KR20150024342A

KR20150024342A - 유방암을 치료하기 위한 베바시주맙 조합 요법에 대한 혈장 바이오마커

Info

Publication number: KR20150024342A
Application number: KR20147035874A
Authority: KR
Inventors: 우르슐라 클라우세; 니콜라 무어; 셀린 팔라우드; 스테판 쉐러; 노르베르트 빌트
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2012-06-26
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2015-03-06
Also published as: RU2015102026A; EP2864788A1; BR112014032456A2; JP2015522815A; CA2871385A1; WO2014001232A1; MX2014014821A; CN104364655A; HK1202334A1

Abstract

본 발명은 HER2 양성 유방암, 특히 국소 재발성 또는 전이성 HER2 양성 유방암으로 진단된 환자의 대조군 수준에 비해 E-셀렉틴, ICAM-1 또는 VEGFR-3의 발현 수준, 특히 혈장 발현 수준을 측정하여 화학치료 요법에 베바시주맙(아바스틴(Avastin: 등록상표))을 첨가함으로써 HER2 양성 유방암, 특히 국소 재발성 또는 전이성 HER2 양성 유방암을 앓고 있는 환자의 화학치료 요법의 치료 효과를 개선하는 방법을 제공한다.

Description

유방암을 치료하기 위한 베바시주맙 조합 요법에 대한 혈장 바이오마커{BLOOD PLASMA BIOMARKERS FOR BEVACIZUMAB COMBINATION THERAPIES FOR TREATMENT OF BREAST CANCER}

본 발명은 유방암으로 진단된 환자가 항-VEGF 항체를 포함하는 항암 요법에 의한 치료로부터 가장 이익을 얻을 것인지를 확인하는 방법에 관한 것이다.

혈관신생은 암 발생과 같은 양성 및 악성 질환에 원인이 되고, 특히 암에서, 원발성 종양 성장, 침습 및 전이에 필수적이다. 성장하기 위해, 종양은 혈관신생 전환이 일어나야 한다. 상기 혈관신생 전환을 유도하기 위해서는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 필요하다. VEGF 및 VEGF 경로내 유전자는 암 진행의 중요한 매개체로 간주된다. VEGF 유전자족은 태반 성장 인자(PlGF), VEGFB, VEGF-C, VEGFD를 포함하는 VEGF에 대한 상동체인, VEGF-A로도 지칭되는 VEGF 유전자; VEGFR-1 및 VEGFR-2(각각 FLT1 및 FLK1/KDR로도 지칭된다)를 포함한 VEGF 수용체; 저산소증 유도 인자 HIF1, HIF2를 포함한 VEGF 유도인자; 및 산소 센서 PHD1, PHD2 및 PHD3을 포함한다.

암세포 성장 및 전이에서 상기 경로의 중요성은 암 치료에 사용하기 위한 항-혈관신생제의 개발을 이끌었다. 상기 치료는, 특히 베바시주맙, 페가프타닙, 수니티닙, 소라페닙 및 바탈라닙을 포함한다. 베바시주맙과 같은 혈관신생 억제제를 사용하여 수득된 상당히 연장된 생존기간에도 불구하고, 환자들은 여전히 암으로 쓰러지고 있다. 또한, 모든 환자가 혈관신생 억제제 치료에 반응하는 것은 아니다. 비-반응성의 기초가 되는 메카니즘은 알려지지 않고 있다. 게다가, 혈관신생 억제제 치료는 위장 천공, 혈전증, 출혈, 고혈압 및 단백뇨와 같은 부작용과 관련된다.

따라서, 어떤 환자가 혈관신생 억제제 치료에 특히 잘 반응하는지를 측정하는 방법이 요구된다.

혈관신생 및 종양형성에 관한 바이오마커의 상태에 대한 연구는, 전체 바이오마커 환자 집단에서 측정된 기준 수준에 대한 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3의 발현 수준이 유방암 환자에서 개선된 치료 결과와 상관됨을 밝혔다. 특히, 전체 바이오마커 환자 집단에서 측정된 기준 수준에 비해 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3의 증가된 발현 수준을 나타내는 환자는 트라스투주맙과 도세탁셀의 조합 화학치료에 베바시주맙의 첨가에 대해 연장된 무진행 생존기간을 입증하였다.

따라서, 본 발명은 유방암으로 진단된 환자 샘플 중 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하고, 이를 기준 수준과 비교함으로써 상기 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 민감한지를 측정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유방암으로 진단된 환자의 치료를 위해 항-VEGF 항체, 예컨대, 베바시주맙을 포함하고 기준 수준에 비해 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 증가된 발현 수준을 갖는 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유방암으로 진단된 환자 샘플에서 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 기준으로, 항-VEGF 항체, 예컨대, 베바시주맙을 첨가함으로써 상기 환자의 화학요법을 포함하는 항암 요법의 치료 효과를 개선하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시양태는 유방암으로 진단된 환자가 항-VEGF 항체를 포함하는 항암 요법에 의해 더욱 또는 덜 적절하게 치료되는지를 측정하는 시험관내 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 유방암으로 진단된 환자로부터 유도된 샘플에서 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계, 및 (b) 상기 (a)에 따른 발현 수준에 근거하여 항-VEGF 항체를 포함하는 항암 요법에 의해 환자가 더욱 또는 덜 적절하게 치료되는지를 확인하는 단계를 포함하고, 이때 기준 수준 이상에서 상기 바이오마커의 발현 수준은, 환자가 항암 요법으로 더욱 적절하게 치료됨을 나타내거나, 기준 수준 미만의 상기 바이오마커의 발현 수준은, 환자가 항암 요법으로 덜 적적하게 치료됨을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 환자가 항암 요법에 의해 적절하게 치료되는지를 무진행 생존기간에 관해 측정된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 환자를 항암 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항암 요법은 항-VEGF 항체, 항-HER2 항체 및 탁산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다. 일부 실시양태에서, 항-HER2 항체는 트라스투주맙이다. 일부 실시양태에서, 탁산은 도세탁셀 또는 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준은 단백질 발현 수준이다. 일부 실시양태에서, 환자로부터 유도된 샘플은 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 E-셀렉틴이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 ICAM-1이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 VEGFR-3이다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 유방암으로 진단된 환자를 위한 치료를 선택하는 시험관내 방법이다. 상기 방법은 (a) 상기 환자로부터의 생물학적 샘플을 분석함으로써, 환자가 기준 수준 이상에서 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 가짐을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정에 근거하여, 항-VEGF 항체를 포함하는 항암 요법을 포함하는 치료를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자가 항암 요법에 의해 적절하게 치료되는지를 무진행 생존기간의 관점에서 측정된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 환자를 항암 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자는 이전에 화학치료 또는 방사선 치료를 받지 않았다. 일부 실시양태에서, 항암 요법은 항-VEGF 항체, 항-HER2 항체 및 탁산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다. 일부 실시양태에서, 항-HER2 항체는 트라스투주맙이다. 일부 실시양태에서, 탁산은 도세탁셀 또는 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준은 단백질 발현 수준이다. 일부 실시양태에서, 환자로부터 유도된 샘플은 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 E-셀렉틴이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 ICAM-1이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 VEGFR-3이다.

본 발명의 추가 실시양태는 유방암으로 진단된 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 민감한지를 측정하는 시험관내 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 유방암으로 진단된 환자로부터 유래된 샘플에서 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계, 및 (b) 상기 (a)에 따른 발현 수준에 근거하여 환자가 화학 치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 민감함을 확인하는 단계를 포함하고, 이때 기준 수준 이상에서 상기 바이오마커의 발현 수준은, 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 민감함을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 환자가 항암 요법에 의해 적절하게 치료되는지를 무진행 생존기간의 관점에서 측정된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 환자를 항암 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자는 이전에 화학치료 또는 방사선 치료를 받지 않았다. 일부 실시양태에서, 항암 요법은 항-VEGF 항체, 항-HER2 항체 및 탁산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다. 일부 실시양태에서, 항-HER2 항체는 트라스투주맙이다. 일부 실시양태에서, 탁산은 도세탁셀 또는 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준은 단백질 발현 수준이다. 일부 실시양태에서, 환자로부터 유도된 샘플은 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 E-셀렉틴이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 ICAM-1이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 VEGFR-3이다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 유방암으로 진단된 환자를 위한 항암 요법을 선택하는 시험관내 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 상기 환자로부터 유래된 생물학적 샘플을 분석함으로써, 환자가 기준 수준 이상에서 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 가짐을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정에 근거하여, 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법을 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자가 항암 요법에 의해 적절하게 치료되는지를 무진행 생존기간의 관점에서 측정된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 환자를 항암 요법으로 치료함을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자는 이전에 화학치료 또는 방사선 치료를 받지 않았다. 일부 실시양태에서, 항암 요법은 항-VEGF 항체, 항-HER2 항체 및 탁산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다. 일부 실시양태에서, 항-HER2 항체는 트라스투주맙이다. 일부 실시양태에서, 탁산은 도세탁셀 또는 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준은 단백질 발현 수준이다. 일부 실시양태에서, 환자로부터 유도된 샘플은 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 E-셀렉틴이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 ICAM-1이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 VEGFR-3이다.

본 발명의 추가 또 다른 실시양태는 유방암으로 진단된 환자의 치료를 위한 항-VEGF 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 이때 상기 환자는 본원에 기재된 임의의 방법에 따른 항-VEGF 항체를 포함하는 항암 요법으로 더욱 적절하게 치료됨을 확인하였다.

본 발명의 추가 또 다른 실시양태는 유방암으로 진단된 환자의 치료를 위한 항-VEGF 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 이때 상기 환자는 본원에 기재된 임의의 방법에 따른 항-VEGF 항체를 포함하는 항암 요법으로 더욱 적절하게 치료됨이 확인된다.

본 발명의 추가 실시양태는 유방암으로 진단된 환자의 치료를 위한 항-VEGF 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 이때 상기 환자는 본원에 기재된 임의의 방법에 따른 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 민감함을 확인하였다.

본 발명의 추가 실시양태는 유방암으로 진단된 환자의 치료를 위한 항-VEGF 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 이때 상기 환자는 본원에 기재된 임의의 방법에 따른 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 민감함이 확인된다.

본 발명의 추가 또 다른 실시양태는 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 검출하기 위한 화합물 세트를 포함하고, 상기 세트는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함으로써 유방암으로 진단된 환자에서 화학치료 요법을 포함하는 항암 요법의 치료 효과를 개선하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 양성 유방암으로 진단된 환자로부터 유도된 샘플에서 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 (a)에 따른 발현 수준에 근거하여 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 민감함을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 (b)에 따른 화학요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 민감한 것으로 확인된 환자에게 효과량의 항-VEGF 항체와 효과량의 화학치료 요법을 조합하여 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 기준 수준 이상에서 상기 바이오마커의 발현 수준은, 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 민감함을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 환자가 항암 요법에 의해 적절하게 치료되는지를 무진행 생존기간의 관점에서 측정된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 환자를 항암 요법으로 치료함을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자는 이전에 화학치료 또는 방사선 치료를 받지 않았다. 일부 실시양태에서, 항암 요법은 항-VEGF 항체, 항-HER2 항체 및 탁산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다. 일부 실시양태에서, 항-HER2 항체는 트라스투주맙이다. 일부 실시양태에서, 탁산은 도세탁셀 또는 파클리탁셀이다. 일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준은 단백질 발현 수준이다. 일부 실시양태에서, 환자로부터 유도된 샘플은 혈장 샘플이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 E-셀렉틴이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 ICAM-1이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 VEGFR-3이다.

1. 정의

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "투여" 또는 "투여하는"은 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 치료 또는 의료 개입을 필요로 하는 환자에게 약학 조성물, 예를 들면, 혈관신생 억제제의 투여를 의미한다. 투여의 비제한적 경로로는 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소, 피내, 비강내 또는 기관지내 투여(예를 들면, 흡입에 의해 수행되는 바와 같은)가 포함된다. 본 발명에 있어서 비경구 투여, 예를 들면, 정맥내 투여가 특히 바람직하다.

용어 "항-혈관신생제" 또는 "혈관신생 억제제"는 혈관신생, 혈관형성 또는 바람직하지 않은 혈관 투과성을 직접적 또는 간접적으로 억제하는 저분자량 물질, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 분리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 이의 접합체 또는 융합 단백질을 지칭한다. 항-혈관신생제는 혈관신생 인자 또는 이의 수용체에 결합하고 이의 혈관신생 활성을 차단하는 약제를 포함함을 이해해야 한다. 예를 들면, 항-혈관신생제는 명세서 전체에 걸쳐 정의되거나 당해 분야에 공지된 바와 같은 혈관신생제에 대한 항체 또는 다른 길항물질, 예를 들면, VEGF-A 또는 VEGF-A 수용체(예를 들면, KDR 수용체 또는 Flt-1 수용체)에 대한 항체, VEGF-트랩, 항-PDGFR 억제제, 예를 들면, 글리벡(Gleevec: 등록상표)(이마티닙 메실레이트(Imatinib Mesylate))이나, 이들로 한정되지는 않는다. 항-혈관신생제는 또한 천연 혈관신생 억제제, 예를 들면, 안지오스타틴, 엔도스타틴 등을 포함한다(예를 들면, 문헌[Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-239 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)(예를 들면, 악성 흑색종에서 항-혈관신생 치료를 열거하고 있는 표 3)]; 문헌[Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5:1359-1364 (1999)]; 문헌[Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(예를 들면, 알려진 항혈관신생 인자를 열거하고 있는 표 2)]; 및 문헌[Sato. Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)(예를 들면, 임상 시험에 사용된 항-혈관신생제를 열거하고 있는 표 1)] 참조).

용어 "항체"는 본원에서 가장 광의로 사용되고, 단클론 및 다클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체), 키메라 항체, CDR 이식된 항체, 인간화 항체, 카멜화(camelized) 항체, 단일쇄 항체 및 항체 단편 및 단편 구조물, 예를 들면, F(ab')₂ 단편, Fab-단편, Fv-단편, 단일쇄 Fv-단편(scFv), 이중특이성 scFv, 디아바디(diabody), 단일 도메인 항체(dAb) 및 미니바디(minibody)를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.

본원에서 사용된 용어 "VEGF" 또는 "VEGF-A"는 예를 들면, 문헌[Leung et al. (1989) Science 246:1306] 및 문헌[Houck et al. (1991) Mol . Endocrin, 5:1806]에 기재된 바와 같이 예를 들면, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련된 121-, 189-, 및 206-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자와 함께 원생 대립형질 및 문헌[Ferrara Mol . Biol . Cell 21:687 (2010)]에 기재된 바와 같은 VEGF₁₆₅의 플라스민 절단에 의해 생성된 110-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자를 포함하는 이의 가공된 형태를 지칭한다. 용어 "VEGF"는 또한 비인간 종, 예컨대, 마우스, 래트 또는 영장류로부터의 VEGF를 지칭한다. 때때로 특정 종으로부터의 VEGF는 예컨대, 인간 VEGF에 대하여 hVEGF, 뮤린 VEGF에 대하여 mVEGF 등의 용어로 나타낸다. 용어 "VEGF"는 또한 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 아미노산 1 내지 109를 포함하는 폴리펩티드의 절두된 형태를 지칭하기 위해 사용된다. VEGF의 임의의 형태에 대한 참조는 예를 들면, "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF₁₆₅"로 본원에서 확인될 수 있다. "절두된" 원생 VEGF에 대한 아미노산 위치는 원생 VEGF 서열에 나타낸 바와 같이 넘버링된다. 예를 들면, 절두된 원생 VEGF에서 아미노산 위치 17(메티오닌)은 또한 원생 VEGF에서 위치 17(메티오닌)이다. 절두된 원생 VEGF는 원생 VEGF에 필적하는 KDR 및 Flt-1 수용체에 대한 결합 친화력을 갖는다.

"VEGF 생물학적 활성"은 임의의 VEGF 수용체 또는 임의의 VEGF 신호전달 활성, 예컨대, 정상 및 비정상 혈관형성 및 맥관형성 둘다의 조절에 결합(문헌[Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev . 18:4-25]; 문헌[Ferrara (1999) J. Mol . Med . 77:527-543]); 배아의 맥관형성 및 혈관형성을 촉진(문헌[Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439]; 문헌[Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442]); 및 자성 생식관에서 순환 혈관 증식, 및 골 성장 및 연골 형성을 위해 조절(문헌[Ferrara et al. (1998) Nature Med . 4:336-340]; 문헌[Gerber et al. (1999) Nature Med . 5:623-628])함을 포함한다. 혈관형성 및 맥관형성 중 혈관형성 인자 이외에, 다면 발현성 성장 인자로서 VEGF는 다른 생리적 과정, 예컨대, 내피 세포 생존, 혈관 투과성 및 혈관확장, 단핵세포 주화성 및 칼슘 유입(상기 문헌[Ferrara and Davis-Smyth (1997)], 및 문헌[Cebe-Suarez et al. Cell. Mol . Life Sci . 63:601-615 (2006)])에서 다중 생물학적 효과를 나타낸다. 더욱이, 최근 연구는 약간의 비내피 세포 유형, 예컨대, 막망 색소 상피 세포, 췌장 관 세포 및 슈반 세포에서 VEGF의 분열촉진 효과를 보고하였다(문헌[Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol . 164:385-394]; 문헌[Oberg-Welsh et al. (1997) Mol . Cell . Endocrinol. 126:125-132]; 문헌[Sondell et al. (1999) J. Neurosci . 19:5731-5740].

"VEGF 길항제" 또는 "VEGF-특이적 길항제"는 VEGF에 결합할 수 있거나, VEGF 발현 수준을 감소시킬 수 있거나, 또는 비제한적으로, 하나 이상의 VEGF 수용체에 결합하는 VEGF, VEGF 매개된 혈관형성 및 내피 세포 생존 또는 증식을 포함하는 VEGF 생물학적 활성을 중성화하거나, 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나, 감소시키거나, 개입할 수 있는 분자를 지칭한다. 본 발명의 방법에 유용한 VEGF-특이적 길항제는 VEGF, 항-VEGF 항체 및 이의 항원-결합 단편, VEGF에 특이적으로 결합함으로써 하나 이상의 수용체, 융합 단백질(예를 들면, VEGF-Trap(레게네론(Regeneron))), 및 VEGF₁₂₁-겔로닌(페레그린(Peregrine))에 이의 결합을 격리시키는 수용체 분자 및 유도체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함한다. VEGF-특이적 길항제는 또한 VEGF 폴리펩티드의 길항제 변이체, VEGF에 유도된 안티센스 핵염기 올리고머, VEGF에 유도된 소 RNA 분자, RNA 앱타머, 펩티바디, 및 VEGF에 대한 리보자임을 포함한다. VEGF-특이적 길항제는 또한 VEGF에 결합하는 비펩티드 소 분자를 포함하고 VEGF 생물학적 활성을 차단하거나, 억제하거나, 제거하거나 감소시키거나 개입할 수 있다. 따라서, 용어 "VEGF 활성"은 특이적으로 VEGF의 VEGF 매개된 생물학적 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, VEGF 길항제는 VEGF의 발현 수준 또는 생물학적 활성의 10% 이상, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 이상을 감소시키거나 억제한다.

"항-VEGF 항체"는 충분한 친화력 및 특이성으로 VEGF에 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 선택된 항체는 통상적으로 VEGF에 대한 충분한 결합 친화력을 가고, 예를 들면, 상기 항체는 100 nM 내지 1 pM의 K_d 값을 갖는 hVEGF와 결합할 수 있다. 항체 친화력은 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명 기반 분석법(예를 들면, PCT출원공개 제 2005/012359 호에 기재된 바와 같은 비아코어(BIAcore) 분석법); 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA); 및 경쟁 분석법(예를 들면, RIA)에 의해 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 수반되는 질환 또는 질병을 표적화하고 그를 저해하는 치료제로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 항체는, 예를 들면, 치료제로서 이의 효과를 평가하기 위해 다른 생물 활성 분석법에 적용될 수 있다. 상기 분석법은 당해 분야에 공지되어 있고, 항체에 대한 표적 항원 및 목적한 용도에 따라 달라진다. 예로는 HUVEC 억제 분석법; 종양 세포 성장 억제 분석법(예를 들면, 국제특허출원공개 제 89/06692 호에 기재된 바와 같음); 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC) 및 보체-매개 세포독성(CDC) 분석법(미국특허 제 5,500,362 호); 및 길항 활성 또는 조혈 분석법(국제특허출원공개 제 95/27062 호 참조)이 포함된다. 항-VEGF 항체는 통상적으로 VEGFB 또는 VEGF-C와 같은 다른 VEGF 상동체에 결합하지 않으며, P1GF, PDGF 또는 bFGF와 같은 다른 성장 인자에도 결합하지 않을 것이다. 일 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생성된 단클론 항-VEGF 항체 A4.6.4로서 동일한 에피토프에 결합하는 단클론 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 비제한적으로 베바시주맙(BV; 아바스틴(AVASTIN: 상표))로서 공지된 항체를 포함하는 문헌[Presta et al., Cancer Res . 57:4593-4599 (1997)]에 따라 제조된 재조합 인간화 항-VEGF 단클론 항체이다.

또한 "rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴(상표)"으로서 공지된 항-VEGF 항체 "베바시주맙(BV)"은 문헌[Presta et al. (1997) Cancer Res . 57:4593-4599]에 따라 제조된 재조합 인간화된 항-VEGF 단클론 항체이다. 이는 이의 수용체에 대한 인간 VEGF의 결합을 차단하는 뮤린 항-hVEGF 단클론 항체 A4.6.1로부터 돌연변이된 인간 IgG1 프레임워크 영역 및 항원-결합 상보성-측정 영역을 포함한다. 프레임워크 영역의 대부분을 포함하는 베바시주맙의 약 93%의 아미노산 서열은 인간 IgG1로부터 유도되고, 약 7%의 서열은 뮤린 항체 A4.6.1로부터 유도된다. 베바시주맙은 약 149,000 달톤의 분자 질량을 갖고 글라이코실화된다. 베바시주맙 및 다른 인간화된 항-VEGF 항체는 전체가 참고로서 본원에 명백하게 혼입된 2005년 2월 26일자 미국특허 제 6,884,879 호에 추가로 기재된다.

용어 "암"은 전형적으로 제어되지 않는 세포 증식을 특징으로 하는, 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예로는 다음이 포함된다: 편평세포암, 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평상피암 포함), 복막암, 간세포암, 위암(위장관암 포함), 췌장암(전이성 췌장암 포함), 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암(liver cancer), 방광암, 간암(hepatoma), 유방암(국소 진행성, 재발성 또는 전이성 HER-2 음성 유방암 및 국소 재발성 또는 전이성 HER-2 양성 유방암 포함), 결장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 침샘암, 신장암 또는 신세포암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암 뿐 아니라, B-세포 림프종(저등급/여포성 비-호지킨(non-Hodgkin) 림프종(NHL); 소림프구성(SL) NHL; 중간 등급/여포성 NHL; 중간 등급 확산성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 골수성 NHL; 고등급 소 비-분할 세포 NHL; 거대(bulky) 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia) 포함); 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 골수성 백혈병(ALL); 모낭 세포성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 및 이식후 림프증식성 질환(PTLD), 및 모반증과 관련된 이상 혈관 증식, 부종(예를 들면, 뇌종양과 관련된 부종), 및 메이그스(Meigs) 증후군.

"생리학적 또는 병리학적 혈관신생 이상"의 예로는 고등급 신경교종, 교모세포종, 렌두-오슬러(M. Rendu-Osler) 질환, 폰-히펠-린다우(von-Hippel-Lindau) 질환, 혈관종, 건선, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 안구내 신혈관형성, 류마티스성 관절염, 자궁내막염, 죽상동맥경화증, 심근허혈, 말초허혈, 뇌허혈 및 상처 치유가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.

용어 "화학치료제" 또는 "화학치료 요법"은 항암 치료 효과를 제공할 수 있고 화학 약제 또는 생물 약제일 수 있는, 특히 암 또는 종양 세포를 저해할 수 있는 임의의 활성 약제를 포함한다. 특정 활성 약제는 악성 세포의 발생, 성숙 또는 증식을 억제하거나 방지하는 항-신생물(화학독성 또는 화학물질환경조절) 약제로 작용하는 것들이다. 화학치료제의 예로는 다음이 포함된다: 알킬화제, 예를 들면, 질소 머스타드(예를 들면, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란 및 클로람부실), 니트로소우레아(예를 들면, 카무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU) 및 세무스틴(메틸-CCNU)), 에틸렌이민/메틸멜라민(예를 들면, 트라이에틸렌멜라민(TEM), 트라이에틸렌, 티오포스포르아미드(티오테파), 헥사메틸멜라민(HMM, 알트레타민)), 알킬 설포네이트(예를 들면, 부설판) 및 트라이아진(예를 들면, 다카바진(DTIC)); 항대사물질, 예를 들면, 폴산 유사체(예를 들면, 메토트렉세이트, 트라이메트렉세이트), 피리미딘 유사체(예를 들면, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 플루오로데옥시우리딘, 겜시타빈, 시토신 아라비노시드(AraC, 시타라빈), 5-아자시티딘, 2,2'-다이플루오로데옥시시티딘), 및 퓨린 유사체(예를 들면, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 아자티오프린, 2'-데옥시코포마이신(펜토스타틴), 에리트로하이드록시노닐아데닌(EHNA), 플루다라빈 포스페이트, 및 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈, 2-CdA)); 천연 산물로부터 개발된 항유사분열 약물(예를 들면, 파클리탁셀, 빈카 알칼로이드(예를 들면, 빈블라스틴(VLB), 빈크리스틴 및 비노렐빈), 도세탁셀, 에스트라무스틴 및 에스트라무스틴 포스페이트), 에피포도필로톡신(예를 들면, 에토포시드, 테니포시드), 항생물질(예를 들면, 액티노마이신 D, 다우노마이신(루비도마이신), 다우노루비콘, 독소루비신, 에피루비신, 미토잔트론, 이다루비신, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신), 미토마이신 C, 액티노마이신), 효소(예를 들면, L-아스파라기나제), 및 생물 반응 조절제(예를 들면, 인터페론-알파, IL-2, G-CSF, GM-CSF); 백금 배위 착물을 포함하는 복합제(miscellaneous agent)(예를 들면, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴), 안트라센디온(예를 들면, 미토잔트론), 치환된 우레아(즉, 하이드록시우레아), 메틸하이드라진 유도체(예를 들면, N-메틸하이드라진(MIH), 프로카바진), 부신피질 억제제(예를 들면, 미토테인(o,p'-DDD), 아미노글루테티미드); 호르몬 및 부신피질스테로이드 길항물질을 포함한 길항물질(예를 들면, 프레드니손 및 등가물, 덱사메타손, 아미노글루테티미드), 프로게스틴(예를 들면, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트), 에스트로겐(예를 들면, 다이에틸스틸베스트롤, 에티닐 에스트라디올 및 이의 등가물); 항에스트로겐(예를 들면, 타목시펜), 안드로겐(예를 들면, 테스토스테론 프로피오네이트, 플루옥시메스테론 및 이의 등가물), 항안드로겐(예를 들면, 플루타미드, 고나도트로핀-방출 호르몬 유사체, 류프롤리드), 비-스테로이드성 항안드로겐(예를 들면, 플루타미드), 상피세포 성장 인자 억제제(예를 들면, 에를로티닙, 라파티닙, 게피티닙), 항체(예를 들면, 트라스투주맙), 이리노테칸, 및 류코보린과 같은 기타 약제. 국소 재발성 또는 전이성 HER2 양성 유방암의 치료를 위해, 베바시주맙과 함께 투여하기 위한 화학치료제 또는 화학치료 양생법으로는 카페시타빈, 파클리탁셀, 도세탁셀 및 타르스투주맙 및 이의 혼합물이 포함된다(또한 본원에 제공된 실시예 참조).

용어 "도세탁셀"은 유리 튜불린에 결합하고 튜블린의 안정한 미세소관으로의 조립을 촉진하는 동시에 이의 조립을 억제하는 항신생물제이다. 이는 정상적인 기능을 갖지 않는 미세소관 다발(bundle)의 생성 및 미세소관의 안정화를 유도하여, 세포 주기의 M-기에서 세포를 차단하고 세포 사멸을 유도한다.

용어 "효과량"은 약물 단독의 또는 다른 약물 또는 치료 요법과 함께 포유동물에서 질환 또는 질병을 치료하는데 효과적인 양을 지칭한다. 암의 경우에, 약물의 치료 효과량은 암세포의 수를 감소시키거나, 종양 크기를 감소시키거나, 주변 장기로의 암세포 침윤을 억제(즉, 어느 정도 지연시키고 바람직하게는 정지)시키거나, 종양 전이를 억제(즉, 어느 정도 지연시키고 바람직하게는 정지)시키거나, 종양 성장을 어느 정도 억제시키고/시키거나, 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물이 존재하는 암 세포의 성장을 방지하고/하거나 상기 암세포를 사멸시킬 수 있는 정도로, 상기 약물은 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 치료시, 생체내 효능은, 예를 들면, 생존 기간, 무진행 생존기간(PFS), 반응률(RR), 반응 기간 및/또는 삶의 질을 평가함으로써 측정될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "발현 수준"은 또한 샘플 중 본 발명의 마커/지표 단백질의 농도 또는 양을 지칭할 수 있다.

용어 "에피토프 A4.6.1"은 항-VEGF 항체 베바시주맙(아바스틴(등록상표))에 의해 인식되는 에피토프를 지칭한다(문헌[Muller Y et al., Structure, 6:1153-1167 (15 September 1998)] 참조). 본 발명의 특정 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생성된 단클론 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프에 결합하는 단클론 항체; 문헌[Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 단클론 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.

"에피토프 4D5"는 국제특허출원공개 제 2009/154651 호에 기재된 바와 같이, 항체 4D5(ATCC CRL 10463) 및 트라스투주맙이 결합하는 HER2의 세포외 도메인 중의 영역이다. 상기 에피토프는 HER2의 막관통(transmembrane) 도메인에 가깝고 약 489 내지 630의 아미노산 잔기(신호 펩티드를 포함하지 않고 잔기 번호매김)인 HER2의 도메인 IV 내에 존재한다(문헌[Garrett et al, Mol Cell. 11:495-505 (2003)]; 문헌[Cho et al, Nature 421:756-760 (2003)]; 문헌[Franklin et al, Cancer Cell:317-328 (2004)]; 및 문헌[Plowman et al, Proc. Natl. Acad. Sci 90:1746-1750 (1993)] 참조). 본질적으로 4D5 에피토프에 결합하는 항체를 선별하기 위해, 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상적인 교차-블로킹 분석법을 수행할 수 있다. 다르게는, 에피토프 지도작성을 수행하여 항체가 본질적으로 HER2의 4D5 에피토프(예를 들면, HER2 세포외 도메인을 포함하여, 약 잔기 529로부터 약 잔기 625까지의 영역 중 임의의 하나 이상의 잔기(신호 펩티드를 포함하여 잔기 번호매김))에 결합하는지를 평가할 수 있다.

"HER 수용체"는 HER 수용체 부류에 속하는 수용체 단백질 티로신 키나아제이고, EGFR, HER2, HER3 및 HER4 수용체를 포함한다. HER 수용체는 일반적으로, HER 리간드에 결합하고/하거나 또 다른 HER 수용체 분자와 이량체화될 수 있는 세포외 도메인; 친유성 막관통 도메인; 보존된 세포내 티로신 키나아제 도메인; 및 포스포릴화될 수 있는 여러 티로신 잔기를 갖는 카복실-말단 신호전달 도메인을 포함할 것이다. HER 수용체는 "원생 서열" HER 수용체 또는 이의 "아미노산 서열 변이체"일 수 있다. 일 실시양태에서, HER 수용체는 원생 서열 인간 HER 수용체이다. 용어 "ErbB1", "HER1", "상피세포 성장 인자 수용체" 및 "EGFR"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 이의 원생 돌연변이체 형태(예를 들면, 문헌[Humphrey et al, PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)]에서와 같은 결실 돌연변이체 EGFR)를 포함하여, 예를 들면, 문헌[Carpenter et al, Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)]에 개시된 바와 같은 EGFR을 지칭한다. erbB는 EGFR 단백질 생성물을 암호화하는 유전자를 지칭한다.

표현 "ErbB2" 및 "HER2"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 인간 항원을 지칭한다. HER2 단백질은, 예를 들면, 문헌[Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985)]; 및 문헌[Yamamoto et al., Nautre 319:230-234 (1986)]에 기술되었다(진뱅크(Genebank) 수탁 번호 X03363). 용어 "erbB2"는 인간 ErbB를 암호화하는 유전자를 지칭하고, "neu"는 래트의 파이(pi) 85를 암호화하는 유전자를 지칭한다.

"항-Her2 항체"는 HER2 수용체에 결합하는 항체이다. 임의적으로, HER 항체는 또한 HER2 활성화 또는 작용을 저해한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항-HER2 항체는 HER2 폴리펩티드 상에 4D5 에피토프를 결합하는 항-HER2 항체이거나, 또 다른 실시양태에서, 트라스투주맙이다.

인간화 HER2 항체는 미국특허 제 5,821,337 호의 표 3에 기재된 바와 같은 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 또는 트라스투주맙(즉, 허셉틴(HERCEPTIN: 등록상표))을 포함한다.

"HER2 양성인" 암 또는 암세포 또는 종양은 동일한 조직형의 비암성 세포에 비해 훨씬 더 높은 수준의 HER 수용체 단백질 또는 유전자를 갖는 것이다. 상기 과발현은 유전자 증폭에 의해 또는 증가된 전사 또는 번역에 의해 야기될 수 있다. HER 수용체 과발현 또는 증폭은 세포의 표면에 존재하는 HER 단백질의 증가된 수준을 평가함으로써(예를 들면, 면역조직화학 분석(IHC)에 의해) 진단 또는 예후 분석에서 측정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 예를 들면, 형광 동일반응계내 하이브리드화(FISH; 1998년 10월에 공개된 국제특허출원공개 제 98/45479 호 참조), 서던 블로팅(southern blotting) 또는 중합효소 연쇄반응(PCR) 기술, 예를 들어, 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 통해, 세포에서 HER-암호화 핵산의 수준을 측정할 수 있다. 또한, 혈청과 같은 생물 유체 중에서 쉐드(shed) 항원(예를 들면, HER 세포외 도메인)을 측정함으로써 HER 수용체 과발현 또는 증폭을 연구할 수 있다(예를 들면, 1990년 6월 12일자로 허여된 미국특허 제 4,933,294 호; 1991년 4월 18일에 공개된 국제특허출원공개 제 91/05264 호; 1995년 3월 28일자로 허여된 미국특허 제 5,401,638 호; 및 문헌[Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)] 참조). 상기 분석법들 이외에도, 다양한 생체내 분석법이 숙련된 전문가에게 이용가능하다. 예를 들면, 환자의 신체내 세포를 임의적으로 검출가능한 표지, 예를 들면, 방사성 동위원소로 표지된 항체에 노출시킬 수 있고, 상기 환자에서 세포에 대한 항체의 결합을, 예를 들면, 방사능에 대해 외부 스캐닝함으로써 또는 항체에 미리 노출된 환자로부터 취한 생검물을 분석함으로써 평가할 수 있다.

용어 "전이" 또는 "전이성"은 이의 원발성 부위로부터 신체의 다른 곳으로의 암의 전파를 지칭한다. 암세포는 원발성 종양으로부터 벗어나서, 림프관 및 혈관내로 침투하여, 혈류를 통해 순환되어, 신체 다른곳의 정상 조직에 원격 병소에서 성장(전이)할 수 있다. 전이는 국소적이거나 원격성일 수 있다. 전이는 원발성 종양을 벗어나서 혈류를 통해 이동하고 원격 부위에서 정착하는 종양 세포에 따른 순차적 과정이다. 새로운 부위에서, 세포는 혈액 공급처를 정하고 성장하여 생명을 위협하는 종괴를 형성할 수 있다. 종양 세포 내의 자극 및 억제 분자 경로는 둘 다 상기 거동을 조절하고, 원격 부위에서 종양 세포와 숙주 세포의 상호작용도 또한 중요하다.

용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되고, 2개 이상, 바람직하게는 3개 초과의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 이루어진 분자를 지칭한다. 이의 정확한 크기는 많은 요인들에 따라 달라질 것이고, 상기 요인들은 올리고뉴클레오티드의 최종 작용 또는 용도에 따라 달라진다. 올리고뉴클레오티드는 합성적으로 또는 클로닝에 의해 유도될 수 있다. 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 키메라도 또한 본 발명의 범위에 속할 수 있다.

용어 "전체 생존기간(OS)"은 치료 중 및 치료 후 환자가 생존하는 시간의 길이를 지칭한다. 숙련된 자가 인지하듯이, 환자가 환자의 또 다른 환자 소집단과 비교하여 통계학적으로 유의한 더 긴 평균 생존 시간을 갖는 환자 소집단에 속하는 경우, 환자의 전체 생존기간은 개선되거나 향상된다.

용어 "환자"는 치료가 바람직한 임의의 단일 동물, 보다 특히 포유동물(예를 들면, 개, 고양이, 말, 토끼, 동물원 동물, 소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류와 같은 비-인간 동물 포함)을 지칭한다. 보다 더 특히, 본원에서 환자는 인간이다.

용어 "앓고 있는 환자"는 생리학적 및 병리학적 혈관신생을 수반하는 질환 및/또는 종양성 질환, 예를 들면, 유방암, 특히 국소 재발성 또는 전이성 HER2 양성 유방암과 관련된 임상 증상을 나타내는 환자를 지칭한다.

용어 "약학 조성물"은 약제의 생물 활성이 효과적이도록 하기 위한 형태이고, 제형이 투여될 대상체에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 멸균 제제를 지칭한다.

용어 "무진행 생존기간(PFS)"은 주치의 또는 연구자의 평가에 따라 환자의 질환이 악화되지 않는, 즉, 진행하지 않는 치료 중 및 치료 후 시간의 길이를 지칭한다. 숙련된 자가 인지하듯이, 환자가 유사한 상황의 환자들로 이루어진 대조군의 평균 무진행 생존기간의 시간에 비해 질환이 진행하지 않는 동안 더 긴 시간 길이를 갖는 환자의 소집단에 속하는 경우, 환자의 무진행 생존기간은 개선되거나 향상된다.

용어 "폴리펩티드"는 아미노산 잔기가 공유 펩티드 결합에 의해 연결된, 주어진 길이의 아미노산 쇄를 포함하는 펩티드, 단백질, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 그러나, 아미노산 및/또는 펩티드 결합이 작용적 유사체, 예를 들면, 20개 유전자-암호화 아미노산 중 하나가 아닌 다른 아미노산 잔기, 예를 들면, 셀레노시스테인으로 치환된 상기 단백질/폴리펩티드의 펩티드모방체(peptidomimetic)도 또한 본 발명에 포함된다. 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질은 폴리펩티드로 지칭될 수 있다. 용어 폴리펩티드 및 단백질은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드의 변형, 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등을 지칭하고, 이들을 배제하지 않는다. 상기 변형은 기본 텍스트 및 보다 상세한 논문뿐만 아니라, 방대한 연구 문헌들에 잘 기재되어 있다. 용어 폴리펩티드는 또한 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"를 지칭하고 포함한다.

본 발명에 있어서, 용어 "반응성인"은 유방암, 특히 국소 재발성 또는 전이성 HER2 양성 유방암을 앓고 있거나, 앓고 있는 것으로 의심되거나, 앓기 쉬운 대상체/환자가 베바시주맙을 포함하는 화학치료 요법에 대해 반응을 나타내는 것을 가르킨다. 숙련된 자라면 본 발명의 방법에 따라 베바시주맙으로 치료된 사람이 반응을 나타내는지를 용이하게 측정할 수 있을 것이다. 예를 들면, 반응은 유방암, 특히 국소 재발성 또는 전이성 HER2 양성 유방암으로부터의 감소된 고통, 예를 들면, 감소되고/되거나 중단된 종양 성장, 종양 크기의 감소, 및/또는 암의 하나 이상의 증상의 호전으로 나타날 수 있다. 바람직하게, 반응은 유방암의 전이성 전환의 감소 또는 약화된 지표, 예를 들면, 전이 형성의 방지 또는 전이 수 또는 크기의 감소로 나타날 수 있다(예를 들면, 문헌[Eisenhauser et al., New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1) Eur. J. Cancer, 45:228-247 (2009)] 참조).

본원에서 사용된 용어 "기준 샘플"은 비교 목적으로 사용된 임의의 샘플, 표준 또는 수준을 지칭한다. 일 실시양태에서, 기준 샘플은 동일한 대상체 또는 환자의 신체(예를 들면 조직 또는 세포)의 건강한 및/또는 비질환 부분으로부터 수득된다. 또 다른 실시양태에서, 기준 샘플은 동일한 대상체 또는 환자의 신체의 비치료된 조직 및/또는 세포로부터 수득된다. 또 다른 추가 실시양태에서, 기준 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 개체의 신체(예를 들면 조직 또는 세포)의 건강한 및/또는 비질환 부분으로부터 수득된다. 심지어 또 다른 실시양태에서, 기준 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 개체의 신체의 비치료된 조직 및/또는 세포 부분으로부터 수득된다.

특정 실시양태에서, 기준 샘플은 시험 샘플이 수득된 때보다 하나 이상의 상이한 시점에서 수득된 동일한 대상체 또는 환자로부터의 단일 샘플 또는 조합된 다중 샘플이다. 예를 들면, 기준 샘플은 시험 샘플이 수득된 때보다 동일한 대상체 또는 환자로부터 이른 시점에서 수득된다. 상기 기준 샘플은, 기준 샘플이 암의 초기 진단 동안 수득되고, 시험 샘플은 암이 전이되고 나중에 수득되는 경우 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 기준 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 한명 이상의 개체으로부터 수득된 용어 "샘플"하에 상기 정의된 바와 같은 모든 유형의 생물학적 샘플을 포함한다. 특정 실시양태에서, 기준 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 혈관생성 질환(예를 들면, 암)을 갖는 한명 이상의 개체으로부터 수득된다. 특정 실시양태에서, 기준 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 한명 이상의 건강한 개체으로부터의 조합된 다중 샘플이다. 특정 실시양태에서, 기준 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 질환 또는 질병(예를 들면, 혈관생성 질환, 예컨대, 암)을 갖는 한명 이상의 개체으로부터의 조합된 다중 샘플이다. 특정 실시양태에서, 기준 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 한명 이상의 개체으로부터의 정상 조직, 또는 풀링된 혈장 또는 혈청 샘플로부터 풀링된 RNA 샘플이다. 특정 실시양태에서, 기준 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 질환 또는 질병(예를 들면, 혈관생성 질환 예컨대, 암)을 갖는 한명 이상의 개체으로부터의 종양 조직, 또는 풀링된 혈장 또는 혈청 샘플로부터 풀링된 RNA 샘플이다.

용어 "기준 수준"은 본원에서 사전측정된 값을 지칭한다. 숙련된 전문가가 인지하듯이, 기준 수준은 사전측정되고, 예를 들면, 특이성 및/또는 민감성의 관점에서 요건을 충족시키도록 설정된다. 상기 요건들은, 예를 들면, 규제 기관에 따라 달라질 수 있다. 상기 요건은, 예를 들면, 분석 민감성 또는 특이성이 각각 특정 한계, 예를 들면, 80%, 90% 또는 95%로 설정되어야 하는 것일 수 있다. 상기 요건들은 또한 양성 또는 음성 예측값의 관점에서 정의될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 제공된 교시내용에 근거하여 상기 요건들을 충족시키는 기준 수준에 이르는 것이 항상 가능할 것이다. 일 실시양태에서, 기준 수준은 건강한 개체에서 측정된다. 일 실시양태에서, 기준 값은 환자가 속하는 질환에서 사전측정되었다. 특정 실시양태에서, 상기 기준 수준은, 예를 들면, 조사된 질환에서 값들의 전체 분포중 25 내지 75%의 임의의 비율로 설정될 수 있다. 다른 실시양태에서, 기준 수준은, 예를 들면, 조사된 질환에서 값들의 전체 분포로부터 측정된 바와 같은 중앙값, 삼분위수 또는 사분위수로 설정될 수 있다. 일 실시양태에서, 기준 수준은 조사된 질환에서 값들의 전체 분포로부터 측정된 바와 같은 중앙값으로 설정된다.

특정 실시양태에서, 용어 "증가" 또는 "보다 높은"은 기준 수준보다 높은 수준, 또는 기준 샘플로부터의 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 수준에 비해 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 수준에서 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 이상의 전체 증가를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 "증가"는 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3에서의 증가를 지칭하고, 여기서 증가는 예를 들면, 기준 샘플로부터 사전측정된 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 수준에 비해 약 1.5, 1.75, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90 또는 100배 이상 더 높다. 일 바람직한 실시양태에서, 용어 증가된 수준은 기준 수준 이상의 값에 관한 것이다.

특정 실시양태에서, 용어 "감소" 또는 "보다 낮은"은 본원에서, 기준 수준보다 낮은 수준, 또는 기준 샘플로부터의 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 수준에 비해 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 수준에서 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 전체 감소를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 "감소"는 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 수준에서의 감소를 지칭하고, 여기서 감소된 수준은 기준 샘플로부터의 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 수준의 최대 약 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05 또는 0.01배 이하이다.

특정 실시양태에서, 용어 "기준 수준에서"는 기준 샘플로부터, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 수준과 동일한 수준을 지칭한다.

"재발성" 암은 초기 치료에 대한 반응 후에, 최초 부위에서 또는 원격 부위에서 재성장한 암이다.

본 발명에 있어서, 용어 "-에 민감한"은 유방암, 특히 국소 재발성 또는 전이성 HER2 양성 유방암을 앓거나, 앓고 있는 것으로 의심되거나, 앓기 쉬운 대상체/환자가 화학치료 요법과 함께 베바시주맙에 의한 치료에 대해 어떻게든 양성 반응을 나타내는 것을 가르킨다. 환자의 반응은 전술한 바와 같은 "-에 반응성"인 환자와 비교할 때 덜 두드러질 수 있다. 예를 들면, 종양 성장 또는 전이 지표에서의 감소를 측정할 수 없고/없거나 화학치료 요법과 함께 베바시주맙에 대한 환자의 반응이 단지 일시적 성질의 것일 수 있긴 하지만, 즉, 종양의 성장 및/또는 전이가 단지 일시적으로 감소되거나 중단된 것일 수 있긴 하지만, 환자는 질환과 관련된 고통을 덜 경험할 수 있다.

용어 "생존기간"은 대상체가 살아있는 것을 지칭하고, 무진행 생존기간(PFS) 및 전체 생존기간(OS)을 포함한다. 생존기간은 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 방법에 의해 추정할 수 있고, 생존기간에서의 임의의 차이는 층화 로그-순위 검정(stratified log-rank test)을 이용하여 산출된다.

"생존기간을 연장하는" 또는 "생존기간 가능성을 증가시키는"은 미치료 대상체에 비해(즉, VEGF 항체로 치료되지 않은 대상체에 비해), 또는 대조군 치료 프로토콜, 예를 들어, 국소 재발성 또는 전이성 유방암을 위한 표준 치료에 사용되는 화학치료제, 예컨대, 카페시타빈, 탁산, 안트라사이클린, 파클리탁셀, 도세탁셀, 파클리탁셀 단백질-결합 입자(예를 들면, 아브락산(Abraxane: 등록상표)), 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 사이클로포스파미드 또는 트라스투주맙(예를 들면, 허셉틴(등록상표)) 또는 이의 조합만을 사용한 치료에 비해, 치료된 대상체에서 PFS 및/또는 OS를 증가시키는 것을 의미한다. 일 실시양태에서, 국소 재발성 또는 전이성 유방암을 치료하기 위한 상기 표준 치료는 트라스투주맙 및 도세탁셀을 포함하는 조합 치료이다. 생존기간은 치료 개시 후 또는 초기 진단 후, 약 1개월, 약 2개월, 약 4개월, 약 6개월, 약 9개월 이상 또는 약 1년 이상, 약 2년 이상, 약 3년 이상, 약 4년 이상, 약 5년 이상, 또는 약 10년 이상 등 동안 모니터링된다.

용어 "위험비(HR)"는 사건의 비율에 대한 통계학적 정의이다. 본 발명의 목적을 위해, 위험비는 임의의 특정 시점에서 대조군 중 사건 확률로 나눈 실험군에서의 사건 확률을 나타내는 것으로 정의된다. 무진행 생존기간 분석에서 "위험비"는, 일정 기간의 추적조사 동안 대조군에 비해 치료시 사망 위험의 감소를 나타내는, 2개의 무진행 생존기간 곡선 간의 차이의 요약이다.

본원에서 사용된 "요법" 또는 "치료"는 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도의 임상적 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접 병리학적 결과의 경감, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다.

용어 "치료 효과"는 용어 "전체 생존기간" 및 "무진행 생존기간"을 포함한다.

용어 "E-셀렉틴"은 다양한 염증성 자극에 의해 유도된 내피 부착 분자를 지칭한다(문헌[Bevilacqua, P. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 9238-9242 (1987)]; 문헌[Luscinskas, F.W. et al., J. Immunol. 142 2257- 2263 (1989)]; 문헌[Kuijpers, T.W. et al., J. Immunol. 147 1369-1376 (1991)]). E-셀렉틴(ELAM-1)을 암호화하는 복제 유전자는 미국특허 제 5,081,034 호에 개시된다. E-셀렉틴은 유니플롯(UniProt)KB 수탁 번호 P16581 및 유전자 ID(NCBI) 6401로 예시된다. 용어 "E-셀렉틴"은 상동체 및 이소폼을 포괄한다. 본 발명에 관하여, 용어 "E-셀렉틴"은 또한 이의 변이체 뿐만 아니라 변형 단백질(이소폼 포함), 상동 단백질 및/또는 단편이 하나 이상의 E-셀렉틴 특이적 항체, 예컨대, 알앤디 시스템즈(R&D Systems)로부터 시판중인 항체 클론 BBIG-E5 또는 5D11로 인식되는 것을 제공하는 서열의 단편을 포괄한다.

용어 "ICAM-1"은 유니플롯KB 수탁 번호 P05362 및 유전자 ID(NCBI) 3383으로 예시된 세포간 접착 분자 1을 지칭한다. 용어 "ICAM-1"은 이의 상동체 및 이소폼을 포괄한다. 본 발명에 관하여, 용어 "ICAM-1"은 또한 이의 변이체 뿐만 아니라 변형 단백질(이소폼 포함), 상동 단백질 및/또는 단편이 하나 이상의 ICAM-1 특이적 항체, 예컨대, 알앤디 시스템즈로부터 시판중인 항체 클론 11C81 또는 14C11로 인식되는 것을 제공하는 서열의 단편을 포괄한다.

용어 "VEGFR-3"은 유니플롯KB 수탁 번호 P35916 및 유전자 ID(NCBI) 2324로 예시된 혈관 내피 성장 인자 수용체 3을 지칭한다. 용어 "VEGFR-3"은 이의 상동체 및 이소폼을 포괄한다. 본 발명에 관하여, 용어 "VEGFR-3"은 또한 이의 변이체 뿐만 아니라 변형 단백질(이소폼 포함), 상동 단백질 및/또는 단편이 하나 이상의 VEGFR-3 특이적 항체, 예컨대, 각각 알앤디 시스템즈 및 아브노바(Abnova)로부터 시판중인 항체 클론 54716 또는 5B6으로 인식되는 것을 제공하는 서열의 단편을 포괄한다.

2. 상세한 실시양태

본 발명에서, E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3은 항-혈관신생 요법에 의한 생존에 대한 마커 또는 예측 바이오마커로서 확인되었다. 용어 "마커", "바이오마커" 및 "예측 바이오마커"는 상호교환적으로 사용될 수 있고, E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3의 발현 수준을 지칭한다. 일 실시양태에서, E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3은 또한 유방암, 더욱 구체적으로는 HER2 양성 유방암에 대한 진단 바이오마커로서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 유방암으로 진단된 환자가 항-VEGF 항체를 포함하는 항암 요법에 의해 더욱 또는 덜 적절하게 치료되는지를 측정하는 시험관내 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다:

(a) 유방암으로 진단된 환자로부터 유도된 샘플에서 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a)에 따른 발현 수준에 근거하여 항-VEGF 항체를 포함하는 항암 요법에 의해 환자가 더욱 또는 덜 적절하게 치료되는지를 확인하는 단계, 이때 기준 수준 이상의 상기 바이오마커의 발현 수준은, 환자가 상기 항암 요법에 의해 더욱 적절하게 치료되는 것을 나타내거나, 기준 수준 미만의 상기 바이오마커의 발현 수준은, 환자가 상기 항암 요법에 의해 덜 적절하게 치료되는 것을 나타낸다. 일 실시양태에서, 환자가 항암 요법에 의해 적절하게 치료되는지를 무진행 생존기간의 관점에서 측정된다. 일 실시양태에서, 상기 항암 요법은 항-VEGF 항체, 항-HER2 항체 및 탁산을 포함한다.

본 발명은, 다음을 포함하는 시험관내 방법에 의해 항-VEGF 항체를 포함한 항암 요법에 의해 더욱 적절하게 치료되는 것으로 확인된 유방암으로 진단된 환자를 치료하기 위한, 항-VEGF 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다:

본 발명은 또한, 다음을 포함하는 시험관내 방법에 의해 항-VEGF 항체를 포함한 항암 요법에 의해 더욱 적절하게 치료되는 것으로 확인된 유방암으로 진단된 환자를 치료하기 위한, 항-VEGF 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다:

본 발명은 또한, 유방암으로 진단된 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감한지를 측정하는 시험관내 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다:

(b) 상기 (a)에 따른 발현 수준에 근거하여 환자가 화학치료에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감한지를 확인하는 단계, 이때 기준 수준 이상의 상기 바이오마커의 발현 수준은, 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감함을 나타낸다. 일 실시양태에서, 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감한지는 무진행 생존기간의 관점에서 측정된다. 일 실시양태에서, 상기 화학치료 요법은 항-HER2 항체 및 탁산을 포함한다.

본 발명은 또한, 다음을 포함하는 시험관내 방법에 의해 화학치료 요법에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감한 것으로 확인되는, 유방암으로 진단된 환자의 치료를 위해 항-VEGF 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다:

본 발명은 또한, 다음을 포함하는 시험관내 방법에 의해 화학치료에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감성인 것으로 확인된, 유방암으로 진단된 환자를 치료하기 위한, 항-VEGF 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다:

(a) 유방암으로 진단된 환자로부터 수득된 샘플에서 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a)에 따른 발현 수준에 근거하여 환자가 화학 요법에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감한지를 확인하는 단계, 이때 기준 수준 이상의 상기 바이오마커의 발현 수준은, 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감함을 나타낸다. 일 실시양태에서, 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감한지는 무진행 생존기간의 관점에서 측정된다. 일 실시양태에서, 상기 화학치료 요법은 항-HER2 항체 및 탁산을 포함한다.

본 발명은 또한, 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함으로써 유방암으로 진단된 환자에서 화학치료 요법을 포함하는 항암 요법의 치료 효과를 개선하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다:

(a) 양성 유방암으로 진단된 환자로부터 수득된 샘플에서 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계;

(b) 상기 (a)에 따른 발현 수준에 근거하여 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감한지를 확인하는 단계; 및

(c) 상기 (b)에 따라 화학치료에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감성인 것으로 확인된 환자에게 효과량의 항-VEGF 항체를 효과량의 화학치료 요법과 함께 투여하는 단계, 이때 기준 수준 이상의 상기 바이오마커의 발현 수준은, 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감함을 나타낸다. 일 실시양태에서, 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감한지는 무진행 생존기간의 관점에서 측정된다. 일 실시양태에서, 상기 화학치료 요법은 항-HER2 항체 및 탁산을 포함한다.

일 실시양태에서, 상기 바이오마커의 측정은 (a) 샘플을 바이오마커에 특이적으로 결합하는 시약과 접촉시킴으로써, 시약과 바이오마커 사이에 착체를 형성하여, 형성된 착체의 양을 검출함으로써 바이오마커의 수준을 측정하거나; (b) 샘플에 존재하는 바이오마커를 증폭시키고, 증폭된 바이오마커를 증폭된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 시약으로 검출함으로써 바이오마커의 수준을 측정하여 수행된다.

일 실시양태에서, 상기 환자는 HER2 양성 유방암, 보다 구체적으로 국소 재발성 또는 전이성 HER2 양성 유방암으로 진단된다. 일 실시양태에서, 상기 환자는 이전에 화학치료 또는 방사선 치료를 받지 않았다.

일 실시양태에서, 상기 항-VEGF 항체는 A4.6.1 에피토프에 결합한다. 보다 구체적으로 상기 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다.

일 실시양태에서, 상기 탁산은 도세탁셀 또는 파클리탁셀, 보다 구체적으로 도세탁셀이다.

일 실시양태에서, 상기 항-HER2 항체는 4D5 에피토프와 결합한다. 보다 구체적으로 상기 항-HER2 항체는 트라스투주맙이다.

일 실시양태에서, 상기 발현 수준은 단백질 발현 수준이다.

일 실시양태에서, 상기 샘플은 혈장 샘플이다.

일 실시양태에서, 상기 발현 수준은 E-셀렉틴의 발현 수준이다. 일 실시양태에서, 상기 발현 수준은 ICAM-1의 발현 수준이다. 일 실시양태에서, 상기 발현 수준은 VEGFR-3의 발현 수준이다.

본원에 기재된 발명에 있어서, E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3의 발현 수준, 특히 단백질 발현 수준은 개별적 마커로서, 또는 2개 이상의 군에서, 발현 프로필 또는 마커 패널로서, 별개로 고려될 수 있다. 본원에 기재된 발명에 있어서, 발현 프로필 또는 마커 패널(여기서, 2개 이상의 마커의 발현 프로필은 함께 고려될 수 있다)은 또한 복합 발현 수준으로 언급될 수 있다. 예를 들면, 2개 이상의 마커들의 발현 수준은 합계되고 유사하게 측정된 대조군 복합 발현 수준과 비교될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 마커의 발현 수준에 근거하여 복합 발현 수준을 포함하여 발현 프로필의 측정을 포함한다.

본원에 기재된 발명 및 첨부된 예시적 실시예에 따라서, E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3을 별개로 고려하기 위해, 하기의 값들을 마커의 상응하는 고발현 값 또는 저발현 값으로 사용하였다: 고 E-셀렉틴(36.9 ng/ml), 저 E-셀렉틴(<36.9 ng/ml), 고 ICAM-1(210 ng/ml), 저 ICAM-1(<210 ng/ml), 고 VEGFR-3(10.6 ng/ml) 및 저 VEGFR-3(<10.6 ng/ml). 상기 수준들은 유망한 분석 방안에 따라 샘플 중앙값으로서 측정되었다. 또한, 특정 마커의 고발현 및 저발현 사이의 컷-오프 값을 구성하는 최적화된 수준은, 컷-오프 상하의 환자 부분집단이 적절한 통계 최적성 기준을 충족시킬 때까지 컷-오프를 변화시킴으로써 측정될 수 있다. 예를 들면, 최적 컷-포인트는 상하의 부분집단 사이에 치료 위험비의 차이를 최대화하거나, 또는 하나의 소집단에서 치료 효과 또는 임의의 다른 적절한 통계학적 기준을 최대화하도록 선택될 수 있다. 그러나, 숙련된 자라면 특정 마커의 발현 수준을 이해하고, 따라서 높거나 낮은 발현 수준을 구성하는 것이 환자 및 환자 집단에 의해 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 숙련된 자라면, 첨부된 예시적 실시예에 기술된 것 이외의 다른 검출 방법을 사용하고 첨부된 예시적 실시예에 기술된 것 이외의 다른 환자 및 환자 집단을 연구하는 경우, 숙련된 자가 특정 바이오마커에 대해 높고/높거나 낮은 발현 수준을 고려하는 것이 본원에 기재된 값에서 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 기재된 방법을 고려하여, 숙련된 자라면 특정 바이오마커 발현의 고수준 및/또는 저수준을 구성하는 것을 측정할 수 있다.

일 실시양태에서, E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3의 상기 기준 수준은 환자 군으로부터 유도된 샘플의 농도의 중앙값으로 설정된다. 일 예에서, E-셀렉틴의 상기 기준 수준은 혈장 중 약 36.9 ng/mL이다. 일 예에서, ICAM-1의 상기 기준 수준은 혈장 중 약 210 ng/mL이다. 일 예에서, VEGFR-3의 상기 기준 수준은 혈장 중 약 10.6 ng/mL이다. 일 실시양태에서, E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3의 상기 기준 수준은 환자 군으로부터 유도된 샘플의 4분위 분석으로 측정된다. 일 실시양태에서, E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3의 상기 기준 수준은 환자 군으로부터 유도된 샘플에서 농도를 증가시키기 위해 첫번째 4분위 값으로 설정된다. 일 예에서, E-셀렉틴의 상기 기준 수준은 혈장 중 약 26.7 ng/mL이다. 일 예에서, ICAM-1의 상기 기준 수준은 혈장 중 약 170.4 ng/mL이다. 일 예에서, VEGFR-3의 상기 기준 수준은 혈장 중 약 7.8 ng/mL이다. 일 실시양태에서, E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3의 상기 기준 수준은 환자 군으로부터 유도된 샘플에서 농도를 증가시키기 위해 3번째 4분위 값으로 설정된다. 일 예에서, E-셀렉틴의 상기 기준 수준은 혈장 중 약 49.1 ng/mL. 일 예에서, ICAM-1의 상기 기준 수준은 혈장 중 약 272.2 ng/mL이다. 일 예에서, VEGFR-3의 상기 기준 수준은 혈장 중 약 13.0 ng/mL이다.

숙련된 전문가가 인지하듯이, 조사중인 진단 질문을 개선하기 위해 2개 이상의 마커의 측정을 이용하는 많은 방법이 있다. 매우 단순하지만, 그럼에도 불구하고 종종 효과적인 접근방법에서, 샘플이 하나 이상의 조사된 마커에 대해 양성인 경우 양성 결과가 추정된다.

그러나, 마커들의 조합도 또한 평가될 수 있다. 마커 패널의 마커들, 예를 들면, E-셀렉틴, ICAM-1 및 ICAM-3에 대해 측정된 값(또는 복합 발현 수준)은 수학적으로 조합되고 조합된 값은 기본 진단 질문과 상관될 수 있다. 마커 값은 임의의 적절한 최신 수학적 방법에 의해 조합될 수 있다. 질환 또는 치료 효과에 마커 조합을 상관시키기 위한 공지된 수학적 방법은, 판별 분석(DA, discriminant analysis)(즉, 선형-, 2차-, 규칙적-DA), 커널(Kernel) 방법(즉, SVM), 비모수 방법(Nonparametric Method)(즉, k-최근접 이웃 분류기(k-Nearset-Neighbor Classifier)), PLS(부분 최소 자승법(Partial Least Squares)), 트리-기반 방법(Tree-Based Method)(즉, 로직 회귀(Logic Regression), CART, 랜덤 포레스트 방법(Random Forest Method), 부스팅(Boosting)/배깅(Bagging) 방법), 일반화 선형 모델(Generalized Linear Model)(즉, 로지스틱 회귀(Logistic Regression)), 주성분 기반 방법(Principal Components based Method)(즉, SIMCA), 일반화 가법 모델(Generalized Additive Model), 퍼지 로직 기반 방법(Fuzzy Logic based Method), 신경망 및 유전자 알고리즘 기반 방법(Neural Networks and Genetic Algorithms based Method)과 같은 방법들을 이용한다. 숙련자들은 적합한 방법을 선택하여 본 발명의 마커 조합을 평가하는데 문제가 없을 것이다. 본원에 개시된 본 발명에 따른 마커 조합들을, 예를 들면, 개선된 전체 생존기간, 무진행 생존기간, 화학치료제/화학치료 요법에 베바시주맙의 첨가에 대한 반응성 또는 민감성, 및/또는 베바시주맙(하나 이상의 화학치료제/화학치료 요법 이외에)에 대한 반응성 또는 민감성의 예측과 상관시키는데 사용된 방법은 DA(즉, 선형-, 2차-, 규칙적 판별 분석), 커널 방법(즉, SVM), 비모수 방법(즉, k-최근접 이웃 분류기), PLS(부분 최소 자승법), 트리-기반 방법(즉, 로직 회귀, CART, 랜덤 포레스트 방법, 부스팅 방법) 또는 일반화 선형 모델(즉, 로지스틱 회귀)로부터 선택된다. 이들 통계학적 방법에 관한 세부사항은 하기 문헌에서 확인된다: 문헌[Ruczinski, I., et al., J. of Computational and Graphical Statistics, 12:475-511 (2003)]; 문헌[Friedman, J.H., J. of the American Statistical Association 84:165-175 (1989)]; 문헌[Hastie, Trevor, Tibshirani, Robert, Friedman, Jerome, The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics (2001)]; 문헌[Breiman, L., Friedman, J.H., Olshen, R.A., Stone, C.J., Classification and regression trees, California: Wadsworth (1984)]; 문헌[Breiman, L., Random Forests, Machine Learning, 45:5-32 (2001)]; 문헌[Pepe, M.S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28 (2003)]; 및 문헌[Duda, R.O., Hart, P.E., Stork, D.G., Pattern Classification, Wiley Interscience, 2nd Edition (2001)].

따라서, 본원에 개시된 본 발명은 생물 마커의 기본 조합에 대한 최적화 다변량(multivariate) 컷-오프의 사용에 관한 것이고, 상태 A와 상태 B, 예를 들면, 화학치료 요법에 베바시주맙의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 반응성 또는 민감성인 환자와 화학치료 요법에 베바시주맙 치료제 첨가에 대해 저반응군인 환자를 구별하는 것에 관한 것이다. 상기 유형의 분석에서, 마커는 더 이상 독립적이지 않고 마커 패널 또는 복합 발현 수준을 형성한다.

3. E- 셀렉틴 , ICAM -1 또는 VEGFR -3의 발현 수준의 검출

마커 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 중 하나 이상의 발현 수준은 환자 샘플 중 특정 단백질 수준의 측정에 적합한 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있고, 바람직하게는 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3의 하나 이상에 특이적인 항체를 사용하여, ELISA와 같은 면역분석 방법에 의해 측정된다. 상기 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 통상적으로 시행되고, 상응하는 상업적 항체 및/또는 키트는 용이하게 이용가능하다. 예를 들면, E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3에 대한 시판중인 항체/검사 키트는 알앤디 시스템즈에서 클론 BBIG-E5 및 5D11로서, 알앤디 시스템즈에서 클론 11C81 및 14C11로서, 및 알앤디 시스템스 및 아브노바(Abnova)에서 클론 54716 및 5B6으로서 각각 수득할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 마커/지표 단백질의 발현 수준은 항체 또는 키트 제조사의 시약 및/또는 프로토콜 권장사항을 이용하여 평가된다. 숙련된 자라면 또한 면역분석 방법에 의해 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 중 하나 이상의 발현 수준을 측정하기 위한 또 다른 수단을 인지할 것이다. 그러므로, 본 발명의 마커/지표의 하나 이상의 발현 수준은 과도한 부담없이 당해 분야의 숙련된 자에 의해 통상적으로 및 재현가능하게 측정될 수 있다. 그러나, 정확하고 재현가능한 결과를 보장하기 위해, 본 발명은 또한 검사 절차의 검증을 보장할 수 있는 전문화된 실험실에서의 환자 샘플의 검사를 포함한다.

E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 단백질 또는 핵산을 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들면, 포유동물로부터의 조직 또는 세포 샘플은 편리하게, 예를 들면, 웨스턴 및 ELISA를 사용하여 단백질을, 노던(Northern), 점-블롯(dot-blot) 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석법, 어레이 하이브리드화, RNase 보호 분석법을 이용하여, 또는 DNA 마이크로어레이 스냅샷(microarray snapshot)을 포함하여 시판중인 DNA SNP 칩 마이크로어레이를 이용하여 해당 유전자 바이오마커로부터의 mRNA 또는 DNA를 분석할 수 있다. 예를 들면, 정량적 PCR 분석법과 같은 실시간 PCR(RT-PCR) 분석법이 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 예시적 실시양태에서, 생물학적 샘플 중 해당 유전자 바이오마커로부터 mRNA를 검출하는 방법은 하나 이상의 프라이머를 사용하여 역 전사에 의해 샘플로부터 cDNA를 생성하고, 상기와 같이 생성된 cDNA를 증폭시키고, 증폭된 cDNA의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 생물학적 샘플중 mRNA의 수준을 측정하게 하는(예를 들면, 액틴족 구성원과 같은 "항존(housekeeping)" 유전자의 비교 대조군 mRNA 서열의 수준을 동시에 검사함으로써) 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 임의적으로, 증폭된 cDNA의 서열을 측정할 수 있다.

상기 기술들을 적용하는 데 있어 참고를 제공하기 위해 많은 참조문헌들이 이용가능하다: 문헌[Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980)]; 문헌[Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)]; 문헌[Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984)]; 문헌[Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibody: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982)]; 및 문헌[Zola, Monoclonal Antibody: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)].

E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 중 하나 이상의 발현 수준은 생물학적 샘플인 환자 샘플에서 평가될 수 있다. 환자 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플 또는 혈장 샘플일 수 있다. 혈액 샘플, 혈청 샘플 및 혈장 샘플을 수득하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 환자 샘플은 선행보조(neoadjuvant) 치료 전이나 후에 또는 보조 치료 전이나 후에 환자로부터 수득될 수 있다.

4. 치료 방법

본 발명에 있어서, 베바시주맙은 당해 분야에 공지된 바와 같은 표준 화학치료 요법의 일부로서 투여되는 하나 이상의 화학치료제 이외에, 또는 이와 조합-치료 또는 동시-치료로서 투여될 것이다. 상기 표준 화학치료 요법에 포함되는 약제의 예로는 5-플루오로우라실, 류코보린, 이리노테칸, 겜시타빈, 에를로티닙, 카페시타빈, 탁산, 예를 들면, 도세탁셀 및 파클리탁셀, 인터페론 알파, 비노렐빈, 및 백금-기재 화학치료제, 예를 들어, 카보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴이 포함된다. 첨부된 예시적 실시예에 나타낸 바와 같이, 베바시주맙의 첨가는 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 중 하나 이상의 발현 수준에 따라 한정되고 선택된 환자 및/또는 환자 집단에서 무진행 생존기간의 증가를 달성하였다. 따라서, 베바시주맙은 첨부된 예시적 실시예에 나타낸 바와 같은 도세탁셀 치료와 같은 화학치료 요법과 조합될 수 있다.

통상적인 투여 방식은 볼루스(bolus) 용량으로서, 또는 정해진 기간 동안의 주입으로서 비경구 투여, 예를 들면, 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 75분, 90분, 105분, 120분, 3시간, 4시간, 5 시간 또는 6 시간에 걸친 총 일일 용량의 투여를 포함한다. 예를 들면, 2.5 내지 15 mg/kg 체중의 베바시주맙(아바스틴(등록상표))을 치료되는 암의 유형에 따라 매주, 2주마다 또는 3주마다 투여할 수 있다. 투여량의 예는, 매주, 2주마다 또는 3주마다 제공되는 2.5 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중, 7.5 mg/kg 체중, 10 mg/kg 체중 및 15 mg/kg 체중을 포함한다. 또 다른 투여량의 예는 2주마다 5 mg/kg 체중, 2주마다 10 mg/kg 체중, 3주마다 7.5 mg/kg 체중 및 3주마다 15 mg/kg 체중이다. 본원에 기재된 발명에 있어서, 저용량 베바시주맙은, 예를 들면, 매주 2.5 mg/kg 체중, 2주마다 5 mg/kg 체중 및 3주마다 7.5 mg/kg 체중의 투여량을 포함한다. 본원에 기재된 발명에 있어서, 고용량 베바시주맙은, 예를 들면, 매주 5 mg/kg 체중, 2주마다 10 mg/kg 체중 및 3주마다 15 mg/kg 체중의 투여량을 포함한다.

숙련된 자라면 베바시주맙의 또 다른 투여 방식이 특정 환자 및 화학치료 요법에 의해 측정되는 바와 같이 본 발명에 포함되고 특정 투여 방식 및 치료 투여량은 당해 분야에 공지된 방법에 따라 주치의에 의해 최선으로 측정됨을 인지할 것이다.

본 발명의 방법에 따라 선택된 환자는 화학치료 요법과 함께 베바시주맙으로 치료되고, 하나 이상의 추가의 항암 요법으로 또한 치료될 수 있다. 특정 양상에서, 상기 하나 이상의 추가 항암 요법은 방사선이다.

5. 키트

본 발명은 또한 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 중 하나 이상의 발현 수준을 측정하기에 적합한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 진단 조성물 또는 키트에 관한 것이다. 본원에 상술된 바와 같이, DNA, RNA 또는 DNA와 RNA 프로브의 혼합물과 같은 올리고뉴클레오티드는 마커/지표 단백질의 mRNA 수준을 검출하는데 사용될 수 있는 반면, 폴리펩티드는 특이적 단백질-단백질 상호작용을 통해 마커/지표 단백질의 단백질 수준을 직접 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 양상에서, E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 중 하나 이상의 발현 수준에 대한 프로브로서 포함되고 본원에 기재된 키트 또는 진단 조성물에 포함되는 폴리펩티드는 상기 단백질들에 대해 특이적이거나 또는 이의 상동체 및/또는 절두체(truncation)에 특이적인 항체이다.

따라서, 본 발명의 추가 실시양태는 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 중 하나 이상의 발현 수준을 측정할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함하는, 본원에 기재된 방법을 수행하는데 유용한 키트를 제공한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 하나 이상의 마커/지표를 암호화하는 mRNA에 특이적인 프라이머 및/또는 프로브를 포함할 수 있고, 폴리펩티드는 마커/지표 단백질과 특이적으로 상호작용할 수 있는 단백질, 예를 들면, 마커/지표 특이적 항체 또는 항체 단편을 포함한다.

전술한 방법들 이외에, 본 발명은 또한 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 중 하나 이상의 발현 수준을 평가 또는 측정하기 위한 추가 면역분석 방법, 예를 들면, 웨스턴 블로팅 및 ELISA-기반 검출을 포함한다. 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 본 발명의 마커/지표 단백질의 발현 수준은 또한 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들면, 노던 블로팅, 실시간 PCR 및 RT-PCR에 의해 mRNA 수준에서 평가될 수 있다. 면역분석- 및 mRNA-기반 검출 방법 및 시스템은 당해 분야에 공지되어 있고, 문헌[Lottspeich, Bioanalytik, Spektrum Akademisher Verlag (1998)] 또는 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, U.S.A. (2001)]과 같은 표준 교재로부터 추론할 수 있다. 기재된 방법들은 유방암, 특히 국소 재발성 또는 전이성 HER2 양성 유방암으로 진단된 집단에서 설정된 대조군에 비해 환자 또는 환자군에서 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3의 발현 수준을 측정하는데 특히 유용하다.

E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 중 하나 이상의 발현 수준은 또한 면역응집, 면역침강(예를 들면, 면역확산, 면역전기영동, 면역 고정화), 웨스턴 블로팅 기술(예를 들면, (동일반응계내) 면역 세포화학, 친화크로마토그래피, 효소 면역분석법) 등의 장점을 취하여 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 용액 중 정제된 폴리펩티드의 양은 또한 물리적 방법, 예를 들면, 광도측정(photometry)에 의해 측정될 수 있다. 혼합물 중 특정 폴리펩티드를 정량화하는 방법은 통상적으로, 예를 들면, 항체의 특이적 결합에 의존한다. 항체의 특이성을 이용하는 특이적 검출 및 정량화 방법은, 예를 들면, 면역분석 방법을 포함한다. 예를 들면, 환자 샘플 중 본 발명의 마커/지표 단백질의 농도/양은 효소 결합-면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 다르게는, 웨스턴 블롯 분석 또는 면역염색을 수행할 수 있다. 웨스턴 블로팅은 전기영동에 의한 단백질 혼합물의 분리와 항체를 사용한 특이적 검출을 조합한다. 전기영동은 2D 전기영동과 같이 다차원적일 수 있다. 통상적으로, 폴리펩티드는 한 차원을 따라 이의 적절한 분자량에 의해서 및 다른 방향을 따라 이의 등전점에 의해 2D 전기영동으로 분리된다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 마커/지표 단백질의 발현 수준은 또한 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3을 암호화하는 상응하는 유전자의 증가된 발현에서 반영될 수 있다. 따라서, 상응하는 유전자의 발현을 평가하기 위해, 번역 전의 유전자 산물(예를 들면, 접합되거나, 비접합되거나, 부분 접합된 mRNA)의 정량적 평가를 수행할 수 있다. 당해 분야의 숙련된 자라면 이와 관련하여 사용되는 표준 방법을 알고 있거나, 표준 교재(예를 들면, 상기 샘브룩(Sambrook, 2001)의 문헌)로부터 상기 방법들을 추론할 수 있다. 예를 들면, E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 중 하나 이상을 암호화하는 mRNA의 각각의 농도/양에 대한 정량적 데이터를 노던 블롯, 실시간 PCR 등에 의해 수득할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위해 유리하게 사용될 수 있고, 특히, 다양한 용도에서, 예를 들면, 진단 분야에서 또는 연구 도구로서 사용될 수 있다. 본 발명의 키트의 요소들은 바이알에 개별적으로, 또는 용기 또는 다중용기 유닛에 함께 포장될 수 있다. 키트의 제조는 바람직하게는 당해 분야의 숙련된 자에게 공지되어 있는 표준 절차를 따른다. 키트 또는 진단 조성물은, 예를 들면, 본원에 기재된 면역조직화학 기술을 사용하여, 본 발명의 본원에 기재된 방법에 따라 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3 중 하나 이상의 발현 수준의 검출을 위해 사용될 수 있다.

본원에 기재된 검출 방법에 사용하기 위해, 숙련된 자는 본 발명에 포함되는 폴리펩티드, 예를 들면, 항체, 또는 올리고뉴클레오티드를 표지하는 능력을 갖는다. 당해 분야에서 통상적으로 실시되는 바와 같이, 면역분석 방법에 사용하기 위한 mRNA 수준 및/또는 항체 또는 항체 단편을 검출하는데 사용하기 위한 하이브리드화 프로브는 당해 분야에 공지된 표준 방법에 따라서 표지되고 가시화될 수 있고, 통상적으로 사용되는 시스템의 비제한 예는 방사성표지, 효소 표지, 형광 태그, 비오틴-아비딘 착체, 화학발광체 등의 사용을 포함한다.

본 발명은 하기의 비제한적인 예시적 실시예로 또한 예시된다.

실시예 1

HER2 양성 국소 재발성 또는 전이성 유방암을 갖는 환자를 위한 1차적 치료로서 트라스투주맙/ 도세탁셀 단독사용과 비교하여 트라스투주맙/ 도세탁셀과 조합되는 베바시주맙 - AVEREL 연구

본원에 개시된 임상 시험의 주 목적은 트라스투주맙/도세탁셀 단독사용에 무작위배정된 환자에 대해 트라스트주맙/도세탁셀과 조합되는 베바시주맙에 무작위배정된 환자에서의 무진행 생존기간(PFS)을 비교하는 것이었다. 2차 목적은 전체 생존기간(OS); 최고 전체 반응(OR); 반응 기간(DR); 치료 실패까지의 시간(TTF); 베바시주맙과 트라스투주맙 및 도세탁셀을 조합하는 안전성 및 내성; 및 최종적으로 삶의 질을 평가하는 것이었다.

구체적으로, 본원에 기재된 연구는 (1) 최소 6 주기 동안 트라스투주맙 8 mg/kg 부하 용량에 이어 질환 진행까지 3주마다 6 mg/kg + 3주마다 도세탁셀 100 mg/m²와 비교할 때, 최소 6 주기 동안 3주마다 15 mg/kg의 베바시주맙 + 트라스투주맙 8 mg/kg 부하 용량에 이어 질환 진행까지 3주마다 6 mg/kg + 3주마다 도세탁셀 100 mg/m²가 PFS의 1차 변수에 양성 치료 효과를 제공하는지; 및 (2) 최소 6 주기 동안 3주마다 15 mg/kg의 베바시주맙 + 트라스투주맙 8 mg/kg 부하 용량에 이어 질환 진행까지 3주마다 6 mg/kg + 3 주마다 도세탁셀 100 mg/m²가 허용되는 안전성 프로필을 갖는지를 측정하는 것이었다.

연구 설계

시험은 무작위 개방 표지 2-군 다기관 3상 연구(randomized open label 2-arm multicentre phase III study)이었다. 환자들은 기관 무작위배정 과정을 통해 1:1 기준으로 처리군에 무작위 배정되었다. 블록 설계 무작위배정 절차를 이용하였다. 두 치료군 간의 환자 집단에서 중요한 예후 인자의 불균형을 피하기 위해, 환자들을 하기 기준에 따라 계층화시켰다:

- 사전 보조제/선행보조 탁산/마지막 용량의 보조제/선행보조 화학치료 이후 재발까지 시간. 환자를 초기에 탁산을 사용한 선행 치료에 대해 계층화하였다(예 대 아니오). "선행 탁산이 없는" 경우, 두번째 계층화를 수행하였다, 즉, 보조제/선행보조 화학치료를 받은 적이 없거나 또는 마지막 용량의 화학치료 이후 12개월 이상 후 재발 대 마지막 용량의 화학치료 이후 12개월 미만.

- 보조 치료의 일부로서 트라스투주맙 대 트라스트주맙 미사용;

- 호르몬 수용체(ER/PgR) 상태(양성 대 음성); 및

- 측정가능한 질환(예 대 아니오).

환자들은 다음의 2군 중 하나로 무작위배정되었다:

- A 군: 최소 6 주기 동안(또는 질환 진행 또는 허용불가능한 독성 어느 쪽이든 최초로 발생할 때까지) 트라스투주맙 8 mg/kg 부하 용량에 이어 질환 진행까지 3주마다 6 mg/kg + 3주마다 도세탁셀 100 mg/m². 진행 또는 독성이 없이 6 주기 후에, 연구자의 재량으로 추가의 주기 동안 도세탁셀을 계속 투여할 수 있다.

- B 군: 최소 6 주기 동안(또는 질환 진행 또는 허용불가능한 독성 어느 쪽이든 최초로 발생할 때까지) 트라스투주맙 8 mg/kg 부하 용량에 이어 질환 진행까지 3주마다 6 mg/kg + 3주마다 도세탁셀 100 mg/m². 진행 또는 독성이 없이 6 주기 후에, 연구자의 재량으로 추가의 주기 동안 도세탁셀 + 질환 진행까지 3주마다 베바시주맙 15 mg/kg을 계속 투여할 수 있다.

연구 개요 및 투약 요법

선별/기준치	약물 치료 기간	추적 검사
선별 날짜	약물 치료 기간 날짜	추적 검사 날짜
-28일에서 -1일까지	각 치료 주기는 21일이다.	마지막 용량의 연구 치료 후 임상 평가
	8 mg/kg의 트라스투주맙 부하 용량을 주기 1의 제 1일, 베바시주맙 및/또는 도세탁셀의 첫번째 용량 24 시간 전에 투여하였다. 이어서, 질환 진행, 허용불가 독성(연구 치료의 중단이 요구되는) 또는 환자 동의 취소까지 매 3주 주기의 제 1일에 6 mg/kg의 용량을 투여하였다. 100 mg/m²의 도세탁셀 초기 용량을 주기 1의 제 2일에 투여한 후, 최소 6 주기 동안 매 3주 주기의 제 1일에 동일 용량을 투여하였다. 15 mg/kg의 베바시주맙 초기 용량을 주기 1의 제 2일에 투여한 후, 허용불가 독성(연구 치료의 중단이 요구되는) 또는 환자의 동의 취소까지 매 3주 주기의 제 1일에 동일 용량을 투여하였다.	- 마지막 용량의 연구 치료 후 1개월[안전을 위한 (28일)] - 마지막 용량의 연구 치료 후 3개월 이후 3개월마다

연구 기간

424명의 환자를 약 29개월에 걸쳐 60개 기관으로부터 모집하고 1차 종료점(PFS)을 위해 약 26개월 동안 수행하였다.

연구 종료

본 연구는 결과 주도형 임상시험이었다. 1차 종료점의 분석은 310개 결과가 무작위배정된 424명의 환자에서 확인되었을 때 수행하였다. 전체 생존기간에 대한 추가 분석은 마지막 환자의 무작위배정 후 약 36개월에 수행하고, 이 시점에서 시험을 종료하였다. 연구 종료는 마지막 환자의 무작위배정 후 약 36개월에 수행된 최종 전체 생존기간 분석과 동시에 진행된 상기 시험에 참여한 마지막 환자의 마지막 방문 날짜에 이루어졌다.

최종 전체 생존기간 분석에 대한 상기 임상 컷-오프 후에, 연구 치료로부터 이익을 얻은 환자들은 질환 진행까지 계속 베바시주맙을 투여받았다.

환자 수/치료군에 배정. 424명의 환자들은 시험의 2개 군으로 1:1 무작위배정되었다:

- 트라스투주맙/도세탁셀 군에 205명의 HER2 양성 환자(A 군); 및

- 베바시주맙 + 트라스투주맙/도세탁셀 치료군에 205명의 HER2 양성 환자(B 군).

환자들은 치료군에 무작위로 배정되었다. 환자들은 무작위배정일에, 무작위배정 후 늦어도 5일 근무일까지 첫번째 용량의 연구 치료를 받았다. 어떤한 경우에도 상기 연구에 참여한 환자는 상기 연구에 다시 무작위배정되지 않고 두 번째 치료 과정에 참여해서는 안된다.

적합한 환자 등록 기준

국소 재발성 또는 전이성 HER2 양성 유방암(원발성 종양-T4d-염증성 암종 제외)을 갖는 폐경전후 여성 및 남성 환자. 환자들은 전이성 유방암(MBC)에 대해 사전 방사선치료를 받았을 수 있으나, 단 무작위배정 3 주전에 완료되었어야 하고 골수-함유 뼈의 30% 이하만 조사되었어야 한다. 사전 보조 방사선치료는 적어도 무작위배정 6개월 전에 완료된 경우에 허용되었다.

보조 요법으로 트라스투주맙을 투여받은 환자도 등록될 수 있되, 트라스투주맙의 마지막 보조 투여 이후 6개월 이상이 지났어야 한다. 환자는 심장초음파 또는 MUGA에 의해 측정할 때 기준치에서 50% 이상의 적절한 LVEF로 정의된 좌심실 박출 기능(Left Ventricular Ejection Function)을 가져야 했다. 보조유도성 질환에 대해 안트라사이클린으로 치료된 환자는, 최대 누적 용량이 독소루비신 360 mg/m² 또는 에피루비신 720 mg/m² 이하인 경우 연구에 포함되었다.

환자들은 측정가능하거나 측정불가능한 국소 재발성 또는 전이성 질환과 함께 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된 유방의 HER2 양성, 폐경전후 선암을 가져야 했다. 환자들은 양호한 수행능력 상태(ECOG 0-1), 정상적인 간, 신장 및 골수 기능을 가지며, 프로토콜 수행 또는 결과 해석에 영향을 미칠 수 있는 다른 심각한 질환이 없어야 했다. 이들은 GI 천공, 고혈압, 단백뇨 및 상처 치유 합병증, 혈전증 또는 출혈의 증가된 위험이 없어야 했다. 전이성 CNS 질환 또는 전이에 의해 야기된 척수 압박을 갖는 환자는 적합하지 않았다. 환자들은 지난 5 년 내에 또 다른 원발성 종양(적절히 치료된 자궁경부의 CIS, 피부의 편평세포암 또는 기저 세포 피부암 제외)을 가지지 않아야 했다. 임신 또는 수유중 여성은 제외되었다.

환자가 무작위배정때 적어도 2주동안 안정한 항응고 수준을 유지했으면 연구 도입시에 완전 항응고요법을 허용하였다.

적격성 기준:

1. 환자 연령 18세 이상;

2. 프로토콜에 따를 수 있음;

3. 1 이하의 ECOG PS;

4. 12주 이상의 기대 수명;

5. 화학치료에 후보였던, 측정가능하거나 측정불가능한 국소 재발성 또는 전이성 병변과 함께 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된 유방암(선암)(원발성 종양-T4d-염증성 선암 제외)을 갖는 폐경 전후 환자. 국소 재발성 질환은 치료 목적의 절제술을 할 수 없었다. ER/PgR 및 HER2 상태는 문서로 기록되어야 했다;

6. 환자들은, 면역조직화학(IHC)에 의해 측정될 때 HER2 단백질 과발현(3+); 또는 무작위배정 전에 중앙 실험실에 의해 확인된 원발성 종양 또는 전이의 형광 동일반응계내 하이브리드화(FISH) 또는 발색성 동일반응계내 하이브리드화(CISH)에 의해 측정될 때 HER2/c-erbB2의 증폭을 나타내어야 했다. 이 시험에서 중앙 실험실에 의한 원발성 종양의 HER2 양성의 확인은 HER2 상태가 기관에 의해 확인된 보조 트라스투주맙의 로슈(Roche) 또는 제넨테크(Genentech) 후원 시험에 이전에 참여했던 환자에 대해서는 필요하지 않았다(예를 들면, HERA, BCIRG006, NSABP B31 또는 인터군(Intergroup)/NCCTG/H2061 시험);

7. 보조 요법으로 트라스투주맙을 투여받은 환자는 이들이 마지막 용량의 트라스투주맙후 6개월 이내에 재발되지 않는 한 적합하였다;

8. 보조 또는 선행보조 요법으로 안트라사이클린으로 치료된 환자는 이들이 무작위배정 전 6개월 이후에 마지막 용량을 투여받은 경우에만 적합하다. 최대 누적 용량은 독소루비신의 경우 360 mg/m²을, 에피루비신의 경우 720 mg/m²을 초과하지 않았어야 한다;

9. 탁산으로 치료된 환자는, 이들이 무작위배정 전 12개월 이후에 마지막 보조 또는 선행보조 화학치료를 받은 경우에만 적합하다;

10. 심장초음파 또는 MUGA에 의해 측정된 50% 이상의 기준치 좌심실 박출 계수(LVEF);

11. 전용량(full-dose) 경구 또는 비경구용 항응고제의 사용은 환자가 무작위배정시 적어도 2주 동안 안정한 항응고 수준을 유지했으면 허용되었다:

- ULN의 1.5 내지 2.5배의 기준치 PTT를 갖는 헤파린 치료 중의 환자 또는 헤파린 치료 시작 전 환자의 값

- 1.5의 일일 용량을 투여받은 저분자량 헤파린(LMWH) 치료 중의 환자

- 패키지 삽입물에 따른, 2 mg/kg(의 에녹사파린) 또는 적절한 용량의 상응하는 항응고제

- 1 내지 4일 간격의 2회 연속 측정 중 기준치에서 평가된 2.0 내지 3.0의 INR을 갖는 쿠마린 유도체 치료 중의 환자

- 항응고 약제를 투여받지 않는 환자는 무작위배정 전 7일 이내에 ULN의 1.5배 이하의 INR 및 1.5배 이하의 PTT를 가졌어야 한다.

배제 기준:

1. 전이성 또는 국소 재발성 유방암에 대한 이전의 화학치료. 이전의 호르몬 치료는 허용되었으나, 적어도 무작위배정 2주 전에 중단했어야 한다.

2. 전이성 유방암 치료를 위한 이전의 방사선치료는 다음 경우에는 허용되지 않았다:

- 골수-함유 뼈가 30%보다 더 많이 조사된 경우

- 무작위배정 전 3주 이내에 마지막 분량의 방사선치료가 시행된 경우

유방암을 위한 사전 보조 방사선치료가 허용되었으되, 적어도 무작위배정 6개월 전에 중단되었어야 한다.

3. 적절히 치료된 자궁경부의 상피내암, 피부의 편평세포암 또는 적절하게 제어된 한정된 기저 세포 피부암은 제외하고, 무작위배정 전 마지막 5년 이내에 다른 원발성 종양(원발성 뇌종양 포함).

4. 척수 압박의 징후 또는 CNS 전이의 현재 징후. 뇌 전이가 임상적으로 의심되는 경우 뇌의 CT 또는 MRI 스캔은 의무적이었다(무작위배정 전 4주 이내에).

5. CNS 질환(암과 관련없는)(표준 의학적 치료로 적절히 치료되지 않는 경우), 예를 들면, 제어되지 않는 발작의 물리적/신경학적 검사시 이력 또는 징후.

6. 연구 치료 시작 전 28일 이내에 주요 수술 절차, 개방 생검 또는 심각한 외상성 손상, 또는 연구 치료 과정 동안 주요 수술에 대한 필요성 예상.

7. 무작위배정시 존재하는 말초 신경병증 > CTC 2등급.

8. 부적절한 골수 기능: ANC < 1.5 x 109/L, 혈소판 수 < 100 x 109/L 및 Hb < 9 g/dL.

9. 부적절한 간 기능:

- 혈청 (총) 빌리루빈 > ULN

- AST 및 ALT > 2.5 x ULN

- 기준치에서 혈청 알칼리성 포스페이트 수준 > 2.5 x ULN과 함께 AST 또는 ALT > 1.5 x ULN

10. 부적절한 신장 기능:

i. 혈청 크레아티닌 > 2.0 mg/dL 또는 177 mol/L

ii. 단백뇨에 대한 소변 시험지검사 2+. 기준치에서 시험지 요분석에서 2+ 단백뇨를 갖는 환자는 24 시간 채뇨해야 하고 1 g의 단백질/24 시간을 나타내야 한다.

11. 코르티코스테로이드를 사용한 만성적 매일 치료(>10 mg/일 메틸프레드니솔론 등가량의 용량)(흡입 스테로이드 제외).

12. 아스프린(>325 mg/일) 또는 클로피도그렐(>75 mg/일)을 사용한 만성적 매일 치료.

13. 조절되지 않는 고혈압(수축기 >150 mm Hg 및/또는 이완기 >100 mm Hg) 또는 임상적으로 유의한(즉, 활동성) 심혈관 질환: CVA/뇌졸중(무작위배정 전 6개월), 심근경색(무작위배정 전 6개월), 불안정 협심증, 뉴욕 심장 학회(NYHA, 부록 6) 클래스 2 이상의 울혈성 심부전, 또는 약을 필요로 하는 중증 심부정맥.

14. 유전적 출혈성 소질 또는 출혈 위험이 있는 응고장애의 이력 또는 징후.

15. 무작위배정 전 6개월 이내 복벽 누공, 위장 천공 또는 복강내 농양의 이력 또는 징후.

16. 무작위배정시 정맥내 항생물질을 요하는 활동성 감염.

17. 중증 비-치료 상처, 소화성 궤양 또는 골절.

18. 임의의 다른 질환, 대사 또는 심리 기능장애, 물리적 검사 결과, 또는 연구하는 약물의 사용을 금지하거나 또는 연구 일정하의 환자 수용상태에 영향을 미치거나 환자를 치료 합병증의 높은 위험에 처하게 할 수 있는 질환 또는 질병을 타당하게 의심케하는 임상 실험실 결과의 증거.

19. 임신 또는 수유중 여성. 혈청 임신 검사는 연구 치료 시작 전 7일 이내에, 또는 연구 치료 시작 전 7일 이내의 확인 요임신 검사하에 14일 이내에 평가되어야 한다.

20. 효과적인 비-호르몬적 피임 수단(자궁내 피임 장치, 살정자 젤리 또는 수술적 불임과 함께 차단 피임 방법)을 이용하지 않는 출산 가능성을 갖는 환자(마지막 생리후 2년이 안된 여성).

21. 또 다른 연구 약물을 사용한 현재 또는 최근(연구 치료 시작 전 30일 이내) 치료 또는 또 다른 조사 연구에 참여.

22. 임의의 연구 약물 또는 부형제에 대한 알려진 과민성.

23. 중국 햄스터 난소 세포 생성물 또는 다른 재조합 인간 또는 인간화 항체에 대한 과민성.

결과:

계층화되지 않고 비-프로토콜 치료(NPT)에 대해 검열되지 않은 연구자-평가 PFS에서의 개선은, 전술한 바와 같이 연구의 대조군보다 2.8개월 더 긴 것으로 산출되었다. 구체적으로, 표 2에 요약된 바와 같이, 중앙 PFS는 대조군(A 군)에 대한 13.7개월 대 "베바시주맙" 군(B 군)에 대한 16.5개월이었으며, 이때 위험비는 95% CI(0.65, 1.02)에서 0.82, p-값 = 0.0775이었다.

연구자-평가 PFS

	트라스트주맙+독소루비신 (n=208)	트라스트주맙+독소루비신+베바시주맙(n=216)
결과가 없는 대상체의 수	154(74.0%)	153(70.8%)
무진행 생존기간율(개월) 중앙값 (95% CI)	13.7(11.4, 16.3)	16.5(14.1, 19.1)
HR(95% CI) p-값(로그-순위)	0.82(0.65, 1.02) 0.0775
계층화 분석 HR(95% CI) p-값(로그-순위)	0.76 (0.60, 0.96) 0.0216

또한, 계층화되고 NPT에 대해 검열된 독립 심사 위원회(IRC)의 평가된 PFS 결과는 통계적학적으로 유의하였다. 구체적으로, 표 3에 요약된 바와 같이, 중앙 PFS는 대조군(A 군)에 대한 13.9개월 대 "베바시주맙"군(B 군)에 대한 16.8개월이었으며, 이때 위험비는 95% CI(0.54, 0.94)에서 0.72, p-값 = 0.0162이었다. 전체적으로, 중앙 "B 군" 또는 "베바시주맙" 군의 PFS는 연구의 대조군보다 2.9개월 더 길었다.

독립 심사 위원회(IRC) PFS

	트라스트주맙+독소루비신 (n=208)	트라스트주맙+독소루비신+베바시주맙(n=216)
결과가 있는 대상체 수	114 (54.8%)	111 (51.4%)
무진행 생존기간율(개월) 중앙값 (95% CI)	13.9(11.2, 16.7)	16.8(14.1, 19.5)
계층화 분석 HR(95% CI) p-값(로그-순위)	0.72(0.54, 0.94) 0.0162

연구의 객관적 반응률(ORR) 결과, 연구자-평가 결과(INV) 및 독립 심사위원회(IRC) 평가 결과를 둘 다 표 4에 나타내었다. 구체적으로, INV-평가된 ORR의 경우, 연구는 대조군에서의 69.9% ORR 대 "베바시주맙"군 또는 B 군에서 74.3%를 나타내었다. 두 군 사이의 차이는 0.3492의 p-값하에 95% CI(-5.2%, 14.0%)에서 4.43%이다. IRC-평가된 ORR의 경우, 연구는 대조군에서의 65.9% ORR 대 "베바시주맙" 또는 B 군에서 76.5%를 나타내었다. 두 군 사이의 차이는 0.0265의 p-값하에 95% CI(1.0%, 20.2%)에서 10.59%이었다.

객관적 반응률(ORR)

	트라스트주맙+독소루비신(n=176)	트라스트주맙+독소루비신+베바시주맙(n=183)
INV 전체 반응이 있는 환자 수 CR PR 전체 반응에 대한 95% CI	123(69.9%) 10(5.7%) 113(64.2%) (62.5, 76.6)	136(74.3%) 10(5.5%) 126(68.9%) (67.4, 80.5)
전체 반응률의 차이 차이에 대한95% CI P-값	4.43 (-5.2, 14.0) 0.3492
IRC 전체 반응이 있는 환자 수 CR PR 전체 반응에 대한 95% CI	116(65.9%) 2(1.1%) 114(64.8%) (58.4, 72.9)	140(76.5%) 2(1.1%) 138(75.4%) (69.7, 82.4)
전체 반응률의 차이 차이에 대한 95% CI P-값	10.59 (1.0, 20.2) 0.0265

연구의 잠정적 전체 생존기간(OS) 결과는 표 5에 요약되어 있고, 상기 표는 중앙 생존율이, 95% CI(0.74, 1.38) 및 0.9543의 p-값에서 1.01의 위험비(HR)하에, 대조군에서 38.3개월 대 "베바시주맙" B 군에서 38.5개월임을 나타내었다.

잠정적 전체 생존기간(OS)

	트라스트주맙+독소루비신(n=208)	트라스트주맙+독소루비신+베바시주맙(n=216)
사망한 환자 수	78 (37.5%)	81 (37.5%)
전체 생존기간(개월)
중앙값(95% CI)	38.3(34.3, NR)	38.5(32.1, NR)
HR(95% CI) p-값(로그-순위)	1.01 (0.74, 1.38) 0.9543
계층화 분석HR(95% CI) p-값(로그-순위)	0.94 (0.68, 1.30) 0.7078

또한, 안전성에 대한 예비 평가는 상기 연구에서 환자에 의해 나타난 새로운 안전성 징후가 없었음을 보여주었다.

실시예 2

AVEREL 연구에서 탐색적 바이오마커 분석

환자 및 면역화학 방법

혈장 기준치 샘플은 본 임상시험에서 162명의 환자로부터 분석에 이용가능하였다.

혈장 분석

바이오마커 발견 및 확인을 위한 혈액 샘플은 연구 BO20231에서 동의하는 환자들로부터 수집하였다. 혈액 샘플(총 약 20 ml)은 기준치에서(무작위배정 후, 연구 약제의 첫번째 투여전에) 및 질환 진행시에 수집하였다.

총 4.9 ml의 혈액을 S-모노베트(S-monovette: 등록상표)(EDTA) 튜브내에 채혈하였다. 그 후에 이들을 튜브를 약하게 뒤집어 균질하게 혼합하고 원심분리기에서 약 1500 g에서 30분내에 원심분리하였다(실온에서 10 분동안). 직후에, 상등액 혈장을 투명한 폴리프로필렌 5 ml 이송 튜브에 분취하였다. 그런 다음, 혈장을 2개의 플라스틱 저장 튜브(각각 약 1.25 ml)에 분취하였다. 샘플을 -70 에서 수직 위치로 저장하였다. 일부 경우에서, 샘플을 -20 에서 1개월까지 저장한 다음 -70 로 옮겼다.

샘플들은 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH)로부터의 면역학적 다중파라미터 칩 기술(IMPACT)을 이용하여, 인터루킨-8(IL-8), 세포간 접합 분자 1(ICAM-1), VEGF-A, VEGF-C, VEGF 수용체-1(VEGFR-1), VEGF 수용체- 2(VEGFR-2), VEGF 수용체-3(VEGFR-3), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 혈소판 유래 성장 인자 C(PDGF-C) 및 E-셀렉틴의 수준 측정에 사용하였다.

IMPACT 다중 분석 기술

로슈 프로페셔날 다이아그노스틱스(Roche Professional Diagnostics)(로슈 다이아그노스틱스 게엠베하)는 작업명 IMPACT(면역학적 다중파라미터 칩 기술) 하의 다중마커 플랫폼을 개발하였다. 상기 기술은 "혈장 분석" 부분에서 전술한 단백질 마커의 측정에 사용되었다. 상기 기술은 유럽특허 제 0939319 호 및 제 1610129 호에 개시된 바와 같은 절차에 의해 제조된 소형 폴리스티렌 칩을 기반으로 한다. 상기 칩 표면은 스트렙타비딘 층으로 코팅되었고, 이어서 상기 층 위에 비오티닐화 항체가 모든 분석을 위해 스폿팅(spotting)되었다. 각각의 마커에 대해, 항체들의 스폿(spot)을 칩 위에 수직선으로 부하시켰다. 분석시에, 어레이를 특정 분석물을 함유하는 시료 샘플로 프로브하였다.

칩 상의 모든 마커를 측정하기 위해 시료당 필요한 혈장 부피는 칩 1에 대해 20 L, 및 칩 2 및 칩 3에 대해 8 L이었다(하기 참조). 상기 샘플 부피를 배양 완충액(50 mM HEPES(pH 7.2), 150 mM NaCl, 0.1% 테싯(Thesit), 0.5% 소 혈청 알부민 및 방부제로서 0.1% 옥시피리온)과 함께 적용하여 칩당 40 L의 전체 반응 부피를 제공하였다. 12 분간 배양하고 세척 완충액(5 mM 트리스(pH 7.9), 0.01% 테싯 및 0.001% 옥시피리온)을 사용하여 세척한 후, 디곡시게닐화 검출 항체 혼합물을 첨가하고(디곡시게닌(Digoxigenin)으로 표지된 분석물-특이적 항체의 혼합물을 포함하는 배양 완충액 40 L) 추가 6 분 동안 배양하여 포획된 분석물 상에 결합시켰다. 형광 라텍스에 결합된 항-디곡시게닌 항체 접합체를 포함하는 시약 완충액(62.5 mM TAPS(pH 8.7), 1.25 M NaCl, 0.5% 소 혈청 알부민, 0.063% 트윈 20 및 0.1% 옥시피리온) 40 L로 세척한 후 제 2의 항체를 최종적으로 검출하였다. 상기 표지를 사용하여, 단일 스폿에서 10개의 개별적 결과를 검출하여, fmol/L 농도 이하까지의 매우 높은 민감성을 얻을 수 있었다. 칩을 검출 유닛으로 이송하였고, 전하 결합 소자(CCD) 카메라는 영상을 제공하고 이것을 전용 소프트웨어를 사용하여 신호 강도로 변환시켰다. 개개 스폿들은 미리정해진 위치에 자동적으로 배치되고 영상 분석에 의해 정량화되었다. 각각의 마커에 대해, 10 내지 12개 스폿들의 라인을 칩 위에 부하시키고, 마커의 농도를 칩 상의 각각의 라인으로부터 적어도 5개의 스폿들의 평균으로서 계산하였다. 상기 기술의 이점은 샌드위치 또는 경쟁 포맷으로 10개 이하의 파라미터를 다중화시키는 능력이다. 칼리브레이터(calibrator) 및 환자 샘플을 2중으로 측정하였다. 하나의 작업은 칼리브레이터 및 작업 대조군으로서 2개의 다중-대조군을 포함하여, 총 100회의 측정을 포함하도록 설계되었다. 선택된 반응물의 일부는 서로(즉, VEGF-A와 VEGFR-1 또는 VEGFR-2)와 반응하기 때문에, 분석물을 다음과 같이 3개의 상이한 칩 상에 분배하였다:

칩 1: VEGF-A, VEGF-C, PDGF-C

칩 2: VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, IL-8, bFGF

칩 3: E-셀렉틴, ICAM-1

본 분석에 사용된 항체

분석물	포획 항체	제조자	검출 항체	제조사
E-셀렉틴	<E-셀렉틴>M-BBIG-E5	알앤디 시스템즈	<E-셀렉틴>M-5D11	알앤디 시스템즈
ICAM-1	<ICAM-1>M-11C81	알앤디 시스템즈	<ICAM-1>M-14C11	알앤디 시스템즈
VEGFR-3	<VEGF-R3>M-54716	알앤디 시스템즈	<VEGF-R3>M-5B6	아브노바

통계학적 분석

샘플 중앙값을 이용하여 저(중앙값 미만) 또는 고(중앙값 이상)로 바이오마커 수준을 둘로 나누었다.

고 또는 저 바이오마커 수준을 갖는 환자의 소집단에서 치료 효과의 위험비는 비례 위험 콕스 회귀 분석(proportional hazard cox regression analysis)으로 평가하였다.

또한, 비례 위험 콕스 회귀분석을 이용하여 바이오마커 수준과 치료 효과 사이의 연관성을 평가하였다. 모델은 하기 공변수(covariate)를 포함하였다: 시험 치료, 바이오마커 수준, 이원 층화 인자(ER/PgR 상태, 기준치에서 측정가능한 질환, 사전 보조제/선행보조 탁산/보조/마지막 용량의 보조/선행보조 화학치료 이후 재발까지시간, 사전 트라스투주맙 선행보조 치료), 바이오마커 수준에 의한 치료의 상호작용 기간. 상호작용 기간에 대한 월드 검증(Wald test)을 이용하여 바이오마커 수준과 치료 효과 사이의 연관성을 측정하였다. 0.05 미만의 P-값을 유의적인 것으로 간주하였다.

통계학적 방법

분석 집단

연구 약제의 임의 성분을 투여받고 전술한 바와 같이 시판중인 항체를 사용하여 평가된 하기의 바이오마커들 중 어느 하나에 대해 기준치에서의 마커 수준을 갖는 모든 환자로 이루어진 바이오마커 평가가능한 집단을 본 연구에서 규정하였다: VEGF-A, VEGF-C, VEGFR-1, VEGFR-2, E-셀렉틴, VEGFR-3, IL-8, bFGF, PDGF-C, ICAM-1.

다중성에 대한 조정

I형 오류의 남발을 피하기 위해, 하기에 나타낸 바와 같은 바이오마커에 등급을 적용하였다. 각각의 바이오마커를 양측검정 5% 수준에서 시험하고, 통계학적 유의성이 충족되는 경우에만 등급에서 다음 바이오마커를 시험하였다.

1. VEGF-A

2. VEGF-R2

3. ICAM-1

4. bFGF

5. IL-8

6. VEGF-R1

7. PDGF-C

8. VEGF-C

9. VEGFR-3

10. E-셀렉틴

효능 분석

PFS 및 OS는 연구 BO20231에 대해 데이터 보고 분석 메뉴얼(DRAM)에 명시된 바와 같이 정의되었다. 바이오마커 데이터의 분석은 최종 PFS 분석 시에 PFS(연구자 평가) 데이터를 기반으로 하였다. 샘플 중앙 바이오마커 농도를 군의 환자들에 대한 컷 포인트(높은 수준 대 낮은 수준의 농도)로서 사용하였다.

무진행에 대한 분석

바이오마커 평가가능한 집단에서 PFS에 대해 하기의 분석을 수행하였다:

- 낮은 바이오마커 수준을 갖는 환자 및 높은 바이오마커 수준을 갖는 환자에 대해 카플란-메이어 곡선으로부터 평가된 중앙 PFS(95% CI)

- 낮은 바이오마커 수준을 갖는 환자 및 높은 바이오마커 수준을 갖는 환자에 대해 콕스 모델로부터의 비계층화된(및 PFS에 대해 계층화된) HR(95% CI)

- 바이오마커 수준의 사분위수에 의한 콕스 모델로부터의 비계층화된 HR(95% CI)

- 바이오마커가, 기준치 바이오마커 수준(샘플 중앙값에서 높고 낮은 수준으로 양분되는 이원 변수로서), 치료, 기준치 예후 인자 및 상호작용 기간(치료에 의한 기준치 바이오마커 수준)을 포함하는 콕스 모델을 이용하여, 국소 재발성 또는 전이성 HER2 양성 유방암을 갖는 환자에 대한 베바시주맙에 의한 PFS에 대한 치료 이점을 예측하는지를 평가하기 위해 바이오마커 평가가능한 환자에 대해 상호작용 검사를 수행하였다.

결과

혈장 마커: 바이오마커의 기준치 기술적 통계를 표 7에 나타내었다.

바이오마커 값(기준치)에 대한 기술적 통계

	E-셀렉틴(ng/mL)	ICAM-1(ng/mL)	VEGFR-3(ng/mL)
최소값	9.3	92.2	3.5
qu 25%	26.7	170.4	7.8
중앙값	36.9	210	10.6
qu 75%	49.1	272.2	13.0
최대값	212.9	749.9	43.5
평균	41.4	239.5	10.8
sd	25.08	106.27	4.30

표 8은 연구자 평가된 무진행 생존기간에 대한 치료 효과와 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3의 연관성에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.

하위군		TH		BV + TH		HR (95% CI)	연관성 p-값^a
하위군		사건/pts, n	중앙값, mo	사건/pts, n	중앙값, mo	HR (95% CI)	연관성 p-값^a
모두		64/82	11.2	66/80	16.5	0.78 (0.56-1.11)
E-셀렉틴	L	31/44	16.4	30/36	16.5	1.01 (0.61-1.68)	0.241
E-셀렉틴	H	32/37	8.2	35/43	16.6	0.57 (0.35-0.92)	0.241
ICAM-1	L	30/45	16.4	29/35	16.5	1.13 (0.68-1.89)	0.017
ICAM-1	H	33/36	10.3	36/44	16.2	0.49 (0.30-0.80)	0.017
VEGFR-3	L	35/48	12.2	25/32	15.3	0.88 (0.52-1.47)	0.051
VEGFR-3	H	28/33	11.0	40/47	16.6	0.65 (0.40-1.06)	0.051
^a모델은 예후 인자를 포함한다. T: 도세탁셀, H: 트라스투주맙, BV: 베바시주맙, L: 낮음, H: 높음

상기 분석에서, E-셀렉틴, 높은 E-셀렉틴(≥ 36.9 ng/mL), 낮은 E-셀렉틴(< 36.9 ng/mL), ICAM-1, 높은 ICAM-1(≥ 210 ng/mL), 낮은 ICAM-1(< 210 ng/mL), 및 VEGFR-3, 높은 VEGFR-3(≥ 10.6 ng/mL), 낮은 VEGFR-3(< 10.6 ng/mL)이 사용되었다.

높은 기준선 ICAM-1은 =0.05에서 베바시주맙으로부터 큰 PFS 이점으로 통계적으로 유의하게 관련된다. VEGFR-3 및 E-셀렉틴은 잠재적인 예측 값을 나타낸다. 따라서, ICAM-1, E-셀렉틴 및 VEGFR-3은 무진행 생존기간에서 베바시주맙 치료 효과를 위한 독립적인 예측 바이오마커일 수 있다.

또한, PFS에서 ICAM-1의 효과는 ICAM-1의 탐색 4분위 분석에서 명백하였다(표 9).

ICAM-1 농도 중앙값(개월) 기준선에 따른 PFS의 4분위 분석

4분위	사건/N	BV+TH	TH	HR	(95% CI)
1st	28/40	12.7	17.2	1.54	(0.72-3.31)
2nd	31/40	20.0	14.7	0.84	(0.41-1.75)
3rd	34/40	16.4	10.5	0.59	(0.30-1.17)
4th	35/40	16.2	8.6	0.35	(0.17-0.73)

Claims

(a) 유방암으로 진단된 환자로부터 수득된 샘플에서 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a)에 따른 발현 수준에 근거하여 항-VEGF 항체를 포함하는 항암 요법에 의해 환자가 더욱 또는 덜 적절하게 치료되는지를 확인하되, 이때 기준 수준 이상의 상기 바이오마커의 발현 수준은, 환자가 상기 항암 요법에 의해 더욱 적절하게 치료됨을 나타내거나, 기준 수준 미만의 상기 바이오마커의 발현 수준은, 환자가 상기 항암 요법에 의해 덜 적절하게 치료됨을 나타내는, 단계
를 포함하는, 유방암으로 진단된 환자가 항-VEGF 항체를 포함하는 항암 요법에 의해 더욱 또는 덜 적절하게 치료되는지를 측정하는 방법.
제 1 항에 있어서,
환자가 항암 요법에 의해 적절하게 치료되는지 여부가 무진행 생존기간의 관점에서 측정되는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
환자를 항암 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
항암 요법이 항-VEGF 항체, 항-HER2 항체 및 탁산을 포함하는 방법.
(a) 유방암으로 진단된 환자로부터 유래된 생물학적 샘플을 분석함으로써 상기 환자가 기준 수준 이상의 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 가짐을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정에 근거하여, 항-VEGF 항체를 포함하는 항암 요법을 포함하는 치료를 선택하는 단계
를 포함하는, 유방암으로 진단된 환자를 위한 치료를 선택하는 시험관내 방법.
제 5 항에 있어서,
환자를 항암 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
항암 요법이 항-VEGF 항체, 항-HER2 항체 및 탁산을 포함하는 방법.
(a) 유방암으로 진단된 환자로부터 수득된 샘플에서 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a)에 따른 발현 수준에 근거하여 상기 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 대해 민감한지를 확인하되, 이때 기준 수준 이상의 상기 바이오마커의 발현 수준은, 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 대해 민감함을 나타내는, 단계
를 포함하는, 유방암으로 진단된 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감한지를 측정하는 시험관내 방법.
제 8 항에 있어서,
환자를 항암 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체의 첨가를 포함하는 항암 요법에 대해 민감한지 여부가 무진행 생존기간의 관점에서 측정되는 방법.
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
화학치료 요법이 항-HER2 항체 및 탁산을 포함하는 방법.
(a) 유방암으로 진단된 환자로부터 유래된 생물학적 샘플을 분석함으로써 상기 환자가 기준 수준 이상의 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 가짐을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정에 근거하여, 화학치료 요법에 대한 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법을 선택하는 단계
를 포함하는, 유방암으로 진단된 환자를 위한 항암 요법을 선택하는 시험관내 방법.
제 12 항에 있어서,
환자를 항암 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
화학치료 요법이 항-HER2 항체 및 탁산을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
환자가 국소 재발성 또는 전이성 HER2 양성 유방암으로 진단되는 방법.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
환자가 이전에 화학치료 또는 방사선 치료를 받지 않은 방법.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
항-VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.
제 4 항, 제 7 항, 제 11 항 및 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
탁산이 도세탁셀 또는 파클리탁셀인 방법.
제 18 항에 있어서,
탁산이 도세탁셀인 방법.
제 4 항, 제 7 항, 제 11 항 및 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
항-HER2 항체가 트라스투주맙인 방법.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
발현 수준이 단백질 발현 수준인 방법.
제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플이 혈장 샘플인 방법.
제 22 항에 있어서,
E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3의 발현 수준이 각각 약 36.9 ng/mL, 약 210 ng/mL 및 약 10.6 ng/mL인 방법.
제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 바이오마커가 E-셀렉틴인 방법.
제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 바이오마커가 ICAM-1인 방법.
제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 바이오마커가 VEGFR-3인 방법.
유방암으로 진단된 환자가 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 15 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 방법에 따른 항-VEGF 항체를 포함하는 항암 요법으로 더욱 적합하게 치료되는 것으로서 확인되는, 상기 환자의 치료를 위한 항-VEGF 항체를 포함하는 약학 조성물.
유방암으로 진단된 환자가 제 8 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 방법에 따른 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 민감한 것으로서 확인되는, 상기 환자의 치료를 위한 항-VEGF 항체를 포함하는 약학 조성물.
E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 검출하기 위한 화합물의 세트를 포함하는 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트로서, 상기 세트가 상기 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는, 키트.
(a) 양성 유방암으로 진단된 환자로부터 유래된 샘플에서 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a)에 따른 발현 수준에 근거하여 상기 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 민감한지를 확인하되, 이때 기준 수준 이상의 상기 바이오마커의 발현 수준은, 환자가 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 민감함을 나타내는, 단계; 및
(c) 상기 (b)에 따른 화학치료에 항-VEGF 항체를 첨가함을 포함하는 항암 요법에 민감한 것으로서 확인된 환자에게 효과량의 항-VEGF 항체 및 효과량의 화학치료 요법을 조합하여 투여하는 단계
를 포함하는, 화학치료 요법에 항-VEGF 항체를 첨가하여 유방암으로 진단된 환자에서 화학치료 요법을 포함하는 항암 요법의 치료 효과를 개선하는 방법.
제 30 항에 있어서,
화학치료 요법이 항-HER2 항체 및 탁산을 포함하는 방법.
제 30 항 또는 제 31 항에 있어서,
환자가 국소 재발성 또는 전이성 HER2 양성 유방암으로 진단된 방법.
제 30 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
환자가 이전에 화학치료 또는 방사선 치료를 받지 않은 방법.
제 30 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
항-VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.
제 31 항에 있어서,
탁산이 도세탁셀 또는 파클리탁셀인 방법.
제 35 항에 있어서,
탁산이 도세탁셀인 방법.
제 31 항에 있어서,
항-HER2 항체가 트라스투주맙인 방법.
제 30 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
발현 수준이 단백질 발현 수준인 방법.
제 30 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플이 혈장 샘플인 방법.
제 39 항에 있어서,
E-셀렉틴, ICAM-1 및 VEGFR-3의 발현 수준이 각각 약 36.9 ng/mL, 약 210 ng/mL 및 약 10.6 ng/mL인 방법.
제 30 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 바이오마커가 E-셀렉틴인 방법.
제 30 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 바이오마커가 ICAM-1인 방법.
제 30 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 바이오마커가 VEGFR-3인 방법.