JP5819728B2 - Nav3の遺伝子異常および複数遺伝子の異常発現を含む方法および使用 - Google Patents
Nav3の遺伝子異常および複数遺伝子の異常発現を含む方法および使用 Download PDFInfo
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Description
i)対象からの生物学的試料中のNAV3コピー数変化を決定し;次いで
ii)対象からの生物学的試料またはもう一つの生物学的試料中のIL23R、GnRHR、β−カテニン、および表8〜12に記載のものから選択される少なくとも1つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を決定し;
iii)NAV3コピー数変化、ならびにIL23R、GnRHR、β−カテニン、および表8〜12に記載のものから選択される少なくとも1つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現の双方が対象からの試料中に存在する場合に、対象における腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示す
ことを含む。
i)対象からの生物学的試料中のNAV3コピー数変化を決定し;
ii)対象からの生物学的試料またはもう一つの生物学的試料中のIL23R、GnRHR、β−カテニン、および表8〜12に記載のものから選択される少なくとも1つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を決定し;次いで
iii)その試料中のNAV3コピー数変化、ならびにIL23R、GnRHR、β−カテニン、および表8〜12に記載のものから選択される少なくとも1つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現の双方を有する対象に対する予後を予測する
ことを含むことを特徴とする予後の予測方法に関する。
i)対象からの生物学的試料中のNAV3コピー数変化を決定し;
ii)対象からの生物学的試料またはもう一つの生物学的試料中のIL23R、GnRHR、β−カテニン、および表8〜12に記載されたものから選択される少なくとも1つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を決定し;次いで
iii)試料中のNAV3コピー数変化、ならびにIL23R、GnRHR、β−カテニン、および表8〜12に記載のものから選択される少なくとも1つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現の双方を有する対象に対する処置を選択する
ことを含むことを特徴とする対象に対する処置の選択方法に関する。
以下において、本発明は、添付図面を参照して、好ましい具体例によってより詳細に記載される。
発明者らは、NAV3コピー数変化がMSSタイプCRC、結腸腺腫、脳腫瘍、表皮角化細胞、およびいくつかの樹立細胞株に頻繁に見出されることを今や報告する。NAV3異常は第12染色体の多染色体性およびリンパ節関与と関連した。さらに、NAV3の特異的なsiRNA遺伝子発現抑制および発現アレイ分析は、NAV3につき少なくとも2つの重要な標的分子を明らかにした。
本願において列記された、上方制御された遺伝子またはそれらの遺伝子産物の全ては、新規な診断原理の開発に利用できる。NAV3コピー数の決定に加えて、少なくとも1つの遺伝子または遺伝子産物の発現が本発明の方法において検討される。本明細書に用いた、「遺伝子産物」なる表現は、mRNA、タンパク質、または遺伝子から達成されたいずれかの生成物をいう。本発明の特定の実施例において、遺伝子産物はタンパク質である。
NAV3(ニューロンナビゲーター3、POMFIL1とも呼ばれる)は、c12q21.1に位置したスプライスされた遺伝子(40エクソン)であり、脳組織、活性化T細胞、胎盤、結腸、およびある種の癌細胞系において発現される。NAV3のアミノ酸配列は、異なる種の中でよく保存され、これは、NAV3が細胞プロセスに基本的な役割を演じることを示している。アミノ酸配列相同性は、NAV3が細胞シグナリングおよび腫瘍抑制に関与することを示唆する。NAV3は、細胞遊走の非常に重要な媒介物質のC.Elegansのunc−53タンパク質のヒト相同体である。また、NAV3相同体のNAV1およびNAV2は、細胞内フィラメントに結合し、細胞の伸長および遊走を調節する。
また、本検討の結果が、NAV3の異常が種々の腫瘍および癌において一般的であることを確認する。発明者らは、NAV3コピー数変化を探索する3種の異なる方法:LOH、アレイ−CGHおよびFISHを用いた。FISH法を用いて、発明者らは、結腸直腸癌(CRC)を持った実質的な数の症例における第12染色体およびNAV3遺伝子のコピー数変化で細胞を観察した。また、重要なことには、NAV3欠失は、23%の腺腫試料で検出した。しかしながら、すべての症例での知見は、主として正常な二倍体形質を含む細胞、および可変数の第12染色体および/またはNAV3標識を含む異常細胞よりなる腫瘍細胞の異種集団を示した。この設定において、遺伝子の対立形質の欠失または増幅は、例えば、同種腫瘍中の腫瘍抑制遺伝子における変異を含む状況とは異なる。このタイプのコピー数異常が、個々の細胞を分析するFISH法でのみ観察できるが、同じタイプの異常を示すために試料中に細胞の40%以上を必要とする2種の方法のアレイ−CGH、またはLOHではほとんどの場合観察できないことに注目することは重要である。未選択の臨床系の組織試料からの発明者らの知見は、同様の第12染色体の多染色体性およびNAV3コピー数変化がMSSタイプの3種のCRC樹立細胞系、およびMSIタイプの1種の細胞系においても観察されたという事実によって強調される。
GnRHRは、脳下垂体の性腺刺激ホルモン分泌細胞により、黄体形成ホルモン(LH)、濾胞刺激ホルモン(FSH)および性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)の分泌を刺激するオートクリン性腺刺激ホルモン受容体である(Yeung CMら 2005, Mol Hum Reprod 11(11):837-42)。脳下垂体の性腺刺激ホルモン分泌細胞に加えて、GnRHRは、リンパ球、乳房、卵巣および前立腺細胞の表面上で発現されることが知られている。多数の最近の報告は、GnRH−GnRHR軸も下垂体細胞外において活性であり、GnRHRの上方制御が、多数の癌、特に、癌腫に観察されたことを示している(Harrison GSら 2004, Endocr Relat Cancer 11(4):725-48)。GnRHR活性化は、β−カテニンおよびT細胞因子(TCF)経路に影響する前初期遺伝子(IE)の活性化に最初に導くと考えられる(Salisbury TBら 2008, Mol Endocrinol 22(6):1295-303)。また、基準Wntシグナル経路のメンバーのβ−カテニンは、β−カテニン分解を調節するグリコーゲン合成酵素キナーゼ3の不活性化(Gardner Sら 2009, Neuroendocrinology 89(3):241-51)を介してGnRHシグナルの変換(Salisbury TBら 2008, Mol Endocrinol 22(6):1295-303)に必須の役割を演じる。他方、いくつかの報告は、β−カテニンの発現レベルの増加が腫瘍のリンパ節転移に影響することを示している(Buhmeida Aら 2008, APMIS 116(1):1-9)。
IL−23Rの同定は、JAK−STATシグナリングに連結され、炎症促進性の組織微小環境が腫瘍細胞の増殖能および拡散に影響するという発明者らの仮説を支持する。IL−23RリガンドIL−23はマクロファージおよび樹状細胞のごとき活性化された炎症細胞によって分泌される。IL−23Rヘテロ二量体は、IL−12受容体・ベータ1(IL−12Rベータ1)およびIL−23R(IL−12Rベータ2に関連)鎖からなり(Beyer BMら 2008, J Mol Biol 382(4):942-55);その後者は、NAV3発現抑制細胞中で上方制御された。JAK2およびSTAT3の双方は、IL−23Rと関連する。JAK2はIL−23に応じて受容体を燐酸化し、活性化STAT3二量体は、核に移動させ、リガンド依存性にIL−23Rに結合する。また、JAK/STAT経路は、上流の遺伝子における突然変異によって活性化され、多数のヒト悪性腫瘍において構成的に活性化されることが示されている(Constantinescu SNら 2008, Trends Biochem Sci 33(3):122-31; Li WX. 2008, Trends Cell Biol 18(11):545-51)。
GNRHRおよびIL23Rに加えて、発癌に関連付けられる5つの遺伝子(ARL11、SMR3B、FAM107A、MFSD2およびBCLB6)および炎症に関連付けられる2種の遺伝子(CYSLTR2およびVNN3)が、本検討におけるNAV3発現抑制により上方制御されることが示された。最近、MFSD2を含めたMYCL1 LD領域における多形性は、MFSD2遺伝子は対立遺伝子頻度における人種差を示すが、肺癌生存率に影響することが示された(Spinola Mら 2007, Lung Cancer 55(3):271-7)。最近、大腸炎関連結腸癌マウスモデルにおいて上皮バニン−1が炎症駆動の発癌を制御し(Poyet et al, 2009)、バニン−1およびバニン−3発現レベルの双方が、乾癬皮膚細胞の炎症促進性サイトカインによって増強される(Jansen PAら 2009, J Invest Dermatol Mar 26)ことが示された。この文脈において、乾癬および腹腔の患者群の双方が癌のリスク増加を有することに注目することは興味深い(Grulich AE および Vajdic CM. 2005, Pathology 37(6):409-19)。膜関連タンパク質クラスターおよびそれらの下流標的の上方制御は、特に注目される。
組織試料
直腸結腸腫瘍試料
ミッケリ中央病院にてCRCで手術した59名の患者から外科的生検試料(61のCRCおよび10の腺腫試料)をFISH、LOHおよび免疫組織化学によって検討した。この検討は、ミッケリ・セントラル病院の倫理審査委員会、および法医学的業務のための国内当局によって承認された。ホルマリン固定のパラフィン包埋組織試料の組織学を経験のある病理学者(MH)によって確認し、腫瘍、腺腫または正常な粘膜を顕微解剖して、純粋に正常または少なくとも50%比の癌腫または腺腫組織を得た。標準的なプロトコールに従い、パラフィン包埋切片を50μmの厚みに切り、核をFISH分析のために単離し、DNAをLOH分析のために精製した(Hyytinen Eら 1994, Cytometry 16: 93-96; Isola J.ら 1994, Am. J. Pathol 145: 1301-1308)。すべての腺腫はMSSであったが、56の癌のうちの14は高度のMSIを有した。
FISHアッセイ用試料を119例の脳腫瘍症例から調製した。症例は、55例の星状細胞腫、20例の乏突起膠腫、13例の上衣腫、18例の髄芽腫、および13例の神経芽細胞腫よりなった。すべての組織試料をルーチンのホルマリン固定によって処理し、パラフィン中に包埋した。
CRL−1541およびCRL−1539の正常結腸細胞(ATCC, Manassas, VA, USA)、グレード4膠芽腫に由来した膠芽腫細胞系A172、および一次表皮角化細胞(すべてATCC, Manassas, VA, USAから)を30を超える継代のためにATCCにより指示されたように増殖させた。また、結腸直腸癌の細胞系CCL−228(SW480)、CCL−230(SW403)、CCL−248(T84)、RKO、LIM1215およびHCA7(ATCC, Manassas, VA, USA)をATCCにより指示されたように増殖させた。CRC細胞系の中で、RKO、LIM1215およびHCA7は、ミスマッチ修復欠損性であり、MSIを有することが知られている。
FISH(蛍光インサイチューハイブリダイゼーション)
細胞系CRL−1541、CRL−1539およびA172を、従前に記載されたマルチカラーFISHを用いてNAV3コピー数変化につき検討した(Karenko Lら 2005, Cancer Res 65:8101-10)。また、FISH分析は、0205細胞系を確立した腫瘍組織につき行った。
患者由来の結腸直腸および脳腫瘍試料からのFISHスライドは、2種の独立した分析機器によって、同一性をサンプリングするようにブラインドして分析した。結果は、200の計数された細胞核の総数中の異常細胞の百分率として示す。2つの第12染色体シグナルおよび1つだけのNAV3シグナルを含む細胞、および2を超える第12染色体シグナルを含むが、より少数のNAV3シグナル(例えば、3つの第12染色体動原体シグナルおよび1つのNAV3シグナル)を含む細胞をNAV3欠失を含む細胞と解釈した。動原体12−シグナルより頻繁なNAV3シグナルを示す細胞は、NAV3増幅を含む細胞と解釈した。増幅を示す間期細胞の百分率が7%を超えるか、または欠失を示す間期細胞の百分率が4%を超える(平均+3標準偏差として通常のサンプル結果の正規分布から計算)ならば、試料は異常なNAV3であると考えた。細胞系CCL−228、CCL−230、CCL−248、RKO、LIM1215およびHCA7について、10〜47の中期をNAV3および動原体12につき分析し、6〜11の中期をアーム−MFISHにつき分析した。
NAV3 LOHアッセイは、従前に記載される (Hahtola Sら 2008, J Invest Dermatology 128: 2304-9)ごとく直腸結腸腫瘍試料で行った。加えて、白人/欧州人において0.493までのヘテロ接合性を示すNAV3遺伝子のエクソン19内のA/G多形性(rs1852464)を、SNuPE反応に用いた。
2症例以外の全てに同一の外科手術にて得られた所与の患者の腺腫および癌の試料間のNAV3コピー数の比較は、NAV3欠失が腺腫段階におけるFISH技術によって頻繁に検出できることも明らかにした(図1)。しかしながら、NAV3異常細胞の量は、組織学的悪性病変において常により高かった。同様に、LOHでの3つの腺腫のうちの2つにおいて、適合する癌は、大抵同様のパターンのLOHを示した。これは、NAV3異常を含む細胞を有する組織学的に良性の腺腫は、既に悪性腫瘍の特性を有し得ることを示唆する。
NAV3コピー数変化を含む細胞は、MSSタイプの結腸直腸の癌腫試料の40%に検出し;NAV3欠失または増幅のいずれかを含む細胞は試料の15%に検出したが、15%の試料はNAV3欠失だけを示し、10%は単独で低レベルのNAV3増幅(3〜5コピー)を有した。また、NAV3欠失を含む細胞は、MSI標本試料の12.5%および腺腫試料の23%に検出した。加えて、第12染色体の多染色体性を含む、最もしばしば、3または5コピーの細胞を、MSSタイプの結腸直腸の癌腫試料の70%、MSI標本試料の50%および腺腫試料の31%に検出した。FISH結果を図2に示す。
6種の異なるCRC樹立細胞系(CCL−228、CCL−230、CCL−248、RKO、LIM1215およびHCA7)および2種の正常な結腸細胞系(CRL−1541およびCRL−1539)を、NAV3特異的FISHで分析した(表2)。正常な結腸細胞CRL−1541およびCRL−1539は、第12染色体動原体シグナルに関してNAV3につき異常シグナルを示さなかったが、CRL−1539においては、8%の細胞はこれらのシグナル双方に四染色体であった。3種の細胞系(SW403、RKO、T84)は、NAV3の損失を含む中期の注目すべき部分を示した(SW−403およびT84は中期の90%以上およびRKOは中期の40%を超える;表2および図3)。近二倍体系CCL−228は、典型的には、1つの正常な第12染色体、NAV3シグナルの損失を含む2つの染色体異常、およびNAV3シグナルを含むが第12染色体動原体シグナルを含まない1つの染色体異常を示した。アームMFISHによってt(2;12)と解釈されたNAV3のもう一つの染色体への転座は、1つを除いてすべての中期に観察した(表2、図3)。
結腸直腸試料のNAV3異常は、統計的有意差を持って、第12染色体の多染色体性およびおよびリンパ節転移と関連した(表3)。さらに、第12染色体の多染色体性は、高度の悪性を持った腫瘍において、よりしばしば生じた(表3)。
表3。
55の星状細胞腫、20の乏突起膠腫、13の上衣腫、18の髄芽腫および13の神経芽腫の全体で119の脳腫瘍ケースを、FISHを用いてNAV3遺伝子コピー数変化および第12染色体の多染色体性につき分析した(表4参照)。NAV3欠失、NAV3増幅および第12染色体の多染色体性についてのカットオフレベルは、各々、4%、7%および10%であった。
アレイCGH
DNAを標準プロトコールによって50マイクロメートルのパラフィン包埋組織切片から抽出した。参照DNAは、4名の健康な男性および女性からフィンランド赤十字にてプールされた血液から抽出した。次いで、製造者(Agilent Technologies, Santa Clara, USA)のプロトコールに従い、消化、標識し、244Kのオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズした。試料は、DNAマイクロアレイスキャナで走査し、Feature ExtractionおよびCGH解析ソフトウェア(Agilent Technologies, Santa Clara, USA)を用いて解析した。解析は、z−スコアおよび1Mb遊走平均ウィンドウを用いて行った。+/−0.4下のLog2−値は、異常であると考えられなかった。3種の結腸癌細胞系および2種の結腸癌腫瘍試料をこの方法を用いて用いて解析した。
患者材料からの2つの試料および、3種のCRC樹立細胞系CLL−230、CLL−248およびCLL−228に対してアレイ−CGH試験を行った。アレイ−CGHデータは、患者試料のうちの1つにNAV3座にわたる12q21における欠失を示し、それにより、FISH結果を確認した(この患者試料は、FISH法によって41%のNAV3の欠失細胞を有した)(図4)。しかしながら、他の患者試料は、恐らくその試料中のNAV3異常細胞の不十分な比例数により、この解析において正常の結果を示した(28%の細胞は、FISH分析でNAV3シグナルの増幅を示す)。培養された癌細胞の中で期待されるように、結腸癌細胞系のアレイ−CGH分析は、第12染色体ならびに他の染色体のFISHで明らかにされた主要な改変におけるNAV3損失を示す。CLL−230系において、NAV3座にわたる広範囲の欠失を12qに検出した。この欠失は他の(2種の)細胞系(CLL−248およびCLL−228)に検出されず、今度は、その染色体の他の部分の増幅を示した。
RNAiおよび遺伝子発現マイクロアレイ
方法
in vitroでのNAV3−遺伝子発現抑制
NAV3遺伝子をプールしたsiRNAオリゴ (On-Target SMART pool, Dharmacon, Chicago, IL, USA)で抑制させた。そのオリゴのその具体的な配列は、以下の通りである:5’−GGACUUAACCUAUAUACUA−3’(配列番号:4)(エクソン12)、5’−GAGAGGGUCUUCAGAUGUA−3’(配列番号:5)(エクソン38−39)、5’−CAGGGAGCCUCUAAUUUAA−3’(配列番号:6)(エクソン7)および5’−GCUGUUAGCUCAGAUAUUU−3’(配列番号:7)(エクソン30−31)。
NAV3によって調節された遺伝子を同定するために、NAV3標的RNAiによって誘導された遺伝子発現プロフィールの変化を、Agilent4×44K2重色マイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドプローブ(Biochip center, Biomedicum Helsinki, http://www.helsinki.fi/biochipcenter/)で測定した。この分析については、siRNAをトランスフェクトした細胞からの合計のRNA試料をトランスフェクションの6、24および48時間後に得た(CRL1541:6および48時間、CRL1539:6および24時間、A172:6および48時間、0205:6および48時間、一次表皮角化細胞(PEK):24および48時間)。
その2種の正常な結腸細胞系CRL−1541およびCRL−1539からのマイクロアレイデータ、およびNAV3発現抑制オリゴまたは対照オリゴでトランスフェクトした膠芽腫細胞および一次表皮角化細胞からのデータを分析した。プローブ強度は、Agilent Feature Extractor 9.1.3.1を用いるLOWESSで背景補正し標準化した。各試料について、各試料内の倍変化を計算し、最高発現を含む200のプローブおよび最低発現を含む200のプローブが差動的な発現と考えられた。すべての正常な結腸細胞系および腫瘍試料中で一貫して差動的に発現した遺伝子は、PathwayExpress(Draghici S.ら 2007, Genome Res 17(10): 1537-45)を用いて、計算上の経路分析に用いた。この方法において、差動的に発現した遺伝子の発現値を用いて、KEGGデータベース[REFE: PMID: 18477636]中の経路を示すためのインパクト・ファクターおよび関連p値を計算し、経路のトポロジーを考慮した。
IL23RおよびGnRHRの効率的なNAV3発現抑制および上方制御をLight Cycler qRT−PCRおよびRNAインサイチューハイブリダイゼーションによって確認した。
NAV3遺伝子のノックダウン効率を評価するために、発明者らは、細胞系A172および0205のsiRNAトランスフェクト細胞のNAV3標的RNAインサイチューハイブリダイゼーションを行った。NAV3の発現を非トランスフェクト細胞および組換えオリゴでトランスフェクトした細胞と比較した。略言すると、NAV3 mRNA転写体をエクソン37−39を認識するプローブで検出し、45℃で一晩ハイブリダイゼーションした。
RNAプローブの調製
RNAプローブを以下のオリゴヌクレオチド(エクソン37−39:アンチセンス 5’−TTGGCTGCTTCTTGGAGTTT−3’(配列番号:14)、センス 5’−CACCAAATCTAGAGCTGCATCA−3’(配列番号:15)を働かせるNAV3遺伝子の特定のエクソン位置に基づいて生成した。得られたPCR生成物をpCR(登録商標)II−TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen)中でクローン化した。RNAプローブは、製造者の指示に従い、DIG RNA標識付けキット(SP6/T7, Roche)を用いて標識した。
細胞系A172および0205を無菌スライドガラス(LAB-TEK II chamber Slide w/Cover RS Glass Slide, Nalge Nunc International)上で培養し、4%パラホルムアルデヒド(MERCK)−PBSで室温にて15分間固定した。スライドをPBSで濯ぎ、1%のPFA−PBS(7分間および+4〜8℃)で再固定した後、PBSで再洗浄した。スライドは、0.1Mトリエタノールアミン(TEA, Riedel-de Haan)pH8.0−0.25%無水酢酸(MERCK)中でアセチル化し、4×SSC−50%脱イオン化ホルムアミドで予めハイブリダイズした。インサイチューハイブリダイゼーションは、変性DIG−RNAアンチセンスプローブ(4ng/μl)またはセンスプローブ(19ng/μl)を含有するハイブリダイゼーション溶液を用いて、45℃にて一晩加湿チャンバーで行った。ハイブリダイゼーション後のスライドを37℃水浴(1×10分間、1×5分間の2×SSCおよび2×5分間の1×SSC)で予め暖めた緩衝液で洗浄し、RNAの過剰を37℃で30分間リボヌクレアーゼ(20μg/mlリボヌクレアーゼA、Sigma;500mM NaCl;10mMトリスpH8.0;1mM EDTA)で除去した。洗浄後、ハイブリダイズしたプローブをブロッキング溶液中で1:1000に希釈した抗−DIGアルカリホスファターゼFabによって免疫学的に検出した。スライドを洗浄し、色基質溶液(0.002mM新鮮なレバミソール(Vector Laboratories)を含有する検出緩衝液中の1:50 NBT/BCIP Stock Solution(Roche))と加湿チャンバーで一晩インキュベートした。反応を終了するために、スライドを洗浄し、簡潔に水で濯ぎ、0.1%のKernchrot(1×5分間, Gurr, BDH Chemicals)で対比染色した。すべての試薬および機具をピロ炭酸ジエチル(DEPC)で処理したか、またはRNアーゼを含まなかった。
GnRHRおよびIL23Rの発現の上方制御で生じたNAV3遺伝子発現抑制
正常な結腸細胞系
NAV3のin vivo関連標的遺伝子を同定するために、発明者らは、NAV3を発現抑制した正常結腸細胞CRL−1541およびCRL−1539(正常なNAV遺伝子コピー数を持つ)の遺伝子発現プロフィールを検討した。これらの実験において、発明者らは、NAV3を発現抑制した正常結腸細胞中で常に上方制御された39の遺伝子のうち、発癌に関与する2つのキーとなる受容体の上方制御を同定した。第1に、PathwayExpressを用いて、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体(GnRHR)経路を統計学的にかなり富化されることを同定し(複合仮説はp値<0.001で修正した)、この結果は転写変異体1のGNRHRの上方制御によって駆動され、4.7〜32.4の倍変化であった。第2に、Jak−STAT経路は、わずかに統計的に有意であることを同定し(修正されたp値<0.058)、インターロイキン23受容体(IL23R)の上方制御によって影響され、3.4〜14.01の倍変化であった。これらの受容体の上方制御は、選択された試料中でqRT−PCRによって確認された。図5を参照されたし。
マルチカラーFISHを用いて、NAV3シグナル数を動原体12シグナル数と比較し、その後、細胞を通常、増幅または欠失したNAV3シグナルのいずれを有するかを規定した。検討した細胞系CRL−1541、CRL−1539、0205およびA172は、NAV3異常のない細胞より主になることを示し(表7)、従って、NAV3発現抑制検討のために適当であった。NAV3の効率的な発現抑制は、qRT−PCRおよびRNAインサイチューハイブリダイゼーションによって確認した(図6および7)。また、Agilent4×44kマイクロアレイ上に存在するNAV3用の双方のプローブを0.26の中央倍変化で過小発現し、これは、NAV3発現抑制が有効であることを示す。全方法は、すべての検討時点で、すべての細胞タイプにおけるNAV3の一貫した下方制御を示した。
遺伝子オントロジーベースのクラスタリングをNAV3欠乏により影響された生物学的プロセスを同定するために行った。GO分析用遺伝子数を増加させるために、発明者らは、10の実験のうちの7つに上方制御された52の遺伝子に対してクラスタリングを行った。この群から、発明者らは4つのGOクラスター(図8):膜(9の遺伝子)、イオン輸送(2つの遺伝子)、核(4つの遺伝子)およびリボヌクレオチド結合(2つの遺伝子)を同定した。リボヌクレオチド結合クラスターは、2つの遺伝子:グリセロールキナーゼおよびARL11を含んだ。グリセロールキナーゼは、グリセロールの摂取および代謝の調節におけるキー酵素であるが、ARL11(またはARLTS1)は、ヒト発癌における改変された多数の調節経路に関与することが知られた小さなGTPアーゼのRasーのスーパーファミリーのARFファミリーに属する。
G1 GAL3ST1 GK RDHE2 CECR1
G2 AQP10 ENST00000327625 CLCA3
G3 GNRHR OPRK1 DNER IL23R FLJ33641
G4 BCL6B FAM107A
組織試料におけるIL23Rおよびβ−カテニン免疫組織化学
IL23Rおよびβ−カテニン発現は、パラフィン包埋大腸生検法から調製した組織マイクロアレイ中の免疫組織化学により検討した。各患者から、組織学的に正常な結腸からの対での試料およびその結腸腫瘍からの2つの試料を、そのアレイに含めた。また、10名の患者からの腺腫様の病変の対での試料および正常結腸からのもう一つの試料を含んだ。全体で57名の患者の43のMSS腫瘍試料、14のMSI腫瘍試料、14の腺腫試料および57の対応する正常結腸試料を組織マイクロアレイに含めた。
カテゴリー変数間の相関をカイ二乗検定または、有効でない場合には、フィッシャーの直接確率法を用いて解析した。生存率分析は、主要終点として結腸癌によって引き起こされた死亡を用いて行った。追跡調査時間は、政府系機関のフィンランド統計局から得た。SPSSバージョン15.0ソフトウェア(SPSS, IL, USA)を用いた。
次いで、β−カテニン(GnRH経路に連結した)およびIL23R発現の免疫組織化学的検出は、43のMSS(同一患者の8の腺腫試料を含む)および14のMSI患者試料(腫瘍および対応する正常結腸上皮)を含む組織マイクロアレイで行った。これらのケースのすべての正常結腸試料において、β−カテニン染色は常に膜性であり、3つのケース(図9)を除いて、全くIL23R発現が見出されないか、または弱いIL23R発現(グレード1)だけが見出された。
GnRHR免疫染色は、900ワットにて24分間の電子レンジ中で、室温にて20分間の冷却し、pH9.0のトリス−EDTA緩衝液を用いて抗原検索後にLabVision immunostainer(Labvision, CA, USA)を行った。GnRHRは、クロモゲン(図11)としてジアミノベンジジン(DAB)を含む、マウスモノクローナル抗体(1:10希釈, Abcam, Cambridge, UK)およびポリマーベースの検出システム(Envision, K5007, DakoCytomation)を用いて検出した(図11)。
NAV3発現抑制0205細胞中のGnRHRタンパク質レベルの上方制御を免疫染色により示した。GnRHR染色は野性型細胞およびsiRNA組み換え対照トランスフェクト細胞よりNAV3発現抑制細胞においてより高かった(図11、a〜c)。また、CRC組織試料中のGnRHRタンパク質免疫染色は正常な結腸上皮(図11d)においてよりも高かった。結果は、2つの典型的なCRC患者試料、MSSタイプCRCを持つ1つの症例、および腫瘍(NAV3欠失についてのカットオフは、早期に報告したごとく正常な参照試料において3%である、図11e)におけるNAV3欠失細胞の41%、MSIタイプCRCの1つの症例、および腫瘍(図11f)中のNAV3欠失細胞の8%(図11f)において再現可能であった。同様に、GNRHRおよびIL23Rの上方制御は、欠失のない神経膠腫瘍と比較して、NAV3欠失を示す予備的な一連の膠芽腫(星状細胞腫)試料中で観察した(図11gおよびh)。
Claims (16)
- 対象における腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示す方法であって、
i)対象からの生物学的試料中のNAV3コピー数変化を決定し;次いで
ii)対象からの生物学的試料またはもう一つの生物学的試料中のIL23R、GnRHRおよびβ−カテニンよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を決定し;
iii)NAV3コピー数変化、ならびにIL23R、GnRHRおよびβ−カテニンよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現の双方が、該対象からの試料に存在する場合に、対象の腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示す
ことを含み、NAV3コピー数変化が、NAV3遺伝子またはその主要部分の欠失または転座によって引き起こされ、またはNAV3が不活性化または低発現されることを特徴とする該方法。 - in vitro方法であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 対象におけるNAV3コピー数変化を含み、かつIL23R、GnRHRおよびβ−カテニンよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子および/または遺伝子産物の過剰発現を含み、NAV3コピー数変化が、NAV3遺伝子またはその主要部分の欠失または転座によって引き起こされ、またはNAV3が不活性化または低発現される、腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示すための、NAV3遺伝子または遺伝子産物、ならびにIL23R、GnRHRおよびβ−カテニンよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子および/または遺伝子産物の使用。
- NAV3欠失がNAV3の全体的または部分的な欠失であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1記載の方法または使用。
- NAV3コピー数変化が、FISH、LOH、CGH、配列解析、免疫組織化学、PCR、qPCRまたは組織マイクロアレイによって確認されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1記載の方法または使用。
- 腫瘍が、直腸結腸腫瘍、脳腫瘍または表皮角化細胞腫瘍であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1記載の方法または使用。
- 腫瘍が、良性腫瘍または悪性腫瘍であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1記載の方法または使用。
- 腫瘍が癌であることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1記載の方法または使用。
- 遺伝子および/または遺伝子産物が、活性化、不活性化、過剰発現または低発現するか、または遺伝子産物の量が増加または減少することを特徴とする請求項1〜8のいずれか1記載の方法または使用。
- NAV3コピー数変化を含み、かつIL23R、GnRHRおよびβ−カテニンよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を含む腫瘍の存在が、リンパ節転移、高度の悪性および/または貧弱な生存に関係することを特徴とする請求項1〜9のいずれか1記載の方法または使用。
- IL23R、GnRHRおよびβ−カテニンよりなる群から選択される遺伝子が、膜タンパク質、細胞プロセス調節タンパク質またはプリンヌクレオチド結合蛋白質であるタンパク質をコードすることを特徴とする請求項1〜10のいずれか1記載の方法または使用。
- 遺伝子または遺伝子産物が、IL23Rおよび/またはGnRHRであることを特徴とする請求項1〜11のいずれか1記載の方法または使用。
- 遺伝子産物がタンパク質であることを特徴とする請求項1〜12のいずれか1記載の方法または使用。
- 生物学的試料中のNAV3コピー数変化を検出するための手段、ならびにIL23R、GnRHRおよびβ−カテニンよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子または遺伝子産物の過剰発現を検出するための手段を含む、診断用キット。
- 腫瘍または細胞の亜集団の悪性形質を示すための請求項14記載の診断用キット。
- 脳腫瘍が神経膠腫であることを特徴とする請求項6記載の方法または使用。
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