CN108753984B

CN108753984B - 预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合及其应用和试剂盒

Info

Publication number: CN108753984B
Application number: CN201810987576.XA
Authority: CN
Inventors: 刘福生; 张俊文; 苏晓东; 张梦梦; 金贵善; 米蕊芳
Original assignee: Beijing Neurosurgical Institute
Current assignee: Beijing Neurosurgical Institute
Priority date: 2018-08-28
Filing date: 2018-08-28
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2038-08-28
Also published as: CN108753984A

Abstract

本发明公开一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合及其应用和试剂盒，所述生物标志物存在于脑脊液的外泌体中，所述生物标志物组合包括：VEGF165、VEGF165b、miR‑21，所述生物标志物组合还包括：miR‑10b、miR‑485‑5p、EGFRvⅢ、VEGF‑A中的至少一种。其可以预测和诊断脑恶性胶质瘤在脑室、脑膜远处的复发转移和原位复发，准确度高。

Description

预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合及其应用和试剂盒

技术领域

本发明属于脑胶质瘤复发诊断和预测领域，具体涉及一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合及其应用和试剂盒，可以预测脑恶性胶质瘤在脑室、脑膜等远处的复发转移。

背景技术

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，发病率约占颅内肿瘤的45％，组织学分四级：I级、II级呈低恶性度，具有良性生物学特性，经过手术、放疗和化疗等综合治疗后，其5年生存率为45～60％；III级和IV级为高级别胶质瘤，特别是胶质母细胞瘤，由于呈弥漫浸润性生长，即使通过手术、放疗、化疗等综合治疗措施，中位生存期仅为18个月(III)及12个月(IV)。

近年来随着分子生物学和基因组学研究进展、治疗方法的不断发展以及手术技术提高，部分患者生存期超过3年。最新临床研究发现此类患者(约占20％)术后会突然复发或向脑室、脑膜等远处转移，一旦发生，进展迅速。

目前常规诊断脑胶质瘤方法如MR、CT、PET-CT等不能早期预测胶质瘤是否有原发部位及脑室、脑膜等部位转移倾向，因此提供一种预测脑恶性胶质瘤术后复发及脑室、脑膜等远处部位侵袭和转移的方法，提前干预该类患者对于改善脑胶质瘤疗效有着重要的意义。

临床上常采用多种肿瘤标志物联合检测，实验证明同一肿瘤含有多种肿瘤标志物，而不同肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型，除有共同的标志物外，也可有不同的标志物。对某一特定的肿瘤测定，可同时选择几种特异性较高的标志物，互相补充来提高诊断的阳性率。但是，鉴于标志物遴选和联合的复杂性，目前还没有针对于预测复发性脑恶性胶质瘤远处侵袭和/或转移的检测方法和检测专用试剂盒，目前的科研和临床工作中亟需此类标志物组合和试剂盒。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合。

本发明的目的之二在于提供上述生物标志物组合的应用。

本发明的目的之三在于提供一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合，所述生物标志物存在于脑脊液的外泌体中，所述生物标志物组合包括：VEGF165、VEGF165b、miR-21。

在上述生物标志物组合中，作为一种优选实施方式，所述生物标志物组合还包括：miR-10b、miR-485-5p、EGFRvⅢ、VEGF-A中的至少一种。

上述生物标志物组合在制备用于预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的试剂中的应用。

在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述脑恶性胶质瘤术后复发包括原位复发和远处转移复发。

在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述试剂是通过实时定量PCR法检测所述生物标志物组合中各种生物标志物表达量的试剂。

一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的试剂盒，所述试剂盒包括：用于检测所述生物标志物组合中各种生物标志物表达量的试剂。

在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂包括：用于扩增所述生物标志物组合中各种所述生物标志物编码基因的特异性引物或特异性探针。

在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，各种所述生物标志物编码基因的特异性引物如下：

用于扩增EGFRvⅢ编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；

用于扩增VEGF-A编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；

用于扩增VEGF165编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；

用于扩增VEGF165b编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:8所示；

用于扩增miR-21编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:10所示；

用于扩增miR-10b编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:11所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:12所示；

用于扩增miR-485-5p编码基因的引物：上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:13所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:14所示。

在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括：外泌体提取试剂；外泌体RNA提取试剂；逆转录试剂；以及实时定量PCR扩增试剂。

在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括：阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为ddH₂O，所述阳性对照分别为含有EGFRvⅢ、VEGF-A、VEGF165、VEGF165b、miR-21、miR-10b、miR-485-5p编码基因的核苷酸碱基序列的质粒。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明通过检测脑脊液外泌体中的miRNA表达水平、EGFR的突变(EGFRvⅢ)以及VEGF-A的可变剪切来预测恶性脑胶质瘤术后复发的风险，特别是远处转移复发的预测，为此类脑胶质瘤患者的治疗提供临床依据。

2、本发明抽取脑胶质瘤患者的脑脊液，提取其外泌体，RT-PCR方法鉴定外泌体EGFRvⅢ、VEGF-A、VEGF-A中VEGF165b与VEGF165的比率、以及miR-21、miR-10b、miR-485-5p的表达，预测恶性脑胶质瘤术后远处着床侵袭和转移的风险。

3、本发明的方法简便易行，预测或诊断恶性脑胶质瘤术后远处着床侵袭和转移的风险的准确率高。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非特别指明，本发明所使用的试剂和材料均可通过商业途径获得。

除非另有说明，本申请的实施将采用常规的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和基因学技术，其均在本领域常规技术手段的范围内。在文献中对此类技术进行了详细说明如Molecula r Cloning:A La bora tory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，1984版)；AnimalCellCulture(R.I.Freshney，1987版)；Methods in Enzymology丛书(美国学术出版社有限公司)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等，1987版，和定期更新)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等，1994版)。本申请中使用的引物、探针和试剂盒可以采用本领域公知的标准技术制备。

除非另有定义，本申请所使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。

研究表明，脑胶质瘤复发和转移与脑胶质瘤细胞分泌到脑脊液中的外泌体密切相关。通过分析其外泌体的成分，建立预测脑恶性胶质瘤术后复发及脑室、脑膜远处转移倾向的方法，为提早干预治疗脑胶质瘤，延长脑胶质瘤患者的生存期具有重要意义。

脑胶质瘤脑脊液中的外泌体，主要成分包括miRNA、蛋白如VEGF-A、EGFRvⅢ等，其中人类胶质母细胞瘤外泌体miRNA包括：miR-21(NCBI的gene ID：406991)、miR-10b(NCBI的gene ID：406903)、miR-485-5p(NCBI的gene ID：574436)。miR-485-5p是一个抑制肿瘤生长的miRNA，其作用的靶点为survivin(乳腺癌)，而在肺癌中通过靶向IGFBP2从而抑制肺癌细胞的生长。检测miRNA的方法可以为实时定量PCR法。

胶质母细胞瘤患者病理组织中检测到突变EGFRvⅢ(表皮生长因子受体变体III)，其脑脊液提取的外泌体中亦含有大量的EGFRvⅢ。人类表皮生长因子受体(epidermalgrowth factorreceptor，EGFR)基因定位于染色体7p12，NCBI的Gene ID:1956，编码一种跨膜酪氨酸激酶受体(EGFR/Erb/Herl)，与其配体EGF结合后可启动细胞核内基因表达，从而促进细胞分裂增殖。在胶质母细胞瘤患者的脑脊液中EGFR外显子2-7框内缺失会形成EGFRvⅢ重排。检测EGFRvⅢ重排的方法包括：实时定量PCR，免疫组织化学，多重探针依赖式扩增技术等，在本发明中采用了实时定量PCR。

VEGF-A，在NCBI的gene ID：7422，其为血管内皮生长因子，又称血管通透因子，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。外泌体中VEGF-A不同剪接形式决定了VEGF-A对血管生成的作用，VEGF-A通过RNA可变剪切可以产生多种不同形式的VEGF-A。可变剪切产生的VEGF165和VEGF165b氨基酸序列差别在于羧基端的6个氨基酸，由“CDKPRR”变为“SLTRKD”。其中VEGF165为VEGF-A主要存在形式，VEGF165结合其受体VEGFR2激活RAS/RAF/MEK/ERK信号通路，促进内皮细胞增殖及新生血管生成；而VEGF165b与VEGF165竞争结合其受体，抑制VEGF信号通路。因此，脑脊液外泌体中VEGF165b与VEGF165的相对比例决定对血管生成的作用。VEGF-A、VEGF165b与VEGF165的浓度可以采用市场有售的试剂盒进行检测，本发明采用实时定量PCR法进行检测。

本发明中涉及的脑恶性胶质瘤术后复发包括原位复发和远处转移复发。

第一方面，本发明提供一种预测脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合，所述生物标志物存在于脑脊液的外泌体中，所述生物标志物组合包括：蛋白VEGF165、蛋白VEGF165b、miR-21。本发明中将这三种生物标志物组合使用来预测脑恶性胶质瘤术后复发概率具有一定的准确度。对于原位复发的预测准确度可以达到60％，对于远处转移复发的预测准确度可以达到58％。

优选地，所述生物标志物组合还包括：miR-10b、miR-485-5p、EGFRvⅢ、VEGF-A中的至少一种。更优选地，当标志物组合为蛋白VEGF165、蛋白VEGF165b、miR-21、miR-10b、蛋白EGFRvⅢ、蛋白VEGF-A，对于原位复发的预测准确度可以达到80％，对于远处转移复发的预测准确度可以达到78％。当标志物组合为VEGF165、VEGF165b、miR-21、EGFRvⅢ、VEGF-A、miR-485-5p时，对于原位复发的预测准确度可以达到76％，对于远处转移复发的预测准确度可以达到73％。当标志物组合为VEGF165、VEGF165b、miR-485-5p、miR-21、miR-10b、EGFRvⅢ、VEGF-A时，对于原位复发的预测准确度可以达到87％，对于远处转移复发的预测准确度可以达到90％。

发明人在进行本发明技术方案的摸索过程中，也尝试了其他标志物的组合，当标志物组合中不含有VEGF165、VEGF165b、miR-21时，而采用其他标志物比如PTEN突变和TP53突变替换VEGF165、VEGF165b、miR-21时，则无论是预测原位复发还是预测远处转移复发的准确率都比较低。例如将EGFRvⅢ、VEGF-A、miR-485-5p与PTEN突变和TP53突变组合使用，预测原位复发和预测远处转移复发的准确率都低于40％。

第二方面，本发明还提供了上述生物标志物组合在制备用于预测脑恶性胶质瘤术后复发的试剂中的应用。

对于上述生物标志物中的蛋白，可以通过实时定量PCR、探针、Western blot免疫组织化学等技术进行检测，对于miRNA则可以通过实时定量PCR和探针的方法进行检测。

优选地，所述试剂是通过实时定量PCR法检测所述生物标志物组合中各种生物标志物表达量的试剂。

第三方面，本发明还提供了一种预测脑恶性胶质瘤术后复发的试剂盒，包括：用于检测所述生物标志物组合中各种生物标志物表达量的试剂。

所述试剂优选包括：用于扩增所述生物标志物组合中各种所述生物标志物编码基因的特异性引物或特异性探针。

优选地，各种所述生物标志物编码基因的特异性引物如下：

所述试剂盒还包括完成上述生物标志物准确定量的其他试剂，比如：外泌体提取试剂；外泌体RNA提取试剂；逆转录试剂；实时定量PCR扩增试剂。这些试剂都可以是市售产品。

为了保证测量结果的可靠性，所述试剂盒还包括：阴性对照、阳性对照以及扩增内参GAPDH的引物；所述阴性对照为ddH₂O，所述阳性对照分别为含有EGFRvⅢ、VEGF-A、VEGF165、VEGF165b、miR-21、miR-10b、miR-485-5p编码基因的核苷酸碱基序列的质粒，比如这些目的基因可以插到pBR322载体上。在采用实时定量PCR测定各种生物标志物的表达量的同时测定内参GAPDH的表达量，然后用测得的目的基因的表达量除以内参基因的表达量，得到的比值为目的基因的相对表达量，其用于预测脑恶性胶质瘤术后复发的可能性。扩增内参GAPDH的引物如下：上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:15所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:16所示。

上述试剂盒还包括：辅助反应液，该辅助反应液包括：缓冲液、Taq酶、dNTPs、Mg²⁺、绿色荧光染料、无RNase去离子水；优选地，该辅助反应液采用宝生物工程(大连)有限公司(大连TaKaRa公司)的产品

Premix Ex Taq^TM II。

第四方面，本发明提供一种预测复发性脑恶性胶质瘤术后复发(包括原位复发、远处侵袭和/或转移)的方法。

上述方法根据患者脑脊液中的外泌体中生物标志物的变化情况判断上述恶性胶质瘤的远处侵袭和/或转移。

上述外泌体中生物标志物至少合包括：VEGF165、VEGF165b、miR-21。优选地，所述生物标志物组合还包括：miR-10b、miR-485-5p、EGFRvⅢ、VEGF-A中的至少一种。当标志物组合为VEGF165、VEGF165b、miR-21、miR-10b、EGFRvⅢ、VEGF-A，对于原位复发的预测准确度可以达到80％，对于远处转移复发的预测准确度可以达到78％。当标志物组合为VEGF165、VEGF165b、miR-21、EGFRvⅢ、VEGF-A、miR-485-5p时，对于原位复发的预测准确度可以达到76％，对于远处转移复发的预测准确度可以达到73％。当标志物组合为VEGF165、VEGF165b、miR-485-5p、miR-21、miR-10b、EGFRvⅢ、VEGF-A时，对于原位复发的预测准确度可以达到95％，对于远处转移复发的预测准确度可以达到90％。

上述方法中，当受试者脑脊液外泌体的各种生物标志物的基因表达量测定值除以内参GAPDH表达量后得到的相对表达量均满足以下指标时预测其原位复发风险特别大，需要提前进行干预治疗：2.5≤受试者EGFRvⅢ的相对表达量/初次发病的原发组EGFRvⅢ的相对表达量的平均值＜4.5，4.2≤受试者VEGF-A的相对表达量/正常人对照组的VEGF-A相对表达量的平均值＜5.4，3.5≤受试者VEGF165与VEGF165b的比值/正常人对照组的VEGF165与VEGF165b的比值的平均值＜5.5，4.5≤受试者miR-21的相对表达量/正常人对照组的miR-21相对表达量的平均值＜5.9，0.2＜受试者miR-485-5p的相对表达量/正常人对照组的miR-485-5p相对表达量的平均值≤0.28，4.1≤受试者miR-10b的相对表达量/正常人对照组的miR-10b相对表达量的平均值＜5.5。

上述方法中，当受试者脑脊液外泌体的各种生物标志物的基因表达量测定值除以内参GAPDH表达量后得到的相对表达量均满足以下指标时预测其远处转移复发风险特别大，需要提前进行干预治疗：受试者EGFRvⅢ的相对表达量/初次发病的原发组EGFRvⅢ的相对表达量的平均值的比值≥4.5，受试者VEGF-A的相对表达量/正常人对照组的VEGF-A相对表达量的平均值≥5.4，受试者VEGF165与VEGF165b的比值/正常人对照组的VEGF165与VEGF165b的比值的平均值≥5.5，受试者miR-21的相对表达量/正常人对照组的miR-21相对表达量的平均值≥5.9，受试者miR-485-5p的相对表达量/正常人对照组的miR-485-5p相对表达量的平均值≤0.2，受试者miR-10b的相对表达量/正常人对照组的miR-10b相对表达量的平均值≥5.5。

以下将限定上述范围的端点值称为cutoff值。

各个cutoff值是通过对正常组、初次原发组、原位复发组和远处转移复发组的各组数据进行均值和标准差的统计分析后得到的，比如2.5≤受试者EGFRvⅢ的相对表达量/初次发病的原发组EGFRvⅢ的相对表达量的平均值＜4.5中的2.5是将原位复发组的全部数据取平均值后再减去5倍SD/初次发病的原发组EGFRvⅢ的相对表达量的平均值，4.5是将远处转移复发组的全部数据取平均值后再减去5倍SD/初次发病的原发组EGFRvⅢ的相对表达量的平均值。4.2≤受试者VEGF-A的相对表达量/正常人对照组的VEGF-A相对表达量的平均值＜5.4中的4.2是原位复发组的VEGF-A全部数据取平均值后再减去5倍SD/正常人对照组的VEGF-A相对表达量的平均值，5.4是将远处转移复发组的VEGF-A全部数据取平均值后再减去5倍SD/正常人对照组的VEGF-A相对表达量的平均值。依次类推获取其他cutoff值。

所述初次发病的原发组的脑脊液外泌体来自北京天坛医院的100位初次诊断为脑胶质瘤的病患，年龄分布在40-60岁之间，EGFRvⅢ的相对表达量的平均值是将这100位初次诊断为脑胶质瘤的病患的EGFRvⅢ的相对表达量取平均值。

所述正常人对照组的脑脊液外泌体来自北京天坛医院的50位非肿瘤患者，由于完全健康的人不会去抽取脑脊液，所以正常人对照组的数据获取非常困难，本发明选用了癫痫病人的脑脊液，目前的研究资料显示，癫痫病人的脑脊液外泌体中VEGF165、VEGF165b、miR-485-5p、miR-21、miR-10b、EGFRvⅢ、VEGF-A的表达量与正常人相比并没有异常变化。

当只有受试者的VEGF165/VEGF165b和miR-21符合上述原位复发条件时，原位复发预测准确度可以达到60％，而当只有受试者的VEGF165/VEGF165b和miR-21符合远处转移复发的条件时，远处转移复发的预测准确度可以达到58％。

当受试者的VEGF165/VEGF165b、miR-21、miR-10b、EGFRvⅢ、VEGF–A均符合上述原位复发条件时，原位复发的预测准确度可以达到80％；当受试者的VEGF165/VEGF165b、miR-21、miR-10b、EGFRvⅢ、VEGF-A均符合上述远处转移复发条件时，远处转移复发的预测准确度可以达到78％。

当受试者的VEGF165/VEGF165b、miR-21、miR-485-5p、EGFRvⅢ、VEGF-A均符合上述原位复发条件时，原位复发的预测准确度可以达到76％，当受试者的VEGF165/VEGF165b、miR-21、miR-485-5p、EGFRvⅢ、VEGF-A均符合上述远处转移复发条件时，远处转移复发的预测准确度可以达到73％。

当受试者的VEGF165/VEGF165b、miR-21、miR-10b、miR-485-5p、EGFRvⅢ、VEGF-A均符合上述原位复发条件时，原位复发的预测准确度可以达到87％，当受试者的VEGF165/VEGF165b、miR-21、miR-10b、miR-485-5p、EGFRvⅢ、VEGF-A均符合上述远处转移复发条件时，远处转移复发的预测准确度可以达到90％。

具体地，上述方法包括以下步骤：

步骤一、外泌体提取：对患者的脑脊液进行外泌体提取处理，得到外泌体。

上述外泌体提取处理包括以下分步骤：

分步骤一、离心：将新鲜的患者的脑脊液进行第一次离心处理，于0-4℃，100-500g离心10-30min(优选为4℃，300g，15min)，去除培养基中悬浮的细胞以及细胞碎片，得到第一次离心上清液；再将该第一次离心上清液进行第二次离心处理，于0-4℃，5000-20000g离心10-40min(优选为4℃，10000g，30min)，除去细胞器和其他杂质，得到第二次离心上清液。

分步骤二、浓缩：将该第二次离心上清液于10-50KD(优选为30KD)的浓缩管中，于0-4℃，1000-5000g(优选为4℃，3000g)进行离心浓缩处理，得到浓缩液，该浓缩液的体积为原体积的1/10至1/100，优选为1/30至1/50。

分步骤三、孵育：将上述浓缩液与总外泌体分离液(Total Exosome Isolation；优选采用Thermo，4478359)混合以(1-3)：1，优选为2:1的体积比混合，震荡混匀后，0-8℃(优选为4℃)过夜孵育，得到孵育后的混合液。

分步骤四、分离：将该孵育后的混合液于0-4℃，5000-20000g离心0.5-1.5h(优选为4℃，10000g，1h)，弃上清液保留沉淀，该沉淀即为外泌体。

步骤二、外泌体RNA提取：对上述外泌体进行RNA提取处理，得到外泌体RNA。

上述RNA提取处理包括以下分步骤：

分步骤一：将上述沉淀(即外泌体)中加入Trizol和氯仿混合液，该混合液中Trizol和氯仿的体积比为(1-5)：1，剧烈震荡10-60s，优选为15-30s，冰上放置1-10min，优选为5min，再于0-4℃，5000-20000g离心1-30min(优选为4℃，12000g，15min)，取上层水相。

分步骤二：将该上层水相与预冷的异丙醇混匀，该上层水相与异丙醇的体积比为(1-3)：(1-3)，优选为2：3，于0-4℃静置10-30min(优选为4℃，20min)，再于0-4℃，5000-20000g离心1-30min(优选为4℃，12000g，10min)，弃上清保留沉淀。

分步骤三：将上述沉淀与体积百分比60-95％，优选为75％的乙醇溶液1-2ml混匀，该乙醇溶液是用DEPC处理过的ddH₂O配制的；再于0-4℃，5000-10000g离心1-10min(优选为4℃，7500g，5min)，弃上清保留沉淀；再将该沉淀室温干燥5-10min，得到干燥后沉淀。

分步骤四：向该干燥后沉淀中加入DEPC处理过的ddH₂O 10-20μl溶解RNA，得到外泌体RNA溶液。

分步骤五：采用分光光度计测量上述RNA溶液的浓度及质量，OD260/280比值在1.6-1.8之间时，进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，将上述RNA溶液于-70℃保存，或进行下一步反转录实验。

步骤三、逆转录：将上述外泌体RNA进行逆转录反应，得到外泌体cDNA。

上述逆转录反应优选采用Promega反转录系统，包括以下分步骤：

分步骤一：在无Rnase的环境中，将上述外泌体RNA溶液(其中RNA为1-6μg，优选为2μg)中加入DEPC水，再于60-80℃孵育5-20min(优选为70℃，10min)，再将孵育后的外泌体RNA混合液放置于冰上。

分步骤二：按照下表的用量配制RNA逆转录体系(优选为20μl体系)，再向其中加入上述外泌体RNA混合液，混匀，与42℃温育3-10min(优选为5min)。

反转录PCR体系如下：

分步骤三：再向上述反转录PCR体系中加入AMV反转录酶(优选为15U)，混匀，于42℃反应0.5-1.5h，优选为1h，得到完成反应的体系。

分步骤四：将上述完成反应的体系于90-100℃加热2-10min(优选为95℃，5min)，失活AMV酶使反应终止；再将终止反应的体系冰浴2-10min，优选为5min，此时获得第一链cDNA，即外泌体cDNA，可保存于-20℃，或直接进行下一步实验。

步骤四、实时定量PCR扩增：将上述外泌体cDNA进行实时定量PCR扩增反应，得到扩增产物。

上述实时定量PCR扩增反应优选采用宝生物工程(大连)有限公司(大连TaKaRa公司)的

Premix Ex TaqTM II荧光染料产品，其中包括

Premix Ex Taq^TMII(包括有缓冲液、Taq酶、dNTPs、Mg²⁺、绿色荧光染料、无Rnase去离子水)。

上述实时定量PCR扩增反应体系如下表，该体系在冰上配制，并避免强光照射。

上述外泌体中不同标志物的cDNA分别在不同的体系中进行PCR扩增反应。

步骤五、数据分析：检测和计算各种标志物的cDNA表达量，然后以内参GAPDH(但miRNA类标志物除外，其以U6作为内参)为对照进行归一化处理得到各种标志物的相对表达量，然后按照上面的判断标准，作出上述恶性胶质瘤原位复发或远处转移复发的风险大小的判定。

实施例1

本实施例为预测脑胶质瘤术后复发的试剂盒。

上述试剂盒包括qRT-PCR扩增引物，该扩增引物包括：

外泌体EGFRvⅢ的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；和/或

外泌体VEGF-A的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；和

外泌体VEGF165的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；和

外泌体VEGF165b的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:8所示；和

外泌体miR-21的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:10所示；

外泌体miR-10b的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:11所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:12所示。

扩增内参GAPDH的引物如下：上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:15所示，下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:16所示。

上述试剂盒还包括：阴性对照和阳性对照；上述阴性对照为ddH₂O，上述阳性对照为含有EGFRvⅢ、VEGF-A、VEGF165b、miR-21、miR-485-5p和miR-10b序列的pBR322质粒。

Premix Ex Taq^TM II。

实施例2

本实施例为预测脑胶质瘤术后复发的方法。

上述方法包括以下步骤：

1、提取外泌体

步骤如下：

(1)收集新鲜的患者的脑脊液于离心管中，4℃，300g离心15分钟，去除培养基中悬浮的细胞以及细胞碎片；

(2)将上清液移入新的离心管中，4℃，10,000g离心30分钟，除去细胞器和其他杂质；

(3)将上清液移入30KD的浓缩管中，4℃，3000g离心浓缩，将培养基浓缩至原体积的1/30至1/50；

(4)将浓缩后的培养基与Total Exosome Isolation(Thermo，4478359)以2:1的体积比混合，震荡混匀后，4℃过夜孵育；

(5)然后将孵育后的混合液在4℃、10,000g离心1小时，沉淀即为外泌体；

2、提取外泌体中的RNA

(1)EP管加入0.6ml Trizol；每ml Trizol中加氯仿200μl于EP管中，剧烈震荡15-30s，冰上放置5min，4℃12000g离心15min；

(2)取上层水相入新EP管中，加入预冷的2/3体积的异丙醇充分混匀，冰上静置20min，4℃12000g离心10min；

(3)弃上清，加入75％乙醇(DEPC处理过的ddH₂O配制)1-2ml混匀，4℃7500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min；

(4)加入DEPC处理过的ddH₂O 10-20μl溶解RNA。

(5)分光光度计测RNA的浓度及质量，OD260/280比值在1.6-1.8之间并进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，-70℃保存或进行反转录实验。

3、逆转录：

反转录获得cDNA(使用Promega反转录系统)

(1)在无Rnase的EP管中，加入2ug总RNA和一定量的DEPC水(用量由反应体系决定)，于70℃孵育10min，冰上放置，并进行下一步；

(2)以20μl反应体系为例，按下表所列加入各组分(各组分用量随反应体系不同成比例调整)，配制成混合液，与上步中RNA溶液混匀，于42℃温育5min；

反转录PCR体系如下：

(3)加入15U的AMV反转录酶，混匀，于42℃反应1h；

(4)于95℃煮样5min，失活AMV酶使反应终止，冰浴5min，此时获得第一链cDNA，可保存于-20℃，或直接进行下一步实验。

4、实时定量PCR扩增

荧光实时定量PCR(qRT-PCR)使用

Premix Ex TaqTM II荧光染料

(1)qRT-PCR反应体系在冰上配制，且避免强光照射，各组分及用量如下表所示：

qRT-PCR反应程序中，具体反应条件如下：

各对设计引物所扩增的目的片段通常控制在300bp左右，各种目的片段的扩增条件如下：预变性：95℃30秒；然后以95℃、5秒，60℃、30秒的程序循环40次。

扩增引物如下：

(2)qRT-PCR反应结束后，进行数据分析，得到各个标志物的基因相对表达量。然后按照下面标准分别预测原位复发风险和远处转移复发风险的高低。。

受试者脑脊液外泌体的各个标志物的基因相对表达量均满足以下指标时预测其原位复发风险特别大，需要提前进行干预治疗：2.5≤受试者EGFRvⅢ的相对表达量/初次发病的原发组EGFRvⅢ的相对表达量的平均值＜4.5，4.2≤受试者VEGF-A的相对表达量/正常人对照组的VEGF-A相对表达量的平均值＜5.4，3.5≤受试者VEGF165与VEGF165b的比值/正常人对照组的VEGF165与VEGF165b的比值的平均值＜5.5，4.5≤受试者miR-21的相对表达量/正常人对照组的miR-21相对表达量的平均值＜5.9，0.2＜受试者miR-485-5p的相对表达量/正常人对照组的miR-485-5p相对表达量的平均值≤0.28，4.1≤受试者miR-10b的相对表达量/正常人对照组的miR-10b相对表达量的平均值＜5.5。

当受试者脑脊液外泌体的各种生物标志物的基因相对表达量均满足以下指标时预测其远处转移复发风险特别大，需要提前进行干预治疗：受试者EGFRvⅢ的相对表达量/初次发病的原发组EGFRvⅢ的相对表达量的平均值的比值≥4.5，受试者VEGF-A的相对表达量/正常人对照组的VEGF-A相对表达量的平均值≥5.4，受试者VEGF165与VEGF165b的比值/正常人对照组的VEGF165与VEGF165b的比值的平均值≥5.5，受试者miR-21的相对表达量/正常人对照组的miR-21相对表达量的平均值≥5.9，受试者miR-485-5p的相对表达量/正常人对照组的miR-485-5p相对表达量的平均值≤0.2，受试者miR-10b的相对表达量/正常人对照组的miR-10b相对表达量的平均值≥5.5。

试验例1

本试验例是利用现有病患资料进行统计分析的试验例。

正常组是指非肿瘤患者，非肿瘤患者的脑脊液均取自北京天坛医院的癫痫病人术后收集的脑脊液，共50例，无其他疾病，年龄分布在40-60岁之间，将其作为正常对照组。由于完全健康的人难以获得其脑脊液，所以本发明选用了癫痫患者术后的脑脊液作为对照组。目前的研究资料并未显示，癫痫病人的脑脊液外泌体中VEGF165、VEGF165b、miR-485-5p、miR-21、miR-10b、EGFRvⅢ、VEGF–A的表达量与正常人相比存在异常。因此可以将其作为正常对照组。

原发组是指初次发病且未进行治疗的病患，原发组的脑脊液来自北京天坛医院，共100位，年龄分布在40-60岁之间。

复发组包括原部位复发组和远处转移复发组(即远处转移复发组)，是指第一次发病经治疗后又再次复发的病患(高级别脑胶质瘤患者(III和IV))，复发组共214例，年龄分布在40-60岁之间，其中原部位复发138例，远处转移组76例。

原发组和复发组病患的病理组织均来自北京天坛医院神经外科。

按照实施例2的方法提取正常组、原发组和复发组病患脑脊液中的外泌体，然后再提取其RNA，反转录后采用qRT-PCR的方法检测外泌体中EGFRvⅢ、VEGF-A、miR-21、VEGF₁₆₅、VEGF_165b、miR-10b、miR-485-5p的表达量，然后利用内参GAPDH的表达量(miRNA用U6)，将上述数据进行归一化处理，从而得到EGFRvⅢ、VEGF-A、miR-21、VEGF₁₆₅、VEGF_165b、miR-10b、miR-485-5p的相对表达量。最后进行数据统计分析，EGFRvⅢ平均表达水平中原发组的EGFRvⅢ表达量的全部数据的平均值，将其定位1；原位复发组的EGFRvⅢ平均表达水平是原位复发组的EGFRvⅢ表达量的全部数据的平均值除以原发组EGFRvⅢ表达量的全部数据的平均值得到的，即原位复发组EGFRvⅢ相对于原发组EGFRvⅢ的表达量的倍数。远处转移复发组中EGFRvⅢ平均表达水平是远处转移复发组的EGFRvⅢ表达量的全部数据的平均值除以原发组全部数据的平均值得到的，即远处转移复发组EGFRvⅢ相对于原发组EGFRvⅢ的表达量的倍数。

正常组的VEGF-A平均表达水平是正常组VEGF-A表达量全部数据的平均值，并将其定位1；原发组的VEGF-A平均表达水平是原发组的VEGF-A表达量的全部数据的平均值除以正常组VEGF-A表达量的全部数据的平均值得到的，即原发组VEGF-A相对于正常组VEGF-A的表达量的倍数。原位复发组的VEGF-A平均表达水平是原位复发组的VEGF-A表达量的全部数据的平均值除以正常组VEGF-A表达量的全部数据的平均值得到的，即原位复发组VEGF-A相对于正常组VEGF-A的表达量的倍数。远处转移复发组的VEGF-A平均表达水平是远处转移复发组的VEGF-A表达量的全部数据的平均值除以正常组VEGF-A表达量的全部数据的平均值得到的，即远处转移复发组VEGF-A相对于正常组VEGF-A的表达量的倍数。

VEGF₁₆₅/VEGF_165b的平均表达水平、miR-21、miR-10b、miR-485-5p的平均表达水平的计算方法同VEGF-A的平均表达水平的计算方法，这里不再赘述。具体统计结果参见下表1。

表1

由表1的结果可以得知，高级别胶质瘤中远处转移倾向的胶质瘤脑脊液外泌体中的EGFRvⅢ突变的表达量明显都高于其他组，miR-485-5p的表达量明显低于其他组，VEGF-A、VEGF₁₆₅/VEGF_165b、miR-10b、miR-21的表达量明显高于其他组。而原位复发组的胶质瘤脑脊液外泌体中的EGFRvⅢ突变的表达量介于原发组和远处转移组之间，miR-485-5p的表达量介于原发组和远处转移组之间，VEGF-A、VEGF₁₆₅/VEGF_165b、miR-10b、miR-21的表达量也介于原发组和远处转移组之间。由此可以确定上述miRNA和蛋白质与胶质瘤复发具有相关性。

发明人还对这些高级别脑胶质瘤患者的病理组织进行了分析，得到的结果与表1类似，由此证明外泌体中上述标志物表达水平与病理组织中该标志物的表达水平基本一致。即可以通过外泌体中特定标志物的表达水平对脑胶质瘤复发进行预测和诊断。

试验例2

该试验例采用盲测的方式验证本发明标志物组合对预测或诊断脑胶质瘤复发的准确度。

待测的病患脑脊液来自北京天坛医院神经外科。其中，正常组(癫痫病人)25人，原发组(初次发病且未进行治疗的病患)42人，原部位复发组78人，远处转移复发组36人。在检测人员不清楚这些脑脊液属于哪个组的情况下，采用本发明方法进行检测并按照上述标准判断其属于哪个组，由此推断本发明方法的准确性。

当采用VEGF165/VEGF165b和miR-21作为判断标志物时，诊断原位复发的准确度为55％，诊断远处转移复发的准确度为53％。

当采用的标志物组合为VEGF165、VEGF165b、miR-21、miR-10b、EGFRvⅢ、VEGF-A时，诊断原位复发的准确度为79％，诊断远处转移复发的准确度为78％。

当采用的标志物组合为VEGF165、VEGF165b、miR-21、EGFRvⅢ、VEGF-A、miR-485-5p时，诊断原位复发的准确度为78％，诊断远处转移复发的准确度为72％。

当采用的标志物组合为VEGF165、VEGF165b、miR-485-5p、miR-21、miR-10b、EGFRvⅢ、VEGF-A时，诊断原位复发的准确度为87％，诊断远处转移复发的准确度为89％。

试验例3

本试验例是通过Transwell实验鉴定胶质瘤细胞侵袭能力，验证了外泌体EGFRvⅢ、VEGF-A、VEGF165、VEGF165b、miR-21、miR-10b作为生物标志物确实与细胞的侵袭和迁移相关。

上述Transwell实验方法包括以下步骤：

1、融化BD Matrigel为液态备用。

2、用50mg/L Matrigel与DMEM培养基(预冷的)按照1:8稀释，混匀得到培养液。

3、每孔取100-150μl培养液包被Transwell小室底部膜的上室面，37℃保温30min或者室温过夜使Matrigel聚合成凝胶；

4、然后水化基底膜，吸出培养板中残余的液体，每孔加入200μl预温的培养液，室温水化30min，再吸去剩余培养液；

5、待胶质瘤细胞(U87MG，购自ATCC)生长至汇合率为85％，状态良好时，消化细胞，用无血清DMEM培养基重悬细胞，计数调整密度至2×105个/ml获得细胞悬液。

6、在Transwell小室(24孔板，8板)加入以下细胞：包括五个处理组，其中处理组1-2：在第1处理组中加入过表达EGFRvⅢ的U87细胞株悬液(该悬浮液利用含有EGFR vⅢ基因的慢病毒转染U87细胞，流式细胞仪筛选阳性细胞)(细胞密度2×10⁵个/ml)。在第2处理组中加入过表达VEGF_165b的U87细胞株悬液(该悬浮液利用含有VEGF_165b基因的慢病毒转染U87细胞，流式细胞仪筛选阳性细胞)(细胞密度2×10⁵个/ml)。第3-5处理组中，上室加入细胞悬液约200μl，再分往这3个处理组分别添加贝伐单抗(VEGF-A抑制剂)、antigomiR-21(miR-21抑制剂)、antigomiR-10b(miR-10b抑制剂)。同时在各处理组下室加入600μL含15％FBS的DMEM培养基，在37℃，5％的CO₂条件下培养24小时，每个处理组重复3个样本。

7、用棉擦去除上室底部基质并用PBS漂洗移除未侵袭细胞。用4％PFA固定30分钟，PBS洗5次，3分钟/次。亚甲蓝溶液染色25分钟，自来水冲洗，PBS清洗3次，5分钟/次；取下聚碳酸脂膜，置于载玻片上，并覆盖盖玻片。

8、计数及统计学分析：随机选择10个40倍倒置显微镜统计视野中的总细胞数，以侵袭细胞的相对数目标示肿瘤细胞的侵袭能力。取平均值。采用Student-t检验，分析各组之间的差异是否具有统计学意义。结果如下表所示。

以不经过处理的U87MG的细胞为对照，其侵袭率理论上是100％。

表中数据说明：组1，因为EGFRvⅢ过表达，所以细胞侵袭率增加到143％了；组2，因为VEGF_165b过表达，所以VEGF₁₆₅/VEGF_165b的比值下降，故细胞侵袭率下降到75％了；组3-5：因为VEGF-A、miR-21、miR-10b的表达被抑制剂抑制，故细胞侵袭率下降到65-81％。

试验例4

本试验例为实施例1的试剂盒、实施例2的预测方法在患者中的应用，主要是预测脑胶质瘤复发的准确度检测。

收集了100例已经进行手术、化疗治疗后9个月的高级别脑胶质瘤患者(III)的脑脊液，采用本发明方法和标准进行预测。将预测结果与跟踪寻访2年内患者的具体情况进行比较，如果预测结果与患者2年内实际发生情况相符则确定为预测准确，否则定为预测结果不准确。

当采用VEGF165/VEGF165b和miR-21作为判断标志物时，预测原位复发的准确度为50％，预测远处转移复发的准确度为50％。

当采用的标志物组合为VEGF165、VEGF165b、miR-21、miR-10b、EGFRvⅢ、VEGF-A时，预测原位复发的准确度为64％，预测远处转移复发的准确度为75％。

当采用的标志物组合为VEGF165、VEGF165b、miR-21、EGFRvⅢ、VEGF-A、miR-485-5p时，预测原位复发的准确度为72％，预测远处转移复发的准确度为63％。

当采用的标志物组合为VEGF165、VEGF165b、miR-485-5p、miR-21、miR-10b、EGFRvⅢ、VEGF-A时，预测原位复发的准确度为85％，预测远处转移复发的准确度为87％。

序列表

<110> 北京市神经外科研究所

<120> 预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合及其应用和试剂盒

<130> C1CNCN180311

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcgaccct ccgggacg 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atctgtcacc acataattac ct 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggagggcaga atcatcacga ag 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacacaggat ggcttgaaga tg 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcaccgcctc ggcttgtcac at 22

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatctagacc tcttccttca tttcagg 27

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccggtacccc atgaactttc tgc 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagatgagct tcctacagca c 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tagcttatca gactgatgtt ga 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gccagcacag aattaatacg ac 22

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taccctgtag aaccga 16

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggagtcggc aattgca 17

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccaagcttca cccattccta acaggac 27

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgggatccgt aggtcagtta catgcatc 28

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aaggtcggag tcaacggatt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctcctggaag atggtgatgg 20

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccaagcttca cccattccta acaggac 27

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgggatccgt aggtcagtta catgcatc 28

Claims

1.一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的生物标志物组合，其特征在于，所述生物标志物存在于脑脊液的外泌体中，所述生物标志物组合包括：VEGF165、VEGF165b、miR-21。

2.根据权利要求1所述的生物标志物组合，其特征在于，所述生物标志物组合还包括：miR-10b、miR-485-5p、EGFRvⅢ、VEGF-A中的至少一种。

3.一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的试剂，其特征在于，所述试剂包含：用于扩增权利要求1或2所述生物标志物组合中各种所述生物标志物编码基因的特异性引物或特异性探针。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述脑恶性胶质瘤术后复发包括原位复发和远处转移复发。

5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，各种所述生物标志物编码基因的特异性引物如下：

6.一种预测或诊断脑恶性胶质瘤术后复发的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：用于检测权利要求1或2所述生物标志物组合中各种生物标志物表达量的试剂。

7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂包括：用于扩增所述生物标志物组合中各种所述生物标志物编码基因的特异性引物或特异性探针。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，各种所述生物标志物编码基因的特异性引物如下：

9.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

外泌体提取试剂；

外泌体RNA提取试剂；

逆转录试剂；以及

实时定量PCR扩增试剂。

10.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为ddH₂O，所述阳性对照分别为含有EGFRvⅢ、VEGF-A、VEGF165、VEGF165b、miR-21、miR-10b、miR-485-5p编码基因的核苷酸碱基序列的质粒。