BR112017016301B1

BR112017016301B1 - Promotor, sequência reguladora de expressão, vetor, célula hospedeira de microrganismo transformado e método de produção de um produto alvo

Info

Publication number: BR112017016301B1
Application number: BR112017016301-2A
Authority: BR
Inventors: Seung Bin Lee; Hyun Ae Bae; Ji Hye Lee; Young Lyeol Yang
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2015-01-29
Filing date: 2016-01-15
Publication date: 2023-12-12
Also published as: TW201629217A; UA116753C2; EP3250692B1; BR112017016301A2; AR103553A1; PH12017501365A1; AU2016212931A1; AU2016212931B2; DK3250692T3; CN106459977A; WO2016122146A8; EP3250692A1; RU2017128034A; KR101632642B1; JP6469874B2; CN106459977B; CA2975374A1; SG11201705765VA; RU2692646C2; RU2017128034A3

Abstract

NOVO PROMOTOR E USOS DO MESMO. São fornecidos um novo promotor e um método para produção de um produto alvo utilizando os mesmos, em que o novo promotor é sintetizado para ser expresso em uma variedade de microrganismos diferentes e para exibir efeitos de expressão muito fortes.

Description

REFERÊNCIA-REMISSIVA AO PEDIDO CORRELATO

[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Coreano N° 10-2015-00014587, depositado em 29 de janeiro de 2015, no Escritório Coreano de Propriedade Intelectual, cuja divulgação é incorporada no presente documento em sua totalidade para referência.

[0002] Uma ou mais modalidades exemplificativas se referem a um novo promotor e a um método de produção de um produto alvo utilizando o mesmo.

TÉCNICA ANTERIOR

[0003] De modo a produzir os produtos alvos, por exemplo, materiais de L-aminoácidos, ácidos orgânicos ou de ácido nucleico, com alto rendimento usando microrganismos, há uma necessidade de controlar seletivamente a expressão de genes relacionados a uma série de processos metabólicos nos microrganismos. Em particular, há uma necessidade de aumentar a expressão dos genes alvo envolvidos em uma via biossintética dos produtos alvos e, por exemplo, pode ser realizada uma modificação da sequência reguladora de expressão. Tal modificação da sequência reguladora de expressão pode incluir, por exemplo, uma substituição de um promotor nativo por um promotor forte, uma modificação de um promotor nativo ou uma modificação de uma sequência de Shine- Dalgarno (SD). A substituição de um promotor nativo por um promotor forte foi mais utilizada e, a este respeito, é considerada essencial para desenvolver um promotor útil.

[0004] Contudo, os promotores fortes conhecidos na técnica são limitados e podem ser expressos apenas em um microrganismo limitado. Em alguns casos, os promotores fortes podem deixar de exibir fortes efeitos de expressão em vários níveis de intensidade conforme desejado.

[0005] Um promotor tac derivado de Escherichia coli é amplamente conhecido na técnica como um forte promotor. No caso do gênero Corynebacterium, um novo promotor foi desenvolvido por modificação de um promotor nativo (vide Gene, 102, 93-98, 1991; Microbiology, 142, 1297-1309, 1996). Por exemplo, foi relatado que um promotor derivado de Corynebacterium ammoniagenesis tinha uma atividade de cerca de 10% superior à do promotor tac derivado de E. coli (vide Biotechnol. Lett. 25,1311-1316, 2003). Além disso, como um forte promotor derivado de Corynebacterium ammoniagenesis, desenvolveu-se promotores de Pcj1 a Pcj7 com vários níveis de intensidade e apresentando forte atividade promotora que é pelo menos 10 vezes maior que a do promotor tac (vide KR 10-0620092). Além disso, um promotor derivado de Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) foi relatado como tendo uma atividade mais forte que a do promotor tac, mas teve uma dificuldade em sua expressão em um microrganismo diferente de um microrganismo pertencente ao gênero Brevibacterium (vide US 5,593,781).

[0006] A este respeito, quando os inventores do presente conceito inventivo exploram uma região que inclui uma sequência promotora que pode ter vários níveis de intensidade em uma variedade de diferentes microrganismos, um novo promotor sintetizado de acordo com o presente conceito inventivo encontra-se expresso em uma variedade de diferentes microrganismos e exibe efeitos de expressão muito mais fortes que os dos promotores existentes conhecidos na técnica, completando assim o presente conceito inventivo.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[0007] Uma ou mais modalidades exemplificativas incluem um novo promotor, uma sequência reguladora de expressão compreendendo o novo promotor, um vetor incluindo o novo promotor, uma célula hospedeira incluindo o vetor e um método de produção de um produto alvo utilizando a célula hospedeira.

SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA

[0008] De acordo com uma ou mais modalidades exemplificativas, é proporcionado um promotor que compreende uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1. No presente conceito inventivo, o promotor é denominado "um promotor o2 (a seguir designado como "Po2")".

[0009] O termo "promotor", como utilizado no presente documento, se refere a uma região de DNA à qual uma RNA polimerase é combinada para permitir o início da transcrição de um gene que está operacionalmente ligado ao promotor e pode ser posicionado em uma extremidade 5' de um sítio de iniciação para transcrição de um RNAm.

[0010] Um polinucleotídeo tendo atividade promotora como utilizado no presente documento, pode ser modificado para algumas extensões de acordo com estudos recentes de várias técnicas, tais como uma técnica de evolução direcionada ou uma técnica de mutagênese direcionada ao sítio. Por exemplo, um promotor tendo uma homologia de 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais da sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1, também está incluído no escopo do presente conceito inventivo.

[0011] O termo "homologia", como utilizado no presente documento, se refere ao grau (representado em percentagem) de identidade da sequência entre sequências polinucleotídicas. No presente relatório descritivo, uma homologia de uma sequência idêntica a uma dada sequência polinucleotídica ou uma sequência que tem atividade semelhante à de uma dada sequência polinucleotídica, é representada em termos de "% de homologia". Por exemplo, a homologia das sequências polinucleotídicas pode ser determinada pelo uso de software padrão, por exemplo, BLAST 2.0, para calcular parâmetros tais como pontuação, identidade e similaridade. Alternativamente, a homologia das sequências polinucleotídicas pode ser identificada pela comparação das sequências de acordo com um método de hibridação realizado sob condições de estringência definidas. As condições definidas e apropriadas para o método de hibridação podem ser determinadas em consideração aos métodos que são bem conhecidos de um versado na técnica (vide Infra em Sambrook e col., 1989).

[0012] De acordo com uma ou mais modalidades exemplares, é proporcionada uma sequência reguladora de expressão, que controla a expressão de um gene alvo, compreendendo a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1.

[0013] O termo "sequência reguladora de expressão", como utilizado no presente documento, se refere a uma sequência de DNA utilizada para a expressão de uma sequência de codificação que está operacionalmente ligada à sequência de DNA em um organismo hospedeiro. Tal sequência reguladora de expressão pode incluir, um promotor necessário para iniciar a transcrição, uma sequência operadora para regular a transcrição, uma sequência que codifica um sítio de ligação de ribossomo de RNAm adequado e uma sequência para regular a terminação da transcrição e tradução. Por exemplo, uma sequência reguladora de expressão adequada para procariotas pode incluir um promotor, uma sequência operadora e um sítio de ligação de ribossomo, mas não está limitada a isso. Uma sequência reguladora de expressão incluindo Po2 do presente conceito inventivo pode constituir, se necessário, um versado na técnica pode constituir uma sequência reguladora de expressão conforme descrito acima.

[0014] De acordo com uma ou mais modalidades exemplares, é proporcionado um vetor incluindo a sequência reguladora de expressão e um gene alvo ligado operativamente à sequência reguladora de expressão.

[0015] O termo "ligado operativamente" como utilizado no presente documento se refere a uma ligação entre uma sequência reguladora de expressão que controla um gene alvo (por exemplo, um promotor) e outras sequências de nucleotídeos. A este respeito, a sequência reguladora de expressão pode ser capaz de controlar a transcrição e/ou a tradução das outras sequências nucleotídicas.

[0016] O termo "vetor", como utilizado no presente documento, se refere a um produto de DNA que inclui sequências de bases de um polinucleotídeo para codificar uma proteína alvo que está operacionalmente ligada a uma sequência reguladora de expressão apropriada para expressar a proteína alvo. Além disso, uma pluralidade das sequências de nucleotídeos pode ser ligada a, ou recombinada com o vetor, de modo que uma sequência de DNA de um gene selecionado com uma sequência 3'-não traduzida apropriada, e um promotor podem ser introduzidos em uma célula. O vetor pode ser usado para transformação em uma célula hospedeira apropriada e, em seguida, pode ser replicado independentemente do genoma da célula hospedeira. Alternativamente, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira. Além disso, o vetor pode incluir o promotor ou uma variante do mesmo e o gene alvo e, além disso, pode incluir uma origem de replicação, um local regulador do promotor, um sítio de ligação de ribossomo, um sítio de terminação de transcrição, um marcador seletivo ou uma combinação destes.

[0017] O vetor utilizado no presente conceito inventivo não é particularmente limitado desde que possa ser replicado em uma célula hospedeira e qualquer vetor disponível na técnica pode ser utilizado. Exemplos do vetor tipicamente utilizado na técnica incluem um vetor plasmídico natural ou recombinante, um vetor cosmídico, um vetor viral e um vetor bacteriófago. Exemplos de vetores bacteriófagos e cosmídeos incluem pWE15, M13, ÀMBL3, ÀMBL4, ÀIXII, ÀASHII, ÀAPII, Àt10, Àt11, Charon4A e Charon21A, e exemplos dos vetores plasmídeos incluem vetores com base em pBR, com base em pUC, com base em pBluescriptII, com base em pGEM, com base em pTZ, com base em pCL e com base em pET, mas os vetores não são limitados a estes.

[0018] O gene alvo se refere a um gene que codifica um produto a ser expresso em uma quantidade em excesso. Por exemplo, o gene alvo pode ser um gene envolvido na produção de um produto selecionado do grupo que consiste em aminoácidos (por exemplo, L-aminoácido), ácidos orgânicos e uma combinação destes. Em detalhes, o gene alvo pode ser um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de aminoácidos, um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de ácidos orgânicos ou um gene que codifica uma proteína envolvida na exportação de um produto alvo, mas não está limitada a isso.

[0019] De acordo com uma ou mais modalidades exemplares, é proporcionada uma célula hospedeira incluindo um vetor, em que o vetor inclui uma sequência reguladora de expressão que controla um gene alvo e inclui um promotor tendo uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1 e um gene alvo que está operacionalmente ligado à sequência reguladora de expressão.

[0020] A célula hospedeira não é particularmente limitada desde que um microrganismo utilizado como célula hospedeira seja capaz de introduzir o vetor incluindo a sequência reguladora de expressão que controla um gene alvo e inclui o promotor possuindo a sequência nucleotídica representada pela SEQ ID NO: 1 e o gene alvo que está operacionalmente ligado à sequência reguladora de expressão. A célula hospedeira pode ser tanto uma célula procariótica como uma célula eucariótica, mas, em uma modalidade exemplar, pode ser uma célula procariótica. Por exemplo, a célula hospedeira pode incluir uma cepa de um microrganismo pertencente ao gênero Escherichia, ao gênero Erwinia, ao gênero Serratia, ao gênero Providencia, ao gênero Corynebacterium e ao gênero Brevibacterium. Por exemplo, a célula hospedeira pode ser uma cepa de um microrganismo pertencente ao gênero Corynebacterium ou ao gênero Escherichia. Por exemplo, a célula hospedeira pode ser uma cepa de um microrganismo pertencente a Echerichia coli, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum ou Brevibacterium lactofermentum.

[0021] A introdução do vetor pode ser realizada, como descrito na técnica, por seleção de uma técnica adequada de acordo com a célula hospedeira. A introdução do vetor pode ser realizada, por exemplo, por eletroporação, choque térmico, precipitação com fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação com cloreto de cálcio (CaCl2), microinjeção, polietilenoglicol (PEG), um método DEAE-dextrano, um método de lipossoma catiônico, um método de acetato de lítio-DMSO, ou uma combinação destes, mas não está limitado a isso.

[0022] De acordo com uma ou mais modalidades exemplificativas, é proporcionado um método para produzir um produto alvo, o método incluindo: cultivo de uma célula hospedeira em um meio, em que a célula hospedeira compreende um vetor que inclui uma sequência reguladora de expressão compreendendo um promotor tendo uma sequência nucleotídica representada pela SEQ ID NO: 1 e um gene alvo que está operacionalmente ligado à sequência reguladora de expressão; e recuperação do produto alvo da célula hospedeira ou do meio incluindo a célula hospedeira cultivada.

[0023] O produto alvo pode ser selecionado do grupo que consiste em aminoácidos (por exemplo, L-aminoácido), ácidos orgânicos e uma combinação destes. O termo "aminoácido" ou "L-aminoácido", como utilizado no presente documento, se refere geralmente a uma unidade básica de uma proteína que constitui um corpo vivo, em que um grupo aminoácido e um grupo carboxila estão ligados ao mesmo átomo de carbono. O aminoácido pode ser selecionado do grupo que consiste em glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, treonina, serina, cisteína, cistina, metionina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, diiodotirosina, lisina, arginina, histidina, fenilalanina, tirosina, triptofano, prolina, oxiprolina e uma combinação destes, mas não está limitado a isso. O termo "ácido orgânico" como utilizado no presente documento se refere a um composto orgânico tendo acidez e, por exemplo, pode incluir um composto orgânico possuindo um grupo carboxila e um grupo sulfônico. O ácido orgânico pode incluir, por exemplo, ácido láctico, ácido acético, ácido succínico, ácido butírico, ácido palmítico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido propiônico, ácido hexenóico, ácido cápríco, ácido caprílico, ácido valérico ou ácido cítrico, mas não está limitado aos mesmos.

[0024] A cultura da célula hospedeira pode ser realizada de acordo com métodos típicos conhecidos na técnica. O meio utilizado para a cultura da célula hospedeira pode incluir, como uma fonte de açúcar, açúcar e carboidratos, como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; óleos e gorduras, como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco; ácidos graxos, tais como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico; alcoóis, tais como glicerol e etanol; e ácidos orgânicos, tais como ácido acético, individualmente ou como uma mistura, mas não está limitado aos mesmos. O meio utilizado para a cultura da célula hospedeira pode incluir, como uma fonte de nitrogênio, peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, água de maceração de milho, farelo de soja e ureia, ou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio ou nitrato de amônio, individualmente ou como uma mistura, mas não está limitado aos mesmos. O meio utilizado para a cultura da célula hospedeira pode incluir como uma fonte de fósforo, di-hidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato dipotássico, ou os seus sais correspondentes contendo sódio, mas não está limitado aos mesmos. O meio utilizado para a cultura da célula hospedeira pode incluir sais de metais, tais como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para o crescimento, mas os sais dos metais não estão limitados a esses. Além disso, durante a cultura da célula hospedeira, substâncias de crescimento essenciais, tais como aminoácidos e vitaminas, ou precursores adequados podem ser adicionados ao meio de cultura. Tais materiais podem ser adicionados ao meio de cultura durante a cultura da célula hospedeira de uma maneira apropriada e, por exemplo, podem ser adicionados de uma maneira contínua ou em lote.

[0025] Além disso, durante a cultura da célula hospedeira, os compostos, tais como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico, podem ser adicionados ao meio de cultura de uma maneira adequada para regular o pH do meio de cultura. Além disso, durante a cultura da célula hospedeira, um agente antiformação, tal como éster poliglicol de ácido graxo pode ser utilizado para evitar a produção de espumas. Para manter as condições aeróbicas do meio de cultura, podem ser introduzidos no meio de cultura oxigênio ou gás contendo oxigênio (por exemplo, ar). Aqui, uma temperatura do meio de cultura pode estar em uma faixa de cerca de 20°C a cerca de 45°C, por exemplo, cerca de 25°C a cerca de 40°C. Além disso, a cultura da célula hospedeira pode ser continuar até a quantidade desejada de um produto alvo ser obtida e, a este respeito, a cultura da célula hospedeira pode continuar durante cerca de 10 horas a cerca de 160 horas.

[0026] A recuperação do produto alvo a partir da célula hospedeira ou do meio de cultura incluindo a célula hospedeira cultivada pode ser realizada (isto é, separado ou recuperado) através de uma reação apropriada conhecida na técnica. Por exemplo, uma reação apropriada pode ser feita de acordo com um tratamento que utiliza precipitantes de proteínas (isto é, um método de salgamento), centrifugação, extração, sonicação, ultrafiltração, diálise, várias técnicas de cromatografia, tais como cromatografia de peneira molecular (isto é, filtração em gel), cromatografia de adsorção, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade e uma combinação destas, mas não estando limitada às mesmas. A este respeito, o produto alvo produzido pode ser recolhido, recuperado ou separado da célula hospedeira ou do meio incluindo a célula hospedeira cultivada.

Modo para a Invenção

[0027] Doravante, o presente conceito inventivo será descrito com mais detalhes com referência aos exemplos que se seguem. No entanto, estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo do presente conceito inventivo.

Exemplo 1: Preparação de um vetor recombinante compreendendo um novo promotor e uma cepa transformada utilizando o mesmo (1) Preparação de um vetor recombinante compreendendo Po2 e uma cepa transformada utilizando o mesmo

[0028] Em termos de sintetização, um promotor que induz a expressão de um gene alvo, sequências de vários promotores derivados de um microrganismo pertencente ao gênero Corynebacterium e um microrganismo pertencente ao gênero Escherichia foram analisados, sintetizando assim um promotor possuindo uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1. O promotor sintetizado foi referido como um promotor o2 (doravante, denominado "Po2"). Para medir uma atividade de Po2 para induzir uma expressão de gene alvo, o Po2 foi operativamente ligado a uma estrutura de leitura aberta (ORF) de um gene GFP de modo que um vetor recombinante foi preparado. Em seguida, cada uma das cepas de Corynebacteria e E. coli foi transformada com o vetor recombinante, preparando assim cada uma das cepas transformadas de Corynebacteria e E. coli.

[0029] Além disso, para preparar uma cepa que tenha uma capacidade aumentada de produzir L-aminoácidos, por exemplo, L-arginina ou aminoácidos ramificados, tais como L-valina, como um exemplo de um produto alvo, o Po2 foi utilizado para melhorar a expressão do gene biossintético para arginina ou valina.

(1.(1) Preparação de um vetor pECCG117-Po2-gfp e uma cepa transformada utilizando o mesmo (1.1.(1) Preparação de um vetor

[0030] A PCR foi realizada utilizando o Po2 sintetizado como um modelo e um conjunto de iniciadores da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 incluindo os sítios de restrição Kpn I/EcoR V. A PCR foi realizada de acordo com ciclos de desnaturação a uma temperatura de 94°C durante 5 minutos, desnaturação a uma temperatura de 94°C durante 30 segundos, recozimento a uma temperatura de 60°C durante 30 segundos e polimerização a uma temperatura de 72°C durante 30 segundos, em que os ciclos foram realizados 30 vezes. Posteriormente, a polimerização foi realizada novamente nas cepas a uma temperatura de 72°C durante 7 minutos, assim conseguindo consequentemente a obtenção de Po2 tendo um comprimento de cerca de 100 pb.

[0031] A PCR foi realizada utilizando um vetor pGFPuv (fabricado pela Clontech, USA) como um modelo e um conjunto de iniciadores da SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5 incluindo sítios de restrição PstI/EcoR V. A PCR foi realizada de acordo com ciclos de desnaturação a uma temperatura de 94°C durante 5 minutos, desnaturação a uma temperatura de 94°C durante 30 segundos, recozimento a uma temperatura de 55°C durante 30 segundos e polimerização a uma temperatura de 72°C durante 1 minuto, em que os ciclos foram realizados 30 vezes. Posteriormente, a polimerização foi realizada novamente a uma temperatura de 72°C durante 7 minutos, assim obtendo consequentemente a SEQ ID NO: 6 incluindo o ORF do gene GFP.

[0032] O Po2 foi tratado com enzimas de restrição PstI e EcoR V e o ORF do gene GFP foi tratado com enzimas de restrição Kpn I e EcoR V, em sítios PstI e Kpn I de um vetor de transporte pECCG117 (vide Biotechnology Letters vol. 13, No. 10, p. 721-726 (1991)) que podem ser expressas em E.coli e Corynebacteria. Em seguida, o Po2 e o ORF tratados do gene GFP foram operativamente ligados entre si utilizando uma enzima de conjugação de DNA, produzindo desse modo um vetor recombinante no qual os genes Po2 e GFP estavam ligados um ao outro. Aqui, o vetor recombinante foi denominado pECCG117- Po2-gfp.

(1.1.(2) Preparação de uma cepa transformada usando o vetor

[0033] Corynebacterium glutamicum ATCC13032 foi transformada com cada um de um vetor pECCG117 e o vetor recombinante pECCG117-Po2-gfp por um método de pulso elétrico e, em seguida, foram obtidas cepas transformadas a partir de um meio seletivo contendo 25 mg/L de canamicina. As cepas obtidas que foram transformadas com o vetor pECCG117 e o vetor recombinante pECCG117-Po2-gfp foram cada uma designadas ATCC13032/pECCG117 e ATCC13032/pECCG117-Po2-gfp.

[0034] Além disso, a E. coli DH5α foi transformada com o vetor recombinante pECCG117-Po2-gfp por um método de choque térmico e, em seguida, as cepas transformadas foram obtidas a partir de um meio agar Luria-Bertani (LB) contendo 25 mg/L de canamicina. As cepas obtidas foram denominadas DH5α/pECCG117-Po2-gfp e atribuídas como uma designação de depósito "CA01-2290". O CA01-2290 foi depositado no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) (Centro Cultural Coreano de Microrganismos) em 23 de outubro de 2014, sob o número de registro KCCM11591P, de acordo com os termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Efeitos de Procedimento em Matéria de Patente.

(1.(2) Preparação de um vetor pECCG117-Po2-argJ e uma cepa transformada usando o mesmo (1.2.(1) Preparação de um vetor

[0035] Em termos de síntese de um vetor em que um gene biossintético principal, por exemplo, um gene argJ (Ncgl1341, SEQ ID NO: 7) que codifica a ornitina acetiltransferase/N-acetilglutamato sintase bifuncional, para uma produção melhorada de arginina é expressa pelo Po2, o vetor recombinante pECCG117-Po2-gfp foi utilizado para preparar um vetor pECCG117-Po2-argJ.

[0036] Em detalhes, a PCR foi realizada em uma cepa usando cromossomos de Corynebacterium glutamicuum ATCC13869 como um modelo e um conjunto de iniciadores da SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, garantindo assim fragmentos de DNA incluindo os genes argJ. A PCR foi realizada de acordo com ciclos de desnaturação a uma temperatura de 94°C durante 1 minuto, recozimento a uma temperatura de 58°C durante 30 segundos e polimerização a uma temperatura de 72°C durante 2 minutos utilizando uma polimerase Pfu, em que os ciclos foram realizados 30 vezes. Consequentemente, foi amplificado um fragmento tendo um comprimento de cerca de 1.201 pb e incluindo sítios de restrição de enzima EcoRV e 3'PstI em uma extremidade 5'. Os fragmentos amplificados gerados pela PCR foram purificados, misturados com o vetor pECCG117-Po2- gfp, aos quais as enzimas de restrição EcoRV e PstI foram tratadas e, em seguida, unidas em conjunto usando o Kit de Clonagem In-Fusion, preparando assim um vetor recombinante, que foi denominado pECCG117-Po2-argJ.

(1.2.(2) Preparação de uma cepa transformada usando o vetor

[0037] Corynebacterium glutamicum KCCM10741P, que é uma cepa produtora de arginina, foi transformada com o vetor recombinante pECCG117-Po2-argJ por um método de pulso elétrico (vide KR 10-0791659) e, em seguida, foram obtidas cepas transformadas a partir de um meio seletivo contendo 25 mg/L de canamicina. A cepa obtida foi denominada KCCM10741P/pECCG117-Po2-argJ.

(1.2.(3) paração de um vetor pECCG117-Po2-ilvE e uma cepa transformada usando o mesmo (1.3.(1) Preparação de um vetor

[0038] Em termos de sintetização de um vetor em que um gene biossintético principal, por exemplo, um gene ilvE (Ncgl2123, SEQ ID NO: 10) que codifica uma aminotransferase de aminoácido de cadeia ramificada, para uma produção melhorada de valina é expresso pelo Po2, o vetor recombinante pECCG117-Po2-gfp foi utilizado para preparar um vetor pECCG117-Po2-ilvE.

[0039] Em detalhes, a PCR foi realizada em uma cepa usando cromossomos de Corynebacterium glutamicuum ATCC14067 como um modelo e um conjunto de iniciadores da SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, garantindo assim fragmentos de DNA incluindo os genes ilvE. A PCR realizou-se de acordo com ciclos de desnaturação a uma temperatura de 94°C durante 1 minuto, recozimento a uma temperatura de 58°C durante 30 segundos e polimerização a uma temperatura de 72°C durante 2 minutos utilizando uma polimerase Pfu, em que os ciclos foram realizados 30 vezes. Consequentemente, foi amplificado um fragmento tendo um comprimento de cerca de 1.201 pb e incluindo sítios de restrição de enzima EcoRV e 3' PstI em uma extremidade 5'. Os fragmentos amplificados gerados pela PCR foram purificados, misturados com o vetor pECCG117-Po2- gfp, aos quais as enzimas de restrição EcoRV e PstI foram tratadas e, em seguida, unidas em conjunto usando o Kit de Clonagem In-Fusion, preparando assim um vetor recombinante, que foi denominado pECCG117-Po2-ilvE.

(1.3.(2) Preparação de uma cepa transformada usando o vetor

[0040] Corynebacterium glutamicum KCCM111201P, que é uma cepa produtora de valina, foi transformada com o vetor recombinante pECCG117-Po2-ilvE por um método de pulso elétrico (vide KR 10-1117022) e, em seguida, foram obtidas cepas transformadas a partir de um meio seletivo contendo 25 mg/L de canamicina. As cepas obtidas foram denominadas KCCM11201P/pECCG117-Po2-ilvE.

Exemplo Comparativo 1: Preparação de um vetor recombinante incluindo um promotor de controle e uma cepa transformada utilizando o vetor

[0041] Para medir uma atividade de Po2 para induzir uma expressão de gene alvo, o gene GFP foi utilizado para ligar operativamente um promotor forte conhecido (por exemplo, Ptrc, Pcj1, Pcj4 ou Pcj7 (vide KR 10-0620092)) ou um promotor de tipo selvagem (por exemplo, aceEP (WT)) ao ORF do gene GFP para preparar um vetor recombinante. Em seguida, cada uma das cepas de Corynebacteria e E. coli foi transformada com o vetor recombinante, preparando assim cada uma das cepas transformadas de Corynebacteria e E. coli.

[0042] Além disso, para avaliar as cepas transformadas incluindo um gene biossintético principal usando o Po2 para a produção melhorada de um gene alvo, uma cepa transformada incluindo um gene biossintético principal para produção melhorada de arginina ou uma cepa transformada incluindo um gene biossintético principal para produção melhorada de valina, foi cada uma preparada.

(1) Preparação de um vetor de expressão gfp tendo um promotor diferente do Po2 em termos de comparação de atividade com o Po2 e uma cepa transformada de Corynebacterium glutamicum

[0043] As sequências básicas de aceEP (WT) foram asseguradas com base no “US National Institute of Health” (NIH Genbank) (Instituto Nacional de Saúde Norte-Americano) e a PCR foi realizada sobre as mesmas usando cromossomos do tipo selvagem Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como um modelo e um conjunto de iniciadores da SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14 incluindo sítios de restrição Kpn I/EcoR V. A PCR foi realizada do mesmo modo que em (1.1) do Exemplo 1, preparando assim um vetor recombinante denominado pECCG117- aceEP(WT)-gfp.

[0044] As cepas de Corynebacterium glutamicum foram transformadas com cada um dos vetores preparados pECCG117- aceEP(WT)-gfp e vetores pECCG117-Pcj1-gfp, pECCG117-Pcj4-gfp e pECCG117-Pcj7-gfp (vide KR 10-0620092), da mesma forma que em (1.1) do Exemplo 1, preparando deste modo cepas transformadas que foram cada uma denominadas ATCC13032/pECCG117-aceEP(WT)-gfp, ATCC13032/pECCG117-Pcj1- gfp, ATCC13032/pECCG117-Pcj4-gfp e ATCC13032/pECCG117-Pcj7- gfp.

(2) Preparação de um vetor de expressão gfp tendo um promotor diferente do Po2 em termos de comparação de atividade com Po2 e uma cepa transformada de E. coli

[0045] As sequências básicas de Ptrc foram asseguradas com base no “US National Institute of Health” (NIH Genbank) (Instituto Nacional de Saúde Norte-Americano), e a PCR foi realizada sobre as mesmas usando pTrc99A (NCBI GenBank, M22744) como um modelo e um conjunto de iniciadores da SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 incluindo sítios de restrição Kpn/EcoR. A PCR foi realizada do mesmo modo que em (1.1) do

Exemplo 1, preparando assim um vetor recombinante denominado pECCG117-Ptrc-gfp.

[0046] As cepas de E. coli eram cada um dos vetores preparados pECCG117-Ptrc-gfp e os vetores pECCG117-Pcj1-gfp e pECCG117-Pcj4-gfp, da mesma maneira que em (1.1) do Exemplo 1, preparando assim cepas transformadas que foram cada uma denominadas DH5α/PECCG117-Ptrc-gfp, DH5α/pECCG117-Pcj1-gfp, e DH5α/pECCG117-Pcj4-gfp.

(3) Preparação de uma cepa transformada tendo um promotor diferente do Po2 em termos de uma comparação de produtibilidade do produto alvo com o Po2 (3) 1) Preparação de uma cepa transformada de Corynebacterium glutamicuum,a cepa transformada apresentando produtibilidade de arginina

[0047] O vetor pECCG117-Pcj7-gfp foi utilizado para preparar um vetor denominado pECCG117-Pcj7-argJ da mesma maneira que em (1.2.1) do Exemplo 1, exceto que a PCR foi realizada usando um conjunto de iniciadores da SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 17.

[0048] Em seguida, preparou-se uma cepa transformada utilizando o vetor pECCG117-Pcj7-argJ do mesmo modo que em (1.2.2) do Exemplo 1, e foi denominada KCCM10741P/pECCG117- Pcj7-argJ.

(3) 2) Preparação de uma cepa transformada de Corynebacterium glutamicuum,a cepa transformada apresentando produtibilidade de valina

[0049] O vetor pECCG117-Pcj7-gfp foi utilizado para preparar um vetor denominado pECCG117-Pcj7-ilvE da mesma maneira que em (1.3.1) do Exemplo 1, exceto que a PCR foi realizada utilizando um conjunto de iniciadores da SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 18.

[0050] Em seguida, preparou-se uma cepa transformada utilizando o vetor pECCG117-Pcj7-ilvE do mesmo modo que em (1.3.2) do Exemplo 1, e foi denominada KCCM11201P/pECCG117- Pcj7-ilvE.

Exemplo 2: Confirmação de uma atividade de Po2 para induzir uma expressão de gene alvo (l)Confirmação de uma atividade de Po2 para induzir uma expressão de gene alvo em Corynebacterium glutamicum

[0051] Para medir uma atividade de Po2 para indução de uma expressão de genes alvo nas cepas transformadas de Corynebacterium glutamicuum, a medição da atividade de proteína de fluorescência verde (GFP) da cepa transformada denominada ATCC13032/pECCG117-Po2-gfp de (1.1.2) do Exemplo 1 foi comparada com a medição da atividade de GFP das cepas transformadas cada uma denominada ATCC13032/pECCG117 de (1.1.2) do Exemplo 1 e ATCC13032/pECCG117-aceEP(WT)-gfp, ATCC13032/pECCG117-Pcj1-gfp, ATCC13032/pECCG117-Pcj4-gfp e ATCC13032/pECCG117-Pcj7-gfp de (1) do Exemplo Comparativo 1.

[0052] Cada uma das cepas transformadas de Corynebacterium glutamicuum acima foi inoculada em um frasco com dispensador curvo de 250 mL contendo 25 mL de um meio de semente por uma proporção de volume de 1: 20 e, em seguida, a cultura agitada (a uma velocidade de cerca de 200 rpm) a uma temperatura de 30°C até as cepas serem cultivadas em uma fase de metáfase de cultura (OD600 = 10,0). Após a conclusão da cultura, as células foram coletadas por centrifugação (a uma velocidade de cerca de 5.000 rpm durante cerca de 15 minutos). As células coletadas foram lavadas duas vezes com uma solução tampão Tris.HCl (pH 8,0) a 0,1% e depois, suspensa na mesma solução tampão para uma turbidez em 610 nm de cerca de 160. As células foram interrompidas durante 6 minutos utilizando um batedor de grânulo, após esferas de vidro serem adicionadas a 1,25 g/1,5 mL da suspensão. Um sobrenadante contendo um extrato celular foi recolhido por centrifugação (a uma velocidade de cerca de 15.000 rpm durante cerca de 20 minutos) e depois, medido quantitativamente em termos de uma concentração de proteína no mesmo, de acordo com o método de Bradford (vide Bradford, M.M 1976. Anal. Biochem. 72:248-254). Em seguida, a mesma quantidade do extrato celular foi irradiada com luz em um comprimento de onda de excitação de 488 nm utilizando o método de Laure Gory ou semelhante, e luz em um comprimento de onda de emissão de 511 nm foi medida utilizando o espectrofotômetro LS-50B (Perkin-Elmer), determinando assim a expressão do gene GFP. Os resultados de medição da atividade de GFP em cada uma das cepas são mostrados na Tabela 1.

[Meio de semente]

[0053] Vinte gramas de glicose, 5 g de sulfato de amônio, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO47H2O, 150 μg de biotina, 1,5 mg de cloridrato de tiamina, 3 mg de ácido pantofênico de cálcio, 3 mg de nicotinamida (com base em 1 L de água destilada) e pH 7,2. [Tabela 1] Intensidade de fluorescência em Corynebacterium glutamicuum

[0054] Conforme mostrado nos resultados da Tabela 1, confirmou-se que o Po2 possuía uma atividade promotora em Corynebacterium glutamicuum e que a cepa denominada ATCC13032/pECCG117-Po2-gfp exibiu intensidade de fluorescência que é pelo menos 13 vezes tão grande quanto a cepa do tipo selvagem ATCC13032/pECCG117-aceEP(WT)-gfp. Além disso, foi confirmado que a cepa denominada ATCC13032/pECCG117-Po2-gfp exibiu intensidade de fluorescência a um nível que é muito maior que o das cepas cada uma denominada ATCC13032/pECCG117-Pcj1-gfp, ATCC13032/ pECCG117-Pcj4-gfp, e ATCC13032/pECCG117-Pcj7-gfp usando promotores fortes conhecidos (por exemplo, Pcj1, Pcj4 e Pcj7). Consequentemente, foi confirmado que Po2 serviu como um forte promotor para expressar um gene alvo.

(2) Confirmação de uma atividade de Po2 para induzir uma expressão de gene alvo em E. Coli

[0055] Para medir uma atividade de Po2 para induzir uma expressão de gene alvo nas cepas transformadas de E. coli, a medição da atividade de GFP da cepa transformada denominada DH5α/pECCG117-Po2-gfp de (1.1.2) do Exemplo 1 foi comparada com a medição de atividade de GFP das cepas transformadas cada uma denominada DH5α/pECCG117-Ptrc-gfp, DH5α/pECCG117- Pcj1-gfp e DH5α/pECCG117-Pcj4-gfp de (2) do Exemplo Comparativo 2.

[0056] Cada uma das cepas transformadas de E. coli acima foi inoculada em um frasco com dispensador curvo de 250 mL contendo 25 mL de um meio LB contendo canamicina a uma proporção volumétrica de 1: 20, e depois cultivada em agitação (a uma velocidade de cerca de 200 rpm) a uma temperatura até as cepas serem cultivadas em uma fase de metáfase de cultura (OD600 = 3,0). Após a conclusão da cultura, as células foram recolhidas por centrifugação (a uma velocidade de cerca de 5.000 rpm durante cerca de 15 minutos), lavadas duas vezes com uma solução tampão de Tris.HCl (pH 8,0), suspensa na mesma solução tampão, interrompida por sonicação e depois submetida a centrifugação (a uma velocidade de cerca de 15.000 rpm durante cerca de 20 minutos) para obter um sobrenadante contendo um extrato celular. O sobrenadante foi medido quantitativamente em termos de uma concentração de proteína no mesmo, de acordo com o método de Bradford. Em seguida, a mesma quantidade do extrato celular foi irradiada com luz em um comprimento de onda de excitação de 488 nm usando o método de Laure Gory ou similar, e a luz em um comprimento de onda de emissão de 511 nm foi medido usando o espectrofotômetro LS-50B (Perkin-Elmer), determinando assim a expressão do gene GFP. Os resultados da medição da atividade de GFP em cada uma das cepas são mostrados na Tabela 2. [Tabela 2] Intensidade de fluorescência em E. coli

[0057] Conforme mostrado nos resultados da Tabela 2, confirmou-se que o Po2 tinha uma atividade promotora em E. coli e que a cepa denominada DH5α/pECCG117-Po2-gfp exibia a intensidade de fluorescência a um nível similar ao da cepa denominada DH5α/PECCG117-Ptrc-gfp, que é conhecida como um forte promotor e maior que aquele da cepa DH5α/pECCG117- Pcj4-gfp. Consequentemente, foi confirmado que o Po2 serviu como um forte promotor para expressar um gene alvo em E. coli.

Exemplo 3: Avaliação de cepas para produtibilidade de produto alvo melhorada (1) Avaliação de cepas para produção melhorada de arginina

[0058] Em termos de fatores de avaliação que influenciam a produção de arginina, quando o principal gene biossintético para arginina, ou seja, o gene argJ, foi expresso usando Po2, a cepa denominada KCCM10741P/pECCG117-Po2-argJ de (1.2.2) do Exemplo 1, que foi usada como a cepa para produção melhorada do gene argJ, foi comparada com a cepa não transformada denominada KCCM10741P (sem produtibilidade de arginina transformada) e a cepa denominada KCCM10741P/pECCG117-Pcj7-argJ de (3.1) do Exemplo Comparativo 1 em termos de produtibilidade de arginina.

[0059] Um loop de cada uma das cepas transformadas acima foi inoculado em um frasco com dispensador curvo de 250 mL contendo 25 mL de um meio de produção e, em seguida, cultivado em agitação a uma velocidade de cerca de 200 rpm a uma temperatura de 30°C durante 48 horas. Após a conclusão da cultura, a produção de L-arginina foi medida por HPLC. Os resultados da medição da produção de L-arginina são mostrados na Tabela 3. [Meio de produção]

[0060] Glicose a 6%, sulfato de amônio a 3%, fosfato monopotássico a 0,1%, sulfato de magnésio heptahidratado a 0,2%, água de maceração de milho (CSL) a 1,5%, NaCl a 1%, extrato de levedura a 0,5%, 100 μg/L de biotina e pH 7,2. [Tabela 3] Produção de arginina em KCCM110741P

[0061] Conforme mostrado nos resultados da Tabela 3, foi confirmado que o Po2 resultou em uma produção melhorada de arginina em Corynebacterium glutamicuum na qual a expressão do gene argJ foi melhorada. Em particular, a produção de arginina em Corynebacterium glutamicuum foi aumentada em cerca de 84% em comparação com a da cepa de controle e foi aumentada em cerca de 23% em comparação com a cepa denominada KCCM10741P/pECCG117-Pcj7-argJ. Consequentemente, foi confirmado que o Po2 influenciou a expressão melhorada do gene argJ.

(2) Avaliação de cepas para produção melhorada de L- valina

[0062] Em termos de fatores de avaliação que influenciam a produção de valina, quando o principal gene biossintético para valina, ou seja, o gene ilE, foi expresso usando o Po2, a cepa denominada KCCM11201P/pECCG117-Po2-ilvE de (1.3.2) do Exemplo 1, que foi usada como a cepa para a produção melhorada do gene ilvE, foi comparada com a cepa não transformada denominada KCCM11201P (sem produtibilidade de L-valina transformada) e a cepa denominada KCCM11201P/pECCG117-Pcj7-ilvE de (3.2) do Exemplo Comparativo 1 em termos de produtibilidade de L-valina.

[0063] Um loop de cada uma das cepas transformadas acima foi inoculado em um frasco com dispensador curvo de 250 mL contendo 25 mL de um meio de produção e, em seguida, cultivado em agitação a uma velocidade de cerca de 200 rpm a uma temperatura de 30°C durante 72 horas. Após a conclusão da cultura, a produção de L-valina foi medida por HPLC. Os resultados da medição da produção de L-valina são apresentados na Tabela 4. [Meio de produção]

[0064] Glicose a 5%, sulfato de amônio a 2%, fosfato monopotássico a 0,1%, sulfato de magnésio Heptahidratado a 0,05%, CSL 2,0%, 200 μg/L de biotina e pH 7,2. [Tabela 4] Produção de valina em KCCM11201P

[0065] Como mostrado nos resultados da Tabela 4, foi confirmado que o Po2 resultou em uma produção melhorada de valina em Corynebacterium glutamicuum na qual a expressão do gene ilvE foi melhorada. Em particular, a produção de valina na cepa denominada KCCM11201P/pECCG117-Po2-ilvE foi significativamente aumentada em cerca de 32% em comparação com a da cepa de controle, e foi aumentada em cerca de 17% em comparação com a da cepa denominada KCCM10741P/pECCG117- Pcj7-ilvE. Consequentemente, foi confirmado que o Po2 influenciou a expressão melhorada do gene ilvE. [Número de registro] Instituição de adesão: “Korean Culture Center of Microorganisms” (Internacional) (Centro Cultural Coreano de Microrganismos) (Internacional) Número de registro: KCCM11591P Data de adesão: 23 de outubro de 2014

[0066] De acordo com uma ou mais modalidades exemplificativas acima, um novo promotor pode ter várias atividades de acordo com um microrganismo utilizado para induzir a expressão de um gene alvo. A este respeito, o novo promotor pode ser utilizado em um caso em que a atividade de um gene alvo precisa ser controlada durante a produção do produto alvo, resultando em uma produção eficiente do produto alvo.

[0067] Deve entender-se que as modalidades exemplificativas descritas no presente documento devem ser consideradas somente em um sentido descritivo e não para fins de limitação. As descrições de características ou aspectos dentro de cada modalidade exemplificativa, devem ser tipicamente consideradas disponíveis para outras características ou aspectos semelhantes à outras modalidades exemplares.

[0068] Embora uma ou mais modalidades exemplares tenham sido descritas, os versados na técnica compreenderão que podem ser feitas várias mudanças na forma e nos detalhes, sem se afastar do espírito e do escopo do conceito inventivo como definido pelas reivindicações que se seguem. TRATADO DE BUDAPEST SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS PARA EFEITOS DE PROCEDIMENTO EM MATÉRIA DE PATENTE FORMULÁRIO INTERNACIONAL Para: CJ CheilJedang RECEBIMENTO NO CASO DE UM Corporalion ORIGINAL emitido nos termos CJ CHEILJEDANG CENTER, 330. do artigo 7.1 pela AUTORIDADE DONGHO-RO, JUNG-GU, SEOUL DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL 100-400, REPÚBLICA DA COREIA identificado ao final deste relatório. 1 Quando o artigo 6.4(d) se aplica, tal data é a data na qual o status da autoridade depositária internacional foi adquirido; quando um depósito feito fora do Tratado de Budapeste após a aquisição do status de autoridade depositária internacional ser convertido em um depósito de acordo com o Tratado de Budapeste, tal data é a data na qual o microrganismo foi recebido pela autoridade depositária internacional. Formulário BP/4 Página única.

Claims

1. Promotor caracterizado pelo fato de que consiste em uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1.

2. Sequência reguladora de expressão caracterizada pelo fato de que compreende o promotor, conforme definido na reivindicação 1.

3. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende a sequência reguladora da expressão, conforme definida na reivindicação 2, e um gene de interesse que está operacionalmente ligado à sequência reguladora da expressão.

4. Célula hospedeira de microrganismo transformado caracterizada pelo fato de que compreende o vetor, conforme definido na reivindicação 3.

5. Célula hospedeira de microrganismo transformado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira de microrganismo transformado pertence ao gênero Corynebacterium ou gênero Escherichia.

6. Método de produção de um produto alvo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: cultura da célula hospedeira de microrganismo transformado, conforme definida na reivindicação 4 ou 5; e recuperação do produto alvo a partir da célula hospedeira de microrganismo transformado cultivada ou de um meio de cultura incluindo a célula hospedeira de microrganismo transformado cultivada.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o produto alvo é um aminoácido.