JPS63237789A - プロアポリポタンパク質遺伝子、対応プラスミド組換体及び対応形質転換体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １泉よ府貝里盆１ 本発明は化学合成したプロアポリポタンパク貿遺伝子、
より詳しくは、ヒトプロアポＡ−■をコードする遺伝子
、該遺伝子を挿入した対応プラスミド組換体（プロアポ
リポタンパク質発現ベクター）及び該組換体で形質転換
された形質転換体に関している。

も−来の技術とその間　点 アポリポタンパク質とは、血漿リポタンパク質より脂質
部分を除いたタンパク質部分で市って、リポタンパク質
の構造と機能を支配する重要な構成タンパク質である。

該アポリポタンパク質は脂質を結合して可溶性を保ち、
また脂質の運搬に役立つものであり、これには例えばＡ
−Ｉ、Ａ−Ｉｔ、Ｂ、Ｃ−■、Ｃ−■、Ｃ−■、Ｄ、Ｅ
等が知られている。之等のうちで特にヒトアポＡ−ｎは
、ヒトの肝臓、小腸等で合成され、これは下式（Ａ）に
示す一次構造のアミノ酸配列（Ｎ末端がピロリドンカル
ボン酸で、Ｃ末端がグルタミンでおるアミノ酸残塁数７
７ｔ［１ｉｌ、分子量約８７００＞を有するポリペプチ
ド鎖が、その６位のシスティンでジスルフィド結合した
二量体の構造でおることが知られている。

ＰＣＡ−△ｌａ−１ｙｓ−（３１ｕ　−ｐｒｏ−Ｃｙｓ
−Ｖａｌ−（３１ｕ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−３ｅｒ
−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ　
−ｌ−ｈｒ−Ａ３ｐ−丁ｙｒ−（３１ｙ−１ｙ３−、Ａ
、３ｐ−ｊｕｇ−４，４＠ｔ−Ｊ３ｊ１４−Ｌｙｓ−Ｖ
ａｌ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ｃｕ−Ｇｌｎ
−Δ！ａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−ＩＪｓ−３ｃｒ−ｒｙｒ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−ＬＶＳ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｃｕ−１！ｅ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
−Ｖａｔ−△５ｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　ｒｙ
ｒ　　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ−１ｃｕ−Ｑｌｙ−
丁ｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｃ
ＯＯＨ（△）また、ヒトプロアポＡ−ｎは、上記ヒトア
ポ△−ＩＩの７７個のアミノ酸配列のＮ末端に更に５個
のアミノ酸の付加された下式（Ｂ）に示す一次溝造を有
するポリペプチドであることが、ヒト遺伝子の塩基配列
の解析より明らかにされている（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａ
ｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　１２　（９）３９
１７−３９３２　（１９８４））。

Ａ！ａ（ｅＬ！−Ｖａｌ−Ａｒ’Ｊ−Ａｒｇ−Ｇ！ｎ−
Ａ！ａ−ＩＪｓ−Ｇ！ＬＪ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−■ａ！−
Ｇ＋Ｌｌ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｔ　−Ｔｈｒ’
−ＡＳＤ−ＴＶｒ−Ｇｌ’／−ＬＶＳ−ＡＳｐ−ＬｅＵ
−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−１’／Ｓ−３ｅｒ
−ＰｒＯ−ＧＩＩＪ−ＬｅｌＪ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇ＋
ＬＩ−△１ａ−ＬＶＳ　Ｓｅｒ　Ｔｙ「−Ｐｈｅ−Ｇｌ
ｕ−ＬＶＳ−３ｅｒ−ＬＶＳ−Ｇｌｕ−（３＋ｎ−Ｌｅ
Ｌｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｉ　Ｉｅ−ＬＶＳ−Ｌ
ｙｓ−Ａ　１ａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖ
ａｔ　−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−ｃｅｕ−８ｅｒ−ｒｙｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−ｊｅｕ−Ｇｒｙ−ｒｈｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−ＣＯＯＨ（Ｂ）
上記式（Ｂ）に示すポリペプチド鎖を有するプロアポＡ
−ＩＩは、細胞内プロセッシングを受けて、アポＡ−ｎ
に変換されるものと考えられ、該アポＡ−ＩＩは、血漿
中高比重りボタンバク質（ＨＤＬ）の主要構成タンパク
の一つで、アポＡ−Ｉと共にＨＤＬ中に存在することが
知られているが、その特有の生理的機能の詳細はいまだ
解明されていない。しかして、該アポＡ−ｎについては
、高脂血症患者における血中濃度の増加傾向や、肝疾患
（例えば急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝ガン等）患者
における有意な血中濃度低下が認められる旨の報告（臨
床病理ＸＸＩＸ：２，１３５〜１３８（１９８１））が
あり、またインスリン作用促進活性を有し、インスリン
作用増強剤、ひいては抗糖尿病剤として有用でおるとの
報告〔特開昭６１−５３２２２号公報〕もあり、之等の
病態等に対して何らかの生理的機能を果していると認め
られる。プロアポＡ−ＩＩについても、そのもの１１本
で、或いは生体内でのプロセッシングを受けてアポＡ−
■となって、上記と同等の機能を果すものと考えられる
。従って、之等は上記各種病態の研究、その治療法の確
立等、基礎研究分野、医療分野等の各種分野で非常に意
義がある。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、上記現状に鑑み、鋭意研究を重ねた結果
、上記ヒトプロアポＡ−ｎをコードする遺伝子を新たに
設計し、化学合成することに成功すると共に、かくして
得られる遺伝子を適当なプラスミドベクターに組込んで
遺伝子組換体（発現ベクター）を構築し、これを利用し
て微生物を形質転換し、該形質転換体を培養して目的と
するプロアポＡ−ＩＩの発現を確認するに成功し、ここ
に本発明を完成するに至った。

本発明によれば、下記式（１）で表わされる塩基配列を
含有することを特徴とするプロアポリポタンパク質遺伝
子が提供される。

ＧＡＣ；　　ＩＡＧ　　ＩＩｃ；　　ｆｉｌ　　Ｕ（ｊ
！ｊ　　ＵＵＡ　　ｌｕ（ｊ更に本発明は、上記式（１
）で表わされるプロアポリポタンパク質遺伝子を、プラ
スミドベクターに挿入したプラスミド組換体、該組換体
で形質転換させた形質転換体、及び之等の製造技術をも
提供するものである。

本明細書において、塩基配列、アミノ酸配列、之等を構
成する各核酸塩基、アミノ酸乃至その残基等の表示は、
ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定乃至当該分野において慣用さ
れる略号によるものとする。

以下、本発明遺伝子の設計、合成、該遺伝子を含む発現
ベクターの構築、該ベクターの導入による形質転換体の
製造、該形質転換体の培養につき順次説明する。

本発明遺伝子の塩基配列の設計に当たっては、以下の基
準を採用した。

（１）宿主細胞として用いる、例えば大腸菌での使用頻
度の高いトリヌクレオチドコドンを選択する。

（２）遺伝子内及びその両端に特定の１１１限酵素認識
部位を持たせ、任意にその部位を操作して、他の遺伝子
との連結、プラスミドベクターへの挿入を行ない得るよ
うにする。

（３）化学合成した遺伝子断片を集合、連結させる場合
、目的とする連結状態とは異なる遺伝子の連結が起こら
ないか、または最小限に留め得るようにする。

上記基準より設計された本発明遺伝子構成部分の好まし
い塩基配列の一興体例は、前記式（１）に示す通りであ
り、これはヒトプロアポＡ−ＩＩのアミノ酸配列に対応
するもの、即ち該アミノ酸配列をコードするものでおる
。しかして本発明遺伝子は、ヒトプロアポＡ−ｎのアミ
ノ酸配列をコードし、遺伝子組換え技術により該ヒトプ
ロアポＡ−■を発現、製造できる限り、上記式（１）の
塩基配列に限定されるものではなり１．これを基礎とし
てその塩基配列の若干の変更、削除、付加等の改変乃至
修飾が可能でおる。かかる改変、修飾等の行なわれた塩
基配列もまた、これが上記式（１）の塩基配列と同一の
プロアポＡ−ＩＩ遺伝情報を有する限り、本発明遺伝子
に包含される。

上記塩基配列の改変乃至修飾は、当業界で知られている
。その具体例は、上記（１）の塩基配列によりコードさ
れるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺
伝暗号（ＱｅｎｅｔｉＣｃｏｄｏｎ　）の採用にある。

また、上記塩基配列の修飾（付加）には、これにより得
られる塩基配列を実際に適当なベクターに挿入し、微生
物で発現させるために必要なプロモーター等の各種調節
因子との連結を行なうための各種制限酵素認識部位の付
与が包含される。即ち、本発明遺伝子は、これを利用し
て遺伝子工学的手法により目的のビトプロアボＡ−ＩＩ
発現ベクターを構築するに当たって、プロアポへ−■遺
伝子に更に、プロモーター、シャイン・ダルガノ配列（
３ｈｉｎｅ　−Ｄ　ａｌｑａｒｎｏ配列、ＳＤ配列）、
タンパク合成の開始コドン、終止コドン等の各種調節因
子を適宜連結させる必要があるが、之等各塩基配列の切
断、結合等の操作はいずれも制限酵素の利用により行な
われるため、上記遺伝子には、その前後に適当な制限酵
素認識部位の付与が必須となる。

かかる適当な制限酵素認識部位の付与された遺伝子もま
た、本発明遺伝子に包含される。その−具体例としては
、下記式（２）で表わされるものを例示できる。これは
、前記式（１）で表わされる塩基配列の前後に、その発
現に必要なプロモーター等の各種調節因子との連結のた
めの特定の制限酵素認識部位を付加したものであり、引
続く当該遺伝子発現ベクターの構築に特に好適である。

下記式（２）には、該塩基配列中の制限酵素認識部位及
び該塩基配列でコードされるアミノ酸配列をも併記する
。

尚、本発明遺伝子中に存在させるべき制限酵素認識部位
は、上記式（２）に示すものに限定ざｈることなく、構
築すべきプロアポＡ−ＩＩ発現ベクターの種類に応じて
、従来より公知の各種のものを適宜選択することができ
る。

上記式（１）及び式（２）で表わされる特定の塩基配列
を有する遺伝子を代表として、本発明の遺伝子は、之等
の塩基配列に従って、各核酸を順次反応させることによ
り合成できる。この反応は通常の方法、例えば同相リン
酸トリエステル法（Ｎａｔｕｒｅ　、　３１０．　１０
５　（１９８４）　）等により行ない得る。また、得ら
れる各塩基配列の単離精製は、例えば高速液体クロマト
グラフィー等の常法に従うことができ、精製された各塩
基配列の確認は、例えばホモクロマトグラフィーによる
二次元展開法（Ｅ、　Ｊａｙ、　Ｒ，Ａ、　Ｂａｍｂａ
ｒａ、　Ｒ。

ｐａｄｍａｎｂｈａｎ　ａｎｄ　Ｒ，Ｗｕ　、　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅＳ１，１，３３１　（１９
７４））やマキサム−ギルバート法ＣＡ、　Ｍ、　Ｍａ
ｘａｍ　ａｎｄ　　Ｗ、　Ｇ１１ｂｅｒｔ。

１）ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、３ｃｉ、、ＵＳＡ、
　７４．５６０（１９７７）　：　Ａ、　Ｍ、　Ｍａｘ
ａｍ　ａｎｄＷ、　Ｇ１１ｂｅｒｔ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ、、Ｖｏｌ、
　６５　、　ｐｐ４９９　。

Ａｃａｄ、　Ｐｒｅｓｓ　（１９８０）　）等により、
それぞれ行なうことができる。

本発明遺伝子の合成は、特に好ましくは前記式（１）又
は式（２）に示される塩基配列の中間に位置するｐｓｔ
工制限酵素認識部位で、該塩基配列を前半部（サブユニ
ットＡ）と後半部（サブユニットＢ）の２つに分け、之
等を別々に構築することにより実施される。この方法に
つき、以下に詳述する。

この方法においては、まずサブユニットＡを合成するた
めに、塩基数１６〜１９個のオリゴヌクレオチド断片Ａ
−１〜△−１５を合成する。またサブユニツｌ−Ｂの合
成のために、ＩＩ数１４〜１９個のオリゴヌクレオチド
断片Ｂ−１〜Ｂ−１５を合成する。之等各オリゴヌクレ
オチド断片の塩基数及び塩基配列は下記第１表に示す通
りである。

第１表 次いで、上記各オリゴヌクレオチド断片の各５個ずつを
下記式（３）〜（８）に示す通りに集合、連結させて、
ブロック１〜ブロツク６をそれぞれ合成する。

得られるブロック１〜ブロツク３を集合、連結させるこ
とにより、所望のザブユニツｌ−Ａが収得される。同様
にブロック４〜ブロツク６の集合、連結により所望のサ
ブユニットＢが収）ｑされる。

かくして得られるサブユニットＡ及びサブユニットＢの
各塩基配列は、次式（９）及び（１０）にそれぞれ示す
通りである。

ザブユニットＡは、その両末端にＥＣ０ＲＩ、ＰＳｔ工
制限酵素認識部位をそれぞれ有してあり、またサブユニ
ットＢは、その両末端にＰＳｔＩ、Ｍｌｕ工制限酵素認
識部位をそれぞれ有している。

ＧＣＧ　　ＣＴＧ　　ＧＴＴ　　ＡＧＡ　　ＣＧＴ　　
ＣＡＡ　　ＧＣＧＣＧＣＧＡＣＣＡＡ　　ＴＣＴ　　Ｇ
ＣＡ　　ＧＴＴ　　ＣＧＣＡＡＡ　　ＧＡＡ　　ＣＣＧ
　　ＴＧＣＧＴＡ　　ＧＡＡ　　ＡＧＣＴＴＴ　　ＣＴ
Ｔ　　ＧＧＣＡＣＧ　　ＣＡＴ　　ＣＴＴ　　ＴＣＧＴ
ＴＡ　　ＧＴＧ　　ＡＧＣＣＡＧ　　ＴＡＣＴＴＣＣＡ
ＧＡＡＴ　　ＣＡＣＴＣＧ　　ＧＴＣＡＴＧ　　ＡＡＧ
　　ＧＴＣＡＣＴ　　ＧＴＴ　　ＡＣＴ　　ＧＡＴ　　
ＴＡＣＧＧＴ　　ＡＡＡＴＧＡ　　ＣＡＡ　　ＴＧＡ　
　ＣＴＡ　　ＡＴＧ　　ＣＣＡ　　ＴＴＴＧＡＣＣＴＧ
　　ＡＴＧ’　ＣＡＡ　ＡＡＡ　　ＧＴＴ　　ＡＡＡＣ
ＴＧ　　ＧＡＣＴＡＣＣＴＴ　　ＴＴＴ　　ＣＡＡ　　
ＴＴＴＴＣＴ　　ＣＣＧ　　ＧＡＧ　　ＣＴＧ　　ＣＡ
　　３’ＡＧＡ　　ＧＧＣＣＴＣＧ　　　　　　５’　
　　　（９）ＧＣＴ　　ＡＡＡ　　ＴＣＧ　　ＴＡＣＴ
ＴＣＧＡＡ　　ＡＡＧＣＧＡ　　ＴＴＴ　　ＡＧＯＡＴ
Ｇ　　ＡＡＧ　　ＣＴＴ　　ＴＴＣＴＣＣＡＡＡ　　Ｇ
ＡＡ　　ＣＡＡ　　ＣＴＧ　　ＡＣＡ　　ＣＣＧＡＧＧ
　　ＴＴＴ　　ＣＴＴ　　ＧＴＴ　　ＧＡＣＴＧＴ　　
ＧＧＣＣＴＧ　　ＡＴＣＡＡＧ　　ＡＡＡ　　ＧＣＣＧ
ＧＴ　　ＡＣＣＧＡＣＴＡＧ　　ＴＴＣＴＴＴ　　ＣＧ
Ｇ　　ＣＣＡ　　ＴＧＧＧＡＧ　　ＣＴＧ　　ＧＴＴ　
　ＡＡＣＴＴＣＣＴＧ　　ＴＣＣＣＴＣＧＡＣＣＡＡ　
　ＴＴＧ　　ＡＡＧ　　ＧＡＣＡＧＧＴＡＣＴＴＣＧＴ
Ｇ　、ＧＡＡ　　ＴＴＡ　　ＧＧＣＡＣ丁ＡＴＧ　　Ａ
ＡＧ　　ＣＡＣＣＴＴ　　ＡＡＴ　　ＣＣＧ　　ＴＧＡ
ＣＡＡ　　ＣＣＴ　　ＧＣＧ　　ＡＣＡ　　ＣＡＧ　　
ＴＡＡ　　ＴＧＡＧＴＴ　　ＧＧＡ　　ＣＧＣＴＧＴ　
　ＧＴＣＡＴＴ　　ＡＣ丁３′ ＧＣＧ　　Ｃ５’　　　　　　　　　　　　　　　（１
０）かくして構築されたサブユニットＡは、これを例え
ばプラスミドベクターＤＢＲ３２２のＥ　Ｃ０ＲＩ−Ｐ
ＳｔＩ制限酵素切断サイトに容易に組込むことができる
。このサブユニットＡを組込んで構築したプラスミド組
換体の具体例としては、後記実施例に示すプラスミドｐ
ＡＰＯ１を例示できる。

また、サブユニットＢは、例えばプラスミドｐＢＲ３２
２のＥＣ０ＲＩ切断部位に予めＭ１ｕ■リンカ−（化学
合成オリゴヌクレオチド：ＧＴＣＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡ
Ｃ）を挿入したベクターｐＢＲ３２２のＰＳｔＩ−ＭＩ
ＩＪＩ制限酵素切断サイトに、上記サブユニットＡと同
様にして容易に組込むことができる。かくして得られる
組換体の具体例としては、後記実施例に示すプラスミド
ｐＡＰＯ２を例示できる。

上記各プラスミドは、各々カルシウム法（Ｅ。

Ｌ　ｅｄｅｒｂｅｒｇ、　Ｓ、　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１１９．１０７２　（１９７４
））等の通常の方法に従い、之等を大腸菌に形質転換さ
せることができ、この方法によりそれぞれ保存、増幅さ
せることができる。

本発明のプロアポＡ−ＩＩ遺伝子を保有するベクターは
、上記プラスミドｐＡＰＯ１及びｐＡＰ。

２より、それらの各々保有する各サブユニットを切出し
て、連結させ、この連結物をプラスミドベクターｐＢＲ
３２２等の適当なベクターに組込むことにより得られる
。その具体例は後記実施例に示す通りであり、以下、か
くして得られるプラスミド組換体を、ｐＡＰＯＡ−ＩＩ
という。このプラスミドｐＡＰＯＡ−ＩＩもまた上記１
）Ａ　ＰＯ１及びｐＡＰＯ２と同様にこれを例えば大腸
菌等の適当な宿主細胞に形質転換させることができ、該
微生物内で安定に保存、増幅させ得る。

上記のごとくして１ｑられる各プラスミドベクターが、
宿主細胞中に存在することの確認は、通常の方法、例え
ばアルカリ−３ＤＳ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、）（、
Ｃ，ａｎｄ　［）ｏｌｙ、Ｊ、　ＮｕｃｌｃｉｃＡｃｉ
ｄｓ　　Ｒｅｓ、、７．１５１３　（１９７９））等に
従って、プラスミドＤＮＡを分取後、種々の制限酵素で
処理し、２等制限酵素の認識部位の存在の有無乃至は生
成りＮＡ断片の長さの検討を行なうことにより判断でき
る。

上記本発明遺伝子を保有するベクターは、これを導入し
て得られる形質転換体が、目的とするプロアポＡ−１１
を発現するためには、本発明遺伝子と共に、その発現の
ための各種調節因子、例えばプロモーター、ＳＤ配列、
翻訳停止シグナル、転写終結信号等を保有する必要があ
る。之等を保イ１するベクターにあける本発明遺伝子の
発現様式及びそのために用いられる各種調節因子は、特
に限定はなく、例えば大腸菌を宿主細胞として利用する
場合、その菌体内に直接発現させる系、ペリプラズム層
に分泌発現させる系等を任意に採用できる。

上記各発現系の構築等の際に用いられる遺伝子工学的手
法は、いずれも常法に従うことができ、各種制限酵素に
よるＤＮＡの切断処理、Ｓ１ヌクレアーゼ、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ等を用いたＤＮＡの連結処理、アガロースゲル
電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等によ
るＤＮＡの単離、精製、フェノール抽出法によるＤＮＡ
の回収、精製等を包含する。また得られる各発現系の確
認も常法に従い、例えば遺伝子の塩基配列を直接マキサ
ム−ギルバート法で解析するか、ミニプレバレージョン
やマツピング法により遺伝子の挿入やその方向を確認す
る方法（Ｈ，Ｃ，３ｉｒｎｂｏｉｍ　ｅｔａｌ、、　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、
　７゜１５１３−１５２３　（１９７９））等によるこ
とができる。之等各操作の具体例は、後記実施例に詳述
する。

上記直接発現系の構築につき、詳述すればこれは本発明
遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ配列を導入するこ
とにより得られる。ここでプロモーターとしては特に限
定はないが、目的遺伝子の弁用性の高いものを選択する
のが好ましく、その例としては、例えばＩａｃＵＶ５ヤ
、ｔａｃプロモーターを例示できる。ＳＤ配列としては
、上記プロモーターと共存する大腸菌由来のものをその
まま用いることができるが、これに限定されるものでは
なく、別途に化学合成されたものを用いることもできる
。上記プロモーター及びＳＤ配列は、本発明遺伝子と同
一方向に並べて用いることができ、その具体例としては
、後記実施例に示す本発明発現ベクターｐＡＰ−Ｄを例
示できる。

この本発明の直接発現系ベクターは、プラスミドベクタ
ー１）ＤＲ５４０（Ｒｕｓｓｅｌ、Ｄ、　Ｒ，ａｎｄ３
ｅｎｎｅｔｔ、　Ｇ、　Ｎ、、Ｇｅｎｅ　、　２旦、２
３１（’１９８２））由来のｔａｃプロモーター及びＳ
Ｄ配列の後に、ベクターｐＡＰＯＡ−ＩＩ由来の本発明
のプロアポＡ−ＩＩ！仏子を連結されたものであり、ｐ
ＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子を保有すると共に
、上記本発明遺伝子をｐＢＲ３２２のテトラサイクリン
領域に挿入されている。従って、該発現ベクターを利用
して常法に従い大腸菌を形質転換させて得られ形質転換
体は、テトラサイクリン領域性、アンピシリン耐性を指
標として容易に選別できる。また該形質転換体はこれを
例えばＬ−ｂｒｏｔｈの液体振盪培養により培養し、培
地にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（Ｉ　Ｐ
ＴＧ＞を添加すれば、ｔａｃプＯモーターを制御してい
るリプレッサータンパクが解除されてｔａｃプロモータ
ーが鮎き、かくして目的とするプロアポＡ−ＩＩが菌体
内に発現される。

次に、大腸菌ペリプラズム層への分泌発現系につき詳）
ホする。この発現系は、例えば大腸菌β−ラクタマーゼ
のシグナルペプチドを利用して構築されるものであり、
この系では、目的タンパク質はシグナルペプチドとの融
合タンパクとして大腸菌内で発現され、該シグナルペプ
チドの作用により内膜まで移行され、該内膜内で融合タ
ンパクよりシグナルペプチドがシグナルペプチダーゼに
より酵素的に切断され、かくして目的タンパクのみが大
腸菌ペリプラズム層に選択的に蓄積される。

従って、この系の利用によれば、大腸菌菌体内における
プロテアーゼによる目的タンパク質の分解の危険性を回
避できる利点があると共に、目的タンパク質はべりプラ
ズム層に局在するため、その分離、精製が容易となる利
点がおり、更に内膜に移行した融合タンパクはシグナル
ペプチドの直後、即ち目的タンパクの直前でシグナルペ
プチダーゼにより選択的に切断され、結果として他のい
かなる不要アミノ酸配列をも含まない目的タンパクのみ
がペリプラズム層に分泌、蓄積される利点もある。

上記本発明発現ベクターで形質転換される宿主細胞とし
ては、例えば大腸菌等のダラム陰性菌、枯草菌等のダラ
ム陽性菌、放線菌等の原核生物細胞及び酵母等の真核生
物細胞を例示できる。之等の内では特に大腸菌が好適で
おる。その具体例としては、例えば大腸菌に１２株由来
のＨ８１０１株（Ｈ，Ｗ、　Ｂｏｙｅｒ　ａｎｄ　Ｄ、
　Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ、、Ｊ、　Ｍｏｌ
。Ｂｉｏｌ、、　４ユ、４５９−４７２　（１９６９）
）及びＪＭ１０３株（Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇｅｔａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１
ｄｓ　　ｌ？：ｅｓ、、９゜３０９（１９８１））等を
例示できる。

上記により得られる本発明発現ベクターで形質転換され
た宿主細胞・の培養は、通常の細胞培養用培地を用いて
行なうことができる。上記培地としテハ、例えばＬ−ｂ
ｒｏｔｈ培地のほか、Ｅ培地、Ｍ９培地、Ｍ６３培地等
の各種のものを利用できる。

之等の培地には、更に通常知られている各種の栄養を添
加することもできる。培養条件としては、微生物の生育
に適したＩＩ、温度、通気、撹拌条件等を適宜選択して
採用できる。例えば大腸菌の場合には、ＤＨ約５〜８の
範囲、特に約７が適当であり、約２０〜４３°Ｃの温度
で、通気撹拌培養すればよい。この培養により、上記し
た通り直接発現系では目的タンパク質は細胞内に生産、
蓄積され、分泌発現系ではべりプラズム層に生産、蓄積
される。

かくして生産された目的タンパク質は、これを常法に従
い分離、精製できる。この分離、精製操作としては、例
えばゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等が単
独で又は適宜組合せて採用できる。

また精製された目的タンパク質の確認は、高速液体クロ
マトグラフィーによる単一ピークの出現、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法による単一バンドの出現等により
行ない得る。更に目的タンパク質の同定は、通常のタン
パク質乃至ポリペプチドの構造解析手段と同様にして、
例えば５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の分析、アミノ酸
分析器によるアミノ酸組成の測定、アミノ酸シークエン
サーによるアミノ酸配列の解析等により行なうことがで
きる。

実　　施　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる
。尚、各側において用いられる各方法及び操作は、特に
明記しない限り、以下の通り行なわれたものである。

１、制限酵素によるＤＮＡの切断操作 使用した制限酵素はすべて宝酒造社製のものでめっ、反
応溶液としては、同社が指定する組成のものを用いた。

反応温度は３７°Ｃとし、温浴中で３時間静置して反応
させた。制限酵素の標準的使用量は、ＤＮＡ１μＱに対
して１ユニツトであり、最終反応液量は１００ｉ以上と
なるようにした。

また反応容器としては滅菌流みの１．５ｍ（２容エツペ
ンドルフチユーブを用いた。

２、フェノール抽出法 酵素反応の終了後、酵素を失活させ反応を停止させるた
めにこのフェノール抽出法を行なった。

即ち、反応液に、その液量の半量となるＴＥ緩衝液飽和
フェノール［１ｍＭ　　ＥＤ丁Ａを含む１０ｍＭ＋−リ
ス塩酸（ｐＨ８，０＞緩衝液をフェノールに飽和させた
もの］を加えて充分ｊ辰盪撹拌し、次いで遠心分離（１
２０００回転／分、５分間）してＤＮＡの含まれる水層
を採取し、更に同量のエーテルを加え、同様に振盪撹拌
後、遠心分離して水層を採取した。この操作を２〜３回
繰返した。

採取された水層に０．１倍容量の３Ｍ酢酸ツートリウム
緩衝液（ｐＨ４，８）と２．５倍容屡の冷エタノールを
加え、（辰盪撹拌し、−８０’Ｃで３０分以上放置後、
遠心力＃（１２０００回転２／分、５分間）することに
よりＤＮＡを沈澱させて回収した。

３、ＤＮＡのプラントエンド化方法 （１）Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる方法６７ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ８，８）、６．７ｍＭ塩化マグネシウム、
１０ｍＭ　　２−メルカプトエタノール、１６．６ｍＭ
ｌ１２アンモニウム、６．７μＭ　　ＥＤ丁Ａ及び各１
ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含
む水溶液中にＤＮＡを溶かし、ＤＮＡ１μｑに対して１
ユニツトとなる量のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社
′ｊＡ）を加え、３７°Ｃで１時間反応させた。最終反
応液量は１００μＱとした。反応終了後、前記フェノー
ル抽出法にてＤＮＡを回収した。

（２）３１ヌクレアーゼによる方法 ３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，６＞　、５０ｍＭ塩
化ナトリウム及び１ｍｌｍｌ鉛亜鉛む水溶液にＤＮＡを
溶かし、ＤＮＡ１μｑに対して３ユニツ１−となる吊の
８１ヌクレアーゼ（ＢＲＬ社製）を加えて、３７°Ｃで
１０分間反応させた。最終反応液量は１００μＱとした
。次いで０．５ＭＥＤ丁Ａ２μＱ及び１Ｍトリス塩酸（
ｐＨ８，０＞１μＱを加えて反応を終了させ、その後、
前記フェノール抽出法にてＤＮＡを回収した。

４、、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ断片の結合操作 ６７ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，６）　、６．７ｍＭＪｎ
化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１ｒ
ＴＩＭ　　ＡＴＰを含む水溶液にＤＮＡを溶かし、ＤＮ
Ａ１μｑに対して１ユニットどなる量のＴ４ＤＮ△リカ
ーゼ（宝酒造社製）を加え、１２°Ｃで５時間以上又は
４°Ｃで一晩以上反応さぜることによりＤＮＡを結合さ
せた。最終反応液量は１００μＱとした。反応終了後、
前記フェノール抽出法にてＤＮＡを回収した。

５、形質転換法 宿主細胞として、大腸菌１−Ｉ　Ｂ　１０１株又はＪＭ
１０３株を用いた。

宿主細胞株を、Ｌ　□−ｂｒｏｔｈ培地（１％バクトド
リプトン、０．５％バクトイ−ストエキストラクト、０
．５％塩化ナトリウム）中で、３７°Ｃ下に、６１０止
の吸光度が０．２５になるまで振盪培養して増殖させた
。この培養液１０ｍＱを遠心分離（７０００回転／分、
５分間）して菌体を回収し、氷冷した。これを０．１Ｍ
塩化マグネシウム５ｍＧに懸濁させて洗浄し、続いて遠
心分離（７０００回転／分、１分間）により菌体を回収
し、水冷した０、１Ｍ塩化カルシウム及びｏ、ｏ５Ｍ塩
化マグネシウム混合溶液５ｎ＋Ｑに懸濁させた。これを
水中で３０分以上放置した後、遠心力＠＜７０００回転
７分、１分間〉して菌体を回収し、再度同溶液０．５ｍ
Ｑに懸濁させた。この懸濁液０．２ｍＱにＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合させたＤＮＡの反応組成液を加え、
３０分間水冷した。次いで４２．５°Ｃの温浴で３０秒
間加温し、Ｌ　−ｂｒｏｔｈ培地１．Ｏｍ（１！を加え
、これを３７℃の温浴中で１時間静置した。

かくして、得られる形質転換株を以下の抗生物質耐性を
指標として選択した。即ち、１．５％寒天を含むＬ−ｂ
ｒｏｔｈ培地にアンピシリン５０μｑ／戒又はテトラサ
イクリン２０μｇ／鵬を添加して調製した平板培地に、
上記で得た反応組成液の溶液各０．２ｍＱずつを拡げ、
これを３７°Ｃで一晩静置培養し、生育するコロニーを
分離した。

６、プラスミドの単離、精製 プラスミドを保有する菌株を、アンピシリン５０μＱ／
ｍＱ又はテトラサイクリン２０μｑ／ｍ１２を添加した
Ｌ−ｂｒｏｔｈ培地４００　ｍＱ中で、３７°Ｃで１２
〜１６時間振盪培養した。これを遠心分離（６０００回
転／分、１０分間）して菌体を集め、これに溶液Ｉ［５
０ｍＭグルコース、１０ｍＭＥＤＴＡ、２５ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ８，０＞及び２ｍｇ／ｍＱリゾチーム、滅菌
後便用コの１４ｍＱを加えて懸濁させ、水中に３０分間
放置した。更にこれに溶液ＩＩ　［０，２Ｎ水酸化ナト
リウム及び１％ソジウムドデシル硫Ｍ］の２８ｍＱを加
えて撹拌し、水中で５分間放置した後、溶液Ｉｎ［３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８＞、滅菌後便用］の２１ｍ
Ｑを加えて、水中で６０分以上放置した。遠心分離（８
０，００回回転力、１０分間）して、上清を集め、２．
５倍容量（１５０ｍＱ＞の冷エタノールを加え、−８０
’Ｃで３０分間放置し、更に遠心分離（８０００回転／
分、１０分間）して沈渣を）ｑだ。これに溶液ＩＶ’［
０，１Ｍ酢酸ナトリウム及び０．０５−Ｍトリス塩酸（
ｐＨ８，０）］の１１ｍｆ２を加えて溶解させ、更に２
．５倍容！（２７，５ｍＱ＞の冷エタノールを加え、−
８０’Ｃで３０分間放置した。もう一度遠心分離（１２
０００回転／分、１５分間））シて沈渣を集めた。

次に、得られた沈渣に丁Ｅ緩衝液［１０ｍＭトリス塩１
（ｐＨ７，５＞及び１ｍＭ　　ＥＤＴＡ（７）溶液コを
４ｍＧ加えて溶解させ、これに塩化セシウム４．６２Ｃ
］を加えて撹拌溶解させ、更にエチジウムブロマイド５
ｍｃ＋／ｍ１２溶液を０．４２１１１Ｇ加えた。

得られた溶液を遠心分離（３０００回転／分、１０分）
して浮遊物を除き、溶液を超遠心分離（５００００回転
／分、１５時間）した。

上記超遠心分離終了後、紫外線照射により螢光を発する
プラスミドＤＮＡ部分を採取した。これを５Ｍ塩化ナト
リウム溶液で飽和したイソプロパツールで５〜６回抽出
し、これからエチジウムブロマイドを除去した。最後に
バイオグルＡ−５０（Ｂｉｏｏｅｌ　Ａ−５０）カラム
クロマトグラフィー［２，５Ｃｍ直径×１５〜２０Ｃｍ
カラムサイズ、溶出溶媒＝ＴＥ緩衝液＋０．５Ｍ塩化ナ
トリウム溶液、Ｕ　Ｖ　２５４　ｎｍにより検出］によ
り塩化セシウム及び混入しているＲＮＡ等を除去し、前
記フェノール抽出法によりプラスミドＤＮＡを回収した
。

得られた精製プラスミドＤＮＡ量は、ＯＤ２６００ｍ測
定による０Ｄ２６ｏ＝０．０２２を’ｌμＱ、／ＩＴＩ
ＱＤＮＡ量と換算して、算出した。

７、オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドの合成は、同相リン酸トリエステル
法により行なった（）ｌ、　　Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｅｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
１０．１７５５−１７６９　（１９８２））。

即ち、まず１％架橋ポリスチレン樹脂Ｓ−Ｘ　１（２０
０〜４００メツシユ、バイオラボラトリーズ社製）をア
ミノメチル化したものと、５′−〇−ジメトキシトリチ
ルヌクレオンドのモノコハク酸エステルとを反応させて
、ヌクレオシド担持樹脂を得た。次に、バーチエム社製
ＤＮＡ合成装置を用いて以下の操作を行なった。

上記樹脂２５ｍｑを同装置の反応管に入れ、２％トリク
ロロ酢酸−ジクロロメタン溶液を加えて、５′位のジメ
［・キシトリチル基を脱離させた。この操作は溶液に橙
色の着色が消えるまで数回繰返した。更にピリジンで２
回、アセトニトリルで２回それぞれ洗）ｐ後、窒素ガス
を通して樹脂を乾燥させた。次に完全に保護されたジヌ
クレオチド又はモノヌクレオチド（Ｃ，Ｂｒｏｋａ　　
ｅｔ　　ａｌ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
８．５４６１−５４．７１（１９８０）の方法により調
製した〕のトリエチルアンモニウム塩２０ｍｑを加え、
縮合剤（メシチレンスルホニル−５−ニトロトリアシー
・ルのピリジン溶液）を用いて、４５°Ｃで２５分間反
応させて縮合させた。反応終了後、反応液を除き、ピリ
ジンで洗浄し、キャツピング剤（ジメチルアミノピリジ
ンのテトラヒドロフラン−ピリジン溶液〉と無水酢酸と
を加え、至温で５分間反応させ、未反応の水酸基をマス
クさせた。最後に、樹脂をピリジンとアセ１−二トリル
とで洗浄し、同相合成法の１サイクルを終了させた。

以上の操作を繰返して、順次鎖長をのばして、目的の保
護基を有するオリゴヌクレオチドを担持した樹脂を得た
。

得られた樹脂に、切断剤［テトラメチルグアニジウム−
２−ピリジンアルドキシメートのピリジン：水（９０：
１０）溶液］をｈ口え４０℃で１５時間放置した。次に
脱脂綿を充填したパスツールピペットを用いて沿過し、
切離された樹脂を除去した後、炉液を減圧下で濃縮した
。この残渣に２８％アンモニア水２．５ｍＱを加え、ガ
ラス管（内径８ｍｍｘ　１０ｃｍ＞に移し、封管後、５
０〜６０℃の温浴中に４時間放置して反応させた。反応
終了後、アンモニアを除去し、Ｏ，Ｏ’１Ｍトリエチル
アンモニウムー二炭酸二本酸塩水溶液２鵬て溶解し、エ
ーテルで洗浄した。ここまでの操作により、目的のオリ
ゴヌクレオチドは、樹脂から切断され、５′末端水酸基
の保護基（ジメトキシトリメチル基）以外のすべての保
護基が除去された状態となった。

次に、副反応生成物、遊離した保護基、脱保護剤等を、
目的とするオリゴヌクレオチドから効率よく除くために
、逆相Ｃ１８シリカゲル（ウォーターズ社製）を充填し
たカラム（バイオラット社製、エコツカラム、内径１ｃ
ｍｘ　３０Ｃｍ）を用いて、粗精製を以下の通り行なっ
た。

このカラムクロマトグラフィーは、５％アセトニトリル
の０．　１Ｍｆｆ１”ＩＩトリエチルアンモニウム水溶
液から３０％アセトニトリルの同水溶液の勾配溶出溶媒
系を用いて、２５４　ｎｍでの吸光度測定により検出し
、目的とするフラクションを単離した。かくして集めた
フラクションを、減圧下に濃縮し、残漬を高速液体クロ
マトグラフィー（ポンプ；ウォーターズ社製モデル６０
００△型及び同社製モデルＭ−４５型、グラジエンター
二同社製モデル６６０型ソルベントプログラマ−１検出
器７同社製４４０型ディテクター）で単一ピークとなる
まで分取、精製した。ここで用いたカラムは逆相ＣＩＢ
ＹＭＣＰａＣｋ　０ＤＳ−△−３１２（山村化学研究所
社製、０．６ｃｍ直径Ｘ１５ｃｍ＞であり、溶出溶媒と
しては５％→４０％アセトニトリル１０．１Ｍ酢酸トリ
エチルアンモニウム水溶液（ｐｆ−１７，５＞を用いて
勾配溶出させた。

かくして精製されたオリゴヌクレオチドは、その５′末
端がまだジメトキシトリチル基で保護されているので、
これを８０％酢酸水溶液で２０分間反応処理し、脱ジメ
トキシトリチル基化後、再度高速液体クロマトグラフィ
ーにより単一ピークになるまで分取、精製した。このク
ロマトグラフィーは前記と同一の０ＤＳ−Ａ−３１２カ
ラムを用い、５％→１５％アセトニトリル１０．１Ｍ酢
酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７，２）で勾配
溶出により実施した。

かくして目的の化学合成オリゴヌクレオチド精製物を得
た。尚、オリゴヌクレオチドの同相合成法における縮合
反応の収率は、各サイクルで脱離させたジメトキシｉ−
リチルアルコールの量から換算できる。即ち６０％過塩
素酸−エタノールの溶液中での５００ｎｍにおける吸光
度を測定することによりその収率を求め得る。

８、オリゴヌクレオチド塩基配列の分析、確認化学合成
したオリゴヌクレオチドの塩基配列の分析は、ホモクロ
マトグラフィーを用いた二次元展開法及びマキサム−ギ
ルバート法により、以下のようにまずオリゴヌクレオチ
ドの５′末端側に３２ｐの導入を行なって実施した。

ｉ）５′末端３２ｐの標識化 オリゴヌクレオチド５μＱ（凍結乾燥品）を、蒸留水１
００μＱに溶解し、この溶液１４μＱに２５０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ７，６）　、５０ｍＭ塩化マグネシウム、
１０ｍＭスペルミン、５０ｍＭジチオスレイトール、５
００ｍＭ塩化カリウムの混合液１２μＱを、次いでγ−
３２Ｐ−ＡＴＰ水溶液（アマジャム社製、１０μＣｉ／
μＱ）１μＱ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒
造社製〉の各１μＱをそれぞれ加え、更に蒸留水を加え
て全量を６０μＱとした。これを３７℃で１時間反応さ
せ、５′末端を３２Ｐで標識化した。１００’Ｃ温浴中
に２分間浸漬して反応を停止させた１多、全量が５μＱ
程度になるまで濃縮し、次いで２０Ｘ２０Ｃｍに切った
ＤＥＡＥ−セルロースプレート（マチエレーナーゲル社
製、ｒＰｏｌｙｇｒａｍ　ｊ　ＣＥＬ３００ＤＥＡＥ／
ＨＲ−２／１５）にスポットし、ホモミックスチャ−タ
イプ■［シグマ社製イーストＲＮＡタイプＶ１１０Ｃ１
を５Ｍ水酸化カリウム水溶液８ｍ１２及び水４２ｍＧと
共に３７℃で２４時間振りまぜて分解させた後、１Ｎ塩
酸で中和し、尿素を７Ｍとなるように加えて溶解させた
後、全量を５００ｍ２とする。使用時は濾過して用いる
］を用いて７０〜８０℃で展開させた。上記展開は、キ
シレンシアツール、オレンジＧ及び酸性ツクシンの各１
％混合水溶液をマーカーとしてスポットし、キシレンシ
アツールの青色マーカーが約１０ｃｍ程度上がるまで行
なった。乾燥後、プレートをポリ塩化ビニリデンフィル
ムで包み、オートラジオグラムをとった。感光時間は室
温で約３０分とした。Ｘ線フィルムを現像し、３２Ｐ−
標識されたオリゴヌクレオチドのスポットの位置をトレ
ーシングペーパーに移しとり、これをもとにして更にＤ
ＥＡＥ−セルロースプレート上に印をつけた。印をつけ
た位置のＤＥＡＥ−セルロース部分をかき取り、エタノ
ール洗浄後、１Ｍトリエチルアンモニウム・二次酸塩水
溶液で溶出させた。濃縮乾固後、カウントを測定し、２
０００ｃｐｍ／μＱとなるように蒸留水を添加して溶解
させた。

・ｉ）二次元ホモクロマトグラフィー・フィンガープリ
ント法 上記１）で得られた５′末端３２Ｐ標識オリゴヌクレオ
チド溶液を７μＱづつ、０．４ｍＱ容エツペンドルフチ
ューブ各３本に各々採取し、之等に各々２５０ｍＭ　ト
リス塩酸（ＤＨ８，０）及び５０ｍＭ塩化マグネシウム
の水溶液２μＱを加え、更に蛇毒フォスフオシエステラ
ーゼ（べ−リンガーマンハイム山之内社製、１．５Ｕ／
ｍ（１／ｌ１ｔＧ）をそれぞれ０．１１１Ｑ／ＩＩＱ、
０．２μＱ／μＱ又は０．５μｇ／μＱ加え、３７℃で
３０分間反応させた。反応の停止は、５ｍＭＥＤＴＡを
２μＱ加えた後、１００℃温浴中に２分間浸漬すること
により行なった。

上記反応液の一部（３μＱ）を取って、ＤＥＡＥ−セル
ロースプレートにスポットし、ホモミックスチャ−タイ
プＶｌ　［シグマ社製イ−スｌ〜ＲＮ　ＡタイプＶ１１
０ｇを５　Ｍ水酸化カリウム水溶液１０ｍＱ及び水４０
ｍＱと共に３７°Ｃで４８時間振りまぜて分解させた後
、１Ｎ塩酸で中和し、尿素を７Ｍとなるように加えて溶
解させた後、金星を５００　ｒｒ＋Ｑとする。使用時は
濾過して用いる〕を用いて７０〜８０’Ｃで展開させた
。展開後、オートラジオグラムをとり、オリゴヌクレオ
チドの部分分解の状態を調べた。部分分解が６１ｆ認さ
れた反応液２μＱを、７Ｍ尿素水溶液９５ｍＱに酢酸５
　ｍＱとピリジン０．５ｍＱとを加えたもので湿らせた
酢酸セルロース膜（力−ルツァイン社製、２．５ｘ３６
ｃｍ）の一端中央部にスポットした。これを酢酸−ビリ
ジン水溶液中で電気泳動させ、オレンジＧの色素マーカ
ーが１５ｃｍ泳動じたところで停止させた。ドライヤー
で酢酸セルロース膜を乾燥させ、ＤＦＡＥ−セルロース
膜Ｌ／　−１〜（２０Ｘ　２０Ｃｍ）の一端から１．５
ｃｍの位置に酢酸セルロース膜の下端を合わせて重ねた
。更にトからは蒸留水で湿らせたワットマン３Ｍペーパ
ー（２，５Ｘ２０Ｃｍ）５〜６枚を載せ、ガラス板と約
２ｋｇの重しを載せて約３０分間放置してオリゴヌクレ
オチド部分分解物をＤＥＡＥ−セルロースプレート上に
移行させた。酢酸セルロース膜、ワットマン３Ｍペーパ
ー及び重しを除去し、ＤＥＡＥ−セルロースプレートを
ＦＪ　ｌ水で約１０ｃｍ展開させた後、ホモミックスヂ
ャータイプＶｌを入れた展開槽に移し、７０〜８０’Ｃ
で約２時間展開させた。展開後、オートラジオグラムを
とり、Ｘ線フィルムを現像し、現われるスポットの泳動
パターンより解析を行なった。

１ｉｉ）　　マキサム−ギルバート法 この方法は、上記ｊ）で得られた５′末端３２Ｐ標識オ
リゴヌクレオチドを用いて、各塩基をこれに特異的な修
飾反応、切断反応を利用して、化学的に分解させ、ポリ
アクリルアミドゲル電気法Ｎを利用して、分解物をその
切ｙｆＩ断片の鎖長差にＪ：って分Ｈｔシ、オートラジ
オグラムをとり、その泳動パターンより塩基配列を読取
る方法である（Ａ、　Ｍ、　Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　　Ｗ
、　Ｑｉｌｂｅｒｔ。

ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａ口、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、、ＵｓＡ
、７４゜５６０（１９７７））。

上記方法のための分析用キットは市販されてあり、本方
法でもニューイングランドヌクレアー社′３Ａ（Ｎｅｗ
　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｎｕｃｌｅａｒ）のマキサム−
ギルパー１〜分析キラｌ〜を用いた。

化学分解は、同キッ１−のマニュアルを参考にして実施
した。電気泳動は２０Ｘ６０Ｃｍの２０％ポリアクリル
アミドゲル（７ＭＩｉ索含有）を用いて行なった。泳動
後は、ゲルをポリ塩化ビニリデンフィルムで包み、オー
１〜ラジオグラムをとった（　−８０’Ｃ１−晩感光〉
。

９、アガロースゲル電気泳動 アガロースゲル濃度は、０．９％又は１．６％とした。

アガロースエ（同位化学研究所製）を上記各濃度となる
ように秤量し、丁ＢＥ緩衝液［０，０８９Ｍトリスホウ
義、０．００２ＭＥＤ丁Ａを含むコを加えて、加熱溶解
させてゲルを作成した。泳動は、ミニゲル電気泳動シス
テム　ミューピッド２（丸首石油社製）を用い、ＴＢＥ
緩衝液を泳動用緩衝液として用いて行なった。泳動後、
０．５μＣ１／ｍ（２エチジウムブロマイド溶液にゲル
を浸漬し、紫外線照射により蛍光を発するＤＮＡ断片を
確認した。ゲルからのＤＮＡの溶出は、目的のバンド部
分のゲルをナイフ等で切りとり、透析チューブ（３５０
０Ｍｗカット）にいれ、ＴＥ緩衝液を満たし、同ミニゲ
ル電気泳動装置で３０分間泳動させることにより行なっ
た。上記で溶出されたＤＮＡを濃縮乾固後、これに少量
の蒸留水を加え、前記フェノール抽出法に従って回収し
た。

実施例１　　ｐＡＰＯＡ−ＩＩの構築 ■　オリゴヌクレオチドの合成 ヒｌ〜プロアポＡ−ＩＩの構造遺伝子を含む前記式（２
）に示す全塩基配列の構築に際し、まず同塩基配列を１
４〜１９鎖長のオリゴヌクレオチド断片３０個（Ａ−１
〜Ａ−１５及びＢ−１〜Ｂ−１５＞に分け、各々の断片
を同相リン酸トリエステル法にて合成した。

各断片、その塩基鎖長、塩基配列は、前記第１表に示す
通りである。

合成された各断片は、二次元ホモクロマトグラフィー・
フィンガープリント法及びマキサム−ギルバート法にて
、その塩基配列の解析を行なって確認した。

■　合成オリゴヌクレオチドの連結 式（２）に示す全塩基配列の構築を、サブユニッ１〜Ａ
（オリゴヌクレオチドＡ−１〜Ａ−１５）とサブユニッ
トＢ（オリゴヌクレオチドＢ−１〜Ｂ−１５＞に分けて
、別々に実施した。

サブユニットＡは、全塩基配列の前半部、ＥＣ０ＲＩ制
限酵素認識部位よりｐｓｊＩ制限酵素認識部位までから
桶成される。また、サブユニットＢは、全塩基配列の後
半部、ＰＳｔＩ制限酵素認識部位からＭｌｕ■制限酵制
限酵素部２識ら溝底される。之等の塩基配列は前記式（
９）及び式（１０）に示す通りである。

上記各サブユニットの構築に当たっては、前述したよう
に、サブユニットＡは、これを前記式（３）〜（５）に
示したブロック１〜ブロツク３に分け、またサブユニッ
トＢは、これを前記式（６）〜（８）に示したブロック
４〜ブロツク６に分け、それぞれ別々に構築した。

上記各ブロック（ブロック１〜ブロツク６）の構築は、
以下のようにして実施した。その概略は第１図に示す通
りである。図において括弧を付して示した数値は塩基鎖
長を示し、各ブロックを示す実線の末端の黒丸印（ドツ
ト）は、５′末端フオスフエート基を示す。

即ち、まずオリゴヌクレオチド断片の５′末端に３２ｐ
を標識し、これを３２Ｐ−ＤＮＡ溶液とした。但し、オ
リゴヌクレオチドＡ−１、Ａ−９、Ｂ−１及びＢ−８は
、上記操作を行なわなかった。各ブロック毎（例えばブ
ロック１の場合、オリゴヌクレオチドＡ−１、Ａ−２、
八−３、Ａ−１４及びＡ−１５＞に、各々の３２Ｐ−Ｄ
ＮＡ溶液１μＱをとり、１００ｍＭ　　ＡＴＰ１μＱと
、リガーピ反応緩衝液［６６０ｍＭトリス塩Ｍ　（ｐＨ
７．６＞　、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭジ
チオスレイトール溶液］６μＱを加え、更に水を加えて
、最終反応液量を６０μＱとし、１００℃の温浴中で２
分間加熱処理後、自然冷却した。

次に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）２、５ユニツ
トを添加して、４°Ｃ下に一晩反応させた。フェノール
抽出後、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行な
い、オートラジオグラムをとり、目的の大きざのブロッ
クでめる二本鎖ＤＮＡ部分をかき取り、ＤＮＡを溶出さ
せた。電気泳動条件は、２０Ｘ６０Ｃｍ、０、３５ｍｍ
厚さ、１２００〜１５００ｖとし、泳動液としてＴＢＥ
緩衝液を用いた。

以上の操作により、各ブロック１〜６を構築した。

次に、１ｑられた各ブロック間の組立てを以下の通り実
施した。即ち、上記で溶出させたブロック１〜６のそれ
ぞれを液体シンチレーションカウンターにてカウント測
定後、５０００Ｃｆ）ｍ／μＱとなるように水で希釈し
、各２μＱ（サブユニットＡはブロック１〜３、サブユ
ニットＢはブロック４〜６）をとり、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ及びＡＴＰを加えて連結反応を行なった。

１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて、目的の
大きざのサブユニットを分離し、かき取り、）Ｒ出させ
ることにより、所望のサブユニッｌ−Ａ及びＢの構築を
完了した。

■　ｐＡＰＯｌ及びｐＡＰＯ２の作製 上記■で構築されたサブユニットＡをプラスミドベクタ
ーｐＢＲ３２２に組込んだベクターをｐＡＰＯｌとし、
同サブユニットＢを同ｐＢＲ３２２に組込んだベクター
をＩ）ＡＰＯ２とした。

まずｐＡＰＯｌの構築につき詳述する。

ｐＢＲ３２２を制限酵素ＰｓｔＩ及びＥＣ０ＲＩで、処
理した後、０．９％アガロースゲル電気泳動を行なって
、約３．６０ｋｂｐのＤＮＡ断片＜Ａ＞を得た。このＤ
ＮＡ断片＜Ａ＞と、サブユニットＡ、Ｔ４ＤＮＡリカー
ゼ、ＡＴＰ及びすが−ゼ反応用緩衝液とを混ぜ、３７°
Ｃで１時間反応させて、ＤＮＡを連結させた。この反応
組成液で大腸菌Ｈ８１０１株の形質転換を行ない、得ら
れる形質転換株をＬ−ｂｒｏｔｈ培地にテトラサイクリ
ン２０９ｇ／ｍＱを添加した平板培地に拡げ、生育して
くるコロニーを選択した。更にこのうちの１株を４００
　ｍＱ　１−ｂｒｏｔｔ）培地にテトラサイクリン２０
μΩ／ｍＱを添加した液体培地にて娠盪培養後、プラス
ミドＤＮＡを単離、精製し、制限酵素ＨｐａＩＩ、ｐｓ
ｔ■とＥＣ０ＲＩの二種酵素反応系で処理し、その切断
様式をポリアクリルアミドゲル電気泳動法により解析し
た。

またマキサム−ギルバート法にて直接塩基配列を解析し
た。かくして、得られた形質転換株がｐＡＰＯｌ、即ち
目的のサブユニツ１〜Ａを含有し、設計した塩基配列を
有するもので必ることを確認した。

次に、ｐＡＰＯ２の構築につき詳）ホする。

ナブユニットＢをプラスミドベクターｐＢＲ３２２に導
入するに際し、構築したサブユニットＢのＣ末端側は、
ＭＩｕＩ制限酵素認識部位となっているが、ｐＢＲ３２
２は該Ｍｌｕ工制限酵素認識部位を有しないため、該サ
ブユニットＢを直接ｐＢＲ３２２に組込むことはできな
い。

従って、まずｐＢＲ３２２にＭＩＩＪニリンカーを挿入
したベクターｐＢＲ３２２−Ｍｔｕを以下の通り作製し
た。即ち、ｐＢＲ３２２（１０μΩＤＮ△）にＥＣ０Ｒ
Ｉの５ユニットを加え、３７°Ｃで２時間反応させ、フ
ェノール抽出法にてＤＮＡを回収し、更に蒸留水で溶解
させた後、Ｓ１ヌクレアーゼと共に反応させて、ｐＢＲ
３２２のＥＣＯＲ工制限酵素認識部位がプラントエンド
化状態になったＤＮＡ断片を得た。

次に、化学合成したＭＩＬＩＩリンカ−［５′ＧＴＣＧ
ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣ３’　］の５′末端にフォスフェ
ート基を導入して得たオリゴヌクレオチドを混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて、連結反応させた。

反応後、この反応組成液で大腸菌Ｈ８１０１株を形質転
換させ、得られたテトラサイクリン耐性コロニーを選択
し、そのうちの１株よりプラスミドＤＮＡｐＢＲ３２２
−Ｍｌｕを単離、精製した。

制限酵素ＥＣＯＲ工、ＭＩＬＩＩ、３ａｌＩ、ｌ−１ｉ
ｎｆ■等で処理し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
にてその切断パターンを解析し、得られたベクターがｐ
ＢＲ３２２のＥＣＯＲ工制限酵素認識部位に化学合成Ｍ
ｌｕＩリンカ−を挿入された目的のものでおることを確
認した。

次に、このベクターｐＢＲ３２２−Ｍｌｕを制限酵素ｐ
ｓｔ工及びＭｌｕＩで処理し、０．９％アガロースゲル
電気泳動にて、約３．６ｋｂｒ）のＤＮＡ断片＜８＞を
単離、精製した。その後、この断片とサブユニットＢ、
Ｔ４ＤＮＡリガーぜを混ぜ、３７°Ｃで１時間反応させ
て連結した。

これを大腸菌Ｈ８１０１株に形質転換して、目的のＤＡ
ＰＯ２を保有する菌株をｊｑだ。

上記で得られたｐＡＰＯ２は、ｐＡＰＯＩと同様にマキ
サム−ギルバート法にてその塩基配列を解析した結果、
サブユニットＢの存在が確認され、また目的の塩基配列
を有していることが確認された。

■　ｐＡＰＯＡ−ＩＩの構築 上記■で得たｐＡＰＯｌを、制限酵素ＰＳｔＩ及びＥＣ
０ＲＩで処理し、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法にて、約０．１３ｋｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ＞を単離、
精製した。

同様にして１）ＡＰＯ２を、制限酵素ＰＳｔＩ及び５ａ
ｌＩで処理し、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
にて、約０．１４ｋｂｐのＤＮＡ断片＜Ｄ＞を単離、精
験した。

一方、ｐＢＲ３２２を制限酵素ＥＣ０ＲＩ及び５ａｌＩ
で処理し、０．９％アガロースゲル電気泳動法にて約３
．７１ｋｂｐのＤＮＡ断片＜Ｅ＞を単離、精製した。

上記で得た３種のＤＮＡ断片＜Ｃ＞、＜Ｄ＞及び＜Ｅ＞
をＴ４ＤＮＡリガーぜを用いて連結反応させた。反応物
で大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換させ、アンピシリン耐
性コロニーを選択し、そのうちの１株よりプラスミドＤ
ＮＡを単離、精製した。

かくして、ヒトプロアポＡ−Ｉ遺伝子をコードする塩基
配列を有する化学合成遺伝子が、ｐＢＲ３２２のＥＣ０
ＲＩ及び３ａｌ■制限酵素認識部位間に挿入されたプラ
スミドベクターｐＡＰＯＡ−ＩＩを得た。

１ｑられたベクターｐＡＰＯＡ−ＩＩにつき、種々の制
限酵素（例えばＨｌ）ａＩ［、ＡａｔＩＩ、ｌ−１ａｅ
［等）による切断パターン、切断部位等を、５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により解析した結果、これ
が全塩基数的３．９７ｋｂｐのヒトプロアポＡ−Ｉ［構
造遺伝子を有する目的のプラスミドｐＡＰＯＡ−ｎであ
ることを確認した。

上記■及び■に示したｐＡＰＯｌ、ｐＡＰＯ２及び１）
ＡＰＯＡ−ＩＩの構築の操作の概略を、第２図に示す。

図においてＡｐｒはアンピシリン耐性を、ＴＣｒはテト
ラサイクリン耐性を、それぞれ示し、以降の各図におい
ても同様とする。

上記プラスミドベクターｐＡＰＯＡ−ＩＩを保有する大
腸菌Ｈ８１０１株は、通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所（微工研）に「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ、ＨＢ　−１０１、ｐＡｐ。

Ａ−ＩＩ−ＮＯ，３Ｊなる表示で寄託番号「微工研菌奇
第９１６５号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９１６５）Ｊとして寄
託されている。

実施例２　　直接発現系ベクターの構築■　ｔａｃプロ
モーターを用いた発現系の構築実施例１の■で得たｐＡ
ＰＯＡ−ＩＩ　（１１μｃｌＤＮＡ＞を、制限酵素ＥＣ
０ＲＩ及びＡｖａ■で処理し、約２．９４ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片＜Ｇ＞を、０．９％アガロースゲル電気泳動法に
より分離、採取した。

また、ｐＡＰＯＡ−Ｉｆ　（１１μｇＤＮＡ＞を、制限
酵素ＥＣ０ＲＩ処理した後、Ｓ１ヌクレアーゼ処理して
、プラントエンド化し、更に制限酵素Ａｖａ■処理して
、約１．０４ｋｂｐのＤＮＡ断片＜Ｆ＞を同様にして分
離、採取した。

更にｔａｃプロモータ一部分を含有するプラスミドｐＤ
Ｒ５４０（Ｒｕｓｓｅｌ、Ｄ、　Ｒ，ａｎｄ３ｅｎｎｅ
ｔｔ、　Ｇ、　Ｎ、、Ｇｅｎｅ　、　２０．２３１（１
９８２））を、制限酵素ＢａｍＨＩｆｆｉ理した後、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ処理してプラントエンド化し、更
に制限酵素ＥＣ０ＲＩ処理して、約０．３９ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片＜Ｈ＞を１．６％アガロースゲル電気泳動法に
て分離、採取した。

２等３種のＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結反応させた俊、反応物で大腸菌ＪＭ１０３株を形質転
換させた。得られる形質転換株からアンピシリン耐性株
を選択し、そのうらの１株からプラスミドＤ　Ｎ　Ａを
単離、精製した。

得られたプラスミドを種々の１ｉ１１限酵素（例えば５
ａＵ３ＡＩ、）−（ａｅ［，３ａｍＨＩ等）で処理し、
その切断パターン及び切断部位の存在を解析した結果、
このものがｔａｃプロモーターの下流に、プロアポＡ−
ｎ構造遺伝子を同一方向に連結された目的の直接発現系
ベクターでおることを確＆名した。

かくして１ｑられたベクターをｒｐＡＰ−ＤＪと命名す
る。そのｔａｃプロモーター、ＳＤ配列とプロアポへ−
■遺伝子の翻訳開始コドン（ｆＭｅｔ）の間のｊｎ塁配
列は次の通りである。

［ＡＧＧＡ］　ＡＡＣＡＧＧＡＴＣ，ＣＣ［ＡＴＧ］Ｓ
Ｄ配列　　　　　　　　　　　　　ｆＭｅｔ上記プラス
ミドベクターｐＡＰ−Ｄを保有する大腸菌ＪＭ１０３株
は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）に ｒＪ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｂｉａ　ｃｏｌｉ、ＪＭ　−１
０３，Ｉ）ＡＰ　−Ｄ−２２Ｊなる表示で寄託番号［微
工研菌奇第９１４８号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９１４８＞ｊ
として寄託されている。

上記ベクター構築の操作の慨略は、第３図に示す通りで
おる。図において、黒矢印はｔａｃプロモーターを、斜
線を付して示した塩基配列部分はプロアポＡ−ＩＩ構造
遺伝子を、それぞれ示し、之等は以下の各図においても
同様とする。

また、上記において３種のＤＮＡ断片の内のＤＮＡ断片
＜Ｈ＞　　（ｔａｃプ０−Ｅ−ターを含ムフラスミドｐ
ＤＲ５４０からのＤＮＡ断片）の処理の際に、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ処理の代りに、Ｓ１ヌクレアーゼ処理を
行なってブラントエンド化したＤＮＡ断片を用いて、同
様にして、ｔａｃプロモーター、ＳＤ配列とｆＭｅｔ間
の塩基数を４塩基短くした直接発現系ベクター（これを
ｆ’ｐＡＰ−Ｃｌと命名する）を得た。

このもののｔａｃプロモーター、ＳＤ配列とプロアポＡ
−ＩＩ溝造遺伝子の翻訳開始コドン（ｆＭｅｔ＞の間の
塩基配列は、次の通りである。

［ＡＧＧＡ］△ＡＣＡＧＣＣ［Ａ丁Ｇ］ＳＤ配列　　　
　　　　　　ｉ’Ｍｅｔ上記プラスミドベクターＤＡＰ
−Ｃを保有する大腸菌ＪＭ１０３株は、通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所（微工研）に 「ｌ：ｓｃｔ］ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、ＪＭ　−１
０３，ｐＡｐ　−Ｃ−２７Ｊなる表示で寄託番号「微工
研菌奇第９１４９号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９１４９）Ｊと
して寄託されている。

実施例３　　発現されたプロアポＡ−ＩＩの確認■　直
接発現系ベクターｐＡＰ−Ｄ及び同ｐＡＰ−Ｃを各々保
有する大腸菌の培養 下記第２表に示す組成の液体培地（Ｍ−９カザミノ酸培
地〕を用いた。

第２表 ＮａＨ２Ｐｏ４　　　　　　　　　　　　　　　　５．
　８　ｇＫＨ２ＰＯ４，３，ｏｇ ＮａＣＱ　　　　　　５．０ｇ ＮＨ４ＣＱｌ、　ＯにＪ カザミノ酸（ディフコ礼装）　　　５．○ｑビタミンＢ
＋　　　　　　　　　　　　１．０ｆｌｌＣＩプロリン
　　　　　　　　　　　　　５０ｍ！ＩＩグルコースｘ
　　　　　　　　　　　５．００１Ｍ　　ＣａＣＡ２Ｘ
　　　　　　　　０．１ｍＱ１Ｍ　　ＭｇＣＱ２Ｘ　　
　　　　　　１．０ＩＴＩＧテトラサイタリン　　　　
　　　２０μｇ／ｍＱＨ２０を加えて全量を１００１０
０Ｏとする但し表中Ｘ印は、別途オートクレーブ滅菌処
１’Ｊｉ（１２１℃で１５分間）した試薬を使用したこ
とを示す。

各々のプラスミドベクターを保有する大腸菌ＪＭｌ　０
３株の前培養液１　ｒｎＱを、上記組成のＭ−９力ザミ
ノ酸培地１００ｍＱを含むフラスコに加え、３７°Ｃで
往復振盪培養を行なった。培養開始後、約４時間（ＯＤ
３１Ｑ＝約０．４）にて、Ｉ　ＰＴＧを０．１ｍＭ戒と
なるように添加し、更に同様にして培養を続けた。

■　菌体からの目的物の抽出 上記■に示した培養条件で培養し、Ｉ　ＰＴＧ添加添加
後間時間養を停止させ、集菌 （１００００回転／分回転弁間）した。

得られた菌体に、培養液の手足の氷冷した水を加えて！
！！Ｉ！濁させ、超音波処理（１００Ｗ、５０秒、２回
、ＢＲＡＮＳＯＮ社製「５ＯＮＩＦＩＥＲＪ使用）を行
ない、更に遠心分離（１５０，００回回転弁、１０分間
）した後、上清液と沈漬とに分離した。

上清液を超音波処理上清両分とした。

また沈渣はこれに８Ｍ尿素／２０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３を加えて溶解させ一晩透析（４°Ｃ）し
て不溶性画分とした。

■　エンザイムイムノアツセイによるプロアポＡ−■の
測定 上記■で得られた各両分のプロアポＡ−ＩＩの測定は、
精製ヒトアポＡ−ＩＩを標準物質として用いたアポＡ−
ＩＩ特異エンザイムイムノアツセイにより行なった。以
下にその測定法の詳細を示す。

まずヒト血清より精製したアポＡ　−■を抗原として、
家兎に免疫して抗血清を得た。これは、凍結乾燥ヒトア
ポＡ−Ｈ１ｍ（］を蒸留水１　ｍＱに溶解後、フロイン
ト完全アジュバント１　ｍＱを加えて乳化させ、これを
家兎３羽の足指皮内に注則し、次に２週間毎に同量の上
記乳化アポＡ−Ｉｆを家兎の背部に皮下注射して、合計
３回免疫し、最終免疫の７日後に全採血して、血清を分
離することにより実施した。かくして得られる抗血清を
以下のアッセイに用いた。

また、ペルオキシダーゼ標識アポＡ−ｎを、古式らの報
告しているマレイミド法（Ｓ。

Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ　、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　９２゜１４１３−１４２４　（１９８２）　
）に従い、以下の通り作製した。即ち、アポＡ−ＩＩを
、６Ｍ尿素の存在下で、還元剤でおるジチオスレイトー
ルで処理してＳ−８結合を切断し、ＳＨ基を１ケ所持つ
単量体分子とした。一方、ペルオキシダーゼへのマレイ
ミド基の導入は、モル比で１００倍量のＮ−サクシニミ
ジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−
１−カルボキシレートとペルオキシダーゼとを反応させ
ることにより行なった。このマレイミド基礎人ペルオキ
シダーゼを、上記で作製したアポＡ−■単量体にモル比
で１：１になるように加え、４°Ｃで２０時間インキュ
ベートした。その後、バイオグルＰ−１００（バイオラ
ット社製〉にてゲル濾過を行ない、ペルオキシダーゼ−
アポＡ−ＩＩ複合体を含む両分を集めた。

アッセイに用いる抗血清及びペルオキシダーゼ標識アポ
Ａ−ｍの希釈倍率、アッセイ条件を最適化するための反
応時間、温度、抗体結合標識抗原（バウンド）と遊離標
識抗原（フリー）の分離方法等の検討を行なって、以下
の測定条件を設定した。即ち、０．５％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）、０．１４Ｍ塩化すトリウム及び２０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）を希釈液として用いて、
抗ヒトアポＡ−ＩＩ血清（１：１２０）５０μＱ１測定
試料又は標準ヒトアポＡ−Ｉ１１００μＱを試験管に加
え、４°Ｃで２０時間インキュベートした後、５％（Ｖ
／Ｖ　）アフィゲルプロティンＡ（バイオラット社製）
１００μＱを加え、撹拌後、室温で１時間静置した。０
．０５％ツイーン２０及び０．１４Ｍ塩化ナトリウムを
含む２０ｍＭリン酸緩衝液（１１７，２＞（ｒＰＢｓ−
Ｔｗ２０Ｊという）１　ｍＱを加え、３０００回転／分
で１分間遠心して上清を除去した。この操作を２回繰返
すことにより試料中のペルオキシダーゼ活性に影響を及
ぼす物質を除くことができた。次にペルオキシダーゼ標
識アポＡ−Ｉ１１００！１Ｑ（２５ｎｏ）を加え、撹拌
後、室温で１時間静置した。その後、ＰＢＳ−ＴＷ２０
の２−を加え、３０００回転／分で１分間遠心して上清
を除いた。この操作を２回繰返して、遊離のペルオキシ
ダーゼ標識アポＡ−ＩＩを除去した。最後に０．０３％
過酸化水素及び１ｍＶｍＱ４−クロロ−〇−フェニレン
ジアミンを含む０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６，５
）２００μＱを加え、撹拌した。

室温で３０分間静置した後、１Ｎ硫酸１戒を加え、反応
を停止ざぜ、４９２ｎｍでの吸光度を測定した。標準ヒ
トアポＡ−ＩＩより得られた標準曲線より、試料中のア
ポＡ−ＩＩ免疫活性物の含量を求めた。

■　ヒトプロアポＡ−Ｈの発現量 プロアポＡ−ｎ直接発現系ベクターを保有する大腸菌形
質転換株を、上記■及び■に従い培養後、各両分につき
、エンザイムイムノアツセイを行なって、アポＡ−４の
免疫活性物含量を求めた。

その結果を下記第３表に示す。尚、集菌時、遠心分離し
て得られる上清画分についても、同様の試験を行なった
が、この両分には、プロアポＡ−ＩＩは、検出されなか
った。

第　　３　　表 直接発現系ベクターを保有する大腸菌ＪＭＩ０３株（単
位二μＱ／Ｑ　） 直接発現系ベクターを保有する大腸菌ＪＭ１０３株にお
いては、その超音波処理上清画分にアポＡ−ＩＩ免疫活
性を検出することができた。

また１ｍ）ＡＰ−ＤとｐＡＰ−Ｃとでは、ＳＤ配列から
ｆＪｅｔ間の距離が異なるが、２等ベクターを保有する
大腸菌は、いずれもアポＡ−ｎ免疫活性を発現すること
が明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明遺伝子を構成するサブユニツ１〜△及
びサブユニットＢの構築の概略を示す図でおる。 第２図は、本発明実施例１に従い、Ｉ）ＢＲ３２２から
ベクター１）Ａ　ＰＯ１及びｐＡＰＯ２をそれぞれ構築
し、また之等各ベクターから本発明プラスミドベクター
Ｉ）ＡＰＯＡ−ＩＩを構築する概略図を示す。 第３図は、本発明実施例２に従い、上記プラスミドベク
ターｐＡＰＯＡ−ＩＩ及び１）ＤＲ５４０から本発明の
直接発現系ベクターｐＡＰ−Ｄを構築する概略図である
。 （以　上） 第１図 サフ゛ユニット８０岑糞釆 ヅＯツク４　　　　　ゴｂツク５　　　　　ヅＯツク６
第３図 ｃｏＲＩ 手続補正占（自発） 昭和６２年５月１１日 ］　事件の表示 昭和６２年特許願第７１１４５号 ２　発明の名称 プロアポリポタンパク質遺伝子、対応プラスミド組換体
及び対応形質転換体 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 株式会社　大塚製薬工場 ４代理人 大阪市東区平野町２の１０　沢の鶴ビル自　　　発 ６　補正の対象 明細書中１発明の詳細な説明」の項 ７　補正の内容 補正の内容 １　明細書第２５頁最下行にｒｐＢＲ３２２ｊと必るを
ｆ’ｐＢＲ３２２−ＭＩｕＪと訂正する。 ２　明細書第４６真第９行にｒ　（ｐＨ７，５）Ｊとあ
るを「（ｐＨ７，２）Ｊと訂正する。 （以　上）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記塩基配列を含有することを特徴とするプロア
   ポリポタンパク質遺伝子。 【遺伝子配列があります】
2. （２）塩基配列が下記のものである特許請求の範囲第１
   項に記載のプロアポリポタンパク質遺伝子。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
3. （３）特許請求の範囲第１項又は第２項に記載のプロア
   ポリポタンパク質遺伝子をプラスミドベクターに挿入し
   てなるプラスミド組換体。
4. （４）プロアポリポタンパク質遺伝子の上流に、当該遺
   伝子の発現を調節するプロモーター及びシャイン−ダル
   ガノ配列を有する特許請求の範囲第３項に記載のプラス
   ミド組換体。
5. （５）プロモーターがｔａｃ又はｌａｃ　ＵＶ−５であ
   る特許請求の範囲第４項に記載のプラスミド組換体。
6. （６）プラスミドベクターがｐＢＲ３２２である特許請
   求の範囲第３〜５項のいずれかに記載のプラスミド組換
   体。
7. （７）プロアポリポタンパク質遺伝子発現プラスミド組
   換体を宿主細胞に形質転換させた形質転換体。
8. （８）宿主細胞が大腸菌である特許請求の範囲第７項に
   記載の形質転換体。