MX2013000676A - Metodo para identificar pacientes con probabilidad incrementada de responder a una terapia anti-cancer. - Google Patents

Metodo para identificar pacientes con probabilidad incrementada de responder a una terapia anti-cancer.

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Abstract

La invención provee métodos para identificar pacientes que se pueden beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF. La invención también provee métodos para monitorear la respuesta del paciente a la terapia anti-cáncer. La invención también provee kits y artículos de manufactura para uso en los métodos.

Description

MÉTODO PARA IDENTIFICAR PACIENTES CON PROBABILIDAD INCREMENTADA DE RESPONDER A UNA TERAPIA ANTI-CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con métodos para identificar cuales pacientes se beneficiaran en su mayoría de tratamiento con agentes anti-cáncer y el monitoreo de pacientes en cuanto a su sensibilidad y responsividad al tratamiento con agentes anti-cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es una de las amenazas más mortales a la salud humana. En los Estados Unidos de América solamente, el cáncer afecta casi a 1.3 millones de nuevos pacientes cada año y es la segunda causa principal de muerte después de enfermedad cardiovascular, sumando aproximadamente 1 de 4 muertes. Los tumores sólidos son responsables por la mayoría de aquellas muertes. Aunque ha habido avances significativos en el tratamiento médico de ciertos canceres, la proporción, de supervivencia de cinco años global para todos los canceres ha mejorado solo por alrededor del 10% en los pasados 20 años. Los canceres o tumores malignos se metastasizan y crecen rápidamente de manera incontrolada, haciendo la detección oportuna y el tratamiento extremadamente difíciles.
Dependiendo del tipo de cáncer, los pacientes tienen comúnmente varias opciones de tratamiento disponibles a ellos incluyendo quimioterapia, radiación y fármacos a base de anticuerpo.
Los métodos de diagnóstico útiles para producir el resultado clínico de los diferentes regímenes de tratamiento se beneficiarían extensamente del manejo clínico de estos pacientes.
Así, hay necesidad de medios más efectivos para determinar cuáles pacientes responderán a cual tratamiento y para incorporar tales determinaciones a regímenes de tratamiento más efectivos para pacientes con terapias anti-cáncer, ya sea usados como un solo agente o combinado con otros agentes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos para identificar pacientes que responderán al tratamiento con agentes anti-cáncer, por ejemplo antagonistas de VEGFA tales como por ejemplo bevacizumab.
Una modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, los métodos comprenden: determinar el nivel de expresión de VEGF sin modificar en una muestra obtenida del paciente en donde el nivel de VEGF sin modificar en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia (por ejemplo, en comparación con una muestra de referencia) indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho , avanzado localmente, recurrente o metastático HER-2 negativo) , cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y, combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel de VEGF sin modificar es un nivel de proteína. En algunas modalidades, el nivel de proteína de VEGF sin modificar es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma de VEGF sin modificar. En algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGF sin modificar que está en o por encima de un nivel de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas ' modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente. En algunas modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho avanzado localmente, recurrente o metastático HER-2 negativo) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia es capecitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la responsividad de un paciente que sufre de un cáncer al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, los métodos comprenden: determinar el nivel de expresión de sin modificar en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF sin modificar en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia (por ejemplo, en comparación con una muestra de referencia) indica que el paciente es más probable de ser responsivo al tratamiento con la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, ¦ el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho avanzado localmente, recurrente o metastático HER-2 negativo) , cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel de proteína de VEGF sin modificar es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma de VEGF sin modificar. En algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGF sin modificar que está en o por encima de un nivel de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la tercera terapia anticáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda anticáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho avanzado localmente, recurrente o metastático HER-2 negativo) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia anti-cáncer es capecitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente con cáncer exhibirá beneficios de terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, los métodos comprenden: determinar el nivel de expresión de VEGF sin modificar en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF sin modificar en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia (por ejemplo, en comparación con una muestra de referencia) indica que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anticáncer. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovarios, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho avanzado localmente, recurrente o metastático HER-2 negativo) , cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de : sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel de proteína de VEGF sin modificar es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma de VEGF sin modificar. En algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGF sin modificar que está en o por encima de un nivel de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VÉGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente. En algunas modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab . En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel . En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia anti-cáncer es capecitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
Aun otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, los métodos comprenden: determinar el nivel de expresión de VEGF sin modificar en una muestra obtenida del paciente en donde el nivel de VEGF sin modificar en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia (por ejemplo, en comparación con una muestra de referencia) indica que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático) , cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel de proteína de VEGF sin modificar es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma de VEGF sin modificar. En algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGF sin modificar que está en o por encima de un nivel de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anticáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente. En algunas modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia¦ cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia anti-cáncer es capecitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
En una modalidad adicional de la invención provee métodos para tratamiento de cáncer en un paciente, los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene un nivel en por encima de un nivel de referencia (por ejemplo, en comparación con una muestra de referencia) de VEGF sin modificar y administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente, mediante lo cual el cáncer es tratado. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático) , cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón. En algunas modalidades, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el nivel de proteína de VEGF sin modificar es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma de VEGF sin modificar. En algunas modalidades, el nivel en el plasma de VEGF sin modificar que está en o por encima de un nivel de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente . En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente. En algunas modalidades, la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente.
En algunas modalidades, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el anticuerpo es bevacizumab. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático) y la segunda terapia anti-cáncer es docetaxel . En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo cáncer pancreático metastático) , la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia cáncer es erlotinib. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer gástrico, la segunda terapia anti-cáncer es capecitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, la segunda terapia anti-cáncer es gemcitabina y la tercera terapia anti-cáncer es cisplatino.
Otra modalidad de la invención provee kits para determinar si un paciente se puede, beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, los kits comprenden un conjunto de compuestos aptos de enlazarse específicamente a VEGF sin modificar e instrucciones para usar estos compuestos para determinar el nivel de VEGF sin modificar para predecir la responsividad de un paciente al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, en donde el nivel de VEGF sin modificar o por encima del nivel de VEGF sin modificar en una muestra de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A. En algunas modalidades, los compuestos son proteínas. En algunas modalidades, las proteínas son anticuerpos.
Una modalidad adicional de la invención provee un conjunto de compuestos para detectar el nivel de VEGF sin modificar, el conjunto comprende por lo menos un compuesto apto de enlazarse específicamente a VEGF sin modificar. Preferiblemente, el conjunto de compuestos es usado para predecir la responsividad de un paciente al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A. En algunas modalidades, los compuestos son proteínas. En algunas modalidades, las proteínas son anticuerpos. Estas y otras modalidades son descritas adicionalmente por la descripción detallada que sigue.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Curva de Kaplan Meier para la supervivencia libre de avance para la población del biomarcador global para la terapia de bevacizumab (baja o alta dosis) más docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente recurrente o metastático. La línea discontinua corta representa placebo más docetaxel. La línea continua representa baja dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) mas docetaxel. La línea discontinua larga representa alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel .
Figura 2: Gráfica de Forest de la proporción de peligro de supervivencia libre de avance antes del inicio de la terapia anti-neoplásica subsecuente por biomarcador (placebo y baja dosis de bevacizumab) , un análisis dicotomizado para terapia de bevacizumab (baja dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático.
Figura 3: Gráfica de Forest de la proporción de peligro de la supervivencia libre de avance antes del inicio de terapia anti-neoplásica subsecuente por biomarcador (placebo más alta dosis de bevacizumab) , un análisis dicotomizado para la terapia de bevacizumab (alta dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático.
Figura 4 (que comprende las figuras 4A y 4B) : Curva de Kaplan Meier para la supervivencia libre de avance antes del inicio de la terapia anti-neoplásica subsecuente para VEGFA de bajo nivel de expresión (<125 pg/ml) VEGFA, (Figura 4A) y alto nivel de expresión (=125 pg/ml) VEGFA, (Figura 4B) , para la terapia de bevacizumab (baja o alta dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente recurrente o metastático. La línea discontinua corta representa placebo más docetaxel. La línea continua representa baja dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) mas docetaxel. La línea discontinua larga representa una alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel .
Figura 5 (que comprende las figuras 5A y 5B) : Curva de Kaplan Meier para la supervivencia libre de avance antes del inicio de terapia anti-neoplásica subsecuente para VEGFR2 de bajo nivel de expresión (<11 ng/ml) , (Figura 5A) y VEGFR2 de alto nivel de expresión (=11 ng/ml) (Figura 5B) , para la terapia de bevacizumab (baja o alta dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático. La línea discontinua corta representa placebo más docetaxel. La línea continua representa baja dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) mas docetaxel. La línea discontinua larga representa alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel.
Figura 6 : Curva de Kaplan Meier para la supervivencia libre de avance antes del inicio de la terapia anti-neoplásica subsecuente para VEGFA y VEGFR2 de bajo nivel de expresión (Formula 1 < 0.132) y alto nivel de expresión (Formula 1 = 0.132)), combinada para terapia de bevacizumab (baja o alta dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático. La linea continua representa placebo más docetaxel. La linea discontinua larga representa baja dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) mas docetaxel. La linea discontinua corta representa alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel.
Figura 7: Curva de Kaplan eier para la supervivencia libre de avance antes del inicio de la terapia anti-neoplásica subsecuente para bajo nivel de expresión combinado (Formula 2 < 0.006) y alto nivel de expresión combinado (Formula 2 = 0.006) de VEGFA y PLGF para terapia de bevacizumab (baja o alta dosis) mas docetaxel versus terapia de placebo más docetaxel para pacientes que son tratados por cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático. La línea discontinua larga representa baja dosis de bevacizumab (7.5 mg/kg cada 3 semanas) mas docetaxel. La línea discontinua corta representa alta dosis de bevacizumab (15 mg/kg cada 3 semanas) más docetaxel .
Figura 8: SEQ ID NO: 1, Secuencia de aminoácidos ejemplar de VEGFA.
Figura 9: SEQ ID NO: 2, Secuencia de aminoácidos ej emplar de VEGFR2.
Figura 10: SEQ ID NO: 3, secuencia de aminoácidos ej emplar de PLGF .
Figura 11: Mediciones de concentraciones incrementadas de VEGFm, VEGF12i, VEGF165 y VEGF189 tal como es medido sobre un chip IMPACT.
Figura 12: Se muestran los conteos (ECL-señal) medidos cuando concentraciones incrementadas de VEGFi65í producidos recombinantemente en E. coli o en células HEK, respectivamente fueron medidos en el analizador Elecsys® automatizado.
Figura 13 (que comprende las figuras 13A y 13B) : Curvas de Kaplan Meier para la Supervivencia Global (Figura 13A) y para la Supervivencia Libre de Avance (Figura 13B) para el marcador VEGFA, tanto para altos niveles de expresión (>111 pg/ml) y bajos niveles de expresión (=111 pg/ml) para la terapia de bevacizumab mas capecitabina/cisplatino versus terapia de placebo testigo más capecitabina/cisplatino para pacientes que son tratados por adenocarcinoma gástrico/gastro-esofagal avanzado localmente/metastático inoperable .
Figura 14 (que comprende las figuras 14A y 14B) : Curvas de Kaplan Meier para asociación con el efecto de tratamiento sobre la Supervivencia Global (Figura 14A) y para Supervivencia Libre de Avance (Figura 14B) para el marcador pVEGFA tanto para altos niveles de expresión ( >lllpg/ml) como para bajos niveles de expresión (= 111 pg/ml) para la terapia de bevacizumab mas capecitabina/cisplatino versus terapia de placebo testigo más capecitabina/cisplatino para pacientes de las regiones de Asia-pacifico que son tratados por adenocarcinoma gástrico/gastro-esofagal avanzado localmente/metastático inoperable .
Figura 15 (que comprende las figuras 15A y 15B) : Curvas de Kaplan Meier para asociación con efecto de tratamiento sobre la Supervivencia Global (Figura 15A) y para la Supervivencia Libre de Avance (Figura 15B) para el marcador VEGFA, tanto para altos niveles de expresión (>111 pg/ml) y bajos niveles de expresión(= 111 pg/ml) para terapia de bevacizumab mas capecitabina/cisplatino versus terapia de placebo testigo más capecitabina/cisplatino para pacientes de regiones que no son de Asia-pacifico que son tratados por adenocarcinoma gástrico/gastro-esofagal avanzado localmente/metastático inoperable.
Figura 16 (que comprende las figuras 16A y 16B) : Curvas de Kaplan Meier para la Supervivencia Global (Figura 16A) y para la Supervivencia Libre de Avance (Figura 16B) para terapia de bevacizumab mas gemcitabina-erlotinib versus terapia de placebo testigo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que son tratados por cáncer pancreático metastático. En las figuras, la línea continua representa el tratamiento con bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento con placebo/gemcitabina-erlotinib.
Figura 17 (que comprende las figuras 17A y 17B) : Curvas de Kaplan Meier para asociación con efecto de tratamiento sobre la Supervivencia Global para el marcador de VEGFA (Figura 17A) y para asociación con el efecto de tratamiento sobre la Supervivencia Libre de Avance del marcador de VEGFA (Figura 17B) tanto para altos niveles de expresión (= 152.9 pg/ml) como para bajos niveles de expresión (< 152.9 pg/.ml) , para la terapia de bevácizumab mas gemcitabina-erlotinib versus terapia de placebo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que son tratados- por cáncer pancreático metastático. En las figuras, la línea, continua representa el tratamiento con bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento con placebo/gemcitabina-erlotinib.
Figura 18 (que comprende las figuras 18A y 18B) : Curvas de Kaplan Meier para asociación con el efecto de tratamiento sobre la Supervivencia Global para los marcadores de VEGFA y VEGFR2 (Figura 18A) como un nivel de expresión combinado tanto para altos niveles de expresión (Formula 1 = 0.1) como para bajos niveles de expresión (Formula 1 < 0.1) y VEGFA y PLGF (Figura 18B) como un nivel de expresión combinado tanto para altos niveles de expresión Formula 2 = 0.042) como para bajos niveles de expresión (Formula 2 < 0.042) para la terapia de bevacizumab/gemcitabina-erlotinib versus terapia de placebo testigo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que son tratados por cáncer pancreático metastático. En las figuras, la línea continua representa el tratamiento con bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento con placebo/gemcitabina-erlotinib.
Figura 19 (que comprende las figuras 19A y 19B) : Curvas de Kaplan Meier para asociación con efecto de tratamiento sobre la Supervivencia Libre de Avance para los marcadores de VEGFA y VEGFR2 (Figura 19A) , como un nivel de expresión combinado tanto para altos niveles de expresión (Formula 1 = 0.1) como para bajos niveles de expresión (Formula 1 < 0.1) y VEGFA y PLGF (Figura 19B) , como un nivel de expresión combinado tanto para altos niveles de expresión (Formula 2 = 0.042) como para bajos niveles de expresión (Formula 2 < 0.042) para la terapia de bevacizumab/gemcitabina-erlotinib versus terapia de placebo testigo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que son tratados por cáncer pancreático metastático. En las figuras, la línea continua representa el tratamiento con bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento con placebo/gemcitabina-erlotinib .
Figura 20 (que comprende las figuras 20A y 20B) : Curva de Kaplan Meier para asociación con efecto de tratamiento sobre la Supervivencia Global para los marcadores de VEGFA y VEGR2 y PLGF (Figura 20A) , como un nivel de expresión combinado tanto para altos niveles de expresión (Formula 3 = 0.837) como para bajos niveles de expresión (Formula 3 < 0.837) y para asociación con los efectos sobre la Supervivencia Libre de Avance para los marcadores de VEGFA, VEGFR2 y PLGF (Figura 20B) , como un nivel de expresión combinado tanto para altos niveles de expresión (Formula 3 = 0.837) como para bajos niveles de expresión (Formula 3 < 0.837), para terapia de bevacizumab mas gemcitabina-erlotinib versus terapia de placebo testigo más gemcitabina-erlotinib para pacientes que son tratados por cáncer pancreático metastático. En la figura, la línea continua representa el tratamiento con bevacizumab/gemcitabina-erlotinib y la línea discontinua representa el tratamiento con placebo/gemcitabina-erlotinib .
Figura 21: Datos de muestras de EDTA y citrato de los mismos pacientes medida dos veces con el análisis IMPACT. La concentración de VEGFA es alrededor de 40% más alta EDTA-plasma que para citrato con una correlación de Spearman para el método de EDTA-citrato comparación de alrededor de 0.8.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS I . Introducción La invención provee métodos para identificar pacientes que tienen probabilidad incrementada de responder a una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF.
II. Definiciones En ciertas modalidades, el término "incremento" o "por encima" se refiere a un nivel, al nivel de referencia o a un incremento global de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o mayor, en nivel de VEGF sin modificar detectado por los métodos descritos en la presente, en comparación con el nivel de VEGF sin modificar de una muestra de referencia. En una modalidad, el termino nivel incrementado se relación con un valor en o por encima de un nivel de referencia.
En ciertas modalidades, el término "disminuir" en la presente se refiere a un nivel debajo del nivel de referencia o a una reducción global del 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, en el nivel de VEGF sin modificar en el plasma detectado mediante los métodos descritos en la presente, en comparación con el nivel de VEGF sin modificar de una muestra de referencia. En ciertas modalidades, el termino disminuir se refiere a la disminución en el nivel de VEGF sin modificar, en donde el nivel disminuido es a lo más alrededor de 0.9-, 0.8-, 0.7-, 0.6-, 0.5-, 0.4-, 0.3-, 0.2-, 0.1- o 0.05- veces el nivel de VEGF sin modificar de la muestra de referencia o más bajo.
En ciertas modalidades, el término "a un nivel de referencia" se refiere a un nivel de VEGF sin modificar que es el mismo como el nivel de VEGF sin modificar detectado por los métodos descritos en la presente de una muestra de referencia.
En ciertas modalidades, el término "nivel de referencia" en la presente se refiere a un valor predeterminado. Como el experimentado en el arte apreciara, el nivel de referencia es predeterminado y establecido para satisfacer los requerimientos en términos por ejemplo de especificidad y/o sensibilidad. Estos requerimientos pueden variar, por ejemplo de cuerpo regulatorio a cuerpo regulatorio. Puede por ejemplo ser que la sensibilidad de análisis o especificidad, respectivamente, tenga que ser establecida a ciertos límites, por ejemplo 80%, 90% o 95%. Estos requerimientos pueden también ser definidos en términos de valores predictivos positivos o negativos. No obstante, en base a las enseñanzas dadas en la presente invención, siempre será posible llegar al nivel de referencia que cumple con . aquellos requerimientos. En una modalidad, el nivel de referencia es determinado en individuos saludables. El valor de referencia en una modalidad ha sido predeterminado en la entidad enferma a la cual el paciente pertenece. En ciertas modalidades, el nivel de referencia puede ser ajustado a cualquier porcentaje entre 25% y 75% de la distribución global de los valores en una entidad enferma investigada. En otras modalidades, el nivel de referencia puede por ejemplo ser establecido a la mediana, terciles o cuartiles tal como se determina de la distribución global de los valores en una entidad enferma investigada. En una modalidad, el nivel de referencia es ajustado al valor mediano tal como se determina de la distribución global de los valores en una entidad enfermedad investigada.
En el contexto de la presente invención, "VEGF-A, " "VEGFA" o "VEGF" se refiere a la proteína A de factor de crecimiento endotelial vascular, ejemplificada por SEQ ID NO: 1, mostrada en la Figura 8 (No. De Acceso Swiss Prot pl5692, Gene ID (NCBI) : 7422) . El término "VEGF-A" abarca la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 también como homólogos e isoformas de la misma. El término "VEGF-A" también abarca las isoformas conocidas, por ejemplo isoformas de empalme de VEGF-A, por ejemplo VEGFm , VEGF12i , VEGFi45 , VEGF165 , VEGF189 y VEGF206, junto con las formas alélicas que se presentan naturalmente en formas procesadas de las mismas, incluyendo el factor de crecimiento celular endotelial vascular humano de 110 aminoácidos generado por la escisión de plasmina de VEGFiss como se describe en Ferrara Mol. Biol . Cell 21:687 (2010) y Leung et al. Science 246:1306 (1989) y Houck et al. Mol. Endocrin. 5:1806 (1991). En el contexto de la invención, el término "isoforma" de VEGF, VEGFA o VEGF-A se refiere tanto a las isoformas de empalme como a las formas generadas mediante escisión enzimática (por ejemplo, plasmina) .
En el contexto de la presente invención VEGF "sin modificar" se refiere a la secuencia de aminoácidos sin modificar de VEGF, sus isoformas y sus productos de escisión. El VEGF sin modificar puede por ejemplo ser producido sintéticamente o de preferencia recombinantemente en sistemas de expresión procarionticos , por ejemplo, en E. coli. VEGF sin modificar por ejemplo no porta una modificación posttraducción como una glicosilación . En el contexto de la invención, el término "VEGF-A sin modificar" también abarca variantes y/u homólogos del mismo, también como fragmentos de VEGF, a condición de que las proteínas variantes (incluyendo isoformas) , proteínas homologas y/o fragmentos son reconocidos por anticuerpos específicos de VEGF-A sin modificar, tal como el clon de anticuerpo 3C5, que está disponible de RELIATech GmbH, Wolfenbüttel , Alemania.
En el contexto de la presente invención, "VEGFR2" se refiera al receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular, ejemplificado por SEQ ID NO: 2, mostrado en la Figura 9 (Numero de acceso Swiss Prot P35968, Gene ID (NCBI) : 3791) . El término "VEGFR2" abarca la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 también como homólogos e isoformas del mismo. En el contexto de la invención, el término "VEGFR2" también abarca proteínas que tienen por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o con la secuencia de aminoácidos' de las variantes u homólogos de los mismos, también como fragmentos de las secuencias, a condición de que las proteínas variantes (incluyendo isoformas) , proteínas homologas y/o fragmentos sean reconocidos por uno o más anticuerpos específicos de VEGFR2, tales como el clon de anticuerpo 89115 y 89109, que están disponibles de R&D Systems .
En el. contexto de la presente invención, "PGLF" se refiere al factor de crecimiento placental ejemplificado pro SEQ ID No. 3, mostrado en la Figura 10 (Numero de acceso Swiss Prot P49763, Gene ID (NCBI) : 5228). El término "PGLF" abarca la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 también como homólogos e isoformas de la misma. En el contexto de la invención, el término "PGLF" también abarca proteínas que tienen por lo menos 85%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o con la secuencia de aminoácidos de las variantes y/u homólogos de las mismas, también como fragmentos de la secuencias, a condición de que las proteínas variantes (incluyendo isoformas) , proteínas homologas y/o fragmentos sean reconocidos por uno o más anticuerpos específicos de PGLF, tales como el clon de anticuerpo 2D6D5 y 6A11D2, que están disponibles de Roche Diagnostics GmbH.
El término "VEGF" también se refiere a VEGF de especies no humanas, tales como ratón, rata o primates. Algunas veces, el VEGF de una especie especifica son indicados por términos tales como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF murino, etc . El término "VEGF" es también usado para referirse a las formas truncadas del polipéptido que comprende aminoácidos 8 a 109 o l a 109 del factor de crecimiento endotelial vascular humano de 165 aminoácidos. La referencia a cualquiera de tales formas de VEGF puede ser identificad en la presente solicitud, por ejemplo por "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" or "VEGFi65. Las posiciones de aminoácido para un VEGF "natural" truncado, son numeradas como se indica en la secuencia de VEGF natural. Por ejemplo, la posición 17 de aminoácido (metionina) en VEGF natural truncada es también la posición 17 (metionina) en VEGF natural . El VEGF natural truncado tiene afinidad de enlace por lo receptores de KDR y Flt-1 comparable a VEGF natural. De acuerdo con una modalidad preferida, el VEGF es un VEGF humano "Actividad biológica de VEGF" incluye enlace a cualquier receptor de VEGF o cualquier actividad de señalización de VEGF tal como regulación tanto de angiogénesis anormal como normal y vasculogenésis (Ferrara y Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527- 543) ; promover la vasculogenésis y angiogénesis embriónica (Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439; Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442); y modular la proliferación de vasos sanguíneos cíclicos en el sistema reproductor femenino y para crecimiento de hueso y formación de cartílagos (Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4:336-340; Gerber et al. (1999) Nature Med. 5:623-628). Además de ser un factor angiogénico en la angiogénesis y vasculogenésis, VEGF, como un factor de crecimiento pleiotropico, exhibe múltiples efectos biológicos en otros procesos fisiológicos, tales como supervivencia celular endotelial, permeabilidad de vasos y vasodilatación, quimio taxis de monocito y flujo hacia adentro de calcio (Ferrara y Davis-Smyth (1997) , supra y Cebe-Suarez et al. Cell. Mol. Life Sci . 63:601-615 (2006)). Además, estudios recientes han reportado efectos mitogénicos de VEGF sobre unos pocos tipos de células no endoteliales tales como células epiteliales de pigmento retinal, células de conducto pancreático y células de Schwann. Guerrin et al. · (1995) J. Cell Physiol . 164:385-394; Oberg-Welsh et al. (1997) Mol. Cell. Endocrinol . 126:125-132; Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740.
Un "antagonista de VEGF" o "antagonista VEGF-especifico" se refiere a una molécula apta de enlace a VEGF, reducir los niveles de expresión de VEGF o neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades biológicas de VEGF, incluyendo pero no limitado a enlace de VEGF a uno o más receptores de VEGF y angiogénesis moderada por VEGF y supervivencia o proliferación de célula endotelial. Incluidos como antagonistas VEGF-específicos útiles en los métodos de la invención están polipéptidos que se enlazan específicamente a VEGF, polipéptidos que se enlazan específicamente a receptores de VEGF, anticuerpos anti-VEGF y fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, moléculas de receptor y derivados que se enlazan específicamente a VEGF, secuestrando mediante esto su enlace a uno o más receptores, proteínas de fusión (por ejemplo, VEGF-Trap (Regeneron) ) y VEGF12i-gelonina (Peregrine) . Antagonistas de VEGF-específicos también incluyen variantes antagonistas de polipéptido de VEGF, oligómeros de núcleo base anti sentido divididos a VEGF, moléculas de ARN pequeñas dirigidas a VEGF, aptámeros de ARN, pepticuerpos y ribosomas contra VEGF, ácidos nucleicos que se hibridizan bajo condiciones severas a secuencias de ácido nucleico que codifican VEGF o receptor, de VEGF (por ejemplo, ARNi) , inmunoadhesinas, anticuerpos de receptor anti-VEGF y antagonistas de receptor de VEGF tales como inhibidores de molécula pequeña de las cinasas de tirosina de VEGFR. De acuerdo con una modalidad preferida, el antagonista de VEGF se enlaza a VEGF e inhiben la proliferación celular endotelial VEGF- inducida in vitro. De acuerdo con una modalidad preferida, el antagonista de VEGF se enlaza a VEGF o un receptor de VEGF con mayor afinidad que sin VEGF o receptor sin VEGF. De acuerdo con una modalidad preferida, el antagonista de VEGF se enlaza a VEGF o un receptor de VEGF con una Kd de entre 1 uM y 1 pM. De acuerdo con otra modalidad preferida, el antagonista de VEGF se enlaza a VEGF o un receptor de VEGF entre 500 nM y 1 pM. Antagonistas VEGF-específicos también incluyen moléculas pequeñas sin péptido que se enlazan a VEGF y son aptos de bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades biológicas de VEGF. Así, el término "actividades de VEGF" incluyen específicamente actividades biológicas moderadas por VEGF de VEGF. En ciertas modalidades, el antagonista de VEGF reduce o inhibe, por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más, el nivel de expresión o actividad biológica de VEGF .
De acuerdo con una modalidad preferida, el antagonista de VEGF es seleccionado de un polipéptido tal como un anticuerpo, un pepticuerpo, una inmunoadhesina, una molécula pequeña o un aptámero. En una modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo-VEGF tal como bevacizumab AVASTIN*) o un anticuerpo receptor anti-VEGF tal como un anticuerpo anti-VEGFR2 o anti-VEGFR3. Otros ejemplos de antagonistas de VEGF incluyen: VEGF-Trap, Mucagen, PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (sorafenib) , ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975/CT6758 y KR -633.
Un "anticuerpo anti-VEGF" es un anticuerpo que se enlaza a VEGF con suficiente afinidad y especificidad. En ciertas modalidades, el anticuerpo seleccionado tendrá normalmente una afinidad de enlace suficiente por VEGF, por ejemplo el anticuerpo se puede enlazar a hVEGF con un valor de Ka de entre 100 nM-1 pM. Las afinidades de anticuerpo pueden ser determinadas mediante un análisis a base de resonancia de plasmón superficial (tal como el análisis BIAcore como se describe en la publicación de Solicitud de PCT WO 2005/012359); análisis inmunoabsorbente enzima-enlazado (ELISA) y análisis de competencia (por ejemplo, RIA) , por ejemplo. Preferiblemente, el anticuerpo anti-VEGF de la invención puede ser usado como agente terapéutico en el apuntamiento e interferencia con enfermedades o condiciones en donde la actividad de VEGF está involucrada. Un anticuerpo anti-VEGF usualmente no se enlazara a otros homólogos de VEGF, tales como VEGF-B o VEGF-C, ni otros factores de crecimientos tales como P1GF, PDGF o bFGF. Un anticuerpo VEGF preferido es un anticuerpo monoclonal que se enlaza al mismo epítope como el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A .6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709. Mas preferiblemente el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599, incluyendo pero no limitado al anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; «Avastin®) . De acuerdo con otra modalidad, anticuerpos anti-VEGF que pueden ser usados incluyen pero no están limitados a los anticuerpos revelados en WO 2005/012359. De acuerdo con una modalidad, el anticuerpo anti-VEGF comprende la región pesada variable y ligera variable de cualquiera de los anticuerpos revelados en las Figuras 24, 25, 26, 27 y 29 de WO 2005/012359 (por ejemplo, G6 , G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 y B20.4.1). En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-VEGF conocido como ranibizumab es el antagonista de VEGF administrado para enfermedad ocular tal como neuropatía diabética y AMD.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-VEGF puede ser usado como agente terapéutico en apuntamiento e interferencia con enfermedades o condiciones en donde la actividad de VEGF está involucrada. También, el anticuerpo puede ser sometido a otros análisis de actividad biológica, por ejemplo con el fin de evaluar su efectividad como terapéutico. Tales análisis son conocidos en el arte y dependen del antígeno objetivo y uso propuesto para el anticuerpo. Ejemplos incluyen el análisis de inhibición de HUVEC; análisis de inhibición de crecimiento de célula de tumor (como se describe en WO 89/06692) ; citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente (ADCC) y análisis de citotoxicidad complemento-moderada (CDC) (Patente Estadounidense 5,500,362) y actividad agonista o análisis de hematopoyesis (véase, WO 95/27062) . Un anticuerpo anti-VEGF usualmente no se enlazara a otros homólogos de VEGF tales como VEGF-B o VEGF-C y otros factores de crecimiento tales como P1GF, PDGF o bFGF. En una modalidad, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal que se enlaza al mismo epítope como el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709. En otra modalidad, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599, incluyendo pero no limitado al anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; AVASTIN*) .
El anticuerpo anti-VEGF "Bevacizumab (BV)", también conocido como "rhuMAb VEGF" o "AVASTIN*, " es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599. Comprende regiones de estructura de IgGl humanas mutadas y regiones determinantes de complementariedad de enlace de antígeno del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF murino A.4.6.1 que bloquea el enlace de VEGF humano a sus receptores . Aproximadamente el 93% de la secuencia de aminoácidos de bevacizumab, incluyendo la mayoría de las regiones de estructura, es derivada de IgGl humana y alrededor de 7% de la secuencia es derivada del anticuerpo murino A.4.6.1. Bevacizumab tiene una masa molecular de alrededor de 149 Dalton y es glicosilado. Bevacizumab y otros anticuerpos anti-VEGF humanizados son descritos adicionalmente en la Patente Estadounidense 6,884,879 y WO 2005/044853.
El anticuerpo anti-VEGF Ranibizumab o el anticuerpo Lucentis® o rhuFab V2 es un fragmento de Fab VEGF humano madurado por afinidad humanizado. Ranibizumab es producido mediante métodos de tecnología recombinante estándar en vector de expresión de Escherichia coli y fermentación bacteriana. Ranibizumab no es glicosilado y tiene una masa muscular de -48,000 Dalton. Véase WO 98/45331 y US 2003/0190317.
Los dos receptores de VEGF mejor caracterizados son VEGFR1 (también conocido como Flt-1) y VEGFR2 (también conocido como KDR y FLK-1 por el homologo murino) . La especificidad de cada receptor por cada miembro de la familia de VEGF varia pero VEGF-A se enlaza tanto a Flt-1 como KDR. El receptor de Flt-1 de plena longitud incluye un dominio extraeelular que tiene siete dominios de Ig, un dominio de transmembrana y un dominio intracelular con actividad de cinasa de tirosina. El dominio extraeelular está involucrado en el enlace de VEGF y el dominio intracelular está involucrado en la transduccion de señal .
Moléculas de receptor de VEGF o fragmentos de las mismas que se enlazan específicamente a VEGF pueden ser usados como inhibidores de VEGF que se enlazan a y secuestran la proteína de VEGF, impidiendo mediante esto su señalización. En ciertas modalidades, la molécula de receptor de VEGF o fragmento de enlace de VEGF de la misma es una forma soluble, tal como flt-1. Una forma soluble del receptor ejerce un efecto inhibidor sobre la actividad biológica de la proteína de VEGF mediante enlace a VEGF, impidiendo mediante esto que se enlace a sus receptores naturales presentes sobre la superficie de células objetivo. También incluidas están las proteínas de fusión de receptor de VEGF, ejemplos de los cuales son descritos posteriormente en la presente.
Una proteína de receptor de VEGF quimérica es una molécula de receptor que tiene secuencias de aminoácido derivadas de por lo menos dos proteínas diferentes, por lo menos una de las cuales es una proteína de receptor de VEGF (por ejemplo, el receptor flt-1 o receptor KDR) , que es apta de enlace a e inhibir la actividad biológica de VEGF. En ciertas modalidades, las proteínas de receptor de VEGF quiméricas de la presente invención consisten de secuencias de aminoácidos derivadas de solamente dos moléculas de receptor de VEGF diferentes; sin embargo, secuencias de aminoácido que comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o todos los siete dominios semejantes a Ig de la región de enlace de ligando extracelular del receptor de Flt-1 o KDR pueden ser enlazados a secuencias de aminoácidos de otras proteínas no relacionadas, por ejemplo secuencias de inmunoglobulina. Otras secuencias de aminoácidos a las cuales dominios semejantes a Ig son combinados serán fácilmente evidentes para aquellos de habilidad ordinaria en el arte. Ejemplos de proteínas de receptor de VEGF quiméricas incluyen pero no están limitados a flt-l/soluble, KDR/Fe o Flt-l/KDR/Fc (también conocido como trampa de VEGF) . (Véase, por ejemplo, Publicación de Solicitud de PCT WO 97/44453) .
Una proteína de receptor de VEGF soluble o proteína de receptor de VEGF quimérica incluyen proteínas de receptor de VEGF que no se fijan a la superficie de células vía un dominio de transmembrana. Como tal, las formas solubles del receptor de VEGF, incluyendo proteínas de receptor quiméricas, en tanto que son aptas de enlazarse a y desactivar VEGF, no comprenden un dominio de transmembrana y así en general no son asociadas con la membrana celular de célula en las cuales la molécula es expresada.
Inhibidores de VEGF adicionales son descritos por ejemplo, en 99/24440, Publicación Internacional de PCT PCT/IB99/00797, en WO 95/21613, WO 99/61422, Patente Estadounidense 6,534,524, Patente Estadounidense 5,834,504, WO 98/50356, Patente Estadounidense 5,883,113, Patente Estadounidense 5,886,020, Patente Estadounidense 5,792,783, Patente Estadounidense 6,653,308, WO 99/10349, O 97/32856, WO 97/22596, WO 98/54093, WO 98/02438, WO 99/16755 y WO 98/02437, todas las cuales son incorporadas en la presente' por referencia en su totalidad.
El término "polipéptido serie B20" como se usa en la presente se refiere a un polipéptido, incluyendo un anticuerpo que se enlaza a VEGF. Los polipéptidos serie B20 incluyen pero no están limitados a anticuerpos derivados de una secuencia del anticuerpo B20 o un anticuerpo B20 -derivado descrito en la Publicación Estadounidense 2006/0280747, Publicación Estadounidense 2007/0141065 y/o Publicación Estadounidense 2007/0020267, el contenido de estas solicitudes de patente es incorporado expresamente en la presente por referencia. En una modalidad, el polipéptido serie B20 es B20-4.1 cómo se describe en la Publicación de Patente Estadounidense 2006/0280747, Publicación Estadounidense 2007/0141065 y/o Publicación Estadounidense 2007/0020267. En otra modalidad, el polipéptido serie B20 es B20-4.1 descrito en la Solicitud de Patente Estadounidense 60/991,302, toda la revelación de la cual es incorporada expresamente por referencia.
El término "polipéptido serie G6" como se usa en la presente se refiere a un polipéptido, incluyendo, un anticuerpo que se enlaza a VEGF. Los polipéptidos de la serie G6 incluyen pero no están limitados a anticuerpos derivados de una secuencia de anticuerpo G6 o un anticuerpo G6-derivado descrito en la Publicación de Patente Estadounidense 2006/0280747, Publicación Estadounidense 2007/0141065 y/o Publicación Estadounidense 2007/0020267. Los polipéptidos series G6 como se describen en la Publicación de Patente Estadounidense 2006/0280747, Publicación Estadounidense 2007/0141065 y/o Publicación Estadounidense 2007/0020267 incluyen pero no están limitados a G6-8, G6-23 y G6-31.
Para anticuerpos adicionales, véanse, por ejemplo Patentes Estadounidenses 7,060,269, 6,582,959, 6,703,020; 6,054,297; WO 98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 2006/009360, 2005/0186208, 2003/0206899, 2003/0190317, 2003/0203409, and 2005/0112126 y Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004). En ciertas modalidades, otros anticuerpos incluyen aquellos que se enlazan a un epitope funcional sobre VEGF humanos que consisten de residuos F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191, K101, E103 y C104 o alternativamente, que comprende residuos F17, Y21, Q22, Y25, D63, 183 y Q89.
Otros anticuerpos anti-VEGF son también conocidos y descritos por ejemplo en Liang et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006) .
Una "respuesta efectiva" de un paciente o la "responsividad" o "sensibilidad" de un paciente al tratamiento con un agente anti-cáncer se refiere al beneficio químico impartido a un paciente en riesgo de o que sufre de cáncer o como resultado con un agente anti-cáncer, tal como por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF-A. Tal beneficio incluye respuestas celulares o biológicas, una respuesta completa, una respuesta parcial, una enfermedad estable (sin avance o recaída) o una respuesta con una recaída posterior del paciente de o como resultado del tratamiento con el antagonista. Por ejemplo, una respuesta efectiva puede ser tamaño de tumor reducido, supervivencia libre de avance o supervivencia global .
"Antagonistas" como se usa en la presente, se refiere a compuestos o agentes que inhiben o reducen la actividad biológica de la molécula a la cual se enlazan. Los antagonistas incluyen anticuerpos, péptidos sintéticos o de secuencia natural, inmunoadhesinas y antagonistas de molécula pequeña que se enlazan a VEGF, opcionalmente conjugados con o fusionados a otra molécula. Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se enlaza.
Un "anticuerpo agonista" como se usa en la presente, es un anticuerpo que imita parcial o completamente por lo menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés .
El término "anticuerpo" es usado en la presente en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos bis específicos) , formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpo, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada.
En ciertas modalidades, un anticuerpo usado como antagonista de VEGF de un método provisto en la presente es un anticuerpo multiespecíficos , por ejemplo un anticuerpo bis especifico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de enlace en al menos dos sitios diferentes. En ciertas modalidades, una de las especificidades de enlace es por VEGF y la otra es para cualquier otro antígeno. En ciertas modalidades, los anticuerpos bis específicos se pueden enlazar a dos epítopes diferentes de VEGF. Anticuerpos bis específicos pueden también ser usados para localizar agentes citotóxicos a células que expresan VEGF. Anticuerpos bis específicos pueden ser preparados como anticuerpos de plena longitud o fragmentos de anticuerpo.
Técnicas para fabricación de anticuerpos multiespecíficos incluyen pero no están limitadas a coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-de cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véase, Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, O 93/08829, and Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), y diseño de "perilla en agujero" (véase, por ejemplo Patente Estadounidense 5,731,168). Anticuerpos multiespecíficos pueden también ser fabricados mediante diseño de efectos de direccionamiento electrostáticos para fabricar moléculas de Fc-heterodimericas de anticuerpo (WO 2009/089004) ; reticulación de dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo Patente Estadounidense 4,676,980 y Brennan, M . et al., Science 229 (1985) 81-83); utilizando cremallera de leucina para producir bis-específicos (véase, por ejemplo, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; utilizando tecnología de "diacuerpo" para fabricar fragmentos de anticuerpo bis-especifico (véase, por ejemplo, Holliger, P. et al., Proc . Natl.'Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); y USO de dímeros de Fv de una sola cadena (sFv) (véase, por ejemplo Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); y preparación de anticuerpos tris-específicos como se describe por ejemplo en, por ejemplo, in Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69) .
Anticuerpos diseñados con tres o más sitios de enlace de antígeno funcionales, incluyendo "anticuerpos pulpo", son también incluidos en la presente (véase, por ejemplo, 2006/0025576) .
El anticuerpo o fragmento de la presente también incluye un "FAb de acción doble" o "DAF" que comprende un sitio de enlace de antígeno que se enlaza a VEGF, también como otro antígeno diferente (véase, por ejemplo 2008/0069820) .
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo usado como antagonista de VEGF en un método provisto en la presente también incluye anticuerpos multiespecíficos como se describe en WO2009/080251, WO2009/080252 , WO2009/080253 , WO2009/080254, WO2010/112193 , WO2010/115589 , W02010/136172 , WO 2010/145792 y WO 2010/145793. Ejemplos de anticuerpos VEGF bis específicos son descritos por ejemplo en WO2010/040508 (VEGF-A G2), PCT/EP2011/054504 (VEGF-ANG2) , WO2005/087812 (VEGF-PDGF) , WO2009120922 (VEGF-PDGFR beta) , WO2011/039370 (VEGF-DII4) .
Un anticuerpo "aislado" es un que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio ambiente natural . Componentes contaminantes de su medio ambiente natural son materiales que interferirían con los usos de investigación, diagnostico o terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas u otros solutos proteinaceos o no proteinaceos . En algunas modalidades, un anticuerpo es purificado (1) a mayor de 95% en peso del anticuerpo, tal como se determina por ejemplo mediante el método de Lowry y en algunas modalidades a mayor de 99% en peso; (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 1 a 15 residuos de secuencia de aminoácido de N-terminal o interna mediante el uso de por ejemplo secuenciado de copa de centrifugación o (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando . por ejemplo teñido de azul de comassie o plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes , puesto que por lo menos un componente del medio ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado mediante por lo menos una etapa de purificación.
"Anticuerpos naturales" son usualmente glicoproteínas heterotretamericas de alrededor de 150,000 daltons compuestas de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera es enlazada a una cadena pesada mediante un enlace de disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera también tienen puentes de disulfuro de intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes . Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el domino constante de la cadena ligera es alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera es alineado con el domino variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos de aminoácidos particulares forman una interface entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada.
La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino-terminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada puede ser denominado como "VH" . El dominio variable de la cadena ligera puede ser denominado como "VL" . Estos dominios son en general las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de enlace de antigeno.
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y son usadas en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular de su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no estará distribuida igualmente en todos los dominios variables de anticuerpo está concentrada en tres segmentos llamados regiones hipervariables (HVR) tanto en los dominios variables de cadena ligera como cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables son llamadas las regiones de estructura (FR) . Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales cada una comprenden cuatro regiones de FR, que adoptan extensamente una configuración de hora beta, unida mediante tres HVR, que forman bucles que unen en algunos casos forman parte de la estructura de hoja beta. Las HVR en cada cadena son mantenidas conjuntamente en proximidad estrecha con las regiones de FR y con las HVR de la otra cadena contribuyen a la formación y el sitio de enlace de antígeno de anticuerpos (véase, Kabat et al., Sequences of Proteins of Im unological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)) . Los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, sino que exhiben varias funciones efectoras , tales como participación del anticuerpo en toxicidad celular anticuerpo-dependiente.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente distintos, ( ) y lambda (?) , en base a las secuencias de amino ácidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, se puede asignar los anticuerpos (inmunoglobulinas) a clases diferentes. Hay cinco clases principales de inmunoglobulina : IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de estas pueden ser divididas en adicionalmente en subclases (isotipos) por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 , IgAl y IgA2. Los dominios constantes de cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulina son llamados a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidos y se describen en general por ejemplo en Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co., 2000) . Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión mas grande formada mediante asociación covalente o no covalente del anticuerpo con uno o más de otras proteínas o péptidos .
Los términos "anticuerpo de plena longitud" , "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" son usados en la presente intercambiablemente para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no fragmentos de anticuerpo como se definen posteriormente . en la presente. Los términos se refieren particularmente a un anticuerpo con cadena pesadas que contienen una región de Fe .
Un "anticuerpo descubierto" para los propósitos de la presente es un anticuerpo que no es conjugado a una porción citotóxica o radia marcador "Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprenden preferiblemente la región de enlace de antígeno del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab' , F(ab')2, y fragmentos Fv; diacuerpos; Anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.
La digestión de papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de enlace de antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de enlace de antígeno y un fragmento de "Fe" refleja su habilidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento de F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y es todavía apto de reticulación de antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de enlace dé antígeno complete. En una modalidad, una especie de Fv de dos cadenas consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y cadena ligera en fuerte asociación no covalente. En una especie de Fv de una sola cadena (scFv) , un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera pueden ser enlazados covalentemente por un enlazador de péptido flexible, de tal manera que las cadenas ligeras y pesadas se pueden asociar en una estructura "dimerica" análoga a aquella en una especie de Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres HVR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace de antígeno sobre la superficie del dímero de VH-VL. Colectivamente, las seis HVR confieren especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aun un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres HVR específicas para un antígeno) tienen la habilidad para reconocer y enlazarse al antígeno, aunque a una afinidad más baja que todo el sitio de enlace.
El fragmento de Fab contiene los dominios variables . de cadena pesada y cadena ligera y también contienen el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos de Fab' difieren de los fragmentos de Fab por la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio de CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteinas de la región de anticuerpo-bisagra. Fab' -SH es la designación en la presente por Fab' en el cual el (los) residuo (s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F (ab' ) 2 originalmente eran producidos como pares de fragmentos de Fab' que tienen cisteinas de bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo son también conocidos.
"Fv de una sola cadena" o fragmento de anticuerpo "scFv" comprenden el dominio de VH y VL de un anticuerpo,, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. En general, el polipéptido de scFv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios de VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para el enlace de antígeno. Para una revisión de scFv, véase, por ejemplo Plueckthun, en The Pharmacology of Mono-clonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds . (Springer-Verlag, New York: 1994), pp 269-315.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo o con dos sitios de enlace de antígeno, tales fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) unido a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL) . Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o bis específicos. Los diacuerpos son descritos más plenamente en, por ejemplo EP 404097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003) y Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993). Triacuerpos y diacuerpos son también descritos en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003) .
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancraímente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo mutaciones que ocurren naturalmente, que pueden estar presentes en cantidades menores. Así, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por no ser una mezcla de anticuerpos discretos. En ciertas modalidades, tal anticuerpo monoclonal incluye comúnmente un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptidos que se enlaza a un objetivo, en donde la secuencia del polipéptido del enlace objetivo fue obtenido mediante un proceso que incluye la selección de una sola secuencia de polipéptido de enlace objetivo de una pluralidad de secuencias de polipéptido. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tal como un fondo de clones de fago o clones de ADN recombinantes . Se debe entender que una secuencia de enlace objetivo seleccionada puede ser alterada adicionalmente , por ejemplo para mejorar la afinidad por el objetivo, para humanizar la secuencia de enlace objetivo, para mejorar su producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de enlace de anticuerpo alterada es también un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste con preparaciones de anticuerpo policlonales que comúnmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal es dirigido contra un solo determinante sobre un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal son ventajosos en que están comúnmente sin contaminar por otras inmunoglobulinas .
El modificador "anticuerpo" indica el carácter del anticuerpo por ser obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se interpretara que requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos . monoclonales a ser usados de acuerdo con la presente invención pueden ser fabricados mediante una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo el método de hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein. , Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlo et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies y T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de ADN recombinantes (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense 4,816,567), tecnologías de despliegue de fago (véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol . 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (5): 1073-1093 (2004); Fellouse, PNAS USA 101(34): 12467-12472 (2004) y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004) y tecnologías para producir anticuerpos humanos o anticuerpo semejantes a humanos en animales que tienen partes o todos los sitios de inmunoglobulina humanos o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humanas (véase, por ejemplo WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; JakobovitS et al., PNAS USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; and 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); orrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol .13 : 65-93 (1995) .
Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la (s) cadena (s) es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, también como fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiben la actividad biológica deseada (por ejemplo, Patente Estadounidense 4,816,567 y Morrison et al., PNAS USA 81:6851-6855 (1984)). Anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos PRIMATIZED® en donde la región de enlace de antígeno del anticuerpo es derivada de un anticuerpo producido por ejemplo al inmunizar monos macacos con el antígeno de interés .
Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En una modalidad, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en el cual residuos de una HVR de receptor fueron reemplazados por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunas instancias, los residuos de FR de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se pueden reasignar adicionalmente el desempeño de anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno y comúnmente dos dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellas de inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) comúnmente aquellas de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase, por ejemplo, ., Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988) y Presta, Curr.
Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véase también, por ejemplo, Vas ani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol . 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc . Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y Patentes Estadounidenses 6,982,321 y 7,087,409.
Un "anticuerpo humano" es una que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o ha sido elaborado utilizando cualquiera de las técnicas para fabricar anticuerpos humanos como se revela en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace de antígeno no humanos . Los anticuerpos humanos pueden ser producidos utilizando técnicas conocidas . en el arte, incluyendo bibliotecas de despliegue de fago. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. .Mol. Biol., 222:581 (1991). También disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos están los métodos descritos en Colé et al., Monoclonal Antibodies y Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1) :86-95 (1991). Véase, también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol . , 5: 368-74 (2001). Los anticuerpos humanos pueden ser preparados al administrar el antígeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir tales anticuerpos en respuesta al ataque antígeno, pero cuyo sitios endógenos han sido deshabilitados, por ejemplo xenoratones inmunizados (véase, por ejemplo Patente Estadounidense 6,075,181 y 6,150,584 con respecto a la tecnología de XENOMOUSE™) . Véase también, por ejemplo, Li et al., PNAS USA, 103:3557-3562 (2006) con respecto a anticuerpos humanos generados vía una tecnología de hibridoma de célula B humana.
El término "región hipervariable" , "HVR" o "HV" , cuando son usados en la presente se refieren a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariable en secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente . En general, los anticuerpos comprenden seis HVR, tres en la VH (Hl, H2, H3) y tres en la VL (Ll, L2 , L3) . En anticuerpos naturales, H3 y L3 mue'stran la mayor diversidad de las seis HVR y H3 en particular se cree que juega un papel único en conferir especificidad fina a anticuerpos. Véase, por ejemplo Xu et al.' Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003) . Por supuesto, anticuerpos de camélido que se presentan en la naturaleza que consisten de una cadena pesada solamente son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera. Véase, por ejemplo Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) y Sheriff et al., Nature Struct. Biol . 3 : 733-736 (1996) .
Un número de delineaciones de HVR están en uso y son abarcadas en la presente. - Las HVR que son regiones determinantes de complementariedad (CDR) de Kabat están basadas en la variabilidad de secuencia y son las más comúnmente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) . Chothia se refiere en lugar de esto a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) . Las HVR de AbM representan una solución intermedia entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y son usadas por los elementos de programación de modelado de anticuerpo AbM de Oxford Molecular. Las HVR de "contacto" están basadas en el análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada de una de estas HVR son indicados a continuación.
Bucle Kabat AbM Chothia Contacto Ll L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeración de Kabat) Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 Las HVR pueden comprender "HVR extendidas" como sigue: 24-36 o 24-34 (Ll) , 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89-96 (L3) en la VL y 26-35 (Hl) , 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102, o 95-102 (H3) en la VH. Los residuos de dominio variable son numerados de acuerdo con Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones de HVR extendidas.
Residuos de "estructura" o residuos "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de HVR como se definen en la presente.
La expresión "numeración de residuos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de posición de aminoácido como en Kabat" y variaciones de las mismas se refieren a sistemas de numeración usado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de o inserción a una FR o HVR de dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un solo .inserto de aminoácido (residuos 52a de acuerdo con Kabat) después de residuos 52 o H2 y residuos insertados (esto es, residuos 82a, 82b y 82c, etc., de acuerdo con Kabat) después del residuo de FR de cadena pesada 82. La numeración de residuos de Kabat puede ser determinada para un anticuerpo dado mediante alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada por Kabat "estándar" .
Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más HVR del mismo que dan como resultado una mejora en l afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo padre que no posee esta (s) alteración (es) . En una modalidad, un anticuerpo madurado por afinidad tiene afinidades nano molares o aun pico molares por el antígeno objetivo. Anticuerpos madurados por afinidad son producidos mediante procedimientos conocidos en el arte. Por ejemplo, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad mediante entremezcla de dominio de VH y VL. La muta génesis aleatoria de HVR y/o residuos de estructura es descrita por ejemplo por: Barbas et al. Proc Nat . Acad. Sci . USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7) : 3310-9 (1995) y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992) .
Anticuerpos "inhibidores de crecimiento" son aquellos que impiden o reducen la proliferación de una célula que expresa un antígeno al cual el anticuerpo se enlaza.
Los anticuerpos que "inducen apoptosis" son aquellos que inducen muerte celular programada, como se determina mediante análisis de apoptosis estándar, tal como enlace de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, dilatación de retículo endoplasmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (llamados cuerpos apoptoticos) .
"Funciones efectores" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región de Fe (una región de Fe de secuencia natural o región dé Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo y varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: enlace de Clq y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) ,- enlace de receptor de Fe; citotoxicidad moderada por la célula dependiente de .anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B) y activación de célula B.
El término "región de Fe" en la presente es usado para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones de Fe de secuencia natural y regiones de Fe variantes . Aunque las fronteras de la región de Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región de cadena pesada de IgG humana es usualmente definida para estirarse de un residuo de aminoácido en posición Cys226 o de Pro230 al término carboxilo del mismo. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración de EU) de la región de Fe puede ser removida, por ejemplo durante la producción o purificación del anticuerpo o al diseñar recombinantemente el ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo . Así, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpo con todos los residuos de K447 removidos, poblaciones de anticuerpo sin residuos K447 removidos y poblaciones de anticuerpo que tienen una mezcla de anticuerpos con o sin el residuo K447.
A no ser que se indique de otra manera en la presente, la numeración de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina es aquella del índice EU como en Kabat et al. El "índice de EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo EU de IgGl humano.
Una "región de Fe de. secuencia natural" posee una "función efectora" de una región de Fe de secuencia natural. "Funciones efectoras" ejemplares incluyen enlace de Clq; CDC; enlace de Fc-receptor; ADCC; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B, BCR) , etc. Tales funciones efectoras requieren en general que la región de Fe sea combinada con un dominio de enlace (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y puede ser determinada utilizando varios análisis como se revela por ejemplo en las definiciones en la presente.
Una "región de Fe de secuencia natural" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región de Fe encontrada en la naturaleza. Regiones de Fe humanas de secuencia natural incluyen una región de Fe de IgGl humana de secuencia natural (alotipos sin A y alotipos A) ; región de Fe de IgG2 humana de secuencia natural; región de Fe de IgG3 humana de secuencia natural y región de Fe de IgG4 humana de secuencia natural, también como variantes que se presentan en la naturaleza de las mismas . * Una "región de Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquellas de una región de Fe de secuencia natural en virtud de por lo menos una modificación de aminoácido, preferiblemente una o más sustitución (es) de aminoácido. Preferiblemente, la región de Fe variante tiene por lo menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región de Fe de secuencia natural o la región de Fe de un polipéptido padre, por ejemplo de alrededor de 1 a alrededor de 10 sustituciones de aminoácido y preferiblemente de alrededor de 1 a alrededor de 5 sustituciones de aminoácido en una región de Fe de secuencia natural o en la región de Fe del polipéptido padre. La región de Fe variante en la presente poseerá preferiblemente por lo menos alrededor de 80% de homología con una región de Fe de secuencia natural y/o con una región de Fe de un polipéptido padre y más preferiblemente por lo menos alrededor de 90% de homología con la misma, mas preferiblemente por lo menos alrededor de 95% de homología con las mismas. 1E1 término "anticuerpo que comprende región de Fe" se refiere a un anticuerpo que comprende una región de Fe. La lisina C-terminal (residuos 447 de acuerdo con el sistema de numeración de EU) de la región de Fe puede ser removida, por ejemplo durante la purificación del anticuerpo o al diseñar recombinantemente el ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Así, una composición que comprende un anticuerpo que tiene una región de Fe de acuerdo con esta invención puede comprender un anticuerpo con K447 con todos los K447 removidos o una mezcla de anticuerpos con o sin el residuo de K447.
"Receptor de Fe" o "FcR" describe un receptor que se enlaza a la región de Fe de un anticuerpo. En algunas modalidades, un FcR es un FcR natural-humano . En algunas modalidades, un FcR es uno que se enlaza a un anticuerpo de IgG (un receptor gama) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y" FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas empalmadas alternativamente de aquellos receptores. Los receptores de FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activante") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor") que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmicos de los mismos. El receptor activante FcyRIIA contiene una porción de activación a base de tirosina de inmuno receptor (ITAM) en su dominio citoplásmico . El receptor inhibidor FcyRIIB contiene una porción de inhibición a base de tirosina de inmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase, por ejemplo Daéron, Annu. Rev. .Immunol. 15:203-234 (11997)). Los FcR son revisados por ejemplo, en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al . , Immunomethods 4:25-34 (1994) y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) . Otros FcRn, incluyen aquellos a ser identificados en el futuro son abarcados por el término "FcR" en la presente.
El término "receptor de Fe" o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable por la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) y regulación de homeostasis de inmunoglobulinas . Métodos para medir el enlace a FcRn son conocidos (véase, por ejemplo Ghetie y Ward, Immunology Today, 18 (12) : 592-8 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15 (7):637-40 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. , 279 (8) : 6213-6 (2004); WO 2004/92219) .
El enlace a FcRn humano in vivo y la vida media del suero de polipéptidos de enlace de alta afinidad de FcRn pueden ser analizados, por ejemplo en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transíectadas que expresan FcRn humano o en primates a los cuales los polipéptidos con una región de Fe variante son administrados. WO 2000/42072 describe variantes de anticuerpo con enlaces mejorados o disminuidos a FcR. Véase, también por ejemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).
"Afinidad de enlace" se refiere en general a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes ente un solo sitio de enlace de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su socio de enlace (esto es, un antígeno) . A no ser que se indique de otra manera en la presente, "afinidad de enlace" se refiere a afinidad de enlace intrínseca que refleja una interacción de 1:1 entre miembros de un par de enlaces (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X por su socio Y puede en general ser presentada por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede ser medida mediante métodos comunes conocidos en el arte, incluyendo "aquellos descritos en la presente. Los anticuerpos de baja afinidad en general se enlazan al antígeno lentamente y tienden a disociarse rápidamente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad en general se enlazan al antígeno más rápido y tienden a permanecer enlazados más tiempo. Una variedad de métodos para medir la afinidad de enlace son conocidos en el arte, cualquiera de los cuales pueden ser usados para los propósitos de la presente invención. Modalidades ilustrativas y ejemplares específicas para medir la afinidad de enlace son descritas en lo siguiente.
Ne una modalidad, la "Kd" o "valor de Kd" de acuerdo con esta invención es medido mediante un análisis de enlace de antígeno radio marcado (RIA) efectuado con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por el siguiente análisis. La afinidad de enlace en solución de los Fab por antígeno es medida al equilibrar el Fab con una concentración mínima del antígeno (125I) -marcado en presencia de un serie de titulación de antígeno sin marcar, luego capturar el antígeno enlazado con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). Para establecer condiciones para el análisis, placas de micro título (DY EX Technologies, Inc.) son recubiertas de la noche a la mañana con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9.6) y subsecuentemente bloqueado con albúmina de suero bovino al 2% (peso/volumen) en PBS por dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . En una placa sin absorbente (Nunc #269620) ,
[1251] -antígeno 100 pM o 26 pM son mezclados con diluciones seriales de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la determinación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., C ncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés es luego incubado de la noche a la mañana; sin embargo, la incubación puede proseguir por un periodo más largo (por ejemplo, alrededor de 75 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Después de esto, las mezclas son transferidas a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por una hora) . La solución es luego removida y la placa lavada ocho veces con surfactanté TWEEN-20 al 0.1% en PBS . Cuando las placas han secado, se agregan 150 µ?/cavidad de agente de centelleo (MICROSCINT-20™ Packard) y las placas son contadas sobre un contador gama TOPCOUNT™ (Packard) por diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menor o igual a 20% de enlace máximo son escogidas para uso en análisis de enlace competitivo.
De acuerdo con otra modalidad, la Kd o valor de Kd es medido al utilizar análisis de resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento BIACORE®-2000 o BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscatawa'y, NJ) a 25°C con chips de antígeno CM5 inmovilizados a -10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips de biodetector de dextrana carboximetilados (CM5, BIAcore, Inc.) son activados con clorhidrato de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno es diluido con el acetato de sodio 10 mM, pH 4.8 a 5 µ?/ml (-0.2 µ?) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto para obtener aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, diluciones seriales de dos veces de Fab (0.78 nM a 500 nM) son inyectadas en PBS con surfactanté TWEEN 20™ al 0.05% (PBST) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 ' µ?/min. Las velocidades de asociación (kencendido) y velocidades de disociación (kapagado) son calculadas utilizando un modelo .de enlace de Langmuir de uno a uno simple (BIAcore® Elementos de Programación de Evaluación versión 3.2) al ajustar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación al equilibrio (Kd) es calculada como la proporción kapagado/kencendido- Véase , por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la velocidad de encendido excede de 106 M^s"1 mediante el análisis de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de encendido puede ser determinar al usar una técnica de apagado fluorescente que mide el incremento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm,- emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antigeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de concentraciones incrementadas de antígeno tal como es medido en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de parada (Aviv Instruments) o espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
Una "velocidad de encendido" , "velocidad de asociación" , "proporción de asociación" o "kencendido" de acuerdo con esta invención puede también ser determinada como se describe anteriormente utilizando un instrumento BIACORE®-2000 o un sistema BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) .
El término "sustancialmente similar" o "sustancialmente el mismo", como se usa en la presente, denota un grado de similaridad suficientemente alto entre dos valores numéricos (por ejemplo, uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparador) , de tal manera que el experimentado en el arte consideraría la diferencia entre los dos valores ser de poca o ningún significado biológico y/o estadístico en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd) . La diferencia entre dichos dos valores es por ejemplo menos de alrededor de 50%, menos de alrededor de 40%, menos de alrededor de 30%, menos de alrededor de 20% y/o menos de alrededor de 10% como función del valor de referencia/comparador.
La frase "sustancialmente reducido" o "sustancialmente diferente", como se usa en la presente, denota un grado de diferencia suficientemente alto entre dos valores numéricos (en general uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparador) de tal manera que el experimentado en el arte consideraría la diferencia entre los dos valores ser de significado estadístico dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd) . La diferencia entre dichos dos valores es por ejemplo, mayor de alrededor de 10%, mayor de alrededor de 20%, mayor de alrededor de- 30%, mayor de alrededor de 40% y/o mayor de alrededor de 50% como función del valor de la molécula de referencia/comparador .
En ciertas modalidades, el anticuerpo humanizado útil en la presente comprende además alteraciones de aminoácido en el Fe de IgG y exhibe afinidad de enlace incrementada por FcRn humano con respecto a un anticuerpo que tiene Fe de IgG tipo silvestre, por al menos 60 veces, por lo menos 70 veces, por lo menos 80 veces, mas preferiblemente por lo menos 100 veces, preferiblemente por lo menos 125 veces, aun mas preferiblemente por lo menos 150 veces a alrededor de 170 veces .
Una "alteración" o "enfermedad" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con una sustancia/molécula o método de la invención. Esto incluye alteraciones o enfermedades crónicas o agudas incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero a la alteración en cuestión. Ejemplos no limitantes de alteraciones a ser tratadas en la presente incluyen cáncer (por ejemplo, tumores malignos y benignos; malignidades sin leucemia y malignidades linfoides) ,- alteraciones neuronales, gliales, astrocitales , hipotalámicas y otras alteraciones glandulares, macrofagales , epiteliales, estromales y blástocolicas y alteraciones inflamatorias, inmunológicas y otras alteraciones angiogénesis-relacionadas .
Los términos "alteración proliferativa celular" y "alteración proliferativa" se refieren a alteraciones que están asociados con algún grado de proliferación celular anormal. En una modalidad, la alteración proliferativa celular es cáncer. En una modalidad, la alteración proliferativa celular es angiogénesis .
"Tumor" como se usa en la presente, se refiere a todo el crecimiento y proliferación celular neoplásica, ya sea maligno o benigno y todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "alteración proliferativa celular" , "alteración proliferativa" y "tumor" no son mutuamente exclusivos como se refiere en la presente.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que es comúnmente caracterizada por proliferación celular sin regular. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a. carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales canceres incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón no pequeña, el adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón) , cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo, por ejemplo cáncer gastrointestinal) , cáncer pancreático (incluyendo, por ejemplo, cáncer pancreático metastático) , glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de pecho (incluyendo cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente, recurrente o metastático) , cáncer de colon, colorectal cáncer, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, de riñon o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, también como linforna de célula B (incluyendo linforna no de Hodking (LNH) de bajo grado/folicular; NHL linfocítico pequeño (SL) , NHL grado intermedio/folicular; NHL difuso grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de célula no escindida pequeño de alto grado NHL de enfermedad voluminosa; linforna de células de manto linforna SIDA-relacionado y la macroglobulinemia de Waldenstrom) , leucemia linfocítica crónica (CLL) , leucemia linfoblástica aguda (ALL) ; leucemia de célula vellosa, leucemia mieloblástica crónico y alteración linfoproliferativa post-trasplante (PTLD) , también como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como aquel asociado con tumores de cerebro) y síndrome de Meigs.
El término "composición anti-neoplásica" o "composición anti-cáncer" o "agente anti-cáncer" se refieren a una composición útil en el tratamiento de cáncer que comprende por lo menos un agente terapéutico activo, por ejemplo "agente anti-cáncer" . Ejemplos de agentes terapéuticos (por agentes anti-cáncer) incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo agentes quimioterapéuticos , agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en terapia de radiación, agentes antirangiogénesis, agentes anti-linfangiogénesis , agentes apoptoticos, agentes anti-tubulina y otros agentes para tratar cáncer, tales como anticuerpos anti-HER-2, anticuerpos anti-CD20, un antagonista del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de cinasa de tirosina) , inhibidor de HERI/EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™) , inhibidores de factor de crecimiento derivados de plaqueta (por ejemplo, Gleevec™ (Imatinib Mesylate) ) , un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , interferones, citoquinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se enlazan a uno o más de los siguientes objetivos ErbB2, ErbB3 , ErbB , PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA VEGF o receptor (es) de VEGF, TRAIL/Apo2, y otros agentes químicos bioactivos y orgánicos, etc. combinaciones de los mismos también están incluidas en la invención.
Como se usa en la presente "tratamiento" se refiere a intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo o célula que es tratada y puede ser efectuado ya sea por profilaxis o durante el curso de patología clínica. Efectos deseables del tratamiento incluyen impedir la presencia o recurrencia de enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualesquier consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, impedir metástasis, disminuir la velocidad de avance de enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad y remisión o prognosis mejorada. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención son usados para retardar el desarrollo de una enfermedad o alteración.
Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva a dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios para obtener el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una sustancia/molécula de la invención, agonista o antagonista puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la habilidad de la sustancia/molécula agonista o antagonista para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual cualesquier efectos tóxicos o perjudiciales de la sustancia/molécula agonista o antagonista son superados por los efectos terapéuticamente benéficos. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipéptido, antagonista de esta invención efectiva para "tratar" una enfermedad o alteración en un mamífero (aka paciente) . En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir el número de células de cáncer; reducir el tamaño o peso del tumor; inhibir (esto es, frenar alguna extensión y preferiblemente detener) la infiltración de células de cáncer a órganos periféricos; inhibir (esto es, frenar alguna extensión y preferiblemente detener) metástasis del tumor, inhibir alguna extensión en crecimiento del tumor y/o aliviar alguna extensión uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. A la extensión que el fármaco puede impedir el crecimiento y/o asignar células de cáncer existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. En una modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad inhibidor del crecimiento. En otra modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que prolonga la supervivencia del paciente. En otra modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que mejora la supervivencia libre de avance del paciente. "Supervivencia libre de avance", como se usa en la presente, se refiere a la duración de tiempo durante y después del tratamiento durante el cual, de acuerdo con la determinación del médico que trata o investigador, la enfermedad del paciente no empeora, esto es, no avanza.
Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva a dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios para obtener el resultado profiláctico deseado. Comúnmente aunque no de manera necesaria, puesto que una dosis profiláctica es usada en sujetos antes de o a una etapa anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva es menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.
El término "agente citotóxico" como se usa en la ¦presente se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de células y/o provoca destrucción de células. El termino pretende influir isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I12.5, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etoposide) , doxorubicina, melfalana, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos, tales como enzimas nucleoliticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de planta o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos y los varios agentes anti-tumor o anti-cáncer revelados posteriormente en la presente. Otros agentes citotóxicos son descritos posteriormente en la presente. Un agente tumoricida provoca destrucción de células de tumor.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto .químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida CYTOXA ®; sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilenetiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®) , beta-lapachona,-lapachol, colchicina, ácido betulínico una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipóside; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1) eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido mecloretamina, melfalán, novembichin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo ; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enedina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gama II y calicheamicina omega II (véase, por ejemplo, Angew Chem Intl. Ed. Engl, 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina, también como cromóforo neocarzinostatina y cromóforos de antibiótico de Enedina de cromoproteínas relacionados) , aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinia , dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicin C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6 -azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina ; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol., mepitiostano, testoláctona; anti-adrenales tales como aminoglutetímida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínicó; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina, acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcide; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; polisacárido de complejo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina,-sizofiran,- espirogermanio, ácido tenuazónico; triaziquona, 2,2', 2" -triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2 , verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretan; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinóside ("Ara-C") ;tiotepa ;taxoides, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb' Oncology, Princeton, NJ) , ABRAXANE™ libre de Cremophor, formulación de nano partículas albúmina-diseñada de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) , y docetaxel TAXOTERE® (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucilo; gemcitabina (GEMZAR®) ; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina (VELBA ®) ; platino; etoposide (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; oxaliplatino ; leucovovin; vinorelbina (NAVELBINE®) ; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato ; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometlilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina (XELODA®) , sales s, ácidos o derivados aceptable farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores, también como combinaciones de dos o más de los anteriores, tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona, y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovovina. Agentes quimioterapéuticos adicionales incluyen los agentes -citotóxicos útiles como conjugados de anticuerpo-fármacos de, tales como maitansinoides (DM1, por ejemplo) y la auristatinas MMAE y MMAF, por ejemplo.
"Agentes quimioterapéuticos" también incluyen "agentes anti-hormonales" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los. efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer y están frecuentemente en forma de tratamiento sistémica o tratamiento de cuerpo entero. Pueden ser hormonas en sí mismos. Ejemplos incluyen anti-estrógenos y moduladores de receptor de estrógeno selectivos (SERM) , incluyendo, por ejemplo tamoxifen (incluyendo tamoxifen NOLVADEX®) , raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON®; anti-progesteronas ; reguladores descendentes de receptor de estrógeno (ERD) ; agentes que funcionan para suprimir o cerrar los ovarios, por ejemplo, hormona de liberación de hormona luteinizante luteinizante (LHRH) , agonistas tales como LUPRON® y acetato de leuprolato ELIGARD®, acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; otros anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida e inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4 (5) -imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, y ARIMIDEX® anastrozol. Además, tal definición de agentes quimioterapéuticos incluye bisfosfonatos , tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®) , etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato DE ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA®, tiludronato SKELID® o risedronato ACTONEL®; también como troxacitabina (un análogo citosina de nucleósido 1,3-dioxolano) ; oligonucleótidos anti sentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación celular aberrante, tales como por' ejemplo, PKC-alfa, Raf , H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) , vacunas tales como vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia genética, por ejemplo, vacuna ALLOVECTINA®, vacuna LEUVECTIN® , y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECA ® ; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña de cinasa de tirosina doble de ErbB-2 y EGFR también conocido como GW572016) y sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores .
Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando es usado en la presente, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento y/o proliferación de una célula. Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un lugar diferente de la fase S) , tales como agentes que inducen la detención Gl y detención de la fase M. bloqueadores de fase M clásicos incluyen el vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos e inhibidores de topoisomerasa II, tales como el antibiótico de antraciclina doxorubicina ( (8S-cis) -10- [ (3-amino-2, 3, 6-tridesoxi-a-L-lixo-hexpiranosil) ] -7, 8, 9, 10-tetrahidro-6 , 8 , 10 , ll-trihidroxi-8- (hidroxiacetil) -1-metoxi-5 , 12-naftacendiona) , epirubicina, daunorubicina, etoposide y vomicina. Aquellos agentes que detienen Gl también se derraman a la detención de fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Información adicional se puede encontrar en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn y Israel, eds . , capitulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and anti-neoplastic drugs" por Murakami et al. ( B Saunders : Philadelphia, 1995), especialmente p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anti cáncer ambos del derivados árbol de Yew. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del yew europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamble de micro túbulos a partir de dímeros de tubulina y estabiliza los micro túbulos al impedir la despolimérización, que da como resultado la inhibición de la mitosis en las células.
Como se usa en la presente, el término "paciente" se refiere a cualquier animal individual, mas preferiblemente un mamífero (incluyendo tales animales no humano, por ejemplo perros, gatos, caballos, conejos, animales de zoológico, vacas, puercos, ovejas y primates no humanos) para los cuales se desea el tratamiento. Más preferiblemente, el paciente en la presente es un humano.
Un "sujeto" en la presente es cualquier sujeto humano individual, incluyendo un paciente elegible para tratamiento que está experimentando o ha experimentado uno o más signos, síntomas u otros indicadores de una alteración angiogénica. Pretendidos para ser incluidos como sujeto están cualesquier sujetos involucrados en pruebas de investigación clínica que no muestran ningún signo clínico de enfermedad o sujetos involucrados en estudios epidemiológicos o sujetos una vez usados como testigos. El sujeto puede haber sido previamente tratado con un agente anti-cáncer o no tratado. El sujeto puede ser naive a un (os) agente (s) adicional (es) que es .(son) usado (s) cuando el tratamiento en la presente es iniciado, esto es, el sujeto puede no haber sido tratado previamente con, por ejemplo, un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, un agente citotóxico en la "línea de referencia" (esto es, en un punto en el tiempo establecido antes de administración de una primera dosis de un anti-cáncer en el método de tratamiento en la presente, tal como el día de selección del sujeto antes de que el tratamiento sea comenzado) . Tales sujetos "naive" son en general considerados como candidatos para tratamiento con tal (es) agente (s) adicional (es) .
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación estéril que está en tal forma para permitir que la actividad biológica del medicamento sea efectiva y que no contiene componentes' adicionales que son inaceptablemente tóxicos a un sujeto al cual la formulación seria administrada.
Una formulación "estéril" es aséptica o libre de todos los microorganismos vivientes y sus esporas .
Un "inserto de empaque" es usado para referirse a instrucciones incluidas , acostumbradamente en empaques comerciales de productos terapéuticos o medicamentos que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones, otros productos terapéuticos a ser combinados con el producto empacado y/o advertencias concernientes con el uso de tales productos terapéuticos o medicamentos, etc.
Un "kit" es cualquier manufactura (por ejemplo, un empaque o recipiente) que contiene por lo menos un reactivo, por ejemplo un medicamento para el tratamiento de una alteración angiogénica o una sonda para detectar específicamente un gen de biomarcador o proteína de la invención. La manufactura es préferiblemente promovida, distribuida o vendida como una unidad para efectuar los métodos de la presente invención.
Por propósitos de no respuesta a medicamento (s) un sujeto que experimenta "un nivel clínicamente no aceptable de toxicidad" del tratamiento previo o actual con uno o más medicamentos experimenta uno o más efectos secundarios negativos o efectos adversos asociados con los mismos que son considerados por un clínico experimentado ser significativos, tales como por ejemplo infecciones serias, insuficiencia cardiaca congestiva, desmielinación (conduciendo a esclerosis múltiples) , hipersensibilidad significativa, eventos neuropatológicos, altos grados de autoinmunidad, un cáncer tal como cáncer endometrial, linfornas no de Hodking, cáncer de pecho, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de ovario o melanoma, tuberculosis (TB) , etc.
"Reducir el riesgo de un efecto secundario negativo" si significa reducir el riesgo de un efecto secundario resultante del tratamiento con el antagonista en la presente a una extensión más baja que el riesgo observado resultante del tratamiento del mismo paciente u otro paciente con un medicamento administrado previamente,. Tales efectos secundarios incluyen resumidos anteriormente con respecto a toxicidad y son preferiblemente infección, cáncer, insuficiencia cardiaca o desmielinación.
"Correlacionar" o "que correlaciona" significa comparar de laguna manera el desempeño y/o resultados de un primer análisis o protocolo con el desempeño y/o resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo para llevar a cabo segundos protocolos y/o se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si un segundo análisis o protocolo debe ser efectuado. Con respecto a varias modalidades en la presente, se pueden usar los resultados de un análisis analítico para determinar si un régimen terapéutico específico utilizando un agente anticáncer, tal como anticuerpo anti-VEGF debe ser efectuado.
III. Métodos La presente invención provee métodos para identificar pacientes que se pueden beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, métodos para predecir la responsividad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, métodos para determinar la probabilidad de que un paciente con cáncer exhibirá beneficio de la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A y métodos para optimizar la eficacia terapéutica de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A.
Los métodos comprenden determinar el nivel de expresión de VEGF sin modificar en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF sin modificar en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer o que el paciente es más probable de ser responsivo al tratamiento con la terapia anti-cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF al paciente .
La invención provee además métodos para tratar cáncer en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene un nivel de VEGF sin modificar en o' por encima de un nivel de referencia y administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF al paciente, mediante lo cual el cáncer es tratado. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar agente (s) adicional (es) (por ejemplo, un segundo, tercero o cuarto agente) al paciente .
A. Métodos dé detección Los métodos y análisis revelados proveen medios convenientes, eficientes y potencialmente efectivos en el costo para obtener datos e información útiles para determinar las terapias apropiadas o efectivas para tratar pacientes. Por ejemplo, de acuerdo con los métodos de la invención, un paciente podría proveer una muestra de sangre antes del tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF y el nivel de VEGF sin modificar en la muestra podría ser determinado y comparado con el nivel de VEGF sin modificar en una muestra de referencia o con un valor de referencia predeterminado, respectivamente. Los pacientes con un nivel incrementado de VEGF sin modificar, son identificados como pacientes probables de responder a la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF. Los métodos se pueden llevar a cabo en una variedad de formatos de análisis, incluyendo análisis que detectan la expresión de proteína (tales como inmunoanálisis de enzima) y análisis bioquímicos que detectan la actividad apropiada. La determinación de expresión o la presencia de tales biomarcadores en las muestras es predictiva de que el paciente que provee la muestra será sensible a los efectos biológicos de un antagonista de VEGF. Comúnmente, un nivel de expresión de VEGF sin modificar en una muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente responderá a o será sensible al tratamiento con un antagonista de VEGF.
Aquel de habilidad en las artes médicas, particularmente pertenecientes a la aplicación de pruebas de diagnóstico y tratamiento con terapéuticos, reconocerá que los sistemas biológicos son un tanto variables y no siempre completamente predecibles y así muchas pruebas de diagnóstico buenas o terapéuticos son ocasionalmente no efectivos. Así, queda finalmente al juicio del médico que atiende el curso más apropiado de tratamiento para un paciente individual, en base a resultados de prueba, condición del paciente e historia del paciente y su propia experiencia. Pueden aun haber ocasiones, por ejemplo, cuando un medico escogerá tratar un paciente con un antagonista de VEGF aun cuando un paciente no es predicho ser particularmente sensible a antagonistas de VEGF, en base a datos de prueba de diagnóstico o de otros criterios, particularmente si todas o la mayoría de las otras opciones de tratamiento obvias han fallado o si se, anticipa algo de sinergia cuando es dado con otro tratamiento.
En modalidades expresadas adicionalmente, la presente invención provee un método para predecir la sensibilidad de un paciente al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF o predecir si un paciente responderá efectivamente a tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, que comprende determinar el nivel de VEGF sin modificar en la muestra y predecir la sensibilidad del paciente a inhibición por un antagonista de VEGF, en donde el nivel de expresión de VEGF sin modificar en o por encima de un nivel de referencia se relación con alta sensibilidad en pacientes a la respuesta efectiva al tratamiento con un antagonista de VEGF.
La muestra puede ser tomada de un paciente que se sospecha de tener o es diagnosticado por tener un cáncer, incluyendo, por ejemplo cáncer coló rectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de pecho (incluyendo, por ejemplo, cáncer de pecho HER-2 negativo avanzado localmente recurrente o metastático) , cáncer pancreático (incluyendo cáncer pancreático metastático) , cáncer gástrico y cáncer de pulmón y de aquí esta probablemente en necesidad de tratamiento o de un individuo normal que no sospecha de tener alguna alteración. Para la determinación de expresión de marcador, muestras del paciente, tales como aquellas que contienen células o proteínas o ácidos nucleicos producidos por estas células, pueden ser usados en los métodos de la presente invención. En los métodos de esta invención, el nivel de un biomarcador puede ser determinado al determinar la cantidad (por ejemplo, cantidad o concentración absoluta) de los marcadores en una muestra, preferiblemente determinada en fluidos corporales o excreciones que contienen niveles detectables de biomarcadores . Los fluidos corporales, o secreciones útiles como muestras en la presente invención incluyen, por ejemplo sangre, fluido linfático, esputo, ascites o cualquier otra secreción corporal o derivados de la misma. La palabra sangre pretende incluir sangre entera, plasma, suero o cualquier derivado de sangre. La determinación de un biomarcador en tales fluidos corporales o excreciones puede algunas veces ser preferida en circunstancias en donde un método de toma de muestras invasivo es inapropiado o inconveniente. Sin embargo, la muestra a ser probada en la presente es preferiblemente sangre, mas preferiblemente plasma sanguíneo. En una modalidad, la muestra es citrato-plasma . En una modalidad, la muestra es EDTA-plasma.
La muestra puede ser congelada, nueva, fija, (por ejemplo, fijada con formalina) , centrifugada y/o embebida (por ejemplo, embebida en parafina) , etc. La muestra celular puede por supuesto ser sometida a una variedad de técnicas preparativas y de almacenamiento post-recolección bien conocidas (por ejemplo, extracción de ácido nucleico y/o proteína, fijación, almacenamiento, congelación, ultra centrifugación, concentración, evaporación, centrifugación, etc . ) antes de determinar la cantidad del marcador en la muestra. Así mismo, las biopsias pueden también ser sometidas a técnicas preparativas y de almacenamiento post-recolección, por ejemplo fijación.1 A. Detección de VEGF sin modificar La proteína de VEGF sin modificar puede ser detectada utilizando cualquier método apropiado conocido en el arte. Preferiblemente, un. anticuerpo será usado que tiene por lo menos las propiedades de enlace preferenciales a VEGF sin modificar en comparación con VEGF modificado como MAB 3C5, que está disponible comercialmente de RELIATech GmbH, Wolfenbüttel, Alemania. Por ejemplo, muestras de tejido o células de mamíferos pueden ser analizadas convenientemente en cuanto a la proteína de VEGF sin modificar utilizando análisis de Western, ELISA, etc. Muchas referencias están disponibles para proveer guías en la aplicación de las técnicas anteriores (Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980) ; Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985) ; Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Ratón, FL, 1982) y Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-1 58 (CRC Press, Inc., 1987)).
Si se hace referencia a la detección o nivel de VEGF sin modificar, esto significa que las moléculas de VEGF sin modificar (isoformas o productos de escisión) como por ejemplo enlazados mediante MAB 3C5 son medidas.
En cuanto a la detección de proteína de VEGF sin modificar, varios análisis están disponibles. Por ejemplo, la muestra se puede poner en contacto con un anticuerpo o una combinación de anticuerpo (por ejemplo, en un análisis de emparedado) que se enlaza de preferencia o específicamente a VEGF sin modificar en comparación con VEGF · modificado, por ejemplo como ocurre naturalmente en una muestra del paciente. Preferiblemente, VEGF sin modificar es detectado utilizando un anticuerpo que se enlaza específicamente a VEGF sin modificar, esto es con un anticuerpo que tiene una sensibilidad por lo menos tres veces más alta por VEGF 165 sin modificar en comparación con VEGF 165 modificado. Tal sensibilidad por lo menos tres veces más alta por VEGF sin modificar es determinada al comparar VEGF 165 producido recombinantemente en E. coli (pureza de por lo menos 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante OD 280 nm) y VEGF 165 producido recombinantemente en célula HEK (pureza de por lo menos 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante OD 280 nm) utilizando los mismos reactivos. Si en esta comparación la señal obtenida para el material HEK-producido es solamente un tercio o menos de la señal tal como es obtenida con el material derivado de E . coli, entonces el VEGF sin modificar es detectado con una sensibilidad por lo menos tres veces más alta. Como el experimentado en el arte apreciara, la señal es preferiblemente leída alrededor de 50% de la señal máxima. Preferiblemente, en este análisis de determinación del Ejemplo 3 es usado. También preferido el anticuerpo que se enlaza específicamente a VEGF sin modificar (VEGF165 ex E. coli) es un anticuerpo que detecta VEGF sin modificar con una sensibilidad por lo menos 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces más alta en comparación con el material de VEGF modificado (células HEK VEGF 165 ex) .
En una modalidad preferida, VEGF sin modificar es detectado específicamente utilizando un anticuerpo que tiene por lo menos la misma preferencia de enlace por VEGF sin modificar en comparación con VEGF modificado como MAK<VEGF-A>M-3C5-18.
La línea de célula de hibridoma preferida de acuerdo con la invención, la línea de célula de hibridoma MAK<VEGF-A>M-3C5-18 fue depositada en virtud del Tratado de Budapest en cuanto al reconocimiento internacional del depósito de microorganismos por propósitos del procedimiento de patentes con Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Alemania: La presente invención es concerniente con la línea de célula de hibridoma MAK<VEGF-A>M-3C5-18 depositada con la DSM bajo el número de acceso... (a ser asignado) el 29 de Junio de 2011.
La presente invención es concerniente con el anticuerpo monoclonal producido por la línea de célula de hibridoma MAK<VEGF-A>M-3C5-18 depositada con la DMS bajo el número de acceso... (a ser asignado) el 29 de Junio de 2011.
En una modalidad, la sensibilidad relativa o enlace preferencial de un anticuerpo a VEGF sin modificar es determinada en un inmunoanálisis de emparedado, en donde el anticuerpo a VEGF sin modificar es usado como anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección es usado que se enlaza a un epítope presente sobre todas las isoformas de VEGF mayores o productos de escisión. En una modalidad, el anticuerpo de detección se enlazará a un epítope fuera del epítope para MAB 3C5, esto es, no se enlazara a un epítope comprendido en un péptido sintético que abarca los aminoácidos 33 a 43 de VEGF. Preferiblemente, el anticuerpo de detección se enlazara a un epítope comprendido en los aminoácidos que varían de 1 a 32, de 44 a 105, a los últimos seis amino ácidos de VEGF 165 madurado o a un epítope conformacional que no se traslapa con el epítope enlazado por MAB 3C5. En una modalidad, el anticuerpo se enlaza específicamente a VEGF 165 sin modificar en comparación con VEGF modificado tiene la propiedad para enlazarse a un epítope comprendido en un péptido sintético que abarca los amino ácidos 33 a 43 de VEGF.
Anticuerpos específicos apropiados que se enlazan específicamente a VEGF sin modificar pueden ser obtenidos de acuerdo con procedimientos estándar. Usualmente, una isoforma de VEGF producida recombinantemente en E. coli u obtenida sintéticamente, por ejemplo mediante síntesis de polipéptido en fase solida o un péptido que representa o comprende un epítope de VEGF producido recombinantemente en E. Coli u obtenido sintéticamente, por ejemplo mediante síntesis de polipéptido en fase solida será usado como inmunogeno. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos fácilmente de acuerdo con protocolos estándar y seleccionados en cuanto a reactividad con VEGF sin modificar con y baja reactividad cruzada apropiada con VEGF modificado. Un método de selección conveniente y preferido está basado en el uso de VEGF 165 producido recombinantemente en E. coli (pureza de por lo menos 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante OD 280 nm) y de VEGF 165 producido recombinantemente en células HEK (pureza de por lo menos 90% mediante SDS-PAGE y concentración determinada mediante OD 280 nm) , respectivamente .
Varios métodos de medición para VEGF sin modificar están disponibles y por ejemplo la muestra se puede poner en contacto con un anticuerpo que se enlaza específicamente a VEGF sin modificar bajo condiciones suficientes para que se forme el complejo de anticuerpo-VEGF sin modificar y luego detectar este complejo. La presencia de la proteína de VEGF sin modificar puede ser detectada en una diversidad de maneras, tal como mediante Western blot (con o sin imunoprecipitación) , SDS-PAGE bidimensional , imunoprecipitación, clasificación celular actividad por fluorescencia (FACS) , citometría de flujo y procedimientos para ELISA para analizar una amplia variedad de tejidos y muestras, incluyendo plasma o suero. Un amplio intervalo de técnicas de inmunoanálisis que utilizan tal formato de análisis están disponibles, véanse por ejemplo Patentes Estadounidense 4,016,043, 4,424,279 y 4,018,653. Estos incluyen tanto análisis de un solo sitio cómo análisis de "emparedado" o dos sitios de los tipos no competitivos, también como en los análisis competitivos tradicionales. Estos análisis también incluyen enlace directo de un anticuerpo marcado a un biomarcador objetivo. Los análisis de emparedado están entre los análisis más útiles y comúnmente usados. Un número de variaciones de la técnica de análisis de emparedado existen y se pretende que todas sean abarcadas por la presente invención. Brevemente, en un análisis directo típico, un anticuerpo sin marcar es inmovilizado sobre un sustrato sólido y la muestra a ser probada es traída en contacto con la molécula enlazada. La inmovilización de este anticuerpo de captura puede ser mediante absorción directa a una fase solida o indirectamente, por ejemplo vía un par de enlace especifico, por ejemplo vía el par de enlace de estreptavidina-biotina . Preferiblemente, el anticuerpo inmovilizado se enlazara a VEGF sin modificar. Después de un periodo de incubación apropiado por un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, un segundo anticuerpo a VEGF es luego agregado e incubado, permitiendo tiempo suficiente para la formación de otro complejo del anticuerpo-antígeno-segundo anticuerpo. El segundo anticuerpo o anticuerpo de detección puede ya sea ser marcado directamente con una molécula de reportero apta de producir una señal detectable o puede ser detectado específicamente mediante un reactivo de detección marcado. En una modalidad, el anticuerpo de detección es marcado con una molécula de reportero. Cualquier material sin reaccionar es lavado y la presencia de VEGF sin modificar es determinada mediante observación de la señal producida por la molécula de reportero. Los resultados pueden ser ya sea cualitativos, mediante simple observación de la señal visible o pueden ser cuantificados al comparar con una muestra testigo que contiene cantidades conocidas de biomarcador. En un montaje alternativo, un anticuerpo que se enlaza tanto a VEGF sin modificar como a VEGF modificado es inmovilizado y un anticuerpo que se enlaza específicamente a VEGF sin modificar que porta opcionalmente una molécula de reportero, puede ser usado para detectar las moléculas objetivo.
Variaciones en el análisis directo incluyen un análisis simultáneo, en el cual tanto la muestra como el anticuerpo marcado son agregados simultáneamente al anticuerpo enlazado. Estas · técnicas son bien conocidas para aquellos experimentados en el arte, incluyendo cualesquier variaciones menores como será fácilmente evidente. En un análisis de emparedado directo típico, por lo menos un anticuerpo que se enlaza específicamente a VEGF sin modificar es empleado, ya sea como el primero o como el segundo anticuerpo como pueda ser el caso el primero y el segundo anticuerpo. Un primer anticuerpo es ya sea enlazado covalente o pasivamente a una superficie sólida. La superficie solida es comúnmente vidrio o un polímero, los polímeros más comúnmente usados son celulosa, poliacriamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Los soportes solidos pueden estar en forma de tubos, perlas, discos o micro placas o cualquier otra superficie apropiada para llevar a cabo un inmunoanálisis . Los procesos de enlace son bien conocidos en el arte y consisten en general de reticulación de enlace covalente o absorción física, el complejo de polímero-anticuerpo es lavado en preparación para la muestra de prueba. En una modalidad, el anticuerpo de captura es biotinilado y enlazado a la fase solida vía la interacción de biotina con avidina y/o estreptavidina . Una alícuota de la muestra a ser probada es luego agregada al complejo en fase solida e incubada por un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, 2-40 minutos o de la noche a la mañana si es más conveniente) y bajo condiciones apropiadas (por ejemplo, de temperatura ambiente a 40°C, tal como entre 25 °C y 32°C inclusive) para permitir el enlace entre el primer anticuerpo o anticuerpo de captura y el antígeno correspondiente. Enseguida del periodo de incubación, la fase sólida que comprende el primer anticuerpo o anticuerpo de captura y enlazado al mismo que el antígeno es lavada e incubada con anticuerpo secundario o anticuerpo marcado que se enlaza a otro epítope sobre el antígeno. El segundo anticuerpo es enlazado a una molécula de reportero que es usada para indicar el enlace del segundo anticuerpo al complejo del primer anticuerpo y el antígeno de interés (por ejemplo, VEGF sin modificar) .
Un método alternativo competitivo involucra inmovilizar VEGF sin modificar sobre una fase sólida y luego exponer el objetivo inmovilizado junto con la muestra a un anticuerpo especifico a VEGF sin modificar, que puede o puede no ser marcado con una molécula de reportero . Dependiendo de la cantidad de objetivo y la intensidad de la molécula de reportero, una competencia por la molécula objetivo puede ser detectable directamente vía tal anticuerpo marcado. Alternativamente, un segundo anticuerpo marcado, específico al primer anticuerpo es expuesto al complejo de objetivo-primer anticuerpo para formar un complejo terciario de obj etivo-primer anticuerpo-segundo anticuerpo. El complejo es detectado por la señal emitida por la molécula de reportero. "Molécula de reportero" como se usa en la presente especificación significa una molécula que, por su naturaleza química, provee una señal identificable analíticamente que permite la detección del antígeno-anticuerpo enlazado. Las moléculas de reportero más comúnmente usadas en este tipo de análisis son ya sea enzimas, fluoroforos o moléculas que contienen radio nuclidos (esto es, radio isótopos) y moléculas quimio luminiscentes.
En el caso de un' inmunoanálisis enzimático, una enzima es conjugada al segundo anticuerpo, en general por medio de glutaraldehido o periodato. Como se reconocerá fácilmente, sin embargo, -una amplia variedad de diferentes técnicas de conjugación existen, que están fácilmente disponibles para el experimentado en el arte. Enzimas usadas comúnmente incluyen peroxidasa de rábano, glucosa oxidasa, beta-galactosidasas y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos a ser usados con las enzimas específicas son en general escogidos para la producción, después de hidrólisis mediante la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Ejemplos de enzimas apropiadas incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También es posible emplear sustratos fluorogenicos que producen un producto fluorescente en lugar de los sustratos cromogenicos usados anteriormente. En todos los casos, la enzima-anticuerpo marcado es agregada al complejo de primer anticuerpo-marcador molecular, se permite que se enlace y luego el reactivo en exceso es lavado. Una solución que contiene el sustrato apropiado es luego agregada al complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo . El sustrato reaccionara con la enzima enlazada al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa, que puede ser cuantificada adicionalmente usualmente de manera espectrofotométrica para dar una indicación de la cantidad de VEGF sin modificar que está presente en la muestra. Alternativamente, compuestos fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina pueden ser acoplados químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de enlace. Cuando son activados mediante iluminación con luz de longitud de onda particular, el anticuerpo fluorocromo-marcado absorbe la energía de luz, induciendo un estado a excitabilidad en la molécula seguido por emisión de la luz a un color característico visualmente detectable con un microscopio de luz. Como en el EIA, el anticuerpo marcado fluorescente se permite que se enlace al complejo de primer anticuerpo-marcador molecular. Después de lavado del reactivo sin enlazar, el complejo terciario restante y luego expuesto a la luz de longitud de onda apropiada, la fluorescencia observada indica la presencia de VEGF sin modificar. La inmunofluorescencia y técnicas de EIA son ambas bien establecidas en el arte. Sin embargo, otras moléculas de reportero, tales como radio isótopos, moléculas quimio luminiscentes o bio luminiscentes pueden también ser empleadas. Inmunoanálisis para detectar VEGF son descritas por ejemplo en las Patentes Estadounidenses 6,855,508 y 7,541,160 y Publicación de Patente Estadounidense 2010'/0255515. Plataformas apropiadas para detectar VEGF son descritas en, por ejemplo EP 0939319 y EP 1610129.
B. Kits Para uso en la detección de VEGF sin modificar, kits o artículos de manufactura son también provistos por la invención, tales kits pueden ser usados para determinar si un sujeto será efectivamente responsivo a una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF. Estos kits pueden comprender medios de portador que son divididos en compartimientos para recibir en combinación estrecha uno o más medios de recipiente, tales como frascos, tubos y los semejantes. Cada uno de los medios de recipientes comprenden uno de los eleme.ntos separados a ser usados en el método. Por ejemplo, uno de los medios de recipiente puede comprender una sonda que es o puede ser marcad detectablemente . Tal sonda puede ser un anticuerpo específico para la proteína de VEGF sin modificar.
Tal kit comprenderá comúnmente el recipiente descrito anteriormente y uno o más de otros recipientes que comprenden materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo soluciones reguladoras del pH, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de empaque con instrucciones para uso. Una etiqueta puede estar presente en el recipiente para indicar que la composición es usada para una aplicación específica y puede también indicar instrucciones ya sea para uso in vivo o in vitro, tales como aquellos descritos anteriormente.
Los kits de la invención tienen un numero de modalidades, una modalidad típica es un kit que comprende un recipiente, una etiqueta sobre el recipiente y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición incluye un anticuerpo que se enlaza preferencialmente a VEGF sin modificar y la etiqueta sobre el recipiente indica que la composición puede ser usada para evaluar la presencia de VEGF sin modificar en una muestra y en donde el kit incluye instrucciones para usar el anticuerpo para evaluar la presencia de VEGF sin modificar en un tipo de muestra particular. El kit puede comprender además un conjunto de instrucciones y materiales para preparar una muestra y aplicar el anticuerpo a la muestra. El kit puede incluir tanto anticuerpo como un anticuerpo secundario, en donde el anticuerpo secundario es conjugado a un marcador, por ejemplo un marcador enzimático.
Otros componentes opcionales del kit incluyen una o más soluciones reguladoras del pH (por ejemplo, solución reguladora del pH de bloqueo, solución reguladora del pH de lavado, solución reguladora del pH del sustrato, etc.), otros reactivos tales como sustrato (por ejemplo, cromogen) que es alterado químicamente por un marcador enzimático, solución de recuperación de epítope, muestras testigo (testigos positivos y/o negativos), portaobjeto (s) testigo, etc. Los kit pueden también incluir instrucciones para interpretar los resultados obtenidos utilizando el kit.
En una modalidad especifica adicional, para kits a base de anticuerpo, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, anexado a un soporte sólido o apto de enlace a un soporte solido) que se enlaza a VEGF y (2) un segundo anticuerpo diferente que se enlaza preferiblemente a VEGF sin modificar, respectivamente. Preferiblemente, el último anticuerpo es marcado con una molécula de reportero. Por supuesto, también es posible intercambiar el primero por el segundo anticuerpo y viceversa cuando se diseña tal análisis.
En modalidades especificas adicionales, para kits a base de anticuerpo, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, anexado a un soporte solido o apto de enlace a un soporte solido) que se enlaza a VEGF sin modificar y (2) un segundo anticuerpo diferente que se enlaza preferiblemente a VEGF y (3) un tercer anticuerpo diferente que se enlaza específicamente al segundo anticuerpo y es marcado .
B . Métodos de tratamiento Algunos métodos de la invención comprenden además administrar un antagonista de VEGF a un paciente con un nivel incrementado de VEGF sin modificar en comparación con una muestra de referencia. Otras modalidades de la invención proveen métodos de tratamiento de un paciente con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF. Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proveer la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, una dosis puede ser administrada, varias dosis divididas pueden ser administradas en el tiempo o la dosis puede ser reducida o incrementada proporcionalmente como sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica.
El médico que tiene habilidad ordinaria en el arte puede determinar prescribir fácilmente la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida, dependiendo de factores tales como el tipo particular de agente anti-cáncer. Por ejemplo, el medico podría iniciar con dosis de tal agente anti-cáncer, tal como un anticuerpo anti-VEGF-A, empleadas en la composición farmacéutica a niveles más bajos que aquellas requeridas con el fin de obtener el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosificación hasta que se obtiene el efecto deseado. La efectividad de una dosis o un régimen de tratamiento dado del antagonista puede ser determinada, por ejemplo al determinar los sitios y síntomas en el paciente utilizando medidas estándar de eficacia.
En todavía otra modalidad, el sujeto es tratado con el mismo agente anti-cáncer, tal como un anticuerpo anti-VEGF-A por lo menos dos veces. Así, las exposiciones de antagonista inicial y segunda exposición de antagonista son preferiblemente con el mismo antagonista y más preferiblemente todas las exposiciones de antagonista son con el mismo antagonista, esto es, tratamiento por las primeras dos exposiciones y preferiblemente todas las exposiciones es con un tipo de agente anti-cáncer, por ejemplo un antagonista que se enlaza a VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF, por ejemplo todo con bevacizumab.
En todos los métodos de la invención resumidos en la presente, el agente anti-cáncer (tal como un anticuerpo que se enlaza a VEGF) puede estar sin conjugar, tal como un anticuerpo descubierto o puede ser conjugado con otra molécula para efectividad adicional, tal como por ejemplo para mejorar la vida media.
Un agente anti-cáncer preferido en la presente es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano, por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF y preferiblemente bevacizumab.
En otra modalidad, el antagonista de VEGF (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF) es el único medicamento administrado al sujeto.
En una modalidad, el antagonista» es un anticuerpo anti-VEGF que es administrado a una dosis de alrededor de 100 o 400 mg cada 1, 2, 3 o 4 semanas o es administrado a una dosis de alrededor de 1, 3, 5, 7.5, 10, 15 o 20 mg/kg cada 1, 2, 3 o 4 semanas. La dosis puede ser administrada como un asóla dosis o como múltiples dosis (por ejemplo 2 o 3 dosis) , tales como infusiones.
En todavía otro aspecto, la invención provee, después de la etapa de diagnosis un método para determinar si se continua administrando un agente anti-cáncer (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF) a un sujeto diagnosticado con cáncer que comprende medir la reducción en el tamaño del tumor, utilizando técnicas de representación de imagen tales como radiografía y/o MRI, después de la administración del antagonista una primera vez, medir la reducción en el tamaño del tumor en el sujeto utilizando técnicas de representación de imagen, tales como radiografía y/o MRI, después de la administración del antagonista una segunda vez, comparar los hallazgos de representación de imagen del sujeto la primera vez y en la segunda vez y si la puntuación es menor en la segunda vez que en la primera vez, continuar la administración del antagonista.
En todavía una modalidad adicional, una etapa es incluida en el método de tratamiento para probar la respuesta del sujeto al tratamiento después de la etapa de administración para determinar que el nivel de respuesta es efectivo para tratar la alteración angiogénica. Por ejemplo, una etapa es incluida para probar la puntuación de representación de imagen (radiográfica y/o MRI) después de la administración y compararla con resultados de representación de imagen de referencia obtenidos antes de la administración para determinar si el tratamiento es efectivo al medir si y · por cuanto ha cambiado. Esta prueba puede ser repetida a varios intervalos de tiempos programados o sin programar después de la administración para determinar el mantenimiento de cualquier remisión parcial o completa.
En una modalidad de la invención, ningún otro medicamento que el antagonista de VEGF tal como anticuerpo anti-VEGF es administrado al sujeto para tratar cáncer.
En cualquiera de los métodos en la presente, el agente anti-cáncer puede ser administrado en combinación con una cantidad efectiva de un (os) agente (s) adicional (es) . Agente (s) adicional (es) apropiado (s) incluye (n) por ejemplo un agente anti-linfangiogenico, un agente anti-angiogénico, un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, un agente citotóxico o combinaciones de los mismos .
Todos estos agentes adicionales pueden ser usados en combinación entre si o por si mismos con el primer medicamento, de tal manera que la expresión "agente adicional" como se usa en la presente no significa que es el único medicamento además del antagonista de VEGF. Asi, el agente adicional no necesita ser un agente individual, sino que puede constituir o comprender más de uno de tales fármacos .
Estos agentes adicionales como se resume en la presente son en general, usados en las mismas dosificaciones y con rutas de administración como se usan anteriormente en la presente o alrededor de uno a 99% de las dosificaciones empleadas hasta ahora. Si tales agentes adicionales son usados, preferiblemente, son usados en cantidades más bajas que si el primer médicamente no estuviera presente, especialmente en dosificaciones subsecuentes más allá de la dosificación inicial con el primer médicamente, para eliminar o reducir efectos secundarios provocados por los mismos .
Para los métodos de re-tratamiento descritos en la presente, en donde un (os) agente (s) adicional (es) es (son) administrado (s) en una cantidad efectiva con una exposición de antagonista, puede ser administrado con cualquier exposición, por ejemplo solo con una exposición o con más de una exposición. En una modalidad, el (los) agente (s) adicional (es) es (son) administrado (s) con la exposición inicial. En otra modalidad, el (los) agente (s) adicional (es) es (son) administrado (s) con la exposición inicial y segunda exposición. En todavía una modalidad adicional, el (los) agente (s) adicional (es) es (son) administrado (s) con todas las exposiciones. Es preferido que, después de la exposición inicial, tal como de esteroide, la cantidad de tal (es) agente (s) adicional (es) sea reducida o eliminada para reducir la exposición del sujeto a un agente con efectos secundarios tales como prednisona, prednisolona, metilprednisolona y ciclofosfoamida .
La . administración combinada de un (os) agente (s) adicional (es) incluyendo co-administración (administración concurrente) , utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica y administración consecutiva ya sea en uno u otro orden, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo en tanto que ambos (o todos) los agentes activos (medicamentos) ejercen simultáneamente sus actividades biológicas .
La terapia anti-cáncer es administrada mediante cualquier medio apropiado, incluyendo administración parenteral, tópica, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal y/o intralesional . Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa (i.v.), intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La administración intratecal es también contemplada. Además, el agente anti-cáncer puede apropiadamente ser administrado mediante infusión punzada, por ejemplo con dosis declinante del agente anti-cáncer. Preferiblemente, la dosificación es dada intravenosa o subcutáneamente y más preferiblemente mediante infusión (es) intravenosa (s) . , Si proveen múltiples exposiciones de agentes anti-cáncer, cada exposición puede ser provista utilizando los mismos o diferentes medios de administración. En una modalidad, cada exposición es mediante administración intravenosa. En otra modalidad, cada exposición es dada mediante administración subcutánea. En todavía otra modalidad, las exposiciones son dadas tanto mediante administración intravenosa como subcutánea.
En una modalidad, el agente anti-cáncer tal como un anticuerpo anti-VEGF es administrado como una infusión intravenosa lenta en ^gar de un empuje intravenoso o bolo. Por ejemplo, un esteroide tal como prednisolona o metil prednisolona (por ejemplo, alrededor de 80-120 mg i.v., más específicamente alrededor de 100 mg i.v.) es administrado alrededor de 30 minutos antes de cualquier infusión del anticuerpo anti-VEGF. El anticuerpo anti-VEGF es por ejemplo aplicado por infusión a través de una línea especializada.
Para la dosis inicial de una exposición de múltiples dosis al anticuerpo anti-VEGF o para la dosis individual si la exposición involucra solo una dosis, tal infusión es preferiblemente comenzada a una velocidad de alrededor de 50 mg/horas. Esta puede ser escalada, por ejemplo a una velocidad de incremento de alrededor de 50 mg/h cada alrededor de 30 minutos a un máximo de alrededor de 400 mg/h. sin embargo, si el sujeto está experimentando una reacción infusión-relacionada, la velocidad de infusión es preferiblemente reducida, por ejemplo a la mitad de la velocidad actual, por ejemplo de 100 mg/h a 50 mg/h. preferiblemente, la infusión de tal dosis de anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, una dosis total de alrededor de 1000 mg) es consumada alrededor de 255 minutos (4 horas, 15 minutos) . Opcionalmente, los sujetos reciben un tratamiento profiláctico de acetaminofén/paracetamol (por ejemplo, alrededor de 1 g) y difenhidramina HCKpor ejemplo, alrededor de 50 mg o dosis equivalente de agente similar) por la boca alrededor de 30 a 60 minutos antes del inicio de una infusión.
Si más de una infusión (dosis) de anticuerpo anti-VEGF es dada para obtener la exposición total, la segunda infusión de anticuerpo anti-VEGF o infusiones de anticuerpo anti-VEGF subsecuentes en esta modalidad de infusión son preferiblemente comenzadas a una velocidad más alta que la infusión inicial, por ejemplo alrededor de 100 mg/h. esta velocidad puede ser escalada, por ejemplo, a una velocidad de incremento de alrededor de 100 mg/h cada alrededor de 30 minutos a un máximo de alrededor de 400 mg/h. los sujetos que experimentan una reacción infusión-relacionada tienen preferiblemente la velocidad de infusión reducida a la mitad de aquella velocidad, por ejemplo de 100 mg/h a 50 mg/h. preferiblemente, la infusión de tal segunda dosis o dosis subsecuente de anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, una dosis total de alrededor de 1000 mg) es consumada por alrededor de 195 minutos (3 horas, .15 minutos) .
En una modalidad preferida, el agente anti-cáncer es un anticuerpo anti-VEGF y es administrado en una dosis de alrededor de 0.4 a 4 gramos y más preferiblemente el anticuerpo es administrado en una dosis de alrededor de 0.4 a 1.3 gramos a una frecuencia de 1 a 4 dosis en un periodo de alrededor de un mes. todavía más preferiblemente, la dosis es de alrededor de 500 mg a 1.2 gramos y en otras modalidades, es de alrededor de 750 mg a 1.1 gramos. En tales aspectos, el antagonista es preferiblemente administrado en dos a tres dosis y es administrado en un periodo de alrededor de 2 a 3 semanas .
En una modalidad, el sujeto nunca ha sido administrado previamente con cualesquier fármacos para tratar el cáncer. En otra modalidad, el sujeto o paciente ha sido previamente administrado con uno o más medicamentos para tratar el cáncer. En una modalidad adicional, el sujeto o paciente no fue responsivo a una o más de las medicaciones que ha sido administrado previamente . Tales fármacos a los cuales el sujeto puede ser no responsivo incluyen por ejemplo agentes anti-neoplásicos , agentes quimioterapéuticos , agentes citotóxicos y/o agentes inhibidores de crecimiento. Mas en particular, los fármacos a los cuales el sujeto puede ser no responsivo incluyen antagonistas de VEGF, tales como anticuerpos anti-VEGF. En un aspecto adicional, tal agente anti-cáncer incluye un anticuerpo o inmunoadhesina, de tal manera que el re-tratamiento es contemplado con uno o más anticuerpos o inmunoadhesinas de esta invención a los cuales el sujeto fue anteriormente no responsivo.
IV. Tratamiento con el agente anti-cáncer Una vez que la población de pacientes más responsiva o sensible al tratamiento con el antagonista de VEGF ha sido identificada, en el tratamiento con el antagonista de VEGF solo o en combinación con otros medicamentos, da como resultado una mejora en los pacientes que sufren de cáncer. Por ejemplo, tal tratamiento puede dar como resultado la reducción en el tamaño del tumor o supervivencia libre de avance. Además, el tratamiento con la combinación de un agente anti-cáncer y por lo menos un agente adicional da como resultado preferiblemente un efecto terapéutico aditivo, mas preferiblemente sinergista (o mayor que aditivo) al paciente. Preferiblemente, en esto método combinado, la sincronización entre por lo menos una administración del (los) agente (s) adicional (es) y por lo menos una administración del agente anti-cáncer es alrededor de 1 mes o menos, mas preferiblemente alrededor de 2 semanas o menos .
Se apreciara por aquel de habilidad en las artes médicas que la manera exacta de administración a dicho paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente anti-cáncer enseguida de la diagnosis de la responsividad probable del paciente al agente anti-cáncer será a discreción del medio que atiende. El modo de administración, incluyendo dosificación en combinación con otros agentes, sincronización y frecuencia de administración y los semejantes, pueden ser afectados por la diagnosis de la responsividad probable del paciente a tal agente anti-cáncer, también como la condición e historia del paciente. Así, a un paciente diagnosticado con una alteración que se permite que sean relativamente insensibles al agente anti-cáncer se pueden todavía beneficiar del tratamiento con el mismo, particularmente en combinación con otros agentes, incluyendo agentes que pueden alterar la responsividad del paciente al agente anti-cáncer.
La composición que comprende un agente anti-cáncer será formulada, dosificada y administrada de manera consistente con la buena práctica médica. Factores para consideración en este contexto incluyen el tipo particular de la alteración que es tratada, el mamífero particular que es tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa de la alteración angiogénica, el sitio de administración del agente, efectos secundarios posibles, el tipo de antagonista, el método de administración, el horario de administración y otros factores conocidos a los prácticos médicos. La cantidad efectiva del agente anti-cáncer a ser administrada será determinada por tales consideraciones.
Como una propuesta general, la cantidad efectiva del agente anti-cáncer administrada parenteralmente por dosis estará en el intervalo de alrededor de 20 mg alrededor de 5000 mg, por una o más dosificaciones. Regímenes de dosificación ejemplares para anticuerpos tales como anticuerpos anti-VEGF incluyen 100 o 400 mg cada 1, 2, 3 o 4 semanas o es administrada una dosis de alrededor de 1, 3, 5, 7.5, 10, 15 o 20 mg/kg cada 1, 2, 3 o 4 semanas. La dosis puede ser administrada como una sola dosis o como múltiples dosis (por ejemplo, 2 o 3 dosis) , tales como infusiones. Como se indica anteriormente, sin embargo, estas cantidades sugeridas de agente anti-cáncer están sujetas a la discreción terapéutica. El factor clave para seleccionar una dosis apropiada y horario apropiado es el resultado obtenido, como se indica anteriormente. En algunas modalidades, el agente anti-cáncer es administrado tan cercano al primer signo, diagnosis, aparición o presencia de la alteración cómo es posible .
El agente anti-cáncer es administrado mediante cualquier medio apropiado, incluyendo administración parenteral, tópica, subcutánea, intraperitoneal , intrapulmonar, intranasal y/o intralesional . Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La administración intratecal es también contemplada. Además, el antagonista puede apropiadamente ser administrado mediante infusión pulsada, por ejemplo con dosis declinantes del antagonista. Más preferiblemente, la dosificación es dada mediante inyecciones intravenosas.
Se pueden administrar agentes adicionales, como se indica anteriormente, con los agentes anti-cáncer de la presente. La administración combinada incluye coadministración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica y administración consecutiva ya sea en un orden u otro, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo en tanto que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.
Además de la administración de agentes anti-cáncer al paciente mediante rutas tradicionales como se indica anteriormente, la presente invención incluye administración mediante terapia genética. Tal administración de ácido nucleico que codifican el agente anti-cáncer es abarcada por la expresión "administrar una cantidad efectiva de un agente anti-cáncer". Véase, por ejemplo WO 1996/07321 concerniente con la terapia genética para generar anticuerpos intracelulares .
Hay dos procedimientos principales para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) a las células del paciente, in vivo y ex Vivo. Para la administración in vivo, el ácido nucleico . es inyectado directamente al paciente, usualmente en el sitio en donde el antagonista es requerido. Para el tratamiento ex vivo, las células del paciente son removidas, el ácido nucleico es introducido a esta células aisladas y las células modificadas son administradas al paciente ya sea directamente o por ejemplo encapsuladas dentro de membranas porosas que son implantadas al paciente (véanse, por ejemplo Patentes Estadounidenses 4,892,538 y 5,283,187). Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos a células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido a células cultivadas dentro o in vivo en las células del huésped destinado, técnicas apropiadas para la transferencia de ácido nucleico a células mamíferas in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, micro inyección, fusión celular, DEAE-dextrana, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Un vector usado comúnmente para administración ex vivo del gen es un retrovirus .
Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen transfixión con vectores virales (tales como adenovirus, virus de herpes simples I o virus adeno-asociado) en sistemas a base de lípido (lípidos útiles para la transferencia lípido-moderada del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . En algunas situaciones, es deseable proveer la fuente de ácido nucleico con un agente específico para la célula objetivo tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular sobre la célula objetivo, un ligando para un receptor sobre el objetivo, etc. En donde se emplean liposomas, proteínas que se enlazan a una proteína de membrana de superficie celular asociada con eridocitosis puede ser usada para apuntamiento y/o para facilitar la absorción, por ejemplo proteínas de capsido o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización en la ciclizacion y proteínas que apuntan la localización intracelular y mejoran la vida media intracelular. La técnica de endocitosis de receptor-moderada es descrita por ejemplo por Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987) y Wagner et al., PNAS USA 87:3410-3414 (1990). Protocolos de marcación genética en terapia genética son descritos, por ejemplo en Anderson et al., Science 256:808-813 (1992) y WO 1993/25673.
Un agente anti -cáncer puede ser combinado en una formulación de combinación farmacéutica o régimen de dosificación como terapia combinada, con por lo menos un compuesto original que tiene propiedades anti-cáncer. El por lo menos un compuesto adicional de la formulación de combinación farmacéutica o régimen de dosificación tiene preferiblemente actividades complementarias a la composición de antagonista de VEGF de tal manera que no se afectan adversamente entre sí.
El por lo menos un compuesto, adicional puede ser un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, una citoquina, un agente inhibidor de crecimiento, un agente anti-hormonal , un agente anti-angiogénico, un agente anti-linfangiogenico y combinaciones de los mismos. Tales moléculas están apropiadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito planeado. Una conjunción farmacéutica que contiene un antagonista de VEGF (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF) puede también comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, un agente citotóxico o combinaciones de los mismos.
En un aspecto, el primer' compuesto es un anticuerpo anti-VEGF y el por lo menos un compuesto es un anticuerpo terapéutico diferente del anticuerpo anti-VEGF. En una modalidad, el por lo menos un compuesto adicional es un anticuerpo que se enlaza a un marcador de superficie de célula de cáncer. En una modalidad, el por lo menos un compuesto adicional es un anticuerpo anti-HER2, trastuzumab, (por ejemplo Herceptin®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA) . En una modalidad, el por lo menos un compuesto adicional es un anticuerpo anti-HER2, pertuzumab (Omnitarg™, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, Véase Patente Estadounidense 6949245)) . En una modalidad, el por lo menos un compuesto adicional es un anticuerpo (ya sea un anticuerpo descubierto o un ADC) y el anticuerpo adicional es un- segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto anticuerpo o más, de tal manera que una combinación de tales segundos, terceros, cuartos, quintos, sextos o más anticuerpos (ya sean descubiertos o como un ADC) es eficaz en el tratamiento de una alteración angiogénica.
Otros regímenes terapéuticos de acuerdo con esta invención pueden incluir la administración de un agente anticáncer VEGF-antagonista e incluyendo sin limitación terapia de radiación y/o trasplantes de medula ósea y sangre periférica y/o un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico o un agente inhibidor de crecimiento. En una de tales modalidades, un agente quimioterapéutico es un agente o una combinación de agentes tales como por ejemplo ciclofosfamida, hidroxidaunorubicina, adriamicina, doxorubincina, vincristina (ONCOVIN™) , prednisolona, CHOP, CVP o COP o inmunoterapeuticos tales como anti-PSCA, anti-HER2 (por ejemplo, HERCEPTIN®, OMNITARG®) . La terapia combinada puede ser administrada como un régimen simultáneo o secuencial. Cuando es administrada secuencialmente, la combinación puede. ser administrada en dos o más administraciones. La administración combinada incluye coadministración, utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica y administración consecutiva ya sea en un orden u otro, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo en donde ambos (o todos) los agentes activos ejercer simultáneamente sus actividades biológicas.
En una modalidad, el tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF involucra la administración combinada de un agente anti-cáncer identificado en la presente y uno, dos o tres o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores de crecimiento, incluyendo co-administración de cocteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Agentes quimioterapéuticos incluyen taxanos (tales como paclitaxel y docetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. Los horarios de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden ser usados de acuerdo con las instrucciones del fabricante o tal como se determina empíricamente por el práctico experimentado. Los horarios d preparación y dosificación para tal quimioterapia son también descritos en "Chemotherapy Service", (1992) Ed. , M.C. Perry, Williams & ilkins, Baltimore, Md.
Dosificaciones apropiadas para cualquiera de los agentes co-administrados anteriores son aquellos usados actualmente y pueden ser disminuidas debido a la acción combinada (sinergia) del agente recién identificado y otros agentes o tratamientos quimioterapéuticos .
La terapia combinada puede proveer "sinergia" y probar ser "sinergista" ,' esto es, el efecto obtenido cuando los ingredientes activos usados conjuntamente es mayor que la suma de los efectos que resultan de usar los compuestos separadamente. Un efecto sinergista puede ser obtenido cuando los ingredientes activos son : (a) co- formulados y administrados o alimentados simultáneamente en una formulación de dosificación unitaria combinada, (2) administradas mediante alternación o en paralelo como formulaciones separadas o (3) mediante algún otro régimen. Cuando son administradas en terapia de alternación, un efecto sinergista puede ser obtenido cuando los compuestos son administrados o alimentados secuencialmente, por ejemplo mediante diferentes inyecciones enseguida separadas. En general, durante terapia de alternación, una dosificación efectiva de cada . ingrediente activo es administrada secuencialmente, esto es, serialmente, mientras que en la terapia combinada, las dosificaciones efectivas de dos o más ingredientes activos son administradas conjuntamente.
Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada del agente terapéutico adicional dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, el tipo del anticuerpo, la severidad y curso de la enfermedad, si el antagonista de VEGF y agente adicional son administrados por propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al antagonista de VEGF y agente adicional y la discreción del médico que atiende . El antagonista de VEGF y agente adicional son administrados apropiadamente al paciente en una vez o una serie de tratamientos. El antagonista de VEGF es administrado comúnmente como se resume en lo anterior. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, alrededor de 200 mg/m2 a 600 mg/m2 del agente adicional es una dosificación candidata inicial para administración del paciente, ya sea por ejemplo mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continúa. Una dosificación diaria típica podría variar de alrededor de 20 mg/m2, 85 mg/m2, 90 mg/m2, 125 mg/m2, 200 mg/m2, 400 mg/m2, 500 mg/m2 o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas en varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que se presenta la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Así, uno o más dosis de alrededor de 20 mg/m2, 85 mg/m2, 90 mg/m2, 125 mg/m2, 200 mg/m2, 400 mg/m2, 500 mg/m2, 600 mg/m2 (o cualquier combinación de las mismas) puede ser administrada al paciente. Tales dosis' pueden ser administrada intermitentemente, por ejemplo cada semana o cada dos, tres, cuatro, cinco o seis (por ejemplo, de tal manera que el paciente recibe de alrededor de dos a alrededor de veinte, por ejemplo alrededor de seis dosis del agente adicional) . Una dosis de carga más alta inicial, seguida por una o más dosis más bajas puede ser administrada. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El avance de esta terapia es monitoreado fácilmente mediante técnicas y análisis convencionales.
V. Formulaciones farmacéuticas Formulaciones terapéuticas de los antagonistas usados de acuerdo con la presente invención son preparadas para almacenamiento al mezclar el antagonista que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores aceptables farmacéuticamente opcionales en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Para información general concerniente con formulaciones, véase, por ejemplo Gilman et al. , (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990), Mack Publishing Co. , Eastori, Pennsylvania . ; Avis et al., (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms : Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman et al.., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; and Lieberman et al., (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms : Disperse Systems Dekker, New York, Kenneth A. Walters (ed.) (2002) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences) , Vol 119, Marcel Dekker.
Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen soluciones reguladoras del pH tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tal como cloruro octadecildimetilbenzil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico, alcohol bencílico; alquil parebenes tal como metil o propil parabenes; catecol, resorcinol; ciclohexanol ,- 3-pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos) , proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulina; polímeros hidrofilicos tales como polivinilpirrolidona; amino ácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos; disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra iones formadores de sal, tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) y/o surfactantes no iónicos tales como T EEN™, PLURONICS™ o polietilen glicol (PEG) .
Formulaciones de anticuerpo anti-VEGF ejemplares son descritas en la Patente Estadounidense 6,884,879. En ciertas modalidades, _ los anticuerpos anti-VEGF son formulados a 25 mg/ml en frascos de un solo uso. En ciertas modalidades 100 mg de los anticuerpos anti-VEGF son formulados en 240 mg de a, a-trehalosa di hidratada, 23.2 mg de fosfato de sodio (monobásico, monohidratado) , 4.8 mg de fosfato de sodio (di básico, anhidro), 1.6 mg de polisorbate 20 y agua para inyección, USP. En ciertas modalidades, 400 mg de los anticuerpos anti-VEGF son formulados en 960 mg de a, -trehalosa di hidratada, 92.8 mg de fosfato de' sodio (monobásico, monohidratado), 19.2 mg de fosfato de sodio (di básico anhidro), 6.4 mg de polisorbate 20 y agua para inyección USP.
Formulaciones liofilizadas aptas para administración subcutánea son descritas por ejemplo en la Patente Estadounidense 6,267,958. Tales formulaciones liofilizadas pueden ser reconstituidas con un diluyente apropiado a una alta concentración de proteína y la formulación reconstituida puede ser administrada subcutáneamente al mamífero a ser tratado en la presente .
Formas cristalizadas del antagonista son también contempladas. Véase, por ejemplo 2002/0136719A1.
La formulación de la presente puede también contener más de un compuesto activo (un (os) agente (s) adicional (es) como se indica anteriormente) , preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. El tipo y cantidades efectivas de tales medicaciones dependen por ejemplo de la cantidad y tipo del antagonista de VEGF presente en la formulación y parámetros clínicos de los sujetos. Los preferidos de tales agentes adicionales son indicados anteriormente .
Los ingredientes activos pueden también estar atrapados en micro capsulas preparadas por ejemplo mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo hidroximetilcelulosa o micro capsulas de gelatina y micro capsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, micro esferas de albúmina, micro emulsiones, nano partículas y nano capsulas) o en macro emulsiones. Tales técnicas son reveladas en Remington's Pharmaceutical Sciences 16 edición, Osol, A. Ed. (1980) .
Preparaciones de liberación sostenida pueden ser preparadas. Ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista, tales matrices están en forma de artículos formados, por ejemplo películas o micro capsulas. Ejemplos de tales matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (alcohol vinílico) , polilacturos (Patente Estadounidense 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y gama-etil-L-glutamato, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, copolímeros de ácido láctico-ácido glicolico degradables tales como el LUPRON DEPOT™ (micro esferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicolico y acetato de leupronato) y acido poli-D (-)-3-hidroxibutirico .
Las formulaciones a ser usadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles .
VI. Kits Para uso en la detección de VEGF sin modificar, kits o artículos de manufactura también son provistos por la invención. Tales kits pueden ser usados para determinar si un sujeto con cáncer será efectivamente responsivo a una terapia de agente anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF (incluyendo, por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF tal como bevacizumab) . Estos kits pueden comprender un medio de portador que es dividido en compartimientos para recibir en confinación estrecha uno o más medios de recipiente tales como frascos, tubos y los semejantes, cada uno de los medios de recipiente comprende uno de los elementos separados a ser usados en el método. Por ejemplo, uno de los medios de recipiente puede comprender · un compuesto que se enlaza específicamente a VEGF sin modificar y otro medio de recipiente puede comprender un compuesto que se enlaza específicamente a VEGF en un epítope que no interfiere o se traslapa con el enlace del primer compuesto.
Tal kit comprenderá comúnmente el recipiente descrito anteriormente y uno o más de otros recipientes que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo soluciones reguladoras del pH, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de empaque con instrucciones para uso. Una etiqueta puede estar presente en el recipiente para indicar que la composición es usada para una aplicación específica y puede también indicar instrucciones ya sea para uso in vivo o in vitro, tal como aquellos descritos anteriormente.
Los kits de la invención tienen un número de modalidades. Una modalidad típica es un kit que comprende un recipiente, una etiqueta sobre el recipiente y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición incluye compuestos que se enlazan específicamente a VEGF sin modificar y la etiqueta sobre el recipiente indica que la composición puede ser usada para detectar VEGF sin modificar y en donde el kit incluye instrucciones para usar el (los) compuesto (s) para detectar VEGF sin modificar. El kit puede comprender además un conjunto de instrucciones y materiales para preparar y usar el (los) compuesto (s) .
Otros componentes opcionales del kit incluyen una o más soluciones reguladoras del pH (por ejemplo, solución reguladora del pH de dilución, etc.), otros reactivos, tales como portador (por ejemplo, dextrana, albúmina) . Los kits pueden también incluir instrucciones para interpretar los resultados obtenidos utilizando el kit.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son provistos para ilustrar pero no limitar la invención actualmente reclamada.
Ejemplo 1 En la prueba de AVADO (BO17708) , los pacientes con cáncer de pecho negativo HER-2 avanzado localmente, recurrente o metastático sin tratar fueron aleatorizados a docetaxel 100 mg/m2 mas bevacizumab 7.5 mg/kg cada 3 semanas (n = 248) , bevacizumab 15 mg/kg (n = 247) cada tres semanas o placebo (n = 241) véase, Miles, J. Clin. Oncol . , 24 May 2010 (¿-publicado) ) .
Muestras de referencia de plasma sanguíneo estuvieron disponibles de 396 pacientes en esta prueba.
Una investigación del estatus de biomarcadores relacionados con angiogénesis y tumorigénesis revelo que los niveles de expresión de tres biomarcadores en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador se correlacionaron con un parámetro de tratamiento mejorado. En particular, los pacientes que exhiben un nivel de expresión más alto de VEGFA en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador, demostró una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de docetaxel. Los pacientes que exhiben un nivel de expresión más alto de VEGFR2 en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador demostró una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de docetaxel. También, los pacientes que exhiben nivel de expresión combinado más alto de VEGFA y VEGFR2 en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador, demostró una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de docetaxel. Además, los pacientes que exhiben nivel de expresión combinado más alto de VEGFA y PLGF en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes demostró una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de docetaxel.
Pacientes y métodos inmunoquimicos Un total de 736 pacientes participaron en el estudio B017708 y muestras de plasma sanguíneo de 396 de los pacientes estuvieron disponibles para análisis de biomarcador. Las características de referencia de los 396 pacientes en el análisis de biomarcador en los pacientes restantes para los cuales ningún análisis de biomarcador fue posible son provistas en la Tablai 1A y Tabla IB.
Tabla 1A: Características de referencia Tabla IB: Características de referencia Análisis de plasma sanguíneo Muestras de plasma fueron recolectadas después de la aleatorización y antes dé que cualquier tratamiento de estudio fuera administrado. Todas las muestras fueron obtenidas de pacientes que fueron después de esto tratados con docetaxel 100 mg/m2 mas ya sea bevacizumab 7:5 mg/kg cada 3 semanas, bevacizumab 15 mg/kg cada tres semanas o placebo hasta el avance de la enfermedad.
Un total de 4.9 mi de sangre fueron extraídos a un tubo S-monovette® (y un tubo de plasma citrado para los 16 pacientes con terapia de anticoagulante) . Fueron mezclados inmediatamente después de esto mediante inversión suave del tubo y fueron centrifugados en el transcurso de 30 minutos a aproximadamente 1500 g en centrifuga (temperatura ambiente durante 10 minutos) inmediatamente después de esto, el plasma del sobrenadante fue tomado en alícuotas en un tubo de transferencia de 5 mi de polipropileno claro. Después de esto, el plasma fue tomado en alícuotas en dos tubos de almacenamiento de plástico (aproximadamente 1.25 mi cada uno) . Las muestras fueron almacenadas en posición vertical a -70°C. En algunos casos, las muestras fueron almacenadas a -20°C por un mes y luego transferidas a -70°C.
Las muestras fueron usadas para medición de niveles de VEGFA, receptor-1 de VEGF (VEGFR1) , VEGFR2 , PLGF y E-SELECTIN utilizando un dispositivo Inmunological Multiparameter Chip Technology (IMPACT) de Roche Diagnostics GmbH.
Tecnología de análisis Multiplex IMPACT Roche Professional Diagnostics (Roche Diagnostics GmbH) ha desarrollado una plataforma de multimarcador bajo el nombre de trabajo IMPACT (Immunological MultiParameter Chip Tecnology) . Esta tecnología fue usada para la medición de los marcadores de proteína mencionados anteriormente en la sección de "Análisis de plasma sanguíneo" . La tecnología está basada en un ' chip de polietileno pequeño manufacturado mediante procedimientos como se revela en EP 0939319 y EP 1610129. La superficie del chip fue recubierta con una capa de estreptavidina, sobre la cual los anticuerpos biotinilados fueron luego depositados para cada análisis. Para cada marcador, puntos de anticuerpos fueron cargados en una línea vertical sobre el chip. Durante el análisis el arreglo fue sondeado con muestras de espécimen que contienen los analitos específicos .
El volumen de plasma requerido por espécimen para medir todos los marcadores en un chip fue de 8 µ?, que fue aplicado junto con 32 µ? de la solución reguladora del pH de incubación (HEPES 50 mM, pH 7.2, NaCl 150 mM, Thesit al 0.1%, albúmina de suero bovino al 0.5% y Oxypyrion al 0.1% como , agente conservador) . Después de la incubación por 12 minutos y lavado del chip utilizando una solución reguladora del pH de lavado (Tris 5 mM, pH 7.9, Thesit al 0.01% y Oxypyrion al 0.001%) la mezcla de anticuerpo monoclonal dioxigenilada fue agregada (40 µ? de solución reguladora del pH de incubación que incluye una mezcla de los anticuerpos analito-específicos marcados con digoxigenina) y fue incubado por 6 minutos adicionales para enlazarse sobre los analitos capturados. El segundo anticuerpo fue finalmente detectado con 40 µ? de una solución reguladora del pH de reactivo (TAPS 62.5 mM, pH 8.7, NaCl 1.25 M, albúmina de suero bovino al 0.5%, Tween 20 al 0.063% y Oxypyrion al 0.1%> incluyendo un conjugado de anticuerpo anti-digoxigenina acoplado con látex fluorescente. Utilizando este marcador, 10 eventos de enlace individuales en un solo punto podrían ser detectados, dando como resultado una sensibilidad muy alta hasta la concentración fmol/L. los chips fueron transportados a la unidad de detección y una cámara del dispositivo de carga-acoplada (CCD) genero una imagen que fue transformada a intensidades de señal utilizando elementos de programación especializados. Los puntos individuales fueron localizados automáticamente en posiciones predefinidas y cuantificados mediante análisis de imagen. Para cada marcador líneas de 10-12 puntos fueron cargadas sobre los chips y uno de 5 puntos fue requerido para determinar la concentración media de muestras. Las ventajas de la tecnología son la habilidad de multiplexión de hasta 10 parámetros en un formato de . emparedado o competitivo. Los calibradores y muestras de paciente fueron medidos por duplicado. Una corrida fue diseñada para contener un total de 100 determinaciones incluyendo dos multicontroles como un control de corrida. Puesto que algunos de los analitos seleccionados reaccionan entre sí (esto es VEGFA y PLGF con VEGFR1 o VEGR2 o VEGFA forma heterodímeros con PLGF) , los cinco analitos fueron divididos en tres chips diferentes como sigue: Chip 1: VEGFA Chip 2: VEGFR1 , VEGFR2 , E-Selectina Los siguientes anticuerpos fueron usados para diferentes análisis : Análisis estadísticos La mediana de muestra fue usada para dicotomizar valores de biomarcador como bajos (por debajo de la mediana) o altos (en o por encima de la mediana) .
La proporción de peligro del efecto de tratamiento en el subgrupo de pacientes con altos o bajos niveles de biomarcador fueron estimados con análisis de regresión de cox de peligro proporcional.
Además, se usaron regresiones de co de peligro proporcional para evaluar la asociación entre el nivel de biomarcador y el efecto de tratamiento. El modelo incluyo los siguientes covariados: tratamiento de prueba, nivel de biomarcador, factores de estratificación binarios (estatus de ER/PgR, enfermedad medible en la referencia, antes de terapia de taxano adyuvantes) , termino de interacción de tratamiento por nivel de biomarcador. La prueba de Wald para el término de interacción fue usada para determinar la aceleración entre el nivel de biomarcador y el efecto de tratamiento. El valor P debajo de 0.05 fue considerado significativo.
Resultados Marcadores de plasma sanguíneo Estadísticas descriptivas de referencia de los biomarcadores son presentadas en la Tabla 2.
Tabla 2 : Estadísticas descriptivas de valores de biomarcador (referencia) La Tabla 3 presenta los resultados del análisis de la asociación de VEGFA o VEGFR2 con el efecto de tratamiento en la supervivencia libre de avance.
Tabla 3: este análisis para VEGFA, bajo VEGFA VEGFA pg/ml) y alto VEGFA (= 125 pg/ml) y para VEGFR2, bajo VEGFR2 (<11 ng/ml) y alto VEGFR2 (> 11 ng/ml) fueron usados.
Estos resultados muestran que la proporción de peligro para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFA en comparación con pacientes con bajo VEGFA. Estos resultados también muestran que la proporción de peligro para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFR2 en comparación con VEGFR2. La misma tendencia es observada cuando se compara baja y alta dosis de bevacizumab con placebo, la evidencia estadística de diferencia entre el subgrupo de biomarcador alto y bajo es más fuerte en los pacientes tratados con baja dosis de bevacizumab. Por consiguiente VEGFA y VEGFR2 son cada uno biomarcadores predictivos independientes para el efecto de tratamiento de bevacizumab en la supervivencia libre de avance.
La Tabla 4 presenta el análisis de asociación de combinaciones de biomarcador con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance para baja dosis (7.5 mg/kg cada 3 semanas) de bevacizumab y para alta dosis (15 mg/kg cada 3 semanas) de bevacizumab.
Para este análisis: Formula 1: norm (VEGFA) +1.3*norm (VEGFR2) Formula equivalente: 0.71*log2 (VEGFA) +3.16*log2 (VEGFR2) - 15.6 Formula 2: 0.25*norm (VEGFA) +0.21*norm (PLGF) Formula equivalente: 0.18*log2 (VEGFA) +0.42*log2 (PLGF) 3.1 Se usa la transformación log2 y.
En donde mad es la desviación absoluta mediana ajustada por un factor de 1.4826.
Tabla : Asociación con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance (análisis de bi-marcador) para baja dosis (7.5 mg/kg cada 3 semanas) de bevacizuma y para alta dosis (15 mg/kg cada 3 semanas de bevacizumab) Es este análisis, un alto nivel de expresión combinado de VEGFA y VEGFR2 es Formula 1 Formula 1 = 0.132 y un bajo nivel de expresión combinado de VEGFA y VEGFR2 es Formula 1 < 0.132 y un alto nivel de expresión combinado de VEGFA y PLGF es Formula 2 = 0.006 y un bajo nivel de expresión combinado de VEGFA y PLGF es Formula 2 < 0.006.
Estos resultados muestran que la proporción de peligro para el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con una combinación con alto VEGFA y VEGFR2 en comparación con una combinación de bajo VEGFA y VEGFR2. Estos resultados también muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con la combinación de alto VEGFA y PGLF en comparación con pacientes con la combinación de bajo VEGFA y PLGF. La misma tendencia es observada cuando se compara baja y alta dosis de bevacizumab con placebo, la evidencia estadística de diferencia entre el subgrupo de biomarcador alto y bajo es más fuerte en pacientes tratados con baja dosis de bevacizumab. Por consiguiente, la combinación de VEGFA y VEGFR2 y la combinación de VEGFA y PLGF son cada uno biomarcadores son predictivos independientes por el efecto de tratamiento de bevacizumab sobre la supervivencia libre de avance .
El valor predictivo de VEGF-A en el brazo de bevacizumab de 15 mg/kg fue explorado además al subdividir el cohorte en cuartiles de acuerdo con los niveles de VEGF-A. Los intervalos de confianza a 95% para todos los cuartiles se traslaparan. En el primer cuartil (< 64 pg/ml) , se observe un efecto de tratamiento muy limitado (proporción de peligro 0.86). En el cuartil más alto (>240 pg/ml), la proporción de peligro por PFS fue de 0.39 (95% CI:0.19-0.77) y la diferencia en PFS mediana fue más pronunciada que en los otros grupos. En general, los valores estimativos puntuales de los cuartiles muestran una mejora consistente en la proporción de peligro con niveles de VEGF-A incrementados.
Estos resultados son mostrados en la Tabla 5 a continuación.
Tabla 5 : PFS de acuerdo con el cuartil de VEGF-A Ejemplo 2: Este ejemplo demuestra que, en base a los anticuerpos usados para detección de VEGF-A en la plataforma IMPACT, las isoformas más cortas de VEGF-A son preferencialmente medidas, en comparación las isoformas más largas de VEGF-A.
El análisis fue efectuado como se describe anteriormente bajo la sección concerniente con la tecnología IMPACT utilizando los anticuerpos enlistados en la tabla antes de la sección "análisis estadístico" .
Cuatro formas de VEGF-A diferentes, esto es VEGFm, VEGF12i, VEGFi65 y VEGFiag estuvieron disponibles y fueron usadas en el análisis. VEGFm y VEGF12i (ambos derivados de la expresión de E. coli) y VEGFi65 (obtenido recombinantemente en una línea de célula de insecto) fueron comprados de R&D Systems, Minneapolis, Estados Unidos de América; VEGFi89 (producido en E. coli) fue obtenido de RELIATech GmbH, Wolfenbüttel, Alemania. Se descubrió más tarde que VEGF189 es más bién inestable y que los datos obtenidos con aquel material no pueden ser confiables. Como es obvio de la Figura 11 las isoformas de VEGF 111 o 121, respectivamente, que habían sido producidas en E. coli . y no son modificadas secundariamente, por ejemplo no glicosiladas , son detectadas mejor en comparación con la isoforma más larga de VEGF con 185 aminoácidos. VEGF 165 ha sido obtenido en una línea de célula de insectos y es por lo menos parcialmente glicosilado .
Sin desear estar limitados a esta teoría, se supone que el enlace preferencial de VEGF sin modificar de este análisis, que está basado en las propiedades de enlace específicas de MAB 3C5 podrían explicar porque un valor predictivo estadísticamente significativo fue observado, mientras que mediciones previas de VEGF-A han conducido a resultados en conflicto en aquel respecto.
Ejemplo 3: Medición comparativa de VEGF165 sin modificar y modificado en el analizador Elecsys Este ejemplo describe experimentos que demuestran que el analizador Elecsys® y un análisis correspondiente pueden ser usados para detectar VEGF sin modificar en plasma humano.
El análisis de VEGF-A fue transferido de IMPACT al sistema de diagnósticos in vitro automatizado Elecsys® (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) . El mismo anticuerpo de captura como el análisis de IMPACT, <hVEGF-A>-m3C5 (RELIATech GmbH, Wolfenbüttel) fue usado, mientras que el anticuerpo de detección <hVEGF-A>-m25603 (R&D Systems, Minneapolis) usado en el sistema IMPACT fue reemplazado por- <hVEGF-A>-mA4.6.1 (Genentech, Sur de San Francisco) .
Los inmunoanálisis que operan en el sistema Elecsys automatizado son inmunoanálisis que utilizan electro quimioluminiscencia (ECLIA) como la tecnología de generación de señal. En el presente análisis de emparedado, el anticuerpo de captura biotinilado se enlaza a micro partículas magnéticas recubiertas con estreptavidina y el anticuerpo de detección rutinilado permite la generación de señal. 75 µ? de <VEGF-A>-m3C5 biotinilado a 1.5 g/ml y 75 µ? de <VEGF-A>M-A.4.6.1 rutinilado a 2 g/ml ambos en solución reguladora del pH de reacción (Tris 50 mM (pH 7.4), EDTA 2 mM, thesit al 0.1 %, IgG bovino al 0.2 %, albúmina de suero bovino al 1.0 %) fueron incubados por 9 minutos 20 µ? de muestra. 30 µ? de una suspensión de micro partículas fueron agregados después de los primeros 9 minutos de incubación y la mezcla entera incubada por nueve minutos adicionales. Durante estas etapas de incubación, un emparedado del anticuerpo-monolito-anticuerpo es formado que es enlazado a las micro partículas. Finalmente, las micro partículas fueron transferidas a la cámara de detección del sistema Elecsys para la generación y lectura de señal.
La preferencia del análisis de VEGF-A Elecsys fue determinada con proteínas recombinantes purificadas: VEGF165 (producida recombinantemente en E. coli por PeproTech GmbH, Hamburg) y VEGF165 (producida recombinantemente en células HEK en Roche Diagnostics, Alemania) . El enlace preferencial de VEGF 165 sin modificar que había sido observado con el análisis de IMPACT fue confirmado en el análisis de Elecsys. Como es obvio de la Figura 12, en el análisis Elecsys en VEGF 165 sin modificar fue detectado con una sensibilidad aproximadamente 5 veces más alta que VEGF 165 modificado.
Ejemplo 4: Estudio aleatorizado fase III en primera línea irresecable avanzado localmente, cáncer gástrico metastático de bevacizumab en combinación con quimioterapias Este ejemplo es concerniente con el análisis de resultados obtenidos de pacientes con cáncer gástrico metastático de primera línea tratado en la forma clínica AVAGAST . El objetivo primario del estudio fue determinar el beneficio clínico de agregar bevacizumab a quimioterapia para tratar cáncer gástrico, tal como es medido mediante supervivencia global (OS) . Los puntos finales secundarios incluyen supervivencia libre de avance (PFS) , velocidad de respuesta global y duración de respuesta. La quimioterapia usada en este estudio fue una combinación de capecitabina o 5-fluorouracilo (5-FU) y cisplatino.
Diseño de estudio 774 pacientes fueron reclutados en la prueba AVAGAST y fueron aleatorizados 1:1 a los siguientes dos brazos: Brazo A (387).: Capecitabina oral 1000 mg/m2 dos veces al día por 2 semanas seguido por una semana de reposo, cada tres semanas hasta el avance de enfermedad o toxicidad inmanejable o para pacientes que no se consideran apropiados para tomar capecitabina oral (por ejemplo, debido a dificultad para digerir, mala absorción u otras condiciones que podrían afectar la ingestión de medicación de medicación de capecitabina oral) , 5-fluorouracilo puede ser administrado en lugar de esto a una dosis de 800 mg/m2/día como una infusión i.v. continua durante 5 días (días 1 a 5 de cada ciclo) cada 3 semanas .
Cisplatino 80 mg/m2 como una infusión i.v. de dos horas con hiperhidratación y pre-medicación (esteroides y anti-eméticos) , cada 3 semanas por un máximo de 6 ciclos, hasta el avance de enfermedad o toxicidad inmanejable.
Brazo B (387) : Capecitabina oral 1000 mg/m2 dos veces al día por 2 semanas seguido por una. semana de reposo, cada tres semanas hasta el avance de enfermedad o toxicidad inmanejable o para pacientes que . no considerados apropiados para tomar capecitabina oral (por ejemplo debido a dificultad para digerir, mala absorción u otras condiciones que podrían afectar la ingestión de medicación de capecitabina oral) , 5-fluorouracilo puede ser administrado en lugar de esto a una dosis de 800 mg/m2/día como una infusión i.v. continua durante 5 días (días 1 a 5 de cada ciclo) cada 3 semanas.
Cisplatino 80 mg/m2 como una infusión i.v. de dos horas con hiperhidratación y pre-medicación (esteroides y antieméticos) , cada 3 semanas por un máximo de 6 ciclos, hasta el avance de enfermedad o toxicidad inmanejable.
Bevacizumab (7.5 mg/kg) cada 3 semanas hasta el avance de enfermedad o toxicidad inmanejable.
Los brazos del tratamiento fueron equilibrados en cuanto a variables de estratificación con la excepción de enfermedad avanzada (2% vs 5%) . Aproximadamente 95% de pacientes fueron metastáticos , dos tercios varones, 49% de Asia/Pacifico, 32% de Europa y 19% de las Américas.
Bevacizumab (AVASTIN®) fue suministrado como un líquido estéril claro a ligeramente opalescente preparado para administración parenteral en dos tamaños de frasco: cada 100 mg (25 mg/ml-4 mi llenos) de frasco de vidrio contenía bevacizumab con fosfato, trehalosa, polisorbate 20 y agua estéril para inyección, USP y cada 400 mg (25 mg/ml-16 mi llenos) de frasco de vidrio contenía bevacizumab con fosfato-, trehalosa, polisorbate 20 y agua estéril para inyección, USP. AVASTIN® fue administrado al extraer la cantidad necesaria para una dosis de 5 mg/kg y diluida en volumen total de 100 mi de inyección de cloruro de sodio al 0..9%, USP antes de la administración intravenosa.
Métodos Los sujetos/pacientes elegibles tenían los siguientes criterios de elegibilidad clave: Edad > 18 años, ECOG 0, l o 2 (Escala de Estatus de Desempeño ECOG) . Todos los sujetos tenían adenocarcinoma histológicamente confirmado del estómago o unión gastro-esofagal con enfermedad inoperable, avanzada localmente o metastática, ' no propensa a terapia curativa. Los sujetos pueden haber tenido ya sea enfermedad mensurable o no mensurable pero evaluable (según los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST) ) . Los sujetos que no reciben medicación de anticoagulante tuvieron un INR menor o igual a 1.5 y un PTT menor o igual a 1.5 x ULN en el transcurso de 7 días antes de la aleatorización.
Los criterios de exclusión incluían los siguientes: quimioterapia previa por cáncer gástrico avanzado localmente o metastático (los pacientes pueden haber recibido neo adyuvante previa o quimioterapia adyuvante en tanto que fuera consumada por lo menos 6 meses antes de la aleatorización) ; terapia con platino o anti-angiogénica previa (esto es, anti-VEGF o inhibidor de cinasa de tirosina de VEGFR, etc.); los pacientes con enfermedad avanzada localmente que fueron candidatos para terapia curativa (incluyendo operación y/o quimioterapia Y/o radioterapia) ; radioterapia en el transcurso de 28 días de aleatorización; procedimiento quirúrgico mayor, biopsia abierta o lesión traumática significativa en el curso de 8 días antes de la aleatorización o anticipación de la necesidad por cirugía mayor durante el curso del tratamiento de estudio (cirugía electiva planeada) ; procedimientos quirúrgicos menores en el transcurso de dos días antes de la aleatorización; evidencia de metástasis CNS en la línea de referencia; historia o evidencia después de examen físico/neurológico de enfermedad de CNS no relacionada con cáncer a no ser que sea tratada apropiadamente con terapia medica estándar, por ejemplo ataques incontrolados; función de medula ósea inapropiada, función de hígado o función renal inapropiada, hipertensión incontrolada o enfermedad cardiovascular clínicamente significativa (esto es, activa) ; infección activa que requiere antibióticos intravenosos en la aleatorizacion; historia o evidencia de diátesis de sangrado heredado o coagulopatía con el riesgo de sangrado; herida serie o no cicatrizante, ulcera péptica o fractura de hueso (cicatrizada incompletamente) ,- sangrado gastrointestinal activo historia de fístula abdominal, perforación gastro intestinal o absceso intra-abdominal en el transcurso de 6 meses de aleatorizacion,- neuropatía (deterioro de la audición y equilibrio) = grado II de acuerdo con CTCAE v 3.0; tratamiento diario crónico con aspirina o clopidogrel; tratamiento diario crónico con corticosteroides orales (esteroides inhalados' y cursos cortos de esteroides orales por anti-emesis o como un estimulante del apetito fueron permitidos) ; deficiencia de dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD) conocida e infección activa aguda o crónica con HBV o HCV.
El punto final primario del estudio fue la supervivencia global (OS) , definida como en tiempo desde la aleatorizacion hasta la muerte de cualquier causa. Los datos del tiempo al evento son comparados entre los brazos de tratamiento utilizando una prueba de logaritmo-rango estratificada. El método de Kaplan-Meier fue usado para estimar la duración de los datos al tiempo del evento. Los intervalos de confianza al 95% para el tiempo al evento mediano fueron calculados utilizando el método de Brookmeyer-Crowley. La HV para los datos del tiempo al evento fué estimada utilizando un modelo de regresión de co estratificado.
Los puntos finales secundarios incluyen supervivencia libre de avance (PFS) , velocidad de respuesta objetivo (RR) , duración de respuesta y seguridad. La supervivencia libre de avance (PFS) es definida como el tiempo desde la aleatprización al avance de enfermedad o muerte, en base a la determinación del investigador. La metodología de Kaplan-Meier fue usada para estimar la PFS mediana para cada brazo de tratamiento. En ciertas modalidades, la proporción de peligro para PFS fue estimada utilizando un modelo de regresión de cox estratificado con los mismos factores de estratificación usados en la prueba de logaritmo-rango estratificada. Los análisis de PFS en cada cohorte fueron efectuados al nivel de a = 0.05 de dos lados. Los datos del tiempo al evento fueron comparados entre brazos de tratamiento utilizando una prueba de logaritmo-rango estratificada. El método de Kaplan-Meier fue usado para estimar la duración de los datos del tiempo al evento. Los intervalos de confianza a 95% para el tiempo al evento mediano fueron calculados utilizando el método de Brookmeier-Crowley. La HR para los datos del tiempo al evento fue estimada utilizando un modelo de regresión de cox estratificado. RR es definido como el porcentaje de los pacientes que obtuvieron una respuesta completa o parcial confirmada = 28 días después de la documentación inicial de respuesta. RR en pacientes con enfermedad mensurable en la línea de referencia fue comparado con la prueba ?2 de Mantel-Haenszel estratificada. Los factores de estratificación de aleatorización fueron incluidos en todos los análisis estratificados.
Muestras de plasma sanguíneo fueron recolectadas de pacientes que participan en un estudio fase III aleatorizado que compara los resultados de agregar bevacizumab a la terapia de capecitabina/cisplatino para el tratamiento de adenocarcinoma gástrico/gastroesofagal avanzado localmente/metastático inoperable (el estudio BO20904, véase, Kang et al, J. Clin. Oncol. 2010; 28 (18S) : LBA4007) .
Una investigación del estatus de biomarcadores relacionados con angiogénesis y tumorigénesis revelo que los niveles de expresión de un biomarcador en el plasma en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador se correlaciono con un parámetro de tratamiento mejorado. En particular, los pacientes que exhiben un nivel de expresión más alto de VEGFA en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador demostraron una supervivencia global prolongada y una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de capecitabina/cisplatino .
Pacientes , muestras y métodos inmunoquimicos Un total de 774 pacientes participaron en el estudio BO20904 y toma de muestra de plasma sanguíneo para análisis de VEGF-A en el plasma fue prescrito en el protocolo.
Todas las muestras fueron obtenidas de pacientes tratados con capecitabina/cisplatino más bevacizumab o placebo. Un total de 4.9 mi fueron recolectado en un tubo de recolección de sangre S-Monovette® EDTA de 4.9 mi.
En el transcurso de 30-60 minutos de recolección de sangre, los tubos de sangre fueron colocados en la centrifuga y centrifugados 1500 g a 4°C por 15 minutos, hasta que las células y plasma estuvieron separados . Inmediatamente después de la centrifugación, el plasma fue transferido cuidadosamente a un tubo de transferencia de propileno utilizando una pipeta de plástico, siendo cuidadosos de no aspirar la interface que contiene las plaquetas en el fondo del tubo. Luego se tomaron alícuotas del plasma igualmente en dos tubos de almacenamiento (mitad de volumen cada aproximadamente 1.25 mi) utilizando una pipeta.
Una vez que el plasma estaba separado, las muestras fueron almacenados en posición vertical a -70°C. Las muestras que podrían solo ser almacenadas a -20 °C fueron embaladas a la Oficina de Muestras . de Roche central (CSO) en el transcurso d un mes después de la extracción de sangre. Todas las muestras fueron analizadas en el Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Alemania.
Todas las muestras fueron desheladas y distribuidas en alícuotas de 40 µ? a placas de micro tubo RE P de 384 cavidades en lotes de 72. Los tubos fueron sellados con un septo de aluminio y almacenados en congeladores ajustados para mantener la temperatura de -85 a -55°C hasta el análisis. Las muestras fueron analizadas en cuanto a concentraciones de VEGFA.
Muestras de plasma de 712 de los participantes estuvieron disponibles para análisis de biomarcador. Las características de referencia de los 712 pacientes en el análisis de biomarcador son provistas en la Tabla 6.
Tabla 6: Características de referencia: población de biomarcador (n = 712) Pl+CapC Bv7.5+CapC N = 357 N = 355 Sexo HOMBRE 239 ( 67%) 238 ( 67%) MUJER 118 ( 33%) 117 ( 33%) n 357 355 Etnicidad CAUCASICO 142 ( 40%) 144 ( 41%) NEGRO 8 ( 2%) 5 < 1%) ORIENTAL 188 ( 53%) 184 ( 52%) OTRO 19 ( 5%) 22 ( 6%) 357 355 Edad (años) . Media 57.6 56.5 SD 11.29 11.50 SEM 0.60 0.61 Mediana 59.0 58.0 Min-Max 22 - 82 22 - 81 357 355 Peso en kg Media 60.75 62.46 SD 13.328 13.805 SEM 0.706 0.734 Mediana 59.00 60.90 Min-Max 36.0 - 145.4 35.7 - 149.5 356 354 Altura en Media 164.5 165.3 SD 9.32 8.79 SEM 0.49 0.47 Mediana 164.0 165.0 Min-Max 138 - 192 140 - 188 356 354 Categoría de edad <65 >=65 <65 253 ( 71%) 256 ( 72%) >=65 104 ( 29%) 99 ( 28%) 357 35S Categoría de edad <40;40-65 >=65 <40 26 ( 7%) 33 ( 9%) 40-65 227 ( 64%) 223 ( 63%) >=65 104 ( 29%) 99 ( 28%) n 357 355 Categoría ECOG en la referencia 0 157 ( 44%) 164 ( 46%) >=1 200 ( 56%) 191 ( 54%) 357 355 n representa el numero de pacientes que contribuyen a estadísticas de resumen.
Los porcentajes están basadas en n (número de valores valido) .
Los porcentajes no calculados si < 10.
Análisis estadístico Se usa la mediana de la muestra para dicotomizar valores del biomaroador como bajos (debajo de la mediana) o altos (por encima de la mediana) .
La proporción de peligro del efecto del tratamiento en el sub-grupo de pacientes con altos o bajos niveles de biomarcador se estimó con análisis de regresión de cox de peligro proporcional.
Además, se usaron regresiones de cox de peligro proporcional para evaluar la asociación entre el nivel del biomarcador y el efecto del tratamiento. El modelo incluía los siguientes co-variados: tratamiento de prueba, nivel de biomarcador, termino de interacción de tratamiento por nivel de biomarcador. La prueba de ald para el término de interacción fue usada para determinar la asociación entre el nivel del biomarcador y el efecto del tratamiento. El valor de p menor de 0.05 fue considerado significativo.
Los valores reportados como debajo del limite de cuantificación (BLQ) o por encima del límite de cuantificación (ALQ) fueron introducidos en el límite inferior de cuantificación (LLQ) y en el límite superior de valores de cuantificación (ULQ) . Una transformación logarítmica de niveles de concentración fue usada en el análisis. Si se necesitaba un corte para el análisis, se usó la mediana de la muestra.
Resultados Marcadores de plasma sanguíneo Las estadísticas descriptivas de referencia de los biomarcadores son presentadas en la Tabla 7.
Tabla 7 : Estadísticas descriptivas de valores de biomarcador (referencia) La Tabla 8 presenta el análisis univariado de la asociación de los biomarcadores seleccionados con el efecto del tratamiento sobre la supervivencia global.
Tabla 8 : Asociación con efectos de tratamiento sobre la supervivencia global- (análisis univariado) En este análisis, para VEGFA, bajo VEGFA VEGFA = 111 pg/ml y alto VEGFA > 111 pg/ml fue usado.
Para VEGFA el nivel de corte fue determinado como el valor de la mediana de datos de muestra, de tal manera que el 50% de pacientes tiene alta expresión y el 50% de pacientes tienen baja expresión, según el plan de análisis predeterminado.
Los resultados de la tabla muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFA en comparación con pacientes con bajo VEGFA. Por consiguiente, VEGFA es un biomarcador predictivo independiente para el efecto de tratamiento con Bevacizumab sobre la supervivencia global .
La Tabla 9 presenta el análisis univariado de la asociación de los biomarcadores seleccionados con efecto de tratamiento sobre la supervivencia global libre de avance Tabla 9 : Asociación con efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance (Análisis univariado) En este análisis, para VEGFA, bajo VEGFA = lllpg/ral y alto VEGFA > 111 pg/ml fue usado.
Para VEGFA, el nivel de corte fue determinado como el valor mediano de datos de muestra, de tal manera que el 50% de pacientes tienen alta expresión y el 50% de pacientes tienen baja expresión, según el plan de análisis predeterminado .
Los resultados de esta tabla muestran que la proporción de peligro para el efecto de . tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFA en comparación con pacientes con bajo VEGFA. Por consiguiente, VEGFA es un biomarcador predictivo independiente para el efecto de tratamiento con Bevacizumab sobre la supervivencia global.
Ejemplo 5: Estudio aleatorizado fase III en cáncer pancreático metastático de bevacizumab en combinación con quimioterapia Pacientes con adenocarcinoma pancreático metastático fueron aleatorizados a gemcitabina-erlotinib mas bevacizumab (n = 306) o placebo (n = 301) .
Muestras de plasma sanguíneo fueron recolectadas de pacientes que participan en un estudio fase III aleatorizado que compara los resultados de agregar bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib para el tratamiento de cáncer pancreático metastático (el estudio BO17706, véase, Van Cutsem, J. Clin. Oncol'. 2009 27:2231-2237). Pacientes con adenocarcinoma pancreático metastático fueron aleatorizados a gemcitabina-erlotinib mas bevacizumab (n = 306) o placebo (n n = 301) . Los pacientes con adenocarcinoma pancreático metastático fueron asignados aleatoriamente para recibir gemcitabina (1000 mg/m2/semana) , erlotinib (100 ' mg/día) y bevacizumab (5 mg/kg cada 2 semanas) o gemcitabina, erlotinib y placebo.
Una investigación del estatus de biornareadores relacionados con angiogénesis y tumorigénesis revelo que los niveles de expresión de tres biomarcadores en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador se correlacionaba con un parámetro de tratamiento mejorado. En particular, los pacientes que exhiben un nivel de expresión más alto de VEGFA en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador, demostró una supervivencia global mejorada y una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib. Los pacientes que exhiben un nivel de expresión más alto · de VEGFR2 en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador demostró una supervivencia global prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib. Los pacientes que exhiben un nivel de expresión más alto de PLGF en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador, demostraron una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-erlotinib. También pacientes que exhiben nivel de expresión combinado más alto de VEGFA y VEGFR2 en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes de biomarcador, demostraron una supervivencia global prolongada y una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a terapia de gemcitabina-erlotinib . Además, los pacientes que exhiben nivel de expresión combinado más alto de VEGFA y PLGF en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes, demostraron una supervivencia global prolongada y una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la. terapia de gemcitabina-erlotinib. Los pacientes que exhiben un nivel de expresión combinado mas alto de VEGFA, VEGFR2 y PLGF en relación con niveles de control determinados en toda la población de pacientes, demostraron una supervivencia global prolongada y una supervivencia libre de avance prolongada en respuesta a la adición de bevacizumab a la terapia de gemcitabina-érlotinib .
Pacientes y métodos inmunoquimicos Un total de 607 pacientes participaron en el estudio B017706 y muestras de plasma sanguíneo de 224 de los participantes estuvieron disponibles para el análisis de biomarcador. Las características de referencia de los 224 pacientes en el análisis de biomarcador son provistas en la Tabla 10.
Tabla 10: Características de referencia: población de biomarcador (n = 224) VAS: Escala análoga visual del dolor KPS: Puntuación de desempeño de Karnosfky Análisis de plasma sanguíneo Muestras de plasma fueron recolectadas después de la aleatorización y antes de que cualquier tratamiento de estudio fuera dado a los pacientes y VEGFA, receptor 1 de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF 1) , VEGFR2 , PLGF y E-SELECTIN fueron medidos utilizando el análisis de IMPACT descrito en el Ejemplo 1 anterior.
Análisis estadístico La mediana de muestra fue usada para dicotomizar valores de biomarcador como bajos (por debajo de la mediana) o altos (por encima de la mediana) .
La proporción de peligro del efecto de tratamiento en el sub-grupo de pacientes con altos o bajos niveles de biomarcador fue estimada con análisis de regresión de cox de peligro proporcional .
Además, se usaron regresiones de cox de regresiones de peligro proporcional para evaluar la asociación entre el nivel del biomarcador y el efecto de tratamiento. El modelo incluía los siguientes co-variados: tratamiento de prueba, nivel de biomarcador, termino de interacción de tratamiento por nivel de biomarcador. La prueba de Wald para el término de interacción fue usada para determinar la asociación entre el nivel de biomarcador y el efecto del tratamiento. El valor de p por debajo de 0.05 fue considerado significativo.
Resultados Marcadores de plasma sanguíneo Las estadísticas descriptivas de referencia de los biomarcadores son presentadas en la Tabla 11.
Tabla 11: Estadísticas descriptivas de valores de biomarcador (Referencia) La Tabla 12 presenta el análisis univariado de la asociación de los biomarcadores seleccionados con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia global.
Tabla 12 : Asociación con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia global- (análisis univariado) En este análisis para VEGFA, bajo VEGFA <152.9 pg/ml y alto VEGFA = 152.9 pg/ml, para VEGFR2, bajo VEGFR2 < 9.9 ng/ml y alto VEGFRA > 9.9 ng/ml, y para PLGF, bajo PLGF < 36.5 pg/ml y alto PLGF = 36.5 pg/ml, fueron usados.
Para VEGFA y VEGFR2 , los niveles de corte fueron determinados como el valor de mediana de los datos de muestra, de tal manera que el 50% de pacientes tienen alta expresión y el 50% de pacientes tienen baja expresión, según el plan de análisis predeterminado. Los niveles de corte de PLGF fueron determinados como 24th percentil de los datos.
Así, el 58% de pacientes tienen alta expresión de PLGF y 42% tienen baja expresión. El corte fue determinado con el fin de incrementar la diferencia estadística entre el efecto de tratamiento y el subgrupo de nivel alto y bajo.
Los resultados de esta tabla muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFA en comparación con pacientes con bajo VEGFA. Los, resultados de esta tabla también muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente el mejor en el subconjunto de pacientes con alto VEGFR2 en comparación con pacientes con bajo VEGFR2. Por consiguiente, VEGFA y VEGFR2 son cada uno biomarcados predictivos independientes para el efecto de tratamiento con bevacizumab sobre la supervivencia global .
La Tabla 13 presenta el análisis univariado de la asociación de los biomarcadores seleccionados con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance.
Tabla 13 : Asociación con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance (análisis univariado) En este análisis para VEGFA, bajo VEGFA < 152.9 pg/ml y alto VEGFA > 152.9 pg/ml, para VEGFR2, bajo VEGFR2 < 9.9 ng/ml y alto VEGFRA > 9.9 ng/ral y para PLGF, bajo PLGF < 36.5 pg/ml y alto PLGF = 36.5pg/ml, fueron usados. Para VEGFA y VEGFR2, los niveles de corte fueron determinados como el valor de mediana de los datos de muestra, de tal manera que el 50% de pacientes tienen alta expresión y el 50% de pacientes tienen baja expresión, según el plan, de análisis predeterminado. Los niveles de corte de PLGF fueron determinados como 42th percentil de los datos. Así, el 58% de pacientes tienen alta expresión de PLGF y 42% tienen baja expresión. El corte fue determinado con el fin de incrementar la diferencia estadística entre el efecto de tratamiento y el subgrupo de nivel alto y bajo.
Los resultados de esta tabla muestran que la proporción de peligro por el éfecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de- pacientes con alto VEGFA en comparación con pacientes con bajo VEGFA. Los resultados de esta tabla' también muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con alto PLGF en comparación con pacientes con bajo PLGF. Por consiguiente, VEGFA y PLGF son cada uno biomarcados predictivos independientes para el efecto de tratamiento con bevacizumab sobre la supervivencia global .
La Tabla 14 presenta el análisis de la asociación de combinaciones de biomarcador con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia global.
Para este análisis, las siguientes ecuaciones fueron usadas : Formula 1: norm (VEGFA) +1.3*norm (VEGFR2 ) . Punto de corte= mediana o 0 Formula equivalente: VEGFA+3.3*VEGFR2. Punto de corte= mediana o 0 Y Formula 2: 0.25*norm (VEGFA) +0.21*norm (PLGF) , Punto de corte= mediana o 0 Formula equivalente: 0.19*VEGFA+0.67*PLGF, Punto de corte= mediana o 4.8 Se usó la transformación logaritmo 2 y , . log2(x,) -we¿//'c7«(log2( )) x,? norniXi) = b " ^ b ,J mad(\og2(x)) Tabla 14 : Asociación con efecto de tratamiento sobre la supervivencia global (análisis de bi-marcador) En este análisis, un nivel de expresión combinado alto de VEGFA y VEGFR2 es (Formula 1 = 0 . 10 ) y una expresión combinada baja de VEGFA y VEGFR2 es (Formula 1 < 0.10), y un nivel de expresión combinado alto VEGFA y PLGF es (Formula 2 = 0 . 042 ) y una expresión combinada baja VEGFA y PLGF es (Formula 2 0.042) .
Los resultados de esta tabla muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con la combinación de alto VEFGA y VEGFR2 en comparación con pacientes con la combinación bajo VEGFA y VEGFR2. Los resultados de esta tabla también muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con la combinación de alto VEGFA y PLGF en comparación con pacientes con la combinación de bajo VEGFA y PLGF. Por consiguiente, la combinación de VEGFA y VEGFR2 y la combinación de VEGFA y PLGF son cada una biomarcadores predictivos independientes por el efecto de tratamiento de bevacizumab sobre la supervivencia global.
La Tabla 15 presenta el análisis de la asociación de combinaciones de biomarcador con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia libre de avance.
Para este análisis se usaron las siguientes ecuaciones: Formula 1: norm (VEGFA) +1.3*norm (VEGFR2 ) . Punto de corte= mediana o 0 Formula equivalente: VEGFA+3.3*VEGFR2. Punto de corte= mediana o 0 y Formula 2: 0.25*norm (VEGFA) +0.21*norm (PLGF) , Punto de corte=mediana o 0 Formula equivalente: 0.19*VEGFA+0.67*PLGF , Punto de corte= mediana o 4.8 Se usa la transformación del algoritmo 2 y log 2 ( x ¡ ) - median (log 2 ( x )) x ¡ —> norm ( x t ) = mtfd (log 2 ( )) Tabla 15: Asociación con el efecto de tratamiento sobre supervivencia libre de avance (análisis de bi-marcador) En este análisis, un alto nivel de expresión combinado de VEGFA y VEGFR2 es (Formula 1 = -0.10) y una baja expresión combinada de VEGFA y VEGFR2 es (Formula 1 < 0.10) , y un nivel de expresión combinado alto VEGFA y PLGF es (Formula 2 = -0'.042) y una baja expresión combinada de VEGFA y PLGF es (Formula 2 < -0.042) .
Los resultados de esta tabla muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con la combinación de alto VEFGA y VEGFR2 en comparación con pacientes con la combinación bajo VEGFA y VEGFR2. Los resultados de esta tabla también muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con la combinación de alto VEGFA y PLGF en comparación con pacientes con la combinación de bajo VEGFA y PLGF. Por consiguiente, la combinación de VEGFA y VEGFR2 y la combinación de VEGFA y PLGF son cada una biomarcadores predictivos independientes por el efecto de tratamiento de bevacizumab sobre la supervivencia libre de avance.
Las Tablas 16 y 17 presentan el análisis de combinaciones de biomarcador de VEGFA, VEGFR2 y asociación de PLGF con el efecto de tratamiento sobre la supervivencia global y supervivencia libre de avance, respectivamente.
En este análisis, se usó la siguiente ecuación: Formula 3: 0.0127 * ln (PLGF+1) + 0.144 * ln (VEGFR2+1) + 0.0949 * ln (VEGFA + 1) En donde ln = logaritmo base e Tabla 16 : Asociación con efecto de tratamiento sobre la supervivencia global (análisis de tri-marcador) Tabla 17: Asociación con efecto de tratamiento sobre supervivencia libre de avance (análisis de tri-marcador) En este análisis, para la supervivencia global, un alto nivel de expresión combinado de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es. (Formula 3 = 0.837) y una baja expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (Formula 3 < 0.837) y para supervivencia libre de avance, un alto nivel de expresión combinado de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (Formula 3 = 0.837) y una baja expresión combinada de VEGFA, VEGFR2 y PLGF es (Formula 3 < 0.837) .
Los resultados de esta tabla muestran que la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con la combinación de alto VEFGA y VEGFR2 en comparación con pacientes con la combinación bajo VEGFA y VEGFR2 y PLGF. Por consiguiente, la combinación de VEGFA y VEGFR2 y la combinación y PLGF son cada una biomarcadores predictivos independientes por el efecto, de tratamiento de bevacizumab sobre la supervivencia libre de avance.
Los resultados de esta tabla también muestran que para la supervivencia global, la proporción de peligro por el efecto de tratamiento es significativamente mejor en el subconjunto de pacientes con la combinación de alto VEGFA y VEGFR2 y PLGF en comparación con pacientes con la combinación de bajo VEGFA, VEGF 2 y PLGF. Por consiguiente, la combinación de VEGFA y VEGFR2 y PLGF es un biomarcador predictivo para el efecto de tratamiento de bevacizumab sobre la supervivencia global.
Ejemplo 6: Análisis de muestras de plasma adicionales en cuanto a VEGFA Muestras de referencia de AVF107g (una prueba química controlada activa aleatorizada multicentro, fase III para evaluar la eficacia y seguridad de rhumab (bevacizumab) en combinación con quimioterapia estándar en sujetos con cáncer colorectal metastático) , AVAiL (un estudio fase III de multicentro doble ciego aleatorizado de bevacizumab en combinación con cisplatino y gemcitabina versus placebo, cisplatino y gemcitabina en pacientes con cáncer 'de pulmón de célula no pequeña no escamosa avanzado o recurrente que no han recibido quimioterapia previa) y AVOREN (un estudio fase III doble ciego aleatorizado para evaluar eficacia y seguridad de bevacizumab en combinación con interferón alfa-2a (roferon) versus interferón alfa-2a y placebo como tratamiento de primero línea administrado a pacientes nefrectomizados con carcinoma de célula renal de célula clara metastática) fueron también analizados con el análisis IMPACT descrito en el Ejemplo 1.
En el estudio AVF2107g, 380 muestras (47%) estuvieron disponibles para las re-pruebas. Los nuevos datos de VEGFA confirmaron un valor de pronóstico para VEGF-A pero no mostraron un valor predictivo potencial. Pacientes con cáncer colorectal metastático con altos niveles de VEGF-A, tal como son medidos mediante el análisis de ELISA de IMPACT, tuvieron proporciones de peligro similares para PFS (0.52 para VEGF-A alto versus 0.64 para VEGF-A bajo) y OS (0.68 para VEGFA alto vs. 0.70 para VEGF-A bajo) .
Un valor de pronóstico similar fue observado en los resultados de los re-pruebas de las 852 muestras de AVAIL (52%) . Sin embargo, los pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña con altos niveles de VEGF-A también mostraron una proporción de peligro similar en comparación con pacientes con bajos niveles de VEGF-A en el grupo de 7.5 mg/kg (0.75 versus 0.77, respectivamente para PFS y 0.89 versus 0.92 para OS). El grupo de dosis de 15 mg/kg también mostró proporciones de peligro similares para pacientes con altos niveles de VEGF-A (0.76 para PFS y 0.98 para OS) en comparación con pacientes con bajos niveles (0.96 para PFS 0.97 para OS) .
También, en la prueba de AVOREN, la re-prueba de 400 muestras de plasma de referencia (62%) no revelaron un valor predictivo potencial para VEGF-A en pacientes con carcinoma de célula renal, aunque se observó el valor de pronóstico del biomarcador. Pacientes con altos niveles de VEGF-A mostraron una proporción de peligro de 0.67 para PFS en comparación con 0.49 para pacientes con bajos niveles de VEGF-A.
La correlación del biomarcador de VEGF-A con resultados clínicos de los seis diferentes estudios de Avastin son presentados en la Tabla 18.
Bev = bevacizumab; Quimio = quimioterapia; MBC = cáncer de pecho metastático; mCRC = cáncer colorectal metastático; PFS = supervivencia libre de avance; mRCC = carcinoma de célula renal metastático; VEGF-A = Factor A de crecimiento endotelial vascular Todos los tres estudios confirmaron el valor de pronóstico de VEGF-A en el plasma, como se muestra previamente con los análisis de VEGF-A previos. Sin embargo, el valor predictivo potencial como es mostrado en AVADO, AVITA y AVAGAST no podría ser confirmado en las pruebas adicionales en tres indicaciones. Se debe notar que las muestras recolectadas en las pruebas de AVADO, AVITA y AVAGAST fueron manejadas un tanto diferentemente en comparación con las muestras recolectadas en AVADO, AVITA y AVAGAST (esto es, citrato versus EDTA, mas ciclos de congelación/deshielo en 12%-16% de las muestras, tiempo de almacenamiento más largo) . Como se muestra en el Ejemplo 7 a continuación, la recolección de plasmas a citrato o EDTA puede afectar la sensibilidad de los análisis de VEGF-A. Las diferencias exactas entre las muestras son mostradas en la Tabla 19 a continuación.
Tabla 19: Condiciones de almacenamiento de las muestras Por consiguiente, la carencia de valores predictivos en tos tres estudios no niega la posibilidad de que VEGF-A puede actuar como marcador predictivo en MBC. Tampoco se puede descartar que el hallazgo ese especifico de indicación. Las diferencias entre los dos análisis han revelado una diferencia en sensibilidad del análisis de segunda generación para VEGF. Sin estar limitados por la teoría, puede haber un efecto biológico diferente y abundancia de diferentes formas modificados y sin modificar de VEGF en diferentes indicaciones .
En resumen, el análisis de IMPACT ha mostrado un valor de pronóstico consistente para VEGF-A en el plasma para las indicaciones probadas. Además, esta prueba genero resultados consistentes en AVADO, AVITA y AVAGAST, demostrando un valor predictivo para bevacizumab en estas indicaciones, en tanto que las re-pruebas de las muestras de plasma en las pruebas AVF2107g, AVAiL y AVOREN no mostró tal correlación, sugiriendo ningún valor predictivo potencial de la expresión de VEGF-A en el plasma en estas tres otras indicaciones. Sin embargo, se debe notar que las diferencias en las muestras podría haber afectado estas diferencias en los resultados; una de tales diferencias es demostrada en el Ejemplo 7 a continuación. Sin estar limitados por la teoría, puede también haber un efecto biológico diferente y la abundancia de diferentes formas modificas y sin modificar de VEGF en diferentes indicaciones, dado que el análisis de IMPACT favorece la detección de VEGF sin modificar.
Ejemplo 7: Detección de VEGF sin modificar en el plasma recolectado en citrato de Na y EDTA Muestras de plasma apareadas fueron recolectadas de pacientes con cáncer de pecho localmente recurrente o metastático HER2+ tanto en el tubo de recolección de Monovette de EDTA (5 mi) y citrato (5 mi) . En el transcurso de 30 minutos de recolección de sangre, los tubos de sangre fueron colocados en la centrifuga y centrifugados a 1500 g a temperatura ambiente por 10 minutos hasta que las células y el plasma estuvieron separados . Inmediatamente después de la centrifugación, el plasma fue transferido cuidadosamente a un tubo de transferencia de polipropileno y luego se tomaron alícuotas a dos tubos de almacenamiento (la mitad del volumen cada uno de aproximadamente 1.25 mi) utilizando una pipeta. Los niveles de VEGF-A en las muestras fueron medidos utilizando el análisis de IMPACT descrito anteriormente. Como se muestra en la Figura 21, la concentración de VEGFA es alrededor de 40% más alta para muestras de plasma recolectadas y almacenadas en EDTA en comparación con muestras de plasma recolectadas y almacenadas en citrato con una correlación de Spearman para el MC de EDTA-citrato de alrededor de 0.8 para muestras de referencia recolectadas antes del tratamiento.
Aunque la invención ha sido descrita en algún detalle como ilustración y .ejemplo por propósitos de claridad y entendimiento, la descripción y ejemplos no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la invención. Las revelaciones de todas las patentes, solicitudes de patentes, referencias científicas y números de acceso de Genbank citados en la presente son incorporados expresamente por referencia en su totalidad para todos los propósitos como si cada patente, solicitud de patente, referencia científica y acceso de Genbank fuera incorporada especifica e individualmente por referencia.

Claims (33)

REIVINDICACIONES
1. Un método para identificar un paciente que se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF, el método está caracterizado porque comprende: determinar el nivel de expresión de VEGF sin modificar en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF sin modificar en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con la terapia anti-cáncer .
2. Un método para predecir la responsividad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, el método está caracterizado porque comprende: determinar el nivel de expresión de VEGF sin modificar en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF sin modificar en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente es más probable de ser responsivo al tratamiento con la terapia anti-cáncer.
3. Un método para determinar la probabilidad de que un paciente con cáncer exhibirá beneficio de la terapia anticáncer que comprende un antagonista ,de VEGF-A, el método esta caracterizado porque comprende: determinar el nivel de expresión de VEGF sin modificar en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF sin modificar en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente tiene probabilidad incrementada.de beneficiarse de la terapia anti-cáncer.
4. Un método para optimizar la eficacia terapéutica de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, el método está caracterizado porque comprende: determinar el nivel de expresión de VEGF sin modificar en una muestra obtenida del paciente, en donde el nivel de VEGF sin modificar en la muestra obtenida del paciente en o por encima de un nivel de referencia indica que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer.
5. Un método para tratamiento de cáncer en un paciente, el método está caracterizado porque comprende: determinar que una muestra obtenida del paciente tiene un nivel de VEGF sin modificar en o por encima del nivel de VEGF sin modificar en una muestra de referencia. administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente, mediante lo cual el cáncer es tratado.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de pecho, cáncer pancreático, cáncer gástrico y cáncer de pulmón.
. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de : sangre entera, plasma, suero y combinaciones de los mismos.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el nivel de VEGF sin modificar es un nivel de proteína.
9. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque el nivel de proteína es determinado al medir el nivel de proteína en el plasma.
10. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque el nivel en el plasma de VEGF sin modificar en la muestra obtenida del paciente que está en o por encima del nivel de VEGF sin modificar en una muestra de referencia indica que el paciente se puede beneficiar de la terapia anti-cáncer, es más probable de ser responsivo a la terapia anti-cáncer o tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 , caracterizado porque comprende además una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A a dicho paciente.
12. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo.
13. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo es bevacizumab.
14. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque comprende además administrar una cantidad efectiva de una segunda terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos.
15. El método de la reivindicación 14 , caracterizado porque la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente.
16. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente .
17. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la tercera terapia comprende además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionado del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos.
18. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente .
19. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la tercera terapia anti-cáncer, segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente
20. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo.
21. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo es bevacizumab.
22. El método de la reivindicación' 5, caracterizado porque la terapia anti-cáncer comprende además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos .
23. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente.
24. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente
25. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la terapia anti-cáncer comprende además administrar una cantidad efectiva de una tercera terapia anti-cáncer seleccionada del grupo que consiste de: un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento y agentes anti-angiogénicos y combinaciones de los mismos.
26. El método de la reivindicación 25, caracterizado porque la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente .
27. El método de la reivindicación 25, caracterizado porque la tercera terapia anti-cáncer, la segunda terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencraímente
28. un kit para determinar si un paciente se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, el kit está caracterizado porque comprende : un . conjunto de compuestos aptos de enlazarse específicamente a VEGF sin modificar y instrucciones para usar . dichos compuestos para determinar el nivel de VEGF sin modificar para predecir la responsividad de un paciente al tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A, en donde el nivel de VEGF sin modificar en o por encima del nivel de VEGF sin modificar en una muestra de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de VEGF-A.
29. El kit de la reivindicación 28, caracterizado porque los compuestos son proteínas .
30. El kit de la reivindicación 29, caracterizado porque las proteínas son anticuerpos.
31. Un conjunto de compuestos para detectar niveles de VEGF sin modificar, el conjunto está caracterizado porque comprende : por lo menos un compuesto de enlazarse específicamente a VEGF sin modificar.
32. El conjunto de compuesto de la reivindicación 31, caracterizado porque los compuestos son proteínas.
33. El conjunto de compuesto de la reivindicación 32, caracterizado porque las proteínas son anticuerpos.
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