FI86886B - Nya expressionsplasmider och deras anvaendning i foerfarandet foer expressering av prokymosin koderande gen i e.coli. - Google Patents

Nya expressionsplasmider och deras anvaendning i foerfarandet foer expressering av prokymosin koderande gen i e.coli. Download PDF

Info

Publication number
FI86886B
FI86886B FI840918A FI840918A FI86886B FI 86886 B FI86886 B FI 86886B FI 840918 A FI840918 A FI 840918A FI 840918 A FI840918 A FI 840918A FI 86886 B FI86886 B FI 86886B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
plasmid
dna
ecori
restriction map
produce
Prior art date
Application number
FI840918A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI840918A (fi
FI840918A0 (fi
FI86886C (fi
Inventor
Takeshi Uozumi
Katsuhiko Nishimori
Norio Shimizu
Yoshiyuki Kawaguchi
Makoto Hidaka
Teruhiko Beppu
Original Assignee
Teruhiko Beppu
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Teruhiko Beppu filed Critical Teruhiko Beppu
Publication of FI840918A0 publication Critical patent/FI840918A0/fi
Publication of FI840918A publication Critical patent/FI840918A/fi
Publication of FI86886B publication Critical patent/FI86886B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI86886C publication Critical patent/FI86886C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12N9/6483—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12Y304/23004—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

1 86886
Uusia ekspressointiplasmideja ja niiden käyttö menetelmässä prokymosiinia koodaavan geenin ekspressoimiseksi E. colissa
Keksinnön kohteena on yleisesti geenitekniikka ja 5 erityisesti yhdistelmä-DNA:ta sisältävän prokymosiinia koodaavan geenin tuottaminen sekä tämän hyväksikäyttö mikro-organismien tuottamiseksi prokymosiinin laajaa tuotantoa varten.
Käsitteellä "geenitekniikka" tarkoitetaan in vitro-10 tekniikkaa, jolla muodostetaan yhdistelmä-DNA, joka sisältää ulkopuolisia geenejä, ja sopiva vektori, valikoidaan DNA halutun geneettisen informaation perusteella ja viedään valikoitu DNA sopivaan isäntä-mikro-organismiin, jolloin vieras geneettinen informaatio tulee isännän täyden geenis-15 tön osaksi. Tällä menetelmällä valmistettu geneettisesti manipuloitu mikro-organismi pystyy ekspressoimaan vierasta geeniä soluissaan sopivissa viljelyolosuhteissa ja tuottamaan ainetta (esim. entsyymejä, proteiinia, hormoneja jne), jota tämä geeni koodaa.
20 Entsymaattinen proteiini kymosiini tunnetaan myös renniininä. Se on proteolyyttinen pääproteiini, jota esiintyy vastasyntyneen märehtijän vasikan mahassa ja aiheuttaa maidon juoksettumisen. Kymosiinia on sen tähden kauan käytetty maitokaseiinin koaguloimiseen juustonteossa. Siinä on 25 32 3 aminohappoa ja sen molekyylipaino on 35 652. On tunnet- : tua, että kymosiinilla on kaksi mahdollista muotoa (A ja B) .
Nämä kaksi muotoa poikkeavat aminohappo-kodonilla 286 (nuk-leotidi 857). Kodoni GAT kymosiini A:ssa olisi kodoni GTT kymosiini B:ssä.
30 Prokymosiini (prorenniini) on kymosiinin prekursori, . . jossa on 42 ylimääräistä aminohappoa kymosiini-molekyylin aminopäätteessä ja se muutetaan kymosiiniksi happamissa olo-‘ suhteissa hävittämällä ylimääräiset aminohapot. Prokymosii- * : nissa on 365 aminohappoa ja sen molekyylipaino on 40 777.
35 Prorenniinin täydellistä aminohapposekvenssiä ovat selostaneet B. Foltmann et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 2 8 6 8 8 6 231 (1977). Julkaistu sekvenssi osoittautui myöhemmin vää räksi joukolle aminohappopaikkoja. Korjattu sekvenssi on sen tähden annettu kuviossa 1.
Koska vastasyntyneen vasikan juoksutusmahan limakal-5 vo erittää kymosiinia, sitä saadaan vasikoiden mahoista kaupalliseen tuotantoon. Kymosiinin saamiseen vasikoista liittyy useita vakavia ongelmia: tämä menetelmä käsittää lukuisia monimutkaisia työvaiheita, jotka aiheuttavat monia vaikeuksia yritettäessä varmistaa suuria määriä. Se on myös 10 kallista eikä ole viime vuosina pystynyt vastaamaan kaupallisia vaatimuksia. Näistä syistä kymosiinin korvikkeita on alettu hyväksyä juuston teossa. Eräs tällainen korvike on mikrobinen juoksutin, jota tuottaa Mucor pusillous, Mucor miehei tai Endothia parasitica. Tällä mikrobijuoksuttimella 15 on kuitenkin kohtuullisen voimakas proteolyyttinen aktiivisuus eikä ole yhtä sopiva juuston kypsyttämisessä kuin itse kymosiini, jolla on spesifinen, mutta silti heikko proteolyyttinen aktiivisuus.
Siten on vielä erittäin merkityksellistä taloudelli-20 seita näkökannalta hankkia suuri määrä kymosiinia.
Tämän keksinnön menetelmässä käytetään uusia ekspres-sointiplasmideja, jotka muodostetaan eristämällä DNA-inser-tio-osia, joissa on prokymosiinia koodaavia geenejä aikaisemmin rakennetuista yhdistelmäplasmideista ja liittämällä 25 tämä DNA sopiviin vektoreihin. Ekspressointiplasmideja käytetään sitten transformoimaan herkkiä mikro-organismeja olosuhteissa, joissa transformointi voi tapahtua. Mikro-organismia kasvatetaan olosuhteissa, jotka edistävät trans-formanttien, jotka sisältävät yhdistelmä-ekspressointiplas-50 midia, korjaamista talteen. Kun isäntä-mikro-organismi on oikein transformoitu, mikrobisoluja voidaan toistuvasti monistaa viljelemällä mikro-organismia sopivassa elatus-aineessa, joka ekspressoi prokymosiinia koodaavaa geeniä tuottamaan prokymosiinia soluissaan. Siten prokymosiinin 35 laaja tuotanto mikro-organismeilla fermentointiviljelyssä 3 86886 tulee mahdolliseksi toteuttaa ja antaa vasikan kymosiinia kohtuullisin kustannuksin.
Tätä keksintöä koskevia kirjallisuusvitteitä ovat US-patentti nro 4 237 224 (Cohen ja Boyer), JP-patenttiha-5 kemus Sho 56-131 631 T. Beppu'lle, K. Nishimori:lie et ai., Gene 19, 337 (1982), EP-patenttihakemus nro 68 691 Celltech Ltd.tlle ja EP-patenttihakemus nro 57 350 Collaborative Research Inc.:Ile. Erityisesti käsittelynalaisessa JP-pa-tenttihakemuksessa Sho 56-131 631, joka vastaa JP-patentti-10 hakemusta Kokai nro 32 896/83, jätetty 24.8.1981 ja joka on siirretty samalle oikeudenomistajalle, on esitetty ekspres-sointiplasmidi, joka sisältää lac UV-promoottorin ja proky-mosiini-cDNA:n melkein koko sekvenssin yhdistettynä E. coli beta-galaktosidaasin N-pääteaminohappoihin.
15 Eräs tämän keksinnön tavoitteista on antaa spesifisiä prokymosiinigeenejä käytettäviksi uusien ekspressointiplas-midien rakenteluun.
Toisena tämän keksinnön kohteena on antaa uusia eks-pressointiplasmideja ja hyödyntää niitä prokymosiinin suuren 20 ekspressoitumisen aikaansaamiseksi mikrobi-isäntäsoluissa.
Edelleen eräs tämän keksinnön kohde on antaa menetelmiä uusien ekspressointiplasmidien tuottamiseksi.
Vielä on tämän keksinnön kohteena käyttää E. coli tryptofaanioperonipromoottoria E. coli lac -operonipromoot-25 torin asemesta. Vielä on tämän keksinnön kohteena saada geneettisesti manipuloituja mikro-organismeja, jotka pystyvät tuottamaan olennaisesti suurempia määriä prokymosiinia kuin mitä tähän asti tunnetuilla mikro-organismeilla voidaan tuottaa.
30 Edel leen tämän keksinnön yhtenä kohteena on aikaan saada menetelmä prokymosiinin tuottamiseksi käyttäen geneettisesti manipuloituja mikro-organismeja.
Lopuksi on keksinnön kohteena vielä antaa itse prokymosiinia, joka on tuotettu edellä mainittujen menetelmien 35 mukaisesti.
4 86886 Läpi koko tämän selityksen "prokymosiinigeeni" määritellään nukleotidien sekvenssiksi, joka koodaa prokymosii-nimolekyyliä. Mitä tahansa nukleotidisekvenssin osaa voidaan käyttää, kuten kuviossa 1 on esitetty.
5 Tämän keksinnön menetelmän mukaisesti prokymosiinin ekspressointi isäntäsoluissa ja niiden tuottaminen voidaan toteuttaa seuraavin vaihein: 1. Spesifisiä prokymosiinigeenejä eristetään tunnetuista yhdistelmäplasmideista, kuten edellä on selostettu 10 uuttamalla sopivilla restriktioentsyymeillä.
2. Prokymosiinigeenit liitetään yhteen vektorin ja translaation aloituskodonin kanssa muodostamaan ekspressoin-tiplasmidi. Jos liitetyt prokymosiinigeenit eivät kata koko koodaussekvenssiä prokymosiinia varten, voidaan ylimääräi- 15 nen synteettinen oligonukleotidi, jossa on koodaussekvenssin puuttuva osa, yhdistää liitettyihin geeneihin. Synteettisellä DNA-palasella voi olla myös translaatiokodoni, joka edullisesti edeltää prokymosiinigeeniosan kärkeä.
3. Sopivia isäntäsoluja transformoidaan ekspressoin-20 tiplasmidilla kalsiumkloridikäsittelyllä.
4. Valikoidaan ampisilliini-resistenttejä transformoituja soluja.
5. Transformoituja soluja viljellään standardivilje-lymenetelmin.
25 6. Solujen raakauutteita testataan prokymosiinin läs näolon suhteen radioimmunoanalyysillä tai proteiinin blot-tausmenetelmällä.
Eräs erityisen kiinnostava yhdistelmäplasmidi on nimetty pCR301:ksi ja sitä ovat kuvanneet Nishimori et aL, Gene, 30 19, 337 (1982). Selostuksia menetelmistä muiden plasmidien rakentamiseksi, joilla on prokymosiini-cDNA'ta, on kuvannut Nishimori et ai., J. Biochem., 90, 901 (1081) ja niitä löytyy muista kirjallisuusviitteistä, joihin edellä viitattiin. Nämä plasmidit ovat käyttökelpoisia prokymosiinigeenien läh-35 teenä ja normaalisti niitä rakennetaan seuraavassa kuvatulla tavalla: . 86886
D
1. Prokymosiinigeenin lähetti-RNA(mRNA):ta eristetään neljännestä vasikan mahasta.
2. mRNA muutetaan kaksirihmaiseksi DNA:ksi tavanomaisin menetelmin.
5 3. Synteettisiä liittäjiä liitetään kaksisäikeisen cDNA:n kumpaankin päähän.
4. cDNA-molekyyli yhdistetään sopivaan vektoriplas-midiin (esim. pBR 322).
5. Yhdistelmäplasmidi viedään sitten isäntäsoluihin 10 transformoimalla.
6. Oikeiden kloonien tunnistaminen suoritetaan pesäke-hybridisointimenetelmällä ja hybridiestetyllä translaatiolla.
7. Kloonien DNA-insertiot sekvenssoidaan Maxamin ja Gilbertin menetelmällä.
15 Proteiinia, jota saadaan prokymosiinia koodaavasta geenistä, josta puuttuu koodaussekvenssin kärkiosasta jonkin verran, nimitetään "prokymosiinin kaltaiseksi proteiiniksi". Prokymosiinia, jossa on metioniini liittyneenä sen N-päät-teeseen, voidaan nimittää N-pääte-metionyyli-prokymosiinik-20 si. Läpi tämän selityksen kumpaakin voidaan nimittää proky-mosiiniksi.
Kuten myöhemmin yksityiskohtaisesti selostetaan viittaamalla edullisiin suoritusmuotoihin, tulisi ymmärtää, että tämä keksintö antaa: 25 1. Menetelmän prokymosiinia koodaavan geenin ekspres- soimiseksi E. coli -isäntäsoluissa, jolloin tämä geeni johdetaan transformanteista, jotka sisältävät kloonattua pro-kymosiini-cDNA:ta, jonka menetelmän mukaisesti: tämä geeni eristetään transformanteista; siihen liitetään 30 ligatoimalla transkriptio-promoottori ja translaation aloi-tuskodoni muodostamaan ekspressointiplasmidi; ja valikoidaan transformoituja soluja, joilla on korkeat prokymosiinin, N-pääte-metionyyli-prokymosiinin tai prokymosiinin kaltaisen proteiinin ekspressointitasot, jolloin geenin on aina-35 kin viidennestä koodaavasta kodonista koodaussekvenssin 6 86886 päähän asti prokymosiinia varten lisäksi oltava yhdistynyt trp L- tai trp E -geenin N-pääteosaan.
2. Menetelmän prokymosiinia koodaavan geenin ekspres-soimiseksi E. coli -isäntäsoluissa, jolloin tämä geeni joh- 5 detaan transformanteista, jotka sisältävät kloonattua pro-kymosiini-cDNA:ta ja jossa menetelmässä: tämä geeni eristetään transformanteista; tähän geeniin liitetään synteettinen oligonukleotidi, jolla on prokymosiinia koodaavan sekvenssin komplementaarinen osa, joka on poistet-10 tu tästä geenistä; siihen liitetään ligatoimalla transkrip-tiopromoottori ja translaation aloituskodoni, kun tätä ei ole läsnä synteettisessä oligonukleotidissa, ekspressointi-plasmidin muodostamiseksi; isäntäsoluja transformoidaan eks-pressointiplasmidilla; ja valikoidaan transformoituja solu-15 ja, joilla on prokymosiinin tai N-pääte-metionyyli-prokymo-siinin korkeat ekspressointitasot, jolloin tällä synteettisellä oligonukleotidilla valinnaisesti on translaation aloi-tuskodoni.
3. Menetelmän prokymosiinin tuottamiseksi ekspressoi-20 maila prokymosiinia koodaavaa geeniä E. coli -isäntäsoluissa, jolloin tämä geeni johdetaan transformanteista, jotka sisältävät kloonattua prokymosiini-cDNA:ta ja jolloin menetelmän mukaisesti: eristetään tämä geeni transformanteista; siihen liitetään 25 ligatoimalla transkriptiopromoottori ja translaation aloitus-kodoni ekspressointiplasmidin muodostamiseksi; transformoidaan isäntäsoluja ekspressointiplasmidilla; valikoidaan transformoituja soluja, joilla on korkeat prokymosiinin ekspressointitasot ja viljellään transformoituja soluja 30 sopivassa elatusaineessa.
4. Ekspressointiplasmidin, joka sisältää prokymosiinia koodaavan geenin ja vektorin siihen operatiivisesti liitettynä, jolloin vektori johdetaan pBR322-plasmidista ja sisältää transkriptiopromoottorin ja translaation aloi-35 tuskodonin.
7 86886
Esillä olevassa patenttihakemuksessa kuvataan myös spesifistä prorenniiniä koodaavaa geeniä, sitä sisältäviä koodaussekvenssejä, menetelmiä uusien ekspressointiplasmi-dien rakentamiseksi; transformoituja mikro-organismeja; ja 5 niistä tuotetun prokymosiinin.
Kuvio 1 esittää täydellistä nukleotidisekvenssiä pro-kymosiinia koodaavalle geenille.
Kuvio 2 esittää restriktioentsyymikarttoja vektori-plasmideille, joita tässä keksinnössä käytetään.
10 Kuvio 3 esittää restriktioentsyymikarttoja ekspres- sointiplasmideille, joita tässä keksinnössä käytetään.
Kuvio 4 esittää DNA-sekvenssiä trp-promoottorin läheisyydessä pOCT2-plasmidissa.
Kuvio 5 on kaavio pTRE1:n rakentamiseksi pOCT3:sta 15 pOCT2:n kautta.
Kuvio 6 on kaavio pTRL1:n rakentamiseksi pOCT2:sta ja pBR322:sta.
Kuvio 7 on kaavio pTRP1:n rakentamiseksi pTREIl:sta.
Kuvio 8 on kaavio pCR501:n rakentamiseksi pCR301:stä 20 ja pTRE1:stä.
Kuvio 9 on kaavio pCR601:n rakentamiseksi pCR301:stä, pTRE1:stä ja pTRL1:stä.
Kuvio 10 on kaavio pCR701:n rakentamiseksi pCR501:sta ja pTRP1:stä.
25 Isäntä-mikro-organismi
Voidaan käyttää mitä tahansa mikro-organismia, joka pystyy hyväksymään ja jäljentämään halutut vektoriplasmidit, mutta käytännön syistä käytetään tässä keksinnössä E. coli c 600;n johdannaisia. Erityisen edullinen kanta on E. coli 30 c600 r^'m^-. Soluja viljellään tavanomaisissa viljelyolo suhteissa. Elatusaineet E. coli -kannalle voivat olla esimerkiksi: 8 86886 L-liemi litraa kohti
Bacto Tryptone 10 g (Bifco Lab., Detroit)
Bacto Yeast Extracts 5 g 5 (Difco Lab., Detroit)
NaCl 10 g glukoosi 2 g M9-liemi litraa kohti
Na2HP04 6 g 10 KH2P04 3 g
NaCl 5 g NH4C1 1 g
CaCl2 15 mg
MgS04*7H20 0,1 g 15 B1 (tiamiini HCl) 5 mg, jos on tarpeen kasaminohappo 2,5 g glukoosi 5 g ampisilliini 50 mg 20 3-beta-indolyyliakryylihappo 15 mg
Tavanomaisesti transformointikokeita suoritetaan LB- elatusaineessa, joka sisältää 50 yug/ml ampisilliinia, Norgard- in menetelmän mukaisesti (Gene 3, 279 1978). Standardimene- 1 2 telmissä E. coli -soluja viljellään tiheyteen 10-30 x 10 25 solua/litra 30-40°C:n lämpötilassa.
Promoottori
Kloonattujen geenien saamiseksi ekspressoitumaan isäntäsoluissa on tarpeen varustaa vektoriplasmidit sopivalla promoottorilla; ekspressoitumisen saavuttamiseksi 30 voidaan käyttää useita promoottoreita niin kauan kuin ne ovat yhteensopivia isäntäsolujen kanssa. Tässä keksinnössä käytetään edullisesti E. coli -tryptofaanioperonipromootto-ria.
Yhdistelmäplasmidit 35 pCR301 Tämän keksinnön mukaisesti geeniä on mukavasti saatavissa primaarisista yhdistelmäplasmideista, kuten edellä 9 86886 selostettiin. Nämä plasmidit sisältävät prorenniiniä koo-daavan geenin, jonka kokoa voidaan vaihdella ja joista joitakin on kartoitettu tarkasti restriktioentsyymiuutolla. Siten voidaan sopivilla restriktioentsyymeillä leikkaamalla 5 erottaa prorenniiniä koodaavien geenien käyttökelpoisia osia ja käyttää DNA:n lähteenä toista kloonausta varten vektoriplasmidiin. Tällaisten plasmidien eräs edustaja on pCR301. Plasmidi pCR301 sisältää laktoosioperonipromootto-rin ja lähes koko prokymosiinigeenisekvenssin (nukleotidistä 10 nro 13 nukleotidiin nro 1 095), josta puuttuvat ainoastaan neljä ensimmäistä kodonia. Tämä plasmidi johdetaan plasmi-dista pBR322 (F. Bolivar et ai., Gene, 2, 95 (1977). Nukleo-todisekvenssi aloituskodonin ATG ja kloonatun prokymosiini-geenin alun välissä on kuvattu seuraavassa (tämä sekvenssi 15 vastaa nukleotidiä, joka koodaa beta-galaktosidaasin 10 N-pääte-aminohappoa): 5' - ATG GCC ATG TTA ACG GAT TCA CTG Met oeta-gaiaktosidaasi 20 3.
GAA TTC CGG -Arg prokymosiini 25 Restriktioentsyymikartta pCR301:lle on esitetty ku viossa 3.
pOCT2
Plasmidi pOCT3, pOCT2:n prekursori, on pBR322-plas-midi, jonka EcoRI-kohtaan on yhdistetty DNA-osanen, jolla 30 on trp-promoottori-operaattori, trp L ja trp E'. Mainittu trp-promoottori-operaattoriosa (- 0,5 Kb) on alunperin uutettu plasmidista p trp ED5-1 (R.A. Hallewell ja S. Emtage,
Gene, 9, 27, 1980). Tämä DNA täytetään T4 D-polymeraasilla, johon on liitetty EcoRl-linkkeri. Muodostunut DNA-fragment-35 ti insertoidaan pBR322:n EcoRI-kohtaan. Plasmidi pOCT3 saatiin ystävällisesti professori K. Matsubara1lta Osakan 10 86886 yliopistosta, School of Medicine'stä. trp operoni-DNA leikataan pOCT3:sta uuttamalla EcoRI:lla ja kun se on eristetty, se pannaan sitten takaisin pOCT3:n EcoRI-kohtaan sillä tavalla, että leikatut päät kääntyvät ympäri, mikä johtaa 5 pOCT2:een. Siten pOCT3:n transkriptiosuunta on päinvastainen pOCT2:n suunnalle; se on myötäpäivään pOCT2:ssa (5'rsta 3'reen), kun taas vastapäivään pOCT3:ssa. Kuvio 4 esittää DNA-sekvenssiä (n. 300 emästä) trp-promoottorin läheisyydessä plasmidissa pOCT2.
10 Kuvio 5 on kaavio pOCT3:n rakentamiseksi pOCT2:sta.
Restriktioentsyymikartta pOCT2:lle on esitetty kuviossa 2.
pTRE 1
Plasmidi pTRE1 johdetaan pOCT2:sta ja siinä on yksi ainoa EcoRI-kohta, koska toinen EcoRI-kohta lähellä ampi-15 silliiniresistenttiä aluetta on poistettu pOCT2:sta. Tämä plasmidi sisältää pOCT2:n koskemattoman trp-operoniosan, kuten kuviossa 2 on esitetty. pTREl:n rakentaminen suoritetaan seuraavalla tavalla.
Plasmidia pOCT2 uutetaan osittain EcoRIrllä, mistä 20 on seurauksena EcoRI-kohdan pilkkoutuminen lähellä ampisil-liiniresistenttiä aluetta. Yksisäikeiset osat korjataan sitten DNA-polymeraasin avulla ja korjatut päät liitetään käyttäen DNA-ligaasia pTREl:n valmistamiseksi.
Restriktioentsyymikartta pTRElrlle on esitetty ku-25 viossa 2. Kuvio 5 esittää kaaviota pTREl:n rakentamiseksi POCT2:sta.
pTRL1
Plasmidissa pTRL1 on DNA-osa pOCT2:sta, jota osaa rajoittavat EcoRI- ja RSal-kohdat. Tämä osa käsittää 360 emäs-30 paria (tunnistamattomasta EcoR-kohdasta RSal-kohtaan trp L-alueella), joista jotkut on sekvenssoitu, kuten kuviossa 4 esitetään. pTRL1:n rakentaminen suoritetaan seuraavalla tavalla.
Plasmidi pOCT2 pilkotaan EcoRIrllä ja uutetaan sitten 35 osittain RSalrlla antamaan 360 emäsparin osanen, joka sisältää trp-promoottorialueen (trp L). Tämä osanen liitetään 11 86886 sitten pBR322:n EcoRI-kohtaan antamaan kahta lajia yhdis-telmäplasmidia. Toinen on plasmidi pTRL1, jossa transkrip-tiosuunta trp-promoottorilta on vastapäivään.
Restriktioentsyymikartta pTRL1:lle on esitetty ku-5 viossa 2. Kuvio 6 on kaavio pTRL1:n rakentamiseksi pOCT2:sta.
pTRP1
Plasmidilla pTRP1 on DNA-osa pTRE1:stä, jota osaa rajoittavat Hpal- ja Clal-kohdat. Tämä osa käsittää n. 4 640 emäsparia, jotka ovat alunperin lähtöisin pBR322:sta. Plas-10 midilla on myös toinen DNA-osa pTRE1:stä, jota osaa rajoittavat Hpal- ja TaqI-kohdat. Tämä osa käsittää 32 emäsparia, jotka vastaavat trp L -promoottoria. pTRP1:n rakentaminen suoritetaan seuraavalla tavalla.
Plasmidi pTRE1 pilkotaan Hpal:11a ja Clalrlla anta-15 maan n. 4 640 emäsparin (bp) suoraketjuisen DNA-osasen. Nämä molemmat osaset liitetään yhteen ligatoimalla antamaan pTRP1. Restriktioentsyymikartta pTRP1:selle on esitetty kuviossa 2. Kuvio 7 on kaavio pTRP1:n rakentamiseksi pTRE1:stä.
Ekspressointiplasmidit 20 Käyttäen jälleen edellä esitettyjä standardimenetel miä, uutetaan haluttu DNA-osanen, joka sisältää kloonatun prokymosiinigeenin, transformantista ja pilkotaan restriktio-entsyymeillä; vektoriplasmidi pilkotaan samalla tavalla; ja osaset sekoitetaan ja liitetään. Nämä vaiheet ovat johtaneet 25 ekspressointiplasmidien pCR501, pCR601 ja pCR701 rakentamiseen, jotka on suunniteltu helpottamaan prokymosiinin eks-pressoitumisen saavuttamista E. colirssa.
pCR501
Plasmidi pCR501 sisältää pTRE1:n DNA-osan yhdistynee-30 nä n. 1 000 nukleotidin päähän pCR301:stä, jotka koodaavat prokymosiinimolekyyliä. pCR501:n rakentaminen suoritetaan seuraavalla tavalla.
Plasmidi pTRE1 leikataan EcoRI:lla ja yksisäikeiset osat poistetaan S1-nukleaasin avulla. EcoRI-liittäjä 35 (GGATTTCC/CCTTAAGG) liitetään tylppään päähän käyttäen DNA-ligaasia. Seuraavaksi tätä DNA:ta uutetaan EcoRI:lla 12 86886 ja Sällillä antamaan suora DNA-segmentti (a) (n. 4 210 bp).
Plasmidi pCR301 leikataan EcoRIillä ja Kpnlilla DNA-segmen-tin (b) saamiseksi. Tämä DNA-segmentti on 246 emäsparin sekvenssi, joka sisältää prokymosiinigeenin yhdistyneenä jäämä-5 beta-galaktosidaasia koodaavaan geeniin. Samalla tavalla pCR301 leikataan Kpnlilla ja Sällillä. DNA-segmentin (c) saamiseksi. Tämä DNA on prokymosiinigeenin 1 025 emäsparin sekvenssi sen C-pääte mukaan lukien. Jokainen DNA-segmentti liitetään yhteen T^ DNA-ligaasin avulla. E. coli -kanta C600 10 transformoidaan liitetyllä DNAilla ja valikoidaan ampisil-liiniresistenttejä pesäkkeitä (pCR501).
Kuten kuviossa 3 on esitetty, on pCR501in analyysi restriktioentsyymi-pilkonnalla paljastunut, että pCR501 sisältää trp-operoni-promoottorin ja n. 1 000 nukleotidia, 15 jotka koodaavat prokymosiinia (nukleotidista nro 13 geenin päähän, nimittäin 5. kodonista 365. kodoniin). Kuvio 8 esittää kaaviota pCR501in rakentamiseksi pCR301istä ja pTREIistä.
Seuraamalla Maxam-Gilbert'in menetelmää on nukleoti-disekvenssin aloitus-ATG-kodonin ja prokymosiinigeenin alun 20 (5. kodoni) välissä analysoitu olevan·.
EcoRI
7 5' - ATG CAA ACA CAA AAA CCG ACT GGG GAA TTC CGG - 3'
Met Arg 25 trP E -alue prokymosiini
Transformoidut solut, joissa on tämä plasmidi, eks-• : pressoivat kloonatun geenin ja tuottavat prokymosiinia trp E -promoottorin säätelyn alaisena.
30 Tällä tavalla tuotetusta prokymosiinista puuttuu ai don prokymosiinin aminohapposekvenssi, joka vastaa sekvens-. , siä ensimmäisestä neljänteen aminohappoon N-päätteellä, mutta sisältää, sen tilalla, kahdeksan aminohappoa (metio-niinin ja muita) jotka ovat peräisin edellä mainitusta trp 35 e -promoottorikoodaussekvenssistä sekä myös kaksi aminohappotähdettä, jotka ovat syntyneet beta-galaktosidaasista.
13 86 δ 86 Tätä prokymosiinia nimitetään sen tähden prokymosiinin kaltaiseksi proteiiniksi.
PCR601
Plasmidi pCR60l sisältää pTRE1:n DNA-osan ja 56 emäs-5 parin osasen pTRLl:stä yhdistyneenä samaan koodaussekvens- siin prokymosiinia varten, joka sekvenssi on läsnä pCR501:ssä. pCR601:n rakentaminen suoritetaan seuraavalla tavalla.
Plasmidi pTRE1 leikataan Hpa:lla ja Sall:lla antamaan suora 4 010 emäsparin segmentti (DNA (d)). Seuraavaksi plas-10 midi pTRLl leikataan Hpal:lla ja EcoRI:lla antamaan 56 emäs-parin segmentti (DNA (e)), joka sisältää trp L -promoottorin. Molemmat segmentit sekoitetaan ja liitetään yhteen DNA (b):n ja (c):n (jotka molemmat on aikaisemmin saatu pCR301:stä) kanssa DNA-ligaasin avulla. E. coli -kanta 15 c 600 transformoidaan syntyneellä liitetyllä DNA:11a ja valikoidaan ampisilliiniresistentit pesäkkeet (pCR 601).
Kuten kuviossa 3 on esitetty, on pCR601:n analyysi restriktioentsyymipilkonnalla paljastanut, että pCR601 sisältää trp L -promoottorin ja n. 1 000 nukleotidia, jotka 20 koodaavat prokymosiinia (nukleotidista nro 13 geenin päähän, nimittäin 5. kodonista 365 kodoniin). Kuvio 9 esittää kaaviota pCR601:n rakentamiseksi pCR301:stä, pTRE1:stä ja pTRLl:stä.
Seuraamalla Maxam-Gilbert'in menetelmää on nukleoti-25 disekvenssin aloitus-ATG-kodonin ja prokymosiinigeenin alun (5. kodonin) välissä analysoitu olevan:
EcoRI
5' 7 3'
- ATG AAA GCA ATT TTC GTG GAA TTC CGG - J
30 Met Ar9 prokymosiini trp L -alue
Transformoidut solut, jotka sisältävät plasmidin, ekspressoivat kloonatun ptokyiiiosiluiyeenin ja tuottavat .. 35 prokymosiinia trp L -promoottorin säätelyn alaisena.
14 8 6 8 3 6 Tällä tavalla tuotetusta prokymosiinista puuttuu aidon prokymosiinin aminohapposekvenssi, joka vastaa sekvenssiä ensimmäisestä neljänteen aminohappoon N-päätteellä, mutta sisältää, sen tilalla, kuusi aminohappoa (metioniinin ja 5 muita), jotka ovat peräisin edellä mainitusta trp L -pro-moottori-koodaussekvenssistä sekä myös kaksi aminohappotähdettä, jotka ovat peräisin beta-galaktosidaasista. Tätä pro-kymosiinia nimitetään sen tähden prokymosiinin kaltaiseksi proteiiniksi.
10 pCR7 01
Plasmidi pCR701 sisältää pTRPI:n DNA-osan ja synteettisen nukleotidipalasen yhdistyneenä prokymosiinia koodaa-vaan sekvenssiin pCR501:stä. pCR701:n rakentaminen suoritetaan seuraavalla tavalla.
15 Plasmidi pTRP1 leikataan Hindlllrlla ja Sall:lla an tamaan suora DNA-segmentti (f) (n. 4 050 bp). Plasmidi pCR501 leikataan BamHI:lla ja Sali :11a suoran DNA-segmentin (g) (1 264 bp) saamiseksi. Syntetisoidaan synteettinen oli- gonukleotidi, jossa on 22 emäsparia ja joka on sekvenssi: 20 5' AGCTTATGGCTGAGATCACCAG 3' 3' ATACCGACTCTAGTGGTCCTAG 5’ Tämä DNA-segmentti (f) korvaa nukleotidisekvenssin, 25 joka on poistettu uuttamalla BamHI:lla, joka leikkaa pro-kymosiinigeenin 14. nukleotidin. Nämä kolme segmenttiä (f), (g) ja (h) liitetään yhteen T^ DNA-ligaasin avulla. E. coli c600 transformoidaan liitetyllä DNA:11a ja valikoidaan am-pisilliiniresistentit pesäkkeet (pCR701).
30 Kuten kuviossa 3 on esitetty, on pCR701:n analyysi restriktioentsyymipilkonnalla paljastanut, että pCR701 sisältää trp L -promoottorin ja koko prokymosiinia koodaavan sekvenssin (ts. nukleotidista nro 1 geenin päähän asti, ni-miltäin 1. kodonilta 365. kodoniin). Kuvio 10 esittää kaa-• 35 viota pCR701:n rakentamiseksi pTRP1:stä ja pCR501:stä.
1 5 868S6
Kuten Maxam-Gilbert’in menetelmällä on määritetty sijaitsee SD- (Shinon ja Delgarno) alue 13 nukleotidin päässä ATG-aloituskodonista, joka edeltää prokymosiinigeenin ensimmäistä kodonia (ks. seuraavaa).
5
Taql Hindlll 5' S ^ 3, AAGG GTA TCGATAAGCTT ATG GCT -SD Δ Met Ala
Clal 10
Transformoidut solut, jotka sisältävät plasmidin, ekspressoivat prokymosiinigeeniä ja tuottavat prokymosiinia trp L -promoottorin säätelyn alaisena.
Tällä tavalla tuotettu prokymosiini on N-pääte-metio-15 nyyliprokymosiini, jossa metioniini, joka on peräisin aloi-tuskodonista ATG, on yhdistynyt aidon prokymosiinin N-päät-teeseen.
Prokymosiinin ekspressoiminen E. coli:ssa E. coli -solujen, jotka on transformoitu ekspressoin-20 tiplasmideilla, täyskasvuviljelyn (LB-väliaineessa) annosta viljellään M9-liemessä, joka sisältää 3-beta-indolyyliakryy-lihappoa (15 ^ug/ml) ja ampisilliinia (50 yug/ml). Solut korjataan talteen, kun lisääntyminen saavuttaa maksimin.
Solut tuhotaan sitten äänikäsittelyllä ja saadaan soluvapaa 25 uute. Tämä uute saatetaan sähköforeesin polyakryyliamidi- geelissä, joka sisältää SDS. Tuoteproteiini havaitaan prote-iiniblottausmenetelmällä. Seuraamalla edellä esitettyjä työvaiheita tai radioimmunoanalyysillä on jokaista transformant-tikantaa, joka sisältää pCR501, pCR601 tai pCR701 testattu 30 kykynsä suhteen tuottaa prokymosiinia. Analyysi autoradio-grafialla (Nishimori, Gene, 19, 337 (1982) on paljastanut, että jokainen kanta antaa proteiininauhan, jonka suuruus on yhtä suuri kuin autenttisen prokymosiinin nauha. Lisäksi prokymosiinin tuotantotason on arvioitu olevan yli 300 000 35 molekyyliä solua kohti. Samanlaisia tuloksia on saatu analyysillä käyttäen radioimmunoanalyysiä.
16 SC886 Nämä tulokset ovat osoittaneet, että prokymosiinia syntyy E. coli -soluissa, jotka sisältävät plasmidia pCR501, pCR601 tai pCR701, E. coli trp operoni -promoottorin transkriptio-säätelyn alaisena ja että tuotantotasot ovat olen-5 naisesti korkeampia kuin aikaisemmin ilmoitetut E. coli lac -operonin säätelyn alaisena. Vieläpä korkeammat tuotantotasot ovat mahdollisia käyttämällä samaa kaaviota keksinnön mukaisesti ja saamalla trp-promoottorin yhdistymisiä lähempänä prokymosiinin aloituskodonia, joka edullisesti seuraa 10 prokymosiinigeenin kärkeä.
Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuista E. coli -kannoista ovat esimerkkejä viljelyt, jotka on talletettu kokoelmaan Fermentation Research Institute, Ibaraki, Japani nimikkeeseen Budapest Treaty ja tunniste-15 taan tulonumerosta, joka on annettu jokaiselle kannalle.
Tätä keksintöä selostetaan yksityiskohtaisesti valai-semistarkoituksessa ja esimerkein; siitä huolimatta on selvää, että tiettyjä vaihteluita ja muunnoksia voidaan tehdä keksinnön piirissä.
20 Esimerkki
Kaikissa seuraavissa esimerkeissä TEN-puskuriliuok-sen on tarkoitettu olevan liuos, joka sisältää Tris-HCl (20 mM), NaCl (50 mM) ja EDTA (1 mM) ja jonka pH on n. 7,5.
Esimerkki 1 25 Plasmidin pTRE1 valmistus
Plasmidia pOCT2 uutettiin osittain EcoRI:lla inku-boimalla 20°C:ssa 7,5 min 30 ^ulissa liuosta, joka sisälsi plasmidia (1,5 ^ug 15 ^ulissä TEN), EcoRI (2,5 U, 0,5 ^ul TEN), EcoRI-puskuria (3 ^,ul) ja H20 (11,5 ^ul) . Agaroosi-30 geelielektroforeesin jälkeen haluttu DNA eristettiin (40 ^ul:ssä TEN) ja tätä kuumennettiin 60°C;ssa viisi minuuttia. Tähän DNA-liuokseen (40 yUl) lisättiin DNA-polymeraasi I:tä (4 U, 4 yul TEN), 16 mM ATP (4 ^ul), polymeraasipuskuri-liuosta (6 yul), ja H20 (2 yUl). Syntynyttä seosta (koko-35 naistilavuus 60 yUl) inkuboitiin 25°C:ssa 30 minuuttia. Sen jälkeen kun oli lisätty 0,25 M EDTA-liuosta (4 ^,ul) , mitä 17 86886 seurasi fenoli- ja eetterikäsittely, DNA saostettiin etanolilla. Sakka liuotettiin liuokseen (10 ^ul) , joka sisälsi DNA-ligaasia (1 U, 1 ,ul), 3 mM ATP (2 ,ul), ligaasipusku- 1 'o riliuosta (2 ^ul) ja H20 (5 ^ul) ja tätä inkuboitiin 22 C:ssa 5 kaksi tuntia. Inkuboinnin jälkeen DNA saostettiin etanolilla ja liuotettiin TEN-liuokseen. Tämä liuos käytettiin transformoimaan kalsiumilla käsitelty E. coli C 600 -kanta.
12 pesäkkeestä saatiin kaksi transformanttia, jotka sisälsivät pTREl.
1 0 Esimerkki 2
Plasmidin pTRLl valmistus i) DNA-segmentin (1) valmistus
Plasmidia pOCT2 leikattiin EcoRI:lla 37°C:ssa kaksi tuntia 120 ^ulissa liuosta, joka sisälsi plasmidia (10,6 ^ug 15 100 ^,ul:ssä TEN), EcoRI-puskuria (12 ^ul) ja EcoRI (40 U, 8 ^ul TEN). Inkuboinnin jälkeen DNA saostettiin etanolilla ja sakka liuotettiin 50 yUlraan TEN. Leikattua DNA:ta uutettiin osittain Rsalrlla inkuboimalla 20°C:ssa 10 minuuttia 60 ^ul:ssa liuosta, joka sisälsi DNA (49 ^,ul TEN), BamHI-20 puskuria (6 ^ul), i^O (3 ^,ul) ja RsaI (20 U, 2 ^,ul TEN). Kaksinkertaisesti leikattua DNA saostettiin etanolilla ja sakka liuotettiin 20 ^,ul:aan TEN. Liuotettu liuos saatettiin sitten polyakryyliamidigeelielektroforeesiin. Elektroforeesin jälkeen eristettiin 364 emäsparin suora DNA (0,16 ^ug 25 40 ^ulissa TEN). Sillä välin EcoRI-liittäjä kinasoitiin T^- polynukleotidikinaasilla 37°C:ssa yksi tunti 20 ^ulissa reaktioseosta, joka sisälsi liittäjää (5 ^ug, 5 ^ul TEN), ATP (3 mM, 2 ^,ul) , kinatointipuskuria (2 ^ul) , (9 ^ul) ja kinaasia (22 U 2 ^ul:ssa TEN). Kinatointiseos (20 ^ul) 30 lisättiin edellä saatuun DNA-liuokseen (35 ^ul), minkä jälkeen lisättiin T^ DNA-ligaasia (5 U, 5 yul TEN), ligaasi-puskuria (4 ^ul) ja ATP (6 mM, 7 ^ul) · Kokonaisseos (71 ^ul) liitettiin yhteen inkuboimalla 22 C:ssa kaksi tuntia. Liitetty DNA saostettiin etanolilla ja sakka liuotettiin 35 50 ^,ul:aan TEN. Liuotettuun liuokseen (45 ^,ul) lisättiin
EcoRI (350 U 70 ^ulissa TEN). EcoRI-puskuria (20 ^ul) ja 86886 18 Η2<3 (65 yUl) . Syntynyttä seosta (200 yul) inkuboitiin 37°C:ssa kolme tuntia. Inkubointi päätettiin fenolikäsittelyllä ja DNA uutettiin eetterillä, saostettiin etanolilla ja liuotettiin 40 yulraan TEN. Liuotettu liuos saatettiin polyakryyli-5 amidigeelielektroforeesiin. Elektroforeesin jälkeen DNA-seg-mentti (1), jolla on koossapysyvät päät (0,1 yUg 240 yultssa Tris-asetaatti-puskuria) eristettiin.
ii) DNA-segmentin (2) valmistus pBR322:sta Plasmidi pBR322 leikattiin EcoRI:lla inkuboimalla 10 37°C:ssa yksi tunti 30 yUl:ssa liuosta, joka sisälsi plas-midia (4,5 yug 20 ^ulissa TEN), EcoRI-puskuria (3 yUl), H20 (3 yUl) ja EcoRI (20 U 4 yulrssa TEN). Inkubointi päätettiin fenolikäsittelyllä ja DNA uutettiin eetterillä, saostettiin etanolilla ja liuotettiin 40 yulraan 10 mM 15 Tris-HCl-puskuria. Liuotettua liuosta käsiteltiin 10 yUlrlla MATE BAP inkuboimalla 65°C:ssa yksi tunti. Inkuboinnin jälkeen MATE BAP poistettiin pesemällä inkuboitu seos 20 yUltlla 10 mM Tris-HCl-puskuria. Täten DNA-segmentti (2) (4,2 yug) otettiin talteen 60 yUlraan 10 mM Tris-HCl-puskuria.
20 iii) DNA-segmentin (1) ja (2) liittäminen
Segmenttiä (1) (0,05 yug 120 ^ulissa Tris-asetaatti- puskuria) ja segmenttiä (2) (0,14 yug 2 yul:ssa 10 mM Tris- HCl-puskuria) sekoitettiin ja sekoitettua liuosta käsiteltiin etanolilla. Syntynyt sakka liuotettiin 50 yul:aan TEN.
25 40 mikrolitraa liuotettua liuosta saatettiin liitettäväksi käyttäen T^DNA-ligaasia (0,9 U 1 yulrssa TEN), ligaasipus-kuria (5 yUl) ja ATP (6 mM, 5 yul TEN) inkuboimalla 51 yul liuosta 22°C:ssa kaksi tuntia. Liitetty DNA saostettiin etanolilla ja liuotettiin 50 puitaan TEN.
30 iv) Transformointi 20 mikrolitraa edellä liitettyä DNA-liuosta käytettiin transformoimaan kannan E. coli C 600 kelvollisia soluja. N. 1 500 transformantin havaittiin olevan ampisilliini-resistenttejä. Restriktioentsyymianalyysi osoitti, että yksi 35 kahdestakymmenestä transformantista sisälsi plasmidia pTRL1.
19 86886
Esimerkki 3
Plasmidin pTRPl valmistus i) DNA-segmentin (3) valmistus plasmidista pTRE1 Plasmidi pTRE1 leikattiin Hpal:lla inkuboimalla 5 37°C:ssa 1,5 tuntia 40 .ulrssa liuosta, joka sisälsi plas-midia (2,46 ^ug 30 ^ulrssa TEN), Hpal-puskuria (4 ^ul) ja Hpal (30 U 6 ^ulrssa TEN). Leikattu DNA leikattiin edelleen Clalrlla lisäämällä DNA-liuos 10 y.ul:aan liuosta, joka sisälsi Clal-puskuria (5 ,ul) ja Clal (25 U, 5 ,ul TEN) ja o ' 10 inkuboimalla 37 C:ssa 1,5 tuntia. Kaksinkertaisesti leikattu DNA saostettiin etanolilla ja sakka liuotettiin 40 ^ul:aan TEN. Liuotettu liuos saatettiin agaroosigeelielektroforee-siin. Elektroforeesin jälkeen eristettiin 4 640 emäsparin suora DNA-segmentti (3) (2,35 yUg 80 ^ulissa TEN). * 15 ii) DNA-segmentin (4) valmistus plasmidista pTRE1
Plasmidia pTRE1 leikattiin Hpaltila 37°C:ssa 1,5 tuntia 120 ^ulissa liuosta, joka sisälsi plasmidia (8,2 ^ug 100 ^ulrssa TEN), Hpal-puskuria (12 ^,ul) ja Hpal (57 U 8 ^ulrssa TEN). Tähän seokseen lisättiin liuos, joka sisäl-20 si Taql (80 l) 9 ^,ul:ssa TEN) ja Hpal-puskuria (12 ^,ul) ja Hpal (57 U 8 ^ulissa TEN). Tähän seokseen lisättiin liuos, joka sisälsi Taql (80 U 9 yUlrssa TEN) ja Hpal-puskuria (1 ^rul) . Syntynyttä seosta (130 ^ul) inkuboitiin 65°C:ssa yksi tunti. Inkuboinnin jälkeen kaksinkertaisesti leikattu 25 DNA saostettiin etanolilla ja sakka liuotettiin 40 ^,ul:aan TEN. Liuotettu liuos saatettiin polyakryyliamidigeelielektro-foreesiin. Elektroforeesin jälkeen eristettiin 32 emäsparin suora DNA-segmentti (4) (0,054 ^,ug 40 ^,ul:ssa TEN), iii) DNA-segmentin (3) ja (4) liitäntä 30 Seos, joka sisälsi DNA-segmenttiä (3) (0,29 ^ug 10 ^ulrssa TEN) ja segmenttiä (4) (0,014 ^ug 10 ^ulissa TEN) saatettiin liitettäväksi käyttäen T^-ligaasia (3,6 U 4 ^ulrssa TEN), ligaasipuskuria (3 ^ul) ja ATP (6 mM, 3 ^ul TEN). Liitäntäseosta (30 ^ul) inkuboitiin 22°C:ssa kaksi 35 tuntia. Liitetty DNA saostettiin etanolilla ja sakka liuotettiin 40 ^ul:aan TEN.
20 86886 iv) Transformointi 30 niikrolitraa edellä saatua TEN-liuosta, joka sisältää liitetyn DNA:n, käytettiin transformoimaan kannan E. coli C600 kelvollisia soluja. N. 840:n transformantin havaittiin 5 olevan ampisilliiniresistenttejä. Kaikki transformantit sisälsivät pTRP1-plasmidin.
Esimerkki 4
Plasmidin pCR501 rakentaminen i) DNA-segmentin (a) valmistus plasmidista pTRE1 10 Plasmidi pTRE1 pilkottiin inkuboimalla 37°C:ssa kak si tuntia 120 ^ulissa reaktioseosta, joka sisälsi plasmidia (8,2 yug 100 ^ulissa TEN), EcoRI-puskuria (12 ^ul), 1^0 (3 yul) ja EcoRI (25 U 5 ^ulissa TEN). Fenoliuuton, eette-riuuton, etanolisaostuksen ja liuottamisen jälkeen 50 ^ul:aan 15 TEN leikattu DNA leikattiin edelleen S1 nukleaasilla 22°C:ssa puoli tuntia 50 ^ulissa reaktioseosta, joka sisälsi DNA (25 yUl TEN), SI-puskuria (5 ^ul) , H20 (10 yUl) ja SI-nuk-leaasia (100 U, 10 ^ul). Inkubointi lopetettiin fenolikäsit-telyllä ja DNA uutettiin eetterillä ja saostettiin etano-20 lilla. Sillä välin EcoRI-liittäjää kinasoitiin polynuk-leotidikinaasilla 37 C:ssa yksi tunti 20 ^ulissa reaktio-seosta, joka sisälsi liittäjää (5 ^,ug, 5 yUl), ATP (3 mM, 2 yul), kinatoimispuskuria (2 yUl), (9 yul) ja kinaa- sia (22 U 2 ^ulissa TEN). Kinatoimisseos (20 ^ul), joka si-25 sälsi EcoRI-liittäjän, lisättiin etanolilla saostettuun leikattuun DNArhan yhdessä ATP:n (3 mM, 5 yul) plus 4,5 yksikön kanssa T^ ligaasia (5 ^ul TEN). Seosta (30 ^ul) in-kuboitiin 22°C:ssa kaksi tuntia. Tuote-DNA saostettiin etanolilla ja sakka liuotettiin 60 ^ultaan TEN. DNA-liuokseen 30 (50 yul) lisättiin EcoRI 500 U 50 ^ulissa TEN), EcoRI-pus- kuria (20 yul) ja 1^0 (80 ^ul). Syntynyttä seosta (200 yul) inkuboitiin 37°C:ssa kaksi tuntia. Inkubointi lopetettiin fenolikäsittelyllä ja DNA uutettiin eetterillä ja saostettiin etanolilla. Saostunut DNA leikattiin Sällillä inku- 35 boimalla 37°C:ssa 1,5 tuntia 110 ,ul:ssa liuosta, joka si- / sälsi Sali (100 U, 20 ^,ul), Sali-puskuria (10 ^,ul), 21 86 8 86 (80 yUl). Inkuboinnin jälkeen leikattu DNA saostettiin etanolilla ja liuotettiin 60 yUlraan TEN.
DNA saatettiin agaroosielektrosähköforeesiin antamaan 3,5 yUg puhdistettua suoraa DNA:ta (a) (4 210 bp) 5 100 yUl:ssa TEN.
ii) DNA-segmentin (b) valmistus plasmidista pCR301 Plasmidi pCR301 leikattiin Kpnl:11a inkuboimalla 37°C:ssa 1,5 tuntia 120 yulrssa liuosta, joka sisälsi plas-midia (7,3 yug 100 yUlrssa TEN), Kpnl-puskuria (12 yul) , 10 H20 (2 yUl) ja Kpnl (35 U, 6 yul TEN). Seokseen lisättiin
EcoRI-puskuriliuosta (14 yUl), joka sisälsi EcoRI (30 U, 6 yUl TEN). 140 yul seosta inkuboitiin 37°C:ssa yksi tunti. Kaksinkertaisesti leikattu DNA saostettiin etanolilla ja sakka liuotettiin 60 yUlraan TEN. Liuotettu liuos saatet-15 tiin polyakryyliamidigeelielektroforeesiin. Elektroforeesin jälkeen eristettiin 246 emäsparia DNA-segmentti (b) (0,03 yUg 4 yUl:ssa TEN).
iii) DNA-segmentin (c) valmistus plasmidista pCR301 Plasmidi pCR301 leikattiin Kpnlrlla inkuboimalla 20 37°C:ssa 1,5 tuntia 120 yulrssa liuosta, joka sisälsi plas-midia (15 ,ug 100 yUlrssa TEN), Kpnl-puskuria (12 yUl), H20 (2 yul) ja Kpnl (35 U, 6 yUl TEN). 14 yul:n Sall-pus-kuriliuos plus Sali (32 U, 4 yUl TEN), H20 (2 yUl) lisättiin edellä inkuboituun seokseen. 140 yul seosta inkuboi-25 tiin edelleen 37°C:ssa yksi tunti. Kaksinkertaisesti leikattu DNA saostettiin etanolilla ja sakka liuotettiin 60 yulraan TEN. Liuotettu liuos saatettiin agaroosigeelielektroforeesiin. Elektroforeesin jälkeen eristettiin 1 025 emäsparin DNA-segmentti (c) 2,15 yug 180 yUlrssa TEN).
30 iv) DNA-segmenttien (a), (b) ja (c) liitäntä
Seos, joka sisälsi DNA-segmenttiä (a) 1 yug 30 yulrssa TEN), -segmenttiä (b) (0,03 yug 4 yulrssa TEN) ja -segmenttiä (c) (0,4 yug 30 yulrssa TEN) lyofilisoitiin. Lyofilisdnnin jälkeen sakka huuhdeltiin etanolilla. Jokainen saostettu 35 segment t.i liitettiin yhteen 20 yul-.ssa liuosta, joka sisälsi ligaasipuskuria (4 ,ul), ATP (3 mM, 4 yul), H20 (1 yUl) 22 8 6 8 δ 6 ja Τ^ ligaasia (0,9 U, 1 ^ul) . Inkubointia jatkettiin kaksi tuntia 22°C:ssa. Liitetty DNA seostettiin etanolilla ja liuotettiin 40 ^ul:aan TEN.
v) Transformointi 5 TEN-puskuriliuos (30 yUl), joka sisälsi edellä saa dun liitetyn DNA:n, käytettiin transformoimaan E. coli -kanta C600. 20 transformantin havaittiin sisältävän plasmidia pCR501. Yksi niistä talletettiin kokoelmaan FRI E. coli C600 rk"mk_ (pCR501) FERM BP 262:na.
1 0 Esimerkki 5
Plasmidin pCR 601 rakentaminen i) DNA-segmentin (d) rakentaminen plasmidista pTRE1 Plasmidi pTRE1 leikattiin Hpal:11a inkuboimalla 37°C:ssa yksi tunti 40 ^ulissa liuosta, joka sisälsi plas-15 midia (2,46 ^ug 30 ^ul:ssa TEN), Hpal-puskuria (4 ^ul) ja Hpal (35 U, 6 ^ul TEN). Inkuboituun seokseen lisättiin sitten 10 ^ul liuosta, joka sisälsi Sai1-puskuria (5 ^ul) ja Sali (20 U, 5 ^ul TEN). Seosta (50 ^ul) inkuboitiin edelleen 37°C:ssa yksi tunti. Kaksinkertaisesti leikattu DNA saos-20 tettiin etanolilla ja sakka liuotettiin 40 yul:aan TEN.
Liuotettu liuos saatettiin agaroosigeelielektroforeesiin. Elektroforeesin jälkeen eristettiin 4 010 emasparin segmentti (d) (2,0 yUg 40 ^ulrssa TEN).
ii) DNA-segmentin (e) valmistus plasmidista pTRL1 25 Plasmidi pTRLl leikattiin Hpal:11a inkuboimalla 37°C:ssa 1,5 tuntia 120 yUl:ssa liuosta, joka sisälsi plasmidia (15,4 yug 100 ^ul:ssa TEN), Hpal-puskuria (12 ^ul), Hpal (25 U, 5 y-ul TEN) ja H^O (3 ^ul) . Inkuboituun seokseen lisättiin sitten 20 ^ul liuosta, joka sisälsi EcoRI-50 puskuria (914 ,ul) ja EcoRI (30 U, 6 ,ul TEN). Seosta
O
(140 ^,ul) inkuboitiin edelleen 37 G:ssa yksi tunti. Kaksinkertaisesti leikattu DNA saostettiin etanolilla ja sakka liuotettiin 40 ^ulraan TEN. Liuotettu liuos saatettiin po-lyakryyliamidigeelielektroforeesiin, Elektroforeesin jäl-35 keen eristettiin 56 emäsparin segmentti (e) (0,18yUg 40 ^ul:ssa TEN).
23 8 6 8 8 6 iii) DNA-segmentin (b) valmistus plasmidista pCR301
Toistamalla esimerkin 4 menettely, mutta käyttämällä 32 yksikköä Kpnl ja 30 yksikköä EcoRI, leikattiin plasmidi pCR301 Kpnl:11a ja sitten EcoRI:11a antamaan 0,46 ^ug 5 (40 yUl:ssa TEN) 246 emäsparin DNA-segmenttiä polyakryyli- amidigeelielektroforeesin jälkeen.
iv) DNA-segmentin (c) valmistus plasmidista pCR301
Toistamalla esimerkin 4 menettely, mutta käyttäen 30 yksikköä Kpnl ja 24 yksikköä Sali, leikattiin plasmidi 10 pCR301 Kpnl:lla ja sitten Sall:lla antamaan 3,9 ^ug (40 yul:ssa TEN) 1 025 emäsparin DNA-segmenttiä agaroosigeeli-elektroforeesin jälkeen.
v) DNA-segmenttien (b), (c), (d) ja (e) liitäntä
Seos, joka sisälsi DNA-segmenttiä (b) (0,06 ^,ug 15 5 yul:ssa TEN), -segmenttiä (c) (0,49 yug 5 ^ul:ssa TEN), -segmenttiä (d) (0,5 yug 10 yul:ssa TEN) ja -segmenttiä (e) (0,49 yug 5 yUl:ssa TEN), saatettiin liitettäväksi käyt täen T^-liqnasia (5,5 U 6 yUl:ssa TEN) ja liitäntäpuskuria (4,5 ,ul) plus ATP (6 mM, 4,5 ,ul). Liitettyä seosta (45 /Ui) ‘ o ^ ' 20 inkuboitiin 22 C:ssa kaksi tuntia. Liitetty DNA saostettiin etanolilla ja liuotettiin 60 ^ul:aan TEN.
vi) Transformointi TEN-puskuriliuos (20 yUl), joka sisälsi edellä liitetyn DNA:n, käytettiin transformoimaan E. coli C600 r^ m^ -25 kanta. Transformoinnin jälkeen saatiin 27 ampisilliinire- sistenttiä transformanttia. Kahdeksan transformantin havaittiin sisältävän pCR601 määritettynä restriktioentsyymiuu-tolla. Tämä E. coli C600 r^ m^ (pCR601) -kanta talletettiin kokoelmaan FRI Ferm BP263:na.
30 Esimerkki 6
Plasmidin pCR701 rakentaminen i) DNA-segmentin (f) valmistaminen plasmidista pTRP1
Plasmidi pTRP1 leikattiin HindIII:lla inkuboimalla 37°C:ssa yksi tunti 120 ^,ul:ssa liuosta, joka sisälsi plas-35 midia (25,2 ^ug 100 yUl:ssa TEN), Hindlll-puskuria (12 ^ul) ja Hindlll (48 U, 8 ^ul TEN). Inkuboituun seokseen lisättiin 86886 24
Sali (24 U, 6 yul TEN) ja Sali-puskuria (14 ^ul). Syntynyttä 140 ^υ1:η liuosta inkuboitiin 37°C:ssa kaksi tuntia. Kaksinkertaisesti leikattu DNA saostettiin etanolilla ja sakka liuotettiin 60 ^ulraan TEN. Liuotettu liuos saatettiin aga-5 roosigeelielektroforeesiin. Elektroforeesin jälkeen eristettiin 4 051 emäsparin suora DNA-segmentti (f) (8,2^ug 120yul; ssa TEN) .
ii) DNA-segmentin (g) valmistus plasmidista pCR501 Plasmidi pCR501 leikattiin Sali :11a inkuboimalla 10 37°C:ssa yksi tunti 120 ^ulrssa liuosta, joka sisälsi plas-midia (39 ^ug 100 ^ulrssa TEN), Sali-puskuria (12 ^ul) ja Sali (32 U, 8 ^ul TEN). Leikattua DNArta uutettiin osittain BamHI:lla lisäämällä BamHI (25 U, 5 ^ul TEN) edelliseen seokseen ja inkuboimalla 22°C:ssa puoli tuntia. Tuote-DNA 15 saostettiin etanolilla ja sakka liuotettiin 60 ^ulraan TEN. Tämä liuos saatettiin agaroosigeelielektroforeesiin. Elektroforeesin jälkeen eristettiin 1 264 emäsparin DNA-segmentti (g) (2^ug 80^ulrssa TEN), lii) DNA-segmentti (h) 20 Saatiin synteettinen oligonukleotidi, jolla oli seu- raava sekvenssi: 5' AGCTTATGGCTGAGATCACCAG 3' ATACCGACTCTAGTGGTCCTAG 5' 25 iv) DNA-segmenttien (f), (g) ja (h) liitäntä
Seos, joka sisälsi DNA-segmenttiä (f) (0,68 ^ug 10 yUl:ssa TEN), -segmenttiä (g) (0,25 ^ug 10 ^ul:ssa TEN), ja -segmenttiä (h) (0,046 ^,ug 10 ^ul:ssa TEN) saatettiin 30 liitettäväksi käyttäen T^-DNA-ligaasia (1,8 U, 2 ^ulissa TEN) ja liitäntäpuskuria (4 ^ul) plus ATP (6 mM, 4 ^ul TEN).
: Liitetty seka-DNA saostettiin etanolilla ja liuotettiin 50 yUl:aan TEN: v) Transformointi 35 20 mikrolitraa edellä saatua liitäntäreaktioseosta käytettiin transformoimaan E. coli C600:n kelvollisia 25 86886
soluja. Saatiin 8 ampisilliiniresistenttiä tranformanttia, määritettynä restriktioentsyymianalyysillä, neljän näistä transformanteista havaittiin sisältävän pCR701. Tämä E. coli C600 (pCR701) -kanta talletettiin kokoelmaan FRI
5 FERM BP 264:nä.
Esimerkki 7
Prokymosiinin ekspressoiminen E. coli:ssa E. coli -kantaa, joka sisälsi pCR501, pCR601 tai pCR701, viljeltiin alustavasti LB:ssa 37°C:ssa yli yön.
10 1 ml viljelylientä siirrettiin sitten M9-elatusaineeseen
(10 ml) ja viljeltiin yksi tunti. Viljelyä jatkettiin 37°C:ssa vielä 3-4 tuntia sen jälkeen kun alustaan oli lisätty 3-beta-indolyyliakryylihappoa (15 mg/1). Solut koottiin talteen linkoamalla kierrosluvulla 1 5 000 kierr. fain. n. 15 mi-15 nuuttia ja suspendoitiin 3 ml:aan PBS-puskuria (150 mM
NaCl 20 mM natriumfosfaattipuskurissa, pH 7,0), joka sisältää 1 mM PMSF (fenyylimetyylisulfonyylifluoridia). Tähän suspensioon lisättiin 60 ,ul 250 mM EDTA ja 30 ,ul lysot- o syymiä (10 ml/1) ja seosta pidettiin 0 C:ssa puoli tuntia.
20 Syntyneet sferoplastit hajotettiin äänikäsittelyllä ja tähän lisättiin 3,09 ml 8 M ureaa. Solulysaattiseosta inku-boitiin 37°C:ssa yksi tunti. Linkoamisen jälkeen nopeudella 3 000 kierr. Anin. puolituntia sakan päällä olevaa nestettä dia-lysoitiin PBS vastaan. Dialysaatti saatettiin sitovaan kil-25 pailevaan radioimmunoanalyysiin (ks. Nishimori et ai., Gene).
Radioimmunoanalyysillä prokymosiini immunosaostettiin ja 125 radioaktiivisen aineen ( I) määrä mitattiin gammasäde-laskimella. Sillä välin valmistettiin kalibrointikäyriä vaihtelemalla autenttisen prokymosiinin väkevyyttä. Vertai-30 lemalla immunosaostetun prokymosiinin laskulukemaa kalibroin-tikäyrien kanssa määritettiin prokymosiinin määrä soluly-saatissa. Tämä koe osoitti, että prokymosiinin ekspressoi-mistaso oli korkein viljelyliemellä, jossa oli E. coli, joka sisälsi pCR501 (n. 300 000 molekyyliä isäntäsolua kohti) 35 ja alin liemellä, jossa oli E. coli, joka sisälsi pCR701.
26 8 6 8 8 6
Edellä saatu,; äänikäsiteltyä soluvapaata uutetta käsiteltiin itsenäisesti 4M urealla. Linkoamisen jälkeen sakan päällä oleva liuos saatettiin SDS-polyakryyliamidigee-lielektroforeesiin ja kulkeutuneet proteiinit siirrettiin sit-5 ten mikroselluloosasuodattimiin. Nämä suodattimet analysoitiin autoradiografiällä, kuten edellä Nishimori'n et ai., Gene-julkaisussa on selostettu. Jokaiselle bakteeriuut-teelle havaittiin selvästi erottuva nauha, joka vastaa pro-kymosiinin nauhaa. Vertaamalla näiden nauhojen tiheyttä 10 määritettiin, että E. coli, joka sisälsi plasmidia pCR501, tuotti n. 300 000 prokymosiinimolekyyliä solua kohti. Jokaisen ekspressointiplasmidia sisältävän isäntäsolun kyvyn tuottaa prokymosiinia arvioitiin olevan järjestyksessä pCR501 £ pCR601 > pCR701. Tämä pääsuunta on hyvin sopusoin-15 nussa tulosten kanssa radioimmunoanalyysimenetelmästä.
Bakteeri-prokymosiinin renaturoiminen ja aktivoiminen ja maidon juoksuttamisaktiivisuus
Plasmidia sisältävien bakteerien kokonais-sonikaat-teja käsiteltiin 8M urealla ja dialysoitiin 25 mM natrium-20 bikarbonaattia (pH 10,0) vastaan urean poistamiseksi. Toisen dialyysin jälkeen 50 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,5) vastaan dialysaatit aktivoitiin lisäämällä 0,4 M glysiiniä (pH 2,3) ja pitämällä liuos huoneen lämpötilassa 15 minuuttia.
25 Jokaisen bakteeriuutteen maidonjuoksutusaktiivisuus testattiin Foltman'in menetelmän mukaisesti (B. Foltman, Prochymosin and Chymosin Methods in Enzymology, 19, 42 (1972). Tässä testissä maidon juoksutusaktiivisuus 10 ml:n kuorittua maitoa koaguloimiseksi 100 sekunnissa 30°:ssa määrite-30 tään yhdeksi kymosiiniyksiköksi (CU). Jokaiselle bakteeri-uutteelle, joka oli johdettu ekspressointiplasmideista, mitattiin maidon juoksutusaktiivisuus näin tuotetun (nimittäin bakteeri-prokymosiinin muuttaminen kymosiiniksi) pro-kymosiinin aktivoimisen jälkeen; aktiivisuus pCR501:lle 35 oli 9,3 CU/mg ja 3,7 CU/mg pCR701:lle. On todettava, että 27 86 8 86 bakteeriuute, jossa ei ollut ekspressointiplasmidia, ei antanut minkäänlaista maidon juoksutusaktiivisuutta määritettynä edellä esitetyillä testimenetelmillä.

Claims (9)

86836
1. Menetelmä prokymosiinia koodaavan geenin eks-pressoimiseksi E. coli -isäntäsoluissa, tunnettu 5 siitä, että yhdistelmäplasmidi pCR501, pCR601 tai pCR701, joilla on kuviossa 3 esitetyt restriktiokartat, viedään isäntäsoluihin transformoimalla.
2. Ekspressointiplasmidi, tunnettu siitä, että se sisältää prokymosiinia koodaavan geenin ja vek- 10 torin, joka on operatiivisesti liitetty siihen ja joka on alunperin johdettu plasmidista pBR322 ja sisältää E. coli trp-operonipromoottorin ja translaation aloituskodonin, joka ekspressointiplasmidi on pCR501, pCR601 tai pCR701, joilla on kuviossa 3 esitetyt restriktiokartat.
3. Menetelmä plasmidin pTREl valmistamiseksi, jol la on kuviossa 2 esitetty restriktiokartta, tunnet-t u siitä, että se käsittää vaiheet, joissa: (1) uutetaan osittain pOCT2, jolla on kuviossa 2 esitetty restriktiokartta, EcoRI:11a EcoRI-kohdan leik- 20 kaamiseksi lähempänä Apr-geeni-osaa; (2) korjataan leikatut yksisäikeiset DNA-osat DNA-polymeraasin avulla; ja (3) yhdistetään korjatut leikatut päät yhteen li-gatoimalla käyttäen T4 DNA-ligaasia. -.25
4. Menetelmä plasmidin pTRLl valmistamiseksi, jol la on kuviossa 2 esitetty restriktiokartta, tunnet-t u siitä, että se käsittää vaiheet, joissa: (a) uutetaan pOCT2, jolla on kuviossa 2 esitetty restriktiokartta, EcoRI:11a ja osittain Rsal:lla suoran
30 DNA-segmentin tuottamiseksi, jossa on 360 emäsparia; (b) siihen liitetään kinasoitu EcoRI-liittäjä, mitä seuraa uuttaminen EcoRI:11a DNA-segmentin (1) tuottamiseksi; (c) uutetaan plasmidia pBR322 EcoRI:11a, mitä seu- 35 raa käsittely MATE BAP:11a DNA-segmentin (2) tuottamiseksi; ja (d) liitetään DNA-segmentit (1) ja (2) T4 DNA-li- 86886 gaasin avulla.
5. Menetelmä plasmidin pTRPl valmistamiseksi, jolla on kuviossa 2 esitetty restriktiokartta, tunnet-t u siitä, että se käsittää vaiheet, joissa 5 (a) uutetaan plasmidia pTREl, jolla on kuviossa 2 esitetty restriktiokartta, Hpalrlla ja Clalrlla peräkkäin antamaan DNA-segmentti (3), jossa on noin 4640 emäsparia; (b) uutetaan pTRElrtä, jolla on kuviossa 2 esitetty restriktiokartta, Hpalrlla ja Taqlrlla peräkkäin an- 10 tamaan DNA-segmentti (4), jossa on 32 emäsparia; ja (c) liitetään DNA-segmentit (3) ja (4) T4 DNA-li-gaasin avulla.
6. Menetelmä plasmidin pCR501 valmistamiseksi, jolla on kuviossa 3 esitetty restriktiokartta, t u n - 15. e t t u siitä, että se käsittää vaiheet, joissa: (a) uutetaan plasmidia pTREl, jolla on kuviossa 2 esitetty restriktiokartta, EcoRIrlla ja Sl:llä peräkkäin antamaan suora DNA-segmentti, jolla on tylpät päät; (b) siihen liitetään EcoRI-liittäjä, mitä seuraa 20 uutto EcoRIrlla ja Sali:11a antamaan suora DNA-segmentti (a), jossa on noin 4210 emäsparia; (c) uutetaan pCR301:tä, jolla on kuviossa 3 esitetty restriktiokartta, Kpnl:lla ja EcoRIrlla peräkkäin antamaan suora DNA-segmentti (b), jossa on 246 emäsparia; 25 (d) uutetaan itsenäisesti pCR301:tä, jolla on ku viossa 3 esitetty restriktiokartta, Kpnlrlla plus Sallrlla antamaan DNA-segmentti (c), jossa on 1025 emäs-paria; ja (e) liitetään DNA-segmentit (a), (b) ja (c) yhteen 30 T4 DNA-ligaasin avulla.
7. Menetelmä plasmidin pCR601 valmistamiseksi, jolla on kuviossa 3 esitetty restriktiokartta, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa: (a) uutetaan plasmidia pTREl, jolla on kuviossa 2 35 esitetty restriktiokartta, Hpalrlla ja Sallrlla peräkkäin antamaan suora DNA-segmentti (d), jossa on 4010 emäs-paria; 86886 (b) uutetaan plasmidia pTRLl, jolla on kuviossa 2 esitetty restriktiokartta, Hpalilla ja EcoRIilla peräkkäin antamaan suora DNA-segmentti (e), jossa on 56 emäs-paria; 5 (c) uutetaan plasmidia pCR301, jolla on kuviossa 3 esitetty restriktiokartta, Kpnl:lla plus EcoRIilla ja vastaavasti Kpnl:lla plus Sällillä antamaan DNA-segmentti (b), jossa on 246 emäsparia, ja segmentti (c), jossa on 1025 emäsparia, ja 10 (d) liitetään DNA-segmentit (b), (c), (d) ja (e) yhteen T4 DNA-ligaasin avulla.
8. Menetelmä plasmidin pCR70l valmistamiseksi, jolla on kuviossa 3 esitetty restriktiokartta, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa 15 (a) uutetaan plasmidia pTRPl, jolla on kuviossa 2 esitetty restriktiokartta, Hindlllilla ja Sällillä peräkkäin antamaan suora DNA-segmentti (f), jossa on 4050 emäsparia; (b) uutetaan plasmidia pCR501, jolla on kuviossa 3 20 esitetty restriktiokartta, Sällillä ja osittain BamHIilla antamaan DNA-segmentti (g), jossa on 1264 emäsparia (c) saadaan synteettinen oligonukleotidi [DNA-segmentti (h)], jolla on nukleotidisekvenssii 3' 25 5' AGCTTATGGCTGAGATCACCAG ATACCGACTCTAGTGGTCCTAG 5 * 3 · ja (d) liitetään DNA-segmentit (f), (g) ja (h) yhteen
30 T4 DNA-ligaasin avulla.
9. Menetelmä prokymosiinin tuottamiseksi ekspres-soimalla prokymosiinia koodaavaa geeniä E. coli -isäntä-soluissa, tunnettu siitä, että isäntäsoluja, jotka on transformoitu plasmidilla pCR501, pCR60l tai 35 pCR701, joilla on kuviossa 3 esitetyt restriktiokartat, viljellään elatusaineessa. 86836
FI840918A 1983-03-09 1984-03-07 Nya expressionsplasmider och deras anvaendning i foerfarandet foer expressering av prokymosin koderande gen i e. coli FI86886C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP58038439A JPS59166086A (ja) 1983-03-09 1983-03-09 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法
JP3843983 1983-03-09

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI840918A0 FI840918A0 (fi) 1984-03-07
FI840918A FI840918A (fi) 1984-09-10
FI86886B true FI86886B (fi) 1992-07-15
FI86886C FI86886C (fi) 1992-10-26

Family

ID=12525334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI840918A FI86886C (fi) 1983-03-09 1984-03-07 Nya expressionsplasmider och deras anvaendning i foerfarandet foer expressering av prokymosin koderande gen i e. coli

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0121775A1 (fi)
JP (1) JPS59166086A (fi)
AR (1) AR241795A1 (fi)
AU (1) AU572827B2 (fi)
BR (1) BR8401049A (fi)
DK (1) DK136184A (fi)
FI (1) FI86886C (fi)
IE (1) IE57264B1 (fi)
NZ (1) NZ207414A (fi)

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI841288A (fi) * 1983-03-31 1984-10-01 Codon Genetic Eng Lab Rekombinant-dna-kod foer uttryckning av polypeptid.
US4721673A (en) * 1983-09-01 1988-01-26 Genex Corporation Recovery and activation process for microbially produced calf prochymosin
JPS60188093A (ja) * 1984-03-09 1985-09-25 Teruhiko Beppu 枯草菌に於ける形質発現プラスミド
JPS60188077A (ja) * 1984-03-09 1985-09-25 Teruhiko Beppu 仔牛プロキモシンｃＤΝＡの全配列を有する新規な発現プラスミド
US5082775A (en) * 1984-05-11 1992-01-21 Berlex Laboratories, Inc. Efficient process for isolating insoluble heterologous protein using non-ionic detergents
US4705848A (en) * 1986-06-02 1987-11-10 International Minerals & Chemical Corp. Isolation of bioactive, monomeric growth hormone
GB2200118A (en) * 1987-01-23 1988-07-27 Allelix Inc Synthetic chymosin-and prochymosin-encoding DNA segments
ES2109336T3 (es) 1990-11-26 1998-01-16 Genetics Inst Expresion de pace en celulas huesped y metodos de utilizacion de la misma.
US5629167A (en) 1994-04-19 1997-05-13 Biocine S.P.A. Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay
CA2308606A1 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Chiron S.P.A. Neisserial antigens
AU1979599A (en) 1998-01-14 1999-08-02 Chiron S.P.A. (neisseria meningitidis) antigens
GB9808932D0 (en) 1998-04-27 1998-06-24 Chiron Spa Polyepitope carrier protein
BR9910089A (pt) 1998-05-01 2004-06-08 Chiron Corp Composições e antìgenos de neisseria meningitidis
RU2245366C2 (ru) 1999-04-30 2005-01-27 Чирон С.Р.Л. Антиген neisseria, кодирующая его нуклеиновая кислота, их использование
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
EP2275552B1 (en) 1999-10-29 2015-09-09 GlaxoSmithKline Biologicals SA Neisserial antigenic peptides
PT2289545T (pt) 2000-01-17 2016-09-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vacina de omv suplementada contra meningococos
MXPA03003690A (es) 2000-10-27 2004-05-05 Chiron Spa Acidos nucleicos y proteinas de los grupos a y b de estreptococos.
ES2354775T5 (es) 2000-11-06 2021-12-23 Chr Hansen As Método de producción de quimosina no bovina y uso de la misma
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
WO2003010194A2 (en) 2001-07-27 2003-02-06 Chiron Srl. Meningococcus adhesins nada, app and orf 40
ES2312649T3 (es) 2001-12-12 2009-03-01 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Inmunizacion frente a chlamydia trachomatis.
CA2485695A1 (en) 2002-05-24 2003-12-04 Fred W. Wagner Method for universal enzymatic production of bioactive peptides
EP1572720A4 (en) 2002-05-24 2008-12-24 Nps Allelix Corp PROCESS FOR THE ENZYMATIC PRODUCTION OF GLP-2 (1-34) AND GLP-2 (1-33) PEPTIDES
EP2279746B1 (en) 2002-11-15 2013-10-02 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Surface proteins in neisseria meningitidis
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
JP4850698B2 (ja) 2003-04-25 2012-01-11 ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ 細胞表面タンパク質相同体をコードするアシドフィルス菌核酸配列及びその使用
DE602004032144D1 (de) 2003-06-23 2011-05-19 Univ North Carolina State Für fructooligosaccharid-nutzende verbindungen codierende nukleinsäuren aus lactobacillus acidophilus und verwendungen davon
PL1704234T3 (pl) 2003-11-21 2012-06-29 Nps Pharma Inc Wytwarzanie glukagonopodobnego peptydu 2 i analogów
GB2429207A (en) 2004-02-02 2007-02-21 Ambrx Inc Modified human interferon polypeptides and their uses
AU2005319099B2 (en) 2004-02-02 2010-09-16 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
US7459289B2 (en) 2004-03-08 2008-12-02 North Carolina State University Lactobacillus acidophilus nucleic acid sequences encoding carbohydrate utilization-related proteins and uses therefor
KR101699142B1 (ko) 2004-06-18 2017-01-23 암브룩스, 인코포레이티드 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도
DK1828224T3 (en) 2004-12-22 2016-07-18 Ambrx Inc Compositions containing, methods including, AND USES OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND POLYPEPTIDES
EP2305791A1 (en) 2005-04-15 2011-04-06 North Carolina State University Methods and compositions to modulate adhesion and stress tolerance in bacteria
PT2339014E (pt) 2005-11-16 2015-10-13 Ambrx Inc Métodos e composições compreendendo aminoácidos não-naturais
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
US20110206692A1 (en) 2006-06-09 2011-08-25 Novartis Ag Conformers of bacterial adhesins
DK2615108T3 (en) 2006-09-08 2017-01-30 Ambrx Inc Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and their applications
KR20140012199A (ko) 2007-03-30 2014-01-29 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
AU2008326324B9 (en) 2007-11-20 2012-11-15 Ambrx, Inc. Modified insulin polypeptides and their uses
EP3103880A1 (en) 2008-02-08 2016-12-14 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
NZ587382A (en) 2008-02-21 2012-01-12 Novartis Ag Meningococcal fhbp polypeptides
UA118536C2 (uk) 2008-07-23 2019-02-11 Амбркс, Інк. Модифікований поліпептид бичачого гранулоцитарного колонієстимулювального фактора та його застосування
MX348657B (es) 2008-09-26 2017-06-21 Ambrx Inc Microorganismos y vacunas dependientes de replicacion de aminoacidos no naturales.
EP3216800A1 (en) 2008-09-26 2017-09-13 Ambrx, Inc. Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses
WO2011024072A2 (en) 2009-08-27 2011-03-03 Novartis Ag Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences
BR112012010531A2 (pt) 2009-10-27 2019-09-24 Novartis Ag "polipeptídeos de modificação meningocócica fhbp"
NZ600363A (en) 2009-12-21 2014-07-25 Ambrx Inc Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
CN102753573A (zh) 2009-12-21 2012-10-24 Ambrx公司 经过修饰的牛促生长素多肽和其用途
CN103221420A (zh) 2010-05-19 2013-07-24 北卡罗莱纳州立大学 用于递送治疗性肽的组合物和方法
BR112013003522B1 (pt) 2010-08-17 2021-05-25 Ambrx, Inc. polipeptídeos relaxina modificados compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente, seu método de preparação e seu uso, bem como ácido nucleico e célula hospedeira
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
RU2473683C1 (ru) * 2011-12-15 2013-01-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк" СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММОВ E.coli, ПОЛУЧЕННЫХ НА ОСНОВЕ ШТАММА BL21(DE3), НЕСУЩЕГО ГЕН T7 RNA ПОЛИМЕРАЗЫ ПОД КОНТРОЛЕМ lacUV5 ПРОМОТОРА, С ПОВЫШЕННЫМ СИНТЕЗОМ БИОМАССЫ И ВЫХОДОМ ЦЕЛЕВОГО БЕЛКА В ТЕЛЬЦАХ ВКЛЮЧЕНИЯ
US10767156B2 (en) 2013-10-24 2020-09-08 Yeda Research And Development Co., Ltd. Polynucleotides encoding BREX system polypeptides and methods of using same
KR20240024362A (ko) 2014-10-24 2024-02-23 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 변형된 fgf-21 폴리펩티드 및 그의 용도
US10590426B2 (en) 2016-08-22 2020-03-17 Board Of Trustees Of Michigan State University Genetic control of cell size
IL250479A0 (en) 2017-02-06 2017-03-30 Sorek Rotem Genetically engineered cells expressing a disarm system that confers resistance to phages and methods for their production
CN110637027A (zh) 2017-02-08 2019-12-31 百时美施贵宝公司 包含药代动力学增强子的修饰的松弛素多肽及其用途
CN107881162A (zh) * 2017-12-25 2018-04-06 中诺生物科技发展江苏有限公司 一种工业化生产凝乳酶的方法
IL258467A (en) 2018-03-29 2018-07-04 Ilana Kolodkin Gal Methods of disrupting a biofilm and/or preventing formation of same
US20220056093A1 (en) 2018-09-11 2022-02-24 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and their uses
WO2020202142A2 (en) 2019-03-31 2020-10-08 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-viral and anti-tumoral compounds
KR20220151202A (ko) 2020-03-11 2022-11-14 암브룩스, 인코포레이티드 인터류킨-2 폴리펩타이드 접합체 및 그의 사용 방법
IL288680A (en) 2021-12-05 2023-07-01 Yeda Res & Dev Genetically modified phages and their use

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4666847A (en) * 1981-01-16 1987-05-19 Collaborative Research, Inc. Recombinant DNA means and method
JPS589687A (ja) * 1981-06-17 1983-01-20 セルテク　リミテッド ポリペプチドの生産方法
IE53517B1 (en) * 1981-06-17 1988-12-07 Celltech Ltd Process for the production of a polypeptide
JPS5832896A (ja) * 1981-08-24 1983-02-25 Teruhiko Beppu 複合プラスミド及びそれを含有する微生物
BR8205954A (pt) * 1981-10-14 1983-09-13 Unilever Nv Sequencia de dna,plasmidio recombinante,cultura bacteriana e microorganismos
ZA834095B (en) * 1982-07-01 1984-02-29 Genex Corp Bovine calf chymosin
IE56372B1 (en) * 1982-12-22 1991-07-03 Genentech Inc Microbially produced rennet methods for its production and plasmids used for its production

Also Published As

Publication number Publication date
FI840918A (fi) 1984-09-10
JPS59166086A (ja) 1984-09-19
DK136184A (da) 1984-09-10
AU572827B2 (en) 1988-05-19
IE840559L (en) 1984-09-09
BR8401049A (pt) 1984-10-16
EP0121775A1 (en) 1984-10-17
IE57264B1 (en) 1992-07-01
FI840918A0 (fi) 1984-03-07
AU2535784A (en) 1984-09-13
JPS6240999B2 (fi) 1987-09-01
AR241795A1 (es) 1992-12-30
FI86886C (fi) 1992-10-26
DK136184D0 (da) 1984-02-29
NZ207414A (en) 1988-02-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI86886B (fi) Nya expressionsplasmider och deras anvaendning i foerfarandet foer expressering av prokymosin koderande gen i e.coli.
FI84080C (fi) Foerfarande foer framstaellning av rennin och daeri anvaendbara hybridplasmider.
US4711845A (en) Portable temperature-sensitive control cassette
EP0035384B1 (en) Deoxynucleotide linkers to be attached to a cloned dna coding sequence
US4769326A (en) Expression linkers
CA1338642C (en) Bacterial methionine n-terminal peptidase
EP0075444A2 (en) Methods and products for facile microbial expression of DNA sequences
US4797359A (en) Heat shock regulated production of selected and fused proteins in yeast
WO1981000114A1 (en) Microbial expression of quasi-synthetic genes
JPH11513562A (ja) 組換えプラスミドの生産方法
EP0278706B1 (en) Recombinant plasmid for the expression of l-phenylalanine ammonia-lyase and transformed strain carrying same
US6472196B1 (en) Amino acid sequence of L-phenylalanine ammonia-lyase
EP0279665B1 (en) A method of regulating expression of a foreign gene by controlling culture temperature and a process of producing a foreign gene product thereby
EP0134673B1 (en) Improved plasmid vector and use thereof
US4880910A (en) Terminal methionyl bovine growth hormone and its use
AU594012B2 (en) Novel expression plasmids containing the full cDNA sequence of calf prochymosin
EP0279664B1 (en) A method of regulating expression of a foreign gene by controlling the sugar concentration in a medium and a process of producing a foreign gene product thereby
CA1283068C (en) Plasmid for expression of penicillin g amidase
US5139935A (en) Method of regulating expression of a foreign gene by controlling the sugar concentration in a medium and a process of producing a foreign product thereby
JP2525413B2 (ja) Ｌ−フェニルアラニン・アンモニアリア−ゼ発現用組換え体プラスミド及び該プラスミドを有する形質転換株
CA1200774A (en) Expression linkers
GB2121048A (en) Microbial expression of quasi- synthetic genes
CA2160861A1 (en) Induction-free process for the recombinant preparation of glutarylamidase
JPS63105681A (ja) Ｄｎａ塩基配列
JPH05268958A (ja) プロキモシンの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed

Owner name: BEPPU, TERUHIKO