ES2469802T3 - Métodos y usos que implican aberraciones genéticas de NAV 3 y expresión aberrante de múltiples genes - Google Patents

Abstract

Un método de demostración del carácter maligno de un tumor o de una subpoblación celular de un sujeto, comprendiendo el método: i) determinar un cambio en el número de copias de NAV3 en una muestra biológica del sujeto; y ii) determinar la sobreexpresión de al menos un gen o un producto génico seleccionados de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina, en la muestra biológica o en otra muestra biológica del sujeto; iii) demostrar el carácter maligno de un tumor o de una subpoblación celular de un sujeto, cuando tanto un cambio en el número de copias de NAV3 como la sobreexpresión de al menos un gen o un producto génico seleccionados de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina están presentes en la(s) muestra(s) del sujeto.

Description

M�todos y usos que implican aberraciones genéticas de NAV 3 y expresión aberrante de múltiples genes

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a los campos de la genética y la oncología y proporciona métodos para detectar tumores as� como métodos para predecir el pronóstico de un paciente.

Espec�ficamente, la presente invención se refiere a un método para demostrar el carácter maligno de un tumor o de una subpoblaci�n celular de un sujeto y a un método para predecir un pronóstico de un sujeto que tiene un tumor con un cambio en el número de copias y con sobreexpresi�n de al menos un gen o de un producto g�nico seleccionados de entre IL23R, GnRHR y beta-catenina. La presente invención también se refiere a los usos del gen NAV3 o de su producto g�nico y al menos un gen y/o un producto g�nico seleccionado de entre IL23R, GnRHR y

15 beta-catenina para demostrar el carácter maligno de un tumor o subpoblaci�n celular, prediciendo un pronóstico de un sujeto que tiene un tumor con un cambio del número de copias de NAV3. Además se describe el uso de un antagonista, un anticuerpo o una molécula inhibidora de al menos un gen y/o de un producto g�nico seleccionados de listas específicas para terapia contra el cáncer en un sujeto.

Adem�s, se describe un kit de diagnóstico que comprende herramientas para detectar el cambio en el número de copias en una muestra biológica y herramientas para detectar la sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico seleccionado de listas específicas en una muestra biológica. La presente invención también se refiere al uso de un gen NAV3 o un producto g�nico y al menos un gen y/o producto g�nico seleccionado de IL23R o betacatenina para demostrar el carácter maligno de un tumor o una subpoblaci�n celular, para predecir un pronóstico de

25 un sujeto con un tumor colorrectal, tumor cerebral o tumor de queratinocitos epid�rmicos y para seleccionar un tratamiento para un sujeto con un tumor colorrectal, tumor cerebral o tumor de queratinocitos epid�rmicos.

Descripci�n

La progresión del cáncer se caracteriza por el desarrollo de inestabilidad cromos�mica, aneuploid�a, y una serie de aberraciones genéticas adquiridas que afectan genes importantes para el crecimiento celular y la supervivencia. Un único gen puede afectar varias rutas críticas y contribuir a la conversión de una célula normal en una célula cancerosa, que implica un proceso en etapas que requiere la activación de oncogenes y la inactivaci�n de los genes supresores de tumores. La tecnología reciente ha posibilitado la identificación de incluso mutaciones raras que

35 contribuyen al desarrollo del cáncer.

El desarrollo del cáncer colorrectal (CRC) por medio de lesiones precursoras benignas, pólipos adenomatosos, junto con la acumulación de cambios genéticos y epigen�ticos es uno de los ejemplos mejor conocidos de la carcinog�nesis multietapa. Las pruebas recientes también sugieren que el microambiente tisular es de una gran importancia en el crecimiento potencial y diseminaci�n de las células tumorales (Kim B.G. y col. 2006, Nature 441: 1015-9; Reuter J.A. y col. 2009, Cancer Cell 15: 477-88) y tal efecto puede estar impulsado por la inflamación crónica. Se sabe que el CRC est� ligado a la enfermedad inflamatoria del intestino grueso (IBD).

La inmensa mayoría de los c�nceres colorrectales muestra uno de los dos fenotipos principales de inestabilidad

45 gen�mica, la inestabilidad microsat�lite (MSI) o la inestabilidad cromos�mica (CIN), también llamada microsat�lite estable (MSS). Aproximadamente el 85 % de los CRC se relacionan con MSS y muestran aneuploid�a y pérdida de heterocigosidad (LOH), y la poliposis adenomatosa cólica (APC) o mutaciones beta-catenina son las aberraciones moleculares precoces más comunes en este fenotipo. Estas mutaciones dan lugar a la activación de la ruta Wnt aberrante, de la que se piensa que inicia la formación del adenoma de colon. Varias rutas de se�alizaci�n est�n implicadas en el desarrollo de c�nceres de colon esporádicos. Por tanto, son necesarios varios años o décadas para desarrollar un cáncer de colon incluso si est�n presentes mutaciones del gen de la poliposis adenomatosa cólica (APC). También es necesaria la activación de KRAS para la progresión de adenomas en carcinomas como una segunda etapa (Phelps R.A. y col. 2009, Cell 37: 623-34). También se ha demostrado que la pérdida de APC funcional induce la aneuploid�a in vivo por medio de una tetraploid�a transitoria (Caldwell C.M. y col. 2007, J Cell Biol

55 178: 1109-20), lo que puede potenciar la idoneidad de células que contienen cromosomas rotos o reorganizados.

Hemos mostrado previamente que las aberraciones en el cromosoma 12q21, específicamente la pérdida al�lica en el gen navegador neuronal 3 (NAV3), se asocian con varios subtipos de linfoma de células T cut�neo (CTCL) (Karenko L. y col. 2005, Cancer Res 65: 8101-10; Hahtola S y col. 2008, J Invest Dermatology 128: 2304-9; WO2008059112 A1) y c�nceres de pulmón asociados a CTCL (Hahtola S y col. 2008, Genes Chromosomes Cancer

47: 107-17). Más recientemente, se han descrito mutaciones de NAV3 o cambios en el número de copias, respectivamente, en el melanoma (Bleeker F. y col. 2008, Human Mutation 29: E451-59), cáncer pancreático (Bleeker F. y col. 2009, Hum Mutat 30(2): E451-9) y en glioblastomas humanos (Nord H. y col. 2009, Neuro Oncol Mar20). Además, se ha encontrado que el NAV3 es el único gen que estaba expresado diferencialmente de forma

65 significativa (regulado negativamente) en el carcinoma adrenal al compararse con los adenomas adrenocorticales (Soon P.H. y col. 2009, ERC). En el panorama de genes del cáncer, el NAV3 pertenece a los genes candidatos de cáncer “tipo colina” (CAN) que comúnmente mutan en c�nceres de mama y colon (Wood L. y col. 2007, Science

318: 1108-13).

Se considera cada vez más importante concentrar los esfuerzos de investigación en la identificación de las rutas que

5 est�n afectadas por las aberraciones genéticas, y de esta manera se proporcionan además herramientas para diagnosticar enfermedades y para diseñar fármacos específicos para tratamientos individualizados. Ahora, hemos encontrado correlaciones sorprendentes y anteriormente desconocidas entre las aberraciones de NAV3 con rutas específicas y genes relacionados con las mismas. Por tanto, proporcionamos nuevos medios y métodos para diagnosticar o hacer un seguimiento del cáncer.

10 Est�n justificados nuevos biomarcadores o combinaciones de biomarcadores que proporcionen diagnósticos más eficaces y precoces de tumores potencialmente agresivos as� como la identificación de tumores susceptibles de terapias dirigidas. La presente invención proporciona una solución específica para predecir o identificar un tumor y la progresión del carcinoma. La presente invención también desvela una herramienta para evaluar la agresividad

15 clónica de los tumores y la supervivencia del paciente.

Breve descripción de la invención

El objetivo de la invención, por tanto, es proporcionar métodos nuevos y medios para demostrar el carácter maligno 20 de un tumor y para estadificar y hacer un seguimiento de un cáncer, tales métodos y medios permiten un diagnóstico preciso de la enfermedad.

Otros objetivos de la invención son proporcionar métodos y medios para predecir el inicio del tumor o la progresión del tumor as� como para predecir el pronóstico de un paciente. Los métodos y medios de la presente invención son 25 específicos y fiables. Los métodos y medios permiten una buena intervención terapéutica dirigida, que puede salvar vidas.

Otro objetivo más de la invención es proporcionar nuevos biomarcadores y combinaciones de biomarcadores útiles en la detección del cáncer as� como en las evaluaciones pron�sticas.

30 Demostrando las aberraciones del NAV3, ligadas a metástasis en los ganglios linfáticos y a la inflamación relevante y las rutas de proliferaci�n celular, se proporcionar� una herramienta relativamente simple y asequible para hacer un seguimiento del cáncer, específicamente un cáncer del colon-recto, cerebro o de queratinocitos epid�rmicos. El NAV3 regula la expresión de otros genes y rutas de se�alizaci�n que tienen un efecto en la transformación maligna

35 y/o en el comportamiento biológico del tumor maligno. Por lo tanto, las rutas afectadas por NAV3 as� como las diferentes combinaciones de las mismas también son dianas para diseñar terapias contra el cáncer.

Los cambios en el número de copias de NAV3, especialmente la deleci�n de NAV3, est� implicada directamente en la carcinog�nesis precoz y abre nuevas posibilidades para diagnosticar más precisamente pero también para 40 estrategias terapéuticas racionales.

La presente invención se refiere a un método de demostración del carácter maligno de un tumor o de una subpoblaci�n celular de un sujeto, comprendiendo el método:

45 i) determinar el cambio en el número de copias en una muestra biológica del sujeto; y ii) determinar la sobreexpresi�n de al menos un gen o unproducto g�nico seleccionados de entre IL23R, GnRHR y beta-catenina en la muestra biológica u otra muestra biológica del sujeto; iii) demostrar el carácter maligno de un tumor o subpoblaci�n celular de un sujeto, cuando tanto el cambio en el número de copias del NAV3 como la sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico seleccionado de

50 entre IL23R, GnRHR y beta-catenina est�n presentes en la(s) muestra(s) del sujeto.

Tambi�n se describe un método de tratamiento para un sujeto que tiene un tumor con un cambio en el número de copias del NAV3 y con sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico seleccionados de entre IL23R, GnRHR y beta-catenina y los que se enumeran en las tablas 8-12, que comprenden una etapa, en la que est�

55 afectado al menos un gen o un producto g�nico con sobreexpresi�n.

La presente invención además se refiere a un método para predecir un pronóstico que comprende:

i) determinar el cambio de número de copias de NAV3 en una muestra biológica de un sujeto;

60 ii) determinar la sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico seleccionado de entre IL23R y betacatenina, en la muestra biológica u otra muestra biológica del sujeto; y iii) predecir un pronóstico para el sujeto que tiene tanto un cambio en el número de copias del NAV3 como la sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico seleccionados de entre IL23R o beta-catenina en la(s) muestra(s).

65 También se describe un método para seleccionar un tratamiento para un paciente, que comprende:

i) determinar un cambio en el número en las copias de NAV3 en una muestra biológica de un sujeto; ii) determinar la sobreexpresi�n de al menos un gen o unproducto g�nico seleccionados de entre IL23R, GnRHR,

5 beta-catenina y los que se enumeran en las tablas 8-12, en la muestra biológica o en otra muestra biológica del sujeto; y iii) seleccionar un tratamiento para el sujeto que tiene tanto un cambio en el número de copias de NAV3 como sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico seleccionado de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina y los que se enumeran en las tablas 8-12 en la(s) muestras(s).

La presente invención además se refiere al uso del gen NAV3 o producto g�nico y de al menos un gen y/o producto g�nico seleccionado de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina para demostrar el carácter maligno de un tumor o subpoblaci�n de células con un cambio en el número de copias de NAV3 y con sobreexpresi�n de al menos un gen

o un producto g�nico seleccionados de entre IL23R, GnRHR y beta-catenina, en un sujeto.

15 La presente invención además se refiere al uso del gen NAV3 o un producto g�nico y al menos un gen y/o un producto g�nico seleccionado de entre IL23R o beta-catenina para predecir el pronóstico de un sujeto.

Adem�s se describe el uso de un gen NAV3 o un producto g�nico y al menos un gen y/o un producto g�nico seleccionado de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina y los que se enumeran en las tablas 8-12 para seleccionar un tratamiento para un sujeto.

Adem�s se describe el uso de al menos un gen y/o un producto g�nico seleccionado de entre IL23R, GnRHR, betacatenina y los que se enumeran en las tablas 8-12 como terapia contra el cáncer en un sujeto que tiene un tumor

25 con un cambio en el número de copias del NAV3.

Tambi�n se desvela el uso de un antagonista, anticuerpo o molécula inhibidora de al menos un gen o un producto g�nico seleccionado de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina y los que se enumeran en las tablas 8-12 para la terapia contra el cáncer en un sujeto que tiene un tumor con un cambio en el número de copias de NAV3 y con sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico seleccionado de entre el IL23R, GnRHR, beta-catenina y los que se enumeran en las tablas 8-12.

Adem�s se desvela un kit de diagnóstico que comprende herramientas para detectar un cambio en el número de copias de NAV3 en una muestra biológica y herramientas para detectar la sobreexpresi�n de al menos un gen o un

35 producto g�nico seleccionado de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina y los que se enumeran en las tablas 8-12 en una muestra biológica.

Adem�s se desvela el uso de un kit de diagnóstico para demostrar el carácter maligno de un tumor o una subpoblaci�n celular.

Adem�s se desvela el uso de un kit de diagnóstico de la invención para predecir el pronóstico de un sujeto con un tumor colorrectal, tumor cerebral o tumor de queratinocitos epid�rmicos.

Adem�s se desvela el uso de un kit de diagnóstico de la invención para seleccionar un tratamiento para un sujeto 45 con un tumor colorrectal, tumor cerebral o tumor de queratinocitos epid�rmicos.

Breve descripción de los dibujos

A continuación la invención se describir� en mayor detalle por medio de las realizaciones preferidas con referencias a los dibujos adjuntos, en los que

La Figura 1 muestra la cantidad de células con el cromosoma 12 polis�mico y NAV3 eliminado en muestras de adenoma y carcinoma de los mismos pacientes. La Figura 2 muestra A) Polisom�a del cromosoma 12, B) Amplificación de NAV3 y C) Deleci�n de NAV3 en el

55 colon normal, carcinoma de colon MSS y MSI y en muestras de adenoma de colon. Cada punto representa una muestra y se contaron 200 células de todas las muestras. La Figura 3 muestra las aberraciones de NAV3 en líneas celulares de cáncer de colon observadas por sondas BAC en relación a las translocaciones del cromosoma 12 por MFISH específica de brazo cromos�mico o deleciones del NAV3 en relación con las deleciones observadas por las sondas YAC. a) Una metafase de la línea celular SW403 (CLL-230) que muestra tres copias del centr�mero del cromosoma 12 (verde, Alexa 488) y un gen NAV3 perdido (rojo; BAC RP11-36P3) en una. Esta deleci�n se observ� en un cromosoma que recibió material translocado del cromosoma 15q (b; MFISH-brazo) y estaba acompañado por dos copias de longitud completa del cromosoma 15 semejante (c, translocaci�n desequilibrada). Las tinciones respectivas DAPI correspondientes se muestran en los paneles d-f. Por FISH específico de brazo (g), se localizó la translocaci�n desde el

65 cromosoma 15 (rojo y violeta) en el brazo p (naranja) del cromosoma 12 (verde y rojo carmesí) y se verificó la deleci�n para el brazo q. En la línea celular RKO (h-j), solo dos de los tres cromosomas 12 (centr�mero verde) mostraron señales de sonda BAC RP11-136F16 específica del gen NAV3 (rojo; h). La translocaci�n desequilibrada entre los cromosomas 12 (i, MFISH) y 2 (j, MFISH) abolió el gen NAV3. Las células T84 (CLL248) mostraban varias copias del cromosoma 12 (centr�mero en azul; k) con pérdida de señales NAV3 en uno (naranja, BAC RP1136P3). La diferencia de tamaño entre el cromosoma 12 normal y el aberrante era pequeña (l,

5 MFISH-brazo), pero se observaron deleciones indicadas por las sondas YAC 825F9 (12S326 y WI-7776, rojo en el panel m) y 885G4 (WI-6429, WI-9760, rojo en panel n), que se extendían proximalmente y distalmente del gen NAV3. Se vio la señal específica de NAV3 (RP11-36P3, rojo) en el der (2) t (2; 12) (o) en el cromosoma 12 normal (q), pero no en los otros dos cromosomas 12 (p – q; centr�mero verde) ni en los cromosomas diminutos con material cen 12 (q). Los cromosomas aberrantes correspondientes que se observan comúnmente observados por el MFISH-brazo (2; 12), r) der (10) t (10; 12; 3), s) e i (12) (p) derecho, t) a lo largo de un cromosoma 12 normal, t). La Figura 4 muestra la pérdida de NAV3 en una muestra de un paciente detectada por matriz CGH. Vistas desde abajo: vista del genoma, cromosoma12, nivel g�nico donde las sondas NAV3 est�n marcadas por un cuadrado. La Figura 5 muestra el dendrograma de agrupamiento GO y el mapa crítico de expresión. El análisis se basa en

15 16 productos g�nicos. El número medio de anotaciones GO por producto g�nico es 8. Además, 23 productos g�nicos no tenían anotación GO y se excluyeron del análisis. Los colores representan los valores de expresión de los productos g�nicos. Los valores de expresión más bajos se indican en rojo y las expresiones más altas en blanco. El dendrograma de la izquierda corresponde al agrupamiento basado en GO, a su vez el dendrograma superior utiliza los valores de expresión para el agrupamiento. La Figura 6 muestra la comparación de expresión de NAV3. Los niveles de ARNm NAV3 tras la transfecci�n con ARNsi NAV3 se evaluaron por LightCycler q RTPCR y micromatrices Agilent 4 x 44K. La Figura 7 muestra la hibridación in situ del ARN de NAV3 silenciado en células A172 de glioblastoma. Se detect� el ARN-NAV3 con una sonda que reconoce los exones 37-39 del ARN NAV3 (púrpura). La expresión de NAV3 en las células silenciadas (e), las células no transfectadas (a), y las células transfectadas con el control de

25 ARN (c). Se muestran los controles en sentido, con 5 x más sondas, para a, c, y e en b, d, y f, respectivamente. La Figura 8 muestra el dendrograma de agrupamiento GO y el mapa crítico de expresión de los genes regulados positivamente en ocho de los diez experimentos de anulación. Los valores de expresión más bajos se indican en rojo y los más altos en blanco. Se muestran el dendrograma basado en el agrupamiento GO (izquierda) y el dendrograma del agrupamiento de muestras basado en los perfiles de expresión (derecha). Los nombres de los genes est�n a la derecha y cada columna representa un único experimento. Los grupos GO con más de un gen son desde abajo a arriba; membrana (negro, 9 genes), transporte de iones (marrón, 2 genes), nuclear (verde, 4 genes), y unión a ribonucle�tidos (azul, 2 genes). La Figura 9 muestra la expresión y la localización celular de IL23R y beta-catenina en los c�nceres de colon y colorrectal humanos. Fotomicrograf�as representativas de la tinción inmunol�gica para IL23R (a) y beta-catenina

35 (d) en tejido normal de colon. Se observ� la inmunorreactividad de IL23R en las muestras de cáncer colorrectal con deleci�n de NAV3 (c, grado 3 de tinción, 8 % de células con NAV3 eliminado) mientras que los c�nceres sin aberración NAV no mostraban tinción IL23R (b). Ambas muestras (b y c) tienen un 20 % de células tumorales con polisom�a del cromosoma 12. Una muestra de CRC sin deleci�n NAV3 mostr� un patrón membranoso normal de tinción de beta-catenina (e) mientras que una muestra de CRC con deleci�n de NAV3 en el 9 % de las células, mostr� principalmente una fuerte localización nuclear de la beta-catenina (f). La Figura 10 muestra el trazado de Kaplan-Meyer de las distribuciones de supervivencia con respecto a la inmunorreactividad de IL23R. La Figura 11 muestra la inmunotinci�n de GnRHR de células NAV3 0205 silenciadas y tejido de glioma. La tinción de membrana de GnRHR en células 0205 silenciadas NAV3 (c) comparadas con las células tipo

45 silvestres, (a) y con las células transfectadas con la construcción de control (b). La expresión de GnRHR en las dos muestras de cáncer colorrectal con deleci�n de NAV3: paciente con CRC tipo MSS (e), paciente con CRC tipo MSI (f), tejido colorrectal normal de control (d). Tinción de GnRHR de dos muestras de glioma (astrocitoma) con un 55 % (g) y un 93 % (i) de células con NAV3 eliminado y número de copias de NAV3 normal (g).

Descripci�n detallada de la invención

Informamos ahora de que los cambios en el número de copias de NAV3 se encuentran con frecuencia en el CRC tipo MSS, en adenomas de colon, en tumores cerebrales, en queratinocitos epid�rmicos y varias líneas celulares establecidas. Las aberraciones en NAV3 se correlacionan con polisom�a en el cromosoma 12 y la implicación de los

55 ganglios linfáticos. Además, los análisis de ARNsi específico del silenciamiento g�nico del NAV3 y de la matriz de expresión revelan al menos dos moléculas diana importantes para NAV3.

M�todos de diagnóstico y métodos de tratamiento y predicción del pronóstico

Todos los genes regulados positivamente o sus productos g�nicos enumerados en la presente solicitud se pueden utilizar en el desarrollo de nuevos principios diagnósticos. Además para determinar el número de copias de NAV3, se estudia la expresión de al menos un gen o un producto g�nico seleccionados de entre IL23R, GnRHR y betacatenina en los métodos de la presente invención. Como se utiliza en el presente documento la expresión de un “producto g�nico” se refiere a un ARNm, proteína o a cualquier producto que se obtiene a partir del gen. En una

65 realización específica de la invención, el producto g�nico es una proteína.

Para las proteínas que son secretoras, se pueden utilizar los métodos para comprobar su aumento de nivel en la sangre del paciente como un método diagnóstico. Para las proteínas no secretoras, el método más apropiado que se utilizar� ser� la inmunohistoqu�mica.

5 Los métodos de diagnóstico se pueden llevar a cabo in vitro o ex vivo. En una realización específica de la invención, el método es un método in vitro.

Adem�s se describe un kit de diagnóstico para demostrar el carácter maligno de un tumor o de una subpoblaci�n celular. Las herramientas para detectar el cambio en el número de copias de NAV3 y/o la sobreexpresi�n de cualquier gen o producto g�nico puede comprender sondas adecuadas, cebadores o anticuerpos.

En una realización específica de la invención, el tumor es un tumor colorrectal, tumor cerebral o tumor de queratinocitos epid�rmicos.

15 La mayoría de los tumores cerebrales se originan en la gl�a (gliomas) tales como los astrocitos (astrocitomas), oligodendrocitos (oligodendrogliomas), o células ependimales (ependimoma). También hay formas mixtas, con ambos componentes celulares astroc�tico y oligodendroglial. Estos se denominan gliomas mixtos u oligoastrocitomas. También se pueden encontrar tumores mixtos glioneuronales (tumores que muestran un componente neuronal, as� como un componente glial, por ejemplo gangliogliomas, tumores neuroepiteliales disembriopl�sticos) y tumores que se originan en las células neuronales (por ejemplo gangliocitoma, gangiocitoma central). Otras variedades de tumor primario cerebral incluyen: tumores primitivos neuroectod�rmicos (PNET, por ejemplo, meduloblastoma, meduloepitelioma, neuroblastoma, retinoblastoma, ependimoblastoma), tumores del par�nquima pineal (por ejemplo, pineocitoma, pineoblastoma), tumores de células ependimales, tumores del plexo coroideo, tumores neuroepiteliales de origen incierto (por ejemplo, gliomatosis cerebral, astroblastoma), etc. En una

25 realización específica de la invención el tumor cerebral es un glioma, es decir, un glioblastoma.

Como se utiliza en el presente documento la expresión “tumor” se refiere a una masa anormal de tejido debido a un exceso anormal de divisiones celulares y la falta de muerte celular normal.

En una realización específica de la invención, el tumor es un tumor benigno o un tumor maligno, es decir, un tumor no canceroso o un tumor canceroso. La expresión “adenoma” se refiere a un tumor no canceroso. En una realización específica de la invención, el tumor es un carcinoma. Los carcinomas son tumores malignos derivados de células epiteliales.

35 Los métodos de la presente invención demuestran el carácter maligno de un tumor. Carácter maligno se refiere a un tumor maligno, es decir, un tumor canceroso. Los tumores malignos pueden ser agresivos, es decir, de crecimiento rápido y que posiblemente metastatiza. Se puede estudiar cualquier “subpoblaci�n celular”, que se refiere a una población restringida de células, para ver sus características de malignidad. La subpoblaci�n celular se puede localizar en las células inflamatorias que infiltran el tejido.

En la presente invención, una muestra biológica puede ser cualquier muestra de tejido, tal como una biopsia del tejido o el ganglio linfático o una lesión tumoral metast�tica en cualquier órgano del cuerpo o en sangre entera. La muestra biológica también puede ser orina, heces u otra excreci�n corporal. La muestra biológica puede pretratarse, si fuera necesario, de una manera adecuada conocida por los expertos en la técnica.

45 La presente invención también se refiere a una predicción o un pronóstico. En una realización específica de la invención, la presencia de un tumor con un cambio en el número de copias NAV3 con sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico seleccionados de entre IL23R o beta-catenina, se asocia con metástasis en ganglios linfáticos, alto grado de malignidad y/o poca supervivencia. En una realización específica de la invención el pronóstico es malo. “Pronóstico malo” se refiere a una alta expectativa de metástasis o diseminaci�n tumoral, poca respuesta a las modalidades de tratamiento habituales y/o poca supervivencia. En un paciente con una predicción de poca supervivencia, la expectativa de vida es menor que en un correspondiente grupo de pacientes comparativo.

En los centros cl�nicos, se debe potenciar la capacidad de diagnosticar precisamente no solo el tipo de tumor sino

55 los cambios genéticos, funcionales e inmunol�gicos que est�n presentes en un tumor en particular. Para una terapia más detallada, entonces se puede ajustar la elección de las moléculas terapéuticas o los anticuerpos a medida de ese tumor en particular. En otras palabras se necesita una medicina personalizada con una combinación de al menos dos fármacos que se dirijan contra diferentes moléculas.

Adem�s se describen varios resultados aprovechables que se pueden utilizar además en el desarrollo de eficaces nuevos principios terapéuticos y diagnósticos. El hallazgo de que la regulaci�n positiva de genes, que est�n regulados positivamente en la deficiencia de NAV3 y est�n implicados en la transformación en malignidad, se puede utilizar en la selección de una terapia racional para un cáncer determinado.

65 La decisión de cuáles alternativas terapéuticas se deberían utilizar, es decir, la selección de un tratamiento, puede basarse en el ensayo de malignidad del tumor por cambio en el número de copias de NAV3 (deleci�n del gen NAV3 que conduce al descenso de la expresión de NAV3) y por la regulaci�n positiva de cualquiera de los genes o productos g�nicos seleccionados de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina, los que se enumeran en las tablas 8-12 y la relación IL23/IL23R as� como las rutas GnRHR.

5 Un método de tratamiento que además comprende una etapa, en la que el gen(es) o producto(s) g�nico(s) seleccionados de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina y los que se enumeran en las tablas 8-12 est�n afectados por una baja expresión o inactivaci�n del gen(es) o producto(s) g�nico(s) o un descenso de la cantidad del producto(s) g�nico(s).

10 Un método de tratamiento que puede comprender además una etapa, en la que est� afectado un gen o un producto g�nico de NAV3.

El gen o producto g�nico de NAV3 est� afectado por sobreexpresi�n o activación del gen o del producto g�nico o el aumento de la cantidad del producto g�nico. El/los gen(es) y/o el/los producto(s) g�nico(s), es decir los

15 seleccionados de NAV3, IL23R, GnRHR, beta-catenina y los que se enumeran en las tablas 8-12, est�n activados, inactivados, sobre expresados o bajo expresados, o la cantidad del producto g�nico est� aumentada o disminuida, al menos est�n afectadas las rutas de se�alizaci�n GnRH y/o JAK/STAT.

Cualquier molécula o moléculas terapéuticas se pueden utilizar para afectar los productos g�nicos diana; se utiliza

20 un antagonista, anticuerpo o molécula inhibidora para afectar al menos a un producto g�nico. “Una molécula inhibidora” se refiere a cualquier molécula (por ejemplo, una molécula pequeña inhibidora de ARN o un anticuerpo), que inhibe o reduce la acción de una diana, por ejemplo la molécula inhibidora es un ARNsi. La regulaci�n positiva de las proteínas asociadas a la membrana es de especial interés, ya que la terapia mediada por anticuerpos se utiliza actualmente ampliamente y los métodos para generar anticuerpos terapéuticos específicos de diana

25 humanizados para moléculas diana est�n disponibles fácilmente.

Un método de tratamiento puede ser en forma de un medicamento convencional o se puede dar como terapia g�nica.

30 En terapia, se puede utilizar la restauración de la función normal de un gen. Esto se puede conseguir potenciando la expresión de genes funcionalmente homólogos, introduciendo un gen intacto o utilizando una forma alterada del gen

o el oligonucle�tido antisentido contra un gen por cualquier técnica disponible actualmente para la terapia g�nica para evitar la progresión de una enfermedad proliferativa. En particular, el crecimiento de las células tumorales se puede ralentizar o incluso pararse con tal terapia. Tales técnicas incluyen los métodos de terapia ex vivo e in situ, lo 35 anterior comprende transductar o transfectar un gen intacto o alterado (o sus dominios funcionales) en forma de recombinante o de p�ptido o como oligonucle�tidos antisentido o en un vector al paciente, esto último comprende la inserción del gen alterado o el oligonucle�tido en un vehículo, el cual se introduce después en el paciente. Dependiendo de la enfermedad a tratarse, se puede conseguir una cura permanente o una cura transitoria. De manera alternativa, se pueden utilizar anticuerpos monoclonales o humanizados o p�ptidos unidos a una proteína

40 diana para suprimir la función de la proteína y por tanto el crecimiento de las células tumorales puede ralentizarse o incluso pararse. Los anticuerpos contra una proteína diana podría también utilizarse para llevar otros agentes, tales como sustancias citot�xicas, a las células cancerosas con sobreexpresi�n del gen. Tales agentes podían utilizarse entonces para eliminar específicamente las células cancerosas.

45 Un tratamiento puede dirigirse a un gen o a un producto g�nico de NAV3 y/o a cualquier gen(es) o producto(s) g�nico(s) que se enumeran en la presente solicitud. Sin embargo, cualquier otro gen(es) o producto(s) g�nico(s) a lo largo de la ruta GnRHR y Jak/Stat también se pueden utilizar como dianas para la terapia.

Una molécula terapéutica tal como un antagonista, anticuerpo o molécula inhibidora se puede administrar sola o en

50 combinación con otros agentes o composiciones. Además de cualquier molécula terapéutica, una composición farmacéutica que se administra a un paciente también puede comprender cualquiera de otros agentes terapéuticos eficaces, vehículos farmac�uticamente aceptables, tampones, excipientes, adyuvantes, antisépticos, disgregantes, estabilizantes o agentes espesantes, y/o cualquier componente que se encuentra normalmente en los productos correspondientes.

55 La composición farmacéutica puede estar en cualquier forma, tal como forma sólida, semis�lida o líquida, adecuada para su administración. La administración de un medicamento puede por ejemplo llevarse a cabo por medio de una administración oral o inhalada o a través de una inyección intratumoral, intramuscular, intra-arterial o intravenosa.

60 El sujeto a diagnosticar, pronosticar o apto para el uso de la invención es un ser humano o un animal. En una realización específica de la invención, el sujeto es un ser humano. En una realización específica de la invención, el sujeto tiene un adenoma colorrectal o un cáncer colorrectal. En otra realización específica de la invención, el sujeto tiene un tumor colorrectal, un tumor cerebral o un tumor de queratinocitos epiteliales.

NAV3

El NAV3 (navegador neuronal 3, también llamado POMFIL1) es un gen empalmado (40 exones) localizado en c12q21.1 y que se expresa en el tejido cerebral, células T activadas, placenta, colon y en ciertas líneas celulares de

5 cáncer. La secuencia de amino�cidos de NAV3 se conserva bien entre diferentes especies, indicando que el NAV3 tiene un papel fundamental en los procesos celulares. La homología de la secuencia aminoac�dica sugiere que el NAV3 participa en la se�alizaci�n celular y en la supresión tumoral. El NAV3 es el homólogo humano de la proteína unc-53 de C. elegans, un mediador crítico de la migración celular. También los homólogos del NAV3, el NAV1 y NAV2 se unen a los filamentos intracelulares y regulan la expansión celular y la migración.

Las pruebas acumuladas sugieren que la destrucción del gen NAV3 contribuye a la progresión del cáncer. La expresión de la transcripción del NAV3 est� regulada negativamente en un 40 % de los neuroblastomas primarios (Coy JF y col. 2002, Gene 290(1-2):73-94). El NAV3 también se elimina o transloca en varios subtipos de linfoma de células T cut�neos (CTCL) (Karenko L. y col. 2005, Cancer Res 65(18):8101-10; Hahtola S. y col. 2008, J Invest

15 Dermatol 128(9):2304-9, Vermeer M.H. y col. 2008, Cancer Res 68(8):2689-98). Hemos identificado también cambios en el número de copias del gen NAV3 (deleciones/ amplificaciones) en c�nceres de origen epitelial (Hahtola S y col. 2008, J Invest Dermatol 128(9):2304-9; Hahtola S y col. 2008, Genes Chromosomes Cancer 47(2):107-17; WO 2008059112 (A1)), y deleciones al�licas de NAV3 en cáncer colorrectal (Sipila L y col. 2008, EJC supplements 6(12) 118).

En una realización específica de la invención, el cambio en el número de copias de NAV3 est� causado por una deleci�n, amplificación o translocaci�n del gen NAV3 o su mayor parte. Los cambios en el número de copias del gen NAV3 se pueden determinar en células haploides, diploides y/o poliploides.

25 “Deleci�n” se refiere a la ausencia de cualquier fragmento(s) de un gen, lo que afecta adversamente la función del gen. “Deleci�n” también se refiere a la ausencia de un gen entero o ausencia del fragmento cromos�mico que contiene el gen. En una realización específica de la invención, la deleci�n de NAV3 es una deleci�n total o parcial de NAV3.

“Amplificación” se refiere a una inserción de cualquier fragmento(s) de un gen en presencia de al menos una copia de ese gen. “Amplificación” también se puede referir a la amplificación de un gen completo o de un fragmento cromos�mico que contiene el gen. En una realización específica de la invención, le amplificación de NAV3 es una amplificación total o parcial del NAV3. La amplificación de un gen puede ser detectada por ejemplo por un cambio en el número de copias del gen.

35 “Translocaci�n” se refiere a una transferencia de regiones cromos�micas entre dos cromosomas no homólogos. El NAV3 puede translocarse parcialmente, totalmente o como una parte del fragmento cromos�mico más grande que comprende el NAV3.

De acuerdo con el método de la presente invención, la presencia o ausencia de un cambio en el número de copias de un gen se puede detectar en una muestra biológica por cualquier método de detección conocido adecuado para detectar deleciones o amplificaciones. Tales métodos son fácilmente reconocidos por los expertos en la técnica e incluyen hibridaciones fluorescentes in situ, tales como hibridaciones fluorescentes multi color in situ, hibridación multifluorescente in situ (MFISH), cariotipado espectral (SKY), relación binaria combinada de marcaje (COBRA),

45 cariotipado con cambio de color (CCK). En la hibridación gen�mica comparativa (CGH) los cambios genéticos se clasifican como pérdidas o ganancias de ADN. La CGH revela un patrón característico que incluye aberraciones a niveles cromos�mico y subcromos�mico. Las técnicas convencionales de banda-G también se pueden utilizar en los casos en los que se prev� que una detección grosera de pérdidas o ganancias es suficiente. Los métodos preferidos son aquellos que son adecuados para su uso en laboratorios cl�nicos

Se puede utilizar cualquier método de detección adecuado para detectar la expresión g�nica de cualquier gen o número de copias de NAV3, es decir, métodos que se basan en la detección del número de copias del gen (o ADN) y/o aquellos basados en la detección de los productos de la expresión g�nica (ARNm o proteínas) en los métodos de la presente invención. Tales métodos son fácilmente reconocidos por los expertos en la técnica e incluyen métodos

55 convencionales de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR RT, hibridaciones in situ, tales como FISH, hibridación de ARNm in situ, análisis de Northern, análisis de Western y Southern, inmunohistoqu�mica, y otros inmunoensayos, tales como ELISA. Los métodos preferidos son aquellos adecuados para su uso en los laboratorios cl�nicos rutinarios.

Los análisis de LOH también se pueden utilizar para detectar cambios en el número de copias de un gen. Como se utiliza en el presente documento “pérdida de heterocigosidad (LOH)” se refiere a la pérdida de la contribución de uno de los parentales a parte del genoma de la célula. La LOH se puede considerar como un evento para desenmascarar un alelo mutante de un gen que puede tener un papel en la supresión de la formación de un tumor. Por tanto, la LOH es un importante marcador para la iniciación de un tumor o su progresión. La LOH en c�nceres se

65 puede identificar por la presencia de heterocigosidad en un locus genético de la línea germinal de ADN y la ausencia de heterocigosidad en el mismo locus de las células tumorales.

En una realización específica de la invención, el cambio en el número de copias se confirma por FISH, LOH, CGH, análisis secuencial, inmunohistoqu�mica, PCR, PCRq o micromatriz tisular.

Los marcadores adecuados para detectar la expresión de un gen o los cambios en el número de copias incluyen 5 cualquier marcador biológico tal como los marcadores microsat�lites, marcadores SNP, cualquier sonda, cebador o anticuerpo asociado con un gen diana.

Efectos de las aberraciones de NAV3

Los resultados del presente estudio también confirman que las aberraciones en el NAV3 son comunes en varios tumores y c�nceres. Nosotros utilizamos tres métodos diferentes para buscar los cambios en el número de copias de NAV3; LOH, matriz CGH, y FISH. Cuando el método es FISH, observamos células con cambios en el número de copias en el cromosoma 12 y el gen NAV3 en un número sustancial de casos con carcinomas colorrectales (CRC). De manera importante, se detect� también la deleci�n de NAV3 en el 23 % de las muestras de adenoma. Sin

15 embargo, los hallazgos mostraron en todos los casos una población heterogénea de células tumorales que consisten principalmente en células con características diploides normales y células anormales con un número variable de marcas en el cromosoma 12 y/o NAV3. En este caso, una deleci�n al�lica o una amplificación del gen es diferente que en, por ejemplo, la situación de tumores homogéneos con mutaciones en los genes supresores de tumores. Es importante señalar que este tipo de aberraciones en el número de copias se puede observar solamente con el método FISH, que analiza células individuales, pero en la mayoría de los casos no con matriz CGH o con LOH, dos métodos que necesitan que más del 40 % de las células en la muestra muestren el mismo tipo de aberración. Nuestros hallazgos a partir de una serie de muestras de tejido sin selección clónica est�n sin contabilizar por el hecho de que se observaron polisom�as del cromosoma 12 y cambios en el número de copias de NAV3 similares también en tres líneas celulares establecidas de CRC del tipo MSS y en una línea celular del tipo MSI.

25 En los casos de carcinoma patente, los casos con aberración en NAV3 mostraron claramente más metástasis en ganglios linfáticos.

En el presente estudio, en los pólipos adenomatosos, los casos de pérdida de NAV3 se veían más a menudo que por los criterios clásicos (tamaño, diferenciación) indicando un alto riesgo para la transformación maligna posterior.

Para entender los efectos de la regulaci�n negativa del NAV3 en los perfiles de expresión g�nica y para caracterizar los efectos de la deleci�n de NAV3 in vitro, silenciamos la expresión de NAV3 por interferencia del ARN en células epiteliales normales de colon, una línea celular de glioblastoma establecida, una línea celular de glioblastoma

35 derivada de nuevo, y queratinocitos primarios humanos carentes de infección por virus de papiloma humano. Se analizaron los perfiles de expresión g�nica en varios puntos temporales después de la transfecci�n utilizando la micromatriz Agilent de doble color 4 x 44K. Con esta estrategia, el silenciamiento del gen NAV3 da lugar a una regulaci�n positiva consistente de 39 genes en las células del colon, mientras que 28 genes se regularon positivamente en las células gliales. Entre estos estaban los receptores IL23 y GnRH, y los análisis PathwayExpress sugerían que las rutas GnRH y Jak-Stat eran dianas de NAV3. Cuando los resultados de todas las líneas celulares se combinaron, 49 genes, incluyendo GnRHR e IL23R estaban regulados positivamente en 7 de 10 muestras, al menos una vez en cada tipo celular. En total, 17 genes incluyendo el receptor de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRHR) y el receptor de interleucina 23 (IL23R) estaban regulados positivamente en todos de los ocho experimentos con células de colon y gliales.

45 El silenciamiento del ARNsi del NAV3 imita la deleci�n al�lica encontrada in vivo y por tanto, la regulaci�n positiva de las dos moléculas de receptores, GnRHR y IL23R, de los que se sabe que ambos est�n implicados en los procesos oncog�nicos as� como en las reacciones inflamatorias / inmunes, tiene una importancia potencial tanto para el inicio del proceso maligno como para la determinación del comportamiento biológico de las células malignas.

De manera importante, en los tumores MSS, la inmunorreactividad de la regulaci�n positiva de IL23R se correlaciona con la estadificaci�n de Dukes (p < 0,001) y la metástasis en ganglios linfáticos (p < 0,001), mientras que la beta-catenina nuclear se correlaciona solo con la metástasis en ganglios linfáticos (p = 0,045). El ensayo de rango logarítmico identificó la inmunorreactividad de la regulaci�n positiva de IL23R como un marcador favorable (p

55 = 0,009).

Adem�s, hay una depleci�n de NAV3 que est� ligada a la inflamación tisular del crecimiento tumoral por regulaci�n positiva de los mediadores inflamatorios IL23R, vanina 3, y CYSLTR2. Nuestros hallazgos sugieren por tanto que los cambios en el número de copias de NAV3 est�n directamente implicados en la carcinog�nesis precoz mientras se encuentra en un microambiente de inflamación, el IL23R regulado positivamente da una ventaja al crecimiento de la célula maligna.

GnRHR

65 El GnRHR es un receptor de una hormona gonadotropina autocrina que estimula la secreción de la hormona luteinizante (LH), hormona fol�culo estimulante (FSH), y hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) por las células gonadotropas hipofisarias (Yeung CM y col. 2005, Mol Hum Reprod 11(11):837-42). Además de las células gonadotropas hipofisarias, se sabe que el GnRHR se expresa en la superficie de los linfocitos, células mamarias, ováricas y prost�ticas. Una multitud de informes recientes demuestran que el eje GnRH-GnRHR est� activo también en células extra-hipofisarias, y se ha observado la regulaci�n positiva de GnRHR en muchos c�nceres,

5 especialmente en carcinomas (Harrison GS y col. 2004, Endocr Relat Cancer 11(4):725-48). Se cree que la activación de GnRHR lleva primero a la activación de los genes inmediatos tempranos (IE) que afectan las rutas de la beta-catenina y del factor de células T (TCF) (Salisbury TB y col. 2008, Mol Endocrinol 22(6):1295-303). La betacatenina, un miembro de la ruta canónica de se�alizaci�n Wnt, también juega un papel esencial en la transducci�n de la señal GnRH (Salisbury TB y col. 2008, Mol Endocrinol 22(6):1295-303) por medio de la inactivaci�n de la glucog�n sintasa quinasa-3, que regula la degradación de la beta-catenina (Gardner S y col. 2009, Neuroendocrinology 89(3):241-51). Por otra parte, varios informes demuestran que el aumento de los niveles de expresión de beta-cateninas afecta a la metástasis en los ganglios linfáticos de tumores (Buhmeida A y col. 2008, APMIS 116(1):1-9).

15 En nuestro material de los pacientes, la expresión de beta-catenina nuclear se encontr� sorprendentemente asociada a las aberraciones de NAV3 y correlacionada con la metástasis a los ganglios linfáticos. También nuestra identificación de la GnRH como una molécula diana regulada por NAV3 representa una ruta candidata para la prevención y terapia del carcinoma.

IL23R

La identificación de IL-23R est� ligada a la se�alizaci�n JAK-STAT y apoya nuestra hipótesis de que el microambiente tisular proinflamatorio afecta el crecimiento potencial y la diseminaci�n de las células tumorales. El ligando IL-23 del IL-23R se segrega en las células inflamatorias activadas, tales como macr�fagos y células

25 dendr�ticas. El heterod�mero IL23R est� compuesto por un receptor IL-12 beta 1 (IL-12Rbeta1) y una cadena IL-23R (designada IL-12Rbeta2) (Beyer BM y col. 2008, J Mol Biol 382(4):942-55); la última de los cuales est� regulada positivamente en las células con NAV3 silenciado. Ambos JAK2 y STAT3 se asocian con IL-23R. El JAK2 fosforila el receptor en respuesta a IL-23 y los d�meros STAT3 activados se translocan al núcleo y se unen al IL-23R de una manera dependiente de ligando. La ruta JAK/STAT también est� activada por mutaciones en los genes corriente arriba y se ha demostrado que se activan constitutivamente en varios procesos malignos humanos (Constantinescu SN y col. 2008, Trends Biochem Sci 33(3):122-31; Li WX. 2008, Trends Cell Biol 18(11):545-51).

Las pruebas acumuladas recientemente sugieren que la IL-23 pueden redirigir las respuestas de las células T citot�xicas hacia las rutas de efector proinflamatorio, que alimentan el tumor en vez de luchar contra él (Langowski

35 JL y col. 2006, Nature 442(7101): 461-5). En consecuencia, las células tumorales que expresan IL-23 es probable que ganen una ventaja para crecer y persistan incluso en presencia de células T específicas del tumor. El IL-23R también se ha ligado a enfermedad inflamatoria del intestino grueso (IBD). En los niños con enfermedad de Crohn precoz, se ha demostrado que los niveles en la mucosa de IL12p40 y ARNm IL23R son significativamente más altos que en la enfermedad tardía (Kugathasan S y col. 2007, Gut 56(12): 1696-705). Es interesante el que se haya ligado la IBD con un aumento del riesgo de CRC y otros c�nceres (Lakatos PL y col. 2008, World J Gastroenterol 14(25): 3937-47; Hemminki K y col. 2008, Int J Cancer 123(6): 1417-21).

La comunicación entre las células inflamatorias del tejido y las células epiteliales durante el inicio del cáncer se demostr� por medio de la pérdida de células T dependientes de la se�alizaci�n de Smad4, dando lugar a c�nceres

45 epiteliales espontáneos en el tracto gastrointestinal de ratones (Kim BG y col. 2006. Nature 441(7098):1015-9). Las células T Smad4 -/-producen IL-6, que activa la ruta de se�alizaci�n JAK/STAT como el complejo IL23/IL23R. La se�alizaci�n L-6/STAT3 también ha demostrado recientemente que tiene un papel pivotante en la formación de tumores en modelos de ratón de cáncer asociado a colitis (Grivennikov S y col. 2009, Cancer Cell 15(2):103-13).

Otros genes diana

Adem�s de GnRHR e IL23R, hay cinco genes ligados a la carcinog�nesis (ARL11, SMR3B, FAM107A, MFSD2 y BCLB6) y dos genes ligados a la inflamación (CYSLTR2 and VNN3) que han mostrado que est�n regulados positivamente por el silenciamiento de NAV3 en el presente estudio. Se ha demostrado recientemente que los

55 polimorfismos en la región MYCL1 LD, incluyendo MFSD2, afectan las tasas de supervivencia en el cáncer de pulmón aunque los genes MFSD2 muestran diferencias étnicas en las frecuencias al�licas (Spinola M y col. 2007, Lung Cancer 55(3):271-7). Se ha demostrado recientemente que la vanina-1 epitelial controla la carcinog�nesis en el modelo de ratón de cáncer de colon asociado a colitis (Poyet y col, 2009), y los niveles de expresión tanto la varina-1 y la varina-3 est�n potenciados por las citoquinas proinflamatorias en las células cut�neas con psoriasis (Jansen PA y col. 2009, J Invest Dermatol Mar 26). En este contexto, es interesante señalar que tanto los grupos de pacientes con psoriasis como cel�acos tienen un aumento en el riesgo de cáncer (Grulich AE y Vajdic CM. 2005, Pathology 37(6): 409-19). La regulaci�n positiva del grupo de proteínas asociadas a la membrana y sus dianas corriente abajo es de especial interés.

65 En la presente invención, al menos un gen o un producto g�nico seleccionados de IL23R, GnRHR y beta-catenina se selecciona para sus métodos, medios o usos. En una realización específica de la invención, el gen(es) seleccionado de IL23R, GnRHR, beta-catenina codifican una proteína, que es una proteína de membrana, una proteína que regula procesos celulares, o una proteína que se une a nucleótidos pur�nicos. También se describen métodos y usos en los que el gen o producto g�nico se selecciona de entre el grupo que consiste en ARL11, SMR3B, FAM107A, MFSD2, BCLB6, CYSLTR2, VNN3, GNGT1, DNER, GnRHR, IL23R, beta-catenina, JAK1 y

5 JAK3. En otra realización específica de la invención el gen o producto g�nico es IL23R y/o GnRHR.

En una realización específica de la invención, la combinación del gen o el producto g�nico es al menos IL23R, GnRHR y beta-catenina. En una realización específica de la invención la combinación del gen o el producto g�nico es IL23R, GnRHR y beta-catenina.

10 En una realización específica de la invención, la combinación del gen o el producto g�nico es de todos los 49 genes

o productos g�nicos que se enumeran en la tabla 9. En otra realización específica de la invención, la combinación del gen o el producto g�nico es de los 17 genes o productos g�nicos que se enumeran en la tabla 8. En una realización específica de la invención, la combinación del gen o el producto g�nico es de todos los 14 genes o

15 productos g�nicos que se enumeran en la tabla 10. En una realización específica de la invención la combinación del gen o producto g�nico es de todos los genes o productos g�nicos que se enumeran en la tabla 11. En una realización específica de la invención, la combinación del gen o producto g�nico es de todos los genes o productos g�nicos que se enumeran en la tabla 12.

20 Los siguientes ejemplos se dan para ilustrar más la invención. Ser� obvio para un experto en la técnica que, como en los avances tecnológicos, el concepto inventivo se puede llevar a cabo de varias maneras. La invención y sus realizaciones no est�n limitadas por los ejemplos descritos a continuación sino que pueden variar dentro del ámbito de las reivindicaciones.

25 Ejemplos

Ejemplo 1. Muestras de tejidos, células y líneas celulares

Muestras de tejidos

30 Muestras de tumor colorrectal

Se estudiaron por FISH, LOH e inmunohistoqu�mica las muestras quirúrgicas para biopsia de 59 pacientes (61 muestras de CRC y 10 de adenoma) que se operaron de CRC en el Mikkei Central Hospital. El estudio fue aprobado35 por la Oficina de Revisión étnica del Mikkei Central Hospital y por la National Authority for Medicolegal Affairs. La histología de las muestras de tejido fijadas en formalina y embebidas en parafina fue verificada por un pat�logo experimentado (MH) y los tumores, adenomas o mucosa normal se microdisecaron para obtener tejido normal puro

o al menos con una relación del 50 % de carcinoma o adenoma. Las secciones embebidas en parafina se cortaron con un espesor de 50 !m y los núcleos se aislaron por análisis FISH y el ADN se purificó con el análisis LOH

40 siguiendo los protocolos de referencia (Hyytinen E y col. 1994, Cytometry 16: 93-96; Isola J. y col. 1994, Am. J. Pathol 145: 1301-1308). Todos los adenomas eran MSS mientras que 14 de los 56 carcinomas tenían un alto grado MSI.

Se utilizaron marcadores repetidos de mononucle�tidos BAT25 y BAT26 del panel de Bethesda (Boland y col., 1998,

45 Cancer Res 58: 5248-5257), suplementado con 5 marcadores de repetición de dinucle�tidos (D12S1684, D12S326, D12S1708, D18S474, y D9S167), para determinar el estatus de inestabilidad microsat�lite (MSI). Las muestras con al menos dos marcadores no estables se consideraron que tenían MSI, mientras que aquellos con un marcador no estable o ninguno se consideraron de microsat�lite estable (MSS).

50 Se incluyeron los siguientes parámetros en los análisis estadísticos: grado del tumor, estadio tumoral de Dukes, y clasificación por TNM como define la Sociedad Americana contra el Cáncer (www.cancer.org), la presencia de metástasis en ganglios linfáticos, el tiempo de seguimiento (meses) y el resultado cl�nico (vivo, muerto por otro motivo o muerto por la enfermedad).

55 Muestras de tumor cerebral

Las muestras para el ensayo FISH se prepararon a partir de 119 casos de tumor cerebral. Los casos consistían en 55 astrocitomas, 20 oligodendrogliomas, 13 ependimomas, 18 meduloblastomas, y 13 neuroblastomas. Todos las muestras de tejido se habían procesado por fijación rutinaria en formalina y embebidas en parafina.

60 Las secciones embebidas en parafina se cortaron con un espesor de 50 !m y los núcleos se aislaron para el análisis FISH siguiendo los protocolos de referencia (Hyytinen E y col. 1994, Cytometry 16: 93-96; Isola J. y col. 1994, Am. J. Pathol 145: 1301-1308).

C�lulas, líneas celulares y cultivos celulares

Se cultivaron células normales de colon CRL-1541 y CRL-1539 (ATCC, Manassas, VA, EE. UU), la línea celular de glioblastoma A172 derivada de un glioblastoma grado 4, y queratinocitos epid�rmicos primarios (todos de ATCC,

5 Manassas, VA, EE. UU) como instruye el ATCC para no más de 30 pasajes. También se cultivaron las líneas celulares de cáncer colorrectal CCL-228 (SW480), CCL-230 (SW403), CCL-248 (T84), RKO, LIM1215, y HCA7 (ATCC, Manassas, VA, EE. UU) como instruye el ATCC. Entre las líneas celulares de CRC se sabe que RKO, LIM1215, y HCA7 son deficientes en reparar incompatibles y tienen MSI.

10 Las células recientes de un glioblastoma 4 multiforme extraído perioperativamente se utilizó para derivar la línea celular 0205. El tejido tumoral se disoci� mecánicamente, y las células se cultivaron en DMEM sin suero añadido, suplementado con la mezcla de nutrientes F12 (Sigma-Aldrich, ST Louis, MO, EE. UU), Fungizona 2,5 !g/!l (Apotecon, NJ, EE. UU), B27 (Gibco/ Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU), factor de crecimiento epid�rmico (EGF) 20 ng/ml (Sigma-Aldrich, ST Louis, MO, EE. UU), factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF) 40 ng/ml (Sigma-Aldrich,

15 ST Louis, MO, EE. UU), penicilina-estreptomicina 100 U/ml, (Biowhittaker, Verviers, Bélgica) y Glutamax (1x) (Gibco/ Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU). Tras cinco pasajes, emergió una población de clones en la preparación del caldo, y se congelaron alícuotas. Para todos los experimentos posteriores, las alícuotas preparadas se descongelaban, y solo se utilizaron las células del cultivo con menos de 20 pasajes. La expresión de los marcadores neuronales (proteína ácida fibrilar glial y tubulina neuronal clase beta) se evalu� por inmunotinci�n. La recolección de las células

20 fue aprobada por el comité �tico de Helsinki y el distrito del hospital Uusimaa, y se consiguió un consentimiento informado de los pacientes.

Ejemplo 2. Análisis FISH y LOH

25 FISH (hibridación in situ de fluorescencia)

Se estudiaron con FISH multicolor las líneas celulares CRL-1541, CRL-1539 y A172 para ver si había cambios en el número de copias de NAV3 como se había descrito anteriormente (Karenko L y col. 2005, Cancer Res 65:8101-10). Los análisis FISH también se llevaron a cabo en el tejido tumoral del que se estableció la línea celular 0205.

30 Además, se llev� a cabo un ensayo FISH específico de NAV3 en los núcleos aislados de las muestras de pacientes (61 CRC y 10 adenomas) y sobre los cromosomas en metafase de las líneas celulares de carcinoma de colon (CCL228, CCL-230, CCL-248, RKO, LIM1215 y HCA7). Se usaron los clones específicos para ADN NAV3 del cromosoma artificial bacteriano (BAC) (RP11-36P3 y RP11-136F16; Research Genetics Inc., Huntsville, AL, EE. UU) y la sonda

35 del centr�mero del cromosoma 12 (pA12H8; American Type Cell Culture) y se marcaron con Alexa 594-5-dUTP y Alexa 488-5’-dUTP (Invitrogen), respectivamente (muestras de pacientes) o con digoxigenina o biotina (metafases de líneas celulares). Los métodos detallados para el marcado con sondas, la preparación de portaobjetos para el ensayo FISH, y el uso de MFISH específica de brazo se muestran a continuación.

40 También, se llev� a cabo el ensayo FISH específico de NAV3 sobre los núcleos aislados de las muestras de 119 casos de tumor cerebral. Los métodos detallados para el marcado con sonda, la preparación de portaobjetos para el ensayo FISH, y el uso del MFISH específico de brazo se muestran a continuación.

Marcado con sonda. Para analizar las muestras de los pacientes se marcaron dos clones cromos�micos artificiales

45 bacterianos específicos de ADN NAV3 (RP11-36P3 y RP11-136F16; Research Genetics Inc., Huntsville, AL, EE. UU) con Alexa 594-5-dUTP y Alexa 488-5-dUTP (Invitrogen), respectivamente, utilizando traducción Nick. Se mezclaron el BAC y las sondas de centr�mero junto con ADN COT-1 (Invitrogen), se precipitaron y se diluyeron en el tampón de hibridación (15 % p/v de sulfato de dextrano, 70 % de formamida en 2 x SSC, pH 7,0).

50 Para analizar las líneas celulares las sondas BAC específicas de NAV3 (véase anteriormente) se prepararon y marcaron con digoxigenina y se prepar� la sonda específica de centr�mero 12 y se marcó con biotina o dUTP conjugado con isotiocianato de fluoresce�na (FITC) por traducción de Nick como se había descrito anteriormente (Karenko y col. 2005) o de manera similar con Dietilaminocumar�n-5-dUTP (DEAC, Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA, EE. UU).

55 Métodos FISH. Las preparaciones de núcleos se pretrataron con tiocianato sádico 1 M a +80 �C durante 5 minutos, se lav� tres veces con 2 x SSC, tratado con glicerol al 50 %, 0,1 x SSC a +90 �C durante 6 minutos, se lav� con 2 x SSC durante 3 minutos y tres veces con agua destilada durante 2 minutos. Las preparaciones se digirieron con proteinasa K (Sigma; 8 !g/ml en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, CaCl2 2 mM) a +37 �C durante 8 minutos. Después de la

60 deshidrataci�n y el secado con aire, se a�adi� la mezcla de sonda, las preparaciones se desnaturalizaron durante 6 minutos a +85 �C y se hibrid� durante 48 h a ∀ 37 �C. Se lavaron las preparaciones tres veces con Urea 1,5 M, 0,1 x SSC a +47 �C durante 10 minutos, con 0,1 x SSC durante 10 minutos a +47 �C, tres veces con PBS, 0,1 % NP a temperatura ambiente, aclarado con agua destilada, secado con aire y montado en un medio Mounting Vectashield con dihidrocloruro de 4’, 6-diamino-2 fenilindol (DAPI; Vector).

65 Las preparaciones FISH de las muestras de los pacientes se evaluaron utilizando el microscopio Olympus BX51 equipado con un objetivo de inmersión de 60 x y un triple filtro de paso de banda para la detección simultánea de Alexa 488, Alexa 594 y DAPI (Chroma Technology Corp., Brattleboro, VT, EE. UU).

5 Las preparaciones convencionales en metafase se prepararon para la FISH como se había descrito anteriormente (Abdel-Rahman W. M. y col. 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98: 2538-43). La hibridación de las sondas y la detección de las sondas NAV3 marcadas con digoxigenina y las sondas específicas del centr�mero 12 marcadas con biotina, se llevaron a cabo con avidina-FITC (Vector laboratories, Burlingame, CA, EE. UU) y con anti-digoxigenina de oveja conjugada con rodamina (Roche, Mannheim, Alemania) como se ha descrito anteriormente (Karenko y col. 2005).

10 Se llev� a cabo el M FISH específico de brazo con el kit XaCyte (Metasystems GmbH. Altlusheim, Alemania) como recomienda el fabricante). Las metafases hibridadas se analizaron con un microscopio de epifluorescencia (Axioplan Imaging 2, Zeiss, GmbH, Jena, Alemania, equipado con cámara-CCD), y con el módulo de programa M FISH (Isis, Metasystems. Altlussheim, Alemania) sea manualmente o utilizando un aparato de captura automática (Metafer, Metasystems. Altlussheim, Alemania).

Evaluaci�n de los resultados FISH

Las preparaciones FISH de pacientes derivadas de muestras de tumores colorrectales y cerebrales fueron analizadas, sin revelar la identidad de las muestras, por dos analizadores independientes. Los resultados se indican 20 como el porcentaje de células anormales en un número total de 200 recuentos de núcleos celulares. Las células con dos señales del cromosoma 12 (células diploides) y solo una señal para NAV3 y células con más de dos señales de cromosoma 12 pero con un número menor de señales NAV3 (por ejemplo, tres señales de centr�mero de cromosoma 12 y una señal NAV3) se interpretaron como células con deleci�n de NAV3. Las muestras que mostraron más frecuentemente señales NAV3 que señales de centr�mero 12 se interpretaron como células con 25 amplificación NAV3. Una muestra se consideraba aberrante NAV3 si el porcentaje de las células de interfase que mostraban una amplificación era mayor del 7 % o si el porcentaje de las células de interfase que mostraban deleci�n era mayor del 4 % (calculado a partir de la distribución normal de los resultados de muestras normales como la media + 3 desviaciones estándar). Para las líneas celulares CCL-228, CCL-230, CCL-248, RKO, LIM1215 y HCA7 se analizaron diez de 47 metafases para ver NAV3 y centr�mero 12, y se analizaron 6 a 11 metafases por MFISH de

30 brazo.

An�lisis LOH NAV3 utilizando marcadores microsat�lite y extensión de cebador de nucleótido único, SnuPE

El ensayo LOH NAV3 se llev� a cabo en muestras de tumor colorrectal como se había descrito anteriormente

35 (Hahtola S y col. 2008, J Invest Dermatology 128: 2304-9). Además, se utilizó el polimorfismo A/G (rs1852464) en el ex�n 19 del gen NAV3 que muestra hasta el 0,493 de heterocigosidad en los Cauc�sicos/Europeos en la reacción SNuPE.

Las muestras de ADN se amplificaron primero por PCR utilizando los cebadores rs1852464F 5’

40 CCTGCTATTTTCATCTTTCAAGC 3’ (SEC ID N� 1) y rs1852464R 5’ GGCTGGGATGCTGTTTGAG 3’ ((SEC ID N� 2) para obtener un fragmento PCR de 130 pb que contenía el polimorfismo A/G. El producto de la PCR se purificó posteriormente por Exonucleasa I (10 U/!l) (ExoSAP-IT, Amersham Biosciences) y se llev� a cabo la Extensión PCR utilizando un cebador de extensión marcado con fluorescencia 5’ GATGCTGTTTGAGCGCAT-CATGCTGGGCCC 3’ (SEC ID N� 3) y una mezcla de nucleótidos conteniendo ddCTP. Los productos de la extensión fueron de 43 pb o 49

45 pb dependiendo de si estaba presente G o A en la matriz y se separaron y el resultado se analizó como se había descrito anteriormente (Hahtola y col. 2008, J Invest Dermatology 128: 2304-9).

Una muestra se valor� como que mostraba LOH, si uno de los alelos en la muestra de tumor tenía un 40 % o más de disminución de señal a rs1852464 o, en el caso de homocigosidad constitucional por su marcador, en sus

50 marcadores microsat�lite adyacentes al compararse con su coincidencia normal (Cleton-Jansen A. M. y col. 2001, Cancer Res 61: 1171-7).

Se encuentran anormalidades NAV3 correspondientes en adenomas y carcinomas colorrectales que aparecen en el mismo paciente cuando se utilizan métodos FISH y LOH

55 La comparación del número de copias de NAV3 entre las muestras de adenoma y carcinoma de un determinado paciente, obtenidas en la misma operación quirúrgica en todos menos en dos casos revelaron que la deleci�n de NAV3 se detectaba frecuentemente por la técnica FISH también en el estadio de adenoma (Figura 1). Sin embargo, la cantidad de células aberrantes NAV3 siempre fue mayor en la lesión histol�gicamente maligna. De forma similar,

60 en 2 de 3 adenomas con LOH, los carcinomas coincidentes mostraban un patrón principalmente similar de LOH. Esto sugiere que adenomas histol�gicamente benignos que tienen células con aberraciones NAV3 pueden ya tener propiedades de crecimiento maligno.

Se encuentran cambios en el número de copias de NAV3 en CRC y en adenomas colorrectales utilizando métodos FISH o LOH

Se detectaron células con cambios en el número de copias NAV3 en el 40 % de las muestras con carcinoma

5 colorrectal tipo MSS; se detectaron células que tenían tanto deleci�n de NAV3 como amplificación en el 15 % de las muestras mientras que el 15 % de las muestras mostraba solamente deleci�n de NAV3 y el 10 % tenía solamente un bajo nivel de amplificación de NAV3 (tres a cinco copias). Las células con deleci�n de NAV3 también se detectaron en el 12,5 % de las muestras del tipo MSI y en el 23 % de las muestras de adenoma. Además, se detectaron células con polisom�a del cromosoma 12 más a menudo en tres o cinco copias, en el 70 % de las muestras con carcinoma

10 colorrectal tipo MSS, en el 50 % de las muestras tipo MSI y en el 31 % de las muestras de adenoma. Los resultados de la FISH se ilustran en la Figura 2.

Los cambios en el número de copias de NAV3 en las células de carcinoma de colon se confirmaron por el ensayo LOH. La LOH se detect� en el 21 % de los carcinomas MSS y en el 18 % de las muestras de adenoma simple. Los

15 resultados de cada marcador se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Resultados de LOH NAV3 para cada marcador D12S1684 D12S26 SNuPE@rs1852464 D12S1708

CRC, MSS 8/37 (22 %) 10/33 (30 %) 4/23 (17 %)* 5/29 (17 %) CRC, MSI 0/3 0/2 0/7* 0/4 Adenoma 1/21 (5 %) 2/19 (11 %) 0/8* 2/16 (13 %)

* Las frecuencias de LOH se calcularon solo para casos informativos. El ensayo SNuPE era no informativo debido a la homocigosidad constitucional en 5 carcinomas y en todos los adenomas que mostraron LOH examinados por microsat�lites del cromosoma 12

Se encontraron cambios en el número de copias de NAV3 o translocaciones, como se demostr� por FISH, enl�neas celulares establecidas de CRC

20 Se analizaron seis líneas celulares establecidas de CRC diferentes (CCL-228, CCL-230, CCL-248, RKO, LIM1215 y HCA7) y dos líneas celulares de colon normal (CRL-1541 y CRL-1539) con una FISH específica de NAV3 (Tabla 2). Las líneas celulares normales de colon CRL-1541 and CRL-1539 no mostraron señales aberrantes para NAV3 en relación con las señales del centr�mero del cromosoma 12 pero en CRL-1539, el 8 % de las células eran

25 tetras�micas para ambas señales. Tres líneas celulares (SW403, RKO, T84) mostraron una porción notable de metafases con pérdida de NAV3 (SW-403 y T84 90 % o más y RKO mas del 40 % de metafases; Tabla 2 y Figura3). La línea CCL-228 casi diploide mostro normalmente un cromosoma 12 normal, dos cromosomas anormales con pérdida de una señal NAV3 y un cromosoma anormal con señal NAV3 pero sin señal de centr�mero del cromosoma 12. Se observ� una translocaci�n de NAV3 a otro cromosoma, interpretado como t (2; 12) por MFISH de

30 brazo, en todas las metafases excepto en una (Tabla 2, Figura 3).

Tabla 2. Sumario de las metafases de la línea celular de CRC que muestran aberraciones

num�ricas de NAV3 o de centr�mero 12. Línea Tipo Nivel de ploid�a más común, y Resultado de FISH Resultados de MFISH de celular frecuencia de tales metafases/todas NAV3 por sondas brazo, MFISH o YAC

las metafases, intervalo de número BAC de citromosoma

CCL-230 CIN casi triploide, 11/15, intervalo 34 a 212 Pérdida de NAV3 en Desequilibrado

=SW403 14/15 metafases Der (12) t (12; 15) (p13?: q?) del(12)(q15 o 21) en 6/6 metafases

CCL-248 CIN casi diploide, 7/10, intervalo 75 a 114 Pérdida de NAV3 en Del(12)(q?q?) en 5/5 =T84 9/10 metafases en MFISH de brazo, metafases deleci�n por YAC FISH en 10/10 metafases

CCL-229 CIN casi diploide, 6/10, intervalo 34-183 Fragmentación o der(2)t(2;12) (Reuter J.A. y col. amplificación de 2009, Cancer Cell 15: 477-88), centr�mero 12 en Der(10)t(3;12;10) (Chung D.C. 10/10 metafases 2000 Gastroenterology 119: 854-65), i(12)(p) (Kim B.G. y col. 2006, Nature 441,1015-1019), inv(12)(p12q12or13) Del(12)(p?)Del(12)(q?) (Fearon E. R. y Vogelstein B, 1990, Cell 61: 759-67)

RKO

MSI casi diploide, 34/47, intervalo 15 a 90 Pérdida de NAV3 en der(12)t(2;12) desequilibrado en

21/47 metafase

6/11 metafases

estudiadas

Las líneas celulares LIM1215 (MIN) y HCA7 (MIN) muestran tantas señales de centr�mero 12 como de NAV3 (27/27 y 27/29 metafases estudiadas, respectivamente), como ocurre con el cromosoma clon 12q+ en HCA7 observado previamente (Abdel-Rahman W.M. y col. 2001. Proc Natl Acad Sci USA 98: 2538-43) que mostraba señal NAV3 en el presente estudio.

Aberraciones en NAV3 de las muestras colorrectales asociadas con polisom�a del cromosoma 12 y con metástasis en los ganglios linfáticos

Las aberraciones de NAV3 de las muestras colorrectales se correlacionan con la polisom�a en el cromosoma 12 y la metástasis en los ganglios linfáticos con significación estadística (Tabla 3). Además, la polisom�a en el cromosoma 12 se produce más a menudo en tumores con alto grado de malignidad (Tabla 3).

Tabla 3. Correlaciones entre las variables de los análisis FISH, tumores de colon y resultado de lospacientes entre las muestras de CRC. El ensayo exacto de Fisher (de dos lados) se utilizó si no se indicaotra cosa. Los análisis de supervivencia se llevaron a cabo utilizando las muertes producidas por elc�ncer de colon como punto de corte primario.

Polisom�a del cromosoma 12

Grado tumoral Grado de Dukes Metástasis en ganglios linfáticos Resultado del paciente (pronóstico)

Cambio en el número de copias de NAV3

p = 0,006 ns 1) ns p = 0,019 ns

Polisom�a en el cromosoma 12

p = 0,019 ns ns ns

Expresi�n de betacatenina nuclear

ns ns ns p < 0,05 ns

Inmunorreactividad de IL23R regulado positivamente 2)

ns ns p < 0,001 p < 0,001 2) p = 0,009 3)

1) ns = no significativo estadísticamente 2) correlación analizada para el grupo de pacientes MSS 2) Prueba de chi cuadrado, exacto, de dos lados 3) Ensayo de rango logarítmico

10 Se encontraron cambios en el número de copias del gen NAV3 en tumores cerebrales

Se analizaron en total 119 casos de tumor cerebral de los cuales 55 eran astrocitomas, 20 oligodendrogliomas, 13 ependimomas, 18 meduloblastomas, y 13 neuroblastomas para ver los cambios en el número de copias del gen NAV3 y polisom�a en el cromosoma 12 utilizando FISH (véase Tabla 4). Los niveles de corte para la deleci�n de

15 NAV3, amplificación de NAV3 y polisom�a del cromosoma 12 fueron del 4 %, 7 %, y 10 %, respectivamente.

Tanto la deleci�n como la amplificación de NAV3 se detectaron en astrocitomas; el 20 % (11 de 55) de los casos estudiados mostraron deleci�n del NAV3 y el 11 % (6 de 55) amplificación. Se observ� polisom�a del cromosoma 12 en el 45 % (25 de 55) de los casos. Los análisis estadísticos utilizando el ensayo de Kaplan-Meier mostraron una

20 tendencia de la amplificación de NAV3 prediciendo un resultado mejor de la enfermedad que con la deleci�n o con un número normal de copias de NAV3.

Los casos de oligodendroglioma estudiados mostraron una deleci�n del 15 % (3 de 20) y una amplificación en el 30 % (6 de 20). La polisom�a del cromosoma 12 se detect� en el 43 % (10 de 23) de los casos. La polisom�a del

25 cromosoma 12 parecía predecir un resultado peor en la enfermedad cuando se analizó por el ensayo de Kaplan-Meier.

Los ependimomas mostraron una deleci�n de NAV3 en el 31 % (4 de 13) de los casos estudiados, una amplificación de NAV3 en el 54 % (7 de 13) y polisom�a del cromosoma 12 en el 69 % (9 de 13). El análisis estadístico indicó que

30 la amplificación de NAV3E y la polisom�a del cromosoma 12 predicen una peor supervivencia.

La deleci�n de NAV3 se observ� en el 11 % (2 de 18) de los caos de meduloblastoma estudiados, la amplificación de NAV3 en el 39 % (7 de 18) y la polisom�a del cromosoma 12 en el 61 % (11 de 18). El análisis estadístico utilizando la prueba de Kaplan-Meier implicaba que la deleci�n NAV3 predice una peor supervivencia y una

35 amplificación de NAV3, por el contrario, predice un mejor resultado que un número normal de copias de NAV3.

No se detect� deleci�n de NAV3 en los casos de neuroblastoma estudiados pero el 69 % (9 de 13) mostraron una amplificación de NAV3 y el 77 % (10 de 13) polisom�a del cromosoma 12. En el ensayo de Kaplan-Meier la amplificación de NAV3 y la polisom�a del cromosoma 12 parecían predecir una supervivencia peor.

Tabla 4. Los tumores cerebrales se clasificaron en cinco clases. Los Casos tumorales, aberraciones NAV3 (deleci�n, amplificación), y polisom�a del cromosoma 12 se muestran como número y porcentajes de los casos estudiados

Tumor

Deleci�n de NAV3 Amplificación NAV3 Polisom�a del cromosoma 12

Astrocitoma 55/46 % Oligodendroglioma 20/17 % Ependimoma 13/11 % Neuroblastoma 13/11 % Meduloblastoma 18/15 %

11/20 % 3/15 % 4/31 % 0/0 % 2/11 % 6/11 % 6/30 % 7/54 % 9/69 % 7/39 % 25/45 % 10/50 % 9/69 % 10/77 % 11/61 %

En total 119/100 %

19/17 % 35/29 % 65/55 %

Los tumores gliales de grado 1, 2, y 3 se agruparon en una clase y se compararon con los tumores gliales grado 4

5 con respecto a las aberraciones NAV3 (Tabla 5). Los análisis mostraron que los grados 1, 2, y 3 más bajos mejor diferenciados contenían más amplificación NAV3 que los tumores gliales de grado 4. La amplificación de NAV3 se observ� en el 27 % (13 de 48) de los tumores gliales de grados 1, 2, y 3 en comparación con el 5 % (2 de 38) de los gliomas grado 4. Por el contrario los tumores gliales de grado 4 contenían más deleci�n NAV3 que los grados 1, 2, y

3. La deleci�n de NAV3 se observ� en el 18 % (7 de 38) de tumores de grado 4 en contraste con el 15 % (7 de 48) 10 de los tumores de grado 1, 2, y 3.

Tabla 5. Los tumores gliales de grados 1, 2, y 3 se agruparon en una clase y los tumores gliales de grado 4formaban la otra clase. Los casos de tumores, amplificación de NAV3, y deleci�n de NAV3 se muestran como número y porcentajes de los casos estudiados en estas dos clases.

Deleci�n NAV3 Amplificación NAV3

Ejemplo 3. CGH

15 Matriz CGH

El ADN se extrajo de las secciones de tejidos de 50 micrómetros embebidos en parafina. El ADN de referencia se extrajo de sangre aportada en la Cruz Roja Finlandesa por 4 hombres y mujeres sanos. El ADN se digirió, se marcó y se hibrid� con una matriz de oligonucle�tidos 244 K según el protocolo del fabricante (Agilent Technologies, Santa

20 Clara, EE. UU). Las muestras se escanearon con un escáner de micromatriz de ADN y se analizó utilizando el software Feature Extraction y CGH Analytics (Agilent Technologies, Santa Clara, EE. UU). Los análisis se llevaron a cabo utilizando puntuación z y una ventana media de movimiento de 1 Mb. Los valores log2 por debajo de +/-0,4 no se consideraron aberrantes. Se analizaron utilizando este método tres líneas celulares de carcinoma de colon y dos muestras de tumor de carcinoma de colon.

An�lisis de matriz CGH de casos seleccionados de material del paciente y líneas celulares de CRC

Los estudios de matriz CGH se llevaron a cabo en dos muestras de material de pacientes y en tres líneas celulares CRC establecidas CLL-230, CLL-248 y CLL-228. Los datos de la matriz CGH demuestran una deleci�n en 12q21 30 que abarca el locus NAV3 en una de las muestras del paciente, confirmando as� los resultados de la FISH (esta muestra del paciente tenía un 41 % de células con NAV3 eliminado según el método FISH) (Figura 4). Sin embargo, la otra muestra de paciente mostraba resultados normales en este análisis, debido probablemente a un número de células aberrantes NAV3 proporcionalmente insuficiente en la muestra (el 28 % de las células mostraba señales de NAV3 amplificado en el análisis FISH). El análisis de matriz de las líneas celulares de carcinoma de colon que

35 mostraban pérdida de NAV3 en FISH revel� alteraciones muy importantes en el cromosoma 12 as� como en otros cromosomas, lo que se esperaba en las células de cáncer cultivadas. En la línea CLL-230, se detect� una amplia deleci�n que abarcaba el locus NAV3 en 12q. Esta deleci�n no se detect� en las otras (dos) líneas celulares (CLL248 and CLL-228) que a su vez demostraron amplificaciones en otras partes del cromosoma.

40 Ejemplo 4. ARNi y Micromatrices de expresión g�nica

M�todos

Silenciamiento g�nico del gen NAV3 in vitro

45 El gen NAV3 se silenci� con oligos ARNsi agrupados (On-Target SMART pool, Dharmacon, Chicago, IL, EE. UU). Las secuencias específicas de los oligos fueron las siguientes: 5’-GGACUUAACGUAUAUACUA-3’ (SEC ID N� 4) (Ex�n 12), 5’-GAGAGGGUCUUCAGAUGUA-3’ (SEC ID N� 5) (Ex�n 38-39), 5’-CAGGGAGCCUCUAAUUUAA

3’ (SEC ID N� 6) (Ex�n 7), y 5’-GCUGUUAGCUCAGAUAUUU-3’ (SEC ID N� 7) (Ex�n 30-31).

Se cultivaron células de glioblastoma A172, queratinocitos epid�rmicos primarios, y las líneas celulares de colon normales CRL-1541 y CRL-1539 en placas de 6 pocillos hasta una confluencia del 70 %, y a partir de ahí se 5 transfectaron con 200 pmol de ARNsi NAV3 agrupado o ARNsi codificado de control (Dharmacon, IL, USA), utilizando reactivo de transfecci�n Dharmafect1 (Dharmacon). Se indujo el crecimiento de células 0205 de glioblastoma como una monocapa adherente alterando las condiciones del cultivo mencionado anteriormente de la siguiente manera: se eliminaron bFGF y EGF y el medio se suplement� con un 10 % de FCS durante 4 días antes de la transfecci�n. Para la transfecci�n de una placa de 6 pocillos, se diluyó el ARNsi 1 !M en 100 !l de 1 x tampón ARNsi (recibido del fabricante) y se mezcl� con una cantidad igual de medio de cultivo normal. Se incubaron cuatro microlitros de agente de transfecci�n durante 5 minutos a temperatura ambiente con 196 !l de medio de cultivo. Se a�adi� la dilución de ARNsi y se incub� durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de la adición a las células en 1600 !l de medio de cultivo. Seis horas después de la transfecci�n, se remplaz� el medio de transfecci�n por medio normal de crecimiento. Se hizo un seguimiento de la viabilidad de las células 48 horas después de la

15 transfecci�n con una tinción de azul trip�n. Todos los tipos celulares mostraron más del 70 % de viabilidad, y además, solo se utilizaron las células adherentes para la preparación del ARN.

Micromatrices de expresión g�nica

Para identificar los genes regulados por NAV3, se midieron los cambios en los perfiles de expresión g�nica inducidos por el ARNi dirigido al NAV3 con micromatrices de color dual Agilent 4 x 44K y sondas de oligonucle�tidos (Biochip center, Biomedicum Helsinki, http://www.helsinki.fi/biochipcenter/). Para estos análisis, se obtuvieron muestras de ARN total de las células transfectadas con el ARNsi a las 6, 24, y 48 horas después de la transfecci�n (CRL 1541: 6 y 48 h, CRL 1539: 6 y 24 h, A172: 6 y 48 h, 0205: 6 y 48 h, queratinocitos epid�rmicos primarios

25 (PEK): 24 and 48h).

Las células se destruyeron en 350 !l de tampón RLT (Qiagen), el ARN se purificó con el kit RNeasy Micro o Mini (dependiendo de la cantidad de células) (Qiagen, Hilden, Alemania) y se almacen� a -70 �C. El ARN total obtenido de las células con NAV3 silenciado se hibrid� con las muestras de cada tiempo postransfecci�n de las mismas células transfectadas con los oligonucle�tidos codificados. Antes de la hibridación, la calidad de las muestras de ARN se evalu� con el Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies).

An�lisis de la micromatriz

35 Se analizaron los datos de la micromatriz de dos líneas celulares de colon normales CRL-1541 y CRL-1539, y los datos de las células de glioblastoma y queratinocitos epiteliales primarios transfectados con los oligos que silencian el NAV3 o con los oligos control. Las intensidades de sonda se corrigieron a fondo y se normalizaron con LOWESS utilizando el Agilent Feature Extractor 9.1.3.1. Para cada muestra, las veces que cambiaba en cada muestra se computaron, y se consideraron como expresadas diferencialmente 200 sondas con la expresión más alta y 200 sondas con la expresión más baja. Los genes que se expresaban de forma diferencial consistente en todas las líneas celulares normales de colon y en las muestras tumorales se emplearon para el análisis computacional de ruta utilizando PathwayExpress (Draghici S. y col. 2007, Genome Res 17(10): 1537-45). En este método, los valores de expresión de los genes expresados diferencialmente se utilizan para computar un factor de impacto y un valor de p asociado para se�alizaci�n de rutas en la base de datos KEGG [REFE: PMID: 18477636], teniendo en cuenta la

45 topología de las rutas.

Con este método, un gen que codifica una proteína situado corriente arriba de una ruta tiene más impacto numérico que las proteínas corriente abajo.

Adem�s, se utilizó un nuevo método basado en el agrupamiento de Ontolog�a G�nica (GO) para revelar los agrupamientos genéticos que comparten una función biológica o localización común en las células (Ovaska K y col. 2008, BioData Min 1(1):11). Las distancias entre los genes se computaron utilizando la medida de similitud semántica de Lin (Lin. Proceedings of the 15th International Conference on Machine Learning 1998: 296-304) basándose en las anotaciones GO. Los genes que tienen anotaciones GO similares tienen distancias menores entre

55 ellos y est�n agrupados próximamente. Los agrupamientos, junto con los valores de expresión, se visualizan utilizando mapas críticos y dendrogramas.

PCR-RTq

El silenciamiento de NAV3 eficaz y la regulaci�n positiva de IL23R y GnRHR se confirmaron con el Light Cycler PCR-RTq y la hibridación de ARN in situ.

Para la PCR-RT cuantitativa, el ARN total se trascribi� inversamente con el kit Revert Aid™ First Strand cADN Synthesis (Fermentas, St.Leon-Rot, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Para preparar las curvas de 65 referencia, se hicieron diluciones seriadas del ADNc de las células A172. Las reacciones se llevaron a cabo con un aparato LightCyder480™ utilizando el kit LC 480 SYBR Green 1 master (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania).

Brevemente, el ADN se desnaturaliz� a 95 �C durante 5 minutos, luego con 45 ciclos de 95 �C, 58 �C y 72 �C, que se hicieron durante 10, 15 y 10 segundos respectivamente, y a continuación por el análisis de curva de fusión de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras el ajuste de fondo se utilizó el punto de ajuste para determinar el valor del punto de cruzamiento como se había descrito anteriormente (Linja MJ y col. 2004, Clin Cancer Res 10(3):1032-40). Para la normalización de los niveles de expresión, se medi� la expresión de la unión de la proteína TATA (TBP) como se había descrito (Linja MJ y col. 2004, Clin Cancer Res 10(3):1032-40). El nivel de expresión relativo se obtuvo dividiendo los valores para NAV3 por el valor TBP. Además del análisis de curva de fusión, los productos de la PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % para asegurar el tamaño correcto del producto. También se confirm� la regulaci�n positiva de IL23R y GnRHR por PCR RTq, aumentando la temperatura de anidamiento a 60 �C. Todos los cebadores utilizados en las reacciones se enumeran en la Tabla 6.

Tabla 6. Cebadores utilizados en la PCR-RTq

Gen

Cebador directo Cebador Inverso

NAV3

ATCCATGGAGCTCAGCAA (SEC ID N� 8) TTGGCTOCTTCTTGGAGTTT (SEC ID N� 9)

GnRHR

AAGAGCACGGCTGAAGACTC (SEC ID N� 10) GCATGGGTTTAAAAAGGCAA (SEC ID N� 11)

IL23R

CGCAAAACTCGCTATTCGACA (SEC ID N� 12) ATGGCTTCCCTCAGGCAGA (SEC ID N� 13)

Hibridaci�n in situ de ARN NAV3 de células con NAV3 silenciado

15 Para evaluar la eficacia de la anulación del gen NAV3, hemos realizado una hibridación in situ de ARN dirigido a NAV3 de las células transfectadas con ARNsi de las líneas celulares A172 y 0205. La expresión de NAV3 se compar� con células no transfectadas y células transfectadas con oligos codificados. En resumen, las transcripciones de ARNm NAV3 se detectaron con una sonda que reconocía los exones 37-39, por hibridación durante una noche a 45 �C.

Hibridaci�n de ARNm in situ para ARNm NAV3

Preparaci�n de sondas ARN

25 Las sondas ARN se generaron basándose en localizaciones específicas del gen NAV3 que ejercen los siguientes oligonucle�tidos (ex�n 37-39: antisentido 5’-TTGGCTGCTTCTTGGAGTTT-3’ (SEC ID N� 14), sentido 5’-CACCAAATCTAGAGCTGCATCA-3’ (SEC ID N� 15)). Los productos PCR resultantes se clonaron en el vector pCR�II-TOPO� (Invitrogen). Las sondas ARN se marcaron utilizando el kit DIG RNA labelling (SP6/T7, Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Hibridaci�n in situ para células fijadas

Se cultivaron las líneas celulares A172 y 0205 en portaobjetos estériles de cristal (LAB-TEK II chamber Slide w/Cover RS Glass Slide, Nalge Nunc International) y se fijaron con paraformaldeh�do al 4 % (MERCK) – PBS 35 durante 15 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se aclararon con PBS y se refijaron con un 1 % PFA-PBS (7 min, +4-8 �C) seguido por relavado en PBS. Los portaobjetos se acetilaron con trietanolamina 0,1 M (TEA, Riedelde Haan) pH 8,0 – 0,25 % de anh�drido acético (MERCK) y se prehibridaron con 4 x SSC – formamida desionizada al 50 %. La hibridación in situ se llev� a cabo en una cámara humidificada durante una noche a 45 �C utilizando una solución de hibridación que contenía sonda DIG-ARN desnaturalizada antisentido (4 ng/!l) o la sonda en sentido (19 ng/!l). Los portaobjetos se lavaron después de la hibridación con tampones precalentados en un baño de agua a 37 �C (1 x 10 min, 1 x 15 min 2 x SSC, y Tris a pH 8,0; EDTA 1 mM) durante 30 min a 37 �C). Después de lavarse, las sondas hibridadas se detectaron inmunol�gicamente con Fab anti-DIG-fosfatasa alcalina diluida 1:1000 en solución bloqueante. Los portaobjetos se lavaron y se incubaron durante una noche en una cámara humidificada con una solución sustrato de color (1:50 NBT/BCIP Solución Madre (Roche) en tampón de detección que contenía levamisol

45 recién preparado 0,002 mM (Vector Laboratories)). Para terminar la reacción los portaobjetos se lavaron, aclararon brevemente en agua y se hizo el recuento de tinción con Kemchrot al 0,1 % (1 x 5 min, Gurr, BDH Chemicals). Todos los reactivos e instrumentos se trataron con dietil pirocarbonato (DEPC) o estaban libres de RNasa.

Resultados

El silenciamiento del gen NAV3 da como resultado la regulaci�n positiva de la expresión de GnRHR e IL23R

L�neas celulares de colon normal

55 Para identificar in vivo los genes diana del NAV3 relevantes, estudiamos los perfiles de expresión de las células normales de colon CRL-1541 y CRL-1539 con NAV3 silenciado (con número de copias del gen NAV normal). En estos experimentos identificamos, entre los 39 genes que est�n regulados positivamente constantemente en las células de colon normal, la regulaci�n positiva de dos receptores clave implicados en carcinog�nesis. En primer lugar, se identificó la ruta del receptor de hormona liberadora de gonadotropinas (GnRHR) utilizando Pathway Express estando enriquecida estadísticamente significativamente (valor de p corregido por múltiples hipótesis < 0,001), y este resultado se debía a la regulaci�n positiva de GnRHR, variante de transcripción 1, con cambios de 4,7-32,4 veces. En segundo lugar, se identificó la ruta Jak-STAT que se identificó como marginalmente significativa estadísticamente (valor p corregido < 0,058) y estaba afectada por regulaci�n positiva del receptor de la interleucina 23 (IL23R), con cambios de 3,4-14,01 veces. La regulaci�n positiva de estos receptores se confirm� por PCR-RTq

5 en muestras seleccionadas. Véase la Figura 5.

L�neas celulares y muestras tisulares

Se compararon el número de señales NAV3 con el número de señales del centr�mero 12 con FISH multicolor, y de

10 esta manera se definió que tenían señales de NAV3 normales, amplificadas o eliminadas. El estudio de las líneas celulares CRL-1541, CRL-1539, 0205 y A172 mostraron que consisten principalmente en células sin aberraciones en NAV3 (Tabla 7) y que eran por tanto adecuadas para los estudios de silenciamiento. El silenciamiento eficaz de NAV3 se confirm� por PCR-RTq e hibridación ARN in situ (Figuras 6 y 7). También ambas sondas para NAV3 presentes en la micromatriz Agilent 4 x 44K estaban bajo expresadas con un cambio medio de 0,26 veces, indicando

15 que el silenciamiento de NAV3 era eficaz. Todos los métodos mostraron una regulaci�n del NAV3 consistente en todos los tipos celulares en todos los tiempos puntuales.

Tabla 7. FISH de NAV3 y centr�mero del cromosoma 12

L�nea celular o muestra tisular

Tipo celular Número de núcleos analizados % de núcleos con señales normales % de núcleos con polisom�a NAV3 % de núcleos con señal NAV3 amplificada % de núcleos con señal NAV3 eliminada

CRL-1541

Colon 30 100 0 0 0

CRL-1539

Colon 37 91,9 8,1 0 0

0205

Glioblastoma 200 98,5 0 0,5 0,5

A172

Glioblastoma 108 11,1 74 5,6 9,3

0205 tumoral

Glioblastoma 206 97,09 0,49 1,46 0,49

Cuando se evaluaron los perfiles de expresión g�nica de todas las células de colon normales CRL-1541 y CRL-1539

20 con NAV3 silenciado, la línea celular de glioblastoma A172 derivada de glioblastoma de grado 4, y queratinocitos epid�rmicos primarios (todos de ATCC, Manassas, VA, EE. UU), identificamos 17 genes regulados positivamente en todos los experimentos (Tabla 8). De estos, se remarc� la regulaci�n positiva de dos receptores clave implicados en la carcinog�nesis. En primer lugar se identificó que la ruta del receptor de la hormona liberadora de gonadotropinas utilizando PathwayExpress estaba enriquecida significativamente estadísticamente (valor de p corregido de múltiples

25 hipótesis < 0, 001). Este resultado fue debido a la regulaci�n positiva de la variante 1 de la transcripción de GnRHR que tenía un cambio medio de 13,7 veces. En segundo lugar se identificó que la ruta Jak-STAT estaba alterada marginalmente significativamente estadísticamente (valor de p corregido < 0, 058) por regulaci�n positiva del receptor de la interleucina 23 (IL23R), que tenía un cambio medio de 7,2 veces. La regulaci�n positiva de estos receptores se confirm� por PCR-RTq en muestras seleccionadas. Hemos decidido incluir los perfiles de expresión

30 g�nica de queratinocitos epiteliales primarios con NAV3 silenciado (PEK) en el análisis. Entonces identificamos 52 genes, incluyendo GnRHR e IL23R que estaban regulados positivamente en 7 de los 10 experimentos que llevaron a cabo con los tres tipos de células (Tabla 9).

Tabla 8. Lista de 17 genes regulados positivamente en los ocho experimentos de silenciamiento de NAV3 con células gliales y de colon

Abreviatura

Máximos cambios en n� de veces Mínimos cambios en n� de veces Nombre completo

C12orf42

47,8 12,7 Fase de lectura abierta 42 del cromosoma 12 de Homo sapiens (C12orf42), ARNm [NM 198521]

GNRHR

32,4 47 Receptor de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRHR) de Homo sapiens, variante de transcripción 1 ARNm [NM 000406]

ARL11

30,2 6,8 Factor de ribosilaci�n 11 similar ADP (ARL11), ARNm [NM 138450]

AF334588

31,8 12,8 ARNm P25 de Homo sapiens, cds completo [AF334588]

A 24 P799680

29,3 6,1 Desconocido

UNQ6490

41,1 5,5 Clon ADN 147309 YPLR6490 (UNQ6490) ARNm de Homo sapiens, cds completo, [AY358209]

FLJ33641

23,4 59 Proteína FLJ33641 hipotética de Homo sapiens (FLJ33641), ARNm [NM_152687]

CN480368

25,3 3,8 UI-H-EU0-azt-m-22-0-UI,s1 NCI_CGAP_Carl Homo sapiens clon ADNc UI-H-EU0-azt-m -22-0-UI 3’ secuencia de ARNm [CN480368]

NP297856

20,0 40 GB|AF132199,1|AAG35545,1 PRO1460 [NP297856]

ENST00000329949

23,6 49 proteína similar a POM121 de Homo sapiens, ARNm (clon ADNc IMAGE 40053742), [BC112340]

ENST00000360623

17,2 5,5 clon F22H de ARNm de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina miosin-reactiva de Homo sapiens, cds parcial, [AF035042]

THC2407334

17,0 4,2 Desconocido

IL23R

14,0 34 Receptor interleucina 23 (IL23R) de Homo sapiens, ARNm [NM144701]

THC2443880

13,3 42 Desconocido

VNN3

12,4 4,5 5 Vanina 3 (VNN3) de Homo sapiens, variante 1 de transcripción, ARNm [NM018399]

LOC348174

50,2 7,9 Homo sapiens ADNc FLJ38732 fis, clon KIDNE2010750, [AK096051]

ENST00000372121

11,2 3,9 Gen de Homo sapiens hipotético apoyado por BC006119, ARNm (clon de ADNc IMAGEN:3505629), cds parcial [BC006119]

Tabla 9, Lista de 49 genes regulados positivamente en al menos 7/10 experimentos de silenciamiento y una vez con cada tipo celular. En la columna de la derecha, se muestran los cambios en número de vecesde la expresión g�nica en las células comparado con la expresión g�nica de los mismos genes en las células con ARNsi silenciado

Nombre del gen

Descripción Cambio medio de veces

AK021467

Clon ADNc FLJ11405 fis Homo sapiens HEMBA1000769 [AK021467] 24,5

C12orf42

Fase de lectura abierta 42 del cromosoma 12 de Homo sapiens (C12orf42), ARNm [NM 198521] 24,1

AF334588

ARNm P25 de Homo sapiens, cds completo [AF334588] 23,2

A 24 P799680

Desconocido 18,9

CN480368

UI-H-EU0-azi-m-22-0-UI.sl NCI_CGAP_Carl Homo sapiens clon ADNc UI-H-EU0-azi-m-22-0-UI 3’, secuencia ARNm [CN480368] 14,3

GNRHR

Receptor de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRHR) de Homo sapiens, variante de transcripción 1 mRHA [NM 000406] 13,7

LOC348174

ADNc FLJ38732 fis de Homo sapiens, clon KIDNE2010750, [AK096051] 13,7

THC2378839

CR457228 FLJ20225 {Homo sapiens;}, parcial (19 %) [THC2318839] 13,2

ENST00000360623

Clon F22H de ARNm de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina miosin-reactiva de Homo sapiens, cds parcial, [AF035042] 12,4

UNQ6490

Clon ADN 147309 YPLR6490 (UNQ6490) ARNm de Homo sapiens, cds completo, [AY358209] 12,4

CECR1

Región candidata 1 del cromosoma del síndrome de ojo de gato de Homo sapiens (CECR1), variante de transcripción 1, ARNm [NM017424] 11,7

OR2W3

Receptor olfatorio de Homo sapiens, familia 2, subfamilia W, miembro 3 (OR2W3), ARNm [NM_001001957] 11,3

A 32 P93894

Desconocido 11,2

GK

Glicerol quinasa de Homo sapiens (GK), variante de transcripción 1, ARNm [NM_203391] 10,0

THC2407334

Desconocido 9,9

ARL11

Factor de ribosilaci�n 11 similar ADP (ARL11), ARNm [NM 138450] 9,9

AA903523

Clon AA9C3523 ok50h02,s1 NCI CGAP Lei2 de Homo sapiens ADNc IMAGEN: 1517427 3’, secuencia ARNm [AA903523] 9,8

TPD52L3

Proteína tumoral D52 similar a 3 de Homo sapiens (TPD52L3), variante de transcripción 1, ARNm [NM_033516] 9,7

FLJ33641

Proteína FLJ33641 hipotética de Homo sapiens (FLJ33641), ARNm [NM_152687] 9,5

A 24 P929289

Desconocido 8,5

ZDHHC15

Dedos de zinc de Homo sapiens, tipo DHHC que contienen 15 (ZDHHC15), ARNm [NM_144969] 8,3

ENST00000329949

Homo sapiens proteína similar a POM121, ARNm (clon ADNc IMAGE 40053742), [BC112340] 8,0

ANKRD45

Dominio repetido de anquirina 45 (ANKRD45) Homo sapiens ARNm [NM_198493] 7,8

THC2443880

Desconocido 7,5

CLCA3

Miembro 3 de la familia del Canal cloruro calcio activado 3 (CLCA3), ARNm [NM_004921] 7,5

ENST00000327625

Desconocido 7,2

IL23R

Receptor interleucina 23 (IL23R) de Homo sapiens, ARNm [NM144701] 7,2

VNN3

Vanina 3 (VNN3) de Homo sapiens, variante 1 de transcripción, ARNm [NM018399] 7,0

OPRK1

Receptor opioide kappa 1 de Homo sapiens 1 (OPRK1), ARNm [NM_000912] 6,9

BX113452

BX113452 cerebro infantil Soares 1N1B Homo sapiens clon ADNc IMAGp998L21165 secuencia ARNm [BX113452] 6,7

ENST00000372127

Gen de Homo sapiens hipotético apoyado por BC006119, ARNm (ADNc clon IMAGEN:3505629), cds parcial [BC006119] 6,6

CYSLTR2

Receptor 2 de cisteinil leucotrina de Homo sapiens (CYSLTR2), ARNm [NM_020377] 6,5

SMR3B

Proteína 3 regulada por andr�genos de la glándula submaxilar de Homo sapiens homóloga B (ratón) (SMR3B), ARNm [NM_006685] 6,3

THC2319152

Desconocido 6,3

THC2405170

Desconocido 6,2

U22172

ADN Humano de reparación de daños y proteína de recombinación RAD52 pseudogen ARNm, cds parcial. [U22172] 6,1

GNGT1

Proteína de unión al nucleótido guanina de Homo sapiens (proteína G), polip�ptido 1 con actividad gamma transductora (GNGT1), ARNm [NM_021955] 5,9

AF078533

Enzima convertidora evolucionariamente relacionada con interleucina – 1beta de Homo sapiens ARNm cds completo [AF078533] 5,8

FAM107A

Miembro A de la familia con similitud 107 de Homo sapiens (FAM107A), ARNm [NM_007177] 5,7

THC2314833

Desconocido 5,7

ZDHHC15

Dedos de zinc de Homo sapiens, tipo DHHC que contienen 15 (ZDHHC15), ARNm [NM_144969] 8,3

CCDC62

Dominio de hélice superenrrollada que contiene 62 de Homo sapiens (CCDC62), variante de transcripción 1, ARN [NM_032573] 5,7

THC2351769

Desconocido 5,7

AK095225

Homo sapiens ADNc FLJ37906 fis, clon COLON20043318, [AK095225] 5,3

A 23 P134405

Desconocido 5,3

BCL6B

Homo sapiens CLL de células B / linfoma 6, miembro B (proteína dedos de zinc) (BCL6B), ARNm [NM_181844] 5,2

NP297856

GB[AF132199,1] AAG35545,1 PRO1460 [NP297856] 5,1

ZSCAN4

Dominio dedos de zinc y SCAN que contiene 4 de Homo sapiens (ZSCAN4) ARNm [NM_152677] 5,1

THC2438003

Q9BVX4 (Q9BVX4) MGC5566 proteína, parcial (23 %) [THC2438003] 4,8

AF119887

PRO2610 ARNm de Homo sapiens, cds completo [AF119887] 4,8

X92185

H. sapiens ARNm para elementos alu [X92185] 4,7

THC2455392

Desconocido 4,3

C19orf30

Fase de lectura abierta 30 del cromosoma 19 de Homo sapiens (C19orf30), ARNm [NM 174947] 4,0

An�lisis de Ontolog�a G�nica de los genes regulados por NAV3

El agrupamiento basado en ontolog�a g�nica se llev� a cabo para identificar procesos biológicos afectados por la

5 depleci�n de NAV3. Para aumentar el número de genes para el análisis GO, realizamos el agrupamiento sobre 52 genes que estaban regulados positivamente en 7 de 10 experimentos. De entre este grupo, se identificaron cuatro grupos GO (Figura 8): membrana (nueve genes), transporte de iones (dos genes), nucleares (cuatro genes), y unión con ribonucle�tidos (dos genes). El grupo de unión a ribonucle�tidos incluía dos genes: glicerol quinasa y ARL11. La glicerol quinasa es una enzima clave en la regulaci�n de la toma de glicerol y el metabolismo, mientras que ARL11

10 (o ARLTS1) pertenece a la familia ARF de la superfamilia Ras de GTPasas pequeñas, que se sabe que est�n

implicadas en múltiples rutas reguladoras alteradas en carcinog�nesis humanas.

Los productos g�nicos se agruparon (unieron) basándose en sus anotaciones de Ontolog�a G�nica (GO). Los genes que tienen anotaciones similares pertenecen al mismo grupo. La distancia entre los productos g�nicos se define 5 utilizando la información de las medidas teóricas de similitud semántica.

En la Tabla 10 a continuación, se muestra el más informativo (más específico) de los términos comunes de cada grupo. Todos los productos g�nicos en el grupo se anotan con el término GO mencionado. Un término GO es más informativo si se produce escasamente en las anotaciones GO del genoma entero. La columna priori contiene una

10 probabilidad a priori p a la que un producto g�nico aleatorio es anotado con el determinado término GO. La información se define como log2p. Generalmente, los grupos con (1) un gran número de productos g�nicos y (2) términos GO comunes con alto contenido informativo son los más interesantes.

Tabla 10, Productos g�nicos que est�n agrupados (unidos) bas�ndoseen sus anotaciones de Ontolog�a genética (GO)

Grupo Tamaño GOID PRIORI INFO DESCRIPCIÓN

G1

4 GO:0003824 0,230 2,120 Actividad catalítica

GO:0008152

0,312 1,681 Procesos metabólicos

GO:0044464

0,906 0,142 Parte celular

G2

3 GO:0005215 GO:0006810 0,046 0,093 4,435 3,434 Actividad transportadora Transporte

G3

5 GO:0005886 0,124 3,014 Membrana plasm�tica

GO:0016021

0,126 2,989 Integral para membrana

G4

2 GO:0005634 0,163 2,620 Núcleo

GO:0005515

0,237 2,079 Unión proteica

GO:0050794

0,262 1,932 Regulaci�n de procesos celulares

MIEMBROS DE GRUPOS G1 GAL3ST1 GK RDHE2 CECR1 G2 AQP10 ENST00000327625 CLCA3 G3 GNRHR OPRK1 DNER IL23R FLJ33641 G4 BCL6B FAM107A

15 Además de los genes del grupo de membrana IL23R y GnRHR tratados anteriormente, hay otros genes en el grupo de membrana (Figura 8) incluidos GNGT1, CYSLTR2, y SMR3B. El GNGT1 codifica la subunidad gamma de la transducina, que se encuentra principalmente en los segmentos de bastoncillos externos. El CYSLTR2 pertenece a los cistenil leucotrienos que son importantes mediadores en el tráfico celular y respuestas inmunes innatas, implicadas en la patog�nesis de procesos inflamatorios. El IFN-gamma induce la expresión de CysLTR2 y potencia

20 las respuestas inflamatorias inducidas por CysLT. El SMR3B (proteína 3 regulado por andr�genos de glándula submaxilar, B), es un candidato a gen relacionado con tumores.

El grupo del núcleo incluye el gen FAM107A, también llamado TU3A, que se ha informado que se silencia epigen�ticamente en varios c�nceres Además, hemos identificado el gen BCLB6, un gen codificante del factor de

25 transcripción, regulado positivamente por el factor neurotr�fico derivado de la línea celular glial. La lista completa de genes en cada grupo se da en la Figura 8. Otros genes de interés que est�n unidos a la inflamación también se encontraron entre los genes regulados positivamente, incluyendo Vanin3 un miembro de la familia Vanin de ectoezimas segregadas o asociadas a la membrana. El Vanin 1 y Vanin 3 han mostrado recientemente tener una actividad proinflamatoria.

30 Cuando se trataron las células de glioma y colon como grupos específicos, identificamos 39 genes consistentemente regulados positivamente en las células de colon normales con NAV3 silenciado y 28 genes regulados positivamente en las células gliales (Tablas 11 y 12) La DNER es una proteína transmembrana que lleva repeticiones extracelulares similares a EGF y un ligando Notch at�pico, y que estaba regulada positivamente solo en las células

35 de colon con NAV3 silenciado (Tabla 11).

Tabla 11. Lista de genes regulados positivamente en los cuatro experimentos con células de colon con silenciamiento de NAV3, El número total de genes era 39, pero los genes que carecían de anotación se dejaron fuera de la tabla. Los genes est�n listados de acuerdo con su grupo GO. Los genes marcados conun asterisco (*) han sido relacionados previamente con cáncer.

Abreviatura Nombre completo M�x. cambios en n� de veces

M�n. cambios en n� de veces

Prote�nas de membrana

GNRHR*

Receptor de la hormona liberadora de gonadotropinas de Homo sapiens (GNRHR), variante de transcripción 1 32,4 14,8

FLJ33641

Proteína hipotética FL33641 de Homo sapiens (FLJ33641), ARN [NM 1526871 23,4 7,0

ENST00000327625

Desconocido 17,8 6,9

AQP10

Aquaporin 10 (AQP10) Homo sapiens 16,2 5,5

IL23R

Receptor Interleucina 23 de Homo sapiens (IL23R) 14 0 4,4

DNER

Transmembrana delta-notch que contiene repeticiones similares a EGF de Homo sapiens (DINER) 21,9 5,8

OPRK1

Receptores opioides kappa1 de Homo sapiens (OPRK1) 14,6 4,9

GAL3ST1

Galactosa-3-OSulfotransferasa 1 de Homo sapiens (GAL3ST1) 13,2 3,9

Uni�n a nucleótidos pur�nicos

ARL11

Factor de ribosilaci�n 11 similar a ADP de Homo sapiens (ARL11) 30,2 6,8

ANKRD45

Dominio 45 de repetición de aniquirina de Homo sapiens (ANKRD45), ARNm 11,2 8,0

GK*

Glicerol quinasa de Homo sapiens (GK), variante de transcripción 1 15 1 4,1

Regulaci�n de procesos celulares

FAM107A*

Familia con similitud de secuencia con la familia 107 de Homo sapiens, miembro A 8,1 4,1

BCL6B

CLL de Células B /linfoma 6, miembro B (proteína dedos de zinc) de Homo sapiens (BCL6B) 9,9 5,4

Sin grupo GO

C12orf42

Fase de lectura abierta 42 del cromosoma 12 de Homo sapiens (C12orf42) 47,8 176

MFSD2*

Homo sapiens ADNc FLJ14490 fis, clon MAMMA1002886 [AK027396] 34,9 9,9

RDHE2

Isoforma 1 de deshidrogenasa reductasa de cadena corta retiniana de Homo sapiens 20,5 7,7

ENST00000329949

Proteína similar a POM121de Homo sapiens 19,9 4 9

ENST00000360623

Clon F22H de ARNm de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina miosin-reactiva de Homo sapiens, cds parcial, [AF035042] 17,2 5,5

ZNF224

Proteína dedos de zinc 224 de Homo sapiens 42,1 8,3

CECR1

Región candidata 1 del cromosoma del síndrome de ojo de gato de Homo sapiens (CECR1), variante de transcripción 1 10,6 5,1

TPD52L3

Proteína tumoral D52 similar a 3 de Homo sapiens (TPD52L3), variante de transcripción 1 11,6 4,2

VNN3

Vanina 3 (VNN3) de Homo sapiens, variante 1 de transcripción, ARNm [NM018399] 12,1 4,5

CCDC62

Dominio de hélice superenrrollada que contiene 62 de Homo sapiens (CCDC62), variante de transcripción 1 8,8 4,9

X92185

H. sapiens ARNm para elementos alu [X92185] 8,4 5,12

CLCA3*

Miembro 3 de la familia Canal cloruro del calcio activado (CLCA3) 12,0 5,2

Tabla 12. Lista de los genes comúnmente regulados positivamente en las líneas celulares gliales

Abreviatura

Máximos cambios en n� de veces Mínimos cambios en n� de veces Nombre completo

C12orf42

36,9 12,7 Fase de lectura abierta 42 del cromosoma 12 de Homo sapiens (C12orf42), ARNm [NM 198521]

AK021467

37,0 9,1 Clon ADNc FLJ11405 fis Homo sapiens HEMBA1000769 [AK021467]

GNRHR

32,3 4,7 Receptor de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRHR) de Homo sapiens, variante de transcripción 1 ARNm [NM 000406]

AF334588

28,6 12,8 ARNm P25 de Homo sapiens, cds completo, [AF334588]

A 24 P799680

29,3 6,1 Desconocido

ENST00000329949

23,6 6,2 Proteína similar a POM121 de Homo sapiens, ARNm (clon ADNc IMAGE 40053742), [BC112340]

LOC348174

21,7 7,9 Homo sapiens ADNc FLJ38732 fis, clon KIDNE2010750, [AK096051]

CN480368

17,3 3,8 UI-H-EU0-azt-m-22-0-UI,s1 NCI_CGAP_Carl Homo sapiens clon ADNc UI-H-EU0-azt-m -22-0-UI 3’ secuencia de ARNm [CN480368]

THC2378839

16,3 5,4 CR457228 FLJ20225 {Homo sapiens;}, parcial (19 %) [THC2318839]

NP297856

15,2 4,0 GB|AF132199,1|AAG35545,1 PRO1460 [NP297856]

VNN3

12,4 4,9 Vanina 3 (VNN3) de Homo sapiens, variante 1 de transcripción, ARNm [NM018399]

CYSLTR2

12,3 3,5 Receptor 2 de cisteinil leucotrina de Homo sapiens (CYSLTR2), ARNm [NM_020377]

ENST00000360623

16,1 9,6 Clon F22H de ARNm de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina miosin-reactiva de Homo sapiens, cds parcial, [AF035042]

THC2407334

15,0 4,2 Desconocido

AA903523

12,2 3,6 Clon AA9C3523 ok50h02,s1 NCI CGAP Lei2 de Homo sapiens ADNc IMAGEN: 1517427 3’, secuencia ARNm [AA903523]

ENST00000372127

11,2 3,9 Gen de Homo sapiens hipotético apoyado por BC006119, ARNm (ADNc clon IMAGEN:3505629), cds parcial [BC006119]

C19orf30

10,9 3,8 Fase de lectura abierta 30 del cromosoma 19 de Homo sapiens (C19orf30), ARNm [NM 174947]

ZSCAN4

10,8 5,3 Dominio dedos de zinc y SCAN que contiene 4 de Homo sapiens (ZSCAN4) ARNm [NM_152677]

SPAG11

10,8 5,3 Ant�geno 11 asociado a esperma de Homo sapiens (SPAG11), variante de transcripción C, ARNm [NM_058203]

A 24 P929289

10,3 4,9 Desconocido

THC2443880

9,7 4,2 Desconocido

UNQ6490

19,4 5,5 Clon ADN 147309 YPLR6490 (UNQ6490) ARNm de Homo sapiens, cds completo, [AY358209]

ARL11

18,1 7,6 Factor de ribosilaci�n 11 similar a ADP de Homo sapiens (ARL11)

THC2314833

7,2 3,9 Desconocido

IL23R

8,7 3,4 Receptor Interleucina 23 de Homo sapiens (IL23R)

FLJ33641

9,8 5,9 Proteína hipotética FL33641 de Homo sapiens (FLJ33641), ARN [NM 1526871

U22172

7,0 4,6 ADN Humano de reparación de daños y proteína de recombinación RAD52 pseudogen ARNm, cds parcial. [U22172]

BX113452

14,7 6,0 BX113452 cerebro infantil Soares 1N1B Homo sapiens clon ADNc IMAGp998L21165 secuencia ARNm [BX113452]

Ejemplo 5. Inmunohistoqu�mica

Inmunohistoqu�mica de IL23R y beta-catenina en las muestras de tejido

5 Se estudiaron las expresiones de IL23R y beta-catenina por inmunohistoqu�mica en micromatrices de tejido preparadas a partir de las biopsias de colon embebidas en parafina. De cada paciente se incluyeron en la micromatriz, muestras pareadas del colon histol�gicamente normal y dos muestras del tumor de colon. También, se incluyeron muestras pareadas de 19 pacientes con una lesión adenomatosa y otra muestra de colon normal. Con un

10 total de 57 pacientes, se incluyeron en las micromatrices de tejido 43 muestras de tumor MSS, 14 muestras de tumor MSI, 14 muestras de adenoma y 57 correspondientes a muestras de colon normal.

Se llev� a cabo la inmunohistoqu�mica utilizando la técnica del complejo avidina-biotina – peroxidasa (Vectastatin Elite ABC kit [mouse IgG], Vector laboratories, Burlingame, CA, EE. UU) con DAB como sustrato cromog�nico y hematoxilina de Mayer como tinción de recuento. Después de la desparafinaci�n estándar, se bloque� la actividad de la peroxidasa end�gena con H2O2 al 3 % y las secciones se pretrataron con un baño de agua a +95 �C en

5 tampón de citrato ((DakoCy-tomation, Glostrup, Dinamarca) durante 20 min. Los portaobjetos entonces se incubaron con anticuerpos monoclonales de ratón contra IL23R (R&D MAB14001; diluidos en 1:30, portaobjetos pretratados con un 1 % de tripsina a 37 �C 30 min) o contra beta-catenina (Zymed CAT-5H10, Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 EE. UU; diluido en 1:250, pretratamiento del portaobjetos a +95 �C durante 30 min en DAKO Target Retrieval Solution S1699, pH 6-6,2) a +4 �C durante una noche. El DAB se utilizó como sustrato cromog�nico para IL23R mientras que se utilizó el kit VECTOR NovaRED substrate S-4800 para la beta-catenina.

Para los análisis estadísticos el resultado del inmunomarcado se puntu� según lo siguiente: para la inmunorreactividad de IL23R sin tinción (puntuación 0), tinción ligeramente positiva (puntuación 1), tinción claramente positiva (puntuación 2), tinción fuertemente positiva (puntuación 3; véase también la Figura 9 para

15 ejemplos) para la beta-catenina no teñida (puntuación 0) , la tinción de la membrana celular (puntuación 1), tinción del citoplasma (puntuación 2), tinción nuclear en la mayoría de las células tumorales (puntuación 3; véase también la Figura 9).

An�lisis estadísticos

Las correlaciones entre las variables categóricas se analizaron utilizando la prueba del chi-cuadrado, o cuando no era válida, el ensayo exacto de Fisher. Los análisis de supervivencia se llevaron a cabo utilizando la muerte producida por el cáncer de colon como punto de corte primario. Los tiempos de seguimiento se obtuvieron de Statistics Finland, una agencia gubernamental. Se utilizó el software SPSS versión 15.0 (SPSS, IL, EE. UU).

25 Expresión de IL23R o beta-catenina nuclear en tumores MSS con NAV3 aberrante asociados con estadificaci�n de Dukes y metástasis en ganglios linfáticos, y expresión de IL23R asociada con mal pronóstico

La detección inmunohistoqu�mica de beta-catenina (ligada a la ruta de la GnRHR) y la expresión de IL23R se llev� a cabo entonces en una micromatriz de tejido que incluía 43 MSS (incluyendo también 8 muestras de adenoma de los mismos pacientes) y 14 muestras de pacientes MSI (tumorales y su correspondiente epitelio normal de colon). Se encontr� en todas las muestras de colon normal de estos casos, excepto en tres casos, que la tinción de betacatenina era siempre membranosa y no había o era solamente débil la expresión de IL23R (grado 1) (Figura 9).

35 Se sabe que en las células epiteliales normales la beta-catenina se localiza en las membranas celulares pero cambia su distribución hacia el núcleo y el citoplasma en muestras de carcinomas. En las muestras representativas de tumor MSS (muestras duplicadas de cada una), se encontr� beta-catenina nuclear en 10/43 casos y la inmunorreactividad de IL23R con regulaci�n positiva (puntuaciones 2-3) en 27/43 casos. La expresión de betacatenina nuclear se correlaciona con metástasis en ganglios linfáticos. La inmunorreactividad de IL23R regulada positivamente en las muestras de matrices de tejido se correlacionaba fuertemente con la estadificaci�n de Dukes (véase la Tabla 3 en el Ejemplo 2, aberraciones de NAV3 asociadas con polisom�a del cromosoma 12 y con metástasis de los ganglios linfáticos) y también con la metástasis de ganglios linfáticos (véase Tabla 3 en Ejemplo 2). Las muestras tumorales con deleciones al�licas NAV3 mostraban frecuentemente una reactividad de IL23R

45 regulada positivamente más clara (Figura 9).

En un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (Figura 10), se encontr� que los pacientes con inmunorreactividad de IL23R con regulaci�n positiva (puntuaciones 2 y 3) tenían peor pronóstico que los pacientes con un nivel normal o bajo de expresión (es decir, una intensidad de tinción, puntuación 0 o 1, respectivamente, y comparable con las muestras de colon normal) (véase Tabla 3 en el Ejemplo 2). El tiempo medio de supervivencia para pacientes con expresión baja de IL23R era de 44 meses (95 %IC 38-50 meses), mientras que para el paciente con una expresión alta de regulaci�n positiva, la media de supervivencia era solamente de 23 meses (95 % IC 13-33 meses)

Para los pacientes con CRC tipo MSS, era posible comparar los resultados de la FISH de IL23F, beta-catenina y

55 NAV3 en muestras de adenoma y tumores, los cambios en el número de copias de NAV3, junto con la elevación en la expresión de IL23R (inmunotinci�n moderada o fuerte) y/o la beta-catenina nuclear estaban presentes en 3 de las muestras de adenoma y la expresión elevada de IL23R sola en dos adenomas adicionales (datos no mostrados). En las correspondientes muestras tumorales, los hallazgos fueron similares excepto en dos muestras donde no se encontr� aberración NAV3 a pesar de haber expresión de IL23R regulada positivamente. En ambos de estos últimos casos, la lesión de adenoma correspondiente, sin embargo, había mostrado polisom�a del cromosoma 12.

Inmunohistoqu�mica de IL23R y GnRHR en muestras de tejido

La inmunotinci�n de GnRHR se llev� a cabo en un inmunostainer LabVision (LabVision, CA, EE. UU) y a

65 continuación se llev� a cabo la recuperación del ant�geno utilizando tampón Tris-EDTA, pH 9,0 en un horno microondas durante 24 minutos a 900 vatios y a continuación se enfri� durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Se detect� el GnRHR con anticuerpo monoclonal de ratón (diluido 1:10, Abcam, Cambridge, R. U) y un sistema de detección basado en pol�mero (Envision, K5007, DakoCytomation) con diaminobenzidina (DAB) como crom�geno (Figura 11).

5 Se incluyeron dos secciones de tejido colorrectal de casos representativos (muestras pareadas de colon histol�gicamente normal y el tumor de colon) y dos casos de astrocitoma (glioblastoma) preparadas a partir de la biopsias embebidas en parafina de pacientes con cáncer colorrectal o astrocitoma. Para estas muestras, se llev� a cabo la inmunohistoqu�mica como se describió anteriormente utilizando el anticuerpo anti-GnRHR y anticuerpo monoclonal de ratón contra IL23R (R&D MAB14001; diluido 1:30, portaobjetos pretratados con tripsina 1 % a 37 �C

10 durante 30 min) y su detección por un complejo avidina-biotina-peroxidasa (Vectastain Elite ABC kit [mouse IgG], Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU) con DAB como sustrato cromog�nico.

Confirmaci�n de regulaci�n positiva de proteína IL23 y GnRHR en células 0205 con NAV3 silenciado, y enmuestras de tejido de CRC y glioblastoma

15 0146 La regulaci�n positiva de los niveles de proteína GnRHR en las células con NAV3 silenciado se demostr� por inmunotinci�n. La tinción de GnRHR fue más alta en células con silenciamiento de NAV3 que en las células tipo silvestre y las células control transfectadas con ARNsi codificado (Figura 11 a-c) La inmunotinci�n de la proteína GnRHR en las muestras de tejido con CRC también fue más alta que en el epitelio normal de colon (Figura 11 d).

20 Los resultados eran repetibles en dos muestras típicas de un paciente con CRC, un caso con un tipo MSS de CRC y en el 41 % de las células con NAV3 eliminado en el tumor (el corte para deleci�n NAV3 es del 3 % en la referencia normal como se inform� anteriormente, Figura 11 e), y en el caso de CRC tipo MSI y el 8 % de las células con NAV3 eliminado en el tumor (Figura 11 f). Igualmente, se observ� regulaci�n positiva de GnRHR e IL23R en una serie de muestras preliminares de glioblastoma (astrocitoma) que mostraron deleci�n de NAV3 en comparación con

25 los tumores gliales sin deleci�n (Figura 11 g y h).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Helsingin yliopiston rahastot 30

<120> Métodos y usos que implican aberraciones genéticas de NAV 3 y expresión aberrante de múltiples genes

<130> 2081898PC 35

<160> 15

<170> PatentIn versión 3.3

40 <210> 1

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

45 <220>

<223> oligonucle�tido

<400> 1

cctgctattt tcatctttca agc 50

<210> 2

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial 55

<220>

<223> oligonucle�tido

<400> 2 60 ggctgggatg ctgtttgag

<210> 3

<211> 30

<212> ADN 65 <213> Artificial

<220> <223> oligonucle�tido

5

<400> 3 gatgctgttt gagcgcatca tgctgggccc 30

10

<210> 4 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial

<220> <223> oligonucle�tido

15

<400> 4 ggacuuaacc uauauacua 19

20

<210> 5 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial

25

<220> <223> oligonucle�tido <400> 5 gagagggucu ucagaugua 19

30

<210> 6 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial

35

<220> <223> oligonucle�tido

<400> 6 cagggagccu cuaauuuaa

19

40

<210> 7 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial

45

<220> <223> oligonucle�tido

50 55

<400> 7 gcuguuagcu cagauauuu <210> 8 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> oligonucle�tido 19

60

<400> 8 atccatggag ctcagcaa 18

65

<210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> oligonucle�tido

5

<400> 9 ttggctgctt cttggagttt 20

10

<210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> oligonucle�tido

15

<400> 10 aagagcacgg ctgaagactc 20

20

<210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

25

<220> <223> oligonucle�tido <400> 11 gcatgggttt aaaaaggcaa 20

30

<210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

35

<220> <223> oligonucle�tido

<400> 12 cgcaaaactc gctattcgac a

21

40

<210> 13 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial

45

<220> <223> oligonucle�tido

50 55

<400> 13 atggcttccc tcaggcaga <210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> oligonucle�tido 19

60

<400> 14 ttggctgctt cttggagttt 20

65

<210> 15 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> oligonucle�tido

<400> 15 caccaaatct agagctgcat ca 22

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método de demostración del carácter maligno de un tumor o de una subpoblaci�n celular de un sujeto, comprendiendo el método:

   5 i) determinar un cambio en el número de copias de NAV3 en una muestra biológica del sujeto; y ii) determinar la sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico seleccionados de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina, en la muestra biológica o en otra muestra biológica del sujeto; iii) demostrar el carácter maligno de un tumor o de una subpoblaci�n celular de un sujeto, cuando tanto un cambio en el número de copias de NAV3 como la sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico seleccionados de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina est�n presentes en la(s) muestra(s) del sujeto.
2. 2. Un método de predicción de un pronóstico de un sujeto que tiene un tumor, comprendiendo el método:

   15 i) determinar un cambio en el número de copias de NAV3 en una muestra biológica del sujeto; ii) determinar la sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico seleccionados de entre IL23R o betacatenina, en la muestra biológica o en otra muestra biológica del sujeto; y iii) predecir un pronóstico de un sujeto, que tiene tanto un cambio en el número de copias de NAV3 como la sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico seleccionados de entre IL23R o beta-catenina en la(s) muestra(s).
3. 3. Un uso del gen NAV3 o de un producto g�nico y al menos un gen y/o un producto g�nico seleccionados de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina para demostrar el carácter maligno de un tumor o de una subpoblaci�n celular con un cambio en el número de copias de NAV3 y con sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico

   25 seleccionados de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina en un sujeto.

4. 4.

   Un uso del gen NAV3 o de un producto g�nico y al menos un gen y/o un producto g�nico seleccionados de entre IL23R o beta-catenina para predecir el pronóstico de un sujeto.

5. 5.

   El método o el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cambio en el número de copias de NAV3 lo causa una deleci�n, amplificación o translocaci�n del gen NAV3 o una gran parte de él.

6. 6.

   El método o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tumor es un

   tumor colorrectal, tumor cerebral o tumor de queratinocitos epid�rmicos. 35

7. 7.

   El método o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tumor es un carcinoma.

8. 8.

   El método o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el/los gen(es) y/o el/los producto(s) g�nico(s) est�n activados, inactivados, sobreexpresados o infraexpresados, o la cantidad del producto g�nico est� aumentada o disminuida.

9. 9.

   El método o el uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 3 o 5-8, en el que la presencia de un tumor con un cambio en el número de copias de NAV3 y con sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico

   45 seleccionados de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina se asocia con metástasis en ganglios linfáticos, alto grado de malignidad y/o baja supervivencia.

10. 10.

    El método o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2,4 o 5-8, en el que la presencia de un tumor con un cambio en el número de copias de NAV3 y con sobreexpresi�n de al menos un gen o un producto g�nico seleccionados de entre IL23R o beta-catenina se asocia con metástasis en ganglios linfáticos, alto grado de malignidad y/o baja supervivencia.

11. 11.

    El método o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 5-9, en el que el/los gen(es)

    seleccionados de entre IL23R, GnRHR, beta-catenina, codifican una proteína, que es una proteína de membrana, 55 una proteína que regula los procesos celulares o una proteína de unión a nucleótidos pur�nicos.

12. 12.

    El método o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 5-8 o 10, en el que el/los gen(es) seleccionados de entre IL23R o beta-catenina, codifican una proteína, que es una proteína de membrana, una proteína que regula procesos celulares o una proteína de unión a nucleótidos pur�nicos.

13. 13.

    El método o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 5-9 u 11, en el que el gen o el producto g�nico son IL23R y/o GnRHR.

14. 14. El método o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tumor cerebral 65 es un glioma.

    Deleci�n de NVV3, adenoma Deleci�n de NVV3, carcinoma

    Deleci�n de NAV3