JPS6240999B2 - - Google Patents
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Description
本発明は遺伝子工学の分野に関するものであ
り、より詳しくは、プロキモシン遺伝子を含有す
る組換えDNAの調製とそれらを利用して、プロ
キモシンを大量に生産するための微生物を得る方
法に関する。 「遺伝子工学」とは外部遺伝子と適当なベクタ
ーを含有する組換えDNAを形成し、希望する遺
伝情報に基づいてDNAを選択し、そして選択さ
れたDNAを適当な宿主微生物に導入し、これら
の過程によつて外部の遺伝情報が宿主の遺伝補体
となる、一連の生体外での操作技術を意味する。
この技術によつて調製され遺伝子操作をほどこさ
れた微生物は、適当な培養条件のもとで、外部遺
伝子をその細胞中で発現することが可能であり、
該遺伝子がコードする物質（例えば、酵素、ホル
モン、蛋白質等）を産生することができる。 本明細書中に記載された酵素蛋白質キモシンは
またレンニンとして知られている。これは予め反
芻する子牛の胃の中に見い出される主要な加水分
解性蛋白であり、牛乳を凝固する。そのためキモ
シンは長い間、チーズ製造業に於いて、ミルクカ
ゼインを凝固させるのに使用されてきた。キモシ
ンは分子量35652で323個のアミノ酸からなる。キ
モシンとして、キモシンＡとキモシンＢが存在す
ることが知られている。これらはヌクレオチド配
列中、アミノ酸コドン286位（ヌクレオチド857
位）が異なつており、キモシンＡではコドン
GATであるところ、キモシンＢではコドンGTT
であろう。プロキモシン（別名プロレンニン）は
キモシン分子のアミノ末端に42個の付加アミノ酸
を有するキモシンの前駆体であり、酸性条件下、
その付加アミノ酸を失うことによりキモシンその
ものに変換される。プロキモシンは分子量40777
で365個のアミノ酸からなる。プロキモシンの完
全なアミノ酸配列はB.Foltmannら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、74、2321（1977）に記載されて
いるが、後にアミノ酸位置数ケ所に誤まりが発見
されたので、正しいアミノ酸配列とプロキモシン
の完全なDNA配列を第１図に示す。 キモシンは、生後間もない仔牛の第４胃の粘膜
から分泌されるため、商業生産では仔牛の胃から
得られてきた。ところが、仔牛からキモシンを得
るには数々の問題がある。この方法は非常に複雑
ないくつもの工程を必要とし、大量のキモシンを
確保するには困難がありすぎる。更に、方法自体
経済的でなく、近年、商業需要に追いつかない状
態である。このような理由から、チーズ製造業で
は幾つかの代替物が使用を認められている。これ
ら代替物の主要なものは微生物起源のレンネツト
でありムコール・プシラス（Mucor pusillous）、
ムコール・ミーハイ（Mucor miehei）、エンドシ
ア・パラシチカ（Endothia parasitica）があ
る。しかしながら、微生物レンネツトはかなり強
い蛋白質分解作用を持つており、チーズ熟成に
は、基質特異性が高く蛋白質分解性が弱いキモシ
ン程適合してはいない。従つて、大量のキモシン
を提供することは商業的に重要な意義がある。 本発明の工程は新規の発現プラスミドを利用す
るものであり、それらは以前に調製された公知の
組換えプラスミドからプロキモシンをコードする
遺伝子を有するDNAを単離し、適当なベクター
に挿入することにより調製される。発現プラスミ
ドは形質転換が可能な条件で感受性ある微生物を
形質転換するのに用いられる。微生物は、組換え
発現プラスミドを含有する形質転換株を収穫でき
る条件で、培養される。一旦宿主微生物が形質転
換されると、微生物の細胞は、微生物を適当な育
成培地で培養することにより、繰り返し、繁殖さ
れキモシンをコードする遺伝子が微生物の細胞内
に発現される。こうして微生物の醗酵によるプロ
キモシンの大量生産が実現可能になり、プロキモ
シンを適正な価格で提供できるようになるだろ
う。 本発明に関連ある公知文献は、米国特許
4237224号（コーヘン・ボイヤー）、特願昭56−
131631号〔特開昭58−32896号〕（別府輝彦）、西
森ら、Gene、19、337（1982）、特開昭57−
141287号（コラボラテイブ・リサーチ）、特開昭
58−9687号（セルテツク・リミテツド）である。
特に、本出願人による特願昭56−131631号（昭和
56年８月24日出願）には、lacUVプロモータと大
腸菌ベーターガラスクトシダーゼのＮ―末端アミ
ノ酸に接合されたプロキモシンcDNAのほとんど
全配列を含有する発現プラスミドが開示されてい
る。 本発明の一つの目的は新規な発現プラスミドを
調製するのに用いる特定のプロキモシン遺伝子を
提供することにある。 本発明の別の目的は新規な発現プラスミドを提
供し、更に、宿主微生物細胞内にプロキモシンの
高い発現を得る為に該プラスミドを利用すること
にある。 本発明の他の目的は該プラスミドを調製する方
法を提供することにある。 本発明のさらに別の目的は大腸菌lac・オペロ
ン・プロモーターの代りに大腸菌トリプトフア
ン・オペロン・プロモーターを用いることにあ
る。 本発明のさらに別の目的は今まで知られている
微生物よりも実質的により多量のプロキモシンを
産生可能な遺伝子操作された微生物を得ることに
ある。 本発明のさらに別の目的は遺伝子操作された微
生物を用いてプロキモシンを生産する方法を提供
することにある。 本発明のさらに他の目的は前記目的に一致する
方法によつて生産されたプロキモシを提供するこ
とにある。 特には、本発明はプラスミドpCR501、
PCR601そしてpCR701からなる群から選ばれる
発現プラスミドを含有しプロキモシンを産生する
ことができる大腸菌及びそれらの遺伝子工学的製
法に関する。 本明細書中で用いられるプロキモシン遺伝子と
はプロキモシンをコードするすべてのヌクレオチ
ド配列として定義され、第１図に示されるヌクレ
オチド配列中のいかなる部分でもかまわない。 本発明の方法によれば、宿主細胞中のプロキモ
シンの発現及び生産は下記の各工程からなつてい
る。 １ 特定のプロキモシン遺伝子を公知の組換えプ
ラスミドから制限酵素切断により単離する。 ２ プロキモシン遺伝子はベクターとともに結合
され発現プラスミドを形成する。もし結合され
たプロキモシン遺伝子がプロキモシン全コーテ
イング配列に対応しない場合には、欠落してい
るヌクレオド配列部分を含む付加的な合成オリ
ゴヌクレオチドを単離した遺伝子にくつつける
ことができる。合成DNA片は好適にはプロキ
モシン遺伝子部分の先端に接合された翻訳開始
コドンを含有していてもよい。 ３ 適当な宿主細胞は発現プラスミドと塩化カル
シウム処理により形質転換される。 ４ アンピシリン耐性形質転換株を選択する。 ５ 形質転換細胞を標準の培養方法により培養す
る。 ６ 細胞の粗抽出物は、ラジオイムノアツセイ法
及び蛋白質プロツテイング法によりプロキモシ
ンの有無が検定される。 前記の公知の組換えプラスミドの中でもつとも
興味のあるプラスミドはpCR301と呼ばれてお
り、西森ら、Gene、19、337（1982）に詳しく記
載されている。プロキモシンンcDNAを含有する
他のプラスミドの調製方法は、西森ら、J.
Biochem.、90、901（1981）そして前記に引用さ
れた他の文献中に見い出される。これらのプラス
ミドはプロキモシン遺伝子の入手源として有用で
あり、通常、下記の方法によつて調製される。 １ プロキモシン遺伝子の伝令RNA（mRNA）
を仔牛の第４胃から単離する。 ２ mRNAを常法により二本鎖DNAに変換す
る。 ３ 合成リンカーを二本鎖DNAの両端に結合す
る。 ４ CDNA分子を適当なベクター・プラスミド
（例えば、pBR322）に導入する。 ５ 組換えプラスミドを次に形質転換により宿主
細胞に入れる。 ６ 正しいクローンをコロニーハイブリダイゼー
シヨン法とハイブリツドアレステツドトランス
レーシヨン法により選択し、プロキモシン遺伝
子の存在を確認する。 ７ クローン中のDNA挿入体はMaxam―Gilbert
法により、塩基配列を決定する。 後に、好ましい実施態様を参照することによ
り、詳しく説明するように、本発明は次の方法を
提供することを理解するべきである。なお、プロ
キモシンコーデイング配列の先端部分が欠如して
いるプロキモシン遺伝子から生産される蛋白質を
プロキモシン類似蛋白質と称し、又、プロキモシ
ンのＮ末端にメチオニンが付着しているプロキモ
シンをＮ末端メチオニルプロキモシンと称し、本
発明においてプロキモシンと呼ぶことがある。 プロキモシン遺伝子を単離すること、転写プロ
モーターおよび翻訳開始コドンを遺伝子に結合し
発現プラスミドを形成させること、発現プラスミ
ドを形質転換とにより宿主細胞に導入すること、
そしてプロキモシン、Ｎ末端メチオニルプロキモ
シンもしくはプロキモシン類似蛋白質の高レベル
の発現を有する形質転換された細胞を選択するこ
とから成り、該プロキモシン遺伝子はクローン化
されたプロキモシンcDNAを含有する組換えプラ
スミドに由来し、且つプロキモシンのコード配列
中少なくとも第５番目の翻訳コドンから配列の末
端までを有する、この配列はtrpL又はtrpE遺伝
子のＮ末端に結合している、大腸菌宿主細胞中で
プロキモシンコード遺伝子を発現させる方法。 プロキモシン遺伝子を単離すること、該遺伝子
から欠落しているプロキモシンのコーデイング配
列部分を有する合成ヌクレオチドを遺伝子に結合
すること、転写プロモーターおよび翻訳開始コド
ン（該合成ヌクレオチドに存在しない時）を遺伝
子に結合し発現プラスミドを形成させること、宿
主細胞を発現プラスミドで形質転換すること、そ
してプロキモシンの高レベルの発現を有する形質
転換された細胞を選択することから成り、該プロ
キモシン遺伝子はクローン化されたプロキモシン
cDNAを含有する組換えプラスミドに由来し、該
合成ヌクレオチドは翻訳開始コドンを有していて
もよい、大腸菌宿主細胞中でプロキモシンコード
遺伝子を発現させる方法。 プロキモシン遺伝子を単離すること、転写プロ
モーターおよび翻訳開始コドンを遺伝子に結合し
発現プラスミドを形成させること、発現プラスミ
ドを形質転換により宿主細胞に導入すること、プ
ロキモシンの高レベルの発現を有する形質転換さ
れた細胞を選択すること、そして細胞を栄養培地
で培養することから成り、該プロキモシン遺伝子
はクローン化されたプロキモシンcDNAを含有す
る組換えプラスミドに由来する、大腸菌宿主細胞
中でプロキモシンコード遺伝子を発現させる手法
によりプロキモシンを生産する方法。 プロキモシン遺伝子とそれに作用的に結合した
ベクターから成り、該ベクターはpBR322に由来
しそして転写プロモータと翻訳開始コドンを含有
する発現プラスミド。 本発明はさらに、特定のプロキモシン遺伝子、
該遺伝子を含むコーデイング配列、新規な発現プ
ラスミドの調整方法、形質転換された微生物、そ
してそれから産生されたプロキモシンをも包含す
ることを理解すべきである。 好適な実施態様 宿主微生物 いかなる微生物でも、望みのベクター・プラス
ミドを受容し、複製できるならば、使用できる。
しかし、本発明では実用的な理由から大腸菌
C600由来株が用いられる。特に好適には、大腸
菌E.coliC600rk -mk -株が用いられる。細胞は通常
知られた培養条件で育成される。例えば、大腸菌
のための培地は次のとおりである。 Ｌ 栄養培地（Ｌ broth） 当り バクト（Bacto）・トリプトン（Difcoラボラトリ
ーズ、テトロイト） 10ｇ バクト酵母抽出物（Difcoラボラトリーズ、デト
ロイト） ５ｇ NaCl 10ｇ グルコース ２ｇ M9栄養培地（M9 brcth） 当り Na2 2HPO4 ６ｇ KH2PO4 ３ｇ NaCl ５ｇ NH4Cl １ｇ CaCl2 15mg MgSO4・7H2O 0.1ｇ Bl（チアミンHCl） 必要ならば５mg casamino acid 2.5ｇ グルコース ５ｇ アンピシリン 50mg ベーターインドリルアクリル酸（３β―
indolylacrylicacid） 15mg 形質転換 通常の形質転換実験は50μｇ／mlのアニピシリ
ンを含むＬ―培地中で、Norqardら、Gene３、
279（1978）の方法に従う。 標準的な技術に於いて、大腸菌は30℃ないし40
℃の温度で、１当り10〜30×1012個細胞の密度
まで生育される。 プロモーター クローン化された遺伝子を宿主細胞中に発現さ
せるには、適当なプロモーターを備えたベクタ
ー・プラスミドを使用することが必要である。所
望の宿主細胞中で活性である限り、数種類のプロ
モーターを使用することができる。望ましくは、
本発明に於て、大腸菌トリプトフアンオペロン・
プロモーターが使用される。 組換えプラスミド pCR301 本発明によれば、遺伝子は便宜上既に公知文献
に記載されている第１次の組換えプラスミドから
得ることができる。これらのプラスミドは様々な
長さを有するプロキモシン遺伝子を含有してい
る。その中幾つかのプラスミドは制限酵素切断に
より正確な遺伝地図がわかつている。それ故、適
当な制限酵素により切断することにより、プロキ
モシン遺伝子の有用な部分を分離し、ベクター・
プラスミドへ第２のクローン化するためのDNA
の材料として用いることができる。このようなプ
ラスミドの代表的なものはpCR301である。プラ
スミドpCR301はラクトースオペロン・プロモー
ターとプロキモシン遺伝子の全長の内最初の４つ
のコドンのみが欠けたヌクレオチド13番（第５コ
ドン）から末端の1095番（第365コドン）までの
DNA配列を含有する。このプラスミドはpBR322
プラスミド（F.BoluarらGene、２、95（1977））
に由来する。プラスミド中の翻訳開始コドンとク
ローン化されたプロキモシン遺伝子との間のヌク
レオチド配列（これはベーターガラクトシダーゼ
のＮ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドに対
応する）を次に示す。 pCR301の制限酵素地図は第３図に示す。 pOCT2 プラスミドpOCT2の母体となるプラスミド
pOCT3は、プラスミドpBR322のEcoRI部位に
trpプロモーターオペレーター、trpL、trpE′を含
むDNA断片が組み込まれたプラスミドであり、
これらは約500塩基対の大腸菌トリプトフアンオ
ペロン（E.coli trp operon）を構成する。
pOCT3プラスミドは大阪大学医学部松原謙一教
授より寄贈された。プラスミドpOCT3をＥcpRI
で切断し、トリプトフアンオペロンDNA断片を
切り出し、切断末端を逆向きに入れ換え、再び
T4リガーゼを用いてＥcpRI位に挿入すると
pOCT2ができあがる。従つて、pOCT3と
pOCT2では転写方向が逆向きになつている。
pOCT3では転写方向が逆時計まわりであるとこ
ろ、pOCT2では時計まわり（5′位から3′位）であ
る。pOCT2からpOCT3を構成する模様を第５図
に示す。pOCT2の制限酵素地図は第２図に示
す。第４図にはpOCT2のtrpプロモーター近辺の
約300塩基対からなるヌクレチド配列が示されて
いる。 pTRE1 プラスミドpTRE1はpOCT2に由来し、アンピ
シリン耐性領域近くの一つのEcoRI部位が
pOCT2から除かれたために単一のEcoRI部位を
有する。このプラスミドは第２図に示すように手
つかずのpOCT2のtrpオペロン部分を含む。
pTRE1の調製は次のように行われる。 プラスミドpOCT2をEcoRIで部分分解する
と、アンピシリン耐性領域に近いEcoRI部位のみ
が開裂される。一本鎖部分のDNAはDNAポリメ
ラーゼにより修復され、修復された末端どおし
T4DNAリガーゼを用いて結合され、pTRE1がで
きあがる。pTRE1の制限酵素地図は第２図に示
される。pOCT2からpTRE1を構成する模様を第
５図に示す。 pTRL1 プラスミドpTRL1はEcoRIとRsaI部位にはさ
まれたpOCT2からの部分を有する。この部分は
pOCT2上のtrpL領域中未知のEcoRI部位から
RsaI部位までの360塩基対から成る。その中のあ
る部分は第４図に示されている。pTRL1の調製
は次のように行われる。 プラスミドpOCT2をEcoRIで分解後、RsaIで
部分分解するとtrpプロモーター領域を含む360塩
基対のDNA断片が得られる。この断片の切断さ
れたRsaI部位にEcoRIリンカーを連結し次いで
EcoRIで処理すると付着端を有する断片ができあ
がる。これをpBR322のEcoRI部位に挿入すると
二種類の組み換えプラスミドが得られるが、
pTRL1はtrpプロモーターからの転写方向が逆時
計回りであるものである。 pTRL1の制限酵素地図を第２図に示す。
pOCT2からpTRL1を構成する模様は第６図に示
される。 pTRP1 プラスミドpTRP1はHpaIとClaI部位にはさま
れたpTRE1からの部分を有する。この部分は元
来pBR322に由来する約4640塩基対の線状DNAか
ら成る。pTRP1はHPaIとTaqI部位にはさまれた
pTRE1からの別の部分をも有する。この部分は
trpLプロモーターに対応する32塩基対からな
る。pTRP1の調製は次のように行なう。 プラスミドpTRE1をHpaIおよびclaIで重複分
解することにより約4640塩基対から成る線状の
DNA断片を得る。同様に、HpaI部位からTaq部
位までの32塩基対のDNA断片がpTRE1から切り
出される。両方のDNA断片がリガーゼにより結
合されpTRP1ができあがる。 pTRP1の制限地図を第２図に示す。制限酵素
地図を第２図に示す。pTRE1からpTRP1を構成
する模様を第７図に示す。 発現プラスミド 前述したと同じく当業者に知られた標準的手法
を用いて、クローン化されたプロキモシン遺伝子
を含む形質転換株中のDNAを抽出して、制限酵
素で切断する。ベクタープラスミドを同様に切断
し、得られた断片を混合してリガーゼを用いて結
合する。かくして大腸菌中でプロキモシンの発現
を可能にするように組み立てられた発現プラスミ
ド、pCR501、pCR601およびpCR701が造成され
た。 pCR501 プラスミドpCR501はpTRE1の一部分を含む。
該部分はpCR301から得られるプロキモシン分子
をコードする約1000のヌクレオチドに結合されて
いる。pCR501の調製は次のようにして行なう。 プラスミドpTRE1をEcoRIで切断し、S1ヌク
レアーゼによつて一本鎖部分を除去する。その末
端にEcoRIリンカー
り、より詳しくは、プロキモシン遺伝子を含有す
る組換えDNAの調製とそれらを利用して、プロ
キモシンを大量に生産するための微生物を得る方
法に関する。 「遺伝子工学」とは外部遺伝子と適当なベクタ
ーを含有する組換えDNAを形成し、希望する遺
伝情報に基づいてDNAを選択し、そして選択さ
れたDNAを適当な宿主微生物に導入し、これら
の過程によつて外部の遺伝情報が宿主の遺伝補体
となる、一連の生体外での操作技術を意味する。
この技術によつて調製され遺伝子操作をほどこさ
れた微生物は、適当な培養条件のもとで、外部遺
伝子をその細胞中で発現することが可能であり、
該遺伝子がコードする物質（例えば、酵素、ホル
モン、蛋白質等）を産生することができる。 本明細書中に記載された酵素蛋白質キモシンは
またレンニンとして知られている。これは予め反
芻する子牛の胃の中に見い出される主要な加水分
解性蛋白であり、牛乳を凝固する。そのためキモ
シンは長い間、チーズ製造業に於いて、ミルクカ
ゼインを凝固させるのに使用されてきた。キモシ
ンは分子量35652で323個のアミノ酸からなる。キ
モシンとして、キモシンＡとキモシンＢが存在す
ることが知られている。これらはヌクレオチド配
列中、アミノ酸コドン286位（ヌクレオチド857
位）が異なつており、キモシンＡではコドン
GATであるところ、キモシンＢではコドンGTT
であろう。プロキモシン（別名プロレンニン）は
キモシン分子のアミノ末端に42個の付加アミノ酸
を有するキモシンの前駆体であり、酸性条件下、
その付加アミノ酸を失うことによりキモシンその
ものに変換される。プロキモシンは分子量40777
で365個のアミノ酸からなる。プロキモシンの完
全なアミノ酸配列はB.Foltmannら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、74、2321（1977）に記載されて
いるが、後にアミノ酸位置数ケ所に誤まりが発見
されたので、正しいアミノ酸配列とプロキモシン
の完全なDNA配列を第１図に示す。 キモシンは、生後間もない仔牛の第４胃の粘膜
から分泌されるため、商業生産では仔牛の胃から
得られてきた。ところが、仔牛からキモシンを得
るには数々の問題がある。この方法は非常に複雑
ないくつもの工程を必要とし、大量のキモシンを
確保するには困難がありすぎる。更に、方法自体
経済的でなく、近年、商業需要に追いつかない状
態である。このような理由から、チーズ製造業で
は幾つかの代替物が使用を認められている。これ
ら代替物の主要なものは微生物起源のレンネツト
でありムコール・プシラス（Mucor pusillous）、
ムコール・ミーハイ（Mucor miehei）、エンドシ
ア・パラシチカ（Endothia parasitica）があ
る。しかしながら、微生物レンネツトはかなり強
い蛋白質分解作用を持つており、チーズ熟成に
は、基質特異性が高く蛋白質分解性が弱いキモシ
ン程適合してはいない。従つて、大量のキモシン
を提供することは商業的に重要な意義がある。 本発明の工程は新規の発現プラスミドを利用す
るものであり、それらは以前に調製された公知の
組換えプラスミドからプロキモシンをコードする
遺伝子を有するDNAを単離し、適当なベクター
に挿入することにより調製される。発現プラスミ
ドは形質転換が可能な条件で感受性ある微生物を
形質転換するのに用いられる。微生物は、組換え
発現プラスミドを含有する形質転換株を収穫でき
る条件で、培養される。一旦宿主微生物が形質転
換されると、微生物の細胞は、微生物を適当な育
成培地で培養することにより、繰り返し、繁殖さ
れキモシンをコードする遺伝子が微生物の細胞内
に発現される。こうして微生物の醗酵によるプロ
キモシンの大量生産が実現可能になり、プロキモ
シンを適正な価格で提供できるようになるだろ
う。 本発明に関連ある公知文献は、米国特許
4237224号（コーヘン・ボイヤー）、特願昭56−
131631号〔特開昭58−32896号〕（別府輝彦）、西
森ら、Gene、19、337（1982）、特開昭57−
141287号（コラボラテイブ・リサーチ）、特開昭
58−9687号（セルテツク・リミテツド）である。
特に、本出願人による特願昭56−131631号（昭和
56年８月24日出願）には、lacUVプロモータと大
腸菌ベーターガラスクトシダーゼのＮ―末端アミ
ノ酸に接合されたプロキモシンcDNAのほとんど
全配列を含有する発現プラスミドが開示されてい
る。 本発明の一つの目的は新規な発現プラスミドを
調製するのに用いる特定のプロキモシン遺伝子を
提供することにある。 本発明の別の目的は新規な発現プラスミドを提
供し、更に、宿主微生物細胞内にプロキモシンの
高い発現を得る為に該プラスミドを利用すること
にある。 本発明の他の目的は該プラスミドを調製する方
法を提供することにある。 本発明のさらに別の目的は大腸菌lac・オペロ
ン・プロモーターの代りに大腸菌トリプトフア
ン・オペロン・プロモーターを用いることにあ
る。 本発明のさらに別の目的は今まで知られている
微生物よりも実質的により多量のプロキモシンを
産生可能な遺伝子操作された微生物を得ることに
ある。 本発明のさらに別の目的は遺伝子操作された微
生物を用いてプロキモシンを生産する方法を提供
することにある。 本発明のさらに他の目的は前記目的に一致する
方法によつて生産されたプロキモシを提供するこ
とにある。 特には、本発明はプラスミドpCR501、
PCR601そしてpCR701からなる群から選ばれる
発現プラスミドを含有しプロキモシンを産生する
ことができる大腸菌及びそれらの遺伝子工学的製
法に関する。 本明細書中で用いられるプロキモシン遺伝子と
はプロキモシンをコードするすべてのヌクレオチ
ド配列として定義され、第１図に示されるヌクレ
オチド配列中のいかなる部分でもかまわない。 本発明の方法によれば、宿主細胞中のプロキモ
シンの発現及び生産は下記の各工程からなつてい
る。 １ 特定のプロキモシン遺伝子を公知の組換えプ
ラスミドから制限酵素切断により単離する。 ２ プロキモシン遺伝子はベクターとともに結合
され発現プラスミドを形成する。もし結合され
たプロキモシン遺伝子がプロキモシン全コーテ
イング配列に対応しない場合には、欠落してい
るヌクレオド配列部分を含む付加的な合成オリ
ゴヌクレオチドを単離した遺伝子にくつつける
ことができる。合成DNA片は好適にはプロキ
モシン遺伝子部分の先端に接合された翻訳開始
コドンを含有していてもよい。 ３ 適当な宿主細胞は発現プラスミドと塩化カル
シウム処理により形質転換される。 ４ アンピシリン耐性形質転換株を選択する。 ５ 形質転換細胞を標準の培養方法により培養す
る。 ６ 細胞の粗抽出物は、ラジオイムノアツセイ法
及び蛋白質プロツテイング法によりプロキモシ
ンの有無が検定される。 前記の公知の組換えプラスミドの中でもつとも
興味のあるプラスミドはpCR301と呼ばれてお
り、西森ら、Gene、19、337（1982）に詳しく記
載されている。プロキモシンンcDNAを含有する
他のプラスミドの調製方法は、西森ら、J.
Biochem.、90、901（1981）そして前記に引用さ
れた他の文献中に見い出される。これらのプラス
ミドはプロキモシン遺伝子の入手源として有用で
あり、通常、下記の方法によつて調製される。 １ プロキモシン遺伝子の伝令RNA（mRNA）
を仔牛の第４胃から単離する。 ２ mRNAを常法により二本鎖DNAに変換す
る。 ３ 合成リンカーを二本鎖DNAの両端に結合す
る。 ４ CDNA分子を適当なベクター・プラスミド
（例えば、pBR322）に導入する。 ５ 組換えプラスミドを次に形質転換により宿主
細胞に入れる。 ６ 正しいクローンをコロニーハイブリダイゼー
シヨン法とハイブリツドアレステツドトランス
レーシヨン法により選択し、プロキモシン遺伝
子の存在を確認する。 ７ クローン中のDNA挿入体はMaxam―Gilbert
法により、塩基配列を決定する。 後に、好ましい実施態様を参照することによ
り、詳しく説明するように、本発明は次の方法を
提供することを理解するべきである。なお、プロ
キモシンコーデイング配列の先端部分が欠如して
いるプロキモシン遺伝子から生産される蛋白質を
プロキモシン類似蛋白質と称し、又、プロキモシ
ンのＮ末端にメチオニンが付着しているプロキモ
シンをＮ末端メチオニルプロキモシンと称し、本
発明においてプロキモシンと呼ぶことがある。 プロキモシン遺伝子を単離すること、転写プロ
モーターおよび翻訳開始コドンを遺伝子に結合し
発現プラスミドを形成させること、発現プラスミ
ドを形質転換とにより宿主細胞に導入すること、
そしてプロキモシン、Ｎ末端メチオニルプロキモ
シンもしくはプロキモシン類似蛋白質の高レベル
の発現を有する形質転換された細胞を選択するこ
とから成り、該プロキモシン遺伝子はクローン化
されたプロキモシンcDNAを含有する組換えプラ
スミドに由来し、且つプロキモシンのコード配列
中少なくとも第５番目の翻訳コドンから配列の末
端までを有する、この配列はtrpL又はtrpE遺伝
子のＮ末端に結合している、大腸菌宿主細胞中で
プロキモシンコード遺伝子を発現させる方法。 プロキモシン遺伝子を単離すること、該遺伝子
から欠落しているプロキモシンのコーデイング配
列部分を有する合成ヌクレオチドを遺伝子に結合
すること、転写プロモーターおよび翻訳開始コド
ン（該合成ヌクレオチドに存在しない時）を遺伝
子に結合し発現プラスミドを形成させること、宿
主細胞を発現プラスミドで形質転換すること、そ
してプロキモシンの高レベルの発現を有する形質
転換された細胞を選択することから成り、該プロ
キモシン遺伝子はクローン化されたプロキモシン
cDNAを含有する組換えプラスミドに由来し、該
合成ヌクレオチドは翻訳開始コドンを有していて
もよい、大腸菌宿主細胞中でプロキモシンコード
遺伝子を発現させる方法。 プロキモシン遺伝子を単離すること、転写プロ
モーターおよび翻訳開始コドンを遺伝子に結合し
発現プラスミドを形成させること、発現プラスミ
ドを形質転換により宿主細胞に導入すること、プ
ロキモシンの高レベルの発現を有する形質転換さ
れた細胞を選択すること、そして細胞を栄養培地
で培養することから成り、該プロキモシン遺伝子
はクローン化されたプロキモシンcDNAを含有す
る組換えプラスミドに由来する、大腸菌宿主細胞
中でプロキモシンコード遺伝子を発現させる手法
によりプロキモシンを生産する方法。 プロキモシン遺伝子とそれに作用的に結合した
ベクターから成り、該ベクターはpBR322に由来
しそして転写プロモータと翻訳開始コドンを含有
する発現プラスミド。 本発明はさらに、特定のプロキモシン遺伝子、
該遺伝子を含むコーデイング配列、新規な発現プ
ラスミドの調整方法、形質転換された微生物、そ
してそれから産生されたプロキモシンをも包含す
ることを理解すべきである。 好適な実施態様 宿主微生物 いかなる微生物でも、望みのベクター・プラス
ミドを受容し、複製できるならば、使用できる。
しかし、本発明では実用的な理由から大腸菌
C600由来株が用いられる。特に好適には、大腸
菌E.coliC600rk -mk -株が用いられる。細胞は通常
知られた培養条件で育成される。例えば、大腸菌
のための培地は次のとおりである。 Ｌ 栄養培地（Ｌ broth） 当り バクト（Bacto）・トリプトン（Difcoラボラトリ
ーズ、テトロイト） 10ｇ バクト酵母抽出物（Difcoラボラトリーズ、デト
ロイト） ５ｇ NaCl 10ｇ グルコース ２ｇ M9栄養培地（M9 brcth） 当り Na2 2HPO4 ６ｇ KH2PO4 ３ｇ NaCl ５ｇ NH4Cl １ｇ CaCl2 15mg MgSO4・7H2O 0.1ｇ Bl（チアミンHCl） 必要ならば５mg casamino acid 2.5ｇ グルコース ５ｇ アンピシリン 50mg ベーターインドリルアクリル酸（３β―
indolylacrylicacid） 15mg 形質転換 通常の形質転換実験は50μｇ／mlのアニピシリ
ンを含むＬ―培地中で、Norqardら、Gene３、
279（1978）の方法に従う。 標準的な技術に於いて、大腸菌は30℃ないし40
℃の温度で、１当り10〜30×1012個細胞の密度
まで生育される。 プロモーター クローン化された遺伝子を宿主細胞中に発現さ
せるには、適当なプロモーターを備えたベクタ
ー・プラスミドを使用することが必要である。所
望の宿主細胞中で活性である限り、数種類のプロ
モーターを使用することができる。望ましくは、
本発明に於て、大腸菌トリプトフアンオペロン・
プロモーターが使用される。 組換えプラスミド pCR301 本発明によれば、遺伝子は便宜上既に公知文献
に記載されている第１次の組換えプラスミドから
得ることができる。これらのプラスミドは様々な
長さを有するプロキモシン遺伝子を含有してい
る。その中幾つかのプラスミドは制限酵素切断に
より正確な遺伝地図がわかつている。それ故、適
当な制限酵素により切断することにより、プロキ
モシン遺伝子の有用な部分を分離し、ベクター・
プラスミドへ第２のクローン化するためのDNA
の材料として用いることができる。このようなプ
ラスミドの代表的なものはpCR301である。プラ
スミドpCR301はラクトースオペロン・プロモー
ターとプロキモシン遺伝子の全長の内最初の４つ
のコドンのみが欠けたヌクレオチド13番（第５コ
ドン）から末端の1095番（第365コドン）までの
DNA配列を含有する。このプラスミドはpBR322
プラスミド（F.BoluarらGene、２、95（1977））
に由来する。プラスミド中の翻訳開始コドンとク
ローン化されたプロキモシン遺伝子との間のヌク
レオチド配列（これはベーターガラクトシダーゼ
のＮ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドに対
応する）を次に示す。 pCR301の制限酵素地図は第３図に示す。 pOCT2 プラスミドpOCT2の母体となるプラスミド
pOCT3は、プラスミドpBR322のEcoRI部位に
trpプロモーターオペレーター、trpL、trpE′を含
むDNA断片が組み込まれたプラスミドであり、
これらは約500塩基対の大腸菌トリプトフアンオ
ペロン（E.coli trp operon）を構成する。
pOCT3プラスミドは大阪大学医学部松原謙一教
授より寄贈された。プラスミドpOCT3をＥcpRI
で切断し、トリプトフアンオペロンDNA断片を
切り出し、切断末端を逆向きに入れ換え、再び
T4リガーゼを用いてＥcpRI位に挿入すると
pOCT2ができあがる。従つて、pOCT3と
pOCT2では転写方向が逆向きになつている。
pOCT3では転写方向が逆時計まわりであるとこ
ろ、pOCT2では時計まわり（5′位から3′位）であ
る。pOCT2からpOCT3を構成する模様を第５図
に示す。pOCT2の制限酵素地図は第２図に示
す。第４図にはpOCT2のtrpプロモーター近辺の
約300塩基対からなるヌクレチド配列が示されて
いる。 pTRE1 プラスミドpTRE1はpOCT2に由来し、アンピ
シリン耐性領域近くの一つのEcoRI部位が
pOCT2から除かれたために単一のEcoRI部位を
有する。このプラスミドは第２図に示すように手
つかずのpOCT2のtrpオペロン部分を含む。
pTRE1の調製は次のように行われる。 プラスミドpOCT2をEcoRIで部分分解する
と、アンピシリン耐性領域に近いEcoRI部位のみ
が開裂される。一本鎖部分のDNAはDNAポリメ
ラーゼにより修復され、修復された末端どおし
T4DNAリガーゼを用いて結合され、pTRE1がで
きあがる。pTRE1の制限酵素地図は第２図に示
される。pOCT2からpTRE1を構成する模様を第
５図に示す。 pTRL1 プラスミドpTRL1はEcoRIとRsaI部位にはさ
まれたpOCT2からの部分を有する。この部分は
pOCT2上のtrpL領域中未知のEcoRI部位から
RsaI部位までの360塩基対から成る。その中のあ
る部分は第４図に示されている。pTRL1の調製
は次のように行われる。 プラスミドpOCT2をEcoRIで分解後、RsaIで
部分分解するとtrpプロモーター領域を含む360塩
基対のDNA断片が得られる。この断片の切断さ
れたRsaI部位にEcoRIリンカーを連結し次いで
EcoRIで処理すると付着端を有する断片ができあ
がる。これをpBR322のEcoRI部位に挿入すると
二種類の組み換えプラスミドが得られるが、
pTRL1はtrpプロモーターからの転写方向が逆時
計回りであるものである。 pTRL1の制限酵素地図を第２図に示す。
pOCT2からpTRL1を構成する模様は第６図に示
される。 pTRP1 プラスミドpTRP1はHpaIとClaI部位にはさま
れたpTRE1からの部分を有する。この部分は元
来pBR322に由来する約4640塩基対の線状DNAか
ら成る。pTRP1はHPaIとTaqI部位にはさまれた
pTRE1からの別の部分をも有する。この部分は
trpLプロモーターに対応する32塩基対からな
る。pTRP1の調製は次のように行なう。 プラスミドpTRE1をHpaIおよびclaIで重複分
解することにより約4640塩基対から成る線状の
DNA断片を得る。同様に、HpaI部位からTaq部
位までの32塩基対のDNA断片がpTRE1から切り
出される。両方のDNA断片がリガーゼにより結
合されpTRP1ができあがる。 pTRP1の制限地図を第２図に示す。制限酵素
地図を第２図に示す。pTRE1からpTRP1を構成
する模様を第７図に示す。 発現プラスミド 前述したと同じく当業者に知られた標準的手法
を用いて、クローン化されたプロキモシン遺伝子
を含む形質転換株中のDNAを抽出して、制限酵
素で切断する。ベクタープラスミドを同様に切断
し、得られた断片を混合してリガーゼを用いて結
合する。かくして大腸菌中でプロキモシンの発現
を可能にするように組み立てられた発現プラスミ
ド、pCR501、pCR601およびpCR701が造成され
た。 pCR501 プラスミドpCR501はpTRE1の一部分を含む。
該部分はpCR301から得られるプロキモシン分子
をコードする約1000のヌクレオチドに結合されて
いる。pCR501の調製は次のようにして行なう。 プラスミドpTRE1をEcoRIで切断し、S1ヌク
レアーゼによつて一本鎖部分を除去する。その末
端にEcoRIリンカー
【式】を
T4DNAリガーゼを用いて連結する。のDNAを次
にEcoRIおよびSalIで切断して約4210塩基対から
成る線状DNA(a)を調製する。一方、プラスミド
pCR301をEcoRIそしてKpnIで切断して、DNA断
片(b)を得る。この断片はプロキモシン遺伝子がベ
ーターガラクトシダーゼをコードする遺伝子に結
合された246塩基対の配列である。同様に、
pCR301をKpnIとSalIで切断して、DNA断片(c)を
得る。この断片はｃ末端を含むプロキモシン遺伝
子の1025塩基対の配列である。DNA断片(a)、(b)
および(c)をT4DNAリガーゼで連結する。連結し
たDNAを大腸菌E.coliC600に導入しアンピシリ
ン耐性コロニー（pCR501を含む）を選択する。
第３図に示すごとく、目的のプラスミドpCR501
を制限酵素切断で分析すると、trpプロモーター
とプロキモシンをコードする約1000ヌクレオチド
（ヌクレオチド13番から遺伝子の末端ヌクレオチ
ド1095番まで即ち第５番目のコドンから365番目
まで）を含むことがわかる。第８図にpCR301と
pTRE1からpCR501を構成する模様を図示する。 開始ATGコドンとプロキモシン５番目のコド
ンまでのヌクレオチド配列はMaxam―Gilbert法
により解析すると以下の通りである。 発現プラスミドを有する形質転換細胞はクロー
ン化されたプロキモシン遺伝子を発現し、trpE
プロモーターの制御のもとにプロキモシンを産生
する。この産生されたプロキモシンは真正なプロ
キモシンのＮ末端第１番目ないし第４番目のアミ
ノ酸を欠き、その代りに前記コーデイング配列に
由来するメチオニン以下trpEプロモーターがコ
ードするアミノ酸８個及びβ―ガラクトシダーゼ
に由来する２個のアミノ酸残基を有するプロキモ
シン類似蛋白質である。 pCR601 プラスミドpCR601はpTRE1の一部分と
pTRL1からの56塩基対の断片を含む。この小断
片はpCR501中に存在するプロキモシンをコード
するヌクレオチド配列と全く同じ配列に結合され
ている。pCR601の調製は次のようにして行な
う。 プラスミドpTRE1をHpaIとSalIで切断し、
4010塩基対の線状DNA断片(d)を切り出す。次に
プロスミドpTRL1をHpaIとEcoRIで切断し、56
塩基対の線状DNA(e)（trpLプロモーターを含
む）を得る。DNA断片(d)および(e)は前記の断片
(b)および(c)（共にpCR301から切り出される）と
共にT4DNAリガーゼを用いて連結される。この
連結されたDNAで大腸菌C600を形質転換しプラ
スミドpCR601を含むアンピシリン耐コロニーを
選択する。第３図に示すごとく、目的のプラスミ
ドpCR601を制限酵素切断で分析するとtrpLプロ
モーターとプロキモシンをコードする約1000ヌク
レオチド（ヌクレオチド13番から遺伝子の末端ヌ
クレオチド1095番まで即ち第５番目のコドンから
365番目まで）を含有することが見い出される。
第９図にpTRE1、pTRL1、pCR301からpCR601
を構成する模様を図示する。 開始ATGコドンとプロキモシン５番目のコド
ンまでのヌクレオチド配列はMaxam―Gilbert法
により解析すると以下の通りである。 発現プラスミドを有する形質転換細胞はクロー
ン化されたプロキモシン遺伝子を発現し、trpL
プロモーターの制御のもとにプロキモシンを産生
する。この産生されたプロキモシンは真正なプロ
キモシンのＮ末端第１番目ないし第４番目のアミ
ノ酸を欠き、その代りに上記コーデイング配列に
由来するメチオニン以下trpLプロモーターがコ
ードするアミノ酸６個及びβ―ガラクシトシダー
ゼに由来する２個のアミノ酸残基を有するプロキ
モシン類似蛋白質である。 pCR701 プラスミドpCR701はpTRP1の一部分と
pCR501から得られるプロキモシンコーデイング
配列に結合された合成ヌクレオチド片を含有す
る。pCR701の調製は次のようにして行なう。プ
ラスミドpTRP1をHindおよびSal1で重複分解
すると約4050塩基対の線状DNA断片(f)を得る。
次にプラスミドpCR501をBamHIおよびSalIで切
断して、1264塩基対の線状DNA断片(g)を切り出
す。一方、化学合成により下記の塩基配列を有す
る22塩基対の合成オリゴヌクレオチド(e)を調製す
る。このDNA断片によりプロキモシン遺伝子
（第１図）のヌクレオチド第14番を切断する
BamHI消化によつて除去されてしまつたヌクレ
オチド配列が回復する。 5′AGCTTATGGCTGAGATCACCAG3′ 3′ATACCGACTCTAGTGGTCCTAG5′ 三つの断片(f)、(g)そして(h)をT4DNAリガーゼ
で連結する。この連結DNAを形質転換によつて
大腸菌C600に導入して、pCR701を含むアンピシ
リン耐性コロニーを選択する。第３図に示すごと
く、目的のプラスミドpCR701を制限酵素切断で
分析するとtrpLプロモーターとプロキモシンを
全コード配列（ヌクレオチド１番から遺伝子の末
端ヌクレオチド1095番まで即ち第１番目のコドン
から365番目のコドンまで）を含有することが見
い出される。第１０図にpTRP1、pCR501から
pCR701を構成する模様を図示する。pCR701中
のtrpL SD（Shinon Delgarno）領域はMaxam―
Gilbert法により解析すると開始コドンATGから
13ヌクレオチド離れており、開始コドンはプロキ
モシン遺伝子の先端コドンに接合されている。 発現プラスミドを有する形質転換細胞はクロー
ン化されたプロキモシン遺伝子を発現し、trpL
プロモーターの制御のもとにプロキモシンを産生
する。この産生されたプロキモシンは真正なプロ
キモシンのＮ末端に開始コドンATGがコードす
るメチオニンが付いているＮ末端メチオニルプロ
キモシンである。 大腸菌中のプロキモシンの発現 前述の発現プラスミドを含有する形質転換細胞
を含む培養物（Ｌ培地中）の一部を３β―インド
リルアクリル酸（15μｇ/ml）およびアンピシリ
ン（50μｇ/ml）を含むM9合成培地中で培養す
る。細胞の増殖が最大に達した時に集菌して、菌
体を音波破壊によつて破壊し無細胞抽出液を得
る。この抽出液をSDS―ポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかける。生成蛋白質は蛋白質ブロツテ
イング法により検出される。このような手法ある
いはラジオイムノ法に従つて、プラスミド
pCR501、pCR601又はpCR701を含有する形質転
換株を各々プロキモシン産生能について検査し
た。オートラジオグラフイー
（autoradiography）による分析〔西森ら、
Gene、19、337（1982）〕によれば各菌株ともプ
ロキモシンにほぼ匹敵する程度の大きさの帯の蛋
白質を産生することが明らかとなつた。この結果
はプロキモシンが各発現プラスミドを有する大腸
菌細胞中で生産されていることを示すものであ
る。さらに加えて、大腸菌１細胞当り約３万分子
以上のプロキモシンの生産レベルであることが明
らかにされた。ラジオイムノアツセイ法による分
析でも同様の結果が得られた。これらの実験結果
を通して、プラスミドpCR501、pCR601又は
pCR701を有する大腸菌中でプロキモシンが大腸
菌trpオペロン・プロモーターの制御のもとに生
産されしかもその生産レベルが以前に報告された
大腸菌lacオペロン・プロモーターの制御のもと
の生産レベルより実質的に高いことが見い出され
た。本発明の手法と同じスキームに従つて、trp
プロモーターをプロキモシンの開始コドンにより
近づけて結合させることにより、好ましくはさら
に開始コドンをプロキモシン遺伝子の先端に結合
させれば、より高レベルの発現を達成することが
できると期待される。 本発明の方法により作製された大腸菌は、工業
技術院微生物工業技術研究所にブタペスト条約に
従つて寄託されており、各菌株に与えられた受託
番号により特定される。 本発明は以下の実施例によりさらに詳しく記述
されるが、様々な変更又は修正が、発明の技術範
囲内で許されることを理解すべきである。 実施例 実施例中常に用いられているTEN緩衝液はト
リス塩酸20mM、NaCl50mM、EDTA1mMを含み
PHは約7.5である。 実施例 １ プラスミドpTRE1の調製 プラスミドpOCT21.5μｇ（15μのTEN）を
EcoRI（2.5単位0.5μTEN中）、EcrRI緩衝液
（３μ）、水11.5μから成る最終容量30μの
溶液中20℃で7.5分間保温（インキユベート）す
ることによりEcoRIで部分消化した。アガロース
ゲルから目的のDNAを回収し（40μTEN）、60
℃で５分間加熱した。このDNA溶液（40μ）
にDNAポリメラーゼＩ（４単位４μTEN）、
16mMATP（４μ）、16mMTTP（４μ）、ポ
リメラーゼ緩衝液６μ、水２μを加えて最終
容量60μとし、25℃で30分間保温した。これに
0.25MEDTA液４μを加えた後、フエノール処
理、エーテル処理を行いエタノールでDNAを沈
殿させた。DNAをT4DNAリガーゼ（１単位、１
μ）、3mMATP（２μ）、リガーゼ緩衝液
（２μ）、水（５μ）の最終容量10μの溶液
に溶解し22℃で２時間保温した。インキユベーシ
ヨン後エタノールでDNAを沈殿させ、沈殿DNA
をTEN溶液に溶解した。この溶液をCa2+で処理
した大腸菌E.coliC600を形質転換するのに用い
た。12個のコロニー中２株のpTRE1が導入され
た形質転換株を得た。 実施例 ２ プラスミドpTRL1の調製 (i) pOCT2からDNA断片(1)の調製 プラスミドpOCT2を、pOCT2 10.6μｇ
（100μTEN）、EcoRI（40単位、８μ
TEN）、EcoRI緩衝液（12μ）を含む最終容
量120μの溶液中、37℃２時間保温すること
によりEcoRIで切断した。インキユベーシヨン
後、エタノールでDNAを沈殿させ、沈殿DNA
を50μのTENに溶解した、この切断DNAを
含む溶液49μをBamHI緩衝液６μ、H2O3
μ、RsaI（20単位、２μTEN）に加え最
終容量60μの溶液を20℃で10分間保温するこ
とにより、RsaIで部分消化した。生成DNAを
エタノールで沈殿させ、沈IDNAを20μの
TENに溶解した。この溶液をポリアクリルア
ミド電気泳動にかけ、364塩基対の線状DNA
（0.16μｇ40μTEN中）を単離した。一方、
EcoRIリンカーを、リンカー５μｇ（５μ
TEN）、3mMATP（２μ）、キネーシヨン緩
衝液（２μ）、水（９μ）、キナーゼ（22単
位２μTEN）を含む最終容量20μの溶液
中、37℃１時間保温することによりT4ポリヌ
クレチドキナーゼで処理した。20μのキネー
シヨン混合物を上記のDNA溶液に加えさらに
T4DNAリガーゼ（５単位、５μTEN）、リ
ガーゼ緩衝液（４μ）と6mMATP（７μ
）を添加した。全混合物（71μ）を22℃で
２時間保温することによりDNA連結を行なつ
た。連結されたDNAをエタノールで沈殿さ
せ、さらに沈殿DNAを50μのTENに溶解し
た。この溶液（45μ）にEcoRI（350単位、
70μTEN）、EcoRI緩衝液20μ、水65μ
を加え、200μの混合物を37℃で３時間保温
した。フエノール処理によりインキユベーシヨ
ンを停止させ、DNAをエーテルで抽出し、エ
タノールで沈殿させ、沈殿DNAを40μの
TENに溶解した。この溶液をポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけ、電気泳動後、付着端
を有するDNA断片(1)（0.1μｇ、240μのト
リス酢酸緩衝液中）を単離した。 (ii) pBR322からDNA断片(2)の調製 プラスミドpBR322を、pBR322 4.5μｇ（20
μTEN）、EcoRI（20単位、４μTEN）、
EcoRI緩衝液３μ、水３μを含む最終容量
30μの溶液中、37℃１時間保温することによ
り、EcoRIで切断した。インキユベーシンをフ
エノール処理により停止し、DNAをエーテル
で抽出し、エタノールで沈殿させ、沈殿DNA
を10mMトリス塩酸緩衝液40μに溶解した。
この溶液を10μのMATEBAPと6.5℃で１時
間インキユベートした。インキユベーシヨン
後、MATE BATは混合物を20μの10mMト
リス塩酸緩衝液で洗浄することにより除去され
た。こうして4.2μｇのDNA断片(2)が60μの
10mMトリス塩酸緩衝液中に回収された。 (iii) DNA断片(1)と断片(2)のリガーゼを用いる連
結 断片(1)（トリス酢酸緩衝液120μ中0.05μ
ｇ）と断片(2)（10mMトリス塩酸緩衝液２μ
中0.14μｇ）を混合し、混合液をエタノール処
理した。生成した沈殿を50μのTENに溶解
した後、40μの溶液を結合反応に使用した。
T4DNAリガーゼ（0.9単位、１μTEN）、リ
ガーゼ緩衝液（５μ）、6mMATP（５μ）
を加え、最終容量51μの溶液を22℃で２時間
保温した。結合DNAをエタノールで沈殿さ
せ、沈殿を50μのTENに溶解した。 (iv) 形質転換 上記の結合DNAを含む溶液20μを大腸菌
E.coli C600の形質転換に用いた。約1500個の
形質転換体が得られたが、約20個に１の形質転
換体がプラスミドpTRL1を含んでいることを
制限酵素分解で確かめた。 実施例 ３ プラスミドpTRP1の調製 (i) pTRE1からDNA断片(3)の調製 プラスミドpTRE1をpTRE1 2.46μｇ（30μ
TEN）、HpaI（30単位、６μ）、HpaI緩衝
液４μを含む最終容量40μの溶液中、37℃
で1.5時間保温することによりHpaIで切断し
た。このDNA溶液をClaI緩衝液５μおよび
ClaI（25単位、５μ）を含む10μの溶液に
加え、37℃で1.5時間保温することにより、
DNAをさらにClaIで切断した。生成したDNA
はエタノールで沈殿させ、沈殿を40μの
TEN溶液に溶解した。この溶液をアガロース
ゲル電気泳動にかけ、2.35μｇ（80μ
TEN）の約4640bpからなるDNA断片を単離し
た。 (ii) pTRE1からDNA断片(4)の調製 pTRE1をpTRE1 8.2μｇ（100μTEN）、
HpaI（57単位、８μ）、HpaI緩衝液12μを
含む最終容量120μの溶液中、37℃で1.5時間
保温することによりHpaIで切断した。この反
応混合物にTaqI（80単位、９μ）及びHpaI
緩衝液１μを加え、130μの混合物を65℃
で１時間保温した。インキユベーシヨンの後、
DNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を40μ
のTEN液に溶解した。この溶液をポリアクリ
ルアミド電気泳動にかけ、0.054μｇ（40μ
TEN）の32bpからなるDNA断片(4)を単離し
た。 (iii) DNA断片(3)と(4)のリガーゼを用いる連結 0.29μｇ（10μTEN）のDNA断片(3)、
0.014μｇ（10μTEN）のDNA断片(4)、
T4DNAリガーゼ（3.6単位、４μ）、リガー
ゼ緩衝液、6mMATP（３μ）を含む混合物
30μを22℃で２時間保温した。連結された
DNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を40μ
のTENに溶解した。 (iv) 形質転換 上記の連結されたDNA溶液30μを大腸菌
E.coli C600の形質転換に用いた。約840の形質
転換体が得られたが、それらのすべてが
pTRP1を含んでいた。 実施例 ４ プラスミドpCR501の調製 (i) pTRE1からDNA断片(a)の調製 プラスミドpTRE1を、pTRE1 8.2μｇ（100
μTEN）、EcoRI（25単位、５μ）、EcoRI
緩衝液、水（３μ）を含む最終容量120μ
の溶液中、37℃２時間保温することにより
EcoRIで消化した。フエノール処理、エーテル
により抽出、エタノールでの沈殿化の後、沈殿
を50μのTEN溶液に溶解させた。この溶液
25μ、S1ヌクレアーゼ（100単位、10μ
）、S1緩衝液（15μ）、水（10μ）を含
む混合物50μを22℃で30分間保温した。エフ
ノール処理でインキユベーシヨンを停止させ、
DNAをエーテルで抽出し、エタノールで沈殿
させた。一方、EcoRIリンカーを、リンカー５
μｇ（５μ）、3mMATP（２μ）、キナー
ゼ緩衝液２μ、水９μ、キナーゼ（22単
位、２μTEN）を含む最終容量20μの溶
液中、37℃で１時間保温することによりT4ポ
リヌクレオチドキナーゼで消化した。この
EcoRリンカーを含む溶液20μを上記の切断
DNAに加え、さらに3mMATP5μ及び4.5単
位のT4リガーゼ（５μTEN）を加えて、最
終容量30μ混合物を22℃で２時間保温した。
生成DNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を60
μTENに溶解した。このDNA溶液50μに
EcoRI（500単位、50μTEN中）、EcoRI緩衝
液、水（80μ）を加えた最終容量200μの
混合物を37℃で２時間保温した。インキユベー
シヨンをフエノール処理で停止させ、DNAを
エーテルで抽出してエタノールで沈殿させた。
沈殿DNAにSalI（100単位、20μ）、Sal緩衝
液（10μ）、水（80μ）を加えた110μの
溶液を37℃で1.5時間保温する。インキユベー
シヨン後、切断されたDNAをエタノールで沈
殿させ、沈殿を60μのTENに溶解させた。
この溶液をアガロースゲル電気泳動にかけると
3.5μｇ（100μTEN）のDNA断片(a)が単離
された。 (ii) pCR301からDNA断片(b)の調製 プラスミドpCR301を、pCR301 7.3μｇ
（100μTEN）、KpnI（35単位、６μ）、
KpnI緩衝溶液（12μ）、水（２μ）を含む
最終容量120μの溶液中37℃で1.5時間保温す
ることによりKpnIで切断した。この反応混合
物にEcoRI（30単位、６μ）とEcoRI緩衝液
14μを加えた140μの溶液を37℃で１時間
保温した。生成した切断DNAはエタノールで
沈殿させ、沈殿を60μのTENに溶解させ
た。この溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけ、0.03μｇ（４mlTEN中）のDNA断
片(b)（246bp）を単離した。 (iii) pCR301からDNA断片(c)の調製 プラスミドpCR301をpCR301 15μｇ（100
μのTEN）、KpnI（35単位、６μ）、KpnI
緩衝溶液12μ、水（２μ）を含む最終容量
120μの溶液中37℃で1.5時間保温することに
よりKpnIで切断した。次いで、Sal（32単位、
４μ）、水（２μ）、SalI緩衝液（14μ）
を上記のインキユベーシヨン混合物に加えた
140μの溶液を37℃で１時間保温した。切断
されたDNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を
60μのTENの溶解した。この溶液をアガロ
ースゲル電気泳動にかけ25μｇ（180μ
TEN）のDNA断片(c)（1025bp）を単離した。 (iv) DNA断片(a)、(b)および(c)の連結 １μｇ（30μTEN）のDNA断片(a)、0.03
μへ（４μ）の断片(b)、0.4μｇの断片(c)を
凍結乾燥させた。凍結乾燥後、沈殿をエタノー
ルで洗浄した。リガーゼ緩衝液４μ、
3mMATP（４μ）、水11μおよびT4DNA
リガーゼ（0.9単位、１μ）を上記の沈殿に
加えた20μの溶液を22℃で２時間保温した。
連結されたDNAはエタノールで沈殿させ、沈
殿を40μのTENに溶解した。 (v) 形質転換 上記の連結DNAを含む30μのTEN溶液を
用いて大腸菌E.coli C600の形質転換を行なつ
た結果、20のpCR501を含む形質転換体が得ら
れた。この菌株E.coli C600rk -mk -（pCR501）
は微工研に受託番号FERMBP262号として寄託
された。 実施例 ５ プラスミドpCR601の調製 (i) pTRE1からDNA断片(d)の調製 プラスミドpTRE1を、pTRE1 2.46μｇ（30
μTEN）、HpaI（35単位、６μ）、HpaI緩
衝液（４μ）を含む最終容量40μの溶液
中、37℃で１時間保温することによりHpaIで
消化した。この溶液にSalI（20単位、５μ）
とSalI緩衝液（５μ）を加えた50μの混合
物を37℃で１時間保温した。切断されたDNA
をエタノールで沈殿させ、沈殿を40μの
TENに溶解させた。この溶液をアガロース電
気泳動にかけ、20μｇ（40μTEN）のDNA
断片(d)（4010bp）を単離した。 (ii) pTRL1からDNA断片(e)の調製 プラスミドpTRL1をpTRL1 15.4μｇ（100
μTEN）、HpaI（25単位、５μ）、HpaI緩
衝溶液12μおよび水３μを含む最終容量
120μの溶液中、37℃で1.5時間保温すること
によりHpaIで切断した。この溶液に、EcoRI
（30単位、６μTEN）そしてEcoRI緩衝液
14Lを加えた140μの混合物を37℃で１時
間保温した。こうしてHpaI、EcoRIで切断さ
れたDNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を40
μのTENに溶解した。この溶液をポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけて、0.18μｇ
（40μTEN）のDNA断片(e)（56bp）を単離
した。 (iii) pCR301からDNA断片(b)の調製 実施例４の方法に従い、KpnI32単位と
EcoRI30単位でpCR301を切断したところ、
0.46μｇ（40μのTEN）の断片(b)が得られ
た。 (iv) pCR301からDNA断片(c)の調製 実施例４の方法に従い、30単位のKpnIと24
単位のSalIでpCR301を切断したところ、3.9μ
ｇ（40μTEN）の断片(c)が得られた。 (v) DNA断片(b)、(c)、(d)および(e)の連結 0.06μｇ（５μTEN）の断片(b)、0.49μｇ
（５μ）の断片(c)、0.5μｇ（10μTEN）
の断片(d)、0.49μｇ（５μ）の断片(e)、
T4DNAリガーゼ（5.5単位、６μTEN）、リ
ガーゼ緩衝液、および6mMATP（4.5μ）を
含む溶液45μを22℃で２時間保温した。連結
されたDNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を
60μのTENに溶解させた。 (vi) 形質転換 上記の連結DNAを含む20μのTEN溶液を
用いて大腸菌E.coli C600の形質転換を行なつ
た結果27の形質転換体が得られたが、その内の
８株がpCR601を含有することを制限酵素分解
によつて確かめた。この菌株E.coli
C600rk -mk -（pCR601）は微工研に受託番号
FERMBP263号として寄託された。 実施例 ６ プラスミドpCR701の調製 (i) pTRP1からDNA断片(f)の調製 プラスミドpTRP1 25.2μｇ（100μ
TEN）、Hindm（48単位、８μTEN）、
Hindm緩衝液を含む120μの溶液を37℃で１
時間保温することによりpTRP1をHindmで切
断した。この溶液にさらにSalI（24単位、６μ
TEN）、SalI緩衝液（14μ）を加えた140μ
の溶液を37℃で２時間保温して、pTRP1を
SalIで切断した。切断されたDNAはエタノール
で沈殿させ、沈殿を60μTENに溶解した。
この溶液をアガロースゲル電気泳動にかけ、
8.2μｇ（120μTEN）のDNA断片(f)を単離
した。 (ii) pCR501からDNA断片(g)の調製 プラスミドpCR501 39μｇ（100μ
TEN）、SalI（32単位、８μTEN）、SalI緩衝
液を含む120μの溶液を37℃で１時間保温す
ることにより、pCR501をSalIで切断した。こ
のDNA溶液に25単位のBamHI（５μ）を添
加して、22℃で30分間保温してpCR301を
BamHIで部分分解した。生成したDNAをエタ
ノールで沈殿させ、沈殿を60μのTENに溶
解した。この溶液をアガロースゲル電気泳動に
かけ、２μｇ（80μTEN）のDNA断片(g)
（1264bp）を単離した。 (iii) DNA断片(h) 化学合成により次のヌクレオチド配列を有す
るオリゴヌクレオチドを得た。 5′AGCTTATGGCTGAGATCACCAG3′ 3′ATACCGACTCTAGTGGTCCTAG5′ (iv) DNA断片(f)、(g)および(h)の連結 0.68μｇ（10μTEN）の断片(f)、0.25μｇ
（10μ）の断片(g)、0.046μｇ（10μ）の断
片(h)、T4DNAリガーゼ（1.8単位、２μ）、
リガーゼ緩衝液４μ、6mMATP4μの混合
物40μを22℃で２時間保温した。リガーゼで
連結されたDNAはエタノールで沈殿させ、沈
殿を50μのTENに溶解した。 (v) 形質転換 上記の連結DNAを含む20μのTEN溶液を
用いて大腸菌E.coli C600の形質転換を行なつ
た結果８個の形質転換体が得られたが、その内
４株がpCR701を含有することを制限酵素分解
によつて確かめた。この菌株E.coli
C600rk -mk -（pCR701）は微工研に受託番号
FERMBP264号として寄託された。 実施例 ７ 大腸菌に於けるプロキモシンの発現 プラスミドpCR501、pCR601又はpCR701を含
有する大腸菌をＬ培地中37℃の温度で一晩予備培
養した。培養物の１mlをM9培地（10ml）に移し
かえ、１時間程培養した後、当り15mgのインド
ールアクリル酸を培地に加えて37℃の温度で３〜
４時間培養した。この後、細胞は15000rpmで約
15分間遠心分離により収集し、pMSF（フエニル
メチルスルホニル フルオライド）1mMを含有
するpBS緩衝液（20mMリン酸ナトリウム緩衝剤
中150mMの塩化ナトリウムを含むPH7.0）３ml中
に懸濁させた。この懸濁液に250mMのEDTA
（60μ）と10mg/のリゾチーム（30μ）を加
え、30分間０℃に保温した。 生成したスフエロプラストを音波で破壊し、こ
れに8M尿素（3.09ml）を加えた細胞処理溶解物
（cell lysate）を37℃で１時間保温した。
3000rmpで30分間遠心分離にかけた後、上澄液を
pBS緩衝液に透析し、透析液に競合結合ラジオイ
ムノアツセイ（binding competitive
radioimmunoassay；前述の西森ら、Gene誌に詳
述の方法）を適用した。 この方法によつて免疫沈殿したプロキモシン中
の放射性同位元素（ 125I）の量をガンマー線計量
器で測定した。一方、標品のプロキモシンの濃度
を種々変化させて得られる検量線を作成し、これ
と比較して細胞抽出液中のプロキモシンの量を算
出した。この実験からプラスミドpCR501を保有
する大腸菌の培養物が最高の発現率を示し（寄主
細胞一個あたり約30万分子のプロキモシン）、
pCR701を保有する大腸菌の培養中での発現が最
低であることがわかつた。更に、前記の音波処理
した無細胞抽出液を4M尿素で処理し、遠心分離
した後上澄液をSDSゲルを含むポリアクリルアミ
ド電気泳動にかけた。移動した蛋白質をニトロセ
ルローズフイルターに吸着させ、このフイルター
を前述の文献（西森ら、Gene誌）に記載の方法
に従つて処理した後、オートラジオグラフイーに
かけて分析した。 いずれの菌株の場合も標品プロキモシンに対応
する帯が観察された。プロキモシン帯の密度この
実験で得られた帯のそれとを比較するとpCR501
を保有する大腸菌が一細胞当り約30万分子のプロ
キモシンを産生することが確認された。各プラス
ミドによるプロキモシン合成能はラジオイムノア
ツセイの結果と一致して、pCR501≧pCR601≫
pCR701の順であつた。 細菌由来のプロキモシンの再生、活性化と凝乳試
験 発現プラスミドを保有する大腸菌培養物を音波
処理し、8M尿素で処理した後に、尿素を除去す
るために25mM重炭酸ソーダ（PH10.0）に対して
透析した。続いて、50mMトリス―塩酸（PH
7.5）に対して透析した後、0.4Mグリシン緩衝液
（PH2.3）を加え、室温に15分間保ち、プロキモシ
ンの活性化を行つた。 凝乳試験はフオルトマンの方法（B.Foltman
Prochymosin and chymosin Methods in
Enzymology19、421（1970））に従つて実施し
た。この試験で、10mlのスキムミルク（Difco）
を30℃で100秒間内に凝固する凝乳活性度を（１
キモシン単位；CU）と定義した。各プラスミド
がプロキモシンを発現した大腸菌培養物抽出液に
ついて、プロキモシンを活性化後（即ち、キモシ
ンに変換後）、凝乳活性度を測定すると、
pCR501の場合9.3CU／mg、pCR701の場合
3.7CU／mgであつた。尚、発現プラスミドを含有
しない大腸菌培養物の抽出液は上記試験方法によ
り全く凝乳活性を示さなかつた。
にEcoRIおよびSalIで切断して約4210塩基対から
成る線状DNA(a)を調製する。一方、プラスミド
pCR301をEcoRIそしてKpnIで切断して、DNA断
片(b)を得る。この断片はプロキモシン遺伝子がベ
ーターガラクトシダーゼをコードする遺伝子に結
合された246塩基対の配列である。同様に、
pCR301をKpnIとSalIで切断して、DNA断片(c)を
得る。この断片はｃ末端を含むプロキモシン遺伝
子の1025塩基対の配列である。DNA断片(a)、(b)
および(c)をT4DNAリガーゼで連結する。連結し
たDNAを大腸菌E.coliC600に導入しアンピシリ
ン耐性コロニー（pCR501を含む）を選択する。
第３図に示すごとく、目的のプラスミドpCR501
を制限酵素切断で分析すると、trpプロモーター
とプロキモシンをコードする約1000ヌクレオチド
（ヌクレオチド13番から遺伝子の末端ヌクレオチ
ド1095番まで即ち第５番目のコドンから365番目
まで）を含むことがわかる。第８図にpCR301と
pTRE1からpCR501を構成する模様を図示する。 開始ATGコドンとプロキモシン５番目のコド
ンまでのヌクレオチド配列はMaxam―Gilbert法
により解析すると以下の通りである。 発現プラスミドを有する形質転換細胞はクロー
ン化されたプロキモシン遺伝子を発現し、trpE
プロモーターの制御のもとにプロキモシンを産生
する。この産生されたプロキモシンは真正なプロ
キモシンのＮ末端第１番目ないし第４番目のアミ
ノ酸を欠き、その代りに前記コーデイング配列に
由来するメチオニン以下trpEプロモーターがコ
ードするアミノ酸８個及びβ―ガラクトシダーゼ
に由来する２個のアミノ酸残基を有するプロキモ
シン類似蛋白質である。 pCR601 プラスミドpCR601はpTRE1の一部分と
pTRL1からの56塩基対の断片を含む。この小断
片はpCR501中に存在するプロキモシンをコード
するヌクレオチド配列と全く同じ配列に結合され
ている。pCR601の調製は次のようにして行な
う。 プラスミドpTRE1をHpaIとSalIで切断し、
4010塩基対の線状DNA断片(d)を切り出す。次に
プロスミドpTRL1をHpaIとEcoRIで切断し、56
塩基対の線状DNA(e)（trpLプロモーターを含
む）を得る。DNA断片(d)および(e)は前記の断片
(b)および(c)（共にpCR301から切り出される）と
共にT4DNAリガーゼを用いて連結される。この
連結されたDNAで大腸菌C600を形質転換しプラ
スミドpCR601を含むアンピシリン耐コロニーを
選択する。第３図に示すごとく、目的のプラスミ
ドpCR601を制限酵素切断で分析するとtrpLプロ
モーターとプロキモシンをコードする約1000ヌク
レオチド（ヌクレオチド13番から遺伝子の末端ヌ
クレオチド1095番まで即ち第５番目のコドンから
365番目まで）を含有することが見い出される。
第９図にpTRE1、pTRL1、pCR301からpCR601
を構成する模様を図示する。 開始ATGコドンとプロキモシン５番目のコド
ンまでのヌクレオチド配列はMaxam―Gilbert法
により解析すると以下の通りである。 発現プラスミドを有する形質転換細胞はクロー
ン化されたプロキモシン遺伝子を発現し、trpL
プロモーターの制御のもとにプロキモシンを産生
する。この産生されたプロキモシンは真正なプロ
キモシンのＮ末端第１番目ないし第４番目のアミ
ノ酸を欠き、その代りに上記コーデイング配列に
由来するメチオニン以下trpLプロモーターがコ
ードするアミノ酸６個及びβ―ガラクシトシダー
ゼに由来する２個のアミノ酸残基を有するプロキ
モシン類似蛋白質である。 pCR701 プラスミドpCR701はpTRP1の一部分と
pCR501から得られるプロキモシンコーデイング
配列に結合された合成ヌクレオチド片を含有す
る。pCR701の調製は次のようにして行なう。プ
ラスミドpTRP1をHindおよびSal1で重複分解
すると約4050塩基対の線状DNA断片(f)を得る。
次にプラスミドpCR501をBamHIおよびSalIで切
断して、1264塩基対の線状DNA断片(g)を切り出
す。一方、化学合成により下記の塩基配列を有す
る22塩基対の合成オリゴヌクレオチド(e)を調製す
る。このDNA断片によりプロキモシン遺伝子
（第１図）のヌクレオチド第14番を切断する
BamHI消化によつて除去されてしまつたヌクレ
オチド配列が回復する。 5′AGCTTATGGCTGAGATCACCAG3′ 3′ATACCGACTCTAGTGGTCCTAG5′ 三つの断片(f)、(g)そして(h)をT4DNAリガーゼ
で連結する。この連結DNAを形質転換によつて
大腸菌C600に導入して、pCR701を含むアンピシ
リン耐性コロニーを選択する。第３図に示すごと
く、目的のプラスミドpCR701を制限酵素切断で
分析するとtrpLプロモーターとプロキモシンを
全コード配列（ヌクレオチド１番から遺伝子の末
端ヌクレオチド1095番まで即ち第１番目のコドン
から365番目のコドンまで）を含有することが見
い出される。第１０図にpTRP1、pCR501から
pCR701を構成する模様を図示する。pCR701中
のtrpL SD（Shinon Delgarno）領域はMaxam―
Gilbert法により解析すると開始コドンATGから
13ヌクレオチド離れており、開始コドンはプロキ
モシン遺伝子の先端コドンに接合されている。 発現プラスミドを有する形質転換細胞はクロー
ン化されたプロキモシン遺伝子を発現し、trpL
プロモーターの制御のもとにプロキモシンを産生
する。この産生されたプロキモシンは真正なプロ
キモシンのＮ末端に開始コドンATGがコードす
るメチオニンが付いているＮ末端メチオニルプロ
キモシンである。 大腸菌中のプロキモシンの発現 前述の発現プラスミドを含有する形質転換細胞
を含む培養物（Ｌ培地中）の一部を３β―インド
リルアクリル酸（15μｇ/ml）およびアンピシリ
ン（50μｇ/ml）を含むM9合成培地中で培養す
る。細胞の増殖が最大に達した時に集菌して、菌
体を音波破壊によつて破壊し無細胞抽出液を得
る。この抽出液をSDS―ポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかける。生成蛋白質は蛋白質ブロツテ
イング法により検出される。このような手法ある
いはラジオイムノ法に従つて、プラスミド
pCR501、pCR601又はpCR701を含有する形質転
換株を各々プロキモシン産生能について検査し
た。オートラジオグラフイー
（autoradiography）による分析〔西森ら、
Gene、19、337（1982）〕によれば各菌株ともプ
ロキモシンにほぼ匹敵する程度の大きさの帯の蛋
白質を産生することが明らかとなつた。この結果
はプロキモシンが各発現プラスミドを有する大腸
菌細胞中で生産されていることを示すものであ
る。さらに加えて、大腸菌１細胞当り約３万分子
以上のプロキモシンの生産レベルであることが明
らかにされた。ラジオイムノアツセイ法による分
析でも同様の結果が得られた。これらの実験結果
を通して、プラスミドpCR501、pCR601又は
pCR701を有する大腸菌中でプロキモシンが大腸
菌trpオペロン・プロモーターの制御のもとに生
産されしかもその生産レベルが以前に報告された
大腸菌lacオペロン・プロモーターの制御のもと
の生産レベルより実質的に高いことが見い出され
た。本発明の手法と同じスキームに従つて、trp
プロモーターをプロキモシンの開始コドンにより
近づけて結合させることにより、好ましくはさら
に開始コドンをプロキモシン遺伝子の先端に結合
させれば、より高レベルの発現を達成することが
できると期待される。 本発明の方法により作製された大腸菌は、工業
技術院微生物工業技術研究所にブタペスト条約に
従つて寄託されており、各菌株に与えられた受託
番号により特定される。 本発明は以下の実施例によりさらに詳しく記述
されるが、様々な変更又は修正が、発明の技術範
囲内で許されることを理解すべきである。 実施例 実施例中常に用いられているTEN緩衝液はト
リス塩酸20mM、NaCl50mM、EDTA1mMを含み
PHは約7.5である。 実施例 １ プラスミドpTRE1の調製 プラスミドpOCT21.5μｇ（15μのTEN）を
EcoRI（2.5単位0.5μTEN中）、EcrRI緩衝液
（３μ）、水11.5μから成る最終容量30μの
溶液中20℃で7.5分間保温（インキユベート）す
ることによりEcoRIで部分消化した。アガロース
ゲルから目的のDNAを回収し（40μTEN）、60
℃で５分間加熱した。このDNA溶液（40μ）
にDNAポリメラーゼＩ（４単位４μTEN）、
16mMATP（４μ）、16mMTTP（４μ）、ポ
リメラーゼ緩衝液６μ、水２μを加えて最終
容量60μとし、25℃で30分間保温した。これに
0.25MEDTA液４μを加えた後、フエノール処
理、エーテル処理を行いエタノールでDNAを沈
殿させた。DNAをT4DNAリガーゼ（１単位、１
μ）、3mMATP（２μ）、リガーゼ緩衝液
（２μ）、水（５μ）の最終容量10μの溶液
に溶解し22℃で２時間保温した。インキユベーシ
ヨン後エタノールでDNAを沈殿させ、沈殿DNA
をTEN溶液に溶解した。この溶液をCa2+で処理
した大腸菌E.coliC600を形質転換するのに用い
た。12個のコロニー中２株のpTRE1が導入され
た形質転換株を得た。 実施例 ２ プラスミドpTRL1の調製 (i) pOCT2からDNA断片(1)の調製 プラスミドpOCT2を、pOCT2 10.6μｇ
（100μTEN）、EcoRI（40単位、８μ
TEN）、EcoRI緩衝液（12μ）を含む最終容
量120μの溶液中、37℃２時間保温すること
によりEcoRIで切断した。インキユベーシヨン
後、エタノールでDNAを沈殿させ、沈殿DNA
を50μのTENに溶解した、この切断DNAを
含む溶液49μをBamHI緩衝液６μ、H2O3
μ、RsaI（20単位、２μTEN）に加え最
終容量60μの溶液を20℃で10分間保温するこ
とにより、RsaIで部分消化した。生成DNAを
エタノールで沈殿させ、沈IDNAを20μの
TENに溶解した。この溶液をポリアクリルア
ミド電気泳動にかけ、364塩基対の線状DNA
（0.16μｇ40μTEN中）を単離した。一方、
EcoRIリンカーを、リンカー５μｇ（５μ
TEN）、3mMATP（２μ）、キネーシヨン緩
衝液（２μ）、水（９μ）、キナーゼ（22単
位２μTEN）を含む最終容量20μの溶液
中、37℃１時間保温することによりT4ポリヌ
クレチドキナーゼで処理した。20μのキネー
シヨン混合物を上記のDNA溶液に加えさらに
T4DNAリガーゼ（５単位、５μTEN）、リ
ガーゼ緩衝液（４μ）と6mMATP（７μ
）を添加した。全混合物（71μ）を22℃で
２時間保温することによりDNA連結を行なつ
た。連結されたDNAをエタノールで沈殿さ
せ、さらに沈殿DNAを50μのTENに溶解し
た。この溶液（45μ）にEcoRI（350単位、
70μTEN）、EcoRI緩衝液20μ、水65μ
を加え、200μの混合物を37℃で３時間保温
した。フエノール処理によりインキユベーシヨ
ンを停止させ、DNAをエーテルで抽出し、エ
タノールで沈殿させ、沈殿DNAを40μの
TENに溶解した。この溶液をポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけ、電気泳動後、付着端
を有するDNA断片(1)（0.1μｇ、240μのト
リス酢酸緩衝液中）を単離した。 (ii) pBR322からDNA断片(2)の調製 プラスミドpBR322を、pBR322 4.5μｇ（20
μTEN）、EcoRI（20単位、４μTEN）、
EcoRI緩衝液３μ、水３μを含む最終容量
30μの溶液中、37℃１時間保温することによ
り、EcoRIで切断した。インキユベーシンをフ
エノール処理により停止し、DNAをエーテル
で抽出し、エタノールで沈殿させ、沈殿DNA
を10mMトリス塩酸緩衝液40μに溶解した。
この溶液を10μのMATEBAPと6.5℃で１時
間インキユベートした。インキユベーシヨン
後、MATE BATは混合物を20μの10mMト
リス塩酸緩衝液で洗浄することにより除去され
た。こうして4.2μｇのDNA断片(2)が60μの
10mMトリス塩酸緩衝液中に回収された。 (iii) DNA断片(1)と断片(2)のリガーゼを用いる連
結 断片(1)（トリス酢酸緩衝液120μ中0.05μ
ｇ）と断片(2)（10mMトリス塩酸緩衝液２μ
中0.14μｇ）を混合し、混合液をエタノール処
理した。生成した沈殿を50μのTENに溶解
した後、40μの溶液を結合反応に使用した。
T4DNAリガーゼ（0.9単位、１μTEN）、リ
ガーゼ緩衝液（５μ）、6mMATP（５μ）
を加え、最終容量51μの溶液を22℃で２時間
保温した。結合DNAをエタノールで沈殿さ
せ、沈殿を50μのTENに溶解した。 (iv) 形質転換 上記の結合DNAを含む溶液20μを大腸菌
E.coli C600の形質転換に用いた。約1500個の
形質転換体が得られたが、約20個に１の形質転
換体がプラスミドpTRL1を含んでいることを
制限酵素分解で確かめた。 実施例 ３ プラスミドpTRP1の調製 (i) pTRE1からDNA断片(3)の調製 プラスミドpTRE1をpTRE1 2.46μｇ（30μ
TEN）、HpaI（30単位、６μ）、HpaI緩衝
液４μを含む最終容量40μの溶液中、37℃
で1.5時間保温することによりHpaIで切断し
た。このDNA溶液をClaI緩衝液５μおよび
ClaI（25単位、５μ）を含む10μの溶液に
加え、37℃で1.5時間保温することにより、
DNAをさらにClaIで切断した。生成したDNA
はエタノールで沈殿させ、沈殿を40μの
TEN溶液に溶解した。この溶液をアガロース
ゲル電気泳動にかけ、2.35μｇ（80μ
TEN）の約4640bpからなるDNA断片を単離し
た。 (ii) pTRE1からDNA断片(4)の調製 pTRE1をpTRE1 8.2μｇ（100μTEN）、
HpaI（57単位、８μ）、HpaI緩衝液12μを
含む最終容量120μの溶液中、37℃で1.5時間
保温することによりHpaIで切断した。この反
応混合物にTaqI（80単位、９μ）及びHpaI
緩衝液１μを加え、130μの混合物を65℃
で１時間保温した。インキユベーシヨンの後、
DNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を40μ
のTEN液に溶解した。この溶液をポリアクリ
ルアミド電気泳動にかけ、0.054μｇ（40μ
TEN）の32bpからなるDNA断片(4)を単離し
た。 (iii) DNA断片(3)と(4)のリガーゼを用いる連結 0.29μｇ（10μTEN）のDNA断片(3)、
0.014μｇ（10μTEN）のDNA断片(4)、
T4DNAリガーゼ（3.6単位、４μ）、リガー
ゼ緩衝液、6mMATP（３μ）を含む混合物
30μを22℃で２時間保温した。連結された
DNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を40μ
のTENに溶解した。 (iv) 形質転換 上記の連結されたDNA溶液30μを大腸菌
E.coli C600の形質転換に用いた。約840の形質
転換体が得られたが、それらのすべてが
pTRP1を含んでいた。 実施例 ４ プラスミドpCR501の調製 (i) pTRE1からDNA断片(a)の調製 プラスミドpTRE1を、pTRE1 8.2μｇ（100
μTEN）、EcoRI（25単位、５μ）、EcoRI
緩衝液、水（３μ）を含む最終容量120μ
の溶液中、37℃２時間保温することにより
EcoRIで消化した。フエノール処理、エーテル
により抽出、エタノールでの沈殿化の後、沈殿
を50μのTEN溶液に溶解させた。この溶液
25μ、S1ヌクレアーゼ（100単位、10μ
）、S1緩衝液（15μ）、水（10μ）を含
む混合物50μを22℃で30分間保温した。エフ
ノール処理でインキユベーシヨンを停止させ、
DNAをエーテルで抽出し、エタノールで沈殿
させた。一方、EcoRIリンカーを、リンカー５
μｇ（５μ）、3mMATP（２μ）、キナー
ゼ緩衝液２μ、水９μ、キナーゼ（22単
位、２μTEN）を含む最終容量20μの溶
液中、37℃で１時間保温することによりT4ポ
リヌクレオチドキナーゼで消化した。この
EcoRリンカーを含む溶液20μを上記の切断
DNAに加え、さらに3mMATP5μ及び4.5単
位のT4リガーゼ（５μTEN）を加えて、最
終容量30μ混合物を22℃で２時間保温した。
生成DNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を60
μTENに溶解した。このDNA溶液50μに
EcoRI（500単位、50μTEN中）、EcoRI緩衝
液、水（80μ）を加えた最終容量200μの
混合物を37℃で２時間保温した。インキユベー
シヨンをフエノール処理で停止させ、DNAを
エーテルで抽出してエタノールで沈殿させた。
沈殿DNAにSalI（100単位、20μ）、Sal緩衝
液（10μ）、水（80μ）を加えた110μの
溶液を37℃で1.5時間保温する。インキユベー
シヨン後、切断されたDNAをエタノールで沈
殿させ、沈殿を60μのTENに溶解させた。
この溶液をアガロースゲル電気泳動にかけると
3.5μｇ（100μTEN）のDNA断片(a)が単離
された。 (ii) pCR301からDNA断片(b)の調製 プラスミドpCR301を、pCR301 7.3μｇ
（100μTEN）、KpnI（35単位、６μ）、
KpnI緩衝溶液（12μ）、水（２μ）を含む
最終容量120μの溶液中37℃で1.5時間保温す
ることによりKpnIで切断した。この反応混合
物にEcoRI（30単位、６μ）とEcoRI緩衝液
14μを加えた140μの溶液を37℃で１時間
保温した。生成した切断DNAはエタノールで
沈殿させ、沈殿を60μのTENに溶解させ
た。この溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけ、0.03μｇ（４mlTEN中）のDNA断
片(b)（246bp）を単離した。 (iii) pCR301からDNA断片(c)の調製 プラスミドpCR301をpCR301 15μｇ（100
μのTEN）、KpnI（35単位、６μ）、KpnI
緩衝溶液12μ、水（２μ）を含む最終容量
120μの溶液中37℃で1.5時間保温することに
よりKpnIで切断した。次いで、Sal（32単位、
４μ）、水（２μ）、SalI緩衝液（14μ）
を上記のインキユベーシヨン混合物に加えた
140μの溶液を37℃で１時間保温した。切断
されたDNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を
60μのTENの溶解した。この溶液をアガロ
ースゲル電気泳動にかけ25μｇ（180μ
TEN）のDNA断片(c)（1025bp）を単離した。 (iv) DNA断片(a)、(b)および(c)の連結 １μｇ（30μTEN）のDNA断片(a)、0.03
μへ（４μ）の断片(b)、0.4μｇの断片(c)を
凍結乾燥させた。凍結乾燥後、沈殿をエタノー
ルで洗浄した。リガーゼ緩衝液４μ、
3mMATP（４μ）、水11μおよびT4DNA
リガーゼ（0.9単位、１μ）を上記の沈殿に
加えた20μの溶液を22℃で２時間保温した。
連結されたDNAはエタノールで沈殿させ、沈
殿を40μのTENに溶解した。 (v) 形質転換 上記の連結DNAを含む30μのTEN溶液を
用いて大腸菌E.coli C600の形質転換を行なつ
た結果、20のpCR501を含む形質転換体が得ら
れた。この菌株E.coli C600rk -mk -（pCR501）
は微工研に受託番号FERMBP262号として寄託
された。 実施例 ５ プラスミドpCR601の調製 (i) pTRE1からDNA断片(d)の調製 プラスミドpTRE1を、pTRE1 2.46μｇ（30
μTEN）、HpaI（35単位、６μ）、HpaI緩
衝液（４μ）を含む最終容量40μの溶液
中、37℃で１時間保温することによりHpaIで
消化した。この溶液にSalI（20単位、５μ）
とSalI緩衝液（５μ）を加えた50μの混合
物を37℃で１時間保温した。切断されたDNA
をエタノールで沈殿させ、沈殿を40μの
TENに溶解させた。この溶液をアガロース電
気泳動にかけ、20μｇ（40μTEN）のDNA
断片(d)（4010bp）を単離した。 (ii) pTRL1からDNA断片(e)の調製 プラスミドpTRL1をpTRL1 15.4μｇ（100
μTEN）、HpaI（25単位、５μ）、HpaI緩
衝溶液12μおよび水３μを含む最終容量
120μの溶液中、37℃で1.5時間保温すること
によりHpaIで切断した。この溶液に、EcoRI
（30単位、６μTEN）そしてEcoRI緩衝液
14Lを加えた140μの混合物を37℃で１時
間保温した。こうしてHpaI、EcoRIで切断さ
れたDNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を40
μのTENに溶解した。この溶液をポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけて、0.18μｇ
（40μTEN）のDNA断片(e)（56bp）を単離
した。 (iii) pCR301からDNA断片(b)の調製 実施例４の方法に従い、KpnI32単位と
EcoRI30単位でpCR301を切断したところ、
0.46μｇ（40μのTEN）の断片(b)が得られ
た。 (iv) pCR301からDNA断片(c)の調製 実施例４の方法に従い、30単位のKpnIと24
単位のSalIでpCR301を切断したところ、3.9μ
ｇ（40μTEN）の断片(c)が得られた。 (v) DNA断片(b)、(c)、(d)および(e)の連結 0.06μｇ（５μTEN）の断片(b)、0.49μｇ
（５μ）の断片(c)、0.5μｇ（10μTEN）
の断片(d)、0.49μｇ（５μ）の断片(e)、
T4DNAリガーゼ（5.5単位、６μTEN）、リ
ガーゼ緩衝液、および6mMATP（4.5μ）を
含む溶液45μを22℃で２時間保温した。連結
されたDNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を
60μのTENに溶解させた。 (vi) 形質転換 上記の連結DNAを含む20μのTEN溶液を
用いて大腸菌E.coli C600の形質転換を行なつ
た結果27の形質転換体が得られたが、その内の
８株がpCR601を含有することを制限酵素分解
によつて確かめた。この菌株E.coli
C600rk -mk -（pCR601）は微工研に受託番号
FERMBP263号として寄託された。 実施例 ６ プラスミドpCR701の調製 (i) pTRP1からDNA断片(f)の調製 プラスミドpTRP1 25.2μｇ（100μ
TEN）、Hindm（48単位、８μTEN）、
Hindm緩衝液を含む120μの溶液を37℃で１
時間保温することによりpTRP1をHindmで切
断した。この溶液にさらにSalI（24単位、６μ
TEN）、SalI緩衝液（14μ）を加えた140μ
の溶液を37℃で２時間保温して、pTRP1を
SalIで切断した。切断されたDNAはエタノール
で沈殿させ、沈殿を60μTENに溶解した。
この溶液をアガロースゲル電気泳動にかけ、
8.2μｇ（120μTEN）のDNA断片(f)を単離
した。 (ii) pCR501からDNA断片(g)の調製 プラスミドpCR501 39μｇ（100μ
TEN）、SalI（32単位、８μTEN）、SalI緩衝
液を含む120μの溶液を37℃で１時間保温す
ることにより、pCR501をSalIで切断した。こ
のDNA溶液に25単位のBamHI（５μ）を添
加して、22℃で30分間保温してpCR301を
BamHIで部分分解した。生成したDNAをエタ
ノールで沈殿させ、沈殿を60μのTENに溶
解した。この溶液をアガロースゲル電気泳動に
かけ、２μｇ（80μTEN）のDNA断片(g)
（1264bp）を単離した。 (iii) DNA断片(h) 化学合成により次のヌクレオチド配列を有す
るオリゴヌクレオチドを得た。 5′AGCTTATGGCTGAGATCACCAG3′ 3′ATACCGACTCTAGTGGTCCTAG5′ (iv) DNA断片(f)、(g)および(h)の連結 0.68μｇ（10μTEN）の断片(f)、0.25μｇ
（10μ）の断片(g)、0.046μｇ（10μ）の断
片(h)、T4DNAリガーゼ（1.8単位、２μ）、
リガーゼ緩衝液４μ、6mMATP4μの混合
物40μを22℃で２時間保温した。リガーゼで
連結されたDNAはエタノールで沈殿させ、沈
殿を50μのTENに溶解した。 (v) 形質転換 上記の連結DNAを含む20μのTEN溶液を
用いて大腸菌E.coli C600の形質転換を行なつ
た結果８個の形質転換体が得られたが、その内
４株がpCR701を含有することを制限酵素分解
によつて確かめた。この菌株E.coli
C600rk -mk -（pCR701）は微工研に受託番号
FERMBP264号として寄託された。 実施例 ７ 大腸菌に於けるプロキモシンの発現 プラスミドpCR501、pCR601又はpCR701を含
有する大腸菌をＬ培地中37℃の温度で一晩予備培
養した。培養物の１mlをM9培地（10ml）に移し
かえ、１時間程培養した後、当り15mgのインド
ールアクリル酸を培地に加えて37℃の温度で３〜
４時間培養した。この後、細胞は15000rpmで約
15分間遠心分離により収集し、pMSF（フエニル
メチルスルホニル フルオライド）1mMを含有
するpBS緩衝液（20mMリン酸ナトリウム緩衝剤
中150mMの塩化ナトリウムを含むPH7.0）３ml中
に懸濁させた。この懸濁液に250mMのEDTA
（60μ）と10mg/のリゾチーム（30μ）を加
え、30分間０℃に保温した。 生成したスフエロプラストを音波で破壊し、こ
れに8M尿素（3.09ml）を加えた細胞処理溶解物
（cell lysate）を37℃で１時間保温した。
3000rmpで30分間遠心分離にかけた後、上澄液を
pBS緩衝液に透析し、透析液に競合結合ラジオイ
ムノアツセイ（binding competitive
radioimmunoassay；前述の西森ら、Gene誌に詳
述の方法）を適用した。 この方法によつて免疫沈殿したプロキモシン中
の放射性同位元素（ 125I）の量をガンマー線計量
器で測定した。一方、標品のプロキモシンの濃度
を種々変化させて得られる検量線を作成し、これ
と比較して細胞抽出液中のプロキモシンの量を算
出した。この実験からプラスミドpCR501を保有
する大腸菌の培養物が最高の発現率を示し（寄主
細胞一個あたり約30万分子のプロキモシン）、
pCR701を保有する大腸菌の培養中での発現が最
低であることがわかつた。更に、前記の音波処理
した無細胞抽出液を4M尿素で処理し、遠心分離
した後上澄液をSDSゲルを含むポリアクリルアミ
ド電気泳動にかけた。移動した蛋白質をニトロセ
ルローズフイルターに吸着させ、このフイルター
を前述の文献（西森ら、Gene誌）に記載の方法
に従つて処理した後、オートラジオグラフイーに
かけて分析した。 いずれの菌株の場合も標品プロキモシンに対応
する帯が観察された。プロキモシン帯の密度この
実験で得られた帯のそれとを比較するとpCR501
を保有する大腸菌が一細胞当り約30万分子のプロ
キモシンを産生することが確認された。各プラス
ミドによるプロキモシン合成能はラジオイムノア
ツセイの結果と一致して、pCR501≧pCR601≫
pCR701の順であつた。 細菌由来のプロキモシンの再生、活性化と凝乳試
験 発現プラスミドを保有する大腸菌培養物を音波
処理し、8M尿素で処理した後に、尿素を除去す
るために25mM重炭酸ソーダ（PH10.0）に対して
透析した。続いて、50mMトリス―塩酸（PH
7.5）に対して透析した後、0.4Mグリシン緩衝液
（PH2.3）を加え、室温に15分間保ち、プロキモシ
ンの活性化を行つた。 凝乳試験はフオルトマンの方法（B.Foltman
Prochymosin and chymosin Methods in
Enzymology19、421（1970））に従つて実施し
た。この試験で、10mlのスキムミルク（Difco）
を30℃で100秒間内に凝固する凝乳活性度を（１
キモシン単位；CU）と定義した。各プラスミド
がプロキモシンを発現した大腸菌培養物抽出液に
ついて、プロキモシンを活性化後（即ち、キモシ
ンに変換後）、凝乳活性度を測定すると、
pCR501の場合9.3CU／mg、pCR701の場合
3.7CU／mgであつた。尚、発現プラスミドを含有
しない大腸菌培養物の抽出液は上記試験方法によ
り全く凝乳活性を示さなかつた。
第１図はプロキモシンの完全なヌクレオチド配
列を示すものである。第２図は各種ベクター・プ
ラスミドの制限地図を示す。第３図は各種発現プ
ラスミドの制限地図を示す。第４図はプラスミド
pOCT2のtrpプロモーターの周りのDNA配列を示
す。第５図はpOCT3よりpOCT2を作り、更に
pOCT2よりpTRE1を構成する模様を示す模式図
である。第６図はpOCT2とpBR322からpTRL1
を構成する模様を示す模式図である。第７図は
pTRE1からpTRP1を構成する模様を示す模式図
である。第８図はpCR301とpTRE1からpCR501
を構成する模様を示す模式図である。第９図は
pCR301、pTRE1、pTRL1からpCR601を構成す
る模様を示す模式図である。第１０図はpCR501
とpTRP1からpCR701を構成する模様を示す模式
図である。
列を示すものである。第２図は各種ベクター・プ
ラスミドの制限地図を示す。第３図は各種発現プ
ラスミドの制限地図を示す。第４図はプラスミド
pOCT2のtrpプロモーターの周りのDNA配列を示
す。第５図はpOCT3よりpOCT2を作り、更に
pOCT2よりpTRE1を構成する模様を示す模式図
である。第６図はpOCT2とpBR322からpTRL1
を構成する模様を示す模式図である。第７図は
pTRE1からpTRP1を構成する模様を示す模式図
である。第８図はpCR301とpTRE1からpCR501
を構成する模様を示す模式図である。第９図は
pCR301、pTRE1、pTRL1からpCR601を構成す
る模様を示す模式図である。第１０図はpCR501
とpTRP1からpCR701を構成する模様を示す模式
図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ プラスミドpCR501、pCR601そしてpCR701
からなる群から選ばれる発現プラスミドを含有し
プロキモシンを産生することができる大腸菌。 ２ 微工研に受託番号FERM BP262号として寄
託された発現プラスミドpCR501を含有する特許
請求の範囲第１項記載の大腸菌。 ３ 微工研に受託番号FERM BP263号として受
託された発現プラスミドpCR601を含有する特許
請求の範囲第１項記載の大腸菌。 ４ 微工研に受託番号FERM BP264号として寄
託された発現プラスミドpCR701を含有する特許
請求の範囲第１項記載の大腸菌。 ５ プロキモシン遺伝子をプラスミドpCR301か
ら単離すること、 大腸菌trpオペロン・プロモーターおよび翻訳
開始コドンを該遺伝子に結合しプラスミド
pCR501及びpCR601よりなる群から選択される
発現プラスミドを形成させること、 該発現プラスミドを形質転換により大腸菌宿主
細胞に導入すること、そして、 プロキモシンの高レベルの発現を有する形質転
換された細胞を選択すること からなるプラスミドpCR501及びpCR601からな
る群から選ばれる発現プラスミドを含有しプロキ
モシンを産生することができる大腸菌の遺伝子工
学的製法。 ６ プロキモシン遺伝子をプラスミドpCR501か
ら単離すること、 該プロキモシン遺伝子の第１〜第４コドンのコ
ード配列を含有する合成ヌクレオチドを該遺伝子
に結合すること、 大腸菌trpオペロン・プロモーターおよび翻訳
開始コドン（該合成ヌクレオチドに存在しない
時）を上記遺伝子に結合し発現プラスミド
pCR701を形成させること、 該発現プラスミドを形質転換により大腸菌宿主
細胞に導入すること、そして プロキモシンの高レベルの発現を有する形質転
換された細胞を選択すること から成る発現プラスミドpCR701を含有しプロキ
モシンを産生することができる大腸菌の遺伝子工
学的製法。 ７ 該発現プラスミドpCR501が次の工程により
形成される特許請求の範囲第５項記載の製法。 (a) プラスミドpTRE1をEcoRIで切断し、S1ヌ
クレアーゼにより一本鎖部分を除去して線状
DNAを作る。 (b) EcoRIリンカーを連結して、EcoRI及びSalI
で消化してDNA断片(a)を作る。 (c) プラスミドpCR301をKpnIとEcoRIで消化し
てDNA断片(b)を作る。 (d) (c)とは別にpCR301をKpnIとSalIで消化して
DNA断片(c)を作る。 (e) DNA断片(a)、(b)、(c)を共にT4DNAリガーゼ
で連結する。 ８ 該発現プラスミドpCR601が次の工程により
形成される特許請求の範囲第５項記載の製法。 (a) プラスミドpTRE1をHpaIそしてSalIで消化
してDNA断片(d)を作る。 (b) プラスミドpTRL1をHpaIそしてEcoRIで消
化してDNA断片(e)を作る。 (c) プラスミドpCR301をKpnIとEcoRIで消化し
てDNA断片(b)を又KpnIとSalIで消化してDNA
断片(c)を作る。 (d) DNA断片(b)、(c)、(d)、(e)を共にT4DNAリガ
ーゼで連結する。 ９ 該発現プラスミドpCR701が次の工程により
形成される特許請求の範囲第６項記載の製法。 (a) プラスミドpTRP1をHindとSalIで消化し
てDNA断片(f)を作る。 (b) プラスミドpCR501をSalIで消化し、BamHI
で部分消化してDNA断片(g)を作る。 (c) 次のヌクレオチド配列を有する合成オリゴヌ
クレオチド（DNA断片(h)）を得る。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58038439A JPS59166086A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法 |
| DK136184A DK136184A (da) | 1983-03-09 | 1984-02-29 | Fremgangsmaade til udtrykkelse af et gen, der koder for prochymosin, i e.coli-vaertsceller og udtrykkelsesplasmid til brug ved fremgangsmaaden |
| EP84102451A EP0121775A1 (en) | 1983-03-09 | 1984-03-07 | Novel expression plasmids and their use in the method for expressing prochymosin coding gene in E. coli |
| AU25357/84A AU572827B2 (en) | 1983-03-09 | 1984-03-07 | Recombinant plasmid containing prochymosin coding gene |
| FI840918A FI86886C (fi) | 1983-03-09 | 1984-03-07 | Nya expressionsplasmider och deras anvaendning i foerfarandet foer expressering av prokymosin koderande gen i e. coli |
| NZ20741484A NZ207414A (en) | 1983-03-09 | 1984-03-07 | Expression of prorennin (prochymosin) using recombinant plasmids in an e. coli host |
| BR8401049A BR8401049A (pt) | 1983-03-09 | 1984-03-08 | Processo para expressar um gene de codificacao de proquimosina em celulas hospedeiras de e.coli.plasmideo de expressao,gene de proquimosina e processo para fazer plasmideos |
| IE55984A IE57264B1 (en) | 1983-03-09 | 1984-03-08 | Novel expression plasmids and their use in the method for expressing prochymosin coding gene in e.coli |
| AR29597484A AR241795A1 (es) | 1983-03-09 | 1984-03-09 | Metodo para expresar un gen que codifica proquimosina; plasmidos aplicados en ese metodo; metodo para obtenerlos; el gen incorporado a esos plasmidos. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58038439A JPS59166086A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59166086A JPS59166086A (ja) | 1984-09-19 |
| JPS6240999B2 true JPS6240999B2 (ja) | 1987-09-01 |
Family
ID=12525334
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58038439A Granted JPS59166086A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0121775A1 (ja) |
| JP (1) | JPS59166086A (ja) |
| AR (1) | AR241795A1 (ja) |
| AU (1) | AU572827B2 (ja) |
| BR (1) | BR8401049A (ja) |
| DK (1) | DK136184A (ja) |
| FI (1) | FI86886C (ja) |
| IE (1) | IE57264B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ207414A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPS60188077A (ja) * | 1984-03-09 | 1985-09-25 | Teruhiko Beppu | 仔牛プロキモシンｃＤΝＡの全配列を有する新規な発現プラスミド |
| JPS60188093A (ja) * | 1984-03-09 | 1985-09-25 | Teruhiko Beppu | 枯草菌に於ける形質発現プラスミド |
| US5082775A (en) * | 1984-05-11 | 1992-01-21 | Berlex Laboratories, Inc. | Efficient process for isolating insoluble heterologous protein using non-ionic detergents |
| US4705848A (en) * | 1986-06-02 | 1987-11-10 | International Minerals & Chemical Corp. | Isolation of bioactive, monomeric growth hormone |
| GB2200118A (en) * | 1987-01-23 | 1988-07-27 | Allelix Inc | Synthetic chymosin-and prochymosin-encoding DNA segments |
| JP4236698B2 (ja) | 1990-11-26 | 2009-03-11 | ジェネティックス インスティチュート，リミテッド ライアビリティ カンパニー | 宿主細胞でのｐａｃｅの発現およびその使用法 |
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Family Cites Families (1)
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