CN111630183A - 透明细胞肾细胞癌生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本文公开了透明细胞肾细胞癌(ccRCC)生物标志物组,所述生物标志物组包括选自由ZNF395、SMPDL3A、SLC28A1、SLC6A3、VEGFA、EGLN3组成的组的至少2种生物标志物,其中所述至少两种生物标志物中的一种为SMPDL3A或SLC28A1。本文还公开了一种使用本文公开的生物标志物组的检测系统、确定受试者是否患有透明细胞肾细胞癌或显示透明细胞肾细胞癌复发的方法、确定肾肿块样品是良性还是恶性的方法、检测受试者对全身治疗的反应的方法以及用于进行所述方法的试剂盒。

Description

透明细胞肾细胞癌生物标志物
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月5日提交的新加坡申请第10201707218R号的优先权权益,其内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
发明领域
本发明涉及分子生物学,特别是生物标志物。特别地,本发明涉及与透明细胞肾细胞癌(ccRCC)相关的生物标志物及其方法和用途。
发明背景
肾细胞癌(RCC)由于经常在晚期诊断出和差的治疗选择而成为最致命的癌症之一。成功治愈该疾病取决于RCC的早期检测和恶性细胞的完全切除。由于肾位于腹膜后间隙深处,因此肾细胞癌在早期主要是无症状的,并且一经诊断出,肿瘤大和/或转移。肾细胞癌的三种最常见的亚型是透明细胞肾细胞癌、乳头状肾细胞癌和嫌色性肾细胞癌。透明细胞肾细胞癌是最常见的亚型,占所有肾细胞癌的75-90%,并且在2012年,全球有338,000例新病例。
由于大多数透明细胞肾细胞癌耐受化学疗法和放射疗法,患有转移性透明细胞肾细胞癌的患者表现出令人沮丧的8%的5年总生存期。甚至早期肿瘤在手术后仍处于转移进展的风险,其中20-40%的患者具有复发。因此,鉴定这种高风险的肾细胞癌患者组仍是一个挑战。此外,肾细胞癌的不同亚型具有不同的预后和治疗反应率。因此,至关重要的是能够区分肾细胞癌的不同亚型。
先前用于诊断患有透明细胞肾细胞癌的患者的方法包括侵入性方法,包括肿瘤活组织检查,或成像方法(包括超声成像或磁共振成像)。然而,基于已知的方法,难以确定小于4cm的肾肿块(mass)是否是肿瘤和/或难以基于单独的成像研究确定肿瘤是良性还是恶性的。约50%至60%的肾肿块小于4cm,其中25%至30%为良性肿瘤。小的肾肿块的过度治疗风险的范围为从直径小于1cm的病灶的40%到直径为3至4cm的肿块的17%。除初步诊断外,用于治疗后随访或主动监测的主要工具也仅包括成像研究。手术或消融会导致组织变化和瘢痕形成,导致局部复发的检测具有挑战性。最后,还缺乏评估晚期透明细胞肾细胞癌患者中全身治疗的效率的方法。鉴于上述情况,对鉴定透明细胞肾细胞癌的方法、区分良性病灶与恶性肿瘤的方法、检测局部治疗后复发的方法以及评估全身治疗的方法存在未被满足的需求。
发明概述
在一方面,本发明涉及透明细胞肾细胞癌(ccRCC)生物标志物组,其中所述生物标志物组包括选自由ZNF395、SMPDL3A、SLC28A1、SLC6A3、VEGFA、EGLN3组成的组的至少两种生物标志物,其中所述至少两种生物标志物中的一种为SMPDL3A或SLC28A1;其中生物标志物是蛋白或编码其的核酸或其变体。
在另一方面,本发明涉及检测系统,所述检测系统包括a)接收部分,所述接收部分接收来自被怀疑罹患透明细胞肾细胞癌的受试者的样品,并且其中所述样品被怀疑包含如本文公开的生物标志物组;和b)检测部分,所述检测部分包含能够检测如本文公开的生物标志物组的一种或更多种物质。
在一方面,本发明涉及确定受试者是否患有透明细胞肾细胞癌或是否显示出透明细胞肾细胞癌的复发的方法,其中所述方法包括获得来自所述受试者的样品;使用如本文公开的检测系统检测所述样品中如本文公开的生物标志物组的存在,其中生物标志物组的存在确定所述受试者患有透明细胞肾细胞癌或显示出透明细胞肾细胞癌的复发。
在另外的方面,本发明涉及检测受试者对全身治疗的反应的方法,所述方法包括a)获得来自所述受试者的样品;和b)确定所述样品中如本文定义的生物标志物组的水平;其中生物标志物组水平的降低或缺乏指示所述受试者对治疗有反应。
在又另一方面,本发明涉及确定肾肿块样品是良性还是恶性的方法,所述方法包括获得来自受试者的肾肿块的样品;确定所述样品中如本文公开的生物标志物组的水平或存在或不存在;其中,与良性样品相比,生物标志物组水平的增加指示所述样品是恶性的。
在另一方面,本发明涉及用于实施如本文公开的方法的试剂盒,其中所述试剂盒包含检测缓冲液、裂解缓冲液以及如本文定义的适于检测如本文公开的生物标志物组的一种或更多种物质。
在另外的方面,本发明涉及用于检测如本文定义的生物标志物组的如本文公开的试剂盒和如本文公开的检测系统。
附图简述
当结合非限制性实例和附图考虑时,参考详细描述,本发明将被更好地理解,在附图中:
图1示出了von Hippel-Lindau(VHL)缺陷的透明细胞肾细胞癌肿瘤表现出异常的顺式调控模式(landscape)。图1A显示了示出正常肾组织的组蛋白染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)(H3K27ac、H3K4me3和H3K4me1)峰与Epigenomics Roadmap数据集中成人肾组织的峰的重叠百分比的图。图1B显示了示出五种原发性透明细胞肾细胞癌肿瘤和源自这些肿瘤的细胞系之间的组蛋白ChIP-seq(H3K27ac、H3K4me3和H3K4me1)峰的重叠百分比的图。图1C显示了表和图,该表和图示出推定活性启动子是由转录起始位点(TSS)附近2千碱基(kb)内H3K4me3、H3K27ac的共现(co-occurrence)而定义的;且推定活性增强子是由H3K4me1、H3K27ac的存在以及启动子的排除而定义的。表进一步示出鉴定的推定启动子和推定增强子的总数;以及在这项研究中鉴定的增益的启动子、损失的启动子、增益的增强子和损失的增强子的总数。图1D显示了示出使用全部17,497个启动子和66,448个增强子将正常样品和肿瘤样品分类为不同簇的主成分分析(PCA)的图。图中的数字描绘了以下患者ID:1-12364284;2-17621953;3-20431713;4-40911432;5-57398667;6-70528835;7-74575859;8-77972083;9-86049102和10-75416923。图1E显示了示出跨越越来越多的原发性样品的预测的启动子或增强子的总数的饱和分析的图。预测的启动子总数在4个或更多个样品时饱和,而预测的增强子总数在16个或更多个样品时饱和。虚线指示通过整合全部10个正常肿瘤对(n=20)的预测的调控元件总数。晶须(whisker)指示标准偏差。图1F显示了描述启动子或增强子的由来自归一化的H3K27ac信号的每个主成分捕获的方差的图和表。表中指示了累计的方差百分比。图1G显示了变化的启动子和增强子的数目/患者的图。图1H显示了以不同的递归(recurrence)截止,通过配对t检验和Benjamini-Hochberg校正(q值<0.10)定义的满足统计显著性的变化区域的分数图。图1I显示了满足统计显著性的区域分数差异的图。启动子在n≥5时达到鞍点,而增强子在n≥6时达到鞍点。图1J显示了在配对患者组织(患者40911432)中具有改变的启动子和增强子的H3K27ac水平的热图。高信号水平以白色反射,而低信号水平以黑色反射。图1Ki和图1Kii显示了涉及10个正常肿瘤对中H3K27ac染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq)信号的实例的图,其中显示了增益的启动子、损失的启动子、未改变的启动子、增益的增强子、损失的增强子和未改变的增强子。N是指来自正常组织的信号,且T是指来自肿瘤组织的信号。图1L显示了增益的启动子和增益的增强子的H3K27ac水平、染色质可及性和DNA甲基化的箱形图。将正常组织和肿瘤组织之间最接近的透明细胞肾细胞癌长编码RNA(lncRNA)的基因表达进行比较。***p值<0.001,双侧t检验。图1M显示了涉及患者40911432的肿瘤正常组织样品对中CCND1基因座处的组蛋白ChIP-seq信号(H3K27ac、H3K4me1、H3K4me3)、RNA-Seq信号和FAIRE-Seq信号的图。为了比较,将来自EpigenomeRoadmap的正常成人肾组织的组蛋白ChIP-seq谱图显示在通过Nano-ChIP-seq生成的正常组织谱图的上方。将源自肿瘤组织的细胞系的组蛋白谱图显示在正常组织谱图的下方。
图2显示了增强子畸变(aberration)是透明细胞肾细胞癌的特征。图2A显示了通过GREAT算法揭示的与增益的启动子和增益的增强子相关的富集途径的条形图,其通过二项式FDR q值排序。图2B示出了涉及VEGFA的组蛋白染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq)谱图的图。从头增强子在透明细胞肾细胞癌肿瘤组织中在VEGFA上游获得。Capture-C确认了786-O细胞中该VEGFA增强子(E)与其启动子(P)的相互作用。弧线表示通过r3Cseq检测的显著相互作用(q<0.05)。该增强子的输入消减的H3K27ac信号与VEGFA基因表达高度相关(Spearman相关性)。图2C示出了涉及SLC2A1/GLUT1的组蛋白ChIP-Seq谱图的图。从头肿瘤增强子与SLC2A1/GLUT1启动子相互作用。图2D和图2E示出了涉及(D)PLIN2和(E)SLC38A1的组蛋白ChIP-Seq谱图的图,其中在过表达的相应透明细胞肾细胞癌致癌基因PLIN2和SLC38A1附近的启动子和增强子增益。图2F显示了肿瘤启动子和增强子的前5个基因本体的分子功能的图。图2G显示了涉及VEGFA和SLC2A1的基因表达与它们在10个肿瘤样品及其匹配的正常样品中预期的增强子的输入消减的H3K27ac水平之间的Spearman相关性的点状图。图2H显示了涉及由显著的Capture C相互作用跨越的距离的累积分布的图。
图3示出了通过肿瘤超级增强子鉴定的关键致癌驱动物(driver)。图3A显示了涉及通过ROSE鉴定并通过它们在正常组织和肿瘤组织之间的差异H3K27ac强度进行排序的总计1,451个超级增强子的图。列出了与增益的和损失的超级增强子相关的基因。图3B显示了涉及PVT1/MYC基因的RNA测序(RNA seq)、组蛋白染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)和Capture C谱图的图。Capture C显示了c-Myc启动子和超级增强子之间的染色体相互作用。图3C显示了涉及EPAS1基因的RNA seq和组蛋白ChIP-seq的图。组蛋白ChIP-Seq证实了在PVT1/MYC(图3B)和EPAS1(图3C)基因座处的增益的超级增强子分别与肾细胞癌风险等位基因重叠。图3D显示了癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas;TCGA)RNA-seq数据的热图,表明与前10个增益的增强子相关的基因在肿瘤中上调,而与前10个损失的增强子相关的基因则下调。这种肿瘤特异性限于透明细胞肾细胞癌,但不限于其他两种肾细胞癌亚型,即乳头状和嫌色性肾细胞癌亚型。不受理论束缚,基于示出的p值和肿瘤/正常比率(T/N),认为ZNF395、SLC28A1、SMPLD3A、VEGFA和EGLN3能够将透明细胞肾细胞癌与其他主要肾细胞癌亚型区分开。图3E涉及通过实时PCR(RT-qPCR)在一组正常肾细胞系和透明细胞肾细胞癌细胞系中测量的ZNF395和SMPDL3A的表达的图。图3F显示了将一组透明细胞肾细胞癌细胞系中ZNF395的蛋白表达进行比较的免疫印迹。图3G涉及指示针对ZNF395的汇集的siRNA抑制了透明细胞肾细胞癌细胞系A-498和786-O的集落形成,但是不抑制HK-2正常的永生化肾细胞的集落形成的图像。针对SMPLD3A的汇集的siRNA抑制A-498的集落形成,但不抑制786-O的集落形成。图3H显示了如通过实时PCR(RT-qPCR)测量的HK-2、786-O和A498细胞中SMPDL3A和ZNF395的siRNA敲低效率的图。图3I涉及具有H3K27ac ChIP-seq的组蛋白ChIP谱图的图,显示了仅在透明细胞肾细胞癌细胞(A-498和786-O)中而非正常肾细胞(PCS-400、HK-2)中的活跃的ZNF395超级增强子。图3J涉及具有肿瘤/正常对的H3K27ac和H3K4me3ChIP-seq的组蛋白ChIP谱图的图,显示了SMPLD3A或SLC28A1与透明细胞肾细胞癌特异性超级增强子相关。图3K(图3Ki、3Kii和3Kiii)涉及具有肿瘤/正常对的H3K27ac、H3K4me3和H3K4me1 ChIP-seq的组蛋白ChIP-seq谱图的图,显示了肿瘤中基因SLC6A3、EGLN3或VEGFA的启动子和增强子的增益。图3L至图3P涉及显示从癌症基因组图谱(TCGA)获得的表达数据的图。图3L显示了SMPDL3A在一组癌症中的表达,其中最高表达存在于透明细胞肾细胞癌(KIRC)(透明细胞肾细胞癌的TCGA符号)中。图3M显示了SLC28A1在一组癌症中的表达,其中最高表达存在于透明细胞肾细胞癌(KIRC)中。图3N显示了SLC6A3在一组癌症中的表达,其中最高表达存在于透明细胞肾细胞癌(KIRC)中。图3O显示了VEGFA在一组癌症中的表达,其中最高表达存在于透明细胞肾细胞癌中。图3P显示了EGLN3在一组癌症中的表达,其中最高表达存在于透明细胞肾细胞癌(KIRC)中。图3Q涉及具有癌症基因组图谱(TCGA)RNA-seq数据的箱形图,其显示了ZNF395在12种癌症类型中的唯一过表达。图3R显示了涉及通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测量的786-O和A-498细胞中ZNF395水平的shRNA敲低效率的图。图3S示出了涉及通过免疫印迹测量的786-O和A-498细胞中ZNF395水平的shRNA敲低效率的免疫印迹。图3T显示了两个shRNA克隆对ZNF395的抑制作用的图像,这两个shRNA克隆减少了786-O和A-498细胞中的集落形成。图3U涉及两个shRNA克隆对ZNF395的抑制作用的图,这两个shRNA克隆减少了体外增殖。图3V显示了两个shRNA克隆对ZNF395的抑制作用的图,这两个shRNA克隆增加了通过胱天蛋白酶3/7底物裂解测量的凋亡。*p值<0.05,双侧t检验。图3W显示了在786-O和A-498细胞中在ZNF395 shRNA敲低之后通过流式细胞术分析的膜联蛋白V染色的直方图。图3X涉及显示shRNA对ZNF395的抑制作用的线图,该shRNA导致体内A-498肿瘤的完全消除和786-O细胞肿瘤生长的延迟。阴性对照(NC):n=7;shZNF395-1:n=7;shZNF395-2:n=6。
图4示出了VHL缺乏重塑了透明细胞肾细胞癌增强子。图4A显示了涉及具有和不具有VHL恢复的786-O、A-498和12364284细胞系的体外增殖的图。通过CellTiterGlo测量增殖率,并针对接种天数归一化。EV是指空载体对照,且VHL是指恢复的野生型VHL。图4B涉及具有和不具有VHL恢复的786-O、A-498和12364284细胞系的体外集落形成的图。通过将10,000个细胞接种在孔中并允许集落形成直到孔汇合来测量集落形成率。EV是指空载体对照,且VHL是指恢复的野生型VHL。图4C显示了涉及具有和不具有VHL恢复的786-O、A-498和12364284细胞系的凋亡的图,所述凋亡通过胱天蛋白酶3/7底物裂解测量并针对空载体对照归一化。EV是指空载体对照,且VHL是指恢复的野生型VHL。图4D示出了其中对裸鼠中786-O皮下肿瘤的体内生长的具有和不具有VHL恢复的同基因细胞进行比较的图。EV是指空载体对照,且VHL是指恢复的野生型VHL。图4E显示了在786-O细胞中在VHL恢复之后如在原代透明细胞肾细胞癌数据集中定义的增益的启动子、增益的增强子和增益的超级增强子处的H3K27ac染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)信号的对数倍数变化的点状图。点表示在VHL恢复之后H3K27ac水平具有显著变化(p值<0.05,负二项式)的顺式调控元件。变化区域(p值<0.05,负二项式)的数目和百分比在右上角和右下角显示出。图4F、图4G和图4H显示了在(图4F)A-498细胞、(图4G)12364284细胞和(图4H)40911432细胞中在VHL恢复之后增益的启动子、增益的增强子和增益的超级增强子处的H3K27ac ChIP-seq信号的对数倍数变化的点状图。点表示p值<0.05。变化区域的数目和百分比在右上角和右下角显示出。EV是指空载体对照,且VHL是指恢复的野生型VHL。图4I显示了与VHL野生型透明细胞肾细胞癌、正常肾细胞系和其他31种癌症细胞系相比,VHL突变的透明细胞肾细胞癌细胞系中VHL响应性增强子处的H3K27ac ChIP-seq的读段覆盖率的箱形图。显示了在VHL恢复之后H3K27ac耗竭或富集的增强子。图4J涉及显示在786-O细胞中在VHL恢复之后与VHL响应性肿瘤增强子相关的基因表达变化的箱形图。*p值<0.05,双侧t检验。图4K显示了在12364284细胞中与VHL响应性肿瘤增强子相关的基因表达变化的箱形图。*p值<0.05,双侧t检验。图4L涉及增益的增强子的频率的条形图,其显示了在患者中在VHL恢复之后H3K27ac耗竭。图4M显示了增益的增强子处差异H3K27ac ChIP-seq信号的无监督分层聚类的热图,其显示了在VHL恢复之后H3K27ac耗竭。图4N显示了ZNF395超级增强子处全部10个肿瘤/正常对的H3K27ac ChIP-seq信号的图。图4O、图4P和图4Q显示了在786-O细胞中与EGFR(图4O)、CCND1(图4P)和ITGB3(图4Q)相关的损失的VHL响应性增强子/超级增强子的实例的组蛋白ChIP seq信号的图。图4R显示了在786-O细胞中与SLC2A1相关的损失的VHL响应性增强子的实例的组蛋白ChIP信号的图。图4S显示了在786-O细胞中与VEGFA相关的损失的VHL响应性增强子/超级增强子的实例的组蛋白ChIP seq信号的图。图4T显示了在786-O细胞中与HK2相关的损失的VHL响应性增强子的实例的组蛋白ChIP信号的图。图4U显示了在VHL恢复之后在786-O和12364284中H3K27ac和H3K4me1的对数倍数变化的Pearson相关性的点状图。(删除,因图中没有颜色)图4V显示了在VHL恢复之后在786-O和12364284中H3K27ac和H3K27me3的对数倍数变化的Pearson相关性的点状图。图4W涉及在增益的增强子处H3K27ac、H3K4me1和H3K27me3信号的对数倍数变化的热图,其显示在786-O细胞中在VHL恢复之后H3K27ac耗竭。
图5示出了HIF2α在VHL响应性肿瘤的增强子处富集。图5A涉及使用HOMER对增益的增强子进行基序分析的表,揭示了AP-1家族、ETS家族、NFκB和HIF1α/2α的显著富集(超几何检验)。损失的增强子被用作基序搜索中的背景,以鉴定肿瘤特异性转录因子。图5B显示了在9种肿瘤细胞系(4种商业细胞系和5种患者来源的细胞系)和2种正常细胞系中在增益的增强子处富集的推定转录因子的蛋白表达的免疫印迹。ACHN是乳头状肾细胞癌细胞系。图5C显示了癌症基因组图谱(TCGA)组群(RNA-Seq数据集)的73对正常肾和透明细胞肾细胞癌肿瘤中所选转录因子的基因表达的散点图。***p值<0.001,**p值<0.01,n.s.(不显著),配对t检验。图5D示出了显示染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)证实了增益的增强子的转录因子富集超过损失的增强子的图。图5E涉及具有和不具有野生型VHL的在786-O和12364284细胞中显示的转录因子的蛋白表达的免疫印迹。图5F示出了在VHL响应性增益的增强子处的转录因子结合的线图,其显示了在VHL恢复后,具有H3K27ac耗竭的增强子处HIF2α和HIF1β的富集超过具有H3K27ac富集的区域。图5G涉及使用ChIPseeker注释的786-O细胞中外源HIF1α和内源HIF2αChIP-seq结合位点的分布的饼状图。图5H显示了ChIP-Seq数据的饼状图,其显示了在经基因工程以过表达HIF1α的786-O细胞中在改变的启动子和增强子处的外源HIF1α和内源HIF2α结合的分布。图5I显示了使用ChIPseeker注释的40914432细胞中内源HIF1α和HIF2αChIP-seq结合位点的分布的饼状图。图5J显示了ChIP-Seq的饼状图,其显示了在40914432细胞中在改变的启动子和增强子处内源HIF1α和HIF2α结合的分布。图5K涉及显示在VHL响应性增强子处的转录因子结合的图,显示了与在VHL恢复之后具有H3K27ac富集的区域相比,在VHL恢复之后具有H3K27ac耗竭的增强子处HIF2α的富集程度高于HIF1α。图5L涉及具有在UBR4附近仅具有HIF2α结合但不具有HIF1α结合的VHL响应性增强子的实例的ChIP Seq的图。图5M涉及具有在CMIP附近仅具有HIF2α结合但不具有HIF1α结合的VHL响应性超级增强子的实例的ChIP Seq的图。
图6示出了HIF2α-HIF1β结合的增强子调节基因表达。图6A涉及所有基因或与HIF2α结合位点相邻的基因处VHL恢复或HIF2αsiRNA敲低后基因表达变化的Pearson相关性的点状图。图6B涉及所有增益的增强子或与结合位点相邻的HIF2α结合的增强子处VHL恢复和HIF2αsiRNA敲低后H3K27ac变化的Pearson相关性的点状图。图6C涉及所有增益的超级增强子或与结合位点相邻的HIF2α结合的超级增强子处VHL恢复和HIF2α siRNA敲低后H3K27ac变化的Pearson相关性的点状图。图6D涉及组蛋白染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq)谱图的图,显示了ZNF395超级增强子(SE)处VHL恢复或HIF2α siRNA敲低后RNAseq和H3K27acChIP-Seq信号的变化以及增强子处富集的转录因子的结合谱图。图6E涉及显示786-O细胞中VHL恢复和HIF2α siRNA敲低均降低了具有HIF2α结合的增强子的基因的表达的图。*p值<0.05,双侧t检验。图6F涉及显示786-O细胞中VHL恢复和HIF2α siRNA敲低均降低了通过萤光素酶报告物测定测量的增强子活性的图。*p值<0.05,双侧t检验。图6G涉及显示四个野生型克隆和四个ZNF395增强子通过CRISPR被耗竭的克隆中ZNF395表达的RT-qPCR测量的柱状图。在786-O细胞中的ZNF395超级增强子处,耗竭区域具有最高的HIF2α结合,其由剪刀上方的黑色条指示(图6D中指示的缺失区域)。*p值<0.05,双侧t检验。
图7显示VHL恢复减少了p300募集,但保留了启动子-增强子相互作用。图7A显示了基于染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq)的在增益的和损失的增强子处p300结合的富集的线图。图7B涉及显示HIF2α和其他转录因子之间重叠百分比的柱状图。图7C涉及HIF2α和p300的ChIP-Seq结合谱图的热图。图7D显示了如通过免疫印迹测量的在786-O和12364284细胞中具有和不具有VHL的p300的蛋白表达的免疫印迹。图7E显示了涉及在786-O细胞中具有和不具有VHL恢复的增强子处p300结合的ChIP-qPCR的图。NC是指阴性对照区域。图7F涉及显示在786-O细胞中具有和不具有HIF2αsiRNA敲低的增强子处p300结合的ChIP-qPCR的图。NC是指阴性对照区域。图7G显示了涉及在具有和不具有VHL恢复的786-O细胞之间在VHL响应性和非VHL响应性增强子处通过Capture-C测量的增强子相互作用的相关性的散点图(RPM–读段/百万)。图7H显示了涉及Capture-C的图,其显示VEGFA增强子-启动子相互作用即使在VHL恢复后仍维持。E是指增强子,且P是指启动子。图7I显示了在透明细胞肾细胞癌中VHL驱动的增强子畸变的示意图的图。图7J涉及786-O(透明细胞肾细胞癌细胞系)和KATO III(胃癌细胞系)的H3K27ac ChIP-seq和Capture C的组蛋白ChIP Seq谱图的图,显示SLC2A1增强子对透明细胞肾细胞癌是特异性的。
图8(图8A至8C)显示了根据从A498(透明细胞肾细胞癌细胞系)和HK-2(正常肾细胞系)获得的外泌体进行的分析的图。每个图显示相应标志物(如每个图的标题所示)的水平,所述标志物的水平是基于从相应细胞系分泌的外泌体(基于图例)检测的。每个图的y轴显示如通过定量聚合酶链式反应(qPCR)测量的这些标志物的基因表达。
图9显示了来自患有透明细胞肾细胞癌(ccRCC)或良性大嗜酸粒细胞瘤(B)的患者组群的微阵列数据分析的热图。比较了良性大嗜酸粒细胞瘤和透明细胞肾癌之间的VEGFA、EGLN3、ZNF395、SMPDL3A、SLC6A3和SLC28A1的表达水平。Z评分越高表示表达水平越高。
本发明的详细描述
肾细胞癌(RCC)是成人中最常见的肾癌类型,其中透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是肾细胞癌的常见亚型之一。肾细胞癌的其他亚型包括例如乳头状肾细胞癌(pRCC)和嫌色性肾细胞癌(crRCC)。肾肿瘤治疗中的一个特别的挑战是肾肿块可以代表的组织学和肿瘤表型的范围。肾肿瘤的范围为从良性到临床上惰性(indolent)恶性肿瘤到侵袭性疾病。侵袭性疾病的实例包括但不限于透明细胞肾细胞癌(ccRCC)。不同亚型的肾癌具有不同的治疗反应率和不同的预后。因此,适当治疗的关键是准确诊断肾细胞癌的不同亚型。
当前的诊断方法包括但不限于侵入性方法,包括来自肿瘤活组织检查的组织学(例如,通过特殊染料对糖原进行染色),对比增强的计算机断层摄影术(CT)扫描(其显示肿瘤的高血管供应(vascularity)),超声成像或磁共振成像(MRI)。然而,侵入性程序导致患者不适,需要局部或全身麻醉并且可能相对昂贵。来自活组织检查的组织学和包括CT扫描、MRI和超声成像在内的成像方法同样不能够准确地检测出肿瘤分期,导致频繁的误诊。鉴定透明细胞肾细胞癌患者的另一种选择是通过检测生物标志物来进行。然而,目前尚无经临床上验证的用于诊断透明细胞肾细胞癌的生物标志物。
鉴于以上问题,本公开内容的发明人已经提供了用于鉴定透明细胞肾细胞癌的生物标志物。因此,在一个实例中,公开了一种或更多种透明细胞肾细胞癌生物标志物。
如本文使用的,术语“透明细胞肾细胞癌”或“ccRCC”是指肾癌,即肾细胞癌(RCC)的最常见的亚型。肾癌是指在肾组织中形成的癌症,肾是过滤来自血液的废弃产物的器官。肾还参与调节血压、电解质平衡和体内红细胞产生。每个肾都连接到输尿管,输尿管是将排泄的尿液运送至膀胱的管。肾细胞癌是一种起源于近曲小管的衬里的肾癌,所述近曲小管是肾中运输初级尿液(primary urine)的非常小的管的一部分。肾细胞癌被分类为腺癌。伴随肾细胞癌的症状和影响在本领域中是公知的,例如血尿(尿液中的血液)、下背部疼痛或胁腹(flank)疼痛和/或胁腹的明显肿块。透明细胞肾细胞癌是肾细胞癌的最常见亚型,占所有肾细胞癌的75%至85%,并且也是肾细胞癌的最具侵袭性的类型。透明细胞肾细胞癌与3p号染色体(包括von Hippel-Lindau基因)的遗传损伤相关。经肉眼检查(grossexamination),透明细胞肾细胞癌通常为金黄色,并且经常发展为出血和梗塞,并在肿瘤内形成囊肿。透明细胞肾细胞癌的典型特征在于具有透明细胞质的恶性上皮细胞和紧凑的肺泡(alveolar)或腺泡(acinar)生长模式,其间散布着缠结的(intricate)、树枝状脉管系统。
如本文使用的,术语“肿瘤”是指形成肿块或生长物的一组异常细胞。肿瘤可以是癌性(恶性)、非癌性(良性)或癌前的。良性肿瘤通常由血管平滑肌脂肪瘤(angiomyolipoma)和大嗜酸粒细胞瘤(oncocytoma)组成。血管平滑肌脂肪瘤基于成像易于区分,而大嗜酸粒细胞瘤通过成像研究则难以区分。
如本文使用的,术语“癌(carcinoma)”是指起始于构成组织衬里器官(例如但不限于肝或肾)的表面(skin)的细胞(也称为上皮细胞)的癌症类型。常见的癌类型包括但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和肾细胞癌。在一个实例中,透明细胞肾细胞癌是指恶性肿瘤,而大嗜酸粒细胞瘤则是良性肿瘤或代表良性肿瘤。在另一个实例中,良性大嗜酸粒细胞瘤的SLC28A1、VEGFA、ZNF395、EGLN3和SLC6A3低。
当面对肾肿块时,难以区分是恶性肿瘤还是良性肿瘤。良性肿瘤通常由血管平滑肌脂肪瘤和大嗜酸粒细胞瘤组成。如本领域中进行的,血管平滑肌脂肪瘤的区分可以通过成像研究来进行。然而,基于单独的成像研究难以区分大嗜酸粒细胞瘤。因此,在一个实例中,公开了用于确定肾肿块样品是良性还是恶性的方法。在另一个实例中,确定肾肿块样品是良性还是恶性的方法,所述方法包括获得来自受试者的肾肿块的样品;确定所述样品中如本文公开的生物标志物组的水平或存在或不存在。在另一个实例中,与良性样品相比,这样的肾肿块样品中生物标志物组水平的增加指示所述样品是恶性的。在又另一个实例中,确定肾肿块样品是良性还是恶性的方法包括获得来自受试者的肾肿块的样品;确定所述样品中如本文公开的生物标志物组的水平或存在或不存在;其中,与良性样品相比,生物标志物组水平的增加指示所述样品是恶性的。
如本文使用的,术语“生物标志物”是指具有可被用于确定特定疾病或状况的存在或不存在和/或严重性的特定生物学性质、生化特征或方面(facet)的分子指示物。在本公开内容中,术语“生物标志物”是指与透明细胞肾细胞癌相关的多肽或编码该多肽的核酸序列、多肽的片段或变体。除了如本文公开的与透明细胞肾细胞癌肽相关的多肽或编码该多肽的核酸序列、这样的多肽的片段或变体之外,生物标志物还指表达的多肽的代谢物或代谢片段。本领域技术人员将理解,本文所指的生物标志物之一的代谢物仍可保留被用作用于本文所描述的方法的生物标志物的能力。还应注意,生物标志物组中的一些生物标志物可以以其变体形式或代谢形式存在,而其他生物标志物则仍然是原封不动的(intact)。如本文使用的,术语“变体”包括对基本相似序列的提及。通常,本发明的核酸序列变体编码保留与由“非变体”核酸序列编码的多肽共同的定性生物学活性的多肽。所述多肽的变体包括由于存在保守氨基酸取代而在它们的氨基酸序列上不同的多肽。例如,这样的变体具有与“非变体”多肽的氨基酸序列在整个序列区域至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的氨基酸序列。变体可以是等位基因变体、剪接变体或任何其他物种特异性同系物、旁系同源物或直系同源物。在一个实例中,同一性的百分比可以通过本领域中已知的算法来确定。以上列举的以百分比(%)计的序列同一性值优选使用本领域已知的程序,例如BLASTp等来确定。变体可以使用例如本领域公知的蛋白工程和定点诱变的方法来制备。
提供功能上相似的氨基酸的保守氨基酸取代表是本领域普通技术人员熟知的。以下六组是被认为是彼此保守取代的氨基酸的实例:i)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);ii)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);iii)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);iv)精氨酸(R)、赖氨酸(K);v)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);vi)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
非保守氨基酸取代可以由以下方面的改变引起:i)在取代区域中氨基酸骨架的结构;ii)氨基酸的电荷或疏水性;或iii)氨基酸侧链的体积(bulk)。通常预期产生蛋白性质最大变化的取代是这样的取代,在所述取代中,i)亲水性残基被取代为疏水性残基(或被疏水性残基取代);ii)脯氨酸被取代为任何其他残基(或被任何其他残基取代);iii)具有大的侧链的残基,例如苯丙氨酸,被取代为不具有侧链的残基例如甘氨酸(或被不具有侧链的残基例如甘氨酸取代);或iv)具有正电侧链的残基,例如赖氨酰基、精氨酰基或组胺酰基,被取代为负电残基例如谷氨酰基或天冬氨酰基(或被负电残基例如谷氨酰基或天冬氨酰基取代)。
如本文定义的,术语“肽”、“蛋白”、“多肽”和“氨基酸序列”在本文可互换使用,是指任何长度的氨基酸残基的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的,其可以包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物,并且其可以被除氨基酸以外的化学部分中断。该术语还包括天然地或通过干预被修饰的氨基酸聚合物;所述修饰例如,二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰,诸如与标记或生物活性组分的缀合。术语肽包含通过共价键(例如酰胺键)连接的两个或更多个天然存在的或合成的氨基酸。氨基酸残基通过酰胺键连接在一起。当氨基酸是α-氨基酸时,可以使用L-光学异构体或D-光学异构体,L-异构体本质上是优选的。如本文使用的术语多肽或蛋白包括任何氨基酸序列,并且包括但不限于修饰的序列,例如糖蛋白。术语多肽特别地预期覆盖天然存在的蛋白以及重组或合成产生的蛋白。
在一个实例中,透明细胞肾细胞癌蛋白生物标志物组包含选自由以下组成的组的至少两种:ZNF395、SMPDL3A、SLC28A1、SLC6A3、VEGFA、EGLN3及其变体,其中至少两种生物标志物之一是SMPDL3A或SLC28A1。在另一个实例中,透明细胞肾细胞癌(ccRCC)生物标志物组包含选自由以下组成的组的至少两种生物标志物:ZNF395、SMPDL3A、SLC28A1、SLC6A3、VEGFA和EGLN3。在另一个实例中,至少两种生物标志物之一是SMPDL3A或SLC28A1。在又另一个实例中,生物标志物是蛋白或编码其的核酸或其变体。
本文还公开了包含如本文公开的生物标志物组的组合物。
如本文使用的,术语“ZNF395”,也称为HDBP-2、HDRF-2、PBF或PRF-1,是指基因和其所表达的多肽,两者均与亨廷顿病相关。该基因是缺氧诱导的转录因子,所述转录因子受IKB信号传导控制,并激活参与先天免疫应答和癌症的基因。已经发现其在各种人类癌症中过表达,特别是响应于缺氧。ZNF395还显示在乳头瘤病毒基因转录中起作用。
如本文使用的,“SMPDL3A”,也称为酸性鞘磷脂磷酸二酯酶样3A或ASML3a,是指基因和其所表达的多肽,两者均具有体外对核苷三磷酸(诸如例如ATP)的核苷酸磷酸二酯酶活性。该蛋白不具有对核苷二磷酸的活性,并且不具有对核苷单磷酸的活性。SMPDL3A具有体外对CDP-胆碱和CDP-乙醇胺的活性,而没有鞘磷脂磷酸二酯酶活性。如以下实验部分所提及的,SMPDL3A是胆固醇代谢的主调控物的靶。
如本文使用的,术语“SLC28A1”,也称为浓度型核苷转运体1(CNT1)、HCNT1或溶质载体家族28成员1,是指基因和其所表达的多肽,两者都是钠依赖性的和嘧啶选择性的。SLC28A1表现出核苷转运系统cit或N2亚型(N2/cit)的转运特征。SLC28A1还转运抗病毒嘧啶核苷3'-叠氮基-3'-脱氧胸苷(AZT)和2’,3’-二脱氧胞苷(ddC)。SLC28A1参与使用抗病毒和化学疗法的核苷衍生药物的摄取。
如本文使用的,术语“SLC6A3”,也称为溶质载体家族6成员3、DAT、多巴胺转运体、钠依赖性多巴胺转运体或PKDYS,是指基因或其所表达的多肽,两者均编码多巴胺转运体,其是钠和氯依赖性神经递质转运体家族的成员。SLC6A3通过其高亲和力钠依赖性重摄取到突触前末梢中来终止多巴胺的作用。该基因或其所表达的多肽的重复数的变化与特发性癫痫、注意力缺陷多动障碍、对酒精和可卡因的依赖性、对帕金森氏病的易感性以及抵抗尼古丁依赖性的保护相关。
如本文使用的,术语“VEGFA”,也称为血管内皮生长因子A、血管通透性因子、VEGF、VPF或MVCD1,是指PDGF/VEGF生长因子家族的成员的基因或其所表达的多肽。VEGFA编码肝素结合蛋白。其是诱导血管内皮细胞增殖和迁移的生长因子,并且对于生理和病理性血管生成都是必不可少的。小鼠中该基因的破坏导致异常的胚胎血管形成。该基因在许多已知的肿瘤中上调,并且其表达与肿瘤分期和进展相关。已经报道了该基因的变体,包括但不限于与1型糖尿病微血管并发症(MVCD1)和动脉粥样硬化相关的等位基因变体、编码不同同种型的可变剪接转录物变体、从上游非AUG(CUG)密码子开始的可变翻译起始(导致额外的同种型)以及C末端延长的同种型,其经由终止密码子通读机制使用可变的符合读框的翻译终止密码子产生(该同种型具有抗血管生成作用)。
如本文使用的,术语“EGLN3”,也称为Egl-9家族缺氧诱导因子3、含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白3、缺氧诱导因子脯氨酰水解酶3、HIF-脯氨酰羟化酶3、HIF-PH3、HPH-1、HPH-3、PHD3、HIFP4H3、Egl9样蛋白3同种型,是指与包括缺氧和慢性高原病在内的疾病相关的基因或其所表达的多肽。该蛋白的相关途径包括HIF-1信号传导途径和HIF阻遏物途径。EGLN3作为细胞氧传感器起作用,其在常氧条件下催化缺氧诱导因子(HIF)α蛋白中4-羟基脯氨酸的翻译后形成。
本文公开的透明细胞肾细胞癌(ccRCC)生物标志物组可以与两种或更多种另外的生物标志物组合使用,其中至少两种生物标志物中的一种是SMPDL3A或SLC28A1。因此,在一个实例中,透明细胞肾细胞癌蛋白生物标志物组包含任意两种、三种、四种、五种或全部六种生物标志物。在另一个实例中,如本文公开的生物标志物组包含至少三种生物标志物。在另一个实例中,如本文公开的生物标志物组包含至少四种生物标志物。在另一个实例中,如本文公开的生物标志物组包含至少五种生物标志物。在另一个实例中,如本文公开的生物标志物组包含至少六种生物标志物。
在另一个实例中,生物标志物组或生物标志物是但不限于ZNF395、SMPDL3A、SLC28A1、SLC6A3、VEGFA和EGLN3及其组合。在一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A和SLC28A1或者由SMPDL3A和SLC28A1组成。在另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A和ZNF395或者由SMPDL3A和ZNF395组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A和SLC6A3或者由SMPDL3A和SLC6A3组成。在仍另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A和VEGFA或者由SMPDL3A和VEGFA组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A和EGLN3或者由SMPDL3A和EGLN3组成。在一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1和ZNF395或者由SLC28A1和ZNF395组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1和SLC6A3或者由SLC28A1和SLC6A3组成。在仍另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1和VEGFA或者由SLC28A1和VEGFA组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1和EGLN3或者由SLC28A1和EGLN3组成。在一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPL3A、SLC28A1和ZNF395或者由SMPL3A、SLC28A1和ZNF395组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPL3A、SLC28A1和SLC6A3或者由SMPL3A、SLC28A1和SLC6A3组成。在仍另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPL3A、SLC28A1和VEGFA或者由SMPL3A、SLC28A1和VEGFA组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPL3A、SLC28A1和EGLN3或者由SMPL3A、SLC28A1和EGLN3组成。在一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、ZNF395和SLC6A3或者由SMPDL3A、ZNF395和SLC6A3组成。在另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、ZNF395和VEGFA或者由SMPDL3A、ZNF395和VEGFA组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、ZNF395和EGLN3或者由SMPDL3A、ZNF395和EGLN3组成。在仍另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、SLC6A3和VEGFA或者由SMPDL3A、SLC6A3和VEGFA组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、SLC6A3和EGLN3或者由SMPDL3A、SLC6A3和EGLN3组成。在另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、VEGFA和EGLN3或者由SMPDL3A、VEGFA和EGLN3组成。在仍另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1、ZNF395和SLC6A3或者由SLC28A1、ZNF395和SLC6A3组成。在另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1、ZNF395和VEGFA或者由SLC28A1、ZNF395和VEGFA组成。在另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1、ZNF395和EGLN3或者由SLC28A1、ZNF395和EGLN3组成。在一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1、SLC6A3和VEGFA或者由SLC28A1、SLC6A3和VEGFA组成。在另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1、SLC6A3和EGLN3或者由SLC28A1、SLC6A3和EGLN3组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1、VEGFA和EGLN3或者由SLC28A1、VEGFA和EGLN3组成。在一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、SLC28A1、ZNF395和SLC6A3或者由SMPDL3A、SLC28A1、ZNF395和SLC6A3组成。在另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、SLC28A1、ZNF395和VEGFA或者由SMPDL3A、SLC28A1、ZNF395和VEGFA组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、SLC28A1、ZNF395和EGLN3或者由SMPDL3A、SLC28A1、ZNF395和EGLN3组成。在仍另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、ZNF395、VEGFA和EGLN3或者由SMPDL3A、ZNF395、VEGFA和EGLN3组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、ZNF395、SLC6A3和VEGFA或者由SMPDL3A、ZNF395、SLC6A3和VEGFA组成。在另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、ZNF395、SLC6A3和EGLN3或者由SMPDL3A、ZNF395、SLC6A3和EGLN3组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、SLC6A3、VEGFA和EGLN3或者由SMPDL3A、SLC6A3、VEGFA和EGLN3组成。在一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1、ZNF395、SLC6A3和VEGFA或者由SLC28A1、ZNF395、SLC6A3和VEGFA组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1、ZNF395、SLC6A3和EGLN3或者由SLC28A1、ZNF395、SLC6A3和EGLN3组成。在仍另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1、ZNF395、VEGFA和EGLN3或者由SLC28A1、ZNF395、VEGFA和EGLN3组成。在一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、SLC28A1、ZNF395、SLC6A3和VEGFA或者由SMPDL3A、SLC28A1、ZNF395、SLC6A3和VEGFA组成。在另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、SLC28A1、ZNF395、SLC6A3和EGLN3或者由SMPDL3A、SLC28A1、ZNF395、SLC6A3和EGLN3组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、SLC28A1、ZNF395、VEGFA和EGLN3或者由SMPDL3A、SLC28A1、ZNF395、VEGFA和EGLN3组成。在仍另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SMPDL3A、ZNF395、SLC6A3、VEGFA和EGLN3或者由SMPDL3A、ZNF395、SLC6A3、VEGFA和EGLN3组成。在另外的实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1、SLC6A3、VEGFA和EGLN3或者由SLC28A1、SLC6A3、VEGFA和EGLN3组成。在又另一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含SLC28A1、ZNF395、SLC6A3、VEGFA和EGLN3或者由SLC28A1、ZNF395、SLC6A3、VEGFA和EGLN3组成。在一个实例中,透明细胞肾细胞癌生物标志物组或生物标志物包含ZNF395、SMPDL3A、SLC28A1、SLC6A3、VEGFA和EGLN3或者由ZNF395、SMPDL3A、SLC28A1、SLC6A3、VEGFA和EGLN3组成。
本发明的生物标志物可以彼此组合,例如作为生物标志物组,从而提供被认为罹患透明细胞肾细胞癌的透明细胞肾细胞癌受试者的灵敏且特异性的确定。组合本公开内容的生物标志物的选择提供了透明细胞肾细胞癌的统计上可靠的检测。在一个实例中,样品中两种或更多种生物标志物的存在指示透明细胞肾细胞癌的存在。在另一个实例中,如本文公开的生物标志物组的存在指示透明细胞肾细胞癌的存在。在另一个实例中,样品中生物标志物组的上调指示透明细胞肾细胞癌的存在。这可以从图3D中提供的数据看出,其中提供了标志物列表的基于p值的统计相关性。
如本文使用的,术语“上调”是指从患病受试者获得的样品中核酸或蛋白的表达水平的增加,其中该增加是与对照样品中相同核酸或蛋白的表达进行比较。在一个实例中,受试者罹患透明细胞肾细胞癌。如本文公开的,该上调可以被描述为例如但不限于高的肿瘤正常比率、低的p值或高的mRNA表达水平。在一个实例中,核酸的表达水平可以例如通过聚合酶链式反应(PCR)来测量。在一个实例中,聚合酶链式反应(PCR)是逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)或实时聚合酶链式反应(qPCR)或其组合。值得注意的是,RT-PCR用于通过从RNA产生互补DNA(cDNA)转录本来定性地检测基因表达,而qPCR则用于使用荧光染料定量地测量DNA的扩增。qPCR在本领域中也称为定量PCR、定量实时PCR和实时定量PCR。
如实验部分所示出的,本公开内容的生物标志物,特别是ZNF395、SMPL3A和SLC28A1,已显示出对透明细胞肾细胞癌是特异性的,并且显示出在两种其他不同的肾细胞癌亚型,乳头状和嫌色性肾细胞中并未过表达(图3D)。ZNF395在透明细胞肾细胞癌中表现出约7的肿瘤正常比率,p值为1x10-22,而在乳头状和嫌色性肾细胞癌中则几乎没有显示出过表达,肿瘤正常比分别为1.2(p=0.02)和1.3(p=0.06)。
此外,实验部分以及例如图3还显示,在通过癌症基因组图谱(TCGA)进行的12种类型的癌症谱图分析中,ZNF395、SMPL3A、SLC28A1、SLC6A3、VEGFA和EGFA仅在透明细胞肾细胞癌肿瘤(KIRC)中过表达。体内ZNF395耗竭进一步证实ZNF395在透明细胞肾细胞癌的肿瘤发生中起重要作用。ZNF395耗竭显著减慢了786-O透明细胞肾细胞癌细胞的体内肿瘤生长。此外,显示SMPDL3A和SLC28A1与透明细胞肾细胞癌特异性的超级增强子相关。
如本公开内容的实验部分中所描述的,细胞培养物的培养基中外泌体的分析可以例如通过测量基因表达水平来进行。该数据可见于例如图8。在一个实例中,这可以通过对透明细胞肾细胞癌细胞系(A498)和正常肾细胞系(HK2)进行的qPCR来进行。本公开内容中来自外泌体分析的结果显示,与正常肾细胞系相比,透明细胞肾细胞癌细胞系中ZNF395、SMPL3A、VEGFA和EGLN3的表达更高。
如本文使用的,术语“外泌体”是指一种类型的小的细胞外囊泡(EV),直径范围为30至200nm。这些外泌体可以从细胞培养基以及一系列真核流体中分离出。这些流体包括但不限于血液、尿液和痰液样品。因此,外泌体可被用于使用非侵入性方法从流体样品中鉴定生物标志物。外泌体当多泡体与质膜融合时从细胞释放出,或者直接从质膜释放出。这些囊泡携带来自例如荷瘤受试者中的肿瘤的核酸(例如,RNA和DNA)和蛋白。外泌体已经牵涉到驱动恶性细胞行为包括但不限于刺激肿瘤细胞生长和抑制宿主免疫应答中。因此,外泌体是鉴定癌症生物标志物的可行来源。从特定组织中分离外泌体还允许鉴定组织特异性或疾病特异性生物标志物。简言之,在一个实例中,外泌体分析可以通过从细胞超速离心来进行。胰蛋白酶消化后,可以进行蛋白质组学分析,并通过例如本领域已知的方法(包括但不限于蛋白印迹和免疫组织化学)来验证候选生物标志物。在一个实例中,使用本文公开的检测系统和/或方法检测外泌体。在另一个实例中,使用定量聚合酶链式反应(qPCR)检测和/或分析外泌体。
如本文使用的,术语“分离(isolated)”或“分离(isolating)”涉及已经与组分天然存在于其中的生物体细胞中的其他生物组分(即其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白和细胞器)基本分离或纯化的生物组分(例如核酸分子、蛋白或细胞器)。被“分离”的核酸包括通过标准纯化方法纯化的核酸。
如本公开内容的实验部分所示出的,本公开内容的发明人发现,可以在如本文所描述的各种样品类型中检测本公开内容的生物标志物。如本文使用的,术语“样品”是指已经从受试者获得、从受试者移出或从受试者分离的单细胞、多细胞、细胞碎片、组织或体液。样品的实例包括但不限于血液、粪便、血清、唾液、尿液、痰液、脑脊髓液、骨髓液、肿瘤样品的冷冻新鲜组织或从远离肿瘤的部位收集的非病变组织的冷冻新鲜组织。例如,生物标志物在固体样品(包括但不限于来自合适器官诸如肾的实体瘤活组织检查物)中清楚地检测到。新鲜冷冻的正常肿瘤组织从肾切除术病例中获得,并且正常组织从远离肿瘤的部位收集。换句话说,如本文所描述的正常肿瘤组织或者如实验部分中所描述的正常肿瘤对意指从同一受试者获得的肿瘤样品和未病变的样品。样品可以包括但不限于从肺、肌肉、脑、肝、皮肤、胰腺、胃、膀胱和其他器官获得的组织。在另一个实例中,样品包括但不限于源自或包含体液的流体样品,例如全血、血清、血浆、泪液、唾液、鼻液、痰液、胃肠液、渗出液(exudate)、渗出液(transudate)、从免疫应答部位收集的流体、从汇集的集合部位收集的流体、支气管灌洗液、有核细胞样品、与粘膜表面、头发或皮肤相关的流体和尿液。在一个实例中,流体样品是液体肿瘤活组织检查物、尿液样品、血液样品、痰液样品或细胞培养基。在另一个实例中,流体样品包括怀疑包含如本文公开的生物标志物或生物标志物组的外泌体。在一个实例中,检测尿液样品、血液样品或痰液样品中的生物标志物是合乎期望的,因为其允许无创检测受试者的透明细胞肾细胞癌。
在另一个实例中,提供了用于检测如本文公开的生物标志物的检测系统。在一个实例中,本公开内容的检测系统包括接收部分,所述接收部分接收来自怀疑罹患透明细胞肾细胞癌的患者的样品。在另一个实例中,样品被怀疑包含本公开内容的两种或更多种生物标志物。在又另一个实例中,检测系统包含能够检测本公开内容的两种或更多种生物标志物的一种或更多种物质。在另外的实例中,至少两种生物标志物之一是SMPDL3A或SLC28A1。在一个实例中,本公开内容的检测系统包括a)接收部分,所述接收部分接收来自怀疑罹患透明细胞肾细胞癌的患者的样品,并且其中所述样品被怀疑包含本公开内容的两种或更多种生物标志物,和b)检测部分,所述检测部分包含能够检测本公开内容的两种或更多种生物标志物或生物标志物组的一种或更多种物质,其中至少两种生物标志物之一是SMPDL3A或SLC28A1。
在一个实例中,检测系统包括接收部分,所述接收部分接收来自怀疑罹患透明细胞肾细胞癌的患者的样品,并且其中所述样品被怀疑包含本公开内容的两种、三种、四种、五种或全部六种生物标志物或生物标志物组。在一个实例中,接收部分可以是生物芯片、测试条、实时聚合酶链式反应(qPCR)设备或微量滴定板。在一个实例中,样品可以是如本文所描述的流体样品。
在一个实例中,本公开内容的检测系统或方法可要求流体样品体积,诸如但不限于在约1μl至约30ml、1μl至5μl、4μl至10μl、9μl至15μl、14μl至20μl、19μl至25μl、24μl至30μl、29μl至35μl、34μl至40μl、39μl至45μl、44μl至50μl、49μl至60ul、59μl至80μl、79μl至100μl、99μl至150μl、149μl至200μl、199μl至250μl、249μl至300μl、299μl至500μl、499μl至1ml、999μl至5ml、4.99ml至10ml、9.99ml至20ml和19.99ml至30ml之间的样品体积。在一个实例中,流体或样品体积可以为约1μl、约5μl、约10μl、约15μl、约20μl、约25μl、约30μl、约35μl、约40μl、约45μl、约50μl、约100μl、约150μl、约200μl、约250μl、约300μl、约350μl、约400μl、约450μl、约500μl、约550μl、约600μl、约650μl、约700μl、约750μl、约800μl、约850μl、约900μl、约950μl、约1ml、约2ml、约3ml、约4ml、约5ml、约6ml、约7ml、约8ml、约9ml、约10ml、约11ml、约12ml、约13ml、约14ml、约15ml、约16ml、约17ml、约18ml、约19ml、约20ml、约21ml、约22ml、约23ml、约24ml、约25ml、约26ml、约27ml、约28ml、约29ml,至约30ml,或其间的任何值。
为了辅助检测本公开内容的生物标志物,本公开内容的检测系统可以包含能够与本公开内容的两种、三种、四种、五种或全部六种生物标志物结合或特异性结合的物质。在一个实例中,该物质是生物特异性捕获试剂,例如但不限于抗体(或其抗原结合片段)、相互作用的融合蛋白、适体或亲和体(其是非免疫球蛋白来源的基于三螺旋束蛋白结构域的亲和蛋白),其全部可以根据它们识别生物标志物和/或其变体的能力来选择。抗体可以包括但不限于一抗、二抗或辣根过氧化物酶(HRP)加标签的二抗等。在一个实例中,该物质包括本领域已知的特异性识别ZNF395、SMPDL3A、SLC28A1、SLC6A3、VEGFA或EGLN3的抗体。
在一个实例中,该物质可以与固相结合,其中生物标志物随后可以通过质谱来检测,或者通过从生物特异性捕获试剂中洗脱生物标志物并通过传统的基质辅助激光解吸/电离(MALDI)或通过表面增强激光解吸/电离(SELDI)来检测洗脱的生物标志物。在另一个实例中,检测系统可以是生物芯片、测试条、qPCR设备或微量滴定板。
在另一个实例中,包括接收部分和检测部分的检测系统可以被配置为检测如本文描述的单独的或彼此组合的一种、两种、三种、四种、五种或全部六种生物标志物或生物标志物组。如本文公开的,检测系统还可以被配置为同时或以任何给定顺序(换言之,一次一种)检测一种或更多种生物标志物。
在另一个实例中,公开了确定受试者是否患有透明细胞肾细胞癌(ccRCC)或显示透明细胞肾细胞癌(ccRCC)复发的方法。在一个实例中,该方法包括获得来自受试者的样品。在另一个实例中,该方法包括使用本发明的检测系统来检测本发明的生物标志物组的存在,其中生物标志物组的存在确定受试者患有透明细胞肾细胞癌或显示透明细胞肾细胞癌复发。在又另一个实例中,该方法包括a)获得来自受试者的样品和b)使用本发明的检测系统来检测本发明的生物标志物组的存在,其中生物标志物组的存在确定受试者患有透明细胞肾细胞癌或显示透明细胞肾细胞癌复发。
在又另一个实例中,该方法包括使用本发明的检测系统来检测从来自受试者的样品中获得的本发明的生物标志物组的存在,其中生物标志物组的存在确定受试者患有透明细胞肾细胞癌或显示透明细胞肾细胞癌复发。
如本文使用的,术语“患者”或“受试者”或“个体”可以互换使用,涉及动物,例如哺乳动物,包括但不限于牛、马、非人灵长类动物、狗、猫和人类。本公开内容的受试者或患者可以被怀疑罹患或先前已经罹患透明细胞肾细胞癌。在一个实例中,本发明的方法可以被应用于怀疑罹患透明细胞肾细胞癌的受试者。在另一个实例中,本公开内容的方法可以被应用于怀疑具有透明细胞肾细胞癌复发的受试者。如本文使用的,术语“复发”是指已经被认为没有肾癌,或者特别地,没有透明细胞肾癌的患者中透明细胞肾细胞癌的回归或再次检测到。
可以使用本领域已知的方法在样品中检测本文公开的生物标志物或生物标志物组。应当理解,本领域技术人员将理解本领域已知的哪些测定将适合于检测本公开内容的生物标志物。例如,本公开内容的生物标志物的检测涉及对生物标志物的存在或不存在的观察。
检测可以直接或间接进行。直接检测涉及基于从多肽本身获得的信号来检测多肽,且该信号的强度与样品中存在的多肽的分子数目直接相关。可以例如通过测量多肽的特定物理或化学性质的强度值来获得这样的信号-有时称为强度信号。间接测量包括测量从次级组分(即不是多肽本身的组分)或生物读取系统获得的信号,例如可测量的细胞反应、配体、标记物或酶促反应产物。以上概述的概念也可以应用于基因,由此可以通过使用本领域已知的方法测量基因表达(全局或靶向基因表达)来确定基因水平。例如,可以使用分子生物学方法进行检测。
分子生物学方法可以包括但不限于聚合酶链式反应(PCR),例如逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)或实时聚合酶链式反应(qPCR,也称为定量PCR);蛋白印迹、斑点印迹;质谱;核酸测序;免疫学方法,例如使用抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA);等等。例如,在本公开内容的实验部分中,使用了蛋白印迹、实时定量PCR(qPCR)和核酸测序。
在一个实例中,检测系统使用定量聚合酶链式反应检测外泌体。
在一个实例中,关于如本文公开的两种或更多种生物标志物或生物标志物组是否存在于从患者获得的样品中,或者受试者是否患有透明细胞肾细胞癌或显示透明细胞肾细胞癌复发的指示,可以基于如本文公开的两种或更多种生物标志物或生物标志物组与对照组中相同的生物标志物的比较来作出。如本文使用的,对照组包括无疾病受试者和/或来自罹患透明细胞肾细胞癌的相同或不同受试者的未病变区域的样品。来自相同或不同受试者的对照样品也可以分别称为匹配对或非匹配对。对照组也可以是从患有透明细胞肾细胞癌的不同受试者获得的非癌性样品;患有不同肾细胞癌亚型的受试者;患有另一种类型的癌症的受试者;或从非癌性肾细胞系获得的样品。非癌性肾细胞系为但不限于HK-2和PCS-400细胞系。在一个实例中,透明细胞肾细胞癌(ccRCC)样品和对照样品从同一受试者获得(正常肿瘤对或肿瘤正常对,如本文所描述的)。因此,该方法还包括将透明细胞肾细胞癌与其他类型的肾细胞癌或与另一种类型的癌症区分开。
在一个实例中,公开了试剂盒,所述试剂盒包含如本文所描述的检测系统和实施如本文所描述的方法所需的物质。在一个实例中,试剂盒包含检测缓冲液、裂解缓冲液和如本文所描述的一种或多种物质。
在一个实例中,本公开内容的生物标志物、方法、检测系统或试剂盒用于鉴定患者中的透明细胞肾细胞癌。本公开内容的生物标志物、方法、检测系统或试剂盒可用于检测或预测可能正在经历或未经历透明细胞肾细胞癌治疗或已经接受透明细胞肾细胞癌治疗的透明细胞肾细胞癌患者中的复发。
在另一个实例中,公开了治疗受试者的透明细胞肾细胞癌的方法,其中该方法包括检测如本文所描述的生物标志物组,以及用抗透明细胞肾细胞癌化合物和/或疗法治疗被确定罹患透明细胞肾细胞癌的受试者。
应当理解,如本文公开的生物标志物组可以用于检测对受试者进行的疗法或已经对受试者进行的疗法是否成功。这是因为当与未病变的组织相比时,病变组织中生物标志物的表达水平和/或存在或不存在存在差异。因此,在一个实例中,提供了检测受试者对全身治疗的反应的方法,所述方法包括获得来自所述受试者的样品;和确定如本文定义的生物标志物组的水平;其中生物标志物组水平的降低或缺乏指示所述受试者对治疗有反应。
本文还公开了检测受试者对抗透明细胞肾细胞癌疗法的敏感性的方法。该方法包括基于如本文公开的生物标志物组的表达和/或存在或不存在,确定当接受一种或更多种抗透明细胞肾细胞癌疗法时来自患病受试者的样品的反应。在一个实例中,抗透明细胞肾细胞癌疗法包括抗癌疗法、抗体等。
本文显示的数据检查了体细胞改变的超级增强子,其使得能够鉴定被认为在透明细胞肾细胞癌的发病机理中起关键作用的主调控物,ZNF395。本公开内容描述了ZNF395表达所需的特异性von Hippel-Lindau依赖性增强子,并在体外和体内显示了ZNF395在透明细胞肾细胞癌肿瘤发生中的作用。
该研究的表观遗传图揭示了促成透明细胞肾细胞癌肿瘤发生的靶。在良好表征的缺氧相关靶(VEGFA、CXCR4、HK2)、SLC介导的膜转运蛋白(SLC2A1、SLC2A2、SLC38A1)、SLC16A家族和脂肪形成(PLIN2)周围发现了广泛的增强子增益。这项研究中揭示的靶包括SMPDL3A、SLC28A1、SLC6A3、VECFA和EGLN3。SMPDL3A是一种透明细胞肾细胞癌特异性致癌基因,在脂质和胆固醇代谢中起作用。来自这项表观基因组学研究的一个发现是ZNF395是透明细胞肾细胞癌中的肿瘤发生所需。ZNF395也称为HDBP2或乳头瘤病毒结合因子(PBF)。ZNF395是间充质干细胞分化为脂肪细胞所必需的,其通过与PPARγ2合作促进脂肪生成。ZNF395已显示与亨廷顿基因和干扰素诱导的基因的启动子结合,并在缺氧条件下引起癌症相关基因(MACC1、PEG10、CALCOCO1和MEF2C)和促血管生成趋化因子(包括IL6和IL8)的上调。
本文示例性地描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或更多个要素、一个或更多个限制的情况下被适当地实施。因此,例如,术语“包括/包含/含有(comprising)”、“包括/包含/含有(including)”、“包括/包含/含有(containing)”等应被广泛地理解,而非限制性的。另外,本文采用的术语和表述被用作描述性而非限制性的术语,并且在这些术语和表述的使用方面,不预期排除所示出的和所描述的特征的任何等同物或其部分,相反,应认识到在所要求保护的发明的范围内,各种修改形式是可能的。因此,应理解,尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征具体公开了本发明,但是本领域技术人员可以采用本文公开的其中体现的本发明的修改形式和变化形式,并且这些修改形式和变化形式被认为是在本发明的范围内。
如本申请中所使用的,单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数引用,除非上下文另有清楚规定。例如,术语“遗传标志物”包括多于一个遗传标志物,包括其混合物和组合。
如本文所使用的,在制剂的成分的浓度的上下文中,术语“约”通常是指所述值的+/-5%、更通常地所述值的+/-4%、更通常地所述值的+/-3%、更通常地所述值的+/-2%、甚至更通常地所述值的+/-1%、且甚至更通常地所述值的+/-0.5%。
遍及本公开内容,某些实施方案可以以范围的形式公开。应理解的是,以范围形式的描述仅为了方便和简洁,并且不应被解释为对所公开范围(range)的范围(scope)的刻板限制。因此,范围的描述应被认为明确公开了所有可能的子范围及该范围内的个体数值。例如,诸如从1至6的范围的描述应被认为明确公开了子范围,诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等,及该范围内的个体数值,例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何,这都适用。
某些实施方案也可以在本文中被广泛地和一般性地描述。落入一般公开内容中的较窄种类和亚类分组中的每一个也形成本公开的一部分。这包括具有从该类中去除任何主题的附带条件或否定限制的实施方案的一般性描述,无论本文是否具体列举了去除的材料。
本文宽泛地和一般性地描述了本发明。落入一般公开内容(generic disclosure)中的每个较窄种类和亚类分组也构成本发明的一部分。这包括具有从该类中去除任何主题的附带条件或否定限制的实施方案的一般性描述,无论本文是否具体列举了去除的材料。
其他实施方案在所附权利要求和非限制性实施例中。此外,在其中本发明的特征或方面根据马库什组被描述的情况下,本领域技术人员将认识到,本发明从而也描述了马库什组的任何个体成员或成员亚组。
实验部分
以下实施例示出了本发明的方面藉以被实践的方法或可以被制备的适于实践本发明的某些实施方案的材料。
实施例1–材料与方法
患者信息
在机构研究伦理审查委员会的批准和患者同意下,从肾切除术病例中获得了新鲜冷冻的正常肿瘤组织。从远离肿瘤的部位收集正常组织。表1涉及该研究的详细患者信息。
ID 诊断时的年龄 种族 性别 组织分型 Fuhrman核级
74575859 80 中国 女性 透明细胞癌 II级
17621953 48 中国 男性 透明细胞癌 II级
57398667 56 中国 男性 透明细胞癌 III级
70528835 52 中国 男性 透明细胞癌 III级
77972083 50 中国 男性 透明细胞癌 IV级
75416923 49 未知 男性 透明细胞癌 II级
20431713 65 印度 男性 具有乳头状特征的透明细胞癌 IV级
40911432 56 中国 女性 透明细胞癌 II级
12364284 未知 未知 未知 透明细胞癌 III级
86049102 51 中国 男性 透明细胞癌 II级
表1:患者信息
细胞系
商业细胞系(786-O、A-498、HK2和PCS-400)购自ATCC。将细胞系维持在具有10%FBS的RPMI(Invitrogen)中,但原代肾近端小管上皮细胞PCS-400除外,PCS-400维持在肾上皮细胞基础培养基(ATCC)中。通过针对公开可得的短串联重复(STR)谱图的STR分析来进行细胞系验证。使用MycoSensor PCR测定试剂盒(Stratagene)进行支原体(Mycoplasma)测试。
来自原发性肿瘤的肿瘤来源的细胞系的建立
通过胶原酶使肿瘤细胞从原发性肿瘤解离,进行接种并维持在具有10%FBS的RPMI中。在80%至90%汇合时,将细胞以1:3的比例传代。60次传代后,认为培养的细胞成功永生化。通过基于靶向测序比较单核苷酸多态性(SNP)的百分比同一性,实现肿瘤组织和细胞系的正确配对。所有肿瘤细胞系对显示出>90%的同一性,而配对的改组(shuffling)显示出<80%的同一性。来自12364284和40911432的肿瘤和细胞系显示出相同的von Hippel-Lindau(VHL)突变,但是来自86049102(86049102T)的组织是VHL突变体,而相应的86049102细胞系(86049102L)则是VHL野生型。
透明细胞肾细胞癌系中的稳定的von Hippel-Lindau恢复
使用了786-O细胞(WT2,VHL+)和786-O细胞(RC3,VHL-)。如下在A-498、12364284和40911432细胞中进行了von Hippel-Lindau(VHL)的稳定转导:使用Lipofectamine 3000(LifeTechnologies),将HA-VHL wt-pBabe-puro质粒以2μg DNA/6孔板的孔转染到PlatA细胞(RV-102,Cell Biolabs)中。转染后10到16小时进行培养基更换。48小时后,收集来自含有逆转录病毒的PlatA细胞的上清液,并将其添加至透明细胞肾细胞癌细胞中,然后在转导后用嘌呤霉素筛选3天。
组蛋白纳米染色质免疫沉淀测序(Nano-ChIP-seq)
Nano-ChIP-seq如先前所描述的进行,稍作修改。使用刀片将新鲜冷冻的癌症和正常组织切离,以获得约5mg的组织。在室温将组织在1%甲醛中固定10分钟。通过添加甘氨酸至终浓度为125nmol/L终止固定。将组织块用TBSE缓冲液洗涤3次。将粉碎的组织在100μL裂解缓冲液中裂解,并使用Bioruptor(Diagenode)声处理16个循环(30s开,30s关)。使用了以下抗体:H3K27ac(ab4729,Abcam)、H3K4me3(07-473,Millipore)、H3K4me1(ab8895,Abcam)和H3K27me3(07-449,Millipore)。免疫沉淀的总体积为1mL,且使用的抗体量为2μg。将输入DNA用蛋白G Dynabeads(Life Technologies)在4℃预清洁1小时,并且然后在4℃与抗体缀合的蛋白G珠一起孵育过夜。用冷的洗涤缓冲液洗涤珠3次。在染色质免疫沉淀(ChIP)和输入DNA回收后,使用WGA4试剂盒(Sigma-Aldrich)和BpmI-WGA引物进行全基因组扩增。将经扩增的DNA用BpmI[New England Biolabs(NEB)]进行消化。之后,将30ng经扩增的DNA与NEBNext ChIP-seq文库制备试剂套装(the NEBNext ChIP-seq library prep reagentset)(NEB)一起使用。细胞系中的染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)使用与以上描述的相同的Nano-ChIP-seq方案进行,但用1×106个细胞。使用101-bp单末端读取,在HiSeq2500上将每个文库测序至平均深度为2000至3000万个原始读段。
组蛋白染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)分析
使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA-mem;version 0.7.10),针对人类参考基因组(hg19)映射测序标签。将读段从前面和后面修剪10bp,以产生81bp。仅将具有mapQ>10且通过rmdup去除重复物的读段用于后续分析。使用CCAT调用显著的峰(P<0.05)。使用CHANCE评估免疫沉淀的强度和质量。
转录因子染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)
对于每种转录因子,在室温将3×107个细胞用1%甲醛交联10分钟,并通过添加甘氨酸至终浓度为125nmol/L终止。提取染色质并声处理为约500bp(Vibra cell,SONICS)。将以下抗体用于染色质免疫沉淀:c-Jun(sc-1694,Santa Cruz Biotechnology)、NF-κB p65(sc-372,Santa Cruz Biotechnology)、ETS1(sc-350,Santa Cruz Biotechnology)、HIF1α(610959,BD Biosciences)、HIF2α(NB100-122,Novus Bio)和p300(sc-585,Santa CruzBiotechnology)。免疫沉淀的总体积为1.5mL,且使用的抗体量为15μg。将输入DNA用蛋白GDynabeads(LifeTechnologies)在4℃预清洁2小时,并且然后在4℃与抗体缀合的蛋白G珠一起孵育过夜。在室温用洗涤缓冲液洗涤珠6次。将至少10ng DNA与NEBNext ChIP-seq文库制备试剂套装(NEB)一起使用。使用101-bp单末端读取,在HiSeq2500上将每个文库测序至平均深度为3000至5000万个读段。
转录因子染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)分析
使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA-mem)(version 0.7.10),针对人类参考基因组(hg19)映射测序标签。仅将具有mapQ>10且通过rmdup去除重复读段的读段用于后续分析。使用MACS2调用显著的峰(q值<0.01)。从GEO数据库下载了HIF2αChIP-seq(GSM856790)、HIF1βChIP-seq(GSM856790)和HIF1αChIP-Seq(GSM1642764)的Fastq文件。使用与以上相同的设置,使用MACS2调用峰。
RNA-Seq
制备10对与染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)组织匹配的正常肿瘤组织,以用于RNA-seq。使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒提取总RNA。根据制造商的说明,使用IlluminaTru-Seq RNA Sample Preparation v2方案制备RNAseq文库。简言之,使用poly-T寡核苷酸缀合的磁珠从1μg输入的总RNA中回收poly-A RNA。将回收的poly-A RNA化学片段化并转至SuperScript II和随机引物。第二链使用第二链主混合物(Second Strand Master Mix)来合成。使用Agilent Bioanalyzer(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)验证文库,将其稀释至11pM,并且然后使用Illumina Cluster Station将其应用于Illumina流通池。用74bp或76个碱基对的配对末端读段在HiSeq2000上进行测序。
RNA-Seq分析
使用TopHat2-2.0.12(默认参数和--文库类型fr-第一链),将RNA-seq读段与人基因组(hg19)比对。仅分析独特地映射的读段。使用HTSeq针对GENCODE v19参考基因模型获得基因计数,并且随后使用DESeq2进行差异分析。
Capture-C
如以前所描述的进行Capture-C。简言之,将1×107个细胞通过2%甲醛交联,然后进行裂解、均质化、DpnII消化、连接和去交联。使用Covaris将DNA声处理至150至200bp,以产生适于寡核苷酸捕获的DNA。使用总计3μg的经剪切的DNA以用于对文库制备物进行测序(NEB)。增强子序列通过与定制的生物素化寡核苷酸(IDT)杂交而被双重捕获,并用Dynabeads(Life Technologies)富集。在HiSeq Illumina平台上,使用150-bp的配对末端读段,将捕获的DNA测序至平均深度为每个探针200万个读段。
Capture-C分析和基因比对
对原始读段进行预处理以去除衔接子序列(trim_galore),并且使用FLASH合并重叠的读段。为了实现将短读段映射至hg19参考基因组,将所得的经预处理的读段然后用DpnII经由电脑模拟进行消化,并使用Bowtie(使用p1、m2、最佳和分层设置)进行比对。使用Capture-C分析仪处理比对的读段以(i)除去PCR重复物;(ii)如果子片段包含在捕获片段中,则将其分类为“捕获(capture)”;如果它们在捕获片段的任一侧的1Kb之内,则将其分类为“邻近排除(proximity exclusion)”;或者如果它们在“捕获”和“邻近排除”区域之外,则将其分类为“报告物(reporter)”;以及(iii)以bigwig格式对每100,000次互动的读段计数进行归一化。将r3Cseq程序包用于捕获片段和报告物片段,以鉴定视点与缩放背景(scaled background)之间的显著相互作用(q值<0.05)。基因比对通过显著的Capture-C峰与具有由GENCODE v19定义的起始和终止的基因的重叠来定义。使用Epigenome Gateway v40.0绘制了相互作用。
鉴定差异富集的区域
跨所有正常肿瘤样品合并通过CCAT调用的显著的H3K27ac峰。用H3K4me1和H3K4me3染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)数据进行相同操作。转录起始位点(TSS)基于GENCODE v19。启动子被定义为H3K27ac和H3K4me3之间重叠并且也与TSS周围±2.0Kb重叠的区域。增强子被定义为H3K27ac和H3K4me1之间重叠但不与启动子重叠的区域。为了使基质污染最小化,我们使用细胞系数据进行了进一步过滤,其中丢弃了在任何细胞系中与H3K27ac峰不重叠的增强子和启动子。使用MEDIPs从bam文件生成窗口大小50bp的Wiggle文件。使用bigWigAverageOverBed计算每个启动子或增强子区域的输入消减信号,以产生每千碱基每百万读段(RPKM)。使用Combat对来自启动子和增强子的H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)的RPKM的批次效应进行校正。肿瘤特异性区域被定义为具有与患者匹配的正常组织的倍数差异≥2且RPKM差异为0.5的区域。正常区域被定义为具有与患者匹配的肿瘤中对应区域的倍数差异≤0.5且RPKM差异为-0.5的区域。反复增益的区域被定义为在≥5/10患者中增益,且在任何患者中均无损失。反复损失的区域被定义为在≥5/10患者中损失,且在任何患者中均无增益。使用配对的t检验和Benjamini-Hochberg校正对每个顺式调控区域进行统计检验。使用NGSplot使差异区域可视化。
鉴定超级增强子区域
使用ROSE(启动子排除在外),使用从所有患者(正常组织和肿瘤组织)合并的H3K27ac峰区域来鉴定超级增强子区域。使用MEDIPs从bam文件生成窗口大小50bp的Wiggle文件。使用bigWigAverageOverBed计算每个超级增强子的输入消减信号(覆盖的碱基的读段之和)。超级增强子区域按正常肿瘤H3K27ac染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)信号的平均差异进行排序。增益的超级增强子被定义为具有平均差异H3K27ac ChIPseq信号>0的区域。损失的超级增强子被定义为具有平均差异H3K27ac ChIP-seq信号<0的区域。
靶向测序
制备10对与染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)组织匹配的正常肿瘤组织,用于靶向突变测序。使用QIAamp DNA Mini试剂盒提取基因组DNA。根据制造商的说明,使用KAPAHyper Prep试剂盒制备基因组DNA文库。简言之,使用Covaris E-220FocusedUltrasonicator(Duty Factor:10%,Cycles per Burst:200,Treatment Time:360;Covaris Inc.),通过声处理将基因组DNA片段化为150-200bp。片段化处理之后,按照制造商推荐的方案进行末端修复、加A尾、衔接子连接和PCR反应,然后进行靶富集。每个步骤之后,使用AMPure XP珠进行纯化步骤,以去除短片段例如衔接子二聚体。使用SureSelect XT2Xplora RNA Bait(Custom,5.9Mb)进行富集。用配对末端100bp选项在Hiseq2500上进行测序。
主成分分析(PCA)
首先使用COMBAT对所有顺式调控元件的H3K27ac强度的RPKM值的批次效应进行校正。对全部17,497个启动子或全部66,448个增强子进行PCA。使用R计算每个主成分的方差和累积比例。
饱和分析
对增强子和启动子独立进行饱和分析。具体地,选择来自20个原发性样品(由10个原发性肿瘤和匹配的正常样品组成)的H3K27ac谱图的子集。测试了每个子集大小的所有组合,除了具有>10,000个可能的组合(n=5-15个样品)的那些子集,在这种情况下,测试了10,000个随机选择的组合。然后,将来自每个子集的H3K27ac富集的区域组合,并合并重叠区域。然后,使用“鉴定差异富集的区域”中报告的定义将这些独特区域进一步分类为启动子和增强子。
GREAT分析
使用GREAT v3.0,根据最近的单基因分配改变的启动子。使用默认的GREAT设置,将改变的增强子分配至具有近端5.0Kb上游,1.0Kb下游延伸和多达1000Kb远端延伸的基因。在MSigDB途径和基因本体(GO)分子功能中富集的居首途径按其超几何q值排序。
Epigenome Roadmap数据集
来自两个正常肾的H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq)的bed文件是通过Epigenome Road生成的。使用CCAT鉴定峰。Epigenome Roadmap与我们的ChIP-Seq数据之间的相似性根据峰之间的重叠百分比来计算。
DNA甲基化分析
从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中获得总计160个肿瘤正常匹配对。跨所有样品进行分位数归一化。将探针分配至最近的启动子或增强子(最大截止值为10kb)。
染色质可及性分析
7个透明细胞肾细胞癌的Bigwig格式的文件与以登录号E-MTAB-1936从EMBL-EBIArrayExpress获得的正常肿瘤FAIRE-Seq数据集匹配。使用bigWigAverageOverBed计算每个启动子或增强子区域的FAIRE-Seq信号(启动子和增强子区域作为输入bed文件)。使用Combat对FAIRE-Seq数据的批次效应进行归一化。
lncRNA分析
从以前的研究下载了肾癌中差异表达的lncRNA的列表。使用bigWigAverageOverBed和由先前的研究定义的染色体位置,跨其中进行染色质免疫沉淀测序(ChIPseq)的相同的10对正常匹配的组织计算每一个lncRNA的RPKM值。将这些差异表达的lncRNA分配至最近的启动子和增强子,但具有最大距离截止值10Kb。将总计约200个lncRNA分配至启动子或增强子。
基序分析
使用增益的启动子和增强子作为输入区域以及损失的启动子和增强子作为背景,使用HOMER进行基序分析。输入区域覆盖启动子和增强子的整个范围。对于von Hippel-Lindau(VHL)响应性区域,输入区域为在VHL恢复后具有H3K27ac耗竭的增益的增强子,且背景区域为在VHL恢复后具有H3K27ac富集的增益的增强子。仅考虑已知的基序。
具有von Hippel-Lindau恢复的组蛋白染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)
使用组蛋白ChIP-seq进行H3K27ac、H3K4me1和H3K27me3 ChIP-seq。在免疫沉淀之前,对具有和不具有von Hippel-Lindau(VHL)的每对细胞的经声处理的DNA进行归一化。使用Deseq2,使用H3K27ac ChIP-seq的原始计数进行H3K27ac的差异分析,p值<0.05。
癌症基因组图谱(TCGA)RNA-Seq
从TCGA下载透明细胞肾细胞癌、乳头状和嫌色性肾细胞癌的预处理的RNA-seq v2数据水平3。仅考虑具有匹配的正常肿瘤对的患者(72个透明细胞肾细胞癌对、32个乳头状肾细胞癌对和25个嫌色性肾细胞癌对)。给定基因的总体肿瘤正常比率通过对个体肿瘤正常比率取平均值来计算,且p值通过配对t检验来计算。TCGA数据的泛癌汇编是从pancan12获得的。
免疫印迹
在冰上用具有蛋白酶抑制剂的冷的RIPA裂解缓冲液(50mM Tris pH 8,150mMNaCl,0.1%Triton X-100,0.5%脱氧胆酸钠,0.1%SDS)(Roche)收集细胞系。通过25号针头机械裂解细胞,并在4℃以13,000rpm离心15min。通过Pierce BCA蛋白测定(LifeTechnologies)测量蛋白浓度。将细胞裂解物在样品缓冲液中于70℃加热10min。每孔装载15μg细胞裂解物,并以130V恒量运行凝胶电泳持续90分钟。通过在冰中以100V转移100分钟,将蛋白转移至硝酸纤维素膜。蛋白印迹通过将膜与以下抗体和稀释液在4℃孵育过夜来进行:ZNF395(1μg/ml)、von Hippel-Lindau(VHL)(1∶250稀释,Cell Signaling 2738)、HIF1A(1∶500稀释,BD#610959)、HIFlB(1∶2000稀释,Novus Bio NB100-110)、HIF2A(1∶1000稀释,Novus Bio NB100-122)、ETS1(1∶1000稀释,Santa Cruz sc-350)、c-Fos(1∶500稀释,Santa Cruz sc-7202)、c-Jun(1∶500稀释,Santa Cruz sc-1694)、NFKB p65(ab7970,AbCAM)和β肌动蛋白(1∶2000,Santa Cruz sc-47779)。将膜在室温与以1∶10,000稀释的二抗孵育1小时,并用SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(ThermoScientific)显影。
siRNA敲低
将ON-TARGETplus SMARTpool siRNA(Dharmacon,UK)与非靶向对照汇集物(Non-Targeting Control Pool)一起用作阴性对照,并将GAPDH对照汇集物(GAPDH ControlPool)用作阳性对照。SMARTpool siRNA的序列如下:
HIF2α(EPAS1)(SEQ ID NO:1GGCAGCACCUCACAUUUGA,SEQ ID NO: 2GAGCGCAAAUGUACCCAAU,SEQ ID NO:3GACAAGGUCUGCAAAGGGU,SEQ ID NO: 4GCAAAGACAUGUCCACAGA)
SMDPL3A(SEQ ID NO:5CAGUAUGAUCCUCGUGAUU,SEQ ID NO: 6GAAGAUUUGCAGCCGGAAA,SEQ ID NO:7GACAGUAAGCAGUUUAUAA,SEQ ID NO: 8CGGCCCAAAUAUAAUGACA)
ZNF395(SEQ ID NO:9CCAAACUGAUCAUGGCUUU,SEQ ID NO: 10UCAGGCAGAUCAUGCAUAC,SEQ ID NO:11GUUCUGCGCUCCAUUGUGG,SEQ ID NO: 12GGACGAACCAGCUCCACGA)
将A-498、786-O和12364284和细胞用胰蛋白酶处理并稀释至适当浓度。将Lipofectamine RNAiMAX(Life Technologies)和SMARTpool siRNA在Opti-MEM中稀释至最终siRNA浓度为50nM。将经稀释的Lipofectamine RNAiMAX添加到经稀释的siRNA,并在室温孵育15min,以允许发生复合物形成。将siRNA混合物等分到6孔板的孔中。转染后48小时,将细胞再接种到6孔板中以用于集落形成测定,以及再接种到96孔板中以用于细胞活力测定。
shRNA敲低
将慢病毒质粒转染到HEK293T细胞中。针对ZNF395的MISSION shRNA克隆购自Sigma Aldrich。克隆的序列如下:
TRCN0000233231SEQ ID NO:13
CCGGGCATCAAACGACACGTCAAAGCTCGAGCTTTGACGTGTCGTTTGATGCTTTTTGTRCN0000233234SEQ ID NO:14
CCGGCAGAAGCCTTTACTGATTAAACTCGAGTTTAATCAGTAAAGGCTTCTGTTTTTG
将细胞用慢病毒颗粒转导48小时,并用嘌呤霉素(2μg/ml)选择四天,然后对其进行基因和蛋白表达分析以及其他功能测定。
定量PCR分析(qPCR)
使用Trizol(ThermoFisher)从细胞系提取总RNA,并用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)进行纯化。使用用于RT-qPCR的iScript Reverse Transcription Supermix(Biorad)进行逆转录。使用Taqman探针(ZNF395Assay ID:Hs00608626_m1,SMPDL3A AssayID:Hs00378308_ml)和TaqMan基因表达主混合物(TaqMan Gene Expression Master Mix)(ThermoFisher)进行qPCR。将基因表达变化针对GAPDH(Assay ID:Hs00699446_ml)归一化。
染色质免疫沉淀定量聚合酶链式反应(ChIP-qPCR)
使用SYBR qPCR主混合物(ThermoFisher)用以下引物探测ChIP DNA。
ZNF395-E1(hg19 chr8:28221378-28221459)
ZNF395-E1-F:GCAACCTTCCAGGCCTGCCG(SEQ ID NO:15)
ZNF395-E1-R:AGGAGAAAGGGGACAGGAGGGC(SEQ ID NO:16)
ZNF395-E2(hg19 chr8:28222803-28222908)
ZNF395-E2-F:TGGGCCGCCCGTGACTTTTC(SEQ ID NO:17)
ZNF395-F2-R:GGTTGGAAGGAGGCCACCGC(SEQ ID NO:18)
ZNF395-E3(hg19 chr8:28223142-28223230)
ZNF395-E3-F:TCGTGCTGAAGGCTTCTCAGGAAA(SEQ ID NO:19)
ZNF395-E3-R:CCCCTCCTGTTGGTGACGGC(SEQ ID NO:20)
ZNF395-E4(hg19 chr8:28269095-28269211)
ZNF395-E4-F:AAGCGGCGGGAGGAGGTTGA(SEQ ID NO:21)
ZNF395-E4-R:GGGCTGCGTCACCTGCAGAA(SEQ ID NO:22)
萤光素酶测定
使用DNeasy Blood&Tissue试剂盒(Qiagen)从786-O细胞提取基因组DNA。使用CloneAmp HiFi PCR Premix(Clonetech)扩增与推定增强子对应的区域,并将其克隆到具有最小FOS启动子的pGL3萤光素酶报告物载体中。
正向引物:(SEQ ID NO:23)
GTAGCTGCATAGATCTGCGCGCCACCCCTCTGGCGCCACCGT
反向引物:(SEQ ID NO:24)
GTAGCTGCATCAAGCTTGCCGGCTCAGTCTTGGCTTCTC
转染前一天,将1x104个细胞接种到96孔板的每个孔中。将细胞用100ng的pGL3-Fos-增强子和20ng的pRL-SV40(Renilla萤光素酶载体,Promega)转染。裂解细胞并使用双萤光素酶报告物系统(Dual-Luciferase Reporter System)(Promega)进行分析。对于萤光素酶报告物测定,用于扩增基因组区域的引物序列如下:
VEGFA-E1(hg19 chr6:43635485-43636708)
VEGFA-E1-F_MluI:GCTCTTACGCGTTGGGGGTGCCTCTCCCACTG(SEQ ID NO:25)
VEGFA-E1-R_NheI:GCCCGGGCTAGCGGGTGGGGGTCCAACAGGACA(SEQ ID NO:26)
VEGFA-E2(hg19 chr6:43692413-43693560)
VEGFA-E2-F_MIuI:GCTCTTACGCGT CCCATCCCCTGCCTCCTGCT(SEQ ID NO:27)
VEGFA-E2-R_NheI:GCCCGGGCTAGC TGGGCTGGCTGCAAAGTGGC(SEQ ID NO:28)
SLC2A1-E1(hg19 chrl:43523259-43525686)
SLC2A1-E1_F_MluI:GCTCTTACGCGT TGGTGACCGTGTTGGGGGTGA(SEQ ID NO:29)
SLC2A1-E1_R_NheI:GCCCGGGCTAGC TCCCCGCCCCTCTGTTGCAT(SEQ ID NO:30)
ZNF395-E1(hg19 chr8:28220788-28221483)
ZNF395-E1-F_MluI:GCTCTTACGCGT ACAGGTGTGCGCTACCACGC(SEQ ID NO:31)
ZNF395-E1-R_NheI:GCCCGGGCTAGCTGGTGTGGAATTCTGGCCAGTTAAAGG(SEQ ID NO:32)
ZNF395-E2(hgl9 chr8:28221957-28222965)
ZNF395-E2-F_MluI:GCTCTTACGCGT TCGGGAGGTTCAAGACCAGCCT(SEQ ID NO:33)
ZNF395-E2-R_NheI:GCCCGGGCTAGCGCTCCCAAGAAAGAACTTACCAGAGG(SEQ ID NO:34)
ZNF395-E3(hg19 chr8:28222984-28224154)
ZNF395-E3-F_MluI:GCTCTTACGCGT ACCAGCCATCCCCTAGTTTGCC(SEQ ID NO:35)
ZNF395-E3-R_NheI:GCCCGGGCTAGC GGCATTTGTCAGCAGAGATGTTGGC(SEQ ID NO:36)
集落形成和细胞活力测定
对于集落形成测定,将每种条件5000个细胞接种到6孔皿中,并允许其生长12天。将集落用0.05%结晶紫进行染色。对于细胞活力测定,将每种条件1000个细胞接种到96孔板中,并通过CellTiter-Glo发光细胞活力测定(CellTiter-Glo Luminescent CellViability Assay)(Promega)持续5天测量细胞活力。
凋亡测定
对于每种条件,将1x103个细胞接种到96孔板的每个孔中。在1小时孵育后,使用Caspase-
Figure BDA0002475699010000401
3/7测定(Promega),通过proluminescent胱天蛋白酶-3/7底物的裂解测量胱天蛋白酶3/7活性。可选地,将细胞用FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒(FITC Annexin VApoptosis Detection Kit)(BD Bioscences)和钙黄绿素AM(ThermoFisher)染色,并在流式细胞仪上进行分析。
体内研究
所有动物研究均遵照由新加坡机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的动物方案进行。在雌性NOD/SCID小鼠(6-8周龄)中,在侧腹皮下地植入用空载体对照或shRNA克隆转导的1x106A-498或1x106 786-O细胞。每2至3天监测肿瘤体积。将肿瘤体积计算为(长x宽x宽)x π/6。当肿瘤体积超过1000mm3时,处死动物。
CRISPR介导的增强子缺失
为了使增强子区域缺失,如之前所描述的,使用2个gRNA(左和右)裂解靶区域。使用ATUM gRNA设计工具设计gRNA。简言之,将磷酸化并退火的有义和反义寡核苷酸连接到Bpil消化的载体中。左侧gRNA被克隆到Bpil消化的pX330A-2A-GFP-1X2骨架(Addgene#58766)中,而右侧gRNA被克隆到Bpil消化的pX330S骨架(Addgene#58778)中。使用稍加修改的一步消化和连接,进行Golden gate组装以将2个gRNA前间区(protospacer)组装到pX330A-2A-GFP-1X2质粒骨架中。使用Lipofectamine3000(Life Technologies)转染后,分选并培养GFP阳性的786-O单细胞。通过基因组DNA的PCR验证个体克隆的增强子缺失,并使用qPCR和Taqman探针测量所得的基因表达。将用gRNA转染但不具有增强子缺失的克隆用作阴性对照。用于增强子缺失的gRNA如下:
ZNF395_E3(hg19 chr8:28223203-28224208)
ZNF395_F3_L_F_gRNA:CACCGTCCCTACTGCCGTCACCAAC(SFQ ID NO:37)
ZNF395_E3_L_R_gRNA:AAACGTTGGTGACGGCAGTAGGGAC(SEQ ID NO:38)
ZNF395_E3_R_F_gRNA:CACCGAAATATGTTTATGGTCCTCC(SEQ ID NO:39)
ZNF395_E3_R_R_gRNA:AAACGGAGGACCATAAACATATTTC(SEQ ID NO:40)
用于增强子缺失的验证引物:
ZNF395-E3(缺失后的产物大小:293bp;WT:1299bp)
ZNF395-E3-F:ACCAGCCATCCCCTAGTTTGCCA(SEQ ID NO:41)
ZNF395-E3-R:GCCACCAGGTAGCAGTTGGGT(SEQ ID NO:42)
数据可及性
染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)和RNAseq数据从Gene Expression Omnibus(GSE86095)可获得。
实施例2-透明细胞肾细胞癌肿瘤中的顺式调控模式异常
为了探索透明细胞肾细胞癌肿瘤是否在其体内顺式调控模式方面表现出变化,在10个原发性肿瘤/正常对、5个患者匹配的肿瘤来源的细胞系、2个市售可得的透明细胞肾细胞癌系(786-O和A-498)和2个正常肾细胞系(HK2和PCS-400)中生成了组蛋白染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)谱图(3个标记:H3K27ac、H3K4me3和H3K4me1)。实施例1中的表1显示了患者的临床信息。在原始的87个样品中,79个样品通过了预测序质量控制过滤器,并进行了ChIP-seq处理和下游分析。生成了总计2,363,904,778个独特映射的读段。在我们的正常肾组织中获得的平均89%的H3K27ac峰、98%的H3K4me3峰和76%的H3K4mel峰与来自Epigenomics Roadmap数据集中的成人肾组织的峰重叠(图1A)。在10个原发性透明细胞肾细胞癌中,9个具有von Hippel-Lindau(VHL)突变,其通过靶向测序检测并通过Sanger测序证实(表2)。细胞系786-O和A-498也具有VHL截短突变(表2)。VHL突变与透明细胞肾细胞癌中常见的其他染色质调节物(modifier)的体细胞突变共现,包括PBRM1(7/10)、SETD2(1/10)、KDM5A(1/10)、KDM5C(1/10)、ARID1A(1/10)和KMT2C(1/10)。
Figure BDA0002475699010000421
表2:通过测序确认透明细胞肾细胞癌组织和细胞系的von Hippel-Lindau(VHL)突变
特定的组蛋白修饰可以区分不同类别的功能调控元件-H3K4me3通常与启动子相关,H3K4me1与增强子相关,且H3K27ac与活性元件相关。整合来自三种组蛋白标记的信号和GENCODE v19注释的转录起始位点(TSS),将活性启动子定义为H3K27ac+/H3K4me3+/±2.0kbTSS区域,并将远端增强子定义为不与启动子重叠的H3K27ac+/H3K4me1+区域。聚焦于体癌细胞特异性的表观基因组事件,细胞系源自五个原发性肿瘤,并与商业细胞系组合,排除了在任何细胞系中均未发现的峰,以减少来自基质细胞的混杂效应。在原发性肿瘤和匹配的系之间观察到染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)峰的平均80%重叠(图1B)。使用这些标准,鉴定出17,497个推定启动子和66,448个推定增强子(图1C),其数目与先前在其他肿瘤类型中的研究相当。定义的启动子和增强子的数目分别在4个和16个样品之后达到饱和,这表明样本量为20(10个肿瘤/正常对)足以能够发现透明细胞肾细胞癌中的大部分顺式调控元件(图1E)。使用启动子或增强子的全局H3K27ac强度的前两个成分(分别代表83%和64%的总方差;图1F)的主成分分析(PCA)成功分离了正常样品和肿瘤样品,这表明顺式调控元件中全基因组普遍性改变是透明细胞肾细胞癌的突出特征(图1D)。
进行差异分析以鉴定改变的启动子和增强子。为了定义增益区域或损失区域,应用了H3K27ac RPKM的倍数差异≥2,绝对差异≥0.5,并且对于更高的严格性,在剩余肿瘤/正常对中不存在反向变化(图1G)。在≥5/10个患者阈值时,80%的改变的区域达到统计显著性(q值<0.1,配对t检验,具有Benjamini–Hochberg校正;图1H),且在该相同的阈值时,满足统计显著性的样品分数的增加达到了鞍点(图1I)。应用这些标准,获得了4,719个增益的启动子、592个损失的启动子、4,906个增益的增强子和5,654个损失的增强子的高可信度和全面的组(图1C、图1J)。代表性区域如图1K(图1Ki和1Kii)所示。
支持这些数据,与正常组织相比,增益的启动子和增强子在肿瘤组织中分别表现出通过更高的FAIRE-seq信号测量的增加的染色质可及性(P<0.0001),以及基于来自癌症基因组图谱(TCGA)的数据还表现出降低的DNA甲基化,这与活性调控区和DNA甲基化之间的相互关系一致(图1L)。有趣的是,与正常组织相比,在肿瘤组织中注意到与增益的启动子和增强子相邻的长非编码RNA的表达升高(分别地P<0.0001)。最后,许多顺式调控元件被证实涉及先前牵涉透明细胞肾细胞癌的区域;例如,观察到在CCND1远端增强子处H3K27ac信号的获得和H3K4me1的富集与肾细胞癌易感性基因座重叠(rs7105934;图1M)。通过无偏倚谱图分析鉴定这种先前已知的增强子的能力进一步支持了本研究的方法。
实施例3-肿瘤特异性增强子与透明细胞肾细胞癌的标志相关
为了鉴定由肿瘤特异性调控元件调节的基因,使用三种方法分配增强子。第一种方法利用了涉及一组高置信度基因的预定义线性邻近规则(GREAT算法)。使用GREAT分配的基因进行的MSigDB途径分析揭示,与增益的启动子相比,增益的增强子表现出高度显著的肾细胞癌特异性特征(增强子q值=3.2x 10-26;启动子q值=1.5x 10-1,二项式FDR;图2A)。尽管增益的启动子参与了一般癌症过程(例如针对完整的启动子途径列表的细胞周期、转录和RNA代谢),但是增益的增强子却富含透明细胞肾细胞癌的疾病特异性特征,包括针对完整的增强子途径列表的HIF1α网络活性、促血管生成途径(血小板激活和PDGFRβ信号传导)以及SLC介导的跨膜转运(图2A)。值得注意的是,HIF1α网络活性始终作为居首的五种途径之一出现,即使在用于定义增益的增强子的患者阈值发生扰动时也是如此(≥3-8位患者;表3)。
截止值 二项式FDR排序 二项式FDR
≥3 1 2.50E-31
≥4 3 7.90E-28
≥5 1 9.20E-30
≥6 1 1.50E-25
≥7 1 2.70E-18
≥8 4 3.30E-18
表3:HIF途径作为居首途径(患者阈值)。FDR代表错误发现率。
与增益的增强子相关的个体基因包括众所周知的缺氧靶(VEGFA,图2B;CXCR4)和参与糖酵解、谷氨酰胺摄入和脂质存储的代谢基因(GLUT1/SLC2A1,图2C;HK2、PFKFB3、PLIN2,图2D)和SLC38A1(图2E)。代谢酶和转运体周围增强子的存在与透明细胞肾细胞癌的代谢情况很大程度上是一致的,后者涉及糖酵解和谷氨酰胺分解的增加。实际上,对增益的增强子的基因本体(GO)分析强烈反映了与透明细胞肾细胞癌相关的标志性代谢变化,包括单羧酸跨膜转运体活性(二项式FDR q值=1.6x10-10;图2F)。
第二种增强子-基因分配方法基于H3K27ac信号与相同拓扑相关结构域(TAD)内的基因表达之间的相关性。基于Spearman相关性,使用q值<0.05,将2,311个增益的增强子分配至2,186个蛋白编码靶。许多增益的增强子的H3K27ac信号与其推定靶基因的基因表达高度相关。例如,VEGFA增强子的H3K27ac水平表现出与VEGFA基因表达高度相关(r=0.83,Spearman相关性),而SLC2A1增强子的H3K27ac信号与SLC2A1基因表达高度相关(r=0.72,Spearman相关性;图2B;图2G)。与GREAT方法类似,TAD相关方法也突出了缺氧(Krieg_Hypoxia_not_via_KDM3A,FDR q值=7x 10-120)和代谢(Chen_Metabolic_Syndrome_Network,FDR q值=2x 10-91)作为高度富集的途径(表4)。
Figure BDA0002475699010000461
表4:TAD相关方法的高度富集的途径
第三,为了在透明细胞肾细胞癌的特定情况下独立地验证GREAT和TAD方法,通过进行Capture-C测定研究了透明细胞肾细胞癌肿瘤特异性增强子的相互作用组。与其他染色质捕获技术相比,Capture-C提供高分辨率(低至单Kb分辨率)和用户定义区域的高通量询问(通常工作范围为10-500个区域)。设计了针对56个增益的增强子的探针,并检查了它们与786-O细胞中蛋白编码基因的相互作用。通过Capture-C揭示的每个基因增强子对都通过基因表达与H3K27ac水平之间的相关性被进一步过滤(q值<0.05)。将56个增益的增强子与36个蛋白编码基因配对。其中58%是通过GREAT预测的,且80%是通过TAD中的基因相关性预测的。通过Capture-C检测的相互作用的中值距离为16kb,且83%的相互作用落在100kb的窗口内(图2H)。作为一个直观的实例,Capture-C确认了VEGFA增强子与VEGFA TSS之间的相互作用(跨越约100kb的距离)(图2B)以及SLC2A1增强子与其启动子之间的相互作用(图2C)。综上所述,这些发现突出了增强子元件的疾病特异性性质,并且在调节透明细胞肾细胞癌病理过程中增强子功能异常的重要作用。
实施例4-肿瘤超级增强子将ZNF395鉴定为透明细胞肾细胞癌肿瘤发生的主调控物
增强子在透明细胞肾细胞癌中的重要性导致该研究检查“超级增强子”或“拉伸增强子(stretch-enhancer)”的模式—位于细胞身份和疾病的主调控物附近的密集的增强子簇。使用ROSE,在透明细胞肾细胞癌组群中鉴定出1,451种超级增强子,其中1,157种在肿瘤中增益,且294种在肿瘤中损失。
居首的增益的超级增强子的推定靶验证了包括MYC/PVT1、VEGFA和HIF2A在内的众所周知的致癌基因(图3A、3B和3C)。此外,发现了一些鲜为人知的基因,包括ERGIC1、ZNF395、SLC28A1和SMPDL3A(图3D)。与它们匹配的正常组织相比,这些基因在肿瘤中高度过表达(图3D)。此外,它们是透明细胞肾细胞癌独特的,并且在乳头状和嫌色性肾细胞癌(其他两种不同于透明细胞肾细胞癌的亚型)中未过表达(图3D)。例如,ZNF395在透明细胞肾细胞癌中表现出肿瘤正常比率为约7(P=1x10-22,配对t检验),但在乳头状和嫌色性肾细胞癌中几乎没有经历过表达,肿瘤正常比率分别为1.2和1.3(乳头状肾细胞癌中P=0.02且嫌色性肾细胞癌中P=0.06,配对t检验)。
相反,与损失的增强子相关的基因在透明细胞肾细胞癌中被反复抑制,并且包括EFHD1、EHF、MAL、GCOM1和HOXB9(图3D)。与肿瘤超级增强子的谱系特异性不同,与损失的超级增强子相关的基因在透明细胞肾细胞癌和乳头状肾细胞癌之间是共同的,这意味着肿瘤抑制基因的更普遍的功能。例如,先前在前列腺癌中发现的肿瘤抑制基因EHF/ESE2在所有三种肾细胞癌亚型中均表现出降低的表达(透明细胞肾细胞癌肿瘤/正常=0.05,P=3x10-15;乳头状肿瘤/正常=0.1,P 2x10-6;嫌色性肿瘤/正常=0.1,P=2x10-6)。
由于目前肾癌的治疗靶限于血管生成和mTOR途径,因此检查了未被超级增强子谱图分析所覆盖的了解较少的基因。由于ZNF395和SMPDL3A的差异肿瘤表达(6-7的肿瘤-正常比率;图3D)和高丰度(ZNF395的平均RPKM为约112;SMPDL3A的平均RPKM为约58),选择了ZNF395和SMPDL3A。尽管ZNF395先前已被鉴定为潜在的透明细胞肾细胞癌生物标志物,但其在透明细胞肾细胞癌恶性肿瘤中的功能作用仍未开发。SMPDL3A与酸性鞘磷脂酶SMPD1具有31%的氨基酸同一性,并且是胆固醇代谢的主调控物,肝X受体(LXR)的靶。
定量PCR(图3E)和免疫印迹(图3F)证实了A-498和786-O透明细胞肾细胞癌细胞表现出ZNF395和SMPDL3A的高表达,而正常肾近端小管细胞PCS-400和HK2则表现出两种基因的低表达。siRNA介导的SMPDL3A的敲低对集落形成具有细胞系依赖性作用,抑制A-498细胞的生长,但对786-O细胞则不具有可观察的作用(图3G)。另一方面,ZNF395在786-O和A-498细胞中始终抑制集落形成,但对正常肾细胞具有最小的影响(图3G、图3H)。与此表型观察一致,ZNF395超级增强子仅在透明细胞肾细胞癌细胞(786-O和A-498)中有活性,而在正常肾细胞(HK2和PCS-400;图3I)中则是沉默的。SMPDL3A和SLC28A1(图3J)还显示与透明细胞肾细胞癌特异性超级增强子相关。与正常(未病变)样品相比,SLC6A3、EGLN3和VEGFA在肿瘤样品中显示出启动子和增强子的增益(图3Ki、3Kii和3Kiii)。此外,在通过癌症基因组图谱(TCGA)进行谱图分析的33种癌症中,SMPDL3A(图3L)、SLC28A1(图3M)、SLC6A3(图3N)、VEGFA(图3O)、EGLN3(图3P)、ZNF395(图3Q-进行谱图分析的仅12种癌症类型)在来自癌症基因组图谱(TCGA)数据的透明细胞肾细胞癌肿瘤(KIRC)中也显示出高表达。
迄今为止,尚无研究在功能上测试ZNF395在透明细胞肾细胞癌或任何其他癌症类型中的致瘤性需求。使用个体shRNA克隆验证了ZNF395的肿瘤促进作用(图3R、图3S)。两个独立的ZNF395 shRNA克隆大幅降低了A-498和786-O细胞的体外集落形成(图3T)和细胞活力(图3U)。ZNF395敲低还导致通过胱天蛋白酶3/7底物的裂解(图3V)和膜联蛋白V染色(图3W)测量的凋亡增加。在体内,小鼠异种移植模型中的肿瘤形成研究揭示了通过ZNF395耗竭的显著肿瘤抑制(图3X)。ZNF395敲低导致A-498肿瘤的消除直至第74天,在那时,对照组中的肿瘤开始超过机构动物方案规定的大小限制。同样,ZNF395耗竭显著减慢了786-O细胞的体内肿瘤生长(图3X)。综上所述,显示了ZNF395在透明细胞肾细胞癌肿瘤发生中的作用。
实施例5-von Hippel-Lindau(VHL)缺陷重塑透明细胞肾细胞癌增强子模式
为了探索在原代透明细胞肾细胞癌中观察到的表观遗传变化(图1)由vonHippel-Lindau(VHL)损失而直接驱动的程度,在具有或没有VHL恢复的情况下检查了同基因细胞系中的染色质变化。与VHL的早期功能研究一致,786-O、A-498和12364284细胞中VHL的恢复在体外对增殖、集落形成和凋亡具有可忽略的影响,但在体内却大大推迟了肿瘤生长(图4A、4B、4C和4D),表明VHL在调节体内肿瘤发生所需的过程(包括肿瘤与基质之间的串扰、血管生成、细胞与基质的相互作用或肿瘤代谢)中的重要性。
聚焦于在原发性肿瘤中定义的相同区域(4,719个增益的启动子、4,906个增益的增强子和1,157个增益的超级增强子;图1C),检查了四种不同的细胞系(两种商业细胞系:786-O和A-498;以及两种患者来源的细胞系:12364284和40911432)中von Hippel-Lindau(VHL)驱动的H3K27ac的变化。跨所有四种细胞系一致地,与启动子相比,VHL恢复诱导了增强子和超级增强子的更明显的变化(图4E、4F、4G和4H)。例如,在786-O细胞中,在VHL恢复之后,与6.5%的启动子(321个启动子;图4E)相比,12%的增强子(549个增强子)被显著耗竭。这证实了与启动子相比,VHL恢复显著改变了更大比例的增强子(P<2.2x 10-16,比例检验),以及涉及增益的超级增强子的甚至更高的比例(P<2.2x 10-16,比例检验)。
尽管预期增益的增强子仅在von Hippel-Lindau(VHL)恢复后显示耗竭,但是H3K27ac水平的变化是双向的(图4E)。然而,与VHL野生型透明细胞肾细胞癌细胞(86049102L)、正常肾细胞系(PCS-400、HK2和HKC-8)以及31种其他各种癌症类型的细胞系相比,只有具有H3K27ac耗竭的增益的增强子在VHL突变的透明细胞肾细胞癌细胞系(786-O、A-498和12364284)中具有独特的活性(图4I)。正常肾细胞系中H3K27ac信号的缺乏反驳了组织谱系是对透明细胞肾细胞癌细胞系中观察到的高H3K27ac染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)信号的主要贡献者。另一方面,在VHL恢复后具有H3K27ac富集的增益的增强子跨多种癌症类型均显示出高活性,这表明这些增强子并非透明细胞肾细胞癌独特的(图4I)。
此外,仅在von Hippel-Lindau(VHL)恢复后显示出H3K27ac耗竭的增益的增强子与它们在786-O和12364284细胞中的推定靶的基因表达的伴随下调显著相关,而在原代透明细胞肾细胞癌中增益的且在VHL恢复后进一步富集H3K27ac的增强子并未导致整体水平的显著基因上调(图4J、图4K)。这些结果表明,前面的增强子(H3K27ac耗竭)很可能代表透明细胞肾细胞癌和VHL特异性表观基因组学改变,而后面的增强子(H3K27ac富集)可能代表了响应VHL恢复的通用补偿机制。组合来自多个系的数据,在≥1种细胞系中通过VHL恢复使总计1,564个增强子耗竭,代表了原发性透明细胞肾细胞癌肿瘤中鉴定的所有增益的增强子的几乎三分之一(32%)。VHL响应性增强子的比例随患者复发水平的增加而增加—仅7.8%的非复发性增益的增强子(1/10名患者)表现出von Hippel-Lindau(VHL)介导的H3K27ac耗竭,而在10名患者中的9名患者中反复增益的18%的增强子和在10名患者中的10名患者中增益的20%的增强子在786-O细胞中显示H3K27ac耗竭(图4L,P=0.0001,比例检验),这与研究中VHL突变的高患病率(9/10名患者)一致。有趣的是,使用1,564个VHL响应性增益的增强子的无监督聚类将单个VHL野生型肿瘤(ID 75416923)与剩余的9个VHL突变体肿瘤分离开(图4M),VHL野生型肿瘤在ZNF395超级增强子处显示出与其患者匹配的正常信号相当的低H3K27ac信号(图4N)。总的来说,在≥2种细胞系中耗竭的增强子的途径分析突出了直接的p53效应物、整合素连接激酶信号传导和HIF1α转录因子网络作为前五位途径,覆盖诸如EGFR(图4O)、CCND1(图4P)、ITGB3(图4Q)、VEGFA(图4S)、SLC2A1(图4R)和HK2(图4T)的基因。这些结果支持了VHL损失在透明细胞肾细胞癌增强子功能异常中的作用,即使存在其他驱动突变也是如此。
还检查了其他组蛋白标记是否与H3K27ac标记伴随改变。在图4U中的786-O细胞(r=0.77,Pearson相关)和12364284细胞(r=0.61,Pearson相关)中,响应于von Hippel-Lindau(VHL)恢复,发现H3K27ac和H3K4me1之间存在高度相关性。整体来看,表现出H3K27ac耗竭的增强子也经历伴随的H3K4me1耗竭(图4W)。接下来检查了VHL恢复是否导致H3K27me3抑制性标记的获得。尽管存在H3K27ac和H3K27me3的中等反相关(786-O细胞:r=-0.28,Pearson相关;12364284细胞:r=-0.22,Pearson相关;图4V),但H3K27me3的水平即使在VHL恢复后在增益的增强子处仍低(图4W)。这些发现表明,VHL恢复可通过H3K27ac和H3K4me1的共耗竭而导致增强子身份的损失,但不是正式过渡到保持H3K4me1但获得H3K27me3的平衡增强子状态。
实施例6-HIF2α-HIF1β异二聚体在von Hippel-Lindau(VHL)响应性增强子处富集
研究了在增益的增强子处哪些转录因子可能介导von Hippel-Lindau(VHL)依赖性染色质重塑。使用原发性透明细胞肾细胞癌数据集,检查了增益的增强子中反式调控物的富集超过损失的增强子。使用HOMER,发现居首的富集的基序是AP1家族、ETS家族以及NF-κB–p65–Rel和HIF1α/2α基序(图5A)。对于后续的体外验证,由于c-Jun在透明细胞肾细胞癌中的激活,因此选择c-Jun作为AP1家族的成员代表,并且由于ETS1已知与HIF2α的相互作用而选择ETS1作为ETS家族的代表,但承认其他AP1和ETS家族的家族成员可能在透明细胞肾细胞癌中发挥作用。c-Jun、ETS1和NF-κB-p65的免疫印迹显示正常和肿瘤细胞系中的可变的蛋白表达,但HIF1α和HIF2α的表达仅限于肿瘤细胞(图5B)。与HIF1α相比,HIF2α在更高比例的透明细胞肾细胞癌细胞系中表达(图5B)。在癌症基因组图谱(TCGA)组群中进一步检查了这些转录因子的基因表达,并发现与正常组织相比,ETS1、RELA(NF-κB-p65的亚基)和HIF2a在肿瘤中显著过表达,肿瘤相关表达模式的范围与透明细胞肾细胞癌系中的变化相似(图5C)。
为了进一步研究这些因子的染色质占用,生成了c-Jun、ETS1和NF-κB细胞的染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)结合谱图,并且在786-O细胞中检查了来自先前文献中的HIF2α、HIF1α和HIF1β结合谱图。由于786-O细胞通过基因组缺失而包含损失的内源性HIF1α表达,因此对经遗传操作以再表达HIF1α蛋白的786-O细胞进行了HIF1αChIP-seq。ChIP-seq结果显示,与损失的增强子相比,所有六种转录因子在增益的增强子处均表现出增加的占用,证实了HOMER的预测(图5D)。
为了确定这些转录因子中的哪些可能直接依赖于von Hippel-Lindau(VHL),然后在具有和不具有野生型VHL恢复的VHL突变的同基因细胞系中比较了它们的蛋白表达。如图5E中所显示的,VHL恢复一致地下调786-O和12364284细胞系中的HIF2α表达,但其他因子的蛋白水平在这两种细胞系之间显示出对比趋势,这表明在所检查的六种因子中,HIF2α蛋白表达最依赖于VHL。实际上,支持HIF2α在VHL依赖性增强子重塑中的重要作用,只有HIF2α和HIF1β在显示VHL依赖性H3K27ac耗竭的增强子处显著富集(图5F)。此外,在HOMER数据库中所有已知的基序中,HIF2α是在表现出H3K27ac耗竭的VHL响应性增强子处富集最多的基序(P=1×10-11)。相比之下,HIF1α在显示H3K27ac耗竭的增强子处未富集(图5F)。尽管与HIF2α共有许多结合位点,但HIF1α主要位于启动子附近区域,而HIF2α经常占用786-O细胞中的内含子和基因间区域(图5G),这与HIF1α的以启动子为中心的占用和HIF2α的以增强子为中心的占用一致(图5H)。增益的增强子在786-O细胞中显示出为肿瘤特异性启动子的两倍的HIF2α占用(P<1×10-16,比例检验),表明与启动子相比,HIF2α在调控增强子中可能发挥更大的作用。
为了将这些HIF1α和HIF2α占用模式发现扩展至表达内源水平的两种因子的系统,在大量共表达两种HIFα亚基的40911432透明细胞肾细胞癌细胞中进行了HIF1α和HIF2α染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)(图5B)。与786-O相似,在40911432细胞中,HIF1α显示出在启动子附近区域处的优先占用,而在远端区域(内含子和远端基因间区域;图5I)中发现了大比例的HIF2α。与HIF2α相比,更高比例的HIF1α结合位点与增益的启动子重叠(HIF1α的68%对比HIF2α的41%,P=0.002,比例检验;图5J)。相反,与HIF1α相比,更高比例的HIF2α结合位点与增益的增强子重叠(HIF1α的29%对比HIF2α的51%,P<2.2×10-16,比例检验)。HIF2α在增强子处的优先占用进一步得到以下的证实:与HIF1α相比,它在von Hippel-Lindau(VHL)恢复后在显示出H3K27ac耗竭的增强子处的富集程度更高(图5K)。仅与HIF2α结合但不与HIF1α结合的VHL响应性增强子的具体实例包括UBR4附近的增强子(图5L)和CMIP附近的超级增强子(图5M)。因此,即使在共表达HIF1α/HIF2α的透明细胞肾细胞癌细胞中,这些结果也表明与HIF1α相比,HIF2α在VHL介导的增强子重塑中发挥更大的作用。
实施例7-HIF2α-HIF1β结合的增强子调节基因表达
为了研究HIF2α沉默足以概括von Hippel-Lindau(VHL)恢复的效应的程度,在具有HIF2 siRNA介导的基因敲低的786-O细胞中进行H3K27ac染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)和RNA测序(RNA-seq),并分析HIF2siRNA敲低与VHL恢复之间的相关性。当针对所有基因进行评估时,HIF2α敲低与VHL恢复之间存在低的相关性(r=0.1,P=5.2×10-31)。然而,重要的是,对于HIF2α结合位点附近的基因,这种相关性增加到0.23(P=5.8×10-14)(图6A)。在表观基因组学水平获得了相似的结果,其中对于增益的增强子,跨所有增益的增强子的相关性低,为0.06(P=1.9×10-5),但在HIF2α结合的增强子处则显著增加至0.37(P=9.5×10-8)(图6B),并且在超级增强子处,相关性从0.089(P=0.0025)增加至在HIF2α结合的超级增强子处的0.25(P=0.00054)(图6C)。作为一个直观的实例,VHL恢复或HIF2a敲低后,ZNF395超级增强子处的H3K27ac信号减弱,伴随ZNF395基因表达的降低(图6D)。通过RT-qPCR进行的验证显示,HIF2a siRNA敲低将VEGFA、SLC2A1和ZNF395表达下调至与VHL恢复相当的程度(图6E)。增强子元件的萤光素酶报告物活性的降低在HIF2a siRNA敲低和VHL恢复之间也是一致的(图6F)。
旨在在HIF2α结合的增强子与基因表达的控制之间建立因果联系。进行了具有最高HIF2α峰的ZNF395增强子区域的CRISPR介导的基因组耗竭(图6G)。与具有完整增强子的克隆相比,具有纯合缺失的ZNF395增强子的所有四种克隆一致地下调其ZNF395表达(P<0.05),提供了证据证明ZNF395表达在表观遗传学上受该HIF2α–HIF1β结合的增强子的控制(图6G)。综上,这些结果表明,HIF2α是von Hippel-Lindau(VHL)驱动的增强子重塑的重要介导物。
实施例8-von Hippel-Lindau(VHL)恢复减少了P300募集,但保留了启动子-增强子相互作用
最后,该研究试图调查von Hippel-Lindau(VHL)恢复引起H3K27ac水平降低的原因。先前的下拉测定已报道HIF2α和HIF1β均可与组蛋白乙酰转移酶p300相互作用。实际上,p300经常标记增强子,并被认为是由组织特异性转录因子募集的。但是,p300的染色质谱图先前尚未在肾癌细胞系中建立,因此,p300在透明细胞肾细胞癌中塑造增强子中的贡献仍不清楚。因此,在786-O细胞中进行了p300染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq),并证实了其在增益的增强子处的富集超过损失的增强子(图7A)。将p300ChIP-seq与HIF2α ChIP-seq进行比较产生了在HIF2α和p300之间的令人惊讶的高度重叠(96%),其甚至比HIF2α和HIF1β的重叠程度更高(89%;图7B和7C)。相比之下,其他转录因子(例如c-Jun、ETS1和NF-κB)则没有表现出如此高的重叠程度(≤60%;图7B)。
对具有和不具有VHL的情况下的肿瘤增强子处的p300结合进行比较。尽管在VHL恢复后786-O细胞中的p300蛋白水平增加(图7D),但跨所检查的所有三种增强子中p300的结合下降(图7E)。通过siRNA敲低的HIF2α耗竭也降低了p300募集(图7F),表明HIF2α的损失可干扰p300募集。
研究了von Hippel-Lindau(VHL)恢复和随后p300结合的损失是否破坏启动子增强子相互作用。在具有和不具有VHL恢复的配对786-O细胞系中进行增强子区域的Capture-C。Capture-C相互作用显示,在VHL响应性区域,VHL缺陷的和VHL恢复的786-O细胞之间具有相对高的相关性(r=0.74,Pearson相关),其甚至高于在非VHL响应性区域观察到的相关性(r=0.57,Pearson相关;图7G)。作为一个直观的实例,即使在VHL恢复后,VEGFA启动子与增强子之间的相互作用仍然完整(图7H),这表明增强子活性的丧失可能不足以使启动子增强子相互作用解离。此外,这些启动子增强子中的许多都是谱系特异性的;例如,在胃癌细胞系KATOIII中未检测到SLC2A1增强子与其启动子之间的相互作用(图7J)。因此,启动子增强子相互作用通常以组织特异性方式预先存在于肾细胞中。
通过定量聚合酶链式反应(qPCR),通过测量生物标志物的基因表达,分析了来自获自透明细胞肾细胞癌细胞系(A498)和正常肾细胞系(HK2)的培养基的外泌体的透明细胞肾细胞癌生物标志物(图8)。与正常肾细胞系相比,ERGIC、EGLN3、ETS1、PVT1、MYC、SMPDL3A、SNX10、VEGFA和ZNF395(图8A、8B和8C)在透明细胞肾细胞癌细胞系中显示出更高的表达。
对来自患有透明细胞肾细胞癌或良性大嗜酸粒细胞瘤的患者组群的微阵列数据进行了比较。与良性大嗜酸粒细胞瘤相比,VEGFA、EGLN3、ZNF395,SLC6A3和SLC28A1在透明细胞肾细胞癌中的表达水平更高,如较高的Z评分值所显示的(图9)。
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表5:基因和蛋白以及其登录号的列表。
提供前述实施例是用于说明本发明的目的,而不应将其解释为对本发明的范围施加任何限制。将容易明显的是,可以对以上描述的并在实施例中说明的本发明的具体实施方案进行许多修改和改变,而不脱离本发明的基础原理。所有这样的修改和改变都旨在被本申请所涵盖。

Claims (20)

1.一种透明细胞肾细胞癌(ccRCC)生物标志物组,其中所述生物标志物组包括选自由ZNF395、SMPDL3A、SLC28A1、SLC6A3、VEGFA、EGLN3组成的组的至少两种生物标志物,其中所述至少两种生物标志物中的一种为SMPDL3A或SLC28A1;其中所述生物标志物是蛋白或编码其的核酸或其变体。
2.如权利要求1所述的透明细胞肾细胞癌生物标志物组,其中所述生物标志物组包括至少三种生物标志物。
3.如权利要求1或2所述的透明细胞肾细胞癌生物标志物组,其中所述生物标志物组由ZNF395、SMPDL3A和SL28A1组成。
4.一种检测系统,所述检测系统包括a)接收部分,所述接收部分接收来自被怀疑罹患透明细胞肾细胞癌的受试者的样品,并且其中所述样品被怀疑包含根据权利要求1至3中任一项所述的生物标志物组;和b)检测部分,所述检测部分包含能够检测根据权利要求1至3中任一项所述的生物标志物组的一种或更多种物质。
5.如权利要求4所述的检测系统,其中所述物质是选自由以下组成的组的生物特异性捕获试剂:抗体或其抗原结合片段、相互作用的融合蛋白、适体和亲和体。
6.如权利要求4和5中任一项所述的检测系统,其中所述系统选自由以下组成的组:生物芯片、测试条、聚合酶链式反应(PCR)设备和微量滴定板。
7.一种确定受试者是否患有透明细胞肾细胞癌或显示透明细胞肾细胞癌复发的方法,其中所述方法包括:
a)获得来自所述受试者的样品;
b)使用根据权利要求4至6所述的检测系统检测所述样品中根据权利要求1至3中任一项所述的生物标志物组的存在,
其中所述生物标志物组的存在确定所述受试者患有透明细胞肾细胞癌或显示透明细胞肾细胞癌复发。
8.一种检测受试者对全身治疗的反应的方法,所述方法包括:
a.获得来自所述受试者的样品;
b.确定所述样品中根据权利要求1至3中任一项所述的生物标志物组的水平;
其中所述生物标志物组水平的降低或缺乏指示所述受试者对治疗有反应。
9.一种确定肾肿块样品是良性还是恶性的方法,所述方法包括:
a.获得来自受试者的肾肿块的样品;
b.确定所述样品中根据权利要求1至3中任一项所述的生物标志物组的水平或存在或不存在;
其中,与良性样品相比,所述生物标志物组水平的增加指示所述样品是恶性的。
10.如权利要求7至9中任一项所述的方法,其中检测使用一种或更多种分子生物学方法进行,和/或所述检测系统使用一种或更多种分子生物学方法。
11.如权利要求10所述的方法,其中所述一种或更多种分子生物学方法选自由以下组成的组:聚合酶链式反应(PCR)、定量聚合酶链式反应(qPCR)、蛋白印迹、斑点印迹、质谱、核酸测序和免疫学方法。
12.如权利要求7至11中任一项所述的方法,其中关于所述受试者是否患有透明细胞肾细胞癌或显示透明细胞肾细胞癌复发的确定基于与对照组的相同生物标志物组的比较进行。
13.如权利要求12所述的方法,其中所述对照组包括从无疾病受试者获得一种或更多种样品和/或来自罹患透明细胞肾细胞癌的相同或不同受试者的未病变区域的样品。
14.如权利要求4至6所述的检测系统或如权利要求7至13所述的方法,其中所述样品是固体样品或流体样品。
15.如权利要求14所述的检测系统或方法,其中所述固体样品是实体瘤活组织检查物。
16.如权利要求14所述的检测系统或方法,其中所述流体样品是液体肿瘤活组织检查物、尿液样品、血液样品、痰液样品或细胞培养基。
17.如权利要求14或16中任一项所述的检测系统或方法,其中所述流体样品包含外泌体,所述外泌体被怀疑包含如权利要求1至3中定义的生物标志物组。
18.如权利要求17所述的检测系统或方法,其中所述外泌体使用定量聚合酶链式反应(qPCR)来检测。
19.一种试剂盒,所述试剂盒用于进行权利要求7至18中任一项所述的方法,其中所述试剂盒包含检测缓冲液、裂解缓冲液以及适于检测根据权利要求1至3中任一项所述的生物标志物组的如权利要求5中定义的一种或更多种物质。
20.根据权利要求19所述的试剂盒以及根据权利要求4至6和14至18中任一项所述的检测系统,用于检测权利要求1至3中任一项所述的生物标志物组。
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