MX2013000672A - Metodo para identificar un paciente con probabilidad incrementada de responder a una terapia anti-cancer. - Google Patents

Metodo para identificar un paciente con probabilidad incrementada de responder a una terapia anti-cancer.

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Sanne Lysbet De Haas
Rebecca Elliott
Johann Karl
Yu-Ju Gloria Meng
Gregory D Plowman
Stefan Scherer
Norbert Wild
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Abstract

La invención provee métodos para identificar pacientes que se pueden beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF. La invención también provee métodos para monitorear la respuesta del paciente a la terapia anti-cáncer. La invención también provee kits y artículos de manufactura para uso en los métodos.

Description

MÉTODO PARA IDENTIFICAR UN PACIENTE CON PROBABILIDAD INCREMENTADA DE RESPONDER A UNA TERAPIA ANTI-CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con métodos para identificar cuales pacientes se beneficiarían en su mayoría de tratamiento con agentes anti-cáncer y el monitoreo de pacientes en cuanto a su sensibilidad y responsividad al tratamiento con agentes anti-cáncer.
Dependiendo del tipo de cáncer, los pacientes tendrán varias opciones de tratamiento disponibles a ellos incluyendo quimioterapia, radiación y fármacos a base de anticuerpo. Los métodos de diagnóstico útiles para producir el resultado clínico de los diferentes regímenes de tratamiento se beneficiarían extensamente del manejo clínico de estos pacientes .
Así, hay necesidad de medios más efectivos para determinar cuáles pacientes responderán a cual tratamiento y para incorporar tales determinaciones a regímenes de tratamiento más efectivos para pacientes con terapias anti-cáncer, ya sea usados como agentes individuales o combinados con otros agentes .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos para identificar pacientes que responderán al tratamiento con agentes anti-cáncer, por ejemplo antagonistas de VEGFA tales como por ejemplo bevacizumab.
Una modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, los métodos comprenden: determinar el nivel de expresión de VEGF12i y VEGFno en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF12i y VEGFno en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel.de referencia (por ejemplo, en comparación con una muestra de referencia) indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con la . terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho negativo HER-2 avanzado localmente, recurrente o metastático) , cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel de VEGF12i y VEGF110 es un nivel de proteína. En algunas modalidades, el nivel de proteína de VEGF12i y VEGFno es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma de VEGF121 y VEGFno . En algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGF121 y VEGFn0 que está en o por encima de un nivel de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho negativo HER-2 avanzado localmente, recurrente o metastático) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel . En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia anti-cáncer es capécitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la responsividad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con- una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, los métodos comprenden: determinar el nivel de expresión de VEGF121 y VEGF110en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF121 y VEGF110 en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia (por ejemplo, en comparación con una' muestra de referencia) indica que el paciente es más probable de ser responsivo al tratamiento con la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático) , cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel de proteína de VEGF12i y VEGFno es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma de VEGF12i y VEGFn0. En algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGF12i y VEGFi10 que está' en o por encima de un nivel de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una terapia anticáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutica-, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. .En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente. En algunas modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel . En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia anti-cáncer es capecitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente con cáncer exhibirá beneficios de terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, los métodos comprenden: determinar el nivel de expresión de VEGF121 y VEGFno en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF12i y VEGF110 en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia (por ejemplo, en comparación con una muestra de referencia) indica que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovarios, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático) , cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel de proteína de VEGF12i y VEGF110 es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma de VEGF121 y VEGFno . En algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGF121 y VEGFno que está en o por encima de un nivel de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades,, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar « una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho negativo HER-2 avanzado localmente, recurrente o metastático) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia anti-cáncer es capecitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatirio. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
Aun otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, los métodos comprenden: determinar el nivel de expresión de VEGF12i y VEGF110 en una muestra obtenida del paciente . en donde el nivel de VEGF121 y VEGFno en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia (por ejemplo, en comparación con una muestra de referencia) indica que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático) , cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel de proteina de VEGF121 y VEGFno es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma de VEGF121 y VEGFno . En algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGF12i y VEGFi10 que está en o por encima de un nivel de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anticáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia anti-cáncer es capecitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
En una modalidad adicional de la invención provee métodos para tratamiento de cáncer en un paciente, los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene un nivel en por encima de un nivel de referencia (por ejemplo, en comparación con una muestra de referencia) de VEGF121 y VEGFno y administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente, mediante lo cual el cáncer es tratado. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático) , cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel de proteína de VEGF12i y VEGF110 es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma de VEGF121 y VEGFno. En. algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGF12i y VEGFno que está en o por encima de un nivel de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel . En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia anti-cáncer es capecitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
Otra modalidad de la invención provee kits para determinar si un paciente se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, los kits comprenden un conjunto de compuestos para determinar el nivel de por lo menos un biomarcador para predecir la responsividad de un paciente al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, en donde el · nivel de VEGF12i y VEGFn0 en o por encima del nivel de referencia (el nivel de VEGF12i y VEGFno en una muestra de referencia) indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A. En algunas modalidades, los compuestos son proteínas. En algunas modalidades, las proteínas son anticuerpos.
Una modalidad adicional de la invención provee un conjunto de compuestos para detectar los niveles de por lo menos un biomarcador seleccionado del grupo que consiste de: VEGF12i Y VEGFno, el conjunto comprende por lo menos un compuesto apto de enlazarse específicamente a por lo menos un biomarcador seleccionado del grupo que consiste de: VEGF12i y VEGFno. Preferiblemente, el conjunto de compuestos son usado para predecir la responsividad de un paciente al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A. En algunas modalidades, los compuestos son proteínas. En algunas modalidades, las proteínas son anticuerpos.
Estas y otras modalidades son descritas adicionalmente por la descripción detallada que sigue.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Curva de Kaplan Meier para la supervivencia libre de avance para la población del biomarcador global para la terapia de bevacizumab (baja o alta dosis) más docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente recurrente o metastático. La linea discontinua corta representa placebo más docetaxel. La línea continua representa baja dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) . más docetaxel. Las lineas discontinuas larga representa alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel.
Figura 2: Gráfica de Forest de proporción de peligro de supervivencia libre de avance antes del inicio de la terapia anti-neoplásica subsecuente por biomarcador (placebo y baja dosis de bevacizumab), un -análisis dicotomizado para terapia de bevacizumab (baja dosis) más docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático.
Figura 3 : Gráfica de Forest de la proporción de peligro de la supervivencia libre de avance antes del inicio de terapia anti-neoplásica subsecuente por biomarcador (placebo más alta dosis de bevacizumab) , un análisis dicotomizado para la terapia de bevacizumab (alta dosis) más docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático.
Figura 4 (que comprende de las figuras 4A y 4B) : Curva de Kaplan Meier para la supervivencia libre de avance antes del inicio de la terapia anti-neoplásica subsecuente, para bajo nivel de expresión (<125 pg/ml) de VEGFA, (Figura 4A)y alto nivel de expresión (=125 pg/ml) de VEGFA, (Figura 4B) , para la terapia de bevacizumab (baja o alta dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente recurrente o metastático. La línea discontinua corta representa placebo más docetaxel. La línea continua representa baja dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) mas docetaxel.' La línea discontinua larga representa una alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel.
Figura 5 (que comprende de las figuras 5A y 5B) : Curva de Kaplan Meier para la supervivencia libre de avance antes del inicio" de terapia anti-neoplásica subsecuente para VEGFR2 de bajo nivel de expresión (<11 ng/ml) , (Figura 5A) y VEGFR2 de alto nivel de expresión (=11 ng/ml) (Figura 5B) , para terapia de bevacizumab (baja o alta dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático . La línea discontinua corta representa placebo más docetaxel. La línea continua representa baja dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) mas docetaxel. La línea discontinua larga representa alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel .
Figura 6: Curva de Kaplan Meier para la supervivencia libre de avance antes del inicio de la terapia anti-neoplásica subsecuente de bajo nivel de expresión (Formula 1 < 0.132) y alto nivel de expresión (Formula 1 = 0.132)), combinada de VEGFA y VEGFR2 para terapia de bevacizumab (baja o alta dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático. La línea continua representa placebo más docetaxel. La línea discontinua larga representa baja dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) mas docetaxel. La línea discontinua corta representa alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel.
Figura 7: Curva de Kaplan Meier para la supervivencia libre de avance antes del inicio de la terapia anti-neoplásica subsecuente para bajo nivel de expresión combinado (Formula 2 < 0.006) y alto nivel de expresión combinado (Formula 2 > 0.006) de VEGFA y PLGF para terapia de bevacizumab (baja o alta dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático. La línea continua representa placebo más docetaxel. La línea discontinua larga representa baja dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) mas docetaxel. La línea discontinua corta representa alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel.
Figura 8: SEQ ID NO: 1, Secuencia de aminoácidos ejemplar de VEGFA.
Figura 9: SEQ ID NO: 2, Secuencia de aminoácidos ej em lar de VEGFR2.
Figura 10: SEQ ID NO: 3, secuencia de aminoácidos ejemplar de PLGF.
Figura 11: Mediciones de concentraciones incrementadas de VEGFm, VEGF12i, VEGFi65 y VEGF189 tal como es medido sobre un chip IMPACT.
Figura 12: Mediciones de concentraciones incrementadas de VEGFm, VEGF121, VEGF165 y VEGF189 tal como son medidas utilizando el análisis Elecsys® en el analizador Elecsys® a automatizado.
Figura 13 (que comprende de las figuras 13A y 13B) : Curvas de Kaplan Meier para la Supervivencia Global (Figura 13A) y para la Supervivencia Libre de Avance (Figura 13B) para el marcador VEGFA, tanto para altos (>111 pg/ml) como bajos niveles de expresión (=111 pg/ml) para terapia de bevacizumab mas capecitabina/cisplatino versus terapia de placebo testigo más capecitabina/cisplatino para pacientes que son tratados por adenocarcinoma gástrico/gastroesofagal avanzado localmente/metastático inoperable.
Figura 14 (que comprende de las figuras 14A y 14B) : Curvas de Kaplan Meier para asociación con el efecto de tratamiento sobre la Supervivencia Global (Figura 14A) y para Supervivencia Libre de Avance (Figura 14B) para el marcador pVEGFA tanto para altos (>lllpg/ml) como para bajos (= 111 pg/ml) niveles de expresión para terapia de bevacizumab mas capecitabina/cisplatino versus terapia de placebo testigo más capecitabina/cisplatino para pacientes de las regiones de Asia-pacifico que son tratados por adenocarcinoma gástrico/gastro-esofagal avanzado localmente/metastático inoperable .
Figura 15 (que comprende de las- figuras 15A y 15B) : Curvas de Kaplan Meier para asociación con efecto de tratamiento sobre la Supervivencia Global (Figura 15A) y para la Supervivencia Libre de Avance (Figura 15B) para el marcador VEGFA, tanto para altos (>111 pg/ml) como bajos (= 111 pg/ml) niveles de expresión para terapia de bevacizumab mas capecitábina/cisplatino versus terapia de placebo testigo más capecitabina/cisplatino para pacientes de regiones que no son de Asia-pacifico que son tratados por adenocarcinoma gástrico/gastro-esofagal avanzado localmente/metastático inoperable .
Figura 16 (que comprende de las figuras 16A y 16B) : Curvas de Kaplan eier para la Supervivencia Global (Figura 16A) y para la Supervivencia Libre de Avance (Figura 16B) para terapia de bevacizumab mas gemcitabina-erlotinib versus terapia de placebo testigo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que son tratados por cáncer pancreático metastático. En las figuras, la línea continua representa el tratamiento de bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento con placebo/gemcitabina-erlotinib .
Figura 17 (que comprende de las figuras 17A y 17B) : Curvas de Kaplan Meier . para asociación con efecto de tratamiento sobre la Supervivencia Global para el marcador de VEGFA (Figura 17A) y para asociación con el efecto de tratamiento sobre la Supervivencia Libre de Avance para el marcador de VEGFA (Figura 17B) tanto para altos (= 152.9 pg/ml) como para bajos (< 152.9 pg/ml) niveles de expresión, para la terapia de bevacizumab mas gemcitabina-erlotinib versus terapia de placebo testigo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que son tratados por cáncer pancreático metastático. En las figuras, la línea continua representa el tratamiento con bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento con placebo/gemcitabina-erlotinib .
Figura 18 (que comprende de las figuras 18A y 18B) : Curvas de Kaplan Meier para asociación con el efecto de tratamiento sobre la Supervivencia Global para los marcadores de VEGFA y VEGFR2 (Figura 18A) como .un nivel de expresión combinado tanto para altos (Formula 1 = 0.1) como para bajos (Formula 1 < 0.1) niveles de expresión y VEGFA y PLGF (Figura 18B) como un nivel de expresión combinado tanto para altos (Formula 2 = 0.042) como para bajos (Formula 2 < 0.042) niveles de expresión para la terapia de bevacizumab/gemcitabina-erlotinib versus terapia de placebo testigo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que son tratados por cáncer pancreático metastático. En las figuras, la línea continua representa el tratamiento con bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento con placebo/gemcitabina-erlotinib.
Figura 19 (que comprende de las figuras 19A y 19B) : Curvas de Kaplan Meier para asociación con efecto de tratamiento sobre la Supervivencia Libre de Avance para los marcadores de VEGFA y VEGFR2 (Figura 19A) , como un nivel de expresión combinado tanto para altos (Formula 1 = 0.1) como para bajos niveles de expresión ( Formula 1 < 0.1) y VEGFA y PLGF (Figura 19B) , como un nivel de expresión combinado tanto para altos (Formula 2 = 0.042) como para bajos (Formula 2 < 0.042) niveles de expresión para la terapia de bevacizumab/gemcitabina-erlotinib versus terapia de placebo testigo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que son tratados por cáncer pancreático metastático. En las figuras, la línea continua representa el tratamiento con bevacizumab/gemcitabina-erlotiiiib y la línea discontinua representa el tratamiento con placebo/gemcitabina-erlotinib.
Figura 20 (que comprende de las figuras '20A y 20 B) : Curva de Kaplan Meier para asociación con efecto de tratamiento sobre la Supervivencia Global para los marcadores de VEGFA y VEGR2 y PLGF (Figura 20A) , como un nivel de expresión combinado tanto para altos (Formula 3 = 0.837) como para bajos (Formula 3 < 0.837) niveles de expresión y para asociación con los efectos de tratamiento sobre la Supervivencia Libre de Avance para los marcadores de VEGFA, VEGFR2 y PLGF (Figura 20B) , como un nivel de expresión combinado tanto para altos (Formula 3 = 0.837) como para bajos (Formula 3 < 0.837) niveles de expresión, para terapia de bevacizumab mas gemcitabina-erlotinib versus terapia de placebo testigo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que son tratados por cáncer pancreático metastático. En la figura, la línea continua representa el tratamiento con bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento con placebo/gemcitabina-erlotinib.
Figura 21: Datos de muestras de EDTA y citrato de los mismos pacientes medidos dos veces con el análisis IMPACT. La concentración de VEGFA es alrededor de 40% más alta para EDTA-plasma que para citrato con una correlación de Spearman para la comparación método de EDTA-citrato de alrededor de 0.8.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS 1. Introducción La invención provee métodos para identificar pacientes que tienen probabilidad incrementada de responder a una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF.
II-. Definiciones En ciertas modalidades, los término "incrementar" o "por encima" se refieren a un nivel por encima del nivel de referencia o a un incremento global de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o mayor, en nivel de VEGF12i y VEGFi10 en el plasma detectado por los métodos descritos en la presente, en comparación con el nivel de VEGF12i y VEGFno de una muestra de referencia. En ciertas modalidades, el término "incremento" se refiere al incremento en el nivel de VEGF121 y VEGFno en el plasma, en donde el incremento es por lo menos alrededor de 1.5-, 1.75-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 40-, 5.0-, 60-, 70-, 75-, 80-, 90- o 100- veces más alto en comparación con el nivel de VEGF121 y VEGFn0 en el plasma, por ejemplo predeterminado de una muestra de referencia. En una modalidad preferida, el termino nivel incrementado se relación a un valor en o por encima de un nivel de referencia.
En ciertas modalidades, el término "disminuir" en la presente se refiere a un nivel debajo del nivel de referencia o a una reducción global del 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, en el nivel de VEGF12i y VEGFuo detectado mediante los métodos descritos en la presente, en comparación con el nivel de VEGF12i y VEGFuo de una muestra de referencia. En ciertas modalidades, el termino disminuir se refiere a la disminución en el nivel de VEGF121 y VEGFuo, en donde el nivel disminuido es a lo más alrededor de' 0.9-, 0.8-, 0.7-, 0.6-, 0.5-, 0.4-, 0.3-, 0.2-, 0.1- o 0.05- veces el nivel de VEGF121 y VEGFuo de la muestra de referencia o más bajo.
En ciertas modalidades, el término "a un nivel de referencia" se refiere . a un nivel que es el mismo como el nivel de VEGF121 y VEGFuo detectado por los métodos descritos en la presente, de una muestra de referencia.
En ciertas modalidades, el término "nivel de referencia" en la presente se refiere a un valor predeterminado. Como el experimentado en el arte apreciará, el nivel de referencia es predeterminado y establecido para satisfacer los requerimientos en términos por ejemplo de especificidad y/o sensibilidad. Estos requerimientos pueden variar, por ejemplo de cuerpo regulatorio a cuerpo regulatorio. Puede por ejemplo ser que la sensibilidad o especificidad de análisis, respectivamente, tenga que ser establecida a ciertos límites, por ejemplo 80%, 90% o 95%. Estos requerimientos pueden también ser definidos en términos de valores predictivos positivos o negativos. No obstante, en base a las enseñanzas dadas en la presente invención, siempre será posible llegar al nivel de referencia que satisface estos requerimientos. En una modalidad, el nivel de referencia es determinado en individuos saludables. El valor de referencia en una modalidad ha sido predeterminado en la entidad enferma a la cual el paciente pertenece. En ciertas modalidades, el nivel de referencia puede por ejemplo ser establecido a cualquier porcentaje entre 25% y 75% de la distribución global de los valores en una entidad enferma investigada. En otras modalidades, el nivel de referencia puede por ejemplo ser establecido a la mediana, terciles o cuartiles tal como se determina de la distribución global de los valores en una entidad enferma investigada. En otras modalidades, el nivel de referencia puede es establecido al valor de mediana como es determinado de la distribución global de los valores en una entidad enferma investigada.
En el contexto de la presente invención, "VEGF-A," "VEGFA" o "VEGF" se refiere a la proteína A del factor de crecimiento endotelial vascular, ejemplificada por SEQ ID NO: 1, mostrada en la Figura 8 (No. De Acceso Swiss Prot pl5692, Gene ID (NCBI) : 7422) . El término "VEGF-A" abarca la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 también como homólogos e isoformas de la misma. El término "VEGF-A" también abarca las isoformas conocidas, por ejemplo isoformas de empalme de VEGF-A, por ejemplo VEGF12i, VEGF145, VEGF165, VEGFi89 y VEGF2os/ junto con las formas alélicas que se presentan naturalmente en formas procesadas de las mismas, incluyendo el factor de crecimiento celular endotelial vascular humano de 110 aminoácidos generado medición escisión de plasmina de VEGFi65 como se describe en Ferrara Mol. Biol . Cell 21:687 (2010) y Leung et al. Science 246:1306 (1989) y Houck et al. Mol. Endocrin. 5:1806 (1991) . En el contexto de la invención, el término "VEGF-A" también abarca variantes y/u homólogos del mismo, también como fragmentos de VEGF-A a condición de que las proteínas variantes (incluyendo isoformas) , proteínas homologas y/o fragmentos sean reconocidos por uno o más anticuerpos específicos de VEGF-A, tales como el clon de anticuerpo 3C5 y 26503, que están disponibles de Bender Relia Tech and R&D Systems, respectivamente y A4.6.1 cómo se describe en Kim et al . , Growth Factors 7 (1) : 53-64 ' (1992) . En el contexto de la invención, el término "isoforma" de VEGF, VEGFA o VEGF-A se refiere tanto a las isoformas de empalme como a formas generadas mediante escisión enzimática (por ejemplo, mediante plasmina) .
En el contexto de la presente invención, "VEGFR2" se refiera al receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular, ejemplificado por SEQ ID NO: 2, mostrado en la Figura 9 (Numero de acceso Swiss Prot P35968, Gene ID (NCBI) : 3791) . El término "VEGFR2" abarca la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 también como homólogos e isoforraas de la misma. En el contexto de la invención, el término "VEGFR2" también abarca proteínas que tienen por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de homología a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos de las variantes y/u homólogos de los mismos, también como fragmentos de las secuencias, a condición de que las proteínas variantes (incluyendo isoformas) , proteínas homologas y/o fragmentos sean reconocidos por uno o más anticuerpos específicos de VEGFR2, tales como el clon de anticuerpo 89115 y 89109, que están disponibles de R&D Systems.
En el contexto de la presente invención, "PGLF" se refiere al factor de crecimiento placental e emplificado por SEQ ID No. 3, mostrado en la Figura 10 (Numero de acceso Swiss Prot P49763, Gene ID (NCBI): 5228). El término "PGLF" abarca la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 también como homólogos e isoformas de la misma. En el contexto de la invención, el término "PGLF" también abarca proteínas que tienen por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o a la secuencia de aminoácidos de las variantes y/u homólogos de las mismas, también como fragmentos de la secuencias, a condición de que las proteínas variantes (incluyendo isoformas) , proteínas homologas y/o fragmentos sean reconocidos por uno o más anticuerpos específicos de PGLF, tales como el clon de anticuerpo 2D6D5 y 6A11D2, que están disponibles de Roche Diagnostics GmbH.
El término "VEGF" también se refiere a VEGF de especies no humanas, tales como ratón, rata o primates. Algunas veces, el VEGF de una especie especifica es indicado por términos tales como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF murino, etc. El término "VEGF" es también usado para referirse a las formas truncadas del polipéptido que ' comprende los aminoácidos 8 a 109 o l a 109 del factor de crecimiento celular endotelial vascular humano de 165 aminoácidos. La referencia a cualquiera de tales formas de VEGF puede ser identificada en la presente solicitud, por ejemplo por "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" o "VEGFi65" . Las posiciones de aminoácido para un VEGF natural "truncado" , son numeradas como se indica en la secuencia de VEGF natural. Por ejemplo, la posición de aminoácido 17 (metionina) en VEGF natural truncado es también la posición 17 (metionina) en VEGF natural. El VEGF natural truncado tiene afinidad de enlace por lo receptores de KDR y Flt-1 comparable con VEGF natural. De acuerdo con una modalidad preferida, VEGF es un VEGF humano "Actividad biológica de VEGF" incluye enlace a cualquier receptor de VEGF o cualquier actividad de señalización de VEGF tal como regulación tanto de angiogénesis vasculogenésis normal como angiogénesis y vasculogenésis anormal (Ferrara y Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543); promover vasculogenésis y angiogénesis embriónica (Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439; Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442); y modular la proliferación de vasos sanguíneos cíclicos en el sistema reproductor femenino y para crecimiento de hueso y formación de cartílagos (Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4:336-340; Gerber et al. (1999) Nature Med. 5:623-628). Además de ser un factor angiogénico en angiogénesis y vasculogenésis, VEGF, como un factor de crecimiento pleiotropico, exhibe múltiples efectos biológicos en otros procesos fisiológicos, tales como supervivencia celular endotelial, permeabilidad y vasodilatación de vasos, quimio taxis de monocito y afluencia de calcio (Ferrara y Davis-Smyth (1997) , supra y Cebe-Suarez et al. Cell. Mol. Life Sci. 63:601-615 (2006)). Además, estudios recientes han reportado efectos mitogénicos de VEGF sobre unos pocos tipos de células no endoteliales tales como células epiteliales de pigmento retinal, células de conducto pancreático y células de Schwann. Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394; Oberg-Welsh et al. (1997) Mol.
Cell. Endocrinol. 126:125-132; Sondell et al . (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740.
Un "antagonista de VEGF" o "antagonista VEGF-especifico" se refiere a una molécula apta de enlazarse a VEGF, reducir los niveles de expresión de VEGF o neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades biológicas de VEGF, incluyendo pero no limitado a enlace de VEGF a uno o más receptores de VEGF y angiogénesis moderada por VEGF y supervivencia o proliferación de célula endotelial. Incluidos como antagonistas de VEGF-específicos útiles en los métodos de la invención están polipéptidos que se enlazan específicamente a VEGF, polipéptidos que se enlazan específicamente a receptores de VEGF, anticuerpos anti-VEGF y fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, moléculas de receptor y derivados que se enlazan específicamente a VEGF, secuestrando mediante esto su enlace a uno o más receptores, proteínas de fusión (por ejemplo, VEGF-Trampa (Regeneron) ) y VEGF12i-gelonina (Peregrine) . Antagonistas de VEGF-específicos también incluyen variantes antagonistas de polipéptido de VEGF, oligómeros de núcleo base de anti sentido divididos a VEGF, moléculas de ARN pequeñas dirigidas a VEGF, aptámeros de ARN, pepticuerpos y ribosomas contra VEGF, ácidos nucleicos que se hibridizan bajo condiciones severas a secuencias de ácido nucleico que codifican' VEGF o receptor de VEGF (por ejemplo, ARNi) , inmunoadhesinas , anticuerpos de receptor anti-VEGF y antagonistas de receptor de VEGF tales como inhibidores de molécula pequeña de las cinasas de tirosina de VEGFR. De acuerdo con una modalidad preferida, el antagonista de VEGF se enlaza a VEGF e inhiben la proliferación celular endotelial VEGF- inducida in vitro. De acuerdo con una modalidad preferida, el antagonista de VEGF se enlaza a VEGF o un receptor de VEGF con mayor afinidad que sin VEGF o receptor sin VEGF. De acuerdo con una modalidad preferida, el antagonista de VEGF se enlaza a VEGF o un receptor de VEGF con una Kd de entre 1 µ? y 1 pM. De acuerdo con otra modalidad preferida, el antagonista de VEGF se enlaza a VEGF o un receptor de VEGF entre 500 nM a 1 pM. Antagonistas VEGF-específicos también incluyen moléculas pequeñas sin péptido que se enlazan a VEGF y son aptos de bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades biológicas de VEGF. Así, el término "actividades de VEGF" incluyen específicamente actividades biológicas moderadas por VEGF de VEGF. En ciertas modalidades, el antagonista de VEGF reduce o inhibe por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más, el nivel de expresión o actividad biológica de VEGF.
De acuerdo con una modalidad preferida, el antagonista de VEGF es seleccionado de un polipéptido tal como un anticuerpo, un pepticuerpo, una inmunoadhesina, una molécula pequeña o un aptámero. En una modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo anti-VEGF tal como bevacizumab AVASTIN®) o un anticuerpo de receptor anti-VEGF tal como un anticuerpo anti-VEGFR2 o anti-VEGFR3. Otros ejemplos de antagonistas de VEGF incluyen: VEGF-Trampa, Mucagen, PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (sorafenib) , ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, G -786034, RWJ-417975/CT6758 y KRN-633.
Un "anticuerpo anti-VEGF" es un anticuerpo que se enlaza a VEGF con suficiente afinidad y especificidad. En ciertas modalidades, el anticuerpo seleccionado tendrá normalmente una afinidad de enlace suficiente por VEGF, por ejemplo el anticuerpo se puede enlazar a hVEGF con un valor de Kd de entre 100 nM-1 pM. Las afinidades de anticuerpo pueden ser determinadas mediante un análisis a base de resonancia de plasmón superficial (tal como el análisis BIAcore como se describe en la publicación de Solicitud de PCT WO 2005/012359); análisis inmunoabsorbente enzima-enlazado (ELISA) y análisis de competencia (por ejemplo, RIA) , por ejemplo. Preferiblemente, el anticuerpo anti-VEGF de la invención puede ser usado como un agente terapéutico en el apuntamiento e interferencia con enfermedades o condiciones en donde la actividad de VEGF está involucrada. Un anticuerpo anti-VEGF usualmente no se enlazara a otros homólogos de VEGF, tales como VEGF-B o VEGF-C, ni otros factores de crecimientos tales como P1GF, PDGF o bFGF. Un anticuerpo VEGF preferido es un anticuerpo monoclonal que se enlaza al mismo epítope como el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709. Mas preferiblemente el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599, incluyendo pero no limitado al anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; Avastin®) . De acuerdo con otra modalidad, los anticuerpos anti-VEGF que pueden ser usados incluyen pero no están limitados a los anticuerpos revelados en WO 2005/012359. De acuerdo con una modalidad, el anticuerpo anti-VEGF comprende la región pesada variable y ligera variable de cualquiera de los anticuerpos revelados en las Figuras 24, 25, 26, 27 y 29 de WO 2005/012359 (por ejemplo, G6, G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 y B20.4.1). En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-VEGF conocido como ranibizumab es el antagonista de VEGF administrado por enfermedad ocular tal como neuropatía diabética y AMD.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-VEGF puede ser usado como agente terapéutico en el apuntamiento e interferencia con enfermedades o condiciones en donde la actividad de VEGF está involucrada. También, el anticuerpo puede ser sometido a otros análisis de actividad biológica, por ejemplo con el fin de evaluar su efectividad como terapéutico. Tales análisis son conocidos en el arte y dependen del antígeno objetivo y uso propuesto para el anticuerpo. Ejemplos incluyen el análisis de inhibición de HUVEC; análisis de inhibición de crecimiento de célula de tumor (como se describe en O 89/06692) ; citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente (ADCC) y análisis de citotoxicidad complemento-moderada (CDC) (Patente Estadounidense 5,500,362) y actividad agonista o análisis de hematopoyesis (véase, WO 95/27062) . Un anticuerpo anti-VEGF usualmente no se enlazara a otros homólogos de VEGF tales como VEGF-B o VEGF-C y otros factores de crecimiento tales como P1GF, PDGF o bFGF. En una modalidad, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal que se enlaza al mismo epítope como el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709. En otra modalidad, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599, incluyendo pero no limitado al anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; AVASTIN®) .
El anticuerpo anti-VEGF "Bevacizumab (BV)", también conocido como "rhuMAb VEGF" o "AVASTIN®, " es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599. Comprende regiones de estructura de IgGl humanas mutadas y regiones determinantes de complementariedad de enlace de antígeno del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF murino A.4.6.1 que bloquea el enlace de VEGF humano a sus receptores . Aproximadamente el 93% de la secuencia de aminoácidos de bevacizumab, incluyendo la mayoría de las regiones de estructura, es derivada de IgGl humana y alrededor de 7% de la secuencia es derivada del anticuerpo murino A.4.6.1. Bevacizumab tiene una masa molecular de alrededor de 149 daltons y es glicosilado. Bevacizumab y otros anticuerpos' anti-VEGF humanizados son descritos adicionalmente en la Patente Estadounidense 6,884,879 y WO 2005/044853.
El anticuerpo anti-VEGF Ranibizumab o el anticuerpo LUCENTIS® o rhuFab V2 es un fragmento de Fab de VEGF antihumano madurado por afinidad humanizado. Ranibizumab es producido mediante métodos de tecnología recombinante estándar en vector de expresión de Escherichia coli y fermentación bacteriana. Ranibizumab no es glicosilado y tiene una masa molecular de ~48,000 daltons. Véase WO 98/45331 y Patente Estadounidense 2003/0190317.
Los dos receptores de VEGF mejor caracterizados son VEGFRl (también conocido como Flt-1) y VEGFR2 (también conocido como KDR y FLK-1 por el homologo murino) . La especificidad de cada receptor por cada miembro de la familia de VEGF varia pero VEGF-A se enlaza tanto a Flt-1 como KDR. El receptor de Flt-1 de plena longitud incluye un dominio extracelular que tiene siete dominios de Ig, un dominio de transmembrana y un dominio intracelular con actividad de cinasa de tirosina. El dominio extracelular está involucrado en el enlace de VEGF y el dominio intracelular está involucrado en la transducción de señal.
Las moléculas de receptor de VEGF o fragmentos del mismo que se enlazan específicamente a VEGF pueden ser usados como inhibidores de VEGF que se enlazan a y secuestran la proteína de VEGF, impidiendo mediante esto su señalización. En ciertas modalidades, la molécula de receptor de VEGF o fragmento de enlace de VEGF de la misma es una forma soluble, tal como flt-1. Una forma soluble del receptor ejerce un efecto inhibidor sobre la actividad biológica de la proteína de VEGF mediante enlace a VEGF, impidiendo mediante esto que se enlace a sus receptores naturales presentes sobre la superficie de células objetivo. También incluidas están las proteínas de fusión de receptor de VEGF, ejemplos de las cuales son descritos posteriormente en la presente.
Una proteína de receptor de VEGF quimérica es una molécula de receptor que tiene secuencias de aminoácido derivadas de por lo menos dos proteínas diferentes, por lo menos una de las cuales es una proteína de receptor de VEGF (por ejemplo, el receptor de flt-1 o receptor KDR) , que es apta de enlace a e inhibir la actividad biológica de VEGF. En ciertas modalidades, las proteínas de receptor de VEGF quiméricas de la presente invención consisten de secuencias de aminoácidos derivadas de solamente dos moléculas de receptor de VEGF diferentes; sin embargo, secuencias de aminoácido que comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o todos los siete dominios semejantes a Ig de la región de enlace de ligando extracelular del receptor de Flt-1 y/o KDR pueden ser enlazados a secuencias de - aminoácidos de otras proteínas no relacionadas, por ejemplo secuencias de inmunoglobulina . Otras secuencias de aminoácidos a las cuales dominios semejantes a Ig son combinadas serán fácilmente evidentes para aquellos de habilidad ordinaria en el arte. Ejemplos de proteínas de receptor de VEGF quiméricas incluyen pero no están limitados a flt-l/Fc soluble, KDR/Fc o Flt-1/KDR/Fc (también conocido como Trampa de VEGF) . (Véase, por ejemplo, Publicación de Solicitud de PCT WO 97/44453) .
Una proteína de receptor de VEGF soluble o proteína de receptor de VEGF quimérica incluyen proteínas de receptor de VEGF que no se fijan a la superficie de células vía un dominio de transmembrana. Como tal, las formas solubles del receptor de VEGF, incluyendo proteínas de receptor quiméricas, en tanto que son aptas de enlazarse a y desactivar VEGF, no comprenden un dominio de transmembrana y así en general no son asociadas con la membrana celular de célula en las cuales la molécula es expresada.
Inhibidores de VEGF adicionales son descritos por ejemplo, en 99/24440, Publicación Internacional de PCT PCT/IB99/00797, en O 95/21613, WO 99/61422, Patente Estadounidense 6,534,524, Patente Estadounidense 5,834,504, WO 98/50356, Patente Estadounidense 5,883,113, Patente Estadounidense 5,886,020, Patente Estadounidense 5,792,783, Patente Estadounidense 6,653,308, WO 99/10349, WO 97/32856, WO 97/22596, WO 98/54093, WO 98/02438, WO 99/16755 y WO 98/02437, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad.
El término "polipéptido serie B20" como se usa en la presente se refiere a un polipéptido, incluyendo un anticuerpo que se enlaza a VEGF. Los polipéptidos serie B20 incluyen pero no están limitados a anticuerpos derivados de una secuencia de anticuerpo B20 o un anticuerpo B20-derivado descrito en la Publicación de Patente Estadounidense 2006/0280747, Publicación Estadounidense 2007/0141065 y/o Publicación Estadounidense 2007/0020267, el contenido de estas solicitudes de patente es incorporado expresamente en la presente por referencia. En una modalidad, el polipéptido serie B20 es B20-4.1 cómo se describe en la Publicación de Patente Estadounidense 2006/0280747, Publicación Estadounidense 2007/0141065 y/o Publicación Estadounidense 2007/0020267. En otra modalidad, el polipéptido serie B20 es B20-4.1 descrito en la Solicitud de Patente Estadounidense 60/991,302, toda la revelación de la cual es incorporada expresamente por referencia.
El término "polipéptido . serie G6" como se usa en la presente se refiere a un polipéptido, incluyendo, un anticuerpo que se enlaza a VEGF. Los polipéptidos de la serie G6 incluyen pero no están limitados a anticuerpos derivados de una secuencia de anticuerpo G6 o un anticuerpo G6-derivado descrito . en la Publicación de Patente Estadounidense 2006/0280747, Publicación Estadounidense 2007/0141065 y/o Publicación Estadounidense 2007/0020267. Los polipéptidos series G6 como se describen en la Publicación de Patente Estadounidense 2006/0280747, Publicación Estadounidense 2007/0141065 y/o Publicación Estadounidense 2007/0020267 incluyen pero no están limitados a G6-8, G6-23 y G6-31.
Para anticuerpos adicionales, véanse, por ejemplo Patentes Estadounidenses 7,060,269, 6,582,959, 6,703,020; 6,054,297; WO 98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 2006/009360, 2005/0186208, 2003/0206899, 2003/0190317, 2003/0203409 y 2005/0112126 y Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004). En ciertas modalidades, otros anticuerpos incluyen aquellos que se enlazan a un epítope funcional sobre VEGF humanos que consisten de residuos F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191, K101, E103 y C104 o alternativamente, que comprende residuos F17, Y21, Q22, Y25, D63, 183 y Q89.
Otros anticuerpos anti-VEGF son también conocidos y descritos por ejemplo en Liang et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006) .
Una "respuesta efectiva" de un paciente o la "responsividad" o "sensibilidad" al tratamiento con un agente anti-cáncer se refiere al beneficio químico impartido a un paciente en riesgo de o que sufre de cáncer de o como resultado con un agente anti-cáncer, tal como por ejemplo un anticuerpo ' anti-VEGF-A. Tal beneficio incluye respuestas celulares o biológicas, una respuesta completa, una respuesta parcial, una enfermedad estable (sin avance o recaída) o una respuesta con recaída más tarde del paciente de o como resultado del tratamiento, con el antagonista. Por ejemplo, una respuesta efectiva puede ser tamaño de tumor reducido, supervivencia libre de avance o supervivencia global.
"Antagonistas" como se usa en la presente, se refiere a compuestos o agentes que inhiben o reducen la actividad biológica de la molécula a la cual se enlazan. Los antagonistas incluyen anticuerpos, péptidos secuencia sintética o natural, inmunoadhesinas y antagonistas de molécula pequeña que se enlazan a VEGF, opcionalmente conjugados con o fusionados a otra molécula. Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se enlaza.
Un "anticuerpo agonista" como se usa en la presente, es un anticuerpo que imita parcial o completamente por lo menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.
El término "anticuerpo" en la presente es usado en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos bis específicos) , formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpo, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada.
En ciertas modalidades, un anticuerpo usado como antagonista de VEGF en un método provisto en la presente es un anticuerpo multiespecíficos , por ejemplo un anticuerpo bis especifico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de enlace por al menos dos sitios diferentes. En ciertas modalidades, una de las especificidades de enlace es por VEGF y la otra es por cualquier otro antígeno. En ciertas modalidades, los anticuerpos bis específicos se pueden enlazar a dos epítopes diferentes de VEGF. Los anticuerpos bis específicos pueden también ser usados para localizar agentes citotóxicos a células que expresan VEGF. Anticuerpos bis específicos pueden ser preparados como anticuerpos de plena longitud o fragmentos de anticuerpo.
Técnicas para fabricación de anticuerpos raultiespecíficos incluyen pero no están limitadas a coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véase, Milstein, C. y Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829 y Traunecker, A. et al., E BO J. 10 (1991) 3655-3659) y diseño de "perilla en agujero" (véase, por ejemplo Patente Estadounidense 5,731,168). los anticuerpos multiespecífieos pueden también ser fabricados mediante diseño de efectos de direccionamiento electrostáticos para fabricar moléculas de heterodimericas de Fe de anticuerpo (WO 2009/089004) ; reticulación de dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo Patente Estadounidense 4,676,980 y Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83); utilizando cremallera de leucina para producir anticuerpos bis-específieos (véase, por ejemplo, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; utilizando tecnología de "diacuerpo" para fabricar fragmentos de anticuerpos bis-específico (véase, por ejemplo, Holliger, P. et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); y uso de dímeros de Fv de una sola cadena (sFv) (véase, por ejemplo Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); y preparación de anticuerpos tris-específicos como se describe por ejemplo en, por ejemplo, en Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69) .
Los anticuerpos diseñados con tres o más sitios de enlace de antígeno funcionales, incluyendo "anticuerpos pulpo", son también incluidos en la presente (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense 2006/0025576) .
El anticuerpo o fragmento de la presente también incluye un "FAb de acción doble" o "DAF" que comprende un sitio de enlace de antígeno que se enlaza a VEGF, también como otro antígeno diferente (véase, por ejemplo Patente Estadounidense 2008/0069820) .
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo usado como antagonista de VEGF en un método provisto en la presente también incluye anticuerpos multiespecíficos como se describe en WO2009/080251, O2009/080252 , WO2009/080253 , WO2009/080254, WO2010/112193 , WO2010/115589 , WO2010/136172 , WO 2010/145792 y WO 2010/145793. Ejemplos de anticuerpos de VEGF bis específicos son descritos por ejemplo en WO2010/040508 (VEGF-ANG2), PCT/EP2011/054504 (VEGF-A G2), O2005/087812 (VEGF-PDGF) , WO2009120922 (VEGF-PDGFR beta) , WO2011/039370 (VEGF-DII4) .
Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio ambiente natural. Los componentes contaminantes de su medio ambiente natural son materiales que interferirían con los usos de investigación, diagnostico o terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas u otros solutos proteinaceos o no proteinaceos . En algunas modalidades, un anticuerpo es purificado (1) a mayor de 95% en peso del anticuerpo, tal como se determina por ejemplo mediante el método de Lowry y en algunas modalidades a mayor de 99% en peso; (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácido de N-terminal o interna mediante el uso de por ejemplo de un secuenciador de copa de centrifugación o (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando por ejemplo teñido de azul de comassie o teñido de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes , puesto que por lo menos un componente del medio ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado mediante por lo menos una etapa de purificación.
"Anticuerpos naturales" son usualmente glicoproteínas heterotretamericas de alrededor de 150,000 daltons compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera es enlazada a una cadena pesada mediante un enlace de disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces de disulfuro varían entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera también tienen puentes de disulfuro de intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes . Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; ' el domino constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el domino variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos de aminoácidos particulares forman una interface entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada.
"Región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino-terminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada puede ser denominado como "VH" . El dominio variable de la cadena ligera puede ser denominado como "VL" . Estos dominios son en general las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de enlace de antígeno.
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y son usadas en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no estará distribuida igualmente en todos los dominios variables de anticuerpo. Está concentrada en tres segmentos llamados regiones hipervariables (HVR) tanto cadena ligera como en dominios variables de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables son llamadas las regiones de estructura (FR) . Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales cada una comprenden cuatro regiones de FR, que adoptan extensamente una configuración de hoja beta, unidas mediante tres HVR, que forman bucles que unen en algunos casos forman parte de la estructura de hoja beta. Las HVR en cada cadena son mantenidas conjuntamente en proximidad estrecha con las regiones de FR y con las HVR de la otra cadena contribuyen a la formación y el sitio de enlace de antígeno de anticuerpos (véase, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, sino que exhiben varias funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en toxicidad celular anticuerpo-dependiente .
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa(K) y lambda (?) , en base a las secuencias de amino ácidos de sus dominios constantes .
Dependiendo de la secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden ser asignados a diferentes clases.
Hay cinco clases principales de inmunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden ser divididas adicionalmente en subclases (isotipos) por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgAl e IgA2. Los ..dominios constantes de cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulina son llamados , d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y descritas en general, por ejemplo en Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. ( . B. Saunders, Co., 2000) . Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión más grande formada mediante asociación covalente o no covalente del anticuerpo con uno o más de otras proteínas o péptidos .
Los términos "anticuerpo de plena longitud" , "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" son usados en la presente intercambiablemente para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no fragmentos de anticuerpo como se definen posteriormente en la presente. Los términos se refieren particularmente a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región de Fe.
Un "anticuerpo descubierto" por los propósitos de la presente es un anticuerpo que no está conjugado a una porción citotóxica o radio marcador "Fragmentos de anticuerpo" comprenden- una porción de un anticuerpo intacto, que comprenden preferiblemente la región de enlace de antígeno del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.
La digestión de . papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de enlace de antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" , cada uno con un solo sitio de enlace de antígeno y un fragmento de "Fe" residual, cuyo nombre refleja su habilidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento de F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y todavía es apto de reticulación de antígeno.
»Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de enlace de antígeno completo. En una modalidad, una especie de Fv de dos cadenas consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en fuerte asociación no covalente. En una especie de Fv de una sola cadena (scFv) , un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera pueden ser enlazados covalentemente mediante un enlazador de péptido flexible, de tal manera que las cadenas ligeras y pesadas se pueden asociar en una estructura "dimerica" análoga a aquella en una especie de Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres HVR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace de antígeno sobre la superficie del dímero de VH-VL. Colectivamente, las seis HVR confieren especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aun un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres HVR específicas para un antígeno) tienen la habilidad para reconocer y enlazarse al antígeno, aunque a una afinidad más baja que todo el sitio de enlace.
Los fragmentos de Fab contiene los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera y también contienen el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos de Fab' difieren de los fragmentos de Fab por la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio de CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región de anticuerpo-bisagra. Fab'-SH es la designación en la presente por Fab' en el cual el (los) residuo (s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F (ab' ) 2 originalmente eran producidos como pares de fragmentos de Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo son también conocidos.
"Fv de una sola cadena" o fragmento de anticuerpo "scFv" comprenden los dominios de VH y VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. En general', el polipéptido de scFv comprende además un enlazador de ' polipéptido entre los dominios de VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para el enlace de antígeno. Para una revisión de scFv, véase, por ejemplo Plueckthun, en The Pharmacology of Mono-clonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds . (Springer-Verlag, New York: 1994), pp 269-315.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo o con dos sitios de enlace de antígeno, tales fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) unido a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL) . Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o bis específicos. Los diacuerpos son descritos más plenamente en, por ejemplo EP 404097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003) y Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y diacuerpos son también descritos en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sµstancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo mutaciones que se presentan naturalmente, que pueden estar presentes en cantidades menores. Así, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por no ser una mezcla de anticuerpos discretos. En ciertas modalidades, tal anticuerpo monoclonal incluye comúnmente un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptidos que se enlaza a un objetivo, en donde la secuencia del polipéptido del enlace objetivo fue obtenido mediante un proceso que incluye la selección de una sola secuencia de polipéptido de enlace objetivo de una pluralidad de secuencias de polipéptido. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tal como un fondo de clones de hibridoma, clones de fago o clones de ADN recombinantes . Se debe entender que una secuencia de enlace objetivo seleccionada puede ser alterada adicionalmente, por ejemplo para mejorar la afinidad por el objetivo, para humanizar la secuencia de enlace objetivo, para mejorar su producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de enlace de anticuerpo alterada es también un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste con preparaciones de anticuerpo policlonales que incluyen comúnmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal es dirigida contra un solo determinante sobre un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal son ventajosas en que están comúnmente sin contaminar por otras irimunoglobulinas .
El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por ser obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se interpretara que requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con la presente invención pueden ser fabricados mediante una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo el método de hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein. , Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies : A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies y T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y. , 1981) ) , métodos de ADN recombinantes (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense 4,816,567), tecnologías de despliegue de fago (véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol . 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol.- 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, PNAS USA 101 (34): 12467-12472 (2004) y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004) y tecnologías para producir anticuerpos humanos o anticuerpo semejantes a humanos en animales que tienen partes o todos los sitios de inmunoglobulina humanos o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humanas (véase, por ejemplo WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., PNAS USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Patentes Estadounidenses 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425 y 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol . 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol .13 : 65-93 (1995).
Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la (s) cadena (s) es idéntico con u homologo con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, también como fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada (por ejemplo, Patente Estadounidense 4,816,567 y orrison et al., PNAS USA 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos PRIMATIZED® en donde la región de enlace de antígeno del anticuerpo es derivada de un anticuerpo producido mediante al inmunizar por ejemplo monos macacos con el antigeno de interés .
Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En una modalidad, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la cual residuos de una HVR de receptor fueron, reemplazados por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunas instancias, los residuos de FR de la inmunoglobulina humana son reemplazados por . residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se pueden hacer para reasignar adicionalmente el desempeño de anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno y comúnmente dos dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) comúnmente aquellas de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992). Véase también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol . 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc . Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994) y Patentes Estadounidenses 6,982,321 y 7,087,409.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o ha sido elaborado utilizando cualquiera de las técnicas para fabricar anticuerpos humanos como se revela en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace de antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos pueden ser producidos utilizando varias técnicas conocidas en el arte, incluyendo bibliotecas de despliegue de fago. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol . , 222:581 (1991). También disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos están los métodos descritos en Colé et al., Monoclonal Antibodies y Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol . , 147(1) :86-95 (1991). Véase, también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001). Los anticuerpos humanos pueden ser preparados al administrar el antígeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir tales anticuerpos en respuesta al ataque antigénico, pero cuyos sitios endógenos han sido deshabilitados, por ejemplo xenoratones inmunizados (véase, por ejemplo Patente Estadounidense 6,075,181 y 6,150,584 con respecto a la tecnología de XENOMOUSE™) . Véase ' también, por ejemplo, Li et al., PNAS USA, 103:3557-3562 (2006) con respecto a anticuerpos humanos generados vía una tecnología de hibridoma de célula B humana.
El término "región hipervariable" , "HVR" o "HV" , cuando es usado en la presente se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente . En general, los anticuerpos comprenden seis HVR, tres en la VH (Hl, H2, H3) y tres en la VL (Ll, L2 , L3) . En anticuerpos naturales, H3 y L3 muestran la mayor diversidad de las seis HVR y H3 en particular se cree que juega uri papel único en conferir especificidad fina a anticuerpos. Véase, por ejemplo Xu et al. Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003) . Por supuesto, anticuerpos de camélido que se presentan naturalmente que consisten de una cadena pesada solamente son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera. Véase, por ejemplo Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) y Sheriff et al., Nature Struct. Biol . 3:733-736 (1996) .
Un número de delineaciones de HVR están en uso y son abarcadas en la presente. Las HVR que son regiones determinantes de complementariedad (CDR) de Kabat están basadas en la variabilidad de secuencia y son las más comúnmente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) ) . Chothia se refiere en lugar de esto a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las HVR de AbM representan una solución intermedia entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y son usadas por los elementos de programación de modelado de anticuerpo AbM de Oxford Molecular. Las HVR de "contacto" están basadas en el análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada de una de estas HVR son indicados a continuación.
Bucle abat AbM Chothia Contacto Ll L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeración de Kabat) Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 Las HVR pueden comprender "HVR extendidas" como sigue: 24-36 o 24-34 (Ll) , 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89-96 (L3) en la VL y 26-35 (Hl) , 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 o 95-102 (H3) en la VH. Los residuos de dominio variable son numerados de acuerdo con Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones de HVR extendidas.
Los residuos de "estructura" o residuos "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de HVR como se definen en la presente.
La expresión "numeración de residuos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de posición de aminoácido como en Kabat" y variaciones de las mismas se refieren a sistemas de numeración usado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de o inserción a una FR o HVR de dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un solo inserto de aminoácido (residuos 52a de acuerdo con Kabat) después de residuos 52 o H2 y residuos insertados (esto es, residuos 82a, 82b y 82c, etc., de acuerdo con Kabat) después del residuo de FR de cadena pesada 82. La numeración de Kabat de residuos puede ser determinada para un anticuerpo dado mediante alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada por Kabat "estándar" .
Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más HVR del mismo que dan como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo padre que no posee aquella (s) alteración (es) . En una modalidad, un anticuerpo madurado por afinidad tiene afinidades nano molares o aun pico molares por el antígeno objetivo. Anticuerpos madurados por afinidad son producidos mediante procedimientos conocidos en el arte. Por ejemplo, arks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad mediante entremezcla de dominio de VH y VL. La muta génesis aleatoria de HVR y/o residuos de estructura es descrita por ejemplo por: Barbas et al. Proc Nat . Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al.
J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al . , J. Immunol . 154(7) :3310-9 (1995) y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992) .
Los anticuerpos "inhibidores de crecimiento" son aquellos que impiden o reducen la proliferación de una célula que expresa un antígeno al cual el anticuerpo se enlaza.
Anticuerpos que "inducen apoptosis" son aquellos que inducen muerte celular programada, tal como se determina mediante análisis de apoptosis estándar, tal como enlace de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, dilatación de retículo endoplasmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (llamados cuerpos apoptoticos) .
"Funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región de Fe (una región de Fe de secuencia natural o región de Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo y varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: enlace de Clq y citotoxicidad complemento-dependiente (CDC) ; enlace de Fc-receptor; citotoxicidad célula-moderada anticuerpo-dependiente (ADCC) ; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B) y activación de célula B.
El término "región de Fe" en la presente es usado para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones de Fe de secuencia natural y regiones de Fe variantes . Aunque las fronteras de la región de Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región de Fe de cadena pesada de IgG humana es usualmente definida para estirarse desde un residuo de aminoácido en posición Cys226 o de Pro230 al término carboxilo del mismo. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración de EU) de la región de Fe puede ser removida, por ejemplo durante la producción o purificación del anticuerpo o al diseñar recombinantemente el ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Así, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpo con todos los residuos K447 removidos, poblaciones de anticuerpo sin residuos K447 removidos y poblaciones de anticuerpo que tienen una mezcla de anticuerpos con o sin el residuo K447.
A no ser que se indique de otra manera en la presente, la numeración de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina es aquella del índice EU como en Kabat et al., supra. El "índice de EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo EU de IgGl humano.
Una "región de Fe de secuencia natural" posee una "función efectora" de una región de Fe de secuencia natural. "Funciones efectoras" ejemplares incluyen enlace de Clq; CDC; enlace de Fc-receptor; ADCC; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B, BCR) , etc. Tales funciones efectoras requieren en general que la región de Fe sea combinada con un dominio de enlace (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y puede ser determinada utilizando varios análisis como se revela por ejemplo en las definiciones en la presente .
Una "región de Fe de secuencia natural" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región de Fe encontrada en la naturaleza. Regiones de Fe humanas de secuencia natural incluyen una región de Fe de IgGl humana de secuencia natural (alotipos sin A y alotipos A); región de Fe de IgG2 humana de secuencia natural; región de Fe de IgG3 humana de secuencia natural y región de Fe de IgG4 humana de secuencia natural, también como variantes que se presentan en la naturaleza de las mismas.
Una "región de Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquellas de una región de Fe de secuencia natural en virtud de por lo menos una modificación de aminoácido, preferiblemente una o más sustitución (es) de aminoácido (s) . Preferiblemente, la región de Fe variante tiene por lo menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región de Fe de secuencia natural o con la región de Fe de un polipéptido padre, por ejemplo de alrededor de 1 a alrededor de 10 sustituciones de aminoácido y preferiblemente de alrededor de 1 a alrededor de 5 sustituciones de aminoácido en una región de Fe de secuencia natural o en la región de Fe del polipéptido padre . La región de Fe variante en la presente poseerá preferiblemente por lo menos alrededor de 80% de homología con una región de Fe de secuencia natural y/o con una región de Fe de un polipéptido padre y más preferiblemente por lo menos alrededor de 90% de homología con la misma, mas preferiblemente por lo menos alrededor de 95% de homología con la misma.
El término "anticuerpo que comprende región de Fe" se refiere a un anticuerpo que comprende una región de Fe. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración de EU) de la región de Fe puede ser removida, por ejemplo durante la purificación del anticuerpo o al diseñar recombinantemente el ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Así, una composición que comprende un anticuerpo que tiene una región de Fe de acuerdo con esta invención puede comprender un anticuerpo con K447 con todos los K447 removidos o una mezcla de anticuerpos con o sin el residuo de K447.
"Receptor de Fe" o "FcR" describe un receptor que se enlaza a la región de Fe de un anticuerpo. En algunas modalidades, un FcR es un FcR natural-humano . En algunas modalidades, un FcR es uno que se enlaza a un anticuerpo de IgG (un receptor gama) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente empalmadas de aquellos receptores. Los receptores de FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor") que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmicos de los mismos. El receptor activante FcyRIIA contiene una porción de activación a base de tirosina de inmuno receptor (ITAM) en su dominio citoplásmico . El receptor inhibidor FcyRIIB contiene una porción de inhibición a base de tirosina de inmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase, por ejemplo Daéron, Annu. Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). Los FcR son revisados por ejemplo, en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994) y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) . Otros FcRn, incluyen aquellos a ser identificados en el futuro son abarcados por el término "FcR" en la presente.
El término "receptor de Fe" o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable por la transferencia de IgG maternales al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) y regulación de homeostasis de inmunoglobulinas . Métodos para medir el enlace a FcRn son conocidos (véase, por ejemplo Ghetie y Ward, Immunology Today, 18 (12):592-8 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15 (7):637-40 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem., 279 (8) : 6213-6 (2004); WO 2004/92219) .
El enlace a FcRn humano in vivo y la vida media del suero de polipéptidos de enlace de alta afinidad de FcRn humanos pueden ser analizados, por ejemplo en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transíectadas que expresan FcRn humano o en primates a los cuales los polipéptidos con una región de Fe variante son administrados. WO 2000/42072 describe variantes' de anticuerpo con enlace mejorado o disminuido a FcR. Véase, también por ejemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).
"Afinidad de enlace" se refiere en general a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de enlace de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su socio de enlace (por ejemplo, un antígeno) . A no ser que se indique de otra manera en la presente, "afinidad de enlace" se refiere a afinidad de enlace intrínseca que refleja una interacción de 1:1 entre miembros de un par de enlaces (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X por su socio Y puede en general ser presentada por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede ser medida mediante métodos comunes conocidos en el arte, incluyendo aquellos descritos en la presente. Los anticuerpos de baja afinidad en general se enlazan al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad en general se enlazan al antígeno más rápido y tienden a permanecer enlazados más tiempo. Una variedad de métodos para medir la afinidad de enlace son conocidos en el arte, cualquiera de los cuales pueden ser usados por los propósitos de la presente invención. Modalidades ilustrativas y ejemplares específicas para medir la afinidad de enlace son descritas en lo siguiente.
En una modalidad, una "Kd" o "valor de Kd" de acuerdo con esta invención es medido mediante un análisis de enlace de antígeno radio marcado (RIA) efectuado con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por el siguiente análisis. La afinidad de enlace en solución de los Fab por antígeno es medida al equilibrar el Fab con una concentración mínima del antígeno (125I) -marcado en presencia de una serie de titulación de antígeno sin marcar, luego capturar el antígeno enlazado con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo Chen et al., J. Mol. Biol . 293:865-881 (1999)). Para establecer condiciones para el análisis, placas de micro título (DYNEX Technologies, Inc.) son recubiertas de la noche a la mañana con 5 g/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9.6) y subsecuentemente bloqueado con albúmina de suero bovino al 2% (peso/volumen) en PBS por ' dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no absorbente (Nunc #269620) ,
[1251] -antigeno 100 pM o 26 pM son mezclados con diluciones seriales de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la determinación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés es luego incubado de la noche a la mañana,-sin embargo, la incubación puede proseguir por un periodo más largo (por ejemplo, alrededor de 75 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Después de esto, las mezclas son transferidas a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por una hora) . La solución es luego removida y la placa lavada ocho veces con surfactante T EEN-20™ al 0.1% en PBS. Cuando las placas han secado, se agregan 150 µ?/cavidad de agente de centelleo (MICROSCINT-20™; Packard) y las placas son contadas en un contador gama TOPCOU T™ (Packard) por diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menor o igual a 20% de enlace máximo son escogidas para uso en análisis de enlace competitivo.
De acuerdo con otra modalidad, la Kd o valor de Kd es medido al usar análisis de resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento BIACORE®-2000 o BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizados a -10 unidades de respuesta (RU) .
Brevemente, los chips de biosensor de dextrana carboximetilados (CM5, BIAcore, Inc.) son activados con clorhidrato de N-etil-N' t (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno es diluido con acetato de sodio 10 m , pH 4.8 a 5 pg/ml (-0.2 µ ) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto para obtener aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Enseguida de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, diluciones seriales de dos veces de Fab (0.78 nM a 500 nM) son inyectadas en PBS con surfactante TWEEN 20™ al 0.05% (PBST) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Las velocidades de asociación (kencendido) y velocidades de disociación (kapagado) son calculadas utilizando un modelo de enlace de Langmuir de uno a uno simple (BIAcore® Elementos de Programación de Evaluación versión 3.2) al ajustar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación al equilibrio (Kd) es calculada como la proporción kapagado/keilcendido · Véase , por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la velocidad de encendido excede de 106 M^s"1 mediante el análisis de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de encendido puede ser determinar utilizando una técnica de apagado fluorescente que mide el incremento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm; paso de banda de 16 nm) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de concentraciones incrementadas de antígeno tal como son medidas en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de parada (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SL -AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
Una "velocidad de encendido" , "velocidad de asociación" , "proporción de asociación" o "kencendido" de acuerdo con esta invención puede también ser determinada como se describe anteriormente utilizando un sistema BIACORE®-2000 o BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) .
El término "sustancialmente similar" o "sustancialmente el mismo"., como se usa en la presente, denota un grado suficientemente alto de similaridad entre dos valores numéricos (por ejemplo, uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparador) , de tal manera que el experimentado en el arte consideraría la diferencia entre los dos valores que es de poco ningún significado biológico y/o estadístico en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd) . La diferencia entre dichos dos valores es por ejemplo menor de alrededor de 50%, menor de alrededor de 40%, menor de alrededor de 30%, menor de alrededor de 20% y/o menor de alrededor de 10% como función del valor de referencia/comparador.
La frase "sustancialmente reducido" o "sustancialmente diferente", como se usa en la presente, denota un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos (en general uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparador) de tal manera que el experimentado en el arte consideraría la diferencia entre los dos valores que es de significado estadístico dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd) . La diferencia entre dichos dos valores es por ejemplo, mayor de alrededor de 10%, mayor de alrededor de 20%, mayor de alrededor de 30%, mayor de alrededor de 40% y/o mayor de alrededor de 50% como función del valor de la molécula de referencia/comparador .
En ciertas modalidades, el anticuerpo humanizado útil en la presente comprende además alteraciones de aminoácido en la Fe de IgG y exhibe afinidad de enlace incrementada por FcRn humano con respecto a un anticuerpo que tiene Fe de IgG tipo silvestre, por al menos 60 veces, por lo menos 70 veces, por lo menos 80 veces, mas preferiblemente por lo menos 100 veces, preferiblemente por lo menos 125 veces, aun mas preferiblemente por lo menos 150 veces a alrededor de 170 veces .
Una "alteración" o "enfermedad" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con una sustancia/molécula o método de la invención. Esto incluye alteraciones o enfermedades crónicas y agudas incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero a la alteración en cuestión. Ejemplos no limitantes de alteraciones a ser tratadas en la presente incluyen cáncer (por ejemplo, tumores malignos y benignos; malignidades sin leucemia y malignidades linfoides) ; alteraciones neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicas y otras alteraciones glandulares, macrofagales , epiteliales, estromales y * blastocolicas y alteraciones inflamatorias, inmunológicas y otras alteraciones angiogénesis-relacionadas .
Los términos "alteración proliferativa celular" y "alteración proliferativa" se refieren a alteraciones que están asociados con algún grado de proliferación celular anormal. En una modalidad, la alteración proliferativa celular es cáncer. En una modalidad, la alteración proliferativa celular es angiogénesis .
"Tumor" como se usa en la presente, se refiere a todo el crecimiento y proliferación celular neoplásico, ya sea maligno o benigno y todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "alteración . proliferativa celular" , "alteración proliferativa" y "tumor" no son mutuamente exclusivos como se refiere en la presente.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que está caracterizada comúnmente por proliferación celular sin regular. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales canceres incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón) , cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular,. cáncer gástrico o de estómago (incluyendo, por ejemplo cáncer gastrointestinal) , cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo, cáncer pancreático metastático) , glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de pecho (incluyendo cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático) , cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, también como linfoma de célula B (incluyendo linfoma no de Hodking de bajo grado/folicular (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL) ; NHL grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de célula no escindida pequeña de alto grado; NHL de enfermedad global; linforna de célula de manto; linforna SIDA-relacionado y la macroglobulinemia de aldenstrom) , leucemia linfocítica crónica (CLL) , leucemia linfoblástica aguda (ALL) ; leucemia de célula vellosa,' leucemia mieloblástica crónica y alteración linfoproliferativa posttrasplante (PTLD) , también como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como aquel asociado con tumores de cerebro) y síndrome de Meigs.
El término "composición anti-neoplásica" o "composición anti-cáncer" o "agente anti-cáncer" se refieren a una composición útil en el tratamiento de cáncer que comprende por lo menos un agente terapéutico activo, por ejemplo "agente anti-cáncer". Ejemplos de agentes terapéuticos (por agentes anti-cáncer) incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo agentes quimioterapéuticos , agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en terapia de radiación, agentes anti-angiogénesis, agentes anti-linfangiogénesis, agentes apoptoticos, agentes anti-tubulina y otros agentes para tratar cáncer, tales como anticuerpos anti-HER-2, anticuerpos anti-CD20, un antagonista del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de cinasa de tirosina) , inhibidor de HER1/EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva ) , inhibidores de factor de crecimiento derivados de plaqueta (por ejemplo, Gleevec™ (Imatinib Mesylate) ) , un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , interferones, citoquinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se enlazan a uno o más de los siguientes objetivos ErbB2 , ErbB3 , ErbB4 , PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BC A VEGF o receptor (es) de VEGF, TRAIL/Apo2 y otros agentes químicos bioactivos y orgánicos, etc., combinaciones de los mismos también están incluidas en la invención.
Como se usa en la presente "tratamiento" se refiere a intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo o célula que es tratada y puede ser efectuado ya sea por profilaxis o durante el curso de patología clínica. Efectos deseables del tratamiento incluyen impedir la presencia o recurrencia de enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualesquier consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, impedir metástasis, disminución de la velocidad de avance de enfermedad, mejora o alivio del estado de enfermedad y remisión o prognosis mejorada. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención son usados para retardar el desarrollo de una enfermedad o alteración.
Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva a dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios para obtener el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una sustancia/molécula de la invención, agonista o antagonista puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuó y la habilidad de la sustancia/molécula agonista o antagonista para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual cualesquier efectos tóxicos o perjudiciales de la sustancia/molécula agonista o antagonista son superados por los efectos terapéuticamente benéficos. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipéptido, antagonista de esta invención efectiva para "tratar" una enfermedad o alteración en un mamífero (aka paciente) . En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir el número de células de cáncer; reducir el tamaño del tumor o peso del tumor; inhibir (esto es, frenar alguna extensión y preferiblemente detener) la infiltración de células de cáncer a órganos periféricos; inhibir (esto es, frenar alguna extensión y preferiblemente detener) metástasis del tumor, inhibir alguna extensión en crecimiento del tumor y/o aliviar alguna extensión uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. A la extensión que el fármaco puede impedir el crecimiento y/o asignar células de cáncer existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. En una modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad inhibidora del crecimiento. En otra modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que extiende la supervivencia del paciente. En otra modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que mejora la supervivencia libre de avance de un paciente. "Supervivencia libre de avance", como se usa en la presente, se refiere a la duración de tiempo durante y después del tratamiento durante el cual de acuerdo con la determinación del médico que trata o investigador, la enfermedad del paciente no empeora, esto es, no avanza.
Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva a dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios para obtener el resultado profiláctico deseado. Comúnmente aunque no de manera "necesaria, puesto que una dosis profiláctica es. usada en sujetos antes de · o a una etapa anterior de enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva es menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.
El término "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de células y/o provoca destrucción de células. El termino pretende influir isótopos radiactivos (por ejemplo, A 7t.211, x1131, 1-125 , vY90, R>„e186, R>e188 , S0rm153, oBi.; 212 , „P32 e_ iisótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etoposide) , doxorubicina, melfalana, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleoliticas , antibióticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de planta o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos y los varios agentes anti-tumor o anti-cáncer revelados posteriormente en la presente. Otros agentes citotóxicos son descritos a continuación en la presente. Un agente tumoricida provoca destrucción de células de tumor .
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida de CYTOXA ® ; alquilo sulfonatos tales como busulfán, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilenetiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; delta- 9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®) , beta-lapachona; lapachol, colchicina, ácido betulínico una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipóside; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1) eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo ; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enedina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gama II y calicheamicina omega II (véase, por ejemplo, Angew Chem Intl. Ed. Engl, 33: 183-186 (1994) ) ; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; también como cromóforo neocarzinostatina y cromóforos de antibiótico de · Enedina de cromoproteínas relacionados) , aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinof lina, cromomicinia , dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina de ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino-doxorrubíciña, cianomorfolino doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicin C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocin, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-raercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabin, floxuridina ; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol , mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina, acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcide; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinana; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etil idrazida; procarbazina; complejo de polisacárido de PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio, ácido tenuazónico; triaziquona, 2,2' , 2 " -triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2 , verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretan; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinóside ("Ara-C" ) ; tiotepa ,-taxoides, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) , ABRAXANE™ Cremophor libre, formulación de nano partículas albúmina-diseñada de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) y docetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucilo; gemcitabina (GEMZAR®) ; 6-tioguanina; mercaptopurina,- metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®) ; platino; etoposide (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; oxaliplatino,-leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®) ; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometlilornitina (DMFO) ; retinoides tal como ácido retinoico; capecitabina (XELODA®) , sales, ácidos o derivados, aceptable farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores, también como combinaciones de dos o más de los anteriores, tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovovina. Agentes quimioterapéuticos adicionales incluyen los agentes citotóxicos útiles como conjugados de anticuerpo- fármacos, tales como maitansinoides (DM1, por ejemplo) y las auristatinas MMAE y MMAF, por ej emplo .
"Agentes quimioterapéuticos" también, incluyen "agentes anti-hormonales" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer y están frecuentemente en forma de tratamiento sistémico o tratamiento de cuerpo entero. Pueden ser hormonas en sí mismos. Ejemplos incluyen anti-estrégenos y moduladores de receptor de estrógeno selectivos (SERM) , incluyendo, pór ejemplo tamoxifen (incluyendo tamoxifen de NOLVADEX®) , raloxifeno de EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y torémifeno de FARESTON® ; anti-progesteronas ; reguladores descendentes de receptor de estrógeno (ERD) ; agentes que funcionan para suprimir o cerrar los ovarios, por ejemplo, hormona de liberación de hormona luteinizante luteinizante (LHRH) , agonistas tales como LUPRON® y ELIGARD® acetato de leuprolato, acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; otros anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida e inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4 (5) -imidazoles, aminoglutetímida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol de RIVISOR®, letrozol de FEMARA®, y anastrozol de ARIMIDEX®. Además, tal definición de agentes quimioterapéuticos incluye bisfosfonatos, tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®) , etidronato de DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato de ZOMETA®, alendronato de FOSAMAX®, pamidronato de AREDIA®, tiludronato de SKELID® o risedronato de ACTONEL®; también como' troxacitabina (un análogo de citosina de nucleósido 1,3-dioxolano) ; oligonucleótidos anti sentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación celular aberrante, tales como por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) , vacunas tales como vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia genética, por ejemplo, vacuna ALLOVECTINA®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECA ® ; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña de cinasa de tirosina doble de ErbB-2 y EGFR también conocido como GW572016) y sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores .
Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando es usado en la presente, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento y/o proliferación de una célula. Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un lugar diferente de fase S) , tales como agentes que inducen la detención de Gl y detención de la fase M. bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos e inhibidores de topoisomerasa II, tales como el antibiótico de antraciclina doxorubicina ((8S-cis) -10- [ (3-amino-2, 3 , 6-tridesoxi- -L-lixo-hexpiranosil) ] -7,8,9, lO-tetrahidro-6, 8, 10, ll-trihidroxi-8- (hidroxiacetil) -l-metoxi-5 , 12-naftacendiona) , epirubicina, daunorubicina, etoposide y bleomicina. Aquellos agentes que detienen Gl también se derraman sobre la detención de fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Información adicional se puede encontrar en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn y Israel, eds . , capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and anti-neoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders : Philadelphia, 1995), especialmente p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anti cáncer ambos derivados del árbol de Yew. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del yew europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamble de micro túbulos a partir de dimeros de tubulina y estabiliza los micro túbulos al impedir la despolimerización, lo que da como resultado la inhibición de la mitosis en las células .
Como se usa en la presente, el término "paciente" se refiere a cualquier animal individual, mas preferiblemente un mamífero (incluyendo tales animales no humanos, por ejemplo perros, gatos, caballos, conejos, animales de zoológico, vacas, puercos, ovejas y primates no humanos) para los cuales se desea el tratamiento. Más preferiblemente, el paciente en la presente es un humano.
Un "sujeto" en la presente es cualquier sujeto humano individual, incluyendo un paciente elegible para tratamiento que está experimentando o ha experimentado uno o más signos, síntomas u otros indicadores de una alteración angiogénica. Pretendidos para ser incluidos como sujetos están como cualesquier sujetos involucrados en pruebas de investigación clínica que no muestran ningún signo clínico de enfermedad o sujetos involucrados en estudios epidemiológicos o sujetos una vez usados como testigos. El sujeto puede haber sido previamente tratado con un agente anti-cáncer o no tratado así. El sujeto puede ser naive a un (os) agente (s) adicional (es) que es (son) usado (s) cuando el tratamiento en la presente es iniciado, esto es, el sujeto puede no haber sido tratado previamente con, por ejemplo, un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, un agente citotóxico en la "línea de referencia" (esto es, en un punto establecido en el tiempo antes de administración de una primera dosis de un agente anti-cáncer en el método de tratamiento en la presente, tal como el día de selección del sujeto antes de que el tratamiento sea comenzado) . Tales sujetos "naive" son en general considerados como candidatos para tratamiento con tal (es) agente (s) adicional (es) .
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación estéril que está en tal forma para permitir que la actividad biológica del medicamento sea efectiva y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos a un sujeto al cual la formulación seria administrada .
Una formulación "estéril" es aséptica o libre de todos los microorganismos vivientes y sus esporas .
Un "inserto de empaque" es usado para referirse a instrucciones incluidas acostumbradamente en empaques comerciales de productos terapéuticos o medicamentos que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones, otros productos terapéuticos a ser combinados del producto empacado y/o advertencias concernientes con el uso de tales productos terapéuticos o medicamentos, etc.
Un "kit" es cualquier manufactura (por ejemplo, un empaque o recipiente) que contiene por lo menos un reactivo, por ejemplo un medicamento para el tratamiento de una alteración angiogénica o una sonda para detectar específicamente un gen de biomarcador o proteína de la invención. La manufactura es preferiblemente promovida, distribuida o vendida como una unidad para efectuar los métodos de la presente invención.
. Por propósitos de no respuesta a medicamento (s) un sujeto que experimenta "un nivel clínicamente inaceptable alto de toxicidad" del tratamiento previo o actual con uno o más medicamentos experimenta uno o más efectos secundarios negativos o efectos adversos asociados con los mismos que son considerados por un clínico experimentado ser significativos, tales como por ejemplo infecciones serias, insuficiencia cardiaca congestiva, desmielinazión (que conduce a esclerosis múltiples) , hipersensibilidad significativa, eventos neuropatológicos , altos grados de autoinmunidad, un cáncer tal como cáncer endometrial, linfornas no de Hodking, cáncer de pecho, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de ovario o melanoma, tuberculosis (TB) , etc.
"Reducir el riesgo de un efecto secundario negativo" significa reducir el riesgo de un efecto secundario resultante del tratamiento con el antagonista en la presente a una extensión menor que el riesgo observado resultante del tratamiento ¾ del mismo paciente u otro paciente con un medicamento administrado previamente. Tales efectos secundarios incluyen aquellos resumidos anteriormente con respecto a toxicidad y son preferiblemente infección, cáncer, insuficiencia cardiaca o desmielinazión.
"Correlacionar" o "que correlaciona" significa comparar de alguna manera el desempeño y/o resultados de un primer análisis o protocolo con el desempeño y/o resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo para llevar a cabo un segundo protocolo y/o se pueden usar los resultados de un primera análisis o protocolo para determinar si un segundo análisis o protocolo debe ser efectuado. Con respecto a varias modalidades en la presente, se pueden usar los resultados de un análisis analítico para determinar si un régimen terapéutico específico utilizando un agente anti-cáncer, tal como anticuerpo anti-VEGF debe ser efectuado.
III. Métodos La presente invención provee métodos para identificar a pacientes que se pueden beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, métodos para predecir la responsividad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, métodos para determinar la probabilidad de que un paciente con cáncer exhibirá beneficio de la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A y métodos para optimizar la eficacia terapéutica de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A.
Los métodos comprenden determinar el nivel de expresión de VEGF121 y VEGF110 en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF121 y VEGFno en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer o que el paciente es más probable de ser. responsivo al tratamiento con la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF ál paciente.
La invención provee además métodos para tratar cáncer en un paciente . Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene un nivel de VEGF121 y EGFno en o por encima de un nivel de referencia y administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF a dicho paciente, mediante lo cual el cáncer es tratado. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar agente (s) adicional (es) (por ejemplo, un segundo, tercero o cuarto agente) al paciente.
A. Métodos de detección Los métodos y análisis revelados proveen medios convenientes, eficientes y potencialmente efectivos en el costo para obtener datos e información útiles para determinar las terapias apropiadas o efectivas . para tratamiento pacientes. Por ejemplo, de acuerdo con los métodos de la invención, un paciente podría proveer una muestra de sangre antes del tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF y el nivel de VEGF121 y VEGF110 en la muestra podría ser determinado y comparado con el nivel de VEGF12i y VEGFno en una muestra, de referencia o con un valor de referencia predeterminado, respectivamente. Los pacientes con un nivel incrementado de VEGF VEGF121 y VEGF110, son identificados como pacientes probables de responder a la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF. Los métodos se pueden llevar a cabo en una variedad de formatos de análisis, incluyendo análisis que detectan la expresión de proteína (tales como inmunoanálisis de enzima) y análisis bioquímicos que detectan la actividad apropiada. La determinación de expresión o la presencia de tales biomarcadores en las muestras es prédictiva de que el paciente que provee la muestra será sensible a los efectos biológicos de un antagonista de VEGF. Comúnmente, un nivel de expresión de VEGF12i y VEGFi10 en una muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente responderá a o será sensible al tratamiento con un antagonista de VEGF.
Aquel de habilidad en las artes médicas, particularmente pertenecientes a la aplicación de pruebas de diagnóstico y tratamiento con terapéuticos, reconocerá que los sistemas biológicos son un tanto variables y no siempre completamente predecibles y asi muchas pruebas de diagnóstico buenas o terapéuticos son ocasionalmente no efectivos. Esto es, depende finalmente del juicio del médico que atiende el curso más apropiado de tratamiento para un paciente individual, en base a resultados de prueba, condición e historia del paciente y su propia experiencia. Pueden aun haber ocasiones, por ejemplo, cuando un medico escogerá tratar un paciente con un antagonista de VEGF aun cuando un paciente no es predicho ser particularmente sensible a antagonistas de VEGF, en base a datos de prueba de diagnóstico o de otros criterios, particularmente si todas o la mayoría de las otras opciones de tratamiento obvias han fallado o si se anticipa algo de sinergia cuando es dado con otro tratamiento.
En modalidades expresadas adicionalmente, la presente invención provee un método para predecir la sensibilidad de un paciente al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF o predecir si un paciente responderá efectivamente a tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, que comprende determinar el nivel de VEGF12i y VEGFi10 en la muestra y predecir la sensibilidad del paciente a la inhibición por un antagonista de VEGF, en donde el nivel de expresión de VEGF121 y VEGF110 en o por encima de un nivel de referencia se correlaciona con alta sensibilidad en pacientes a la respuesta efectiva al tratamiento con un antagonista de VEGF.
La muestra puede ser tomada de un paciente que se sospecha de tener o es diagnosticado por tener un cáncer, incluyendo, por ejemplo cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo,' cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente recurrente o metastático) , cáncer pancreático (incluyendo cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón y de aquí esta probablemente en necesidad de tratamiento o de un individuo normal que no sospecha de tener tal alteración. Para la determinación de expresión de marcador, muestras del paciente, tales como aquellas que contienen células o proteínas o ácidos nucleicos producidos por estas células, pueden ser usadas en los métodos de la presente invención. En los métodos de esta invención, el nivel de un biomarcador puede ser determinado al determinar la cantidad (por ejemplo, cantidad absoluta o concentración absoluta) de los marcadores en una muestra, preferiblemente determinada en fluidos corporales o excreciones que contienen niveles detectables de biomarcadores . Los fluidos corporales o secreciones útiles como muestras en la presente invención incluyen, por ejemplo sangre, fluido linfático, esputo, ascites u otra excreción corporal o derivados de la misma. La palabra sangre pretende incluir sangre entera, plasma, suero o cualquier derivado de sangre. La determinación de un bio marcador en tales fluidos corporales o excreciones puede algunas veces ser preferida en circunstancias en donde un método de toma de muestras invasivo es inapropiado o inconveniente. Sin embargo, la muestra a ser probada en la presente es preferiblemente sangre, más preferiblemente plasma sanguíneo. En otra modalidad, la muestra es EDTA-plasma. En una modalidad, la muestra es citrato-plasma .
La muestra puede ser congelada, nueva, fija, (por ejemplo, fijada con formalina) , centrifugada y/o embebida (por ejemplo, embebida en parafina) , etc. La muestra celular puede por supuesto ser sometida a una variedad de técnicas preparativas y de almacenamiento post-recolección bien conocidas (por ejemplo, extracción de ácido nucleico y/o proteína, fijación, almacenamiento, congelación, ultra centrifugación, concentración, evaporación, centrifugación, etc.) antes de determinar la cantidad del marcador en la muestra. Así mismo, biopsias pueden también ser sometidas a técnicas de preparación y de almacenamiento post-recolección, por ejemplo fijación.
A. Detección de VEGF121 y VEGFno La proteína de VEGF121 y VEGFno puede ser detectada utilizando cualquier método conocido en el arte. Por ejemplo, muestras de tejido o células de mamíferos pueden ser analizadas convenientemente, por ejemplo por proteínas utilizando Western, ELISA, etc. Muchas referencias están disponibles para proveer guías en la aplicación de las técnicas anteriores (Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980) ; Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurreil, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Ratón, FL, 1982) y Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-1 58 (CRC Press, Inc., 1987)).
Si se hace referencia a. la detección del nivel de VEGF121 y VEGF110, esto significa que las, moléculas de ambas moléculas es medida como por ejemplo mediante un análisis que detecta tanto VEGF12i como VEGF110 . Análisis de detectan ambas moléculas VEGF121 y VEGF110, incluyen, por ejemplo análisis que tienen una sensibilidad por la otra forma correspondiente (esto es, para VEGF12i si VEGF110 es reconocida mejor o por VEGFno si VEGF121 es reconocida mejor, respectivamente) de por lo menos 25%. En ciertas modalidades, en los análisis que tienen sensibilidad a la otra forma correspondiente de por lo menos 50%, 75%, 80%, 85%, 90% o mayor. En una modalidad, tanto VEGF121 como VEGFno son medidos con esencialmente la misma sensibilidad.
En cuanto a la detección de proteína de VEGF12i y VEGF110, varios análisis están disponibles. Por ejemplo, la muestra se puede poner en contacto con un anticuerpo o una combinación de anticuerpo (por ejemplo, en un análisis de emparedado) que se enlaza de preferencia o específicamente a VEGF12i y VEGF11CT en comparación con las isoformas VEGF-A más largas que se presentan en la naturaleza como VEGFi21 y VEGFno, respectivamente. Preferiblemente, las isoformas cortas son detectadas con una sensibilidad por lo menos tres veces más alta en' comparación con las isoformas más largas de VEGFiS5 . En una modalidad, un anticuerpo que tiene una sensibilidad por lo menos tres veces más alta por VEGF121 y VEGF110 en comparación con VEGFi65 usado. Tal sensibilidad por lo menos tres veces más alta por VEGFi21 y VEGFno es determinada al comparar VEGF16s , VEGFi2i y VEGFn0 (pureza de por lo menos 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante OD 280 nm.) utilizando los mismos reactivos. Si en esta comparación la señal obtenida para VEGFi65 es solamente un tercio o menor de la señal tal como es obtenida con VEGF12i y VEGFi10, respectivamente, entonces tanto VEGF121 como VEGFno son detectados con una sensibilidad por lo menos tres veces más alta que VEGF165. También preferido la sensibilidad para las isoformas cortas es por lo menos 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces más alta en comparación con las isoformas largas, especialmente con VEGF165 En una modalidad preferida, ambas isoformas cortas VEGF121 y VEGFno so detectadas específicamente. Tal detección especifica es, por ejemplo posible si los anticuerpos, especialmente anticuerpos monoclonales son usados y empleados. Es por ejemplo posible usar un anticuerpo que se enlaza específicamente a VEGF12i y un anticuerpo que se enlaza específicamente a VEGFn0. tal anticuerpo VEGF12i-especifico, por ejemplo se puede enlazar a la secuencia generada al unir los exones 4 y 8 en VEGF12i y tal anticuerpo VEGFn0-especifico se puede por ejemplo enlazar al extremo C-terminal libre de VEGFno, respectivamente.
Un anticuerpo (monoclonal) a VEGFi21 por ejemplo, se enlaza a la secuencia generada al unir los exones 4 y 8 , respectivamente en VEGF121 y no se enlazara a las secuencias de aminoácidos comprendidas en las isoformas de VEGF más largas 165 y 189, respectivamente, puesto que en las mismas otras secuencias de aminoácidos están presentes debido a la unión del exón 4 y exón 7 y de exón 4 y exón 5, respectivamente (véase : Ferrara, N. , Mol. Biol . of the Cell 21 (2010) 687-690) . El enlace especifico a VEGF121 en el sentido anterior es reconocido si el anticuerpo usado exhibe menos de 10% de reactividad cruzada con aquellas isoformas que no comprenden la secuencia generada al unir los exones 4 y 8, por ejemplo VEGF165. También preferida, la reactividad cruzada será menor del 5%, 4%, 3%, 2% y 1%, respectivamente, para isoformas de VEGF que no tienen la secuencia generada al unir los exones 4 y 8, por ejemplo VEGFi65.
Anticuerpos específicos apropiados que se enlazan a la isoforma de VEGF corta VEGF12i puede ser obtenido de acuerdo con procedimientos estándar. Usualmente, un péptido que representa o que comprende por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más amino ácidos que comprenden aminoácidos C-terminales y N-terminales al aminoácido 115 de VEGF121 , respectivamente, serán sintetizados, opcionalmente acoplados a un portador y usados para inmunización. Preferiblemente, tal péptido será de por lo menos 6 aminoácidos de largo y comprenderá por lo menos los aminoácidos 115 y 116 de VEFG121 . También preferido, comprenderá por lo menos los amino ácidos 114, 115, 116 y 117 de VEGF12i. Como el experimentado en el arte apreciara péptidos más largos que comprenden por ejemplo 3, 4 o más aminoácidos N- y C-terminales a la unión de exón entre los aminoácidos 115 y 116 de VEGF12i pueden también ser usados para obtener anticuerpos que se enlazan específicamente a VEGFiai.
La detección especifica de VEGFuo es por ejemplo posible si anticuerpos, especialmente anticuerpos monoclonales son usados y empleados que se enlazan al extremo 3 -terminal libre de VEGF110. Tal anticuerpo anti termino C de VEGF110 no se enlaza a cualquier isoforma de VEGF-A que comprende el aminoácidoxxo como parte de una cadena de polipéptido más larga o a fragmentos de VEGF-A más cortos que. terminan, por ejemplo en el aminoácido 109. El enlace especifico a VEGF110 en el sentido anterior es reconocido, si el anticuerpo usado exhibe menos de 10% de reactividad cruzada con un fragmento más corto de VEGF que no tiene el aminoácido 110 en su término C y menos del 10% de reactividad cruzada con aquellas isoformas de VEGF-A que no tienen un aminoácido C-terminal libre 110. También preferido, la reactividad cruzada será menor del 5%, 4%, 3%, 2% y 1%, respectivamente, para ambos fragmentos más cortos de las isoformas de VEGF y VEGF que no tienen el aminoácido C-terminal libre 110.
Anticuerpos específicos apropiados solamente se enlazan al VEGFno de producto de escisión de VEGF corto pueden ser obtenidos de acuerdo con procedimientos estándar usualmente, un péptido que representa o comprende el amino ácido C-terminal por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más amino ácidos de VEGFno será sintetizado opcionalmente acoplado a un portador y usado para inmunización. Anticuerpos policlonales específicos pueden ser obtenidos mediante etapas de inmunoabsorción apropiados. Los anticuerpos monoclonales pueden ser seleccionados fácilmente en cuanto a reactividad con VEGFno y baja reactividad cruzada apropiada. Baja reactividad cruzada en términos del anticuerpo VEGF110- especifico puede ser determinada para ambos fragmentos más cortos de VEGFno (por ejemplo, que carece del aminoácido C- terminal de VEGFn0) e isoformas de VEGF-A que no tienen un aminoácido C-terminal libre de VEGFi10.
Varios métodos de medición están disponibles y por ¦ ejemplo la muestra se puede poner en contacto con un anticuerpo que se especificó para VEGF12i y un anticuerpo específico para VEGF110 bajo condiciones suficientes para que se forme el complejo de anticuerpo VEGF121 y VEGF110, respectivamente se forme y luego detectar ambos de estos complejo. La presencia de proteína de VEGF121 y VEGFj.10 puede ser detectada de una diversidad de maneras, tal como mediante Western blot (con o sin imunoprecipitación) , SDS-PAGE bidimensional , imunoprecipitación, clasificación celular actividad por fluorescencia (FACS) , citometría de flujo y procedimientos de ELISA para analizar una amplia variedad de tejidos y muestras, incluyendo plasma o suero. Un amplio intervalo de técnicas de inmunoanálisis que utilizan tal formato de análisis están disponibles, véanse por ejemplo Patentes Estadounidense 4,016,043, 4,424,279 y 4,018,653. Estos incluyen tanto análisis de un solo sitio como de dos sitios o de "emparedado" de los tipos no competitivos, también como en los análisis competitivos tradicionales. Estos análisis también incluyen enlace directo de un anticuerpo marcado a un biomarcador objetivo. Los análisis de emparedado están entre los análisis más útiles y comúnmente usados. Un número de variaciones de la técnica de análisis de emparedado existen y se pretende que todas sean abarcadas por la presente invención. Brevemente, en . un análisis directo típico, un anticuerpo sin marcar es inmovilizado sobre un sustrato sólido y la muestra a ser probada es traída en contacto con la molécula enlazada. La inmovilización de este anticuerpo de captura puede ser mediante absorción directa a una fase solida o indirectamente, por ejemplo vía un par de enlace especifico, por ejemplo vía el par de. enlace de estreptavidina-biotina . Preferiblemente, el anticuerpo inmovilizado se enlazara tanto a VEGF121 como a VEGFno , respectivamente. Después de un periodo de incubación apropiado por un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, un segundo anticuerpo especifico , al antígeno (esto es, VEGF121 o VEGFno , respectivamente) marcado con una molécula de reportero apropiada apta de producir una señal detectable es luego agregado e incubado permitiendo un tiempo suficiente para la formación de otro complejo de anticuerpo anticuerpo-antígeno-marcado . Cualquier material sin reaccionar es lavado y la presencia de VEGF121 y VEGFno es determinada mediante observación de la señal producida por la molécula de reportero. Los resultados pueden ser ya sea cualitativos, mediante simple observación de la señal visible o pueden ser cuantificados al comparar con una muestra testigo que contiene cantidades conocidas de biomarcador. En un montaje alternativo, el anticuerpo específico para VEGF121 y el anticuerpo para VEGFno, respectivamente, es inmovilizado y un anticuerpo que se enlaza tanto a VEGF12i como a VEGF110 opcionalmente que porta una molécula de reportero, puede ser usado para detectar las moléculas objetivo.
Variaciones en el análisis directo incluyen un análisis simultáneo, en el cual tanto la muestra como el anticuerpo marcado son agregados simultáneamente al anticuerpo enlazado. Estas técnicas son bien conocidas para aquellos experimentados en el arte, incluyendo cualesquier variaciones menores como será fácilmente evidente. En un análisis de emparedado directo típico, un primer anticuerpo es enlazado covalente o pasivamente a una superficie sólida. La superficie solida es comúnmente vidrio o un polímero, los polímeros más comúnmente usados son celulosa, poliacriamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.
Los soportes solidos pueden estar en forma de tubos, perlas, discos o micro placas o cualquier otra superficie apropiada para llevar a cabo un inmunoanálisis . Los procesos de enlace son bien conocidos en el arte y consisten en general de reticulación de enlace covalente o absorción física, el complejo de polímero-anticuerpo es lavado en preparación para la muestra de prueba. Una alícuota de la muestra a ser probada es luego agregada al complejo en fase solida e incubada por un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, 2-40 minutos o de la noche a la mañana si es más conveniente) y bajo condiciones apropiadas, (por ejemplo, de temperatura ambiente a 40°C, tal como entre 25°C y 32°C inclusive) para permitir el enlace entre el primer anticuerpo o anticuerpo de captura y el antígeno correspondiente. Enseguida del periodo de incubación, la fase sólida que comprende el primer anticuerpo o anticuerpo de captura y enlazado al mismo que el antígeno es lavada e incubada con anticuerpo secundario o anticuerpo marcado que se enlaza a otro epítope sobre el antígeno. El segundo anticuerpo es enlazado a una molécula de reportero que es usada para indicar el enlace del segundo anticuerpo al complejo del primer anticuerpo y el antígeno de interés .
Un método alternativo competitivo involucra inmovilizar VEGF12i y VEGFno sobre una fase sólida y luego exponer el objetivo inmovilizado junto con la muestra a un anticuerpo especifico a VEGF121 y VEGFn0/ respectivamente que puede o puede no ser marcado con una molécula de reportero. Dependiendo de la cantidad de objetivo y la intensidad de la molécula de reportero, una competencia por la molécula objetivo puede ser detectable directamente vía tal anticuerpo marcado. Alternativamente, un segundo anticuerpo marcado, específico al primer anticuerpo es expuesto al complejo de objetivo-primer anticuerpo para formar un complejo terciario de objetivo-primer anticuerpo-segundo anticuerpo. El complejo es detectado por la señal emitida por la molécula de reportero. "Molécula de reportero" como se usa en la presente especificación, significa una molécula que, por su naturaleza química, provee una señal identificable analíticamente que permite la detección del antígeno-anticuerpo enlazado. Las moléculas de reportero más comúnmente usadas en este tipo de análisis son ya sea enzimas, fluoróforos o moléculas que contienen radionúclidos (esto es, radio isótopos) y moléculas quimio luminiscentes.
En el caso de un inmunoanálisis de enzima, una enzima es conjugada al segundo anticuerpo, en general por medio de glutaraldehido o peryodato. Como se reconocerá fácilmente, sin embargo, existen una amplia variedad de técnicas de conjugación diferentes, que están fácilmente disponibles para el experimentado en el arte. Enzimas usadas comúnmente incluyen peroxidasa de rábano, glucosa bxidasa, beta-galactosidasas y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos a ser usados con las enzimas específicas son en general escogidos para la producción, después de la hidrólisis mediante la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Ejemplos de enzimas apropiadas incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También es posible emplear sustratos fluorogenicos que producen un producto fluorescente en lugar de los sustratos cromogenicos indicados anteriormente. En todos los casos, el anticuerpo enzima-marcado es agregado al complejo de primer anticuerpo-molécula de marcador, se permite que se enlace y luego el reactivo en exceso es lavado. Una solución que contiene el sustrato apropiado es luego agregada al complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo. El sustrato reaccionara con la enzima enlazada al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa, que puede ser cuantificada adicionalmente usualmente de manera espectrofotométrica para dar una indicación de la cantidad de VEGF12i y VEGF110 que está presente en la muestra. Alternativamente, compuestos fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina pueden ser acoplados químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de enlace . Cuando son activados por iluminación con luz de longitud de onda particular, el anticuerpo fluorocromo-marcado absorbe la energía de luz, induciendo un estado a excitabilidad en la molécula seguido por emisión de la luz a un color característico detectable visualmente con un microscopio de luz. Como en el EIA, se permite que el anticuerpo marcado fluorescente que se enlace al complejo de primer anticuerpo-marcador molecular. Después de lavado del reactivo sin enlazar, el complejo terciario restante y luego expuesto a la luz de longitud de onda apropiada, la fluorescencia observada indica la presencia de VEGF121 y VEGFno. La inmunofluorescencia y técnicas de EIA son ambas bien establecidas en el arte. Sin embargo, otras moléculas de reportero, tales como radio isótopos, ' moléculas quimio luminiscentes o bio luminiscentes pueden también ser empleadas. Inmunoanálisis para detectar VEGF son descritos por ejemplo en las Patentes Estadounidenses 6,855,508 y 7,541,160 y Publicación de Patente Estadounidense 2010/0255515. Plataformas apropiadas para detectar VEGF son descritas en, por ejemplo EP 0939319 y EP 1610129.
En ciertas modalidades, los mARN o ADN de una isoforma de VEGF de interés son detectados utilizando análisis de Northern, inmunoabsorción o reacción en cadena de polimerasa (PCR) , hibridización de arreglo, análisis de protección de RNasa o utilizando micro arreglos e ADN, que están disponibles cormecialménte, incluyendo instataneas de microarreglo de ADN: por ejemplo, análisis de PCR en tiempo real (RT-PCR) tales como análisis de PCR cuantitativos que son bien conocidos en el arte. En una modalidad ilustrativa de la invención, un método para detecatr mARN de una isoforma de VEGF de interés en una muestra biológica comprende producir cADN de la muestra mediante transcripción inversa utilizando por lo menos un cebador; amplificar el cADN asi producido y detectar la presencia del cADN amplificado. Además, tales métodos pueden incluir una o mas etapas que permiten determinar los niveles de mARN en una muestra biológica (por ejemplo, al examinar simultanaeamente los niveles de una secuencia de mARN testigo comparativo de un gen de "mantenimiento" tal como un miembro de la familia de actina) . Opcionalmente, la secuencia del cADN amplificado puede ser determinada. El análisis de Northern blot es una técnica convencional bien conocida en el arte y es descrita por ejemplo en Molecular Cloning, a Laboratory Manual, second edition, 1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500. Protocolos típicos para evaluar el status de genes y productos genéticos son encontrados por ejemplo en Ausubel et al. eds . , 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting) , 4 (Southern Blotting) , 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis) .
B. Kits Para uso en la detección de VEGF12i y VEGF110, kits o artículos, de manufactura son también provistos por la invención, tales kits pueden ser usados para determinar si un sujeto será éfectivamente responsivo a una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF. Estos kits pueden comprender medios de portador que es dividido en compartimientos para recibir en combinación estrecha uno o más medios de recipiente, tales como frascos, tubos y los semejantes. Cada uno de los medios de recipientes comprenden uno de los elementos separados a ser usados en el método. Por ejemplo, uno de los medios de recipiente puede comprender una sonda que es o puede ser marcada detectablemente . Tal sonda puede ser un anticuerpo o polinucleootido específico para la proteína o mensaje de VEGF121 o VEGFno . En donde el kit utiliza hibridización de ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico objetivo, el kit puede también tener recipientes que contienen nucleótido (s) para amplificación de la secuencia de ácido nucleico objetio y/o un recipiente que comprende medios de reportero, tal como una proteína de enlace de biotina, por ejemplo avidina o estreptavidina enlazada a una molécula de reportero, tal como un marcador enzimático, fluorescente o de radioisótopo.
Tal kit comprenderá comúnmente el recipiente descrito anteriormente y uno o más de otros recipientes que comprenden materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo soluciones reguladoras del pH, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de empaque con instrucciones para uso. Una etiqueta puede estar presente sobre el recipiente para indicar que la composición es usada para una aplicación específica y puede también indicar instrucciones ya sea para uso in vivo o in vitro, tales como aquellos descritos anteriormente.
Los kits de la invención tienen un numero de modalidades, una modalidad típica es un kit que comprende un recipiente, una etiqueta sobre el recipiente y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición incluye un anticuerpo que se enlaza preferencialmente a ambas isoformas de VEFF cortas y EGF121 y VEGFno o un anticuerpo que se enlaza específicamente a VEGF121 y un anticuerpo que se enlaza específicamente a VEGFn0, respectivamente y la etiqueta sobre el recipiente indica que la composición puede ser usada para evaluar la presencia de VEGF12i y/o VEGF110 en una muestra y en donde el kit incluye instrucciones para usar el anticuerpo para evaluar la presencia de VEGF12i y VEGFno en un tipo de muestra particular. El kit puede comprender además un conjunto de instrucciones y materiales para preparar una muestra y aplicar el anticuerpo a la muestra. El kit puede incluir tanto anticuerpo como un anticuerpo secundario, en donde el anticuerpo secundario es conjugado a un marcador, por ejemplo un marcador enzimático.
Otros componentes opcionales del kit incluyen una o más soluciones reguladoras del pH (por ejemplo, solución reguladora del pH de bloqueo, solución reguladora del pH de lavado, solución reguladora del pH del sustrato, etc.), otros reactivos tales como sustrato (por ejemplo, cromogeno) que es alterado químicamente por un marcador enzimático, solución de recuperación de epítope, muestras testigo (testigos positivos y/o negativos), portaobjeto (s) testigo, etc. Los kit pueden también incluir instrucciones para interpretar los resultados obtenidos utilizando el kit.
En una modalidad especifica adicional, para kits a base de anticuerpo, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, anexado a un soporte sólido o apto de enlace a un soporte solido) que se enlaza a VEGF121 y VEGFno; (2) un segundo anticuerpo diferente que se enlaza preferiblemente a las isoformas de VEGF-A cortas y VEGF121 y VEGFno, respectivamente. Preferiblemente, el último anticuerpo es marcado la misma molécula de reportero. Por supuesto, también es posible intercambiar el primer por el segundo anticuerpo y viceversa cuando se diseña tal análisis.
En modalidades especificas adicionales, para kits a base de anticuerpo, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, anexado a un soporte solido o apto de enlace a un soporte solido) que se enlaza a VEGF121 y VEGFno; (2) un segundo anticuerpo diferente que se enlaza preferiblemente a VEGF y (3) un tercer anticuerpo diferente que se enlaza específicamente a VEGFi10. Preferiblemente, los últimos dos son ambos marcados con la misma molécula de reportero .
B. Métodos de tratamiento Algunos métodos de la invención comprenden además administrar un antagonista de VEGF a un paciente con un nivel incrementado de VEGF121 y VEGF o en^ comparación con una muestra de referencia. Otras modalidades de la invención proveen métodos de tratamiento de un paciente con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF. Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proveer la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, una dosis puede ser administrada, varias dosis divididas pueden ser administradas en el tiempo o la dosis puede ser proporcionalmente reducida o incrementada como sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica.
El médico tiene habilidad ordinaria en el arte puede fácilmente determinar y prescribir la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida, dependiendo de factores tales como el tipo particular de agente anti-cáncer. Por ejemplo, el medico podría iniciar con dosis de tal agente anti-cáncer, tal como un anticuerpo anti-VEGF-A, empleadas en la composición farmacéutica a niveles más bajos que aquellas requeridos con el fin de obtener el efecto terapéutico deseado e gradualmente incrementar la dosificación hasta que se obtiene el efecto deseado. La efectividad de una dosis o un régimen de tratamiento dado del antagonista puede ser determinada, por ejemplo al determinar los signos y síntomas en el paciente utilizando medidas estándar de eficacia.
En todavía otra modalidad, el sujeto es tratado con el mismo agente anti-cáncer, tal como un anticuerpo anti-VEGF-A por lo menos dos veces. Así, las exposiciones inicial y segunda exposición de antagonista son preferiblemente con el mismo antagonista y más preferiblemente todas las exposiciones de antagonista son con el mismo antagonista, esto es, tratamiento por las primeras dos exposiciones y preferiblemente todas las exposiciones, es con un tipo de agente anti-cáncer, por ejemplo un antagonista que se enlaza a VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF, por ejemplo todo con bevacizumab.
En todos los métodos de la invención resumidos en la presente, el agente anti-cáncer (tal como un anticuerpo que se enlaza a VEGF) puede estar sin conjugar, tal como un anticuerpo descubierto o puede ser conjugado con otra molécula paor efectividad adicional, tal como por ejemplo para mejorar la vida media.
Un agente anti-cáncer preferido en la presente es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano, por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF y preferiblemente bevacizumab.
En otra modalidad, el antagonista de VEGF (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF) es el único medicamento administrado al sujeto. ' En una modalidad, el antagonista es un anticuerpo anti- VEGF que es administrado a una dosis de alrededor de 100 o 400 mg cada, 1, 2, 3 o 4 semanas o es administrado a una dosis de alrededor de 1, 3, 5, 7.5, 10, 15 o 20 mg/kg cada 1, 2, 3 o 4 semanas. La dosis puede ser administrada como una sola dosis o como múltiples dosis (por ejemplo 2 o 3 dosis) , tales como infusiones.
En todavía otro aspecto, la invención provee, después de la etapa de diagnosis un método para determinar si se continua administrando un agente anti-cáncer (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF) a un sujeto diagnosticado con cáncer que comprende medir la reducción en el tamaño del tumor, utilizando técnicas de representación de imagen tales como radiografía y/o MRI, después de la administración del antagonista una primera vez, medir la reducción en el tamaño del tumor en el sujeto utilizando técnicas de representación de imagen, tales como radiografía y/o MRI, después de la administración del antagonista una segunda vez, comparar los hallazgos de representación de imagen del sujeto la primera vez y en la segunda vez y si la puntuación es menor en la segunda vez que en la primera vez, continuar la administración del antagonista.
En todavía una modalidad adicional, incluye una etapa en el método de tratamiento para probar la respuesta del sujeto al tratamiento después de la etapa de administración para determinar que el nivel de respuesta es efectivo para tratar la alteración angiogénica. Por ejemplo, se incluye una etapa para probar la puntuación de representación de imagen (radiográfica y/o RI) después de la administración y compararla con resultados de representación de imagen de referencia obtenidos antes de la administración para determinar si el tratamiento es efectivo al medir si y por cuanto ha cambiado. Esta prueba puede ser repetida a varios intervalos de tiempo programados o sin programar después de la administración para determinar el mantenimiento de cualquier remisión parcial o completa.
En una modalidad de la invención, ningún otro medicamento que el antagonista de VEGF tal como anticuerpo anti-VEGF es administrado al sujeto para tratar cáncer.
En cualquiera de los métodos en la presente, el agente anti-cáncer puede ser administrado en combinación con una cantidad efectiva de un (os) agente (s) adicional (es) . Agente (s) adicional (es) apropiado (s) incluye (n) por ejemplo un agente anti-linfangiogenico, un agente anti-angiogénico, un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, un agente citotóxico o combinaciones de los mismos.
Todos estos agentes adicionales pueden ser usados en combinación entre si o por si mismos con el primer medicamento, de tal manera que la expresión "agente adicional" como se usa en la presente no significa que es el único medicamento además del antagonista de VEGF. Así, el agente adicional no necesita ser un agente individual, sino que puede constituir o comprender más de uno de tales fármacos .
Estos agentes adicionales como se resume en la presente son en general usados en las mismas dosificaciones y con rutas de administración como se usan anteriormente en la presente o alrededor de uno a 99% de las dosificaciones empleadas hasta ahora. Si tales agentes adicionales son usados, preferiblemente, son usados en cantidades más bajas que si el primer médicamente no estuviera presente, especialmente en dosificaciones subsecuentes más allá de la dosificación inicial con el primer médicamente, para eliminar o reducir efectos secundarios provocados por los mismos.
Para los métodos de re-tratamiento descritos en la presente, en donde un (os) agente (s) adicional (es) es (son) administrado (s) en una cantidad efectiva con una exposición de antagonista, puede ser administrado con cualquier exposición, por ejemplo solo con una exposición o con más de una exposición. En una modalidad, el (los) agente (s) adicional (es) es (son) administrado (s) con la exposición inicial. En otra modalidad, el (los) agente (s) adicional (es) es (son) administrado (s) con la exposición inicial y segunda exposición. En todavía una modalidad adicional, el (los) agente (s) adicional (es) es (son) administrado (s) con todas las exposiciones. Es preferido que, después de la exposición inicial, tal como de esteroide, la cantidad de tal (es) agente (s) adicional (es) sea reducida o eliminada para reducir la exposición del sujeto a un agente con efectos secundarios tales como prednisona, prednisolona, metilprednisolona y ciclofosfoamida.
La administración combinada de un (os) agente (s) adicional (es) incluyendo co-administración (administración concurrente) , utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica y administración consecutiva ya sea en uno u otro orden, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo en tanto que ambos (o todos) los agentes activos (medicamentos) ejercen simultáneamente sus actividades biológicas .
La terapia anti-cáncer es administrada mediante cualquier medio apropiado, incluyendo administración parenteral, tópica, subcutánea, intraperitoneal , intrapulmonar, intranasal y/o intralesional . Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa (i.v.), intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La administración intratecal es también contemplada. Además, el agente anti-cáncer puede apropiadamente ser administrado mediante infusión punzada, por ejemplo con dosis declinante del agente anti-cáncer. Preferiblemente, la dosificación es dada intravenosa o subcutáneamente y más preferiblemente mediante infusión (es) intravenosa (s) .
Si proveen múltiples exposiciones de agentes anti-cáncer, cada exposición puede ser provista utilizando los mismos o diferentes medios de administración. En una modalidad, cada exposición es mediante administración intravenosa. En otra modalidad, cada exposición es dada mediante administración subcutánea. En todavía otra modalidad, las exposiciones son dadas tanto mediante administración intravenosa como subcutánea.
En una modalidad, el agente anti-cáncer tal como un anticuerpo anti-VEGF es administrado como una infusión intravenosa lenta en lugar de un empuj e intravenoso o bolo . Por ejemplo, un esteroide tal como prednisolona o metil prednisolona (por ejemplo, alrededor de 80-120 mg i.v., más específicamente alrededor de 100 mg i.v.) es administrado alrededor de 30 minutos antes de cualquier infusión del anticuerpo anti-VEGF. El anticuerpo anti-VEGF es por ejemplo aplicado por infusión a través de una línea especializada.
Para la dosis inicial de una exposición de múltiples dosis al anticuerpo anti-VEGF o para la dosis individual si la exposición involucra solo una dosis, tal infusión es preferiblemente comenzada a una velocidad de alrededor de 50 mg/horas. Esta puede ser escalada, por ejemplo a una velocidad de incremento de alrededor de 50 mg/h cada alrededor de 30 minutos a un máximo de alrededor de 400 mg/h. sin embargo, si el sujeto está experimentando una reacción infusión-relacionada, la velocidad de infusión es preferiblemente reducida, por ejemplo a la mitad de la velocidad actual, por ejemplo de 100 mg/h a 50 mg/h. preferiblemente, la infusión de tal dosis de anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, una dosis total de alrededor de 1000 mg) es consumada alrededor de 255 minutos (4 horas, 15 minutos) . Opcionalmente, los sujetos reciben un tratamiento profiláctico de acetaminofén/paracetamol (por ejemplo, alrededor de 1 g) y difenhidramina HCl(por ejemplo, alrededor de 50 mg o dosis equivalente de agente similar) por la boca alrededor de 30 a 60 minutos antes del inicio de una infusión.
Si más de una infusión (dosis) de anticuerpo anti-VEGF es dada para obtener la exposición total, la segunda infusión de anticuerpo anti-VEGF o infusiones de anticuerpo anti-VEGF subsecuentes en esta modalidad de infusión son preferiblemente comenzadas a una velocidad más alta que la infusión inicial, por ejemplo alrededor de 100 mg/h. esta velocidad puede ser escalada, por ejemplo, a una velocidad de incremento de alrededor de 100 mg/h cada alrededor de 30 minutos a un máximo de alrededor de 400 mg/h. los sujetos que experimentan una reacción infusión-relacionada tienen preferiblemente la velocidad de infusión reducida a la mitad de aquella velocidad, por ejemplo de 100 mg/h a 50 mg/h. preferiblemente, la infusión de tal segunda dosis o dosis subsecuente de anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, una dosis total de alrededor de 1000 mg) es consumada por alrededor de 195 minutos (3 horas, 15 minutos) .
En una modalidad preferida, el agente anti-cáncer es un anticuerpo anti-VEGF y es administrado en una dosis de alrededor de 0.4 a 4 gramos y más preferiblemente el anticuerpo es administrado en una dosis de alrededor de 0.4 a 1.3 gramos a una frecuencia de 1 a 4 dosis en un periodo de alrededor de un mes. todavía más preferiblemente, la dosis es de alrededor de 500 mg a 1.2 gramos y en otras modalidades, es de alrededor de 750 mg a 1.1 gramos. En tales aspectos, el antagonista es preferiblemente administrado en dos a tres dosis y es administrado en un periodo de alrededor de 2 a 3 semanas .
En una modalidad, el sujeto nunca ha sido administrado previamente con cualesquier fármacos para tratar el cáncer. En otra modalidad, el sujeto o paciente ha sido previamente administrado con uno o más medicamentos para tratar el cáncer. En una modalidad adicional, el sujeto o paciente no fue responsivo a una o más de las medicaciones que ha sido administrado previamente. Tales fármacos a los cuales el sujeto puede no ser responsivo incluyen por ejemplo agentes anti-neoplásicos, agentes quimioterapéuticos , agentes citotóxicos y/o agentes inhibidores de crecimiento. Mas en particular, los fármacos a los cuales el sujeto puede ser no responsivo incluyen antagonistas de VEGF, tales como anticuerpos anti-VEGF. En un aspecto adicional, tal agente anti-cáncer incluye un anticuerpo o inmunoadhesina, de tal manera que el re-tratamiento es contemplado con uno o más anticuerpos o inmunoadhesinas de esta invención a los cuales el sujeto fue anteriormente no responsivo.
IV. Tratamiento con el agente anti-cáncer Una vez que la población de pacientes más responsiva o sensible al tratamiento con el antagonista de VEGF ha sido identificada, en el tratamiento con el antagonista de VEGF solo o en combinación con otros medicamentos, da como resultado una mejora en los pacientes que sufren de cáncer. Por ejemplo, tal tratamiento puede dar como resultado la reducción en el tamaño del tumor o supervivencia libre de avance. Además, el tratamiento con la combinación de un agente anti-cáncer y por lo menos un agente adicional da como resultado preferiblemente un efecto terapéutico aditivo, mas preferiblemente sinergista (o mayor que aditivo) al paciente. Preferiblemente, en esto método combinado, la sincronización entre por lo menos una administración del (los) agente (s) adicional (es) y por lo menos una administración del agente anti-cáncer es alrededor de 1 mes o menos, mas preferiblemente alrededor de 2 semanas o menos .
Se apreciara por aquel de habilidad en las artes médicas que la manera exacta de administración a dicho paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente anti-cáncer enseguida de la diagnosis de la responsividad probable del paciente al agente anti-cáncer será a discreción del medio que atiende. El modo de administración, incluyendo dosificación en combinación con otros agentes, sincronización y frecuencia de administración y los semejantes, pueden ser afectados por la diagnosis de la responsividad probable del paciente a tal agente anti-cáncer, también como la condición e historia del paciente. Así, a un paciente diagnosticado con una alteración que se permite que sean relativamente insensibles al agente anti-cáncer se pueden todavía beneficiar del tratamiento con el mismo, particularmente en combinación con otros agentes, incluyendo agentes que pueden alterar la responsividad del paciente al agente anti-cáncer.
La composición que comprende un agente anti-cáncer será formulada, dosificada y administrada de manera consistente con la buena práctica médica. Factores para consideración en este contexto incluyen el tipo particular de la alteración que es tratada, el mamífero particular que es tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa de la alteración angiogénica, el sitio de administración del agente, efectos secundarios posibles, el tipo de antagonista, el método de administración, el horario de administración y otros factores conocidos a los prácticos médicos. La cantidad efectiva del agente anti-cáncer a ser administrada será determinada por tales consideraciones.
Como una propuesta general, la cantidad efectiva del agente anti-cáncer administrada parenteralmente por dosis estará en el intervalo de alrededor de 20 mg alrededor de 5000 mg, por una o más dosificaciones. Regímenes- de dosificación ejemplares para anticuerpos tales como anticuerpos anti-VEGF incluyen 100 o 400 mg cada 1, 2, 3 o 4 semanas o es administrada una dosis de alrededor de 1, 3, 5, 7.5, 10, 15 o 20 mg/kg cada 1, 2, 3 o 4 semanas. La dosis puede ser administrada como una sola dosis o como múltiples dosis (por ejemplo, 2 o 3 dosis), tales como infusiones.
Como se indica anteriormente, sin embargo, estas cantidades sugeridas de agente anti-cáncer están sujetas a la discreción terapéutica. El factor clave para seleccionar una dosis apropiada y horario apropiado es el resultado obtenido, como se indica anteriormente. En algunas modalidades, el agente anti-cáncer es administrado tan cercano al primer signo, diagnosis, aparición o presencia de la alteración cómo es posible.
El agente anti-cáncer es administrado mediante cualquier medio apropiado, incluyendo administración parenteral, tópica, subcutánea, intraperitoneal , intrapulmonar, intranasal y/o intralesional . Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La administración intratecal es también contemplada. Además, el antagonista puede apropiadamente ser administrado mediante infusión pulsada, por ejemplo con dosis declinantes del antagonista. Más preferiblemente, la dosificación es dada mediante inyecciones intravenosas.
Se pueden administrar agentes adicionales, como se indica anteriormente, con los agentes anti-cáncer de la presente. La administración combinada incluye coadministración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica y administración consecutiva ya sea en un orden u otro, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo en tanto que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.
Además de la administración de agentes anti-cáncer al paciente mediante rutas tradicionales como se indica anteriormente, la presente invención incluye administración mediante terapia genética. Tal administración de ácido nucleico que codifican el agente anti-cáncer es abarcada por la expresión "administrar una cantidad efectiva de un agente anti-cáncer" . Véase, por ejemplo WO 1996/07321 concerniente con la terapia genética para generar anticuerpos intracelulares .
Hay dos procedimientos principales para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) a las células del paciente, in vivo y ex vivo. Para la administración in vivo, el ácido nucleico es inyectado directamente al paciente, usualmente en el sitio en donde el antagonista es requerido. Para el tratamiento ex vivo, las células del paciente son removidas, el ácido nucleico es introducido a esta células aisladas y las células modificadas son administradas al paciente ya sea directamente o por ejemplo encapsuladas dentro de membranas porosas que son implantadas al paciente (véanse, por ejemplo Patentes Estadounidenses 4,892,538 y 5,283,187). Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos a células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido a células cultivadas dentro o in vivo en las células del huésped destinado. Técnicas apropiadas para la transferencia de ácido nucleico a células mamíferas in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, micro inyección, fusión celular, DEAE-dextrana, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Un vector usado comúnmente para administración ex vivo del gen es un retrovirus.
Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen transfixión con vectores virales (tales como adenovirus, virus de herpes simples I o virus adeno-asociado) en sistemas a base de lípido (lípidos útiles para la transferencia lípido-moderada del gen son DOT A, DOPE y DC-Chol, por ejemplo). En algunas situaciones, es deseable proveer la fuente de ácido nucleico con un agente específico para la célula objetivo tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular sobre la célula objetivo, un ligando para un receptor sobre el objetivo, etc. En donde se emplean liposomas, proteínas que se enlazan a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis puede ser usada para apuntamiento y/o para facilitar la absorción, por ejemplo proteínas de capsido o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas . que sufren internalización en la ciclizacion y proteínas que apuntan la localización intracelular y mejoran la vida media intracelular. La técnica de endocitosis de receptor-moderada es descrita por ejemplo por Wu et al . , J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987) y Wagner et al., PNAS USA 87:3410-3414 (1990). Protocolos de marcación genética en terapia genética son descritos, por ejemplo en Anderson et al., Science 256:808-813 (1992) y WO 1993/25673.
Un agente anti-cáncer puede ser combinado en una formulación de combinación farmacéutica o régimen de dosificación como terapia combinada, con por lo menos un compuesto original que tiene propiedades anti-cáncer. El por lo menos un compuesto adicional de la formulación de combinación farmacéutica o régimen de dosificación tiene preferiblemente actividades complementarias a la composición de antagonista de VEGF de tal manera que no se afectan adversamente cada uno entre sí.
El por lo menos un compuesto adicional puede ser un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, una citoquina, un agente inhibidor de crecimiento, un agente anti-hormonal, un agente anti-angiogénico, un agente anti-linfangiogenico y combinaciones de los mismos. Tales moléculas están apropiadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito planeado. Una conjunción farmacéutica que contiene un antagonista de VEGF (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF) puede también comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, un agente citotóxico o combinaciones de los mismos.
En un aspecto, él primer compuesto es un anticuerpo anti-VEGF y el por lo menos un compuesto es un anticuerpo terapéutico diferente del anticuerpo anti-VEGF. En una modalidad, el por lo menos un compuesto adicional es un anticuerpo que se enlaza a un marcador de superficie de célula de cáncer. En una modalidad, el por lo menos un compuesto adicional es un anticuerpo anti-HER2, trastuzumab, (por ejemplo Herceptin®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA) . En una modalidad, él por lo menos un compuesto adicional es un anticuerpo anti-HER2, pertuzumab (Omnitarg™, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, Véase Patente Estadounidense 6949245)) . En una modalidad, el por lo menos un compuesto adicional es un anticuerpo (ya sea un anticuerpo descubierto o un ADC) y el anticuerpo adicional es un segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto anticuerpo o más, de tal manera que una combinación de tales segundos, terceros, cuartos, quintos, sextos o más anticuerpos (ya sean descubiertos o como un ADC) es eficaz en el tratamiento de una alteración angiogénica.
Otros regímenes terapéuticos de acuerdo con esta invención pueden incluir la administración de un agente anti-cáncer VEGF-antagonista e incluyendo sin limitación terapia de radiación y/o trasplantes de medula ósea y sangre periférica y/o un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico o un agente inhibidor de crecimiento. En una de tales modalidades, un agente quimioterapéutico es un agente o una combinación de agentes tales como por ejemplo ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, adriamicina, doxorubincina, vincristina (ONCOVIN™) , prednisolona, CHOP, CVP o COP o inmunoterapeuticos tales como anti-PSCA, anti-HER2 (por ejemplo, HERCEPTIN®, OM ITARG®) . La terapia combinada puede ser administrada como un régimen simultáneo o secuencial. Cuando es administrada secuencialmente, la combinación puede ser administrada en dos o más administraciones. La administración combinada incluye coadministración, utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica y administración consecutiva ya sea en un orden u otro, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo en donde ambos (o todos) los agentes activos ejercer simultáneamente sus actividades biológicas.
En una. modalidad, el tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF involucra la administración combinada de un agente anti-cáncer identificado en la presente y uno, dos o tres o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores de crecimiento, incluyendo co-administración de cocteles de diferentes agentes quimioterapéuticos . Agentes quimioterapéuticos incluyen taxanos (tales como paclitaxel y docetaxel) y/o antibióticos de antraciclina . Los horarios de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden ser usados de acuerdo con las instrucciones del fabricante o tal como se determina empíricamente por el práctico experimentado. Los horarios d preparación y dosificación para tal quimioterapia son también descritos en "Chemotherapy Service", (1992) Ed. , M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
Dosificaciones apropiadas para cualquiera de los agentes co-administrados anteriores son aquellos usados actualmente y pueden ser disminuidas debido a la acción combinada (sinergia) del agente recién identificado y otros agentes o tratamientos quimioterapéuticos .
La terapia combinada puede proveer "sinergia" y probar ser "sinergista" , esto, es, el efecto obtenido cuando los ingredientes activos usados conjuntamente es mayor que la suma de los efectos que resultan de usar los compuestos separadamente. Un efecto sinergista puede ser obtenido cuando los ingredientes activos son : (a) co- formulados y administrados o alimentados simultáneamente en una formulación de dosificación unitaria combinada, (2) administradas mediante alternación o en paralelo como formulaciones separadas o (3) mediante algún otro régimen. Cuando son administradas en terapia de alternación, un efecto sinergista puede ser obtenido cuando los compuestos son administrados o alimentados secuencialmente, por ejemplo mediante diferentes inyecciones enseguida separadas. En general, durante terapia de alternación, una dosificación efectiva de cada ingrediente activo es administrada secuencialmente, esto es, serialmente, mientras que en la terapia combinada, las dosificaciones efectivas de dos o más ingredientes activos son administradas conjuntamente.
Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada del agente terapéutico adicional dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, el tipo del anticuerpo, la severidad y curso de la enfermedad, si el antagonista de VEGF y agente adicional son administrados por propósitos preventivos o terapéuticos, . terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al antagonista de VEGF y agente adicional y la discreción del médico que atiende. El antagonista de VEGF y agente adicional son administrados apropiadamente al paciente en una vez o una serie de tratamientos. El antagonista de VEGF es administrado comúnmente como se resume en lo anterior. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, alrededor de 200 mg/m2 a 600 mg/m2 del agente adicional es una dosificación candidata inicial para administración del paciente, ya sea por ejemplo mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continúa. Una dosificación diaria típica podría variar de alrededor de 20 mg/m2, 85 mg/m2, 90 mg/m2, 125 mg/m2, 200 mg/m2, 400 mg/m2, 500 mg/m2 o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas en varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que se presenta la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Así, uno o más dosis de alrededor de 20 mg/m2, 85 mg/m2, 90 mg/m2, 125 mg/m2, 200 mg/m2, 400 mg/m2, 500 mg/m2, 600 mg/m2 (o cualquier combinación de las mismas) puede ser administrada al paciente. Tales dosis pueden ser administrada intermitentemente, por ejemplo cada semana o cada dos, tres, cuatro, cinco o seis (por ejemplo, de tal manera que el paciente recibe de alrededor de dos a alrededor de veinte, por ejemplo alrededor de seis dosis del agente adicional) . Una dosis de carga más alta inicial, seguida por una o más dosis más bajas puede ser administrada. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El avance de esta terapia es monitoreado fácilmente mediante técnicas y análisis convencionales.
V. Formulaciones farmacéuticas Formulaciones terapéuticas de los antagonistas usados de acuerdo con la presente invención son preparadas para almacenamiento al mezclar el antagonista que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores aceptables farmacéuticamente opcionales en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Para información general concerniente con formulaciones, véase, por ejemplo Gilman et al. , (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics , 8th Ed. , Pergamon Press; A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990), Mack Publishing Co., Eastori, Pennsylvania . ; Avis et al . , (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman et al.., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms : Tablets Dekker, New York; and Lieberman et al., (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York, Kenneth A. Walters (ed.) (2002) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences) , Vol 119, Marcel Dekker.
Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen soluciones reguladoras del pH tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tal como cloruro octadecildimetilbenzil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico, alcohol bencílico; alquil parebenes tal como metil o propil parabenes; catecol, resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos) , proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulina; polímeros hidrofilicos tales como polivinilpirrolidona; amino ácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos ; disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbítol; contra iones formadores de sal, tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™ , PLURONICS™ o polietilen glicol (PEG) .
Formulaciones de anticuerpo anti-VEGF ejemplares son descritas en la Patente Estadounidense 6,884,879. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-VEGF son formulados a 25 mg/ml en frascos de un solo uso. En ciertas modalidades 100 mg de los anticuerpos anti-VEGF son formulados en 240 mg de a, -trehalosa di hidratada, 23.2 mg de fosfato de sodio (monobásico, monohidratado) , 4.8 mg de fosfato de sodio (di básico, anhidro), 1.6 mg de polisorbate 20 y agua para inyección, USP. En ciertas modalidades, 400 mg de los anticuerpos anti-VEGF son formulados en 960 mg de , a-trehalosa di hidratada, 92.8 mg de fosfato de sodio (monobásico, monohidratado), 19.2 mg de fosfato de sodio (di básico anhidro), 6.4 mg de polisorbate 20 y agua para inyección USP.
Formulaciones liofilizadas aptas para administración subcutánea son descritas por ejemplo en la Patente Estadounidense 6,267,958 (Andya et al.). Tales formulaciones liofilizadas pueden ser reconstituidas con un diluyente apropiado a una alta concentración de proteína y la formulación reconstituida puede ser administrada subcutáneamente al mamífero a ser tratado en la presente.
Formas cristalizadas del antagonista son también contempladas. Véase, por ejemplo 2002/0136719A1 (Shenoy et al.).
La formulación de la presente puede también contener más de un compuesto activo (un (os) agente (s) adicional (es) como se indica anteriormente) , preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. El tipo y cantidades efectivas de tales medicaciones dependen por ejemplo de la cantidad y tipo del antagonista de VEGF presente en la formulación y parámetros clínicos de los sujetos. Los preferidos de tales agentes adicionales son indicados anteriormente.
Los ingredientes activos pueden también estar atrapados en micro capsulas preparadas por ejemplo mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo hidroximetilcelulosa o micro capsulas de gelatina y micro capsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, micro esferas de albúmina, micro emulsiones, nano partículas y nano capsulas) o en macro emulsiones. Tales técnicas son reveladas en Remington's Pharmaceutical Sciences 16 edición, Osol, A. Ed. (1980) .
Preparaciones de liberación sostenida pueden ser preparadas. Ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista, tales matrices están en forma de artículos formados, por ejemplo películas o micro capsulas. Ejemplos de tales matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2- idroxietil-metacrilato) o poli (alcohol vinílico) , polilacturos (Patente Estadounidense 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y gama-etil-L-glutamato, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, copolímeros de ácido láctico-ácido glicolico degradables tales como el LUPRON DEPOT™ (micro esferas inyectables compuestas de copolíméro de ácido láctico-ácido glicolico y acetato de leuprolato) y ácido poli-D (-)-3-hidroxibutirico .
Las formulaciones a ser usadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles .
VI. Kits Para uso en la detección de VEGF121 y/o VEGFn0, kits o artículos de manufactura son también provistos por la invención. Tales kits pueden ser usados para determinar si un sujeto con cáncer será efectivamente responsivo a una terapia de agente anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF (incluyendo, por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF tal como bevacizumab) . Estos kits pueden comprender un medio de portador que son divididos en compartimientos para recibir en confinación estrecha uno o más medios de recipiente tales como frascos, tubos y los semejantes, cada uno de los medios de recipiente comprende uno de los elementos separados a ser usados en el método. Por ejemplo, uno de los medios de recipiente puede comprender un compuesto que se enlaza específicamente a VEGF121 y otro medio de recipiente puede comprender un compuesto que se enlaza específicamente a VEGFno · Tal kit comprenderá comúnmente el recipiente descrito anteriormente y uno o más de otros recipientes que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo soluciones . reguladoras del pH, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de empaque con instrucciones para uso. Una etiqueta puede estar presente en el recipiente para indicar que la composición es usada para una aplicación específica y puede también indicar instrucciones ya sea para el uso in vivo o in vitro, tales como aquellos descritos anteriormente.
Los kits de la invención tienen un número de modalidades. Una modalidad típica es un kit que comprende un recipiente, una etiqueta sobre el recipiente y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición incluye compuesto (s) que se enlaza específicamente a VEGF121 y/o VEGFno y la etiqueta sobre el recipiente indica que la composición puede ser usada para detectar V VEGF121 y/o VEGFno y en donde el kit incluye instrucciones para usar el (los) compuesto (s) para detectar VEGF1.21 y/o VEGF110. El kit puede comprender además un conjunto de instrucciones y materiales para preparar y usar el (los) compuesto (s) .
Otros componentes opcionales del kit incluyen una o más soluciones reguladoras del pH (por ejemplo, solución reguladora del pH de dilución, etc.), otros reactivos, tales como portador (por ejemplo, dextrana, albúmina) . Los kits pueden también incluir instrucciones para interpretar los resultados obtenidos utilizando el kit.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son provistos para ilustrar pero no limitar la invención actualmente reivindicada.
Ejemplo 1 En la prueba AVADO (BO17708) , los pacientes con cáncer de. pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático sin tratar son aleatorizados a docetaxel 100 mg/m2 mas bevacizumab 7.5 mg/kg cada 3 semanas (n = 248), bevacizumab 15 mg/kg (n = 247) cada tres semanas o placebo (n = 241) véase, Miles, J. Clin. Oncol . , 24 May 2010 (e-publicado) ) .
Muestras de referencia de plasma sanguíneo estuvieron disponibles de 396 pacientes en esta prueba.
Una investigación del status de biomarcadores relacionados con angiogénesis y tumorigénesis revelo que los niveles de expresión de tres biomarcadores en relación con niveles testigo determinados en toda la población de pacientes de biomarcádor se correlaciono con un parámetro de tratamiento mejorado. En particular, los pacientes que exhiben un nivel de expresión más alto de VEGFA en relación con niveles testigo determinados en toda la población de pacientes de biomarcádor, demostró una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de docetaxel . Los pacientes que exhiben un nivel de expresión más alto de VEGFR2 en relación con niveles testigo determinados en toda la población de pacientes de biomarcádor demostró una supervivencia libre de ' avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de docetaxel. También, los pacientes que exhiben nivel de expresión combinada más alto de VEGFA y VEGFR2 en relación con niveles de testigo determinados en toda la población de pacientes de biomarcádor, demostró una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de docetaxel . Además, los pacientes que exhiben nivel de expresión combinado más alto de VEGFA y PLGF en relación con niveles de testigo determinados en toda la población' de pacientes demostró una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de docetaxel.
Pacientes y métodos inmunoquimicos Un total de 736 pacientes participaron en el estudio BO17708 y muestras de plasma sanguíneo de 396 de los pacientes estuvieron disponibles para análisis de biomarcador. Las características de referencia de los 396 pacientes en el análisis de biomarcador en los pacientes restantes para los cuales ningún análisis de biomarcador fue posible son provistas en la Tabla 1A y Tabla IB.
Tabla 1A: Características de referencia Tabla IB: Características de referencia Análisis de plasma sanguíneo Muestras de plasma fueron recolectadas después de la aleatorización y antes de que cualquier tratamiento de estudio fuera administrado. Todas las muestras fueron obtenidas de pacientes que fueron después de esto tratados con docetaxel 100 mg/m2 mas ya sea bevacizumab 7.5 mg/kg cada 3 semanas, bevacizumab 15 mg/kg cada tres semanas o placebo hasta el avance de la enfermedad.
Un total de 4.9 mi de sangre fueron extraídos a un tubo S-monovette® (EDTA) (o un tubo de plasma citrado para los 16 pacientes con terapia de anticoagulante) . son mezclados inmediatamente después de esto mediante inversión suave del tubo y fueron centrifugados en el transcurso de 30 minutos a aproximadamente 1500 g en centrifuga (temperatura ambiente por 10 minutos) inmediatamente después de esto, el plasma del sobrenadante fue tomado en alícuotas en un tubo de > transferencia de 5 mi de polipropileno claro. Después de esto, se tomaron alícuotas del plasma en dos tubos de almacenamiento de plástico (aproximadamente 1.25 mi cada uno) . Las muestras fueron almacenadas en posición vertical a -70°C. En algunos casos, las muestras fueron almacenadas a - 20 °C por un hasta mes y luego transferidas a -70 °C.
Las muestras fueron usadas para medición de niveles de VEGFA, receptor 1 de VEGF (VEGFR1) , VEGFR2 , PLGF y E- SELECTINA utilizando un dispositivo Inmunological Multiparameter Chip Technology (IMPACT) de Roche Diagnostics GmbH.
Tecnología de análisis Multiplex IMPACT Roche Professional Diagnostics (Roche Diagnostics GmbH) ha desarrollado una plataforma de multimarcador bajo el nombre de trabajo IMPACT ( Immunological MultiParameter Chip Tecnology) . Esta tecnología fue usada para la medición de los marcadores de proteína mencionados anteriormente en la sección de "Análisis de plasma sanguíneo" . La tecnología está basada en un chip . de polietileno pequeño manufacturado mediante procedimientos como se revela en EP 0939319 y EP 1610129. La superficie, del chip fue recubierta con una capa de estreptavidina, sobre la cual los anticuerpos biotinilados fueron luego depositados para cada análisis. Para cada marcador, puntos de anticuerpos fueron cargados en una línea vertical sobre el chip. Durante el análisis, el arreglo fue sondeado con muestras de espécimen que contienen los analitos específicos .
El volumen de plasma requerido por espécimen para medir todos los marcadores en un chip fue de 8 µ?, que fue aplicado junto con 32 µ? de una solución reguladora del pH de incubación (HEPES 50 mM, pH 7.2, NaCl 150 mM, Thesit al 0.1%, albúmina de suero bovino al 0.5% y Oxypyrion al 0.1% como agente conservador) . Después de la incubación por 12 minutos y lavado del chip utilizando una solución reguladora del pH de lavado (Tris 5 mM, pH 7.9, Thesit al 0.01% y Oxypyrion al 0.001%) la mezcla de anticuerpo monoclonal dioxigenilada fue agregada (40 µ? de solución reguladora del pH de incubación que incluye una mezcla de los anticuerpos analito-específicos marcados con digoxigenina) y fue incubada por 6 minutos adicionales para enlazarse sobre los analitos capturados. El segundo anticuerpo fue finalmente detectado con 40 µ? de una solución reguladora del. pH de reactivo (TAPS 62.5 mM, pH 8.7, NaCl 1.25 M, albúmina de suero bovino al 0.5%, Tween 20 al 0.063% y- Oxypyrion al 0.1%) incluyendo un conjugado de anticuerpo anti-digoxigenina acoplado con látex fluorescente. Utilizando este marcador, 10 eventos de enlace individuales en un solo punto podrían ser detectados, dando como resultado una sensibilidad muy alta hasta la concentración de fmol/L. los chips fueron transportados a la unidad de detección y una cámara del dispositivo de carga-acoplada (CCD) genero una imagen que fue transformada a intensidades de señal utilizando elementos de programación especializados. Los puntos individuales fueron localizados automáticamente a posiciones predefinidas y cuantificados mediante análisis de imagen. Para cada marcador líneas de 10-12 puntos fueron cargadas sobre los chips y un mínimo de 5 puntos fue requerido para determinar la concentración media de muestras. Las ventajas de la tecnología son la habilidad de multiplexión de hasta 10 parámetros en un formato de emparedado o competitivo. Los calibradores y muestras de paciente fueron medidos por duplicado. Una corrida fue diseñada para contener un total de 100 determinaciones, incluyendo dos multitestigos como testigo de corrida. Puesto que algunos de los analitos seleccionados reaccionan entre sí (esto es VEGFA y PLGF con VEGFR1 o VEGR2 o VEGFA forma heterodímeros con PLGF) , los cinco analitos fueron divididos en tres chips diferentes como sigue: Chip 1: VEGFA Chip 2: VEGFR1, VEGFR2 , E-Selectina Chip 3: PLGF Los siguientes anticuerpos fueron usados para diferentes análisis: Análisis estadísticos La mediana de muestra fue usada para dicotomizar valores de biomarcador como bajos (por debajo de la mediana) o altos (en o por encima de la mediana) .
La proporción de peligro del efecto de tratamiento en el subgrupo de pacientes con altos o bajos niveles de biomarcador fueron estimados con análisis de regresión de cox de peligro proporcional.
Además, se usó regresión de cox de peligro proporcional para evaluar la asociación entre el nivel de biomarcador y el efecto de tratamiento. El modelo incluía los siguientes covariados: tratamiento de prueba, nivel de biomarcador, factores de estratificación binarios (status de ER/PgR, enfermedad medible en la referencia, antes de terapia de taxano adyuvantes) , termino de interacción de tratamiento por nivel de biomarcador. La prueba de Wald para el término de interacción fue usada para determinar la aceleración entre el nivel de biomarcador y el efecto de tratamiento. El valor P debajo de 0.05 fue considerado significativo.
Resultados Marcadores de plasma sanguíneo Estadísticas descriptivas de referencia de los biomarcadores son presentadas en la Tabla 2.
Tabla 2 : Estadísticas descriptivas de valores de biomarcador (referencia) La Tabla 3 presenta los resultados del análisis de la asociación de VEGFA o VEGFR2 con el efecto de tratamiento en la supervivencia libre de avance.
Tabla 3: En este análisis para VEGFA, bajo VEGFA VEGFA (<125 pg/ml) y alto VEGFA (= 125 pg/ml) y para VEGFR2 , bajo VEGFR2 (<11 ng/ml) y alto VEGFR2 (= 11 ng/ml) fueron usados.
Estos resultados muestran que la proporción de peligro para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFA en comparación con pacientes con bajo VEGFA. Estos resultados también muestran que la proporción de peligro para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFR2 en comparación con bajo VEGFR2.
La misma tendencia es observada cuando se comparan baja y alta dosis de bevacizumab con placebo, la evidencia estadística de diferencia entre el subgrupo de alto y bajo biomarcador es más fuerte en los pacientes tratados con baja dosis de bevacizumab. Por consiguiente VEGFA y VEGFR2 son cada uno biomarcadores predictivos independientes por el efecto de tratamiento de bevacizumab en la supervivencia libre de avance.
La Tabla 4 presenta el análisis de asociación de combinaciones de biomarcador con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance para baja dosis (7.5 mg/kg cada 3 semanas) de bevacizumab y para alta dosis (15 mg/kg cada 3 semanas) de bevacizumab.
Para este análisis: Formula 1 : norm (VEGFA) +1.3*norm (VEGFR2 ) Formula equivalente: 0.71*log2 (VEGFA) +3.16*log2 (VEGFR2) - 15.6 y Formula 2: 0.25*norm (VEGFA) +0.21*norm (PLGF) Formula equivalente: 0.18*log2 (VEGFA) +0.42*log2 (PLGF) - 3.1 Se usa la transformación log2 y log 2(xj) - median(\og 2(x)) x¡— > norm{x¡) mad(log 2(x)) En donde mad es la desviación absoluta mediana ajustada or un factor de 1.4826.
Tabla : Asociación con el e ecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance (análisis de bi-marcador) para baja dosis (7.5 mg/kg cada 3 semanas) de bevacizumab y para alta dosis (15 mg/kg cada 3 semanas de bevacizumab) Es este análisis, un alto nivel de expresión combinado de VEGFA y VEGFR2 es Formula 1 Formula 1 = 0.132 y un bajo nivel de expresión combinado de VEGFA y VEGFR2 es Formula 1 < 0.132 y un alto nivel de expresión combinado de VEGFA y PLGF es Formula 2 > 0.006 y un bajo nivel de expresión combinado de VEGFA y PLGF es Formula 2 < 0.006.
Estos resultados muestran que la proporción de peligro para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con una combinación con alto VEGFA y VEGFR2 en comparación con los pacientes con una combinación de bajo VEGFA y VEGFR2. Estos resultados también muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con la combinación de alto VEGFA y PGLF en comparación con pacientes con la combinación de bajo VEGFA y PLGF. La misma tendencia es observada cuando se compara baja y alta dosis de bevacizumab con placebo, la evidencia estadística de diferencia entre el subgrupo de biomarcador de alto y bajo es más fuerte en pacientes tratados con baja dosis de bevacizumab. Por consiguiente, la combinación de VEGFA y VEGFR2 y la combinación de VEGFA y PLGF son cada uno biomarcadores son predictivos independientes por el efecto de , tratamiento de bevacizumab sobre la supervivencia libre de avance .
El valor predictivo de VEGF-A en el brazo de bevacizumab de 15 mg/kg fue explorado adicionalmente al subdividir el cohorte en cuartiles de acuerdo con el nivel de VEGF-A. Los intervalos de confianza al 95% para todos los cuartiles se traslaparon. En el primer cuartil (< 64 pg/ml) , se observó un efecto de tratamiento muy limitado (proporción de peligro 0.86). En el cuartil más alto (>240 pg/ml), la proporción de peligro por PFS fue de 0.39 (95% CI : 0.19-0.77) y la diferencia en PFS mediana fue más pronunciada que en los otros grupos. En general, los valores estimativos puntuales de los cuartiles muestran una mejora consistente en la proporción de peligro con niveles de VEGF-A incrementados. Estos resultados son mostrados en la Tabla 5 a continuación.
Tabla 5 : PFS de acuerdo con el cuartil de VEGF-A Ejemplo 2: Detección de isoformas de VEGF-A utilizando el análisis de IMPACT Este ejemplo demuestra que, en base a los anticuerpos usados para detección de VEGF-A en la plataforma de IMPACT, las isoformas más cortas de VEGF-A son preferencialmente medidas en comparación las isoformas más largas de VEGF-A.
El análisis fue efectuado como se describe anteriormente bajo la sección concerniente con la tecnología de IMPACT utilizando los anticuerpos enlistados en la tabla antes de la sección "análisis estadístico" .
Cuatro formas de VEGF-A diferentes, esto es VEGFm, VEGF12i, VEGF165 y VEGF189 estuvieron disponibles y fueron usadas en el análisis. VEGFm, VEGF12i y VEGFi65 fueron comprados de R&D Systems, Minneapolis, Estados Unidos de América y VEGF189fue obtenido de RELIATech GmbH, Wolfenbüttel , Alemania. Como se muestra en la Figura 11, las isoformas más cortas que tienen 111 o 121 aminoácidos, respectivamente, son detectadas mejor en comparación con las isoformas más larga de VEGF con 165 y 189 aminoácidos, respectivamente. El producto de escisión de plasmina biológicamente interesante VEG110 no estuvo disponible para las pruebas en este punto en el tiempo, pero se tiene que esperar que la detección de esta isoforma será comparable con aquella que es observada para la molécula de VEGF con 111 aminoácidos.
Sin estar limitados a esta teoría, se supone que el enlace preferencial de las isoformas como VEGF110 y VEGF121, respectivamente, sin modificar de este análisis, podrían explicar por qué en los estudios descritos en la presente se observó un valor predictivo estadísticamente significativo, mientras que mediciones previas de VEGF-A han conducido a resultados en conflicto con respecto a eso.
Ejemplo 3: Detección de isoformas de VEGF cortas utilizando el analizador Elecsys® Este ejemplo describe experimentos que demuestran un análisis utilizando el analizador Elecsys® puede ser usado para detectar isoformas de VEGF cortas en plasma humano.
El análisis de VEGF-A fue transferido de IMPACT al sistema de diagnóstico in vitro automatizado Elecsys® (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) . El mismo anticuerpo de captura como el análisis de IMPACT, <hVEGF-A>-m3C5 (RELIATech GmbH, Wolfenbüttel) fue usado, mientras que el anticuerpo de captura <hVEGF-A>-m25603 (R&D Systems, Minneapolis) usado en el sistema IMPACT fue reemplazado por <hVEGF-A>-mA4.6.1 (Genentech, Sur de San Francisco) .
Los inmunoanálisis que ejecutan en el sistema Elecsys® automatizado son inmunoanálisis que utilizan electro quimioluminiscencia (ECLIA) como la tecnología que genera de señal. En el análisis de emparedado presente, el anticuerpo de captura biotinilado se enlaza a micro partículas magnéticas recubiertas con estreptavidina y el anticuerpo de detección rutinilado permite la generación de señal. 75 µ? de <VEGF-A>-m3C5 biotinilado a 1.5 g/ml y 75 µ? de <VEGF-A>M-A.4.6.1 rutinilado a 2 g/ml tanto en solución reguladora del pH de reacción (Tris 50 mM (pH 7.4), EDTA 2 mM, thesit al 0.1 %, IgG bovino al 0.2 %, albúmina de suero bovino al 1.0 %) fueron incubados por 9 minutos 20 µ? de muestra. 30 µ? de una suspensión de micro partículas fueron agregados después de los primeros 9 minutos de incubación y luego la mezcla entera incubada por nueve minutos adicionales . Durante estas etapas de . incubación, un emparedado del anticuerpo-monolito-anticuerpo es formado que es enlazado a las micro partículas. Finalmente, las micro' partículas fueron transferidas a la cámara de detección del sistema Elecsys para la generación y lectura de señal .
La preferencia del producto de escisión/isoforma en el análisis de VEGF-A de Elecsys® fue determinada utilizando proteínas recombinantes purificadas: VEGF110 (producido mediante escisión de plasmina en Genentech, Sur de San Francisco) , VEGF121 y VEGF165 (ambos suministrados por R & Systems, Minneapolis) . El enlace preferencial de isoformas ®que había sido observado con el análisis de IMPACT fue confirmado en el análisis de Elecsys. Como se muestra en la Figura 12,. en el análisis Elecsys®, las isoformas de VEGF 121 y el producto de escisión de plasmina VEGF 110, respectivamente, ambos fueron detectados con una sensibilidad aproximadamente 5 veces más alta que VEGF 165.
Ejemplo 4: Prueba aleatorizada fase III en cáncer gástrico avanzado localmente, metastático irresectable de primera linea de bevacizumab en combinación con quimioterapias Este ejemplo es concerniente con el análisis de resultados obtenidos de pacientes con cáncer gástrico metastático de primera línea tratado en la prueba clínica AVAGAST . El objetivo primario del estudio fue determinar el beneficio clínico de agregar bevacizumab a quimioterapia para tratamiento cáncer gástrico, tal como es medido mediante supervivencia global (OS) . Los puntos finales secundarios incluyeron supervivencia libre de avance (PFS) , velocidad de respuesta global y. duración de respuesta. La quimioterapia usada en esta prueba fue una combinación de capecitabina o 5-fluorouracilo (5-FU) y cisplatino.
Diseño de estudio 774 pacientes fueron reclutados en la prueba AVAGAST y fueron aleatorizados 1:1 a los siguientes dos brazos: Brazo A (387) : Capecitabina oral 1000 mg/m2 dos veces al día por 2 semanas seguido por una semana de reposo, cada tres semanas hasta el avance de enfermedad o toxicidad inmanejable o para pacientes que no se consideran apropiados para tomar capecitabina oral (debido por ejemplo, a dificultad para digerir, mala absorción . u otras condiciones que podrían afectar la ingestión de medicación de capecitabina oral) , 5-fluorouracilo puede ser administrado en lugar de esto a una dosis de 800 mg/m2/día como una infusión i.v. continua durante 5 días (días 1 a 5 de cada ciclo) cada 3· semanas.
Cisplatino 80 mg/m2 como una infusión i.v. de dos horas con hiperhidratación y pre-medicación (esteroides y anti-eméticos) , cada 3 semanas por un máximo de 6 ciclos, hasta el avance de enfermedad o toxicidad no manejable.
Brazo B (387) : Capecitabina oral 1000 mg/m2 dos veces al día por 2 semanas seguido por una semana de reposo, cada tres semanas hasta el avance de enfermedad o toxicidad no manejable o para pacientes que no considerados apropiados para tomar capecitabina oral (debido por ejemplo la dificultad para digerir, mala absorción u otras condiciones que podrían afectar la ingestión de medicación de capecitabina oral) , 5-fluorouracilo puede ser administrado en lugar de esto a una dosis de 800 mg/m2/día como una infusión i.v. continua durante 5 días (días 1 a 5 de cada ciclo) cada 3 semanas.
Cisplatino 80 mg/m2 como una infusión i.v. de dos horas con hiperhidratación y pre-medicación (esteroides y antieméticos) , cada 3 semanas hasta el avance de enfermedad o toxicidad no manejable por un máximo de 6 ciclos.
Bevacizumab (7.5 mg/kg) cada 3 semanas hasta el avance de enfermedad o toxicidad no manejable.
Los brazos del tratamiento fueron equilibrados en cuanto a variables de estratificación con la excepción de enfermedad avanzada (2% vs 5%) . Aproximadamente 95% de pacientes fueron metastáticos, dos tercios varones, 49% de Asia/Pacifico, 32% de Europa y 19% de las Américas.
Bevacizumab (AVASTIN®) fue suministrado como un líquido estéril claro a ligeramente opalescente preparado para administración parenteral en dos tamaños de frasco: cada 100 mg (25 mg/ml-4 mi llenos) de frasco de vidrio contenía bevacizumab con fosfato, trehalosa, polisorbate 20 y agua estéril para inyección, USP y cada 400 mg (25 mg/ml-16 mi llenos) de frasco de vidrio contenía bevacizumab con fosfato, trehalosa, polisorbate 20 y agua estéril para inyección, USP. AVASTIN® fue administrado al extraer la cantidad necesaria para una dosis de 5 mg/kg y diluida en volumen total de 100 mi de inyección de cloruro de sodio al 0.9%, USP antes de la administración intravenosa.
Métodos Los sujetos/pacientes elegibles tuvieron los siguientes criterios de elegibilidad clave: Edad > 18 años, ECOG 0, l o 2 (Escala de Status de Desempeño ECOG) . Todos los sujetos tuvieron adenocarcinoma histológicamente confirmado del estómago o unión gastro-esofagal con enfermedad inoperable, avanzada localmente o metastática, no propensa a terapia curativa. Los sujetos pueden tener ya sea enfermedad mensurable o no mensurable pero evaluable (según los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST) ) . Los sujetos que no reciben medicación anticoagulante tuvieron un INR menor o igual a 1.5 y un PTT menor o igual a 1.5 x ULN en el transcurso de 7 días antes de la aleatorización.
Los criterios de exclusión incluyeron los siguientes: quimioterapia previa por cáncer gástrico avanzado localmente o metastático (los pacientes pueden haber recibido quimioterapia de neo adyuvante o adyuvante previa o en tanto que fuera consumada por lo menos 6 meses antes de la aleatorización) ; terapia con platino o anti-angiogénica previa (esto es, anti-VEGF o inhibidor de cinasa de tirosina de VEGFR, etc.); pacientes con enfermedad avanzada localmente que fueron candidatos por terapia curativa (incluyendo operación y/o quimioterapia y/o radioterapia) ; radioterapia en el transcurso de 28 días de aleatorización; procedimiento quirúrgico mayor, biopsia abierta o lesión traumática significativa en el curso de 8 días antes de la aleatorización o anticipación de la necesidad de cirugía mayor durante el curso del tratamiento de estudio (cirugía electiva planeada) ; procedimientos quirúrgicos menores en el transcurso de dos días antes de la aleatorización; evidencia de metástasis de CNS en la línea de referencia; historia o evidencia en el examen físico/neurológico de enfermedad de CNS no relacionada con cáncer a no ser que sea tratada apropiadamente con terapia medica estándar, por ejemplo ataques incontrolados; función de medula ósea inapropiada, función de hígado o función renal inapropiada, hipertensión incontrolada o enfermedad cardiovascular clínicamente significativa (esto es, activa) ; infección activa que requiere antibióticos intravenosos en la aleatorización; historia o evidencia de diátesis de sangrado heredado o coagulopatía con el riesgo de sangrado; herida seria o herida que no cicatriza; ulcera péptica o fractura de hueso (cicatrizada incompletamente) ; sangrado gastrointestinal activo; historia de fístula abdominal, perforación gastro intestinal o absceso intra-abdominal en el transcurso de 6 meses de aleatorización; neuropatía (por ejemplo, deterioro de la audición y equilibrio) = grado II de acuerdo con CTCAE v 3.0; tratamiento diario crónico con aspirina o clopidogrel; tratamiento diario crónico con corticosteroides orales (esteroides inhalados y cursos cortos de esteroides orales por anti-emesis o como un estimulante del apetito fueron permitidos) ; deficiencia de dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD) conocida e infección activa aguda o crónica con HBV o HCV.
El punto final primario del estudio fue la supervivencia global (OS) definida como en tiempo desde la aleatorización hasta la muerte de cualquier causa. Los datos del tiempo al evento son comparados entre los brazos de tratamiento utilizando una prueba de logaritmo-rango estratificada. El método de Kaplan-Meier fue usado para estimar la duración de los datos al tiempo del evento. Los intervalos de confianza al 95% para el tiempo al evento mediano fueron calculados utilizando el método de Brookmeyer-Crowley . La HV para los datos del tiempo al evento fue estimada utilizando un modelo de regresión de cox estratificado.
Los puntos finales secundarios incluyeron supervivencia libre de avance (PFS) , velocidad de respuesta objetivo (RR) , duración de respuesta y seguridad. La supervivencia libre de avance (PFS) es definida como el tiempo desde la aleatorización al avance de enfermedad o muerte, en base a la determinación del investigador. La metodología de Kaplan-Meier fue usada para estimar la PFS mediana para cada brazo de tratamiento. En ciertas modalidades, la proporción de peligro por PFS fue estimada utilizando un modelo de regresión de cox estratificado con los mismos factores de estratificación usados en la prueba de logaritmo-rango estratificada. Los análisis de PFS en cada cohorte fueron efectuados al nivel de o¡ = 0.05 de dos lados. Los datos del tiempo al evento fueron comparados entre brazos de tratamiento utilizando una prueba de logaritmo-rango estratificada. El método de Kaplan-Meier fue usado para estimar la duración de los datos del tiempo al evento. Los intervalos de confianza de 95% para el tiempo al evento mediano fueron calculados utilizando el método de Brookmeier-Crowley. HR para los datos del tiempo al evento fue estimada utilizando un modelo de regresión de cox estratificado. RR es definida como el porcentaje de los pacientes que obtuvieron una respuesta completa o parcial confirmada = 28 días después de la documentación inicial de respuesta. La RR en pacientes • con enfermedad mensurable en la línea de referencia fue comparado utilizando la prueba ?2 de Mantel-Haenszel estratificada. Los factores de estratificación de aleatorización fueron incluidos en todos los análisis estratificados..
Muestras de plasma sanguíneo fueron recolectadas de pacientes que participan en un .estudio fase III aleatorizado que compara los resultados de agregar bevacizumab a la terapia de capecitabina/cisplatino para el tratamiento de adenocarcinoma gástrico/gastroesofagal avanzado localmente/metastático inoperable (el estudio BO20904, véase, Kang et al, J. Clin. Oncol . 2010; 28 (18S) : LBA4007) .
Una investigación del status de biomarcadores relacionados con angiogénesis y tumorigénesis revelo que los niveles de expresión de un biomarcador n el plasma en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador se correlaciono con un parámetro de tratamiento mejorado. En particular, los pacientes que exhiben un nivel de expresión más alto de VEGFA en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador demostró una supervivencia global prolongada y una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de capecitabina/cisplatino .
Pacientes , muestras y métodos inmunoquímicos Un total de 774 pacientes participaron en el estudio BO20904 y toma de muestra de plasma sanguíneo para análisis de VEGF-A en el plasma fue pre-especificado en el protocolo.
Todas las muestras fueron obtenidas de pacientes tratados con capecitabina/cisplatino más bevacizumab o placebo. Un total de 4.9 mi fueron recolectado en un tubo de recolección de sangre EDTA S-Monovette® de 4.9 mi.
En el transcurso de 30-60 minutos de la recolección de sangre, los tubos de sangre fueron colocados en la centrifuga y centrifugados a 1500 g a 4°C por 15 minutos, hasta que las células y plasma fueron separados. Inmediatamente después de la centrifugación, el plasma fue transferido cuidadosamente a un tubo de transferencia de propileno utilizando una pipeta de plástico, siendo cuidadosos de no aspirar la interface que contiene las plaquetas en el fondo del tubo. Luego se tomaron alícuotas del plasma igualmente en dos tubos de almacenamiento (mitad de volumen cada aproximadamente 1.25 mi) utilizando una pipeta.
Una vez que el plasma estaba separado, las muestras fueron almacenados en posición vertical a -70°C. Las muestras que podrían solo ser almacenadas a -20 °C fueron embarcadas a la Oficina de Muestras central de Roche (CSO) en el transcurso de un mes después de la extracción de sangre.
Todas las muestras fueron analizadas en el Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Alemania.
Todas las muestras fueron desheladas y distribuidas en alícuotas de 40 µ? a placas de micro tubos REMP de 384 cavidades en lotes de 72. Los tubos fueron sellados con un septum de aluminio y almacenados en congeladores ajustados para mantener la temperatura de -85 a -55°C hasta el análisis. Las muestras fueron analizadas en cuanto a concentraciones' de VEGFA.
Muestras de plasma de 712 de los participantes estuvieron disponibles para análisis de biomarcador. Las características de referencia de los 712 ( pacientes en el análisis de biomarcador son provistas en la Tabla 6.
Tabla 6: Características de referencia: población de biomarcador (n = 712) N = 357 = 35S Sexo HOMBRE 239 ( 67%) 238 ( 67%) MUJER 118 ( 33%) 117 ( 33%) n 357 355 Etnicidad CAUCASICO 142 ( 40%) 144 ( 41%) NEGRO 8 ( 2%) 5 ( 1%) ORIENTAL 188 ( 53%) 184 ( 52%) OTRO 19 ( 5%) 22 ( 6%) n 357 355 Edad (años) Media 57.6 56.5 SD 11.29 11.50 SEM 0.60 0.61 Mediana 59.0 58.0 Min-Max 22 - 82 22 - 81 n 357 355 Media 60.75 62.46 SD 13.328 13.805 SEM 0.706 0.734 Mediana 59.00 60.90 Min-Max 36.0 - 145.4 35.7 - 149.5 n 356 354 Altura en cm Media 164.5 165.3 SD 9.32 8.79 SEM 0.49 0.47 Mediana 164.0 165.0 Min-Max 138 - 192 140 - 188 n 356 354 Categoría de edad <65 ; >=65 <65 253 ( 71%) 256 ( 72%) >=65 104 ( 29%) 99 ( 28%) n 357 355 Categoría de edad <40 40-65 >=65 n Categoría ECOG en la referencia 0 157 ( 44%) 164 ( 46%) >=1 200 ( 56%) 191 ( 54%) n 357 355 n representa el número de pacientes que contribuyen al resumen estadísticas .
Los porcentajes están basadas en n (número de valores valido) .
Los porcentajes no calculados sí < 10.
Análisis de plasma sanguíneo Muestras de plasma fueron recolectadas después de la aleatorización y antes de que cualquier tratamiento de estudio fuera dado a los pacientes . VEGFA, fu medido utilizando el análisis de ELISA IMPACT multiplex descrito en el ejemplo 1.
Análisis estadístico La mediana de la muestra fue usada para dicotomizar los valores de biomarcador como bajos (por debajo de la mediana) o altos (por encima de la mediana) .
La proporción de peligro del efecto de tratamiento en el sub-grupo de pacientes con altos o bajos niveles de biomarcador fue estimada con análisis de regresión de cox de peligro proporcional.
Además, se usó regresión de cox de peligro proporcional para evaluar la asociación entre el nivel del biomarcador y el efecto de tratamiento. El modelo incluía los siguientes co-variados: tratamiento de prueba, nivel de biomarcador, termino de interacción de tratamiento por nivel de biomarcador. La prueba de Wald para el término de interacción fue usada para determinar la asociación entre el nivel de biomarcador y el efecto del tratamiento. El valor de p por debajo de 0.05 fue considerado significativo.
Los valores reportados como debajo del limite de cuantificación (BLQ) o por encima de límite de cuantificación (ALQ) fueron introducidos en el límite inferior de los valores de cuantificación (LLQ) y el límite superior de cuantificación (ULQ) . Se usó una transformación logarítmica de los niveles de concentración en el análisis. Si un corte fue necesario para el análisis, se usó la mediana de la muestra.
Resultados Marcadores de plasma sanguíneo Las estadísticas descriptivas de referencia de los biomarcadores son presentadas en la Tabla 7.
Tabla 1 : Estadísticas descriptivas de valores de biomarcador (Referencia) La Tabla 8 presenta . el análisis univariado de la asociación de los biomarcadores seleccionados con el efecto del tratamiento sobre la supervivencia global .
Tabla 8 : Asociación con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia global- (análisis univariado) En este análisis, para VEGFA, se usó bajo VEGFA = 111 pg/ml y altó VEGFA > 111 pg/ml .
Para VEGFA, el nivel de corte fue determinado como el valor de la mediana de datos de muestra, de tal manera que el 50% de pacientes tienen alta expresión y el 50% de pacientes tienen baja expresión, según el plan de análisis predeterminado .
Los resultados de esta tabla muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFA en comparación con pacientes con bajo VEGFA. Por consiguiente, VEGFA es un biomarcador predictivo independiente para el efecto de tratamiento con Bevacizumab con respecto la supervivencia global.
La Tabla 9 presenta el análisis univariado de la asociación de los biomarcadores seleccionados con efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance Tabla 9: Asociación con efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance (Análisis univariado) En este análisis, para VEGFA, se usó bajo VEGFA = lllpg/ml y alto VEGFA > 111 pg/ml .
Para VEGFA, el nivel de corte fue determinado como' el valor mediano de datos de muestra, de tal manera que el 50% de pacientes tienen alta expresión y el 50% de pacientes tienen baja expresión, según el plan de análisis predeterminado .
Los resultados de esta tabla muestran que la proporción de peligro para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFA en comparación con pacientes con bajo VEGFA. Por consiguiente, VEGFA es un biomarcador predictivo independiente para el efecto de tratamiento con Bevacizumab sobre la supervivencia libre de avance.
Ejemplo 5: Prueba aleatorizada fase III en cáncer pancreático metastático de bevacizumab en combinación con quimioterapia Pacientes con adenocarcinoma pancreático metastático fueron aleatorizados a gemcitabina-erlotinib mas bevacizumab (n = 306) o placebo (n = 301) .
Muestras de plasma sanguíneo fueron recolectadas de pacientes que participan en un estudio fase III aleatorizado que compara los resultados de agregar bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib para el tratamiento de cáncer pancreático metastático (el estudio BO17706, véase, Van Cutsem, J. Clin. Oncol . 2009 27:2231-2237). Pacientes con adenocarcinoma pancreático metastático fueron aleatorizados a gemcitabina-erlotinib mas bevacizumab (n = 306) o placebo (n n = 301) . Los pacientes con adenocarcinoma pancreático metastático fueron asignados aleatoriamente para recibir gemcitabina (1000 mg/m2/semana) , erlotinib (100 mg/día) y bevacizumab (5 mg/kg cada 2 semanas) o gemcitabina, erlotinib y placebo .
Una investigación del status de biomarcadores relacionados con angiogénesis y tumorigénesis revelo que los niveles de expresión de tres biomarcadores en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador se correlacionaba con un parámetro de tratamiento mejorado. En particular, los pacientes que exhiben un nivel de expresión más alto de VEGFA en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador, demostró una supervivencia global mejorada y una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib . Los pacientes que exhiben un nivel de expresión más alto de VEGFR2 en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador demostró una supervivencia global prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib. Los pacientes que exhiben un nivel de expresión más alto de PLGF en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador, demostraron una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib. También pacientes que exhiben nivel de expresión combinado más alto de VEGFA y VEGFR2 en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador, demostraron una supervivencia global prolongada y una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a terapia de gemcitabina-erlotinib. Además, los pacientes que exhiben nivel de expresión combinado más alto de VEGFA y PLGF en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes, demostraron una supervivencia global prolongada y una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib. Los pacientes que exhiben un nivel de expresión combinado más alto de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes, demostraron una supervivencia global prolongada y una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib.
Pacientes y métodos inmunoquimicos Un total de 607 pacientes participaron en el estudio B017706 y muestras de plasma sanguíneo de 224 de los participantes estuvieron disponibles para el análisis de biomarcador. Las características de referencia de los 224 pacientes en el análisis de biomarcador son provistas en la Tabla 10.
Tabla 10: Características de referencia: población de biomarcador (n = 224) VAS: Escala análoga visual del dolor KPS : Puntuación de desempeño de Karnosfky Análisis de plasma sanguíneo Muestras de plasma fueron recolectadas después de la aleatorización y antes de que cualquier tratamiento de estudio fuera dado a los pacientes y VEGFA, receptor 1 de factor del crecimiento endotelial vascular (VEGFR1) , VEGFR2, PLGF y E-SELECTIN fueron medidos utilizando el análisis IMPACT descrito en el Ejemplo 1 anterior.
Análisis estadístico La mediana de muestra fue usada para dicotomizar valores de biomarcador como bajos (por debajo de la mediana) o altos (encima de la mediana) .
La proporción de peligro del efecto de tratamiento en el sub-grupo de pacientes con altos o bajos niveles de biomarcador fue estimada con análisis de regresión de cox de peligro proporcional.
Además, se usaron cox de regresiones de peligro proporcional para evaluar la asociación entre el nivel del biomarcador y el efecto de tratamiento. El modelo incluía los siguientes co-variados: tratamiento de prueba, nivel de biomarcador, termino de interacción de tratamiento por nivel de biomarcador. Se usó la prueba de Wald para el término de interacción fue usada para determinar la asociación entre el nivel de biomarcador y el efecto del tratamiento. El valor de p menor de 0.05 fue considerado signif cativo.
Resultados Marcadores de plasma sanguíneo Las estadísticas descriptivas de referencia de los biomarcadores son presentadas en la Tabla 11.
Tabla 11: Estadísticas descriptivas de valores de biomarcador (Referencia) La Tabla 12 presenta el análisis univariado de la asociación de. los biomarcadores seleccionados con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia global.
Tabla 12 : Asociación con el efecto de tratamiento sobre supervivencia global- (análisis univariado) En este análisis para VEGFA, se usaron bajo VEGFA <152.9 pg/ml y alto VEGFA = 152.9 pg/ml, para VEGFR2 , bajo VEGFR2 < 9.9 ng/ml y alto VEGFRA > 9.9 ng/ml y para PLGF, bajo PLGF < 36.5 pg/ml y alto PLGF > 36.5 pg/ml.
Para VEGFA y VEGFR2, los niveles de corte fueron determinados como él valor de mediana de los datos de muestra, de tal manera que el 50% de pacientes tienen alta expresión y el 50% de pacientes tienen baja expresión, según el plan de análisis predeterminado. Los niveles de corte de PLGF fueron determinados como 24th percentil de los datos. Así, el 58% de pacientes tienen alta expresión de PLGF y 42% tienen baja expresión. El corte fue determinado con el fin de incrementar la diferencia estadística entre el efecto de tratamiento y el subgrupo de alto y bajo nivel.
Los resultados de esta tabla muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFA en comparación con pacientes con bajo VEGFA. Los resultados de esta tabla también muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente el mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFR2 en comparación con pacientes con bajo VEGFR2. Por consiguiente, VEGFA y VEGFR2 son cada uno biomarcados predictivos independientes para el efecto de tratamiento con bevacizumab sobre la supervivencia global .
La Tabla 13 presenta el análisis univariado de la asociación de los biomarcadores seleccionados con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance.
Tabla 13 : Asociación con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance (análisis univariado) En este análisis para VEGFA, se usaron bajo VEGFA < 152.9 pg/ml y alto VEGFA = 152.9 pg/ml, para VEGFR2 , bajo VEGFR2 < 9.9 ng/ml y alto VEGFRA = 9.9 ng/ml y para. PLGF, bajo PLGF < 36.5 pg/ml y alto PLGF = 36.5pg/m. Para VEGFA y VEGFR2, los niveles de corte fueron determinados como el valor de mediana de los datos de muestra, de tal manera que el 50% de pacientes tienen alta expresión y el 50% de pacientes tienen baja expresión, según el plan de análisis predeterminado. Los niveles de corte de PLGF fueron determinados como 42th percentil de los datos. Así, el 58% de pacientes tienen alta expresión de PLGF y 42% tienen baja expresión. El corte fue determinado con el fin de incrementar la diferencia estadística entre el efecto de tratamiento en el subgrupo de nivel alto y bajo.
Los resultados de esta tabla muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFA en comparación con pacientes con bajo VEGFA. Los resultados de esta tabla también muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto PLGF en comparación con pacientes con bajo PLGF. Por consiguiente, VEGFA y PLGF son cada uno biomarcadores predictivos independientes para el efecto de tratamiento con bevacizumab sobre la supervivencia libre de avance.
La Tabla 14 presenta el análisis de la asociación de combinaciones de biomarcador con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia global .
Para este análisis, las siguientes ecuaciones fueron usadas : Formula 1: norm (VEGFA) +1.3*norm (VEGFR2 ) . Punto de corte= mediana o 0 Formula equivalente: VEGFA+3.3 *VEGFR2. Punto de corte= mediana o 0 Y Formula 2: 0.25*norm (VEGFA) +0.21*norm (PLGF) , Punto de corte= mediana o 0 Formula equivalente: 0.19*VEGFA+0.67*PLGF, Punto de corte= mediana o 4.8 Se usó la transformación logaritmo 2 y , . log 2(x,.) - 772eí/ a«(lo 2( )) x¡—> norma) -—2 mad (log2(x)) Tabla 14: Asociación con efecto de tratamiento sobre la supervivencia global (análisis de bi-marcador) En este análisis, un nivel alto de expresión combinado de VEGFA y VEGFR2 es (Formula 1 = 0.10) y una baja expresión de VEGFA y VEGFR2 combinados es (Formula 1 < 0.10), y un alto nivel de expresión combinado de VEGFA y PLGF es (Formula 2 = 0.042) y una baja expresión combinada VEGFA y PLGF es (Formula 2 < 0.042) .
Los resultados de esta tabla muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con la combinación de alto VEFGA y VEGFR2 en comparación con pacientes con la combinación bajo VEGFA y VEGFR2. Los resultados de esta tabla también muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con la combinación de alto VEGFA y PLGF en comparación con pacientes con la combinación de bajo VEGFA y PLGF. Por consiguiente, la combinación de VEGFA y VEGFR2 y la combinación de VEGFA y PLGF son cada una biomarcadores predictivos independientes por el efecto de tratamiento de bevacizumab sobre la supervivencia global.
La Tabla 15 presenta el análisis de la asociación de combinaciones de biomarcadór con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance.
Para este análisis se usaron las siguientes ecuaciones: Formula 1: norm (VEGFA) +1.3*norm (VEGFR2 ) . Punto de corte= mediana o 0 Formula equivalente: VEGFA+3.3*VEGFR2. Punto de corte= mediana o 0 Formula 2: 0.25*norm (VEGFA) +0.21*norm (PLGF) , Punto de corte=mediana o 0 Formula equivalente: 0.19*VEGFA+0.67*PLGF , Punto de corte= mediana o 4.8 Se usa la transformación del algoritmo 2 y log 2(x , ) - median (log 2(x)) x,— > norm (x, ) = mad (log 2(x)) Tabla 15 : Asociación con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance (análisis de bi-marcador) En este análisis, un alto nivel de expresión combinado de VEGFA y VEGFR2 es (Formula 1 = -0.10) y una baja expresión combinada de VEGFA y VEGFR2 es (Formula 1 < -0.10), y un alto nivel de expresión combinado VEGFA y PLGF es (Formula 2 = 0.042) y una expresión combinada baja de VEGFA y PLGF es (Formula 2 < -0.042) .
Los resultados de esta tabla muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con la combinación de alto VEFGA y VEGFR2 en comparación con pacientes con la combinación de bajo VEGFA y VEGFR2. Los resultados de esta tabla también muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con la combinación de alto VEGFA y PLGF en comparación con pacientes con la combinación de bajo VEGFA y PLGF. Por consiguiente, la combinación de VEGFA y VEGFR2 y la combinación de VEGFA y PLGF son cada uno biomarcadores predictivos independientes por el efecto de tratamiento de bevacizumab sobre la supervivencia libre de avance .
Las Tablas 16 y 17 presentan el análisis de combinaciones de biomarcador de VEGFA, VEGFR2 y asociación de PLGF con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia global y supervivencia libre de avance, respectivamente.
En este análisis, se usó la siguiente ecuación: Formula 3: 0.0127 * ln (PLGF+1) + 0.144 * ln (VEGFR2+1) + 0.0949 * ln (VEGFA + 1) En donde lñ = logaritmo base e Tabl 16: Asociación con efecto de tratamiento sobre supervivencia global (análisis de tri-marcador) En este análisis, para la supervivencia global, un alto nivel de expresión combinado de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (Formula 3 = 0.837) y una baja expresión combinada.de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (Formula 3 < 0.837) y para supervivencia libre de avance, un alto nivel de expresión combinado de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (Formula 3 = 0.837) y una baja expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (Formula 3 < 0.837) .
Los resultados de esta tabla muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con la combinación de alto VEFGA y VEGFR2 en comparación con pacientes con la combinación de bajo VEGFA y VEGFR2 y PLGF. Por consiguiente, la combinación de VEGFA y VEGFR2 y la combinación y PLGF son cada una biomarcadorés predictivos independientes por el efecto de tratamiento de bevacizumab sobre la supervivencia libre de avance.
Los resultados de esta tabla también muestran que para la supervivencia global, la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con la combinación de alto VEGFA y VEGFR2 y PLGF en comparación con pacientes con la combinación de bajo VEGFA, VEGFR2 y PLGF. Por consiguiente, la combinación de VEGFA y VEGFR2 y PLGF es un biomarcador predictivo para el efecto de tratamiento de bevacizumab sobre la supervivencia global.
Ejemplo 6 : Análisis de muestras de plasma adicionales en cuanto a VEGFA Muestras de referencia del AVF107g (una prueba química controlada activa aleatorizada multicentro, fase III para evaluar la eficacia y seguridad de rhumab (bevacizumab) en combinación con quimioterapia estándar en sujetos con cáncer colorectal metastático) , AVAiL (un estudio fase III de multicentro doble ciego aleatorizado de bevacizumab en combinación con cisplatino y gemcitabina versus placebo, cisplatino y gemcitabina en pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña no escamosa avanzado o recurrente que no han recibido quimioterapia previa) y AVOREN (un estudio fase III doble ciego aleatorizado para evaluar la eficacia y seguridad de bevacizumab en combinación con interferón alfa-2a (roferon) versus interferón alfa-2a y placebo como tratamiento de primero línea administrado a pacientes nefrectomizados con carcinoma de célula renal de célula clara metastática) fueron también analizados con el análisis IMPACT descrito en el Ejemplo 1.
En el estudio AVF2107g, 380 muestras (47%) estuvieron disponibles para las re-pruebas. Los nuevos datos de VEGF-A confirmaron un valor de prognóstico para VEGF-A pero no mostraron un valor predictivo potencial. Pacientes con cáncer colorectal metastático con altos niveles de VEGF-A, tal como son medidos por el análisis de ELISA de IMPACT, tuvieron proporciones de peligro similares para PFS (0.52 para VEGF-A alto versus 0.64 para VEGF-A bajo) y OS (0.68 para VEGFA alto vs. 0.70 para VEGF-A bajo) .
Un valor de prognóstico similar fue observado en los resultados de los re-pruebas de las 852 muestras de AVAIL (52%) . Sin embargo, los pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña con altos niveles de VEGF-A también mostraron una proporción de peligro similar en comparación con pacientes con bajos niveles de VEGF-A en el grupo de 7.5 mg/kg (0.75 versus 0.77, respectivamente para PFS y 0.89 versus 0.92 para OS). El grupo de dosis de 15 mg/kg también mostró proporciones de peligro similares para pacientes con altos niveles de VEGF-A (0.76 para PFS y 0.98 para OS) en comparación con pacientes con bajos niveles (0.96 para PFS 0.97 para OS) .
También, en la prueba de AVOREN, la re-prueba de 400 muestras de plasma de referencia (62%) no revelaron un valor predictivo potencial para VEGF-A en pacientes con carcinoma de célula renal, aunque se observó el valor de prognóstico del biomarcador. Pacientes con altos niveles de VEGF-A mostraron una proporción de peligro de 0.67 para PFS en comparación, con 0.49 para, pacientes con bajos niveles de VEGF-A.
La correlación del biomarcador de VEGF-A con resultados clínicos de los seis diferentes estudios de Avastin son presentados en la Tabla 18.
Tabla 18 Correlación del biomarcador de VEGF-A con el resultado clínico de estudios de bevacizumab Tabla 18 (cont) Correlación del biomarcador de VEGF-A con el resultado clínico de estudios de bevacizumab Bev = bevacizumab; Quimio = quimioterapia; MBC = cáncer de pecho metastático; mCRC = cáncer colorectal metastático; PFS = supervivencia libre de avance; mRCC = carcinoma de célula renal metastático; VEGF-A = Factor A de crecimiento endotelial vascular Todos los tres estudios confirmaron el valor de pronóstico de VEGF-A en el plasma, como se muestra previamente con los análisis de VEGF-A previos. Sin embargo, el valor predictivo potencial como es mostrado en AVADO, AVITA y AVAGAST no podría ser confirmado en las pruebas adicionales en tres indicaciones diferentes. Se debe notar que las muestras recolectadas en las pruebas de AVF2107G, AVAil y AVOREN fueron manipuladas un tanto diferentemente en comparación con las muestras recolectadas en AVADO, AVITA y AVAGAST (esto es, citrato versus EDTA, mas ciclos de congelación/deshielo en 12%-16% de las muestras, tiempo de almacenamiento más largo) . Como se muestra en el Ejemplo 7 a continuación, la recolección de plasmas en citrato o EDTA puede afectar la sensibilidad de los análisis de VEGF-A. Las diferencias exactas entre las muestras son mostradas en la Tabla 19 a continuación.
Tabla 19: Condiciones de almacenamiento de las muestras Por consiguiente, la carencia de valores predictivos en estos tres estudios no niega la posibilidad de que VEGF-A puede actuar como marcador predictivo en MBC. Tampoco se puede descartar que el hallazgo ese especifico de indicación. Las diferencias entre los dos análisis han revelado una diferencia en sensibilidad del análisis de segunda generación para isoformas de VEGF más cortas. Sin estar limitados por la teoría, puede haber un efecto biológico diferente y abundancia de diferentes isoformas diferentes . indicaciones . Por ejemplo, VEGF12i ha mostrado una inducción más fuerte de tumorig'enesis que las otras isoformas comúnmente expresadas 165 y 169 en modelos de xenoinjertos transfectados . (Zhang, H.T. et al., Brit. J. Cáncer 83 (2000) 63-68). La isoforma de 121 amino ácidos del factor de crecimiento vascular endotelial es más fuertemente tumorigénica que otras variantes de empalme in vivo (Zhang, H.T. et al., Brit. J. Cáncer 83 (2000) 63-68) . Esto es particularmente significativo en vista del hecho de que la isoforma 121 ha mostrado ser la isoforma predominante en carcinoma de pecho primarios (Relf, M. et al., Cáncer Res. 57 (1997) 963-969).
En resumen, el análisis de IMPACT ha mostrado un valor de prognóstico consistente para VEGF-A en el plasma para las indicaciones probadas. Además, esta prueba genero resultados consistentes en AVADO, AVI A y AVAGAST, demostrando un valor predictivo para bevacizumab en estas indicaciones, mientras que las re-pruebas de las muestras de plasma en las pruebas AVF2107g, AVAiL y AVOREN no mostraron tal correlación, sugiriendo ningún valor predictivo potencial de la expresión de VEGF-A en el plasma en estas tres otras indicaciones. Sin embargo, se debe notar que las diferencias en las muestras podría haber afectado estas diferencias en los resultados; una de tales diferencias es demostrada en el Ejemplo 7 a continuación. Sin estar limitados por la teoría, puede también haber un efecto biológico diferente y la abundancia de diferentes en diferentes indicaciones, dado que el análisis de IMPACT favorece la detección las isoformas cortas de VEGF110 y VEGF12i.
Ejemplo 7 : Detección de VEGF cortas en plasma recolectado en citrato de Na y EDTA Muestras de plasma apareadas fueron recolectadas de pacientes con cáncer de pecho localmente recurrente o metastático HER2+ tanto en el tubo de recolección de Monovette de EDTA (5 mi) y citrato (5 mi) . En el transcurso de 30 minutos de recolección de sangre, los tubos de sangre fueron colocados en la centrifuga y centrifugados a 1500 g a temperatura ambiente por 10 minutos hasta que las células y el plasma fueron separados . Inmediatamente después de la centrifugación, el plasma fue transferido cuidadosamente a un tubo de transferencia de polipropileno y luego se tomaron alícuotas igualmente a dos tubos de almacenamiento (la mitad del volumen cada uno de aproximadamente 1.25 mi) utilizando una pipeta. Los niveles de VEGF- en las muestras fueron medidos utilizando el análisis de IMPACT descrito anteriormente. Como se muestra en la Figura 21, la concentración de VEGFA es alrededor de 40% más alta para muestras de plasma recolectadas y almacenadas en EDTA en comparación con muestras de plasma recolectadas y almacenadas en citrato con una correlación de Spearman para el MC de EDTA-citrato de alrededor de 0.8 para muestras de referencia recolectadas antes del tratamiento.
Aunque la invención ha sido descrita en algún detalle como ilustración y ejemplo por propósitos de claridad y entendimiento, la descripción y ejemplos no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la invención. Las revelaciones de todas las patentes, solicitudes de patentes, referencias científicas y números de acceso de Genbank citados en la presente son incorporados expresamente por referencia en su totalidad para todos los propósitos como si cada patente, solicitud de patente, referencia científica y acceso de Genbank fuera incorporada especifica e individualmente por referencia.

Claims (33)

REIVINDICACIONES
1. Un método para identificar un paciente que se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista ¦ de VEGF, el método está caracterizado porque comprende : determinar el nivel de expresión de VEGF12i y VEGF110 en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF12i y VEGFno en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con la terapia anti-cáncer.
2. Un método para predecir la responsividad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, el método está caracterizado porque comprende: determinar el nivel de expresión de VEGF12i y VEGFn0en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF121 y VEGFno en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente es más probable de ser responsivo al tratamiento con la terapia anti-cáncer.
3. Un método para determinar la probabilidad de que un paciente con cáncer exhibirá beneficio de la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, el método está caracterizado porque comprende: determinar el nivel de expresión de VEGF121 y VEGF110 en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF121 y VEGF110 en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer.
4. Un método para optimizar la eficacia terapéutica de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, el método está caracterizado porque comprende: determinar el nivel de expresión de VEGF12i y VEGF110en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF12i y VEGF110 en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer .
5. Un método para tratamiento de cáncer en un paciente, el método está caracterizado porque comprende: determinar que una muestra obtenida del paciente tiene un nivel de VEGF121 y VEGFn0 en o por encima del nivel de VEGF12i y VEGF110 en una muestra de referencia administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente, mediante lo cual el cáncer es tratado.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de pecho, cáncer pancreático, cáncer gástrico y cáncer de pulmón.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el nivel de VEGF121 y VEGF110 es un nivel de proteína.
9. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque el nivel de proteína es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma.
10. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque el nivel en el plasma de VEGF12i y VEGFn0 en la muestra obtenida del paciente que está en o por encima del nivel de VEGF121 y VEGF110 en una muestra de referencia indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 , caracterizado porque comprende además administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente.
12. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo.
13. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo es bevacizumab.
14. El método de la reivindicación 11, caracterizado 5 porque comprende además administrár una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. 10
15. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente.
16. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de 15 VEGF-A son administrados secuencialmente .
17. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la tercera terapia comprende además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionado del grupo que consiste de: un agente citotóxico, 20 un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos .
18. El método de la reivindicación 17, caracterizado porgue la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia , 25 anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente .
19. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la tercera terapia anti-cáncer, segunda terapia anticáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente
20. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo.
21. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo es bevacizumab .
22. El método de la reivindicación 5, caracterizado porque la terapia anti-cáncer comprende además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos.
23. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente.
24. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente
25. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la terapia anti-cáncer comprende además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos.
26. El método de la reivindicación 25, caracterizado porque la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente .
27. El método de la reivindicación 25, caracterizado porque la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente
28. un kit para determinar si un paciente se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, el kit está caracterizado porque comprende : un conjunto de compuestos aptos de enlazarse específicamente a· VEGF sin modificar y instrucciones para usar dichos compuestos para determinar el nivel de por lo menos un biomarcador para predecir la responsividad de un paciente al tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, en donde el nivel de VEGF12i y VEGFi10 en o por encima del nivel de VEGF121 y VEGFno en una muestra de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-c ncer que comprende un antagonista de VEGF-A.
29. El kit de la reivindicación 28, caracterizado porque los compuestos son proteínas.
30. El kit de la reivindicación 29, caracterizado porque las proteínas son anticuerpos.
31. Un conjunto de compuestos para detectar niveles de por lo menos un biomarcador, el conjunto está caracterizado porque comprende : por lo menos un compuesto apto de enlazarse específicamente a un biomarcador seleccionado del grupo que consiste de VEGF121 y VEGFn0.
32. El conjunto de compuesto de la reivindicación 31, caracterizado porque los compuestos son proteínas.
33. El conjunto de compuesto de la reivindicación 32, caracterizado porque las proteínas son anticuerpos.
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