CN113876953B - 新型细胞衰老干预靶点及其在化疗抗癌中的靶向应用 - Google Patents

新型细胞衰老干预靶点及其在化疗抗癌中的靶向应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型细胞衰老干预靶点及其在化疗抗癌中的靶向应用。本发明揭示了组蛋白去甲基化酶KDM4A或KDM4B可以作为细胞衰老干预以及肿瘤药物耐药性干预的新型靶点。以其作为靶标，可开发抑制肿瘤耐药性的药物、抑制或延缓衰老相关分泌表型的药物，以及对相关疾病或症状进行诊断、预后评估。

Description

新型细胞衰老干预靶点及其在化疗抗癌中的靶向应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及新型细胞衰老干预靶点及其在化疗抗癌中的靶向应用。
背景技术
细胞衰老是指真核细胞一种相对稳定且通常不可逆的细胞周期停滞的状态，该状态下增殖细胞会对促生长刺激产生耐受，通常由DNA损伤等胁迫性信号所引起。
衰老细胞的特征是形态学异常、代谢活性变化、染色质重构、基因表达改变、脂褐素增加、颗粒性明显、空泡化严重以及出现一种称为衰老相关分泌表型(SASP)的促炎症表型。由于核纤层lamin B1表达丧失，可观察到核膜完整性破坏。衰老细胞积累功能失调的线粒体，并表现出活性氧种属(ROS)水平升高。还可观察到溶酶体内含物增加和溶酶体活性改变，表现为pH为6.0时β-半乳糖苷酶染色阳性率上升，使其成为广被采用的细胞衰老标志物。衰老的生物学作用比较复杂，衰老细胞的保护作用和有害作用均已有描述，主要取决于病理生理学环境。例如，尽管衰老可能作为避免受损细胞恶性转化的机制进化而来，但衰老的发生可能会导致许多年龄相关病变，包括癌症、心脑血管疾病、骨质疏松、关节炎、代谢性疾病、神经退行性症状等一系列临床问题。
细胞衰老表现为核膜内折，染色质固缩，细胞体积增大，激活下游包括p53、p16INK4A/Rb、PI3K/Akt、FoxO转录因子和线粒体SIRT1等在内的多条信号通路。除了进入永久性增殖停滞，衰老细胞常关系到许多病理学特征，包括局部炎症。细胞衰老发生于受损细胞，并防止其在生物体内增殖。在各种外界刺激和内部因素影响下，细胞损伤可以导致明显的细胞衰老迹象。当损伤累积达到一定的限度，组织中呈现各种肉眼可辨的组织退行变化和生理上的衰老表型。
尤其值得注意的是，衰老细胞中炎症性细胞因子的表达水平显著升高，这一现象被称为衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)。SASP这一概念是由Coppe等人于2008年首次提出。他们发现衰老细胞能通过分泌胞外基质蛋白、炎症相关因子及癌细胞生长因子促进邻近癌前细胞发生癌变或恶性增强，并称这些蛋白为SASP因子。
衰老细胞主要通过3个途径参与机体的各种生理和病理过程：(1)衰老细胞基因表达和形态改变逐步累积可影响相应组织的功能；(2)衰老细胞限制干细胞和未分化祖细胞的再生潜能，导致细胞再生能力下降；(3)衰老细胞不仅表现为生长周期停滞，还通过自分泌和旁分泌途径释放大量的细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶等，影响邻近细胞和组织的微环境，导致和加速衰老及相关疾病，在这一过程中SASP起到核心的病理作用。此外，衰老细胞分泌的这些因子还会影响周围的正常细胞，而抑制SASP则能够延缓机体衰老。典型的SASP因子包括TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1a、基质金属蛋白酶(MMP)、GM-CSF和纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI1)等，这些因子促进免疫系统激活，导致组织微环境中衰老细胞等异常因素被机体清除，发挥肿瘤抑制功能。然而矛盾的是，SASP尚可通过特定分泌因子(如VEGF，ANGPTL4)促进血管生成、细胞外基质重塑或上皮-间质转化(EMT)的因子来促进肿瘤发展。此外，衰老诱导的慢性炎症可引起系统性免疫抑制，这种慢性炎症还可促进衰老相关的组织损伤和变性、器官功能失调和癌症等多种衰老相关疾病的发生和发展。
DNA损伤、端粒功能障碍、癌基因激活、氧化应激等刺激均可诱导细胞出现SASP，其机制与转录级联、自分泌环路和持续DNA损伤反应密切相关。但是，过表达或者抑制衰老经典通路p53和p16INK4A/Rb不能影响SASP的表达，表明尽管衰老细胞的周期停滞和SASP经常协同发生，两者的调控通路并不完全重叠。DNA损伤反应(DDR)在细胞受损后立即被激活，衰老细胞出现成熟SASP则需要约1周的时间，并且短暂的DNA损伤反应并不能诱导细胞衰老，也不能诱导SASP，表明除了DNA损伤反应外还存在其它机制共同诱导SASP。
DDR、p38MAPK和mTOR信号作为上游驱动因子，NF-κB和C/EBPβ作为下游转录因子，均参与到衰老细胞SASP的调节过程中。NF-κB和C/EBPβ转录因子在细胞衰老时活性增加，参与调节细胞应激和炎症信号的细胞因子表达。细胞衰老时磷酸化的NF-κB/RelA亚基入核，与SASP启动基因结合，调控SASP因子表达，因此NF-κB通常被称为SASP的主调节器。小鼠肝脏、肾脏及老年人大脑组织的衰老细胞中锌指转录因子4(GATA4)水平较高，GATA4可以通过调节衰老细胞中NF-κB的活性影响SASP相关基因IL-6、IL-8、CXCL1的表达。p38MAPK是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，是重要的信号转导分子，激活或者阻断p38MAPK足以影响衰老细胞SASP形成。p38MAPK在衰老程序开始几天后被激活，通过活化丝裂原和应激激活的蛋白激酶-MSK1和MSK2，间接激活NF-κB，使得p65和p50在核内聚集，这与SASP早期发展过程相一致。衰老细胞不直接分泌促炎因子IL-1α，但衰老细胞表面分布大量的IL-1α，与NF-κB共同形成正反馈环路促进炎性因子的编码转录，建立和维持SASP。mTOR通过调节IL-1α水平促进SASP因子分泌，而雷帕霉素不影响IL-1αmRNA水平，却明显降低衰老细胞表面IL-1α蛋白的表达。mTOR也能够调节p38MAPK下游信号MAPKAPK2影响SASP因子分泌，细胞衰老期间，MAPKAPK2磷酸化RNA结合蛋白ZFP36L1，从而限制其对SASP因子转录产物的降解能力。转录因子c/EBPβ与肿瘤基因激活诱导的细胞衰老有关，衰老时c/EBPβ募集到IL-6启动子上，直接促进SASP因子转录，c/EBPβ也是IL-6正反馈自分泌环路的重要组成部分，可以激活SASP的炎症网络，是SASP早期扩散的重要调节器。HMGB2靶向作用于c/EBPβ调控SASP，通过抑制异染色质的扩散来促进SASP基因的表达，细胞衰老期间大量HMGB2与染色质结合，消除了衰老相关异染色质位点(SAHF)对SASP基因的沉默作用，导致IL-8、IL-6等表达增加。
Sirtuins是一种代谢相关、NADH依赖的去乙酰化酶，在不同模型中已发现SIRT1有寿命延长的效应。衰老细胞中SIRT1通过脱乙酰化IL-6和IL-8启动子区组蛋白H3K9和H4K16实现对SASP因子的表达抑制，当敲除SIRT1后，细胞衰老期间这些区域乙酰化水平高于对照组细胞。microRNAs是一类高度保守的单链非编码RNA，长度大约为20～26个核苷酸，在真核细胞中调节基因的表达。研究结果表明，miR-146、miR-34、miR-21和miR-183等可以调节衰老细胞SASP，并能够有效地抑制炎性细胞因子的过度生成。miR-146a/b可以降低人脐静脉内皮细胞中IL-1受体相关激酶的产生；相反抑制miR-146a/b可以提高IL-1受体相关激酶的活性，激活转录因子NF-κB，诱导IL-6和IL-8产生。
表观遗传改变通过影响DNA损伤修复、端粒长度和代谢途径或激活衰老相关基因和miRNAs的表达而影响衰老。多种证据表明染色质状态的改变与细胞衰老的控制密切相关。细胞可以感觉到不同的衰老刺激，这些刺激会激活信号通路，驱动染色质状态的改变。然而，衰老信号引起这种改变的途径仍然很大程度上是未知的。因此，从表观遗传角度揭示细胞衰老及其特定表型发生发展的调控机制，从进而揭示具有靶向价值的关键分子及其信号通路，是衰老生物学和老年医学的一个新兴方向，亟需深入开展相关探索，为临床医学提供重要科学依据和潜在的干预措施。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型细胞衰老干预靶点及其在化疗抗癌中的靶向应用。
在本发明的第一方面，提供KDM4A或KDM4B的下调剂的应用，用于：制备抑制肿瘤耐药性的组合物(较佳地，所述组合物可与化疗药物联用于治疗肿瘤)；与化疗药物联合使用，制备抑制肿瘤、或抑制肿瘤耐药性的组合物；或制备抑制或延缓衰老相关分泌表型(SASP)的组合物。
在本发明的另一方面，提供KDM4A或KDM4B的应用，用于：作为抑制肿瘤耐药性、或筛选抑制肿瘤耐药性药物的靶标(或标志物)；作为抑制或延缓衰老相关分泌表型、或筛选抑制或延缓衰老相关分泌表型药物的靶标(或标志物)；作为对肿瘤耐药性进行诊断或预后的标志物；或制备肿瘤耐药性诊断或预后的诊断试剂。
在一个优选例中，所述的化疗药物为在给药后发生肿瘤耐药的化疗药物；较佳地包括基因毒药物；更佳地包括：米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素，沙铂，顺铂，卡铂，道诺霉素，诺加霉素，阿柔比星，表柔比星，多柔比星，阿糖胞苷，卡培他滨，吉西他滨或5-氟尿嘧啶。
在另一优选例中，所述的肿瘤为具有耐药性的肿瘤；较佳地包括在基因毒药物处理后产生耐药性或肿瘤微环境中产生衰老相关分泌表型的肿瘤；更佳地包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌，肾癌。
在另一优选例中，所述衰老相关分泌表型为DNA损伤情况下发生的衰老相关分泌表型；较佳地，所述的DNA损伤为化疗药物造成的DNA损伤；更佳地，所述化疗药物包括基因毒药物。
在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒，包括：KDM4A或KDM4B的下调剂，以及化疗药物。
在一个优选例中，所述KDM4A或KDM4B的下调剂包括下调KDM4A或KDM4B活性的物质或下调KDM4A或KDM4B的表达水平、稳定性或减少其有效作用时间的物质。
在另一优选例中，，所述下调剂包括：针对KDM4A或KDM4B的化学小分子拮抗剂或抑制剂，敲除或沉默KDM4A或KDM4B的试剂，蛋白酶体。
在另一优选例中，所述针对KDM4A或KDM4B的化学小分子拮抗剂或抑制剂包括：ML324，JIB-04，Z-JIB-04(NSC 693627)。
在另一优选例中，所述敲除或沉默KDM4A或KDM4B的试剂包括：特异性干扰KDM4A或KDM4B的编码基因表达的干扰分子，针对KDM4A或KDM4B的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述定点突变试剂将KDM4A或KDM4B进行功能丧失性突变。
在另一优选例中，所述干扰分子包括siRNA、shRNA，miRNA，反义核酸等，或能形成所述siRNA、shRNA，miRNA，反义核酸等的构建体。
在另一优选例中，所述KDM4A或KDM4B的下调剂和化疗药物按照重量比为：1:1～200；较佳地为1:2～100；更佳地为1:5～50(如1:10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、150、180等)。
在另一优选例中，所述KDM4A或KDM4B的下调剂的终浓度为：1～200μM(如2、3、8、10、15、20、25、30、50、80、100μM等)；较佳地2～150μM；更佳地5～50μM。
在另一优选例中，所述的化疗药物的终浓度为：0.01～100μM(如0.02、0.05、0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、3、5、10、15、20、30、40、60、70μM)；较佳地0.05～80μM；更佳地0.1～50μM。
在另一优选例中，所述的下调剂或组合物还用于：提高基质组织中H3K9/H3K36三甲基化水平；干扰NF-KB活性；降低衰老细胞TSSs和TESs的富集信号；或抑制衰老相关基因的转录激活。
在另一优选例中，所述下调剂或组合物不影响细胞周期。
在另一优选例中，所述下调剂或组合物不影响细胞衰老或细胞周期阻滞。
在另一优选例中，所述抑制或延缓SASP有利于限制SASP促进的肿瘤恶性进展。
在本发明的另一方面，提供一种制备抑制肿瘤的药物组合物或药盒的方法，包括：将KDM4A或KDM4B的下调剂与化疗药物混合；或，将KDM4A或KDM4B的下调剂与化疗药物置于同一药盒中。
在本发明的另一方面，提供一种筛选降低肿瘤耐药性或抑制或延缓衰老相关分泌表型的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达KDM4A或KDM4B；和(2)检测所述体系中KDM4A或KDM4B的表达或活性；若所述候选物质在统计学上能够下调KDM4A或KDM4B的表达或活性，则该候选物质是降低肿瘤耐药性或抑制或延缓衰老相关分泌表型的潜在物质。
在另一优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或，步骤(2)包括：检测所述体系中KDM4A或KDM4B的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上能够下调(显著下调，如下调10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等，或使之不表达或没有活性)KDM4A或KDM4B的表达或活性，则该候选物质是降低肿瘤耐药性或抑制或延缓衰老相关分泌表型的潜在物质。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对KDM4A或KDM4B或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子，小分子化合物等。
在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如表达KDM4A或KDM4B的细胞或细胞培养物)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于抑制肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型有用的物质。
在本发明的另一方面，提供特异性识别或扩增KDM4A或KDM4B的试剂的用途，用于制备对肿瘤耐药性进行诊断或预后的诊断试剂或试剂盒。
在本发明的另一方面，提供所述的诊断试剂包括：特异性结合KDM4A或KDM4B蛋白的结合分子(如抗体或配体)；特异性扩增KDM4A或KDM4B基因的引物；特异性识别KDM4A或KDM4B基因的探针；或特异性识别KDM4A或KDM4B基因的芯片。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、一种基于SILAC的鉴定人源基质细胞系PSC27增殖阶段和衰老阶段蛋白质的技术方案。PRE，增殖细胞。SEN，衰老细胞。
图2、数据经过生物信息学分析后，不同类别蛋白分子的统计柱状图。*已鉴定的蛋白分子(732)。
图3、SILAC鉴定的蛋白分子散点图。蛋白质序列覆盖率根据蛋白分子量绘制(447个可量化)。
图4、代表性二级质谱数据图，表征基于串联质谱(MS/MS)的定量蛋白质组学分析。对于MS扫描，m/z扫描范围为100-1100，在轨道器中检测到完整的肽，分辨率为70,000。
图5、Heatmap描述博莱霉素处理造成的衰老细胞中基因的显著上调。CTRL，对照。BLEO，博莱霉素。基因按照RNA-seq数据由PRE细胞与SEN细胞的表达倍数排列。
图6、化疗药物(TIS)、复制衰竭(RS)或癌基因激活(OIS)诱导PSC27细胞衰老的条件下DNA损伤修复、细胞衰老和SASP中关键分子的免疫印迹分析。PN，细胞代数。HRASG12V，癌基因RAS突变体。
图7、化疗药物(SAT、BLEO和MIT)处理、复制衰竭(REP)或癌基因激活(HRASG12V)后PSC27细胞γH2AX、H3K9me3和H3K36me3的免疫荧光染色。
图8、人前列腺癌(PCa)组织中KDM4A/B表达的组织学图像(化疗前样本)。在每组图片中，左、中柱的图像来自免疫组织化学(IHC)染色，右柱的图像来自苏木精和伊红(HE)染色。上图像中的矩形区域放大成相应的下图像。标尺，100μm。
图9、人前列腺癌(PCa)组织中KDM4A/B表达的组织学图像(化疗后样本)。在每组图片中，左、中柱的图像来自免疫组织化学(IHC)染色，右柱的图像来自苏木精和伊红(HE)染色。上图像中的矩形区域放大成相应的下图像。标尺，100μm。
图10A～B、间质KDM4A/B在PCa组织中表达的病理评估(42例未处理，48例治疗)。左，KDM4A。右，KDM4B。在每组中，患者根据间质组织中IHC染色强度对应的病理级别被划分为4类。1，阴性；2，弱；3，中度；4，强。
图11A～B、化疗前后KDM4A/B在转录水平的表达比较分析。对上皮细胞和基质细胞进行激光捕获，分别得到两个细胞谱系后进行定量分析。每个点代表一个单独的病人，连接化疗“前”和“后”的数据，使得可以在同一个病人中直接分析KDM4A/B的表达趋势。
图12、化疗后PCa患者间质中KDM4A/B、CXCL8和WNT16B的病理相关性。评分来源于分子特异性IHC染色的评估，表达水平通过低(绿松石色)和中(黄色)到高(红色)信号强度着色以反映变化趋势。列表示单个病人，行代表不同的分子。共对48例治疗后患者进行分析，每个患者的评分来自为3个独立的病理读数平均值。
图13A～D、在48例具有匹配蛋白表达评估数据的肿瘤中，KDM4A、KDM4B和CXCL8/WNT16B病理评分之间的统计相关性(Pearson分析，r＝0.97；P<0.0001)。
图14A～B、Kaplan-Meier分析PCa患者。无病生存(DFS)根据KDM4A、KDM4B表达分层(KDM4A，低，平均分<2，绿线，n＝20；高，平均分≥2，红线，n＝28)(KDM4B，低，平均分<2，黄线，n＝20；高，平均分≥2，品红线，n＝28)。DFS表示从PCa诊断日到第一次疾病复发点之间的周期长度(月)。根据Kaplan-Meier方法生成的生存曲线，用对数秩(Mantel-Cox)检验计算p值。
图15、博莱霉素处理诱导的PSC27衰老细胞免疫印迹结果。不同时间点(0，1h，6h，24h，3d，7d，10d)收集的细胞经裂解后分析其DNA损伤，KDM4因子，H3K9和H3K36位点甲基化程度，以及p16INK4a和p21CIP1的表达水平。
图16(A～D)-17(A～D)、DNA损伤处理之后基质细胞KDM4家族成员和IL6、CXCL8、p16INK4A和p21CIP1转录表达的时间过程测量。
图18、BLEO和/或环己酰胺(CHX)处理基质细胞KDM4表达的免疫印迹分析。在特定的时间点收集细胞裂解物。
图19、BLEO和/或MG132处理的基质细胞中KDM4表达水平的免疫印迹评估结果。
图20A～B、免疫沉淀(IP)评价KDM4蛋白翻译后修饰，然后进行免疫印迹试验。用BLEO和/或MG132处理PSC27细胞，并在体外损伤后第7天进行裂解分析。抗KDM4A/B用于IP，用KDM4A/B抗体进行免疫印迹试验。用抗泛素抗体检测KDM4A/B的泛素化分布。
图21、BLEO和/或MG132处理的基质细胞中KDM4表达的免疫印迹评估。在特定的时间点收集细胞裂解物。
图22、基质细胞KDM4A/B和p-53BP1的免疫荧光染色有代表性图像。
图23A～B、统计对比在对照(CTRL)和衰老(SEN)细胞中出现KDM4A/B和p-53BP1核共定位的细胞。标尺，5μm。
图24、染色质断裂后KDM4和H3K9/H3K36甲基化的免疫印迹评估。组蛋白H3，核裂解物的上样对照。
图25、转录水平上SASP表达的定量评估。用编码人KDM4A的慢病毒转导PSC27细胞并经BLEO处理，然后收集细胞进行分析。
图26、免疫印迹法检测DNA损伤修复(DDR)信号、H3K9/H3K36甲基化和SASP在不同方式处理下的细胞中表达。KDM4A表达载体用于慢病毒转染PSC27细胞。
图27、免疫印迹法检测DNA损伤修复(DDR)信号、H3K9/H3K36甲基化和SASP在不同方式处理下的细胞中表达。KDM4B表达载体用于慢病毒转染PSC27细胞。
图28、PSC27细胞分别经过SA-β-GAL和BrdU染色后的代表性图像。KDM4A表达载体用于慢病毒转染PSC27细胞。
图29A～B、基质细胞染色结果的比较统计。A，SA-β-GAL染色。B，BrdU染色。
图30、PSC27细胞分别经过SA-β-GAL和BrdU染色后的代表性图像。KDM4B表达载体用于慢病毒转染PSC27细胞。
图31A～B、基质细胞染色结果的比较统计。A，SA-β-GAL染色。B，BrdU染色。
图32、Heatmap显示DNA损伤和选择性化学抑制剂ML324对PSC27细胞转录表达谱的影响。基因排序基于表达上调倍数。红星，受ML324影响的典型SASP因子。
图33、GO谱图分析展示的关键生物活性和差异信号通路。当衰老细胞被ML324处理时，显著富集的基因被下调并根据其倍数变化进行排序。
图34、Venn图显示BLEO上调基因(673，相对于CTRL)和下调基因的ML324(348，相对于BLEO)。
图35、免疫印迹法检测KDM4家族A和B、H3K9/H3K36甲基化、p16INK4a/p21CIP1和SASP在不同方式处理下的细胞中表达。KDM4特异性抑制剂ML324用于处理PSC27细胞。
图36A～B、BLEO/ML324共处理细胞，对其中具有显著富集分数的基因进行GSEA谱显示。A，SASP表达标签用作参照分析基因集。B，NF-kB表达标签用作参照分析基因集。
图37A～B、BLEO和/或ML324处理后基质细胞的体外菌落形成实验。左，结晶紫染色代表性图像。右，统计比较。
图38A～B、BLEO和/或ML324处理后基质细胞的SA-β-Gal染色实验。左，SA-β-Gal染色代表性图像。右，统计比较。
图39A～B、BLEO和/或ML324处理后基质细胞的BrdU染色实验。左，BrdU染色代表性图像。右，统计比较。
图40、Heatmap显示DNA损伤和选择性化学抑制剂ML324对PSC27细胞转录表达谱的影响。基因排序基于表达下调倍数。
图41A～D、SASP典型因子(CXCL8、CSF2、CXCL1和IL6)的时间表达曲线。细胞接受BLEO和/或ML324处理7天后收集、裂解用作分析。
图42、PSC27细胞接受BLEO和/或ML324处理7天后收集其相应的胞外液(CM)用于培养前列腺癌细胞(PC3/DU145/LNCaP/M12)，检测其细胞数量判断增殖速度。
图43、PSC27细胞接受BLEO和/或ML324处理7天后收集其相应的胞外液(CM)用于培养前列腺癌细胞(PC3/DU145/LNCaP/M12)，以transwell检测其在培养条件下的迁移能力。
图44、PSC27细胞接受BLEO和/或ML324处理7天后收集其相应的胞外液(CM)用于培养前列腺癌细胞(PC3/DU145/LNCaP/M12)，以transwell检测其在培养条件下的侵袭潜力。
图45A～B、PSC27细胞接受BLEO和/或ML324处理7天后收集其相应的胞外液(CM)用于培养前列腺癌细胞(PC3/DU145/LNCaP/M12)，以MIT作为细胞毒药物分析其在IC50浓度下的耐药程度。左，统计结果。右，PC3细胞的代表性图片
图46、增殖细胞、衰老细胞(BLEO诱导)和BLEO/ML324共处理细胞(分别标记为CTRL、BLEO和BLEO/ML324)之间1000个最活跃基因的ATAC-seq富集度信号去噪分析。
图47A～B、Heatmap显示SASP标记基因(RNA-seq，左)的表达(FPKM)和可评估的染色质富集(RPKM)(ATAC-seq，右)在其启动子(TSS±2.5kb)区域信号对比。作为示例的SASP因子基因与每种类型的热图平行分析并展示。4
图48、GO分析结果表明在增殖与衰老细胞之间，一些基因出现显著的表达倍数变化，但在ML324处理后受到明显抑制。衰老细胞中所有上调基因的数量百分比，每类P值log10 p<0.05为显著。
图49、Heatmap显示ATAC-seq富集的峰附近的可接近的启动子(3.0kb上游的TSS和下游的TES每个基因)在每组检测样本中的异同点。收集所有活性TSSs和TESs的富集信号，通过基因表达值的上限分析进行分类，并通过层次聚类定义峰值。选择前1000个富集信号基因进行分析。
图50、Heatmap显示ATAC-seq富集的峰附近的可接近的启动子(3.0kb上游的TSS和下游的TES每个基因)在每组检测样本中的相对情况。在每个样本的整个基因组范围进行评估。
图51、每组样品中从远端ATAC-seq峰中鉴定出转录因子(TF)基序。在每个样品中只有TFs表达可检测(FPKM≥5)和基序富集P<1×10-10。
图52、UCSC genome browser视图显示增殖细胞、衰老细胞(BLEO诱导)和BLEO/ML324共处理后细胞特定基因的启动子区域开放信号富集度。COMMD9，PRR5L，TRAF6，RAG1和IFTAP，均为细胞衰老非相关基因。
图53、UCSC genome browser视图显示增殖细胞、衰老细胞(BLEO诱导)和BLEO/ML324共处理后细胞特定基因的启动子区域开放信号富集度。IL-1β，SASP典型因子。
图54、UCSC genome browser视图显示增殖细胞、衰老细胞(BLEO诱导)和BLEO/ML324共处理后细胞特定基因的启动子区域开放信号富集度。CXCL1，SASP典型因子。
图55、UCSC genome browser视图显示增殖细胞、衰老细胞(BLEO诱导)和BLEO/ML324共处理后细胞特定基因的启动子区域开放信号富集度。AREG，SASP典型因子。
图56、UCSC genome browser视图显示增殖细胞、衰老细胞(BLEO诱导)和BLEO/ML324共处理后细胞特定基因的启动子区域开放信号富集度。IL6，SASP典型因子。
图57、UCSC genome browser视图显示增殖细胞、衰老细胞(BLEO诱导)和BLEO/ML324共处理后细胞特定基因的启动子区域开放信号富集度。SPINK1，SASP典型因子。
图58、UCSC genome browser视图显示增殖细胞、衰老细胞(BLEO诱导)和BLEO/ML324共处理后细胞特定基因的启动子区域开放信号富集度。WNT16B，SASP典型因子。
图59、UCSC genome browser视图显示增殖细胞、衰老细胞(BLEO诱导)和BLEO/ML324共处理后细胞特定基因的启动子区域开放信号富集度。COMMD9，PRR5L，TRAF6，RAG1和IFTAP,均为细胞衰老及SASP非相关基因。
图60、UCSC genome browser视图显示增殖细胞、衰老细胞(BLEO诱导)和BLEO/ML324共处理后细胞特定基因的启动子区域开放信号富集度。CDKN2A，细胞衰老标记性CDKI分子。
图61、UCSC genome browser视图显示增殖细胞、衰老细胞(BLEO诱导)和BLEO/ML324共处理后细胞特定基因的启动子区域开放信号富集度。TP53，细胞衰老标记性上游调控分子。
图62、非肥胖糖尿病和严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠预临床试验的示意图。在皮下植入和体内摄取组织重组体两周后，动物接受单一(单)或组合(双)药经过几个周期组成的节拍式治疗。
图63、预临床试验小鼠给药时间和给药方式示意图。每两周为一次给药周期，在第3/5/7周的第一天分别对小鼠腹腔给药。8周疗程结束后，解剖小鼠并进行病理鉴定与表达分析。
图64A～B、肿瘤终端体积统计分析。PC3细胞单独或与PSC27细胞共同移植到NOD/SCID小鼠的后侧。化疗药物MIT单独或与KDM4抑制剂ML324一起诱导肿瘤消退。右侧，代表性肿瘤图像。
图65、临床前试验中PC3/PSC27荷瘤动物的代表性BLI图像。数字信号与IVIS装置测量的体内荧光素酶活性成正比。
图66A～B、SA-β-GAL染色法比较肿瘤组织内细胞衰老的影像学。在动物解剖时获取其肿瘤组织，并随即制备冷冻切片。标尺，200μm。右，小提琴统计图。
图67A～G、从NOD/SCID小鼠肿瘤分离的基质细胞中几种典型SASP因子(包括IL6/CXCL8/SPINK1/WNT16B)在体内表达对比统计分析。用LCM技术将基质细胞和癌细胞分别进行特异分离、制备总RNA并用于SASP表达检测。
图68A～B、从NOD/SCID小鼠肿瘤分离的基质细胞中p16和p21在体内表达对比统计分析。用LCM技术将基质细胞和癌细胞分别进行特异分离、制备总RNA并用于表达分析。
图69A～B、IHC染色对比分析不同药物处理条件下小鼠肿瘤组织中KDM4A和KDM4B的表达情况。左，KDM4A；右，KDM4B。
图70、不同处理条件下动物肿瘤组织分离的基质细胞中SASP因子表达的定量评价。每个因子的信号均同其在安慰剂组动物数据进行规范化。
图71、预临床过程中收集的小鼠肿瘤样本内DNA损伤和细胞凋亡的统计评估。数值显示为用抗γ-H2AX或Caspase3(cleaved)抗体经IHC染色后的阳性细胞的百分比。
图72、预临床治疗治疗结束时肿瘤中Caspase3(cleaved)的代表性IHC图像。安慰剂处理组动物的活检样本作为MIT处理小鼠的阴性对照。标尺，100μm。
图73、严重疾病大鼠的长期生存比较统计学。从重组组织移植至皮下至动物死亡当天为计算存活时间。通过对Mantel-Cox测试分析获得生存数据。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，揭示了组蛋白去甲基化酶KDM4A或KDM4B可以作为细胞衰老干预以及肿瘤药物耐药性干预的新型靶点。以其作为靶标，可开发抑制肿瘤耐药性的药物、抑制或延缓衰老相关分泌表型的药物，以及对相关疾病或症状进行诊断、预后评估。
KDM4A或KDM4B
在本发明中，术语“KDM4A”指具有GenBank登录号ID 9682(人)的蛋白。
在本发明中，术语“KDM4B”指具有GenBank登录号ID 23030(人)的蛋白。
上述术语“KDM4A”或“KDM4B”还包括具有与KDM4A或KDM4B相同功能的序列的变异形式。这些变异形式包括但并不限于：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括KDM4A或KDM4B的活性片段和活性衍生物。
上述术语“KDM4A”或“KDM4B”还包括与上述GenBank登录号所限定的多肽序列的同源性为80％或更高；更优选地同源性为85％或更高，如同源性90％，95％，98％或99％)的、且具有本发明中实施例中所涉及的KDM4A或KDM4B相同功能的蛋白也包括在本发明内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸或多肽之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。
编码KDM4A或KDM4B或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列(编码序列)也可以应用到本发明中。术语“编码基因”可以是包括编码所述蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明人的研究工作中，发现衰老细胞组蛋白H3赖氨酸位点的表观基因修饰发生显著变化，临床癌症患者组织内受损的肿瘤微环境(TME)中基质细胞KDM4A/B的表达与不良预后有关(负相关)，KDM4A或KDM4B表达上调伴随着衰老细胞H3K9/H3K36甲基化降低，且KDM4A或KDM4B在不影响衰老的情况下可以功能性调节SASP表达。
在上述发现的基础上，本发明人特异性抑制KDM4A或KDM4B活性，发现靶向KDM4的去甲基酶活性可以有效抑制SASP表达，抑制KDM4A或KDM4B后大部分SASP因子在衰老细胞中的表达明显降低。因此，用抑制剂靶向控制KDM4的去甲基酶活性可以在不影响细胞衰老的情况下延缓SASP的发展，从而限制SASP促进癌症恶性进展的潜力。
进一步地，本发明人通过动物试验发现，选择性靶向KDM4治疗可以避免化疗耐药并显著提高总体疗效。经典化疗联合KDM4靶向抑制剂可诱导肿瘤消退，其指标明显优于单纯化疗造成的结果，接受化疗药物+KDM4抑制剂联合治疗的动物表现出最长的中位生存期，比单独使用化疗药物治疗的动物获得至少多出50％的生存时间。
这些结果揭示，KDM4A或KDM4B在正常和病理性状态中起着关键的功能，可以作为细胞衰老干预以及肿瘤药物耐药性干预的新型靶点。
KDM4A或KDM4B下调剂及其应用
基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种KDM4A或KDM4B或其编码基因的下调剂的用途，用于制备抑制肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型的药物组合物。
在本发明中，除非另外说明，所述的“肿瘤”为具有耐药性的肿瘤。较佳地，所述肿瘤包括在基因毒药物处理后产生耐药性或肿瘤微环境中产生衰老相关分泌表型的肿瘤；更佳地包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌，肾癌。
在本发明的一些方式中，所述“衰老相关分泌表型”为DNA损伤情况下发生的衰老相关分泌表型；较佳地，所述的DNA损伤为化疗药物造成的DNA损伤；更佳地，所述化疗药物包括基因毒药物。
如本文所用，所述的KDM4A或KDM4B或其编码基因的下调剂包括了抑制剂、拮抗剂剂、阻滞剂、阻断剂等，这些术语可互换使用。
所述的KDM4A或KDM4B或其编码基因的下调剂是指任何可降低KDM4A或KDM4B的活性、降低KDM4A或KDM4B或其编码基因的稳定性、下调KDM4A或KDM4B的表达、减少KDM4A或KDM4B有效作用时间、或抑制KDM4A或KDM4B基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调KDM4A或KDM4B有用的物质，从而可用于抑制肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型。例如，所述的下调剂是：特异性干扰KDM4A或KDM4B基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性与KDM4A或KDM4B基因编码的蛋白结合的抗体或配体，等等。
作为本发明的一种选择方式，所述的下调剂可以是针对KDM4A或KDM4B的小分子化合物。本领域技术人员可以采用本领域的常规筛选方法，来进行这类小分子化合物的筛选。例如，本发明的实施例中，提供了一种可选的筛选方法。
在本发明的优选方式中，所述的下调剂为靶向于KDM4A或KDM4B的小分子化合物ML324。在本发明具体实施例中，动物实验显示，在化疗药物MIT和ML324联合治疗时，ML324可显著抑制肿瘤耐药性，从而促进了化疗药物的抑制肿瘤的有效性，显著提高动物的存活率。同时，在本发明具体实施例中，ML324的运用也显著地延缓了SASP。
在本发明的优选方式中，所述的下调剂可以为蛋白酶体，或是蛋白酶体的上调剂。本发明人发现，在细胞通透性蛋白酶体抑制剂存在下，KDM4A/B的蛋白水平得以升高。由此可见，蛋白酶体本身或其上调剂，可以通过介导KDM4A/B的降解作用，来降低该两种因子或其一的活性，从而发挥抑制肿瘤的耐药性或延缓SASP的作用。
作为本发明的一种可选的方式，所述的下调剂可以是KDM4A或KDM4B特异性的干扰RNA分子(shRNA)，本发明人可以理解到，根据本发明中提供的KDM4A或KDM4B基因序列，可以制备获得此类干扰RNA分子。对干扰RNA分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。所述的干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
作为本发明的一种可选的方式，可采用CRISPR/Cas(如Cas9)系统进行靶向的基因编辑，从而在靶向疾病的区域敲除KDM4A或KDM4B基因。常见的敲除KDM4A或KDM4B基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9 mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的核酸共转到靶向区域或靶向细胞中。在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到细胞内。所述的能形成所述sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，或所述的能形成所述Cas9 mRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA及Cas9 mRNA。
以上为一些代表性的下调KDM4A或KDM4B的方式，应理解，在本领域技术人员了解了本发明的总体方案后，还可以采取本领域已知的其它方法来对KDM4A或KDM4B进行调控，这些方法也包含在本发明中。
诊断及预后评估相关的应用
本发明中，揭示了对肿瘤耐药性或SASP的发生和发展有着重要调控作用的靶标。基于本发明人的这一新发现，可以将KDM4A或KDM4B作为抑制肿瘤耐药性、或筛选抑制肿瘤耐药性药物的靶标(或标志物)：(i)进行肿瘤的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的肿瘤耐药性治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法。比如，可分离出由KDM4A或KDM4B基因表达异常的人群，从而可进行更有针对性的治疗。
可以通过判断待评估样本中KDM4A或KDM4B的表达情况或活性情况，来预测提供该待评估样本的受试者的肿瘤或SASP预后情况，选择合适的药物实施治疗。通常，可以规定一个KDM4A或KDM4B的阈值，当KDM4A或KDM4B的表达情况高于所规定的阈值时，考虑采用抑制KDM4A或KDM4B的方案进行治疗。所述的阈值对于本领域技术人员而言是易于确定的，例如可以通过将正常人细胞或组织中的KDM4A或KDM4B的表达情况与患者细胞或组织中的KDM4A或KDM4B的表达情况进行比较后，获得KDM4A或KDM4B表达异常的阈值。
可采用各种本领域已知的技术来检测KDM4A或KDM4B基因的存在与否以及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。
本发明还提供了用于在分析物中检测KDM4A或KDM4B或其编码基因的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增KDM4A或KDM4B的引物；或特异性识别KDM4A或KDM4B的探针来确定KDM4A或KDM4B基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合KDM4A或KDM4B编码的蛋白的抗体或配体来确定KDM4A或KDM4B的表达情况。
针对KDM4A或KDM4B基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与KDM4A或KDM4B基因上特定位点发生特异性结合，而不与KDM4A或KDM4B基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。
利用特异性结合KDM4A或KDM4B的抗体来检测分析物中KDM4A或KDM4B表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。
本发明还提供了用于在分析物中检测KDM4A或KDM4B基因的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增KDM4A或KDM4B基因的引物；特异性识别KDM4A或KDM4B基因的探针；或特异性结合KDM4A或KDM4B基因编码的蛋白的抗体或配体。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。
药物筛选
在得知了KDM4A或KDM4B的高表达或高活性与肿瘤耐药性或SASP的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制KDM4A或KDM4B或其编码基因的表达或活性的物质。可从所述的物质中找到对于抑制肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型真正有用的药物。
因此，本发明提供一种筛选抑制肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达KDM4A或KDM4B的体系；和检测所述体系中KDM4A或KDM4B的表达或活性；若所述候选物质可抑制KDM4A或KDM4B的表达或活性，则表明该候选物质是抑制肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型的潜在物质。所述的表达KDM4A或KDM4B的体系较佳的是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达KDM4A或KDM4B的细胞；或可以是重组表达KDM4A或KDM4B的细胞。此外，也可通过观测KDM4A或KDM4B与其上下游蛋白的相互作用情况，来评估所述潜在物质是否是有用的。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到KDM4A或KDM4B的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达KDM4A或KDM4B的体系。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型真正有用的物质。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的抑制肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制KDM4A或KDM4B的表达和活性，进而抑制肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型有用的物质。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的KDM4A或KDM4B或其编码基因的下调剂，以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种优选方式，提供了一种用于抑制肿瘤耐药性或抑制/延缓衰老相关分泌表型的组合物，所述的组合物含有有效量的KDM4A或KDM4B或其编码基因的下调剂，以及药学上可接受的载体。较佳地，所述的下调剂是特异性敲除KDM4A或KDM4B编码基因的基因编辑试剂，该基因编辑试剂识别KDM4A或KDM4B编码基因并敲除该基因，或能表达或形成所述基因编辑试剂的构建物。
如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
在得知了所述KDM4A或KDM4B或其编码基因的下调剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的下调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物或人。
优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将KDM4A或KDM4B的下调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带KDM4A或KDM4B的下调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的KDM4A或KDM4B下调剂，具体情况需视所述的下调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。
本发明所述的KDM4A或KDM4B或其编码基因的下调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的KDM4A或KDM4B或其编码基因的下调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
本发明的具体实施例中，给出了一些针对动物如鼠的给药方案。从动物如鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据Meeh-Rubner公式来进行计算：Meeh-Rubner公式：A＝k×(W2/3)/10,000。式中A为体表面积，以m2计算；W为体重，以g计算；K为常数，随动物种类而不同，一般而言，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。应理解的是，根据药物以及临床情形的不同，根据有经验的药师的评估，给药剂量的换算是可以变化的。
本发明还提供了含有所述的药物组合物或直接含有所述的KDM4A或KDM4B或其编码基因的下调剂的药盒。此外，所述的药盒中还可包括说明药盒中药物的使用方法的说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
1.细胞培养
(1)细胞系维持
正常人源前列腺原代基质细胞系PSC27(获自美国弗雷德哈青森癌症研究中心)于PSCC完全培养液中增殖和传代。前列腺癌上皮细胞系DU145，PC3，LNCaP和M12(购自ATCC)均在5％FBS的RPMI-1640完全培养液中、于37℃、5％CO2条件的培养箱中培养。
(2)细胞冻存与复苏
细胞冻存：以0.25％胰蛋白酶收集对数生长期细胞，1000rpm离心2min，弃上清，重新悬浮细胞于新鲜配置的冻存液中。分装细胞于已标示的无菌冻存管中。然后经梯度降温(4℃10min，-20℃30min，-80℃16-18h)，最后转入液氮中长期储存。
细胞复苏：取出液氮中冻存的细胞，立即放入37℃水浴，使其快速融化。直接加入2ml细胞培养液，使细胞均匀悬浮。待细胞贴壁后，更换新的培养液。
(3)体外实验处理
为造成细胞损伤，PSC27细胞生长至80％(简称PRE)时培养液中加入50μg/ml博来霉素(bleomycin，BLEO)。药物处理6小时后，细胞被PBS简单洗过3次，留置于培养液中7～10天，然后进行后续实验。
2.质粒制备和慢病毒转染
全长人源KDM4A(GenBank登录号ID 9682)、KDM4B(GenBank登录号ID 23030)分别克隆在慢病毒表达载体pLenti-CMV/To-Puro-DEST2(Invitrogen)酶切位点BamHI和SmaI之间、pLVX-Puro(Addgene)酶切位点XhoI和XbaI之间。包装系293FT被用于细胞转染和慢病毒制造。用于敲除这两个基因的small hairpin RNAs(shRNAs)靶序列分别为：
KDM4A：
(1)GCACCGAGTTTGTCTTGAAAT(SEQ ID NO:1)；
(2)TTCGAGAGTTCCGCAAGATAG(SEQ ID NO:2)；
(3)TAGTGAAAGGACGAGCCATTT(SEQ ID NO:3)；
KDM4B：
(1)GCGGCAGACGTATGATGACAT(SEQ ID NO:4)；
(2)GCGGCATAAGATGACCCTCAT(SEQ ID NO:5)
(3)GATGACCTTGAACGCAAATAC(SEQ ID NO:6)。
3.免疫荧光和组化分析
小鼠单克隆抗体anti-phospho-Histone H2A.X(Ser139)(clone JBW301，Millipore)和兔多抗anti-H3K9me3(Cat#ab8898，Abcam)，兔多抗anti-H3K36me3(Cat#A2366，ABclonal)及二级抗体Alexa
Figure BDA0002567270350000191
488(or 594)-conjugated F(ab’)2按顺序加入到覆有固定细胞的载玻片上。细胞核用2μg/ml of 4’，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)进行复染。FV1000激光扫描共聚焦显微镜(Olympus)用于获取细胞共聚焦荧光图像。
临床前列腺癌患者组织IHC染色所用H3K9me3、H3K36me3抗体同上，分别购自Abcam和ABclonal；兔多抗anti-KDM4A(Cat#ab24545，abcam)和兔多抗anti-KDM4B(Cat#8639，Cell signaling)配合染色使用。具体步骤如下：常规脱蜡，用0.6％H2O2甲醇在37℃孵育30min，然后用0.01M pH 6.0的柠檬酸缓冲液修复20min，室温冷却30min。用正常羊血清封闭20min，用一抗(1:200)在37℃孵育1h，移至4℃冰箱过夜。第二天用TBS洗三次，以二抗(HRP偶联的羊抗兔)在37℃孵育45min，再用TBS洗3次，最后用DAB显色。
4.基质-上皮共培养和体外药物实验
用DMEM+0.5％FBS的培养液培养PSC27细胞3天，然后以1倍PBS清洗满丰度的细胞群。简单离心后收集上清作为条件性培养基存放-80℃或直接使用。前列腺上皮细胞在这种条件性培养基中连续培养3天的时间里开展体外实验。对于化疗抗性，上皮细胞系在低血清DMEM(0.5％FBS)(简称“DMEM”)中，或条件性培养基中培养，同时米托蒽醌(MIT)用于处理细胞1至3天，浓度接近各个细胞系的IC50数值，随后在亮场显微镜下进行观察。
5.全基因组范围表达芯片分析(RNA-seq)
对正常人源前列腺原代基质细胞系PSC27进行全基因组范围二代测序(PE150)分析的程序和方法参见Zhang，B.等，2018.The Senescence-Associated SecretoryPhenotype Is Potentiated by Feedforward Regulatory Mechanisms InvolvingZscan4 and TAK1.Nat Commun.9:1723.DOI:10.1038/s41467-018-04010-4)。
6.定量PCR(RT-PCR)测定基因表达
(1)细胞总RNA的提取
以Trizol法进行提取。分光光度计定量RNA之后，取少量总RNA进行1％琼脂糖电泳，检查RNA状态和质量。
(2)常规方法进行逆转录反应。
(3)常规方法进行实时定量PCR反应。
7.Western blot分析
(1)细胞总蛋白抽提；(2)BCA法蛋白定量；(3)SDS-PAGE电泳；(4)蛋白转膜；(5)抗体标记和ECL检测。
8.临床前列腺癌患者组织样本获取和分析
化疗药物方案根据去势抵抗性前列腺癌患者(临床试验注册号NCT03258320)的病理学特征指定。临床分期为原发癌在I subtype A(IA)(T1a，N0，M0)以上但没有明显远端转移病灶的患者被招募至临床队列中。同时，年龄40-75岁经临床确诊为PCa，或者年龄大于18岁在组织上被证实有渗透性BCa的患者、年龄小于75岁经临床确诊为CRC的患者方被招募。所有患者均被提供知情同意书并签字确认。有关肿瘤大小，组织类型，肿瘤渗透，淋巴结转移和病理TNM疾病阶段的数据从病理记录系统获取。肿瘤加工为FFPE样本并处理成组织学切片以供评估。OCT冰冻切片经LCM选择性分离，用于基因表达分析。特别地，根据先前报道的方法(Sun，Y.等，Treatment-Induced Damage to the Tumor MicroenvironmentPromotes Prostate Cancer Therapy Resistance through WNT16B.Nat Med.18:1359-1368.DOI:10.1038/nm.2890)，化疗前后的腺体相关基质细胞经LCM分离。免疫活性评分(IRS)根据每一组织样本的组化染色呈色深浅分别归类于0-1(阴性)，1-2(若)，2-3(中)，3-4(强)四类(Fedchenko and Reifenrath，2014)。PCa样本的诊断由彼此独立的病理学医生进行判断和评分。随机对照试验(RCT)方案和所有实验程序均经上海交通大学医学院IRB批准和授权，并根据权威指导原则逐步开展。
9.染色质分馏
为了评估染色质结合部分KDM4家族成员的水平，CTRL和BLEO处理的PSC27细胞与1％甲醛交联5min，用0.125m甘氨酸猝灭；然后，用1×PBS洗涤细胞三次，用缓冲液A(10mmHEPES，pH7.9，10mm KCL，1.5mM MgCl2，10％甘油，0.34M蔗糖，1mM DTT，0.1％Triton，PMSF和蛋白酶抑制剂)在4℃下孵育10min。细胞裂解物在1500×g离心5min，4℃，上清液去除。将颗粒重新悬浮在缓冲液B(3mM EDTA、0.2mM EGTA、1mM DTT、PMSF和蛋白酶抑制剂混合物)中，在冰上孵育10分钟，然后在1，700×g下离心5分钟，4℃。为了制备染色质结合组分，在37℃下用含有1mM CaCl2和0.6单位MNase的缓冲液A孵育30min，在4℃下20，000×g离心10min，收集上清液并进行免疫印迹分析。
10.用于细胞培养稳定同位素标记技术(SILAC)的样品制备
在含10％FBS和1％青霉素/链霉素的高糖(4.5g/L)DMEM培养基中，在含95％空气和5％CO2的37℃下，将PSC27细胞培养到80％丰度。根据制造商的建议，用“重同位素赖氨酸”(13C-赖氨酸)或“轻同位素赖氨酸”(12C-赖氨酸/精氨酸)标记细胞。简言之，对照组的细胞用L-13C6-赖氨酸/L-13C6 15N4-精氨酸标记为“重”类，实验组的细胞用L-赖氨酸/L-精氨酸标记为“轻”类。在每种情况下，细胞在收获前培养6代以上。在实验之前至少有一段时间，在一个预实验中评估了重标记氨基酸在蛋白质中的掺入效率，其中细胞内蛋白质的一小部分被裂解、还原、烷基化和胰蛋白酶消化，并进行质谱(MS)分析，如下所述。重标记物从对照(非衰老)细胞中掺入蛋白质被评估为>99％。
对于蛋白质组学，在收获前24小时，铺层的细胞(大约5×108，在15个150cm2瓶)用新鲜的无FBS介质洗涤三次，10分钟，均在37℃进行。然后将细胞在无FBS培养基(每瓶12毫升)中孵育24小时，37℃。在培养期结束时，细胞没有凋亡的证据。制备了MS分析样品，包括用50mM Tris-Cl(pH8.0)(5个洗涤步骤，用自旋柱在5000×g)进行缓冲交换去除酚红染料。样品用6M尿素变性，用20mM DTT还原(37℃30分钟)，用50mM碘乙酰胺烷基化(RT30分钟)，用1：50的酶：底物比，测序级胰蛋白酶(Promega，Madison，WI)在37℃过夜消化。消化后，样品用甲酸酸化，用HLB绿洲SPE盒(Water，Milford，MA)脱盐。蛋白质/肽回收没有具体评估，然而上述样品的制备和消化方案在以前的优化和重现性研究中彻底评估其重现性。亲水相互作用液相色谱(HILIC)肽分馏法是在1525HPLC系统上进行的，该系统配备了4.6×25mm TSK凝胶酰胺-80小时5mm柱(Tosoh Bioscience，South San Francisco，CA)。样品装在80％溶剂B(98％acetonitrile，0.1％TFA)中，用以下梯度洗脱：80％B 5min，80％B-60％B 40min，0％B 5min，0.5ml/min。溶剂A由98％HPLC级水和0.1％TFA组成，收集9个组分。
11.质谱分析
用反相HPLC-ESI-MS/MS对样品进行分析，采用Eksigent Ultra Plus nano-LC 2DHPLC系统(Dublin，CA)连接到quadrupole time-of-flight TripleTOF 5600(QqTOF)massspectrometer(SCIEX)。通常，MS1扫描和相应前体离子的质量分辨率为～35,000(5600的三重态)，而MS/MS扫描和所产生的碎片(MRM-HR transitions)的分辨率为～15,000(“高灵敏度”产品离子扫描模式)。简言之，注射后，肽混合物被转移到分析级C18-nanocapillaryHPLC column(C18 Acclaim PepMap100，75mm I.D.×15cm，3mm particle size，100A°poresize，Dionex，Sunnyvale，CA)，用5％到80％溶剂B的逐步梯度洗脱，总运行时间为90min，包括流动相平衡。溶剂流动相A为2％acetonitrile/98％of 0.1％formic acid(v/v)在水中，流动相B为水中0.1％甲酸(v/v)的98％乙腈/2％。在TripleTOF 5600的数据依赖采集(DDA)模式下进行数据采集，在每次测量MS1扫描(250msec)后，获得30个最丰富有的前体离子(50msec per MS/MS))的MS/MS光谱，产生1.8秒的总周期时间。
12.基质细胞克隆形成
用血细胞计对PSC27细胞进行胰蛋白酶化和计数。在六孔板的每个孔中铺上两毫升DMEM全介质，培养500个细胞。在绝对甲醇中用0.5％结晶紫(Sigma-Aldrich)染色前，将细胞保持在37℃7天，以形成集落。对每孔菌落进行计数，并通过3个独立实验记录数量。
13.癌细胞表型鉴定
上皮细胞增殖按MTT法(Promega)进行测定。用含有多孔(8μm pore size)膜的Transwells(Cultrex 24孔细胞迁移实验板)在培养条件下评估迁移和侵袭(用于迁移试验)或用0.5×的基底膜提取液和孔底指示的CM胞外液(用于侵袭试验)。在24h后，根据供应商的建议，对多孔膜底部的迁移或入侵细胞进行染色和吸光度定量。
14.组织学和免疫组织化学
小鼠组织标本在10％neutral-buffered formalin中过夜固定，并进行石蜡包埋处理。用苏木精/伊红对每个标本块处理的5-8μm厚度切片进行标准染色。在免疫组织化学中，组织切片被去石蜡化，并在95℃的柠檬酸盐缓冲液中孵育40min，然后在4℃下与所指示的抗体孵育一夜。用PBS洗涤3次后，组织切片与生物素偶联的抗鼠IgG(1:200dilution，Vector Laboratories)在室温下孵育1h，然后洗涤三次，然后加入streptavidin-horseradish peroxidase conjugates(Vector Laboratories，CA，USA)，玻片孵育45min。后加入DAB溶液(Vector Laboratories)，用苏木精对玻片进行染色。
15.生物信息学数据库搜索和SILAC定量
使用数据库搜索引擎ProteinPilot(SCIEX Beta 4.5，revision 1656)和Paragonalgorithm(4.5.0.0，1654)搜索MS数据。搜索参数设置为：胰蛋白酶消化、半胱氨酸烷基化设置为碘乙酰胺、SILAC Quantification(Lys-6、Arg-6、无偏校正)和Homo sapiens作为物种。胰蛋白酶特异性被认为是赖氨酸和精氨酸处的C端切割。处理参数设置为“生物修饰”，并使用了彻底的ID搜索努力。在搜索过程中，Protein Pilot根据高度自信的肽谱对数据集进行自动质量重新校准。具体来说，第一次搜索迭代是为了选择高置信肽标识来重新校准MS和MS/MS数据，然后自动重新搜索。在重新搜索数据的迭代步骤中，搜索参数不那么严格，例如允许额外的“missed cleavages”(通常不超过2)。
所有数据文件都是使用Swissprot(2014年1月22日发布)搜索的，总共搜索了40，464个人类“审查”的蛋白质序列。选择截止肽置信值为99，每个蛋白质至少需要2个鉴定肽。Protein Pilot false discovery rate(FDR)分析工具、蛋白质组学系统性能评价流水线(PSPEP algorithm)在所有情况下都提供了1％的全局FDR和1％的局部FDR。蛋白质定量比较衰老(轻)细胞与未衰老(重)细胞CM之间的3个生物重复实验中的蛋白质，需要ProteinPilot显着性阈值<0.05。
16.RNA-seq和数据分析
首先从基质细胞中获得总RNA样本。样品质量经Bioanalyzer 2100(Agilent)验证，RNA经Illumina HiSeqX10测序，基因表达水平由软件包RSEM(https://deweylab.github.io/rsem/)量化。简单地说，RNA样品中的rRNAs是用RiboMinusEukaryote kit(Qiagen，Valencia，CA，USA)消除的，而链特异性RNA-seq文库是在深度测序前根据制造商的指示使用TruSeq Stranded Total RNA preparation kits(Illumina，SanDiego，CA，USA)构建的。
配对末端转录reads被映射到参考基因组(GRCh38/hg38)，参考注释来自Gencodev27使用Bowtie工具。利用picard tools(1.98)脚本标记重复(https://github.com/broadinstitute/picard)识别重复读取，只保留非重复读取。参考剪接结由参考转录组(Ensembl build 73)提供。FPKM值用Cufflinks计算，差异基因表达由Cuffdiff maximum-likelihood estimate function调用。表达显著变化的基因由false discovery rate(FDR)-corrected P value<0.05来定义，仅使用状态“已知”和生物型“编码”的ensemblgenes 73进行下游分析。
读取被修剪使用Trim Galore(v0.3.0)(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)和质量评估使用FastQC(v0.10.0)(http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/)。
随后，利用DAVID生物信息学平台(https://david.ncifcrf.gov/)、独创性途径分析(IPA)程序(http://www.ingenuity.com/index.html)对差异表达基因进行了富集。在Majorbio I-Sanger Cloud Platform(www.i-sanger.com)的免费在线平台上对原始数据进行了初步分析，并随后将原始数据存入NCBI Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中，登录代码为GSE128282。
17.RNA-seq数据基因集富集分析(GSEA)
对于每个差异表达分析比较，基因使用从DESeq2获得的“Wald统计量”进行排序，并在MSigDB(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)中可用的所有已处理基因集的这些排序列表上执行GSEA。DESeq2独立过滤是基于归一化读取计数的平均值，并过滤出表达水平很低的基因。根据以往报道的方法，将SASP和GSEA签名导出。
18.Omni-ATAC操作流程
每组CTRL、BLEO或BLEO/ML324细胞(每组3个重复)在37℃用200U/ml DNase(Worthington)预处理30min，去除游离漂浮的DNA，消化死亡细胞的DNA。然后将培养基洗掉，将细胞重新悬浮在冷PBS中，进行计数和处理，如前面所述(Corces et al.，2017)。简言之，将50，000个细胞重新悬浮在1ml冷ATAC-seq再悬浮缓冲液(RSB；10mM Tris-HCl pH7.4，10mM NaCl和3ml MgCl2在水中)中。细胞在500r.c.f转速下于预冷(4℃)固定角度离心机离心5分钟。离心后，吸出900μl上清液，留下100μl上清液。这剩余的100μl上清液是通过用P200移液管尖端吸出的，以避免取出细胞颗粒。然后将细胞颗粒重新悬浮在含有0.1％NP40，0.1％Tween-20,和0.01％digitonin的50μl ATAC-seq RSB中，进行3次。该细胞裂解反应在冰上孵育3分钟。裂解后，加入1ml 0.1％Tween-20(无NP40或digitonin)，倒置混合。然后在500r.c.f下预冷(4℃)固定角度离心机中离心10分钟，上清液用两个滴管步骤去除。如前面所述，细胞核在50μl transposition mix(25μl 2×TD buffer，2.5μl transposase(100nM final)，16.5μl PBS，0.5μl 1％digitonin，0.5μl 10％Tween-20，and 5μl H2O)上下六次。其余的ATAC-seq文库制备是通过按照制造商的指示(Nextera DNA Flex LibraryPrep kit，Illumina，cat.no.20018704)进行的。在进行深度测序之前，Bioanalyzer 2100(Agilent)对样品质量进行了验证。简言之，所有文库都在4nM被扩增，目标浓度为20μl，相当于产物的80femtomoles。用1.5×AMPure(Beckman)珠纯化文库，并进行下一代测序。原始数据保存在NCBI Gene Expression Omnibus(GEO)数据库下的登录代码GSE135481。
19.小鼠移植瘤试验和预临床化疗程序
所有实验小鼠实验均严格遵循中国科学院上海生命科学研究院实验动物照护和使用委员会(IACUC)的有关规章进行。年龄6周左右的免疫缺陷型小鼠ICR/SCID mice(体重约25g)用于本发明相关动物实验。基质细胞PSC27和上皮细胞以1:4的比例混合，而每一移植体包含1.25×106细胞，用于组织重构。移植瘤通过皮下移植方式植入小鼠体内，移植手术结束之后8周末动物被执行安乐死。肿瘤体积按照如下公式计算：V＝(π/6)x((l+w)/2)3(V，体积；l，长度；w，宽度)。类似地，乳腺癌移植瘤分别由MDA-MB-231(三阴性、高恶性乳腺癌细胞系)和HBF1203(乳腺成纤维细胞系)，通过组织重构形成。
在预临床化疗试验中，经过皮下移植的小鼠被供给标准实验食谱，2周之后实施化疗药物米托蒽醌(0.2mg/kg剂量)和/或ML324(4.0mg/kg剂量)腹腔给药。时间点为肿瘤皮下移植后第3、5、7周的第一天，整个疗程共进行3次循环给药，每个循环为2周。疗程结束后，小鼠肾脏被收集用于肿瘤测量和组织学分析。每只小鼠累积性共接受米托蒽醌0.6mg/kg体重，和/或ML324 12.0mg/kg体重。化疗试验进行到第8周末结束，小鼠处死之后立即解剖，其移植瘤被收集并用于病理系统分析。给药7天之后的部分小鼠用于组化评估其组织水平的caspase 3(cleaved)活性。在给药过程中，将Xenogen IVIS Imager(CaliperLifesciences)应用于可见光谱的BLI记录，每次实时监测肿瘤时皮下注射D-Luciferin(150mg/kg，BioVision)。
20.血液测试评估体内细胞毒性
作为常规血液检查，从每只动物中获得100μl新鲜血液，并立即与EDTA混合。用Celltac Alpha MEK-6400series血液学分析仪(Nihon Kohden，MEK-6400).对血样进行分析。在血清生化分析中，采集血样，在室温下凝血2h，或在4℃下过夜。然后将样品离心(1000×g，10分钟)，得到血清。用Chemistry Analyzer(Mindray，BS-350E)对约50μl血清进行肌酐、尿素、碱性磷酸酶(ALP)和丙氨酸转氨酶(ALT)分析。在VetTest 8008chemistryanalyzer(IDEXX)上，采用dry-slide技术对血红蛋白、白细胞、淋巴细胞和血小板的循环水平进行评价。
21.生物统计学方法
本专利申请中所有涉及细胞增殖率，迁移性，侵袭性和存活性等的体外实验和小鼠移植瘤及化疗处理的体内试验均重复3次以上，数据以均值±标准误的形式呈现。统计学分析建立在原始数据的基础上，通过two-tailed Student’s t test，one-or two-wayANOVA，Pearson’s correlation coefficients test，Kruskal-Wallis，log-rank test，Wilcoxon-Mann-Whitney test or Fisher’s exact test进行计算，而P<0.05的结果被认作具有显著性差异。
实施例1、衰老细胞组蛋白H3赖氨酸位点的表观基因修饰发生显著变化
为了在蛋白质水平上建立衰老细胞的全景式表观遗传谱，本发明人选择用一种基于质谱(MS)技术的稳定氨基酸标记策略(SILACS)来分析博莱霉素(BLEO)诱导的衰老细胞(SEN)及其增殖态对照(CTRL)细胞的蛋白组学(图1)。检查每组的独立性实验重复，并证实了DNA损伤引起的原代人源前列腺基质细胞系(PSC27)的衰老，该细胞系主要由成纤维细胞组成。最终，检测到了732种彼此不同的细胞内蛋白，置信度为95％，其中447个是可准确量化的(图2-3)。
在鉴定的差异性表达的人类蛋白中，87个在衰老细胞中出现显著增加，29个则显著降低(>2倍，P<0.05)。然而，在分析PRE和SEN细胞之间存在差异的翻译后修饰(posttranslational modification，PTM)位点时，本发明人注意到组蛋白H3.2信号在二甲基化和三甲基化蛋白类别中的减少，即H3K27和H3K36(图4)。由于组蛋白PTMs可以改变染色质的结构，并参与衰老细胞相关表型的表观遗传调控，本发明人考虑组蛋白H3位点发生系统性或普遍性变化的可能性，以及它们是否同细胞衰老过程中以及特定后果之间具有因果关系。
为了剖析这些问题，接下来本发明人重点分析在组蛋白H3.2上发生的PTMs的主要形式，包括甲基化。众所周知，H3K27me3是一种主要富集在异染色质中的抑制性组蛋白标记，通过自噬/溶酶体途径在衰老的人成纤维细胞中趋于降低。在这里，本发明人特别关注到H3K36。为了证实蛋白质组学分析的数据，用RNA测序(RNA-seq)进行了整个转录组评估。这些数据显示了一个典型的SASP表达谱，表现为多种促炎因子的上调和衰老相关信号通路的激活(图5)，证实了细胞暴露于药物引起的遗传毒性后进入衰老状态。针对经典的组蛋白特异性甲基化酶和去甲基化酶的表达评估，揭示了表观遗传因子明显上调这一趋势，特别是KDM4家族(包括成员A、B、C和D)，尽管定量RT-PCR证实了只有A和B显著上调。
为了验证这些发现，本发明人使用了临床常用的几种化疗药物，包括顺铂(CIS)、卡铂(CARB)、沙铂(SAT)、米托蒽醌(MIT)和阿霉素(DOXO)，作为使用BLEO处理PSC27细胞的平行试验(图6A)。此外，本发明人还将细胞暴露于复制性衰老(RS)和癌基因诱导的衰老(OIS，HRASG12V)条件下(分别为图6B和6C)。在每一种情况下，观察到显著的细胞衰老。免疫印迹分析表明，ATM磷酸化，p16INK4A、p21CIP1和CXCL8(即IL8，SASP标志性因子)的表达增强，而H3K36位点甲基化模式(包括三水平和二水平)减弱(图6)。由于KDM4选择性地去甲基化H3K9和H3K36这两个位点，这是一种与DNA损伤修复(DDR)、细胞周期调节和衰老等关键细胞过程有关的活性，本发明人同时检测了H3K9甲基化。H3K9在所有基于细胞的检测中表现出基本类似于H3K36的去甲基化倾向(图6)。免疫荧光(IF)染色后，本发明人观察到H3K9me3和H3K36me3的信号明显减少，与DNA双链断裂(DSB)处DDR灶的典型标记γH2AX形成鲜明对比，DBS的表达在DNA损伤的PSC27细胞中明显增强(图7)。数据表明，组蛋白H3.2表观遗传PTM标记的丢失，特别是H3K9和H3K36甲基化状态的下降，伴随着KDM4家族成员(主要是A/B)的表达增加，并作为一种普遍现象在衰老细胞中持续发生，尽管这是由一种未知的机制引起的，并且具有至今不明的生物学后果。
实施例2、临床癌症患者组织内受损的肿瘤微环境(TME)中基质细胞KDM4A/B的表达与不良预后有关
鉴于KDM4A/B在体外条件下在衰老细胞中的表达上调，本发明人继而验证这些结果在临床环境中是否有可重复性。首先研究了来自前列腺癌(PCa)患者队列的样本，并观察到化疗后前列腺肿瘤组织中KDM4A/B的显著表达，特别是与治疗前收集的样本相比(图8-9)。十分有趣的是，上调的KDM4A/B通常定位于基质组织中，而非邻近的癌症上皮区域，后者似乎只有痕量信号或没有信号。
根据其免疫组织化学(IHC)染色强度，预先建立的病理评估方案定量证实了KDM4A/B在前列腺组织中的表达(P<0.001)(图10A-B)。为了证实它们在体内的可诱导性质，本发明人分析了一组患者，他们的化疗前和化疗后样本均有备存切片，通过对每个细胞谱系的激光捕获微解剖(LCM)进行转录分析。
数据显示基质中KDM4A/B有明显的上调作用，但在化疗处理后患者样本中其附近的癌症上皮无明显上调作用(分别为P<0.001，P>0.05)(图11A-B)。本发明人进一步注意到，KDM4A/B在受损TME中的表达动力学与CXCL8和WNT16B这两个标志性SASP因子基本相似(图12)。治疗后患者KDM4A/B与CXCL8/WNT16B表达的相关性通过对其表达水平的病理评价得到进一步支持(图13A-D)。更重要的是，Kaplan-Meier分析根据KDM4A/B在肿瘤间质中的表达分层的PCA患者样本分析表明，KDM4A/B与治疗队列中的无病生存(DFS)呈显著的负相关(图14A-B)。
然后，本发明人分析了KDM4C/D的情况，它们为KDM4亚家族的另外两个成员。病理数据表明，化疗后肿瘤间质中两种分子均无上调，而每个细胞谱系的表达谱在基质组织或上皮部分并无变化。此外，根据KDM4C/D在肿瘤间质中的表达进行病理分层，也未能揭示KDM4C/D与患者DFS在治疗队列中的潜在相关性(P>0.05，log-rank test)。
鉴于KDM4A/B在治疗后癌症患者基质组织中的显著表达，本发明人考察H3K9和H3K36的甲基化水平是否可能发生变化，主要由于H3K9和H3K36是人细胞中去甲基酶KDM4A/B的两个主要靶点。对患者样本的IHC评估表明，基质细胞中的H3K9me3和H3K36me3信号减弱，而疾病灶中的邻近癌细胞则基本不受影响。每个细胞谱系的LCM支持的比较表达实验数据证实了基质细胞中H3K9me3和H3K36me3的下降模式，但在TME染色中并未发现其上皮组织的相应变化。值得注意的是，KDM4A/B的表达与H3K9/H3K36三甲基化之间存在很大的反向相关性，如化疗后患者样品中靶信号的病理评价所示。Pearson统计分析进一步证实了这些内在联系。本发明人注意到基质组织中H3K9/H3K36三甲基化水平越低，化疗后阶段PCa患者的生存率越短，这意味着可能存在着与这些表观遗传标记和不良后果有关的潜在机制，特别是癌症患者的死亡率。
实施例3、KDM4A/B表达上调伴随着衰老细胞H3K9/H3K36甲基化降低
接下来，本发明人利用在BLEO诱导细胞衰老后的单个时间点收集的基质细胞裂解液物进行了时间曲线表达试验。与急性反应相关的DDR信号相比，KDM4A/B蛋白水平在进入第7天高峰值的过程中逐渐升高。在DNA损伤时，KDM4C略有增强，但在前6小时后似乎开始下降，直到接近一个相对稳定的阶段；而KDM4D在整个检测过程中在蛋白质水平上基本上是无法检测到的(图15)。对KDM4的转录分析很大程度上可以重复免疫印迹实验得到的数据，衰老细胞中KDM4A/B水平逐渐升高，而KDM4C/D则没有(图16A-D)。值得注意的是，KDM4A/B的表达模式确实类似于SASP标志因子(IL6，CXCL8)和细胞周期素依赖性激酶抑制剂(p16INK4A，p21CIP1)(图17A-D)。
为了探讨KDM4蛋白表达的机制，本发明人用蛋白合成抑制剂环己酰胺(CHX)处理细胞。与对照细胞相比，BLEO诱导的衰老细胞表现出KDM4A/B的表达增加，而在CHX处理后的时间过程中，它们的信号减弱，表明KDM4A/B在这些细胞中受到蛋白质周转的影响(图18)。在细胞通透性蛋白酶体抑制剂MG132存在下，KDM4A/B的蛋白水平得以升高，从而证实这两种因子确实容易受到蛋白酶体介导的降解作用(图19)。与KDM4C/D的情况不同，MG132显著提高了KDM4A/B的水平，从而进一步支持它们受蛋白酶体调节的性质(图19)。随后，衰老细胞总裂解物的免疫沉淀(IP)表明，MG132处理后KDM4A/B增强，但泛素介导的PTM强度降低，提示衰老细胞中KDM4A/B蛋白的增加与泛素/蛋白酶体捕获机制部分相关(图20A-B；图21)。
在基于IF的细胞染色实验中，本发明人注意到PSC27细胞核中KDM4A/B的水平呈增强趋势(图22)。有趣的是，这两个因子基本上与p-53BP1共定位，而p-53BP1是DDR的典型标记之一，其信号显示DNA损伤细胞显著增加(图22)。值得注意的是，在DDR处用KDM4A/B检测到的阳性细胞百分比在BLEO处理后显著提高(图23A-B)。为了明晰KDM4A/B在细胞衰老过程中的亚细胞定位，本发明人用染色质分馏法检测了细胞裂解物。免疫印迹分析表明，这两种因子在衰老细胞的染色质组分中相对于其增殖态对照细胞显著升高(图24)。因此，KDM4A/B受到PTM相关和泛素/蛋白酶体逃逸途径的调控，在衰老细胞的细胞核中具有潜在的、但至今未知的表观遗传调控作用。
实施例4、KDM4A/B在不影响衰老的情况下可以功能性调节SASP表达
接下来，本发明人研究KDM4/B与衰老细胞SASP发生发展的相关性。细胞转导实验数据表明，KDM4A过表达并不改变SASP因子的基础水平，而异位KDM4A表达却能进一步增强大多数SASP因子在DNA损伤背景下的表达(图25)。免疫印迹在蛋白质水平上验证了这一趋势，这反映在衰老细胞中CXCL8的表达增强，在外源KDM4A存在下，H3K9/H3K36甲基化(tri-和di)强度进一步降低(图26)。
由于KDM4A/B具有十分相似的蛋白质结构域组成，包括两个PHD和两个TUDOR结构域，本发明人推测KDM4A对SASP的影响基本上也可以在KDM4B转导实验中造成类似结果。这一假设在用KDM4B进行的实验中得到了证实，类似的转录本和蛋白质数据有力证明了这一点(图27)。当细胞暴露于组蛋白甲基转移酶抑制剂Chaetocin时(对SUV39H1具有特异性抑制作用，而SUV39H1在人类细胞中优先催化H3K9甲基化(H3K9me2/me3))，数据大致类似于KDM4A/B的表达。有趣的是，p16INK4A和p21CIP1的表达是细胞衰老的关键指标，但在转基因表达KDM4A/B时，p16INK4A和p21CIP1的表达基本不受影响，表明细胞周期阻滞或细胞衰老可能不受这些表观遗传因素的调控。为了验证这一假设，本发明人分别用SA-β-GAL染色和BrdU掺入实验进行了细胞衰老和细胞周期阻滞试验。得到的数据表明，无论是KDM4A还是KDM4B的表达都不足以影响细胞衰老或复制(图28-31)。
实施例5、特异性靶向KDM4的去甲基酶活性可以有效抑制SASP
鉴于KDM4A/B在SASP表达中的关键作用，本发明人随后研究药物靶向其去甲基化酶活性是否能有效地控制衰老细胞的SASP这一典型特征。为此，本发明人使用了ML324，一种特异性抑制KDM4家族酶活性的小分子化合物。RNA-seq数据表明，使用ML324处理后，大部分SASP因子在衰老细胞中的表达明显降低，包括但不限于CXCL8、CSF2、CCL20、IL1A、CXCL1和IL6(图32)。
当培养液中加入ML324时，在细胞衰老显著上调的基因中则有相当一部分表达降低，尽管一些SASP不相关的基因也受到这种药物的影响，如PTGS2、RGS4和POU2F2(图32)。GO分析表明，最受ML324抑制的途径和生物过程与细胞外分泌、NF-KB信号、受体酪氨酸磷酸化和MAPK信号级联有关，这些活动通常是典型SASP因子的特征(图33)。进一步的生物信息学分析则验证了一个由129个基因组成的重叠区，这些基因在细胞衰老时被上调，却在ML324介导的KDM4抑制下被下调(图34)，后者表现为H3K9/H3K36位点(三型和二型)的逆转性甲基化，并伴随着CXCL8表达的降低(图35)。基因集富集分析(GSEA)证实，抑制KDM4A/B活性能有效地抑制SASP表达，并显著干扰NF-KB活性(图36A-B)。然而，ML324处理并未干扰细胞集落形成或细胞生长停滞(图37-39)。有趣的是，在衰老细胞中表达下降的一些基因在细胞接触ML324时被上调(图40)，这表明KDM4A/B的抑制尽管改变一系列基因的表达，其中包括编码SASP因子的基因，同时受影响的基因并非限于衰老细胞中那些上调的基因。
体外检测包括SA-β-GAL染色和BrdU掺入的结果表明，ML324并不影响细胞衰老或细胞周期阻滞，这与KDM4A/B对维持细胞衰老本身并不重要的发现一致(图38-39)。基因表达时间曲线证实ML324显著限制SASP因子的表达，如CXCL8、CSF2、CXCL1和IL6的情况，其效果在细胞衰老诱导的整个过程中均很明显(图41A-D)。为了进一步定义ML324造成的SASP靶向结果，特别是在组织微环境中，本发明人使用了一个共培养系统，该系统涉及基质细胞衍生的条件性培养基(CM)和癌细胞。值得注意的是，PC3、DU145、LNCAP和M12这几种典型的前列腺癌(PCa)细胞系，其增殖、迁移和侵袭能力与PSC27基质系(来自人体前列腺)具有相同的器官来源，在ML324(20μM)存在时基质细胞胞外液CM处理下癌细胞增殖、迁移和侵袭能力均出现显著降低(图42-44)。更重要的是，当基质细胞用ML324处理(终浓度为20μM)时，PCa细胞对MIT(终浓度为1μM)的耐药性显著降低(MIT，米托蒽醌)(图45A-B)。因此，用小分子抑制剂靶向控制KDM4的去甲基酶活性可以在不影响细胞衰老的情况下延缓SASP的发展，从而限制SASP促进癌症恶性进展的潜力。
实施例6、染色质重塑促进SASP的发展，后者在靶向KDM4的条件下可与细胞衰老发生解偶联
染色质的状态能够决定许多重要的细胞活性或生理过程，如DNA修复和基因表达，而染色质可接近性则影响一系列调控序列，包括增强子、启动子和位点控制区域，以协同调节基因表达。接下来，本发明人进一步确定染色质结构改变在支持衰老细胞SASP发生发展中的可能性和生物学意义。由于可访问的区域全景图可以通过高通量测序(ATAC-seq)这一技术通过确定染色质开放性来绘制，并与靶基因的增强子和启动子共同定位，因此使用这种表观遗传研究策略来定义衰老细胞中全基因组可访问的区域。
本发明人首先研究了衰老细胞的可接近性染色质景观是否与它们增殖态细胞对照有所不同。令人惊讶的是，在BLEO诱导的衰老细胞中观察到转录活性基因的转录末端位点(TESs)的上游(～0.5kb)存在异常增强的ATAC-seq信号(图46)。虽然转录起始位点(TSSs)上游约2.0kb的信号急剧上升，但衰老和对照组细胞在TSSs近端区域的差异似乎是有限的。然而，在KDM4抑制剂ML324存在下，本发明人观察到衰老细胞TSSs和TESs的富集信号显著降低(图46)，提示这些衰老相关基因的转录激活基本被药物逆转。开放性的TES染色质可能反映参与转录终止的因子的空间结合，而这些位点可能作为促进多种细胞生理相关活动必需基因高水平转录的增强子。本发明人的数据表明，开放染色质可以在衰老细胞转录活性基因的启动子和近TES区域发现。
接下来，本发明人研究SASP典型因子的增强子和启动子的染色质可接近性是否与它们的实际表达活性普遍一致。与ATAC-seq和RNA-seq测序结果输出的数据映射结果表明，一组典型的SASP因子的转录水平与其启动子处ATAC-seq信号的强度密切相关(图47A-B)。生物信息学分析结果表明，绝大多数基因在细胞衰老过程中上调，但在ML324处理过程中下调，对细胞因子、趋化因子、跨膜受体结合、细胞外基质结构、生长因子和金属蛋白酶相关活性有影响(图48)。
随后，本发明人绘制的基于富集信号的热图显示了最活跃的1000个基因(分别收集其为TSS上游和TES下游的3.0kb数据)，或整个转录组区域。在对照组细胞和衰老组细胞之间以及暴露于溶剂对照、暴露于药物ML324中的衰老细胞之间显示出显著的差异(图49-50)。由于增强子一般代表转录因子(TF)结合的热点位点，本发明人推测远端ATAC-seq峰值可能为调节细胞衰老和/或相关表型的TFs提供基序。利用基序分析程序HOMER，本发明人提取了在PSC27细胞中的3种实验条件下发现的富集在远端峰中的TFs阵列的结合基序(图51)。值得注意的是，其中一些TFs，包括AP-1、RELA(NF-KB的亚基p65)、STAT3、NF-KB1(NF-KB的p50/p105)、GATA4和c/EBPβ，据报道与SASP相关，清楚地显示了一种“衰老-上调和ML324-下降”模式。总之，衰老细胞在远端ATAC-seq峰上表现出明显的景观，而显著的基因表达与少数“主导性TFs”调节衰老特异性电路有关，并在ML324诱导的KDM4功能缺陷时有效地复位。此外，本发明人注意到有一组SASP并不相关的基因，其ATAC-seq信号在衰老细胞中显著降低，但在细胞暴露于ML324时明显逆转，表明KDM4抑制的影响可能不仅仅限于SASP表达的染色质可接近性变化。
为了进一步验证这些数据，本发明人对特定基因的相关染色质可接近性进行了足迹分析。ATAC-seq数据的生物样本之间的可重现性首先用一小组人类基因证实，包括COMMD9、PRR5L、TRAF6、RAG1和IFTAP，这些基因大致与细胞衰老无关(图52)。接下来，本发明人评估了等位基因ATAC-seq富集实验的数据，并发现了多个SASP典型因子的开放基因组区域，包括衰老细胞中的IL1β、CXCL1、AREG、IL6、SPINK1和WNT16B，但在KDM4活性被抑制时其染色质的可接近性明显降低(图53-58)。相反，与衰老无关的基因的染色质开放程度基本上保持不变，如COMMD9、PRR5L和TRAF6(图59)。作为一种特殊的对照，CDKN2A和TP53被用于平行分析，在衰老细胞中表现出增强的可接近性，但当细胞暴露于ML324处理时，基本保持了持续性的信号强度(图60-61)。
总体而言，染色质的可接近性和转录表达与SASP标志因子密切相关，而活性调控元件则可由细胞的表达机制获得，如一组特殊的关键原件TFs。虽然在细胞衰老过程中可访问的染色质景观的转变使得位点特异性转录发生，但特定转座元件可以在衰老细胞KDM4功能缺陷的情况下重塑这些染色质景观。
实施例7、选择性靶向KDM4治疗可以避免化疗耐药并显著提高总体疗效
鉴于表观遗传因子KDM4在细胞衰老相关表型，特别是SASP的发展中起着十分突出和关键的作用，本发明人接下来推断了有选择地利用这个靶点来提高年龄相关疾病治疗效果的潜力。由于癌症是全球范围内年龄标准化发病率和过早死亡率的主要原因，并与衰老细胞的影响密切相关，本发明人随即选择肿瘤微环境(TME)作为后续体内表观遗传操作的病理模型。
首先，本发明人通过将基质细胞(PSC27)与癌细胞(PC3)在非肥胖糖尿病和严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)的实验小鼠皮下植入其大腿后侧，从而产生体内组织重组体。为了密切模拟临床情况，设计了一种临床前方案，其中包括基因毒药物MIT(米托蒽醌)和/或KDM4特异性抑制剂ML324(图62)。植入后两周，当观察到体内肿瘤的稳定摄取时，在第3、第5和第7周的第一天分别向动物体内注射一剂治疗剂或安慰剂(vehicle/placebo)(注射量分别为：MIT 0.2mg/kg，ML324 4mg/kg，MIT 0.2mg/kg+ML324 4mg/kg)，直到8周方案完全结束(图63)。在临床前试验结束后测量肿瘤时，本发明人发现MIT单独给药可显著降低肿瘤大小(42.8％，P<0.001)，而ML324的加入可进一步降低肿瘤体积(54.5％，P<0.001)，使其总收缩率达到74.0％(图64)。另外，稳定表达荧光素酶的PC3细胞(PC3-LUC)和PSC27细胞构成的移植瘤的生物发光成像(BLI)检测排除了癌细胞从原发部位向远端器官发生转移的可能，信号强度与本发明人在PC3/PSC27动物中观察到的肿瘤生长模式基本一致(图65)。这些数据表明，经典化疗联合KDM4靶向抑制剂可诱导肿瘤消退，其指标明显优于单纯化疗造成的结果。
当检查治疗药物对TME的潜在脱靶效应时，本发明人注意到在MIT药物治疗的小鼠的病灶中有相当大比例的衰老细胞，这可能是基因毒药物本身造成的组织损伤所致(图66)。然而，ML324本身并没有造成这样的后果，这与其靶向机制基本一致。使用LCM技术进行细胞谱系特异性分离，从新鲜解剖获得的肿瘤样本中单独分离基质和癌细胞亚群时，本发明人评估了特定基因的转录水平。所得到的数据表明，SASP因子的表达显著增加，包括但不限于IL6、CXCL8、SPINK1、WNT16B、IL1α、MMP3和GM-CSF(图67)，而这一趋势伴随着p16INK4A和p21CIP1在MIT处理动物组织中的显著上调(图68)。然而，这些变化似乎仅限于基质细胞，而不是其邻近的上皮细胞，可能是由于后者在治疗过程中已经获得耐药性并出现再增殖。本发明人进一步评估了KDM4A/B在肿瘤标本原位中的可诱导性，并注意到这些因子在经历涉及MIT治疗的动物中的大量表达(图69)，这与体外数据基本一致(图15-16)。这些数据表明，体内衰老细胞的出现实际上伴随着典型的SASP的发生发展和KDM4A/B的表达，这是化疗干预过程中基因毒药物引起的副作用，主要发生在TME中的良性细胞群。
接下来，本发明人通过评估这些样本组之间的标志性SASP因子表达水平来分析ML324的体内疗效。值得注意的是，当比较单独用MIT处理的动物和MIT/ML324处理的动物时，绝大多数SASP组分的表达呈现显著降低，尽管衰老标记p16INK4A和p21CIP1保持不变(图70)。这些体内数据客观上进一步确证了体外研究结果，即靶向KDM4可抑制或延缓SASP的发生发展，而不是细胞衰老本身，这一现象与KDM4介导的组蛋白H3去甲基化的差异性调节有关，后者使得染色质出现重组。
为了研究直接导致MIT诱导癌细胞耐药的机制，本发明人在治疗后第7天从不同药物处理组的动物体内解剖肿瘤，这实际上也是耐药性出现之前的一个时间点。与安慰剂治疗组相比，MIT给药引起了DNA损伤程度和凋亡指数的显著增强，而这一点在从ML324处理的动物解剖的肿瘤中没有观察到(图71)。本发明人注意到，仅在ML324用药的情况下既不能诱导典型的DDR，也不能导致细胞死亡。然而，在MIT和ML324联合治疗时，观察到组织内DNA损伤和细胞凋亡的最大信号强度，表明治疗效果优于单独使用每种药物(图71)。免疫组织化学(IHC)染色检测Caspase3(cleaved)是细胞凋亡的典型生物标志物，其在组织水平的信号差异在很大程度上证实了肿瘤实际上对于不同用药方式存在着不同反应(图72)。
鉴于特异性靶向KDM4在控制治疗本身造成的损伤性TME方面带来的显著效果，本发明人随后通过以时间延长的方式，比较那些经受不同治疗方式处理的动物的生存情况，来评估这些预临床策略对于实验动物的总体影响。一旦动物荷载的肿瘤超出一定限制(例如，当大小超过2000mm3时)，就判定其已经形成一种必须要干预的疾病，而动物需要即刻处死。接受MIT/ML324联合治疗的小鼠表现出最长的中位生存期，比单独使用MIT治疗的小鼠获得至少多出50％的生存时间(图73，绿色与蓝色)。然而，值得注意的是，仅对动物用药ML324仅轻微延长了其存活(图73，橙色与红色)。因此，单独靶向TME中的KDM4既不改变肿瘤生长，也不改变动物存活，但MIT/ML324联合治疗却能够显著改善这两个关键参数。
实施例8、筛选方法
细胞：PSC27细胞生长至80％时，培养液中加入50μg/ml博来霉素(bleomycin，BLEO)。该处理后细胞发生DNA损伤，KDM4A/KDM4B高表达。
测试组：前述经BLEO处理的细胞，并给予候选物质；
对照组：前述经BLEO处理的细胞，不给予候选物质。
分别检测测试组和对照组中KDM4A/KDM4B的表达或活性情况，并进行比较。如果测试组中KDM4A/KDM4B的表达或活性在统计学上低于(如低30％或更低)对照组，就表明该候选物是逆转肿瘤耐药性或抑制或延缓衰老相关分泌表型的潜在物质。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海营养与健康研究所
<120> 新型细胞衰老干预靶点及其在化疗抗癌中的靶向应用
<130> 204169
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
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Claims (17)

1.KDM4A或KDM4B的下调剂联合化疗药物在制备抑制肿瘤、或抑制肿瘤耐药性的组合物中的应用；所述的肿瘤为耐药性的肿瘤；所述KDM4A或KDM4B的下调剂为针对KDM4A或KDM4B的化学小分子拮抗剂或抑制剂ML324；所述化疗药物为基因毒药物米托蒽醌。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为在基因毒药物处理后产生耐药性或肿瘤微环境中产生衰老相关分泌表型的肿瘤。
3.如权利要求1或2 所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌， 肝癌， 胰腺癌， 膀胱癌， 皮肤癌，肾癌。
4.如权利要求2 所述的应用，其特征在于，所述衰老相关分泌表型为DNA损伤情况下发生的衰老相关分泌表型；所述的DNA损伤为化疗药物造成的DNA损伤。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述KDM4A或KDM4B的下调剂和化疗药物按照重量比为：1:1～200。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述KDM4A或KDM4B的下调剂和化疗药物按照重量比为1:2～100。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述KDM4A或KDM4B的下调剂和化疗药物按照重量比为1:5～50。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述KDM4A或KDM4B的下调剂的终浓度为：1～200 μM，所述的化疗药物的终浓度为：0.01～100 μM。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述KDM4A或KDM4B的下调剂的终浓度为2～150μM，所述的化疗药物的终浓度为0.05～80 μM。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述KDM4A或KDM4B的下调剂的终浓度为：5～50μM，所述的化疗药物的终浓度为0.1～50 μM。
11.一种制备用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒的方法，包括将KDM4A或KDM4B的下调剂以及化疗药物混合；或，将KDM4A或KDM4B的下调剂与化疗药物置于同一药盒中；所述KDM4A或KDM4B的下调剂为针对KDM4A或KDM4B的化学小分子拮抗剂或抑制剂ML324；所述化疗药物为基因毒药物米托蒽醌。
12.如权利要求11所述的制备用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒的方法，其特征在于，所述KDM4A或KDM4B的下调剂和化疗药物按照重量比为：1:1～200。
13.如权利要求12所述的制备用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒的方法，其特征在于，所述KDM4A或KDM4B的下调剂和化疗药物按照重量比为1:2～100。
14.如权利要求13所述的制备用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒的方法，其特征在于，所述KDM4A或KDM4B的下调剂和化疗药物按照重量比为1:5～50。
15.如权利要求11所述的制备用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒的方法，其特征在于，所述KDM4A或KDM4B的下调剂的终浓度为：1～200 μM；所述的化疗药物的终浓度为：0.01～100 μM。
16.如权利要求15所述的制备用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒的方法，其特征在于，所述KDM4A或KDM4B的下调剂的终浓度为2～150μM，所述的化疗药物的终浓度为0.05～80 μM。
17.如权利要求16所述的制备用于抑制肿瘤的药物组合物或药盒的方法，其特征在于，所述KDM4A或KDM4B的下调剂的终浓度为：5～50μM，所述的化疗药物的终浓度为0.1～50 μM。
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