HU230231B1

HU230231B1 - Fehérjék termelése

Info

Publication number: HU230231B1
Application number: HU0202519A
Authority: HU
Inventors: Günter STEMPFER; Jörg Windisch; Franz Knauseder
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1999-08-09
Filing date: 2000-08-07
Publication date: 2015-10-28
Also published as: CA2379571C; SK287488B6; PL353101A1; WO2001011057A1; NO20020633L; EP1200604B1; HUP0202519A2; MXPA02001424A; PL200225B1; SK1852002A3; NZ516869A; NO20020633D0; DE60029968T2; TR200200253T2; US20050186564A1; HK1047128A1; KR20020026366A; JP4820512B2; ATE335826T1; NO328339B1

Description

Á jelen találmány bakteriális gazdasejtekben világosan mes ?gén N -terminálisú, rekomblnáns termelési ant

amelyben kiindulásként a pestivírus N^pro aútoproteáz autoprotec Etikus aktivitással rendelkező fúziós peptidjét es a a

az

zárványtestként állítja elő, és ezek után a elkülöníti és úgy kezeli, hogy a kívánt het.erolőg Nn» autoproteolítikus aktivitás a fúziós

Heterológ szervezetekben, mint például a ben, a kifejezett humán vagy más eukanota fehérjét, gyakran igen nehéz olyan világosan meghatározott N-terminálissal megkapni, mely a lehetőségek szerint közel 100 %-han homogén. Ez különösen a gyógyszerészeti rekombináns fehérjéknél lenne fon tos, melyek aminosav szekvenciájának sok esetben a természetben, így emberekben vagy állatokban, előforduló aminosav szekvenciával azonosnak kellene lenniük.

Természetes kifejezéskor, például emberben, a gyógyszerészeli fehérje az extracelluiáris térbe jut, és közben az előanyag fehérjén lévő hasítási jelszekvencia világosan meghatározott Nterminálís megjelenését eredményezi. Bakteriális sejtekben ilyen homogén N~ terminálist számos ok miatt nem mindig könnyű előállítani.

Ipari méretű termelésnél számos gyógyszerészeti fehérje a bakteriális sejtek (mint például Eschsnvhia colt) citoplazmájában termelődik, mivel ezek felhalmozása megfelelő mennyiségben lehetséges, és ezen .kívül gyakran oldhatatlan zárványtestek {ÍB-k} képződnek, melyek a léptéknövelésben és a tisztításban nagy előnyt jelentenek. Továbbá az IB formában kifejeződő fehérje az intracelluláris proteázok lebontó hatásától védett {Rudolph: Protein Engínééring: Prihciples and Fractiees, szerkesztők: Jeffrey és mtsai , John Wiley & Sons Inc., {1.995) ISBN 0-47110354-3]..

Viszont az IB anyag termelése a kifejezett fehérje megfelelő in vitro feltekeredését igényli. Ez számos esetben ismert eljárásokkal per se befolyásolható {Rudolph és mtsai: Protein Function: A Practical Approacb, szerkesztő: Creightoíi, 139(1996}]. Ehhez az IB formában lévő fehérjéket erősen denaturáló szerek hozzáadásával redukáló körülmények között szoluhilizálni kell, majd ezek után renatu falhatjuk.

A prokarióta vagy az eukarióta jelszekvenvencíák segítségével a fehérje bakteriális periplazmába juttatása csak ritkán lehetséges, mivel a rendszerint alacsony szállítási kapacitás és az adott bakteriális exportrendszer miatt a termék felhalmozása csak kis mennyiségben lehetséges.

Ezen kívül a bakteriális citoplazma jelentős mértékben eltér az eukarióta extracelinláris tértől. Másrészt, ezekbexi redukáló «·* » » ' «· ·* « * *

♦ X** ♦ * .♦ fc (>♦ *« * ' ♦ ** *

környezet található, valamint ezekben az érett fehérje kialakításához az N-termínális vezető szekvenciák hasítására, nincs mechanizmus, A citoplazmatikns kezdődik, amit a megfelelő beindító) határoz meg. Ez az N-termínális metionín számos a gazuara jellemző metionin-aminopeptídázzal (MAP) megtörténik a lehasítás, A hasítás hatékonysága főleg két tényezőtől függ: 1. a metionint követő aminosav természetétől, és 2. a fehérje háromdimenziós felépítésében az N-termínális helyzetétől, Az Nterminális metionín előnyösen akkor deletálódik, ha a következő aminosav szerín, alanin, glíein, metionín vagy valin, és ha az Ntenninálís szabadon van, azaz nem a fehérje belsejébe rejtett. Másrészt, ha a metionint követő aminosav eltér, különösen, ha töltéssel rendelkezik, (giutaminsav, aszparaginsav, lizin, arginín), vagy ha az N-termínális a fehérje belsejében található, akkor a legtöbb esetben az N- terminális metionín lehasítása nem megy végbe (Kníppers és Rolő Moleknlare Genetík,, 6. kiadás, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. (1.995) ISBN 3-13-103916az esetben ís, ha a 2. helyű gítő aminosav van, a hasítás csak ritkán teljes, Általános, egy figyelemre méltó részre (1-50 %) a MAP nem hat.

Kezdetben a gyógyszerészeti rekombináns bakteriális termelése egyszerűen a metionint kódoló ÁTG kezdőtatásával, az érett fehérje (azaz a szignál-szekvencia.

vagy más N-termínális kiterjesztés nélkül) nyitott olvasási, keretének (ORF) elejére helyezésével történt. így a következő felépítésű fehérjét fejezték ki: H^N-Met-céltábla fehérje.

Á gazda saját MAP-jával az N-termiaális metionin teljes mértékű eltávolítása csak néhány esetben vált lehetségessé. Áz így termelt fehérjék legtöbbje N-terminálisra nézve inhomogénnek tekinthető (a Met~íorm.a és a Met mentes forma) vagy mindegyik N-terminálís további idegen aminosavat (Met) tartalmazott (csak Met-forma),

Ez az inhomogenitás, vagy a természetes szekvenciától való eltérés, számos esetben elfogadhatatlan, mivel ezek a tennék gyakran nem kívánt immunológiai viselkedését eredményezik (például az elfenanyagképzés beindítása) és gyógyszerészetileg eltérő tulajdonságokat (féléletídő, farmakokinetika) mutattak. A fentiek miatt számos esetben szükségessé vált, hogy természetes formával megegyező terméket állítsunk elő (mely homogén és Ntennínálisán idegen aminosavat nem tartalmaz). Citoplazmatikus kifejeződéskor a legfőbb esetben a megoldásnak ez tekinthető, amennyiben a céltábla fehérje N-termínálisához specifikus endöpeptidázok (például Xa faktor, enterokínáz, KEX endopeptidáz, IgA proteáz), vagy arrnnopeptídázok (például dípeptidíbamínopeptidáz) által felismert hasítási szekvenciákat (vezető szekvencia) kapcsolunk. Ez viszont további lépést jelent, ami a. költségeket növeh, valamint a feldolgozás során, un. downstream folyamatban, további anyagok feldolgozását igényli. Ráadásul ÍB-k jelen* *

4r X * « ♦ * »»ΧΦ * ‘ ** * ♦ * ♦-*·* > * ♦ ♦ »♦ · ♦* ♦* létekor számos esetben a fehérje újratekeredését a vezetö-szekveneia befolyásolja, sót azt teljesen meg is akadályozhatja.

így igény van olyan heterológ céltábla fehérje előállítási eljárására, mely a bakteriális sejtekben zárványtest formájában fejeződik ki, melyből a céltábla fehérje egységesen, a kívánt. Nvéggel kinyerhető. A jelen találmány célkitűzése a kívánt céltábla fehérje zárványtestekbőí történő melyhez a pestivírusokfaöl származó vira

A pesíívímsok olyan zek sei e s ke íly világméretű gazdaság

anyós sertésláz vírus (CSFV) különösen jelentős. A vírus (SVBVj által okozott veszteségek szintén méltóak, különösen a magzat rendszeresen el intra.ut.erin fertőzése.

A pestivírusok kiesi burokkal rendelkező vírusok, genomja közvetlenül niRNS-ként hat, méretük 12,3 kb, és géntermékeík a eitoplazmában keletkeznek.

Ez egyetlen políprotein formában alakul ki, mely körülbelül 4000 anúnosavat tartalmaz, és amelyet a virális és celluláris proteázok körülbelül 12 érett fehérjévé alakítanak.

a pestivírusban két vírus által kódolt proteázt nevezetesen az és az NS3 szerín proteázt. Az N-íerminálís Np^íO proteáz a políprotein N-végén helyezkedik el és molekulatömege 23 kd. A saját C-terminálisa. (CyslbS) és a nuk6 leokapszíd C fehérje N-termmáHsa (Ser 169) közötti hasítást katalizálja (Stark és mtsai: J. ViroL, 67, 7088-7095(1993}]. Továbbá, az Νρ^γθ gén duplázódásait a BVDV vírusokon leírták. Ebben az NS3 proteázhoz hasonló módon az Nr^ri> gén az N-terminálison hasonlóképpen duplikálódott formában is megtalálható. Az Nr^roNS3 fehérje autoproteolítikus hasítását ebben az esetben is megfigyelték (Stark és mtsai: 3. Vhol., 67, 7088-7095(1993)].

Az Νρ^γο autoproteáz 168 aminosavből áll és M_r értékei körülbelül 2ÖÖÖÖ Da (in nívó). A pestivírusok (CSW, BDV (határkor vírus) vagy BVDV) políproteinjeí közül ez az első, mely autoproteolízísen megy át, miközben az utána kővetkező nukleokapszíd C fehérje lehasad (Wiskerehen és mtsai: 3. ViroL, 65, 4508-4514 (1991); Stark és mtsai: 3. Vhol., 67, 70887095(1993)]. A hasítás az utolsó aminosavánál történik (Cysl68).

A jelen találmány kidolgozása során meglepetésünkre azt találtuk, hogy az Np*° autoproteolitikus funkciója a fúziós fehérjén lévő heterológ polipeptidek hasításában használható fel, mely bakteriális expressziős rendszerben zárványtestként fejeződik ki, és amely a pestivirus Np™ autoproteázát és a heterológ polipeptidet tartalmazza. Ez együttjár a. hasítatlan Np^íofúziós fehérje zárványtestekből történő elkülönítésével, oldatba vitelével és az újjátekeredés során hasításával..

így a találmány egyik tárgyköre a heterológ polipeptid rekombínáns termelésének folyamatára vonatkozik, mely a következő lépésekből áll:

(1) a fúziós fehérjét kodolo nuklémsavat tartalmazó expresszios vektorral transzformált bakteriális gazdasejtek tenyésztése, ahol a fúziós fehérje a pestivirus Np^£0 autoproteáz autoproteolítikus funkcióját mutató első polipeptidet és az első polipeptid C-ternnnálisával az első poli · pepiidhez kapcsolt második polipeptidet úgy tartalmazza, hogy a második polipeptid. a fúziós fehérjéről lehasítható az első polipeptid autoproteolítikus aktivitása révén, valamint a második polipeptid heterológ jellegű, ahol a tenyésztés olyan körülmények között, történik, mely a fúziós fehérje kifejezését és a megfelelő eitopiazmatikus zárványtestek képzését lehetővé teszi, (íí) a gazdasejtből a zárványtestek izolálása, (iii) az elkülönített zárványtestek szolubilizálása, (ív) az oldott zárványtestek hígítása oly mértékben, hogy a fúziós fehérjéről a heterológ polipeptid auloproteolitikus hasítása megtörténjen, és (v) a hasított heterológ polipeptid elkülönítése.

Előnyben részesítjük a pestivírus Np™ autoproteázának autotoproteolítikus aktivitásával rendelkező polipeptidjét, különösen a pestivirus vagy származékénak antoproteolitíkus aktivitású Np³'° auloproteázát,

A jelen találmány céljának megfelelően a heterológ polipeptid'’ szakkifejezés alatt a pestivirus Np™ autoproteázával. terme8 szerben nem Másított polipepidet értünk, mely hasítás a fúziós fehérjén vagy a poliproteinen megy végbe.

A heteroióg polípeptídek példái a kővetkezők: ipari enzimek (folyamat enzimek) vagy gyógyszerészeti, elsősorban humán gyógyászati aktivitású polípeptídek. A humán gyógyászati aktivitással rendelkező polipepíidek előnyben részesített példái a következők: interleukínok, például IL-6, interferonok, mint például leukooita interferonok, például interferon a2.B, növekedési faktorok, elsősorban a hemopoietikus vagy sebgyőgyító növekedési faktorok, mint például G-CSF, eritropoietin vagy IGF, hormonok, mint például, humán növekedési hormon (hGH), ellenanyagok és vakcinák.

A találmány szerinti folyamatban a pestivírust előnyösen a CSFV, BDV és BVDV csoportból választjuk ká, legelőnyösebbnek a CSFV-t tartjuk.

A jelen találmány szerinti folyamatban ezen kívül előnyben részesítjük azt a formát, amelyben az első fehérje a CSFV (E.MBL adatbázis hozzáférési száma: X87939) ,Νρ^γο autoproteáz következőkben bemutatott szekvenciáját tartalmazza (N-C irányban olvasva 1-168. amino sa vak) :

vagy autöprateolitikus aktivitással rendelkező amínosavszekvencia származékait.

* * ♦ *

Az NP^rö autoproteáz autoproteolitikus aktivitást mutató palipepiid a. pestívírus N?™ autoproteáz olyan származéka is lehet, mely a pestivírus Np^í<; autoproteázának mutageneziséből származik, különösen, melyek aminosav helyettesítéseket, hiányokat, többleteket és/vagy beépüléseket tartalmaznak, amíg a megkívánt autoproteolitikus aktivitással rendelkeznek, elsődlegesen, ha a kívánt heterolőg polipeptid homogén N-terminálissal rendelkezik. A szakirodalomban jártas szakemberek számára a mutagenezíssel megvalósítható szánnazékképzési eljárások ismertek. Az autoproteáz aktivitásának optimalizálása az ilyen mutációkkal lehetséges, a különböző beterológ fehérjék vonatkozásában, melyeket a fúziós fehérjéről kell leválasztani. A fúziós fehérjékről, melyek a kívánt heterolőg fehérje mellett az N'p^ío autoproteáz származékát tartalmazzák, a ködolő nukleinsavak előállítása után, melyek a természetben előforduló Np-'ü autoproteázzal összevetve egy vagy több mutációt mutatnak, az autoproteolitikus aktivitás meghatározásával megállapítjuk., hogy a kívánt funkcióval rendelkeznek-e?

Az autoproteolitikus aktivitás például az izolált/tisztított IBk 7 M g»anidin/HCl oldatban, és ezután. 1:100 arányú reakcíóol hattal történő hígítása után kimutatható, miután 25 óráig a reakciöelegyet inkubáltuk a hasítás bekövetkeztének megállapítására a reakcióoldatot SDS-PAGEval vizsgáljuk. Az átalakított és a nem átalakított arány megállapításhoz Western lenyomatolást hajtunk végre. Á hasított anyag mennyiségét a Coomassíe-val ♦·« · *.

Λ Κ * ♦ « ♦ #♦* *· festett SDS-PÁGE gélen denzitömeiriás analízissel határozzuk meg.

Például, a jelen találmány szerinti előnyben részesített fo lyamatban a fúziós fehérjét kódoló nukleinsav molekulát tartalmazó expressziős vektor található, melyen az N~terminá.Iíssa.i rendelkező fúziós fehérje 2-21. amínosavainak régiójában egy vagy több aminosav hiányzik vagy helyettesített, azzal a feltevéssel, hogy az eredményül kapott származék az autoproteáz autokatalítikus funkcióját a kívánt mértékben mutatja, Λ jelen találmány céljainak megfelelően az előnyben részesített származékok például azok, melyeknek aminosav szekvenciája a CSFV autoproteáz amínesavszekvenciájában a 2-16. vagy 2~ 21. amínosavak között hiányt mutatnak. Az is lehetséges, hogy az aminosav szekvenciák változtatása érdekében aminosav helyettesítések vagy további aminosavak szerepelnek, így például a tisztítás elősegítésére amínosav szekvenciák építhetők he.

A jelen találmány szerinti különösen előnyben részesített nukleinsav molekula azt a fúziós fehérjét kódolja, melyben az első polipeptid a CSFV vagy az antoproteolítíkus aktivitású származékának Np>'° autoproteáz Glu22-Cys 168-ág terjedő aminosav szekvenciáját tartalmazza, ahol az első polipeptid ezen kívül Met-N-terminálissal rendelkezik, és a heterolőg polipeptid közvetlenül a CSFV Np^í0 autoproteáz Cys 163. aminosavához kapcsolt.

A jelen találmányban szintén előnyben részesített nukleinsav molekulára jellemző, hogy' egy olyan fúziós fehérjét kódol, mely első polipeptidként a CSFV Νρ·^:ό autoproteáz Prol7-Cysl68 aminosavaít vagy annak autoproteolitikus aktivitású származékait tartalmazza, ahol az első polipeptid ezen kívül Met-N-terminálissal rendelkezik, és a heterológ polipeptid közvetlenül a CSFV N>° autoproteáz Cysl68. amínosavához kapcsolt.

Á jelen találmány eljárásában a szóban forgó nukleinsav molekula előnyösen DNS.

A jelen találmány eljárásában alkalmazott expressziós vektor előnyösen legalább egy kifejezést szabályozó szekvenciát tartalmaz, Az expressziós szabályozó szekvenciák előnyösen promoterek (mint például lac, tae, T3, T7, trp, gac, vhh, lambda pb vagy phoA). riboszőma kötőhelyek (például természetes riboszőma kötőhelyek, melyek a fentiekben említett, promoterekhez, tartoznak, cro vagy szintetikus riboszőma kötőhelyek), vagy transzkripciót befejező szakaszok (például rrnB T1T2 vagy bla). A fentiekben említett gazdasejtek előnyösen az Esehenchái nemzetségbe tartozó bakteriális sejtek. Viszont más bakteriális sejtek alkalmazása is lehetséges (lásd később), Egy előnyben részesített megvalósítási formában az expressziős vektor plazmid,

Az alkalmazásra jelölt bakteriális gazdasejtek a jelen találmány szerinti eljárásokban például a következő mikroorganizmusok közül választhatok ki: gram-negatív baktériumok, mint például Ascfichc/ua fajok, például Psoherícbía cok, vagy más gramnegatív baktériumok, például Pseaáomonas sp., mint például Pseudomonas aempinosa, vagy Cauíobacter sp., mint például Caulobaoter eraacentus, vagy gram-pozitív baktériumok, mint pél12 dá.ul Bueiiátö sp., előnyösen Bödffeís suhtílís. Gazdasejtként különösen előnyben részesítjük az Escheriehta coli --t,

A bakteriális gazdasejtet, azaz a kifejezést végző törzset, a szakirodalomban ismert mikrobiológiai eljárásokkal tenyésztjük. A törzset általában egyetlen telepből táptalajon növesztjük, de az is lehetséges, hogy fagyasztott sejtszuszpenzioból (sejtbankból nyert) induljunk ki. A további felhasználáshoz elegendő biomassza nyerése érdekében a törzset általában többlépéses folyamatban tenyésztjük, laboratóriumi méretekben ez rázott lombikokkal történik, amiben komplex-táptalajt (például LB levest) alkalmazhatunk. De az is lehetséges, hogy ismert alkotókból álló meghatározott összetételű táptalajt használjunk (például extrát táptalaj). A tenyésztéshez a gazdatőrzs kis térfogatú (amit egyetlen teleppel vagy a krio-tenyészettel oltottunk) előtenyészetét feinövesztjűk, a további eredmény általában a tenyésztési hőmérséklettől nem függ, így lehetséges, hogy rutinszerűen viszonylag magas hőmérsékletet alkalmazzunk (például 30 °C vagy 37 °C). A főfermen táeiőt nagyobb térfogatban végezzük (például 500 ml), ahol már fontos a jő levegőztetés biztosítása (a nagyobb térfogatú lombikok térfogatuknak megfelelően nagyobb rázatási sebességet igényelnek). Mivel szándékunknak megfelelően a kifejezés oldhatatlan zárványtestek kialakításához kötött, ezért a legtöbb esetben a föfermentácíőt szintén viszonylag magas hőmérsékleten végezzük (például 30 vagy 37 »C). A zárványtestek képzésére különösen az indukálható rendszerek alkalmasak (például trp, lae; tae vagy phoA promoterrel). A késői logfázís elérése után (általá13 ♦ * ♦ * ** * « » ♦ χ * *. » ♦ « » ♦ * * *♦ « > « « « » » « K »»»♦ * «** ♦* * baji az optikai denzitás értéke a rázott lom bi kokban 0,5 és 1,0 közé esik) indukáló anyagot (például indolakrilsavat, izopropil-SD-tiogalaktopiranozidot - IPTG-t) adunk és az inkubációt 1-5 , Közben az Ne*° fúziós fehérje legtöbbje a Az sejteket ősszegyüjthetjűk és további ieldolgoóráig tovább

eredményúl

a t alkalmaz, i es irarészesitik az ismert alkotókból álló . Továbbá a biomassza és a termék mennyiségének az is lehetséges, hogy bizonyos tápanyagokat (fed batc-h) < Mas tekintetben a folyamat a rázottfőfermentációt végeznek, ahol a tenyésztési hőmérsékletet úgy választják meg, hogy az egyezzék a rázott lombiknál megadottal. Az ínokuiáeiós fermentort az úgynevezett inokulummal oltják, ami általában egyetlen

vagy egy anotenyeszetooe a jo levegoztetest es a indukáló anyag koncentrációját a fermentorban is biztosítani kell, különösen ^fermentációkor. Az indukciós fázisnak néhány esetben jelentősen hosszabbnak kell lennie mint a rázott

Az eredményűi kapott sejteket ezután feldolgozzuk, n találmány szerinti folyajnatban a zárvanytesteket a :böl ismert módon vonjuk ki, ahogy azt a an és mtsaí; Protein

A Practical

Approach, szerkesztő: Creighton, 1RL Press, 1-39(1996); Rudolph: Modern Methods ín Protein and Nucleíc Acid Research, szerkesztő: Tschesche, De Gruvter, Berlin, 149-171(1990); Rudolph, Protein Engineering: Principles and Practices, szerkesztők: Cleland és Craik, Wileytiss Inc., 283-298(1995)],

Például a fermentálás befejezése után a sejteket centrifugalássál gyújthetjük össze. A sejtek feltárása után, amit például nagynyomású diszpergálással végzünk, a bennük lévő zárványtestek (IB-k) alacsony fordulatszámú centrüúgálással nyerhetjük ki. Ezek után a kívánt céltábla fehérje tisztaságát az IB-k különböző pufferekben végzett többszörös reszuszpendálásával javíthatjuk, például NaCl jelenlétében (például 0,5-1,0 M) és/vagy detergenssel (például Triton X-100), Ez általában a legtöbb Idegen fehérje IB-böl történő eltávolításához vezet. A fennmaradó idegen fehérjék az autoproteolíííkus hasítást általában nem befolyásolják.

Az IB-k oldatba vitele rutinszerűen például guanidint tartalmazó pufferes oldással történik (például 0,1 M túsz/HCI, 6,0 M guanidin/HCl, 5 mM EDTA, 50 mM DTT) (Rudolph és mtsai: Protein Punetion, A Practica! Approach, szerkesztő: Creighton, IRL Press, 1-39(1996); Rudolph: Modern Methods ín Protein and Nueleie Aeid Researeh, szerkesztő: Tschesche, De Gruyier, Berlin, 149-171(1990); Rudolph, Protein Engineering: Principles and Practices, szerkesztők: Cleland és Craik, Wileyláss Inc., 283 -298(1995)). Miután az oldhatatlan anyagot, például χ ♦ β κ« « * » ♦ * X » ♦ * X < ♦ ♦ » * X * > < * « *

XX « « * X « ♦ · ♦ * » centnlugalás a fehérjét a fei

A fúziós fehérjéből a heterolög polipeptid autoproteolítikus a hasitő-pufferes (például 1 mi feloldandó anyag + 99 ml hasító-pufífer) hígítással történik, például íriszt tartalmazó puffer ref, ahol az előnyben részesített koncentráció 0,8-1,0 M, vagy egy arginmt tartalmazó hasító pufferrel, ahol az arginin mennyisége előnyösen 0,4-0,6 M, például semleges pH mellett, előnyösen a pH = 7,0-7,5, és például kevesebb mint 30 ^öC~on, előnyösen 1020 ^öC-on, igy reakcíóelegy alakul ki [Rudolph és mtsai: Protein Funetion, A Practieai Approaeh, szerkesztő: Creighton, 1RL Press, 1-39( 1996)]. Ezután a hasítási oldattal egy adott ideig, például 12 és az NP‘-o gy előnyben részesített megvalósítási formában a szolubk az arginmt úíu«.

v ^koncentrációja legfeljebb 1,0 M legyen, előnyösen 0,4-

is el hogy a szoluszemben

A hasításhoz a reakeiőoldat hőmérséklete például 0 és 30 izött lehet. A hőmérséklet előnyösen 10-20 °C.

A reakeiőoldat pH-ja például 5,0-9,0 között található. Előa pH - 7,0-8,0, még előnyösebben 7,0-7,5.

Ahol arra szükség van a. reakcióoldat 0,5-100 mM koncentrációban DTT tartalmaz. A DDT koncentráció előnyösen 5,5 mM.

* ♦ ♦

Á reakeiöoldatban a hasítás során a fehérje koncentrációja 20-150 pg/rni lehet. A fehérje koncentrációja el kevesebb mint 4(

A hasítás során a reakcióddal: tr 1,0 M koncentrációig. A trisz/HC1 koncentráció el

0,8 M és 1,0 M között van.

Az arg

vul más

Egy különösen előnyben részesített megvalósítási formában a hasítöpuhér p.H-ja 7,0-7,5, a hasítási hőmérséklete 10-20 °C, a fehérje koncentrációja nem haladja meg a 40-50 gg/ml-t és a hasítási szakirodalomban leírt módon elkülöníthetjük ÍDeutscher: Methods in Enzymology: Guide to Protein Purificatioa, Academíc

Press Inc., 309-392(1990)

A következő példák a jelen találmány bemutatására szolgálanélkül, hogy annak oltalmi körét korlátoznák,

WuuumaMm

Az Nr^ri>-hGH (humán növekedési hormon.) kifejezése és ín latro hasítása

A fúziós fehérjéket Eachehchía cok-ban heterológ el expresszlós rendszer felhasználásával állítottuk elő gazdasejt: W3110). A vektor ♦ « k * ♦ »·« ♦ * « # ♦ * « ♦♦ X XX * Φ rendszer összes eleme az Eschehchi'n coE génemből származik. A plóOTPl egy pBR322 származék, melyben a kifejezés irányításéi áz Eschenchia coli módosított trp promoterével történik, nevezetesen ez a promoter nem tartalmaz attenuátor régiót. Az azonos operonrőí származó attenuátor pepiid Shme Dalgarno szekvenciáját mint ríboszoma kötőhelyet alkalmazzak {RBS). Az Escheríehía coli rmB génből származó T1T2 befejezést. irányító régió, a bia gén terminátorával együtt, ami a konstrukcióban, megmarad, az átírás hatékony befejezését biztositja. Az expressziós kazettát a pBR322 EcoRI hasítási helyére, az óramutató járásával ellentétes irányban, (azaz a tetracíklín rezisztencia gén irányával ellenkezően) építettük he. A &laktamáz gént {bia) promoterével együtt eltávoKtottuk. A kifejezésre váró heterolőg fehérjék strukturális génjeit az Xbal hasítási helyen keresztül, a 3506. helyzetbe építjük be {általában a PCR fragmens méretre alakításával).

Az Nr^-hGH strukturális gén forrásaként a (NPH-pET) plazmád szolgál, A plazmid az ismert pETl 1 expressziós vektort tartalmazza {Studíer és mtsai: Methods. Enzymot, 1.85. 60-89 {1990)). Először a fúziós fehérjét, mely az és a CSFV nukleokapszid fehérjéből áll, az expressziős vektorba klónozzuk. Ez felöleli a természetes első 16 aminosav szekvenciájának {MELNHFE-LLYKTSKQK) kicserélését a 10 aminosav hosszúságú oligö-hisztidin tisztítási segédpeptídre {MÁSHHHHHHH). Az Spel hasítási helyet az Nr^rf> és a nukleokapszid fehérje közé alakítottuk ki, mely így a céltábla mufagenezisre alkalmas « « ♦ ♦ ♦: * * ♦ ♦*.*

expressziős piazmid kialakítását eredményezi. Ezzel lehetővé válik a vektorból Spel restrikciós emésztéssel (az 5’ végen) és Xhol emésztéssel (a 3' végen) a nukleokapszid fehérje strakturális génjének eltávolítása. Az így kialakuló iinearizált Nr^!«-pETll vektort preparativ gélelektroforézissel elválasztjuk a nukleokapszid génfragmenstől. Ezután lehető válik a hGH strukturális gén beépítése Spel és az Xhol ragadós végekkel.

Ennek érdekében a hGH génnel a következő munkálatokat kell elvégezni. A strukturális gént a humán agyból származó cDNS bankból sokszorozzuk, ami nagypontosságú PCR-rel (Clontech) végrehajtható (például Pwo polimerázzal, amit a Roche Bíochemicals-töl szerzünk be, és amelynél a gyártó utasításait alkalmaztuk). Erre a célra a kővetkező oligonukleotidokat használ1, oligonuldeotid (N-terminális):

5'·· ATAATTACTAGTTOTTTCGCAACCATTCCC TTAT'CCAGGC C-3’

2. oligonukleotid (C-terminálís'j;

5'- ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTAGAAGCCA CAGCTGCCCT

CCAC-3'.

Az Spel hasítási helyet az 5' végre építettük, és az Xbol hasítási helyet pedig a 3’ végre, melyekhez oligonukleotidokat használtunk fel. Továbbá a kettős ochre stop-kodont (TAATAÁ) a transzláció hatékony befejezése érdekéhen a strukturális gén végeihez csatoltuk. Az Spel hasítási hely az egyik végen az Nrt°pETl 1 olvasási keretbe történő ligálását teszi lehetővé, melyet a fentiekben leírt vektorból nyertünk. A másik végen az Xhol ha19 *·Κ * ♦ sííási hely az irányított klónozást biztosítja. Az így kialakított plazmidot NPH-pET-vel jelöltük.

Áz NPH-pET-t, ahogy azt már említettük, az Nr^ro-hGH fúziós fehérje strukturális génjének forrásaként használtuk. Erre a célra ismételten Pwo polimerázos nagypontosságű PCR-t alkalmaztunk, melyhez terápiáiként az Xhol-gyel linearizált NPHpET plazmidot használtuk. Á klónozható fragmens előállításához a következő prímereket használtuk.

A strukturális gén egyik végén (mely megfelel a fehérje Ntermínálisának):

S’-AGGGTATCTAGAATrCTATGCCAGTGGGAGTGGAGGAACCG-S’ A strukturális gén másik végén (mely a fehérje C-terminálisának felel meg):

S'-AGAÁTTAAGC TTCTAGATfA TTAGAAGCCA CAGCTGCCCT

CCAC-3’

Az Xbal hasítási helyet ezek után a klónozáshoz használtuk fel (első és második vég, az ábrán aláhúztuk, és a kezdő (ATG) és a befejező stop (TAATAA) kodonokat vastagon jelöltük).

A strukturális gén sokszorozása során, keletkező két oligpnukleotidot, melyek a iüziós fehérje (EP) nyitott olvasási keretét, valamint a his-tisztításhoz a megfelelő ammosavszekvencíát is biztosították (metionín kivételével hisztidinek, ahol a metionín a transzláció megkezdéséhez szükséges) teljes mértékben eltávolítottuk.

A nyitott olvasási kerettel rendelkező NP^ro-hGH fúziós fehérje PC.R fragmens szekvenciáját (1072 bp) az alábbiakban megad29 :♦ ' X * * ♦ ♦ *

¢. «: 9 4 X * *»

Λ «49»· * < * 4 * « S * 4 ♦·*«· ** * tűk. Λ start kodon t és a két stop kod ont vastagon szedtük, és a használt Xhaí hasítási helyeket aláhúzással jelöltük.

5‘GAGGAGATATGAGAACAACACTGAGGGACCTACCCAGGAAAGGT

GCTGCTCATCGAGTCGTGGCTGGAGGCCGTGCAGTTCCTCAGGA

ATGGGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCGGGGACTGGGCAGATCTT

CAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGA zx a í^zxzx^

♦ * ♦ · ♦ * ** χ ♦ ♦ * ♦ * » ♦

X * * X * ;♦ ♦ * »«♦ * X « « .*.«.♦» χ ♦ ♦ ♦ χ:*

CTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAATAATCTAGAAGCTTAATTC

Τ-3^!

Ez az ORF az alábbiakban bemutatott fúziós fehérjét kódolja, a második helyzetben a prolin a természetes NP^ro fehérje 17. prolinjának felel meg. Az NP^íO-hGH fúziós fehérje szekvenciája (344 aminosav, melyből 153 az Nr^ro és 191 a hGH) így a következő (M-C irányban olvasva), ahol az Nn-» szekvencia 17. helyzetét (prolin, mely a fúziós fehérje 2. helyzete) dőlt. betűvel jelöltük, és a hGH szekvenciát vastagon szedtük:

Redukált állapotban az FP molekulatömege 39316,92 Da, és a lehetséges hasítás után az Nr«’ részé (redukált): 17220,02 Da és a hGH részé 22114,88 Da (redukált). Az N?^ri> 6 clszteint tartalmaz, míg a hGH négyet A. bakteriális cítoplazmában ezek a ciszteinek főleg redukált állapotban találhatok meg. Az. ezt követő folyamatban feltehetőleg legalább részleges diszulfidhid képzés történik. Elvárható, hogy a fúziós fehérje (vagy az W^;r;i rész) Nterminálisa a metioninnál a gazdára jellemző metíonin * * Λ* ♦ * « « « * « * ♦ * * ♦ * X *«Χ·

X « * ft * »♦·* ♦ »«♦ «* <♦:

aminöpeptidázzal (ΜΛΡ) általában hasított, melynek eredményeként a molekulatömeg 131 Da~nal 39186 Da-ra (FF), illetőleg 17089 Da-ra (Nm^;j csökken.

A PCR fragmenst, mely az FP strukturális génjét tartalmazza, a leírtaknak megfelelően tisztítjuk, és Xbal-gyel hasltjuk, és a céltábla fragmenstől a két hasítási szekvenciát eltávolítjuk. Ezt a fragmenst a leírtaknak megfelelően a plöOTPl expressziős vektorba ligájuk.

Ehhez a vektort először Xbal-gyel linearízáljuk és horjűbél foszfatázzal (CIP) 5^!-defoszforilezznk. A ligáláshoz T4 DNS ligást használunk- Az összekapcsolt DNS-t elektroporáeióval Eschtvíc/na coá K-12 DH lOB-be juttatjuk be és kúria tápleves (LB) agarra lemezeljük, mely 15 mg/! tetraciklint tartalmaz. Ebből a transzformációból számos telepet kapunk. A plazmíd DN8~t több telepből kinyerjük és a helyes méretű és irányultságú ínszert jelenlétére restrikciós analízissel megvizsgáljuk. Az egyik kiónt részletes restrikciós analízissel és DNS szekvenálással vizsgáltuk, A plazmíd tulajdonságai az elvárttal egyeztek. Ezt a plazmidot. pNPHl-nek neveztük el, és a továbbiakban ezt használtuk.

A pNPHl (4840 bp) expressziös plazmíd szekvenciáját az alábbiakban bemutattuk. Az Ni^w<1~hGH fúziós fehérje kezdőkodonját és stop-kodonját aláhúztuk. Á szekvencia a nyitott olvasási keretet fordított irányban mutatja be.

S’-GAATrCTCÁTGTTTGÁCAGCTTÁTCATCGATAAGCTTTAATGC23 *♦ *

Φ φφ

X Φ Φ Κ * » X Φ φτ * ♦ Μ· 9 ♦ ♦•♦Φ φ νκ«« * Φ « X »«♦» 9 «Φ» ΦΦ Χ«

TGAAATCTAA.CAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCC

GGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATrTCTATGCGCA

GGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCGGGACGCATCG

3AGAGCGTCGACCGATGC

PVv-VíVíX

GAGGACCGCTITCGCTGGAG<

TGCGGTATTCGGAATCTÍGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCÁC

CCGGCATGGCGGCGGAGGCGGTGGGCTACGTCTTGerGGCGTT

CGCGACGCGAGGGTGGATGGCCTTCCCCAl'TATGATTCTTCTCGC

TTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCG1TGCAGGCCATGCTGTCCA vzvr αφ·λ.

♦ Φ ♦ φ φ* ♦ * φ ΦΦ t φ *

X β Φ » X Φ Φ φ χ * V ♦ Λ « «♦♦* X ΦΦΦ ♦ > *φ

GCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATrCACCACTCCAAGAATTGGA

GCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCT ^G

CTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATnTTCTCTG

GC

CCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTT

CTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACAT

CCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCA

GCTCCCGGAGACGG'TCACAGCITGTCTGTAAGCGGATGCCGGGA

ATACTGGCTrAACTATGCGGCATCAGAGCAGÁTTGTACTGAGAGT

ATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACrGAGrCGCT « k * ♦« ♦ * » * * ♦ * « ♦ ♦ χ: * 4 » * * ♦

CTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTG

AAÁAGGAAAGGGCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTrrrATTCTA

Jt * ♦ * 9 4 444 »44 4 fi « « ?

«««» K ♦♦ K«

GATGCGCAGGAATC/rCTCGACCTTGTCCzVrGTCC/rrCCTGxAAGCA

GTAGAGCAGCCCGTAGTTCTTGAGTAGTGCGTCATCG2TGTGTGA

G'rrrGTGTCGAACTTGCTGTAGGTCTGCTrGAAGATCTGCCCAGT

GTGTCGGAATAGACTCTGAGAAACAGAGGGAGGTCTGGGGGTTC

A Z**

C ACTTTÁGGGT^ÍVVrr'

TGCAAC

ACGCGTGAGCCTGCCTATTCTCTTAGTCACCTCGCAGAACTGGGC

TAGGTCCGTCAGTGTTGTTCTGATATCTGCTCTCCCCCTGTCGTGT

AGTTAACTAGTTCCJATGATTAATTGTCAáCAGCTCATTrCAGAATAT TTGCGAGAACCG'!

CGGGAGTGCGCCTFGAGCGACACGAATTATGCAGTGATTTACGAC ♦ fc * ♦ ♦« * * ♦ X* * X ♦ β ' · ♦ Λ * ♦ ♦ ♦♦ ♦ **♦♦ * « « X fc ♦ ♦«χ * ♦♦* »« *♦

CTGCACAGCCATACCACAGCTTCCGATTGGCTGCCTGACGCCAG

GCGÁTCÁCCGACCATGACÁeCACAGCAT-O*

és mtsai:

Az W^r0~hGH~t kifejező Eschenchia coli gazdatörzset a termeység és a biológia biztonság tényezőit figyelembe véve ki. Az Esehenehio coli K-12 az egyik légi' E&cherichia coli törzs (Rachmann:

and Salmonella American Socíety fór Washington D.C. 1191-1219 (1987a); Baehmann és Barbara:

coli K-12, 7.

b

2.

szeri

1, Am. Soc. Microbíot, Washíngtoxi DC, 807Jensen: J. Racteriot, 175, 3401 -3407(1993)]. és e törzs képviselőit általában biztonságosnak tekintik.

Az Escherichia eoc K -12 W31 lö ÍATCC 27325) törzs egy prototrőf származék, mely a vad típusú Eschenehxn coli Κ-12-hőz közel áll, és gyakran alkalmazzák heterológ fehérjék kifejezésére. Letétbe helyezése az American Type Culture Collection (ATCC) gyűjteményébe a következő genotípussal történt:

)P- rnerA mcrB IN(rrnD-rrnE) l lambda-j.

A törzset az ÁTCC-tol szerezhetjük he. Teljesen szintetikus táptalajon kiválóan nő, és tenyésztése igen jól megoldható.

A W3110[pNPHl] expressziős törzs előállítása a fentiekben

3110-ba történő transzformá99 9 * χ * *» ♦ X * »« * « X * * * * * « ***

UV X «««« » * * ♦ «»Ο *«·* ♦ 999 «« *Φ lásávai valósítható meg A transzformációt eiektroporácíóval végeztük, melyhez 10 % glicerint: tartalmazó szuszpenziós táptalajt használtunk fel·, 50 ng (1 μΐ) pNPHl vizes oldatot 30 μΐ W311.0 kevertünk össze és 1 mm-es küvettáhan 1800

ak tettük ki Í.E

2510). A >OC táptalajba vettük fel és 37 ^öC-on 1 óráig rázattuk, majd ezek után 15 rag/1 tetraeiklint tartalmazó Luria tápleves agarra

Ebből a egy át 37

1] °C-on

A napi alkalmazáshoz a törzset °C-on végzett inkubálás után számos

A közepes méretik határozott szegélyű telej ez adta az alapját a és mester agar

5(pNPHlj törzset egyetlen telepből kiindulva agár lemezeken tovább tenyésztettük és ezt használtuk fel a táplevest és 15 mg/1 tetraeiklint tartalmazó tápleves 1

tenyészetet 250 rpm-mel 30 °€~on 14 óráig rázattuk, miközben az ODt>oo körülbelül 1,0 értéket, ért el. Az inokulációs tenyészet 10 ml-ét ezután a főfermentáció oltásához használtuk fel (mindegyik 330 ml cifrát-táptalaj 1 literes lombikban) (3 % inokuium). A főfermentáciőt 37 °C-on (250 rpm) ODeoo 0,8 értékig folytattuk, es ezután a fúziós fehérje termelést 50 pg indolakril savval/ml tenyészet indukáltuk (végkoncentráeiő; törzsoldat 5 mg/ml 100 % analitikai minőségű EtOH-ban). A « Λ» »* » * fc « «Γ « * * « » « »«« *« «» tenyészeteket további 4 óráig tenyésztettük (37 °C és 2,50 rpra}, miközben az OD&oo elérte az 1,5-3,0 értéket,

A tenyészeteket steril 500 ml~es centrifuga csövekbe átvittük és 10ÖÖÖ g-vel 30 percig centrifugáltuk. A centnfugálás felük üszóját teljes egészében elöntöttük, és az üledékeket a további feldolgozáshoz -80 Óra lefagyasztottuk.

Körülbelül 12 g (nedvestömeg) BEI 2 Í(DE3) sejt üledéket ezek után 30 ml 50 mM írisz/HCl-t, 5 mM benzamidint tartalmazó oldatba (pH = 8,0) szuszpendáltük és Ultraturrax készülékkel homogenizáltuk. Miután 0,5 mM EDTA-t és 0,1 vegyes% lizoztmot hozzáadtunk a sejtszuszpenziót 30 percig jégfürdöben inkubáliuk, Az ezt követő ultrahanggal végzett kezelés (7 x 20 másodperc 20 másodperces megszakításokkal) a sejtek teljes feltárását eredményezte. Ezután a széttört szuszpenziőboz 10 mM MgCk-t és 0,006 vegyes% DNázt adtunk, és 4 «C-on 30 percig ínkubáltuk. Az oldhatatlan és az oldható alkotókat ezután centrifugálással elválasztottuk (JA 20; 7700g). Az üledéket a következő össze- * tételű oldatba szuszpendáltük: 40 ml 50 mM trísz/HCI, 5 mM benzamidín, 5 mM EDTÁ, pH - 8,0, és ismételten centrifugáltuk (JA 20; 7700 g). Ezt a lépést kétszer megismételtük, és az eredményül kapott üledékeket a következő összetételű oldatba szuszpendáltuk: 40 ml 20 mM trísz/HCI, pH - 7,0. 20 ml 1,5 M NaCI, 60 mM EDTÁ, pH 7,0, és jégfürdőn 30 percig inkubáítuk. Végül tovább centrifugáltuk (JA 20; 7700 g) és HAJ val mostuk. Az eredményül kapott üledék az NnMiGH 1B két (zárványtesteket) képviseli.

« fc * K fcfcfc’ fcfcfc» * ♦ Μ ♦ fcfc ♦ fc Π * * * fc * * « Λ » fc V ♦ >» Kit fcfc

Rutinszerűen ezek után körülbelül 100 mg IB-t szobahőmérsékleten 30 percig a kővetkező összetételű oldatba szuszz 2 ml 6,0 M guaniáin-hidroklorid, 0,1 M trísz, 5 mM DTT, pH ^:::: 9,0. Az oldhatatlan alkotókat ezek után centrífügálással eltávohtottuk (10 perc /30000 g). A fehérje meghatározását ezen a felülúszón végeztük (a fehérje koncentmg/ racro hasítási vizsgalat bán vagy °C-on tároltuk (max. 7 nap) felhasználtuk, vagy -20

2. Példa

kozott

Az rész hasítása hasítási (a koncentráció kisebb mint 0,06 M)

Az lMr^rö rész hasításának mértéke a hasítási termék SDSPAGE-vei végzett elektroforézis után mérhető. Ez az SDS-PÁGE a gél fényképezését.

intenzitásának megfelelő mérését foglalja magába. A megfelelő csíkokat egy előző Western fenyomatolásí vizsgálatban azonosítottuk.

♦ X • * ♦ Χ·.« X X ♦ * x « « » « XX « ♦ »»κ* ♦ « » « χ « *χ* ♦»

2.1. Példa

Az Nn°~hHG m mtro hasítása, argminnal

A hasítás a szolubilízátum hasítási pufferben (20 mM trisz/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH ~ 7,0 és a megfelelő argínín koncentrációk) szobahőmérsékleten hígítással (1:100) megy végbe. A hasítási elegyekben a fehérje koncentrációja 20 pg/ml. A hasítás mértékét 24 óra után mértük a hasítási termék SDSPAGE-val történő feldolgozásával.

Kiderült, hogy az W^s'° hasítás hatékonysága a hasítási puíferhez hozzáadot t arginin koncentrációval egyenes arányban változik. A maximális hasítás 0,4-0,6 M argininnál megy végbe.

2.2. Példa

Az NP^K>-hGH-ről az hasítása araiamban különböző hőmérsékleteken

A hasítások a hasítási pufferben (20 mM trisz/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH - 7,0, 0 - 1,0 M arginin) külön hozó hőmérsékleten 1:100 hígítással történtek. A hasítási elegyekben a fehérje koncentrációja 20 pg/ml. A hasítás mértékét 24 óra után mértük a hasítási termék SDS-PAGE-val történő feldolgozásával

Kiderült, hogy a maximális hasítás 10 és 20 °C között megy

2.3. Példa «♦ * w ΦΦ ♦ * * · * » Μ » » .» * * V Φ Φ Φ Μ ΜΦ * φ* ** Φ φ χ φ χ φ φ φ * » «» « φφ φ «

Αζ Νρ^γο-hGH-ről az fk»» hasítás mértéke különböző hőmérsékleteken a pH függvényében

A hasítások az adott pH-η a hasítási pufferöen (20 jsM trisz/HCl, 2 tnM EDTA, 5 raM DTT, 0,5 M argímn} a szolufoilízátűm 1:100 hígításával történtek. A hasítási elegyekhen a fehérje koncentrációja 20 gg/ml. A hasítás mértékét 24 óra után mértük a hasítási termék SDS-PAGE-val történő feldolgozásával.

A hasításokat szisztematikusan a hasítási pufféi* pH-jának változtatásával pH ~ 5,0 és 9,0 között végeztük. Az alkalmazott arginin. koncentrációknál az Nw fúziós fehéije optimális hasítása pH 7,0-7,5 között figyelhető meg.

2.4. Példa

Az Nr^-hGH-ről azNP^ro hasítása különböző DTT koncentrációnál

A hasítási hatékonyság DTT koncentráció-függését megvizsgáltuk. A hasítások az adott pH-η a hasítási pufferbcn (20 mM trísz/HCi, 2 mM EDTA, 0-100 mM DTT, 0,5 M arginin, 15 Oon) a szolubilizátum 1:100 hígításával történtek. Mivel a szolubilizátumban a DTP koncentrációja 0 mM DTT-nél még 0,5 mM DTT~ t tartalmaz. A hasítási elegyekhen a fehérje koncentrációja 20 ug/mk A hasítás mértékét 24 óra után mértük a hasítási termék SDS-PAGE-val történő feldolgozásával.

Az rész lehasitási optimuma körülbelül 5,5 mM DTTnél figyelhető meg.

2.5. Példa » * » ♦ * * » X V * »SrK» « « φ. ψ *«»» A »»« ♦♦ ♦♦

A pH változtatása a szolubilizátumban, az Np^- HGH hasítás vizsgálatához

A hasítás pH függését különböző érékeknél (pH -6,0, pH 7,0, pH - 8,0, pH 9,0) a szolubílizátum hasítási pufferrel (20 mM trisz/HC1, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, 0-0,8 M argínin, pH ^::= 7,0, 15 Oon) történő hígításával (1:100) vizsgáltuk. A különböző pH értékeket, az 1B-k szoiuhiiizáeiós puíferrel való keverésekor, a megfelelő pH-jü. pufferekkel értük el. A hasítási elegyekben a fehérje koncentrációja 20 gg/mh A hasítás mértékét 24 óra után. mértük a hasítási termék SDS-PAGE-val történő feldolgozásával.

Kiderült, hogy a hasítás pH optimuma körülbelül 7,0-8,0 között van.

2.6, Példa

Az Hr^ro hasítás kinetikája NP^-hGH-ról

A denaturált Nr^-hGH reaktiválása a kővetkező összetételű oldatban, 1:100 hígításnál, történt: 20 mM trisz/HC1, 0,5 M arginin, 2 mM BDTA, 10 mM DTT, pH - 7,0, 15 «Ο·οη.

Kiderült, hogy a hasítás végpontját körülbelül 24 óra után éri eh

2.7. Példa

Az Np»^:< hasítása az NP^ro hGH-ról különböző fehérje-koncentrációknál

A hasítások a hasítási pufferben (20 mM trísz/HCl, 0,5 M argínin, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH - 7,0, 15 »C~on) a szolubili34 zátum Μ00 hígításával történtek, Δ hasítás megtörténtének ellenőrzését körülbelül 24 órás hasítás után a termék SDS-PÁGE vizsgálatával végeztük.

Kiderült, hogy több mint 40 pg/ml fehérje a hasítási hatékonyság csökkenéséhez vezet. A további vizsgálatok felfedték, hogy az optimális fehérje koncentráció 20-40 pg/ml között talál2.8. Példa

Áz hasítása az Np^-hGH-ról dialízissel a fehérje -koncentráció függvényében

A szóin bílízált Nr^TO-hGH IB-ről a guanidin-hídroklorídot dia lízissel (1:100) eltávolítottuk a következő összetételű dialízis oldat felhasználásával: 20 mM trisz/HCl, 0,5 M arginin, 2 mM EDTA, 10 mM DTT, pH ~ 7,0, 4 °C, így a hasítást sikerült megindítani. Áz iehasadásának vizsgálatához körülbelül 24 óra elteltével az 8DS -PAGE-t alkalmaztunk.

Kiderült, hogy az N?>^TO rész hasadása nem csak a hígítással, hanem a szoiubiiizált anyag dialízisével is elérhető.

2.9. Példa

Az lehasad ásának hatékonysága az NP^r»-hGH-rói a trisz/HCl koncentráció függvényében

A hasítást a szolubilizátum következő hasítási oldatban történő hígításával (1:100) végeztük: 2 mM EDTA, 20 mM DTT, pH ~ * · *.* «.♦ ♦ ♦ ♦ « » « ♦ * * » ♦ φ♦*

XX φ Φ >

7,0, 0,1 - 1,0 Μ trisz/HCi, 15 ^öC). A hasítást 24 ára után a hasítási termék SDS-PAGE-val történő feldolgozásával ellenőriztük.

Azt tapasztaltuk, hogy 0,8 M-ig a növekvő trisz/HCi koncentráció az Νρ™ fúziós fehérje hasítási kitermelését javítja. E fölött az Nr^ro hasítás észrevehetően nem nőtt, így a reakciót előnyösen 0,8-1,0 M tris/HCl koncén f rációnál végezhet] ük.

. Példa

Az NP^ro-pGH (sertés növekedési hormon) kifejezése

Az NP^ro-pGH expresszlós vektor előállítása az pNPHl-höl indul ki (lásd az 1. példát). A plazmídot Bglll-vel linearízálúik és PCR-rel sokszoroztuk. Ez magában foglalja a hGH strukturális gén (a Phel ködömtől a PhelOl kodonig) Pwo polimerázzal és az 5* foszfát nélkül, primerekkel végzett sokszorozását. A tisztított PCR fragmenst a pGH strukturális génnel való lígálásakor vektorként alkalmaztuk. Az 5’ foszfátok eltávolítása (például borjúbél foszfatázzal, Artric garnélarák íoszíátázzal) az önlígálödás elkerülését biztosítja.

A pGH strukturális gént szintén PCR-rel, sokszorozással állítottuk elő. A használt templát sertés cDNS bankból származott (például sertés máj SMrányü cDNS könyvtárból, mely a Clontech-töl szerezhető be, vagy a sertésagy vagy -hipofízis cDNS bankból is nyerhető). A sokszorozáshoz a következő printereket alkalmaztuk, és a szintézis során mindegyiket 5’ foszfáttal biztosítottuk:

♦♦ « * ΧΦ φφ * t ΦΦ Φ 4 φ * * * Φ Φ Φ φφ φ * .*:♦:>:·«· φ φ Φ χ » χφ» Φ φφκ κχ φφ

A strukturális gén egyik vége (mely a fehérje termék N-terminálisának felel meg) (Phel -Ser?):

A strukturális gén másik vege (mely a terminálisának felel meg) (Phe 190-Val l 84) termék O rr

A PCR íragmens kizárólag az érett pGH ORP-jét (a struk:njét) tartalmazza. Áz ORF ligálás (T4 DNS lígáz) olyan ~t eredményez, mely a pNPHl-gyel analóg. Áz itt leírt ét ez az ORF kódolja. A ligáit DNS-t az Eschen'chia

T12 DHlOB-be eietroporácíőval íuttattuk be (az elei

petens sejteket a Life Technologies biztosította, ahol az Eschehehiu coB genotípusa: K~12 F mcrÁ A(mrr hsdRMS-mcrÖC) AMIS ÁlacX74 deoR recAl endAl araDI39 A(ara, és Lurla tápleves (LB) agar 15 mg/1 tetracikünt tartalmaztak. Ez a transzformáció számos klonálís telepet eredményez. A t., és a megfelelő méretű ínszert jelenlétére, valamint annak helyes irányára nézve restrikciós analízissel vizsgáltuk. Az egyik kiónt kiválasztottuk és restrikciós analízissel, valamint DNS szekvenalár jellemeztük. A plazmid az összes vizsgálatban a megfelelően viselkedett. Ezt a plazmidot pNPP 1-nek neveztük, és ezt használtuk a további munkákban.

A következő amínosav szekvencia (N-C irányban) az Np^:í!pGH-t mutatja be (342 amínosav, melyből 153 az Np^5<í és 189 a * ♦ » ♦ ♦♦ * « ♦ $ „ . » pGH), ahol a. természetes He^f0 szekvencia 17. prolin helyzetét (a fúziós fehérje 2. helye) dőlten jelöltük, és a pGH szekvenciát vastagon szedtük.

Az FF molekulatömege redukált állapotban 38819,82 Da, és a lehetséges hasítás után az Hr^to 17220,02 Da (redukált), míg a pGH 21617,79 Da (redukált). Az Ne^ro hat ciszteint, míg a pGH négyet tartalmaz. A bakteriális citoplazmában ezek a císzteínek leginkább redukált formában fordulnak elő. Az ezt. következő folyamat alatt a deszulfidhidak legalább részleges képződése megy végbe. Elvárható, hogy? a fúziós fehérjében (vagy az részben) az N~terminális metíonin legnagyobb része a gazda, metionin-aminopeptidázának (MAP) hatására lehasad, ami a molekulatömeget 131 Da nal 38689 Da-ra (PP), illetőleg 17089 Da-ra (N?^ro) csökkenti.

A W31 lÖjpNPPIj törzs expressziójáí az 1. példában leírtaknak megfelelően végeztük, ennek érdekében a pNPPl expressziós piazmidot transzformációval (elektroporáció) az Bsehenehfo. cok ΚΙ 2 W3110 törzsbe bejuttattuk. A részletes restrikciós analízissel végzett jellemzés ebben a kísérletben is megfelelt az elvártnak.

♦ * ♦ X «χ ♦ * » ♦ * « X χ * * * * * * * ♦♦ χ χ » 4 φ « » ♦ χ *** X* ♦♦

A közepes méretű telepeket határozott szegéllyel kiemeltük, és ez adta az alapját a W31 lOjpNPPIl expressziós törzsnek. A kiónt tenyésztettük és krÍG-ampnllákhan -80 ^eC-on tároltuk (kiindulási anyag, mester sejthank (MCB)). A napi alkalmazáshoz a törzset LB-tetraciklin agarlemezekre esikoztuk.

eiezese!

Nr^-hGH fúziós történt.

Az Np^-pGH ÍB-k előállítása az 1. példában leírt Nz^rofúziós fehérie előállításához hasonlóan történt,

A szoluhilizáció és a renaturálási vizsgálat az Nr^r®~pGH fúziós fehérjénél megfelelt a Nr^ro~hGH fúziós fehérjénél leírtaknak. A mái' leírt paraméter-változtatások (lásd a fentiekben) után kiderült, hogy az rész in uiiro hasítása, a szoínhilizáciő és renaturálás után, az NP^m-pGH-ról lehetséges.

Claims

EMI IGÉNYPONTOK

1, Eljárás heterológ polipeptid rekombináns technikával való előállítására, azzal jellemezve, begy a következő lépéseket alkalmazzuk:

(i) egy fúziós fehérjét kódoló nukleinsavat. tartalmazó expressziős vektorral transzformált bakteriális gazda.sejt.ek tenyésztése, ahol a fúziós fehérje a pestivirus NP^ro autoproteáz autoproteolítikus funkcióját mutató első polipeptidet és az első polipeptid C-terminálisával az első polipepiidhez kapcsolt második polipeptidet úgy tartalmazza, a második polipeptid a. fúziós fehérjéről lehasítható az első íroteolítlkus aktivitása, révért, valamint, a második polipeptid heterológ jellegű, ahol a tenyésztés olyar mely a fúziós fehérje kifejezését és a kus zárványtestek képzését lehetővé teszi, a ől a zárványtestek izolálása, hígítása oly mértékben, a fúziós lél heterológ polipeptid autoproteolítikus hasitá-sa megtörténjen, és a hasított heterológ polipeptid elkülönítése.
2. Az 1, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pestivirus a hagyományos sertésláz vírus (CSW), a határkor vírus ÍBDV] vagy a borjú hasmenés vírus szerinti eljárás.

jellemezve, hogy a pestivirus a
4, A 3, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első vagy ennek W^re autoproteáz antoproteokükus aktivitással rendelkező származékának aminosav szekvenciája.
5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a CSFV W⁰ antoproteáz vagy annak W⁰ autoproteáz autoproteolítlkns aktivitással rendelkező származékának Glu22~Cysl68 aminosavait tartalmazza, amelyben az első polipeptid Met: N-terminálissal bír, és amelyben a heterológ polipeptid közvetlenül a CSFV Ni'^ro autoproteáz Cvsl63 ami· nosavával
6. A 3, k az e.

eptíd a CSFV ők⁵’⁵ autoproteáz vagy annak Np^s‘^g autoproteáz autoproteolítíkus aktivitással rendelkező származékának Frol
7-Cysl88 aminosavait tartalmazza, amelyben az első polipeptid Met N-terminálissal bír, és amelyben a

Az 1-6, közvetlenül a CSFV antoproteáz Cysl68 amibármelyike szerinti ellá hogy a nukieínsav DNS molekula.
8. Az 1-7, igt hogy az expressziős vektor azzal jellemezve, szerinti eljárás, azzal jellemezve.
9, Az 1-8, á bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve.

hogy a bakteriális gazdasejt Escheriehín coli sej

A meghatalmazott