JP2015180879A - 抗癌治療への応答可能性の増大した患者を同定する方法 - Google Patents

抗癌治療への応答可能性の増大した患者を同定する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ＶＥＧＦアンタゴニストを含む抗癌治療法による治療から利益を得る可能性のある患者を同定するための方法、及び抗癌治療法に対する患者の応答をモニタリングするための方法を提供する。【解決手段】患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の発現レベルを決定することを含み、患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルが基準レベルかそれを上回ることが、患者が抗癌治療法による治療から利益を得る可能性があることを示す方法。【選択図】図１２

Description

関連出願
本出願は、２０１０年７月１９日に出願されたＥＰ１０１７０００４．５及びＥＰ１０１７０００８．６、及び、２０１０年１１月１７日に出願された米国仮出願第６１／４１４８５３号；第６１／４１４８５９号；及び第６１／４１４８６１号に関連し、その各の開示は、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。
発明の分野
本発明は、どの患者が最も抗癌剤による治療の利益を受けるかを特定し、かつ、それらの感受性及び抗癌剤による治療に対する応答性を監視するための方法に関する。
発明の背景
癌は、ヒトの健康に最も致命的な脅威の一つである。米国のみに於いて、癌は毎年約１３０万人の新規患者に影響を及ぼし、心臓病に続く死亡原因の第２位であり、死者４人に約１人を占める。固形腫瘍はこれらの死亡のほとんどに関与している。特定の癌の治療に大きな進歩があったものの、全ての癌の全体的な５年生存率は過去２０年間でほんの約１０％向上したにすぎない。癌、又は悪性腫瘍は、転移し、制御不能な様態で急速に増殖し、時宜を得た検出と治療を非常に困難にしている。
癌の種類に応じて、患者は一般的に、化学療法、放射線療法及び抗体ベースの薬を含め、彼らに利用可能な幾つかの治療の選択肢を持っている。異なる治療法から臨床転帰を予測するための有用な診断方法が、これらの患者の臨床管理の大きな利益となるであろう。
従って、どの患者がどの治療に応答するかを決定し、その決定を、単剤であろうが他の薬剤と併用されようが、抗癌治療によるより効果的な患者の治療レジメンに組み込むためのより効果的な手段が必要である。
発明の概要
本発明は、抗癌剤、例えばＶＥＧＦ Ａアンタゴニスト、例えばベバシズマブによる治療に応答する患者を同定するための方法を提供する。
本発明の一実施態様は、ＶＥＧＦアンタゴニストを含む抗癌治療による治療の利益を受ける可能性がある患者を同定する方法を提供し、該方法は、患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の発現レベルを決定することを含み、患者から得たサンプル中において（例えば基準サンプルと比較した場合）基準レベルか又はそれを上回るレベルでのＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルは、患者が抗癌治療による治療の利益を受ける可能性があることを示す。幾つかの実施態様において、癌は、結腸直腸癌、神経膠芽腫、腎癌、卵巣癌、乳癌（例えば、局所進行、再発または転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌を含む）、膵臓癌（例えば、転移性膵臓癌を含む）、胃癌、肺癌からなる群から選択される。幾つかの実施態様にて、患者から得られたサンプルは、全血、血漿、血清、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されたメンバーである。幾つかの実施態様にて、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルはタンパク質のレベルである。幾つかの実施態様にて、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のタンパク質レベルは、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の血漿タンパク質レベルを測定することによって決定される。幾つかの実施態様にて、基準レベルかまたはそれ以上であるＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の血漿レベルは、患者が抗癌治療により利益を受ける可能性があり、抗癌治療法により応答する可能性がより高いか、又は抗癌治療法の利益を受ける可能性が増加していることを示す。幾つかの実施態様にて、本方法はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法の有効量を前記患者に投与することを更に含む。幾つかの実施態様にて、本方法は、細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第二の抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む。幾つかの実施態様では、第二の抗癌治療法とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に投与される。幾つかの実施態様では、第二の抗癌治療法とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが逐次的に投与される。幾つかの実施態様では、本方法は、細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第三の抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む。幾つかの実施態様では、第三の抗癌治療法、第二の抗癌治療法及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に投与される。幾つかの実施態様では、第三の抗癌治療法、第二の抗癌治療法及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが逐次的に投与される。幾つかの実施態様において、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは抗体である。幾つかの実施態様において、抗体はベバシズマブである。幾つかの実施態様において、癌は乳癌（例えば、局所進行、再発または転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌を含む）であり及び第二の抗癌治療法はドセタキセルである。幾つかの実施態様において、癌は膵臓癌（例えば、転移性膵臓癌を含む）であるり、第二の抗癌治療法は、ゲムシタビンであり、第三の抗癌療法はエルロチニブである。幾つかの実施態様において、癌は胃癌であり、第二の抗癌療法はカペシタビンであり、及び第三の抗癌療法はシスプラチンである。幾つかの実施態様において、癌は肺癌であり、第二の抗癌治療法はゲムシタビンであり、及び第三の抗癌療法はシスプラチンである。
本発明の更なる実施態様は、癌に罹患する患者の、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法に対する応答性を予測する方法を提供し、該方法は、患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の発現レベルを決定することを含み、患者から得たサンプル中において（例えば基準サンプルと比較した場合）基準レベルか又はそれを上回るレベルでのＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルは、患者は抗癌治療法による治療に応答する可能性がより高いことを示す。幾つかの実施態様において、癌は、結腸直腸癌、神経膠芽腫、腎癌、卵巣癌、乳癌（例えば、局所進行、再発または転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌を含む）、膵臓癌（例えば、転移性膵臓癌を含む）、胃癌、肺癌からなる群から選択される。幾つかの実施態様にて、患者から得られたサンプルは、全血、血漿、血清、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されたメンバーである。幾つかの実施態様にて、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のタンパク質レベルは、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の血漿タンパク質レベルを測定することによって決定される。幾つかの実施態様にて、基準レベルかまたはそれ以上であるＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の血漿レベルは、患者が抗癌治療により利益を受ける可能性があり、抗癌治療法により応答する可能性がより高いか、又は抗癌治療法の利益を受ける可能性が増加していることを示す。幾つかの実施態様にて、本方法はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法の有効量を前記患者に投与することを更に含む。幾つかの実施態様にて、本方法は、細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第二の抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む。幾つかの実施態様では、第二の抗癌治療法とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に投与される。幾つかの実施態様では、第二の抗癌治療法とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが逐次的に投与される。幾つかの実施態様では、本方法は、細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第三の抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む。幾つかの実施態様では、第三の抗癌治療法、第二の抗癌治療法及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に投与される。幾つかの実施態様では、第三の抗癌治療法、第二の抗癌治療法及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが逐次的に投与される。幾つかの実施態様において、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは抗体である。幾つかの実施態様において、抗体はベバシズマブである。幾つかの実施態様において、抗体はベバシズマブである。幾つかの実施態様において、癌は乳癌（例えば、局所進行、再発または転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌を含む）であり及び第二の抗癌治療法はドセタキセルである。幾つかの実施態様において、癌は膵臓癌（例えば、転移性膵臓癌を含む）であるり、第二の抗癌治療法は、ゲムシタビンであり、第三の抗癌療法はエルロチニブである。幾つかの実施態様において、癌は胃癌であり、第二の抗癌療法はカペシタビンであり、及び第三の抗癌療法はシスプラチンである。幾つかの実施態様において、癌は肺癌であり、第二の抗癌治療法はゲムシタビンであり、及び第三の抗癌療法はシスプラチンである。
本発明の更に別の実施態様は、癌患者が、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法からの利益を示す可能性を決定するための方法を提供し、該方法は、患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の発現レベルを決定することを含み、患者から得たサンプル中において（例えば基準サンプルと比較した場合）基準レベルか又はそれを上回るレベルでのＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルは、患者は抗癌治療法による治療に応答する可能性がより高いことを示す。幾つかの実施態様において、癌は、結腸直腸癌、神経膠芽腫、腎癌、卵巣癌、乳癌（例えば、局所進行、再発または転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌を含む）、膵臓癌（例えば、転移性膵臓癌を含む）、胃癌、肺癌からなる群から選択される。幾つかの実施態様にて、患者から得られたサンプルは、全血、血漿、血清、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されたメンバーである。幾つかの実施態様にて、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のタンパク質レベルは、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の血漿タンパク質レベルを測定することによって決定される。幾つかの実施態様にて、基準レベルかまたはそれ以上であるＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の血漿レベルは、患者が抗癌治療により利益を受ける可能性があり、抗癌治療法により応答する可能性がより高いか、又は抗癌治療法の利益を受ける可能性が増加していることを示す。幾つかの実施態様にて、本方法はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法の有効量を前記患者に投与することを更に含む。幾つかの実施態様にて、本方法は、細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第二の抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む。幾つかの実施態様では、第二の抗癌治療法とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に投与される。幾つかの実施態様では、第二の抗癌治療法とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが逐次的に投与される。幾つかの実施態様では、本方法は、細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第三の抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む。幾つかの実施態様では、第三の抗癌治療法、第二の抗癌治療法及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に投与される。幾つかの実施態様では、第三の抗癌治療法、第二の抗癌治療法及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが逐次的に投与される。幾つかの実施態様において、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは抗体である。幾つかの実施態様において、抗体はベバシズマブである。幾つかの実施態様において、抗体はベバシズマブである。幾つかの実施態様において、癌は乳癌（例えば、局所進行、再発または転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌を含む）であり及び第二の抗癌治療法はドセタキセルである。幾つかの実施態様において、癌は膵臓癌（例えば、転移性膵臓癌を含む）であるり、第二の抗癌治療法は、ゲムシタビンであり、第三の抗癌療法はエルロチニブである。幾つかの実施態様において、癌は胃癌であり、第二の抗癌療法はカペシタビンであり、及び第三の抗癌療法はシスプラチンである。幾つかの実施態様において、癌は肺癌であり、第二の抗癌治療法はゲムシタビンであり、及び第三の抗癌療法はシスプラチンである。
本発明の更に別の実施態様は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法の治療的有効性を最適化するための方法を提供し、該方法は、患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の発現レベルを決定することを含み、患者から得たサンプル中において（例えば基準サンプルと比較した場合）基準レベルか又はそれを上回るレベルでのＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルは、患者は抗癌治療法による治療に応答する可能性がより高いことを示す。幾つかの実施態様において、癌は、結腸直腸癌、神経膠芽腫、腎癌、卵巣癌、乳癌（例えば、局所進行、再発または転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌を含む）、膵臓癌（例えば、転移性膵臓癌を含む）、胃癌、肺癌からなる群から選択される。幾つかの実施態様にて、患者から得られたサンプルは、全血、血漿、血清、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されたメンバーである。幾つかの実施態様にて、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のタンパク質レベルは、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の血漿タンパク質レベルを測定することによって決定される。幾つかの実施態様にて、基準レベルかまたはそれ以上であるＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の血漿レベルは、患者が抗癌治療により利益を受ける可能性があり、抗癌治療法により応答する可能性がより高いか、又は抗癌治療法の利益を受ける可能性が増加していることを示す。幾つかの実施態様にて、本方法はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法の有効量を前記患者に投与することを更に含む。幾つかの実施態様にて、本方法は、細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第二の抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む。幾つかの実施態様では、第二の抗癌治療法とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に投与される。幾つかの実施態様では、第二の抗癌治療法とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが逐次的に投与される。幾つかの実施態様では、本方法は、細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第三の抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む。幾つかの実施態様では、第三の抗癌治療法、第二の抗癌治療法及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に投与される。幾つかの実施態様では、第三の抗癌治療法、第二の抗癌治療法及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが逐次的に投与される。幾つかの実施態様において、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは抗体である。幾つかの実施態様において、抗体はベバシズマブである。幾つかの実施態様において、抗体はベバシズマブである。幾つかの実施態様において、癌は乳癌（例えば、局所進行、再発または転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌を含む）であり及び第二の抗癌治療法はドセタキセルである。幾つかの実施態様において、癌は膵臓癌（例えば、転移性膵臓癌を含む）であるり、第二の抗癌治療法は、ゲムシタビンであり、第三の抗癌療法はエルロチニブである。幾つかの実施態様において、癌は胃癌であり、第二の抗癌療法はカペシタビンであり、及び第三の抗癌療法はシスプラチンである。幾つかの実施態様において、癌は肺癌であり、第二の抗癌治療法はゲムシタビンであり、及び第三の抗癌療法はシスプラチンである。
本発明の更なる実施態様は、患者の癌を治療するための方法を提供し、該方法は、患者から得られたサンプルが、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルが（例えば基準サンプルと比較した場合）基準レベルかそれ以上のレベルを有することを決定し、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法の有効量を前記患者に投与され、それによって癌が治療されることを含む。幾つかの実施態様において、癌は、結腸直腸癌、神経膠芽腫、腎癌、卵巣癌、乳癌（例えば、局所進行、再発または転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌を含む）、膵臓癌（例えば、転移性膵臓癌を含む）、胃癌、肺癌からなる群から選択される。幾つかの実施態様にて、患者から得られたサンプルは、全血、血漿、血清、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されたメンバーである。幾つかの実施態様にて、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のタンパク質レベルは、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の血漿タンパク質レベルを測定することによって決定される。幾つかの実施態様にて、基準レベルかまたはそれ以上であるＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の血漿レベルは、患者が抗癌治療により利益を受ける可能性があり、抗癌治療法により応答する可能性がより高いか、又は抗癌治療法の利益を受ける可能性が増加していることを示す。幾つかの実施態様にて、本方法は、細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第二の抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む。幾つかの実施態様では、第二の抗癌治療法とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に投与される。幾つかの実施態様では、第二の抗癌治療法とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが逐次的に投与される。幾つかの実施態様では、本方法は、細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第三の抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む。幾つかの実施態様では、第三の抗癌治療法、第二の抗癌治療法及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に投与される。幾つかの実施態様では、第三の抗癌治療法、第二の抗癌治療法及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが逐次的に投与される。幾つかの実施態様において、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは抗体である。幾つかの実施態様において、抗体はベバシズマブである。幾つかの実施態様において、抗体はベバシズマブである。幾つかの実施態様において、癌は乳癌（例えば、局所進行、再発または転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌を含む）であり及び第二の抗癌治療法はドセタキセルである。幾つかの実施態様において、癌は膵臓癌（例えば、転移性膵臓癌を含む）であるり、第二の抗癌治療法は、ゲムシタビンであり、第三の抗癌療法はエルロチニブである。幾つかの実施態様において、癌は胃癌であり、第二の抗癌療法はカペシタビンであり、及び第三の抗癌療法はシスプラチンである。幾つかの実施態様において、癌は肺癌であり、第二の抗癌治療法はゲムシタビンであり、及び第三の抗癌療法はシスプラチンである。
本発明の別の実施態様は、患者が、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法による治療から利益を受けうるかを決定するためのキットを提供し、そのキットは、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法による治療に対する患者の応答性を予測する少なくとも一のバイオマーカーのレベルを決定するための一組の化合物を含み、ここで、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルが、基準レベル（例えば基準サンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベル）かそれ以上のレベルであることは、患者が、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法による治療から利益を受け得ることを示す。幾つかの実施態様において、化合物はタンパク質である。幾つかの実施態様において、タンパク質は抗体である。
本発明の更なる実施態様は、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０からなる群から選択される少なくとも一のバイオマーカーのレベルを検出するための一組の化合物を提供し、その組は、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０からなる群から選択される少なくとも一のバイオマーカーに特異的に結合することが可能である少なくとも一化合物を含む。好ましくは、一組の化合物は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法による治療に対する患者の応答性を予測するために使用される。幾つかの実施態様において、化合物はタンパク質である。幾つかの実施態様において、タンパク質は抗体である。
これら及び他の実施態様は、以下の詳細な説明によって更に記載されている。
局所的進行、再発又は転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌の治療を受けている患者において、ベバシズマブ（低または高用量）及びドセタキセル療法対プラセボ＋ドセタキセル療法に関する全バイオマーカーの集団の無増悪生存についてのカプランマイヤー曲線。短鎖線はプラセボ＋ドセタキセルを表す。実線は低用量ベバシズマブ（７．５ｍｇ／ｋｇを３週間毎）＋ドセタキセルを示す。長鎖線は高用量ベバシズマブ（１５ｍｇ／ｋｇを３週間毎）＋ドセタキセルを示す。 バイオマーカー(プラセボ及び低用量ベバシズマブ)による後の抗腫瘍治療の開始前の無増悪生存のハザード比のフォレストプロット、局所的進行、再発性又は転移性のＨＥＲ−２陰性乳癌について治療される患者において、プラセボとドセタキセル治療法に対するベバシズマブ（低用量）とドセタキセル治療法について、二分分析。 バイオマーカー(プラセボ及び高用量ベバシズマブ)による後の抗腫瘍治療の開始前の無増悪生存のハザード比のフォレストプロット、局所的進行、再発性又は転移性のＨＥＲ−２陰性乳癌について治療される患者において、プラセボとドセタキセル治療法に対するベバシズマブ（高用量）とドセタキセル治療法について、二分分析。 局所的進行、再発性又は転移性のＨＥＲ−２陰性乳癌について治療される患者において、プラセボとドセタキセル治療法に対するベバシズマブ（低又は高用量）治療法について、低発現レベル（＜１２５ｐｇ／ｍｌ）のＶＥＧＦＡ（図４Ａ）及び高発現レベル（≧１２５ｐｇ／ｍｌ）ＶＥＧＦＡ，（図４Ｂ）について、後の抗腫瘍治療の開始前の無増悪生存のカプランマイヤー曲線。短鎖線はプラセボ＋ドセタキセルを表す。実線は低用量ベバシズマブ（７．５ｍｇ／ｋｇを３週間毎）＋ドセタキセルを示す。長鎖線は高用量ベバシズマブ（１５ｍｇ／ｋｇを３週間毎）＋ドセタキセルを示す。 局所的進行、再発性又は転移性のＨＥＲ−２陰性乳癌について治療される患者において、プラセボとドセタキセル治療法に対するベバシズマブ（低又は高用量）治療法について、低発現レベル（＜１１ｎｇ／ｍｌ）のＶＥＧＦＲ２（図５Ａ）及び高発現レベル（≧１１ｎｇ／ｍｌ）ＶＥＧＦＲ２，（図５Ｂ）について、後の抗腫瘍治療の開始前の無増悪生存のカプランマイヤー曲線。短鎖線はプラセボ＋ドセタキセルを表す。実線は低用量ベバシズマブ（７．５ｍｇ／ｋｇを３週間毎）＋ドセタキセルを示す。長鎖線は高用量ベバシズマブ（１５ｍｇ／ｋｇを３週間毎）＋ドセタキセルを示す。 局所的進行、再発性又は転移性のＨＥＲ−２陰性乳癌について治療される患者において、プラセボとドセタキセル治療法に対するベバシズマブ（低又は高用量）治療法について、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２の低発現レベル（式１＜−０．１３２）の組み合わせ及び高発現レベル（式１≧−０．１３２）の組み合わせについて、後の抗腫瘍治療の開始前の無増悪生存のカプランマイヤー曲線。実線は、プラセボ＋ドセタキセルを表す。長鎖線は低用量ベバシズマブ（７．５ｍｇ／ｋｇを３週間毎）＋ドセタキセルを示す。短鎖線は高用量ベバシズマブ（１５ｍｇ／ｋｇを３週間毎）＋ドセタキセルを示す。 局所的進行、再発性又は転移性のＨＥＲ−２陰性乳癌について治療される患者において、プラセボとドセタキセル治療法に対するベバシズマブ（低又は高用量）治療法について、ＶＥＧＦＡとＰＬＧＦの低発現レベル（式２＜−０．００６）の組み合わせ及び高発現レベル（式２≧−０．００６）の組み合わせについて、後の抗腫瘍治療の開始前の無増悪生存のカプランマイヤー曲線。実線は、プラセボ＋ドセタキセルを表す。長鎖線は低用量ベバシズマブ（７．５ｍｇ／ｋｇを３週間毎）＋ドセタキセルを示す。短鎖線は高用量ベバシズマブ（１５ｍｇ／ｋｇを３週間毎）＋ドセタキセルを示す。 配列番号１、ＶＥＧＦＡの典型的なアミノ酸配列。 配列番号２、ＶＥＧＦＲ２の典型的なアミノ酸配列。 配列番号３、ＰＬＧＦの典型的なアミノ酸配列。 ＩＭＰＡＣＴチップ上で測定されるＶＥＧＦ１１１，ＶＥＧＦ１２１，ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９の増加する濃度の測定。 自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アナライザー上でのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイを使用して測定されるＶＥＧＦ１１０，ＶＥＧＦ１２１，及びＶＥＧＦ１６５の増加する濃度の測定。 手術不能な局所進行／転移性の胃／胃食道腺癌の治療を受けている患者において、コントロールのプラセボとカペシタビン／シスプラチン治療法に対するベバシズマブとカペシタビン／シスプラチン治療法について、高（＞１１１ｐｇ／ｍｌ）発現レベル及び低（≦１１１ｐｇ／ｍｌ）発現レベルの両方について、マーカーＶＥＧＦＡに対する全生存（図１３Ａ）及び無増悪生存（図１３Ｂ）についてのカプランマイヤー曲線。 手術不能な局所進行／転移性の胃／胃食道腺癌の治療を受けているアジア太平洋地域からの患者において、コントロールのプラセボとカペシタビン／シスプラチン治療法に対するベバシズマブとカペシタビン／シスプラチン治療法について、高（＞１１１ｐｇ／ｍｌ）発現レベル及び低（≦１１１ｐｇ／ｍｌ）発現レベルの両方について、マーカーｐＶＥＧＦＡに対する全生存（図１４Ａ）及び無増悪生存（図１４Ｂ）における治療効果との関連についてのカプランマイヤー曲線。 手術不能な局所進行／転移性の胃／胃食道腺癌の治療を受けている非アジア太平洋地域からの患者において、コントロールのプラセボとカペシタビン／シスプラチン治療法に対するベバシズマブとカペシタビン／シスプラチン治療法について、高（＞１１１ｐｇ／ｍｌ）発現レベル及び低（≦１１１ｐｇ／ｍｌ）発現レベルの両方について、マーカーＶＥＧＦＡに対する全生存（図１５Ａ）及び無増悪生存（図１５Ｂ）における治療効果との関連についてのカプランマイヤー曲線。 転移性膵癌の治療を受けている患者において、コントロールプラセボとゲムシタビン−エルロチニブ治療法に対するベバシズマブとゲムシタビン−エルロチニブ治療法について、全生存（図１６Ａ）及び無増悪生存（図１６Ｂ）についてのカプランマイヤー曲線。図中、実線は、ベバシズマブ／ゲムシタビン−エルロチニブ治療を表し、破線はプラセボ／ゲムシタビン−エルロチニブ治療法を表す。 転移性膵癌の治療を受けている患者おいて、コントロールプラセボとゲムシタビン−エルロチニブ治療法に対するベバシズマブとゲムシタビン−エルロチニブ治療法について、マーカーＶＥＧＦＡについて全生存における治療効果との関係（図１７Ａ）及びマーカーＶＥＧＦＡについて無増悪生存における治療効果との関係（図１７Ｂ）について、高（≧１５２．９ｐｇ／ｍｌ）発現レベル及び低（＜１５２．９ｐｇ／ｍｌ）発現レベルの両方についてのカプランマイヤー曲線。図中、実線は、ベバシズマブ／ゲムシタビン−エルロチニブ治療を表し、破線はプラセボ／ゲムシタビン−エルロチニブ治療法を表す。 転移性膵癌の治療を受けている患者において、コントロールプラセボとゲムシタビン−エルロチニブ治療法に対するベバシズマブとゲムシタビン−エルロチニブ治療法について、マーカーＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＡ２（図１８Ａ）について、高（式１≧−０．１）発現レベル及び低（式１＜−０．１）発現レベルの両方を組み合わせた発現レベルとして、及びＶＥＧＦＡとＰＬＧＦ（図１８Ｂ）について、高（式２≧−０．０４２）発現レベル及び低（式２＜−０．０４２）発現レベルの両方を組み合わせた発現レベルとして、全生存における治療効果との関連についてのカプランマイヤー曲線。図中、実線は、ベバシズマブ／ゲムシタビン−エルロチニブ治療を表し、破線はプラセボ／ゲムシタビン−エルロチニブ治療法を表す。 転移性膵臓癌の治療を受けている患者において、コントロールプラセボとゲムシタビン−エルロチニブ治療法に対するベバシズマブとゲムシタビン−エルロチニブ治療法について、マーカーＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２（図１９Ａ）について、高（式１≧−０．１）及び低（式１＜−０．１）発現レベルの両方の混合発現レベルとして、及びＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦ（図１９Ｂ）について、高（式２≧−０．０４２）及び低（式２＜−０．０４２）発現レベルの両方の混合発現レベルとして、無増悪生存における治療効果との関連についてのカプランマイヤー曲線。図中、実線は、ベバシズマブ／ゲムシタビン−エルロチニブ治療を表し、破線はプラセボ／ゲムシタビン−エルロチニブ治療法を表す。 転移性膵臓癌の治療を受けている患者において、コントロールプラセボとゲムシタビン−エルロチニブ治療法に対するベバシズマブとゲムシタビン−エルロチニブ治療法について、マーカーＶＥＧＦＡ、ＶＦＧＦＲ２及びＰＬＧＦ（図２０Ａ）について、高（式３≧０．８３７）及び低（式３＜０．８３７）発現レベルの両方の混合発現レベルとして、全生存における治療効果との関連についてのカプランマイヤー曲線、及びＶＥＧＦＡ、ＶＦＧＦＲ２及びＰＬＧＦ（図２０Ｂ）について、高（式３≧０．８３７）及び低（式３＜０．８３７）発現レベルの両方の混合発現レベルとして、無増悪生存における治療効果との関連についてのカプランマイヤー曲線。図中、実線は、ベバシズマブ／ゲムシタビン−エルロチニブ治療を表し、破線はプラセボ／ゲムシタビン−エルロチニブ治療法を表す。 ＩＭＰＡＣＴアッセイで２回測定された同一患者由来のＥＤＴＡサンプルとクエン酸塩サンプルからのデータＶＥＧＦＡ濃度は、ＥＤＴＡ−クエン酸塩法比較のスピアマン相関が約０．８で、クエン酸塩よりもＥＤＴＡ血漿が約４０％高い。
好適な実施態様の詳細な説明
Ｉ．序論
本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニストを含む抗癌治療法への応答可能性の増大を有する患者を同定するための方法を提供する。
ＩＩ．定義
ある実施態様では、用語「増加」又は「上回る」は、ここに記述された方法によって検出される血漿のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルにおいて、基準サンプルからのＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルに比べて、基準レベルを超えたレベル又は５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上の全体的増加を指す。ある実施態様にて、その用語は、血漿のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０レベルの増加を指し、その増加が、例えば基準サンプルから予め決められた血漿のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルに比べて、少なくとも約１．５、１．７５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、又は１００倍高い。好ましい実施態様にて、用語「増加したレベル」は、基準レベルの値か又はそれを超えた値を指す。
ある実施態様では、用語「減少」又は「下回る」は、ここに記述された方法によって検出されるＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルにおいて、基準サンプルからのＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルに比べて、基準レベルを下回るレベル又は５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の全体的減少を指す。ある実施態様において、用語「減少」は、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルの減少を指し、ここでその減少レベルは、基準サンプルからのＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルのたかだか約０．９倍、０．８倍、０．７倍、０．６倍、０．５倍、０．４倍、０．３倍、０．２倍、０．１倍、０．０５倍、又は０．０１倍である。
ある実施態様では、用語「基準レベルで」とは、基準サンプルから、ここで記載の方法で検出されたＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルと同じであるレベルを指す。
ある実施態様では、用語「基準レベル」はここでは予め決められた値を指す。当業者には理解されるように、基準レベルは予め決められており、例えば特異性及び／又は感受性の観点からその要件を満たすように設定される。これらの要件は、例えば規制機関から規制機関へと変化させることができる。アッセイの感度又は特異性が、それぞれ所定の限界、例えば、８０％、９０％又は９５％に設定されねばならないかもしれない。これらの要件は、正又は負の予測値を単位として定義することができる。にもかかわらず、本発明に与えられた教えに基づいて、これらの要件を満たす基準レベルに到達することが常に可能となる。一実施態様にて、基準レベルは健常な個体にて決定される。一実施態様における基準レベルは、患者の属する疾患実体にて予め決められている。ある実施態様では、基準レベルは、調査される疾患実体における値の全体的分布の２５％から７５％の間の任意の割合に設定されることができる。他の実施態様では、基準レベルは、調査される疾患実体における値の全体的分布から決定される、中央値、三分位数又は四分位数に例えば設定されることができる。一実施態様では、基準レベルは、調査される疾患実体における値の全体的分布から決定される、中央値に設定される。
本発明の文脈において、「ＶＥＧＦ」、「ＶＥＧＦＡ」又は「ＶＥＧＦ−Ａ」は、図８（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１５６９２，Ｇｅｎｅ ＩＤ（ＮＣＢＩ）：７４２２）に示される配列番号１に例示される血管内皮増殖因子タンパク質Ａを指す。用語「ＶＥＧＦＡ」は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質並びにそのホモログ及びアイソフォームを包含する。用語「ＶＥＧＦ−Ａ」はまた、既知のアイソフォーム例えばＶＥＧＦ−Ａのスプライスアイソフォーム、例えば、ＶＥＧＦ１２１，ＶＥＧＦ１４５，ＶＥＧＦ１６５，ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６、併せて天然に生じる対立遺伝子やそのプロセスされた形態をも包含し、Ferrara Mol. Biol. Cell 21:687 (2010)及びLeung et al. Science 246:1306 (1989), 及びHouck et al. Mol. Endocrin. 5:1806 (1991)に記載されるように、ＶＥＧＦ１６５のプラスミン開裂により生成する１１０アミノ酸ヒト血管内皮細胞増殖因子を含む。本発明の文脈において、用語「ＶＥＧＦ−Ａ」はまた、変異体タンパク質（アイソフォームを含む）、ホモログタンパク質、及び／又は断片が、一以上のＶＥＧＦ−Ａ特異的抗体、例えば、Bender Relia Tech and R&D Systemsから入手できる抗体クローン３Ｃ５及び２６５０３、及びKim et al., Growth Factors 7(1): 53-64 (1992に記載のＡ４.６.１などによって認識されることを条件として、その変異体及び／又はホモログ並びにＶＥＧＦ−Ａの断片をも包含する。本発明の文脈において、用語ＶＥＧＦの「アイソフォーム」、ＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦ−Ａは、スプライスアイソフォーム及び（例えばプラスミンによる）酵素開裂により生成される形態の両方を指す。
本発明の文脈において、「ＶＥＧＦＲ２」は、図９（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ３５９６８，Ｇｅｎｅ ＩＤ（ＮＣＢＩ）：３９７１）に示される配列番号２に例示される血管内皮増殖因子受容体２を指す。用語「ＶＥＧＦＲ２」は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質並びにそのホモログ及びアイソフォームを包含する。本発明の文脈において、用語「ＶＥＧＦＲ２」はまた、変異体タンパク質（アイソフォームを含む）、相同性タンパク質及び／又は断片が、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な抗体クローンの８９１１５及び８９１０９などの一以上のＶＥＧＦＲ２特異的抗体により認識されることを条件として、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の相同性を有するタンパク質、又はその変異体及び／又はホモログ並びにその配列の断片を包含する。
本発明の文脈において、「ＰＬＧＦ」は、図１０（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ４９７６３，Ｇｅｎｅ ＩＤ（ＮＣＢＩ）：５２２８）に示される配列番号３に例示される胎盤増殖因子を指す。用語「ＰＬＧＦ」は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質並びにそのホモログ及びアイソフォームを包含する。本発明の文脈において、用語「ＰＬＧＦ」はまた、変異体タンパク質（アイソフォームを含む）、相同性タンパク質及び／又は断片が、ロシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）から入手可能な抗体クローンの２Ｄ６Ｄ５及び６Ａ１１Ｄ２などの一以上のＰＬＧＦ特異的抗体により認識されることを条件として、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の相同性を有するタンパク質、又はその変異体及び／又はホモログ並びにその配列の断片を包含する。
用語「ＶＥＧＦ」とは、非ヒト種、例えば、マウス、ラットまたは霊長類由来のＶＥＧＦをも指す。ときには、特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦに対するｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦに対するｍＶＥＧＦなどの用語として記載される。用語「ＶＥＧＦ」は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子のアミノ酸８〜１０９または１〜１０９を含むポリペプチドの切断型のことを指すためにも使用される。そのような形態のＶＥＧＦのいずれかに対する言及は、本願において例えば、「ＶＥＧＦ（８−１０９）」、「ＶＥＧＦ（１−１０９）」または「ＶＥＧＦ１６５」によって特定され得る。「切断型」天然ＶＥＧＦに対するアミノ酸位置は、天然ＶＥＧＦ配列において示されるように番号付けされる。例えば、切断型天然ＶＥＧＦにおけるアミノ酸１７位（メチオニン）は、天然ＶＥＧＦにおいても１７位（メチオニン）である。切断型天然ＶＥＧＦは、ＫＤＲおよびＦｌｔ−１レセプターに対して天然ＶＥＧＦに匹敵する結合親和性を有する。好ましい実施態様において、ＶＥＧＦはヒトＶＥＧＦである。
「ＶＥＧＦの生物学的活性」は、任意のＶＥＧＦ受容体への結合、または正常な血管新生および血管形成ならびに異常な血管新生および血管形成の両方の調節等、任意のＶＥＧＦシグナル伝達活性（ＦｅｒｒａｒａおよびＤａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．１８：４〜２５；Ｆｅｒｒａｒａ（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：５２７〜５４３）；胚の血管形成および血管新生の促進（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３５〜４３９；Ｆｅｒｒａｒａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３９〜４４２）；さらに、雌の生殖器系における、ならびに骨の成長および軟骨の形成のための周期性の血管増殖の調節（Ｆｅｒｒａｒａら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：３３６〜３４０；Ｇｅｒｂｅｒら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：６２３〜６２８）を含む。血管新生および血管形成における血管新生因子であることに加え、ＶＥＧＦは、多面的な増殖因子として、内皮細胞の生存、血管透過性および血管拡張、単核球走化性、ならびにカルシウムの流入等のその他の生理学的プロセスにおいて、複数の生物学的な作用を示す（ＦｅｒｒａｒａおよびＤａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ（１９９７）、上記、ならびにＣｅｂｅ−Ｓｕａｒｅｚら Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６３：６０１〜６１５（２００６））。さらに、最近の研究からは、網膜色素上皮細胞、膵管細胞およびシュワン細胞等のいくつかの非内皮細胞型に対するＶＥＧＦの分裂促進作用も報告されている。Ｇｕｅｒｒｉｎら（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６４：３８５〜３９４；Ｏｂｅｒｇ−Ｗｅｌｓｈら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２６：１２５〜１３２；Ｓｏｎｄｅｌｌら（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：５７３１〜５７４０。
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」又は「ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト」は、ＶＥＧＦへ結合し、ＶＥＧＦ発現レベルを低減させ、又は一又は複数のＶＥＧＦレセプターへの結合、ＶＥＧＦ媒介性の血管新生及び血管内皮細胞生存又は増殖を含むがこれに限定されないＶＥＧＦの生物学的活性を中和、遮断、阻害、無効化、低減又は干渉することができる分子を指す。本発明の方法において有用なＶＥＧＦ特異的アンタゴニストとして含まれるのは、ＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチド、ＶＥＧＦレセプターに特異的に結合するポリペプチド、抗ＶＥＧＦ抗体、及びその抗原結合断片、ＶＥＧＦに特異的に結合しそれによって一又は複数のレセプターへの結合を隔離するレセプター分子及びその誘導体、融合タンパク質（例えばＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ））、及びＶＥＧＦ１２１−ゲロニン（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）が含まれる。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストはまた、ＶＥＧＦポリペプチドのアンタゴニスト変異体、ＶＥＧＦに対するアンチセンス核酸塩基オリゴマー、ＶＥＧＦに対する低分子ＲＮＡ分子、ＲＮＡアプタマー、ペプチボディ(peptibodies)、及びＶＥＧＦに対するリボザイム、ストリンジェントな条件下で、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプターをコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸（例えばＲＮＡｉ）、イムノアドヘシン、抗ＶＥＧＦレセプター抗体及びＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子阻害剤などのＶＥＧＦレセプターアンタゴニストを含む。一つの好ましい実施態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦに結合し、インビトロでのＶＥＧＦ誘導性内皮細胞増殖を阻害する。一つの好ましい実施態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプターに非ＶＥＧＦ又は非ＶＥＧＦレセプターよりも高親和性で結合する。一つの好ましい実施態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプターに、Ｋｄが１ｕＭ及び１ｐＭの間で結合する。その他の好ましい実施態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦ又はＶＥＧＦレセプターに、５００ｎＭ及び１ｐＭの間で結合する。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストには、ＶＥＧＦと結合して、ＶＥＧＦ生物学的活性を遮断、阻害、抑制、低減又は干渉することができる非ペプチド小分子も含まれる。ゆえに、「ＶＥＧＦ活性」なる用語は、特にＶＥＧＦのＶＥＧＦ媒介性生物学的活性を含む。ある実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦの発現レベル又は生物学的活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上低減又は阻害する。
好ましい実施態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗体、ペプチボディ、イムノアドヘシン、小分子またはアプタマーなどのポリペプチドから選択される。好ましい実施態様において、抗体は、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））または抗ＶＥＧＦＲ２または抗ＶＥＧＦＲ３抗体などの抗ＶＥＧＦ受容体抗体などの抗ＶＥＧＦ抗体である。ＶＥＧＦアンタゴニストの他の例は次のとおりである：ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ，Ｍｕｃａｇｅｎ，ＰＴＫ７８７，ＳＵ１１２４８，ＡＧ−０１３７３６，Ｂａｙ ４３９００６（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ），ＺＤ−６４７４，ＣＰ６３２，ＣＰ−５４７６３２，ＡＺＤ−２１７１，ＣＤＰ−１７１，ＳＵ−１４８１３，ＣＨＩＲ−２５８，ＡＥＥ−７８８，ＳＢ７８６０３４，ＢＡＹ５７９３５２，ＣＤＰ−７９１，ＥＧ−３３０６，ＧＷ−７８６０３４，ＲＷＪ−４１７９７５／ＣＴ６７５８及びＫＲＮ−６３３．
「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性及び特異性でＶＥＧＦに結合する抗体である。ある実施態様において、選択される抗体は通常ＶＥＧＦに十分な結合親和性を有し、例えば、抗体はｈＶＥＧＦにＫｄ値が１００ｎＭから１ｐＭの間で結合しうる。抗体の親和性は、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（例えばＰＣＴ出願公開番号第２００５／０１２３５９号に記載されてビアコアアッセイなど）；酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）；及び競合アッセイ（例えばＲＩＡ）により決定することができる。好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与している疾患又は症状を標的とすること及び妨げることにおける治療剤として使用することができる。抗ＶＥＧＦ抗体は通常、ＶＥＧＦ−Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｃなどの他のＶＥＧＦホモログにも、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦなどの他の増殖因子にも結合しないであろう。好ましい抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ１０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４.６.１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。より好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ(ＢＶ；ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標))として知られる抗体を含むがこれに限定されない、Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599に従って生成される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。その他の実施態様において、使用可能な抗ＶＥＧＦ抗体は、限定されないが、国際公開第２００５／０１２３５９号に開示された抗体を含む。一実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、国際公開第２００５／０１２３５９号の図２４、２５、２６、２７、２９に開示された抗体（例えば、Ｇ６ Ｇ６−２３、Ｇ６−３１、Ｇ６−２３．１、Ｇ６−２３．２、Ｂ２０、Ｂ２０−４及びＢ２０．４．１）のいずれか１つの可変重鎖および可変軽領域を含む。その他の好ましい実施態様において、ラニビズマブとして知られている抗ＶＥＧＦ抗体は、糖尿病性神経障害及びＡＭＤなどの眼疾患のために投与するＶＥＧＦのアンタゴニストである。
ある実施態様において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与している疾患又は症状を標的とすること及び妨げることにおける治療剤として使用することができる。また、抗体は、例えば治療としての有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイを施してもよい。このようなアッセイは、当技術分野で公知であり、標的抗原に依存し、抗体としての使用を意図している。例として、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ、腫瘍細胞増殖阻害アッセイ（例えば、国際公開第８９／０６６９２号に記載）；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５５００３６２号）；及びアゴニスト活性又は造血アッセイ（国際公開第９５／２７０６２号を参照）。抗ＶＥＧＦ抗体は通常、ＶＥＧＦ−Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｃなどの他のＶＥＧＦホモログにも、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦなどの他の増殖因子にも結合しないであろう。一実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ１０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４.６.１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。その他の実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ（ＢＶ；ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））として知られる抗体を含むがこれに限定されない、Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599に従って生成される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。
「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「アバスチン(登録商標)」としても知られる抗ＶＥＧＦ抗体「ベバシズマブ(ＢＶ)」は、Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599に従って生成される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。これは、ヒトＶＥＧＦのそのレセプターへの結合をブロックするマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域と変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域を含有する。ほとんどのフレームワーク領域を含む、ベバシズマブのおよそ９３％のアミノ酸配列はヒトＩｇＧ１由来のものであり、配列のおよそ７％はマウス抗体Ａ４.６.１由来である。ベバシズマブは、およそ１４９０００ダルトンの分子質量であり、グリコシル化される。ベバシズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は米国特許第６８８４８７９号及び国際公開第２００５／０４４８５３号に更に記載されている。
抗ＶＥＧＦ抗体ラニビズマブ又はルセンティス（登録商標）抗体またはｒｈｕＦａｂ Ｖ２は、ヒト化、親和性成熟抗ヒトＶＥＧＦ Ｆａｂ断片である。ラニビズマブは、大腸菌発現ベクター及び細菌発酵における標準的な組換え技術法によって製造される。ラニビズマブはグリコシル化されておらず、〜４８０００ダルトンの分子量を有する。国際公開第９８／４５３３１号及び米国特許出願公開第２００３０１９０３１７号を参照。
２つの最も良好に特徴付けられたＶＥＧＦレセプターは、ＶＥＧＦＲ１(別名Ｆｌｔ−１)およびＶＥＧＦＲ２(別名マウスホモログのＫＤＲおよびＦＬＫ−１)である。各々のＶＥＧＦファミリメンバーの各々のレセプターの特異性は変化するが、ＶＥＧＦ−ＡはＦｌｔ−１およびＫＤＲに結合する。完全長Ｆｌｔ−１レセプターは、７つのＩｇドメインを有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインはＶＥＧＦの結合に関与しており、細胞内ドメインはシグナル伝達に関与している。
ＶＥＧＦに特異的に結合するＶＥＧＦレセプター分子又はその断片は、ＶＥＧＦタンパク質に結合して隔離し、それによってシグナル伝達を妨げるＶＥＧＦインヒビターとして用いられうる。ある実施態様では、ＶＥＧＦレセプター分子又はそのＶＥＧＦ結合断片は、可溶型、例えばｓＦｌｔ−１である。レセプターの可溶型は、ＶＥＧＦに結合して標的細胞の表面上に存在する天然のレセプターへのその結合を妨げることによって、ＶＥＧＦタンパク質の生物活性に対して阻害作用を及ぼす。また、ＶＥＧＦレセプター融合タンパク質も包含され、その例を後述する。
キメラＶＥＧＦレセプタータンパク質は、少なくとも２つの異なるタンパク質由来のアミノ酸配列を有するレセプター分子であり、そのうちの少なくとも１はＶＥＧＦレセプタータンパク質(例えばｆｌｔ−１又はＫＤＲレセプター)であり、ＶＥＧＦに結合してＶＥＧＦの生物活性を阻害することができる。ある実施態様では、本発明のキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質は、２つの異なるＶＥＧＦレセプター分子だけから得られるアミノ酸配列からなるが、ｆｌｔ−１及び／又はＫＤＲレセプターの細胞外リガンド結合領域の１、２、３、４、５、６又は７つすべてのＩｇ様ドメインを含むアミノ酸配列は、他の無関係なタンパク質、例えば免疫グロブリン配列のアミノ酸配列に連結されうる。Ｉｇ様ドメインが結合される他のアミノ酸配列は、当業者に容易に明らかであろう。キメラＶＥＧＦレセプタータンパク質の例には、限定するものではないが、可溶性Ｆｌｔ−１／Ｆｃ、ＫＤＲ／Ｆｃ又はＦＬｔ−１／ＫＤＲ／Ｆｃ(別名ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ)が含まれる。(例としてＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９７／４４４５３を参照のこと)。
可溶性ＶＥＧＦレセプタータンパク質又はキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質には、膜貫通ドメインを介して細胞の表面に固定されていないＶＥＧＦレセプタータンパク質が含まれる。また、キメラレセプタータンパク質を含むＶＥＧＦレセプターの可溶型は、ＶＥＧＦに結合してＶＥＧＦを不活性化することができるが、膜貫通領域を含んでおらず、したがって一般に、この分子が発現される細胞の細胞膜に結合したものとならない。
他のＶＥＧＦインヒビターは、例えば国際公開第９９／２４４４０、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９９／００７９７号、国際公開第９５／２１６１３号、国際公開第９９／６１４２２号、米国特許第６５３４５２４号、米国特許第５８３４５０４号、国際公開第９８／５０３５６号、米国特許第５８８３１１３号、米国特許第５８８６０２０号、米国特許第５７９２７８３号、米国特許第６６５３３０８号、国際公開第９９／１０３４９号、国際公開第９７／３２８５６号、国際公開第９７／２２５９６号、国際公開第９８／５４０９３号、国際公開第９８／０２４３８号、国際公開第９９／１６７５５号、及び国際公開第９８／０２４３７号に記載されており、これらすべては出典明記によってその全体がここに援用される。
ここで使用される「Ｂ２０シリーズポリペプチド」なる用語は、ＶＥＧＦに結合する抗体を含むポリペプチドを意味する。Ｂ２０シリーズポリペプチドには、限定するものではないが、米国特許出願公開第２００６０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７０１４１０６５号及び／又は米国特許出願公開第２００７００２０２６７号に記載されたＢ２０抗体又はＢ２０誘導抗体の配列に由来する抗体が含まれ、これらの特許出願の内容は出典明示により明示的にここに援用される。一実施態様では、Ｂ２０シリーズポリペプチドは、米国特許出願公開第２００６０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７０１４１０６５号及び／又は米国特許出願公開第２００７００２０２６７号に記載されたＢ２０−４．１である。他の実施態様において、Ｂ２０シリーズポリペプチドは米国特許出願番号６０／９９１３０２号に記載されたＢ２０-４.１.１であり、この開示内容の全体は出典明示により明示的にここに援用される。
ここで使用される「Ｇ６シリーズポリペプチド」なる用語は、ＶＥＧＦに結合する抗体を含むポリペプチドを指す。Ｇ６シリーズポリペプチドには、限定するものではないが、米国特許公開第２００６０２８０７４７号、米国特許公開第２００７０１４１０６５号及び／又は米国特許公開第２００７００２０２６７号に記載されたＧ６抗体又はＧ６由来の抗体の配列から由来する抗体が含まれる。米国特許公開第２００６０２８０７４７号、米国特許公開第２００７０１４１０６５号及び／又は米国特許公開第２００７００２０２６７号に記載されたＧ６シリーズポリペプチドには、限定するものではないが、Ｇ６-８、Ｇ６-２３及びＧ６-３１が含まれる。
更なる抗体については、米国特許第７０６０２６９号、同第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；同第６０５４２９７号；国際公開９８／４５３３２；国際公開９６／３００４６；国際公開９４／１０２０２；欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許公開２００６００９３６０、２００５０１８６２０８、２００３０２０６８９９、２００３０１９０３１７、２００３０２０３４０９及び２００５０１１２１２６；及びPopkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)を参照のこと。ある実施態様では、他の抗体には、残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３およびＣ１０４を含むか、あるいは残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｉ８３およびＱ８９を含むヒトＶＥＧＦ上の機能的エピトープに結合するものを含む。
他の抗ＶＥＧＦ抗体もまた知られており、例えば、Liang et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006)に記載される。
抗癌剤による治療に対する、患者の「有効な応答」又は患者の「応答性」又は「感受性」は、抗ＶＥＧＦ抗体などの抗癌剤による治療の結果、又は治療により、癌のリスクがあるか、又は癌に罹患している患者に付与された臨床的又は治療上の利益を言う。このような利点は、細胞性応答又は生物学的応答、完全寛解、部分寛解、安定した疾患（進行又は再発なし）、又はアンタゴニストによる治療により、又は治療の結果、患者の後に再発した応答を含む。例えば、有効な応答は、腫瘍の大きさ、無増悪生存、又は全生存を縮小することができる。
本明細書中で使用されるアンタゴニストは、それらが結合する分子の生物学的活性を阻害又は低下させる化合物又は薬剤を言う。アンタゴニストは、ＶＥＧＦに結合し、場合によっては他の分子に結合し又は融合した、合成によるペプチド又は天然配列のペプチド、イムノアドヘシン、及び小分子アンタゴニストを含む。「ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は阻害又はそれが結合する抗原の生物学的活性を減少させるものである。
本明細書中で用いる「アゴニスト抗体」は、対象のポリペプチドの機能的な活性の少なくとも一つを部分的に又は完全に模倣する抗体である。
本明細書中の「抗体」は最も広義に用いられ、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を表す限りにおける抗体断片を包含する。
ある実施態様において、本明細書で与えられた方法中でＶＥＧＦアンタゴニストとして使用される抗体は、例えば２重特異性抗体などの多重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはＶＥＧＦに対してであり、他は任意の他の抗原に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、ＶＥＧＦの２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたＶＥＧＦを発現する細胞に細胞傷害性薬物を局在化するために用いることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現(Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, 国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照)及び「ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83を参照)；２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること(例えば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照)；二重特異性抗体フラグメントを作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること(例えば、Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照)；及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること(例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照)；及び、例えばTutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照）。
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＶＥＧＦ並びにその他の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
本明細書に与えられる方法においてＶＥＧＦアンタゴニストとして使用される抗体又は抗体断片はまた、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２、及び国際公開第２０１０／１４５７９３に記述される多重特異性抗体を含む。二重特異性ＶＥＧＦ抗体の例は、例えば国際公開第２０１０／０４０５０８（ＶＥＧＦ−ＡＮＧ２）号、ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５４５０４（ＶＥＧＦ−ＡＮＧ２）号、国際公開第２００５／０８７８１２（ＶＥＧＦ−ＰＤＧＦ）号、国際公開第２００９１２０９２２（ＶＥＧＦ−ＰＤＧＦＲベータ）号、国際公開第２０１１／０３９３７０（ＶＥＧＦ−ＤＩＩ４）に記述されている。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の研究、診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。幾つかの実施態様では、抗体は、(１)例えばローリー法で測定した場合、抗体の９５重量％を超えるまて、及び幾つかの実施態様では９９重量％を超えるまで、(２)例えばスピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに十分なほどに、又は、(３)例えばクーマシーブルー又は銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで十分なほど精製される。その自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体又は他のポリペプチドは少なくとも一の精製工程により調製される。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間のインターフェイスを形成すると考えられている。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称されうる。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称されうる。これらのドメインは一般に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域(ＨＶＲ)と呼ばれる３つのセグメントに集中される。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの各々は、主としてβ-シート立体構造をとり、３つの高頻度可変領域によって連結され、β-シート構造を連結し、場合によってはその一部を形成することもある４つのＦＲを含む。各鎖のＨＶＲはＦＲによって極く近傍に一緒に保持され、他の鎖からのＨＶＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照)。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係しないが、例えば抗体依存性細胞傷害への抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる明確に区別される２つのタイプのタイプを割り当てることができる。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、抗体（免疫グロブリン）は、異なるクラスに割り当てることができる。抗体の5つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、例えば、Abbas等．Cellular and Mol. Immunology, 第４版(2000)(W.B. Saunders, Co., 2000)に記述されている。抗体は、抗体と一以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合性又は非共有結合性の会合により形成されたより大きな融合分子の一部であり得る。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、実質的にインタクトな形態の抗体を指し、以下に定義される抗体断片ではない。この用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
本明細書中の「ネイキッド抗体」は、細胞障害性部分にコンジュゲートしていないか又は放射性標識されていない抗体である。
「抗体断片」は、好ましくは抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施態様において、二本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)種では、柔軟なペプチドリンカーによって１の重鎖及び１の軽鎖可変ドメインは共有結合性に連結することができ、よって軽鎖及び重鎖は、二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似の「二量体」構造に結合することができる。この配置において、各可変ドメインの３つのＨＶＲは相互作用し、ＶＨ-ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
Ｆａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含み、また軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。抗体断片の他の化学結合も知られている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York,頁 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは二価でも二特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／１１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる可能性がある突然変異、例えば自然に生じる突然変異を除いて同一である。従って、「モノクローナル」との形容は、別々の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。ある実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの、唯一のクローンの選択とすることができる。選択された標的結合配列は、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等のために更に変化させることができ、変化させた標的結合配列を含む抗体もまた、本発明のモノクローナル抗体である。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
「モノクローナル」との形容は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないと解釈されるべきものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作製することができ、それらの技術には、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)；Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5);1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immounol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004))、並びに、ヒト免疫グロブリン座位の一部又は全部、又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒト又はヒト様抗体を生成する技術(例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号；国際公開第１９９６／３４０９６号；国際公開第１９９６／３３７３５号；国際公開第１９９１／１０７４１号；Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号; Marks等, Bio.Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照)が含まれる。
本発明のモノクローナル抗体は、具体的には「キメラ」抗体を含み、重鎖及び／又は軽鎖の一部は、特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列と同一又は相同であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、他の種由来又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、並びにそのような抗体の断片において、対応する配列と同一又は相同である(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。キメラ抗体には、抗体の抗原結合領域が例えば対象の抗原をマカクザルに免疫投与することによって作製される抗体に由来する、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体が含まれる。
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様において、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲからの残基が、望まれる特異性、親和性、及び／又は能力を有するマウス、ラット又はウサギのようなヒト以外の種（ドナー抗体）のＨＶＲからの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非−ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体にも見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能を更に精密化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グリブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。更なる詳細については、Jones et al.,Nature,321:522-525(1986);Reichmann et al.,Nature,332:323-329(1988);及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)を参照。また、例えば、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); 及び米国特許第６９８２３２１号及び第７０８７４０９号も参照。
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもので、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当該分野で知られている様々な技術を使用して生産することが可能である。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 頁77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)において記述される方法は、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照のこと。ヒト化抗体は、抗原刺激に応答して抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによって調製することができる(例として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照)。例えば、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されるヒト抗体に関するLi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。
本明細書で使用される用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示し、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすと考えられている。例としてXu等 (2000) Immunity 13:37-45；Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) 及びSheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照。
多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。Ｋａｂａｔ相補性決定領域(ＣＤＲ)であるＨＶＲは配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ ＨＶＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲ及びＣｈｏｔｈｉａの構造的ループの間の折衷を表し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲのそれぞれに由来する残基を以下に示す。
Figure 2015180879
ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら拡大ＨＶＲの各々を規定するために、上掲のKabat等に従って番号を付した。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域(ＨＶＲ)残基以外の可変ドメイン残基である。
「Ｋａｂａｔによる可変ドメイン残基番号付け」又は「Ｋａｂａｔに記載のアミノ酸位番号付け」なる表現及びその異なる言い回しは、上掲のＫａｂａｔ等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲの短縮又はＦＲ又はＨＶＲへの挿入に対応する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ)、及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)を含んでもよい。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準の」カバット番号付け配列による抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数のＨＶＲにおいて一又は複数の改変を持つものである。一実施態様では、親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はさらにピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られているある手順を用いて生産される。例えば、Marks等, Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和成熟について記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘導は、例としてBarbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169：147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
「増殖阻害性」抗体は、抗体が結合する抗原を発現している細胞の増殖を妨げるか又は低減するものである。
「アポトーシスを誘導する」抗体とは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞の縮み、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス性本体と呼ばれる)といった、標準的なアポトーシスアッセイにより決定される、プログラムされた細胞死を誘導するものである。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
本明細書の「Ｆｃ領域」なる用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基又はＰｒｏ２３０から、Ｆｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。従って、インタクトな抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体及び有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。
本明細書中で特に明記しない限り、免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、上掲のＫａｂａｔらによるＥＵインデックスのそれである。「ＫａｂａｔによるＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１のＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、ＡＤＣＣ、食作用、細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ)の下方制御などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、例えば本明細書中の定義に開示される様々なアッセイを使用して評価される。
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡ-アロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；並びに、これらの自然に生じる変異体が含まれる。
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾、好ましくは一又は複数のアミノ酸置換により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦＣ領域におよそ１からおよそ１０のアミノ酸置換、好ましくはおよそ１からおよそ５のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と、少なくともおよそ８０％の同一性を有するか、最も好ましくは少なくともおよそ９０％の配列同一性を、より好ましくは少なくともおよそ９５％の配列又はそれ以上の同一性を有するものであろう。
「Ｆｃ領域含有抗体」なる用語は、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムに従うと残基４４７)は、例えば、抗体の精製中又は抗体をコードする核酸を組み換え操作することによって除去してもよい。従って、本発明のＦｃ領域を有する抗体を含んでなる組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、すべてのＫ４４７が除去された抗体、又はＫ４４７残基を有する抗体とＫ４４７残基を有さない抗体の混合を包含しうる。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。ある実施態様では、ＦｃＲは天然のヒトＦｃＲである。ある実施態様では、ＦｃＲはＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif；ＩＴＩＭ)を含んでいる(例としてDaeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲに関しては、例としてRavetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語もまた、母性ＩｇＧの胎児への移送(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、及び免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)；Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)：国際公開第２００４／９２２１９号(Hinton et al.)を参照)。
インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又は変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。国際公開公報００／４２０７２(Presta)にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。例としてShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に結合親和性を測定するための具体的な例示的実施態様を記載する。
一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、以下のアッセイにより説明される目的の抗体のＦａｂ型（バージョン）で実施される放射性標識した抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)で測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって測定される（例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照）。アッセイの条件を決めるために、ミクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)にて一晩コートして、その後２％(w/v)のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温(およそ２３℃)で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した目的のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは確実に平衡状態に達するまでに長時間(例えば６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０ＴＭ界面活性剤を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔγ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
他の実施態様によると、Ｋｄ又はＫｄ値は、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％ＴＷＥＥＮ２０ＴＭ界面活性剤(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度(ｋｏｎ)及び解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ,ＮＪ）を用いて上記のように表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。
本明細書で用いる「実質的に類似」、「実質的に同じ」なる用語は、当業者が２つの数値(例えば、本発明の抗体に関連するもの、及び参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上わずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意差がないと認められるほど、２つの数値が有意に類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較抗体についての値の好ましくは約５０％以下、好ましくは約４０％以下、好ましくは約３０％以下、好ましくは約２０％以下、及び／又は好ましくは約１０％以下である。
本明細書で用いる「実質的に減少」、又は「実質的に異なる」という句は、当業者が２つの数値(一般に、本発明の抗体に関連するもの、及び参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上統計学的に有意であると認められるほど、２つの数値が有意に異なっていることを意味する。前記２つの値間の差異は、例えば、参照／比較抗体に対する値に応じて、約１０％より大きく、約２０％より大きく、約３０％より大きく、約４０％より大きく、及び／又は約５０％より大きい。
所定の実施態様において、本明細書にて有用なヒト化抗体はさらにＩｇＧのＦｃにアミノ酸改変を含み、ヒト化ＦｃＲｎに対して、更に野生型ＩｇＧのＦｃを有する抗体に対して、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、更に好ましくは少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１２５倍、更により好ましくは少なくとも１５０倍から約１７０倍増加した結合親和性を示す。
「疾病」又は「疾患」は、本発明の物質／分子又は方法を用いた治療によって恩恵を得る任意の症状である。これには、問題とする疾患に哺乳動物がかかりやすくなる病理学的症状を含む慢性及び急性の疾病又は疾患を含む。ここで治療されるべき疾患の限定されない例として、癌（悪性及び良性の腫瘍；非白血病及びリンパ系悪性腫瘍）；神経、グリア、アストロサイト、視床下部、及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質と割腔、疾患、及び炎症、免疫学的及び他の血管新生関連の疾患を含む。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」なる用語は、ある程度の異常な細胞増殖と関係している疾患を指す。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。一実施態様では、細胞増殖性疾患は血管形成である。
本明細書中の「腫瘍」とは、悪性か良性かにかかわらず、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖と、すべての前癌性及び癌性細胞及び組織を指す。「癌」、「癌性」「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語は、本明細書に参照される場合互いに排他的でない。
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に調節不可能な細胞増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は表す。癌の例には、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含む)、腹膜癌、肝細胞癌、胃(gastric)又は腹部(stomach)癌(例えば、消化器癌を含む)、膵臓癌(例えば、転移性膵臓癌を含む)、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、肝癌、乳癌（局所的進行型、再発性又は転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌を含む）、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)又は腎(renal)癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝細胞癌、及び様々なタイプの頭頸部癌、並びにＢ細胞リンパ腫(低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；小リンパ球(ＳＬ)ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小非分割細胞ＮＨＬ；バルキー疾患ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンストロームのマクログロブリン病を含む)；慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球白血病(ＡＬＬ)；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)、並びに、母斑症と関係する異常な血管性増殖、浮腫(脳腫瘍と関係するものなど)、メイグス症候群が含まれる。
「抗新生物性組成物」、「抗癌組成物」、又は「抗癌剤」なる用語は、少なくとも一の活性な治療剤、例えば「抗癌剤」を含む癌の治療に有用な組成物を指す。治療剤(抗癌剤)の例には、限定するものではないが、例えば化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害性剤、放射線療法において使用する薬剤、抗血管新生剤、抗リンパ脈管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、毒素、及び癌を治療するための他の薬剤、例えば抗ＨＥＲ-２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)アンタゴニスト(例えば、チロシンキナーゼインヒビター)、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビター（例えば、エルロチニブ(TarcevaTM)、血小板由来増殖因子インヒビター（例えば、GleevecTM(メシル酸イマチニブ)）ＣＯＸ-２インヒビター(例えば、セレコキシブ)、インターフェロン、サイトカイン、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＶＥＧＦレセプターの一又は複数に結合するアンタゴニスト(例えば、中和抗体)を含み、それらは以下のターゲット、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−ｂｅｔａ、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ ＶＥＧＦ、又はＶＥＧＦレセプター、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、及び他のバイオ活性がある有機化学的薬剤の一以上に結合する。それらの組合せも本発明に包含される。
ここで使用される「治療」とは、治療される個体又は細胞の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を意味し、予防のため、又は臨床病理経過中に実施することができる。治療の所望する効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾病の進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は、疾患又は疾病の進行を遅らせるために用いられる。
「有効量」とは、所望される治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、必要な用量での有効量を意味する。
個体に所望する反応を引き出すために、本発明の物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの「治療的有効量」は、病状、年齢、性別、個体の体重、及び、物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力等の要因に応じて変わり得る。また、治療的有効量とは、物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の毒性又は有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量である。「治療的有効量」なる用語は、哺乳動物（別名患者）における疾患又は障害を「治療」するために有効な、本発明の抗体、ポリペプチド又はアンタゴニストの量を指す。癌の場合には、薬剤の治療的有効量は、癌細胞の数を減らし、腫瘍の大きさや重量を減少させ、末梢器官へのの癌細胞の浸潤を阻害し（すなわち、ある程度ゆっくりと好ましくは停止させ）、腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度ゆっくりと、好ましくは停止させ）、ある程度、腫瘍の成長を阻害し、及び/又は、ある程度癌に伴う症状の一又は複数の症状を緩和する。薬が既存の癌細胞の成長を防ぐか及び／又は死滅させることができる程度に、それは細胞増殖抑制性及び／又は細胞傷害性であり得る。一実施態様では、治療上有効な量は、増殖阻害量である。別の実施態様では、治療的有効量は患者の生存期間を延長させるする量である。別の実施態様では、治療的有効量は患者の無増悪生存を改善する量である。本明細書で使用される「無増悪生存（ＰＦＳ）」とは、治療の間及びその後に、治療担当医師または治験責任医師の評価によると、患者の病気は悪化しない、すなわち進行しない時間の長さを指す。
「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。典型的には、しかし必ずではないが、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に患者に使用されるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、及びＬｕの放射性同位元素)、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞毒性剤を以下に記載する。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標登録))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール(ドロナビロール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標))；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標)、ＣＰＴ−１１(イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAngew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標)（モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidainine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ＥＬＩＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(ＴＡＸＯＬ(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, シャンバーグ、イリノイ州)及びドセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標)、Rhome-Poulene Rorer, Antony, France)；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン、及びカルボプラチン；ビンブラスチン(ＶＥＬＢＡＮ(登録商標))；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、オキサリプラチン、ロイコボビン、ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン（novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）)；上述したものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体、並びに、上記のうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略称)、及びＦＯＬＦＯＸ(５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン(ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ)を用いる治療計画の略称)が含まれる。追加の化学療法剤は、メイタンシノイド（ＤＭ１など）、例えばアウリスタチン（auristatins）ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ、などの抗体薬物結合体として有用な細胞傷害性薬剤が含まれる。
本明細書中に定義される化学療法剤には、癌の成長を促しうるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働く、「抗ホルモン剤」が含まれ、しばしば全身性の、又は全身治療の形態であってもよい。それらはそれ自体がホルモンであってよい。例として、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(ＳＥＲＭ)を含み、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標)トレミフェン；抗プロゲステロン、エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）；卵巣を抑制又は活動停止することに機能する薬剤、例えば、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプトレリン（tripterelin）などの黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、フルタミド（flutamide）、ニルタミド（nilutamide）、ビカルタミド（bicalutamide）などの他の抗アンドロゲン；及び副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標)酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標)ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標)レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標)アナストロゾールを含む。更に、化学療法剤のその定義では、ビスフォスフォネートを含み、例えば、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート、又はＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネート、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、及び上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）及びＶＡＸＩＤ（登録商標）などのワクチン、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１インヒビター、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、ラパチニブジトシラート（またＧＷ５７２０１６として知られているのＥｒｂＢ−２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）、及び上記何れかの薬学的に許容可能な塩類、酸類及び誘導体類を含む。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の成長及び／又は増殖を阻害する化合物又は組成物を意味する。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばアントラサイクリン系抗生物質ドキソルビシン（(8S-シス)-10-[(3-アミノ-2,3,6-トリデオキ-α-L-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-7,8,9,10-テトラヒドロ-6,8,11-トリヒドロキシル-8-(ヒドロキシアセチル)-1-メトキシ-5,12-ナフタセンジオン)、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael,編, 第一章, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」,Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類(パクリタキセル及びドセタキセル)は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ブリストル−マイヤー スクウィブ)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
本明細書において使用される用語「患者」は、任意の一動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、及びヒト以外の霊長類いった非ヒト哺乳動物を含む）を意味する。最も好ましくは、本明細書の患者はヒトである。
本明細書中における「被験体」は、血管新生疾患の１つ以上の徴候、症状又は他の指標を経験しているか又は経験した治療の資格のある患者を含む、任意の単一のヒト被験体である。被験体として含まれると意図されるのは、疾患の臨床的兆候を見せていない臨床研究臨床試験に関与している任意の被験体、又は、疫学研究に関与している被験体、又はコントロールとして一度使用された被験体である。被験体は、以前は抗癌剤で治療されたか、又はそのように治療されていない場合があり得る。被験体は、本明細書の治療が開始されるとき、使用されている追加の薬剤に対してナイーブである可能性があり、すなわち、「ベースライン」で（すなわち、本明細書中の治療における抗癌剤の最初の用量の投与前の設定時点において、例えば、治療が開始される前に被験体を検診する日に）、被験体は、例えば、抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性薬剤で以前に治療されていない可能性がある。このような「ナイーブ」な被験者は、一般的に、追加の薬剤による治療の候補と見なされる。
「薬学的製剤」なる用語は、医薬の生物学的活性を有効にする形態で存在し、製剤を投与する被験体にとって許容できない毒性がある他の成分を含まない無菌の調製物を指す。
「無菌の」製剤は、防腐性であるか、又は生きているすべての微生物及びそれらの胞子を含まない。
「パッケージ挿入物」という用語は、効能、用法、用量、投与、禁忌、そのパッケージ製品と組み合わされる他の治療製品、及び／又は治療製品又は医薬の使用に関する警告についての情報を含む、治療製品又は医薬の商業的包装に慣習的に含まれた指示書を指す。
「キット」は、少なくとも一の試薬、例えば、血管新生障害の治療のための医薬、又は本発明のバイオマーカー遺伝子又はタンパク質を特異的に検出するためのプローブを含む任意の製造品(例えば、パッケージ又は容器)である。製造品は、本発明の方法を行うためのユニットとして宣伝され、流通され、又は市販されることが好ましい。
薬剤に対する非応答のために、一又は複数の医薬による以前又は現在の治療から「毒性の臨床的に容認できないほど高いレベル」を経験した患者は、経験豊かな臨床医により重大であると見なされたそれに関連する負の副作用又は有害事象、例えば、重篤な感染症、うっ血性心不全、脱髄（多発性硬化症につながる）、重要な過敏症、神経病理学的事象、高度の自己免疫、子宮内膜癌、非ホジキンリンパ腫、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌などの癌、又は黒色腫、結核（ＴＢ）などを経験する。
「負の副作用のリスクを軽減する」により、以前に投与した薬剤により同じ患者又は他の患者の治療に起因する観察されたリスクよりも低い程度で、本明細書のアンタゴニストによる治療に起因する副作用のリスクを減らすことを意味する。そのような副作用は、毒性に関する上述したものを含み、好ましくは感染症、癌、心不全、又は脱髄である。
「相関」又は「相関する」は、任意の方法で、第一の分析又はプロトコルの成績及び／又は結果を、第二の分析又はプロトコルの成績及び／又は結果と比較することを意味する。例えば、第二のプロトコルを行う際に第一の分析又はプロトコルの結果を用いてもよいし、及び／又は第一の分析又はプロトコルの結果を用いて、第二の分析又はプロトコルを行うかどうかを決定してもよい。遺伝子発現分析又はプロトコルの実施態様に関し、遺伝子発現分析又はプロトコルの結果を用いて、特定の治療投薬計画を実行するかどうかを決定してもよい。本明細書の様々な実施態様に関して、抗ＶＥＧＦ抗体などの抗癌剤を使用して、特定の治療計画を実行すべきかどうかを判断するために、分析アッセイの結果を用いても良い。
ＩＩＩ．方法
本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニストを含む抗癌療法による治療の利益を受ける可能性のある患者を同定するための方法であって、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法による治療に対して、癌に罹患した患者の反応を予測する方法、癌患者が、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法からの利益を示すであろう可能性を決定するための方法、及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法の治療的有効性を最適化するための方法を提供する。
その方法は患者由来のサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の発現レベルを決定することを含み、患者由来のサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルが基準レベルかそれを上回るレベルは、患者がＶＥＧＦアンタゴニストを含む抗癌治療による治療からの利益を受ける可能性があり、患者が抗癌治療法から利益を受ける可能性が増大していること、又は患者が抗癌治療法による治療に応答する可能性が高くなること示す。幾つかの実施態様にて、本方法はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法を患者に投与することを更に含む。
本発明は、患者の癌を治療するための方法を更に提供する。本方法は、患者から得られたサンプルが、基準レベルかそれを上回るレベルのＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０レベルを有することを決定し、前記患者にＶＥＧＦアンタゴニストを含む抗癌治療法の有効量を投与し、それによって癌が治療されることを含む。幾つかの実施態様において、本方法は、患者に追加の薬剤（例えば、第二、第三、又は第四の薬剤）を投与することを更に含む。
Ａ．検出方法
開示された方法及びアッセイは、患者の治療のために適切又は効果的な治療法を評価する上で有用なデータ及び情報を入手ための便利で効率的で潜在的に費用対効果の高い手段を提供する。例えば、本発明の方法によれば、患者は、ＶＥＧＦアンタゴニストを含む抗癌療法による治療前に血液サンプルを提供することができ、サンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルが決定され、それぞれ基準サンプルにおけるＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルに対して、又は所定の基準値に対して比較することができる。ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルが増大した患者が、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストを含む抗癌治療法に応答する可能性がある患者として同定される。本方法は、タンパク質発現を検出するアッセイ（例えば、酵素免疫測定法）及び適切な活性を検出する生化学的アッセイを含む様々なアッセイ形態で行うことができる。サンプル中のそのようなバイオマーカーの発現の定量又はその存在は、サンプルを提供する患者がＶＥＧＦアンタゴニストの生物学的影響に感受性であることを予測する。典型的には、患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の発現レベルが基準レベルかそれを上回ることは、患者がＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に応答するか又は感受性であることを示す。
特に診断検査及び治療薬による治療の適用に関する医学分野の当業者は、生物学的システムには若干の多様性があり、常に完全に予想可能ではなく、従って、多くの優れた診断検査又は治療薬が時には効果が無いということを理解するであろう。従って、個々の患者の治療の最も適切な方針を、検査結果、患者の病態及び既往歴、及び彼又は彼女自身の経験に基づいて決定するのは、最終的には主治医の判断次第である。例えば、診断検査からのデータ、又は他の判断基準からのデータに基づいて、特に、他の自明な治療選択肢の全て又は大半が失敗した場合に、又は別の治療とともに与えられたときにかなりの相乗効果が予想される場合には、患者がＶＥＧＦアンタゴニストに特に感受性であると予測されないときでさえ、ＶＥＧＦアンタゴニストで患者を治療することを選択するであろう場面さえあり得る。
更なる実施態様において、本発明は、サンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルを評価すること；及びＶＥＧＦアンタゴニストによる阻害に対する患者の感受性を予測することを含む、ＶＥＧＦアンタゴニストを含む抗癌治療法による治療に対する患者の感受性を予測する方法、又はＶＥＧＦアンタゴニストを含む抗癌治療法による治療に対して有効に応答するであろうかを予測する方法を提供し、ここでＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の発現レベルが基準レベルか又はそれを上回ることは、ＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に対する有効な応答に対する患者の高度な感受性と相関している。
サンプルは、結腸直腸癌、神経膠芽腫、腎癌、卵巣癌、乳癌（例えば、局所進行、再発または転移性ＨＥＲ−２陰性乳癌を含む）、膵臓癌（例えば、転移性膵臓癌を含む）、胃癌、肺癌を含む癌に罹患していることが疑われるか又は癌に罹患していると診断され、従って治療を必要とする可能性がある患者から、又は任意の疾患を有していると疑われない正常個体から採取され得る。マーカー発現の評価のために、患者のサンプル、例えば細胞を含むもの、又はこれらの細胞により産生されるタンパク質又は核酸などが本発明の方法で使用され得る。この発明の方法において、バイオマーカーのレベルは、サンプル中のマーカーの量（例えば絶対量又は濃度）を評価することにより決定され、好ましくは検出可能なレベルのバイオマーカーを含む体液又は排泄物中で評価することができる。本発明における試料として有用な体液又は分泌液は、例えば、血液、リンパ液、喀痰、腹水、又は任意の他の分泌液又はその誘導体を含む。血液という単語は、全血、血漿、血清、又は血液の任意の誘導体を含むことを意味する。そうした体液又は排泄物中のバイオマーカーの評価は、時には侵襲的サンプリング法が不適当又は不便である状況では好ましい場合がある。しかし、本明細書で検査されるサンプルは、好ましくは血液、最も好ましくは血漿である。一実施態様では、サンプルは、ＥＤＴＡ−血漿である。一実施態様では、サンプルは、クエン酸塩−血漿である。
サンプルは凍結され、新鮮であり、固定され（例えば、ホルマリン固定）、遠心分離され、及び／又は包埋 され（例えば、パラフィン包埋 ）るなどであり得る。細胞試料は、サンプル中のマーカーの量を評価する前に、もちろん、よく知られている回収後の調製及び保存技術（例えば、核酸及び／又はタンパク質抽出、固定、保存、凍結、限外ろ過、濃縮、蒸発、遠心分離等）に供することができる。同様に、生検は、回収後の調製及び保存技術、例えば、固定化を施してもよい。
Ａ．ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の検出
ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０タンパク質は当該技術分野で公知の任意の方法を用いて検出することができる。例えば、哺乳動物由来の組織又は細胞サンプルは、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ法等を用いてタンパク質について都合良くアッセイすることができる。上掲技術の適用における指針を与える多くの参考文献が利用可能である(Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); 及びZola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques,頁147-1 58 (CRC Press, Inc., 1987))。
参照がＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の検出又はレベルに対してなされる場合、このことは両方の分子の合計が、例えばＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の両方を検出するアッセイを用いて測定されることを意味する。ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の両方の分子を検出するアッセイは、例えば、対応する他の形態に対して（すなわち、それぞれもしＶＥＧＦ１１０がより良好に認識される場合、ＶＥＧＦ１２１に対して、又はもしＶＥＧＦ１２１がより良好に認識される場合、ＶＥＧＦ１１０に対して）感受性をもっているアッセイを含む。ある実施態様において、そのアッセイは、対応する他の形態に対する感受性が少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％又はそれ以上を有する。一実施態様において、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の両方が本質的に同じ感受性で測定される。
ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０タンパク質の検出に関して、様々なアッセイが利用可能である。例えば、サンプルは（例えば、サンドイッチアッセイにおいて）抗体又は抗体の組み合わせと優先的に接触され得、又は、長い天然に生じるＶＥＧＦ−ＡアイソフォームであるＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９などのそれぞれと比較した場合、短いＶＥＧＦ−ＡアイソフォームであるＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のそれぞれに特異的に結合する。好ましくは、長いアイソフォームのＶＥＧＦ１６５と比較した場合、短いアイソフォームが、少なくとも３倍高い感受性で検出される。一実施態様において、ＶＥＧＦ１６５と比較した場合、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０に対する少なくとも３倍高い感受性を有する抗体が使用される。ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０に対するその少なくとも３倍高い感受性は、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のそれぞれ（全アイソフォームについて純度がＳＤＳページにより少なくとも９０％で濃度はＯＤ２８０ｎｍで測定）を同一試薬を用いて比較することによって評価される。この比較においてＶＥＧＦ１６５について得られたシグナルがＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のそれぞれで得られたシグナルより小さいか又はわずか３分の一である場合、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の両方がＶＥＧＦ１６５の少なくとも３倍高い感受性で検出される。また、短いアイソフォームに対する感受性は、長いアイソフォームと比較した場合、特にＶＥＧＦ１６５と比較した場合、少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍又は９倍高いことが好まれる。
一の好ましい実施態様において、短いアイソフォームのＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の両方が特異的に検出される。そのような特異的検出は、例えば、もし抗体、特にモノクローナル抗体が使用され採用される場合に可能である。例えば、ＶＥＧＦ１２１に特異的に結合する一抗体及びＶＥＧＦ１１０に特異的に結合する一抗体を使用することが可能である。そのようなＶＥＧＦ１２１に特異的抗体は、ＶＥＧＦ１２１中のエキソン４及び８を連結することにより生成する配列に例えば結合することができ、及びそのようなＶＥＧＦ１１０に特異的抗体は、ＶＥＧＦ１１０の遊離Ｃ末端に例えば結合することができる。
ＶＥＧＦ１２１に対する（モノクローナル）抗体は、ＶＥＧＦ１２１中のエキソン４及び８をそれぞれ連結することにより生成する配列に例えば結合することができ、長いＶＥＧＦアイソフォームの１６５及び１８９のそれぞれに含まれるアミノ酸配列には結合しないであろうが、その理由は、その中に別のアミノ酸配列が、エキソン４及びエキソン７の連結及びエキソン４及びエキソン５の連結のそれぞれに起因して存在するためである。もし使用される抗体が、エキソン４及び８を連結することにより生成する配列を含まないアイソフォーム、例えばＶＥＧＦ１６５と１０％未満の交差反応性を示す場合、上記の意味でのＶＥＧＦ１２１への特異的結合が認識されている。また、交差反応性が、エキソン４及び８を連結することにより生成する配列を含まないＶＥＧＦアイソフォーム、例えばＶＥＧＦ１６５について５％、４％、３％、２％及び１％未満であろうことが好まれる。
短いＶＥＧＦアイソフォームのＶＥＧＦ１２１と結合するだけの適切な特異的抗体は、標準的な手順に従って得ることができる。通常、ＶＥＧＦ１２１のアミノ酸１１５のＣ末端及びＮ末端のそれぞれのアミノ酸を含む、少なくとも５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸を表すか又は含むペプチドが合成され、必要に応じて担体に結合させ、免疫化に用いられる。好ましくは、このようなペプチドは、長さが少なくとも６個のアミノ酸であり、少なくともＶＥＧＦ１２１のアミノ酸の１１５及び１１６を含むであろう。また、それは、ＶＥＧＦ１２１の少なくともアミノ酸１１４、１１５、１１６及び１１７を含んでなることが好ましい。当業者には理解されるように、ＶＥＧＦ１２１のアミノ酸１１５及び１１６の間のエキソンジャンクションのＮ末端及びＣ末端の例えば３、４、又はそれ以上のアミノ酸を含む長いペプチドもまたＶＥＧＦ１２１に特異的に結合する抗体を得るために使用することができる。
ＶＥＧＦ１１０の特異的検出は、もし、ＶＥＧＦ１１０の遊離Ｃ末端に結合する抗体、特にモノクローナル抗体が使用され採用される場合に例えば可能である。そうしたＶＥＧＦ１１０抗Ｃ末端抗体は、長いポリペプチド鎖の一部としてアミノ酸１１０を含む任意のＶＥＧＦ−Ａアイソフォームに結合せず、又は例えばアミノ酸１０９が終端である短いＶＥＧＦ−Ａ断片に結合しない。上掲の意味でのＶＥＧＦ１１０への特異的結合は、使用される抗体がそのＣ末端にアミノ酸１１０を有しないＶＥＧＦの短い断片と１０％未満の交差反応性を示し、及び遊離Ｃ末端アミノ酸１１０を持たないＶＥＧＦ−Ａアイソフォームと１０％未満の交差反応性を示す場合に認識される。また、遊離Ｃ末端アミノ酸１１０を有しないＶＥＧＦ及びＶＥＧＦアイソフォームの短い断片の両方に、５％、４％、３％、２％及び１％未満のそれぞれであることが望まれる。
短いＶＥＧＦ開裂産物ＶＥＧＦ１１０と結合するだけの適切な特異的抗体は、標準的な手順に従って得ることができる。通常、ＶＥＧＦ１１０Ｃ末端の最も少なくとも４、５、６、７、８、９又はそれ以上のアミノ酸を表すか又は含むペプチドが合成され、必要に応じて担体に結合させ、免疫化に用いられる。特異的ポリクローナル抗体は、適切な免疫吸着工程によって得ることができる。モノクローナル抗体はＶＥＧＦ１１０との反応性及び適切な低い交差反応性について容易スクリーニングすることができる。ＶＥＧＦ１１０特異的抗体に関して低い交差反応性は、ＶＥＧＦ１１０の短い断片（例えば、ＶＥＧＦ１１０のＣ末端アミノ酸を欠損）及び、ＶＥＧＦ１１０の遊離Ｃ末端アミノ酸を持たないＶＥＧＦ−Ａアイソフォームの両方について評価することができる。
様々な測定方法が問題となっており、例えば、抗体−ＶＥＧＦ１２１又は抗体−ＶＥＧＦ１１０の複合体がそれぞれ形成されるのに十分な条件下で、サンプルがＶＥＧＦ１２１に特異的抗体及びＶＥＧＦ１１０に特異的抗体と接触され得、その後これらの複合体の両方が検出される。ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０タンパク質の存在は、例えば、血漿または血清を含む広範囲の組織および試料をアッセイするための、ウェスタンブロッティング法（免疫沈降の有無にかかわらず）、２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、免疫沈降法、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリー法、およびＥＬＩＳＡ法などの多くの方法で検出することができる。このようなアッセイ形式を使用する広範囲のイムノアッセイ技術が利用可能であり、例えば、米国特許第４０１６０４３号、第４４２４２７９号及び第４０１８６５３号を参照。これらは、非競合型の単一部位及び二部位又は「サンドイッチ」アッセイ、並びに従来の競合結合アッセイの両方が含まれる。これらのアッセイはまた、標的バイオマーカーに対する標識抗体の直接結合を含む。
サンドイッチアッセイは最も便利で一般的に使用されるアッセイの一つである。サンドイッチアッセイ技術の多くの変法が存在し、全てが本発明に包含されることが意図される。簡潔には、典型的なフォワードアッセイ（ｆｏｒｗａｒｄ ａｓｓａｙ）にて、非標識抗体が固体基板上に固定化され、試験されるサンプルを結合分子と接触させる。この捕捉抗体の固定化は、固相への直接吸着によるか、又は例えば特異的結合対、例えばストレプトアビジン−ビオチン結合対を介して間接的であって良い。好ましくは、固定された抗体は、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のそれぞれ両方を結合するであろう。抗体−抗原複合体の形成を可能にするのに十分な時間のインキュベーションの適切な時間後、次いで検出可能なシグナルを生成する能力のあるレポーター分子で標識された抗原に特異的な第二抗体（すなわちＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１１０のそれぞれ）を添加し、インキュベートし、抗体−抗原標識化抗体の別の複合体の形成に十分な時間をかけた。あらゆる未反応物質が洗い流され、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の存在が、レポーター分子によって生成されたシグナルを観察することにより決定される。結果は、可視信号の単純な観察により定性的であって良く、又はバイオマーカーの既知量を含む対照サンプルと比較することにより定量され得る。代わりのセットアップにおいて、ＶＥＧＦ１２１に特異的な抗体とＶＥＧＦ１１０に特異的な抗体のそれぞれが固定化され、必要に応じてレポーター分子を運ぶＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の両方に結合する抗体が、標的分子を検出するために用いられ得る。
フォワードアッセイにおける変法には、サンプル及び標識抗体の両方が結合抗体に同時に添加される同時アッセイが含まれる。これらの技術は、任意の少数の変法を含めて、当業者に良く知られている。典型的なフォワードサンドイッチアッセイにおいて、第１の抗体は固体表面に共有結合的又は受動的に結合している。固体表面は、典型的にはガラス又はポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーであるセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、又はイムノアッセイを行うのに適した任意の他の表面の形態であってもよい。結合プロセスは、当技術分野でよく知られており、一般に架橋共有結合または物理的吸着からなり、ポリマー-抗体複合体は、試験サンプルの調製のために洗浄される。次いで試験すべきサンプルのアリコートが固相複合体に添加され、第一又は捕獲抗体とその対応する抗原の間の結合を可能にするために、十分な期間（例えば、２〜４０分間又はより都合良い場合一晩）かつ適切な条件下（例えば２５℃から３２℃の間を含むなど例えば室温から４０℃）でインキュベートされる。インキュベーション期間に続いて、第一抗体又は捕獲抗体及びそこに結合した抗原が洗浄され、抗原上の他のエピトープに結合する第二抗体又は標識化抗体とともにインキュベートした。第二の抗体はレポーター分子に連結され、それは第一抗体と目的の抗原の複合体に対する第二抗体の結合を示すために用いられる。
代わりの競合法は、ＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１１０を固相に固定化し、その後、固定化した標的分子をサンプルと一緒に、レポーター分子で標識されたか又はされていなくても良いＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１１０のそれぞれに対して特異的な抗体に曝露することを含む。標的の量とレポーター分子シグナルの強さに応じて、標的分子による競合は、このような標識抗体を介して直接検出することができる。あるいは、一次抗体に特異的な二次標識抗体が、標的−一次抗体複合体にさらされ、標的−一次抗体−二次抗体の三次複合体を形成する。複合体は、レポーター分子によって放出されるシグナルにより検出される。本明細書中で用いられる「レポーター分子」は、その化学的性質によって、抗原と結合した抗体の検出を可能とし分析的に同定可能なシグナルを提供する分子を意味する。この種のアッセイにおいて最も一般的に用いられるレポーター分子は、酵素、蛍光体又は分子を含有する放射性核種（すなわち放射性同位体）および化学発光分子である。
酵素イムノアッセイの場合、一般にグルタールアルデヒド又は過ヨウ素酸塩によって、酵素を二次抗体にコンジュゲートさせる。しかしながら、容易に認識されるように、当業者に容易に利用可能である多種多様な異なるコンジュゲート技術が存在する。一般的に用いられる酵素には、とりわけ、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む。特定の酵素と共に用いられる基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解の際の検出可能な色の変化の産生で選択する。適切な酵素の例として、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼを含む。また、上記の発色性基質よりむしろ蛍光性産物を産生する蛍光性基質を用いることができる。すべての例において、酵素標識抗体を一次抗体-分子マーカー複合体に加えて、結合させ、次いで過剰な試薬を洗い流す。次いで、適当な基質を含有する溶液を抗体-抗原-抗体の複合体に加える。基質は二次抗体と結合した酵素と反応して、通常は分光測定法により更に定量化され得る定性的な可視化シグナルを生じ、サンプル中に存在するＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１１０の量の指標を与える。あるいは、フルオレセイン及びローダミンなどの蛍光性化合物を、抗体の結合能を変化させることなく抗体に化学的に結合させてもよい。特定の波長の光を照射することにより活性化されると、蛍光色素標識抗体はその光エネルギーを吸収し、それによリその分子において励起状態が誘発され、続いて光学顕微鏡を用いて目視で検出可能な特徴的な色で光が放射される。ＥＩＡでは、蛍光標識抗体は、一次抗体−分子マーカー複合体に結合できる。結合していない試薬を洗い落とした後に、残りの三次複合体を適当な波長の光に曝すと、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の存在を示す蛍光発光が観察される。免疫蛍光法およびＥＩＡ技術は何れも、当該技術分野で良く確立されたものである。しかしながら、放射性同位体、化学発光性分子または生物発光性分子などの他のレポーター分子も用いられてもよい。ＶＥＧＦを検出するための免疫アッセイは、例えば、米国特許第６８５５５０８号、及び第７５４１１６０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０２５５５１５号に記載されている。ＶＥＧＦを検出するための適切なプラットフォームは、例えば欧州特許第０９３９３１９号及び欧州特許第１６１０１２９号に記載されている。
ある実施態様において、対象のＶＥＧＦアイソフォームからのｍＲＮＡ又はＤＮＡが、ノーザン、ドットブロット、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、アレイハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイを用いて、又はＤＮＡマイクロアレイスナップショットを含む市販のＤＮＡマイクロアレイを用いて検出される。例えば、定量的ＰＣＲアッセイなどのリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイが当該分野で周知である。本発明の例示的な実施態様では、生物学的試料中の対象のＶＥＧＦアイソフォームからｍＲＮＡを検出する方法は、少なくとも一のプライマーを用いて逆転写によってサンプルからｃＤＮＡを生産し；そのようにして生産されるｃＤＮＡを増幅し；増幅されたｃＤＮＡの存在を検出することを含む。また、そのような方法は、（例えばアクチンファミリーメンバーのような「ハウスキーピング」遺伝子の比較コントロールｍＲＮＡ配列のレベルを同時に調べることによって）生物学的試料中のｍＲＮＡのレベルを決定することを可能にする一又は複数の工程を含みうる。場合によっては、増幅されたｃＤＮＡの配列を決定することができる。ノーザンブロット分析は、当該技術分野で周知の従来技術であり、例えば、Molecular Cloning, a Laboratory Manual, second edition, 1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500に記載されている。遺伝子の状態および遺伝子産物を評価するための典型的なプロトコルは、例えば、Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, ユニット２（ノーザンブロッティング), ４（サザンブロッティング），１５（イムノブロッティング）及び１８（ＰＣＲ分析）に見いだされる。
Ｂ．キット
ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の検出に使用のため、キット又は製造品もまた本発明により与えられる。そのようなキットは、被験体が、ＶＥＧＦアンタゴニストを含む抗癌治療に効果的に応答するかどうかを決定するために使用できる。これらのキットは、バイアル、チューブ等の一又は複数の容器手段を閉じ込めて収容するように区画化された運搬手段を含み、各容器手段は本方法で使用される別個の要素の一つを含む。例えば、容器手段の一つは、検出可能に標識された又は標識が可能なプローブを含みうる。そのようなプローブは、それぞれＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１１０タンパク質又はメッセージに特異的な抗体又はポリヌクレオチドでありうる。キットが核酸ハイブリダイゼーションを利用して標的核酸を検出する場合、キットは、標的核酸配列を増幅するためのヌクレオチドを収容する容器、及び／又はレポーター手段、例えばビオチン結合タンパク質、例えばアビジン又はストレプトアビジンを、レセプター分子、例えば酵素、蛍光、又は放射性同位元素標識に結合して含有する容器を有しうる。
そのようなキットは、上述の容器、及びバッファー、希釈液、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書と共にパッケージ挿入物を含む、商業用及び使用者の観点から望ましい物質を含む、一又は複数の他の容器を典型的には含むであろう。ラベルは、組成物が特定の用途に使用されることを示すように容器に存在し、またインビボ又はインビトロ使用のための指示、例えば上述したものを示しうる。
本発明のキットは多くの実施態様を有する。典型的な実施態様は、容器、該容器上のラベル、及び該容器に収容された組成物を含むキットであり、ここで組成物は、短いＶＥＧＦ−ＡアイソフォームＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０又はＶＥＧＦ１２１に特異的に結合する抗体、及びＶＥＧＦ１１０に特異的に結合する抗体をそれぞれ含み、該容器上のラベルは、組成物が試料中のＶＥＧＦ１２１及び／又はＶＥＧＦ１１０の存在を評価するために使用可能であることを示し、キットが、特定の試料タイプ中におけるＶＥＧＦ１２１及び／又はＶＥＧＦ１１０の存在を評価するために抗体を使用することについての使用説明書を含む。本キットは、試料を調製し、試料に抗体を適用するための使用説明書と材料のセットを更に含みうる。本キットは、一次及び二次抗体の両方を含み、ここでは該二次抗体はラベル、例えば酵素的標識にコンジュゲートしている。
キットの他の任意の成分には、一又は複数のバッファー（例えば、ブロッキングバッファー、洗浄バッファー、基質バッファー等）、他の試薬、例えば酵素標識により化学的に改変される基質（例えば色素原）、エピトープ回収液、コントロール試料（正及び／又は負のコントロール）、コントロールスライド等が含まれる。またキットには、キットを使用して得られる結果を解釈するための説明書を含めることもできる。
抗体ベースキットについての更なる特定の実施態様では、キットは、例えば、（１）ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０に結合する第一の抗体（例えば、固体支持体に結合する又は固体支持体に結合することが可能）；（２）短いＶＥＧＦ−ＡアイソフォームＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０にそれぞれ優先的に結合する第二の異なる抗体を含みうる。好ましくは、後者の抗体は同じレポーター分子で標識される。もちろん、そうしたアッセイをデザインする場合に、第一を第二抗体に交換することも可能であり逆も可能である。
更なる具体的な実施態様において、抗体ベースキットについて、例えば：（１）ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０に結合する第一抗体（例えば、固体支持体に結合する又は固体支持体に結合することが可能）；（２）ＶＥＧＦ１２１に特異的に結合する第二の異なる抗体及び（３）ＶＥＧＦ１１０に特異的に結合する第三の異なる抗体を含み得る。好ましくは、後者の２つは両方とも同じレポーター分子で標識される。
Ｂ．治療の方法
本発明の幾つかの方法は、基準サンプルと比較して、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルが増加した患者にＶＥＧＦアンタゴニストを投与することを含む。本発明の他の実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストを含む抗癌治療法で患者を治療する方法を提供する。投与計画は、最適な所望の反応（例えば、治療応答）を提供するように調整することができる。例えば、一用量を投与することができ、幾つかの分割用量を時間をかけて投与してもよいし、又は治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例して減少させ又は増加させることができる。
当該技術分野における通常の技術を有する医師は、抗癌剤の特定のタイプのような要因に依存して、必要な薬学的組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。例えば、医師は、薬学的組成物で用いられる抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体などの抗癌剤の投与量を、望ましい治療効果を達成するために必要な用量よりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増加させることができる。与えられた用量の有効性又はアンタゴニストの治療計画は、例えば、有効性の標準的な指標を用いて、患者の兆候又は症状を評価することによって、決定することができる。
更に別の実施態様では、被験体は、少なくとも二回、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体等の同一の抗癌剤で治療される。従って、初回及び第二回目のアンタゴニストの曝露は、同じアンタゴニストによるのが好ましく、及びより好ましくはアンタゴニストの曝露の全ては、同じアンタゴニストにより、すなわち、最初の２回の曝露、及び好ましくは全ての曝露に対する治療は、一種類の型の抗癌剤により、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦに結合するアンタゴニストにより、例えば全てはベバシズマブによる。
本明細書に記載の全ての発明方法においては、抗癌剤（例えばＶＥＧＦに結合する抗体など）は、ネイキッド抗体など非結合型であって良く、又は更なる有効性のため、例えば半減期を向上するために、別の分子に結合されても良い。
本明細書における一つの好ましい抗癌剤は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体であり、好ましくはベバシズマブである。
別の実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）は被験体に投与する唯一の医薬である。
一実施態様では、アンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体であり、約１００ｍｇ又は４００ｍｇの投与量を毎週、２週間ごと、３週間ごと、又は４週間ごとに投与され、もしくは１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、又は２０ｍｇ／ｋｇの投与量を毎週、２週間ごと、３週間ごと、又は４週間ごとに投与される。投与量は注入などによる単回投与又は複数回の投与（例えば、２回又は３回の投与）で投与され得る。
更に別の態様において、本発明は、診断ステップの後に、癌と診断された被検体に抗癌剤（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）の投与を続けるかどうかを決定する方法を提供し、該方法は、最初にアンタゴニストを投与した後に、Ｘ線及び／又はＭＲＩなどのイメージング技術を用いて、腫瘍の大きさの縮小を測定することを含み、２回目にアンタゴニストを投与した後に、Ｘ線及び／又はＭＲＩなどのイメージング技術を用いて、腫瘍の大きさの縮小を測定することを含み、初回及び２回目の被検体における画像上の知見を比較し、もしそのスコアが初回よりも２回目で小さい場合には、アンタゴニストの投与を続行することを含む。
更に別の実施態様では、投与段階後に治療に対する患者の応答を試験し、その応答のレベルが血管新生疾患の治療に有効であることを決定するために、一段階が治療方法に含まれる。例えば、一段階は投与後のイメージング（Ｘ線及び／又はＭＲＩ）スコアを試験し、それを投与前に得た基準のイメージング結果と比較し、それが変化しているか、及びどの程度変化しているかを測定することにより、治療が効果的であるかを決定することを含む。この試験は、部分的又は完全な寛解の維持を確定するため、投与後に、定期に又は不定期に様々な時間間隔で繰り返され得る。
本発明の一実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体以外の医薬は、癌を治療するために被験体に投与されない。
本明細書のいずれかの方法では、抗癌剤は、付加的薬剤の有効量と組み合わせて投与され得る。適切な付加的薬剤は、例えば、抗リンパ管新生剤、抗血管新生剤、抗新生物剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞毒性剤、又はそれらの組み合わせを含む。
これらのすべての付加的薬剤は、第一の医薬とともにお互いに組み合わせるか又は単独で使用され得、本明細書で使用される「付加的薬剤」なる表現は、それがＶＥＧＦアンタゴニストに加えて唯一の医薬であることを意味しない。従って、付加的薬剤は単一薬剤である必要はなく、複数のそうした薬物を構成するか又は含み得る。
本明細書に記載のこれらの付加的薬剤は、一般的には本明細書の以上で使用されるのと同じ用量でかつ同じ投与経路によるか、又は従来用いられる投与量の約１％から９９％で使用される。仮にそうした付加的薬剤が使用される場合、好ましくは、第一の医薬が存在していなかった場合、それによって引き起こされる副作用を除去又は減少させるように、特に第一の医薬の初回投薬後の続く投薬におけるよりも低量で使用される。
付加的薬剤がアンタゴニストの曝露とともに効果的な量で投与される、本明細書に記載の再治療法において、付加的薬剤は例えば一回の曝露によるのみか又は複数の曝露によるかなど、任意の曝露で投与され得る。一実施態様において、付加的薬剤は、初回の曝露で投与される。その他の実施態様において、付加的薬剤は、初回及び２回目の曝露で投与される。更に他の実施態様では、付加的薬剤、全ての曝露で投与される。ステロイド等の初回曝露後に、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、及びシクロホスファミド等の副作用を持つ薬剤に対する被検体の曝露を減少させるように、そうした付加的薬剤の量は減少され又は除去されるのが望ましい。
付加的薬剤の併用投与は共投与（同時投与）を含み、別々の製剤か又は単一の薬学的製剤、及び何れかの順番による連続投与を用い、好ましくは両方（又は全て）の活性薬剤（医薬）が同時にその生物学的活性を発揮する期間がある。
抗癌治療法は、非経口、局所、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、及び/又は病巣内投与を含む任意の適当な手段によって投与される。非経口注入は、静脈内(ｉ.ｖ.)、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。髄腔内投与もまた考慮される。更に、抗癌剤は、例えば抗癌剤の用量を減少させつつ、パルス注入により、適切に投与することができる。好ましくは、投薬は、静脈内又は皮下に与えられ、より好ましくは静脈内注入で与えられる。
抗癌剤の複数の曝露が与えられる場合は、それぞれの曝露は同一か又は異なる投与手段を用いて与えられ得る。一実施態様では、各曝露は、静脈内投与によるものである。別の実施態様では、各暴露は皮下投与で与えられる。更に別の実施態様では、曝露は静脈内及び皮下投与の両方で与えられる。
一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体などの抗癌剤は静脈内プッシュ又はボーラス投与よりも遅い静脈内注入として投与される。例えば、プレドニゾロン又はメチルプレドニゾロン等のステロイド（例えば、約８０−１２０ｍｇの静脈内投与、より好ましくは約１００ｍｇの静脈内投与）が、抗ＶＥＧＦ抗体の任意の注入前の約３０分に投与される。抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、専用ラインを介して注入される。
抗ＶＥＧＦ抗体に対する複数投与量暴露の初回投与において、又は曝露は一投与量のみを含む場合の単回投与において、そうした注入は、好ましくは約５０ｍｇ／時間の速度で開始される。これは例えば約３０分ごとに約５０ｍｇ／時間の増分速度で最大で約４００ｍｇ／時間まで増大させることができる。しかしながら、もし被検体が注入に関連した反応を経験している場合には、注入速度は好ましくは、例えば現在の速度の半分に、例えば１００ｍｇ／時間から５０ｍｇ／時間に減少される。好ましくは抗ＶＥＧＦ抗体のそうした投与量の注入は（例えば、約１０００ｍｇの総投与量）、約２５５分（４時間１５分）で完結する。場合によっては、被検体はアセトアミノフェン／パラセタモール（例えば約１ｇ）の予防的治療及びジフェンヒドラミン塩酸（例えば、約５０ｍｇ又は類似薬の等価な投与量）を注入開始前の約３０分から６０分に口から受ける。
抗ＶＥＧＦ抗体の複数の注入（投与量）が、総曝露量を達成するために与えられる場合は、この注入の実施態様の２回目又はそれに続く抗ＶＥＧＦ抗体注入は、好ましくは、最初の注入よりも速い速度で、例えば約１００ｍｇ／時間で開始される。この速度は、例えば約３０分ごとに約１００ｍｇ／時間の増分で、最大４００ｍｇ／時間まで増大させることができる。注入に関連した反応を経験している被検体は、注入速度を好ましくは、例えば１００ｍｇ／時間から５０ｍｇ／時間に減少させる。好ましくは抗ＶＥＧＦ抗体のそうした第２回目又はそれに続く投与量の注入は（例えば、約１０００ｍｇの総投与量）、約１９５分（３時間１５分）で完結する。
好ましい実施態様では、抗癌剤は、抗ＶＥＧＦ抗体であり、約０．４から４グラムの用量で投与され、より好ましくは、抗体は、約一ヶ月の期間内に１回からに４回までの頻度で、０．４から１．３グラムの用量で投与される。更により好ましくは、投与量は約５００ｍｇから１．２ｍｇであり、他の実施態様では約７５０ｍｇから１．１グラムである。そのようなの態様では、アンタゴニストは、好ましくは２回から３回投与され、及び／又は約２週間から３週間の期間内に投与される。
１つの態様において、被検体は、癌を治療するために、以前に任意の薬剤（複数）を投与されていない。別の実施態様では、被験体又は患者は以前に癌を治療する1つ又は複数の医薬を投与されている。更なる実施態様では、被験体又は患者は以前に投与された医薬の１つ又は複数に対して応答はなかった。被験体が応答しないかもしれない薬剤としては、例えば、抗悪性腫瘍薬、化学療法剤、細胞傷害性剤、及び／又は増殖阻害剤が含まれる。より具体的には、被検体には応答しないような薬は抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦアンタゴニストが含まれ得る。更なる態様では、そうした抗癌剤は、抗体又はイムノアドヘシンを含み、被検体が以前には非応答性であった本発明による一つ又は複数の抗体又はイムノアドヘシンによる再治療が熟考される。
ＩＶ．抗癌剤による治療
ＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に最も応答し又は感受性のある患者集団が同定されると、単独で又は他の医薬との併用したＶＥＧＦアンタゴニストによる治療は、癌患者への治療上の利点をもたらす。例えば、そのような治療は、腫瘍の大きさ又は無増悪生存期間の減少を結果としてもたらし得る。更に、抗癌剤及び少なくとも一つの付加的薬剤の組み合わせによる治療は、好ましくは相加的、より好ましくは相乗的な（あるいは相加的より大きい）患者への治療効果を得る結果となる。好ましくは、この組み合わせ法において、付加的薬剤の少なくとも一回の投与及び抗癌剤の少なくとも一回の投与の間のタイミングは約１ヶ月以内、より好ましくは約２週間以内である。
抗癌剤に対する患者の応答可能性の診断後に、前記患者に抗癌剤の治療的有効量を投与する正確な方法は、主治医の裁量であることが医療分野における当業者によって理解されるであろう。投与量、他の薬剤との併用、タイミング及び投与の頻度などを含む投与方式は、このような抗癌剤に対する患者の応答可能性の診断、並びに患者の状態や病歴によって影響を受ける可能性がある。従って、障害と診断され、抗癌剤に対して比較的無反応であることが予測される患者でさえもなお、特に、抗癌剤に対する患者の応答を変えうる薬剤を含む他の薬剤と組み合わせて、それによる治療の恩恵を受ける可能性がある。
抗癌剤を含む組成物が調剤され、投薬され、良好な医療行為と一致した方式で投与されるであろう。この文脈において考慮すべき要因は、治療される疾患の特定の型、治療される疾患の哺乳動物、薬の送達部位、可能性のある副作用、アンタゴニストの型、投与方法、投与のスケジュール、及び医療従事者に知られている他の要因を含む。投与されるべき抗癌剤の有効量はそのような考え方に支配され得る。
一般的な提案として、投与量あたり非経口で投与される抗癌剤の有効量は、１回又は複数の投薬により、約２０ｍｇから約５０００ｍｇの範囲であろう。抗ＶＥＧＦ抗体などの抗体における例示的な投薬レジメンは、毎週、２週間ごと、３週間ごと又は４週間ごとに１００ｍｇ又は４００ｍｇを含み、あるいは、毎週、２週間ごと、３週間ごと又は４週間ごとに約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、又は２０ｍｇ／ｋｇの投与量が投与される。投与量は、注入などによる単回投与として、又は複数回投与（例えば、２回又は３回投与）として投与され得る。
上述したように、しかしながら、抗癌剤のこれらの提案された量は、治療の裁量に大きく依存する。適切な投与量及びスケジューリングを選択する上で重要な要因が、上に示されるように、得られた結果である。いくつかの実施態様において、抗癌剤はできるだけ最初の徴候、診断、所見、又は障害の発生に忠実に投与される。
抗癌剤は、非経口、局所、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、及び/又は病巣内投与を含む任意の適当な手段によって投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、腹腔、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。髄腔内投与もまた考慮される。更に、アンタゴニストは、例えばアンタゴニストの用量を減少させるパルス注入により、適切に投与され得る。最も好ましくは、投薬は静脈注射で与えられる。
上記のように、本明細書に記載の抗癌剤と共に、付加的薬剤を投与することができる。併用投与は、別々の調剤又は単一の薬学的製剤、及び何れかの順番の連続投与を用いた共投与を含み、好ましくは両方（又は全て）の活性剤が同時にその生物学的活性を発揮する期間がある。
上記のような従来の経路による抗癌剤の患者への投与の他に、本発明は遺伝子治療による投与を考察する。抗癌剤をコードする核酸のそのような投与は「抗癌剤の有効量を投与する」という表現に含まれる。細胞内抗体を産生する遺伝子治療の使用に関しては、例えば国際公開第１９９６／０７３２１号を参照。
核酸(場合によってはベクター内に含まれたもの)を患者の細胞に入れるために、インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は患者に直接、通常はアンタゴニストが必要とされている部位に注入される。エキソビボ処置では、患者の細胞を取り出し、核酸がこれらの単離された細胞に導入され、修飾された細胞が患者に直接に、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与される(米国特許第４８９２５３８号及び第５２８３１８７号参照)。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによって異なる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
現在好適なインビボでの核酸移入技術には、ウイルスベクター(アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルスなど)及び脂質ベースのシステム(遺伝子の脂質介在移入のために有用な脂質は例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)によるトランスフェクションが含まれる。場合によっては、標的細胞に特異的な薬剤、例えば標的細胞上の細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンドなどにより核酸供給源を提供するのが好ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関係する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の種類の細胞に対するキャプシドタンパク質ないしはその断片、循環への内部移行を起こすタンパク質に対する抗体、並びに、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を上げるタンパク質は、ターゲティングのため及び／又は取込を促すために用いられてもよい。レセプターが媒介するエンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)、及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)に記載されている。遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールは、例えばAnderson等, Science 256:808-813 (1992)及び国際公開第１９９３／２５６７３号に記載されている。
抗癌剤は、医薬の組み合わせ製剤で、又は抗癌特性を有する少なくとも１つの追加の化合物とともに、併用療法としての投与計画において組み合わせることができる。薬学的組合せ製剤又は投与計画の少なくとも一つの追加の化合物は、好ましくは互いに悪影響を及ぼさないようなＶＥＧＦアンタゴニスト組成物に対する相補的な活性を有する。
少なくとも一つの追加の化合物は、化学療法剤、細胞傷害剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、抗血管新生剤、抗リンパ管新生剤、及びそれらの組み合わせであり得る。このような分子は、意図する目的のために有効である量で組み合わせて適切に存在している。ＶＥＧＦアンタゴニストを含有する薬学的組成物（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）は、抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞毒性剤、又はそれらの組み合わせの治療的有効量を含み得る。
一態様では、第一の化合物は、抗ＶＥＧＦ抗体であり、少なくとも１つの追加の化合物は、抗ＶＥＧＦ抗体以外の治療用抗体である。一実施態様では、少なくとも１つの追加の化合物は癌細胞表面マーカーを結合する抗体である。一実施態様では、少なくとも一つの追加の化合物は、抗ＨＥＲ２抗体のトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、ジェネンテック・インク、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）である。一実施態様では、少なくとも一つの追加の化合物は、抗ＨＥＲ２抗体のペルツズマブ（オムニターグＴＭ、ジェネンテック・インク、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ、米国特許第６９４９２４５号参照）である。一実施態様では、少なくとも一つの追加の化合物は抗体であり（ネイキッド抗体ないしはＡＤＣ）、追加の抗体は、第２、第３、第４、第５、第６、又はそれ以上の抗体であり、第２、第３、第４、第５、第６、又はそれ以上の追加の抗体（ネイキッド抗体ないしはＡＤＣ）を組み合わせることが、血管形成性疾患の治療に効果的である。
本発明に従った他の治療的投薬計画は、限定されないが放射線療法及び／又は骨髄及び末しょう血液移植、及び／又は細胞障害剤、化学療法剤又は増殖阻害剤を含む、ＶＥＧＦアンタゴニスト抗癌剤の投与を含み得る。そうした実施態様の一つにおいて、化学療法剤は、例えば、シクロホスファミド、ヒドロキシダウノルビシン、アドリアマイシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン(オンコビンTM)、プレドニゾロン、ＣＨＯＰ、ＣＶＰないしはＣＯＰ、又は抗ＰＳＣＡ、抗ＨＥＲ２(例えばハーセプチン(登録商標)、オムニターグＴＭ)などの薬剤又は薬剤の組合せである。併用療法は同時又は連続的な投薬計画として投与されてもよい。逐次的に投与される場合、組合せは２以上の投与で投与されてもよい。組合せ投与には、別々の製剤又は単一の製薬的製剤を用いての同時投与や、いずれかの順序での連続投与が含まれ、このとき、両方(又はすべて)の活性剤が同時にその生物学的活性を及ぼす一定時間があるのが好ましい。
一実施態様では、抗ＶＥＧＦによる治療は、本明細書において同定される抗癌剤、及び異なる化学療法剤の混合物の同時投与を含む一又は複数の化学療法剤又は増殖阻害性剤の併用投与を伴う。化学療法剤には、タキサン(例えばパクリタキセル及びドセタキセル)及び／又はアントラサイクリン抗生物質が含まれる。このような化学療法剤のための調製や投薬計画は、製造業者の指示従って使われてもよいし、又は熟練した専門家によって経験的に決定されうる。このような化学療法の調製や投薬計画は、“Chemotherapy Service”, (1992)Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Mdにも記載される。
上記いずれかの同時に投与される薬剤の適切な用量は現在用いられている通りでもよいし、新規に同定される薬剤及び他の化学療法剤ないしは治療の組み合わされる作用(相乗)に応じて低くしてもよい。
併用療法により「相乗効果」を与えることがあり、「相乗的」、すなわち、一緒に用いた活性成分が別々に該化合物を用いて生じる作用の和よりも多い場合に得られる効果を証明し得る。活性成分が、（１）組み合わせた単位用量製剤において同時に処方され、投与されるか、又は同時に送達される場合、（２）別々の製剤として交互に又は同時に送達される場合、又は、（３）他の投薬計画による場合に、相乗効果が達成されうる。交互療法で送達される場合、例えば別々の注射器での異なる注入によって、化合物が順次投与されるか又は送達される場合に、相乗効果が達成されてもよい。一般に、交互療法の間、各々の活性成分の有効用量は順次、すなわち連続的に投与されるのに対して、併用療法では、２つ以上の活性成分の有効用量が一緒に投与される。
病気の予防又は治療のため、追加の治療剤の適切な投与量は、治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び追加の薬剤が予防又は治療の目的で投与されるのかどうか、以前の治療、患者の病歴及びＶＥＧＦアンタゴニスト及びその他の薬剤への応答、及び主治医の裁量に依存する。ＶＥＧＦアンタゴニスト及びその他の薬剤が一度に、又は一連の治療において患者に適切に投与される。ＶＥＧＦアンタゴニストは、通常、上記のように投与される。疾患の種類や重症度に応じて、追加剤の約２０ｍｇ／ｍ２から６００ｍｇ／ｍ２が、例えば、１回又は複数の別々の投与によるか、又は連続注入によるに関わらず、患者への投与における初回候補投与量である。上記の因子に依存して、典型的な毎日の投与量は、約２０ｍｇ／ｍ２、８５ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、１２５ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、５００ｍｇ／ｍ２かそれ以上かの範囲である可能性がある。数日間か又はより長きにわたる反復投与については、状況に応じて、病気の症状の所望の抑制がおきるまで、その治療が継続される。約２０ｍｇ／ｍ２、８５ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、１２５ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、５００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２（又はその組合わせ）の一回又は複数の投与量が患者に投与され得る。そうした投与量は断続的に投与される場合があり、例えば、毎週、又は２週間ごとに、３週間ごとに、４回，５回，又は６回（例えば、患者が追加の薬剤を約２回から約２０回まで、例えば約６回の投与量を受けるように）。最初の高い負荷投与量の後に１回又は複数の低投与量が投与されても良い。しかし、他の投与計画が有用である場合もある。この治療の進捗は従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
Ｖ．薬学的製剤
本発明にしたがって使用されるアンタゴニストの治療用製剤は、所望の純度を持つアンタゴニストを、任意で薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより、凍結乾燥又は水溶液の形態で保存のために調製される。製剤に関する一般的な情報については、Gilman et al.,(eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press；A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990), Mack Publishing Co., Eastori, Pennsylvania.；Avis et al., (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York；Lieberman et al.., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York；及びLieberman et al., (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York、Kenneth A. Walters (ed.) (2002) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119, Marcel Dekkerを参照のこと。
許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度においてレシピエントに非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
例示的な抗ＶＥＧＦ抗体製剤は、米国特許第６８８４８７９号に記載されている。ある実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、単回使用バイアル２５ｍｇ／ｍＬにて処方される。ある実施態様において、１００ｍｇの抗ＶＥＧＦ抗体が、米国薬局方による、１４０ｍｇのα，α−トレハロース二水和物、２３．２ｍｇリン酸ナトリウム（一塩基性、一水和物）、４．８ｍｇリン酸ナトリウム（二塩基性で無水）、１．６ｍｇポリソルベート２０、及び注射用の水に処方される。ある実施態様においては、４００ｍｇの抗ＶＥＧＦ抗体が、米国薬局方による、９６０ｍｇのα，α−トレハロース二水和物、９２．８ｍｇリン酸ナトリウム（一塩基性、一水和物）、１９．２ｍｇリン酸ナトリウム（二塩基性で無水）、６．４ｍｇポリソルベート２０、及び注射用の水に処方される。
皮下投与に適した凍結乾燥製剤は、例えば、米国特許第６２６７９５８(Andya et al.)において記述される。このような凍結乾燥製剤は適切な希釈液により高タンパク濃度に再編成され得、再構成された製剤は本明細書中において治療されるべき哺乳動物の皮下に投与され得る。
アンタゴニストの結晶化形態もまた考えられる。例えば米国特許公開公報第２００２／０１３６７１９（Ａ１）号(Shenoy et al.）を参照。
本明細書に記載の製剤はまた、二以上の活性化合物(上述したような付加的薬剤)、好適には互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。このような医薬の種類及び有効量は、例えば製剤中に存在するＶＥＧＦアンタゴニストの量及びタイプ、及び被検体の臨床上のパラメーターに依存する。このような付加的薬剤の好適なものは上述したとおりである。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばコロイド薬剤送達システム(例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルジョンにおいて、それぞれ、ヒドリキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル、及びポリ-(メチルメタアシレート)マイクロカプセルに封入されうる。このような技術は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
持続放出調製物が調製され得る。適切な持続放出調製物の例は、アンタゴニストを含む固体疎水性ポリマーの半透明マトリックスを含み、該マトリックスは、形成品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-ビニル酢酸塩、非分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。インビボ投与に使用される製剤は無菌でなくてはならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
ＶＩ．キット
ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の検出に使用のため、キット又は製造品もまた本発明により与えられる。そのようなキットは、癌に罹患した被験体が、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体）を含む抗癌剤治療に効果的に応答するかどうかを決定するために使用できる。これらのキットは、バイアル、チューブ等の一又は複数の容器手段を閉じ込めて収容するように区画化された運搬手段を含み、各容器手段は本方法で使用される別個の要素の一つを含む。例えば、容器手段の一は、ＶＥＧＦ１２１に特異的に結合する化合物を含み得、他の容器手段はＶＥＧＦ１１０に特異的に結合する化合物を含み得る。
そのようなキットは、上述の容器、及びバッファー、希釈液、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書と共にパッケージ挿入物を含む、商業用及び使用者の観点から望ましい物質を含む、一又は複数の他の容器を典型的には含むであろう。ラベルは、組成物が特定の用途に使用されることを示すように容器に存在し、またインビボ又はインビトロ使用のための指示、例えば上述したものを示しうる。
本発明のキットは多くの実施態様を有する。典型的な実施態様は、容器、前記容器上のラベル、及び前記容器内に収容される組成物を具備するキットであり、組成物はＶＥＧＦ１２１及び／又はＶＥＧＦ１１０に特異的に結合する化合物を含み、そして該容器のラベルは、組成物がＶＥＧＦ１２１及び／又はＶＥＧＦ１１０の検出に使用可能であることを示しており、そしてそのキットはＶＥＧＦ１２１及び／又はＶＥＧＦ１１０の検出のための化合物を使用するための使用説明書を含んでいる。本キットは、化合物を調製し使用するための使用説明書と材料のセットを更に含みうる。
キットの他の任意の組成物は一以上のバッファー（例えば、希釈バッファー）、担体（例えば、デキストラン、アルブミン）などの他の薬剤を含む。キットはまたキットを用いて得られた結果を解釈するための説明書を含めることができる。
以下の実施例は、説明するために提供されるが、本請求項に記載の発明を限定するものではない。
実施例１：
ＡＶＡＤＯ試験（ＢＯ１７７０８）において、未治療、局所的に進行、再発性又は転移性のＨＥＲ−２陰性乳癌に罹患した患者を、ドセタキセル１００ｍｇ／ｍ２とベバシズマブ７．５ｍｇ／ｋｇを３週間ごとに（ｎ＝２４８）、ベバシズマブ１５ｍｇ／ｋｇを３週間ごとに（ｎ＝２４７）又はプラセボ（ｎ＝２４１）に無作為に割り付けられた。Miles, J. Clin. Oncol., 24 May 2010（電子出版）を参照。
血漿ベースラインのサンプルはこの試験で396人の患者から入手可能であった。
血管新生及び腫瘍形成に関連するバイオマーカーの状況の調査が、全バイオマーカー患者集団で測定されたコントロールレベルに比べて３つのバイオマーカーの発現レベルが、治療パラメーターの改善に相関することが明らかになった。特に、全バイオマーカー患者集団で測定されたコントロールレベルに比べて、ＶＥＧＦＡの高発現レベルを示す患者は、ドセタキセル療法に対するベバシズマブの追加に応答して長期の無増悪生存を示した。全バイオマーカー患者集団で測定されたコントロールレベルに比べて、ＶＥＧＦＲ２の高発現レベルを示す患者は、ドセタキセル療法に対するベバシズマブの追加に応答して長期の無増悪生存を示した。また、全バイオマーカー患者集団で測定されたコントロールレベルに比べて、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の高い複合発現レベルを示す患者は、ドセタキセル療法に対するベバシズマブの追加に応答して長期の無増悪生存を示した。更に、全患者集団で測定されたコントロールレベルに比べて、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの高い複合発現レベルを示す患者は、ドセタキセル療法に対するベバシズマブの追加に応答して長期の無増悪生存を示した。
患者及び免疫化学的方法
総計７３６人の患者が、ＢＯ１７７０８試験に参加し、参加者の３９６人からの血漿サンプルが、バイオマーカー分析に利用することができた。バイオマーカー分析における３９６患者及びバイオマーカー分析が可能でなかった残りの患者のベースライン特性を表１Ａ及び表１Ｂに記載する。
Figure 2015180879
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血漿の分析
血漿サンプルは無作為化後、研究治療が投与される前に採取された。全サンプルは、疾患が進行するまて、ドセタキセル１００ｍｇ／ｍ２とベバシズマブ７．５ｍｇ／ｋｇを３週間ごとに、ベバシズマブ１５ｍｇ／ｋｇを３週間ごとに又はプラセボでその後処置された患者から得られた。
総計４．９ｍＬの血液がＳ−ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ（登録商標）（ＥＤＴＡ）チューブ（または抗凝固療法を受けている１６人の患者のためにクエン酸血漿チューブ）に引き込まれた。それらはその後直ちにチューブを穏やかに反転させ、３０分以内に遠心機で約１５００ｇで遠心分離した（１０分間室温で）。この後直ちに、上清血漿を透明ポリプロピレン製５ｍＬの移送管に分注した。その後、血漿を２本のプラスチック製のストレージ管に（約１．２５ミリリットルずつ）分注した。サンプルは立てた状態で−７０℃で保存した。幾つかのケースでは、サンプルは、最大１ヶ月は−２０℃で保存し、その後−７０℃に移した。
サンプルは、ロシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）からの免疫学的マルチパラメータチップ技術（インパクト）（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ＭｕｌｔｉＰａｒａｍｅｔｅｒ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＭＰＡＣＴ））を用いて、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦ受容体−１（ＶＥＧＦＲ１）、ＶＥＧＦＲ２、ＰＬＧＦ及びＥ−セレクチンのレベルの測定に使用した。
インパクトマルチプレックスアッセイ技術（ＩＭＰＡＣＴ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
ロシュプロフェッショナルダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（ロシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ））は、実施名称インパクト（ＩＭＰＡＣＴ）（免疫学的マルチパラメータチップ・テクノロジー）の下で、マルチマーカプラットフォームを開発している。この技術は、「血漿の分析」の項で上述したタンパク質マーカーの測定に使用した。本技術は、欧州特許第０９３９３１９号及び欧州特許第１６１０１２９号に開示された手順により製造された小さいポリスチレンチップに基づいている。チップ表面をストレプトアビジン層で被覆し、次いでその上にビオチン化抗体が全てのアッセイでスポットされた。各マーカーについて、抗体のスポットがチップ上に縦線でロードされた。アッセイ中に、アレイは特定の分析物を含む検体試料で探索した。
一つのチップ上の全マーカーを測定するために検体あたり必要な血漿容積は８μＬであり、それはインキュベーションバッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｈｅｓｉｔ、０．５％ウシ血清アルブミン、及び防腐剤として０．１％のオキシピリオン（Ｏｘｙｐｙｒｉｏｎ））と一緒に適用された。１２分のインキュベーション及び洗浄バッファー（５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．９，０．０１％Ｔｈｅｓｉｔ及び０．００１％のオキシピリオン（Ｏｘｙｐｙｒｉｏｎ））を用いてチップを洗浄後に、ジゴキシゲニン化モノクローナル抗体混合物を追加し（ジゴキシゲニンで標識した分析物に特異的な抗体の混合物を含むインキュベーション緩衝液４０μＬ）、捕獲した分析物に結合させるために、更に６分間インキュベートした。第二抗体が、蛍光ラテックスに結合した抗ジゴキシゲニン抗体複合体を含む試薬バッファー（６２．５ｍＭのＴＡＰＳ ｐＨ８．７、１．２５ＭのＮａＣｌ、０．５％ウシ血清アルブミン、０．０６３％のＴｗｅｅｎ２０、０．１％オキシピリオン（Ｏｘｙｐｙｒｉｏｎ））４０μＬで最終的に検出された。この標識を使用して、単一スポットで１０の独立した結合事象を検出することができ、ｎｍｏｌ／Ｌの濃度に至るまで非常に高感度を与えた。チップは、検出部に運ばれ、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラが、専用のソフトウェアを使用して信号強度に変換された画像を生成した。個々のスポットは、自動的に所定の位置に配置され、画像解析によって定量化された。各マーカーについて、１０〜１２スポットの線がチップにロードされ、５つのスポットの最小値がサンプルの平均濃度を決定するために必要であった。本技術の利点は、サンドイッチ形式又は競合形式において、最大１０までパラメーターを多重化する能力である。検量用試料及び患者検体は二重に測定した。一回の実行は、実行コントロールとして２つのマルチコントロールを含む計１００の判定を含むように設計した。選択された分析物の一部はお互いに反応するため（すなわち、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦはＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＲＦ２と、又はＶＥＧＦＡはＰＬＧＦとヘテロダイマーを形成する）、５つの分析物が以下の３つの異なるチップ上に分けられた。
チップ１：ＶＥＧＦＡ
チップ２：ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｅ−セレクチン
チップ３：ＰＬＧＦ
以下の抗体が異なるアッセイで使用された。
Figure 2015180879
統計的分析
サンプルの中央値は、バイオマーカーの値を低（中央値未満）又は高（中央値以上）として二分するために使用された。
高または低バイオマーカーレベルの患者のサブグループにおける治療効果のハザード比は、比例ハザードコックス回帰分析を用いて推定された。
更に、コックス比例ハザード回帰が、バイオマーカーレベルと治療効果との関連を評価するために使用された。本方法は以下の共変量を含んだ：試用版治療、バイオマーカーレベル、層別因子（ＥＲ／ＰｇＲの状態、ベースライン時に測定可能な疾患、事前アジュバントタキサン療法）、バイオマーカーのレベルによる治療の相互作用項。相互作用項のためのＷａｌｄ検定は、バイオマーカーレベルと治療効果との間の関連性を決定するために使用された。０．０５未満のＰ値は有意であると考えられた。
結果
血漿マーカー
バイオマーカーのベースラインの記述統計が表２に示される。
Figure 2015180879
表３は、無増悪生存における治療効果とＶＥＧＦＡ又はＶＥＧＦＲ２との関連性を解析した結果を示す。
Figure 2015180879
この解析において、ＶＥＧＦＡについて、低ＶＥＧＦＡ（＜１２５ｐｇ／ｍｌ）及び高ＶＥＧＦＡ（≧１２５ｐｇ／ｍｌ），及びＶＥＧＦＲ２について、低ＶＥＧＦＲ２（＜１１ｎｇ／ｍｌ）及び高ＶＥＧＦＲ２（≧１１ｎｇ／ｍｌ）が使用された。
これらの結果は、治療効果のハザード比は、低ＶＥＧＦＡを持つ患者に比べて高ＶＥＧＦＡを持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。またこれらの結果は、治療効果のハザード比は、低ＶＥＧＦＲ２を持つ患者に比べて高ＶＥＧＦＲ２を持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。同じ傾向が低及び高用量のベバシズマブをプラセボに対して比較した場合に観察され、高及び低バイオマーカーサブグループ間の相違の統計的証拠は、低用量のベバシズマブで治療された患者においてより強い。従って、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２は各々が、無増悪生存におけるベバシズマブ治療効果について独立した予測バイオマーカーである。
表４は、低用量（７．５ｍｇ／ｋｇを３週間ごと）ベバシズマブ及び高用量（１５ｍｇ／ｋｇを３週間ごと）ベバシズマブについて、無増悪生存における治療効果とバイオマーカー組み合わせの関連性の解析を示す。
この解析において、
Figure 2015180879
ここではｌｏｇ２変換を使用し、
Figure 2015180879
ここでｍａｄは係数１.４８２６で調整された絶対偏差中央値である。
Figure 2015180879
この解析において、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２の高混合発現レベルは式１≧−０．１３２であり、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２の低混合発現レベルは式１＜−０．１３２であり、ＶＥＧＦＡとＰＬＧＦの高混合発現レベルは式２≧−０．００６であり、ＶＥＧＦＡとＰＬＧＦの低混合発現レベルは式２＜−０．００６である。
これらの結果は、治療効果のハザード比は、低いＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２の組み合わせを持つ患者に比べて高いＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２の組み合わせを持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。またこれらの結果は、治療効果のハザード比は、低いＶＥＧＦＡ＆ＰＬＧＦの組み合わせを持つ患者に比べて高いＶＥＧＦＡ＆ＰＬＧＦの組み合わせを持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。同じ傾向が低及び高用量のベバシズマブをプラセボに対して比較した場合に観察され、高及び低バイオマーカーサブグループ間の相違の統計的証拠は、低用量のベバシズマブで治療された患者においてより強い。従って、ＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２の組み合わせ及びＶＥＧＦＡ＆ＰＬＧＦの組み合わせは各々が、無増悪生存におけるベバシズマブ治療効果について独立した予測バイオマーカーである。
ベバシズマブ１５ｍｇ／ｋｇの効力におけるＶＥＧＦ−Ａの予測値は、ＶＥＧＦ−Ａのレベルに従ってコホートを四分位数に細分化することで更に検討された。全ての四分位数の９５％信頼区間が重なった。第一四分位数（＜６４ｐｇ／ｍｌ）では、非常に限定された治療効果が観察された（ハザード比０．８６）。最高四分位数では（＞２４０ｐｇ／ｍｌ）、ＰＦＳのハザード比は０．３９（９５％ＣＩ：０．１９−０．７７）で、無増悪生存の中央値の差は、他の群に比べてより顕著であった。全体として、四分位数の推定値は、ＶＥＧＦ−Ａレベルの増加に伴い、ハザード比において一貫性のある改善を示している。これらの結果を下の図５に示す。
Figure 2015180879
実施例２：インパクトアッセイを用いるＶＥＧＦ−Ａの短いアイソフォームの検出
この例では、インパクトプラットフォーム上におけるＶＥＧＦ−Ａの検出のために使用される抗体に基づいて、ＶＥＧＦ−Ａの短いアイソフォームがＶＥＧＦ−Ａの長いアイソフォームに比べて優先的に測定されることを示している。
「統計解析」のセクション前の表に一覧された抗体を用いるインパクト技術を言及するセクションで上述されるように実行された。
４つの異なるＶＥＧＦ−Ａ型、すなわち、ＶＥＧＦ１１１，ＶＥＧＦ１２１，ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９が利用可能であって本解析で使用された。ＶＥＧＦ１１１，ＶＥＧＦ１２１，及びＶＥＧＦ１６５はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡから購入し、ＶＥＧＦ１８９はＲｅｌｉａｔｅｃｈ，Ｗｏｌｆｅｎｂｕｅｔｔｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙから得た。図１１に示されるように、１１１又は１２１アミノ酸をそれぞれ有する短いアイソフォームは、１６５又は１８９アミノ酸をそれぞれ有する長いアイソフォームに比べてより良好に検出された。生物学的に興味深いプラスミン切断産物のＶＥＧＦ１１０はこの時点では試験のために入手できなかったが、このアイソフォームの検出は１１１アミノ酸を持つＶＥＧＦ分子で見られるものと匹敵するであろうことが期待されるに違いない。
理論に縛られることなく、このアッセイにおけるＶＥＧＦ１１０とＶＥＧＦ１２１のそれぞれのような短いＶＥＧＦアイソフォームの優先的結合は、本明細書に記載の研究において、なぜ統計的に有意な予測値が観察されたのか、一方ＶＥＧＦ−Ａの以前の測定ではその点について相反する結果へと導いたかを説明することが想定される。
実施例３：Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒを使用する短いＶＥＧＦアイソフォームの検出
この実施例では、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒを使用するアッセイはヒト血漿中の短いＶＥＧＦアイソフォームを検出するために使用することができることを実証する実験を説明する。
ＶＥＧＦ−Ａアッセイはインパクト（ＩＭＰＡＣＴ）から自動化されたインビトロ診断システムのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）（ロシュ・ダイアグノスティックス社、マンハイム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）へと移された。インパクトアッセイと同一の捕獲抗体，＜ｈＶＥＧＦ−Ａ＞−ｍ３Ｃ５（Ｒｅｌｉａｔｅｃｈ，Ｗｏｌｆｅｎｂｕｅｔｔｅｌ）が用いられたが、一方、インパクトシステム上で使用された捕獲抗体＜ｈＶＥＧＦ−Ａ＞−ｍ２５６０３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス）は＜ｈＶＥＧＦ−Ａ＞−ｍＡ４．６．１（ジェネンテック、サウスサンフランシスコ）で置き換えられた。
自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システム上で実行されるイムノアッセイは信号生成技術として、電気化学発光（ＥＣＬＩＡ）を用いるイムノアッセイである。本サンドイッチアッセイでは、ビオチン化捕獲抗体がストレプトアビジン被覆、磁性微粒子に結合し、及びルテニル（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｅｄ）検出抗体は、信号生成を可能とする。反応バッファー（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４），２ｍＭのＥＤＴＡ，０．１％のｔｈｅｓｉｔ，０．２％のウシＩｇＧ、１．０％ウシ血清アルブミン）中にある１．５μｇ／ｍｌのビオチン化＜ＶＥＧＦ−Ａ＞−ｍ３Ｃ５を７５μｌ及び２μｇ／ｍｌのルテニル＜ＶＥＧＦ−Ａ＞Ｍ−Ａ．４．６．１を７５μｌは両方とも２０μｌのサンプルとともに９分間インキュベートした。３０μｌの微粒子懸濁がインキュベーションの最初の９分後に添加され、次いで、全混合物を更に９分間インキュベートした。これらのインキュベーション工程のあいだに、微粒子に結合する抗体検体の抗体サンドイッチが形成される。最後に、微粒子は、信号生成及び読み出し用Ｅｌｅｃｓｙｓシステムの検出チャンバーに移された。
Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ＶＥＧＦ−Ａアッセイの切断産物／アイソフォームの優先度を、精製された組換えタンパク質：ＶＥＧＦ１１０（ジェネンテック社、サウスサンフランシスコにて、プラスミン切断により生成）、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５（両方ともＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリスにより提供）で評価した。インパクト（登録商標）アッセイで見られた短いＶＥＧＦアイソフォームの優先的結合はＥｌｅｃｓｙｓアッセイにて確認された。図１２に示されるように、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイにおいて、ＶＥＧＦ１２１及びプラスミン切断産物ＶＥＧＦ１１０のそれぞれのアイソフォームは、両方ともＶＥＧＦ１６５よりも約５倍高感度で検出された。
実施例４：化学療法と併用したベバシズマブの、一次の切除不能、局所進行性、転移性胃癌における第ＩＩＩ相無作為化試験
この例は、ＡＶＡＧＡＳＴ臨床試験における一次の転移性胃癌患者から得られた結果の分析に関する。研究の主な目的は、全生存（ＯＳ）によって測定され、胃癌を治療するための化学療法にベバシズマブを加えることの臨床的有用性を決定することであった。二次エンドポイントは無増悪生存（ＰＦＳ）、全奏効率及び奏効期間が含まれていた。この試験で用いられた化学療法は、カペシタビンとの組み合わせ又は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）及びシスプラチンであった。
研究設計
７７４人の患者がＡＶＡＧＡＳＴ試験に登録され、次の両群に無作為に１：１に割り付けられた：
群Ａ（３８７）：
経口カペシタビン１０００ｍｇ／ｍ２を２週間１日２回とその後１週間の安静を３週間ごとに、疾患の進行又は管理不能な毒性に至るまで、ないしは、経口カペシタビンを取ることが適切であると考えられない患者（例えば、嚥下障害、吸収不良又は経口カペシタビン薬の摂取に影響を及ぼす可能性がある他の状態のために）に対しては、代わりに５−フルオロウラシルが持続静脈注射として８００ｍｇ／ｍ２／日の用量で３週間ごとに５日間にわたり（各サイクルの１から５日）；及び
シスプラチン８０ｍｇ／ｍ２を水分過剰で２時間の静脈注射として、及び前投薬（ステロイドと制吐薬）を３週間ごとに最大６サイクルが、疾患の進行又は管理不能な毒性に至るまで投与され得る。
群Ｂ（３８７）：
経口カペシタビン１０００ｍｇ／ｍ２を２週間１日２回とその後１週間の安静を３週間ごとに、疾患の進行又は管理不能な毒性に至るまで、ないしは、経口カペシタビンを取ることが適切であると考えられない患者（例えば、嚥下障害、吸収不良又は経口カペシタビン薬の摂取に影響を及ぼす可能性がある他の状態のために）に対しては、代わりに５−フルオロウラシルが持続静脈注射として８００ｍｇ／ｍ２／日の用量で３週間ごとに５日間にわたり（各サイクルの１から５日）；及び
シスプラチン８０ｍｇ／ｍ２を水分過剰で２時間の静脈注射として、及び前投薬（ステロイドと制吐薬）を３週間ごとに、疾患の進行又は管理不能な毒性に至るまで最大６サイクル：及び
ベバシズマブ（７．５ｍｇ／ｋｇ）を３週間ごとに、疾患の進行又は管理不能な毒性に至るまで投与され得る。
治療群は、進行性疾患を例外として、層別変数のためにバランスをとった（２％対５％）。患者の約９５％は転移性で、３分の２は男性、４９％はアジア／太平洋地域、３２％がヨーロッパ、１９％がアメリカであった。
ベバシズマブは（アバスチン（登録商標））は、非経口投与される状態で透明からわずかに乳白色な無菌液体として、２つのバイアルサイズで提供された：ベバシズマブをリン酸、トレハロース、ポリソルベート２０及び米国薬局方注射用滅菌水とともに含んだ各１００ｍｇ（２５ｍｇ／ｍｌ−４ｍｌ容量）のガラスバイアル、及びベバシズマブをリン酸、トレハロース、ポリソルベート２０及び米国薬局方注射用滅菌水とともに含んだ各４００ｍｇ（２５ｍｇ／ｍｌ−１６ｍｌ容量）のガラスバイアル。アバスチン（登録商標）は、５ｍｇ／ｋｇの用量に必要な量を吸引し、米国薬局方の０．９％塩化ナトリウム注射剤で総容量１００ｍｌに希釈して投与された。
方法
適格な被験体／患者は、次の鍵となる適格基準を持っていた：年齢＞１８歳、ＥＣＯＧ、０，１又は２（ＥＣＯＧパフォーマンスステータススケール）。全ての被験体は、手術不能な局所進行または転移性疾患で、根治療法を受け入れない、胃又は胃食道接合部の腺癌を組織学的に確認した。被検体は、計測可能か又は計測不可能であるが、評価可能な疾患（固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ））に罹患していても良い。抗凝固薬を受けていない被検体は、無作為化の前に、７日間以内に、１．５未満のＩＮＲ及び１．５×ＵＬＮ未満のＰＴＴを有していた。
除外基準は以下を含んでいた：局所進行性又は転移性胃癌について以前の化学療法（無作為化前の少なくとも６ヶ月前に無作為に完了している限り、患者は以前にネオアジュバント又はアジュバント化学療法を受けている可能性がある）；以前の白金又は抗血管新生療法（すなわち、抗ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤など）；治癒的療法（手術及び／又は化学療法及び／又は放射線療法を含む）について候補であった局所進行性疾患を有する患者；無作為化から２８日以内に放射線治療：無作為化の前に２８日以内に大手術、切開生検又は重大な外傷、又は試験治療（予定された待機手術）の経過中に大手術の必要性の予想；無作為化の前に２日以内での簡単な外科的処置；ベースラインでのＣＮＳ転移の証拠；標準的な医学療法で十分に治療されない限り、癌とは無関係のＣＮＳ疾患の物理的／神経学的検査時での病歴又は証拠、例えば制御不能な発作；不十分な骨髄機能、肝機能又は腎機能；制御不能な高血圧症又は臨床的に重大な（つまり活動性）心血管疾患；無作為化で静脈内抗生物質投与を必要とする活動性感染症：出血リスクを伴う遺伝性の出血性素因又は凝固障害の病歴又は証拠；深刻な又は非治癒傷、消化性潰瘍、又は（不完全に治癒した）骨折；活動性消化管出血：無作為の６ヶ月以内での腹瘻、消化管穿孔、又は腹腔内膿瘍の病歴；神経障害（例えば、聴覚及びバランスの障害）ＣＴＣＡＥ ｖ３．０によるグレードＩＩ；アスピリン又はクロピドグレルによる慢性的な日々の治療；経口コルチコステロイド薬（抗嘔吐用又は食欲刺激としての吸入ステロイドと経口ステロイドの短期コースが許容された）による慢性的な日々の治療；既知のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）欠損症；及びＨＢＶ又はＨＣＶによる既知の急性又は慢性活動性感染。
研究の主要エンドポイントは、無作為化から任意の原因による死亡までの時間として定義された全生存（ＯＳ）であった。事象に至る時間を、層別ログランク検定を用いて処置群の間で比較する。カプランマイヤー法が、事象までの時間の期間の推定に用いられた。事象までの時間の中央値の９５％信頼区間は、ブルックマイヤー・クロウリー法を用いて計算した。事象までの時間のデータのＨＲは、層別コックス回帰モデルを用いて推定した。
二次エンドポイントは無増悪生存（ＰＦＳ）、客観的奏効率（ＲＲ）、奏効期間、及び安全性を含んでいた。無増悪生存（ＰＦＳ）は、治験責任医師の評価に基づいて、無作為化から疾患の進行又は死亡までの時間として定義される。カプランマイヤーの方法論は、各治療群についてのＰＦＳ中央値の推定に用いられた。ある実施態様において、ＰＦＳのハザード比は、層別ログランク検定で使用したのと同じ層別因子による層別コックス回帰モデルを用いて推定した。各コホートにおけるＰＦＳの解析は、両側α＝０．０５のレベルで実施された。事象に至る時間を、層別ログランク検定を用いて処置群の間で比較した。カプランマイヤー法が、事象までの時間の期間の推定に用いられた。事象までの時間の中央値の９５％信頼区間は、ブルックマイヤー・クロウリー法を用いて計算した。事象までの時間のデータのＨＲは、層別コックス回帰モデルを用いて推定した。ＲＲは、応答の最初の文書化後２８日以上確認される完全又は部分応答を達成した患者のパーセンテージとして定義される。ベースラインで計測可能な疾患を持つ患者におけるＲＲは、層別マンテルヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ）χ２検定を用いて比較した。無作為化の層別因子は全て層別解析に含めた。
血液血漿サンプルは、手術不可能な局所進行性／転移性の胃／胃食道腺癌の治療のためのカペシタビン／シスプラチン療法にベバシズマブを追加した結果を比較する無作為化第ＩＩＩ相研究に参加した患者から採取した（ＢＯ２０９０４研究，Kang et al, J. Clin. Oncol. 2010; 28 (18S): LBA4007を参照）。
血管新生及び腫瘍形成に関連するバイオマーカーの状況の調査が、全バイオマーカー患者集団で測定されたコントロールレベルに比べて一血漿バイオマーカーの発現レベルが治療パラメーターの改善に相関することが明らかになった。特に、全バイオマーカー患者集団で測定されたコントロールレベルに比べて、ＶＥＧＦＡの高発現レベルを示す患者は、カペシタビン／シスプラチン療法に対するベバシズマブの追加に応答して長期の全生存及び無増悪生存を示した。
患者、サンプル及び免疫化学的方法
総計７７４人の患者が、ＢＯ２０９０４研究に参加し、血漿ＶＥＧＦ−Ａの分析用に血液中の血漿サンプリングが本プロトコールで前もって指定された。
全てのサンプルは、カペシタビン／シスプラチンとベバシズマブ又はプラセボによる治療を受けた患者から得られた。合計．４．９ｍｌが、４．９ｍＬのＥＤＴＡ−Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ（登録商標）採血管に回収された。
血液回収の３０〜６０分以内に、採血管を遠心分離機に入れ、細胞および血漿が分離されるまで、１５分間、４℃で１５００ｇで回転させた。遠心分離後直ちに、血漿を、慎重に管の底に血小板を含む界面を吸引しないように注意しながら、プラスチックのピペットを用いてプロピレン製の移送管に移した。血漿は、その後、ピペットを用いて２本の貯蔵管に等しく（半量が各々約１．２５ｍＬ）分注した。
一旦血漿を分離した後、サンプルはまっすぐ立てた状態で−７０℃で保存された。−２０℃で保存することしかできないサンプルは、採血後一ヶ月以内にロシュ中央サンプルオフィス（ＣＳＯ）に発送された。全てのサンプルは、ロシュ・ダイアグノスティックス社、ペンツベルク、ドイツで分析した。
全てのサンプルが解凍され、７２のバッチで３８４ウェルＲＥＭＰマイクロプレートに４０μｌのアリコートに分配された。管はアルミ膜で密閉し、分析するまで−８５から−５５℃の温度を維持するように設定した冷凍庫に保存された。サンプルはＶＥＧＦＡ濃度を分析した。
参加者の７１２人からの血漿サンプルを、バイオマーカー分析に利用することができた。バイオマーカー解析における７１２人の患者のベースライン特性を表６に記載する。
Figure 2015180879
血漿の分析
血漿サンプルは無作為化後、患者に研究治療が投与される前に採取された。ＶＥＧＦＡを、実施例１に記載の多重ＩＭＰＡＣＴ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。
統計解析
サンプルの中央値は、バイオマーカーの値を低（中央値未満）又は高（中央値以上）として二分するために使用された。
高または低バイオマーカーレベルの患者のサブグループにおける治療効果のハザード比は、比例ハザードコックス回帰分析を用いて推定された。
更に、比例ハザードコックス回帰が、バイオマーカーレベルと治療効果との関連を評価するために使用された。モデルは、以下の共変量を含んだ：試験治療、バイオマーカーレベル、バイオマーカーレベルによる治療の相互作用項。相互作用項のためのＷａｌｄ検定は、バイオマーカーレベルと治療効果との間の関連性を決定するために使用された。０．０５未満のＰ値は有意であると考えられた。
定量下限値以下（ＢＬＱ）か又は定量上限を超える（ＡＬＱ）として報告された値は、定量下限値（ＬＬＱ）値及び定量上限（ＵＬＱ）値で帰属された。濃度レベルの対数変換を分析に用いた。カットオフを分析のために必要とされた場合は、サンプルの中央値を用いた。
結果
血漿マーカー
バイオマーカーのベースラインの記述統計が表７に示される。
Figure 2015180879
表８は、全生存における治療効果と選択されたバイオマーカーの関連性の単変量解析を示す。
Figure 2015180879
この分析において、ＶＥＧＦＡについて、低ＶＥＧＦＡ≦１１１ｐｇ／ｍｌ及び高ＶＥＧＦＡ＞１１１ｐｇ／ｍｌを使用した。
ＶＥＧＦＡについて、カットオフレベルは、所定の解析計画に従って、患者の５０％が高発現し、５０％の患者が低い発現を有するを有するように、サンプルデータ中央値として決定した。
この結果の表は、治療効果のハザード比は、低ＶＥＧＦＡを持つ患者に比べて高ＶＥＧＦＡを持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。従って、ＶＥＧＦＡは、全生存におけるベバシズマブ治療効果について独立した予測バイオマーカーである。
表９は、無増悪生存における治療効果と選択されたバイオマーカーの関連性の単変量解析を示す。
Figure 2015180879
この分析において、ＶＥＧＦＡについて、低ＶＥＧＦＡ≦１１１ｐｇ／ｍｌ及び高ＶＥＧＦＡ＞１１１ｐｇ／ｍｌを使用した。
ＶＥＧＦＡについて、カットオフレベルは、所定の解析計画に従って、患者の５０％が高発現し、５０％の患者が低い発現を有するを有するように、サンプルデータ中央値として決定した。
この結果の表は、治療効果のハザード比は、低ＶＥＧＦＡを持つ患者に比べて高ＶＥＧＦＡを持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。従って、ＶＥＧＦＡは、無増悪生存におけるベバシズマブ治療効果について独立した予測バイオマーカーである。
実施例５：化学療法と併用したベバシズマブの、転移性膵癌における第ＩＩＩ相無作為化試験
転移性膵臓癌患者は、ゲムシタビン（ｇｅｍｉｃｉｔａｍｉｂｅ）−エルロチニブとベバシズマブ（ｎ＝３０６）又はプラセボ（ｎ＝３０１）に無作為に割り付けられた。
血液血漿サンプルは、転移性膵癌の治療のためのゲムシタビン（ｇｅｍｉｃｉｔａｍｉｂｅ）−エルロチニブ療法にベバシズマブを追加した結果を比較する無作為化第ＩＩＩ相研究に参加した患者から採取した（ＢＯ１７７０６研究,Van Cutsem, J. Clin. Oncol. 2009 27:2231-2237を参照)。転移性膵臓癌患者は、ゲムシタビン（ｇｅｍｉｃｉｔａｍｉｂｅ）−エルロチニブとベバシズマブ（ｎ＝３０６）又はプラセボ（ｎ＝３０１）に無作為に割り付けられた。転移性膵臓癌患者は、ゲムシタビン（１，０００ｍｇ／ｍ２／週）、エルロチニブ（１００ｍｇ／日）及びベバシズマブ（５ｍｇ／ｋｇを２週間毎）又はゲムシタビン、エルロチニブ、及びプラセボを無作為に割りあてられた。
血管新生及び腫瘍形成に関連するバイオマーカーの状況の調査が、全バイオマーカー患者集団で測定されたコントロールレベルに比べて３つのバイオマーカーの発現レベルが、治療パラメーターの改善に相関することが明らかになった。特に、全バイオマーカー患者集団で測定されたコントロールレベルに比べて、ＶＥＧＦＡの高発現レベルを示す患者は、ゲムシタビン（ｇｅｍｉｃｉｔａｍｉｂｅ）−エルロチニブ療法に対するベバシズマブの追加に応答して長期の全生存及び無増悪生存を示した。全バイオマーカー患者集団で測定されたコントロールレベルに比べて、ＶＥＧＦＲ２の高発現レベルを示す患者は、ゲムシタビン（ｇｅｍｉｃｉｔａｍｉｂｅ）−エルロチニブ療法に対するベバシズマブの追加に応答して長期の全生存を示した。全バイオマーカー患者集団で測定されたコントロールレベルに比べて、ＰＬＧＦの高発現レベルを示す患者は、ゲムシタビン（ｇｅｍｉｃｉｔａｍｉｂｅ）−エルロチニブ療法に対するベバシズマブの追加に応答して長期の無増悪生存を示した。また、全バイオマーカー患者集団で決定されたコントロールレベルに比べて、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２の高混合発現レベルを示す患者は、ゲムシタビン（ｇｅｍｉｃｉｔａｍｉｂｅ）−エルロチニブ療法に対するベバシズマブの追加に応答して長期の全生存及び無増悪生存を示した。更に、全患者集団で決定されたコントロールレベルに比べて、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦの高混合発現レベルを示す患者は、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｍｉｂｅ）−エルロチニブ療法に対するベバシズマブの追加に応答して長期の全生存及び無増悪生存を示した。全患者集団で決定されたコントロールレベルに比べて、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの高混合発現レベルを示す患者は、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｍｉｂｅ）−エルロチニブ療法に対するベバシズマブの追加に応答して長期の全生存及び無増悪生存を示した。
患者及び免疫化学的方法
総計６０７人の患者が、ＢＯ１７７０６試験に参加し、参加者の２２４人からの血漿サンプルが、バイオマーカー分析に利用することができた。バイオマーカー解析における２２４人の患者のベースライン特性を表１０に記載する。
Figure 2015180879
血漿の分析
無作為化後及び任意の研究治療前に収集された血漿が患者に与えられ、上の実施例１に記載されるＩＭＰＡＣＴアッセイを用いて、ＶＥＧＦＡ、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）、ＶＥＧＦＲ２、ＰＬＧＦ及びＥ−セレクチンを測定した。
統計解析
サンプルの中央値は、バイオマーカーの値を低（中央値未満）又は高（中央値以上）として二分するために使用された。
高または低バイオマーカーレベルの患者のサブグループにおける治療効果のハザード比は、比例ハザードコックス回帰分析を用いて推定された。
更に、コックス比例ハザード回帰が、バイオマーカーレベルと治療効果との関連を評価するために使用された。モデルは以下の共変量が含まれていた：試験治療、バイオマーカーレベル、バイオマーカーレベルによる治療の相互作用項。相互作用項のためのＷａｌｄ検定は、バイオマーカーレベルと治療効果との間の関連性を決定するために使用された。０．０５未満のＰ値は有意であると考えられた。
結果
血漿マーカー
バイオマーカーのベースラインの記述統計が表11に示される。
Figure 2015180879
表１２は、全生存における治療効果と選択されたバイオマーカーの関連性の単変量解析を示す。
Figure 2015180879
この解析において、ＶＥＧＦＡについて、低ＶＥＧＦＡ＜１５２．９ｐｇ／ｍｌ及び高ＶＥＧＦＡ≧１５２．９ｎｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦＲ２について、低ＶＥＧＦＲ２＜９．９ｎｇ／ｍｌ及び高ＶＥＧＦＲＡ≧９．９ｎｇ／ｍｌ、及びＰＬＧＦについて、低ＰＬＧＦ＜３６．５ｐｇ／ｍｌ及び高ＰＬＧＦ≧３６．５ｐｇ／ｍｌが使用された。
ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２について、カットオフレベルは、所定の解析計画に従って、患者の５０％が高発現し、５０％の患者が低い発現を有するを有するように、サンプルデータ中央値として決定した。ＰＬＧＦカットオフレベルはデータの４２パーセンタイル値として決定した。従って、患者の５８％がＰＬＧＦの高発現を有し、４２％が低発現を有している。カットオフは、高レベルサブグループにける治療効果と低レベルサブグループにおける治療効果の間に統計的な違いを大きくするために決定した。
この結果の表は、治療効果のハザード比は、低ＶＥＧＦＡを持つ患者に比べて高ＶＥＧＦＡを持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。またこの結果の表は、治療効果のハザード比は、低ＶＥＧＦＲ２を持つ患者に比べて高ＶＥＧＦＲ２を持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。従って、ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２は各々が、無増悪生存におけるベバシズマブ治療効果について独立した予測バイオマーカーである。
表１３は、無増悪生存における治療効果と選択されたバイオマーカーの関連性の単変量解析を示す。
Figure 2015180879
この解析において、ＶＥＧＦＡについて、低ＶＥＧＦＡ＜１５２．９ｐｇ／ｍｌ及び高ＶＥＧＦＡ≧１５２．９ｎｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦＲ２について、低ＶＥＧＦＲ２＜９．９ｎｇ／ｍｌ及び高ＶＥＧＦＲＡ≧９．９ｎｇ／ｍｌ、及びＰＬＧＦについて、低ＰＬＧＦ＜３６．５ｐｇ／ｍｌ及び高ＰＬＧＦ≧３６．５ｐｇ／ｍｌが使用された。ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＲ２について、カットオフレベルは、所定の解析計画に従って、患者の５０％が高発現し、５０％の患者が低い発現を有するを有するように、サンプルデータ中央値として決定した。ＰＬＧＦカットオフレベルはデータの４２パーセンタイル値として決定した。従って、患者の５８％がＰＬＧＦの高発現を有し、４２％が低発現を有している。カットオフは、高レベルサブグループにける治療効果と低レベルサブグループにおける治療効果の間に統計的な違いを大きくするために決定した。
この結果の表は、治療効果のハザード比は、低ＶＥＧＦＡを持つ患者に比べて高ＶＥＧＦＡを持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。またこの結果の表は、治療効果のハザード比は、低ＰＬＧＦを持つ患者に比べて高ＰＬＧＦを持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。従って、ＶＥＧＦＡ及びＰＬＧＦは各々が、無増悪生存におけるベバシズマブ治療効果について独立した予測バイオマーカーである。
表１４は、全生存における治療効果とバイオマーカーの組み合わせの関連の分析を示す。
この解析では以下の式を用いた：
Figure 2015180879
ここではｌｏｇ２変換を使用し、
Figure 2015180879
Figure 2015180879
この解析において、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２の高混合発現レベルは式１≧−０．１０であり、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２の低混合発現レベルは式１＜−０．１０であり、ＶＥＧＦＡとＰＬＧＦの高混合発現レベルは式２≧−０．０４２であり、ＶＥＧＦＡとＰＬＧＦの低混合発現レベルは式２＜−０．０４２である。
この結果の表は、治療効果のハザード比は、低いＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２の組み合わせを持つ患者に比べて高いＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２の組み合わせを持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。またこの結果の表は、治療効果のハザード比は、低いＶＥＧＦＡ＆ＰＬＧＦの組み合わせを持つ患者に比べて高いＶＥＧＦＡ＆ＰＬＧＦの組み合わせを持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。従って、ＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２の組み合わせ及びＶＥＧＦＡ＆ＰＬＧＦの組み合わせは各々が、全生存におけるベバシズマブ治療効果について独立した予測バイオマーカーである。
表１５は、無増悪生存における治療効果とバイオマーカーの組み合わせの関連の分析を示す。
この解析では以下の式を用いた：
Figure 2015180879
ここではｌｏｇ２変換を使用し、
Figure 2015180879
Figure 2015180879
この解析において、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２の高混合発現レベルは式１≧−０．１０であり、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２の低混合発現レベルは式１＜−０．１０であり、ＶＥＧＦＡとＰＬＧＦの高混合発現レベルは式２≧−０．０４２であり、ＶＥＧＦＡとＰＬＧＦの低混合発現レベルは式２＜−０．０４２である。
この結果の表は、治療効果のハザード比は、低いＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２の組み合わせを持つ患者に比べて高いＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２の組み合わせを持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。またこの結果の表は、治療効果のハザード比は、低いＶＥＧＦＡ＆ＰＬＧＦの組み合わせを持つ患者に比べて高いＶＥＧＦＡ＆ＰＬＧＦの組み合わせを持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。従って、ＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２の組み合わせ及びＶＥＧＦＡ＆ＰＬＧＦの組み合わせは各々が、無増悪生存におけるベバシズマブ治療効果について独立した予測バイオマーカーである。
表１６及び表１７は、それぞれ全生存及び無増悪生存において、治療効果と、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦのバイオマーカー組み合わせの関連の解析を示す。
この解析において、以下の式を用いた：
Figure 2015180879
ここでｌｎ＝ｌｏｇ ｂａｓｉｓ ｅ
Figure 2015180879
Figure 2015180879
この解析において、全生存について、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの高混合発現レベル（式３≧−０．８３７）、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの低混合発現レベルは（式３＜−０．８３７であり）、無増悪生存について、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの高混合発現レベルは（式３≧−０．８３７）であり、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＲ２及びＰＬＧＦの低混合発現レベルは（式３＜−０．８３７）である。
この結果の表は、治療効果のハザード比は、低いＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２＆ＰＬＧＦの組み合わせを持つ患者に比べて高いＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２＆ＰＬＧＦの組み合わせを持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。従って、ＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２＆ＰＬＧＦの組み合わせは、無増悪生存におけるベバシズマブ治療効果について独立した予測バイオマーカーである。
またこの結果の表は、全生存について、治療効果のハザード比は、低いＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２＆ＰＬＧＦの組み合わせを持つ患者に比べて高いＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２＆ＰＬＧＦの組み合わせを持つ患者のサブセットで有意に良好であることを示している。従って、ＶＥＧＦＡ＆ＶＥＧＦＲ２＆ＰＬＧＦの組み合わせは、全生存におけるベバシズマブ治療効果について独立した予測バイオマーカーである。
実施例６：ＶＥＧＦＡに対する付加的血漿サンプルの分析
ＡＶＦ２１０７ｇ（転移性結腸直腸癌を有する被験体において標準的な化学療法との組み合わせでｒｈｕｍａｂ（ベバシズマブ）の有効性及び安全性を評価するための第ＩＩＩ相、多施設、無作為化、能動的制御臨床試験）、ＡＶＡｉＬ（化学療法を受けていない、進行性又は再発性の非扁平上皮非小細胞肺癌患者における、プラセボ、シスプラチン及びゲミシタビンに対するシスプラチンとゲムシタビンを併用したベバシズマブの無作為化、二重盲検、多施設第ＩＩＩ相試験）、及びＡＶＯＲＥＮ（転移性腎明細胞癌に罹患した腎摘出された患者に投与される一次治療として、インターフェロンα−２ａとプラセボに対するインターフェロンα−２ａ（ｒｏｆｅｒｏｎ）と併用したベバシズマブの有効性と安全性を評価するための無作為化二重盲検第ＩＩＩ相試験）もまた実施例１に記載のＩＭＰＡＣＴアッセイで分析された。
研究ＡＶＦ２１０７ｇでは、（４７％）からの３８０サンプルが再試験のために利用可能であった。新しいＶＥＧＦ−Ａのデータは、ＶＥＧＦに対する予後値を確認したが、潜在的な予測値を示さなかった。ＶＥＧＦ−Ａの高レベルを持つ転移性結腸直腸癌患者は、ＩＭＰＡＣＴ ＥＬＩＳＡにより測定される場合、ＰＦＳついて似たハザード比（ＶＥＧＦ−Ａ高に対して０．５２対ＶＥＧＦ−Ａ低に対して０．６４）及びＯＳについて似たハザード比（ＶＥＧＦ−Ａ高に対して０．６８対ＶＥＧＦ−Ａ低に対して０．７０）を有していた。
類似の予後値は８５２ ＡＶＡＩＬサンプル（５２％）の再検査の結果で見られた。しかしながら、７．５ｍｇ／ｋｇの群において、ＶＥＧＦ−Ａの高いレベルを有する非小細胞肺癌患者もまた、ＶＥＧＦ−Ａの高いレベルを有する患者に比べて類似のハザード比を示した（ＰＦＳについてそれぞれ０．７５対０．７７及びＯＳについて０．８９対０．９２）。１５ｍｇ／ｋｇの用量群もまた、ＶＥＧＦ−Ａの低いレベルを有する患者（ＰＦＳについて０．９６及びＯＳについて０．９７）と比較して、ＶＥＧＦ−Ａの高いレベルを有する患者（ＰＦＳについて０．７６及びＯＳについて０．９８）について類似のハザード比を示した。
またＡＶＯＲＯＮ試験において、バイオマーカーの予後値が見られたものの、４００ベースラインの血漿サンプル（６２％）の再試験は、腎細胞癌患者におけるＶＥＧＦ−Ａの潜在的な予測値を明らかにしなかった。ＶＥＧＦ−Ａの高いレベルを持つ患者は、ＰＦＳについて、ＶＥＧＦ−Ａの低レベルを持つ患者の０．４９と比較して０．６７のハザード比を示した。
６つの異なるアバスチンの研究からの臨床転帰とのＶＥＧＦ−Ａバイオマーカーの相関を表１８に示す。
Figure 2015180879
Figure 2015180879
全ての３つの研究では、以前のＶＥＧＦ−Ａアッセイで以前に示されたように、血漿ＶＥＧＦ−Ａの予後因子を確認した。しかしながら、ＡＶＡＤＯ，ＡＶＩＴＡ，及びＡＶＡＧＡＳＴに示されるように、潜在的な予測値は、３つの異なる適応において、追加の試験で確認することができなかった。ＡＶＦ２１０７ｇ，ＡＶＡｉＬ，及びＡＶＯＲＥＮの試験で回収されたサンプルは、ＡＶＡＤＯ，ＡＶＡＧＡＳＴ，及びＡＶＩＴＡで回収されたサンプルと比べて若干異なる方法で処理されたことを特記すべきである（すなわち、クエン酸対ＥＤＴＡ、１２％〜１６％のサンプルでより多くの凍結／融解サイクル、より長い貯蔵時間）。下記の実施例７に示すように、血漿のクエン酸塩又はＥＤＴＡへの回収は、ＶＥＧＦ−アッセイの感度に影響を与え得る。サンプル間の正確な違いが、以下の表１９に示される。
Figure 2015180879
従って、これらの３つの研究における予測値の欠如は、ＶＥＧＦ−Ａは、ＭＢＣにおける予測マーカーとして機能し得るという可能性を否定するものではない。また、発見が適応症特異的であることを排除することはできない。２つのアッセイ間の違いは、短いＶＥＧＦアイソフォームについての第二世代のアッセイの感度の違いを明らかにした（ＶＥＧＦ１１０及びＶＥＧＦ１２１）。理論に束縛されることなく、異なる適応症において異なるアイソフォームの異なる生物学的効果及び存在量があり得る。例えば、ＶＥＧＦ１２１は、トランスフェクトされた異種移植モデルにおいて、他の一般的に発現された１６５及び１８９アイソフォームよりも、腫瘍形成のより強い誘導を示している(Zhang, H.T. et al., Brit. J. Cancer 83 (2000) 63-68)。血管内皮増殖因子の１２１−アミノ酸アイソフォームは、インビボでの他のスプライス変異体よりもより強く腫瘍形成性である(Zhang, H.T. et al., Brit. J. Cancer 83 (2000) 63-68)。このことは１２１アイソフォームが原発性ヒト乳癌における支配的なアイソフォームであることが示されているという事実の観点から特に重要である(Relf, M. et al., Cancer Res. 57 (1997) 963-969)。
要約すると、インパクト（ＩＭＰＡＣＴ）アッセイは、試験された適応症にわたる血漿ＶＥＧＦ−Ａについての一貫した予後値を示している。更に、この試験は、ＡＶＡＤＯ，ＡＶＩＴＡ，及びＡＶＡＧＡＳＴにおいて一貫した結果を生成し、これらの適応症におけるベバシズマブの予測値を示しており、一方ＡＶＦ２１０７ｇ，ＡＶＡｉＬ，及びＡＶＯＲＥＮ試験における血漿サンプルの再試験ではそのような相関を示さず、これらの３つの別の適応症では血漿ＶＥＧＦＡ−Ａの可能性のある予測値が無いことを示す。しかしながら、サンプル中の相違は結果においてこれらの違いに影響を与えている可能性があり；そうした相違の一つが下の実施例７において実証されている。理論に拘束されることなく、インパクトアッセイが短いアイソフォームＶＥＧＦ１１０及びＶＥＧＦ１２１を好むとする条件において、異なる適応症における異なるアイソフォームの異なる生物学的影響及び存在量もまたあり得る。
実施例７：Ｎａクエン酸及びＥＤＴＡ中に回収される血漿中の短いＶＥＧＦアイソフォームの検出
一対の血漿サンプルが、ＥＤＴＡ ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ（５ｍＬ）−及びクエン酸塩Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ採血管（５ｍＬ）の両方におけるＨＥＲ２＋を局所的に再発したか又は転移性乳癌から回収された。血液回収の３０分以内に、採血管を遠心分離機に入れ、細胞および血漿が分離されるまで、１０分間室温で１５００ｇで回転させた。遠心分離後直ちに、血漿は注意深くプロピレン移送管に移され、ついでピペットを用いて２本の貯蔵管に（半分の容積で各々約１．２５ｍＬ）分注された。サンプル中のＶＥＧＦＡ−Ａのレベルが上述のインパクトアッセイを用いて測定された。図２１に示されるように、ＶＥＧＦＡ濃度は、ＥＤＴＡクエン酸塩法比較についてスピアマン相関が治療前に回収されたベースラインサンプルにおいて約０．８であり、回収されたクエン酸塩中に保管された血漿サンプルに比べて回収されてＥＤＴＡ中保管された血漿サンプルにおいて約４０％高い。
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書中に引用される全ての特許、特許出願、科学的な文献、及びＧｅｎｂａｎｋ受入番号は、各特許、特許出願、科学的な文献、及びＧｅｎｂａｎｋ受入番号が具体的かつ個々に参照として援用されるかのように、全ての目的についてその全体が出典明示により明示的に援用される。

Claims (33)

  1. ＶＥＧＦアンタゴニストを含む抗癌治療法による治療から利益を得る可能性のある患者を同定するための方法であって、
    患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の発現レベルを決定することを含み、患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルが基準レベルかそれを上回ることが、患者が抗癌治療法による治療から利益を得る可能性があることを示す方法。
  2. ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法による治療に対する癌に罹患した患者の応答性を予測する方法であって、
    患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の発現レベルを決定することを含み、患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルが基準レベルかそれを上回ることが、患者が抗癌治療法による治療に応答する可能性が高いことを示す方法。
  3. 癌患者がＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療からの利益を示す可能性を決定するための方法であって、
    患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の発現レベルを決定することを含み、患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルが基準レベルかそれを上回ることが、患者が抗癌治療法からの利益の可能性が増加していることを示す方法。
  4. ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法の治療的有効性を最適化するための方法であって、
    患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の発現レベルを決定することを含み、患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルが基準レベルかそれを上回ることが、患者が抗癌治療法からの利益の可能性が増加していることを示す方法。
  5. 患者の癌を治療するための方法であって、
    患者から得られたサンプルが、基準レベルかそれを上回るレベルのＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルを有することを決定し、
    前記患者にＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法の有効量を投与し、それによって癌が治療されることを含む方法。
  6. 癌が、結腸直腸癌、神経膠芽腫、腎癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌及び肺癌からなる群から選択される請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
  7. 患者から得られたサンプルが、全血、血漿、血清、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されたメンバーである、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
  8. ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルがタンパク質レベルである、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
  9. タンパク質レベルが血漿タンパク質レベルを測定することにより決定される、請求項８に記載の方法。
  10. 患者から得られたサンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０の血漿レベルが、基準サンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルかそれを上回ることが、患者が抗癌治療により利益を受ける可能性があり、抗癌治療法により応答する可能性がより高いか、又は抗癌治療法の利益を受ける可能性が増加していることを示す、請求項９に記載の方法。
  11. 前記患者に対してＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
  12. ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが抗体である、請求項１１に記載の方法。
  13. 抗体がベバシズマブである、請求項１２に記載の方法。
  14. 細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第二の抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む、請求項１１に記載の方法。
  15. 第二の抗癌治療法とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に投与される、請求項１４に記載の方法。
  16. 第二の抗癌治療法とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが逐次的に投与される、請求項１４に記載の方法。
  17. 細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第三の抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
  18. 第三の抗癌治療法、第二の抗癌治療法及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に投与される、請求項１７に記載の方法。
  19. 第三の抗癌治療法、第二の抗癌治療法及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが逐次的に投与される、請求項１７に記載の方法。
  20. ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが抗体である、請求項５に記載の方法。
  21. 抗体がベバシズマブである、請求項２０に記載の方法。
  22. 抗癌治療法が、細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第二の抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む、請求項５に記載の方法。
  23. 第二の抗癌治療法とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に投与される、請求項１９に記載の方法。
  24. 第二の抗癌治療法とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが逐次的に投与される、請求項１９に記載の方法。
  25. 抗癌治療法が、細胞毒性剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗血管新生剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第三の抗癌治療法の有効量を投与することを更に含む、請求項１９に記載の方法。
  26. 第三の抗癌治療法、第二の抗癌治療法及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが同時に投与される、請求項２５に記載の方法。
  27. 第三の抗癌治療法、第二の抗癌治療法及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが逐次的に投与される、請求項２５に記載の方法。
  28. ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法による治療から利益を得る可能性のある患者を決定するためのキットであって、
    ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０からなる群から選択される少なくとも一のバイオマーカーに特異的に結合することができる一組の化合物、及び
    ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法による治療に対する患者の応答性を予測するための少なくとも一のバイオマーカーのレベルを決定するための前記化合物を使用するための使用説明書を含み、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルが基準サンプル中のＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０のレベルかそれ以上のレベルであることが、患者が、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む抗癌治療法による治療から利益を受け得ることを示すキット。
  29. 化合物がタンパク質である、請求項２８に記載のキット。
  30. タンパク質が抗体である、請求項２９に記載のキット。
  31. ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０からなる群から選択される少なくとも一のバイオマーカーのレベルを検出するための化合物の一式であって、
    ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１１０からなる群から選択される少なくとも一のバイオマーカーに特異的に結合することができる少なくとも一化合物を含む一組の化合物。
  32. 化合物がタンパク質である、請求項３１に記載の一組の化合物。
  33. タンパク質が抗体である、請求項３２に記載の一組の化合物。
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