JPH04179486A - 組換え大腸菌の培養方法 - Google Patents
組換え大腸菌の培養方法Info
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- JPH04179486A JPH04179486A JP30625690A JP30625690A JPH04179486A JP H04179486 A JPH04179486 A JP H04179486A JP 30625690 A JP30625690 A JP 30625690A JP 30625690 A JP30625690 A JP 30625690A JP H04179486 A JPH04179486 A JP H04179486A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
主粟上■肌里分！
本発明は、ｐＵＣプラスミドの複製開始点（Ｏｒｉ）を
有するプラスミドで形質転換された組換え大腸菌を効率
よく培養し、目的蛋白質を大量に生産する方法に関する
。
有するプラスミドで形質転換された組換え大腸菌を効率
よく培養し、目的蛋白質を大量に生産する方法に関する
。
従米夏肢歪
ｐＵＣプラスミドの複製開始点（Ｏｒｉ）を有するプラ
スミドで形質転換された組換え大腸菌を培養して目的蛋
白質を生産させる場合、ｐＵＣプラスミドの複製開始点
（Ｏｒｉ）が温度依存性であるため、培養温度が低いと
プラスミドのコピー数が少なく目的蛋白質の発現がほと
んど認められないことが知られている（例えば、Ｍｉｋ
ｉ、 Ｔ、 ｅｔ ａｌ、（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＋ １．３２７−３３２）。
スミドで形質転換された組換え大腸菌を培養して目的蛋
白質を生産させる場合、ｐＵＣプラスミドの複製開始点
（Ｏｒｉ）が温度依存性であるため、培養温度が低いと
プラスミドのコピー数が少なく目的蛋白質の発現がほと
んど認められないことが知られている（例えば、Ｍｉｋ
ｉ、 Ｔ、 ｅｔ ａｌ、（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＋ １．３２７−３３２）。
そのため、目的蛋白質を効率よく発現させるためには、
組換え大腸菌を３７℃以上で培養することが行なわれて
いるが、この場合はプラスミドのコピー数が増幅して培
養初期から目的蛋白質の発現が始まるため、菌の増殖が
阻害され、十分な菌体量が得られず、その結果、目的蛋
白質の大量生産は困難であった。
組換え大腸菌を３７℃以上で培養することが行なわれて
いるが、この場合はプラスミドのコピー数が増幅して培
養初期から目的蛋白質の発現が始まるため、菌の増殖が
阻害され、十分な菌体量が得られず、その結果、目的蛋
白質の大量生産は困難であった。
が１ しよ゛と るテ
本発明は、ｐＵＣプラスミドの複製開始点（Ｏｒｉ）を
有するプラスミドで形質転換された組換え大腸菌を目的
蛍白質の発現能を維持した状態で効率的に培養すること
により目的蛍白質を大量に生産する方法を提供するもの
である。
有するプラスミドで形質転換された組換え大腸菌を目的
蛍白質の発現能を維持した状態で効率的に培養すること
により目的蛍白質を大量に生産する方法を提供するもの
である。
′ るための
本発明者らは、上述の課題を解決すべ（研究を重ねた結
果、ｐＵｃプラスミドの複製開始点（Ｏｒｉ）を有する
プラスミドで形質転換された組換え大腸菌の培養の温度
を２０〜３５℃で開始し、対数増殖期の途中から、プラ
スミドのコピー数が増幅する温度である３７℃以上に上
昇させることにより、単位菌体量あたりの目的蛍白質の
発現量を高くすることができるだけでなく、高密度の菌
体量を得ることができることを見出した。その結果、目
的蛋白質を大量に生産することができることを見出し、
本発明をなすに至った。
果、ｐＵｃプラスミドの複製開始点（Ｏｒｉ）を有する
プラスミドで形質転換された組換え大腸菌の培養の温度
を２０〜３５℃で開始し、対数増殖期の途中から、プラ
スミドのコピー数が増幅する温度である３７℃以上に上
昇させることにより、単位菌体量あたりの目的蛍白質の
発現量を高くすることができるだけでなく、高密度の菌
体量を得ることができることを見出した。その結果、目
的蛋白質を大量に生産することができることを見出し、
本発明をなすに至った。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明に使用するプラスミドとしては、ρＵＣプラスミ
ドの複製開始点（Ｏｒｉ）を有するプラスミドであれば
いずれにも通用できる。例えば、本発明者らによって既
にＨｇされているブターアデニレートキナーゼ発現ヘク
ター（特開昭６４−５１０８８号）、ヒトーアンジオジ
ェニン発現ヘクター（特願平ｌ−２１２４４２号） 、
血小板ファクター４発現ヘクター（特願平１−２７１２
４９号）、ＴＣ；Ｆ−α発現ヘクター（特願平１−２７
１２５０号）及びヒルジン発現ヘクター（特願平２−１
９７０６９号）などを例示することができる。
ドの複製開始点（Ｏｒｉ）を有するプラスミドであれば
いずれにも通用できる。例えば、本発明者らによって既
にＨｇされているブターアデニレートキナーゼ発現ヘク
ター（特開昭６４−５１０８８号）、ヒトーアンジオジ
ェニン発現ヘクター（特願平ｌ−２１２４４２号） 、
血小板ファクター４発現ヘクター（特願平１−２７１２
４９号）、ＴＣ；Ｆ−α発現ヘクター（特願平１−２７
１２５０号）及びヒルジン発現ヘクター（特願平２−１
９７０６９号）などを例示することができる。
また、本発明に使用するＭｉ換え大腸菌としては、上述
のプラスミドで形質転換された大腸菌であればいずれを
使用してもよい。例えば、Ｅ、 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９
ｐＭＡＫ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４５３）、Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９ ｐＭＡＧＮｌ（ＦＥＩＩＭ ＢＰ
−２５０４）、Ｅ、 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｐ門ＡＰ
Ｆ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６１０）、 Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ ＪＭ１０９ ｐＭＡＫ丁ＧＦ α（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２６１１）、Ｅ、 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９
ｐＭＴＡＫＨＶＩ（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５３８）、Ｅ、
ｃｏｌｉＪＭ１０９ ｐＭＴＡＫＨＶＩ Ｍ２（ＦＥ
ＩＩＩＭ ０Ｐ−２９８８） 、ε、 ｃｏｌｉ
川１０９ ｐＭＴＡＫＨＶＩ Ｍ３（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２９８９）、Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ｐＭＴＡ
ＫＨν３（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５４０）、Ｅ、 ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０９ ｐＭＴｓＨＶ１ｃ３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３１０４）などを例示することができる。
のプラスミドで形質転換された大腸菌であればいずれを
使用してもよい。例えば、Ｅ、 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９
ｐＭＡＫ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４５３）、Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９ ｐＭＡＧＮｌ（ＦＥＩＩＭ ＢＰ
−２５０４）、Ｅ、 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｐ門ＡＰ
Ｆ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６１０）、 Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ ＪＭ１０９ ｐＭＡＫ丁ＧＦ α（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２６１１）、Ｅ、 ｃｏｌｉ ＪＭ１０９
ｐＭＴＡＫＨＶＩ（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５３８）、Ｅ、
ｃｏｌｉＪＭ１０９ ｐＭＴＡＫＨＶＩ Ｍ２（ＦＥ
ＩＩＩＭ ０Ｐ−２９８８） 、ε、 ｃｏｌｉ
川１０９ ｐＭＴＡＫＨＶＩ Ｍ３（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２９８９）、Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ｐＭＴＡ
ＫＨν３（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５４０）、Ｅ、 ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０９ ｐＭＴｓＨＶ１ｃ３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３１０４）などを例示することができる。
ｍ換え大腸菌の培養に使用する培地としては、例えば、
グルコース、シュークロースのような炭素源、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、カザミノ酸のような窒素
源、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛のような無機塩を含む培地が
用いられる。
グルコース、シュークロースのような炭素源、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、カザミノ酸のような窒素
源、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛のような無機塩を含む培地が
用いられる。
酵母エキス、トリプトンのような天然物からなる培地を
使用してもよい。また、必要に応じて、アンピシリン、
テトラサイクリンのような抗生物質を添加することもで
きる。
使用してもよい。また、必要に応じて、アンピシリン、
テトラサイクリンのような抗生物質を添加することもで
きる。
培養温度は、培養開始時から対数増殖期の途中までは、
プラスミドの増幅が起こらない、したがって目的蛋白質
の発現の起こらない温度である２０〜３５℃１好ましく
は２６〜３２℃に制御する。菌体の増殖が、対数増殖期
に達した段階で、培養温度を３７℃以上、好ましくは３
７〜４２℃に上昇させて以後この温度に制御して培養を
継続する。
プラスミドの増幅が起こらない、したがって目的蛋白質
の発現の起こらない温度である２０〜３５℃１好ましく
は２６〜３２℃に制御する。菌体の増殖が、対数増殖期
に達した段階で、培養温度を３７℃以上、好ましくは３
７〜４２℃に上昇させて以後この温度に制御して培養を
継続する。
培養中の培地のｐＨは６〜９、好ましくは７〜８が適し
ており、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニ
アなどを用いて調節することができる。
ており、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニ
アなどを用いて調節することができる。
また酸素を混合した空気を供給するか、あるいは培養槽
を加圧するなどの方法により、培養中の培養液の溶存酸
素濃度を３ ｐｐｍ以上に保持しつつ培養すると、より
高密度の菌体量を得ることができ好ましいが、特に限定
するものではない。
を加圧するなどの方法により、培養中の培養液の溶存酸
素濃度を３ ｐｐｍ以上に保持しつつ培養すると、より
高密度の菌体量を得ることができ好ましいが、特に限定
するものではない。
上述のような方法によれば、単位菌体量あたりの目的蛍
白質の発現量を高くすることができるだけでなく、高密
度の菌体量を得ることができ、したがって、目的蛍白質
を効率的かつ大量に生産することが可能である。
白質の発現量を高くすることができるだけでなく、高密
度の菌体量を得ることができ、したがって、目的蛍白質
を効率的かつ大量に生産することが可能である。
以下、実施例により本発明を説明する。
実施例１
（１） ヒルジン発現ヘクターｐＭＴＡＫＨＶ１の調
製（特願平２−１９７０６９号参照） （ｉ）プラスミドｐＭＴ１の調製 第１図に示すように、市販のプラスミドｐＫＫ ２２３
−３（ファルマシア社製）を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及びＮ
ｒｕ １で切断したＰｔａｃサイト部と市販のρＵＣｌ
３を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及びＰｖｕ Ｉ！で切断した複
製開始点（Ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子を含む
サイト部とをＴ４リガーゼで接合した。これを大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株に導入して培養し、アンピシリン耐性により
スクリーニングして、ｔａｃプロモーターとｐＨｃ１８
の複製開始点（Ｏｒｉ）とを有するベクターを得た。こ
のプラスミドｐＭＫ２とした。第２図に示すように、こ
のプラスミドｐＭＫ２１０ｎｇを３０単位のＥｃｏＲＩ
及びＥｃｏ４７１１［で消化し、ｔａｃプロモーターを
含む断片を除去し、複製開始点を含む断片をアガロース
ゲル電気泳動によって回収した。一方、第３図に示した
ｔｒｐプロモーターの塩基配列をＴＲＰ−１とＴＲＰ−
２とに分割してＤＮＡ合成機で合成した。これらを逆相
Ｃ１８カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによ
り精製し、各々１００１００ｐをアニーリングして二重
鎖ＤＮＡを得た。この断片と前記ｐＭＫ２とをＥｃｏＲ
１及びＥｃ。
製（特願平２−１９７０６９号参照） （ｉ）プラスミドｐＭＴ１の調製 第１図に示すように、市販のプラスミドｐＫＫ ２２３
−３（ファルマシア社製）を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及びＮ
ｒｕ １で切断したＰｔａｃサイト部と市販のρＵＣｌ
３を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及びＰｖｕ Ｉ！で切断した複
製開始点（Ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子を含む
サイト部とをＴ４リガーゼで接合した。これを大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株に導入して培養し、アンピシリン耐性により
スクリーニングして、ｔａｃプロモーターとｐＨｃ１８
の複製開始点（Ｏｒｉ）とを有するベクターを得た。こ
のプラスミドｐＭＫ２とした。第２図に示すように、こ
のプラスミドｐＭＫ２１０ｎｇを３０単位のＥｃｏＲＩ
及びＥｃｏ４７１１［で消化し、ｔａｃプロモーターを
含む断片を除去し、複製開始点を含む断片をアガロース
ゲル電気泳動によって回収した。一方、第３図に示した
ｔｒｐプロモーターの塩基配列をＴＲＰ−１とＴＲＰ−
２とに分割してＤＮＡ合成機で合成した。これらを逆相
Ｃ１８カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによ
り精製し、各々１００１００ｐをアニーリングして二重
鎖ＤＮＡを得た。この断片と前記ｐＭＫ２とをＥｃｏＲ
１及びＥｃ。
４７ｎ［で消化した断片はＴ４ ＤＮＡリガーゼにより
１６℃で一晩反応させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０
９株を形質転換し、ｔｒｐプロモーターとｐＭＫ２の複
製開始点（Ｏｒｉ） とを有するベクターを調製した。
１６℃で一晩反応させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０
９株を形質転換し、ｔｒｐプロモーターとｐＭＫ２の複
製開始点（Ｏｒｉ） とを有するベクターを調製した。
このプラスミドの塩基配列はサンガー等の方法で確認し
、プラスミドｐＭＴ１と命名した。
、プラスミドｐＭＴ１と命名した。
（ｉｉ ） 発現ベクターｐＭＡＫＨＶ１の調製公知の
ブタ−アデニレートキナーゼ発現ベクターｐＭＫＡＫ３
（特開昭６４−５１０８８号公報参照） ｌａｇをｌ
Ｏ単位のＮｃｏ Ｉ及び旧ｎｄｎ［で消化して得られた
ブタ−アデニレートキナーゼの８０番目のメチオニンま
でをコードする遺伝子を含む断片を、アガロースゲル電
気泳動により抽出した。またＨＶ−１遺伝子ヲ有ｔ ；
６７” ラスミＦｐＵＣＨＶ−１１０μｇを３０単位の
Ｎｃｏ １及び旧ｎｄＩ［Ｉで消化し、２１０ｂｐのＨ
Ｖ−１をコードする断片を得た。この断片と上記ｐＭＫ
ＡＫ３をＮｃｏ Ｉ及びＨｉｎｄｌ［［で消化した断片
をリガーゼ緩衝液（６６ｍＭＴｒｉｓ −ＣＩ！、、
ｐＨ７，５、５ｍＭ ＭｇＣ１！、、 、 ５ｍＭ
ＤＴＴ、 １ｍＭＡＴＰ）に溶解し、３００単位
のＴ４０ＮＡリガーゼにより１６℃で一晩反応させた。
ブタ−アデニレートキナーゼ発現ベクターｐＭＫＡＫ３
（特開昭６４−５１０８８号公報参照） ｌａｇをｌ
Ｏ単位のＮｃｏ Ｉ及び旧ｎｄｎ［で消化して得られた
ブタ−アデニレートキナーゼの８０番目のメチオニンま
でをコードする遺伝子を含む断片を、アガロースゲル電
気泳動により抽出した。またＨＶ−１遺伝子ヲ有ｔ ；
６７” ラスミＦｐＵＣＨＶ−１１０μｇを３０単位の
Ｎｃｏ １及び旧ｎｄＩ［Ｉで消化し、２１０ｂｐのＨ
Ｖ−１をコードする断片を得た。この断片と上記ｐＭＫ
ＡＫ３をＮｃｏ Ｉ及びＨｉｎｄｌ［［で消化した断片
をリガーゼ緩衝液（６６ｍＭＴｒｉｓ −ＣＩ！、、
ｐＨ７，５、５ｍＭ ＭｇＣ１！、、 、 ５ｍＭ
ＤＴＴ、 １ｍＭＡＴＰ）に溶解し、３００単位
のＴ４０ＮＡリガーゼにより１６℃で一晩反応させた。
これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、目的の
組換え体プラスミドｐＭＡＫＨＶＩをもつ菌株を得た。
組換え体プラスミドｐＭＡＫＨＶＩをもつ菌株を得た。
この菌株は、受託番号微工研条寄第２５３７号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−２５３７）として微生物工業技術研究所に寄
託されている。なお、プラスミドｐＭＩＫＨＶ１の塩基
配列はサンガー等の方法で確認した。
Ｍ ＢＰ−２５３７）として微生物工業技術研究所に寄
託されている。なお、プラスミドｐＭＩＫＨＶ１の塩基
配列はサンガー等の方法で確認した。
（ｉ）プラスミドｐＭＴＡＫＨＶ１の調製上記プラスミ
ドｐＭ７１１μｇを第４図に示すようにｌθ単位の制限
酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌｌｌで切断し、ベクタ一部
分をアガロースゲル電気泳動法により回収した。一方ｐ
ＭＡＫＨＶ１１０μｇを３０単位のＥｃｏＲ１及び旧ｎ
ｄｌ［［で消化し、融合蛋白質をコードする遺伝子断片
をゲルから回収した。この断片と上記ｐＭＴ１のＥｃｏ
ＲＩ及びＥｃｏＲ４７ｍで消化した断片を、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼにより１６℃で一晩反応させた。これを用い
て大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、目的の組換え体プ
ラスミドｐＭＴＡＫＨＶ１をもつ菌株を得た。この菌株
は、受託番号 微工研条寄第２５３８号（ＦＥＲＭＢＰ
−２５３８）として微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。なお、プラスミドｐＭＴＡＫ）ＩＶＩの塩基配列
はサンガー等の方法で確認した。
ドｐＭ７１１μｇを第４図に示すようにｌθ単位の制限
酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌｌｌで切断し、ベクタ一部
分をアガロースゲル電気泳動法により回収した。一方ｐ
ＭＡＫＨＶ１１０μｇを３０単位のＥｃｏＲ１及び旧ｎ
ｄｌ［［で消化し、融合蛋白質をコードする遺伝子断片
をゲルから回収した。この断片と上記ｐＭＴ１のＥｃｏ
ＲＩ及びＥｃｏＲ４７ｍで消化した断片を、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼにより１６℃で一晩反応させた。これを用い
て大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、目的の組換え体プ
ラスミドｐＭＴＡＫＨＶ１をもつ菌株を得た。この菌株
は、受託番号 微工研条寄第２５３８号（ＦＥＲＭＢＰ
−２５３８）として微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。なお、プラスミドｐＭＴＡＫ）ＩＶＩの塩基配列
はサンガー等の方法で確認した。
（２） ヒルジン発現ベクターｐＭＴＡＫＨＶ１形質
転換微生物の培養 ヒルジン発現ベクターｐＭＴＡＫＨＶ１で形質転換して
得たＥ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｐＭＴＡＫＨＶｌ（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２５３８）を第１表の種培養培地５０Ｍ
１を含む５００１ｄ三角フラスコに接種して、３０℃で
１６時間培養して、種菌を調製した。ついで、第１表の
生産用培地１１を含む２１容培養槽（１）〜（５）の５
台にそれぞれ上述の種菌２０ｍを加え、培養を開始した
。
転換微生物の培養 ヒルジン発現ベクターｐＭＴＡＫＨＶ１で形質転換して
得たＥ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ｐＭＴＡＫＨＶｌ（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２５３８）を第１表の種培養培地５０Ｍ
１を含む５００１ｄ三角フラスコに接種して、３０℃で
１６時間培養して、種菌を調製した。ついで、第１表の
生産用培地１１を含む２１容培養槽（１）〜（５）の５
台にそれぞれ上述の種菌２０ｍを加え、培養を開始した
。
以下余白
第 １ 表
１Ｎａｃｌ ０．３ ｇ ０．３ｇ ｉ培
養期間中は酸素を混合した空気を供給することにより、
培養液の溶存酸素濃度を６．５ ｐｐｍにコントロール
した。またｐＨはアンモニア水溶液？、二より７．０に
維持した。培養温度は、培養槽（１）は３７℃１培養槽
（２）〜（４）Ｌこついては３０℃で開始し、１時間お
きにサンプリングして菌体量（６６０ｎｎの吸光度）を
測定した。吸光度が５．１０．１５．２０に達した時点
で、培養槽（２）、（３）、（４）、（５）の培養温度
をそれぞれ３７“Ｃに上昇させて培養を継続し、培養開
始、後１５時間で終了した。培養終了後、各培養槽から
菌体を回収し、乾燥菌体重量を測定した。
養期間中は酸素を混合した空気を供給することにより、
培養液の溶存酸素濃度を６．５ ｐｐｍにコントロール
した。またｐＨはアンモニア水溶液？、二より７．０に
維持した。培養温度は、培養槽（１）は３７℃１培養槽
（２）〜（４）Ｌこついては３０℃で開始し、１時間お
きにサンプリングして菌体量（６６０ｎｎの吸光度）を
測定した。吸光度が５．１０．１５．２０に達した時点
で、培養槽（２）、（３）、（４）、（５）の培養温度
をそれぞれ３７“Ｃに上昇させて培養を継続し、培養開
始、後１５時間で終了した。培養終了後、各培養槽から
菌体を回収し、乾燥菌体重量を測定した。
また、回収菌体をレムリの綴衝液に懸濁し、加熱熔解後
５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分子
置駒１７，０００の位置のハントの強度をデンシトメー
ターで測定することによりヒルジン融合蛋白質の発現量
を求めた。これらの結果を第２表に示した。
５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分子
置駒１７，０００の位置のハントの強度をデンシトメー
ターで測定することによりヒルジン融合蛋白質の発現量
を求めた。これらの結果を第２表に示した。
以下余白
この結果から明らかなように、３７℃で培養を開始する
と全く菌の生育が認められない（培養槽（１））のに対
し、３０℃で培養を開始し対数増殖期に温度を３７“Ｃ
に上昇させると、著量のヒルジンが生産された。また、
菌体が増殖した後（培養槽（（４）及び（５）） 、温
度を３７℃に上昇させると菌体は発育するがヒルジン生
産量は非常に低いがあるいはほとんど認められなかった
。
と全く菌の生育が認められない（培養槽（１））のに対
し、３０℃で培養を開始し対数増殖期に温度を３７“Ｃ
に上昇させると、著量のヒルジンが生産された。また、
菌体が増殖した後（培養槽（（４）及び（５）） 、温
度を３７℃に上昇させると菌体は発育するがヒルジン生
産量は非常に低いがあるいはほとんど認められなかった
。
光肌皇皿果
本発明によれば、ｐＵＣプラスミドの複製開始点（Ｏｒ
ｉ）を有するプラスミドで形質転換された組換え大腸菌
を目的蛋白質の発現能を維持した状態で効率的に培養す
ることが可能であり、種々の目的蛋白質を大量に生産す
ることができる。
ｉ）を有するプラスミドで形質転換された組換え大腸菌
を目的蛋白質の発現能を維持した状態で効率的に培養す
ることが可能であり、種々の目的蛋白質を大量に生産す
ることができる。
第１図、第２図及び第４図は、ｐＵＣプラスミドから本
発明で使用するプラスミドρＭＴＡＸＨＶＩを調製する
概略図を、また第３図は、本発明で使用するｔｒｐプロ
モーターのＤＮＡ配列を示す。 ｒｉ Ｏｒｌ 第１図 ｒ４ ＭＫ２ 第２図 第３図 （ＴＲＰ Ｚ）
発明で使用するプラスミドρＭＴＡＸＨＶＩを調製する
概略図を、また第３図は、本発明で使用するｔｒｐプロ
モーターのＤＮＡ配列を示す。 ｒｉ Ｏｒｌ 第１図 ｒ４ ＭＫ２ 第２図 第３図 （ＴＲＰ Ｚ）
Claims (3)
- （１）ｐＵＣプラスミドの複製開始点（Ｏｒｉ）を有す
るプラスミドで形質転換された組換え大腸菌を培養する
にあたり、２０〜３５℃の温度範囲で培養を開始し、対
数増殖期に培養温度を３７℃以上に上昇させること特徴
とする組換え大腸菌の培養方法。 - （２）ｐＵＣプラスミドの複製開始点（Ｏｒｉ）を有す
るプラスミドがヒルジンまたはその変異体の発現ベクタ
ーである請求項（１）に記載の組換え大腸菌の培養方法
。 - （３）組換え大腸菌がＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９ｐＭＴＡ
ＫＨＶ１（ＦＥＲＭＢＰ−２３５８）である請求項（１
）に記載の組換え大腸菌の培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2306256A JP2528381B2 (ja) | 1990-11-14 | 1990-11-14 | 組換え大腸菌の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2306256A JP2528381B2 (ja) | 1990-11-14 | 1990-11-14 | 組換え大腸菌の培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04179486A true JPH04179486A (ja) | 1992-06-26 |
| JP2528381B2 JP2528381B2 (ja) | 1996-08-28 |
Family
ID=17954886
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2306256A Expired - Fee Related JP2528381B2 (ja) | 1990-11-14 | 1990-11-14 | 組換え大腸菌の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2528381B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002052027A1 (fr) * | 2000-12-22 | 2002-07-04 | Nippon Soda Co., Ltd. | Procede de production d'une substance a l'aide d'un catalyseur microbien |
-
1990
- 1990-11-14 JP JP2306256A patent/JP2528381B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.CHEM.ENG.JAPAN=1986 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002052027A1 (fr) * | 2000-12-22 | 2002-07-04 | Nippon Soda Co., Ltd. | Procede de production d'une substance a l'aide d'un catalyseur microbien |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2528381B2 (ja) | 1996-08-28 |
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