TWI591175B - 新啟動子及其使用 - Google Patents

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TWI591175B TW105102596A TW105102596A TWI591175B TW I591175 B TWI591175 B TW I591175B TW 105102596 A TW105102596 A TW 105102596A TW 105102596 A TW105102596 A TW 105102596A TW I591175 B TWI591175 B TW I591175B
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Description

新啟動子及其使用 [相關申請案的交叉參考]
本申請案主張2015年1月29日於韓國智慧財產局申請的韓國專利申請案第10-2015-0014587號的權益，所述申請案的揭露內容以全文引用的方式併入本文中。
一或多個例示性實施例是關於一種新啟動子以及一種藉由使用所述新啟動子產生目標產物的方法。
為了藉由使用微生物以高產量產生例如L-胺基酸、有機酸或核酸材料等目標產物，需要選擇性地控制相關於微生物中的許多代謝過程的基因的表現。詳言之，需要增強目標產物的生物合成路徑中所涉及的靶基因的表現，且例如可執行表現調節序列的修改。表現調節序列的此修改可包含(例如)用原生啟動子取代強啟動子、修改原生啟動子或修改夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno；SD)序列。最常使用原生啟動子取代強啟動子，且就此而言，認為開發有用啟動子是必不可少的。
然而，本領域中已知的強啟動子是有限的，且僅可在有 限微生物中表現。在一些狀況下，強啟動子可能不能如所要地在各種強度位準下展現強烈的表現效應。
自大腸桿菌衍生的tac啟動子在本領域中被廣泛稱為強啟動子。在棒狀桿菌屬的狀況下，已藉由修改原生啟動子來開發新啟動子(參見基因期刊(Gene)，102，93至98，1991；微生物學期刊(Microbiology)，142，1297至1309，1996)。舉例而言，據報導，自產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenesis)衍生的啟動子的活性比自大腸桿菌衍生的tac啟動子的活性高約10%(參見生物技術學刊快報期刊(Biotechnol.Lett.)25，1311至1316，2003)。另外，作為自棒狀桿菌氨生成衍生的強啟動子，具有各種強度位準的Pcj1至Pcj7啟動子已開發且具有至少是tac啟動子的活性的10倍的強啟動子活性(參見KR 10-0620092)。另外，自黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)MJ-233(FERM BP-1497)衍生的啟動子據報導具有比tac啟動子的活性強的活性，但在除屬於短桿菌屬的微生物以外的微生物中難以表現(參見US 5,593,781)。
就此而言，當本發明概念的發明人探究包含在多種不同微生物中可具有各種強度位準的啟動子序列的區域時，根據本發明概念合成的新啟動子被發現表現在多種不同微生物中並且展現比本領域中已知的現有啟動子的表現效應強得多的表現效應，藉此完成本發明概念。
一或多個例示性實施例包含新啟動子、包括所述新啟動 子的表現調節序列、包含所述新啟動子的載體、包含所述載體的宿主細胞，以及藉由使用所述宿主細胞產生目標產物的方法。
現將詳細參考例示性實施例，所述實施例的實例在附圖中說明，其中相同參考數字在全文中指代相同元件。就此而言，本發明實施例可具有不同形式且不應被解釋為限於本文中所闡述的描述。因此，下文僅藉由參看諸圖描述例示性實施例以解釋本發明描述的態樣。如本文中所使用，術語「及/或」包含相關聯所列項目中的一或多者中的任一者以及所有組合。
額外態樣將部分在接下來的描述中闡述，並且部分將自描述顯而易見，或可藉由實踐所提出的實施例來獲悉。
根據一或多個例示性實施例，提供一種啟動子，其包括由SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列。在本發明概念中，所述啟動子被稱為「02啟動子」(在下文中，稱作「Po2」)。
如本文中所使用的術語「啟動子」指DNA區域，RNA聚合酶組合至所述DNA區域以允許引發以操作方式連結(operatively linked)至所述啟動子的基因的轉錄，且可定位於引發位點的5'端處以用於mRNA的轉錄。
具有如本文中所使用的啟動子活性的多核苷酸可根據若 干技術(諸如定向進化(directed evolution technique)技術或定點突變誘發(site-directed mutagenesis)技術)的近期研究修改至某些程度。舉例而言，與由SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列具有70%或大於70%、80%或大於80%、90%或大於90%或95%或大於95%的同源性的啟動子亦包含在本發明概念的範疇內。
如本文中所使用的術語「同源性」指多核苷酸序列之間的序列一致性的程度(以百分比表示)。在本說明書中，等同於給定多核苷酸序列的序列或具有與給定多核苷酸序列的活性類似的活性的序列的同源性以「%同源性」表示。舉例而言，多核苷酸序列的同源性可藉由使用標準軟體(例如，BLAST 2.0)計算諸如分數、識別碼及相似性的參數而判定。替代地，多核苷酸序列的同源性可藉由根據在經界定嚴格條件下執行的雜化方法比較序列來識別。用於雜化方法的經定義且適當的條件可考慮在本領域具有知識者(下文參見桑布魯克等人(Sambrook et al.)的著作，1989)所熟知的方法來判定。
根據一或多個例示性實施例，提供一種控制靶基因的表現的表現調節序列，其包括由SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列。
如本文中所使用的術語「表現調節序列」指用於以操作方式連結至宿主生物體中的DNA序列的編碼序列的表現的DNA序列。此表現調節序列可包含引發轉錄所需的啟動子、用於調節轉錄的操作子(operator)序列、編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列以及用於調節轉錄及翻譯的終止的序列。舉例而言，適合於原核生物的表現調節序列可包含啟動子、操作子序列以及核糖體結合位點，但不限於此。表現調節序列包含可構成本發明概 念的Po2，必要時，本領域具有知識者可構成如上所述的表現調節序列。
根據一或多個例示性實施例，提供一種載體，其包含所述表現調節序列及以操作方式連結至所述表現調節序列的靶基因。
如本文中所使用的術語「以操作方式連結」指控制靶基因(例如，啟動子)的表現調節序列與其他核苷酸序列之間的連結。就此而言，所述表現調節序列可能能夠控制其他核苷酸序列的轉錄及/或翻譯。
如本文中所使用的術語「載體」指DNA產物，其包含多核苷酸的鹼基序列以編碼以操作方式連結至適當表現調節序列的靶蛋白以表現所述靶蛋白。另外，多個核苷酸序列可結合至所述載體或與所述載體重新組合，使得具有適當3'-未轉錄序列的選定基因的DNA序列以及啟動子可被引入至細胞中。不管宿主細胞的基因體如何，所述載體可用於適當宿主細胞中之轉化，且接著可被複製。替代地，所述載體可整合至宿主細胞的基因體中。另外，所述載體可包含啟動子或其變體以及靶基因，且此外，可包含複製起點、啟動子調節位點、核糖體結合位點、轉錄終止位點、選擇性標識物或其組合。
本發明概念中所使用的載體不受特別限制，只要所述載體可在宿主細胞中複製，且可使用本領域中的任何可用載體。本領域中通常所使用的載體的實例包含天然的或重組的質體載體、黏質體載體、病毒載體以及噬菌體載體。噬菌體載體及黏質體載體的實例包含pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、 λAPII、λt10、λt11、Charon4A以及Charon21A，且質體載體的實例包含基於pBR、基於pUC、基於pBluescriptII、基於pGEM、基於pTZ、基於pCL以及基於pET的載體，但所述載體不限於此。
靶基因指編碼產物以過量表現(expression in an excess amount)的基因。舉例而言，靶基因可為選自由以下各者組成之群的產物的產生中所涉及的基因：胺基酸(例如，L-胺基酸)、有機酸及其組合。詳細地，靶基因可為編碼胺基酸的生物合成中所涉及的酶的基因、編碼有機酸的生物合成中所涉及的酶的基因或編碼導出(exporting)目標產物中所涉及的蛋白的基因，但不限於此。
根據一或多個例示性實施例，提供一種包含載體的宿主細胞，其中所述載體包含控制靶基因且包含具有由SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列的啟動子的表現調節序列，以及以操作方式連結至所述表現調節序列的靶基因。
所述宿主細胞不受特別限制，只要用作所述宿主細胞的微生物能夠引入載體，所述載體包含控制靶基因且包含具有由SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列的啟動子的表現調節序列以及以操作方式連結至所述表現調節序列的靶基因。所述宿主細胞可為原核細胞及真核細胞兩者，但在例示性實施例中，可為原核細胞。舉例而言，所述宿主細胞可包含屬於以下各者的微生物的菌株：艾氏菌(Escherichia)屬、伊文氏桿菌(Erwinia)屬、沙雷菌(Serratia)屬、普羅威登斯菌(Providencia)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬以及短桿菌(Brevibacterium)屬。舉例而言，所述宿主細胞可為屬於棒狀桿菌屬或艾氏菌屬的微生物的菌 株。舉例而言，所述宿主細胞可為屬於以下各者的微生物的菌株：大腸桿菌、谷胺酸棒狀桿菌、熱產胺棒狀桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、黃色短桿菌或乳糖醯酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)。
載體的引入可如本領域中所描述藉由根據宿主細胞選定合適技術來執行。載體的引入可藉由(例如)以下各者執行：電穿孔、熱休克、磷酸鈣(CaPO4)沈澱、氯化鈣(CaCl2)沈澱、顯微注射、聚乙二醇(PEG)、DEAE-聚葡萄糖方法、陽離子脂質體方法、乙酸鋰-DMSO方法或其組合，但不限於此。
根據一或多個例示性實施例，提供一種產生目標產物的方法，所述方法包含：在培養基中培養宿主細胞，其中所述宿主細胞包括載體，所述載體包含包括具有由SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列的啟動子的表現調節序列，以及以操作方式連結至所述表現調節序列的靶基因；以及自所述宿主細胞或包含所述經培養宿主細胞的所述培養基回收所述目標產物。
所述目標產物可選自由胺基酸(例如，L-胺基酸)、有機酸及其組合組成之群。如本文中所使用的術語「胺基酸」或「L-胺基酸」通常指構成生物體的蛋白質的基本單元，其中胺基酸基團及羧基連結至同一碳原子。胺基酸可選自由以下各者組成之群：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、半胱胺酸、胱胺酸、甲硫胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺、麩胺酸、二碘酪胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、脯胺酸、羥脯胺酸及其組合，但不限於此。如本文中所使用的術語「有機酸」指具有酸性的有機化合物，且例如可 包含具有羧基及磺酸基的有機化合物。有機酸可包含(例如)乳酸、乙酸、丁二酸、丁酸、棕櫚酸、草酸、酒石酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸或檸檬酸，但不限於此。
宿主細胞的培養可根據本領域中已知的典型方法執行。用於宿主細胞的培養的培養基可包含(分別地或作為混合物)作為糖來源的以下各者：糖及碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉以及纖維素；油及脂肪，諸如大豆油、葵花油、蓖麻油以及椰子油；脂肪酸，諸如棕櫚酸、硬脂酸以及亞麻油酸；醇類，諸如甘油以及乙醇；以及有機酸，諸如乙酸，但不限於此。用於宿主細胞的培養的培養基可包含(分別地或作為混合物)作為氮來源的以下各者：腖(peptones)、酵母提取物、肉類提取物、麥芽提取物、玉米浸液、黃豆粕以及尿素或諸如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨或硝酸銨等無機化合物，但不限於此。用於宿主細胞的培養的培養基可包含作為磷來源的以下各者：磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或其對應的含鈉鹽，但不限於此。用於宿主細胞的培養的培養基可包含生長所需的金屬鹽(諸如硫酸鎂或硫酸鐵)，但金屬鹽不限於此。另外，在宿主細胞的培養期間，可將必需生長物質(諸如胺基酸及維生素)或合適前驅物添加至培養基。此等材料可在宿主細胞的培養期間以適當方式添加至培養基，且例如可以分批或連續方式添加。
此外，在宿主細胞的培養期間，可將諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸以及硫酸的化合物以合適方式添加至培養基，以調節培養基的pH。另外，在宿主細胞的培養期間，諸如脂肪酸聚二醇酯的抗形成劑可用以防止泡沫產生。為了維持培養基的有 氧條件，可將氧氣或含氧氣體(例如空氣)引入培養基中。在此，培養基的溫度可在約20℃至約45℃(例如約25℃至約40℃)範圍中。另外，宿主細胞的培養可繼續，直至獲得所要量的目標產物，且就此而言，宿主細胞的培養可繼續約10小時至160小時。
目標產物自宿主細胞或包含經培養宿主細胞的培養基的回收可經由本領域中已知的適當反應執行(亦即，分離或回收)。舉例而言，適當反應可根據使用以下各者的處理進行：蛋白質沈澱劑(亦即，鹽析方法)、離心、萃取、音波處理、超過濾、透析、各種層析技術(諸如分子篩層析法(亦即，凝膠過濾)、吸附層析法、離子交換層析法、親和性層析法)及其組合，但不限於此。就此而言，所產生的目標產物可自宿主細胞或包含經培養宿主細胞的培養基收集、回收或與之分離。
在下文中，將參考以下實例更詳細地描述本發明概念。然而，此等實例僅用於說明性目的且不欲限制本發明概念的範圍。
實例1：製備包括新啟動子的重組載體以及使用所述重組載體的轉化菌株
(1)製備包括Po2的重組載體以及使用所述重組載體的轉化菌株
就合成引發靶基因的表現的啟動子而言，分析自屬於棒狀桿菌屬的微生物以及屬於埃希氏菌屬的微生物衍生的各種啟動子的序列，藉此合成具有核苷酸序列SEQ ID NO：1的啟動子。合成的啟動子被稱作o2啟動子(在下文中稱為「Po2」)。為了測量用於誘發靶基因表現的Po2活性，將Po2以操作方式連結至GFP基因的開放閱讀框架(open reading frame；ORF)，使得製備重組 載體。接著，用所述重組載體轉化棒狀桿菌及大腸桿菌的菌株中的每一者，藉此製備棒狀桿菌及大腸桿菌的轉化菌株中的每一者。
另外，為了製備具有產生L-胺基酸(諸如L-精胺酸)或分支鏈胺基酸(諸如L-纈胺酸)的增強能力的菌株，作為目標產物的實例，使用Po2增強用於精胺酸或纈胺酸的生物合成基因的表現。
(1.1)製備載體pECCG117-Po2-gfp以及使用所述載體的轉化菌株
(1.1.1)製備載體
藉由使用合成的Po2作為模板以及包含KpnI/EcoRV限制位點的SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3的引子集合來執行PCR。根據以下循環來執行PCR：在94℃的溫度下變性歷時5分鐘，在94℃的溫度下變性歷時30秒，在60℃的溫度下退火歷時30秒，以及在72℃的溫度下聚合歷時30秒，其中所述循環執行30次。之後，在72℃的溫度下再次對菌株執行聚合歷時7分鐘，藉此從而獲得具有約100bp的長度的Po2。
藉由使用pGFPuv載體(由美國Clontech製造)作為模板以及包含PstI/EcoRV限制位點的SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5的引子集合來執行PCR。根據以下循環來執行PCR：在94℃的溫度下變性歷時5分鐘，在94℃的溫度下變性歷時30秒，在55℃的溫度下退火歷時30秒，以及在72℃的溫度下聚合歷時1分鐘，其中所述循環執行30次。之後，在72℃的溫度下再次執行聚合歷時7分鐘，藉此從而獲得包含GFP基因的ORF的SEQ ID NO：6。
在可在大腸桿菌及棒狀桿菌中表現的穿梭載體 pECCG117(參見生物技術快報(Biotechnology letters)第13卷，第10期，721至726頁(1991))的PstI及KpnI位點處，Po2經限制酶PstI及EcoRV處理且GFP基因的ORF經限制酶KpnI及EcoRV處理。接著，藉由使用DNA共軛酶將經處理Po2及GFP基因的ORF以操作方式彼此連結，藉此製造重組載體，其中Po2及GFP基因彼此連結。此處，重組載體被稱為pECCG117-Po2-gfp。
(1.1.2)使用所述載體製備轉化菌株
藉由電脈衝方法用載體pECCG117及重組載體pECCG117-Po2-gfp中的每一者轉化谷胺酸棒狀桿菌ATCC13032，且接著，自含有25mg/L卡那黴素的選擇性培養基獲得轉化菌株。用載體pECCG117及重組載體pECCG117-Po2-gfp轉化的所獲得菌株各自被稱為ATCC13032/pECCG117及ATCC13032/pECCG117-Po2-gfp。
另外，藉由熱衝擊方法用重組載體pECCG117-Po2-gfp轉化大腸桿菌DH5α，且接著，自含有25mg/L卡那黴素的魯利亞-貝爾塔尼(Luria-Bertani；LB)瓊脂培養基獲得轉化菌株。所獲得菌株被稱為DH5α/pECCG117-Po2-gfp且具有寄存編號「CA01-2290」。根據國際承認用於專利程序的微生物保存的布達佩斯條約的條款，CA01-2290於2014年10月23日以KCCM11591P的寄存編號寄存在韓國微生物培養中心(Korean Culture Center of Microorganisms；KCCM)。
(1.2)製備載體pECCG117-Po2-argJ以及使用所述載體的轉化菌株
(1.2.1)製備載體
就合成載體(其中用於精胺酸的增強產生的主要生物合成基因(例如編碼雙功能鳥胺酸乙醯基轉移酶/N-乙醯基谷胺酸合成酶的argJ基因(Ncgl1341，SEQ ID No：7))是藉由Po2表現)而言，重組載體pECCG117-Po2-gfp用以製備載體pECCG117-Po2-argJ。
詳細地說，藉由使用谷胺酸棒狀桿菌ATCC13869的染色體作為模板以及SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9的引子集合而對菌株執行PCR，藉此確保DNA片段包含argJ基因。根據以下循環來執行PCR：在94℃的溫度下變性歷時1分鐘，在58℃的溫度下退火歷時30秒，以及藉由使用Pfu聚合酶在72℃的溫度下聚合歷時2分鐘，其中所述循環執行30次。因此，擴增具有約1,201bp的長度且在5'端上包含EcoRV及3'PstI限制酶位點的片段。藉由PCR產生的擴增片段經純化，與載體pECCG117-Po2-gfp(經EcoRV及PstI限制酶處理)混合，且接著使用In-fusion選殖套組接合在一起，藉此製備重組載體，所述重組載體被稱為pECCG117-Po2-argJ。
(1.2.2)使用所述載體製備轉化菌株
藉由電脈衝方法用重組載體pECCG117-Po2-argJ轉化谷胺酸棒狀桿菌KCCM10741P(其為產生精胺酸的菌株)(參見KR 10-0791659)，且接著，自含有25mg/L卡那黴素的選擇性培養基獲得轉化菌株。所獲得菌株被稱為KCCM10741P/pECCG117-Po2-argJ。
(1.3)製備載體pECCG117-Po2-ilvE以及使用所述載體的轉化菌株
(1.3.1)製備載體
就合成載體(其中用於纈胺酸的增強產生的主要生物合成基因(例如編碼分支鏈胺基酸的轉胺酶的ilvE基因(Ncgl2123，SEQ ID NO：10))是藉由Po2表現)而言，重組載體pECCG117-Po2-gfp用以製備載體pECCG117-Po2-ilvE。
詳細地說，藉由使用谷胺酸棒狀桿菌ATCC14067的染色體作為模板以及SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12的引子集合而對菌株執行PCR，藉此確保DNA片段包含ilvE基因。根據以下循環來執行PCR：在94℃的溫度下變性歷時1分鐘，在58℃的溫度下退火歷時30秒，以及藉由使用Pfu聚合酶在72℃的溫度下聚合歷時2分鐘，其中所述循環執行30次。因此，擴增具有約1,201bp的長度且在5'端上包含EcoRV及3'PstI限制酶位點的片段。藉由PCR產生的擴增片段經純化，與載體pECCG117-Po2-gfp(經EcoRV及PstI限制酶處理)混合，且接著使用In-fusion選殖套組接合在一起，藉此製備重組載體，所述重組載體被稱為pECCG117-Po2-ilvE。
(1.3.2)使用所述載體製備轉化菌株
藉由電脈衝方法用重組載體pECCG117-Po2-ilvE轉化谷胺酸棒狀桿菌KCCM111201P(其為產生纈胺酸的菌株)(參見KR 10-1117022)，且接著，自含有25mg/L卡那黴素的選擇性培養基獲得轉化菌株。所獲得菌株被稱為KCCM11201P/pECCG117-Po2-ilvE。
比較例1：製備包含控制啟動子的重組載體以及使用所述載體的轉化菌株
為了量測Po2表現誘發活性，使用GFP基因將已知強啟動子(例如，Ptrc、Pcj1、Pcj4或Pcj7(參見KR 10-0620092))或野生型啟動子(例如，aceEP(WT))以操作方式連結至GFP基因的ORF以製備重組載體。接著，用所述重組載體轉化棒狀桿菌及大腸桿菌的菌株中的每一者，藉此製備棒狀桿菌及大腸桿菌的轉化菌株中的每一者。
另外，為了評估包含使用Po2用於靶基因的增強產生的主要生物合成基因的轉化菌株，分別準備包含用於精胺酸的增強產生的主要生物合成基因的轉化菌株或包含用於纈胺酸的增強產生的主要生物合成基因的轉化菌株。
(1)製備就與Po2的活性比較而言具有不同於Po2的啟動子的gfp表現載體以及谷胺酸棒狀桿菌的轉化菌株
基於美國國立衛生研究院(NIH基因銀行)確保aceEP(WT)的鹼基序列，且藉由使用野生型谷胺酸棒狀桿菌ATCC13032的染色體作為模板以及包含KpnI/EcoRV限制位點的SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14的引子集合對鹼基序列執行PCR。以與實例1的(1.1)中的方式相同的方式執行PCR，藉此製備稱為pECCG117-aceEP(WT)-gfp的重組載體。
以與實例1的(1.1)中的方式相同的方式，用製備的載體pECCG117-aceEP(WT)-gfp及載體pECCG117-Pcj1-gfp、pECCG117-Pcj4-gfp以及pECCG117-Pcj7-gfp(參見KR 10-0620092)轉化谷胺酸棒狀桿菌的菌株，藉此製備轉化菌株，所述轉化菌株分別被稱為ATCC13032/pECCG117-aceEP(WT)-gfp、ATCC13032/pECCG117-Pcj1-gfp、ATCC13032/pECCG117-Pcj4-gfp 以及ATCC13032/pECCG117-Pcj7-gfp。
(2)製備就與Po2的活性比較而言具有不同於Po2的啟動子的gfp表現載體以及大腸桿菌的轉化菌株
基於美國國立衛生研究院(NIH基因銀行)確保Ptrc的鹼基序列，且藉由使用pTrc99A(NCBI基因銀行，M22744)作為模板以及包含KpnI/EcoRV限制位點的SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16的引子集合對鹼基序列執行PCR。以與實例1的(1.1)中的方式相同的方式執行PCR，藉此製備稱為pECCG117-Ptrc-gfp的重組載體。
以與實例1的(1.1)中的方式相同的方式，大腸桿菌的菌株為製備的載體pECCG117-Ptrc-gfp及載體pECCG117-Pcj1-gfp及pECCG117-Pcj4-gfp中的每一者，藉此製備轉化菌株，所述轉化菌株分別被稱為DH5α/pECCG117-Ptrc-gfp、DH5α/pECCG117-Pcj1-gfp以及DH5α/pECCG117-Pcj4-gfp。
(3)製備就與Po2的靶產物產生能力比較而言具有不同於Po2的啟動子的轉化菌株
(3.1)製備谷胺酸棒狀桿菌的轉化菌株，所述轉化菌株具有精胺酸產生能力
除PCR是藉由使用SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：17的引子集合執行以外，以與實例1的(1.2.1)中的方式相同的方式，使用載體pECCG117-Pcj7-gfp製備稱為pECCG117-Pcj7-argJ的載體。
接著，以與實例1的(1.2.2)中的方式相同的方式，藉由使用載體pECCG117-Pcj7-argJ來製備轉化菌株，且所述轉化菌 株被稱為KCCM10741P/pECCG117-Pcj7-argJ。
(3.2)製備谷胺酸棒狀桿菌的轉化菌株，所述轉化菌株具有纈胺酸產生能力
除PCR是藉由使用SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：18的引子集合執行以外，以與實例1的(1.3.1)中的方式相同的方式，使用載體pECCG117-Pcj7-gfp載體製備稱為pECCG117-Pcj7-ilvE的載體。
接著，以與實例1的(1.3.2)中的方式相同的方式，藉由使用載體pECCG117-Pcj7-i1vE來製備轉化菌株，且所述轉化菌株被稱為KCCM11201P/pECCG117-Pcj7-ilvE。
實例2：確認用於誘發靶基因表現的Po2活性
(1)確認用於在谷胺酸棒狀桿菌中誘發靶基因表現的Po2活性
為了量測用於在谷胺酸棒狀桿菌的轉化菌株中誘發靶基因表現的Po2活性，對實例1的(1.1.2)的稱為ATCC13032/pECCG117-Po2-gfp的轉化菌株的綠色螢光蛋白質(green fluorescence protein；GFP)活性的量測值與各自稱為以下各者的轉化菌株的GFP活性的量測值進行比較：實例1的(1.1.2)的ATCC13032/pECCG117，以及比較例1的(1)的ATCC13032/pECCG117-aceEP(WT)-gfp、ATCC13032/pECCG117-Pcj1-gfp、ATCC13032/pECCG117-Pcj4-gfp以及ATCC13032/pECCG117-Pcj7-gfp。
按1：20的體積比在含有25ml種子培養基的250ml角瓶中接種上文的谷胺酸棒狀桿菌的轉化菌株中的每一者，接著在30 ℃的溫度下(以約200rpm的速度)搖晃培養，直至菌株在培養中期階段中生長(OD600=10.0)。在培養完成後，藉由離心(以約5,000rpm的速度進行約15分鐘)收集細胞。用0.1% Tris-HCl(pH 8.0)緩衝溶液洗滌收集到的細胞兩次，接著使細胞懸浮於所述緩衝溶液中以達成610nm下的約160的渾濁度。在以1.25g/1.5ml將玻璃珠添加至懸浮液之後，藉由使用珠磨器破壞細胞歷時6分鐘。藉由離心(以約15,000rpm的速度進行約20分鐘)收集含有細胞提取物的清液層，接著根據布拉福方法(參見Bradford,M.M 1976.分析生物化學期刊(Anal.Biochem.)72：248-254)就其中的蛋白質濃度進行定量量測。接著，使用勞瑞爾戈里(Laure Gory)的方法或類似者用488nm激發波長下的光照射相同量的細胞提取物，且藉由使用LS-50B分光光度計(珀金-埃爾默(Perkin-Elmer))量測511nm發射波長下的光，藉此判定GFP基因的表現。量測菌株中的每一者中的GFP活性的結果展示於表1中。
[種子培養基]
以1L蒸餾水計，包括20g葡萄糖、5g硫酸銨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5g MgSO47H2O、150μg生物素、1.5mg鹽酸噻胺、3mg泛酸鈣以及3mg煙鹼醯胺( )，且pH值為7.2。
如表1的結果中所示，確認Po2在谷胺酸棒狀桿菌中具有啟動子活性，且稱為ATCC13032/pECCG117-Po2-gfp的菌株顯現至少為野生型ATCC13032/pECCG117-aceEP(WT)-gfp菌株的螢光強度的13倍的螢光強度。另外，確認稱為ATCC13032/pECCG117-Po2-gfp的菌株以比使用已知強啟動子(例如，Pcj1、Pcj4以及Pcj7)的分別稱為ATCC13032/pECCG117-Pcj1-gfp、ATCC13032/pECCG117-Pcj4-gfp以及ATCC13032/pECCG117-Pcj7-gfp的菌株的螢光強度高許多的位準顯現螢光強度。因此，確認Po2作為用以表現靶基因的強啟動子。
(2)確認用於在大腸桿菌中誘發靶基因表現的Po2活性
為了量測用於在大腸桿菌的轉化菌株中誘發靶基因表現的Po2活性，對實例1的(1.1.2)的稱為DH5α/pECCG117-Po2-gfp的轉化菌株的GFP活性的量測值與各自稱為以下各者的轉化菌株的GFP活性的量測值進行比較：比較例2的(2)的DH5α/pECCG117-Ptrc-gfp、DH5α/pECCG117-Pcj1-gfp以及DH5α/pECCG117-Pcj4-gfp。
按1：20的體積比在含有25ml含卡那黴素的LB培養基的250ml角瓶中接種上文的大腸桿菌的轉化菌株中的每一者，接著在30℃的溫度下(以約200rpm的速度)搖晃培養，直至菌株在培養中期階段中生長(OD600=3.0)。在培養完成後，藉由離心(以約5,000rpm的速度進行約15分鐘)收集細胞，用0.1% Tris-HCl(pH 8.0)緩衝溶液洗滌收集到的細胞兩次，接著使細胞懸浮於所述緩衝溶液中，藉由音波處理進行破壞，接著經受離心(以約 15,000rpm的速度進行約20分鐘)，從而獲得含有細胞提取物的清液層。根據布拉福方法就清液層中的蛋白質濃度對清液層進行定量量測。接著，使用勞瑞爾戈里的方法或類似者用488nm激發波長下的光來照射相同量的細胞提取物，且藉由使用LS-50B分光光度計(珀金-埃爾默)量測511nm發射波長下的光，藉此判定GFP基因的表現。量測菌株中的每一者中的GFP活性的結果展示於表2中。
如表2的結果中所示，確認Po2在大腸桿菌中具有啟動子活性，且稱為DH5α/pECCG117-Po2-gfp的菌株以類似於稱為DH5α/pECCG117-Ptrc-gfp(被稱為強啟動子)的菌株的螢光強度且高於DH5α/pECCG117-Pcj4-gfp菌株的螢光強度的位準顯現螢光強度。因此，確認Po2作為用以在大腸桿菌中表現靶基因的強啟動子。
實例3：評估用於增強目標產物產生能力的菌株
(1)評估用於精胺酸的增強產生的菌株
關於評估影響精胺酸的產量的因素，當用於精胺酸的主要生物合成基因(亦即，argJ基因)是藉由使用Po2表現時，對實例1的(1.2.2)的稱為KCCM10741P/pECCG117-Po2-argJ的菌株(其用作用於argJ基因的增強產生的菌株)與稱為KCCM10741P 的非轉化菌株(不具有經轉化的精胺酸可產生能力)以及比較例1的(3.1)的稱為KCCM10741P/pECCG117-Pcj7-argJ的菌株的精胺酸產生能力進行比較。
在含有25ml產生培養基(production medium)的250ml角瓶中接種1圈上文的轉化菌株中的每一者，接著在30℃的溫度下以約200rpm的速度搖晃培養歷時48小時。在培養完成後，藉由HPLC來量測L-精胺酸的產量。量測L-精胺酸的產量的結果展示於表3中。
[產生培養基]
包括6%葡萄糖、3%硫酸銨、0.1%磷酸一鉀、0.2%七水合硫酸鎂、1.5%玉米漿(corn steep liquor；CSL)、1%NaCl、0.5%酵母提取物以及100μg/L生物素，且pH值為7.2。
如表3的結果中所示，確認Po2導致谷胺酸棒狀桿菌中的精胺酸的改良產量，其中argJ基因的表現被增強。詳言之，谷胺酸棒狀桿菌中的精胺酸產量與對照菌株中的精胺酸產量相比增加約84%，且與稱為KCCM10741P/pECCG117-Pcj7-argJ的菌株中的精胺酸產量相比增加約23%。因此，確認Po2影響argJ基因的增強表現。
(2)評估用於L-纈胺酸的增強產生的菌株
關於評估影響纈胺酸的產量的因素，當用於纈胺酸的主 要生物合成基因(亦即，ilE基因)是藉由使用Po2表現時，對實例1的(1.3.2)的稱為KCCM11201P/pECCG117-Po2-ilvE的菌株(其用作用於ilvE基因的增強產生的菌株)與稱為KCCM11201P的非轉化菌株(不具有經轉化的L-纈胺酸可產生能力)以及比較例1的(3.2)的稱為KCCM11201P/pECCG117-Pcj7-ilvE的菌株的L-纈胺酸產生能力進行比較。
在含有25ml產生培養基的250ml角瓶中接種1圈上文的轉化菌株中的每一者，接著在30℃的溫度下以約200rpm的速度搖晃培養歷時72小時。在培養完成後，藉由HPLC來量測L-纈胺酸的產量。量測L-纈胺酸的產量的結果展示於表4中。
[產生培養基]
包括5%葡萄糖、2%硫酸銨、0.1%磷酸一鉀、0.05%七水合硫酸鎂、2.0%CSL以及200μg/L生物素，且pH值為7.2。
如表4的結果中所示，確認Po2導致谷胺酸棒狀桿菌中的纈胺酸的產量改良，其中ilvE基因的表現被增強。詳言之，稱為KCCM11201P/pECCG117-Po2-ilvE的菌株中的纈胺酸產量與對照菌株中的纈胺酸產量相比顯著增加約32%，且與稱為KCCM10741P/pECCG117-Pcj7-ilvE的菌株中的纈胺酸產量相比增加約17%。因此，確認Po2影響ilvE基因的增強表現。根據上文的例示性實施例中的一或多個，新啟動子可具有根據用以誘發靶 基因的表現的微生物的各種活性。就此而言，新啟動子可在靶基因的活性在目標產物的產生期間需要受控制的情形下使用，從而導致目標產物的高效產生。
應理解，本文中所描述的例示性實施例應僅視為描述性意義，而非出於限制的目的。每一例示性實施例內的特徵或態樣的描述通常應被視為可用於其他例示性實施例中的其他類似特徵或態樣。
雖然已參看諸圖描述一或多個例示性實施例，但在本領域具有通常知識者將理解，可在不脫離如由所附申請專利範圍所定義的本發明概念的精神以及範疇的情況下在其中進行形式以及細節的各種改變。
【生物材料寄存】 [國內寄存資訊]
寄存機構：財團法人食品工業發展研究所
寄存日期：2016年04月13日
寄存編號：BCRC940659
[國外寄存資訊]
寄存機構：韓國微生物培養中心(國際)
寄存日期：2014年10月23日
寄存編號：KCCM11591P
<110> CJ第一製糖股份有限公司
<120> 新啟動子及其使用
<130> PX051110
<150> KR 2015-0014587
<151> 2015-01-29
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> o2啟動子的DNA序列
<400> 1
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> o2啟動子的正向引子
<400> 2
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> o2啟動子的反向引子
<400> 3
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於pGFPuv的PCR的正向引子
<400> 4
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於pGFPuv的PCR的反向引子
<400> 5
<210> 6
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP的DNA序列
<400> 6
<210> 7
<211> 1167
<212> DNA
<213> 谷胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 7
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於argJ的PCR的正向引子
<400> 8
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於argJ的PCR的反向引子
<400> 9
<210> 10
<211> 1104
<212> DNA
<213> 谷胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 10
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於ilvE的PCR的正向引子
<400> 11
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於ilvE的PCR的反向引子
<400> 12
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於aceP(WT)的PCR的正向引子
<400> 13
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於aceP(WT)的PCR的反向引子
<400> 14
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於trcP的PCR的正向引子
<400> 15
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於trcP的PCR的反向引子
<400> 16
無

Claims (7)

  1. 一種啟動子，其由SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列所組成。
  2. 一種表現調節序列，包括如申請專利範圍第1項所述的啟動子。
  3. 一種載體，包括如申請專利範圍第2項所述的表現調節序列以及以操作方式連結至所述表現調節序列的靶基因。
  4. 一種宿主細胞，包括如申請專利範圍第3項所述的載體。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞為屬於棒狀桿菌屬或埃氏菌屬的細菌細胞。
  6. 一種產生目標產物的方法，所述方法包括：培養如申請專利範圍第4項或第5項所述的宿主細胞；以及自所述宿主細胞或包含所述經培養宿主細胞的培養基回收所述目標產物。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中所述目標產物為胺基酸。
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