CN1369014A - 蛋白质生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在细菌宿主细胞中重组生产具有明确均一N端的预期异源多肽的方法,包括首先在宿主细胞中以胞质包涵体的形式形成包含具有瘟病毒自我蛋白酶Npro自我蛋白酶解活性的肽与所述异源多肽的融合蛋白,然后分离并处理包涵体,从而通过Npro自我蛋白酶解活性切割融合蛋白获得预期异源多肽。

Description

蛋白质生产
本发明涉及用于在细菌宿主细胞中重组生产具有明确均一N端的预期异源多肽的方法，包括首先在宿主细胞中以胞质包涵体的形式形成包含具有瘟病毒自我蛋白酶(autoprotease)Npro自我蛋白酶解活性的肽与异源多肽的融合蛋白，然后分离并处理包涵体，从而通过Npro自我蛋白酶解活性切割融合蛋白获得预期异源多肽。
在异源生物体中生产重组蛋白时，诸如在细菌细胞中表达人或其它真核生物蛋白时，通常难以获得尽可能接近100％均一的明确N端。本发明具体应用于在许多情况中氨基酸序列应当与人/动物中天然发生的氨基酸序列相同的重组药用蛋白质。
例如在人体中天然表达后，使用中的许多药用蛋白质被转运至胞外空间，并为此目的切除蛋白质前体中存在的信号序列，产生明确N端。由于各种原因，并不总是能够容易的产生这种均一N端，例如在细菌细胞中时。
对于工业规模生产，许多药用蛋白质是在细菌细胞(例如大肠杆菌)的胞质中生产的，因为它们可能在此积累至足够量，而且常常形成不溶性包涵体(IB)，包涵体在加工和纯化中具有极大优势。另外，以包涵体形式表达的蛋白质受到保护免受胞内蛋白酶的降解(R.Rudolph，在《蛋白质工程：原理和实践》一书中，JeffreyL.Cleland和Charles S.Craik编，John Wiley&Sons公司，1995，ISBN0-471-10354-3)。
然而，包涵体物质的生产需要表达的蛋白质在体外重折叠。在许多情况中，这可以通过本身已知的方法来实现(R.Rudolph等人，1996，在《蛋白质功能：实践方法》一书中，T.E.Creighton编，第1-39页)。为此，在还原条件下加入强变性剂以溶解包涵体形式的蛋白质，然后复性。
只有在很少情况中，借助合适的原核或真核信号序列，将表达的蛋白质输出至细菌周质，由于细菌输出机制的转运能力低，此处通常可能只积累很小量的产物。
然而，细菌胞质与真核细胞胞外空间显著不同。一方面，那里存在还原条件；另一方面，那里没有切除N端前导序列而形成成熟蛋白质的机制。所有胞质蛋白质的合成都是由甲硫氨酸起始的，它是由适当起始密码子(ATG＝翻译起点)确定的。在许多蛋白质中保留了这种N端甲硫氨酸；而在其它蛋白质中，由胞质中存在的宿主内在甲硫氨酸氨肽酶(MAP)切除。切除效率主要取决于两个参数：1.下一个氨基酸的本性，和2.N端在蛋白质三维结构中的定位。当下一个氨基酸是丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、或缬氨酸时，且当N端暴露(即不是“隐藏”在蛋白质内部)时，优选删除N端甲硫氨酸。当下一个氨基酸是其它氨基酸时，特别是带电荷的氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、或精氨酸)，或者当N端位于蛋白质内部时，在大多数情况中，不切除N端甲硫氨酸(Knippers，Rolf，1995，《分子遗传学》，第6版，Georg Thieme Verlag.Stuttgart，纽约，ISBN 3-13-103916-7)。
甚至当第2位氨基酸可促进切割时，切割也很少是完全的。通常会有可观的比例(1-50％)保持不受MAP的影响。
在使用细菌细胞生产重组药用蛋白质的早期，流程只是将编码甲硫氨酸的ATG起始密码子置于成熟(即不含信号序列或其它N端延伸)蛋白质开放读码框(ORF)的前面。表达的蛋白质因而具有序列H2N-Met-靶蛋白。
只有在少数情况中，有可能实现宿主内在MAP完全切除N端甲硫氨酸。因此，以这种方式生成的大多数蛋白质，或是就其N端而言不均一(Met形式与无Met形式的混合物)，或是它们在N端都具有额外的外来氨基酸(Met)(只有Met形式)。
然而，在许多情况中，这种不均一性或不同于天然序列是不能接受的，因为这些产物常常显示不同的免疫学(例如诱导抗体形成)和药理学(半寿期、药代动力学)特性。由于这些原因，现在在大多数情况中有必要生成性质相同的产物(N端均一且不含外来氨基酸)。在胞质表达的情况中，在大多数情况中本发明的补救方法是将特定内肽酶(例如因子Xa、肠激酶、KEX内肽酶、IgA蛋白酶)或氨肽酶(例如二肽基氨肽酶)的切割序列(前导序列)融合在靶蛋白的N端。然而，这就使得在产物的进一步加工(所谓的下游加工)过程中必需进行额外步骤，包括费用和材料的支出。另外，当存在包涵体时，在许多情况中前导序列将干扰甚至完全阻止重折叠。
因此，需要在细菌细胞中以包涵体形式表达的预期异源靶蛋白的生产方法，即由包涵体制备具有统一的预期N端的靶蛋白。在本发明的范围内，已经使用来自瘟病毒的病毒自我蛋白酶Npro开发了用于由包涵体生成预期靶蛋白的这种方法。
瘟病毒形成了在全世界在猪和反刍动物中引起严重经济损失的一组病原体。作为必须申报的传染性疾病的病原体，典型性猪热病毒(classical swine fever virus，CSFV)是特别重要的。由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea virus，BVDV)引起的损失也是可观的，尤其是通过胎儿的子宫内感染的定期发生。
瘟病毒是小型被膜病毒，其大小为12.3kb的基因组直接作为mRNA，在胞质中翻译成病毒基因产物。这是以单一多蛋白的形式进行的，该多蛋白包含大约4000个氨基酸，由病毒和细胞蛋白酶分解成大约12种成熟蛋白质。
至今，已经在瘟病毒中鉴定了2种由病毒编码的蛋白酶，自我蛋白酶Npro和丝氨酸蛋白酶NS3。N端蛋白酶Npro位于多蛋白的N端，表观分子量为23kDal。它催化发生于其自身的C端(Cys168)与核衣壳蛋白C的N端(Ser169)之间的切割(R.Stark等人，病毒学杂志(J.Virol.)67：7088-7095，1993)。另外，已经在致细胞病变的BVDV病毒中描述了Npro基因的重复。在这些重复中，第二个拷贝的Npro位于同样重复的NS3蛋白酶的N端。在这种情况中也观察到Npro-NS3蛋白质的自我蛋白酶解切割(R.Stark等人，见上文)。
Npro是长度为168个氨基酸的自我蛋白酶，表观分子量为大约20,000Dal(体内)。它是瘟病毒(CSFV、BDV(边界病病毒，borderdisease virus)、或BVDV)多蛋白中的第一种蛋白质，并经历自我蛋白酶解切割与后面的核衣壳蛋白C分开(M.Wiskerchen等人，病毒学杂志(J.Virol.)65：4508-4514，1991；Stark等人，病毒学杂志(J.Virol.)67：7088-7095，1993)。该切割发生于Npro序列最后一个氨基酸Cys168的后面。
现在在本发明的范围内令人惊讶的发现，可利用自我蛋白酶Npro的自我蛋白酶解功能，切割在细菌表达系统中以包涵体形式表达且包含瘟病毒自我蛋白酶Npro与异源多肽的融合蛋白而获得异源多肽。这需要由包涵体分离未切割的Npro融合蛋白，溶解，并在重折叠过程中切割。
因此，本发明在一个方面涉及用于重组生产异源多肽的方法，包括：(i)培养用包含编码融合蛋白的核酸分子的表达载体转化的细菌宿主细胞，该融合蛋白包含展示瘟病毒自我蛋白酶Npro的自我蛋白酶解功能的第一种多肽与以能够通过第一种多肽的自我蛋白酶解活性由融合蛋白切割下来的方式连接于第一种多肽C末端的第二种多肽，该第二种多肽是异源多肽，其中培养是在融合蛋白得以表达且相应胞质包涵体得以形成的条件下进行的；(ii)由宿主细胞分离包涵体；(iii)溶解分离的包涵体；(iv)稀释溶解物以产生反应液，在反应液中通过自我蛋白酶解切割融合蛋白获得异源多肽；并(v)分离切割获得的异源多肽。
具有瘟病毒自我蛋白酶Npro的自我蛋白酶解功能的多肽具体是瘟病毒自我蛋白酶Npro或其具有自我蛋白酶解活性的衍生物。
为了本发明的目的，术语“异源多肽”指不是通过瘟病毒自我蛋白酶Npro天然切割天然融合蛋白或多肽获得的多肽。异源多肽的范例是具有制药学(特别是人类制药学)活性的工业酶(工艺酶)或多肽。
具有人类制药学活性的优选多肽的范例是细胞因子，诸如白介素，例如IL-6；干扰素，诸如白细胞干扰素，例如干扰素α2B；生长因子，特别是造血或愈伤生长因子，诸如G-SCF、促红细胞生成素、或IGF；激素，诸如人类生长激素(hGH)；抗体；或疫苗。
在本发明的方法中，瘟病毒优选选自下组：CSFV、BDV、和BVDV，其中特别优选CSFV。
在本发明的方法中，进一步优选的是，融合蛋白的第一种多肽包含CSFV自我蛋白酶Npro的如下氨基酸序列(见EMBL数据库编号X87939)(第1-168位氨基酸，阅读方向N端-C端)(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168)，或其具有自我蛋白酶解活性的衍生物的氨基酸序列。
展示自我蛋白酶Npro自我蛋白酶解活性的多肽还可以是通过诱变，特别是氨基酸替代、删除、添加、和/或插入，由瘟病毒自我蛋白酶Npro产生的衍生物，只要它保留了要求的自我蛋白酶解活性，特别是生成具有均一N端的预期异源多肽即可。熟练技术人员熟悉用于通过诱变生成这种衍生物的方法。通过这种突变，有可能根据待由融合蛋白切割的不同异源多肽优化自我蛋白酶Npro的活性。在生成了用于编码包含预期异源多肽和与天然自我蛋白酶Npro相比展示一处或多处突变的自我蛋白酶Npro衍生物的融合蛋白的核酸之后，通过测定自我蛋白酶解活性确定是否存在要求的功能。
例如，可如下检测自我蛋白酶解活性：首先将分离/纯化的包涵体溶于7M胍/HCl溶液，然后用反应液1∶100稀释；保温大约24小时后，通过SDS-PAGE对反应液检验发生的切割；进行Western印迹来确定已加工与未加工的比例；通过考马斯染色SDS-PAGE凝胶的光密度分析测定经切割物质的比例。
例如，在本发明的一种优选方法中，表达载体包含编码N端区域第2-21位氨基酸中一个或多个氨基酸已删除或替代的融合蛋白的核酸分子，只要产生的衍生物继续展示预期程度的自我蛋白酶Npro的自我蛋白酶解功能即可。为了本发明的目的，融合蛋白中的优选自我蛋白酶Npro衍生物包含，例如，CSFV自我蛋白酶Npro删除了第2-16位或第2-21位氨基酸的氨基酸序列。还有可能通过氨基酸替代或添加来改变或引入氨基酸序列，例如引入帮助纯化的氨基酸序列。
本发明方法特别优选的核酸分子编码其中第一种多肽包含CSFV自我蛋白酶Npro的Glu22-Cys168氨基酸序列或其具有自我蛋白酶解活性的衍生物的融合蛋白，该第一种多肽还具有Met作为N末端，且异源多肽直接连接CSFV自我蛋白酶Npro的氨基酸Cys168。
本发明方法同样优选的核酸分子编码其中第一种多肽包含CSFV自我蛋白酶Npro的Pro17-Cys168氨基酸序列或其具有自我蛋白酶解活性的衍生物的融合蛋白，该第一种多肽还具有Met作为N末端，且异源多肽直接连接CSFV自我蛋白酶Npro的氨基酸Cys168。
在本发明方法中，所述核酸分子具体是DNA分子的形式。
本发明方法采用的表达载体优选包含至少一种表达控制序列。表达控制序列具体是启动子(诸如lac、tac、T3、T7、trp、gac、vhb、λPL、或phoA)、核糖体结合位点(例如属于上述启动子的天然核糖体结合位点、cro、或合成的核糖体结合位点)、或者转录终止子(例如rrnB、T1T2、或bla)。上述宿主细胞优选埃希氏杆菌属(Escherichia)细菌细胞，特别是埃希氏大肠杆菌(E.codi)。然而，也可能使用其它细菌细胞(见下文)。在优选实施方案中，表达载体是质粒。
例如，本发明方法采用的细菌宿主细胞可选自下组微生物：革兰氏阴性细菌，诸如埃希氏杆菌属(Escherichia)物种，例如大肠埃希氏菌(E.coli)，或其它革兰氏阴性细菌，例如假单胞菌属(Pseudomonas)物种，诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，或者柄杆菌属(Caulobacter)物种，诸如新月柄杆菌(C.crescentus)；或者革兰氏阳性细菌，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)物种，特别是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。特别优选大肠杆菌作为宿主细胞。
按照本身已知的微生物学实践，培养细菌宿主细胞，即表达菌株。菌株培养通常由培养基上的单菌落开始，但是也可能采用冷藏的细胞悬浮液(细胞库)。通常以多级方法培养菌株以获得足够生物量用于进一步应用。
对于小规模，可在摇瓶中进行。在大多数情况中有可能采用复合培养基(例如LB肉汤)，但是也可能使用确定成分培养基(例如柠檬酸(盐)培养基)。对于培养，首先进行宿主菌株的小体积预培养(接种单菌落或来自冷冻培养物的细胞悬浮液)，预培养的温度通常对后来的表达结果一般不重要，因此通常可能在较高温度(例如30℃或37℃)进行预培养。然后建立大体积的主培养物(例如500mL)，其中特别需要确保良好的通气(与内容物体积相当的大体积烧瓶，高速旋转)。既然意欲以不溶性包涵体的形式进行表达，那么在大多数情况中将在较高温度(例如30℃或37℃)进行主培养。诱导系统特别适用于生成包涵体(例如trp、lac、tac、或phoA启动子)。在到达晚期对数期后(通常摇瓶中的光密度达到0.5-1.0)，在这些情况中加入诱导物(例如吲哚丙烯酸、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷＝IPTG)，并继续保温1-5小时。在此期间，大部分Npro融合蛋白以包涵体的形式沉淀在细菌胞质中。收获产生的细胞，并进一步处理。
对于大规模，多级系统包括多个生物反应器(发酵罐)，在这种情况中，优选采用确定成分培养基，从而能够改进对该方法的加工工程控制。另外，极有可能通过量入特定养分(分批培养)来提高生物量和产物形成。在其它方面，该方法与摇瓶类似。例如，使用预备阶段发酵罐和主要阶段发酵罐，并与摇瓶相似的选择培养温度。预备阶段发酵罐接种所谓的种菌(inoculum)，通常通过在摇瓶中培养单菌落或冷冻培养物获得。在发酵罐中还必须确保良好的通气和足够的诱导物浓度--尤其在主要阶段。然而，在有些情况中，诱导期显著比摇瓶法中长。再一次交付产生的细胞用于进一步处理。
在本发明方法中，以已知方式由宿主细胞分离包涵体，例如，如下列参考文献所述：R.Rudolph等人，在《蛋白质功能，实践方法》一书中，T.E.Creighton编，IRL出版社，第1-39页，1996；R.Rudolph，在《蛋白质和核酸研究的现代化方法》一书中，H.Tschesche编，DeGruyter，柏林，第149-171页，1990；R.Rudolph，在《蛋白质工程：原理和实践》一书中，J.L.Cleland和C.S.Craik编，Wiley-Liss公司，第283-298页，1995。
例如，在进行发酵之后，通过离心收获细胞。例如通过高压破碎或通过低转速简单离心破坏细胞后，可获得其中存在的包涵体。然后通过在多种缓冲液(例如存在NaCl(例如0.5-1.0M)和/或去污剂(例如屈立通X-100))中多次重悬包涵体，可改进期望靶蛋白的纯度。这通常能够除去包涵体中的大部分外来蛋白质。残余的任何外来蛋白质通常不干扰自我蛋白酶解切割。
通常通过将包涵体溶于例如含胍缓冲液(例如0.1M Tris-HCl、6.0M胍-HCl、5mM EDTA、50mM DTT)来进行溶解(例如见R.Rudolph等人，1996；R.Rudolph，1990；R.Rudolph，1995；同上)。例如通过离心除去不溶物后，可对上清液进行蛋白质测定。
通过在切割缓冲液中稀释溶解物(例如1mL溶解物+99mL切割缓冲液)形成反应液(见R.Rudolph，1996，同上)，由此实现通过自我蛋白酶解切割融合蛋白获得异源多肽。所述切割缓冲液例如是含Tris的切割缓冲液，优选浓度0.8-1.0M；或者含精氨酸的切割缓冲液，优选浓度0.4-0.6M精氨酸；于例如中性pH，优选pH7.0-7.5；于例如低于30℃的温度，优选10-20℃进行。随后将切割液保温特定时间，例如12小时，并通过SDS-PAGE分析Npro的切割程度。
在优选的实施方案中，在含精氨酸的缓冲液中稀释溶解物，使精氨酸的终浓度高达1.0M，优选0.4-0.6M。或者，也可能通过在含精氨酸的适当切割缓冲液中透析溶解后的包涵体来进行稀释。
切割反应液的温度是例如0-30℃之间，优选10-20℃。
反应液的pH是例如5.0-9.0，优选pH7.0-8.0，特别是pH7.0-7.5。
根据需要，反应液可包含浓度为0.5-100mM，优选大约5.5mM的DTT。
在切割过程中，反应液中的蛋白质浓度可以是例如20-150μg/mL范围，优选低于40μg/mL
在切割过程中，反应液可含Tris-HCl的浓度是例如高达1.0M，优选0.8-1.0M之间。
其它缓冲系统也可能取代含精氨酸缓冲液和/或含Tris-HCl缓冲液。
在特别优选的实施方案中，切割缓冲液的pH是7.0-7.5，切割过程中的温度是10-20℃，蛋白质浓度不超过40-50μg/mL，且切割缓冲液中包含大约5mM DTT作为还原剂。
最后，以本身已知的方式分离已经由融合蛋白切割获得的异源多肽(例如见M.P.Deutscher，在《酶学方法：蛋白质纯化指南》，Academic出版公司，第309-392页，1990)。
                        实施例
下列实施例举例说明本发明，绝非限制其范围。实施例1：Npro-hGH(人生长激素)的表达和体外切割
通过在表达系统(载体p160TP1和宿主W3110)的大肠杆菌中异源表达生成融合蛋白。该系统中用于构建载体的所有元件都来源于大肠杆菌基因组。
p160TP1是由pBR322衍生的载体，其中的表达受到删除了衰减子(attenuator)的经修饰大肠杆菌trp启动子的控制。以来自相同操纵子的衰减子肽的Shine-Dalgarno序列作为核糖体结合位点(RBS)。来自大肠杆菌rrnB基因的双重终止子T1T2，与构建物中保留的bla基因终止子一起，确保了转录的有效终止。以逆时针方向(即与四环素抗性基因的取向相反)将表达盒插入pBR322的EcoRI切割位点(作为起点)。将β-内酰胺酶基因(bla)与启动子一起删除。通过第3506位XbaI切割位点引入待表达异源蛋白的结构基因(通常是切割至合适大小的PCR片段)。
以表达质粒NPH-pET作为Npro-hGH结构基因的来源。该质粒包含已知的表达载体pET11a(F.W.Studier等人，酶学方法(MethodsEnzymol.)185：60-89，1990)。首先，将包含Npro与CSFV核衣壳蛋白的融合蛋白克隆到表达载体中。这使得用长10个氨基酸的寡组氨酸纯化标签(MASHHHHHHH)取代天然Npro序列的前16个氨基酸(MELNHFELLYKTSKQK)。通过靶向诱变在产生的表达质粒中在Npro与核衣壳蛋白的接合处引入SpeI切割位点。这使之有可能通过SpeI(位于5’端)和XhoI(位于3’端)的限制性消化由载体删除核衣壳蛋白的结构基因。通过制备性凝胶电泳将相应的线性化Npro-pET11a载体与核衣壳蛋白基因片段分开。然后才有可能通过SpeI和XhoI的“粘性”末端引入hGH结构基因。
为此，在hGH基因上进行的下列制备性工作是必需的。使用高精度PCR(例如Roche Biochemicals的Pwo聚合酶，如制造商所述进行操作)，由人脑cDNA库(Clontech)扩增结构基因。为此采用下列寡核苷酸：寡核苷酸1(N端)：5′-ATAATTACTA GTTGTTTCCC AACCATTCCC TTATCCAGGC C-3′寡核苷酸2(C端)：5′-ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTAGAAGCCA CAGCTGCCCT CCAC-3′
通过所用寡核苷酸，在5’端引入SpeI切割位点，在3’端引入XhoI切割位点。另外，在结构基因的末端引入双重ochre终止密码子(TAATAA)，以确保翻译的有效终止。前端的SpeI切割位点使得能够以相同读码框连接上述Npro-pET11a载体。后端的XhoI切割位点使得能够进行定向克隆。以这种方式生成的质粒称为NPH-pET。
如上所述，以该质粒NPH-pET作为Npro-hGH融合蛋白结构基因的来源。为此，以用XhoI线性化的质粒NPH-pET作为模板，再一次用Pwo聚合酶进行高精度PCR。使用下列引物生成可克隆的片段：结构基因的前端(对应于蛋白质的N端)：5′-AGGGTA TCTA  GAATTCTATG CCAGTGGGAG TGGAGGAACC G-3′结构基因的后端(对应于蛋白质的C端)：
5′-AGAATTAAGC T TCTAGATTA TTAGAAGCCA CAGCTGCCCT CCAC-3′
下划线显示了随后用于克隆(前端和后端)的XbaI切割位点，而较大的字母显示了起始密码子(ATG)和终止密码子(TAATAA)。
使用这两种寡核苷酸扩增包含融合蛋白(FP)开放读码框(ORF)的结构基因，其中完全删除了His7纯化标签和前面的氨基酸(除了翻译起始必需的甲硫氨酸)。
下文描述了包含Npro-hGH融合蛋白开放读码框的PCR片段(1072bp)的序列。粗体显示了起始密码子和两个终止密码子，而下划线显示了用于克隆的XbaI切割位点。5′-缺序列(见第13页)-3’
5′-AGGGTA TCTAGAATTCTATGCCAGTGGGAGTGGAGGAACCGGTGTATGACACCGCGGGGAGACC
ACTATTTGGGAACCCAAGTGAGGTACACCCACAATCAACGCTGAAGCTGCCACACGACAGGGGGAGA
GGAGATATCAGAACAACACTGAGGGACCTACCCAGGAAAGGTGACTGTAGGAGTGGCAACCATCTAG
GCCCGGTTAGTGGGATATACATAAAGCCCGGCCCTGTCTACTATCAGGACTACACGGGCCCAGTCTA
TCACAGAGCTCCTTTAGAGTTCTTTGATGAGGCCCAGTTCTGCGAGGTGACTAAGAGAATAGGCAGG
GTCACGGGTAGTGATGGTAAGCTTTACCACATATATGTGTGCGTCGATGGTTGCATACTGCTGAAAT
TAGCCAAAAGGGGCACACCCAGAACCCTAAAGTGGATTAGGAACTTCACCAACTGTCCATTATGGGT
AACTAGTTGTTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCCTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCGT
CTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGAAGAAGCCTATATCCCAAAGGAACAGAAGT
ATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCGACACCCTCCAACAG
GGAGGAAACACAACAGAAATCCAACCTAGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGG
CTGGAGCCCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCA
ACGTCTATGACCTCCTAAAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGAGGCTGGAAGATGG
CAGCCCCCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGAT
GACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACAT
TCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAA TAATCTAGAAGCTTAAT
TCT-3′
由此，ORF编码下文显示的融合蛋白，第2位脯氨酸对应于天然Npro蛋白质的第17位脯氨酸。Npro-hGH融合蛋白的序列(344个氨基酸，其中Npro占153个，hGH占191个)如下(阅读方向：N端-C端)，其中斜体显示了来自天然Npro序列的第17位脯氨酸(融合蛋白的第2位)，而粗体显示了hGH序列：MPVGVEEPVYDTAGRPKFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCFPTIPLSRPFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
还原态融合蛋白的分子量为39316.92Dal，而在可能的切割后，Npro部分(还原型)的分子量应为17220.02Dal，hGH部分(还原型)的分子量应为22114.88Dal。Npro含6个半胱氨酸，hGH含4个半胱氨酸。在细菌胞质中，这些半胱氨酸中的大部分可能是还原形式的。在随后的加工过程中，大概至少部分形成二硫键。肯定希望融合蛋白(或Npro部分)的N端甲硫氨酸大部分被宿主内在甲硫氨酸氨肽酶(MAP)切除，这将降低分子量，其中融合蛋白和Npro降低131Dal，分别至39186Dal和至17089Dal。
将含上述融合蛋白结构基因的PCR片段纯化，并用XbaI切割，将两端切割产物与靶片段分开。将该片段连接所述表达载体p160TP1。
为此，首先用XbaI将载体线性化，然后用小牛肠磷酸酶(CIP)5’-去磷酸化。使用T4 DNA连接酶进行连接。通过电穿孔将连接后的DNA导入大肠杆菌K-12 DH10B，并涂布于含15mg/L四环素的Luria肉汤(LB)琼脂平板上。由这种转化产生大量的克隆菌落。由几个克隆分离质粒DNA，并通过限制性分析检验是否存在大小和取向正确的插入片段。选择一个克隆，通过限制性分析和DNA测序进行详细鉴定。质粒在所有调查中的情况都与计算一致。该质粒称为pNPH1，并用于随后的工作。
下文显示了Npro-hGH表达质粒pNPH1(4840bp)的序列。下划线显示了Npro-hGH融合蛋白的起始密码子和终止密码子。开放读码框的方向与这种显示形式相反。5′-GAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCCCCATGAACAGAAATTCCCCCTTACACGGAGGCATCAAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAA TCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCTCGAGGCCATCCGTCAGGATGGCCTTCTGCTTAATTTGATGCCTGGCAGTTTATGGCGGGCGTCCTGCCCGCCACCCTCCGGGCCGTTGCTTCGCAACGTTCAAATCCGCTCCCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTCTAGA TTATTAGAAGCCACAGCTGCCCTCCACAGAGCGGCACTGCACGATGCGCAGGAATGTCTCGACCTTGTCCATGTCCTTCCTGAAGCAGTAGAGCAGCCCGTAGTTCTTGAGTAGTGCGTCATCGTTGTGTGAGTTTGTGTCGAACTTGCTGTAGGTCTGCTTGAAGATCTGCCCAGTCCGGGGGCTGCCATCTTCCAGCCTCCCCATCAGCGTTTGGATGCCTTCCTCTAGGTCCTTTAGGAGGTCATAGACGTTGCTGTCAGAGGCGCCGTACACCAGGCTGTTGGCGAAGACACTCCTGAGGAACTGCACGGGCTCCAGCCACGACTGGATGAGCAGCAGGGAGATGCGGAGCAGCTCTAGGTTGGATTTCTGTTGTGTTTCCTCCCTGTTGGAGGGTGTCGGAATAGACTCTGAGAAACAGAGGGAGGTCTGGGGGTTCTGCAGGAATGAATACTTCTGTTCCTTTGGGATATAGGCTTCTTCAAACTCCTGGTAGGTGTCAAAGGCCAGCTGGTGCAGACGATGGGCGCGGAGCATAGCGTTGTCAAAAGGCCTGGATAAGGGAATGGTTGGGAAACAACTAGTTACCCATAATGGACAGTTGGTGAAGTTCCTAATCCACTTTAGGGTTCTGGGTGTGCCCCTTTTGGCTAATTTCAGCAGTATGCAACCATCGACGCACACATATATGTGGTAAAGCTTACCATCACTACCCGTGACCCTGCCTATTCTCTTAGTCACCTCGCAGAACTGGGCCTCATCAAAGAACTCTAAAGGAGCTCTGTGATAGACTGGGCCCGTGTAGTCCTGATAGTAGACAGGGCCGGGCTTTATGTATATCCCACTAACCGGGCCTAGATGGTTGCCACTCCTACAGTCACCTTTCCTGGGTAGGTCCCTCAGTGTTGTTCTGATATCTCCTCTCCCCCTGTCGTGTGGCAGCTTCAGCGTTGATTGTGGGTGTACCTCACTTGGGTTCCCAAATAGTGGTCTCCCCGCGGTGTCATACACCGGTTCCTCCACTCCCACTGG CATAGAATTCTAGATACCCTTTTTACGTGAACTTGCGTACTAGTTAACTAGTTCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATATTTGCCAGAACCGTTATGATGTCGGCGCAAAAAACATTATCCAGAACGGGAGTGCGCCTTGAGCGACACGAATTATGCAGTGATTTACGACCTGCACAGCCATACCACAGCTTCCGATTGGCTGCCTGACGCCAGAAGCATTGGTGCACCGTGCAGTCGAGATGCGCGTCGGCACCCTGGCGATCACCGACCATGACACCACAGCAT-3′
根据生产力和生物安全性的考虑，选择用于表达Npro-hGH融合蛋白的大肠杆菌宿主菌株。大肠杆菌K-12是大肠杆菌物种中最详细表征的株系(B.J.Bachmann，在《埃希氏大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌：细胞和分子生物学》一书中，J.L.Ingraham等人编，美国微生物学学会，华盛顿特区，第1191-1219页，1987a；B.J.Bachmann，1987b；J.Barbara，1987b，大肠杆菌K-12的连锁图，第7版，在《埃希氏大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌》一书中，第2卷，F.C.Neidhard编，美国微生物学学会，华盛顿特区，第807-876页，1987b；K.F.Jensen，细菌学杂志(J.Bacteriol.)175：3401-3407，1993)，而且通常认为其代表性菌株是安全的。
大肠杆菌K-12 W3110(ATCC 27325)是原养型衍生物，非常接近大肠杆菌K-12的野生型，常常作为宿主菌株用于表达异源蛋白。它已经保藏于美国典型培养物收藏中心(ATCC)，基因型如下：[F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)1λ-]
该菌株可由ATCC购买。它在不含复合氮源的完全合成培养基上生长极好，而且对它进行的加工工程控制有可能非常有效。
通过将上述表达质粒pNPH1转化到W3110中，生成了表达菌株W3110[pNPH1]。通过电穿孔进行转化，以10％甘油作为悬浮介质。混合1μL(50ng)pNPH1水溶液与30μL W3110细胞悬浮液，并在1mm电击杯(Eppendorf Electroporator 2510)中暴露于1800V脉冲。将细胞重悬于SOC培养基，于37℃振摇培养1小时，然后涂布于含15mg/L四环素的Luria肉汤琼脂平板上。于37℃保温(过夜)后，由这种转化产生大量的克隆。
挑取具有清楚边缘的中等大小菌落，形成表达菌株W3110[pNPH1]的基础。培养克隆并在冷冻管中保存于-80℃(原种细胞库MCB)。对于日常使用，将菌株在LB-四环素琼脂平板上划线。
由来自琼脂平板上的单菌落传代培养菌株W3110[pNPH1]，并用于接种预培养物Luria肉汤+15mg/L四环素(200mL，装在1L带挡板摇瓶中)。将预培养物以250rpm于30℃振摇14小时，在此过程中，OD600达到大约1.0。然后将10mL预培养物用于接种主培养物(在每种情况中，1L带挡板摇瓶中装有330mL柠檬酸培养基)(3％接种量)。将主培养物以250rpm于37℃培养至OD600达到0.8，然后加入吲哚丙烯酸(原液5mg/mL溶于100％分析级EtOH)至终浓度50μg/mL培养液来诱导融合蛋白的生成。将培养物以250rpm于37℃再培养4小时，在此过程中，OD600达到大约1.5-3.0。
将培养物转移至无菌的500mL离心瓶中，并以10,000g离心30分钟。完全弃去离心上清液，并将沉淀冻存于-80℃直至进一步处理。
然后将大约12g(湿重)BL12 I(DE3)细胞沉淀悬浮于30mL 50mMTris-HCl、5mM苯甲脒(pH8.0)，并使用Ultraturrax匀浆。加入0.5mMEDTA和0.1％(w/v)溶菌酶后，将细胞悬浮液在冰浴中保温30分钟。随后进行超声波处理(20秒7次，各间隔20秒)以完全破坏细胞。然后加入10mM MgCl2和0.006％(w/v)DNA酶到破坏的悬浮液中，并于4℃保温30分钟。随后通过离心(JA 20；7700g)分离不溶组分与可溶组分。将沉淀悬浮于40mL 50mM Tris-HCl、5mM苯甲脒、5mM EDTA(pH8.0)，并再次离心(JA 20；7700g)。将该步骤再重复2次，并将产生的沉淀悬浮于40mL 20mM Tris-HCl(pH7.0)。向悬浮液中加入20mL 1.5M NaCl、60mM EDTA(pH7.0)，并在冰浴中保温30分钟。最后再次离心(JA 20；7700g)，并用H2O清洗。产生的沉淀代表Npro-hGH包涵体物质。
通常随后将大约100mg包涵体物质悬浮于2mL 6.0M盐酸胍、0.1MTris、5mM EDTA、50mM DTT(pH9.0)，于室温放置30分钟。随后通过离心(30000g 10分钟)除去不溶组分。对该上清液进行蛋白质测定(蛋白质浓度大约20mg/mL)。以这种方式产生的溶解物，或是立即用于切割测试，或是保存于-20℃(最多7天)。实施例2：在多种条件下切割包涵体融合蛋白
通过在切割缓冲液中1∶100(或更大)稀释溶解物(盐酸胍的残余浓度≤0.06M)，原则上有可能切除Npro部分。在此过程中，蛋白质浓度通常是20μg/mL(下文指出了例外情况)。
还有可能通过在切割缓冲液中(1∶100)透析溶解物质来切除Npro部分。
可通过SDS-PAGE检测切割产物来测量Npro部分的切除程度。这需要在SDS-PAGE后对聚丙烯酰胺凝胶拍照，并测量适当条带的强度。通过预备测试中的Western印迹鉴定适当条带。实施例2.1-精氨酸对Npro-hGH的体外切割
通过在切割缓冲液(20mM Tris-HCl、2mM EDTA、5mM DTT、特定的精氨酸浓度，pH7.0，室温)中稀释(1∶100)溶解物来进行切割。切割混合物中的蛋白质浓度是20μg/mL。24小时后通过SDS-PAGE检测切割产物来测量切除程度。
发现，通过在切割缓冲液中加入精氨酸可显著提高Npro切除效率。最大切除发生于精氨酸浓度0.4-0.6M。实施例2.2-于各种温度通过精氨酸由Npro-hGH切除Npro
通过在切割缓冲液(20mM Tris-HCl、2mM EDTA、5mM DTT、0-1.0M精氨酸，pH7.0，特定温度)中稀释(1∶100)溶解物来进行切割。切割混合物中的蛋白质浓度是20μg/ml。24小时后通过SDS-PAGE检测切割产物来测量切除程度。
发现，最大切除发生于温度10-20℃之间。实施例2.3-于各种温度由Npro-hGH切除Npro的程度作为pH的函数
通过在切割缓冲液(20mM Tris-HCl、2mM EDTA、5mM DTT、0.5M精氨酸，特定pH)中稀释(1∶100)溶解物来进行切割。切割混合物中的蛋白质浓度是20μg/ml。24小时后通过SDS-PAGE检测切割产物来测量切除程度。
切割缓冲液中pH的系统变化为pH5.0-9.0。在采用的精氨酸浓度，用于切割Npro融合蛋白的最佳pH为pH7.0-7.5。实施例2.4-于各种DTT浓度由Npro-hGH切除Npro
调查了切除效率对DTT浓度的依赖性。
通过在切割缓冲液(20mM Tris-HCl、2mM EDTA、0-100mM DTT、0.5M精氨酸，pH7.0，15℃)中稀释(1∶100)溶解物来进行切割。由于溶解物中的DTT浓度，含“0mM DTT”的混合物仍含0.5mM DTT。切割混合物中的蛋白质浓度是20μg/ml。24小时后通过SDS-PAGE检测切割产物来测量切除程度。
Npro部分的最大切除是在大约5.5mM DTT达到的。实施例2.5-用于Npro-hGH切割的溶解物的pH变化
通过在切割缓冲液(20mM Tris-HCl、2mM EDTA、5mM DTT、0-0.8M精氨酸，pH7.0，15℃)中稀释(1∶100)各种pH值(pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0)的溶解物来进行切割。在与包涵体混合前，通过滴定溶解缓冲液将pH值调至适当pH值。切割混合物中的蛋白质浓度是20μg/mL。24小时后通过SDS-PAGE检测切割产物来测量切除程度。
发现，溶解物的最佳pH是7.0-8.0。实施例2.6-由Npro-hGH切除Npro的动力学
通过在20mM Tris-HCl、2mM EDTA、10mM DTT、0.5M精氨酸，pH7.0，15℃中进行稀释(1∶100)来起始变性Npro-hGH的再激活。
发现，在大约24小时后达到切割终点。实施例2.7-通过稀释至各种蛋白质浓度由Npro-hGH切除Npro
通过在切割缓冲液(20mM Tris-HCl、2mM EDTA、10mM DTT、0.5M精氨酸，pH7.0，于15℃)中稀释(1∶100)溶解物来进行切割。24小时后通过SDS-PAGE检测切割产物来测定是否发生切割。
发现，蛋白质浓度≥40μg/mL导致切割效率显著下降。进一步测试发现，最佳蛋白质浓度是20-40μg/ml。实施例2.8-通过透析由Npro-hGH切除Npro作为蛋白质浓度的函数
通过在20mM Tris-HCl、2mM EDTA、10mM DTT、0.5M精氨酸，pH7.0，4℃中进行透析，由溶解的Npro-hGH包涵体物质除去盐酸胍，由此起始切割。大约24小时后通过SDS-PAGE分析已发生的Npro切除。发现，通过稀释和透析溶解物都能够切除Npro部分。实施例2.9-由Npro-hGH切除Npro的效率作为Tris-HCl浓度的函数
通过在切割缓冲液(0.1-1.0M Tris-HCl、2mM EDTA、20mM DTT，pH7.0，15℃)中稀释(1∶100)溶解物来进行切割。大约24小时后通过SDS-PAGE检测切割产物来检查切除情况。
发现，将缓冲液中的Tris-HCl浓度升高至0.8M，可改进Npro融合蛋白的切割效率。进一步升高浓度不引起可测量的Npro切除效率提高。
因此，优选在Tris-HCl浓度0.8-1.0M进行反应。实施例3：Npro-pGH(猪生长激素)的表达和体外切割
Npro-pGH表达载体的生成由pNPH1(见实施例1)开始。用BglII将质粒线性化，并通过PCR扩增。这需要用Pwo聚合酶和不含5’-磷酸的引物对扩增不含hGH结构基因(由Phe1的密码子至Phe191的密码子)区域的完整质粒。以纯化后的PCR片段作为载体，连接pGH结构基因。5’-磷酸的消除(例如使用小牛肠磷酸酶、北极虾碱性磷酸酶)防止了通过自身连接而环化。
同样通过PCR扩增生成pGH结构基因。所用模板是猪cDNA库(例如来自Clontech的猪肝5’-片段cDNA文库或者猪脑或垂体cDNA库)。使用下文引物对进行扩增，而且在每一种情况中在合成过程中提供5’-磷酸：结构基因的前端(对应于蛋白质的N端)(Phe1至Ser7)：5′-TTC CCA GCC ATG CCC TTG TCC-3′结构基因的后端(对应于蛋白质的C端)(Phe190-Val184)：5′-GAA GGC ACA GCT GCT CTC CAC-3′
PCR片段只含成熟pGH的ORF(结构基因)。连接(T4 DNA连接酶)产生Npro-pGH的ORF，与pNPH1类似。该ORF编码下文描述的融合蛋白。通过电穿孔将连接后的DNA导入大肠杆菌K-12 DH10B(由LifeTechnologies供应的电击感受态细胞，大肠杆菌K-12的基因型如下：[F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZ ΔM15 ΔlacX74 deoRrecA1 endA1 araD139Δ(ara，leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG])，并涂布于含15mg/L四环素的Luria肉汤(LB)琼脂平板上。由这种转化产生大量的克隆菌落。由几个克隆分离质粒DNA，并通过限制性分析检验是否存在大小和取向正确的插入片段。选择一个克隆，通过限制性分析和DNA测序进行详细鉴定。质粒在所有调查中的表现都与计算一致。该质粒称为pNPP1，并用于随后的工作。
在下文Npro-pGH融合蛋白的氨基酸序列(阅读方向：N端-C端)(342个氨基酸，其中Npro占153个，pGH占189个)中，斜体显示了融合蛋白第2位脯氨酸，对应于天然Npro序列第17位脯氨酸，而粗体显示了pGH序列。MPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQNAQAAFCFSETIPAPTGKDEAQQRSVELLRFSLLLIQSWLGPVQFLSRVFTNSLVFGTSDRVYEKLKDLEEGIQALMRELEDGSPRAGQILKQTYDKFDTNLRSDDALLKNYGLLSCFKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF
还原态融合蛋白的分子量为38819.82Dal，而在可能的切割后，Npro部分(还原型)的分子量应为17220.02Dal，pGH部分(还原型)的分子量应为21617.79Dal。Npro含6个半胱氨酸，hGH含4个半胱氨酸。在细菌胞质中，这些半胱氨酸中的大部分可能是还原形式的。在随后的加工过程中，大概至少部分形成二硫键。肯定希望融合蛋白(或Npro部分)的N端甲硫氨酸大部分被宿主内在甲硫氨酸氨肽酶(MAP)切除，这将降低分子量，融合蛋白和Npro分别降低131Dal至38689Dal和17089Dal。
如实施例1所述，通过将表达质粒pNPP1转化(电穿孔)到大肠杆菌K-12 W3110中，生成了表达菌株W3110[pNPP1]。在这种情况中同样的，甚至详细鉴定也没有揭示与预期限制性模式存在偏差。
由转化平板挑取具有清楚边缘的中等大小菌落，形成表达菌株W3110[pNPP1]的基础。培养克隆并于冷冻管中保存于-80℃(原种细胞库MCB)。对于日常使用，将菌株在LB-四环素琼脂平板上划线。
如实施例1关于Npro-hGH融合蛋白所述，进行Npro-pGH融合蛋白的表达。
如实施例1关于Npro-hGH融合蛋白所述，进行Npro-pGH包涵体的制备。实施例4：在体外由Npro-pGH切除Npro
如上文关于Npro-hGH所述，对Npro-pGH融合蛋白进行相应的溶解和复性测试。在变化上述参数(见上文)之后发现，在Npro-pGH融合蛋白的情况中，在溶解和复性后也可能在体外切除Npro部分。

Claims (9)

1.用于重组生产异源多肽的方法，包括：
(i)培养用包含编码融合蛋白的核酸分子的表达载体转化的细菌宿主细胞，所述融合蛋白包含展示瘟病毒自我蛋白酶Npro自我蛋白酶解功能的第一种多肽与以能够通过第一种多肽的自我蛋白酶解活性由融合蛋白切割下来的方式连接于第一种多肽C末端的第二种多肽，该第二种多肽是异源多肽，其中培养是在融合蛋白得以表达且相应胞质包涵体得以形成的条件下进行的；
(ii)由宿主细胞分离包涵体；
(iii)溶解分离的包涵体；
(iv)稀释溶解物以产生反应液，其中在反应液中通过自我蛋白酶解切割融合蛋白获得异源多肽；并
(v)分离切割后的异源多肽。
2.权利要求1的方法，其中瘟病毒选自下组：CSFV、BDV、和BVDV。
3.权利要求2的方法，其中瘟病毒是CSFV。
4.权利要求3的方法，其中第一种多肽包含如下氨基酸序列(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168)，
或其具有自我蛋白酶解活性的衍生物的氨基酸序列。
5.权利要求3的方法，其中第一种多肽包含CSFV自我蛋白酶Npro的Glu22-Cys168氨基酸序列或其具有自我蛋白酶解活性的衍生物，其中第一种多肽以Met作为N末端，且异源多肽直接连接CSFV自我蛋白酶Npro的氨基酸Cys168。
6.权利要求3的方法，其中第一种多肽包含CSFV自我蛋白酶Npro的Pro17-Cys168氨基酸序列或其具有自我蛋白酶解活性的衍生物，其中第一种多肽以Met作为N末端，且异源多肽直接连接CSFV自我蛋白酶Npro的氨基酸Cys168。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中核酸分子是DNA分子。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中表达载体是质粒。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中细菌宿主细胞是大肠杆菌细胞。
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