PT2350316E

PT2350316E - Métodos e utilizações envolvendo aberrações genéticas de nav3 e expressão aberrante de genes múltiplos

Info

Publication number: PT2350316E
Application number: PT98216443T
Authority: PT
Inventors: Kai Krohn; Annamari Ranki; Emilia Carlsson; Kristian Ovaska; Sampsa Hautaniemi
Original assignee: Valipharma
Priority date: 2008-10-20
Filing date: 2009-10-19
Publication date: 2014-06-23
Also published as: PL2350316T3; JP2012505666A; ES2469802T3; US20120058108A1; CA2740351A1; AU2009306260A1; DK2350316T3; EP2350316A1; SI2350316T1; AU2009306260B2; JP5819728B2; WO2010046530A8; EP2350316B1; WO2010046530A1; EP2350316A4; CY1115258T1; US20160083798A1

Description

ΕΡ2350316Β1

DESCRIÇÃO

MÉTODOS E UTILIZAÇÕES ENVOLVENDO ABERRAÇÕES GENÉTICAS DE NAV3 E EXPRESSÃO ABERRANTE DE GENES MÚLTIPLOS

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se aos campos da genética e oncologia e providencia métodos para detetar tumores, bem como métodos para prever o prognóstico de um paciente.

Especificamente, a presente invenção refere-se a um método de demonstrar o caráter maligno de um tumor ou subpopulação de células num sujeito e a um método de prever um prognóstico de um sujeito com um tumor com alteração do número de cópias do NAV3 e com sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR e beta-catenina. A presente invenção também se refere a utilizações do gene NAV3 ou produto génico e, pelo menos, um gene e/ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR e beta-catenina para demonstrar o caráter maligno de um tumor ou subpopulação de células, para prever um prognóstico de um sujeito com um tumor com alteração do número de cópias do NAV3. Além disso, é descrita uma utilização de um antagonista, anticorpo ou molécula inibidora de, pelo menos, um gene e/ou produto génico selecionado de listas especificas para terapêutica de cancro num sujeito.

Ainda, é descrito um kit diagnóstico que compreende ferramentas para detetar uma alteração do número de cópias do NAV3 numa amostra biológica e ferramentas para detetar a sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de listas especificas numa amostra biológica. A presente invenção também se refere a uma utilização de um gene NAV3 ou produto génico e, pelo menos, um gene e/ou 1 ΕΡ2350316Β1 produto génico selecionado de IL23R ou beta-catenina para demonstrar o caráter maligno de um tumor ou subpopulação de células, para prever um prognóstico de um sujeito com um tumor colorretal, tumor cerebral ou tumor de gueratinócitos epidérmicos e para selecionar um tratamento a um sujeito com um tumor colorretal, tumor cerebral ou tumor de queratinócitos epidérmicos.

DESCRIÇÃO A progressão de cancro é caracterizada pelo desenvolvimento de instabilidade cromossómica, aneuploidia e uma série de aberrações genéticas adquiridas que afetam genes importantes para o crescimento e sobrevivência celular. Um único gene pode afetar várias vias criticas e contribuir para a conversão de uma célula normal numa célula cancerígena, envolvendo um processo por passos que requer a ativação de oncogenes e desativação de genes supressores de tumor. Tecnologia recente permitiu a identificação de mutações mesmo raras que contribuem para o desenvolvimento de cancro. 0 desenvolvimento do cancro colorretal (CRC) através de lesões precursoras benignas, pólipos adenomatosos, juntamente com a acumulação de alterações genéticas e epigenéticas é um dos exemplos melhor conhecidos de carcinogénese em múltiplos passos. Evidência recente também sugere que o microambiente do tecido é de profunda importância para o crescimento potencial e difusão das células tumorais (Kim B.G. et al. 2006, Nature 441: 1015-9; Reuter J.A. et al. 2009, Câncer Cell 15: 477-88) e tal efeito pode ser motivado por inflamação crónica. O CRC é conhecido por estar ligado à doença inflamatória intestinal (IBD) . 2 ΕΡ2350316Β1 A grande maioria de cancros colorretais exibe um dos dois fenótipos de instabilidade genómica principais, instabilidade de microssatélites (MSI) ou instabilidade cromossómica (CIN), também designada estável nos microssatélites (MSS). Cerca de 85% do CRC está relacionado com MSS e exibe aneuploidia e perda de heterozigotia (LOH), e polipose coli adenomatosa (APC) ou mutações da beta-catenina são as aberrações moleculares iniciais mais comuns neste fenótipo. Estas mutações conduzem à ativação da via Wnt aberrante, que se pensa que inicia a formação do adenoma do cólon. Várias vias sinalizadoras estão envolvidas no desenvolvimento de cancros do cólon esporádicos. Assim, demora vários anos ou décadas para desenvolver cancro do cólon mesmo que estejam presentes mutações do gene polipose coli adenomatosa (APC). Também é necessária a ativação de KRAS, para a progressão de adenomas em carcinomas como uma segunda etapa (Phelps R.A. et al. 2009, Cell 37: 623-34). Também foi demonstrado que a perda de APC funcional induz aneuploidia in vivo através de tetraploidia transitória (Caldwell C.M. et al. 2007, J Cell Biol 178: 1109-20), que pode aumentar a aptidão das células contendo cromossomas quebrados ou rearranjados.

Mostramos previamente que as aberrações do cromossoma 12q21, especificamente a perda alélica do gene navegador do neurónio 3 (NAV3), estão associadas com vários subtipos de linfoma das células T cutâneas (CTCL) (Karenko L. et al. 2005, Câncer Res 65: 8101-10; Hahtola S et al. 2008, J Invest Dermatology 128: 2304-9; documento W02008059112 Al) e cancros do pulmão associados a CTCL (Hahtola S et al. 2008, Genes Chromosomes Câncer 47: 107-17). Mais recentemente, as mutações ou alterações do número de cópias do NAV3, respetivamente, foram reportadas em melanoma (Bleeker F. et al. 2008, Human Mutation 29: E451-59), cancro pancreático (Bleeker F. et al. 2009, Hum Mutat 3 ΕΡ2350316Β1 30(2): Ε451-9) e em glioblastomas humanos (Nord H. et al. 2009, Neuro Oncol Mar20). Além disso, verificou-se que o NAV3 era o único gene que era expresso de forma significativamente diferente (regulado para baixo) no carcinoma adrenal quando comparado com adenomas adrenocortiçais (Soon P.H. et al. 2009, ERC) . No cenário dos genes do cancro, o NAV3 pertence aos genes do cancro candidatos de "tipo colina" (CAN) vulgarmente mutados no cancro da mama e do cólon humanos (Wood L. et al. 2007,

Science 318: 1108-13). É considerado, de forma crescente, importante concentrar os esforços de investigação na identificação das vias afetadas por aberrações genéticas e providenciar, assim, ferramentas adicionais para diagnosticar doenças e para desenhar produtos farmacêuticos específicos para medicina individualizada. Neste momento, encontrámos correlações surpreendentes e previamente desconhecidas das aberrações do NAV3 com vias específicas e genes relacionados com as mesmas. Assim, providenciamos novas formas e métodos de diagnosticar ou seguir cancro.

Estão garantidos novos biomarcadores ou combinações de biomarcadores para providenciar um diagnóstico mais eficaz e precoce de tumores potencialmente agressivos, bem como identificar tumores suscetíveis de terapêuticas dirigidas. A presente invenção providencia uma solução específica para prever ou identificar a progressão de tumor e carcinoma. A presente invenção também revela uma ferramenta para avaliar a agressividade clínica de tumores e sobrevivência do paciente.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO O objeto da invenção é, assim, providenciar novos 4 ΕΡ2350316Β1 métodos e formas de demonstrar o caráter maligno de um tumor e de avaliar o estado e monitorizar um cancro, permitindo tais métodos e formas um diagnóstico preciso da doença.

Outros objetos da invenção são providenciar novos métodos e formas de prever a iniciação do tumor ou progressão do tumor, bem como prever um prognóstico de um paciente. Os métodos e formas da presente invenção são específicos e fiáveis. Os métodos e formas permitem uma intervenção terapêutica bem dirigida, que pode salvar a vida.

Ainda outro objeto da invenção é providenciar novos biomarcadores e combinações de biomarcadores úteis na deteção de cancro, bem como em avaliações de prognóstico.

Demonstrar aberrações do NAV3, associadas a metástases do nódulo linfático e a inflamação relevante e vias de proliferações celular, providenciará uma ferramenta relativamente simples e acessível para monitorizar cancro, especificamente um cancro do colorretal, cerebral ou dos queratinócitos epidérmicos. 0 NAV3 regula a expressão de outros genes e vias sinalizadoras que têm um efeito na transformação maligna e/ou no comportamento biológico do tumor maligno. Portanto, as vias afetadas por NAV3, bem como as diferentes combinações das mesmas, também são alvos para o desenho de terapêuticas anti-cancro.

As alterações do número de cópias do NAV3, especialmente a deleção de NAV3, estão diretamente envolvidas na carcinogénese precoce e abrem novas possibilidades para diagnósticos mais precisos, mas também para abordagens terapêuticas racionais. 5 ΕΡ2350316Β1 A presente invenção refere-se a um método para demonstrar o caráter maligno de um tumor ou subpopulação de células num sujeito, compreendendo o método: i) determinar a alteração do número de cópias do NAV3 numa amostra biológica do sujeito; e ii) determinar a sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina na amostra biológica ou noutra amostra biológica do sujeito; iii) demonstrar o caráter maligno de um tumor ou subpopulação de células num sujeito, quando ambas alteração do número de cópias do NAV3 e sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina estão presentes na(s) amostra(s) de um sujeito.

Um método de tratar um sujeito com um tumor com alteração do número de cópias do NAV3 e com sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina e também são descritos daqueles listados nos quadros 8-12, compreendendo uma etapa, em que, pelo menos, um gene ou produto génico com sobre-expressão é afetado. A presente invenção refere-se, ainda, a um método de prever um prognóstico compreendendo: i) determinar a alteração do número de cópias do NAV3 numa amostra biológica de um sujeito; ii) determinar a sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R ou beta-catenina, na amostra biológica ou noutra amostra biológica do sujeito; e iii) prever um prognóstico do sujeito com ambas 6 ΕΡ2350316Β1 alteração do número de cópias do NAV3 e sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R ou beta-catenina na(s) amostra(s).

Também é descrito um método de selecionar um tratamento a um sujeito, compreendendo: i) determinar a alteração do número de cópias do NAV3 numa amostra biológica do sujeito; ii) determinar a sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina e daqueles listados nos quadros 8-12, na amostra biológica ou noutra amostra biológica do sujeito; e iii) selecionar um tratamento ao sujeito com ambas alteração do número de cópias do NAV3 e sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL-23R, GnRHR, beta-catenina e daqueles listados nos quadros 8-12 na(s) amostra(s). A presente invenção refere-se, ainda, a uma utilização do gene NAV3 ou produto génico e, pelo menos, um gene e/ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina para demonstrar o caráter maligno de um tumor ou subpopulação de células com alteração do número de cópias do NAV3 e com sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina, num sujeito. A presente invenção refere-se, ainda, a uma utilização do gene NAv3 ou produto génico e, pelo menos, um gene e/ou produto génico selecionado de IL23R ou beta-catenina para prever um prognóstico de um sujeito. É, ainda, descrita uma utilização do gene NAV3 ou 7 ΕΡ2350316Β1 produto génico e, pelo menos, um gene e/ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina e dagueles listados nos quadros 8-12 para selecionar um tratamento a um sujeito. É, ainda, descrita uma utilização de, pelo menos, um gene e/ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina e daqueles listados nos quadros 8-12 para terapêutica de cancro num sujeito com um tumor com alteração do número de cópias do NAV3.

Também é revelada uma utilização de um antagonista, anticorpo ou molécula inibidora de, pelo menos, um gene e/ou produto génico selecionado de IL-23R, GnRHR, beta-catenina e daqueles listados nos quadros 8-12 para terapêutica de cancro num sujeito com um tumor com alteração do número de cópias do NAV3 e com sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina e daqueles listados nos quadros 8-12 . E, ainda, revelado um kit diagnóstico compreendendo ferramentas para detetar a alteração do número de cópias do NAV3 numa amostra biológica e ferramentas para detetar a sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina e daqueles listados nos quadros 8-12 numa amostra biológica. É, ainda, revelada uma utilização de um kit diagnóstico da invenção para demonstrar o caráter maligno de um tumor ou subpopulação de células. É, ainda, revelada uma utilização de um kit diagnóstico da invenção para prever um prognóstico de um sujeito com um tumor colorretal, tumor cerebral ou tumor de 8 ΕΡ2350316Β1 queratinócitos epidérmicos. É, ainda, revelada uma utilização de um kit diagnóstico da invenção para selecionar um tratamento a um sujeito com um tumor colorretal, tumor cerebral ou tumor de queratinócitos epidérmicos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

No que se segue, a invenção será descrita com maior detalhe por meio de modalidades preferidas com referência aos desenhos anexos, nos quais A Figura 1 mostra a quantidade de cromossoma 12 polissómico e células com NAV3 deletado em amostras de adenoma e carcinoma dos mesmos pacientes. A Figura 2 mostra A) polissomia do cromossoma 12, B) amplificação do NAV3 e C) deleção do NAV3 em amostras do cólon normal, carcinoma do cólon MSS e MSI e adenoma do cólon. Cada ponto representa uma amostra e foram contadas 200 células de todas as amostras. A Figura 3 mostra aberrações do NAV3 em linhas de células de cancro do cólon observadas por sondas BAC em relação a translocações do cromossoma 12 por MFISH especifico do braço do cromossoma ou deleções do NAV3 em relação a deleções observadas por sondas YAC. a) Uma metáfase da linha de células SW403 (CLL-230) que mostra três cópias do centrómero do cromossoma 12 (verde, Alexa 488) e um gene NAV3 em falta (vermelho; BAC RP11-36P3) num. Esta deleção foi observada num cromossoma que recebeu material translocado do cromossoma 15q (b; MFISH de braço) e foi acompanhado por duas cópias que apareceram do cromossoma 15 de tamanho completo (c, g ΕΡ2350316Β1 translocação desiquilibrada). São mostradas as respetivas colorações DAPI correspondentes nos painéis d - f. Através de FISH especifico de braço (g) , a translocação do cromossoma 15 (vermelho e violeta) foi localizada para o braço p (laranja) do cromossoma 12 (verde e vermelho carmosina) e a deleção foi verificada para o braço q. Na linha de células RKO (h - j), apenas dois de três cromossomas 12 (centrómero em verde) mostraram os sinais da sonda BAC RP11-136F16 específicos do gene NAV3 (vermelho; h) . A translocação desiquilibrada entre os cromossomas 12 (i, MFISH) e 2 (j, MFISH) aboliu o gene NAV3. Células T84 (CLL-248) mostraram várias cópias do cromossoma 12 (cen em azul; k) com sinais de NAV3 ausentes num (laranja, BAC RPll-36P3). A diferença de tamanho entre o cromossoma 12 normal e aberrante foi pequena (I, MFISH de braço), mas foram observadas deleções indicadas pelas sondas YAC 825F9 (12S326 e WI-7776, vermelho no painel m) e 885G4 (WI-6429, WI-9760, vermelho no painel n) , estendendo proximal e distalmente do gene NAV3. Foi observado um sinal específico do NAV3 (RP11-36P3, vermelho) no der (2) t (2; 12) (o) e no cromossoma normal 12 (q) , mas não nos outros dois cromossomas 12 (p - q; centrómero verde) nem nos cromossomas minutos com material cen 12 (q) . Os cromossomas aberrantes correspondents vulgarmente observados por MFISH de braço (2;12), r) der (10)t (10;12; 3),s) e i(12) (p) direito, t) juntamente com um cromossoma normal 12, t). A Figura 4 mostra perda de NAV3 numa amostra de pacientes conforme detetada pelo conjunto CGH. Vistas do fundo: visão global do genoma, cromossoma 12, nível do gene onde sondas NAV3 são marcadas com caixa quadrada. 10 ΕΡ2350316Β1 A Figura 5 mostra um dendrograma de agrupamento de GO e mapa de calor de expressão. A análise é baseada em 16 produtos génicos. 0 número mediano de anotações GO por produto génico é 8. Além disso, 23 produtos génicos não tinham gualguer anotação GO e foram excluídos da análise. As cores representam valores de expressão dos produtos génicos. Os valores de expressão mais baixos estão indicados com vermelho e expressões mais elevadas com branco. 0 dendrograma da esquerda corresponde a agrupamento com base em GO, enquanto que o dendrograma do topo utiliza valores de expressão para agrupamento. A Figura 6 mostra a comparação da expressão do NAV3. Os níveis de ARNm do NAV3 após a transfeção com ARNsi do NAV3 foram avaliados por q RTPCR LightCycler e microarrays Agilent 4 x 44 K. A Figura 7 mostra a hibridização in situ com ARN em células de glioblastoma A172 com NAV3 silenciado. 0 ARN do NAV3 foi detetado com uma sonda que reconhece exões 37-39 do ARN do NAV3 (púrpura). A expressão do NAV3 nas células silenciadas (e), células não transfetadas (a) e células transfetadas com o ARN controlo (c) . Controlos senso, com 53 mais sonda, para a, c, e e são mostrados em b, d, e f, respetivamente. A Figura 8 mostra o dendrograma de agrupamento de GO e o mapa de calor de expressão dos genes regulados para cima em oito de dez experiências knockdown. Os valores de expressão mais baixos estão indicados com vermelho e os mais elevados com branco. São mostrados o dendrograma de agrupamento com base em GO (esguerda) e amostras de grupos do dendrograma com base em perfis de expressão (direita). Os nomes dos genes estão a direita e cada coluna representa uma única experiência. Grupos 11 ΕΡ2350316Β1 GO com mais de um gene são, de baixo para cima: membrana (preto, 9 genes), transporte de ião (castanho, 2 genes), nuclear (verde, 4 genes) e de ligação ribonucleotidica (azul,2 genes). A Figura 9 mostra a expressão e localização celular do IL23R e beta-catenina no cancro colorretal e do cólon humanos. Fotomicrografias representativas de imunocoloração para IL23R (a) e beta-catenina (d) em tecido do cólon normal. Foi observada imunorreatividade de IL23R regulado para cima em amostra de cancro colorretal com deleção de NAV3 (c, grau 3 de coloração, 8% células com NAV3 deletado), ao passo gue cancros sem aberração do NAV não mostraram gualquer coloração do IL23R (b) . Ambas amostras (b e c) tinham 20% das células tumorais com polissomia do cromossoma 12. Uma amostra de CRC sem deleção do NAV3 mostrou um padrão de membrana normal da coloração com beta-catenina (e), ao passo que uma amostra de CRC com deleção do NAV3 em 9% das células mostrou localização nuclear particularmente forte da beta-catenina (f). A Figura 10 mostra a curva de distribuições de sobrevivência pelo método de Kaplan-Meier em relação à imunorreatividade do IL23R. A Figura 11 mostra a imunocoloração do GnRHR de célula 0205 com NAV3 silenciado e tecido colorretal e glioma. A coloração de membrana do GnRHR em células 0205 com NAV3 silenciado (c) , comparada com células de tipo selvagem (a) e com células transfetadas com a construção controlo (b) . Expressão do GnRHR nas duas amostras de cancro colorretal com deleção de NAV3: paciente com CRC de tipo MSS (e) , paciente com CRC de tipo MSI (f), controlo de tecido colorretal normal (d). 12 ΕΡ2350316Β1

Coloração de GnRHR de duas amostras de glioma (astrocitoma) com 55% (h) e 93% (i) células com NAV3 deletado e número de cópias do NAV3 normal (g).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Reportamos agora que a alteração do número de cópias do NAV3s é frequentemente observada em CRC de tipo MSS, em adenomas do cólon, em tumores cerebrais, em queratinócitos epidérmicos e em várias linhas de células estabelecidas. As aberrações do NAV3 estão correlacionadas com a polissomia do cromossoma 12 e com envolvimento do nódulo linfático. Além disso, o silenciamento do gene ARNsi especifico do NAV3 e análise de conjuntos de expressão revelaram, pelo menos, duas moléculas alvo importantes para o NAV3. Métodos de diagnóstico e métodos de tratamento e previsão de um prognóstico

Todos os genes regulados para cima ou os seus produtos génicos listados na presente aplicação podem ser utilizados no desenvolvimento de novos princípios diagnósticos. Além de determinar o número de cópias do NAV3, é estudada a expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR e beta-catenina nos métodos da presente invenção. Conforme utilizada aqui, a expressão "produto génico" refere-se a um ARNm, proteína ou a qualquer produto conseguido a partir do gene. Numa modalidade específica da invenção, o produto génico é uma proteína.

Para proteínas que são secretoras, podem ser utilizados métodos para testar o seu nível aumentado no sangue de pacientes como um método diagnóstico. Para proteínas não secretoras, a imunohistoquímica será o método 13 ΕΡ2350316Β1 mais apropriado para utilizar. Métodos diagnósticos podem ser realizados in vitro ou ex vivo. Num modalidade especifica da invenção, o método é um método in vitro. É, ainda, descrito um kit diagnóstico para demonstrar o caráter maligno de um tumor ou subpopulação de células. Ferramentas para detetar uma alteração do número de cópias do NAV3 e/ou sobre-expressão de qualquer gene ou produto génico pode compreender sondas, iniciadores ou anticorpos adequados.

Num modalidade especifica da invenção, o tumor é um tumor colorretal, tumor cerebral ou tumor de queratinócitos epidérmicos. A maioria dos tumores cerebrais primários originam-se na glia (gliomas), tais como astrócitos (astrocitomas), oligodendrócitos (oligodendrogliomas) ou células epêndimas (ependimoma). Existem também formas mistas, com ambos um astrocitico e um componente de célula oligodendroglial. Estes são designados gliomas mistos ou oligoastrocitomas. Além disso, podem ser encontrados tumores glioneuronais mistos (tumores que exibem um componente neuronal, bem como glial, por exemplo, gangliogliomas, tumores neuroepiteliais disembrioplásticos) e tumores com origem em células neuronais (por exemplo, gangliocitoma, gangliocitoma central). Outras variedades de tumores cerebrais primários incluem: tumores neuroectodérmicos primitivos (PNET, por exemplo, meduloblastoma, medulo-epitelioma, neuroblastoma, retinoblastoma, ependimoblastoma), tumores do parênquima pineal (por exemplo, pineocitoma, pineoblastoma), tumores de células epêndimas, tumores do plexo coróide, tumores neuroepiteliais de origem incerta (por exemplo, gliomatose 14 ΕΡ2350316Β1 cerebri, astroblastoma), etc. Numa modalidade específica da invenção o tumor cerebral é um glioma, isto é, glioblastoma.

Conforme utilizada aqui, a expressão "tumor" refere-se a uma massa anormal de tecido devido ao excesso anormal de divisões celulares ou ausência de morte celular normal.

Numa modalidade especifica da invenção, o tumor é um tumor benigno ou um tumor maligno, isto é, tumor não cancerígeno ou tumor cancerígeno. A expressão "adenoma" refere-se a um tumor não cancerígeno. Numa modalidade específica da invenção, o tumor é um carcinoma. Carcinomas são tumores malignos derivados de células epiteliais. Métodos da presente invenção demonstram o caráter maligno de um tumor. Caráter maligno refere-se a um tumor maligno, isto é, tumor cancerígeno. Os tumores malignos podem ser agressivos, isto é, de crescimento rápido e possivelmente metastizantes. Qualquer "subpopulação de células", referindo-se a uma população restrita de células, pode ser estudada em relação a caráteres malignos. A subpopulação de células pode estar localizada dentro das células inflamatórias infiltrantes no tecido.

Na presente invenção, uma amostra biológica pode ser qualquer amostra de tecido adequada, tal como biópsia do tecido ou nódulo linfático ou uma lesão de tumor metastático em qualquer órgão do corpo ou sangue inteiro. A amostra biológica também pode ser urina, fezes ou outra excreção corporal. A amostra biológica pode ser, se necessário, pré-tratada de forma adequada conhecida daqueles habilitados na arte. A presente invenção também se refere a uma previsão de 15 ΕΡ2350316Β1 um prognóstico. Numa modalidade especifica da invenção, a presença de um tumor com alteração do número de cópias do NAV3 e com sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R ou beta-catenina está associada com metástases do nódulo linfático, elevado grau de malignidade e/ou baixa sobrevivência. Numa modalidade especifica da invenção o prognóstico é fraco. "Prognóstico fraco" refere-se a uma elevada expectativa de metástase ou de dispersão do tumor, falta de recetividade a modalidades de tratamento do estado da arte e/ou baixa sobrevivência. Num paciente com baixa sobrevivência prevista, a esperança de vida é inferior à de um grupo de pacientes comparativo correspondente.

Em cenários clínicos, a capacidade de diagnosticar com precisão não só o tipo de um tumor mas as alterações genéticas, funcionais e imunológicas que estão presentes nesse tumor particular tem de ser potenciada. Para uma terapêutica mais detalhada, a escolha das moléculas terapêuticas ou anticorpos pode ser perfilada a esse tumor particular. Por outras palavras, é necessária medicina personalizada com uma combinação de, pelo menos, dois fármacos dirigidos a moléculas diferentes. São, ainda, descritos vários resultados exploráveis que podem ser, ainda, utilizados no desenvolvimento de novos princípios terapêuticos eficazes e diagnósticos. A observação de regulação para cima dos genes, que são regulados para cima na deficiência do NAV3 e estão envolvidos na transformação maligna, pode ser utilizada na seleção de terapêutica racional para um determinado cancro. A decisão de que alternativas terapêuticas deveriam ser utilizadas, isto é, uma seleção de um tratamento, pode ser baseada no teste do tumor maligno para a alteração do 16 ΕΡ2350316Β1 número de cópias do NAV3s (deleção do gene NAV3 conduzindo a expressão diminuída do NAV3) e para a regulação para cima de qualquer um dos genes ou produtos génicos selecionados de IL23R, GnRHR, beta-catenina, aqueles listados nos quadros 8-12 e o IL23/IL23R, bem como as vias GnRHR.

Um método de tratamento compreende, ainda, uma etapa, em que o(s) gene(s) ou produto(s) génico(s) selecionado(s) de IL23R, GnRHR, beta-catenina e daqueles listados nos quadros 8-12 é afetada por subexpressar ou desativar o(s) gene(s) ou produto(s) génico(s) ou diminuindo a quantidade do(s) produto (s) génico(s).

Um método de tratamento pode compreender, ainda, uma etapa, em que um gene ou produto génico do NAV3 é afetado. 0 gene ou produto génico do NAV3 é afetado sobre-expressando ou ativando o gene ou produto génico ou aumentando a quantidade do produto génico. 0(s) gene(s) e/ou produto(s) génico (s), isto é, selecionado de NAV3, IL23R, GnRHR, beta-catenina e daqueles listados nos quadros 8-12, é ativado, desativado, sobre-expresso ou subexpresso ou a quantidade do produto génico é aumentada ou diminuída, pelo menos, a via sinalizadora GnRH e/ou JAK/STAT é afetada.

Qualquer molécula ou moléculas terapêutica(s) pode ser utilizadas para afetar os produtos génicos alvo; um antagonista, anticorpo ou molécula inibidora é utilizado para afetar, pelo menos, um produto génico. "Uma molécula inibidora" refere-se a qualquer molécula (por exemplo, pequena molécula de ARN inibidora ou anticorpo), que inibe ou reduz a ação de um alvo, por exemplo, a molécula inibidora é ARNsi. A regulação para cima de proteínas associadas à membrana é de especial interesse, já que a 17 ΕΡ2350316Β1 terapêutica mediada por anticorpo é presentemente amplamente utilizada e os métodos para gerar anticorpos terapêuticos específicos alvo humanizados para moléculas alvo estão prontamente disponíveis.

Um método de tratamento pode ser na forma de um medicamento convencional ou pode ser dado como terapêutica génica.

Em terapêutica, o restauro da função normal de um gene pode ser utilizado. Isto pode ser conseguido potenciando a expressão de genes funcionalmente homólogos, introduzindo um gene intacto ou utilizando uma forma alterada do gene ou oligonucleotídeo antissenso contra um gene em qualquer técnica presentemente disponível para terapêutica génica para prevenir a progressão de uma doença proliferante. Em particular, o crescimento da célula tumoral pode ser retardado ou mesmo parado por tal terapêutica. Tais técnicas incluem os métodos terapêuticos ex vivo e in situ, compreendendo o anterior transduzir ou transfetar um gene intacto ou alterado (ou os seus domínios funcionais) numa forma recombinante ou peptídica ou como oligonucleotídeos antissenso ou num vetor para o paciente, este último compreendendo o gene alterado ou oligonucleotídeo num veículo, que é depois introduzido num paciente. Dependendo da doença a ser tratada, pode ser conseguida uma cura transitória ou uma cura permanente. Em alternativa, podem ser utilizados anticorpos monoclonais ou humanizados ou péptidos ligantes a uma proteína alvo para suprimir a função da proteína e, assim, o crescimento da célula tumoral pode ser retardado ou mesmo parado. Anticorpos contra uma proteína alvo também poderiam ser utilizados para transportar outros agentes, tais como substâncias citotóxicas, às células cancerígenas que sobre-expressam o gene. Tais agentes poderiam depois ser utilizados para 18 ΕΡ2350316Β1 matar especificamente as células cancerígenas.

Um tratamento pode estar dirigido a um gene ou produto génico do NAV3 e/ou gualquer gene(s) ou produto(s) génico(s) listados na presente aplicação. Contudo, também pode ser utilizado qualquer outro(s) gene(s) ou produto(s) génico (s) ao longo da via GnRH e Jak/Stat como alvos para terapêutica.

Uma molécula terapêutica tal como um antagonista, anticorpo ou molécula inibidora pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros agentes ou composições. Além de qualquer molécula terapêutica, uma composição farmacêutica administrada a um paciente também pode compreender quaisquer outros agentes terapeuticamente eficazes, veículos farmaceuticamente aceitáveis, tampões, excipientes, adjuvantes, antisséticos, agentes em quebra, estabilizadores ou espessantes e/ou quaisquer componentes normalmente encontrados nos produtos correspondentes. A composição farmacêutica pode estar em qualquer forma, tal como forma sólida, semi-sólida ou líquida, adequada para administração. A administração de um medicamento pode, por exemplo, ser conduzida através de uma administração oral ou inalável ou através de uma injeção intratumoral, intramuscular, intra-arterial ou intravenosa. 0 sujeito para diagnóstico, prognóstico ou utilização da invenção é um humano ou um animal. Numa modalidade específica da invenção, o sujeito é um humano. Numa modalidade especifica da invenção, o sujeito tem um adenoma colorretal ou cancro colorretal. Noutra modalidade específica da invenção, o sujeito tem um tumor colorretal, tumor cerebral ou tumor de queratinócitos epidérmicos. 19 ΕΡ2350316Β1 NAV3 0 NAV3 (navegador neuronal 3, também designado P0MFIL1) é um gene dividido (40 exões) localizado em cl2q21.1 e expresso no tecido cerebral, células T ativadas, placenta, cólon e em certas linhas de células cancerígenas. A sequência de aminoácidos do NAV3 está bem conservada entre diferentes espécies, indicando que o NAV3 desempenha um papel fundamental nos processos celulares. A homologia de sequência de aminoácidos sugere que o NAV3 participa na sinalização celular e supressão de tumor. O NAV3 é o homólogo humano da proteína unc-53 de C. elegans, um mediador crítico da migração celular. Além disso, os homólogos de NAV3, NAVl e NAV2, ligam-se a filamentos intracelulares e regulam a expansão e migração celular.

Evidência cumulativa sugere que a interrupção do gene NAV3 contribui para a progressão do cancro. A expressão do transcrito do NAV3 é regulada para baixo em 40% dos neuroblastomas primários (Coy JF et al. 2002, Gene 290(1-2) :73-94) . O NAV3 também é deletado ou translocado em vários subtipos de linfoma de células T cutâneo (CTCL) (Karenko L. et al. 2005, Câncer Res 65 (18) :8101-10; Hahtola S. et al. 2008, J Invest Dermatol 128(9):2304-9, Vermeer M.H. et al. 2008, Câncer Res 68(8):2689-98). Também identificámos alterações do número de cópias do gene NAV3 (deleções/amplificações) em cancros de origem epitelial (Hahtola S et al. 2008, J Invest Dermatol 128 (9) : 2304-9; Hahtola S et al. 2008, Genes Chromosomes Câncer 47(2):107-17; documento WO 2008059112 (Al)) e deleções de NAV3 alélicas no cancro colorretal (Sipila L et al. 2008, EJC suplementos 6(12) 118).

Numa modalidade específica da invenção, a alteração do número de cópias do NAV3 é causada por uma deleção, 20 ΕΡ2350316Β1 amplificação ou translocação do gene NAV3 ou de grande parte dele. As alterações do número de cópias do gene NAV3 podem ser determinadas em células haplóides, diplóides e/ou poliplóides. "Deleção" refere-se a uma ausência de qualquer fragmento (s) de um gene, cuja ausência afeta de forma adversa a função do gene. "Deleção" também se refere à ausência de um gene inteiro ou à ausência de um fragmento do cromossoma que contém o gene. Numa modalidade especifica da invenção, a deleção do NAV3 é uma deleção total ou parcial do NAV3. "Amplificação" refere-se a uma inserção de qualquer fragmento (s) de um gene na presença de, pelo menos, uma cópia desse gene. "Amplificação" também se pode referir à amplificação de um gene inteiro ou de um fragmento de cromossoma que contém o gene. Numa modalidade especifica da invenção, a amplificação do NAV3 é uma amplificação total ou parcial do NAV3. A amplificação de um gene pode, por exemplo, ser detetada por uma alteração do número de cópias do gene. "Translocação" refere-se a uma transferência de regiões cromossómicas entre cromossomas não homólogos. 0 NAV3 pode ser translocado parcial, totalmente ou como uma parte do fragmento cromossómico maior que compreende o NAV3 .

De acordo com o método da presente invenção, a presença ou ausência de alteração do número de cópias do gene pode ser detetada a partir de uma amostra biológica por qualquer método de deteção conhecido adequado para detetar deleções ou amplificações. Tais métodos são facilmente reconhecidos por aqueles habilitados na arte e 21 ΕΡ2350316Β1 incluem hibridizações in situ de fluorescência, tais como hibridizações in situ de fluorescência multi-cores, hibridização in situ multi-fluór (MFISH), cariotipagem espetral (SKY), rotulagem de razão binária combinada (COBRA), cariotipagem de alteração de cor (CCK). Em hibridização genómica comparativa (CGH), as alterações genéticas são classificadas como ganhos e perdas de ADN. CGH revela-se como um padrão caracteristico que inclui aberrações aos níveis cromossómico e subcromossómico. As técnicas de bandas G convencionais também podem ser utilizadas em casos onde a deteção grosseira dos ganhos ou perdas é considerada como suficiente. Métodos preferíveis são aqueles adequados para utilização em laboratórios clínicos.

Qualquer método de deteção conhecido adequado para detetar uma expressão de gene de qualquer gene ou número de cópias do NAV3, isto é, métodos baseados na deteção do número de cópias do gene (ou ADN) e/ou aqueles baseados na deteção dos produtos de expressão do gene (ARNm ou proteína) podem ser utilizados nos métodos da presente invenção. Tais métodos são facilmente reconhecidos por aqueles habilitados na arte e incluem métodos de reação em cadeia da polimerase (PCR) convencionais, RT-PCR, hibridizações in situ, tais como FISH, hibridização in situ do ARNm, análise Northern, Southern e Western, imunohistoquímica e outros imuno-ensaios, tais como ELISA. Métodos preferíveis são aqueles adequados para utilização em laboratórios clínicos de rotina. A análise LOH também pode ser utilizada para detetar alterações de número de cópias do gene. Conforme utilizada aqui, a expressão "perda de heterozigotia (LOH)" refere-se à perda da contribuição de um único progenitor a parte do genoma da célula. A LOH pode ser considerada como um evento 22 ΕΡ2350316Β1 para desmascarar um alelo mutante de um gene que pode desempenhar um papel na supressão de formação de tumor. Assim, a LOH é um marcador importante para iniciação ou progressão de tumor. A LOH em cancros pode ser identificada pela presença de heterozigotia num locus genético no ADN da linha estaminal e a ausência de heterozigotia no mesmo locus nas células tumorais.

Numa modalidade especifica da invenção, a alteração do número de cópias do NAV3 é confirmada por FISH, LOH, CGH, análise de sequenciação, imunohistoquimica, PCR, qPCR ou microarray de tecido.

Marcadores adequados para detetar uma expressão de gene ou alterações de número de cópias do gene incluem quaisquer marcadores biológicos tais como marcadores microssatélites, marcadores SNP, quaisquer sondas, iniciadores ou anticorpos associados a um gene alvo.

Efeitos das aberrações do NAV3

Resultados do presente estudo também confirmam que as aberrações do NAV3 são comuns em vários tumores e cancros. Utilizámos três métodos diferentes para averiguar a alteração do número de cópias do NAV3s; LOH, CGH-array e FISH. Com o método FISH, observámos células com as alterações do número de cópias do cromossoma 12 e o gene NAV3 num número considerável de casos com carcinomas colorretais (CRC). De forma importante, a deleção do NAV3 também foi detetada em 23% das amostras de adenoma. Contudo, os resultados em todos os casos mostraram uma população heterogénea de células tumorais consistindo essencialmente de células com caráter diplóide normal e células anormais com um número variável do cromossoma 12 e/ou rótulo NAV3. Neste cenário, uma deleção ou 23 ΕΡ2350316Β1 amplificação alélica do gene difere de, por exemplo, uma situação com mutações em genes supressores de tumor em tumores homogéneos. É importante notar que este tipo de aberrações do número de cópias pode ser observado apenas com o método FISH, que analisa as células individuais, mas, na maioria dos casos, não com CGH-array ou com LOH, dois métodos que requerem que mais de 40% das células na amostra mostrem o mesmo tipo de aberração. Os nossos resultados de uma série clinica não selecionada de amostras de tecido estão subclassifiçados pelo facto de que foram também observadas uma polissomia do cromossoma 12 semelhante e alteração do número de cópias do NAV3s em três linhas de células CRC estabelecidas do tipo MSS e numa linha de células do tipo MSI.

Nos casos de carcinoma declarado, os casos com aberração do NAV3 mostraram claramente mais metástases do nódulo linfático.

No presente estudo, nos pólipos adenomatosos, a perda do NAV3 foi mais frequentemente observada em casos que por critérios clássicos (tamanho, diferenciação) indicaram um risco mais elevado para transformação maligna subsequente.

Para compreender os efeitos da regulação para baixo do NAV3 nos perfis de expressão génica e para caracterizar os efeitos da deleção do NAV3 in vitro, silenciámos a expressão do NAV3 com interferência do ARN em células epiteliais do cólon normais, numa linha de células de glioblastoma estabelecida, numa linha de células de glioblastoma recentemente derivada e queratinócitos humanos primários desprovidos de infeção pelo virus do papiloma humano. Os perfis de expressão génica em vários pontos temporais após transfeção foram analisados utilizando microarray Agilent dupla-cor 4 x 44K. Com esta abordagem, o 24 ΕΡ2350316Β1 silenciamento do gene NAV3 conduziu à regulação para cima consistente de 39 genes em células do cólon, enquanto 28 genes foram regulados para cima em células da glia. Entre estes, estavam os recetores de IL23 e GnRH e análises PathwayExpress sugeriram que as vias sinalizadoras GnRH e Jak-Stat são dirigidas por NAV3. Quando os resultados de todas as linhas de células foram combinados, 49 genes, incluindo GNRHR e IL23R, foram regulados para cima em 7 de 10 amostras, pelo menos, uma vez em cada tipo de célula. Todos juntos, 17 genes incluindo o recetor da hormona libertadora de gonadotropina (GnRHR) e recetor da interleucina 23 (IL23R), foram regulado para cima em todas as oito experiências com células do cólon e da glia. O silenciamento do ARNsi do NAV3 imita a deleção alélica encontrada in vivo e, assim, a regulação para cima das duas moléculas recetoras, GnRHR e IL23R, conhecidas por estarem envolvidas tanto em processos oncogénicos como em reações inflamatórias/imunes, tem importância potencial tanto para a iniciação do processo maligno como para a determinação do comportamento biológico das células malignas.

De forma importante, nos tumores MSS, a regulação para cima da imunorreatividade de IL23R estava correlacionada com o faseamento de Dukes (p<0,001) e com metástases do nódulo linfático (p<0.001), enquanto a beta-catenina nuclear estava correlacionada com apenas as metástases do nódulo linfático (p=0,045). O teste logrank identificou imunorreatividade de IL23R regulada para cima como um marcador desfavorável (p= 0,009).

Além disso, a depleção do NAV3 ligou a inflamação do tecido ao crescimento do tumor regulando para cima os mediadores inflamatórios IL23R, vanina 3 e CYSLTR2. Os 25 ΕΡ2350316Β1 nossos resultados sugerem, assim, que as alterações do número de cópias do NAV3 estão diretamente envolvidas na carcinogénese precoce uma vez que num micro-ambiente de inflamação, a IL23R regulada para cima dá à célula maligna uma vantagem de crescimento.

GnRHR

GnRHR é um recetor da hormona gonadotropina autócrino que estimula a secreção de hormona luteinizante (LH), hormona estimulante de folículo (FSH) e hormona libertadora de gonadotropina (GnRH) pelas células gonadotrópicas da pituitária (Yeung CM et ai. 2005, Mol Hum Reprod 11(11):837-42. Além das células gonadotrópicas da pituitária, sabe-se que GnRHR é expresso à superfície de linfócitos, células da mama, ovário e próstata. Uma multitude de relatórios recentes demonstram que o eixo GnRH-GnRHR também está ativo em células extra-pituitárias e que a regulação para cima do GnRHR foi observada em muitos cancros, especialmente em carcinomas (Harrison GS et al. 2004, Endocr Relat Câncer 11(4):725-48). Pensa-se que a ativação do GnRHR conduz primeiro à ativação de genes precoces imediatos (IE) que afetam as vias da beta-catenina e o fator das células T (TCF) (Salisbury TB et al. 2008,

Mol Endocrinol 22(6):1295-303). A beta-catenina, um membro da via sinalizadora Wnt canónica, também desempenha um papel essencial na transdução do sinal GnRH (Salisbury TB et al. 2008, Mol Endocrinol 22(6):1295-303) através da desativação de glicogénio sintase quinase-3, que regula a degradação da beta-catenina (Gardner S et al. 2009,

Neuroendocrinology 89(3):241-51). Por outro lado, vários relatórios demostraram que os níveis de expressão aumentados de beta-cateninas afetam as metástases de tumores dos nódulos linfáticos (Buhmeida A et al. 2008, APMIS 116(1):1-9). 26 ΕΡ2350316Β1

No nosso material paciente, verificou-se que, surpreendentemente, a expressão da beta-catenina nuclear estava associada a aberrações do NAV3 e correlaciona-se com metástases do nódulo linfático. Além disso, a nossa identificação do GnRH como uma molécula alvo regulada por NAV3 representa uma via candidata para a prevenção e terapêutica de carcinoma.

IL23R A identificação da IL-23R está ligada à sinalização JAK-STAT e suporta a nossa hipótese de que o micro-ambiente de tecido pró-inflamatório afeta o potencial de crescimento e dispersão das células tumorais. 0 ligando da IL-23R, IL-23, é segregado por células inflamatórias ativadas, tais como macrófagos e células dendriticas. 0 heterodímero IL-23R é composto de um recetor IL-12 beta 1 (IL-12Rbetal) e de uma cadeia IL-23R (relacionado com IL-12Rbeta2) (Beyer BM et al. 2008, J Mol Biol 382 (4) : 942-55) ; sendo a última regulada para cima em células com NAV3 silenciado. JAK2 e STAT3 estão associados a IL-23R. JAK2 fosforila o recetor em resposta a IL-23 e dimeros STAT3 ativados translocam para o núcleo e ligam-se a IL-23R de uma forma dependente do ligando. A via JAK/STAT também é ativada por mutações em genes a montante e demonstrou-se que são ativados de forma constitutiva num número de malignidades humanas (Constantinescu SN et al. 2008, Trends Biochem Sei 33(3):122-31; Li WX. 2008, Trends Cell Biol 18(11):545-51).

Evidência cumulativa recente sugere que a IL-23 pode redirigir respostas de células T citotóxicas para células tumorais em direção a vias efetoras pró-inflamatórias, que alimentam o tumor em vez de o combaterem (Langowski JL et al. 2006, Nature 442(7101):461-5). Consequentemente, s células tumorais que expressam o IL-23R ganham, muito 27 ΕΡ2350316Β1 provavelmente, uma vantagem de crescimento e persistem mesmo na presença de células T específicas do tumor. 0 IL-23R também foi ligado à doença intestinal inflamatória (IBD). Em crianças com doenças de Crohn precoce, demonstrou-se que os níveis mucosais de ARNm de IL12p40 e IL23R são significativamente superiores do que na doença tardia (Kugathasan S et al.2007, Gut 56(12):1696-705). De forma interessante, a IBD foi associada a um risco aumentado de CRC e outros cancros (Lakatos PL et al. 2008, World J Gastroenterol 14(25):3937-47; Hemminki K et al. 2008, Int J Câncer 123(6):1417-21). A comunicação entre as células inflamatórias de tecido e células epiteliais durante a iniciação do cancro foi demonstrada através da perda de sinalização dependente de Smad4 nas células T, conduzindo a cancros epiteliais espontâneos no trato gastrointestinal de ratinhos (Kim BG et al. 2006. Nature 441(7098):1015-9). As células Smad 4 Γ T produziram IL-6, que ativa a via sinalizadora JAK-STAT como o complexo IL23/IL-23R. Também se demonstrou recentemente que a sinalização por L-6/STAT3 tem um papel central na formação do tumor em modelos de ratinho de cancro associado a colite (Grivennikov S et al. 2009, Câncer Cell 15(2):103-13).

Outros genes alvo

Além de GNRHR e IL23R, demonstrou-se que cinco genes ligados à carcinogénese (ARL11, SMR3B, FAM107A, MFSD2 e BCLB6) e dois genes ligados à inflamação (CYSLTR2 e VNN3) eram regulados para cima por silenciamento do NAV3 no presente estudo. Demonstrou-se recentemente que polimorfismos na região MYCL1 LD, incluindo MFSD2, afetam as taxas de sobrevivência de cancro do pulmão apesar dos genes MFSD2 mostrarem diferenças étnicas nas frequências 28 ΕΡ2350316Β1 alélicas (Spinola M et al. 2007, Lung Câncer 55(3):271-7). Foi demonstrado recentemente que a vanina-1 epitelial controla a carcinogénese motivada pela inflamação no modelo de ratinho com cancro do cólon associad a colite (Poyet et al, 2009) e que ambos os níveis de expressão de vanina-1 e vanina-3 são aumentados por citocinas pró-inflamatórias em células de pele com psoríase (Jansen PA et al. 2009, J Invest Dermatol Mar 26) . Neste contexto, é de interesse notar que ambos os grupos de pacientes com psoríase e celíacos têm um risco aumentado de cancro (Grulich AE e Vajdic CM. 2005, Pathology 37(6):409-19). A regulação para cima do grupo de proteínas associado a membrana e os seus alvos a jusante são de especial interesse.

Na presente invenção, pelo menos um gene ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR e beta-catenina é selecionado para métodos, meios ou utilizações. Numa modalidade específica da invenção, o(s) gene(s) selecionado(s) de IL23R, GnRHR, beta-catenina, codifica uma proteína, que é uma proteína da membrana, uma proteína que regula processos celulares ou uma proteína que se liga ao nucleotídeo purina. Também são descritos métodos e utilizações em que o gene ou produto génico é selecionado de um grupo que consiste em ARL11, SMR3B, FAM107A, MFSD2, BCLB6, CYSLTR2, VNN3, GNGT1, DNER, GnRHR, IL23R, beta-catenina, JAK1 e JAK3. Noutra modalidade específica da invenção, o gene ou produto génico é IL23R ou/e GnRHR.

Numa modalidade específica da invenção, a combinação do gene ou produto génico é, pelo menos, IL23R, GNRHR e beta-catenina. Numa modalidade especifica da invenção a combinação do gene ou produto génico é IL23R, GNRHR e beta-catenina .

Numa modalidade específica da invenção, a combinação 29 ΕΡ2350316Β1 do gene ou produto génico é todos os 4 9 genes ou produtos génicos listados no quadro 9. Noutra modalidade específica da invenção, a combinação do gene ou produto génico é todos os 17 genes ou produtos génicos listados no quadro 8. Numa modalidade específica da invenção, a combinação do gene ou produto génico é todos os 14 genes ou produtos génicos listados no quadro 10. Numa modalidade específica da invenção, a combinação do gene ou produto génico é todos os genes ou produtos génicos listados no quadro 11. Numa modalidade específica da invenção, a combinação do gene ou produto génico é todos os genes ou produtos génicos listados no quadro 12.

Os exemplos seguintes são facultados para ilustrar ainda mais a invenção. Será óbvio para alguém habilitado na arte que, à medida que a tecnologia avança, o conceito

inventivo pode ser implementado de várias maneiras. A invenção e as suas modalidades não se limitam aos exemplos descritos a seguir, mas podem variar no âmbito das reivindicações.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Amostras de tecido, células e linhas de células Amostras de tecido

Amostras de tumor colorretal

Amostras de biópsias cirúrgicas de 59 pacientes (amostras de 61 CRC e 10 adenomas) , operados ao CRC no Hospital Central Mikkeli foram estudadas por FISH, LOH e imunohistoquímica. O estudo foi aprovado pelo Comité de Revisão Ética do Hospital Central Mikkeli e pela Autoridade Nacional dos Assuntos Médico-legais. A histologia das amostras de tecido embebidas em parafina e fixas em 30 ΕΡ2350316Β1 formalina foi verificada por um patólogo com experiência (MH) e tumores, adenomas ou mucosa normal foram microdissecados para obter tecido normal puro ou, pelo menos, uma razão de 50% de tecido de carcinoma ou adenoma. Secções embebidas em parafina foram cortadas com 50 pm de espessura e os núcleos foram isolados para análise FISH e o ADN foi purificado para análise LOH seguindo os protocolos convencionais (Hyytinen E et al. 1994, Cytometry 16: 93-96; Isola J. et al. 1994, Am. J. Pathol 145: 1301-1308) . Todos os adenomas foram MSS, enquanto que 14 dos 56 carcinomas tinham elevado grau de MSI.

Marcadores de repetição de mononucleotideo BAT25 e BAT26 do painel de Bethesda (Boland et al., 1998, Câncer Res 58: 5248-5257), suplementados com cinco marcadores de repetição de dinucleotideo (D12S1684, D12S326, D12S1708, D18S474 e D9S167) , foram utilizados para determinar o estado de instabilidade de microssatélite (MSI). Amostras com, pelo menos, dois marcadores instáveis foram consideradas como tendo MSI, enquanto que aquelas com um marcador instável ou nenhum foram consideradas estáveis em termos de microssatélite (MSS).

Os parâmetros seguintes foram incluídos nas análises estatísticas: grau do tumor, estágio do tumor por Dukes, e pela classificação TNM, conforme definido pela Sociedade Americana de Cancro (www.câncer.org), presença de metástases do nódulo linfático, tempo de seguimento (meses) e resultado clínico (vivo, morto por outra razão ou morto por doença).

Amostras de tumor cerebral

Foram preparadas amostras para o casos de tumor cerebral. Os casos ensaio FISH consistiam de 119 em 55 31 ΕΡ2350316Β1 astrocitomas, 20 oligodendrogliomas, 13 ependimomas, 18 meduloblastomas e 13 neuroblastomas. Todas as amostras de tecido foram processadas por fixação em formalina de rotina e embebidas em parafina.

Secções embebidas em parafina foram cortadas com 50 pm de espessura e os núcleos foram isolados para análise FISH seguindo os protocolos convencionais (Hyytinen E et al. 1994, Cytometry 16: 93-96; Isola J. et al. 1994, Am. J. Pathol 145: 1301-1308). Células, linhas de células e culturas de células Células de cólon normal CRL-1541 e CRL-1539 (ATCC, Manassas, VA, USA), a linha de células de glioblastoma A172 derivada de giloblastoma de grau 4 e gueratinócitos epidérmicos primários (todos de ATCC, Manassas, VA, EUA) foram crescidas conforme instruído por ATCC durante não mais de 30 passagens. Também foram crescidas linhas de células de cancro colorretal CCL-228 (SW480), CCL-230 (SW4 0 3) ., CCL-248 (T84), RKO, LIM1215 e HCA7 (ATCC, Manassas, VA, EUA) conforme instruido por ATCC. Entre as linhas de células CRC, RKO, LIM1215 e HCA7 são conhecidas por reparação deficiente discordante e por terem MSI. Células frescas de um gliobtastoma multiforma de grau 4 extraído de forma perioperativa foram utilizadas para derivar a linha de células 0205. Tecido tumoral foi dissociado mecanicamente e as células foram cultivadas em DMEM sem soro adicionado, suplementado com mistura de nutrientes F12 (Sigma-Aldrich, ST Louis, MO, EUA) , Fungizona 2,5 mg/ml (Apothecon, NJ, EUA) , B27 (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), fator de crescimento epidérmico (EGF) 20 ng/ml(Sigma-Aldrich, ST Louis, VA, EUA) , fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) 40 32 ΕΡ2350316Β1 ng/ml (Sigma-Aldrich, ST Louis, VA, EUA), penicilina-estreptomicina 100 U/ml,(Biowhittaker, Verviers, Bélgica) e Glutamax (lx) (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) . Após cinco passagens, uma população de células clonais emergiu da preparação a granel e foram congeladas aliguotas. Para todas as experiências subsequentes, foram descongeladas aliquotas frescas e foram utilizadas apenas a cultura de células com menos de 20 passagens. A expressão de marcadores neuronais (proteina acidic fibrilar da glia e beta-tubulina de classe neuronal) foi avaliada por imunocoloração. A colheita das células foi aprovada pelo Comité de Ética do Hospital Distrital de Helsínquia e Uusimaa, sendo obtido dos pacientes o seu consentimento informado por escrito.

Exemplo 2. Análise FISH e LOH FISH (hibridização in-situ de fluorescência)

Linhas de células CRL-1541, CRL-1539 e A172 foram

estudadas para as alterações do número de cópias do NAV3 com FISH multi-cor, conforme descrito previamente (Karenko L et al. 2005, Câncer Res 65:8101-10) . A análise FISH também foi realizada para o tecido tumoral do qual a linha de células 0205 foi estabelecida.

Além disso, o ensaio FISH específico do NAV3 foi realizado em núcleos isolados de amostras do paciente (61 CRC e 10 adenoma) e em cromossomas em metáfase de linhas de células de carcinoma do cólon (CCL-228, CCL-230, CCL-248, RKO, LIM1215 e HCA7). Foram utilizados clones de cromossoma artificial bacterianos (BAC) específicos do ADN do NAV3 (RP11-36P3 e RP11-136F16; Research Genetics Inc.,

Huntsville, AL, EUA) e a sonda do centrómero do cromossoma 12 (pA12H8; Cultura de Células de Tipo Americana) e

rotulados com Alexa 594-5-dUTP e Alexa 488-5'-dUTP 33 ΕΡ2350316Β1 (Invitrogen), respetivamente (amostras de pacientes) ou com dioxigenina ou biotina (metafaes de linhas de células). Os métodos detalhados para rotulagem de sondas, a preparação das lâminas para o ensaio FISH e a utilização de MFISH especifica de braço são mostrados a seguir.

Além disso, foi realizado um ensaio FISH especifico de NAV3 em núcleos isolados de amostras de 119 casos de tumor cerebral. Os métodos detalhados para a rotulagem da sonda, a preparação das lâminas para o ensaio FISH e a utilização de MFISH especifico de braço são mostrados a seguir.

Rotulagem de sonda. Para analisar amostras de pacientes, dois clones de cromossoma artificial bacteriano (BAC) especifico do ADN de NAV3 (RP11-36P3 e RP11-136F16; Research Genetics Inc., Huntsville, AL, EUA) e a sonda do centrómero do cromossoma 12 (pA12H8; Cultura de Células Tipo Americana) foram rotulados com Alexa 594-5-dUTP e Alexa 488-5-dUTP (Invitrogen), respetivamente, utilização tradução nick. BAC e as sondas de centrómero foram misturadas com ADN COT-1 humano (Invitrogen), precipitados e diluídos em tampão de hibridização (15% p/v sulfato de dextrano, 70% formamida em 2 x SSC, pH 7,0).

Para analisar as linhas de células NAV3, foram preparadas e rotuladas sondas BAC específicas (ver acima) com digoxigenina e foi preparada e rotulada sonda especifica do centrómero 12 com biotina ou dUTP conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) por tradução nick, conforme descrito anteriormente (Karenko et al. 2005) ou de forma semelhante com dietilaminocoumarina-5-dUTP (DEAC, Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA, EUA) . Métodos FISH. Foram pré-tratadas lâminas de núcleos 34 ΕΡ2350316Β1 com 1 M tiocianato de sódio a +80°C durante 5 minutos, lavadas três vezes com 2 x SSC, tratadas com 50% glicerol, 0,1 x SSC a + 90°C durante 6 minutos, lavadas com 2 x SSC durante 3 minutos e com água destilada três vezes durante 2 minutos. As lâminas foram digeridas com proteinase K (Sigma; 8 pg/ml em 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM CaCl2> a +37°C durante 8 minutos. Após desidratação e secagem ao ar, foi adicionada mistura de sonda, as lâminas foram desnaturadas durante 6 min a +85°C e hibridizadas durante 48 horas a 637°C. As lâminas foram lavadas três vezes com 1,5 M Ureia, 0,1 x SSC a +47°C durante 10 minutos, com 0,1 x SSC durante 10 minutos a +47°C, três vezes com PBS, 0,1% NP-40 à temperatura ambiente, enxaguada com água destilada, seca ao ar e montada em meio de montagem Vectashield com 4',6-diamino-2 fenilindol dihidrocloreto (DAPI; Vector).

As lâminas FISH de amostras de pacientes foram avaliadas utilizando microcópios Olympus BX51 (Tóquio, Japão) equipados com uma objetiva 60X em óleo de imersão e um filtro triplo de passagem de banda para deteção simultânea de Alexa488, Alexa594 e DAPI (Chroma Technology Corp., Brattleboro, VT, EUA).

Foram preparadas lâminas de metaphase convencionais para FISH, conforme descrito anteriormente (Abdel-Rahman W. M. et al. 2001, Proc Natl Acad Sei USA 98: 2538-43). A hibridização das sondas e deteção das sondas NAV3 rotuladas com digoxigenina das sondas especificas do centrómero 12 rotuladas com biotina foi realizada com avidina-FITC (Laboratórios Vector, Burlingame, CA, EUA) e com anti-digoxigenina de ovelha conjugada com rodamina (Roche, Mannheim, Alemanha), conforme descrito anteriormente (Karenko et al. 2005) . O MFISH específico de braço foi realizado com o kit XaCyte (Metasystems GmbH, Altlusheim, Alemanha), conforme recomendado pelo fabricante). As 35 ΕΡ2350316Β1 metáfases hibridizadas foram analisadas com micoscópio de epifluorescência (Axioplan Imaging 2, Zeiss, GmbH, Jena, Alemanha equipado com uma câmara CCD) e módulo de programa MFISH (Isis, Metasystems, Altlussheim, Alemanha) manualmente ou utilizando uma estrutura de captura automática (Metafer, Metasystems, Altlussheim, Alemanha).

Avaliação dos resultados de FISH

Foram analisadas lâminas FISH de amostras de tumor cerebral e colorretal derivadas de pacientes, sem identificação da identidade da amostra, por dois analistas independentes. Os resultados são indicados como a percentagem de células anormais num número total de 200 núcleos de células contados. Células com dois sinais do cromossoma 12 (células diplóides) e apenas um sinal para NAV3 e células com mais de dois sinais do cromossoma 12, mas com um número inferior de sinais NAV3 (por exemplo, três sinais de centrómero do cromossoma 12 e um sinal NAV3) foram interpretadas como células com deleção de NAV3. Células que exibem sinais NAV3 mais frequentes do que os sinais do centrómero 12 foram interpretadas como células com amplificação do NAV3. Uma amostra foi considerada ser aberrante para o NAV3 se a percentagem de células interfase que exibiam amplificação era superior a 7% ou percentagem de células interfase que exibiam deleção era superior a 4% (calculado a partir da distribuição normal dos resultados de amostra normal como média + 3 desvios padrão) . Para as linhas de células CCL-228, CCL-230, CCL-248, RKO, LIM1215 e HCA7, foram analizadas dez a 47 metáfases para NAV3 e centrómero 12, e foram analisadas 6 a 11 metáfases para MFISH em braço. 36 ΕΡ2350316Β1

Análise LOH do NAV3 utilizando marcadores micros satélites e extensão de iniciador de nucleotídeo único, SnuPE 0 ensaio LOH de NAV3 foi realizado em amostras de tumor colorretal, conforme descrito anteriormente (Hahtola S et al. 2008, J Invest Dermatology 128: 2304-9). Além diso, foi utilizado o polimorfismo A/G (rsl852464) dentro do exão 19 do gene NAV3 mostrando até 0,4 93 de heterozigotia em Caucasianos/Europeus na reação SNuPE.

Amostras de ADN foram primeiro amplificadas por PCR utilizando os iniciadores rsl852464F 5' CCTGCTATTTTCATCTTTCAAGC 3' (SEQ. ID N.° 1) e rsl852464R 5' GGCTGGGATGCTGTTTGAG 3' (SEQ. ID N.° 2) para produzirem um fragmento de PCR com 130 pb contendo o polimorfismo A/G. O produto da PCR foi subsequentemente purificado pela Exãouclease I (10 U/ml) e SAP (fosfatase alcalina de camarão, 2 U/ml) (ExoSAP-IT, Amersham Biosciences) e foi realizada Extensão de PCR utilizando um iniciador de extensão rotulado de forma fluorescente 5' GATGCTGTTTGAGCGCAT-CATGCTGGGCCC 3' (SEQ. ID N.° 3) e mistura de nucleotideos contendo ddCTP. Os produtos da extensão tinham 43 pb ou 4 9 pb dependendo de se G ou A estavam presentes no molde e foram separados e os resultados analisados, conforme descrito anteriormente (Hahtola et al. 2008, J Invest Dermatology 128: 2304-9) .

Uma amostra foi classificada como mostrando LOH, se um dos alelos na amostra do tumor tinha 40% ou mais do sinal diminuído no rsl852464 ou, no caso de homozigotia constitucional para este marcador, nos marcadores microssatélites do flanco comparados com o seu normal correspondente (Cleton-Jansen A. M. et al. 2001, Câncer Res 61:1171-7) . 37 ΕΡ2350316Β1

Anormalidades de NAV3 correspondentes são encontradas em adenomas colorretais e carcinomas que aparecem no mesmo paciente quando se utilizam os métodos FISH ou LOH A comparação do número de cópias do NAV3 entre amostras de adenoma e carcinoma de um dado paciente, obtidas na mesma operação cirúrgica em todos menos dois casos, revelou que a deleção do NAV3 era, com frequência, também detetável pela técnica FISH no estágio de adenoma (Figura 1) . Contudo, a quantidade de células aberrantes de NAV3 era sempre superior na lesão histologicamente maligna. De forma análoga, em 2 dos 3 adenomas com LOH, os carcinomas correspondentes mostraram maioritariamente um padrão semelhante de LOH. Isto sugere que os adenomas histologicamente benignos que têm células com aberrações de NAV3 podem já ter propriedades para crescimento maligno.

Alterações do número de cópias do NAV3 são encontradas em CRC e em adenomas colorretais utilizando os métodos FISH ou LOH

Foram detetadas células com alterações do número de cópias do NAV3 em 40% de amostras de carcinoma colorretal de tipo MSS; células com deleção ou amplificação do NAV3 foram detetadas em 15% das amostras, enquanto 15% das amostras mostrou apenas deleção de NAV3 e 10% tinham apenas baixo nível de amplificação de NAV3 (três a cinco cópias). Células com deleção de NAV3 também form detetadas em 12,5% de amostras tipo MSI e em 23% de amostras de adenoma. Além disso, foram detetadas células com polissomia do cromossoma 12, com, mais frequentemente com três ou cinco cópias, em 70% de amostras de carcinoma colorretal de tipo MSS, em 50% de amostras de tipo MSI e em 31% de amostras de adenoma. Os resultados do FISH estão ilustrados na Figura 2. 38 ΕΡ2350316Β1

Alterações do número de cópias do NAV3 em células de carcinoma do cólon foram confirmadas por ensaio LOH. LOH foi detetado em 21 % de carcinomas MSS e em 18% de amostras de adenoma. Os resultados de cada marcador são mostrados no Quadro 1.

Quadro 1. Resultados de LOH do NAV3 para cada marcador _D12S1684 D12S26 SNuPE@rsl852464 D12S1708_ CRC, MSS 8/37 (22%) 10/33 (30%) 4/23 (17%)* 5/29 (17%) CRC, MSI 0/3 0/2 0/7* 0/4

Adenoma 1/21 (5%) 2/19 (11%) 0/8* 2/16 (13%) * As frequências LOH foram calculadas apenas para casos informativos. O teste SNuPE não foi informativo devido a homozigotia constitucional em 5 carcinomas e em todos os adenomas que mostraram LOH por microssatélites do cromossoma 12 examinados. São observadas alterações do número de cópias do NAV3 ou translocações, conforme demonstrado com FISH, em linhas de células CRC estabelecidas

Seis linhas de células CRC diferentes estabelecidas (CCL-228, CCL-230, CCL-248, RKO, LIM1215 e HCA7) e duas linhas de células de cólon normal (CRL-1541 e CRL-1539) foram analisadas com FISH especifico de NAV3 (Quadro 2). As células de cólon normal CRL-1541 e CRL-1539 não mostraram sinais aberrantes para NAV3 em relação aos sinais de centrómero do cromossoma 12 mas em CRL-1539, 8% das células foram tetrassómicas para ambos estes sinais. Três linhas de células (SW403, RKO, T84) mostraram uma porção notável de metáfases com perda de NAV3 (SW-403 e T84 90% ou mais e RKO mais de 40% de metáfases; Quadro 2 e Figura 3) . A linha quase-diplóide CCL-228 mostrou tipicamente um cromossoma 12 normal, dois cromossomas anormais com um sinal NAV3 em falta e um cromossoma anormal com sinal NAV3 mas sem sinal de centrómero do cromossoma 12. Foi observada uma translocação de NAV3 para outro cromossoma, interpretada 39 ΕΡ2350316Β1 como t(2;12) por MFISH de braço, em todas as metáfases com exceção de uma (Quadro 2, Figura 3).

Quadro 2. Sumário de metáfases da linha de células CRC mostrando aberrações do NAV3 numéricas ou do centrómero 12.

Resultados de FISH do NAV3 por sondas BAC

Resultados do MFISH de braço, MFISH ou YAC

Linha Tipo 0 nível mais de comum de células ploidia e a frequência de tais metáfases/todas metáfases, intervalo do número de citromossomas CCL-230 CIN quase- Perda de NAV3 Desiquilibrado =SW403 triplóide, em 14/15 der(12)t(12;15)(pl3?:q?) 11/15, metáfases del(12)(ql5or21) em 6/6 intervalo 34 a 212 metáfases CCL-248 CIN quase-diplóide, Perda de NAV3 Del (12) (q?q?) em 5/5 =T84 7/10, intervalo em 9/10 metáfases em MFISH de 75 a 114 metáfases braço, deleção por YAC FISH em 10/10 metáfases CCL-229 CIN quase-diplóide, Fragmentação der(2)t(2;12) (Reuter 6/10, intervalo ou J.A. et al. 34-183 amplificação 2009, Câncer Cell 15: de centrómero 477-88), 12 em 10/10 der(10)t(3;12;10) (Chung metáfases D.C. 2000 Gastroenterology 119: 854-65), i(12)(p) (Kim B.G. et al. 2006, Nature 441,1015-1019), inv(12) (pl2ql2orl3) del(12)(p?)del(12)(q?) (Fearon E. R. e Vogelstein B, 1990, Cell 61: 759-67) RKO MSI quase-diplóide. Perda de NAV3 Desiquilibrado 34/47, em 21/47 der (12)t(2;12) em 6/11 intervalo 15 a metáfases metáfases 90 estudadas

Linhas de células LIM1215 (MIN) e HCA7 (MIN) mostraram tantos centrómeros 12 como sinais NAV3 (27/27 e 27/29 metáfases estudadas, respetivamente) , como mesmo o cromossoma clonal 12q+ em HCA7 observado previamente (Abdel-Rahman W.M. et al. 2001. Proc Natl Acad Sei USA 98: 2538-43) mostrou sinal NAV3 no presente estudo._ 40 ΕΡ2350316Β1

Aberrações do NAV3 de amostras colorretais associadas a polis somia do cromossoma 12 e a metástases do nódulo linfático

As aberrações do NAV3 de amostras colorretais correlacionaram-se com polissomia do cromossoma 12 e metástases do nódulo linfático com significância estatística (Quadro 3). Além disso, a polissomia do cromossoma 12 ocorreu com maior frequência em tumores com um grau mais elevado de malignidade (Quadro 3).

Quadro 3. Correlações entre variáveis das análises FISH, tumores do cólon e resultados dos pacientes entre as amostras CRC. Se não for indicado o contrário, foi utilizado o teste exato de Fisher (duas caudas). Foram realizadas análises de sobrevivência utilizando a morte causada por cancro do cólon como o ponto final primário.

Polissomia do cromossoma 12 Grau do Tumor Grau de Dukes Metástases do nódulo linfático Resultado do paciente (prognóstico) Alteração do número de cópias do NAV3 p=0,006 ns1’ ns p=0,019 Ns Polissomia do cromossoma 12 p=0,019 ns ns Ns Expressão da beta-catenina nuclear 2) ns ns ns p<0,05 Ns Imunorreatividade de IL23R regulada para cima 2) ns ns p<0,001 p<0, 0 01 21 p=0, 009 3) 1) ns = não significativo estatisticamente 2) correlação analisada para o grupo de pacientes MSS. 2) Teste de Qui-quadrado, exato, com duas caudas 3) teste log-rank 41 ΕΡ2350316Β1

Alterações de número de cópias do gene NAV3 são encontradas em tumores cerebrais

Em total, foram analisados 119 casos de tumor cerebral, dos quais 55 astrocitomas, 20 oligodendrogliomas, 13 ependimomas, 18 meduloblastomas e 13 neuroblastomas para alterações de número de cópias do gene NAV3 e polissomia do cromossoma 12 utilizando FISH (ver Quadro 4). Os níveis de corte para a deleção de NAV3, amplificação de NAV3 e polissomia do cromossoma 12 foram 4%, 7% e 10%, respetivamente.

Tanto a deleção como a amplificação de NAV3 foram detetadas em astocitomas; 20% (11 de 55) dos casos estudados mostraram deleção de NAV3 e 11% (6 de ! 55) amplificação. A polissomia do cromossoma 12 foi observada em 45% (25 de 55) dos casos. A análise estatística utilizando o teste de Kaplan-Meier mostrou uma tendência da amplificação do NAV3 para prever melhor o resultado da doença do que a deleção ou o número de cópias normal do NAV3.

Casos de oligodendroglioma estudados mostraram deleção do NAV3 em 15% (3 de 20) e amplificação em 30% (6 de 20). A polissomia do cromossoma 12 foi detetada em 43% (10 de 23) dos casos. A polissomia do cromossoma 12 pareceu prever pior o resultado da doença quando analisada com o teste de Kaplan-Meyer.

Ependimomas mostraram deleção do NAV3 em 31% (4 de 13) dos casos estudados, amplificação de NAV3 em 54% (7 de 13) e polissomia do cromossoma 12 em 69% (9 de 13) . A análise estatística indicou que a amplificação do NAV3 e a polissomia do cromossoma 12 prevêm pior a sobrevivência. 42 ΕΡ2350316Β1

Foi observada deleção do NAV3 em 11 % (2 de 18) dos casos de meduloblastoma estudados, amplificação do NAV3 em 39% (7 de 18) e polissomia do cromossoma 12 em 61% (11 de 18) . A análise estatística utilizando o teste de Kaplan-Meier implicou que a deleção de NAV3 prevê uma sobrevivência mais baixa e a amplificação de NAV3, por oposição, previu melhor o progóstico do que o número de cópias normal do NAV3. Não foi detetada a deleção do NAV3 em casos de neuroblastoma estudados, mas 69% (9 de 13) mostraram amplificação do NAV3 e 77% (10 de 13) polissomia do cromossoma 12 . No teste de Kaplan-Meier , a amplificação do NAV3 e a polissomia do cromossoma 12 pareceram prever pior a sobrevivência.

Quadro 4. Tumores cerebrais foram classificados em cinco classes.

Casos de tumor, aberrações do NAV3 (deleção, amplificação) e polissomia do cromossoma 12 são mostrados como números e percentagens dos casos estudados.

Tumor Deleção do NAV3 Amplificação do NAV3 Polissomia do cromossoma 12 Astrocitoma 55/46% Oligodenroglioma 11/20% 6/11% 25/45% 20/17% 3/15% 6/30% 10/50% Ependimoma 13/11% 4/31% 7/54% 9/69% Neuroblastoma 13/11% Meduloblastoma 0/0% 9/69% 10/77% 18/15% 2/11% 7/39% 11/61% Todos 119/100% 19/17% 35/29% 65/55%

Tumores da glia de graus 1, 2 e 3 foram agrupados numa classe e comparados com tumores da glia de grau 4 em relação às aberrações do NAV3 (Quadro 5). A análise mostrou que os graus inferiores 1, 2 e 3 melhor diferenciados continham mais amplificação do NAV3 do que os tumores da glia de grau 4. A amplificação do NAV3 foi observada em 27% 43 ΕΡ2350316Β1 (13 de 48) dos tumores da glia de graus 1, 2 e 3 em contraste com 5% (2 de 38) nos gliomas de grau 4. Pelo contrário, os tumores da glia de grau 4 continham mais deleção do NAV3 do que os graus 1, 2 e 3. A deleção do NAV3 foi observada em 18% (7 de 38) dos tumores da glia de grau 4 em contraste com 15% (7 de 48) em tumores de graus 1, 2 e 3.

Quadro 5. Tumores da glia de graus 1, 2 e 3 foram agrupados numa classe e os tumores da glia de grau 4 formaram a outra classe. Casos de tumor, amplificação do NAV3 e deleção do NAV3 são mostrados como números e percentagens dos casos estudados nestas duas classes.

Deleção do NAV3 Amplificação do NAV3 Tumores da glia de graus 1, 2 e 3 48 /56% 7/15% 13/27% Tumores da glia de grau 4 38/44% 7/18% 2/5% Todos 86/100% 14/16% 15/17%

Exemplo 3. C6H CGH em array

Foi extraído ADN de secções de tecido embebidos em parafina com 50 micrómetros utilizando um protocolo convencional. Foi extraído ADN de referência de sangue colhido pela Cruz Vermelha Finlandesa de 4 healthy homens e mulheres saudáveis. O ADN foi depois digerido, rotulado e hibridizado com um oligonucleotídeo array de 244K, de acordo com o protocolo do fabricante (Agilent Technologies, Santa Clara, EUA) . As amostras foram digitalizadas com um scanner de ADN microarray e analisadas utilizando os programas Feature Extraction e CGH Analytics (Agilent Technologies, Santa Clara, EUA) . A análise foi realizada utilizando a classificação z e uma janela de movimento 44 ΕΡ2350316Β1 médio de 1Mb. Os valores Log2 inferiores a +/- 0,4 não foram considerados aberrantes. Três linhas de células de carcinoma do cólon e duas amostras de tumor de carcinoma do cólon foram analisadas utilizando este método.

Análise de CGH em array de casos selecionados de material de pacientes e de linhas de células de CRC

Foram realizados estudos de CGH em array em duas amostras de material de pacientes e em três linhas de células de CRC estabelecidas CLL-230, CLL-248 e CLL-228. Os dados de CGH em array demonstraram uma deleção em 12q21 que abrange o locus do NAV3 numa das amostras dos pacientes, confirmando, assim, os resultados FISH (esta amostra de paciente tinha 41% de células com NAV3 deletado pelo método FISH) (Figura 4) . Contudo, a outra amostra de paciente mostrou resultados normais nesta análise, provavelmente devido a um número proporcional insuficiente de células aberrantes de NAV3 na amostra (28% das células mostraram sinais de NAV3 amplificados na análise FISH). A análise CGH em array de linhas de células de carcinoma do cólon que mostraram perda do NAV3 em FISH revelou grandes alterações no cromossoma 12, bem como noutros cromossomas, como é de esperar em células de cancro cultivadas. Na linha CLL-230, foi detetada uma deleção ampla que abrangia o locus do NAV3 em 12q. Esta deleção não foi detetada nas outras (duas) linhas de células (CLL-248 e CLL-228) que, por sua vez, demonstraram amplificações das outras partes do cromossoma.

Exemplo 4. ARNi e microarrays de expressão génica MÉTODOS

Silenciamento do gene NAV3 in vitro O gene NAV3 foi silenciado com oligos ARNsi agrupados 45 ΕΡ2350316Β1 (On-Target SMART pool, Dharmacon, Chicago, IL, EUA) . As sequências especificas dos oligos foram como se segue: 5'-GGACUUAACGUAUAUACUA-3' (SEQ. ID N.° 4) (Exão 12), 5'-GAGAGGGUCUUCAGAUGUA-3' (SEQ. ID N.° 5) (Exão 38-39), 5'-CAGGGAGCCUCUAAUUUAA-3' (SEQ. ID N.° 6) (Exão 7) e 5'-GCUGUUAGCUCAGAUAUUU-3' (SEQ. ID N.° 7) (Exão 30-31). Células de glioblastoma A172, os queratinócitos epidérmicos primários, e as linhas de células de cólon normal CRL-1541 e CRL-1539 foram cultivadas em placas com 6 poços para 70% de confluência, e, depois disso, transfetadas com 200 pmol de um conjunto de ARNsi de NAV3 ou ARNsi misturado controlo (Dharmacon, IL, EUA), utilizando reagente de transfeção Dharmafectl (Dharmacon). Células de glioblastoma 0205 foram induzidas para crescerem como uma monocamada aderente alterando as condições de cultura anteriormente referidas conforme se segue: bFGF e EGF foram retirados e o meio foi suplementado com 10% FCS durante 4 dias antes da transfeção. Para a transfeção de uma placa com 6 poços, o ARNsi foi diluído para 1 μΜ em 100 μΐ de tampão 1 x ARNsi (recebido do fabricante) e misturado com uma quantidade igual de meio de crescimento normal. Quatro microlitros de reagente de transfeção foram incubados durante 5 minutos à temperatura ambiente com 196 μΐ de meio de crescimento. A diluição do ARNsi foi adicionada e incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente antes da adição às células em 1600 μΐ de meio de crescimento. Seis horas depois da transfeção, o meio de transfeção foi substituído com meio de crescimento normal. A viabilidade das células foi monitorizada 48 horas após a transfeção com coloração de azul de tripano. Todos os tipos de células mostraram mais de 70% de viabilidade e, além disso, apenas as células aderentes foram utilizadas para a preparação do ARN. 46 ΕΡ2350316Β1

Microarrays de expressão génica

Para identificar os genes regulados pelo NAV3, foram medidas as alterações nos perfis de expressão génica induzidos por ARNi dirigido por NAV3 com microarrays de cor dupla Agilent 4 x 44K e sondas oligonucleotídicas (Biochip center, Biomedicum Helsinguia, http://www.helsinki.fi/biochipcenter/). Para esta análise, as amostras de ARN total das células transfetadas com ARNsi foram obtidas 6, 24 e 48 horas após a transfeção (CRL 1541: 6 e 48 h, CRL 1539: 6 e 24 h, A172: 6 e 48 h, 0205: 6 e 48 h, queratinócitos epidérmicos primários (PEK): 24 e 48h).

As células foram lisadas em 350 μΐ de tampão RLT (Qiagen), o ARN foi purificado com RNeasy Micro ou Mini kit (dependendo da quantidade de células) (Qiagen, Hilden, Alemanha) e armazenado a -70°C. O ARN total obtido das células com NAV3 silenciado foi hibridizado com as amostras de pontos de tempo correspondentes das mesmas células transfetadas com oligonucleotideos misturados. Antes da hibridizaão, a qualidade das amostras de ARN foi avaliada com o Bioanalisador 2100 (Agilent Technologies).

Análise de microarray

Foram analisados os dados de microarray das duas linhas de células de cólon normal CRL-1541 e CRL-1539, e os dados das células de glioblastoma e queratinócitos epidérmicos primários transfetados com os oligos slienciadores de NAV3 ou com os oligos controlo. As intensidades da sonda foram corrigidas pelo fundo e normalisadas com LOWESS utilizando o programa Agilent Feature Extractor 9.1.3.1. Para cada amostra, foram computadas as alterações em número de vezes dentro de cada amostra e foram consideradas as 200 sondas com a expressão 47 ΕΡ2350316Β1 mais elevada e as 200 sondas com a expressão mais baixa como expressas diferencialmente. Os genes que expressaram, de forma consistente, diferencialmente em todas as linhas de células de cólon normal e amostras de tumor foram utilizados para análise da via computacional utilizando o PathwayExpress (Draghici S. et ai. 2007, Genome Res 17(10): 1537-45). Neste método, os valores de expressão de genes expressados diferencialmente são utilizados para calcular um fator de impacto e um valor de p associado para vias sinalizadoras na base de dados KEGG [REFE: PMID: 18477636], levando em consideração a topologia das vias.

Com este método, um gene que codifica uma proteína localizada a montante de uma via tem mais impacto numérico do que as proteínas a jusante.

Além disso, foi utilizado um novo método de agrupamento baseado na Ontologia de Gene (GO) para revelar grupos de genes que partilham uma função biológica comum ou localização na célula (Ovaska K et al. 2008, BioData Min 1(1):11). As distâncias entre genes são calculadas utilizando a medida de similitude semântica Lin (Lin. Proceedings of the 15th International Conference on Machine Learning 1998: 296-304) com base nas anotações de GO. Os genes com anotações de GO semelhantes têm distâncias mais curtas uns dos outros e são agrupados mais proximamente. Os grupos, juntamente com os valores de expressão, são visualizados utilizando um mapa de calor e dendrogramas.

qRT-PCR A eficiência do silenciamento de NAV3 e da regulação para cima de IL23R e GnRHR foi confirmada por Light Cycler qRT-PCR e hibridização de ARN in situ. 48 ΕΡ2350316Β1

Para a RT-PCR quantitativa, o ARN total foi transcrito de forma reversa com o Kit de Sintese de ADNc de primeira cadeia Revert Aid™ (Fermentas, St.Leon-Rot, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Para preparar curvas padrão, foram realizadas diluições em série de ADNc de células A172. As reações foram realizadas com um aparelho LightCyder480™ utilizando o kit LC 480 SYBR Green 1 master (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). Em resumo, o ADN foi desnaturado em 95°C durante 5 minutos, depois foram corridos 45 ciclos de 95°C, 58°C e 72°C durante 10, 15 e 10 segundos, respetivamente, seguidos de análise da curva de fusão, de acordo com as instruções do fabricante. Depois de um ajuste de fundo, foi utilizado o método de ponto de ajuste para determinar o valor de ponto cruzado, conforme descrito previamente (Linja MJ et al. 2004, Clin Câncer Res 10(3):1032-40). Para a normalização dos níveis de expressão, foi medida a expressão da proteína de ligação ao TATA (TBP), conforme descrito (Linja MJ et al. 2004, Clin Câncer Res 10(3):1032-40). O nível de expressão relativo foi obtido dividindo os valores para NAV3 pelo valor de TBP. Além da análise da curva de fusão, os produtos da PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5% para assegurar um tamanho do produto correto. A regulação para cima de IL23R e GnRHR também foi confirmada por qRT PCR, aumentando a temperatura de emparelhamento para 60°C. Todos os iniciadores utilizados nas reações estão listados no Quadro 6.

Quadro 6. Iniciadores de PCR utilizados na qRT-PCR

Gene Iniciador fwd Iniciador rew NAV3 ATCCATGGAGCTCAGCAA (SEQ. ID N. ° 8) TTGGCTOCTTCTTGGAGTTT (SEQ. ID N. ° 9) GnRHR AAGAGCACGGC T GAAGAC T C (SEQ. ID N.° 10) GCATGGGTTTAAAAAGGCAA (SEQ. ID N.° 11) IL23R CGCAAAACTCGCTATTCGACA (SEQ. ID N.° 12) ATGGCTTCCCTCAGGCAGA (SEQ. ID N.° 13) 49 ΕΡ2350316Β1

Hibridização in si tu de ARN do NAV3 de células com NAV3 silenciado

Para avaliar a eficiência knockdown do gene NAV3, realizámos a hibridização in situ de ARN dirigido a NAV3 das células transfetadas com ARNsi das linhas de células A172 e 0205. A expressão do NAV3 foi comparada com células não transfetadas e células transfetadas com os oligos misturados. Em resumo, os transcritos de ARNm do NAV3 foram detetados com uma sonda que reconhece os exões 37-39, com hibridização durante a noite a 45°C.

Hibridização in situ de ARNm para ARNm de NAV3 Preparação de sondas de ARN

As sondas de ARN foram geradas com base em localizações especificas do exão do gene NAV3 que exercem os seguintes oligonucleotideos (exão 37-39: antissenso 5'-TTGGCTGCTTCTTGGAGTTT-3' (SEQ. ID N.° 14), senso 5'- CACCAAATCTA-GAGCTGCATCA-3' (SEQ. ID N.° 15)) Os produtos da PCR resultantes foram clonados em vetor pCR®II-TOPO® (Invitrogen). As sondas de ARN foram rotuladas utilizando o kit de rotulagem de ARN DIG (SP6/T7, Roche) , de acordo com as instruções do fabricante.

Hibridização in situ para células fixas

As linhas de células A172 e 0205 foram cultivadas em lâminas de vidro estéreis (lâmina de câmara LAB-TEK II com lâmina de vidro Cover RS, Nalge Nunc International) e fixas em 4% paraf ormaldeideo (MERCK) - PBS durante 15 min à temperatura ambiente. As lâminas foram enxaguadas com PBS e voltadas a fixar em 1% PFA-PBS (7 min, +4 - 8°C) seguido de nova lavagem em PBS. As lâminas foram acetiladas em 0,1 M trietanolamina (TEA, Riedel-de Haan) pH 8,0 - 0,25% 50 ΕΡ2350316Β1 anidrido acético (MERCK) e pré-hibridizadas com 4 x SSC-50% de formamida desionizada. A hibridização in situ foi realizada numa câmara humidificada durante a noite a 45°C utilizando solução de hibridização contendo sonda antissenso ARN-DIG desnaturada (4 ng/μΐ) ou sonda senso (19 ng/μΐ). As lâminas pós-hibridização foram lavadas com tampões pré-aquecidos num banho de água a 37°C (lxlOmin, lxõmin 2 x SSC e 2 x 5min 1 x SSC) e o excesso de ARN foi removido com ARNase (20 pg/ml ARNase A, Sigma; 500 mM NaCl; 10 mM Tris pH 8,0; 1 mM EDTA) durante 30 min a 37°C) .

Depois de serem lavadas, as sondas hibridizadas foram detetadas imunologicamente por Fab fosfatase alcalina anti-DIG diluído 1:1000 em solução bloqueadora. As lâminas foram lavadas e incubadas durante a noite numa câmara humidificada com solução de substrato de cor (1:50 NBT/BCIP solução Stock (Roche) em tampão de deteção contendo 0,002 mM levamisol fresco (Laboratórios Vector)). Para terminar a reação, as lâminas foram lavadas, enxaguadas brevemente em água e contra-coradas com 0,1% Kemchrot (1 x 5min, Gurr, BDH Chemicals). Todos os reagentes e instrumentos foram tratados ou com dietilpirocarbonato (DEPC) ou estavam livres de ARNase.

RESULTADOS

Silenciamento do gene NAV3 resultou na regulação para cima de GnRHR e expressão de 1L23R

Linhas de células de cólon normal

Para identificar genes alvo relevantes in vivo de NAV3, estudámos os perfis de expressão génicos de células de cólon normal com NAV3 silenciado CRL-1541 e CRL-1539 (com números de cópia do gene NAV normais) . Nestas experiências, identificámos, entre 39 genes constantemente regulados para cima nas células de cólon normal com NAV3 51 ΕΡ2350316Β1 silenciado, a regulação para cima de dois recetores chave envolvidos na carcinogénese. Em primeiro lugar, a via do recetor da hormona libertadora de gonadotropina (GnRHR) foi identificada utilizando PathwayExpress como estando enriquecida de forma estatisticamente significativa (valor de p corrigido para múltiplas hipóteses <0,001) e este resultado foi motivado pela regulação para cima de GNRHR, variante 1 do transcrito, com alterações entre 4,7 - 32,4 vezes. Em segundo lugar, a via Jak-STAT foi identificada como sendo marginalmente significativa estatisticamente (valor de p corrigido <0,058) e foi afetada pela regulação para cima do recetor da interleucina 23 (IL23R), com alterações entre 3,4-14,01 vezes. A regulação para cima destes recetores foi confirmada por qRT-PCR em amostras selecionadas. Ver Figura 5.

Linhas de células e amostras de tecido

Com FISH multicor, o número de sinais NAV3 foi comparado com o número de sinais do centrómero 12 e as células dai em diante foram definidas como tendo sinais de JVAV3normais, amplificados ou deletados. As linhas de células CRL-1541, CRL-1539, 0205 e A172 estudadas foram crescidas para consistirem principalmente de células sem aberrações de NAV3 (Quadro 7) e, portanto, são adequadas para estudos de silenciamento do NAV3. O silenciamento eficiente de NAV3 foi confirmado por qRT-PCR e hibridização de ARN in situ (Figuras 6 e 7) . Além disso, ambas sondas para NAV3 presentes no microarray 4 x 44k Agilent foram subexpressas com uma alteração mediana do número de vezes de 0,26, indicando que o silenciamento de NAV3 foi eficaz. Todos os métodos mostraram regulação para baixo do NAV3 consistente em todos os tipos de células em todos os pontos temporais estudados. 52 ΕΡ2350316Β1

Quadro 7. FISH do NAV3 e centrómero do cromossoma 12

Linha de células ou amostra de tecido Tipo de célula Número de núcleos analisados % de núcleos com sinais normais % de núcleos com polissomia do NAV3 % de núcleos com sinal do NAV3 amplificado % de núcleos com sinal do NAV3 deletado CRL- 1541 Cólon 30 100 0 0 0 CRL- 1539 Cólon 37 91, 9 8,1 0 0 0205 Glioblastoma 200 98,5 0 0,5 0,5 A172 Glioblastoma 108 11,1 74 5, 6 9,3 Tumor 0205 Glioblastoma 206 97, 09 0,49 1, 46 0,49

Quando os perfis de expressão génicos de todas as células de cólon normal CRL-1541 e CRL-1539 com NAV3 silenciado, a linha de células de glioblastoma A172 derivada de glioblastoma de grau 4 e os gueratinócitos epidérmicos primários (todos de ATCC, Manassas, VA, EUA) foram avaliados, identificámos 17 genes regulados para cima em todas as experiências (Quadro 8) . Destes, foi notada a regulação para cima de dois recetores chave envolvidos na carcinogénese. Em primeiro ligar, a via do recetor da hormona libertadora de gonadotropina (GnRHR) foi identificada utilizando PathwayExpress como estando enriquecida de forma estatisticamente significativa (valor de p corrigido para múltiplas hipóteses <0,001). Este resultado foi motivado pela regulação para cima da variante 1 do transcrito de GNRHR que tinha uma alteração mediana do número de vezes de 13,7. Em segundo lugar, a via Jak-STAT foi identificada como estando alterada de forma marginalmente significativa estatisticamente (valor de p corrigido <0,058) pela regulação para cima do recetor da interleucina 23 (IL23R), que tinha uma alteração mediana do número de vezes de 7,2. A regulação para cima destes recetores foi confirmada pro qRT-PCR em amostras 53 ΕΡ2350316Β1 selecionadas. Também decidimos incluir na análise os perfis de expressão génicos de queratinócitos humanos primários (PEK) com NAV3 silenciado. Identificámos depois 52 genes, incluindo GnRHR e IL23R que foram regulados para cima em 7 das 10 experiências realizadas com os três tipos de células (Quadro 9).

Quadro 8. Lista de 17 genes regulados para cima nas oito experiências de silenciamento do NAV3 com células do cólon e da glia.

Abreviatura Máximo de alteração de vezes Mínimo de alteração de vezes Nome completo C12orf42 47,8 12,7 fase de leitura aberta 42 do cromossoma 12 de Homo sapiens (C12orf42), ARNin [NM 198521] GNRHR 32,4 47 recetor da hormona libertadora de gonadotropina (GNRHR) de Homo sapiens, variante 1 do transcrito de ARNm [NM 000406] ARL11 30,2 6, 8 fator de ribolisação de ADP tipo 11 (ARL11) de Homo sapiens, ARNm [NM 138450] AF 334588 31, 8 12, 8 cds completo de ARNm P25 de Homo sapiens, [AF334588] A 24 P799680 29, 3 6,1 Desconhecido UNQ6490 41, 1 5, 5 clone DNA147309 YPLR6490 (UNQ6490) ARNm de Homo sapiens, cds completo, [AY358209] FLJ33641 23, 4 59 proteína hipotética FLJ33641 (FLJ33641) de Homo sapiens, ARNm [NM_152687] CN480368 25, 3 3, 8 UI-H-EU0-azt-m-22-0-UI, sl NCI_CGAP_Carl de Homo sapiens ADNc clone UI-H-EU0-azt-m-22-0-UI 3' sequência de ARNm [CN480368] NP297856 N> O O 40 GB|AF13219 9, 1|AAG35545, 1 PRO1460 [NP297856] ENST00000329949 23, 6 49 proteína tipo POM121-de Homo sapiens, ARNm (clone ADNc IMAGEM 40053742), [BC112340] ENST00000360623 17,2 5,5 clone F22H de ARNm reativo a miosina da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina de Homo sapiens, cds parcial, [AF035042] 54 ΕΡ2350316Β1 THC2407334 17, 0 4,2 Desconhecido IL23R 14, 0 34 recetor da interleucina 23 (IL23R) de Homo sapiens, ARNm [NM 144701] THC2443880 13,3 42 Desconhecido VNN3 12,4 4,5 5 vanina 3 (VNN3) de Homo sapiens, variante 1 do transcrito, ARNm [NM 018399] LOC348174 50,2 7,9 ADNc FLJ38732 fis de Homo sapiens, clone KIDNE2010750, [AK096051] ENST00000372121 11,2 3,9 gene hipotético suportado por BC006119 de Homo sapiens, ARNm (ADNc clone IMAGEM:3505629), cds parcial [BC006119]

Quadro 9. Lista de 49 genes regulados para cima em, pelo menos, 7/10 experiências de silenciamento e uma vez em cada tipo de célula. Na coluna da direita, é indicado o número de vezes que as expressões do gene foram alteradas em células comparadas com as expressões do gene dos mesmos genes nas células com ARNsi silenciado.

Nome do gene Descrição Mediana do número de vezes alterado AK021467 ADNc FLJ11405 fis clone HEMBA1000769 Homo sapiens [AK021467] 24,5 C12orf42 fase de leitura aberta 42 do cromossoma 12 Homo sapiens (C12orf42) ARNm [NM_198521] 24,1 AF334588 P25 Homo sapiens ARNm cds completo [AF334588] 23,2 A 24 P799680 Desconhecido 18,9 CN480368 UI-H-EU0-azi-m-22-0-UI.sl NCI_CGAP_Carl Homo sapiens ADNc clone UI-H-EU0-azi-m-22-0-UI 3', sequência de ARNm [CN480368] 14,3 GNRHR variante 1 do transcrito do recetor da hormona libertadora de gonadotropina (GNRHR) de Homo sapiens, ARNm [NM 000406] 13, 7 LOC348174 ADNc FLJ38732 fis Homo sapiens, clone KIDNE2010750. [AK096051] 13, 7 THC2378839 CR457228 FLJ20225 {Homo sapiens;}, parcial (19%) [THC2318839] 13,2 55 ΕΡ2350316Β1 ENST00000360623 clone F22H de ARNm reativo a miosina da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina de Homo sapíens, ARNm cds parcial. [AF035042] 12,4 UNQ6490 clone ADN 147309 YPLR6490 (UNQ6490) Homo sapíens ARNm, cds completo. [AY358209] 12,4 CECR1 Região do cromossoma do sindrome de olho de gato de Homo sapíens, candidato 1 (CECR1) variante 1 do transcrito, ARNm [NM 017424] 11,7 OR2W3 Recetor olfativo de Homo sapíens, família 2, subfamília W, membro 3 (OR2W3), ARNm [NM_001001957] 11,3 A 32 P93894 Desconhecido 11,2 GK glicerol quinase (GK) Homo sapíens, variante 1 do transcrito, ARNm [NM_203391] 10,0 THC2407334 Desconhecido 9, 9 ARL11 fator de ribolisação de ADP tipo 11 (ARLI1) de Homo sapíens, ARNm [NM_138450] 9, 9 AA903523 AA9C3523 ok50h02.sl NCI CGAP Lei2 Homo sapíens ADNc clone IMAGEM: 1517427 3', sequência de ARNm [AA903523] 9,8 TPD52L3 Proteína de tumor tipo D52 3 (TPD52L3) de Homo sapíens, variante 1 do transcrito, ARNm [NM_033516] 9,7 FLJ33641 proteína hipotética FLJ33641 (FLJ33641) de Homo sapíens, ARNm [NM_152 6 871 9,5 A 24 P929289 Desconhecido 8,5 ZDHHC15 dedo de zinco Homo sapíens, tipo DHHC contendo 15 (ZDHHC15) , ARNm [NM_144969] 8,3 ENST00000329949 proteína tipo POM121 Homo sapíens, ARNm (clone ADNc IMAGEM 40053742), [BC112340] 8,0 ANKRD45 domínio de repetição de anquirina 45 (ANKRD45) de Homo sapíens ARNm [NM_198493] 7,8 THC2443880 Desconhecido 7,5 CLCA3 Canal de cloreto Homo sapíens, membro da família 3 ativado pelo cálcio (CLCA3), ARNm [NM_004921] 7,5 ENST00000327625 Desconhecido 7,2 56 ΕΡ2350316Β1 IL23R Recetor da interleucina 23 (IL23R) de Homo sapiens, ARNm [NM_14 4 7 01] 7,2 VNN3 variante 1 do transcrito de vanina 3 (VNN3) Homo sapiens, ARNm [NM_018399] 7,0 0PRK1 Recetor opióide kapa 1 (OPRK1), Homo sapiens, ARNm [NM_000912] 6, 9 BX113452 BX113452 cérebro de criança Soares 1N1B Homo sapiens clone ADNc IMAGp998L21165 sequência de ARNm [BX113452] 6,7 ENST00000372127 gene hipotético suportado por BC006119 de Homo sapiens, ARNm (clone ADNc IMAGEM 3505629), cds parcial, [BC006119] 6, 6 CYSLTR2 Recetor de leucotrina cisteinil 2 (CYSLTR2) de Homo sapiens, ARNm [NM_020377] 6,5 SMR3B Proteína 3 regulada por androgénio da glândula submaxilar homólogo B (ratinho) (SMR3B) de Homo sapiens, ARNm [NM_006685] 6,3 THC2319152 Desconhecido 6,3 THC2 4 0517 0 Desconhecido 6,2 U22172 Proteína de recombinação e de reparação de dano do ADN humana RAD52 pseudogene ARNm, cds parcial. [U22172] 6,1 GNGT1 proteína de ligação ao nucleotídeo guanina (proteína G) de Homo sapiens, polipéptido de atividade de transdução gama 1 (GNGT1), ARNm [NM_021955] 5,9 AF078533 Enzima conversora de interleucina 1-beta relacionada evolutivamente de Homo sapiens ARNm cds completo [AF078533] 5, 8 FAM107A Família com semelhança de sequência 107 Homo sapiens, membro A (FAM107A), ARNm [NM_0 0717 7] 5,7 THC2314833 Desconhecido 5,7 ZDHHC15 dedo de zinco tipo BHHC contendo 15 (ZDHHC15) Homo sapiens ARNm [NM_144969] 8,3 57 ΕΡ2350316Β1 CCDC62 domínio espiral enrolado contendo 62 (CCDC62) Homo sapíens, variante 1 do transcrito, ARN [NM_032573] 5,7 THC23517 69 Desconhecido 5,7 AK095225 ADNc FLJ37906 fis Homo sapiens, clone COLON20043318, [AK095225] 5,3 A 23 P134405 Desconhecido 5, 3 BCL6B célula BCLL/linfoma 6 Homo sapiens, membro B (proteína de dedo de zinco) (BCL6B) , ARNm [NM_181844] 5,2 NP297856 GB [AF132199.1 ] AAG35545.1 PRO1460 [NP297856] 5,1 ZSCAN4 Dedo de zinco Homo sapiens e domínio SCAN contendo 4 (ZSCAN4) ARNm [NM_152677] 5,1 THC2438003 Q9BVX4 (Q9BVX4) proteína MGC5566, parcial (23%) [THC2438003] 00 AF119887 PRO2610 ARNm Homo sapiens, cds completo [AF119887] 00 X92185 ARNm H.sapiens para elementos alu [ X 9 218 5 ] 4,7 THC2455392 Desconhecido 4,3 C19orf30 Fase de leitura aberta 30 do cromossoma 19 (C19orf30) de Homo sapíens, ARNm [NM_174947] 4,0

Análise da Ontologia de Gene de genes regulados pelo NAV3 0 agrupamento com base na Ontologia de Gene foi realizado para identificar processos biológicos afetados pela deleção do NAV3. Para aumentar o número de genes para a análise de GO, realizámos agrupamento nos 52 genes que foram regulados para cima em 7 de 10 experiências. Deste grupo, identificámos quatro grupos GO (Figura 8): membrana (nove genes), transporte de iões (dois genes), nuclear (quatro genes) e de ligação ribonucleotídica (dois genes). O grupo de ligação ribonucleotídica incluiu dois genes: glicerol quinase e ARL11. A glicerol quinase é uma enzima chave na regulação da captação e metabolismo do glicerol, 58 ΕΡ2350316Β1 enquanto que o ARL11 (ou ARLTS1) pretence à família ARF da superfamília Ras de pequenas GTPases, conhecidas por estarem envolvidas em múltiplas vias reguladoras alteradas na carcinogénese humana.

Os produtos génicos são agrupados (conjuntos) com base nas anotações da sua ontologia de Gene (GO) . Genes com anotações semelhantes pertencem ao mesmo grupo. A distância entre produtos génicos é definida utilizando medidas de similitude semântica informadas teoricamente.

No Quadro 10 a seguir, são mostrados os termos GO comuns mais informativos (mais específicos) de cada grupo. Todos os produtos génicos no grupo estão anotados com o termo GO mencionado. Um termo GO é mais informativo se ocorre raramente nas anotações de GO de todo o genoma. A coluna Antes contém a probabilidade p a priori de que um produto génico aleatório esteja anotado com o dado termo GO. Informação é definida como log2P- Em geral, os grupos com (1) um grande número de produtos génicos e (2) termos de GO comuns com elevado conteúdo de informação são os mais interessantes.

Quadro 10. Produtos génicos são agrupados (conjuntos) com base nas suas anotações de Ontologia de Gene (GO). GRUPO TAMANHO GOID ANTES INFORMAÇÃO DESCRIÇÃO G1 4 GO:0003824 0,230 2, 120 Atividade catalítica GO:0008152 0,312 1, 681 Processo metabólico GO:0044464 0, 906 0, 142 Parte da célula G2 3 GO:0005215 0, 046 4,435 Atividade transportadora GO:0006810 0, 093 3, 434 Transporte G3 5 GO:0005886 0,124 3, 014 Membrana plasmática GO:0016021 0,126 2, 989 Integral para a membrana G4 2 GO:0005634 0,163 2, 620 Núcleo GO:0005515 0,237 2, 079 Ligação a proteína 59 ΕΡ2350316Β1 G0:0050794 0,262 1,932 Regulação de processo celular

MEMBROS DO GRUPO G1 GAL3ST1 GK RDHE2 CECR1 G2 AQP10 ENST00000327625 CLCA3 G3 GNRHR OPRK1 DNER IL23R FLJ33641 G4 BCL6B FAM107A

Além dos genes do grupo membrana IL23R e GnRHR discutidos previamente, outros genes no grupo membrana (Figura 8) incluíram GNGT1, CYSLTR2 e SMR3B. GNGTl codifica a subunidade gama da transducina, encontrada principalmente em segmentos externos de bastonetes. CYSLTR2 pertence aos cisteinil leucotrienos que são mediadores importantes do tráfego celular e respostas imunes inatas, envolvidos na patogénese de processos inflamatórios. IFN-gama induz a expressão de CysLTR2 e potência respostas inflamatórias induzidas por CysLT. SMR3B (proteína 3,B regulada por androgénio da glândula submaxilar), é um gene relacionado com tumor candidato. O grupo núcleo incluiu o gene FAM107A, também designado TU3A, que se reportou ser silenciado epigeneticamente numa variedade de cancros. Além disso, identificámos o gene BCLB6, um gene que codifica um fator de transcrição, regulado para cima pelo fator neurotrófico derivado da linha de células da glia. A lista completa de genes em cada grupo é dada na Figura 8. Outros genes de interesse que estão ligados à inflamação também foram encontrados entre os genes regulados para cima, incluindo um membro Vanina3 da família Vanina de ectoenzimas associadas a membrana ou segregadas. Demonstrou-se recentemente que a Vanina 1 e Vanina 3 têm atividade pró-inflamatória .

Quando as células do cólon e de glioma foram tratadas como grupos específicos, identificámos 39 genes regulados 60 ΕΡ2350316Β1 para cima de forma consistente nas células do cólon normal com NAV3 silenciado e 28 genes regulados para cima nas células da glia (Quadros 11 e 12) DNER é uma proteína transmembranar que transporta repetições tipo EGF extracelulares e um ligando Notch atípico e que foi regulada para cima apenas em células do cólon com NAV3 silenciado (Quadro 11).

Quadro 11. Lista de genes regulados para cima nas quatro experiências de silenciamento de NAV3 em células de cólon. O número total de genes foi 39, mas os genes que carecem de anotação foram deixados de fora do quadro. Os genes são listados de acordo com o seu grupo GO. Os genes marcados com asterisco (*) foram previamente relacionados com cancro.

Abreviatura Nome completo Alteração de máximo de vezes Alteração de mínimo de vezes Proteínas da membrana GNRHR* Recetor da hormona libertadora da gonadotropina (GNRHR) de Homo sapiens, variante 1 do transcrito 32,4 14, 8 FLJ33641 Proteína hipotética FL33641 (FLJ33641) de Homo sapiens, ARN [NM 1526871 23,4 7,0 ENST00000327625 Desconhecido 17,8 6, 9 AQP10 Aquaporina 10 de Homo sapiens (AQP10) 16,2 5, 5 IL23R Recetor da interleucina 23 de Homo sapiens (IL23R) 14 0 4,4 DNER Transmembrana contendo repetição EGF tipo delta-notch de Homo sapiens (DINER) 21,9 5, 8 0PRK1 Recetores de opióide de Homo sapiens, kapa 1 (OPRK1) 14,6 4,9 GAL3ST1 Galactose-3-Ο- Sulfotransferase 1 de Homo sapiens (GAL3ST1) 13,2 3,9 Ligação ao nucleotídeo purina 61 ΕΡ2350316Β1 ARL11 tipo fator ADP-ribosilação 11 de Homo sapíens (ARL11) 30,2 00 ANKRD45 Domínio de repetição anquirina 45 de Homo sapíens (ANKRD45), ARNm 11,2 8,0 GK* glicerol quinase (GK) de Homo sapíens, variante 1 do transcrito 15 1 4,1 Regulação de processo celular FAM107A* Família com semelhança de sequência 107 de Homo sapíens, membro A 8,1 4,1 BCL6B CLL célula B/linfoma 6 de Homo sapíens, membro B (proteína do dedo zinco) (BCL6B) 9, 9 5,4 Sem grupo GO C12orf42 Fase de leitura aberta 42 do cromossoma 12 de Homo sapíens (C12orf42) 47, 8 176 MFSD2* ADNc de Homo sapíens FLJ14490 fis, clone MAMMA1002886 [AK027396] 34,9 9, 9 RDHE2 Cadeia curta retinal da dehidrogenase redutase isoforma 1 de Homo sapíens 20,5 7,7 ENST00000329949 Proteína tipo POM121 de Homo sapíens 19, 9 4 9 ENST00000360623 clone F22H de ARNm reativo a miosina da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina de Homo sapíens, cds parcial 17,2 5,5 ZNF224 Proteína do dedo zinco 224 de Homo sapíens 42,1 8,3 CECR1 Região do cromossoma do síndrome de olho de gato de Homo sapíens, candidato 1 (CECR1) variante 1 do transcrito 10,6 5, 1 TPD52L3 Proteína de tumor tipo D52 3 (TPD52L3) de Homo sapíens, variante 1 do transcrito 11, 6 4,2 VNN3 vanina 3 (VNN3) Homo sapíens, variante 1 do transcrito 12,1 4,5 CCDC62 Domínio espiral enrolado contendo 62 (CCDC62) de Homo sapíens, variante 1 do transcrito 8,8 4, 9 62 ΕΡ2350316Β1 X92185 ARNm de H. sapiens para elementos alu, [X92185] co 5, 12 CLCA3* Canal de cloreto de Homo sapiens, membro da família 3 ativado pelo cálcio (CLCA3) 12, 0 5,2

Quadro 12. Lista de genes vulgarmente regulados para cima nas linhas de células da glia.

Abreviatura Alteração do máximo de vezes Alteração do mínimo de vezes Nome completo C12orf42 36, 9 12,7 Fase de leitura aberta 42 de cromossoma 12 de Homo sapiens (C12orf42), ARNm [NM_198521] AK021467 37,0 9,1 ADNc de Homo sapiens FLJ11405 fis, clone HEMBA1000769, [AK021467] GNRHR 32,3 4,7 Recetor da hormona libertadora da gonadotropina (GNRHR) de Homo sapiens, variante 1 do transcrito, ARNm [NM_000406] AF334588 28,6 12,8 ARNm P25 de Homo sapiens, cds completo, [AF334588] A_24_P799680 29,3 6,1 Desconhecido ENST00000329949 23, 6 6,2 Proteína tipo POM121 de Homo sapiens, ARNm (clone ADNc IMAGEM 40053742), [BC112340] LOC348174 21,7 7,9 ADNc de Homo sapiens FLJ38732 fis, clone KIDNE2010750, [AK096051] CN480368 17,3 3, 8 UI-H-EU0-azt-m-22-0-UI, sl NCI_CGAP_Carl Homo sapiens ADNc clone UI-H-EU0-azt-m-22-0-UI 3', sequência ARNm [CN480368] THC2378839 16,3 5,4 CR457228 FLJ20225 {Homo sapiens], parcial (19%) [THC2378839] NP297856 15,2 4,0 GB|AF132199, 11AAG35545, 1 PRO1460 [NP297856] VNN3 12,4 4,9 vanina 3 (VNN3) de Homo sapiens, variante 1 do transcrito, ARNm [NM_018399] CYSLTR2 12,3 3, 5 Recetor de cisteinil leucotrieno 2 (CYSLTR2) de Homo sapiens, ARNm [NM_020377] ENST00000360623 16,1 9, 6 Clone F22H reativo a miosina ARNm da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina de Homo sapiens, cds parcial, [AF035042] THC2407334 15, 0 4,2 Desconhecido 63 ΕΡ2350316Β1 AA903523 12,2 3, 6 AA93553 ok50h02,sl NCI_CGAP_Lei2 Homo sapiens clone ADNc IMAGEM:1517427 3', sequência de ARNm [AA903523] ENST00000372127 11,2 3,9 Gene hipotético suportado por BC006119 Homo sapiens, ARNm (clone ADN IMAGEM:3505629) , cds parcial, [ABC006119] C19orf30 10, 9 3, 8 fase de leitura aberta 30 do cromossoma 19 (C19orf30) de Homo sapiens, ARNm [NM_174947] ZSCAN4 10, 8 5, 3 Dedo de zinco Homo sapiens e domínio SCAN contendo 4 (ZSCAN4), ARNm [NM__152677 ] SPAG11 10, 8 5, 3 Antígeno associado a esperma 11 (SPAG11) de Homo sapiens, variante C do transcrito, ARNm [NM_058203] A_24_P922440 10,3 4,9 Desconhecido THC2443880 9,7 4,2 Desconhecido UNQ6490 19, 4 5, 5 clone DNA147309 YPLR6490 (UNQ6490) Homo sapiens, ARNm, cds completo, [AY358209] ARL11 18, 1 7,6 Fator de ribolisação de ADP tipo 11 (ARL11) Homo sapiens, ARNm [NM 138450] THC2314833 7,2 3,9 Desconhecido IL23R 8,7 3,4 Recetor da interleucina 23 (IL23R) de Homo sapiens, ARNm [NM 144701] FLJ33641 9,8 5,9 Proteína hipotética FLJ33641 (FLJ33641) de Homo sapiens, ARNm [NM 152687] U22172 7,0 4, 6 Proteína de recombinação e de reparação de dano ao ADN humano RAD52 pseudogene ARNm, cds parcial, [U22172] BX113452 14,7 6, 0 BX113452 cérebro criança Soares 1NIB Homo sapiens clone ADNc IMAGp998L21165, sequência de ARNm [BX113452]

Exemplo 5. Imunohistoquímica

Imunohistoquímica de IL23R e beta-catenina em amostras de tecido estudada por preparados a A expressão de IL23R e beta-catenina foi imunohistoquímica em microarrays de tecido 64 ΕΡ2350316Β1 partir de biópsias de cólon embebidas em parafina. De cada paciente, foram incluídas no array amostras emparelhadas do cólon histologicamente normal e duas amostras do tumor do cólon. Além disso, foram incluídas amostras emparelhadas de 10 pacientes de uma lesão adenomatosa e outra amostra do cólon normal. Um total de 57 pacientes, 43 amostras de tumor tipo MSS, 14 amostras de tumor tipo MSI, 14 amostras de adenoma e 57 amostras de cólon normal correspondentes foram incluídos nos microarrays de tecido.

Foi realizada imunohistoquímica utilizando a técnica do complexo avidina-biotina-peroxidase (kit ABC Vectastain Elite [IgG de ratinho], Laboratórios Vector, Burlingame, CA, EUA) com DAB como substrato cromogénico e hematoxilina de Mayer como contra-corante. Após uma desparafinização convencional, a atividade peroxidase endógena foi bloqueada em 3% H202 em PBS durante 10 min e as secções foram pré-tratadas num banho de água a +95°C em tampão citrato (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) durante 20 min. As lâminas foram depois incubadas com anticorpos monoclonais de ratinho contra IL23R (R&D MAB14001; diluído em 1:30, lâminas pré-tratadas com 1% tripsina a 37°C 30 min) ou contra beta-catenina (Zymed CAT-5H10, Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 EUA; diluído em 1:250, pré-tratamento das lâminas a +95°C durante 30 em solução de recuperação alvo DAKO S1699, pH 6-6,2) a +4°C durante a noite. DAB foi utilizado como substrato colorigénico para IL23R, enquanto que o kit substrato S-4800 NovaRED VECTOR foi utilizado para a beta-catenina .

Para as análises estatísticas, o resultado da imuno-rotulagem foi classificado como se segue: para a imunorreatividade de IL23R sem coloração (pontuação 0), com coloração positiva fraca (pontuação 1), com coloração claramente positiva (pontuação 2), com coloração fortemente 65 ΕΡ2350316Β1 positiva (pontuação 3; ver também Figura 9 para exemplos) para beta-catenina sem coloração (pontuação 0), coloração de membrana celular (pontuação 1), coloração citoplasmática (pontuação 2), coloração nuclear na maioria das células do tumor (pontuação 3; ver também Figura 9).

Análises estatísticas

Correlações entre variáveis categóricas foram analisadas utilizando o teste de qui-quadrado, ou quando inválido, o teste exato de Fisher. As análises de sobrevivência foram realizadas utilizando a morte causada por cancro do cólon como o ponto final primário. Os tempos de seguimento foram obtidos a partir de Statistics Finland, uma agência governamental. Foi utilizado o programa SPSS versão 15.0 (SPSS, IL, EUA).

Expressão de IL23R ou beta-catenina nuclear em tumores MSS com NAV3 aberrante está associada a estágios de Dukes e a metástases do nódulo linfático, e a expressão de IL23R está associada com um prognóstico fraco

Foram depois realizadas a deteção imunohistoquímica de beta-catenina (ligada à via GNRHR) e a expressão de IL23R num microarray de tecido incluindo 43 MSS (incluindo também 8 amostras de adenoma dos mesmos pacientes) e 14 amostras de pacientes com MSI (tumor e epitélio de cólon normal correspondente). Em todas as amostras de cólon normal destes casos, a coloração com beta-catenina foi sempre membranosa e não foi encontrada qualquer expressão de IL23R ou apenas expressão fraca (grau 1), com exceção de três casos (Figura 9).

Em células epiteliais normais a beta-catenina é conhecida por estar localizada nas membranas celulares, mas 66 ΕΡ2350316Β1 altera a sua distribuição em direção ao núcleo e citoplasma em amostras de carcinoma. Nas amostras de tumor MSS representativo (amostras duplicadas de cada), a beta-catenina nuclear foi encontrada em 10/43 dos casos e regulação para cima da imunorreatividade de IL23R (pontuações 2-3) em 27/43 dos casos. A expressão da beta-catenina nuclear correlacionou-se com metástases do nódulo linfático. A imunorreatividade da IL23R regulada para cima em amostras de array de tecido estava fortemente correlacionada com os estágios de Dukes (ver Quadro 3 no Exemplo 2, aberrações de NAV3 associam-se com polissomia do cromossoma 12 e com metástases do nódulo linfático) e também com metástases do nódulo linfático (ver Quadro 3 no Exemplo 2) . As amostras de tumor com deleções de NAV3 alélicas mostraram com maior freguência reatividade de IL23R claramente regulada para cima (Figura 9).

Numa análise de sobrevivência com o método de Kaplan-Meier (Figura 10), verificou-se que os pacientes com imunorreatividade de IL-23R regulada para cima (pontuações 2 e 3) tinham um prognóstico pior do que os pacientes com nível de expressão normal ou baixo (isto é, intensidade de coloração imunohistológica, pontuada 0 ou 1, respetivamente, e comparável com a de amostras do cólon normal) (ver Quadro 3 no Exemplo 2) . 0 tempo médio de sobrevivência para um paciente com baixa expressão de IL23R foi de 44 meses (95%IC 38-50 meses), ao passo que para um paciente com elevada expressão regulada para cima, o tempo médio de sobrevivência foi de apenas 23 meses (95%IC 13-33 meses) .

Para 11 pacientes com CRC de tipo MSS, foi possível comparar os resultados FISH de IL23R, beta-catenina e NAV3 nas amostras de adenoma e tumor, alterações do número de cópias do NAV3, juntamente com expressão de IL23R aumentada 67 ΕΡ2350316Β1 (imunocoloração moderada ou forte) e/ou beta-catenina nuclear estavam presentes em 3 das amostras de adenoma e expressão de IL23R aumentada apenas em dois adenomas adicionais (dados não mostrados), Nas amostras de tumor correspondentes, os resultados foram semelhantes com exceção de duas amostras onde não foi encontrada qualquer aberração de NAV3, apesar da expressão de IL23R regulada para cima. Contudo, em ambos estes últimos casos, a lesão de adenoma correspondente mostrou polissomia do cromossoma 12 .

Imunohistoquímica de IL23R e GnRHR em amostras de tecido A imunocoloração de GnRHR foi realizada num imunocorante LabVision (Labvision, CA, EUA) seguida de recuperação do antigeno utilizando o tampão Tris-EDTA, pH 9,0 num forno de micro-ondas durante 24 minutos a 900 watts seguido de arrefecimento durante 20 minutos à temperatura ambiente. GnRHR foi detetado com anticorpo monoclonal de ratinho (diluído 1:10, Abcam, Cambridge, Reino Unido) e um sistema de deteção abseado em polímero (Envision, K5007, DakoCytomation) com diaminobenzidina (DAB) como o cromogénio (Figura 11).

Foram incluídos dois casos representativos de secções de tecido colorretal (amostras emparelhadas de cólon histologicamente normal e tumor de cólon) e dois casos de astrocitoma (glioblastoma) preparados a partir de biópsias de cólon embebidas em parafina de pacientes com cancro colorretal ou astrocitoma. Para estas amostras, foi realizada imunohistoquímica, conforme descrito previamente, utilizando o anticorpo anti-GnRHR e anticorpo monoclonal de ratinho contar IL23R (R&D MAB14001; diluído 1:30, lâminas pré-tratadas com 1% tripsina a 37 °C durante 30 min) e deteção do complexo avidina-biotina-peroxidase (kit ABC 68 ΕΡ2350316Β1

Vectastain Elite [IgG de ratinho], Laboratórios Vector, Burlingame, CA, EUA) com DAB como o substrato cromogénico.

Confirmação de regulação para cima da IL23 e proteína GnRHR em células 0205 com NAV3 silenciado e amostras de tecido de CRC e glioblastoma A regulação para cima dos níveis de proteína GnRHR em células 0205 com NAV3 silenciado foi demonstrada por imunocoloração. A coloração de GnRHR foi superior em células com NAV3 silenciado do que nas células de tipo selvagem e em células transfetadas controlo com ARNsi misturado (Figuras 11 a-c). A imunocoloração da proteína

GnRHR em amostras de tecido de CRC também foi superior do que no epitélio de cólon normal (Figura 11 d). Os resultados foram replicáveis em duas amostras típicas de pacientes com CRC, um caso com um CRC de tipo MSS e 41 % de células com NAV3 deletado no tumor (ponto de corte para deleção do NAV3 é 3% em amostras de referência normais, conforme reportado anteriormente, Figura 11 e) , e um caso de CRC de tipo MSI e 8% de células com NAV3 deletado no tumor (Figura 11 f) . Da mesma forma, foi observada a regulação para cima de GNRHR e IL23R numa série preliminar de amostras de glioblastoma (astrocitoma) com deleção de NAV3 comparada com tumores da glia sem deleção (Figuras 11 g e h) .

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Helsingin yliopiston rahastot <120> Métodos e utilizações envolvendo aberrações genéticas de NAV3 e expressão aberrante de múltiplos genes

<130> 2081898PC 69 ΕΡ2350316Β1 < 16 0 > 15 <17 0> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleotideo <4 0 0> 1 cctgctattt tcatctttca age <210> 2 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleotideo <4 0 0> 2 ggctgggatg ctgtttgag 19 <210> 3 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleotideo ΕΡ2350316Β1 <4Ο0> 3 gatgctgttt gagcgcatca tgctgggccc 30 <210> 4 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleotideo <4 0 0> 4 ggacuuaacc uauauacua 19 <210> 5 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleotideo <4 0 0> 5 gagagggucu ucagaugua 19 <210> 6 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleotídeo <400> 6 cagggagccu cuaauuuaa 19 71 ΕΡ2350316Β1

<210> 7 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleotideο <4 0 0> 7 gcuguuagcu cagauauuu 19 <210> 8 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleotideo <4 0 0> 8 atccatggag ctcagcaa 18 <210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleotideo <400> 9 ttggctgctt cttggagttt 20 <210> 10 <211> 20 <212> ADN 72 ΕΡ2350316Β1 <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleotideo <4 0 0> 10 aagagcacgg ctgaagactc 20 <210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleotideo <4 0 0> 11 gcatgggttt aaaaaggcaa 20 <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleotideo <4 0 0> 12 cgcaaaactc gctattcgac a 21 <210> 13 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial 73 ΕΡ2350316Β1 <22 0> <223> oligonucleotídeo <4 0 0> 13 atggcttccc tcaggcaga 19 <210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleotídeo <4 0 0> 14 ttggctgctt cttggagttt 20 <210> 15 <211> 22

<212> ADN <213> Artificial <220> <223> oligonucleotídeo <4 0 0> 15 caccaaatct agagctgcat ca 22 74 ΕΡ2350316Β1

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora tenha sido tomado muito cuidado na compilação das referências, não se poderão excluir erros e omissões e o IEP nao assume qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição • WO 2008059112 AI [0007] [0055]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição: • KIM B.G. et al. Nature, 2006, vol. 441, 1015-9 [0005] • REUTER J.A. et al. Câncer Cell, 2009, vol. 15, 477-88 [0005] [0104] • PHELPS R.A. et al. Cell, 2009, vol. 37, 623-34 [0006] • CALDWELL C.M. et al. J Cell Biol, 2007, vol. 178, 1109-20 [0006] • KARENKO L. et al. Câncer Res, 2005, vol. 65, 8101-10 [0007] • HAHTOLA S et al. J Invest Dermatology, 2008, vol. 128, 2304-9 [0007] [0098] • HAHTOLA S et al. Genes Chromosomes Câncer, 2008, vol. 47, 107-17 [0007] • BLEEKER F. et al. Human Mutation, 2008, vol. 29, 451- 59 [0007] • BLEEKER F. et al. Hum Mutat, 2009, vol. 30 (2), 451-9 [0007] • NORD H. et al. Neuro Oncol, 20 March 2009 [0007] • WOOD L. et al. Science, 2007, vol. 318, 1108-13 [0007] • COY JF et al. Gene, 2002, vol. 290 (1-2), 73-94 [0055] • KARENKO L. et al. Câncer Res, 2005, vol. 65 (18), 75 ΕΡ2350316Β1 8101-10 [0055] • HAHTOLA S. et al. J Invest Dermatol, 2008, vol. 128 (9), 2304-9 [0055] • VERMEER M.H. et al. Câncer Res, 2008, vol. 68 (8), 2689-98 [0055] • HAHTOLA S et al. J Invest Dermatol, 2008, vol. 128 (9), 2304-9 [0055] • HAHTOLA S et al. Genes Chromosomes Câncer, 2008, vol. 47 (2), 107-17 [0055] • SIPILA L et al. EJC supplements, 2008, vol. 6 (12), 118 [0055] • YEUNG CM et al. Mol Hum Reprod, 2005, vol. 11 (11), 837-42 [0072] • HARRISON GS et al. Endocr Relat Câncer, 2004, vol. 11 (4), 725-48 [0072] • SALISBURY TB et al. Mol Endocrinol, vol. 22 (6), 1295- 303 [0072] • SALISBURY TB et al. Mol Endocrinol, 2008, vol. 22 (6), 1295-303 [0072] GARDNER S et al. Neuroendocrinology, 2009, vol. 89 (3), 241-51 [0072] BUHMEIDA A et al. APMIS, 2008, vol. 116 (D, 1-9 [0072] BEYER BM et al. J Mol Biol, 2008, vol. 382 (4) , 942-55 [0074] • CONSTANTINESCU SN et al. Trends Biochem Sei, 2 008, vol. 33 (3), 122-31 [0074] • LI WX. Irends Cell Biol, 2008, vol. 18 (11), 545-51 [0074] • LANGOWSKI JL et al. Nature, 2006, vol. 442 (7101), 461-5 [0075] • KUGATHASAN S et al. Gut, 2007, vol. 56 (12), 1696-705 [0075] • LAKATOS et al. World J Gastroenterol, 2008, vol. 14 (25), 3937-47 [0075] 76 ΕΡ2350316Β1 • ΗΕΜΜΙΝΚΙ Κ et al. Int J Câncer, 2008, vol. 123 (6), 1417-21 [0075] • KIM BG et al. Nature, 2006, vol. 441 (7098), 1015-9 [0076] • GRIVENNIKOV S et al. Câncer Cell, 2009, vol. 15 (2), 103-13 [0076] • SPINOLA M et al. Lung Câncer, 2007, vol. 55 (3), 271-7 [0077] • JANSEN PA et al. J Invest Dermatol, 2 6 March 200 9 [0077] • GRULICH AE ; VAJDIC CM. Pathology, 2005, vol. 37 (6), 409-19 [0077] • HYYTINEN E et al. Cytometry, 1994, vol. 16, 93-96 [0082] [0086] • ISOLA J. et al. Am. J. Pathol, 1994, vol. 145, 1301- 1308 [0082] [0086] • BOLAND et al. Câncer Res, 1998, vol. 58, 5248-5257 [0083] • KARENKO L et al. Câncer Res, 2005, vol. 65, 8101-10 [0089] • ABDEL-RAHMAN W. M. et al. Proc Natl Acad Sei USA, 2001, vol. 98, 2538-43 [0096] • HAHTOLA et al. J Invest Dermatology, 2008, vol. 128, 2304-9 [0099] • CLETON-JANSEN A. M. et al. Câncer Res, 2001, vol. 61, 1171-7 [0100] • CHUNG D.C. Gastroenterology, 2000, vol. 119, 854-65 [0104] • KIM B.G et al. Nature, 2006, vol. 441, 1015-1019 [0104] • FEARON E. R. ; VOGELSTEIN B. Cell, 1990, vol. 61, 759- 67 [0104] • ABDEL-RAHMAN W.M. et al. Proc Natl Acad Sei USA, 2001, vol. 98, 2538-43 [0104] • DRAGHICI S. et al. Genome Res, 2007, vol. 17 (10), 77 ΕΡ2350316Β1 1537-45 [0119] vol. 10 (3), LINJA MJ et al. Clin Câncer Res, 2 0 04, 1032-40 [0123]

Lisboa, 4 de Junho de 2014 78

Claims

ΕΡ2350316Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de demonstrar o caráter maligno de um tumor ou subpopulação de células num sujeito, compreendendo o método: i) determinar uma alteração do número de cópias do NAV3 numa amostra biológica do sujeito; e ii) determinar a sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina, na amostra biológica ou noutra amostra biológica do sujeito; iii) demonstrar o caráter maligno de um tumor ou subpopulação de células num sujeito, quando ambas alteração do número de cópias do NAV3 e sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina estão presentes na(s) amostra(s) do sujeito.
2. Um método de prever um prognóstico de um sujeito com um tumor, compreendendo o método: i) determinar uma alteração do número de cópias do NAV3 numa amostra biológica de um sujeito; ii) determinar a sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R ou beta-catenina, na amostra biológica ou noutra amostra biológica do sujeito; e iii) prever um prognóstico de um sujeito com ambas alteração do número de cópias do NAV3 e sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R ou beta-catenina na(s) amostra(s).
3. Uma utilização do gene NAV3 ou produto génico e de, pelo menos, um gene e/ou produto génico selecionado de 1 ΕΡ2350316Β1 IL23R, GnRHR, beta-catenina para demonstrar o caráter maligno de um tumor ou subpopulação de células com uma alteração do número de cópias do NAV3 e com sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina, num sujeito.
4. Uma utilização do gene NAV3 ou produto génico e, pelo menos, um gene e/ou produto génico selecionado de IL23R ou beta-catenina para prever um prognóstico de um sujeito.
5. 0 método ou utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a alteração do número de cópias do NAV3 é causada por uma deleção, amplificação ou translocação do gene NAV3 ou de uma grande parte do mesmo.
6. 0 método ou utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o tumor é um tumor colorretal, tumor cerebral ou tumor de queratinócitos epidérmicos.
7. 0 método ou utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o tumor é um carcinoma.
8. 0 método ou utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o(s) gene(s) e/ou produto (s) génico (s) é ativado, desativado, sobre-expressado ou sub-expressado ou a quantidade do produto génico é aumentada ou diminuída.
9. 0 método ou utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 ou 5-8, em que a presença de um tumor com uma alteração do número de cópias do NAV3 e com sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina está associado com metástases do nódulo linfático, malignidade de grau 2 ΕΡ2350316Β1 elevado e/ou baixa sobrevivência.
10. O método ou utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 4 ou 5-8, em que a presença de um tumor com uma alteração do número de cópias do NAV3 e com sobre-expressão de, pelo menos, um gene ou produto génico selecionado de IL23R ou beta-catenina está associado com metástases do nódulo linfático, malignidade de grau elevado e/ou baixa sobrevivência.
11. O método ou utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 ou 5-9, em que o(s) gene (s) selecionado(s) de IL23R, GnRHR, beta-catenina, codifica uma proteina, que é uma proteína da membrana, uma proteína reguladora de processos celulares ou uma proteína de ligação ao nucleotídeo purina.
12. O método ou utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 4, 5-8 ou 10, em que o(s) gene(s) selecionado(s) de IL23R ou beta-catenina, codifica uma proteína, que é uma proteína da membrana, uma proteína reguladora de processos celulares ou uma proteína de ligação ao nucleotídeo purina.
13. O método ou utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 ou 5-9 ou 11, em que o gene ou produto génico é IL23R e/ou GnRHR.
14. O método ou utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o tumor cerebral é um glioma. Lisboa, 4 de Junho de 2014 3