃｙ
ｓ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　ＣｙＳＡｓｐ　
Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＡｒｇＧＴＡ　−ＧＡＣ−Ｇ　Ｍ　−
ＴＧＣ−ＴＧＴ−ＴＴＴ−ＣＧＴ−ＴＣＴ−ＴＧＣ−Ｇ
ＡＴ−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＣＡＴ−ＣＴＧ−ＣＴ
Ｔ−ＡＣＧ−ＡＣＡ−ＡＡＡ−ＧＣＡ−八ＧＡ−ＡＣＧ
−ＣＴＡ−ＧＡＧ−ＧＣＧ−ＧＣＡ−ｇｏ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
０Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　
Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｓ
ｅｒ１ａ ＧＣＧ−３’ ＣＧＣ−５’ 前記Ｃｄ融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子はＩＧＦ−Ｉをコードす
る遺伝子（以下、Ｔ、ＧＦ−Ｉ遺伝子という）の上流に
ペプチドＣｄをコードする遺伝子（以下、Ｃｄ遺伝子と
いう）が結合したものである。

Ｃｄ融合ＩＧＦ−１遺伝子は、常法により合成法で類５
コすることもできるが、公知のプラスミドから適当な制
限酵素で切り出したフラグメントをライゲルジョンする
ことによっても得ることができる。

すなわち、特開昭６２−６６８９号公報で公知のプラス
ミドｐｃＬａＨｔｒｐｓｄ　ｆ！−ＥｃｏＲＩおよびＢ
ａｍＨＩで開裂して得られる大きい方のフラグメントと
、特開昭６１−１３９６号公報で公知のプラスミドｐＬ
Ｈ５ｄＭｍｔｒｐからＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切
り出した小さい方のフラグメントをライゲーションして
得られるプラスミドｐＣｄＳＭｔｒｐ中に得ることがで
きる。プラスミドｐＣｄＳＭｔｒｐはそれ自体、発現プ
ラスミドであるので、そのまま適当な宿主微生物を形質
転換して形質転換体を得、Ｃｄ融合ＩＧＦ−１の生産に
用いてもよいし、あるいは適当な制限酵素、例えばＣ１
ａＩおよび３ａｍＨＩで切り出して、別の発現プラスミ
ドに導いてもよい。

かくして得られるＣｄ融合ＩＧＦ−１遺伝子の一例とし
て、プラスミドｐＣｄＳＭｔｒｐをＣ１ａＩおよびＢａ
ｍＨＩで切り出した遺伝子のＤＮＡ配列は次の通りであ
る。

Ｃ１ａＩ　　　　　　　ｌ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０Ｍｅｔ　
Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｙ　ＴｙｒＣＧＡＴＡＡＡ−ＡＴＧ−ＴＴＣ
−ＴＡＣ−ＴＴＣ−ＭＣ−ＭＡ−ＣＣＧ−八ＣＣ−ＧＧ
Ｃ−ＴＡＴ−ＴＡＴＴＴ−ＴＡＣ−ＭＧ−ＡＴＧ−ＡＡ
Ｇ−ＴＴＧ−ＴＴＴ−ＧＧＣ−ＴＧＧ−ＣＣＧ−ＡＴＡ
−Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　
Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ＴＭ　Ｇｌｙ　工Ｉｓ　Ｖａ
ｌＧＧＣ−ＴＣＣ−ＡＧＣ−ＴＣＴ−ＣＧＴ−ＣＧＣ−
ＣＣＡ−ＣＣＧ−ＣＡＧ−ＡＣＴ−ＧＧＴ−ＡＴＣ−Ｇ
ＴＡ−ＣＣＧ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−ＡＧＡ−ＧＣＡ−ＧＣ
Ｇ−ＣＧＴ−ＧＧＣ−ＧＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡＧ
−ＣＡＴ−ＥｃｏＲＩ　　３０　　　　Ａｖａエエハｓ
ｐ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　　Ｇｌｕ
　　Ｐｈｅ　　Ｍｅｔ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ
　　ＴｈｒＧＡＣ−ＧＡＧ−ＧＧＴ−ＧＧＣ−ＧＡＴ−
ＧＭ−ＴＴＣ−ＡＴＧ−ＧＧＴ−ＣＣＴ−ＧＡＡ−ＡＣ
Ｔ−ＣＴＧ−ＣＴＣ−ＣＣＡ−ＣＣＧ−ＣＴＡ−ＣＴＴ
−ＭＧ−ＴＡＣ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−ＣＴＴ−ＴＧＡ−Ｌ
ｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａ
ｌ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ
ＣＴＧ−’ｒＧＣ−ＧＧＣ−ＧＣＴ−ＧＡＡ−ＣＴＧ−
ＧＴＴ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＧ−ＣＡＡ−’ｒＴＴ−
ＧＴＡ−ＧＡＣ−ＡＣＧ−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴＴ−Ｇ
ＡＣ−ＣＭ−ＣＴＧ−ＣＧＡ−ＧＡＣ−ＧＴＴ−八ＡＡ
−ＣＡ’ｌＦ’−Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇ
ｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　ＬｙＳＰｒｏ
　Ｔｈｒ　ＧｌｙＴＧＴ−ＧＧＴ−ＧＡ、Ｔ−ＣＧＴ−
ＧＧＴ−ＴＴＣ−ＴＡＣ−ＴＴＣ−ＭＣ−ＡＡＡ７ｃｃ
ｃ−ＡＣＣ−ＧＧＣ−ＡＣＡ−ＣＣＡ−ＣＴＡ−ＧＣＡ
−ＣＣＡ−ＡＡＧ−ＡＴＧ−ΔＡＧ−Ｔ’ｒＧ−ＴＴＴ
−ＧＧＣ−ＴＧＧ−ＣＣＧ−Ｔｙｒ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　八ｒｇ　　Ａｌ
ａ　　Ｐｒｏ　　Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　工１
ｅＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＡＧＣ−ＴＣＴ−ＣＧＴ−
ＣＧＣ−ＧＣＡ−ＣＣＧ−ＣＡＧ−ＡＣＴ−ＧＧＴ−Ａ
ＴＣ−ＡＴＡ−ＣＣＧ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−ＡＧＡ−ＧＣ
Ａ−ＧＣＧ−ＣＧＴ−ＧＧＣ−ＧＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ
−ＴＡＧ−Ｖａｌ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　
Ｃｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ａｒｇ　　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｓ
ｐ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　ＡｒｑＧＴＡ−ＧＡＣ−Ｇ
ＡＡ−ＴＧＣ−ＴＧＴ−ＴＴＴ−ＣＧＴ−ＴＣＴ−ＴＧ
Ｃ−ＧＡＴ−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＣＧＴ−ＣＡＴ−ＣＴＧ
−ＣＴＴ−ＡＣＧ−ＡＣＡ　−ＡＡＡ　−ＧＣＡ　−Ａ
ＧＡ−ＡＣＧ−ＣＴＡ、−ＧＡＧ−ＧＣＧ　−ＧＣＡ　
−Ｔ、ｅｕ　　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　　Ａ
ｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　八
ｌａ　　Ｌｙｓ　　５ｅｒＣＴＧ　−ＧＡＡ　−ＡＴＧ
−ＴＡＣ−ＴＧＴ−ＧＣＴ−ＣＣＡ　−ＣＴＧ　−ＡＡ
Ｇ　−ＣＣＡ−ＧＣＡ　−ＭＡ　−ＴＣＣ−ＧＡ　Ｃ−
ＣＴＴ　−ＴＡＣ−ＡＴＧ−ＡＣＡ−ＣＧＡ−ＧＧＴ−
ＧＡＣ−ＴＴＣ−ＧＧＴ　−ＣＧ　Ｔ　−Ｔ’ＴＴ−Ａ
ＧＧ　−１０１ｓｔ、ｏｐ　ｓ七ｏｐ　ＢａｍＨ工１ａ ＧＣＧ−ＴＧＡ−ＴＡＧ−３’ ＣＧＣ−ＡＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’前記の工稈２
において、用いられるブロモ−クー遺伝子とは、詳しく
はプロモーター・オペレーター領域をもつ遺伝子であっ
て、ブロモ−クー、オペレーターおよび例えばＡＡＧＧ
、ＡＧＧＡ、　ＧＡＧ、ＡＧＧＡ、　ＧＡＧＧなどのシ
ャイン・ダルガノ配列（以下、ＳＤ配列という）を含有
する。　Ｃｄ融合ＬＧＦ−Ｉ遺伝子は５’−（［には、
例えば、ＡＴＧである開示コドン、３′　−側には、例
えばＴＧＡ、　ＴＡＧなどの終示ゴドンをもつことが必
須である。開示、コドンのＡＴＣはそれ自体保護ペプチ
ドの先頭のアミノ醸であるメグーオニンをフードする。

この目的に用いうるプロモーター遺伝子としては、Ｃｄ
融合ＩＧＦ−Ｔ遺伝子を発現芒せ得るものであれば何で
もよいが、その好適な例としては、例えば合成ｔｒｐプ
ロモーターエ、合成しｒｐプロモーター■およびそれら
が１〜３連となったものなどが挙げられる。

合成ｔｒｐプロモーターエ遺伝子および合成ｔｒｐプロ
モーター■遺伝子のＤＮＡ配列は次の通りである。

合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子： ＥｃｏＲ工 ）Ｔｐａ工 ＴＴＣＣＣＡＴＡＧＣＴＴＡＡ 合成ｔｒｐプロモーター■遺伝子： ＥｃｏＲ工 Ｈｐａ工 ＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＭＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴ
ＴＭＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴ−ＡＣＡ
ＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＡＧＴＡＧＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴ
ＴＧＡ、ＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣ八−合成ｔ
ｒｐプロモータ・Ｉ　３ｉ伝子の製法は上述の特開昭６
１（３９６号公報に、また合成ｔｒｐプロモーター■遺
伝子の製法は特開昭６２−６６８９号公報に開示されて
いる３発現プラスミドの製造に用いるプラスミドとして
はＣｏ１Ｅ１プラスミド、ｆ列えはＰＢＲ３２２などが
挙げられる。

適当な宿主微生物としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ）（以下、Ｅ、　ｃｏｌｉという）、例
えばＥ、　ｃｏｌｉＨＢＩＯＩ　（ＡＴＣＣ３３６９４
）　、　Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　２９４（ＡＴＣＣ３１４
４６）などが挙げられる。

プロモーター遺伝子およびＣｄ融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を
適当なプラスミドと、所望により適当なりＮＡ断片（た
とえばリンカ−１他の制限、部位など）を用いて、常法
（たとえば制限酵素による消化、Ｔ４ボリタクレオチド
キナーゼを用いてのホスホリル化、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いてのライゲーションなど）により順次、環状に連
結することにより、発現プラスミドを得ることができる
。

次いで発現プラスミドを常法（たとえば形質転換、顕微
注射など）により宿主微生物に挿入することにより、形
質転換体を得ることができる。

この発明の方法によってＣｄＦＡ合ＩＧＦ−Ｉを製造す
るには、このようにして得た発現プラスミド含有形質転
換体を栄養培地中で培養する。

栄養培地は戻素源（たとえばグルコース、グリセリン、
マンニトール、フルクトース、ラクト−スなど）および
無機または有機の窒素源（硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、カゼイン加水分Ｍ物、酵母エキス、ポリペプ
トン、バク（・トリプトン、牛肉エキスなど）を含有す
る。所■により、他の栄′５＋２源［たとえば無機塩類
（たとえばリン醋−ナトリウムまたはカリウム、リン酸
水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム
、２塩化カルシウムなど）、ビタミン類（たとえばビタ
ミンＢ１など）、抗生物質（たとえばアンピシリンなど
）など］を培地に加えてもよい。

形質転換体の培養は一般に、ｐ）１５．５〜８．５（好
ましくはｐＨ７〜７．５）、１８〜４０℃（好ましくは
２５〜３８℃）で、５〜５Ｃ時間にわたって行え、ばよ
い。

こうして生産されたＣｄ融合ＩＧＦ−１は培養された形
質転換体の細胞中に存在するのが普通であるので、細胞
を濾過または遠心分離によって集め、それらの細胞壁お
よび／または細胞膜を常法（たとえば超音波処理および
／またはリソチーム処理など）により破壊して、デブリ
スを得る。このデブリスから、天然または合成の蛋白を
単は、精製するのに一般に採用される常法［たとえば適
当な溶媒（たとえば８Ｍ床素水溶液、１６　Ｍ塩酸グア
ニジンなど）を用いての蛋白の溶解、透析、ゲル濾過、
カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ
ーなど］により、Ｃｄ融合ＩＧＦ−１を単離、精製でき
る。

本発明における保護ペプチド脱離反応は、この反応に悪
影響を及ぼ芒ない慣用の溶媒中で、緩和な条件下に実施
することができる。

この明細書において、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式 を意味し、５′−末端Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式 を意味し、３′−末端Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式 を意味する。

［発明の効果コ ペプチドＣｄを保護ペプチドとして用いることにより、
上記工程４における融合ペプチドの発現効率が著しく高
まり、従来法に比べて、単位培養液量から最終的に得ら
れるＩＧＦ−Ｉの量を高めることができる。

［実施例］ 以下、実施例により、この発明をよりＳ羊細（こ言見明
゛する。

ｇ　　プラスミドｐｃｄｓ丙ｔｒｐの構築プラスミドｐ
ｃＬａＨｔｒｐｓｄ（ＩＯＫ　＞　（特開昭６２−６６
８９号公報に記載されているＥ、　ｃｏｌｉ　Ｈｌを用
１．％て、゛屑法ニヨリプラスミＦ　ｐｃＬａＨｔｒｐ
ｓｄを４％ｆこ、なお、Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｈｌを得るための原料となるプラスミドｐ７
ｔｒｐを含有するＥ、　ｃｏｌｉ　Ｆ−９はＦＥＲＮ　
ＢＰ−９０５として微生物工業技イホｒ研究所に寄託さ
れてｌ、Ｓる）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し
た。０．８％アガロースゲル電気泳動で精製して、大き
し）方のフラグメント（約ａ、３ｋｂｐ、　５．０＜）
をイリた。

一方、プラスミドｐＬＨ５ｄＭｍｔｒｐ　（特開昭６１
−１３９６号公報に記載諮れているＥ、　ｃｏｌｉ　Ｆ
−６を月１０で、常法によりプラスミドｐＬＨ５ｄＭｍ
ｔｒｐを得た。な」づ、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｆ−６はＦＥ
Ｒｌ（ＢＰ−７２９として微生物工業Ｉ支＜Ｒ研究所に
寄託きれている）　（１０４）をＥｃｏＲＩ才ｊよびＢ
ａｍＨＩで切断して、２２４　ｂｐのＩＧＦ−Ｉ遺伝子
を含むフラグメント（３００ｎｇ　）を得た。このフラ
グメントを先に得た約４．３ｋｂｐのフラグメンｌ□　
（２００ｎｇ　）と合わせてライゲーション緩衝液［５
０ｍＭ丁ｒｉｓＨｃ１（ｐｉ（７，６）、１０ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ２．２０ｍ旺チオスレイトール、１　ｍＭ　ＡＹ
Ｐ、１ｍＭスペルミジンおよび５０ｘ牛血清アルブミン
からなるライゲーション緩衝液コ（２０ｍ　＞に移し、
Ｔ４リガーゼ（宝酒造製造、３５０−”＋４位）を加え
て、１５℃で３０分インキュベイトした。得られたライ
ゲーション混合物で、Ｅ、　ｃｏｌｉ　）ＩＢｌｏＬを
形質転換した。アンピシリン耐性をマーカーとして目的
とする形質転換体 （Ｅ、　ｃｏｌｉ　）ＩＢＩＯＩ−ｐｃｄｓＭ−ｔｒｐ
）を選び出し、さらに選ばれた形質転換株から、プラス
ミドを抽出し２、制限酵素分析により、そのプラスミド
が目的とするプラスミド（ｐＣｄＳＭｔｒｐ　）である
ことを確認した。

制限酵素分析：　Ｈｐａｌ　−Ｂａｍ）ｔＩ　１０７ｂ
ｐ、　３４８ｂｐ；Ｃ１ａＩ　−ＥｃｏＲＩ　９２６ｂ
ｐ；　ＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨＩ　２２４ｂｐ；Ｃ１ａＩ
　−ＢａｍＨｚ　３１６ 発現ブラスミＦ　ｐＣｄＳＭｔｒｐの構築の模式図を第
１図に示す゛。

実施例２　プラスミドｐＣｄＳＭｔｒｐを含有するＥ、
　ｃｏｌｉｌ（ＢＩＯＩ（７）形質転換体（Ｅ、　ｃｏ
ｌｉ　ＨＢｌｏｌ−ｐＣｄＳＭｔｒｐ）によるペプチド
Ｃｄ融合ＩＧＦ−１の発現 実施例１で得た形質転換体Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ
−ｐＣｃｌＳＭｔｒｐをアンピシリン５ｏｓｇ／戒を含
有するしプロス［バクト・トリプトン（ＤＩＦＣＯ製）
１０ｇ、パクト・酵ｆｆＪ　エキスＣＭＦＣＯ製）　５
　ｇ、　ＮａＣ１５ｇ、水ＩＩ２、ｐＨ７，２〜７．４
１５　ｍＱに移し、３７℃で８時間培養した。得られた
培養液の全量をさらにアンピシリン５ｋＰｇ／ｍＱを含
有するＬブａ　ス１００ｍ０．に移し、３７°Ｃで一夜
培養した。得られた培Ａ液のうち２０ｍ１をＭ９ＣＡブ
ロス（カザミノ酸０，５２≦、グル：１−ス０．２％、
グ・アミンｓｏ＜／ｍ’、アンピシリン２５＋Ｉｇ／ｍ
ｕ；４００ｍＱ　）に移し、３７℃で培養した。　２．
５〜３．０時間後０Ｄ６ｏ（、（ＧＯＯｒｕｎにおける
吸光度）が０４〜０．６となったとき、β−インドール
アクリルｍ（２ｍｇ／ｍＱ　；　２　ｍＱ　）を添加し
た。約３時間後、ｏＤ６ｏｏは、１６〜２．０となり増
殖は平衡に達した＊　１９養液を遠心（４℃、８．００
０ｒｐｍ、１０分）し、得られる湿菌体を１０ｍＭリン
酸緩衝液−ＥＤＴＡ　Ｅ　ＮｔＣｌ（８，０ｇ　）、Ｋ
ＣＩ（０，２ｇ　＞、Ｎａ２ＨＰＯ，・１２Ｈ２０（２
，９ｇ　）、ＫＩ（２ＰＯ４（０，２ｇ）およびＥＤＴ
Ａ（３，７３ｃ　）を水に溶解し、ＮａＯＨでｐ）＋８
．０とし、全量を１！とする）Ｂ＋ｎＱに懸？”Ｍした
。

懸濁液を０°Ｃで超音波処理し、遠心（４°Ｃ２１５，
０ＯＯｒｐ＋ｎ、　２０分）して、上清を除いた。

残渣をＧｎ・ＨＣＩ緩衝液（６Ｍグアニジン塩酸塩、１
０ｍＭＰＢＳ−ＥＤＴＡ、　２ｍＭβ−メルカプ）・エ
タノール）８ｍａに懸濁した。再び、０゛Ｃで超音波処
理し、その処理液を遠心して得た上清液を脱イオン水（
２ＯＮ）に対して透析した。

透析液にβ−メルカプトエタノール（４００４）を加え
て、０℃で３０分放置後、遠心して沈殿を集めた。得ら
れた沈殿物をアセトンで洗浄した後、減圧乾燥してペプ
チドＣｄ融合Ｔ、ＧＦ−Ｉの粗製物（４２ｍｇ）を得た
。

【図面の簡単な説明】

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ペプチドＣｄと融合したヒトインスリン様成長因
   子Ｉをコードする遺伝子を含有する発現プラスミド。
2. （２）プラスミドｐＣｄＳＭｔｒｐである特許請求の範
   囲第１項に記載の発現プラスミド。
3. （３）ペプチドＣｄと融合したヒトインスリン様成長因
   子Ｉをコードする遺伝子を含有する発現プラスミドを用
   いて宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体を培
   地に培養し、得られる培養液からペプチドＣｄと融合し
   たヒトインスリン様成長因子Ｉを分離採取し、次いで、
   該融合ペプチドを保護ペプチド脱離反応に付し、ヒトイ
   ンスリン様成長因子Ｉを得ることを特徴とするヒトイン
   スリン様成長因子Ｉの製造法。
4. （４）発現プラスミドがｐＣｄＳＭｔｒｐであり、宿主
   微生物が大腸菌である特許請求の範囲第３項に記載のヒ
   トインスリン様成長因子Ｉの製造法。
5. （５）下記アミノ酸配列を有するペプチドＣｄを融合し
   たヒトインスリン様成長因子Ｉ。 【アミノ酸配列があります】