CN103333252A

CN103333252A - 通过融合蛋白的自我蛋白剪切制备重组蛋白

Info

Publication number: CN103333252A
Application number: CN2013102335999A
Authority: CN
Inventors: A·容鲍尔; R·哈恩; A·车理丝尼格; W·卡尔
Original assignee: Boehringer Ingelheim Austria GmbH; Sandoz AG
Current assignee: Boehringer Ingelheim RCV GmbH and Co KG; Sandoz AG
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-25
Publication date: 2013-10-02
Also published as: JP2008538897A; US20090203069A1; PT1874825E; US20100062490A1; JP2008539171A; EP1874932A2; WO2006113958A2; AU2006239721B2; EP1874933B1; ES2342100T3; KR101374149B1; WO2006113958A3; ATE461936T1; CA2605145A1; US8163890B2; AU2006239721A1; WO2006113957A3; WO2006113957A8; US7829319B2; ES2399031T3

Abstract

本发明涉及通过融合蛋白的自我蛋白剪切制备重组蛋白。具体而言，本发明涉及一种使用包含有感兴趣的多肽且N端为具有自我蛋白水解功能的多肽的融合多肽来制备具有同源N端的感兴趣的异源多肽的方法，这种方法包括以下三个步骤：a)使用亲和色谱体系将融合多肽以可熔的、自我蛋白水解功能失活的形态固定起来，b）再折叠融合多肽，以便激活融合多肽的自我蛋白水解功能并使感兴趣的异源多肽剪切，c)最后洗脱感兴趣的异源多肽，上述三个步骤都在亲和色谱体系中进行。

Description

通过融合蛋白的自我蛋白剪切制备重组蛋白

本申请是申请号为200680014323.X，申请日为2006年4月25日，发明名称为“通过融合蛋白的自我蛋白剪切制备重组蛋白”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种制备具有特定同源N端的所需要的异源重组多肽（heterologous recombinant polypeptide）的方法。本发明将色谱体系与融合多肽结合起来，该融合多肽包括所需要的多肽（polypeptide of interest）以及一个附加部分，即具有自我蛋白水解功能的第二多肽，该多肽与所需要的多肽的N端相连。所述的色谱体系形成本发明的一部分，当融合多肽被固定在色谱体系中时，该体系使融合多肽N端的自我蛋白水解功能激活。融合多肽的固定，再折叠以及剪切都在同一个色谱体系中进行，之后，从该色谱体系中分离出纯化形式的所需要的多肽。

背景技术

大多数所需要的多肽，例如源于真核细胞的医药用途蛋白，由于其具有高表达速度（expression rate）及高产量（yields），所以其制备通常在细菌细胞中进行。然而，在细菌细胞中合成多肽的机制与在真核细胞中合成多肽的机制不同；通常，细菌细胞中表达的多肽在N端都具有一个附加的外来氨基酸，或者其N端为不同源的（inhomogenous），虽然附加的氨基酸可以剪切，但是大多数情况下此剪切并不完全。

然而，尤其在医药领域，上述不同源性（inhomogeneity）是不受欢迎的，因为这些多肽与天然多肽所呈现的性质并不相同，例如，抗体形成的诱导、半衰期、药代动力学等等。当天然的蛋白衍生的N端，和/或N端不同源则N端会出现不可接受的特性。制备用药多肽时，大部分情况下要求生产一种与天然相同的产品，其与正确的N端同源，，并且没有附加氨基酸。已知的方法是在多肽制备过程中增加一些附加的步骤，借此试图达到上述要求，但是这种方法耗费了更多的财力和材料，而且把所谓的生产下游工艺变的相当复杂。

在细菌细胞中制备具有特定同源N端的多肽的已知的方法中所使用的融合多肽包含有所需要的多肽，且其N端连接一个具有自我蛋白水解活性的多肽，具有自我蛋白水解活性的多肽优选瘟病毒的N^pro自我蛋白酶。通过融合多肽的自我水解活性可以剪切出感兴趣的、具有同源N端的多肽。

如果在细菌细胞的细胞质中制备多肽，在一定的条件下，多肽的生产率大于其折叠动力学（folding kinetics）。因此会形成高浓度的多肽聚集体（aggregates），该聚集体以包涵体的形式堆积在细胞质中。在工业生产水平中，人们对上述这种以包涵体形式制备多肽的方式非常感兴趣，因为所表达在包涵体中的多肽的含量很大，纯度也很高。另外，细胞中的包涵体缺乏蛋白酶，所以储存在包涵体中的多肽也可以得到保护。此外，包涵体非常易于离析。然而，以细胞质包涵体形式制备多肽的主要缺点是，包涵体溶解性很低，并且必须进行多肽的再折叠。

因此，尤其当要求正确的再折叠以得到具备生物活性的感兴趣的多肽时，包涵体的处理就变得非常复杂。尽管利用上述融合多肽的自我蛋白水解活性可以制备出具有同源N端的多肽，但是所需产物的纯化工艺依然非常冗长，尤其是当其以细胞质包涵体的形式表达时。处理工艺包括大量清洗（washing），再折叠，剪切，纯化以及分离等步骤。

因此，要快速、低成本的制备多肽，复杂的下游工艺将会是一个巨大的挑战。工业生产中这种情况更为迫切。因此，寻找一种简单可行的生产并纯化多肽的工艺迫在眉睫。

发明内容

在本发明中，人们惊奇的发现，通过将特殊的亲和色谱方法与具有自我蛋白水解活性的融合多肽体系结合可以极大的便利例如，从包涵体中获得所需的异源多肽的制备方法。因此，该制备方法可以通过一种色谱体系的协助得以进行。

首先制备融合多肽。融合多肽包含具有自我蛋白水解功能的多肽，优选为自我蛋白酶的自我蛋白水解功能，更优选为瘟病毒属（Pestivirus）的N^pro自我蛋白酶及其衍生物的自我蛋白水解功能。多肽的C端具有自我蛋白水解功能，上述融合多肽还包含所需的异源多肽。

融合多肽是在抑制其N端自我蛋白水解活性的环境下在宿主细胞中制备的。特别以细胞质包涵体的变性形态（denatured form）制备融合多肽。从细胞中将这些包涵体离析出来并使其在保持自我蛋白水解活性失活的环境下溶解。融合蛋白选择性地固定在色谱体系中，特别是可以保持融合多肽N端失活及变性状态的色谱柱中。

一旦融合多肽被固定在色谱体系中，必要的话，未固定的杂质成分将被清洗出来。

当只有融合多肽从色谱体系中脱离时，纯化体系将从抑制自我蛋白水解功能的环境改变为激活自我蛋白水解功能的环境。这种环境的改变使融合多肽恢复其原本的结构，从而N端部分自我蛋白水解功能被激活，感兴趣的多肽被剪切出来，最后洗脱出来的成分为纯化的、经重叠的、具有同源N端的所需的多肽，而融合多肽的N端部分继续固定在色谱体系中。

一旦融合多肽被固定在与色谱体系中，步骤1)清洗未被固定的杂质（或污染物）成分2)再折叠3)剪切所需多肽的以及4)在同一个色谱体系中纯化所需的多肽。这极大的便利了操作。未被固定的杂质成分在此体系中非常易于清洗，同时融合多肽保持与色谱体系的选择性固定。

具体实施方式

本发明提供一种制备具有同源N端的所需要的异源多肽的新方法，该方法大大简化了获取活性多肽所需的复杂的处理过程。

因此，本发明涉及一种使用包含有所需多肽和连接在所需多肽N端的，具有自我蛋白剪切功能的多肽的融合多肽制备具有同源N端的异源所需多肽的方法，该方法包括以下步骤：a)使用亲和色谱体系将融合多肽以可溶的、自我蛋白水解功能失活的形态固定，b）再折叠融合多肽，以便激活融合多肽的自我蛋白水解功能并使所需的异源多肽剪切，c)随后洗脱所需的异源多肽，其中所述的步骤都在一个亲和色谱体系中进行。

本文涉及的术语含义如下所述：

术语“所需的异源多肽”（heterologous polypeptide of interest）意为一种并非通过天然自我蛋白酶剪切天然（融合）多肽而形成的多肽，所需的异源多肽例如有工业酶（工艺酶）或具有治疗活性，尤其是针对人类治疗的多肽。

术语“融合多肽”意为包含有两个或多个多肽的多肽。特别的，一个融合多肽可能包含一个亲和标记、一个自我蛋白剪切部分，优选自我蛋白酶、以及一个所需要的多肽。在本发明中，融合多肽包含所需要的多肽，以及具有自我蛋白剪切功能的，N端连接所需要的多肽的多肽。

术语“变性形态”（denatured form）在本发明中意为在重组制备过程中，通常是在溶解包涵体之后所获得的作为产品的，具有生物失活形态的表达融合多肽。

术语“再折叠”意为溶解多肽恢复其原本结构和生物活性的机制，例如，将处于变性、失活形态的蛋白质重组，使其恢复其活性形态。

术语“自我蛋白水解功能”(autoproteolytic function)意为融合成分（fusionpartner）中一种成分的自我蛋白水解活性，当融合多肽处于变性形态时，此活性被抑制，当融合多肽进行再折叠时，此活性被激活。

当融合多肽的自我蛋白水解功能失活时，融合多肽被固定在色谱体系中。在环境改变、所需要的多肽剪切、以及之后的过程中，融合多肽都必须保持固定在色谱体系中。在本发明中，当融合多肽再折叠的同时剪切开始进行，此时融合多肽从失活形态恢复至活性形态。本发明提供了一种亲和色谱体系，在使变性环境下，融合多肽的N端固定在此亲和色谱体系中，之后当环境改变时，具有自我蛋白水解功能的融合成分依然保持固定在亲和色谱体系中。再折叠发生的同时多肽仍然被固定在色谱体系中，所以要求亲和体系和再折叠方法互不干扰。这个问题在本发明中已得以解决。

本文使用的术语“使变性”意为多肽原始三维结构被破坏了的环境。

在融合多肽的自我蛋白水解活性部分，再折叠可以激活此部分的活性并引发剪切的开始。同时，所需要的的多肽部分恢复其原本的结构，最后剪切下来的所需要的多肽便具备其原本的、活性的形态。剪切之后，由于融合多肽的自我蛋白水解活性部分仍然固定在色谱柱中，而在剪切开始之前，未被固定的杂质成分已经从色谱柱中清洗出来，所以从色谱柱中洗脱出来的便是纯净的、经再折叠的所需要的多肽。因此，不需要再进行融合多肽两部分的分离，剪切剂的分离或再折叠这些后序工作。

在本发明中，融合多肽是在细菌宿主细胞中，以最初失活形态制备而成的。

在本发明的优选实施例中，融合多肽是通过在细菌宿主细胞内以包涵体的形式重组表达制备而成的，所使用的宿主细胞的转化（transform）是通过含有编码融合多肽的核酸分子的表达载体得以实现的。

本文使用的术语“包涵体”意为存在于转化后的宿主细胞细胞质中的含有异源多肽的集合体。在显微镜下，包涵体呈亮点状（bright spots），可以通过分离细胞质获得包涵体。

本文使用的术语“转化的宿主细胞”意为包含编码异源多肽载体的细胞。

为了启动色谱柱上的剪切，需要在最开始以及多肽已经在宿主细胞中表达的过程中抑制融合多肽的自我蛋白水解活性。表达的多肽在宿主细胞的细胞质中聚集，尤其是以包涵体形态聚集，该过程的环境需要保持融合多肽的失活形态。

本发明中所使用的细菌宿主细胞为，例如革兰氏阴性细菌如埃希氏菌属，例如大肠杆菌，或者其他革兰氏阴性细菌，例如假单胞菌属，如绿脓杆菌，或杆菌属（caulobacter sp.），如新月柄杆菌（Caulobacter crescentus），或者革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌属，尤其是枯草杆菌。优选大肠杆菌作为宿主细胞。

在本发明的方法中使用的表达载体包含编码融合多肽的核酸分子，其包含具有自我蛋白水解功能的多肽，并且其C端连有所需的多肽。剪切在具有自我蛋白水解活性的多肽C端进行，以便形成所需多肽的同源N端。

在本发明的优选实施例中，具有自我蛋白水解功能的多肽为自我蛋白酶。

本文使用的术语“自我蛋白酶”意为具有自我蛋白水解功能的，可以从更长的多肽部分上将自身剪切下来的多肽，优选天然蛋白酶。本领域技术人员熟知自我蛋白酶的概念，已知的有很多天然自我蛋白酶体系。研究比较深入的自我蛋白酶有，例如病毒蛋白酶，发育蛋白质（developmental proteins）（如HetR，Hedgehog蛋白质（其羧基端蛋白酶），RumA蛋白酶领域，UmuD，等等）。

黄病毒科的病毒（Flaviviridae），包括瘟病毒属（pestiviruses）都具有NS3蛋白酶。通过黄热病毒、2型登革热病毒和西尼罗河病毒所显示，蛋白酶结构域位于NS3的N端～180残基上，其可在NS2A/2B和NS2B/NS3接点处以作用与明显的分子内形式（in an apparent intramolecular fashion）被剪切下来。通过对丙型肝炎和GB病毒NS3序列分析显示，其与黄病毒（flavivirus）和瘟病毒属（pestiviruses）NS3序列有着密切的联系。

N端自我蛋白酶也会出现在口疮病毒属（aphthoviruses）[口蹄疫病毒（FMDV）]中，该口疮病毒属属于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的正链（positive strand）RNA病毒。该蛋白酶也被称作前导蛋白酶（Lpro），其属于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶科。该蛋白酶除了可以将其自身从多肽上剪切下来之外，还可导致真核起始因子4G的220-kDa组的蛋白水解退化（degradation）并停止加帽依赖性（cap-dependent）宿主细胞的蛋白质合成。由于小核糖核酸RNA没有加帽，所以当加帽结合（cap-binding）蛋白质复合体失活时其被继续翻译。然而，细胞培养中的病毒复制并不需要口疮病毒前导蛋白酶基因。

小核糖核酸病毒（picornavirus）科中的另外两种自我蛋白酶是2A和3C，它们与和类糜蛋白酶丝氨酸蛋白酶（chymotrypsin-like serine-proteases）极其一致。两种蛋白酶都包含在多聚蛋白质的前体（precursor）中。植物病毒中自我蛋白质水解的简短的例子是，甜菜黄化病毒中的前导蛋白酶，此前导蛋白具有非保护的（non-conserved）N端结构域（RNA扩增功能）和保护的（conserved）类木瓜蛋白酶（papain-like）的C端结构域，其需要自我蛋白水解。

在逆转录酶病毒，例如人类免疫缺陷病毒（HIV-1）中的Gag-Pol多聚蛋白中，也可以发现自我蛋白酶。该多聚蛋白包含一个有99个氨基酸的蛋白酶，当其与另一个多聚蛋白中的蛋白酶聚合之后便可将自身释放出来。

术语“自我蛋白酶”优先指代瘟病毒的N^pro自我蛋白酶，包括其所有具有自我蛋白水解活性的衍生物。

在本发明中更深一层的实施例中，自我蛋白酶为瘟病毒的N^pro，或其具有自我水解功能的衍生物。

瘟病毒为小型包膜病毒，它具有一条直接担任mRNA的基因组。从瘟病毒中鉴别出的两种病毒编码的蛋白酶分别为N^pro自我蛋白酶和丝氨酸蛋白酶NS3。N^pro蛋白酶位于多聚蛋白的N端。N^pro组成瘟病毒多聚蛋白的第一个蛋白质，并在自我蛋白水解过程中与后面的核包核酸蛋白剪切开。剪切发生在N^pro序列Cys168的最后一个氨基酸之后。

瘟病毒可以形成一系列的包括其他病毒的病原体，典型猪瘟病毒（CSFV），边境病毒（BDV）以及牛病病毒性腹泻病毒（BVDV）。

在本发明的优选实施例中，瘟病毒选自CSFV，BDV或者BVDV，其中CSFV为最优选。

在本发明更加优选的实施例中，CSFV的N^pro自我蛋白酶的氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO1：

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168)，

或为具有自我蛋白水解功能的N^pro自我蛋白酶的衍生物的氨基酸序列。

又见EMBL数据库，登陆号X87939，1至168位氨基酸，从N端向C端方向读取。

当需要保持所需的自我蛋白酶的活性，尤其是制备所需的具有同源N端的所需的异源多肽时，本发明具有自我蛋白水解功能的衍生物是由瘟病毒的N^pro自我蛋白酶通过突变，特别是氨基酸的替换、缺失、添加和／或插入衍生而来。通过突变制备上述衍生物的方法已为本领域技术人员所熟知。从融合多肽中剪切下来的不同种类的异源多肽的N^pro自我蛋白酶的性质可以通过上述突变进行调整。在本发明中可以对多肽进行设计，使其与天然蛋白酶相比不仪具有改良的性质，且仍然保持瘟病毒N^pro的自我蛋白水解活性。出于这种考虑，优选那些在溶解性方面具有改良性质以及可以优先固定在亲和色谱体系中的衍生物，这些性质在本专利中用处极大。

由突变得到的衍生物的自我蛋白水解功能可以通过例如WO01／11056进行测试。

优选半胱氨酸残基被替换的，氨基酸序列为上述ID NO1所述的天然的瘟病毒N^pro的衍生物。更优选C112，C134，C138三个半胱氨酸残基被其他氨基酸残基(例如谷氨酸)替换的，天然N^pro的衍生物。尤其优选具有下列氨基酸序列的衍生物：

SEQ ID NO2：

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168)。

另外一种优选的天然的瘟病毒N^pro的衍生物，除上述半胱氨酸的突变之外，53位和57位上的精氨酸被替换为谷氨酸残基，54位上的甘氨酸被替换为天冬氨酸，143位上的亮氨基酸被替换为谷氨酰胺。此衍生物的氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO3：

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168)。

因此另一方面，本发明也涉及到上述方法，其中融合多肽包含CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物，该衍生物除至少一个半胱氨酸残基如上所述被替换之外，还有至少一个疏水氨基酸残基被替换为亲水残基。

在本发明中，优选一种CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物，其中除了至少一个半胱氨酸如上所述被替换之外，下列氨基酸中至少其中之一也被替换：V24，A27，L32，G54，L75，A109，V114，V121，L143，1155以及F158。优选下列氨基酸被苏氨酸(T)替换所形成的衍生物：丙氨酸(A)109，缬氨酸(V)114，异亮氨酸(I)155和苯基丙氨酸(F)158。

因此在另一方面，本发明优先涉及到上述方法，其中融合多肽包含CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物，其中除至少一个如上所述半胱氨酸残基被替换之外，下列氨基酸也被替换为苏氨酸(T)：丙氨酸(A)109，缬氨酸(V)114，异亮氨酸(I)155和苯基丙氨酸(F)158。另外，在本发明中更优选具有下列氨基酸序列的CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物：

SEQ ID NO4：

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168)。

因此，在另一方面，本发明更加优先涉及到上述方法，其中融合多肽包含具有SEQ ID NO4中所示氨基酸序列的CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物。

在本发明中，更优选一种CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物，此衍生物除至少一个半胱氨酸如上所述被替换之外，下列氨基酸：丙氨酸(A)109，缬氨酸(V)114，异亮氨酸(I)155，苯基丙氨酸(F)158被替换为苏氨酸(T)；精氨酸(R)53被替换为谷氨酸(E)，甘氨酸(G)54被替换为天冬氨酸(D)，精氨酸(R)57被替换为谷氨酸(E)，亮氨酸(L)143被替换为谷氨酰胺(O)。

在本发明中，最优选的CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物具有下列氨基酸序列：

SEQ ID NO5：

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168)。

因此，在另一最优选的方面，本发明同样涉及上述方法，其中融合多肽含序列SEQ ID NO5所示的CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物。

在另一同样优选的方面，本发明涉及到上述制备异源蛋白的方法，其中融合多肽含有CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物，此衍生物的氨基酸序列为SEQ ID NO5，其中将天门冬素(N)35替换为苏氨酸(T)，将苏氨酸(T)158替换为丝氨酸(S)。

在本发明上述方面的方法中所使用的CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物也是本发明的一部分，其氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO50：

(1）-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGTPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNSTNCPLWVTSC-(168)。

在另一优选的方面，本发明涉及上述制备异源蛋白(heterologous protein)的方法，其中融合多肽含有CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物，此衍生物的氨基酸序列为SEQ ID NO32，其中将丙氨酸(A)28替换为谷氨酸(E)，将丝氨酸(S)71替换为苯基丙氨酸(F)，将精氨酸(R)150替换为组氨酸(H)。

SEQ ID NO51：

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTEGRPLFGTPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRFGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPHTLKWTRNSTNCPLWVTSC-(168)。

制备胰岛素原时，在本发明所述的方法中，将序列为SEQ ID NO32的CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物与至少具有胰岛素原，优选与胰岛素原，更优选与人类胰岛素原，最优选与重组人类胰岛素原前三位氨基酸的蛋白质融合。

根据本发明，优选的CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物除至少一个半胱氨酸残基如上所述被替换之外，下列氨基酸至少其中之一也被替换：精氨酸(R)53，糖基乙酸(G)54，精氨酸(R)57，苏氨酸(T)109、114、155、158，亮氨酸(L)143。根据本发明，优选的CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物除至少一个半胱氨酸残基如上所述被替换之外，下列氨基酸分别被替换为：精氨酸(R)53被替换为谷氨酸(E)，糖基乙酸(G)54被替换为天冬氨酸(D)，精氨酸(R)57被替换为谷氨酸(E)，苏氨酸(T)109、114、155、158被替换为丝氨酸(S)，亮氨酸(L)被替换为谷氨酰胺(O)或天门冬素(N)或天冬氨酸(D)或丝氨酸(S)或组氨酸。

在本发明上述方面的方法中优选使用的CSFV的N^pro自我蛋白酶的衍生物也是本发明的一部分，其氨基酸序列如下所示：

SEQ ID52：

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKSAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168)。

SEQ ID53：

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKNAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168)。

SEQ ID54：

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKDAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168)。

SEQ ID55：

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKHAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168)

SEQ ID56：

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGCVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168)

表达载体编码作为融合多肽的一部分的所需要的多肽，其可以通过自我蛋白水解剪切下来。在本发明中，可以使用上述表达载体制备一系列的所需要的多肽。例如，具备药理活性的多肽，其选白干扰素、白介素、生长荷尔蒙、生长因子(growthfactor)、细胞因子、酶、酶抑制剂、抗体和抗体片段，诸如此类，例如干扰素α2A、干扰素α2B、白介素-3、白介素-6、人类生长荷尔蒙、胰岛素(原)、胰岛素样生长因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、干扰素β1、牛促生长激素(bovine somatropin)、猪促生长激素(porcinesomatropin)、白介素11、白介素-2、抗原结合片段(Fab-fragment)、以及小肽如降钙素、甲状旁腺荷尔蒙(PTH)、或胰增血糖素、CD40配基可溶形式、血浆酶原激活剂、性类固醇结合蛋白、表皮生长因子以及组织因子细胞外域(tissue factorextracellular domain)。

另外，所需的多肽也可以是其他任意形式的多肽，尤其是特别适合用于分析方法的多肽，例如绿色荧光蛋白质(GFP)。

在本发明的方法所使用的表达载体中，融合多肽需与至少一个表达控制序列（expression control sequence）可操作地相连。特别地表达控制序列为，启动子（如lac，tac，T3，T7，trp，gac，vhb，lambda pL或phoA启动子），核糖体结合部位（如属于上述启动子的自然核糖体结合部位，cro或合成核糖体结合部位），或转录中止子（如rrnB T1T2或bla）。

载体也可能包含编码融合结构域的序列，如下所述，其位于融合多肽的N端，并要求其固定在亲和色谱体系中，例如，多聚氨基酸如多熔素，或者用于免疫亲和色谱的所谓的“抗原决定基标记（epitope tags）”，已知的可用于特殊单克隆抗体的抗原决定基标记包括FLAG，流行性感冒病毒血凝素（HA）和原癌基因标记。

在本发明的优选实施例中，表达载体为质粒。

转化的细菌宿主细胞也就是表达菌株（expression strain），其培养是按照已知的微生物方法（microbiological practice）进行的。

宿主菌株（Host strain）是在营养基上由简单生物群培养而成的，当然也可以使用低温保存的细胞悬浮液（细胞银行）。通常需要经过多级工艺培养菌株来获得足够的生物量以备后用。

在小规模制备情况下，可以在摇瓶中，大部分情况下使用复合培养基（例如LB肉汤培养基）进行培养。也可以使用成分明确的培养基（例如柠檬酸盐培养基）。由于在本发明的优选实施例中融合多肽为不溶的包涵体的形式，所以培养需要在相对高温的条件下进行（例如30°C或者37°C）。诱导系统非常适用于制备包涵体（例如含有trp，lac，tac，phoA启动子）。

在大规模制备情况下，多级体系由大量的生物反应器（发酵罐）组成，优先使用成分明确的培养基。另外，通过在培养基基中添加特殊的营养（分批加入）还可以大大增加生物量和生产量。此外，此方法与使用摇瓶培养类似。

在本发明的方法中，包涵体以一种已知的方式从宿主细胞中分离出来。

例如，在发酵开始之后，通过离心法、微过滤法、絮凝法或这几种方法的结合得到宿主细胞，优选使用离心法。潮湿的细胞群通过机械、化学或物理的方法得以破碎，例如高压均质器，砂摩机，弗氏细胞压碎器，压碎器，渗压震扰法，去污剂，酶解或者上述几种方法的结合。优选使用高压均质器使细胞分裂。在重组融合多肽以包涵体的形式聚集的优选实施例中，可以通过例如高压弥散或者更好是低转速的简单离心过滤获得包涵体。通过离心过滤或者微过滤或两者结合可以将包涵体分离出来。可以通过在一系列的缓冲液中对包涵体进行多级重悬浮来提高所需的多肽的纯度，例如使用NaCl（例如0.5-1.0M）和/或去污剂（例如TritonX100）。优选使用一系列的缓冲液进行多级清洗来改善包涵体的纯度（例如先用0.5%的脱氧胆酸，之后用两遍1M的NaCl溶液，最后用蒸馏水）。这样就可以将大多数杂质多肽从包涵体中清除出来。

在准备亲和色谱时，需要对分离出来的包涵体进行溶解。

本发明涉及上述方法，在此方法中优先使用色谱体系，制备好的融合多肽在离液序列高且抑制自我蛋白水解活行的环境下进行溶解。

本文中使用的术语“离液序列高”(高浓度离液)（chaotropic）意为不能或几乎不能观察到分子内部作用的环境。可以通过例如加入去污剂、酒精、尿素或者胍盐酸的方法形成此环境。适用于不同多肽的上述环境也不尽相同。如何确定适用于各种多肽的上述环境属于本领域技术人员的工作范畴。

使用高浓度离液剂（chaotropic agent）将包涵体溶解。包涵体溶解之后，可以得到一实质上降低了分子内和分子间作用的单分子悬浮液。优选的溶剂为尿素、胍盐酸和强离子去污剂，例如N-月桂酰肌氨酸（N-lauroylsarcosine）。在本发明的另一个优选实施例中，也可以使用pH值呈碱性的含水酒精溶液，或者pH值呈碱性的水溶液来溶解包涵体。

本文中使用的术语“溶解”意为用于溶解包涵体的方法。溶解之后可以得到一具有分子内和分子间最小作用的多肽单分子悬浮液。，

在本发明中，当存在氧化半胱氨酸残基时，优选使用pH值为7.3的含有50mMTris/HCl，8M尿素，添加有还原剂例如50mM DTT的悬浮液溶解包涵体。

必要的时候可以通过例如离心分离法除去部分不溶物质。

当失活的融合多肽在细胞内以可溶的状态制备出来之后，对澄清的细胞匀浆进行前面所述的操作以得到溶解出来的包涵体。

溶解的多肽被进一步稀释，之后进入色谱体系被固定在亲和色谱柱上。在本发明中，可以调节色谱体系，从而可以选择性地识别出具有自我蛋白水解功能的融合多肽部分，并在使变性、离液序列高的环境中将其固定在色谱柱上。在上述环境中，融合多肽变性并失活。当融合多肽被固定在色谱柱上时，将使失活、离液序列高的环境改变为使复性、cosmotropic的环境，融合多肽便可恢复其原本的结构，并重新激活自我蛋白水解功能。在此环境改变的过程中，具有自我蛋白水解功能的部分仍然被固定在色谱柱上。

本文中使用的术语“cosmotropic”意为促进分子间相互作用并促使生物结构形成的环境。适用于不同分子的上述环境也不尽相同。作为阴离子的柠檬酸盐、硫酸盐和作为阳离子的四元胺或铵的cosmotropic作用最强。其他一些试剂，如去污剂或氧化还原系统也可用于促进再折叠的进行。如何确定适用于各种多肽的上述环境属于本领域技术人员的工作范畴。

在本发明框架中，理论上所有的色谱体系都可以在离液序列高的环境（chaotropic condition）下选择性的固定融合多肽，并在cosmotropic condition（的环境）下继续与其保持固定。在优选的实施例中，色谱体系的基质为色谱柱形式，也可以选择其他形式的基质，如色谱粒或有机物质，例如用亲和肽修改过的聚乙烯乙二醇。

适用于本发明的色谱体系基于纤维素结合域（cellulose binding domain），可以是使用例如多聚精氨酸或多聚赖氨酸等的聚阳离子标记的阳离子交换色谱体系，也可以是使用例如多聚天门冬素等聚阴离子标记的阴离子交换色谱。

在本发明中，亲和色谱体系优选选自固定金属离子色谱(IMAC)、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、纤维素结合域色谱以及肽亲和色谱。

所使用的亲和色谱体系优选阳离子交换色谱，在该色谱中融合多肽含有聚阳离子标记（polycationic tag），更优选使用聚精氨酸或者聚赖氨酸作为亲和标记。

对于阳离子交换色谱体系，表达的融合多肽包括N端聚阳离子标记，例如聚精氨酸或者聚赖氨酸标记。包含从宿主细胞中提取出来的表达的融合多肽的溶液，（过滤之后）被装载在色谱柱上，色谱柱中填有适用于阳离子交换色谱的介质，例如SP凝胶FF，CM凝胶FF，Fractogel EMD SO^3-。优选使用传导性较低的缓冲液。装载好之后将未固定的物质洗脱出来，之后使用尿素含量较低的缓冲液进行再折叠。当尿素含量低于0.5M时，目标蛋白被剪切并从色谱柱中洗提（eluted）出来。

在本发明的另一个优选实施例中，也可选择阴离子交换色谱体系，在此色谱体系中，融合多肽需含有聚阴离子标记。优选多聚天门冬素作为亲和标记。

在一个更为优选的实施例中，也可以使用固定金属离子亲和色谱体系（IMAC）达到上述固定特性。

在本发明的一个优选实施例中，选择固定金属离子亲和色谱（IMAC）作为亲和色谱体系，融合多肽包含金属螯合亲和标记。

在上述情况下，融合多肽被识别出来，并通过其金属螯合亲和标记被固定在色谱体系中。

在本发明的一个更为优选的实施例中，金属螯合亲和标记为聚组氨酸亲和标记。

IMAC是基于组氨酸或其他特殊氨基酸（天然蛋白质表面的氨基酸或者通过DNA重组技术而得的氨基酸）以及各种固定金属离子，例如铜，镍，锌或铁离子的共价结合。已知的适用于IMAC的色谱材料（chromatographic materials）同样适用于本发明中。在本发明的一个优选实施例中，使用Ni²⁺-Chelating Sepharose Fastflow（GE Healthcare,Uppsala,SE）作为基质（matrix）。

另外，也可以选择免疫亲和色谱，使用N端带有上述抗原决定基标记的融合多肽，通过该标记的抗体识别所述功能将其固定在色谱基质上。

另外，在本发明中，使用寡肽配基的亲和色谱体系也具有所需的固定特性。

本文使用的术语“寡肽”（oligopeptides）意为至少包含三个氨基酸的蛋白质化合物。这种寡肽长度通常不超过35个氨基酸的长度。

在本发明的一个优选实施例中，在亲和色谱体系中使用5到12个氨基酸长度的寡肽配基，更优选6到8个氨基酸长度且包含一个色氨酸残基的寡肽配基，在离液序列高的环境下，寡肽配基选择性的与融合多肽上具有自我蛋白水解功能的部分结合，当环境变化为cosmotropic环境时，寡肽配基与具有自我蛋白水解功能的部分依然保持结合。

例如从抗体中得知，在这种形式的亲和色谱中使用到某些多肽与其他多肽之间的特殊的结合。寡肽也可用作亲和配基。这些分子具有较高的化学稳定性、功效和选择性，并具有较低的价格，并且通常为无毒性的。这些特性在生物制药工艺中是非常大的优势。本领域技术人员知道如何从组合肽文库或生物库中寻找直接针对目标分子的寡肽配基。根据本发明，寡肽配基的筛选需要在离液序列高的环境中进行。

现有技术已知的合成肽的方法可以用于制备本发明中所需的寡肽配基。优选使用SPOT合成法、PIN合成法、teabag合成法、Ruiwu Liu等人在ExperimentalHematology31(2003)11-30中所述的mix and split法、Joseph A.Buettner等人在Int.J.Peptide Protein Res.47(1996)，70-83中所述的PELICAN法制备寡肽配基。可以使用一些连接化学物(linker chemistries)来固定(anchoring)第一个氨基酸。在本发明的一个优选实施例中，可以分别制备配基，然后将其一一固定在色谱基质上。在本发明的另一个优选实施例中，可以将肽配基直接在色谱基质上合成。

寡肽配基具有高度特异性。本发明中所合成的寡肽的特性在于，在使变性环境下，此寡肽可以选择性的结合N^pro、N^pro衍生物及其融合多肽。在本发明中，上述寡肽配基直接针对具有自我蛋白酶解功能的融合多肽部分。

在本发明的优选实施方案中，寡肽配基具有选自如下的氨基酸序列：

SEQ ID NO6：VSIFEW，

SEQ ID NO7：AVSIEWY，

SEQ ID NO8：AVSFIWY，

SEQ ID NO9：VSFIWYK，

SEQ ID NO10：ASRFWYA，

SEQ ID NO11：AFYTWYA，

SEQ ID NO12：AFYRWYK，

SEQ ID NO13：AFYRWY，

SEQ ID NO14：AFYRWYA，

SEQ ID NO15：AVSIFEWY，

SEQ ID NO16：AVSRNWY，

SEQ ID NO17：ASRFWY，

SEQ ID NO18：AFYRWYAA，

SEQ ID NO19：AFYRWY，

SEQ ID NO20：ASRFWYAA，

SEQ ID NO21：AFYRWYAA，

SEQ ID NO22：AFYSWYAA。

在本发明中，可以使用具有自由N端的寡肽配基或具有封闭N端的寡肽配基，通过例如乙酰化作用得以形成封闭的N端。

在本发明的最优选的实施例中，使用氨基酸序列为SEQ ID NO5的天然的CSFV的N^pro，结合使用氨基酸序列选自SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13和SEQ ID NO14的寡肽配基。

因此，本发明还提供了含有固相的亲和基质（affinity matrix）以及含有偶联在这个固相的肽键的亲和配基，其中含有肽键的亲和配基选自以下配基：

a)含有通式为X₁X₂X₃X₄的肽，其中X₁至X₄为氨基酸残基，X₁至X₄中至少有两个残基为W、Y或F；

b)含有通式为X₅X₆X₇X₈的肽，其中X₅至X₈为氨基酸残基，X₅至X₈中至少有一个残基为W，X₅至X₈中至少有一个残基为E或D；以及

c)由R、K、E和D组成的氨基酸单体和由Y、F和W组成的氨基酸单体构成的聚氨基酸，优选聚KY，聚KF，聚KW，聚RY，聚RF，聚RW，聚EY，聚DY，聚EF，聚EW，聚DF和聚DW。

条件是a)和b)所示的缩肽长度最多为35个氨基酸残基，而且c)所示的肽长度最少为20个氨基酸残基。

这些亲和配基对所述的自我蛋白酶分子，尤其是对N^pro，N^pro的衍生物及其融合蛋白的结合具有很高的亲和性。特别的，无论是在离液序列高的环境下还是在cosmotropic的环境下，上述配基或亲和基质都可以固定N^pro、N^pro的衍生物及其融合蛋白，最少也能固定例如融合蛋白的N^pro。

a)和b)所示的肽（这里也可称作“寡肽”）的长度为优选5至12个氨基酸残基，更优选6至8个氨基酸残基。寡肽中最好至少有一个带正电荷的氨基酸。c)所示的聚氨基酸长度优选至少35个氨基酸残基，更优选至少50个氨基酸残基，最优选至少100个氨基酸残基。优选的聚氨基酸为：例如用作培养基的商用聚氨基酸，如聚KW，4:1（MW20.000-50.000Da；SIGMA产品No.P9285），聚KY，4:1（MW20.000-50.000Da；SIGMA产品No.P4695）或聚KF，1:1（MW20.000-50.000Da；SIGMA产品No.P3150）。

本发明中所涉及的亲和配基需要经过化学修饰，特别是乙酰化、酯化、酰胺化、氧化、还原或通过连接分子制备。

优选通过共价键将亲和配基与固相基质相连。

目前已经投入使用的基质材料都适宜用作固相基质。优选的是固相基质，其选自色谱材料，尤其是基于纤维素、琼脂糖、丙烯酰胺、聚苯乙烯二乙烯基苯（poly(styrene-divinylbenzene)）的载体（support）或乙烯基乙二醇异丁烯酸酯(ethylene glycol-methacrylate copolymers)、微量滴定板、硝化纤维膜、微芯片、玻片或金属涂层载体。

本发明中用到一系列种类的固相载体，例如基于纤维素、琼脂糖（琼脂糖凝胶或Macro-Prep凝胶）、右旋糖苷（交联葡聚糖凝胶）、丙烯酰胺（Sephacryl,Trisacrylgels）、无水硅酸（TSK，SW凝胶）、聚苯乙烯二乙烯基苯（poly(styrenedivinylbenzene)）（Source或Poros凝胶）、乙烯基乙二醇异丁烯酸酯（ToyopearlHW，TSK，PW，fractogel EMD凝胶）或以上物质混合物的载体，尤其是基于琼脂糖和右旋糖苷（Superdex凝胶）的载体。优选已经通过美国权威机构（FDA食品药物管理局）或欧盟办事处验证的，可用于人类或牲畜的载体。另外，所选的载体必须与本发明中的亲和配基相固定，最好是通过共价结合的方式（载体要功能化）。作为基质的主要成分，固相基质可以包括目前已知的，适用与蛋白质或其他生物分子固相分离的物质，这些物质可以是天然的也可以是合成的，可以是有机的也可以是无机的，例如，天然的或合成的多聚糖，如琼脂和琼脂糖；纤维素，纤维素醚，如羟丙基纤维素，羧甲基纤维素；淀粉；树脂如瓜尔豆胶，阿拉伯胶，茄替胶，黄芪胶，刺槐豆胶，黄原胶；果胶；粘蛋白；右旋糖苷；壳质；壳聚糖；藻酸盐；角叉（菜）胶；肝磷脂；白明胶；以及合成聚合物，例如聚酰胺如聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺；聚酰亚胺；聚酯；聚醚；聚乙烯基化合物，如聚乙烯醇和聚苯乙烯；聚烯烃；无机材料如硅土材料如二氧化硅，包括无定形二氧化硅和石英；硅石；金属硅，可控孔度玻璃（controlled pore glasses）和陶瓷；金属氧化物和硫化物，以及上述或天然或合成或有机或无机的材料的组合。

基质的主要成分（backbone）优选琼脂，琼脂糖，纤维素，纤维素醚例如羟丙基纤维素，羧甲基纤维素，聚酰胺例如聚丙烯酰胺，聚乙烯乙醇，硅石以及可控孔度玻璃。

作为基质的主要成分，尤其引人注意的固相材料有例如琼脂或琼脂（聚）糖珠粒，如瑞典Pharmacia Biotech公司的Sepharose珠粒和Superose珠粒，美国Biorad公司的Biogel A;右旋糖苷粒如Pharmacia Biotech公司的ephadex；纤维素珠粒和纤维素膜如捷克斯洛伐克Secheza公司的Perioza纤维素；复合珠粒，如PharmaciaBiotech公司的Sephacryl和Superdex；合成有机聚合物珠粒如美国Toso-Haas公司的Fractogel；美国Perceptive Biosystem公司的POROS介质，Biorad公司的Bio-Rex，Bio-Gel P和Marcro Prep，TESSEK公司的HEMA和Separon，美国BioSepra公司的Hyper D和Trisacryl介质，美国3M公司的Enzacryl和Azlactone；硅石粒如英国Bioprocesing公司的可控孔度玻璃和PROSEP，BioSepra公司的Spherocil；以及粒状或膜状的涂层硅石合成物，如美国Arbor Technologies公司的ACTI-DISK，ACTI-MOD和CycloSep。

典型情况下，固相基质主要成分以及具有特别功能的固相基质可以是例如不规则颗粒状，圆球状，膜状或片状，模制的表面或棒状。固相材料可被设计为对蛋白质部分渗透或完全渗透或不渗透。在本发明的一个特别引人注意的实施例中，基质呈不规则颗粒状或圆球状，大小在1-10000μm之间，优选10-1000μm之间，例如在高操作性能中使用大小在10-60μm之间的基质，在介体用途（preparativepurpose）中使用大小在50-500μm或优选50-300μm之间的基质。

基质还有一种非常有趣的形态，是由控制密度颗粒聚结组成的密度可控的基质。上述聚结非常适用于大规模操作过程中的液化床色谱和膨胀床色谱以及各种间歇式色谱的非填装（non-packed）色谱柱，例如搅拌槽中的单批吸收过程。

在本发明中，亲和配基可以通过任何种类的已知的合适的共价键与固相基质相连，通过亲和配基与固相基质的直接化学反应或使用已知的合适的反应物预先激活固相基质或配基都可以将基质主要成分与配基固定起来。合适的激活反应物有，例如表氯醇，表溴醇，烯基缩水甘油醚（allyl-glycidylether）；双环氧化物如丁二醇二缩水甘油醚（butane diol diglycidylether）；卤丁二烯脂肪族化合物如二氯丙醇，二乙烯砜；羰二咪唑；醛式氢如戊二醛；醌；溴化氰；高碘酸盐如高碘酸钠；碳二亚胺；氯三嗪如氰尿酰氯；磺酰氯如甲苯磺酰氯和三氟乙烷磺酰氯（tresylchlorides）；N羟基琥珀酰亚胺；2-氟-1-甲基吡啶甲苯-4-磺酸酯（2-fluoro-1-methylpyridinlum toluene-4-sulfonates）；唑酮；马来酰亚胺；二硫吡啶以及酰肼。在这些激活反应物中，优选具有不同于单键的隔离剂群组SP1（leavinga spacer group SP1 different from a single bond）激活反应物，例如表氯醇，表溴醇，丙烯基缩水甘油醚；双环氧化物；卤丁二烯脂肪族化合物；联乙烯砜；醛；醌；溴化氰；氯三嗪；唑酮；马来酰亚胺；二硫吡啶以及酰肼。

特别受人关注的激活反应物为环氧化合物，例如表氯醇，烯基缩水甘油醚和丁二醇二缩水甘油醚。

在本发明中，所有可以固定肽配基的基质都可以用在肽亲和色谱体系中。优选德国达姆施塔特Merck公司的Fractogel epoxy(M)或“整体式色谱介质”（“monolithic chromatography medium”）CIM-epoxy。配基可以直接固定在经化学激活的色谱基质的主要成分上，也可以通过隔离剂（spacer）或连接剂（linker）与色谱基质主要成分上固定。当通过隔离剂连接时，结合在色谱基质上的隔离剂需经过化学激活，以便使配基固定。优选Fractogel epoxy基质与隔离剂结合使用。

在本发明的一个特别优选的实施例中，隔离剂是通过色谱基质首先与二氨基二丙胺（diaminodipropylamine（DADPA））发生反应之后再与琥珀酐（SA）发生反应形成的。形成的隔离剂的终端羧基经过化学激活之后与一个终端氨基相连。配基被固定在基体上或者通过其含有的隔离剂的反应基团固定在隔离剂上。针对肽配基的反应基团可以是氨基团，羧基团或者巯基团。在本发明中，优选通过氨键使肽固定在基质或隔离剂上。

在本发明中，亲和基质尤其是用于亲和色谱材料的亲和基质，优选符合上面a)和b)所定义的寡肽。

本文使用的术语“寡肽”意为含有至少三个氨基酸的蛋白质化合物。通常情况下，寡肽的长度不超过35个氨基酸长度，最好为4至20个氨基酸残基。

本发明中亲和色谱体系所使用的寡肽配基优选长度为5至12个氨基酸，更优选6到8个氨基酸，最好包含一个色氨酸残基，配基在离液序列高的环境下选择性的固定在具有自我蛋白水解功能的融合多肽部分，当环境改变为cosmotropic时，配基与具有自我蛋白水解功能的融合多肽的部分仍然保持固定。

以抗体为例所知，在亲和色谱中使用到某些多肽与其他多肽之间的特殊的固定。寡肽也可用作亲和配基。这些分子具有较高的化学稳定性、功效和选择性，并具有较低的价格，并且通常为无毒性的。这些特性在生物制药工艺中是非常大的优势。本领域技术人员知道如何从组合肽文库或生物文库中寻找直接针对目标分子的寡肽配基。根据本发明，寡肽配基的筛选需要在离液序列高的环境中进行。

在本发明中，亲和配基一个显著的特性是，它可以在使变性环境下，例如4M尿素，与N^pro和N^pro融合蛋白（以及其突变物或包含其突变物的蛋白质）相固定。

现有技术已知的合成缩氨酸的方法可以用来制备本发明中所述的寡肽配基。优选通过SPOT合成法、PIN合成法、teabag合成法、Ruiwu Liu等人在Experimental Hematology31(2003)11-30中所述的mix and split合成法或Joseph A.Buettner等人在Int.J.Peptide Protein Res.47(1996),70-83中所述的PELICAN合成法制备寡肽配基。可以使用一些连接剂化学物来固定（anchoring）第一个氨基酸。

在本发明的一个优选实施例中，可以先分别制备配基然后再将其固定在色谱基质上，在本发明的另一个优选实施例中，可以将肽配基直接合成在色谱基质上。

寡肽配基有很强的特异性。本发明中所合成的寡肽的显著特征是，它可以在使变性的环境下与N^pro、N^pro衍生物及其融合多肽相连。在本发明中，寡肽直接针对具有自我蛋白水解功能的融合多肽部分。

在本发明的一个更优选的实施例中，其中寡肽的氨基酸序列可以从下列序列中选择：VSIFEW，AVSIEWY，AVSFIWY，VSFIWYK，ASRFWYA，AFYTWYA，AFYRWYK，AFYRWY，AFYRWYA，AVSIFEWY，AVSRNWY，ASRFWY，AFYRWYAA，AFYRWY，ASRFWYAA，AFYRWYAA及AFYSWYAA。

在本发明中，寡肽配基可以带有一个自由N端也可以带有一个封闭N端，通过例如乙酰化作用形成封闭的N端。

在本发明的最优选的实施例中，使用序列为SEQ ID NO5（由于这个突变体的衍生物具有在53至57位“EDDIE”部分序列（替代“RGDIR”野生型）这个突变体（和含有这个部分的其他突变物）称为“EDDIE-突变体），的天然CSFV的N^pro的衍生物与选自下列氨基酸序列的寡肽配基相结合：ASRFWYA，AFYTWYA，AFYRWYK，AFYRWY和AFYRWYA。

优选亲和配基选自：VSDDWY，VSEDWY，VSIDWY，VSYDWY，VSVDWY，VSWDWY，VSYDWY，VSFDWY，VSDEWY，VSEEWY，VSIEWY，VSYEWY，VSVEWY，VSWEWY，VSYEWY，VSFEWY，DDDDWY，DDEDWY，DDIDWY，DDYDWY，DDVDWY，DDWDWY，DDYDWY，DDFDWY，VSIFWE，FSIFEW，WSIFEW，VSLIWY，VSLIDW，VSLIEW，VSLIWE，FSLEEW，VSDLDW，VSDLEW，VSYIDW，VSYIWE（上述所有氨基酸在pH值为5.5时固定N^pro），VSIDWY，VSIEWY，VSIWWY，VSIIWY，VSYIWY，VSVIWY，VSFIWY，VSFIWE，VSIFEW，VSIFWE，FSIFEW，WSIFEW，VSLIWY，VSLIDW，VSLIEW，VSLIWE，FSLIEW，WSLIEW，FSYFEW，FSFYEW，WSFYEW，FSYIEW，WSYIEW（上述所有氨基酸在pH值为7.3时固定N^pro），AFYTWYA，AFYRWYK，AFYRWY，AFYRWYA，AFFRWYA，AFGRWYA，AFHRWYA，AFIRWYA，AFLRWYA，AFMRWYA，AFNRWYA，AFPRWYA，AFQRWYA，AFRRWYA，AFSRWYA，AFTRWYA，AFVRWYA，AFYRWYA，AFYFWYA，AFYGWYA，AFYLWYA，AFYMWYA，AFYNWYA，AFYPWYA，AFYTWYA，AFYVWYA，AFYWWYA，AFYYWYA，AKWFRYA，VSRNWY，ASRNWYA，ASRFWYA，FSRNWYA，VFRNWYA，VWRNWYA，VYRNWYA，VSRAWYA，VSRFWYA，VSRWWYA，VSRYWYA，VSRNFYA，VSRNYYA，VSRNWFA，VSRNWWA（上述所有氨基酸对于在53至57位氨基酸残基上具有EDDIE序列的N^pro突变体具有极强的亲和力），Ac-AFYTWYAK，Ac-AFYRWYKK，Ac-AFYRWYK，Ac-AFYRWYAK，Ac-AFFRWYAK，Ac-AFGRWYAK，Ac-AFHRWYAK，Ac-AFIRWYAK，Ac-AFLRWYAK，Ac-AFMRWYAK，Ac-AFNRWYAK，Ac-AFPRWYAK，Ac-AFQRWYAK，Ac-AFRRWYAK，Ac-AFSRWYAK，Ac-AFTRWYAK，Ac-AFVRWYAK，Ac-AFYRWYAK，Ac-AFYFWYAK，Ac-AFYGWYAK，Ac-AFYLWYAK，Ac-AFYMWYAK，Ac-AFYNWYAK，Ac-AFYPWYAK，Ac-AFYTWYAK，Ac-AFYVWYAK，Ac-AFYWWYAK，Ac-AFYYWYAK，Ac-AKWFRYAK，Ac-VSRNWYK，Ac-ASRNWYAK，Ac-ASRFWYAK，Ac-FSRNWYAK，Ac-VFRNWYAK，Ac-VWRNWYAK，Ac-VYRNWYAK，Ac-VSRAWYAK，Ac-VSRFWYAK，Ac-VSRWWYAK，Ac-VSRYWYAK，Ac-VSRNFYAK，Ac-VSRNYYAK，Ac-VSRNWFAK，Ac-VSRNWWAK，YWKA，Ac-YWKAK，YKYA，Ac-YKYAK，YWRA，Ac-YWRAK，ARWY，Ac-ARWYK，YWRA，Ac-YWRAK（由于N端乙酰化作用和C端赖氨酸化作用（lysination），上述所有肽已经改进了对底物的固化能力）。

任何可以固定肽配基的基质都能使用于本发明保护范围内的肽亲和色谱。优选德国达姆施塔特Merck公司的Fractogel epoxy(M)或CIM-epoxy的“整体式色谱介质”。配基可以直接固定在经过化学激活的色谱基质的主要成分上，也可以通过隔离剂或连接剂固定。当通过隔离剂连接时，结合在色谱基质上的隔离剂需经过化学激活，以便使配基连接。Fractogel epoxy基质与隔离剂结合使用效果更好。

在本发明的优选实施例中，隔离剂是通过色谱基质首先与二氨基二丙胺（diaminodipropylamine）（DADPA）发生反应之后再与琥珀酐（SA）发生反应得来的。隔离剂的终端羧基经过化学激活之后优选与一个终端氨基相连。通过隔离剂的反应基团配基被固定在基体上，或者固定在隔离剂上。针对肽配基的反应基团可以是氨基团，羧基团或者巯基团。在本发明中，优选通过氨键使肽固定在基质或隔离剂上。

当融合多肽被固定在色谱体系中后，未被固定的杂质成分便能够很容易的从色谱柱上清洗下来。这些杂质成分可能是例如宿主细胞多肽以及聚集在包涵体内或吸附在包涵体上的核酸，这些核酸被溶解之后依然存在于多肽溶液之中，还有酶细胞破坏之后的残余成分。清洗之后，固定在色谱柱上就只剩下融合多肽，因此接下来的步骤都是在纯化的体系中进行的。

融合多肽在离液序列高、使失活的环境下固定在色谱柱上。固定之后将环境改变为cosmotropic环境，以进行诱导再折叠。

在一个优选实施例中，融合多肽的再折叠操作是通过改变缓冲液将离液序列高的环境改变至cosmotropic的环境得以进行的。

可以逐渐地或瞬间将离液序列高的缓冲液替换成cosmotropic的缓冲液。在本发明的一个优选实施例中，可以将离液序列高的缓冲液逐渐替换为cosmotropic缓冲液，此时缓冲液的作用类似一个塞子（plug）。在本发明的另一个优选实施例中，也可以将离液序列高的缓冲液瞬间替换为cosmotropic缓冲液。

缓冲液交换过程中如果调节温度将会大大促进融合多肽在色谱柱上的固定和/或再折叠和剪切。可以使用例如冷却套/加热套的方法。因此，在一个优选实施例中，使用冷却套/加热套作为温度调节；如果能预先将缓冲液的温度控制在所需范围之内更好，这样就可以达到温度调节的目的了。

当填充层中的环境改变时，融合多肽开始进行再折叠，并激活其具有自我蛋白水解功能部分的活性。之后，在自我蛋白水解部分的特异性所决定的位置上，将融合多肽C端的所需要的多肽剪切下来，因此所需的多肽便形成了一个同源N端。根据融合多肽再折叠的时间，当填充层中所有离液序列高的缓冲液都被替换时，慢慢减小cosmotropic缓冲液中移动相的速度或将其停止。当再折叠进行完毕后，通过继续添加cosmotropic缓冲液将剪切下来的所需要的多肽清洗出来。通过传统的方法将融合多肽N端具有自我蛋白水解功能的部分以及未剪切的融合多肽洗脱出来，例如，使用较高的盐浓度，改变pH值或NaOH使色谱材料再生。可以使用能将自我蛋白酶从吸附剂上剥离的缓冲液来清洗填充层，使色谱材料再生。这些缓冲液包括酸溶液、碱溶液或有机溶剂。在填充层中重新添加起始缓冲液/离液序列高的缓冲液便可进入新一轮的循环。

因为有时剪切速度无法达到预期高度值，所以可以将再生阶段中从色谱柱上清洗下来的未剪切的融合多肽再次返回至下一循环。

根据所选的缓冲液不同，所得的多肽可能为部分再折叠或完全再折叠。在本发明中，被洗脱出来的所需多肽可能为部分再折叠或完全再折叠，当然完全再折叠最好。在本发明中，有可能存在融合多肽上自我蛋白水解功能的部分可以完全再折叠，而所需的多肽保持部分未再折叠。当所需的多肽具有非常复杂的结构如二聚体或三聚体，或者包括弥补基（prosthetic group）或辅助因素（cofactor）时，就可能产生上述现象。需要特殊的环境才能对该种所需的多肽进行完全再折叠。可以通过例如质子力（protonic strength）和pH值或完全清除再折叠过程中通常添加的去污剂等采用分别的步骤来形成上述特殊的环境，使得折叠逐渐得以完全进行。

在本发明中，可以对环境进行任意修改使得融合多肽保持吸附在色谱柱上。

本发明也阐述了用于本发明中的寡肽配基和上述CSFV的N^pro的衍生物。本发明同样涉及寡肽配基和上述CSFV的N^pro的衍生物在本发明中的用途。

除非特别说明，这里所用到的所有技术和科学术语的含义均与本领域技术人员所理解的含义相同。

通过下列实施例对本发明进行了更进一步的描述，该实施例仅以说明使用并无限制。特别的，下列实施例涉及本发明的优选实施例。

实施例

实施例1：通过使用肽亲和色谱和不同种类的融合多肽制备本发明异源多肽的方法。

1.1.使用瘟病毒的N^pro自我蛋白酶制备异源多肽

本实施例描述了瘟病毒自我蛋白酶6xHis-N^pro的融合多肽GFPmut3.1的制备过程，从而，再折叠和剪切是在肽亲和基质上进行的。

以下实施例中，用于与N^pro的融合构建的GFPmut3.1是GPF的突变体，GFP非常适用于在大肠杆菌中制备。GFPmut3.1具有下列氨基酸序列替代：S2被替换为R，S65被替换为G，S72被替换为A。整个融合结构的第178至415位氨基酸序列被命名为6H-sNp-Gmut3.1-Pet30a，参见Gmut3.1的氨基酸序列。

在1.2.1.1和1.2.1.2中描述了6H-sNp-Gmut3.1-Pet30a载体的结构。

在以下的1.2.2中描述了宿主细胞的转化过程。

1.1.1色谱装置

实施例1中所使用的色谱是通过AeKTA100Explorer色谱体系（AmershamBiosciences）实现的。将制备好的肽亲和吸附剂填入HR5色谱柱中（5mm i.d.，Amersham Biosciences）。凝胶体积约为1ml。

1.1.2寡肽配基的准备

实施例1中所使用的寡肽配基按如下方法制备：

固相肽的合成是在433A肽合成器（Applied Biosystem，维也纳，奥地利）中通过Fmoc-protected氨基酸（Bachem，Bubendorf，瑞士）的1-羟基-1H-苯并三唑/N,N’-二环己基碳酰亚胺(1-hydroxy-1H-benzotriazol/N，N’-dicyclohexylcarbodiimide(HOBt/DCC))活化作用得以进行。肽在4-羟甲基-苯氧基甲基-共聚苯乙烯(4-hydroxymethyl-phenoxymethyl-copolystyrene-)1%二乙烯基苯树脂（HMP树脂，Wang树脂）上合成。侧链保护基团为酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸的叔丁基（T-Bu），谷氨酸、天冬氨酸的OtBu，赖氨酸、色氨基酸的tert-丁氧基羰基（tert-butoxycarbonyl）（Boc），以及半胱氨酸、组氨酸、天门冬素、谷氨酰胺的三苯甲基（Trt）。对于第一个氨基酸的偶合使用4-二甲基氨基吡啶（DMAP）作为催化剂。第一个氨基酸偶合之后，使用苯甲酸酐进行加帽步骤（capping step）。使用20%的哌啶完成Fmoc基的脱保护。通过含有95%的三氟乙酸（TFA），2.5%的水和2.5%的三异丙基硅烷（TIS）的剪切混合物的反应进行侧链的脱保护及其从树脂上的剪切。使用二氯甲洗脱之后，通过多次进行醛醚沉淀法然后再进行冻干法便可纯化粗氨基酸（crude peptide）。使用带有P3500泵（Amersham Biosciences，乌普萨拉，瑞士）和Luna15μC18(2)250×21.2mm色谱柱（Phenomenex，Torrence，加拿大，美国）的反相高效液相色谱，使用线性梯度为5-50%的乙腈和水（0.1%TFA），其流量为30ml/min，便可对氨基酸进行进一步的纯化。使用带有HP1090液相色谱（Hewlett Pchard，美国）和Luna3μC18(2)100×4.6mm色谱柱的分析反相高效液相色谱，使用线性梯度为每分钟1%的乙腈，便可确定氨基酸的纯度。可通过激光解吸附电离-飞行时间质谱仪（ThermoBioanalysis，Hempstead，英国）辅助基质来测定同源性和同一性。

1.1.3亲和基质的制备

实施例1中所使用的亲和基质按如下方法制备：

10g Fractogel epoxy（M）（Merk，达姆施塔特，德国）与50ml1M的二氨基二丙胺（Diaminodipropylamine（DADPA））在室温条件下反应48个小时。反应完毕之后,用50ml10mM的HCL和3遍50ml的水清洗凝胶。凝胶在水中重悬浮，加入0.1M的NaOH和2g琥珀酐（succinic anhydrid）将pH值调节至7.0。温和搅拌30min之后再加入10M的NaOH和2g琥珀酐（succinic anhydrid）使pH值达到7.0。再经过30min的温和搅拌之后，使用50ml0.1M的NaOH，50ml的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），三遍50ml的水和20%的乙醇清洗凝胶。经过抽吸干燥（suctiondrying）之后在4°C条件下保存凝胶。

1.1.4羧基的激活和肽的固定

实施例1中的亲和基质通过如下方法被激活：

如1.1.3中所述，1g湿Fractogel经过DADPA-SA隔离剂（spacer）修饰之后，再用5ml的乙腈清洗两遍。活化作用通过将3ml0.1M的琥珀酰亚胺基三氯乙烷碳酸酯（Succinimidyl trichloroethyl carbonate）和0.1M的三乙胺在乙腈中溶解3个小时得以进行。最后使用乙腈和1mM的HCL清洗凝胶。肽AFYRWYA以3mg/ml的浓度溶解在PBS中。迅速将5ml肽溶液加入凝胶中并使其反应24个小时。将肽VSFIWYK溶解在含有O.1M三乙胺的二甲基甲酰胺(DMF)中。将5ml肽溶液迅速加入凝胶中并使其反应24个小时。通过对样品偶合前后进行反相高效液相色谱分析便可确定偶合产率。

肽在CIM-epoxy上的固定：

将肽溶解在100mM的pH值为10.0，含有0.15M的NaCL的Na₂CO₃缓冲液中。由厂商提供的卡盘(cartrige)中安装有一个CIM-盘，在室温下使用P1泵(Amersham Biosciences)缓慢的循环抽取肽溶液使其经过CIM-盘，此过程持续48个小时。通过对样品偶合前后进行反相高效液相色谱分析便可确定偶合产率。偶合完成之后在pH值为10.0的条件下使用0.5M的乙醇胺对剩余的环氧基进行48个小时的嵌段(block)。

1.1.5融合多肽的表达

在10升的发酵罐培养含有具有6xHis-tag和C端融合的GFPmut3.1的N^proN端的自我蛋白酶，表达融合多肽大肠杆菌重组体HMS 174(DE3)。融合多肽的氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO 23：

1 MHHHHHHELN HFELLYKTSK QKPVGVEEPV YDTAGRPLFG NPSEVHPOST LKLPHDRGRG 60

61 DIRTTLRDLP RKGDCRSGNH LGPVSGIYIK PGPVYYQDYT GPVYHRAPLE FFDEAOFCEV 120

121 TKRIGRVTGS DGKLYHIYVC VDGCILLKLA KRGTPRTLKW IRNFTNCPLW VTSCSGTMRK 180

181 GEELFTGVVP ILVELDGDVN GHKFSVSGEG EGDATYGKLT LKFICTTGKL PVPWPTLVTT 240

241 FGYGVQCFAR YPDHMKQHDF FKSAMPEGYV QERTIFFKDD GNYKTRAEVK FEGDTLVNRI 300

301 ELKGIDFKED GNILGHKLEY NYNSHNVYIM ADKQKNGIKV NFKIRHNIED GSVQLADHYQ 360

361 QNTPIGDGPV LLPDNHYLST QSALSKDPNE KRDHMVLLEF VTAAGITHGM DELYK

细菌宿主细胞，也就是表达菌株(expression strain)，其培养是按照已知的微生物学方法实践(microbiological practice)进行的。一般情况下，表达菌株是由单克隆在培养基上培养形成的，当然也可以使用低温的细胞悬浮液(细胞银行)。通常需要经过多级工艺培养菌株来获得足够的生物量以备后用。

在小规模培养情况下，可以在摇瓶中进行，大多数情况使用复合培养基(例如LB肉汤培养基)进行培养。也可以使用成分明确的培养基培养基(例如柠檬酸盐培养基)。首先要对宿主细胞(使用单克隆接种或低温培养(cryo-culture)的细胞悬浮液进行接种)进行小体积的预培养(pre-culture)，一般情况下，此培养过程中的温度对于后续的表达结果不是关键的，所以惯常在相对高的温度下(例如30℃或37℃)进行培养。主要的培养过程是在较大的体积(例如500m1)内进行的，此过程尤其需要保证良好的通风(与内含物的体积对比，高速旋转大体积摇瓶)。由于希望表达以不溶的包涵体的形式进行，所以大部分情况下，主要的培养过程也需在相对较高的温度(例如30℃或37℃)下进行。诱导系统非常适用于制备包涵体(例如含有trp，lac，tac，phoA启动子)。当达到对数生长晚期(1atelogarithmic phase)时(通常为当摇瓶中的光学密度为0.5至1.0时)，添加诱导物（例如吲哚丙稀酸，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷＝IPTG）然后持续进行1到5小时的孵育（incubation）。在此期间，大多数的N^pro融合多肽以包涵体的形式在细胞质中沉淀下来。可以收集最终形成的细胞并对其进行进一步的处理。

在大规模培养情况下，多级体系由大量的生物反应器（发酵罐）组成，在这种情况下优先使用成分明确的培养基以改进整个方法的工艺工程控制（processengineering control）。另外，通过在培养基中定量添加特殊的营养（分批次（fedbatch））还可以大大增加生物量和生产量。此外，此工艺与使用摇瓶培养类似。例如，使用一个初期发酵罐和一个主要发酵罐，选择与摇瓶工艺内相似的培养温度。在初期发酵罐中使用在摇瓶中由单克隆或低温培养物（cryoculture）培养得来的所谓的接种物（inoculum）进行接种(inoculate)。在发酵罐中，尤其是在主要培养过程中必须还保证良好的通风以及充足的诱导物浓度。然而，在某些情况下，诱导期的时间必须明显大于摇瓶过程中的时间。最终形成的细胞被进行进一步处理。

1.1.6包涵体的分离

收集最终形成的细胞之后，将细胞（湿重850g）悬浮在pH值为8.0的含有2500ml的50mM的Tris/HCL，5mM的EDTA和1%的Triton X-100的溶液中。冷的悬浮液在800bar的压强下三次通过APV-2000高压均质器（Invensys）使细胞得以破裂。在经过高压均质器的过程中，用冰块冷冻悬浮液，用Ultraturrax使细胞均质化。对匀浆进行低速（JLA10.500，7500rpm，30min）离心分离以获得含有重组融合多肽的包涵体。

1.1.7包涵体的溶解

将圆颗粒（pellet）悬浮在pH值为8.0的含有2500ml的50mM的Tris/HCL，5mM的EDTA和1%的Triton X-100的溶液中，然后进行离心分离。重复进行此步骤。通过水洗步骤之后，圆颗粒（pellet）便悬浮在水中。得到的包涵体悬浮液被储存在-20℃的环境下以备进一步使用。在室温条件下，使用pH值为7.3的含有50mM Tris/HCL、10M尿素和50mM的DTT的溶液以1:5的比例对包涵体悬浮液进行稀释。通过离心分离将不溶解的成分清除出来。获得约为15mg/ml的多肽浓度。使用pH值为7.3的含有50mM Tris/HCL、100mM的NaCL和4M的尿素的溶液对多肽溶液进行稀释直至多肽浓度达到约2mg/ml。

1.1.8融合多肽在色谱柱上的固定

将0.5ml的多肽溶液加入Fractogel-DADPA-SA-VSFIWYK（0.5×0.5cm）基质中，借此该多肽的制备及结合按照1.1.2和1.1.3中所述的方法进行。使用pH值为7.3的50mM Tris/HCL、100mM的NaCl和4M的尿素以50cm/h的流速对色谱柱进行平衡。注入样品之后，该流速增加至150cm/h。

1.1.9未固定杂质的清洗

使用5倍色谱柱体积的平衡缓冲液对未固定成分进行清洗。之后更换为再折叠缓冲液，特别是pH值为7.3的含有0.5M的Tris/HCl、2mM的EDTA、3％的丙三醇和5mM的DTT的缓冲液，该缓冲液体积为4.5倍色谱柱体积。

1.1.10折叠、剪切和洗脱

将离液序列高的环境改变至cosmotropic环境之后，通过停止缓冲液的流动使融合多肽在色谱树脂上进行25个小时的再折叠。活性的自我蛋白酶将C端的GPFmut3.1剪切下来。使用再折叠缓冲液以50cm/h的低流速进行洗脱，经荧光测试器以及SDS-PAGE确定，洗脱出的物质为纯净的天然GPFmut3.1。

1.1.11再生

使用O.1M的NaOH，以50cm/h的低流速对色谱树脂进行再生操作。

1.2使用瘟病毒的N^pro自我蛋白酶的衍生物制备异源多肽

本实施例描述了瘟病毒N^pro自我蛋白酶的突变体(6xHis-N^proEDDIE)的融合多肽GPFmut3.1的制备，此制备过程中，再折叠和酶切都是在肽亲和基质上进行的。

寡肽配基和亲和基质的制备如实施例1.1中所述，使用与实施例1中相同的色谱装置。

1.2.1质粒的结构

1.2.1.1 7H-Np-Gmut3.1-pET30a质粒的结构

一个含有截去N端的(N-terminally truncated)、N端带有7-His tag的N^pro基因的DNA片段从NP6-pET(Sandoz)质粒上进行PCR扩增，并经由Ndel和Kpnl(Asp718)限制位点(restriction sites)被插入到pET-30a(#69909-3，2002-2003catalogue，Novagen，CN Bioscience公司，Merck KgaA，达姆施塔特，德国)中。引物对：

T7-pET(SEQ ID NO24)：

5′-GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG-3′；

N^proR-Kpn(SEQ ID NO25)：

5′-ATA CGG TAC CAG AGC AAC TAG TTA CCC ATA ATG-3′

通过接合反应(1igation reaction)转化大肠杆菌DH5alpha(#10643-013，Invitrogencatalogue2003，Invitrogen Life Technologies Corporation，1600Faraday Avenue，POBox6482Carlsbad，加利福尼亚，92008)，从转化的克隆体中分离出来DNA质粒，经测序确认所得为7H-N^pro-pET30a质粒。GFPmut3.1质粒也可以通过pGFPmut3.1质粒(#6039-1，catalogue1999，BD Biosciences Clonetech，1020East Meadow Circle，Palo A1to，加拿大94303-4230，美国)进行PCR扩增。

引物对：

GFP F-Kpn(SEQ ID NO26)：

5′-GAA AGG TAC CAT GCG TAA AGG AGA AG-3′

GFP R-Sal(SEQ ID NO27)：

5′-TAA GTC GAC TTA TTT GTA TAG TTC ATC CAT GCC-3′

通过凝胶离析并经由Kpnl—Sa/l限制位点(restriction sites)克隆到7H-N^pro-DET30a结构中，结果在剪切位点之后形成SGT(丝氨酸-氨基乙酸-苏氨酸)氨基酸序列。经证实，7H-Np-Gmut3.1-pET30a结构的氨基酸序列如上所示。

1.2.1.2 6H-sNp-Gmut3.1-pET30a质粒的结构

N^pro-胰岛素原的DNA序列(SEQ ID NO28)：

ATGGAACTCAATCATTTCGAACTGCTCTACAAAACTAGCAAGCAAAAACCTGTTGGCGTTGAAGAGCCGGTCTACGATACTGCAGGTCGTCCTCTTTTTGGGAATCCGTCCGAAGTGCACCCCCAGTCAACCCTCAAGCTTCCCCATGACCGCGGACGCGGTGACATTCGTACAACGCTGCGCGATCTGCCTCGTAAAGGCGATTGTCGCTCTGGAAACCACCTAGGTCCGGTGTCGGGCATTTACATTAAACCAGGTCCCGTCTATTACCAAGACTACACTGGTCCGGTTTACCATCGTGCACCTCTGGAATTCTTTGATGAAGCTCAATTTTGCGAAGTGACTAAACGTATTGGCCGTGTAACCGGTTCGGACGGGAAACTGTACCACATCTACGTGTGCGTTGATGGCTGTATCCTGCTGAAACTCGCGAAGCGCGGAACCCCTCGCACCCTGAAATGGATCCGTAACITCACTAACTGTCCACTGTGGGTCACTAGTTGCTTCGTTAACCAACATCTGTGCGGTTCACACCTTGTGGAAGCCCTGTATCTGGTGTGTGGCGAACGCGGATTCTTTTATACCCCGAAAACGCGGCGCGAAGCCGAAGATCTTCAGGTTGGTCAAGTGGAACTGGGCGGAGGTCCGGGAGCCGGGAGCCTGCAACCGCTGGCGCTTGAAGGGTCGCTGCAAAAACGCGGTA TTGTTGAACAGTGCTGTACCTCCATCTGCTCTCTGTATCAGCTGGAAAACTACTGCAATTAATAA

该DNA序列经过定制合成(custom-synthesized)并被插入到OperonBiotechnologies公司(1000Atlantic Avenue，Suite108A1ameda，加拿大94501，美国)的pUC119(NCBI#U07650：National Center for Biotechnology InformationPlasmid Database，National Library of Medicine，Building38A，Bethesda，马里兰20894，美国)中。从这种质粒，粗体表示的N^pro-胰岛素原(pro-insulin)的序列可以通过下列引物对进行PCR扩增：

6H-N^pro-F-Ndel(SEQ ID NO29)：

5′-CTC TCA TAT GCA TCA CCA TCA TCA TCA CGA ACT CAA TCATTTCGA ACT GCT C-3′

和Ins-R-Sall(SEQ ID NO30)：

5′-CTT TCG TCG ACT TAT TAA TTG CAG TAG TTT TC-3′

通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶提取(gel extraction)分离最终获得的片段，并通过新形成的Ndel和Sall(粗体字母)的限制位点(restriction sites)接合到pET30a载体(#69909-3，2002-2003catalog，Novagen，CN Biosciences公司，Merk KgaA，达姆施塔特，德国)中，并在同样的限制位点处剪切形成6H-sN^pro-Ins-Pet30a。所述的6H-sN^pro-Ins-Pet30a在Spel和Sa/1的限制位点上被剪切，通过凝胶电泳和凝胶提取(extraction)将较长的片段分离出来，从而删除胰岛素原序列。插入之前的准备工作是使用相同的酶消化载体7HNp-Gmut3.1-pET30a(结构见1.2.1.1)并使用凝胶提取(gel extraction)将编码GFPmut3.1的准确的DNA片段分离出来。将DNA片段接合在准备好的载体中，得到6H-sNp-Gmut3.1-pET30a结构。其DNA序列如1.2.1.1中所示。

1.2.1.3S-Np-Ins-Pet30a的结构

对含有N^pro-pro-insulin的DNA序列的构造进行定制合成(custom-synthesized)，并将其插入到Operon Biotechnologies公司的pUCll9中。使用下列引物对对所需的N^pro-pro-insulin的序列进行PCR扩增：

N^pro-F-Ndel(SEQ ID NO31)：

5′-CGCGACATATGGAACTCAATCATTTCGAAC-3′

和Ins-R-Sall(SEQ ID NO30)

经过琼脂糖凝胶电泳和凝胶提取分离最终形成的片段，并通过新形成的Ndel和Sall(粗体字母)的限制位点接合在载体pET30a中，并在相同的限制位点剪切。sN^pro-Ins-pET30a质粒的DNA序列如1.2.1.1中所示。

1.2.1.4 6H-EDDIE-sGmut3.1-Pet30a质粒的结构

对含有N^pro-pro-insulin的DNA序列的构造进行定制合成，并将其插入到Operon Biotechnologies公司的pUC119中。使用下列引物对对所需的N^pro-pro-insulin的序列进行PCR扩增：

N^pro-F-Ndel(SEQ ID NO31)

和

N^pro-R-Sall(SEQ ID NO32)：

5′-CGC AGA GAT GTT GGT CGA CGC TGC AAC TAG TG-3′

经由新形成的Ndel和Sall(粗体字母)的限制位点将其插入到形成pET30a载体中形成S-NP-6H-pET30a。对S-Np-6H-pET30a使用两个标准50kd PCR反应扩增N^pro的序列：第一个反应使用50pmol的N^pro-F-Ndel引物(见表1)和50pmol回向突变引物(3’-)，5单位的Taq DNA聚合酶(#GC002004，2004catalog，Genecraft，Treskow街10，D-48163明斯特，德国)，1×PCR缓冲液(#GC00206，2004catalog，Genecraft)和20nmol的各种dNTP混合物(#GC013004，2004catalog，Genecraft)；第二个反应使用50pmol的N^pro-R-S引物见下表1)和50pmol正向突变引物(5’-)，5单位的Taq DNA聚合酶，1×PCR缓冲液和20nmol的各种dNTP混合物。PCR反应在一个加热的热循环罩中进行，其内使用下列程序：94°C：3min；25个循环：94°C：30sec，54°C；30sec，68°C：lmin；最后在68°C下孵育7min。按照厂商建议(

Spin手册，2002年7月)使用QIAquick PCR Purification Kit(股份有限公司，Qiagen街1，D40724Hilden，德国，Cat．Nr．28106，Qiagen Product Guide2004)清除游离引物。将百分之一的两种PCR联合起来并使用50pmol的N^pro-F-Ndel引物(SEQ ID NO.31)和50pmol的N^pro-R-Sall引物(SEQID NO32)、5单位的Taq DNA聚合酶(Genecraft)、1×PCR缓冲液(Genecraft)和20nmol各种dNTP混合物(Genecraft)将其在加热的热循环套中扩增，热循环套中使用下列程序：94°C：3min；25个循环：94°C：30sec，54°C：30sec，68°C：1min；最后在68°C下孵育7min。按照厂商建议使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)清除游离引物。经由Ndel和Sall限制位点，PCR片段被插入到pET30a载体中。之后此构造被用于突变步骤。氨基酸通过六个连贯的步骤一个接着一个的改变，各自引物的选择如下表1中所示。通过上述DNA序列分析(见1．2．1．1)可以控制每一个步骤中出来的质粒。通过下列引物对的简单PCR反应完成最后一个突变步骤(1155T和F158T)。

N^pro-F-Ndel(SEQ ID NO31)

和

3′_1155T,F158T(SEQ ID NO33)：

5′-GCA ACT AGT GAC CCA CAG TGG ACA GTT AGT GGT GTT ACG GGT CCA TTTCAG G-3′

得到的PCR产物经由Ndel和Spel(粗体，见下表1)限制位点被插入到S-Np-6H-pET30a中。通过上述DNA序列分析(1．2．1．1)可以确定EDDIE-6H-pET30a构造的序列。

表1：

在EDDIE-6H-pET30a上使用下列引物对对其进行PCR扩大：

可以使用6H-N^pro-F-Ndel，（SEQ ID NO29）和N^pro-R-Sal，（SEQ ID NO32）以及最终形成的片段，经由S-Np-Ins-pET30a（见1.2.1.3）构造上的Ndel和Spel（粗体字母）限制位点来替换N^pro，形成6H-EDDIE-Ins-pET30a。6H-EDDIE-Ins载体被Spel/Sa/l消化，通过凝胶电泳和凝胶提取出较长的片段，从而删除胰岛素原序列。插入过程是在经Operon Biotechnologies公司定制制备的pUC119中从含有合成sGFPmut3.1基因（SEQ ID NO46）的构造上，使用下列引物对(SEQ ID NO47和SEQ ID NO48)通过PCR得以实现的。

SEQ ID NO46

TGCAGCAAAGGCGAAGAAGTGTTTACCGGTGTCGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGTCATAAATTTAGCGTGAGCGGCGAAGGTGAAGGCGATGCGACCTATGGTAAACTGACCCTGAAATTTATTTGCACCACCGGCAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCTTTGGTTATGGCGTGCAGTGCTTTGCGCGCTATCCGGATCACATGAAACAGCATGATTTTTTTAAAAGCGCGATGCCGGAAGGTTATGTGCAGGAACGCACCATTTTTTTTAAAGATGATGGCAACTATAAAACCCGCGCGGAACTGAAATTTGAAGGTGATACCCTGGTGAACCGCATTCAACTGAAACGCATTGATTTTAAAGAAGATGGTAACATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAACTATAACAGCCATAACGTGTATATTATGGCGGATAAACAGAAAAACGGTATTAAAGTCAACTTTAAAATTCGCCATAACATTGAAGATGGCAGCGTGCAGCTGGCGGATCATTATCAGCAGAACACCCCGATTGGTGATGGCCCGGTGCTGCTGCCGGATAACCATTATCTGAGCACCCAGAGCGCGCTGAGCAAAGATCCGAACGAAAAACGCGATCACATGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCGGCGGGTATTACGCATGGCATGGATGAACTGTATAAATAATAA

sGFP-F-Spe,(SEQ ID NO47):

5′-GGA TGC ACT AGT TGC AGC AAA GGC GAA G-3′

和

sGFP-R-Sal(SEQ ID NO48):

5′-CGA GGT CGA CTT ATT ATT TAT ACA GTT CAT C-3′.

之后，纯化的PCR产物被Spel/Sa/l消化并被接合（ligated）在6H-EDDIE-Ins的Spel/Sa/l片段中，使用sGmut3.1替代胰岛素原基，因以形成6H-EDDIE-sGmut3.1-pET30a构造。每个步骤中的DNA序列都如上所述（见1.2.1.1）得以控制。

1.2.2转化

在1升的细菌培养基上培养电转化感受态细胞（在37°C、225rpm条件下生长至OD₆₀₀=0.5）。用冰块冷冻细胞悬浮液15分钟（连续搅拌），沉淀（pelleted）（4°C，2500g，10min）之后将上清液全部移除。在4°C条件下将剩下的圆颗粒（pellet）再次悬浮在1升的去离子水中，减缓搅拌速度（spun down）（4°C，2500g，10min）并通过间歇离心分离步骤（4°C，2500g，10min）使用50ml的去离子水（4°C）清洗两遍。最后使用50ml的10%的已消毒的丙三醇溶液（4°C）清洗圆颗粒，沉淀（4°C，2500g，10min）之后将其再次悬浮在2.5ml的10%的已消毒的丙三醇溶液中（4°C），然后将其冰冻并以40μl的等份储存在-80°C条件下。使用冰块将一等份的电转化感受态细胞解冻，再进行1μl的包含有5ng的DNA的接合反应，并在没有气泡的情况下将其传送到电极间距为1mm的电穿孔试管（electroporationcuvette）中。使用包含有BIO-RAD脉冲控制器（Bio-Rad Laboratories公司，2000Alfred Nobel Drive，Hercules，加拿大94547，美国；cat.n.1652077，Life ScienceResearch Products1998）的BIO-RAD基因脉冲发生器（Bio-Rad Laboratories公司，2000Alfred Nobel Drive，Hercules，加拿大94547，美国；cat.n.1652098，Life ScienceResearch Products1998）进行电穿孔，其内参数设置为1.5kV，25μF，200Ohms，时间常数不超过4.5ms。此后立即添加180μl的TY培养基（1.0%w/v的蛋白胨，0.7%w/v的酵母浸出物，0.25%w/v的NaCl），将悬浮液移至14ml的已消毒的塑料管中并孵育30min（37°C，225rpm）。之后将悬浮液放置在选择培养基上。经37°C过夜的孵育便可获取克隆，将其移至2ml的TY培养基并在37°C、225rpm的条件下孵育过夜。通过标准方法使用1ml的过夜培养物来制备质粒，质粒的制备受限制性分析（restriction analysis）和DNA测序支配。经过序列分析之后质粒被用于表达菌株中更进一步的转化（transformation），其方法将在本文中阐述。

1.2.3融合多肽的表达

重组大肠杆菌HMS174（DE3）包含一个表达融合多肽的pET30质粒，该融合多肽具有N端自我蛋白酶6H-N^proEDDIE，C端为GFPmut3.1，其氨基酸序列如下所示，上述重组大肠杆菌的培养是在装有1.8升的LB培养基的摇瓶中进行的。

SEQ ID NO49:

1 MHHHHHHELN HFELLYKTSK QKPVGVEEPV YDTAGRPLFG NPSEVHPQST LKLPHDRGED 60

61 DIETTLRDLP RKGDCRSGNH LGPVSGIYIK PGPVYYQDYT GPVYHRAPLE FFDETQFEET 120

121 TKRICRVTGS DGKLYHIYVE VDGEILLKQA KRGTPRTLKW TRNTTNCPLW VTSCSKGEEL 180

181 FTGVVPILVE LDGDVNGHKF SVSGEGEGDA TYGKLTLKFI CTTGKLPVPW PTLVTTFGYG 240

241 VQCFARYPDH MKQHDFFKSA MPEGYVQERT IFFKDDGNYK TRAEVKFEGD TLVNRIELKG 300

301 IDFKEDGNIL GAKLEYNYNS HNVYIMADKQ KNGIKVNFKI RHNIEDGSVQ LADHYQQNTP 360

361 IGDGPVLLPD NHYLSTQSAL SKDPNEKRDH MVLLEFVTAA GITHGMDELY K

细胞的培养如1.1.5中所述。

包涵体的分离

细胞的破碎是通过酶得以实现的。简要地说，将细胞悬浮在40ml的pH值为8.2的含有20mM的Tris/HCl、5mM的EDTA、2mM的MgCl₂的溶液中。添加72mg的溶解酶和300U的

在室温下孵育45min之后，加入1.3g NaCl和0.5ml Triton X-100。再过15min之后，对悬浮液进行离心分离（Beckman JA25.50，10000rpm，15min，4°C）以获得包涵体。

1.2.4包涵体的溶解

使用20ml的0.5%的脱氧胆酸对圆颗粒进行一次清洗，再使用20ml的1M的NaCl对圆颗粒进行两次清洗，之后再用水清洗。剩余的圆颗粒（湿重约为2g）被悬浮在10ml的水中并保存在-20°C条件下作进一步的使用。

使用pH值为7.3的含有50mM的Tris/HCl、10M的尿素的溶液以1:5的比例稀释一等份的悬浮液，从而溶解包涵体。离心分离除去不溶成分之后再使用pH值为7.3的含有50mM的Tris/HCl、100mM的NaCl和4M的尿素的溶液以1:5的比例稀释上述溶液。

1.2.5包涵体的固定

将2ml的多肽含量约为2mg/ml的溶液按前述的方法添加到肽亲和基质上。简要地说，使用pH值为7.3的含有50mM的Tris/HCl、100mM的NaCl、4M的尿素的溶液平衡Fractogel-DADPA-SA-AFYRWYA。以25cm/h的低速注入2ml的样品。

1.2.6未固定的杂质的清洗

使用5倍色谱柱体积的平衡缓冲液对未固定成分进行清洗，流速为150cm/h。之后更换为pH值为7.3的含有200mM的Tris/HCl、2mM的EDTA、10%的丙三醇的缓冲液进行再折叠过程，该缓冲液体积为4.5倍色谱柱体积。

1.2.7再折叠、剪切和洗脱

停止缓冲液的流动，使固定的融合多肽进行25h的再折叠。在再折叠过程中，固定的蛋白酶在其特异位点剪切并释放出融合成分（fusion partner）GFPmut3.1。之后使用pH值为7.3的含有200mM的Tris/HCl、2mM的EDTA、10%的丙三醇的缓冲液以150cm/h的流速对融合多肽进行洗脱。收集1ml的片段并在280nm吸光率、488nm荧光性和520nm光发射条件下对其进行分析。仍含有融合成分GFPmut3.1的片段通过SDS-PAGE进行进一步的分析以获得纯化的GFPmut3.1。

1.2.8再生

洗脱出剪切下来的所需的多肽之后，需要使用5倍色谱柱体积的0.1M的NaOH溶液以150cm/h的流速对色谱柱进行再生操作。

实施例2：

采用固定金属例子亲和色谱制备异源多肽的方法

本实施例描述了瘟病毒N^pro自我蛋白酶（6xHis-N^proEDDIE）突变体的融合多肽GFPmut3.1的制备，在此制备过程中，再折叠和剪切都是在固定金属离子色谱基质上进行的。

His标记被引入融合多肽中使在固定金属离子亲和色谱和多肽亲和色谱中都可以使用到相同的构造，以便对两种方法进行直接对比。在亲和色谱中，融合多肽与寡胎配基的相互作用并不需要标记。

包涵体的制备和溶解如实施例1.2.4和1.2.5中所述。

2.1色谱柱的准备，融合多肽在色谱柱上的固定

将Chelating Sepharose Fast flow（Amersham Biosciences）以0.5i.d.×5cm的层（bed）尺寸填入色谱柱中，用水将储藏溶液清洗出来。接着将金属离子Ni^2＋装载在色谱柱上。使用约三分之二的色谱柱体积的100mM的NiCl₂或NiSO₄。未被固定的Ni^2＋离子被清洗出来。使用pH值为7.3的含有50mM的Tris、100mM的NaCl、4M的尿素的溶液平衡色谱柱之后，0.5ml含量约为2mg/ml的多肽溶液会被固定在色谱柱上。装载流速（loading flow rate）为50cm/h。

2.2未固定的杂质的清洗

使用5倍色谱柱体积的平衡缓冲液将未固定成分清洗出来之后，将平衡缓冲液改变为pH值为7.3的含500mM的Tris/Acetate，0.25M的蔗糖，1mM的DTT的缓冲液。

2.3再折叠、剪切和洗脱

使用4.5倍色谱柱体积的缓冲液之后停止缓冲液的流动，使融合多肽进行再折叠，在再折叠过程中自我蛋白酶将融合成分（fusion partner）剪切下来。再次使用lml的流速为150cm/h，pH值为7.3的含有50mM的Tris／Acetate、0．25M的蔗糖、1mm的DTT的缓冲液便可分离出所需的多肽。收集片段，并使用荧光测量装置和SDS-PAGE对其进行分析。

2．4再生

使用流速为50cm／h，pH值为3．5的含有50mM醋酸盐、6M的氯化胍对色谱树脂进行再生。

实施例3：

N^proEDDIE-sSPA-D在色谱柱上的剪切

本实施例描述了通过瘟病毒N^pro自我蛋白酶(N^proEDDIE)的突变体的融合蛋白表达(expression)制备葡萄球菌A蛋白质D结构域的过程，再折叠和剪切都是在多肽亲和基质上进行的。通过下列方法制备包含N^proEDDIE自我蛋白酶且C端连接有A蛋白质D结构域(sSPA-D)的被称做N^proEDDIE-sSPA-D的融合蛋白。

重组大肠杆菌HMS174(DE3)包含一个表达融合多肽的pET30质粒，其氨基酸序列如下所示，根据1．1．5中所述，该重组体在101的发酵罐中培养。整个融合构造的1到168位氨基酸为N^proEDDIE的序列，169到229位氨基酸为sSPA-D的序列。

1 11 21 31 41 51

l l l l l l

1 MELNHFELLY KTSKQKPVGV EEPVYDTAGR PLFGNPSEVH PQSTLKLPHD RGEDDIETTL 60

61 RDLPRKGDCR SGNHLGPVSG IYIKPGPVYY QDYTGPVYHR APLEFFDETQ FEETTKRIGR 120

121 VTGSDGKLYH IYVEVDGEIL LKQAKRGTPR TLKWTRNTTN CPLWVTSCAD AQQNKFNKDQ 180

181 QSAFYEILNM PNLNEEQRNG FIQSLKDDPS QSTNVLGEAK KLNESQAPK

包涵体的分离和溶解如实施例1．1中所述。

融合多肽在色谱柱上的固定

使用流速为150cm／h，pH值为7．3的含有50mM的Tris／HCl、100mM的NaCl、4M的尿素的溶液平衡Fractogel-DADPA-IT-多肽(0．5×5cm)基质，各个多肽的选择和结合通过之前所述的方法进行。使用lml线流速为50cm／h的多肽溶液。当注入样品之后多肽溶液的流速增加至150cm／h。

未固定杂质成分的清洗

使用5倍色谱柱体积的平衡缓冲液清洗未固定成分。之后更换为再折叠缓冲液，特别是pH值为7．3的含有1M的Tris／HCl、2mM的EDTA、0．25M的蔗糖、10M的α-单硫代甘油(α-monothioglycero1)的缓冲液，该缓冲液体积为6倍色谱柱体积。

再折叠，剪切和洗脱

当把离液序列高的环境改变为cosmotropic环境之后，通过停止缓冲液的流动使融合多肽在色谱树脂上进行25h的再折叠。具有活性的自我蛋白酶将C端连接的sSPA-D剪切下来。使用再折叠缓冲液进行最终的洗脱得到天然的sSPA-D。使用流速为150cm/h的10CV的0.2M的NaOH对基质进行再生。

实施例4：

6His-N^proEDDIE-GFPmut3.1在色谱柱上的再折叠和剪切

本实施例描述了使用经6His-N^proEDDIE-GFPmut3.1融合多肽的表达制备天然GFPmut3.1的过程，再折叠和剪切在被称作为Actigel-polyKW的亲和基质上进行。色谱环境与前面所述相同。

实施例5：

N^proEDDIE-sSPA-D在色谱柱上的剪切

本实施例描述了使用N^proEDDIE-sSPA-D融合多肽的表达制备天然sSPA-D，再折叠和剪切在被称作为Actigel-polyKY的亲和基质上进行。色谱环境与前面所述相同。

实施例6：

使用阳离子交换色谱在色谱柱上进行再折叠

粗品（Crude）N^pro37-6His

((1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168))包涵体提取物（extracts）被悬浮在pH值为7.0的含有8M尿素、50mM的磷酸钠溶液中。最后得到的蛋白质浓度为0.5mg/ml。2ml装载在HiTrapSP琼脂糖FF色谱柱（2.5×0.7cm i.d.；色谱柱体积为1ml；GE Healthcare）上，首先使用与上述相同的缓冲液以50cm/h的线流速进行平衡。之后将缓冲液改为pH值为7的包含有50mM的磷酸钠、2mM的EDTA、5%的丙三醇、10mM的α-monothioglycerol（MTG）的缓冲液。在室温下令蛋白质进行1h的再折叠。进一步使用再折叠缓冲液可以将经过再折叠和剪切的蛋白质洗脱出来。使用pH值为7的含有2M的NaCl、50mM的磷酸钠可以进行再生操作。通过SDS-PAGE分析可以监控融合蛋白（6His）的再折叠。

Claims

1.一种使用包含有所需多肽和连接在所需多肽N端的，具有自我蛋白水解功能的多肽的融合多肽制备具有同源N端的异源所需多肽的方法，该方法包括以下步骤：a)使用亲和色谱体系将融合多肽以可溶的、自我蛋白水解功能失活的形态固定，b）再折叠融合多肽，以便激活融合多肽的自我蛋白水解功能并使所需的异源多肽剪切，c)随后洗脱所需的异源多肽，其中所述的步骤都在一个亲和色谱体系中进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的融合多肽是通过细菌宿主细胞中以包涵体形态的重组表达制备而成，所使用的通过含有编码融合多肽的核酸分子的表达载体转化宿主细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的具有自我蛋白水解功能的多肽为自我蛋白酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的自我蛋白酶是瘟病毒属的N^pro，或其具有自我蛋白水解功能的衍生物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的瘟病毒属选自CSFV、BDV或者BVDV。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的自我蛋白酶是CSFV的N^pro，其氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO1：

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKUAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168)，或为其具有自我蛋白水解功能的衍生物的氨基酸序列。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述的自我蛋白酶是CSFV的N^pro的一种衍生物，其氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO2：

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYVQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168)。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述的自我蛋白酶是CSFV的N^pro的一种衍生物，其氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO3:

9.根据权利要求5所述的方法，其中所述的自我蛋白酶是CSFV的N^pro的一种衍生物，其氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO4.

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTCSDGKLYHIYVEVDGEILLXLAKRGTPRTLKWTENTTNCPLWVTSC-(168)。

10.根据权利要求5所述的方法，其中所述的自我蛋白酶是CSFV的N^pro的一种衍生物，其氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO5:

11.根据上述任一项权利要求所述的方法，其中所述的亲和色谱体系选自固定金属离子色谱(IMAC)、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、纤维素结合域色谱或者肽亲和色谱。

12.根据权利要求11中所述的方法，其中所述的亲和色谱体系为固定金属离子色谱，而且其中所述的融合多肽含有金属螯合亲和标记。

13.根据权利要求12中所述的方法，其中所述的金属螯合亲和标记为多聚组氨酸。

14.根据权利要求11中所述的方法，其中所述的亲和色谱体系为阳离子交换色谱，而且其中所述的融合多肽含有聚阳离子亲和标记。

15.根据权利要求14中所述的方法，其中所述的聚阳离子亲和标记选自聚精氨酸或者聚赖氨酸。

16.根据权利要求11中所述的方法，其中所述的亲和色谱体系为阴离子交换色谱，而且其中所述的融合多肽包含有聚阴离子亲和标记。

17.根据权利要求16中所述的方法，其中所述的聚阴离子标记为聚天门冬素。

18.根据权利要求11中所述的方法，其中所述的肽亲和色谱体系中使用长度为5至12个氨基酸长度的、包含色氨酸残基的寡肽配基，在离液序列高的环境中，该配基选择性的与融合多肽上具有自我蛋白水解功能的部分固定，当从离液序列高的环境改变至cosmotropic环境中时，该配基与融合多肽上具有自我蛋白水解功能的部分仍然保持固定。

19.根据权利要求18中所述的方法，其中所述的寡肽配基的长度为6至8个氨基酸的长度。

20.根据权利要求19中所述的方法，其中所述的寡肽配基的氨基酸序列选自：

SEQ ID NO6:VSIFEW，

SEQ ID NO7.AVSIEWY，

SEQ ID NO8:AVSFIWY，

SEQ ID NO9：VSFIWYK，

SEQ ID NO10:ASRFWYA，

SEQ ID NO11:AFYTWYA，

SEQ ID NO12:AFYRWYK，

SEQ ID NO13:AFYRWY，

SEQ ID NO14:AFYRWYA，

SEQ ID NO15:AVSIFEWY，

SEQ ID NO16:AVSRNWY，

SEQ ID NO17:ASRFWY，

SEQ ID NO18:AFYRWYAA，

SEQ ID NO19:AFYRWY，

SEQ ID NO20:ASRFWYAA，

SEQ ID NO21：AFYRWYAA，

SEQ ID NO22：AFYSWYAA。

21.根据权利要求18中所述的方法，其中所述的根据SEQ ID NO5的天然CSFV的N^pro的衍生物，用于与选自如下所示的寡肽配基相结合

SEQ ID NO10:ASRFWYA，

SEQ ID NO11：AFYTWYA，

SEQ ID NO12：AFYRWYK，

SEQ ID NO13：AFYRWY和

SEQ ID NO14：AFYRWYA。

22.根据上述任一项权利要求所述的方法，其中融合多肽的再折叠步骤通过改变缓冲液将离液序列高的环境改变至cosmotropic环境得以实现。

23.根据上述任一项权利要求所述的方法中使用的寡肽配基。

24.根据权利要求1至22任一项所述的方法中使用的CSFV的N^pro的衍生物。

25.寡肽配基在权利要求1至22中任一项所述方法中的应用，其中所述的寡肽配基的氨基酸序列选自：

SEQ ID NO6:VSIFEW，

SEQ ID NO7：AVSIEWY，

SEQ ID NO8:AVSFIWY，

SEQ ID NO9：VSFIWYK，

SEQ ID NO10:ASRFWYA，

SEQ ID NO11:AFYTWYA，

SEQ ID NO12:AFYRWYK，

SEQ ID NO13:AFYRWY，

SEQ ID NO14:AFYRWYA，

SEQ ID NO15:AVSIFEWY，

SEQ ID NO16:AVSRNWY，

SEQ ID NO17:ASRFWY，

SEQ ID NO18:AFYRWYAA，

SEQ ID NO19:AFYRWY，

SEQ ID NO20:ASRFWYAA，

SEQ ID NO21:AFYRWYAA，

SEQ ID NO22:AFYSWYAA。

26.CSFV的N^pro的衍生物在权利要求1至22中任一项所述方法中的应用。