JPS61185197A - ウロガストロンの微生物学的製造法 - Google Patents
ウロガストロンの微生物学的製造法Info
- Publication number
- JPS61185197A JPS61185197A JP17178284A JP17178284A JPS61185197A JP S61185197 A JPS61185197 A JP S61185197A JP 17178284 A JP17178284 A JP 17178284A JP 17178284 A JP17178284 A JP 17178284A JP S61185197 A JPS61185197 A JP S61185197A
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- JP
- Japan
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- gene
- plasmid
- urogastrone
- secretory
- production method
- Prior art date
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- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、遺伝子工学的手法によるウロガストロンの製
造法に関する。
造法に関する。
ウロガストロンはヒトの十二指腸及び唾液腺で合成され
るポリペプチドホルモンであり、５３個のアミノ酸から
なる事が知られている（ｔｌｅｉｔｚ ｅｔａｌ、、Ｇ
ｕｔ、 １９ ４０８−４１３ （１９７Ｂ） ；
Ｇｒｅｇｏｒｙ ＆ Ｐｒｅｓｔｏｎ、 Ｉｎｔ、
Ｊ、 Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ、、
９１０７−１１８（１９７７） ）。 ウロガストロ
ンは胃酸の分泌を抑制し、細胞の成長を促進する作用を
有し、潰瘍の治療や傷の治療等に利用することができる
本発明は組み換えＤＮＡ技術により安価にしかも多量に
純粋なウロガストロンを生産することを主な目的とする
ものである 即ち、本発明は、ウロガストロンを宿主細胞で生産させ
かつこれを細胞質外に分泌させる分泌型発現プラスミド
を構築し、これにより宿主細胞を形質転換しこの形質転
換体の培養によりウロガストロンを生産（これを発現と
呼ぶ）する方法を提供する。
るポリペプチドホルモンであり、５３個のアミノ酸から
なる事が知られている（ｔｌｅｉｔｚ ｅｔａｌ、、Ｇ
ｕｔ、 １９ ４０８−４１３ （１９７Ｂ） ；
Ｇｒｅｇｏｒｙ ＆ Ｐｒｅｓｔｏｎ、 Ｉｎｔ、
Ｊ、 Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ、、
９１０７−１１８（１９７７） ）。 ウロガストロ
ンは胃酸の分泌を抑制し、細胞の成長を促進する作用を
有し、潰瘍の治療や傷の治療等に利用することができる
本発明は組み換えＤＮＡ技術により安価にしかも多量に
純粋なウロガストロンを生産することを主な目的とする
ものである 即ち、本発明は、ウロガストロンを宿主細胞で生産させ
かつこれを細胞質外に分泌させる分泌型発現プラスミド
を構築し、これにより宿主細胞を形質転換しこの形質転
換体の培養によりウロガストロンを生産（これを発現と
呼ぶ）する方法を提供する。
本発明において用いる分泌型発現プラスミドは、化学的
に合成したウロガストロン遺伝子及び分泌型ベクターを
用いて構築することができる。
に合成したウロガストロン遺伝子及び分泌型ベクターを
用いて構築することができる。
本発明において用いるウロガストロン遺伝子は通常用い
られているヌクレオチド合成法によって製造される。
このウロガストロン遺伝子は、ウロガストロンのアミノ
酸配列からそれに対応する遺伝子のヌクレオチド配列（
以下これを構造遺伝子と呼ぶ）を決定し設計されるが、
大部分のアミノ酸に関してそれに対応する遺伝子暗号（
コドン）が２個以上存在するので５３個のアミノ酸より
なる配列に対して極めて多数のヌクレオチド配列を考え
ることが可能である。この多数の可能性の中から望まし
い配列を決定するに当たっての判断基準として、例えば
、使用すべき宿主細胞において多頻度に使用されている
コドンを使用すべきであること、構造遺伝子を含む配列
の両端及び内部に適当な制限酵素認識部位を持たせてプ
ラスミドへの挿入、解析を行う事を容易にすること、化
学合成の過程において遺伝子断片の集合及び連結が容易
にできる様に各構成断片間での不必要な相互作用が最小
になるようにコドンを選択する事等があげられる。
られているヌクレオチド合成法によって製造される。
このウロガストロン遺伝子は、ウロガストロンのアミノ
酸配列からそれに対応する遺伝子のヌクレオチド配列（
以下これを構造遺伝子と呼ぶ）を決定し設計されるが、
大部分のアミノ酸に関してそれに対応する遺伝子暗号（
コドン）が２個以上存在するので５３個のアミノ酸より
なる配列に対して極めて多数のヌクレオチド配列を考え
ることが可能である。この多数の可能性の中から望まし
い配列を決定するに当たっての判断基準として、例えば
、使用すべき宿主細胞において多頻度に使用されている
コドンを使用すべきであること、構造遺伝子を含む配列
の両端及び内部に適当な制限酵素認識部位を持たせてプ
ラスミドへの挿入、解析を行う事を容易にすること、化
学合成の過程において遺伝子断片の集合及び連結が容易
にできる様に各構成断片間での不必要な相互作用が最小
になるようにコドンを選択する事等があげられる。
宿主細胞によって種々の条件が考慮されるが、通常量も
一般的に用いられる大腸菌（Ｅ、 Ｃｏ１１ ）の場合
について述べれば下記の通りである。
一般的に用いられる大腸菌（Ｅ、 Ｃｏ１１ ）の場合
について述べれば下記の通りである。
ｉ） 構造遺伝子の設計
ウロガストロンを構成するアミノ酸を指定するいくつか
のコドンの中から、下記の条件を満たすものを選んでＤ
ＮＡを合成する。
のコドンの中から、下記の条件を満たすものを選んでＤ
ＮＡを合成する。
（１） Ｇ−Ｃ塩基対に富む領域に続いてＡ−Ｔ塩基
ついに富む領域が続かない様にする。
ついに富む領域が続かない様にする。
（２）各々の合成フラグメントが分子内あるいは分子間
で望まない相補性塩基配列を持たない様にする。
で望まない相補性塩基配列を持たない様にする。
このような条件を満たすように設計されたウロガストロ
ン構造遺伝子の一具体例として下記ヌクレオチド配列で
表わされる遺伝子があげられる。
ン構造遺伝子の一具体例として下記ヌクレオチド配列で
表わされる遺伝子があげられる。
ウロガストロンの構造遺伝子：
ｉｉ） 遺伝子全体の設計
（１）構造遺伝子の５°端に翻訳開始コドンＡＴＧを付
加し、翻訳を終結せしめるため構造遺伝子の３゛端に翻
訳終止信号（Ｔ Ａ Ａ及びＴＧＡ）を付は加える。
加し、翻訳を終結せしめるため構造遺伝子の３゛端に翻
訳終止信号（Ｔ Ａ Ａ及びＴＧＡ）を付は加える。
（２）プラスミドへの組み込み、プラスミドからの切出
しを容易にするため５゛、３゛両端に制限酵素認識部位
をもたせる。
しを容易にするため５゛、３゛両端に制限酵素認識部位
をもたせる。
（３）形質転換体の検索を容易にするため遺伝子内に−
又は二辺上の制限酵素認識部位をもたせることが望まし
い。
又は二辺上の制限酵素認識部位をもたせることが望まし
い。
このような条件を満たすように設計されたウロガストロ
ン遺伝子の一興体例として下記ヌクレオチド配列（１）
で表わされる遺伝子があげられる。
ン遺伝子の一興体例として下記ヌクレオチド配列（１）
で表わされる遺伝子があげられる。
ヌクレオチド配列（１）：
Ｂａｗｌ Ｉ／５ａｕ３ａ Ｉ
Ｃ１ａ Ｉ／Ｔａｑ Ｉ Ｈｉｎｆ
ＩＡＴＴＧＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴ
ＡＡＣＧＧＡＣＧＴＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＡＣＴａｑ
Ｉ Ａｌｕ Ｉ ｐｈ Ｉ Ｎａｕ ［／Ｔｈａ ｌ ５ＴＯＰ Ｂｃ Ｉ／５ａｕ３Ａ上記の配列か
ら明らかなように、この遺伝子は構造遺伝子の５°端に
翻訳開始コドンＡＴＧが付加し、３°端に終止コドンＴ
ＡＡ、ＴＧＡが付加されている。
ＩＡＴＴＧＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴ
ＡＡＣＧＧＡＣＧＴＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＡＣＴａｑ
Ｉ Ａｌｕ Ｉ ｐｈ Ｉ Ｎａｕ ［／Ｔｈａ ｌ ５ＴＯＰ Ｂｃ Ｉ／５ａｕ３Ａ上記の配列か
ら明らかなように、この遺伝子は構造遺伝子の５°端に
翻訳開始コドンＡＴＧが付加し、３°端に終止コドンＴ
ＡＡ、ＴＧＡが付加されている。
ＡＴＧの上流にｍＲＮＡのリポゾーム結合部位に対応す
る配列を含み、同時に翻訳開始コドンＡＴＧの直前にＣ
１ａ Ｉ認識配列が配置される配列ＧＴＡＧＴＴＧＡＡ
ＧＧＡＧＴＴＴＡＡＴＣＧを有する。
る配列を含み、同時に翻訳開始コドンＡＴＧの直前にＣ
１ａ Ｉ認識配列が配置される配列ＧＴＡＧＴＴＧＡＡ
ＧＧＡＧＴＴＴＡＡＴＣＧを有する。
Ｒａｍ ）ＩＩ認識配列の粘着末端に相当する配列を５
゛端にＢｃｌ Ｉ認識部位配列の粘着末端に相当する
配列を３゛端に有する。 また、構造遺伝子内に旧ｎｆ
ｌ、 Ｔａｑ Ｉ、 Ａｌｕ Ｉ、 Ｈｐｈ ［、Ｎａ
ｕ Ｉ及びＴｈａ Ｉ認識部位を含むものである。
゛端にＢｃｌ Ｉ認識部位配列の粘着末端に相当する
配列を３゛端に有する。 また、構造遺伝子内に旧ｎｆ
ｌ、 Ｔａｑ Ｉ、 Ａｌｕ Ｉ、 Ｈｐｈ ［、Ｎａ
ｕ Ｉ及びＴｈａ Ｉ認識部位を含むものである。
この遺伝子は翻訳終結信号及び５゛、３”両端に制限酵
素認識部位を含んでいるため使用し得るヘクターの制限
が極めて少なくなっている。
素認識部位を含んでいるため使用し得るヘクターの制限
が極めて少なくなっている。
上述の遺伝子は、本願発明者の一部によりすでに製造法
が発明されておりこのヌクレオチド配列（１）の遺伝子
の製造法、及びこの遺伝子を含む組み換えプラスミドｐ
ＵＧ１２の取得法が日本特許出願昭５８−２４０６８７
号及び昭５８−２４０６８８号明細書に開示されている
。 上記の遺伝子はこのプラスミドｐ ＵＧ １２から
容易に取得することができる。 また、実際に本遺伝子
を用い発現プラスミドを構築する場合、必要に応じこの
遺伝子を修飾、加工し使用することができる。
が発明されておりこのヌクレオチド配列（１）の遺伝子
の製造法、及びこの遺伝子を含む組み換えプラスミドｐ
ＵＧ１２の取得法が日本特許出願昭５８−２４０６８７
号及び昭５８−２４０６８８号明細書に開示されている
。 上記の遺伝子はこのプラスミドｐ ＵＧ １２から
容易に取得することができる。 また、実際に本遺伝子
を用い発現プラスミドを構築する場合、必要に応じこの
遺伝子を修飾、加工し使用することができる。
このつ、ロガストロン遺伝子を宿主細胞内で発現させる
手段としては複数の手段をとり得るが、宿主細胞で生産
されている分泌蛋白質のシグナル配列との融合蛋白質と
して発現せしめた後、そのシグナル配列を利用して細胞
質外に分泌させる様に構築された分泌型発現ベクターを
用いて発現、分泌させる方法は以下の点において利点を
有している。
手段としては複数の手段をとり得るが、宿主細胞で生産
されている分泌蛋白質のシグナル配列との融合蛋白質と
して発現せしめた後、そのシグナル配列を利用して細胞
質外に分泌させる様に構築された分泌型発現ベクターを
用いて発現、分泌させる方法は以下の点において利点を
有している。
（１） 細胞質外に分泌されるために細胞質内に存在
する蛋白質分解酵素等に依って分解される機会が少なく
なる。
する蛋白質分解酵素等に依って分解される機会が少なく
なる。
（２） 細胞質外に分泌されるため宿主細胞の育成増殖
にとって不利益な物質であっても生産し得る可能性があ
る。
にとって不利益な物質であっても生産し得る可能性があ
る。
（３） 細胞質内に生産物を蓄積させる方法よりも相対
的に単離、精製が容易である。
的に単離、精製が容易である。
しかしながら、所望の構造遺伝子を分泌ベクターに挿入
すれば必ず効率良く分泌されるというわけではない事が
知られてきつつあり、任意の構造ベクターに対して望ま
しい分泌型ベクター（即ちシグナル配列）を予知する事
は困難であって、試行錯誤的に望ましい分泌ベクターを
探索しなければならないという困難さを伴っている。
すれば必ず効率良く分泌されるというわけではない事が
知られてきつつあり、任意の構造ベクターに対して望ま
しい分泌型ベクター（即ちシグナル配列）を予知する事
は困難であって、試行錯誤的に望ましい分泌ベクターを
探索しなければならないという困難さを伴っている。
本発明者らはこの様な状況の中でウロガストロンの微生
物学的生産を目的として種々検討を重ね研究を続けた結
果、ウロガストロンを高いレベルで発現、分泌させるこ
とが可能である本発明を完成するに至った。
物学的生産を目的として種々検討を重ね研究を続けた結
果、ウロガストロンを高いレベルで発現、分泌させるこ
とが可能である本発明を完成するに至った。
本発明のウロガストロン遺伝子によるウロガストロンの
発現及び分泌は宿主細胞によって適宜の方法をとり得る
が、大腸菌に於いては、β−ラクタマーゼのシグナル配
列（例えば、Ｖｉｌｌａ ｅｔ ａｔ。
発現及び分泌は宿主細胞によって適宜の方法をとり得る
が、大腸菌に於いては、β−ラクタマーゼのシグナル配
列（例えば、Ｖｉｌｌａ ｅｔ ａｔ。
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ
７５３７２７ （１９７８）；Ａｍ５ｔｅｒ ｅｔ
ａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
８ ２０５５（１９８０）） 、大腸菌外膜リポプロテ
ィンのシグナル配列〔例えば、Ｍａｓｕｉ ｅｔ ａｌ
、＋’Ｅｘｐｒｅｉｍｅｎｔａ１Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ” ｐ
ｐ１５−３２＋Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９
８３） ） 、大腸菌アルカリフォスファターゼのシグ
ナル配列〔例えば、０ｈｓｕｙｅｅＬ ａｌ、、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ＩＩ
１２８３ （１９８３）〕等を有する公知の種
々の分泌ベクター 〔例えば、山崎ら、化学と生物 旦
６４９−６５８（１９８３））を用いて行うことがで
きる。
７５３７２７ （１９７８）；Ａｍ５ｔｅｒ ｅｔ
ａｌ、、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
８ ２０５５（１９８０）） 、大腸菌外膜リポプロテ
ィンのシグナル配列〔例えば、Ｍａｓｕｉ ｅｔ ａｌ
、＋’Ｅｘｐｒｅｉｍｅｎｔａ１Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ” ｐ
ｐ１５−３２＋Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９
８３） ） 、大腸菌アルカリフォスファターゼのシグ
ナル配列〔例えば、０ｈｓｕｙｅｅＬ ａｌ、、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ＩＩ
１２８３ （１９８３）〕等を有する公知の種
々の分泌ベクター 〔例えば、山崎ら、化学と生物 旦
６４９−６５８（１９８３））を用いて行うことがで
きる。
これらの分泌型ベクターのうち特に好ましい具体例は、
大腸菌アルカリフォスファタゼーのシグナル配列を利用
した分泌型ベクターｐＹＫ３３１及びｐＹＫ３３２であ
る。この分泌型ベクターｐＹＫ３３１及びｐＹＫ３３２
の構築法に関しては本発明者らの一部の者に依って出願
された日本特許出願昭５８−１９８０４３号明細書に詳
細に記載されておりその方法に従い容易に製造すること
ができる。
大腸菌アルカリフォスファタゼーのシグナル配列を利用
した分泌型ベクターｐＹＫ３３１及びｐＹＫ３３２であ
る。この分泌型ベクターｐＹＫ３３１及びｐＹＫ３３２
の構築法に関しては本発明者らの一部の者に依って出願
された日本特許出願昭５８−１９８０４３号明細書に詳
細に記載されておりその方法に従い容易に製造すること
ができる。
本発明のウロガストロン遺伝子のベクターへの組み込み
は分子生物学の分野において公知の通常の方法により容
易に行うことができる。 例えば、ウロガストロン遺伝
子を含む組み換えプラスミドｐＵＧ１２を前述の特許出
願の方法に従い構築しこのプラスミドをＣ１ａ Ｔ及び
５ａｕ３Ａ ［で消化し、ウロガストロン遺伝子を含む
１６８ｂｐのＤＮＡ断片を得、これを８１ヌクレアーゼ
で消化する。
は分子生物学の分野において公知の通常の方法により容
易に行うことができる。 例えば、ウロガストロン遺伝
子を含む組み換えプラスミドｐＵＧ１２を前述の特許出
願の方法に従い構築しこのプラスミドをＣ１ａ Ｔ及び
５ａｕ３Ａ ［で消化し、ウロガストロン遺伝子を含む
１６８ｂｐのＤＮＡ断片を得、これを８１ヌクレアーゼ
で消化する。
他方プラスミドｐＹＫ３３１をｌ１ｉｎｄ ＩＩＩで切
断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とする。
断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とする。
このＤＮＡと上記のウロガストロン遺伝子を含む断片を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応を行って連結させこの反応液を
用いて、例えば、大腸菌（Ｅ、ｃ。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応を行って連結させこの反応液を
用いて、例えば、大腸菌（Ｅ、ｃ。
］ ｉ ） ２９４ （Ｂａｃｋｍａｎ、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＩＳＡ 互
４１７４−４１７８ （１９７８６））に形質転換した
後、ＤＮＡ分析を行ってウロガストロン遺伝子を含む形
質転換体を選びだすことにより構築することができる。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＩＳＡ 互
４１７４−４１７８ （１９７８６））に形質転換した
後、ＤＮＡ分析を行ってウロガストロン遺伝子を含む形
質転換体を選びだすことにより構築することができる。
本発明の方法に於いて、宿主細胞として用いられる最も
代表的な具体例は、大腸菌の場合、Ｅ。
代表的な具体例は、大腸菌の場合、Ｅ。
ｃｏｌｉ ２９４、及び公知の種々の Ｅ、ｃ。
１ｉＫ−１２株誘導体〔例えば、Ｂａｃｈｍａｎｎ＋Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏ１． Ｒｅｖ、 ３６ ５２５−５５
７ （１９７２））等である。 これらのＥ、ｃｏｌｉ
Ｋ−１２株誘導体の多くのものは公認の微生物機関
、例えば、Ａｎｇｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、に寄託さい
る。
ａｃｔｅｒｉｏ１． Ｒｅｖ、 ３６ ５２５−５５
７ （１９７２））等である。 これらのＥ、ｃｏｌｉ
Ｋ−１２株誘導体の多くのものは公認の微生物機関
、例えば、Ａｎｇｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、に寄託さい
る。
本発明のプラスミドによる形質転換操作それ自体は、分
子生物学の分野で公知の通常の方法で行うことができる
〔例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ。
子生物学の分野で公知の通常の方法で行うことができる
〔例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ。
Ｎａ１１．＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ｔｌｓ＾、 ６９
２１１０−２１１４ （１９７２） ；Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣＩｏｎｉ
ｎｇ＋ ２４９−２５３ （１９８２）〕。 このよう
にして得られた形質転換体の培養によるウロガストロン
の生産は、分子生物学及び醗酵学の分野でそれ自体公知
の方法に従い行うことができる。 生産したウロガスト
ロンの回収、積装は生化学及び醗酵学の分野において自
体公知の方法を適宜組み合わせることにより容易に実施
Ｃることができる。
２１１０−２１１４ （１９７２） ；Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣＩｏｎｉ
ｎｇ＋ ２４９−２５３ （１９８２）〕。 このよう
にして得られた形質転換体の培養によるウロガストロン
の生産は、分子生物学及び醗酵学の分野でそれ自体公知
の方法に従い行うことができる。 生産したウロガスト
ロンの回収、積装は生化学及び醗酵学の分野において自
体公知の方法を適宜組み合わせることにより容易に実施
Ｃることができる。
また、ウロガストロンは公知のラジオイムノアッセイ
（Ｈｉｒａｔａ ｅｔ ａｔ、、 Ｊ、Ｃｌ１ｎ、 Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、 Ｍｅｔａｂ、 ４８ ６７３−
６７９ （１９７９）） 、ラジオリセブターアッセイ
（０’Ｋｅｅｆｅ ら、 Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ。
（Ｈｉｒａｔａ ｅｔ ａｔ、、 Ｊ、Ｃｌ１ｎ、 Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、 Ｍｅｔａｂ、 ４８ ６７３−
６７９ （１９７９）） 、ラジオリセブターアッセイ
（０’Ｋｅｅｆｅ ら、 Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ。
１６４ ５１８−５２６ （１９７４））等を用いて
検出、定量することができる。
検出、定量することができる。
本発明について、実施例を挙げ更に詳細に説明する。
しかし、本発明は、これらの実施例のみに限定されるも
のではない。
しかし、本発明は、これらの実施例のみに限定されるも
のではない。
実施例１
＼ン゛・ プラスミドの構築ニ
ブラスミドｐＵＧ１２（特許出願昭５８−２４０６８７
号及び５８−２４０６８８号の方法に従い製造）約６０
ｐｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ！ｐＨ７，４，
１０ｍＭＭｇＳＯ４，１ｍＭ ＤＴＴ、８０単位の制
限酵素 Ｃ１ａ Ｉ及び８０単位の制限酵素 ５ａｕ３
Ａ Ｉを含む１００Ｉｌｌの反応液中で３７℃、１時間
消化した後フェノール抽出を行いＤＮＡをエタノールで
沈澱させた。
号及び５８−２４０６８８号の方法に従い製造）約６０
ｐｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ！ｐＨ７，４，
１０ｍＭＭｇＳＯ４，１ｍＭ ＤＴＴ、８０単位の制
限酵素 Ｃ１ａ Ｉ及び８０単位の制限酵素 ５ａｕ３
Ａ Ｉを含む１００Ｉｌｌの反応液中で３７℃、１時間
消化した後フェノール抽出を行いＤＮＡをエタノールで
沈澱させた。
回収したＤＮＡを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分離し、所望の大きさく１６８ｂｐ）のバンドを含む
ゲルを切出して細片化した後緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＪｐＨ７，５１ｍＭＥＤＴＡ）で抽出した。
で分離し、所望の大きさく１６８ｂｐ）のバンドを含む
ゲルを切出して細片化した後緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＪｐＨ７，５１ｍＭＥＤＴＡ）で抽出した。
抽出液をＤＥＡＥセルロースカラムにかけ、ＩＭＮ ａ
Ｃｌを含有する上記緩衝液で溶出した後ＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させ回収した。
Ｃｌを含有する上記緩衝液で溶出した後ＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させ回収した。
このＤＮＡを６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８，
８，６，７ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ ２−メル
カプトエタノール、６．７ａＭ ＥＤＴＡ、１６．６
ｍＭ （ＮＨａ ）ｚ ＳＯ４，３３０μＭｄ Ｎ Ｔ
Ｐ （ｄ Ａ Ｔ Ｐ 、 ｄ Ｇ Ｔ Ｐ 、 ｄ
ＣＴ Ｐ及びｄ ＴＴ Ｐ）及び５単位のＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼをふくむ３０μｌの反応液中で３７℃、１
時間反応させた後、フェノール抽出、エタノール沈澱を
行ってＤＮＡを回収した。
８，６，７ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ ２−メル
カプトエタノール、６．７ａＭ ＥＤＴＡ、１６．６
ｍＭ （ＮＨａ ）ｚ ＳＯ４，３３０μＭｄ Ｎ Ｔ
Ｐ （ｄ Ａ Ｔ Ｐ 、 ｄ Ｇ Ｔ Ｐ 、 ｄ
ＣＴ Ｐ及びｄ ＴＴ Ｐ）及び５単位のＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼをふくむ３０μｌの反応液中で３７℃、１
時間反応させた後、フェノール抽出、エタノール沈澱を
行ってＤＮＡを回収した。
プラスミドｐｌＮ−１−Ａｌ （例えば、Ｎａｋａｍ
ｕｒａらＥＭＢＯＪ、 １７７１−７７５ （１９８２
） ）約５μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１’
ｐＨ７，４，１００ｍＭ ＮａＣ１，１０ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ４，１ｍＭＤＴＴ 及び１５単位の制限酵素
ＥｃｏＲＩ を含む３０μｌの反応液中で３７℃、１
時間消化しフェノール抽出、エタノール沈澱を行った後
、上記と同様に７４ＤＮＡポリメラ一ゼ反応を行った。
ｕｒａらＥＭＢＯＪ、 １７７１−７７５ （１９８２
） ）約５μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１’
ｐＨ７，４，１００ｍＭ ＮａＣ１，１０ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ４，１ｍＭＤＴＴ 及び１５単位の制限酵素
ＥｃｏＲＩ を含む３０μｌの反応液中で３７℃、１
時間消化しフェノール抽出、エタノール沈澱を行った後
、上記と同様に７４ＤＮＡポリメラ一ゼ反応を行った。
このＤＮＡと先に得た１６８ｂｐのウロガストロン遺伝
子を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７，６）
、１０ｍＭ ＭｇＣｊ？２．１０ｍＭ ＤＴＴ、５
ｍＭ ＡＴＰ及び５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む
３０μβの反応液中で１５℃、１時間インキュベートし
て連結させた。
子を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７，６）
、１０ｍＭ ＭｇＣｊ？２．１０ｍＭ ＤＴＴ、５
ｍＭ ＡＴＰ及び５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む
３０μβの反応液中で１５℃、１時間インキュベートし
て連結させた。
次ぎに、この反応液を用いて大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ２９４
株を形質転換し、アンピシリン抵抗性（５０μｇ ／
ｍ ｌ ）の形質転換体を得た。
株を形質転換し、アンピシリン抵抗性（５０μｇ ／
ｍ ｌ ）の形質転換体を得た。
これらの形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、制
限酵素開裂パターンの分析を行って下記に示す組み換え
プラスミドｐｌＮＵＧを含む形質転換体を選びだした。
限酵素開裂パターンの分析を行って下記に示す組み換え
プラスミドｐｌＮＵＧを含む形質転換体を選びだした。
プラスミドｐｌＮＵＧ ＩＯｐｇを１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌｐＨｌ、４．１００ｍＭ Ｎａ Ｃ７
！、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＤＴＴ、２０
単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ及び２０単位の制限酵素５ａ
ｉｌを含む５０μ２の反応液中で３７℃、１時間消化し
た後１％アガロースゲル電気泳動を行って、ウロガスト
ロン遺伝子を含むＩ ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
ｒｉｓ−ＨＣｌｐＨｌ、４．１００ｍＭ Ｎａ Ｃ７
！、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＤＴＴ、２０
単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ及び２０単位の制限酵素５ａ
ｉｌを含む５０μ２の反応液中で３７℃、１時間消化し
た後１％アガロースゲル電気泳動を行って、ウロガスト
ロン遺伝子を含むＩ ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
このＤＮＡを前記の７４ＤＮＡポリメラ一ゼ反応を行っ
た後フェノール抽出、エタノール沈澱を行って回収した
。
た後フェノール抽出、エタノール沈澱を行って回収した
。
プラスミドｐＹＫ３３１ ５μｇを１０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨｅｌｐＨ７，４，１０ｍＭＭｇＳＯ４，１ｍＭＤＴＴ
及び１０単位の制限酵素器ｎｄＩｌｌを含む４０μβの
反応液中で３７℃、１時間消化上後フェノール抽出、エ
タノール沈澱を行ってＤＮＡを回収した。
ＨｅｌｐＨ７，４，１０ｍＭＭｇＳＯ４，１ｍＭＤＴＴ
及び１０単位の制限酵素器ｎｄＩｌｌを含む４０μβの
反応液中で３７℃、１時間消化上後フェノール抽出、エ
タノール沈澱を行ってＤＮＡを回収した。
このＤＮＡを前記と同様に７４ＤＮＡポリメラ一ゼ反応
を行った後、フェノール抽出、エタノール沈澱を行いＤ
ＮＡを回収した。
を行った後、フェノール抽出、エタノール沈澱を行いＤ
ＮＡを回収した。
このＤＤＮＡｌｏｏｎと前記のウロガストロン遺伝子を
含む約Ｉ Ｋｂｐ断片３００ｎｇを前記のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ反応を行って連結させた。
含む約Ｉ Ｋｂｐ断片３００ｎｇを前記のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ反応を行って連結させた。
次ぎにこの反応液を用いて前記と同様に形質転換、プラ
スミドＤＮＡの解析を行って下記に示される様な組み換
えプラスミドｐＹＫＵｃ；１５を含む形質転換体を選び
出しこの形質転換体をＥ、Ｃｏ ｌ １２９４ （ｐ
ＹＫＵＧ１５）と命名した。
スミドＤＮＡの解析を行って下記に示される様な組み換
えプラスミドｐＹＫＵｃ；１５を含む形質転換体を選び
出しこの形質転換体をＥ、Ｃｏ ｌ １２９４ （ｐ
ＹＫＵＧ１５）と命名した。
以下に本実施例の概略を示す。
ラーゼ
ＥｃｏＲＩ消化 Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
工ｍ１−（（Ｄ ）
実施例２
ンへ プラスミドの構築
プラスミドｐＵＧ１２ Ｌｏμｇを１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨｅｌｐＨ７，４，１０ｍＭＭ ｇ Ｓ Ｏａ、
１００ｍＭ ＮａＣＲ１２０単位の制限酵素Ｃ１ａｌ
及び２０単位の制限酵素５ａｕ３Ａ Ｉを含む５０μｐ
の反応液で３７℃、２時間消化した後５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行ってウロガストロン遺伝子を含
むＩＪ３８ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡを
３０ｍＭ ＣＨｓ Ｃ００ＮａｐＨ４，６，５０ｍＭ
ＮａＣ１，１ｍＭＺｎＳＯ４及び２単位の８１ヌク
レアーゼを含む１００μｐの反応液中で１８℃、２時間
消化した後フェノール抽出、エタノール沈澱を行ってＤ
ＮＡを回収した。プラスミドｐＹＫ３３Ｌを前記と同様
に制限酵素器ｎｄ Ｉｌｌで切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑末端とした。 このＤＮＡ １００ｎｇと
上記のウロガストロン遺伝子を含む１６８ｂｐ断片３０
０ｎｇを前記のＴ４ＤＮＡリガーゼ反応を行って連結さ
せた。 次ぎにこの反応液を用いて前記と同様に大腸菌
Ｅ、ｃｏ１４２９４株を形質転換、プラスミドＤＮＡ
の解析を行って下記に示す様な組み換えプラスミドｐＹ
ＫＵ’Ｇ２０を含む形質転換体を選び出し、この形質転
換体をＥ、ｃｏ Ｉ １２９４ （ｐＹＫＵＧ２０）
と命名した。以下に本実施例の概要を示す。
ｉｓ−ＨｅｌｐＨ７，４，１０ｍＭＭ ｇ Ｓ Ｏａ、
１００ｍＭ ＮａＣＲ１２０単位の制限酵素Ｃ１ａｌ
及び２０単位の制限酵素５ａｕ３Ａ Ｉを含む５０μｐ
の反応液で３７℃、２時間消化した後５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行ってウロガストロン遺伝子を含
むＩＪ３８ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡを
３０ｍＭ ＣＨｓ Ｃ００ＮａｐＨ４，６，５０ｍＭ
ＮａＣ１，１ｍＭＺｎＳＯ４及び２単位の８１ヌク
レアーゼを含む１００μｐの反応液中で１８℃、２時間
消化した後フェノール抽出、エタノール沈澱を行ってＤ
ＮＡを回収した。プラスミドｐＹＫ３３Ｌを前記と同様
に制限酵素器ｎｄ Ｉｌｌで切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑末端とした。 このＤＮＡ １００ｎｇと
上記のウロガストロン遺伝子を含む１６８ｂｐ断片３０
０ｎｇを前記のＴ４ＤＮＡリガーゼ反応を行って連結さ
せた。 次ぎにこの反応液を用いて前記と同様に大腸菌
Ｅ、ｃｏ１４２９４株を形質転換、プラスミドＤＮＡ
の解析を行って下記に示す様な組み換えプラスミドｐＹ
ＫＵ’Ｇ２０を含む形質転換体を選び出し、この形質転
換体をＥ、ｃｏ Ｉ １２９４ （ｐＹＫＵＧ２０）
と命名した。以下に本実施例の概要を示す。
実施例３
分沁刑 ｆプラスミドの構築
上述の特許出願昭５８−２４０６８７及び５８−２４０
６８８号明細書の方法に従いフラグメント”ＡＧＣＴＡ
ＡＣＴＣＴＧ”及びフラグメント”ＴＴＧＡＧＡＣＴＣ
；Ａ”を合成し同特許出願記載の方法で５゛水酸基をリ
ン酸化した。
６８８号明細書の方法に従いフラグメント”ＡＧＣＴＡ
ＡＣＴＣＴＧ”及びフラグメント”ＴＴＧＡＧＡＣＴＣ
；Ａ”を合成し同特許出願記載の方法で５゛水酸基をリ
ン酸化した。
プラスミドｐｕｃｔ２を前記と同様に制限酵素Ｃ１ａ
Ｉ及び５ａｕ３Ａ Ｉで消化しウロガストロン遺伝子を
ふくむ１６８ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。
Ｉ及び５ａｕ３Ａ Ｉで消化しウロガストロン遺伝子を
ふくむ１６８ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。
このＤＮＡを更に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ７
，４、ｌＯＱｍＭ ＮａＣ１１、１０ｍＭＭｇＳＯ４
，１ｍＭ ＤＴＴ 及び５単位の制限酵素器ｎｆ
Ｉを含む２０μｌの反応液で３７℃、１時間インキユヘ
ートした後５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
てウロガストロンの３番目のアミノ酸以後をコードする
遺伝子を含む１５４ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。 こ
のＤＮＡと前記の合成フラグメント″ＡＧＣＴＡＡＣＴ
ＣＴＧ１及びＴＴＧＡＧＡＣＴＧＡ″を前記のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ反応を行って連結させた後５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行って１６５ｂｐのＤＮＡ断片を
回収した。
，４、ｌＯＱｍＭ ＮａＣ１１、１０ｍＭＭｇＳＯ４
，１ｍＭ ＤＴＴ 及び５単位の制限酵素器ｎｆ
Ｉを含む２０μｌの反応液で３７℃、１時間インキユヘ
ートした後５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
てウロガストロンの３番目のアミノ酸以後をコードする
遺伝子を含む１５４ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。 こ
のＤＮＡと前記の合成フラグメント″ＡＧＣＴＡＡＣＴ
ＣＴＧ１及びＴＴＧＡＧＡＣＴＧＡ″を前記のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ反応を行って連結させた後５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行って１６５ｂｐのＤＮＡ断片を
回収した。
プラスミドｐＹＫ３３１ ５．ｃｒｇをｌＯｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ７，６，１０ｍＭＭ ｇ Ｓ Ｏａ
、１００ ｍ Ｍ Ｎ ａ Ｃ（１，１５単位の制限
酵素器ｎｄ ＩＩＩ及び１５単位の制限酵素ＢａｍＨ１
含む５０μｌの反応液で３７℃、１時間消化した後１％
アガロースゲル電気泳動を行って小断片を除去した。
このＤＮＡ １１００ｎと前記のウロガストロン遺伝
子を含む１６５ｂｐのＤＮＡ断片４００ｎｇを前記のＴ
４ＤＮＡリガーゼ反応を行って連結した。 次ぎにこの
反応液を用いて前記と同様にＥ、ｃｏｌｉ２９４を形質
転換、プラスミドＤＮＡの解析を行って下記に示す様な
組み換えプラスミドｐＹＫＵＧ３０を含む形質転換体を
選び出し、これをＥ、ｃｏｌｉ２９４ （ｐＹＫＵＧ
３０）と命名した。
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ７，６，１０ｍＭＭ ｇ Ｓ Ｏａ
、１００ ｍ Ｍ Ｎ ａ Ｃ（１，１５単位の制限
酵素器ｎｄ ＩＩＩ及び１５単位の制限酵素ＢａｍＨ１
含む５０μｌの反応液で３７℃、１時間消化した後１％
アガロースゲル電気泳動を行って小断片を除去した。
このＤＮＡ １１００ｎと前記のウロガストロン遺伝
子を含む１６５ｂｐのＤＮＡ断片４００ｎｇを前記のＴ
４ＤＮＡリガーゼ反応を行って連結した。 次ぎにこの
反応液を用いて前記と同様にＥ、ｃｏｌｉ２９４を形質
転換、プラスミドＤＮＡの解析を行って下記に示す様な
組み換えプラスミドｐＹＫＵＧ３０を含む形質転換体を
選び出し、これをＥ、ｃｏｌｉ２９４ （ｐＹＫＵＧ
３０）と命名した。
ＢａｍＨＩ ）ｆｉｎｄ ＩＩＩウロ
ガストロンのラジオリセプターアソセイ大腸菌で発現さ
れたウロガストロンの検定、定量は公知のラジオリセプ
ターアソセイ法に従って行った。リセプターは下記の方
法で調製した。
ガストロンのラジオリセプターアソセイ大腸菌で発現さ
れたウロガストロンの検定、定量は公知のラジオリセプ
ターアソセイ法に従って行った。リセプターは下記の方
法で調製した。
雄のＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラフト５匹より肝臓
を取り出し、２５０ｍｌの冷却した０、２５Ｍシューク
ロース中でホモジナイズした後６００ｘｇで遠心分離し
た。 その上清を１２．ＯＯＯｘｇ、３０分間、４℃の
遠心分離を行い約２００ｍ１Ｏ上清を得た。 上清に２
Ｍ ＮａＣ１，４ｍＭＭｇＳＯ４を最終濃度がＯ，Ｉ
Ｍ ＮａＣ１！、０．２ｍＭ ＭｇＳＯ４になるよ
うに添加した後４０．ＯＯＯｘｇ、４０分間、４℃の遠
心分離を行った。 得られた沈澱物を１２０ｍｌの０６
０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨｌ、４に縣濁し４Ｑ、
ｏｏｏｘｇ、４０分間、４℃の遠心分離を行い、沈澱物
を再度同じ操作を繰り返した。 得られた沈澱物を２０
ｍＪの０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ７，４に縣
濁し少量づつ分注して一８０℃で保存した。 得られた
レセプター蛋白の蛋白質を牛血清アルブミンを対象にし
てＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓ５ａｙ Ｋｉ
ｔを用いて測定した所、約２００ｍｇであった。
を取り出し、２５０ｍｌの冷却した０、２５Ｍシューク
ロース中でホモジナイズした後６００ｘｇで遠心分離し
た。 その上清を１２．ＯＯＯｘｇ、３０分間、４℃の
遠心分離を行い約２００ｍ１Ｏ上清を得た。 上清に２
Ｍ ＮａＣ１，４ｍＭＭｇＳＯ４を最終濃度がＯ，Ｉ
Ｍ ＮａＣ１！、０．２ｍＭ ＭｇＳＯ４になるよ
うに添加した後４０．ＯＯＯｘｇ、４０分間、４℃の遠
心分離を行った。 得られた沈澱物を１２０ｍｌの０６
０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨｌ、４に縣濁し４Ｑ、
ｏｏｏｘｇ、４０分間、４℃の遠心分離を行い、沈澱物
を再度同じ操作を繰り返した。 得られた沈澱物を２０
ｍＪの０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ７，４に縣
濁し少量づつ分注して一８０℃で保存した。 得られた
レセプター蛋白の蛋白質を牛血清アルブミンを対象にし
てＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓ５ａｙ Ｋｉ
ｔを用いて測定した所、約２００ｍｇであった。
１．５ｍｌのプラスティックチューブに、リセプター蛋
白質を８液０．１ｒｒｌ （約１００μｇの蛍白ｉ）
、Ｉｔｓ Ｉで標識されたマウス上皮細胞成長促進因
子（以下ｍＥＧＦと略称する）Ｏ，１ｍ１（５ｘｌＯ’
ｃｐｍ）及び既知濃度のｍＥＧＦ溶液又は測定用サンプ
ル（０，１％の牛血清アルブミンを含む５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７，４で適当に希釈したもの）０
．１ｍｌを加え混合した後２５℃、１時間インキュベー
トした。
白質を８液０．１ｒｒｌ （約１００μｇの蛍白ｉ）
、Ｉｔｓ Ｉで標識されたマウス上皮細胞成長促進因
子（以下ｍＥＧＦと略称する）Ｏ，１ｍ１（５ｘｌＯ’
ｃｐｍ）及び既知濃度のｍＥＧＦ溶液又は測定用サンプ
ル（０，１％の牛血清アルブミンを含む５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７，４で適当に希釈したもの）０
．１ｍｌを加え混合した後２５℃、１時間インキュベー
トした。
反応終了後１０．ＯＯＯｒｐｍ、１０分間の遠心分離を
行ってレセプター蛋白を沈澱せしめ、１ｍｌの０．１％
牛血清アルブミンを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ！ｐ
Ｈ７，４で洗浄した。 リセプクーに結合した”’
Ｉ −ｍＥＧＦ量をガンマ−カウンターを用いて測定し
、既知濃度のｍＥＧＦを用いて作成した検量線からウロ
ガストロン量（ｍＥＧＦ換算量）を計算した。
行ってレセプター蛋白を沈澱せしめ、１ｍｌの０．１％
牛血清アルブミンを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ！ｐ
Ｈ７，４で洗浄した。 リセプクーに結合した”’
Ｉ −ｍＥＧＦ量をガンマ−カウンターを用いて測定し
、既知濃度のｍＥＧＦを用いて作成した検量線からウロ
ガストロン量（ｍＥＧＦ換算量）を計算した。
ウロガストロンの 現 び局在部位
Ｅ、ｃｏｌｉ２９４ （ｐＹＫ３３１）及びＥ、 ｃ
ｏ１ｉ２９４ （ｐＹＫＵＧ１５）を５ｍｌのし培地（
アンピシリン５０μｇ ／ ｍ Ｒ含有）に接種し、３
７℃で一夜培養した。 培養液２ｍｌを新たな上記培地
２００ｍβに加え、３７℃で２時間培養した後遠心分離
を行って集菌した。
ｏ１ｉ２９４ （ｐＹＫＵＧ１５）を５ｍｌのし培地（
アンピシリン５０μｇ ／ ｍ Ｒ含有）に接種し、３
７℃で一夜培養した。 培養液２ｍｌを新たな上記培地
２００ｍβに加え、３７℃で２時間培養した後遠心分離
を行って集菌した。
次ぎに、この菌体を低リン酸培地（１２にグルコース４
ｇ−ＮａＣ１１，５ｇ、、ＮＨａ Ｃ（１１゜１ｇ、Ｎ
ａｚ ＳＯ４０，３５ｇ、ＭｇＣｌ２ ０．２ｇ、Ｃａ
Ｃ１ｔ ３０ｍｇ、ＦｅＣＪｚ ｏ、５ｍｇ、ＺｎＣ１
！ｚ ０．２７ｍｇ、トリスヒドロキシメチルアミノ
メタン １２ｇを含み塩酸にてｐＨ７，５に８潤製した
ものに５０Ａ１ｇ／ｍＩ！のアンピシリン及び２μｇ
／ ｍ ｌのビタミンＢ１を添加）に縣濁して更に４時
間培養した後集菌した。
ｇ−ＮａＣ１１，５ｇ、、ＮＨａ Ｃ（１１゜１ｇ、Ｎ
ａｚ ＳＯ４０，３５ｇ、ＭｇＣｌ２ ０．２ｇ、Ｃａ
Ｃ１ｔ ３０ｍｇ、ＦｅＣＪｚ ｏ、５ｍｇ、ＺｎＣ１
！ｚ ０．２７ｍｇ、トリスヒドロキシメチルアミノ
メタン １２ｇを含み塩酸にてｐＨ７，５に８潤製した
ものに５０Ａ１ｇ／ｍＩ！のアンピシリン及び２μｇ
／ ｍ ｌのビタミンＢ１を添加）に縣濁して更に４時
間培養した後集菌した。
集菌して得られた菌体の半量を浸透圧ショク処理（Ｈｅ
ｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｆｆｌ、 ２４０ ３６８５−３６９１ （１９６５）
） Ｌ、抽出液を得ペリプラズム画分試料とした。
残りの両分に１００μｌのリゾチーム）８液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ７！ ｐＨ８゜０、ｌｏｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、 ２５％５ｕｃｒｏｓｅ 、 ３ｍｇリゾ
チーム／ｍ！！５を加えで０℃、３０分間インキュベー
トした。 つぎに１００μ！の界面活性剤溶液（５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ７！ｐＨ８，０，１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸｌｏｏ、 ０．４％デ
オキシコール酸ナトリウム）を加え０℃、１０分間イン
キュベートした後、２ｐｌ！のＤＮａｓｅ ！溶液（
１０ｍｇ／ｍ！り及び１０μｌの１ＭＭｇＣ１２を加え
室温で１−２分間インキエベートした。 遠心分離し上
清を回収しく細胞質＋膜）画分試料とした。また、低リ
ン酸培地で４時間培養して得られた菌体の残りの半量は
上記の（細胞質＋膜）画分の調製と同様に処理して全菌
体試料とした。 上記のペリプラズム画分及び（細胞質
＋膜）画分の分画の信頼性を検定するため、各画分試料
中のβ−ガラクトシダーゼ（細胞質酵素）活性及びβ−
ラクタマーゼ（ペリプラズム酵素）活性を下記の方法で
定量した。 即ち、β−ラクタマーゼ活性は本酵素が合
成基質オルソニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを
分解することによっておこる４２０ｎｍの吸収変化を測
定することで（Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅｘｐｒｅｉａ＋ｅｎ
ｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、 ３５２−３５６（１９７２）） 、ま
たβ−ラクタマーゼ活性は本酵素がペニシリンを分解し
て生じるペニシリンクアシフドと沃素澱粉との反応によ
り起こる６ ２０ ｎｍの吸収の経時変化を測定するこ
とで定量（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４３ ６９−８５
（１９７５） ） シ下記の結果を得た（数値はいず
れも任意単位で表示した）。
ｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｆｆｌ、 ２４０ ３６８５−３６９１ （１９６５）
） Ｌ、抽出液を得ペリプラズム画分試料とした。
残りの両分に１００μｌのリゾチーム）８液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ７！ ｐＨ８゜０、ｌｏｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、 ２５％５ｕｃｒｏｓｅ 、 ３ｍｇリゾ
チーム／ｍ！！５を加えで０℃、３０分間インキュベー
トした。 つぎに１００μ！の界面活性剤溶液（５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ７！ｐＨ８，０，１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸｌｏｏ、 ０．４％デ
オキシコール酸ナトリウム）を加え０℃、１０分間イン
キュベートした後、２ｐｌ！のＤＮａｓｅ ！溶液（
１０ｍｇ／ｍ！り及び１０μｌの１ＭＭｇＣ１２を加え
室温で１−２分間インキエベートした。 遠心分離し上
清を回収しく細胞質＋膜）画分試料とした。また、低リ
ン酸培地で４時間培養して得られた菌体の残りの半量は
上記の（細胞質＋膜）画分の調製と同様に処理して全菌
体試料とした。 上記のペリプラズム画分及び（細胞質
＋膜）画分の分画の信頼性を検定するため、各画分試料
中のβ−ガラクトシダーゼ（細胞質酵素）活性及びβ−
ラクタマーゼ（ペリプラズム酵素）活性を下記の方法で
定量した。 即ち、β−ラクタマーゼ活性は本酵素が合
成基質オルソニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを
分解することによっておこる４２０ｎｍの吸収変化を測
定することで（Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅｘｐｒｅｉａ＋ｅｎ
ｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、 ３５２−３５６（１９７２）） 、ま
たβ−ラクタマーゼ活性は本酵素がペニシリンを分解し
て生じるペニシリンクアシフドと沃素澱粉との反応によ
り起こる６ ２０ ｎｍの吸収の経時変化を測定するこ
とで定量（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４３ ６９−８５
（１９７５） ） シ下記の結果を得た（数値はいず
れも任意単位で表示した）。
注）上記表中Ｅ、（ｐＹＫＵＧｌ５）は、Ｅ、 ｃｏ
ｌ ｉ ２９４ （ｐＹＫＵＧｌ ５）を、Ｅ、
（ｐＹＫ３３１）はＥ、ｃａｌ １２９４ （ｐＹＫ３
３１）を表す。
ｌ ｉ ２９４ （ｐＹＫＵＧｌ ５）を、Ｅ、
（ｐＹＫ３３１）はＥ、ｃａｌ １２９４ （ｐＹＫ３
３１）を表す。
この結果、各両分相互の混入は１０％弱でありペリプラ
ズム画分及び（細胞質＋膜）画分としてほぼ全ての蛋白
が回収されたと考えられる。
ズム画分及び（細胞質＋膜）画分としてほぼ全ての蛋白
が回収されたと考えられる。
そこで各両分のウロガストロン量を前述のラジオリセプ
ターアソセイ法で定量し下記の結果を得た（数値はｎ
ｇ ／ ｍ ｌ培養液で表示した）。
ターアソセイ法で定量し下記の結果を得た（数値はｎ
ｇ ／ ｍ ｌ培養液で表示した）。
注）上記表中Ｅ、 （ｐＹＫＵＧ１５）は、Ｅ、
ｃｏ ｌ ｉ ２９４ （＋）ＹＫｔＪＧｌ ５）を、
Ｅ、 （ｐＹＫ３３１）はＥ、ｃｏｌｉ２９４ （ｐ
ＹＫ３３１）を表す。
ｃｏ ｌ ｉ ２９４ （＋）ＹＫｔＪＧｌ ５）を、
Ｅ、 （ｐＹＫ３３１）はＥ、ｃｏｌｉ２９４ （ｐ
ＹＫ３３１）を表す。
以上
Claims (23)
- （１）予定した宿主細胞の細胞質内で発現した遺伝子産
物を細胞質外に分泌させるように構築した分泌型プラス
ミドベクターの挿入部位にウロガストロン遺伝子を挿入
することにより構築した分泌型発現プラスミドにより該
宿主細胞を形質転換し得られた形質転換体を適当な培地
で培養することを特徴とするウロガストロンの製造法 - （２）ウロガストロン遺伝子が下記のヌクレオチド配列
で表わされるウロガストロン構造遺伝子を含む遺伝子で
ある特許請求の範囲第１項記載の製造法 【遺伝子配列があります】 - （３）宿主細胞がエシエリシア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ
）属に属する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である特許請求の
範囲第１項記載の製造法 - （４）分泌型プラスミドベクターが大腸菌のアルカリフ
ォスファターゼ遺伝子（ｐｈｏＡ）のシグナル配列遺伝
子部分を利用した分泌型プラスミドベクターである特許
請求の範囲第２項記載の製造法 - （５）ウロガストロン構造遺伝子の５’端に翻訳開始コ
ドンＡＴＧ及び３’端に翻訳終止コドンＴＡＡ及びＴＧ
Ａを有する遺伝子を含む発現プラスミドを用いる特許請
求の範囲第４項記載の製造法 - （６）ウロガストロン遺伝子がヌクレオチド配列（１）
で表される遺伝子である特許請求の範囲第４項記載の製
造法 - （７）分泌型プラスミドベクターがｐＹＫ３３１である
特許請求の範囲第３項記載の製造法 - （８）分泌型プラスミドベクターがｐＹＫ３３２である
特許請求の範囲第３項記載の製造法 - （９）分泌型発現プラスミドがｐＹＫＵＧ１５である特
許請求の範囲第３項記載の製造法 - （１０）分泌型発現プラスミドがｐＹＫＵＧ２０である
特許請求の範囲第３項記載の製造法 - （１１）分泌型発現プラスミドがｐＹＫＵＧ３０である
特許請求の範囲第３項記載の製造法 - （１２）予定した宿主細胞の細胞質内で発現した遺伝子
産物を細胞質外に分泌させるように構築した分泌型プラ
スミドベクターの挿入部位にウロガストロン遺伝子を挿
入することにより構築した分泌型発現プラスミド - （１３）ウロガストロン遺伝子が下記のヌクレオチド配
列で表わされるウロガストロン構造遺伝子を含む遺伝子
である特許請求の範囲第１２項記載のプラスミド 【遺伝子配列があります】 - （１４）分泌型プラスミドベクターが大腸菌のアルカリ
フォスファターゼ遺伝子（ｐｈｏＡ）のシグナル配列遺
伝子部分を利用した分泌型プラスミドベクターである特
許請求の範囲第１２項記載のプラスミド - （１５）ウロガストロン構造遺伝子の５’端に翻訳開始
コドンＡＴＧ及び３’端に翻訳終止コドンＴＡＡ及びＴ
ＧＡを有する遺伝子を含む特許請求の範囲第１３項記載
のプラスミド - （１６）ウロガストロン遺伝子の両端に制限酵素認識部
位を有するウロガストロン遺伝子を含む特許請求の範囲
第１５項記載のプラスミド - （１７）ウロガストロン遺伝子がヌクレオチド配列（１
）で表されるウロガストロン遺伝子である特許請求の範
囲第１２項記載のプラスミド - （１８）分泌型プラスミドベクターがｐＹＫ３３１であ
る特許請求の範囲第１２項記載のプラスミド - （１９）分泌型プラスミドベクターがｐＹＫ３３２であ
る特許請求の範囲第１２項記載のプラスミド - （２０）分泌型発現プラスミドｐＹＫＵＧ１５である特
許請求の範囲第１２項記載のプラスミド - （２１）分泌型発現プラスミドｐＹＫＵＧ２０である特
許請求の範囲第１２項記載のプラスミド - （２２）分泌型発現プラスミドｐＹＫＵＧ３０である特
許請求の範囲第１２項記載のプラスミド - （２３）大腸菌のアルカリフォスファターゼ遺伝子（ｐ
ｈｏＡ）のシグナル配列遺伝子部分を利用した分泌型プ
ラスミドベクターに下記のヌクレオチド配列で表わされ
るウロガストロン構造遺伝子を含む遺伝子を挿入し構築
した分泌型発現プラスミドにより大腸菌を形質転換する
ことにより製造した形質転換体 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17178284A JPS61185197A (ja) | 1984-08-17 | 1984-08-17 | ウロガストロンの微生物学的製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17178284A JPS61185197A (ja) | 1984-08-17 | 1984-08-17 | ウロガストロンの微生物学的製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61185197A true JPS61185197A (ja) | 1986-08-18 |
Family
ID=15929580
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17178284A Pending JPS61185197A (ja) | 1984-08-17 | 1984-08-17 | ウロガストロンの微生物学的製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61185197A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4743679A (en) * | 1986-02-24 | 1988-05-10 | Creative Biomolecules, Inc. | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof |
| JPS63219381A (ja) * | 1987-03-09 | 1988-09-13 | Oji Paper Co Ltd | 蛋白の発現と分泌に関与する領域を含むｄｎａ及び前記ｄｎａ配列を有する発現・分泌ベクター |
| JPS63237789A (ja) * | 1987-03-24 | 1988-10-04 | Otsuka Pharmaceut Factory Inc | プロアポリポタンパク質遺伝子、対応プラスミド組換体及び対応形質転換体 |
-
1984
- 1984-08-17 JP JP17178284A patent/JPS61185197A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4743679A (en) * | 1986-02-24 | 1988-05-10 | Creative Biomolecules, Inc. | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof |
| JPS63219381A (ja) * | 1987-03-09 | 1988-09-13 | Oji Paper Co Ltd | 蛋白の発現と分泌に関与する領域を含むｄｎａ及び前記ｄｎａ配列を有する発現・分泌ベクター |
| JPS63237789A (ja) * | 1987-03-24 | 1988-10-04 | Otsuka Pharmaceut Factory Inc | プロアポリポタンパク質遺伝子、対応プラスミド組換体及び対応形質転換体 |
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