CN1933851B - 使用抗-α5β1抗体抑制癌细胞增殖 - Google Patents

Abstract

本发明提供了采用抗-α5β1抗体直接杀伤癌细胞的方法。通常，该方法包括将在其表面表达α5β1的癌细胞与抗-α5β1抗体接触，从而诱导癌细胞死亡。本发明方法可用于癌症发生早期的患者，以防止肿瘤形成。此外，该方法还可用于治疗已形成的肿瘤，尤其是尚未证实易受抗-血管新生疗法作用的癌症。可以抗-α5β1抗体与癌症化疗剂或其它分子基癌症治疗剂的联合疗法的形式应用该方法。

Description

使用抗-α5β1抗体抑制癌细胞增殖

发明领域

本发明提供了能特异性识别癌细胞表面表达的α5β1整联蛋白的抗体，以及利用该抗体抑制癌细胞增殖的方法。

发明背景

α5β1整联蛋白与肿瘤血管新生的关联是众所周知的(例如，参见1999年5月7日提交的美国专利申请US 2002/0172675 A1，其内容被纳入本文作为参考)。α5β1是能特异性结合配体纤连蛋白的异二聚化整联蛋白。α5β1在内皮细胞表面表达，介导向纤连蛋白迁移并粘附于纤连蛋白。已发现α5β1与纤连蛋白间的结合相互作用对肿瘤血管新生非常重要。当一种或多种促血管新生生长因子(例如，FGF、VEGF、PDGF等)的释放局部激活内皮细胞时，肿瘤内开始进行血管新生。然后，这些激活的内皮细胞通过其α5β1整联蛋白与细胞外基质中的纤连蛋白结合，形成新的血管。在体内肿瘤模型中，已发现抗-α5β1抗体能抑制血管新生(例如，参见US2002/0172675 A1)。

抗血管新生癌症治疗建立在抑制肿瘤血管形成，从而防止肿瘤继续生长和转移的基础上(例如，参见综述Marx，“加剧肿瘤饥饿”(A Boost for TumorStarvation)，Science 301,452(2003)；Sato，“肿瘤血管新生的分子诊断与抗血管新生的癌症治疗”(Molecular Diagnosis of Tumor Angiogenesis andAnti-Angiogenic Cancer Therapy)，Int.J.Clin.Oncol.8,200(2003)；Bissachi等，“抗血管新生和阻止新血管形成：机制、问题与展望”(Anti-Angiogenesis andAngioprevention：Mechanisms，Problems and Perspectives)，Cancer Detec.Prev.27，229(2003))。目前超过60种基于抗血管新生的疗法处于癌症治疗的临床开发阶段。虽然在一些癌症中，可通过阻止肿瘤血管形成而“饥饿”肿瘤，但目前的研究表明，一些癌症不易受到抗血管新生治疗的作用(参见Sato，同上)。例如，抗-VEGF抗体药物AVASTINTM(贝伐单抗)在结肠癌的临床试验中成功，但在乳腺癌中不成功(参见Marx，同上)。此外，基于抗-血管新生的治疗方法不大适用于肿瘤血管形成过程尚未开始时的早期治疗。

由于其在血管新生中的作用，提出将α5β1整联蛋白作为多种由血管新生过程介导的疾病(包括恶性肿瘤生长)的治疗靶点。开发了阻断与纤连蛋白的特异性结合的嵌合性和人源化的α5β1抗体。发现嵌合性α5β1抗体M200(也可称为其通用名称，沃罗昔单抗(volociximab))能体外诱导活化的内皮细胞凋亡，而与生长因子刺激无关。

因此，仍然需要甚至在肿瘤血管形成过程开始之前，或当证明靶向抗血管新生疗法无效时，能够直接杀伤癌细胞的癌症疗法和早期治疗方法。

发明概述

本发明提供了利用抗-α5β1抗体杀伤癌细胞的方法。在一个一般的实施方式中，该方法包括将表面表达α5β1的癌细胞与抗-α5β1抗体接触。

在一个优选的实施方式中，本发明提供了抑制表面表达α5β1整联蛋白的癌(或肿瘤)细胞增殖的方法，所述方法包括将肿瘤细胞与能结合肿瘤细胞表面表达的α5β1整联蛋白的抗体接触。在一个优选的实施方式中，肿瘤细胞来自难治性实体瘤患者。在另一个优选的实施方式中，肿瘤细胞来自选自下组的癌：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、纤维肉瘤、肺癌、转移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾细胞癌和脾脏癌。

在另一个实施方式中，本发明提供了诱导表面表达α5β1整联蛋白的肿瘤细胞死亡的方法，该方法包括将肿瘤细胞与能结合肿瘤细胞表面表达的α5β1整联蛋白的抗体接触。在一个优选的实施方式中，肿瘤细胞来自难治性实体瘤患者。在另一个优选的实施方式中，肿瘤细胞来自选自下组的癌：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、纤维肉瘤、肺癌、转移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾细胞癌和脾脏癌。

在另一个实施方式中，本发明提供了抑制患者癌细胞增殖的方法，所述癌细胞在其表面表达α5β1整联蛋白。在本实施方式中，所述方法还包括给予患者治疗有效量的抗体，所述抗体竞争性抑制M200与癌细胞表面的α5β1整联蛋白结合。在另一个实施方式中，抗体包含氨基酸序列与SEQ ID NO：2、4、6和8基本上相同的可变区。在此方法的一个优选的实施方式中，给予患者的抗体中和了α5β1整联蛋白的至少一种生物学活性。在另一实施方式中，给予患者的抗体包含治疗效应物部分(例如，抗体-药物偶联物)。在所述方法的又一个实施方式中，将抗体与另一种化疗药物按顺序或一起给予患者。在所述方法的另一个优选实施方式中，将抗体与另一种化疗药物按顺序或一起给予难治性实体瘤患者。

在另一个实施方式中，本发明提供了治疗怀疑发生细胞表面表达α5β1的癌症的对象的方法，其中，所述对象尚未发生肿瘤，所述方法包括给予患者治疗有效量的含可结合α5β1整联蛋白的抗体的药物组合物。在一个优选的实施方式中，癌症选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、纤维肉瘤、肺癌、转移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾细胞癌和脾脏癌。

在另一个实施方式中，本发明提供了治疗具有患表达α5β1的癌症的遗传倾向的对象的方法，其中，所述对象尚未发生肿瘤，所述方法包括给予对象治疗有效量的含可结合α5β1整联蛋白的抗体的药物组合物。在一个优选的实施方式中，癌症选白：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、纤维肉瘤、肺癌、转移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾细胞癌和脾脏癌。

可用于本发明方法的优选抗-α5βl抗体包括IIAl、M200、F200以及与IIAl、M200和F200一样特异性结合于α5β1上相同表位的抗体。

在另一个实施方式中，可用于本发明方法的抗．-α5β1抗体包括能竞争性抑制IIAl和/或M200与肿瘤细胞表面表达的伐α5β1整联蛋白的结合的抗体。

可用于本发明方法的其它抗体包括具有与SEQ ID NO：2、4、6和8基本上相同的可变区氨基酸序列的抗体。并且，包括具有与SEQ ID NO：2、4、6和8至少约90％、95％、98％或优选99％或更多相同的可变区氨基酸序列的抗体。

在另一个实施方式中，本发明提供配制成药物组合物的抗．-α5β1抗体。这些药物组合物可用于本文公开的各种本发明方法。在各种实施方式中，可通过多种途径将治疗有效量的抗。-α5β1抗体药物组合物给予对象，所述途径包括但不限于：口服、皮下、局部、静脉内、鼻内、经皮、腹膜内、肌内、肺内、经阴道、经直肠、眼内、心室内或鞘内。在优选的实施方式中，药物组合物是包含约1.O-15mg/mL的抗-α5β1抗体、约22-27mM柠檬酸盐、约145-165mM氯化钠、约0.04-0.06％的聚山梨酯(

)80，pH约5.5-7.5的液体制剂。在另一个优选的实施方式中，药物组合物是包含约10mg/mL抗-α5β1抗体、约25mM柠檬酸盐、约l50 mM氯化钠、约0.05％聚山梨酯(

)80，pH约6.5的液体制剂。在一个尤其优选的实施方式中，药物组合物是包含约lOmg/mLM200、约25 mM柠檬酸盐、约150 mM氯化钠、约0.05％聚山梨酯(

)80，pH约6.5的液体制剂。在其它优选的实施方式中，本文所述各药物组合物可还包含化疗药物。在另一个实施方式中，将含抗-α5β1抗体的药物组合物与治疗有效量的另一种化疗药物一起给予患者。

上述药物组合物可用于治疗诊断患有或怀疑患有选自下组的癌症的患者的方法中：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、纤维肉瘤、肺癌、转移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾细胞癌和脾脏癌，所述方法包括：静脉内给予患者治疗有效剂量的包含约1.0-15mg/mL抗-α5β1抗体、约22-27 mM柠檬酸盐、约145-165 mM氯化钠、约0.04-0.06％聚山梨酯(

)80，pH约5.5-7.5的液体制剂。在治疗方法的一个实施方式中，给予的治疗有效剂量约为10mg/kg。在一个优选的实施方式中，用药物组合物治疗的患者已被诊断患有或怀疑患有肾细胞癌或转移性黑色素瘤，治疗有效剂量约为10mg/kg。

附图简要说明

图1描述了：(A)IIAl V_H核酸序列(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ IDNO：2)；(B)IIA1 V_L核酸序列(SEQ ID NO：3)和氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

图2描述了：(A)M200 V_H核酸序列(SEQ ID NO：5)和氨基酸序列(SEQ IDNO：6)；(B)M200 V_L核酸序列(SEQ ID NO：7)和氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。

发明详述

为了清楚说明和理解，下面的描述以示例性实施方案和例证的方式详细阐述了本发明。本说明书所包括的实施方案和实施例不是为了限制本发明的范围。本领域普通技术人员容易明白，可采用等价材料和/或方法，和/或可对所述实施方案和实施例进行任何明显改变、变化或改进，而不背离所附权利要求书的范围。

本说明书所引用的所用文献和专利申请都已纳入本文作为参考，这就如同将各个出版物或专利申请单独列入本文作为参考一样。

除非另有说明，本文所用的所有科技术语的意义都与本发明所属技术领域的技术人员通常所理解的意义一致。

概述

本发明基于以下意外发现：α5β1整联蛋白在多种癌症的肿瘤上皮细胞表面上表达。并且发现，结合该表面α5β1的靶向抗体能直接杀伤这些癌细胞。因为攻击和杀伤死细胞的方法是直接的，适用于非常早期的治疗(即在实质性肿瘤形成之前)。而且，本发明直接杀伤癌细胞的方法尤其适用于治疗细胞表面表达α5β1但未证明易受抗-血管新生方法作用的癌症。该类癌症包括但不限于：膀胱癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和转移性黑色素瘤。

本发明提供了采用抗-α5β1抗体杀伤或防止癌细胞增殖的方法。在其最一般的实施方式中，所述方法包括将表面表达α5β1的癌细胞与抗-α5β1抗体接触，从而诱导癌细胞死亡(例如，通过凋亡)。

可采用本发明方法在体内(例如，在患者体内)杀伤癌细胞，从而防止或减缓肿瘤形成和生长。此外，该方法也可用于治疗已形成的肿瘤，可与其它癌症疗法(例如，化疗药物或其它分子基癌症治疗药物)联用。例如，相继使用抗体M200制剂和化疗化合物如阿霉素来治疗患有恶性肿瘤的患者。因为M200是人体内毒性较低的嵌合抗体，所以联合治疗可提供与仅用较高剂量的化疗药物相当的癌细胞杀伤能力，而没有伴随后者的毒副作用。

本发明提供一种方法，其中，抗-α5β1抗体直接杀伤和/或抑制癌细胞增殖，即使不存在任何易受这些抗体的抗-血管新生作用的肿瘤血管。因此，该方法尤其适用于预防或治疗表达α5β1但不形成高度血管化肿瘤、和/或不易受抗-血管新生疗法作用的癌症，例如，胰腺癌、肾癌、转移性黑色素瘤、肺癌和乳腺癌。

而且，由于M200(和本文所述其它抗-α5β1抗体)的癌细胞直接杀伤能力，可将这些抗体用于血管化肿瘤形成之前的早期癌症治疗。随着人类基因组序列中的遗传标记信息的发展，产生了新的更灵敏的癌症诊断方法，早期治疗方法就显得尤其重要。可能在非常早期即肿瘤前(pretumor)阶段来检测和诊断多种普通癌症，其中，癌细胞存在于组织和/或循环系统中，但尚未建立可由敏感性较差的非遗传诊断方法检测的肿瘤结构。在这种早期诊断方案中，当肿瘤血管形成尚未建立时，抗-血管新生疗法作用很小或没有作用，并且一般化疗剂毒副作用太大，难以应用。因为本发明方法可抗体-靶向地直接杀伤其表面上表达α5β1整联蛋白的癌细胞，所以该方法尤其适用于早期预防性治疗。

那些最有可能受益于早期治疗方法的对象包括但不限于：1)肿瘤前诊断试验显示发生和/或存在肿瘤(或微型肿瘤)的可能性高的对象；2)暴露于高强度致癌环境从而非常可能发生肿瘤的对象；和3)发生癌细胞在其表面表达α5β1的癌症的遗传倾向高的对象。

抗-α5β1抗体

本发明方法采用抗-α5β1抗体作为直接杀伤癌细胞的试剂。本文所用的术语“抗体”指可特异性结合特定抗原或能与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子，包括多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体和其它修饰形式的抗体，包括但不限于嵌合抗体、人源化的鼠抗体、异源偶联抗体(例如，双特异性抗体、双体、三体和四体)以及抗体的抗原结合片段，包括，例如Fab′、F(ab′)₂、Fab、Fv、rIgG和scFv片段。术语“scFV”指常规抗体的重链和轻链的可变区连接形成一条链的单链Fv抗体。此外，本发明描述中使用的术语“抗体”包括可与特定抗原反应的一种以上抗体的混合物(例如可与α5β1整联蛋白反应的不同类型单克隆抗体的混合物)。

优选地，本发明方法中使用的抗-α5β1抗体是单克隆抗体。可采用多种本领域已知的技术包括采用杂交瘤技术、重组技术和噬菌体呈现技术或它们的组合来制备本发明中使用的单克隆抗体，。例如，可采用本领域已知的杂交瘤技术制备单克隆抗体，例如，参见Harlow & Lane，《抗体，实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual)(1988)；Hammerling等，《单克隆抗体与T-细胞杂交瘤》(″Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)″，Elsevier，New York(1981)，第563-681页(这两份文献的内容被纳入本文作为参考)。可通过筛选重组抗体噬菌体文库或类似载体文库来制备抗体，例如，参见Huse等，Science246:1275-1281(1989)；Ward等，Nature 341:544-546(1989)；以及Vaughan等，Nature Biotech.14:309-314(1996)，或者用抗原或编码抗原的DNA免疫动物来制备抗体。

在优选的实施方式中，可采用过去已鉴定的抗-α5β1抗体、IIA1、M200或F200实施本发明直接杀伤癌细胞的方法。IIA1是亲代小鼠IgG1类抗体，已表明它能抑制α5β1整联蛋白与纤连蛋白的结合(例如，参见1999年5月7日提交的美国专利申请US 2002/0172675 A1，其内容被纳入本文作为参考)。M200是来源于IIA1的嵌合IgG4抗体。F200是来源于M200的Fab片段。在2003年11月26日提交的美国专利申请10/724,274和2004年4月23日提交的10/830,956中描述了这些抗体的产生、功能鉴定及其具体的氨基酸序列，其内容被纳入本文作为参考。在猴眼和兔眼模型中已表明，M200和F200都具有体内抗-血管新生效力(参见2003年11月26日提交的美国专利申请10/724,274，和2004年4月23日提交的10/830,956)。

本发明中使用的抗体还包括与IIA1、M200和F200一样特异性结合于α5β1上相同表位的抗体。“表位”(或“抗原决定簇”)指抗原上的抗体结合位点。表位可由连续氨基酸或通过蛋白质三级折叠并列的不连续氨基酸形成。例如，α5β1整联蛋白上表位可包括构成异源二聚体结构的各α和β多肽链上的氨基酸。连续氨基酸形成的表位用变性溶剂处理时通常可以保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常会消失。表位一般至少包括具有独特的空间构象的至少3个、更常见至少5个或6-10个氨基酸。确定表位空间构象的方法包括(例如)X射线晶体衍射和二维核磁共振。例如，参见《分子生物学方法中的表位作图指南》(Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology)，第66卷，Glenn E.Morris编(1996)。

当蛋白质中降低或消除一种抗体结合的氨基酸突变也可降低或消除另一种抗体的结合时，认为两种抗体结合相同的蛋白质表位。并且，当两种抗体竞争性结合某蛋白，即一种抗体与蛋白质的结合竞争性抑制、降低或消除另一种抗体的结合时，认为两种抗体结合相同的表位。因此，可采用已确定可竞争性抑制IIA1、M200(沃罗昔单抗)或F200与癌细胞表面表达的α5β1整联蛋白的结合的抗体来实施本发明方法。

可用于本发明方法的抗-α5β1抗体并不限于IIA1、M200和F200，而是包括具有与IIA1、M200和F200基本上相同的可变区、框架区或CDR氨基酸序列的抗体。可变区、框架区和CDR的长度是本领域普通技术人员所熟知的(例如，参见Kabat等，《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(″Sequences of Proteins ofImmunological Interest″)，第5版，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。如本文所用，抗体重链可变区(“V_H”或“VH”)或轻链可变区(“V_L”或“VL”)，包括重链或轻链抗原结合片段，例如Fv、scFv、dsFv或Fab。抗体轻链和重链可变区还包含四个被三个超变区间隔开的“框架”区，也称为“互补决定区”或“CDR”。CDR主要负责与抗原表位的结合。

“基本上相同的”可变区、恒定区、框架区或CDR指至少约85-90％，优选至少95％的氨基酸序列与天然或未改变的抗体可变区或恒定区相同的抗体区域。术语“相同的”或“相同性”百分数当用于比较两个或多个氨基酸或核苷酸序列时是指两个或多个序列或亚序列相同，或者其特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同(即，当比较和比对的比较窗或指定区内的最大一致性时，特定区域上具有约60％的相同性，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的相同性)，可利用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法确定相同性，默认参数如下所述，或者通过人工比对和目测确定相同性(例如，参见国家生物技术信息中心(NCBI)，网址www.ncbi.nlm.nih.gov中关于BLAST的描述)。

相同或基本上相同的序列包括含有缺失和/或加入的序列、具有取代的序列、以及天然产生的变体如多态性或等位基因变体和人工变体如保守修饰的变体。测定序列相同性的公知算法考虑到缺口等。优选地，相同性存在于至少长约为25个氨基酸或核苷酸，更优选长约50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。

本发明方法中使用的抗-α5β1抗体的氨基酸序列并不限于天然抗体中发现的序列；可采用公知的重组DNA技术重新设计抗体，以获得所需特征。这种“遗传上改变的抗体”包括那些氨基酸序列与亲代(即未改变)抗体不同的抗体。可能的变异包括从仅仅一个或几个氨基酸的改变到完全重新设计(例如)可变区或恒定区。在恒定区中可通过定点突变导致改变，以改进或改变治疗性抗体的功能特征，例如免疫原性、药代动力学特征(例如血清半衰期)、补体固定、与膜的相互作用以及其它效应子功能。通常，可改变抗体可变区，以改进抗原结合特征。

在一个优选的实施方式中，本发明的直接杀伤癌细胞方法中可采用嵌合抗体M200。术语“嵌合抗体”指一种免疫球蛋白分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、取代或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接于类别、效应功能和/或物种不同或改变的恒定区、或者连接于可赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或者(b)用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、取代或交换可变区或其一部分。制备嵌合抗体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。例如，参见Morrison等，Science 229：1202-1207(1985)；Oi等，BioTechniques 4：214-221(1986)；Gillies等，J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；和美国专利5,807,715、4,816,567和4,816,397，其内容被纳入本文作为参考。

在另一个优选的实施方式中，本发明直接杀伤癌细胞的方法采用人源化抗-α5β1抗体。当用于人体治疗时，人源化的抗体中添加的人序列可进一步降低抗体可能的免疫原性。IIA1的人源化类型参见2003年11月26日提交的美国专利申请10/724,274，和2004年4月23日提交的10/830,956中的描述，其内容被纳入本文作为参考。术语“人源化抗体”指含有人框架、至少一个且优选所有CDR来自非人抗体的免疫球蛋白分子，其中，存在的任何恒定区与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，即至少约85-90％，优选至少95％相同。因此，除CDR以外，人源化的免疫球蛋白的所有部分与一种或多种天然人免疫球蛋白序列的对应部分基本上相同。因此，这种人源化抗体是嵌合抗体，其中，大大小于完整的人可变区被非人可变区的相应序列取代。人框架区的框架残基可被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变、优选改进抗原结合(性能)。这些框架取代部分可由本领域公知的方法鉴定，例如，通过建立CDR与框架残基相互作用的模型来鉴定对抗原结合重要的框架残基，以及建立序列比较的模型来鉴定特定位置的非常规框架残基。例如，参见Queen等，美国专利5,530，101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370(本文都已完整纳入作为参考)。可采用本领域公知的各种方法来人源化抗体，例如，CDR-嫁接(EP 239,400；PCT专利公开号WO 91/09967；美国专利5,225,539；5,530,101和5,585,089)、贴面(veneering)或表面重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Mol.Immunol.，28:489-498(1991)；Studnicka等，Prot.Eng.7:805-814(1994)；Roguska等，Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-973(1994)，以及链改组(美国专利No.5,565,332)，这些都已完整纳入本文作为参考。

在另一个实施方式中，根据本发明方法，可利用人α5β1抗体(即包含人可变区和恒定区的抗体)来治疗人患者。可利用本领域已知的多种方法制备或获得人抗体，包括利用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库的上述噬菌体展示法。见美国专利4,444,887和4,716,111；PCT公开号WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO 96/33735和WO 91/10741，这些都已完整纳入本文作为参考。也可利用不能表达有功能的内源性免疫球蛋白、而可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠生产人抗体。生产人抗体的技术的一般介绍参见Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。制备人抗体和人单克隆抗体的技术和制备这些抗体的方案的详细描述参见，例如，PCT公开WO 98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO 96/33735；欧洲专利0598 877；美国专利5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,66l,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，这些都已完整纳入本文作为参考。也可采用称为“导向选择”的技术产生识别选定表位的完整人抗体。在这种技术中，使用选定的非人单克隆抗体如小鼠抗体，来指导识别相同表位的完整人抗体的选择(Jespers等，Biotechnology 12：899-903(1988)。

在另一个实施方式中，根据本发明方法，可采用灵长动物源化(primatized)抗体(即包含猴可变区和人恒定区的抗体)进行治疗。制备灵长动物源化抗体的方法是本领域已知的。例如，参见美国专利5,658,570；5,681,722；和5,693,780，这些都已完整纳入本文作为参考。

抗体功能

本发明方法采用能特异性结合α5β1整联蛋白的功能性抗体。抗体特异性结合抗原的亲合力试验使本领域技术人员能够鉴定出能特异性识别α5β1整联蛋白的一个或多个表位的抗体。如果发生下列情况则认为抗体的结合是特异性的：1)显示出结合活性的阈值水平，和/或2)抗体不与相关的多肽分子发生明显的交叉反应。

首先，如果本文所述抗-α5β1抗体与α5β1整联蛋白多肽、肽或表位的结合亲和力(K_a)达到10⁶ mol^-1或更高、优选10⁷mol^-1或更高、更优选10⁸mol^-1或更高、最优选10⁹mol^-1或更高，则本发明方法所用抗-α5β1抗体发生特异性结合(或“特异性反应”或“特异性免疫反应”)。本领域普通技术人员通过Scatchard分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660-72，1949)或利用BIAcore通过表面等离子共振很容易确定抗体的结合亲和力。可用于鉴定抗-α5β1抗体的各种抗体结合试验参见2003年11月26日提交的美国专利申请10/724,274，和2003年4月23日提交的10/830,956，其内容被纳入本文作为参考。

第二，抗体如果不与相关多肽发生明显的交叉反应则抗体进行特异性结合。如果采用标准蛋白质印迹分析(例如，参见《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel等编，1995)只检测到α5β1整联蛋白多肽而检测不到已知的相关多肽，则抗体不与相关的多肽分子发生明显的交叉反应。已知的相关多肽的例子包括直向同源物、整联蛋白蛋白家族成员中同一物种来源的蛋白、或突变改变了抗-α5β1表位的突变的α5β1整联蛋白多肽。另外，可以用已知的相关多肽“筛选”抗体，以分离出可与α5β1整联蛋白特异性结合的抗体群体。例如，将用人α5β1整联蛋白多肽产生的抗体吸附到粘附于不溶性基质的相关多肽上；在合适的缓冲液条件下使人α5β1整联蛋白多肽的特异性抗体流出该基质。这种筛选可以分离出与紧密相关多肽无交叉反应性的多克隆和单克隆抗体(《抗体：实验室手册》(Antibodies：A LaboratoryManual)，Harlow和Lane(编)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；《新编免疫学实验指南》(Current Protocols in Immunology)，Cooligan等(编)，NationalInstitutes of Health，John Wiley and Sons，Inc.，1995)。特异性抗体的筛选和分离方法是本领域所公知的(见《基础免疫学》(Fundamental Immunology)，Paul编)，Raven Press，1993；Getzoff等，Adv.in Immunol.43：1-98，1988；《单克隆抗体：原理与实践》(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，Goding，J.W.(编)，Academic Press Ltd.，1996，Benjamin等，Ann.Rev.Immunol.2：67-101，1984)。这种分析方法的典型例子包括：并行免疫电泳、放射性免疫分析、放射性免疫沉淀、酶联免疫吸附分析(ELISA)、点印迹或蛋白印迹分析、抑制性或竞争性分析以及夹心分析。免疫学方法和免疫分析方法的综述见《基础和临床免疫学》(Basic and Clinical Immunology)，(Stites & Terr编，第7版，1991)。

可通过α5β1结合的选择过程制备本发明方法中使用的特异性结合的抗-α5β1抗体。通常，可选择能特异性结合特定蛋白、或其多态性变体、等位基因、直向同源物、保守修饰变体、剪接变体的多克隆抗体，以获得只与选定蛋白(例如α5β1整联蛋白)发生特异性免疫反应而不与其他蛋白发生特异性免疫反应的多克隆抗体。通过消减与其它分子交叉反应的抗体，实现特异性结合的选择。可采用多种免疫分析模式来选择与α5β1整联蛋白多肽特异性反应的抗体。例如，固相ELISA免疫分析可用于选择能与蛋白发生特异性免疫反应的抗体(例如，参见Harlow & Lane，《抗体，实验室手册》(Antibodies，A LaboratoryManual)(1988)所描述的用于确定特异性免疫反应性的免疫分析形式和条件)。

抗体药物偶联物

在一些实施方式中，杀伤癌细胞的方法中可采用与效应子部分偶联的抗-α5β1抗体。效应子部分可以是任何数量的分子，包括标记部分如放射性标记或荧光标记，或优选是治疗性部分。效应子部分(或“效应子组分”)可与抗-5β1抗体通过接头或化学键共价结合(或连接、偶联)，或通过离子键、范德华力、静电作用或氢键非共价结合。

一方面，治疗性部分是调节α5β1整联蛋白活性的小分子。另一方面，治疗性部分了影响与α5β1整联蛋白结合或邻近该整联蛋白的分子或细胞的活性。例如，治疗性部分可以是细胞毒剂。本文所用术语“细胞毒剂”指能抑制或阻碍细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素(例如，I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰和Re¹⁸⁶)，化疗剂，毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段。合适的毒素及其相应片段包括白喉毒素A链、外毒素A链、篦麻毒素A链、相思豆毒素A链、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、酚霉素、依诺霉素、耳抑素(auristatin)(例如，耳抑素E或耳抑素F)等。使治疗性部分靶向癌细胞表面表达的α5β1整联蛋白不仅可以增加治疗性部分在癌患区域的局部浓度，而且可以降低与这些治疗性部分有关的不良副作用。

可用作本发明抗-α5β1抗体的治疗性部分的化疗剂的例子包括但不限于：多柔比星、阿霉素、盐酸阿霉素脂质体(doxil)、表柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、塞替派、白消安、细胞毒素(cytoxin)、紫杉醇类如紫杉醇(TAXON^TM，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多塞泰素(doxetaxel)(TAXOTERE^TM，Rhone-Poulenc Rorer)、泰索米(toxotere)、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊甙、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、柔红霉素、洋红霉素、氨基蝶呤、更生霉素、丝裂霉素、艾普霉素(esperamicins)(见美国专利4,675,187)、5-FU、6-硫鸟嘌呤、6-巯嘌呤、放线菌素D、VP-16、苯丁酸氮芥、美法仑以及其它有相关氮芥类。定义中还包括可用于调节或抑制肿瘤上激素作用的激素类药，例如他莫昔芬和奥那司酮。

或者，可将上述化疗剂与抗-α5β1抗体在同一制剂中(非偶联)一起给予患者，来实施本发明方法。

癌症适应症

本发明涉及通过用抗体靶向癌细胞表面上的α5β1整联蛋白来杀伤癌细胞、抑制癌细胞增殖和/或代谢的方法。癌症是一种生理疾病，一般特征为细胞不受调控地生长。癌症包括所有恶性肿瘤，包括但不限于：癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。可采用本发明方法靶向的细胞表面表达α5β1的癌症的更多具体例子包括但不限于：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、纤维肉瘤、肺癌、转移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾细胞癌和脾脏癌。

肿瘤是缺乏正常生长调控的细胞增殖物。肿瘤可以是良性或恶性的，可包括癌前细胞和组织、或癌性细胞和组织。癌细胞通常随癌症进程而形成肿瘤。肿瘤生长伴随着血管密度增加。肿瘤新生血管提供肿瘤生长所需的营养。抗-血管新生抗体治疗剂抗-α5β1和抗-VEGF(VEGF＝血管内皮生长因子)在多种癌症模型中具有阻碍肿瘤生长的功效(例如，参见Kim等，J Clin Invest.，110(7)：933-41(2002)；Ferrara，Nat Rev Cancer，2(10)：795-803(2002))。体外试验及血管新生性眼病(例如，晚期黄斑变性；见2003年11月26日提交的美国专利申请10/724,274，和2004年4月23日提交的10/830,956，其各自的内容被纳入本文作为参考)的兔和猴模型的体内试验表明，抗-α5β1抗体M200能抑制血管新生。

本发明基于以下意外发现：对于许多癌症类型来说，α5β1整联蛋白在肿瘤上皮细胞表面表达(除肿瘤血管内皮细胞外)，抗体与该表面α5β1的靶向结合导致直接杀伤癌细胞。因此，即使不形成任何肿瘤血管，也可用抗-α5β1抗体治疗和/或靶向特征为表达α5β1的上皮细胞增殖的癌症。因为攻击和杀伤癌细胞的方法是直接的，所以适用于非常早期的治疗(即实质性肿瘤形成之前)。

那些最有可能受益于早期治疗方法的患者包括但不限于：1)肿瘤前诊断试验显示发生和/或存在肿瘤(或微型肿瘤)的可能性高的患者；2)暴露于高强度致癌环境从而非常可能发生肿瘤的患者；和3)发生癌细胞在其表面表达α5β1的癌症的遗传倾向高的对象。例如，具有乳腺癌遗传倾向的患者(例如，BRCA基因阳性)，或检测到一些肿瘤前癌症标记的患者(例如，PCR检测到微小转移)将尤其适合于早期预防性直接杀伤癌细胞的方法，所述方法给予抗-α5β1抗体的药物组合物。

表示癌症遗传倾向增加的基因，以及表示肿瘤发生可能性的肿瘤标记见于癌症生物医学文献和数据库。此外，本领域普通技术人员所熟知的生物医学文献中也列出了可大大增加癌症风险的致癌物及其暴露水平。普通技术人员可利用这些文献资源以及与下述检测癌细胞上α5β1整联蛋白表达的公知方法来确定对象是否适用于本发明早期癌症治疗方法。如下面的实施例2所述，流式细胞术分析表明，α5β1整联蛋白至少在来源于以下癌症的细胞系表面表达：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、纤维肉瘤、肺癌、转移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肾细胞癌。

而且，本发明直接杀伤癌细胞的方法尤其适用于治疗表达α5β1但未证明易受抗-血管生成方法作用的癌症。该类癌症的例子包括但不限于：膀胱癌、乳腺癌、纤维肉瘤、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和转移性黑色素瘤。在一个尤其优选的实施方式中，本发明方法可用于治疗任何上述癌症，其中，患者表现为难治性实体瘤。抗-α5β1抗体M200(沃罗昔单抗)在患有各种表现为难治性实体瘤的人患者的治疗中显示一定效力，包括：结肠直肠癌(CRC)、黑色素瘤(MEL)、肾细胞癌(RCC)、肝细胞癌(HCC)、肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、腮腺癌(PARO)和乳腺癌(BC)。

本领域普通技术人员根据标准免疫组化法，利用抗-α5β1抗体(例如，IIA1或M200)探测肿瘤活检样品，以确定肿瘤上皮细胞表面表达α5β1的癌症。如下面的实施例1所述，取自黑色素瘤、肺癌、肾癌、胰腺癌和乳腺癌患者的肿瘤活检样品的免疫组化(IHC)分析都表明，α5β1整联蛋白在肿瘤上皮细胞上表达。合理地预测，利用IHC(或其它方法)可发现也有其它癌症的肿瘤上皮细胞表面表达α5β1，认为这些癌症易受本发明直接杀伤癌细胞方法的作用。

除肿瘤样品的IHC以外，还可利用抗-α5β1抗体及本领域普通技术人员所熟知的标准流式细胞技术来筛选细胞表面表达α5β1的癌细胞株。如下面的实施例2中所述，流式细胞术筛选揭示，21株公知的癌细胞株表面表达α5β1。基于上述结果，这些细胞株易受本发明方法用抗-α5β1抗体直接杀伤细胞的作用。而且，当确定癌细胞株在其表面表达α5β1，且细胞株对应于、来源于或衍生自癌症患者的癌细胞时，那么可用本发明方法治疗该患者。例如，实施例2中发现，来源于乳腺癌肿瘤的NW231细胞株在其表面表达α5β1整联蛋白。因此，本领域普通技术人员可立即确认，可根据本发明方法使用抗-α5β1抗体治疗乳腺癌患者。

抗体的组合物、制剂和给药

本发明方法中使用的抗-α5β1抗体可以分离或纯化的形式应用，并且与癌细胞或肿瘤直接接触。纯化抗-α5β1抗体(例如，IIA1、M200和F200)的方法公开于2003年11月26日提交的美国专利申请10/724,274和2004年4月23日提交的10/830,956，其各自的内容被纳入本文作为参考。F200也可以是根据2004年6月5日提交的美国专利申请60/583,127所述方法制备的Fab′-NAC片段，该申请的内容被纳入本文作为参考。F200-Fab′-NAC在抗体的液体制剂或冻干制剂中稳定性增加。采用标准分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法确定纯度和均一度。认为占制剂绝大部分的抗体是基本纯的。例如，在电泳凝胶中主要显示一条带的抗体溶液是基本纯的。优选地，本发明药物组合物中使用的抗体的纯度至少为85％，更优选至少95％，最优选至少99％。

在优选的实施方式中，实施直接杀伤癌细胞的方法，所述方法包括将纯化的抗-α5β1抗体配制成药物组合物，将治疗有效量的该药物组合物给予对象。本文所用“治疗有效量”指足以治愈、缓解、减缓或至少部分阻滞癌症和/或其症状和/或并发症的药物制剂或组合物的用量。确定用于治疗癌症的抗-α5β1抗体的治疗有效量的临床方法是本领域普通技术人员所熟知的，可采用常规实验根据经验测定。例如，在癌症的治疗过程中，  “治疗有效量”是能够引起以下一种或多种效果的量：(1)在一定程度上抑制肿瘤生长，包括减缓生长和完全阻滞生长；(2)减少癌细胞的数量；(3)减小肿瘤大小；(4)抑制(即降低、减缓或完全阻止)癌细胞浸润周围器官；(5)抑制(即降低、减缓或完全阻止)癌细胞转移；(6)增强抗癌免疫反应，可以但不一定能够导致肿瘤消退或退化；和/或(7)在一定程度上缓解疾病相关的一种或多种症状。

给予的药物组合物通常包含溶解于药学上可接受的载体或辅料，优选水性载体中的抗-α5β1抗体。药物组合物所用的可接受的载体、辅料或稳定剂以使用剂量和浓度暴露于细胞或哺乳动物时无毒性。生理学上可接受的载体的例子包括：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约1 0个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇和山梨糖醇；成盐反离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如

、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。可使用多种水性载体，例如，缓冲盐水等。这些溶液应无菌且通常不含不需要的物质。可通过常规公知灭菌技术灭菌药物组合物。

药物组合物也可按需包含药学上可接受的辅助物质以调节生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠和其它药学上可接受的盐，包括酸和碱加成盐。药物组合物还可包含一种或多种以下物质：载体蛋白，例如血清白蛋白；缓冲剂；填充剂，例如微晶纤维素、乳糖、玉米淀粉和其它淀粉；粘合剂；甜味剂和其它调味剂；着色剂；和聚乙二醇。这些制剂中抗体的浓度可显著不同，主要根据所选择的具体给药模式和患者需要，基于液体体积、粘度、体重等进行选择(例如，  《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Science)(第15版，1980)和Goodman &Gillman，《药物的药理学基础》(The Pharmacologial Basis ofTherapeutics)(Hardman等编，1996))。

在本发明方法优选的实施方式中，将抗-α5β1抗体配制成药物组合物，所述药物组合物包含约1.0-15.0mg/mL抗体、约22-28 mM柠檬酸盐、约135-165mM氯化钠、0.04％-0.06％聚山梨酯(

)80，pH 5.5-7.5的溶液。优选地，液体制剂的pH范围约为pH 6.0-7.0，最优选约为pH 6.3-6.7。在一个尤其优选的实施方式中，药物组合物包含约10.0mg/mL抗体、约25 mM柠檬酸盐、约150 mM氯化钠、约0.05％聚山梨酯()80，pH约6.5的溶液。在其它实施方式中，上述抗-α5β1抗体药物组合物还包含化疗剂，或与治疗有效量的另一种化疗剂一起给予患者。

优选地，药物组合物液体制剂是稳定、无色或澄清-稍呈乳光的溶液，SEC-HPLC测定显示不多于10％、优选5％或更少的降解抗体单体。优选地，观察到不大于10％，优选5％或更少的水解断裂(clipping)，形成不大于10％，优选5％或更少的抗体聚集体。优选地，制剂的浓度、pH和渗透压的改变不大于10％。效力为对照的70-130％，优选80-120％。

可以多种方式将含抗-α5β1抗体的药物组合物给予对象，包括但不限于：口服、皮下、静脉内、鼻内、局部、经皮、腹膜内、肌内、肺内、经阴道、经直肠、眼内、心室内或鞘内。众所周知，口服给药时应保护抗体以免消化。这通常可通过将分子与组合物复合以使其耐受酸和酶的水解作用，或通过将分子包封在合适的耐受载体如脂质体或保护屏障中来实现。保护试剂以免消化的方式是本领域所公知的。

根据给药方法，可以多种单位剂量形式给予药物组合物。例如，适用于口服的单位剂量形式包括但不限于：粉末剂、片剂、丸剂、胶囊和锭剂。

本发明方法的具体实施方式中所采用的确切剂型取决于治疗目的，可由本领域技术人员通过公知技术确定(例如，Ansel等，“药物剂型与药物递送(″Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery″)；Lieberman，“药物剂型”(″Pharmaceutical Dosage Forms″)(第1-3卷，1992)，Dekker，ISBN0824770846,082476918X，0824712692,0824716981；Lloyd，“药物化合物的领域、科学与技术”(″The Art，Science and Technology of PharmaceuticalCompounding″)(1999)；以及Pickar，“剂型计算”(″Dosage Calculations″)(1999))，如本领域所知，调节癌症降级(degradation)、全身与局部递送、新蛋白酶合成的速率、以及年龄、体重、总健康情况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用和疾病严重性可能是(确定确切剂量)必需的，并且本领域技术人员可采用常规实验方法确定它们。

在本发明方法的一个实施方式中，以每(kg)患者体重的抗体重量(mg)计，将含抗-α5β1抗体的药物组合物给予患者。因此，优选的剂量水平包括至少约0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg和15mg/kg。优选地，将该剂量在1小时内静脉输注给患者。可在延长的时间内给予患者额外剂量，以在患者中建立稳态血清浓度。例如，可在一年疗程中每周给予10mg/kg输液。

在一个优选的实施方式中，选择抗-α5β1抗体剂量水平和方案，以确保该剂量产生的最大血清浓度低于猴(例如，短尾猴)中进行的药动学研究所显示的安全平均血清峰浓度。例如，在短尾猴中，50mg/kg剂量下，每周给药4次后，M200的平均峰浓度为1862μg/mL(范围：1000-2606μg/mL)。在该血清浓度下未显示对猴的毒性。此外，或者可选择剂量，以使血清谷浓度大于>1μg/mL，体外活性试验中，该浓度对α5β1与纤连蛋白结合的产生80％抑制。

根据本发明治疗性杀伤癌细胞方法的一个实施方式，将含抗-α5β1抗体的药物组合物以固定剂量，通常约为0.1-10毫克/患者/天静脉内给予患者。在将药物组合物给予独立(secluded)部位如体腔或器官内腔而不是血流的实施方式中，可采用的固定剂量从0.1毫克直到约100毫克/患者/天。当需要局部给药时，剂量可能高得多。制备胃肠外给药的组合物的实际方法是本领域技术人员已知的，例如《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Science)和Goodman&Gillman，《药物的药理学基础》(The Pharmacologial Basis ofTherapeutics)，同上。

可给予本发明杀伤癌细胞方法中所采用的药物组合物，作为治疗或预防性治疗的一部分。在治疗性方法中，将药物组合物给予已患有癌症的患者，给予的量足以治愈、或至少部分地阻滞疾病及其并发症的进程。通常，在治疗性治疗过程中，可以肿瘤大小的减小或肿瘤生长速率的降低来监测治疗过程。足以实现该作用的量被定义为“治疗有效剂量”。对于此用途有效的量取决于癌症的严重性和患者健康的总状态。可根据剂型和患者耐受的频率单次或多次给予药物组合物。

早期治疗方法涉及在怀疑发生癌症的对象或在非常早期的癌症患者中阻滞或减缓癌症进程。早期治疗所需的具体剂量取决于患者的患病状况和病史、要预防的具体癌症、以及其它因素如年龄、体重、性别、给药途径、效率等。早期治疗方法也可用作预防性治疗，例如在以前患有癌症的患者中防止癌症复发，或在怀疑很可能发生癌症的患者中用作预防性治疗。例如，已检测到一些肿瘤前癌症标记(例如，PCR检测到微小转移)、具有乳腺癌遗传倾向的患者将尤其适用于早期治疗方法。

在本发明的另一实施方式中，可实施直接杀伤癌细胞的方法，其中除抗-α5β1抗体外，还给予化疗剂。该实施方式中使用的典型的化疗剂如上所述。这种组合疗法尤其适用于当患者没有完全发病的症状时作早期、或预防性治疗。在早期治疗，或预防性治疗中，许多患者可能无法忍受单独使用标准化疗剂时伴有的毒副作用。通过给予较低剂量标准化疗剂与相对无毒的抗-α5β1抗体，可预防性或在非常早期治疗癌症，该给药发案有效且患者更加耐受。

下面的实施例是为了解释而非限制本发明。

实施例

实施例1：IHC检测肿瘤样品上的α5β1表达

免疫组化(IHC)测定取自黑色素瘤、肺癌、肾癌、胰腺癌和乳腺癌患者的肿瘤活检样品中α5β1整联蛋白的表达。

材料与方法

将冷冻组织样品(得自Mayo Clinic或Cleveland Clinic)冷冻在最佳切片温度(OCT)化合物中，储存于-70℃。将低温恒温组织切片(7μm)固定在75％丙酮/25％乙醇中1分钟。将样品与抗-α5β1小鼠抗体IIA1(5μg/ml)或对照小鼠IgG1(抗-三硝基苯基，ATCC杂交瘤克隆1B7.11)孵育30分钟。采用生物素化第二抗体，山羊-抗-小鼠IgG(3μg/ml，30分钟；Jackson ImmunoResearch)检测抗体结合，并用Vectastain Elite ABC试剂盒(Vector Laboratories)和稳定的DAB(二氨基联苯胺和H₂O₂；Research Genetics)发色。在室温下用DAKOAutostainer进行染色。

结果

如表1所示，几乎所有分析的肿瘤切片都对肿瘤血管上α5β1呈阳性染色。令人惊讶的是，相当比例的肿瘤样品还显示对肿瘤上皮本身上α5β1整联蛋白表达呈阳性染色。这些结果表明，除侵入新生血管外，抗-α5β1抗体还可直接靶向癌细胞。

表1：抗-α5β1抗体IIA1染色的肿瘤样品的IHC结果

实施例2：流式细胞术检测癌细胞系上的α5β1表达

通过流式细胞术测定24种癌细胞株中α5β1整联蛋白的表达。如表2所示，24种细胞株来源于多种不同癌症，包括：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、纤维肉瘤、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌和脾脏癌。

材料与方法

用5mM EDTA的Tris-HCl(pH 8.0)溶液取出细胞，在含3％热灭活FBS、1％普通山羊血清(Sigma)和1％BSA的Hank平衡盐溶液中4℃下离心5分钟，以收集细胞。将细胞与小鼠抗-α5β1抗体、IIA1(10μg/ml)的FACS缓冲液(含0.1％BSA的PBS)在4℃下孵育30-60分钟。离心除去过量的单克隆抗体，用FACS缓冲液洗涤细胞两次，然后重悬于PE-抗-小鼠IgG(H+L)抗体(SouthernBiotech，1∶400稀释)中，4℃下保持30-60分钟。洗涤后，将细胞重悬于含碘化丙锭(propidium iodide)(1μg/ml)的FACS缓冲液中。在FACSCalibur(BectonDickinson)上测定平均荧光强度(MFI)。背景MFI约为5。

结果

如表2所示，24种评价的细胞株中有21种观察到明显可检测的α5β1整联蛋白在表面表达。三株癌细胞株CHL-1、COLO 357和C32的MFI值非常接近背景，表明很少有或没有α5β1整联蛋白在表面表达。这21种表面表达α5β1整联蛋白的细胞株易受抗-α5β1抗体的直接细胞杀伤作用。此外，衍生这些细胞株的癌症也易受抗-α5β1抗体治疗的作用。

表2：用IIA1对多种癌细胞株进行FACS分析的结果，以及用M200进行体外增殖试验的结果。

nd¹＝未检测

²2天而不是4天试验测定的生长抑制百分比值

实施例3：M200的体外癌细胞增殖抑制

在细胞增殖试验中，在存在或不存在血清的情况下，评价28种癌细胞株对嵌合的抗-α5β1抗体M200的敏感性。

材料与方法

将癌细胞以密度2500细胞/孔接种于96-孔板中补充有或没有lO％FBS的IMDM中。种板时，用多种浓度的M200或非-功能阻断(blocking)抗-a5抗体VC5刺激细胞。四天后，根据生产商的说明书，用CellTiter 96水性非放射性细胞增殖试验(Promega)评价细胞活力。所有生长研究以三复孔进行至少3次。

结果

如表2所示，无血清情况下，M200抑制13种癌细胞株生长，有血清情况下，抑制两种细胞株。发现无论是否有血清，两种细胞株LOX和NW231对M200都敏感。基于这些结果，产生这些细胞株的癌症(黑色素瘤和乳腺癌)可能对M200治疗有反应。

实施例4：在NW23l和LOX异种移植模型中，体内抑制肿瘤细胞增殖

在SCID小鼠中，NW231和LOX细胞生长为正位异种移植物，用抗-α5β1抗体M200和IIAl的腹膜内注射刺激小鼠。

材料与方法

免疫缺陷小鼠CB-17 SCID(C.B-Ighl/IcrTac-Prkdc品系)得自TaconicFarms(Germantown，NY)。采用6-lO周龄雌性小鼠(体重约20克)开始研究。在将NW231(1×10⁷细胞的IMDM悬液)接种于乳房脂肪垫1小时之前，腹膜内注射10mg/kg M200、IIAl或对照IgG以预处理动物。以3次/周的频率继续给药3周，剂量为10mg/kg。每周用卡尺测定肿瘤体积两次，由π/6×长×宽×高计算体积。根据二LACUC规定，每天观察临床表现和死亡率。

结果

在该模型中，发现IIAl可重现性地抑制NW231和LOX异种移植瘤生长。在这些模型中，未发现M200能重现性地抑制肿瘤生长。由于IIAl不识别抑制异种移植瘤血管系统中的小鼠α5β1，IIA1对肿瘤的全部抑制作用可归功于对肿瘤癌细胞的直接抗．增殖作用。

实施例5：在NW23l体内异种移植模型中，联用IIA1与来防止肿瘤形成

进行以下试验，来确定抗-α5β1整联蛋白抗体IIAl与化疗剂

联用在体内防止人NW231肿瘤形成中的效力。

是盐酸阿霉素的脂质体封装制剂，盐酸阿霉素是从波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)分离得到的细胞毒性葸环类抗生素。NW231细胞株来源于乳腺癌，认为是研究乳腺癌治疗的良好模型。

材料与方法

4-6周龄雌性SCID小鼠得自Taconic Farms并饲养在小型隔离笼中，将1×10⁷NW23l细胞接种于这些小鼠的乳房脂肪垫中。在肿瘤细胞接种时，第一次给动物注射5mg/kg的TLB对照(n=20)或M200(n=20)。后续治疗为每次注射0.7mg/kg。肿瘤细胞接种后5天开始治疗。第一次注射的化疗剂剂量为4mg/kg，后续注射为2mg/kg。通过腹膜内注射递送试剂四次。每周测定肿瘤体积两次，根据IACUC规定，每天观察临床表现和死亡率。

结果

小鼠中，ILAl治疗显示减缓NW231肿瘤形成的显著疗效。植入NW-231肿瘤24天后，对照TLB处理的异种移植瘤平均肿瘤体积以指数形式增加至约425立方毫米，而IIA1处理的异种移植瘤增加至平均体积约175立方毫米。

治疗本身也具有防止肿瘤形成的显著疗效。对于仅用

治疗异种移植瘤来说，在移植后最初45天期间，平均肿瘤体积起初仅增加至约25立方毫米，到74天时，逐渐增加至高达约275立方毫米。

与单独治疗相比，IIAl与doxil联用治疗小鼠对肿瘤形成速率的抑制作用甚至更高。对于IIAl加

治疗的异种移植瘤来说，54天时平均肿瘤体积保持约为O，74天时逐渐增加至仅仅约125立方毫米。这些结果表明，联用抗-α5βl抗体IIAl和化疗剂的体内疗效(即，协同的肿瘤抑制作用)提高。

实施例6：在VX2兔肿瘤模型中测定M200的效力

虽然M200不会与小鼠或大鼠α5β1整联蛋白发生交叉反应，但它能识别兔中发现的α5βl整联蛋白。因此，兔VX2癌可能是确定M200体内直接杀伤癌细胞效力的优良模型。VX2是用于研究各种部位原发性肿瘤治疗的广泛接受的兔模型(例如，参见Chen JG等，Lab Anim．2004年1月；38(1)：79-84；Purdie，TG等，Phys Med Bi01．2001年12月；46(12)：3161-75)；Geschwind，JH等，CancerRes．2002年7月；62(1)：3909-3913)。

A.M200 VX2预试验

进行预试验，以确定在兔VX2肿瘤模型中进行M200效力研究的一般参数。

肿瘤接种

第0天，用细胞悬浮液(100μl)皮下(左后肢)接种兔，以约3毫米的深度肌内(右后肢)接种兔。肌内接种过程如下所述。用氯胺酮/异氟烷麻醉兔子，在股骨轴的前侧和外侧(lateral aspect)上，离开股骨-骨盆(臀部)关节约1/3总股骨长度，沿右股骨用解剖刀作约2厘米的切口。分离肌肉群，产生约0.5厘米深的洞。将来自供体动物的一个VX2肿瘤片段置入该洞内。用无菌外科肘钉(staple)或缝线牢固地闭合皮肤，并在伤口部位局部应用抗生素。

肿瘤测定

第5天开始，通过连接便携式计算机的电子游标卡尺测定肿瘤大小(长、宽和高)，以毫米表示，最少每周测定两次。为了一致，整个研究过程中由同一个受过训练的技术人员进行肿瘤测定。采用公式长×宽×高×0.52计算肿瘤体积。处死动物后，小心地切下肿瘤，修剪并称重。此外，动物最少每周称重一次。将各个肿瘤的代表性样品保存于装有福尔马林或OCT的样品盒中，快速冷冻在液氮中。

VX2肿瘤的体内传代

通过每月体内传代，维持预试验和M200效力研究中所用VX2肿瘤。各后肢肌内接种细胞悬液(100μl)或肿瘤块(约5-10立方毫米)。肉眼监测动物和肿瘤，在肿瘤直径达到2厘米之前切除肿瘤，用于体内传代。通过处死动物，取出肿瘤，加工成5-10立方毫米块，以进行体内传代。然后，将肿瘤块重新植入下一组2只兔子中。

IHC分析M200处理兔的VX2肿瘤

以10mg/kg的剂量，将M200静脉内给予荷瘤兔，1小时后切下肿瘤。用以下物质染色肿瘤切片：(i)对肿瘤结合的M200特异的抗-人二抗；(ii)IIA1，然后是抗-小鼠二抗，以测定总的α5β1；或(iii)对照IgG和抗-小鼠二抗。

结果

通过IHC评价，发现静脉内注射M200可到达皮下肿瘤和肌内肿瘤。染色切片的IHC分析表明，VX2肿瘤细胞和兔肿瘤血管系统中都存在高水平的α5β1表达。

B.M200 VX2效力试验

基于预试验的IHC结果，使用VX2兔模型评价M200体内效果。

方法

用VX2细胞悬液(100μ1)或肿瘤块(约5-10立方毫米)皮下或肌内接种兔(共30只)。用10mg/kg的M200静脉内处理20只动物的试验组，每周2次，持续3周。以与M200相同的方法递送，用对照IgG处理10只动物的对照组。根据上述预试验的方法，进行肿瘤测定、终止、称重、肿瘤保存和实验持续时间。此外，每周从耳缘静脉取1mL血液，用于血清分析。

结果

观察到肿瘤生长抑制与动物中M200循环水平之间存在强相关性。通常，当M200水平维持在50μg/mL或更高时，可抑制肿瘤生长。由于M200对兔有免疫原性，早在给予M200后两周时，一些试验组中的兔子就对M200发生免疫应答，最终发现所有的动物都发生血清转化。在产生抗-独特型应答导致M200清除(即第14天，M200<50μg/mL)的试验组动物中，观察到肿瘤生长得较大。因此，VX2癌模型观察到的结果表明，在强效体内肿瘤模型中，M200能够抑制肿瘤生长。

实施例7：M200和IIA1在SCID小鼠VX2异种移植模型中的效力

如实施例6所述，M200在兔VX2癌模型中有效。在SCID小鼠VX2异种移植模型中进一步测定M200和IIA1直接杀伤癌细胞的能力。因为M200和IIA1不识别VX2移植瘤血管上的小鼠α5β1整联蛋白，所以对VX2异种移植瘤生长的任何抑制作用可归功于M200和IIA1对VX2癌细胞的直接抗增殖作用。

材料与方法

免疫缺陷小鼠CB-17 SCID(C.B-Ighl/IcrTac-Prkdc品系)得自TaconicFarms(Germantown，NY)。采用6-10周龄的雌性小鼠(体重约20克)进行研究。在将VX2(1×10⁷细胞的IMDM(Iscove改良的Dulbecco培养基)悬液)接种于乳房脂肪垫1小时之前，腹膜内注射10mg/kg M200、IIA1或对照IgG预处理动物。以3次/周的频率继续给药3周，剂量为10mg/kg。每周用卡尺测定肿瘤体积两次，由π/6×长×宽×高计算。根据IACUC规定，每天观察临床表现和死亡率。

结果

与给予对照IgG的小鼠相比，M200或IIA1的剂量与VX2肿瘤生长速率的降低或总的肿瘤大小缩小无关。这些结果提示，在小鼠异种移植瘤模型中，M200或IIA1都不能直接杀伤VX2细胞。

实施例8：在患有难治性实体瘤的人患者中M200剂量逐步增加的I期临床研究

A.概述

进行两部分开放式标记的I期临床试验，以在21位患有各种难治性实体瘤的人患者中确定用多达6种剂量水平(从0.5mg/kg到15.0mg/kg)的M200(沃罗昔单抗)的疗效。第一部分总的治疗持续时间为6周，最后一次给药后进行45天健康评价。第二部分是扩展研究，对11位患者中在第一部分中显示稳定疾病响应的6位患者继续给予M200，长达52周。

B.研究参数和方案

1.患者的选择

选择符合以下纳入/排除标准的患者进行研究：

a.常规计算机化断层成像(CT)或磁共振成像(MRI)上具有至少一个可测定的损伤；

b.估计生存期>3个月；东部协作癌症研究组(Eastern CollaborativeOncology Group)(ECOG)性能状态<2；

c.无中枢神经系统(CNS)肿瘤或转移(头部成像筛选记录)；

d.进入前4周内没有进行重大的外科手术；

e.进入前一周内没有进行小型外科手术；进入前4周内没有进行化疗、免疫治疗或放疗；

f.无主动出血障碍或血栓形成；

g.无其它临床上明显或不稳定的医学病症；

h.过去已接受鼠或嵌合mAb治疗的患者在抗-M200抗体(即交叉反应性人-抗-鼠-抗体[HAMA]或人-抗-嵌合抗体[HACA])的筛选试验中应为阴性。

共招募了22位患者进行试验。这22位患者的肿瘤类型包括：结肠直肠癌(4位患者；CRC)、黑色素瘤(4位患者；MEL)、肾细胞癌(3位患者；RCC)、食道癌(2位患者；EC)、肝细胞癌(2位患者；HCC)、肺癌(1位患者；NSCLC)、前列腺癌(1位患者；PRO)、甲状腺癌(1位患者；THY)、胰腺癌(2位患者；PC)、腮腺癌(1位患者；PARO)和乳腺癌(1位患者；BC)。治疗22位患者中的21位，21位治疗患者中20位完成了所有5次给药，以及随访至第45天。21位治疗患者(12位男性，9位女性)的中位年龄为59岁(范围29-81)，东部协作癌症研究组(Eastern Collaborative Oncology Group)(ECOG)平均评分为1(范围0-2)。

2.选择M200剂量水平和方案

选择剂量水平和方案，以确保最高剂量(15.0mg/kg)产生的最大血清浓度低于短尾猴显示的安全的平均血清峰浓度，并且，剂量≥1.0mg/kg时血清谷水平的血清浓度>1μg/mL，体外活性试验中该浓度可产生对α5β1与纤连蛋白结合的80％抑制。

本研究中采用的剂量水平和方案如下所述。第1、15、22、29和36天将M200给予21位患者。剂量水平和每个水平的患者数量为：0.5mg/kg(1位患者)、1.0mg/kg(2位患者)、2.5mg/kg(3位患者)、5.0mg/kg(3位患者)、10.0mg/kg(6位患者)和15mg/kg(6位患者)。1小时内以静脉输液形式给予上述剂量。第一和第二给药间隔两周，以获得单剂量药动学数据的样品。第一剂量后进行实时PK测定，用于预测各患者在第五次给药后的血清峰浓度。如果预测第五次给药后血清峰浓度小于750μg/mL，则患者接受所有5次剂量的M200。剩下的3次给药每周一次，然后进行45-天评价。

基于上述给药方案预测M200的人血清浓度，施用与短尾猴中观察到的相同变化区间(即平均值的54％-140％)。人体中，最高剂量(15.0mg/kg)时，预测5次给药后的平均峰浓度为592μg/mL，预测变化区间为320-829μg/mL。表3罗列了来自猴研究的PK数据，以预测人体中各剂量水平下，各剂量的血清峰浓度和谷浓度(分别为Cmax和Cmin)。

表3：估计M200在人体中的血清峰浓度和谷浓度

^a以μg/mL表示的值。

^b计算第一次给药后1周预测的值

根据上表，预测15.0mg/kg的最终半衰期约为13天，较低剂量的半衰期更短。预计剂量水平≥5.0mg/kg时，M200的血清蓄积显著，剂量<10.0mg/kg时，4周内达到稳态浓度，剂量>10.0mg/kg时，5周内达到稳态浓度。

3.M200制剂与给药

根据现行药品生产管理规范(current Good Manufacturing Practices(cGMP))制备生物试剂M200。本研究中使用的M200制剂组合物为10mg/mLM200、25mM柠檬酸盐、150mM氯化钠、0.05％聚山梨酯80，pH6.5。该制剂是无菌、无色、澄清-稍呈乳光、不含防腐剂的液体，适合静脉内使用。填充每个20mL单次使用的小管，以递送15mL 10.0mg/mL的M200。填充每个10mL一次性小管，以递送10mL 10.0mg/mL的M200。将完整的小管储存在2.8℃(36-46°F)的冰箱中，维持不冻结或摇动。

制备后，如果在室温下(25℃)储存则6小时内给予M200，如果在冰箱中(2-8℃)储存则48小时内给予。超过上述时间，则丢弃制备的溶液。

将患者体重(kg)乘以患者合适的剂量水平(mg/kg)，计算适合给予患者的M200剂量。采用患者在试验第l天给药前的体重计算整个试验过程中的剂量。对于0.5mg/kg-10.0mg/kg剂量组的患者，以及15.0mg/kg剂量组中体重≤80kg的患者来说，1小时内以固定总体积120mL给药。

虽然给予患者120mL稀释的试验药物，制备的输液袋包含共150mL体积。另外30mL用于启动(prime)输液线，而不是给予患者。因此，置于输液袋中的试验药物总剂量为患者剂量(即患者体重(kg)×剂量水平[mg/kg]×1.25)。通过加入注射用氯化钠，USP(0.9％)，使输液袋的总体积为150mL。

对于15.0 mg/kg剂量组中体重>80 kg的患者来说，1小时内以固定总体积180mL给药。虽然给予患者180mL稀释的试验药物，制备的输液袋包含共210mL体积。另外30mL用于启动输液线，而不是给予患者。因此，置于输液袋中的试验药物的总剂量为患者剂量(即患者体重(kg)×剂量水平[mg/kg]×1.167)。通过加入注射用氯化钠，USP(0.9％)，使输液袋的总体积为210mL。

预填充的输液线直接连接患者静脉入口(例如，肝素锁(heparin lock))。采用输液泵，1小时内，以2mL/分钟(或者，对于患者体重>80kg的15.0mg/kg试验组来说，速率为3mL/分钟)的速率给患者输液。

4.初步终点(Primary Endpoints)与副作用

研究终点包括最大耐受剂量、剂量-限制性毒性、安全性、免疫原性、药动学(PK)、单核细胞饱合(单核细胞表达α5β1受体)以及基于实体瘤响应评价(RECIST)标准的肿瘤响应(见Therasse P等，“评价实体瘤治疗响应的新方法”(New guidelines to evaluate the response to treatment in solidtumors)，Journal ofthe National Carcer Institute，92(3)：205-216(2000)，其内容被纳入本文作为参考)。

采用美国国立癌症研究所(NCI)副作用的普通专业术语标准(CommonTerminology Criteria)(CTCAE)，3.0版，进行副作用分级。剂量-限制性毒性被定义为3级或4级副作用，排除预定住院治疗和选择的外科治疗影响。合适地按照医疗监测者和管理机构的审查时，排除认为与M200无关的3级或4级副作用。

研究期间的患者评价包括：

a.筛选(进入研究14天内)：患者病史和身体检查、ECOG性能状态、常规化学情况(panel)、差异和血小板的全血计数(CBC)、敏感的C-反应性蛋白(CRP)、用显微镜分析进行尿液分析(UA/显微)、心电图(ECG)、胸部放射成像(CXR)、导向疾病的身体CT或MRI、给药前48小时内进行尿妊娠试验、凝血试验(凝血酶原[PT]和部分促凝血酶原激酶时间[PTT])、对已给予鼠抗体或嵌合抗体的患者检测抗-M200抗体(即，检测交叉反应性HAMA或HACA)、对患有通常转移至脑或CNS的肿瘤患者进行头部CT，以及，在一些患者中，进行活组织检查以评价肿瘤血管形成。

b.试验中的实验室评价：常规化学情况、尿酸盐、血清淀粉酶、差异和血小板的CBC、UA/显微。

c.根据一维(uni-dimensional)RECIST标准，在用M200治疗之前和之后，采用常规疾病导向的放射成像(例如，CT扫描)来评价肿瘤响应。根据其大小(具有最大直径(LD)的病灶)以及对精确重复测定(通过成像技术或临床观察)的适用性来选择靶病灶。对所有靶病灶的LD进行加合计算，表示为基线总LD。使用基线总LD作为参照，以表征目标肿瘤响应。采用以下靶病灶的响应标准来估计最佳总响应：

完全响应(CR)：第一次记录CR之后25-28天重复成像，证实所有靶病灶消失。

部分响应(PR)：第一次记录PR之后25-28天重复成像，以基线总LD作为参照，证实靶病灶的总LD至少降低30％。

稳定疾病(SD)：以最小的总LD作为参照，既没有满足PR的足量缩小也没有满足PD的足量增大。

进行性疾病(PD)：以治疗开始后记录的最小总LD为参照，靶病灶的总LD增加至少20％或出现一个或多个新生病灶。

d.取血进行血清PK测定、免疫原性分析(抗-M200抗体)、血管生长因子、以及测定外周血单核细胞上结合和未结合的α5β1。

e.最后一次用M200治疗后，从同意进行此过程的患者(招募时不是必须同意)获取3-毫米浅表肿瘤转移的钻孔活检样品并冷冻。采用该活检标本来评价M200治疗后的肿瘤血管生成情况。

5.药动学测定

采用低浓度下第一个人的PK数据预测高浓度下的人血清水平(如上所述)。正好在第一次给药之前和之后、以及完成第一次给药后4、24、48和168小时时，获取用于测定M200浓度的血清。也可正好在每次后续输液之前、结束时、完成后4小时获取用于测定M200浓度的血清样品。在下一次给药之前和试验结束时分离并等分分析这些样品：第一次给药结束时、第一次给药后168小时、正好在第2次、第3次、第4次、第5次给药前(谷浓度)和给药后(峰浓度)。ELISA测定M200血清水平。

对每位患者的M200血浆浓度-时间数据进行PK分析。计算中包括以下参数：峰浓度(Cmax)和谷浓度(Cmin)、末期半衰期(T_1/2β)、血浆浓度时间曲线下面积(AUC)、清除率(CL)、分布容积(V)。对每个试验组的患者计算小结参数。还计算PK参数变化与给药和时间的函数。

6.免疫原性

通过双抗原桥接ELISA分析测定M200的免疫原性。治疗前、第二次给药之前、试验结束时、M200最后一次给药后45天，从患者获取抗-M200抗体的血清样品。此外，如果给药间隔≥2周，获取抗-M200抗体的血清。储存样品并在试验结束时进行评价。对测定M200抗体阳性的样品再次测定其中和M200抗体(的能力)。第一次给予M200之前，在已知暴露于鼠或嵌合单克隆抗体的患者中筛选存在抗-M200抗体的患者。

7.流式细胞术分析

外周血单核细胞上也表达整联蛋白α5β1。为测定这些循环细胞上的α5β1位点被M200饱合时的剂量，在试验第1天第一次给药之前、试验第2天、第8天、刚好在每次后续给药之前、以及试验第43天，取外周血样品。流式细胞术测定单核细胞上α5β1位点的饱合情况。利用CD14抗体鉴定单核细胞。通过加入标记的抗-人IgG4，检测单核细胞表面结合的M200。通过加入标记的IIA1，检测细胞上未占据(游离)的α5β1。还评价了表达α5β1的单核细胞和淋巴细胞的百分比。

C.结果-剂量递增试验

剂量高达15mg/kg时，患者能很好地耐受M200，且没有观察到剂量-限制性M200毒性。该试验的总响应结果为：11位患者是稳定疾病(SD)，10位患者是进行性疾病(PD)。表4显示了根据剂量和患者肿瘤类型分类的响应结果。

表4：剂量与肿瘤类型的响应结果

0.5mg/kg	1.0mg/kg	2.5mg/kg	5.0mg/kg	10.0mg/kg	15.0mg/kg
						CRC(PD)	HCC(SD)	CRC(PD)	HCC(SD)	CRC(SD)	EC(PD)
	PC(SD)	NSCLC(SD)	EC(PD)	CRC(SD)	RCC(SD)

		MEL眼(PD)	THY(PD)	PARO(SD)	PRO(PD)
										BC(SD)	MEL(PD)
				RCC(SD)	MEL(SD)
										MEL(PD)	RCC(PD)

缩写：CRC＝结肠直肠癌；MEL＝黑色素瘤；RCC＝肾癌；EC＝食道癌；HCC＝肝细胞癌；NSCLC＝肺癌；PRO＝前列腺癌；THY＝甲状腺癌；PC＝胰腺癌；PARO＝腮腺癌；BC＝乳腺癌；SD＝稳定疾病；PD＝进行性疾病

副作用的强度通常为轻度到中度，包括疲劳、恶心、便秘、头痛和食欲减退。不存在剂量限制性严重副作用，或观察者未发现与M200相关的严重副作用。发现0.5mg/kg和1.0mg/kg剂量水平下3位患者为抗-M200抗体阳性，但不存在明显的相关副作用。在较高剂量组中没有患者为抗-M200阳性。接受0.5mg/kg的那一位患者在第一次给药后发热，记录为输液反应。然而，该患者能够完成5次M200给药，而没有后续的发热现象或其它输液反应迹象。

研究数据表明，M200具有非线性药代动力学。较高浓度下观察到较慢的清除率，10mg/kg剂量水平下T_1/2＝15.7天。此外，10mg/kg剂量下单核细胞饱合，第一次给药2周后的平均谷浓度为82μg/mL，高于体外最低有效浓度2-3μg/mL。

D.结果-扩展研究

11位产生稳定疾病响应或更好响应的患者中6位参与了扩展研究并继续给药。如下表5所示，6位患者中5位产生稳定疾病(SD)响应或更好响应。15.0mg/kg剂量组中一位肾细胞癌(RCC)患者产生部分响应。

表5：扩展研究结果

剂量组(患者数；肿瘤类型)	最佳响应结果	进程时间*(天)
			2.5mg/kg(1；NSCLC)	SD	129
5mg/kg(1；HCC)	SD	122
			10mg/kg(1；CRC)	PD	70
10mg/kg(1；PARO)	SD	143

15mg/kg(1；RCC)	PR	214
			15mg/kg(1；MEL)	SD	172+(研究中)

*包括剂量递增研究的43天和扩展研究的天数。

SD定义为稳定≥16周(112天)

实施例9：患有转移性肾细胞癌的人患者中，M200的开放性标记II期临床研究

A.概述

基于实施例8的I期临床试验所显示的M200的效力，进行M200在治疗人类患者中的效力的开放性标记、多中心、单臂、2-阶段研究。本研究的主要目的是评价M200在患有转移性肾细胞癌(RCC)患者中的效力(肿瘤响应)，如采用实体瘤响应标准所定义(见上述实施例8的RECIST)。本研究的第二个目的是评价其它效力指标(即，至疾病进展时间和响应持续时间)，进一步评价实施例8的I期临床试验中初步评价的M200的安全性、免疫原性和PK参数。另一个探索性目的是测定血清和血浆中的可检测生物标记物。本研究在多达8个研究地点招募了多达40位患者。20位患者进入该研究的阶段1。如果证实4个月(16周)内能够观察到一例完全响应(CR)或部分响应(PR)，或4个月时观察到一例稳定疾病(SD)，则招募另外20位患者(阶段2)。30分钟内所有患者静脉内输注给予M200(10mg/kg)，每隔一周一次，持续52周或直到疾病进展(以先发生的为准)。最后一次给药后45天或患者不能返回而导致提早结束时，该研究退出随访(exit visit)。最后一次给药后3个月进行随访。如果随访不可行，也可电话随访。最后一次给药后6个月进行长期电话随访。

B．研究参数与方案

根据表6所列参数和方案进行II期临床研究

表6：转移性。肾细胞癌患者中，II期临床研究的参数

冰箱内(2-8℃)则必须48小时内给予。超过上述时间，应丢弃制备的溶液。

给予方案/给药途径	30分钟内，所有符合条件的患者静脉内(IV)输注给予10mg/kg的M200，每隔1周一次，持续52周或直到疾病进展，以先发生的为准。通过患者体重(kg)乘以剂量水平(10kg/mg)计算给予患者的M200的剂量。采用试验第0天给药前患者体重计算整个试验过程的中的剂量，只要体重变化不超过10％。除去适当体积的10mg/mL M200制剂，用0.9％氯化钠稀释至最终体积120mL，30分钟内静脉输注入患者。
		治疗持续时间与随访	所有患者每隔一周静脉内给予M200(10 mg/kg)一次，持续52周或直到疾病进展，以先发生的为准。最后一次给药后45天或患者不能返回而导致提早结束时，该研究退出随访。最后一次给药后3个月进行随访。如果随访不可行，也可电话随访。最后一次给药后6个月进行长期电话随访。
终点：	本研究的初步终点为研究期间的任何时间具有证实的肿瘤响应的患者比例。第二终点为：(1)至疾病进展时间；(2)肿瘤响应持续时间；(3)M200的PK；和(4)免疫原性。研究终点为测定到血清和血浆中可检测的生物标记。
		效力测定：	采用一维RECIST，每8周(2个月)进行疾病导向的放射成像，以评价肿瘤响应。筛选时，进行头部、胸部、腹部和骨盆的CT或MRI。每8周，对筛选中呈现的所有病灶以及所有疾病导向的解剖学病灶进行一次完整身体检查和成像扫描。对于任何PR或CR，PR或CR后一个月(28-35天)重复进行证实性放射成像。所有可测定病灶中，作为所有涉及器官的代表，每个器官最多5个病灶，共10个病灶被鉴定为靶病灶，在基线处记录和测定。可测定的病灶定义如下：采用常规CT/MRI在一个维度上为2.0厘米，采用螺旋状CT的在一个维度上为1.0厘米。计算所有靶病灶的最长直径(LD)之和，记录为基线总

	LD。使用基线总LD作为参照，鉴定目标肿瘤响应。
		安全性测定：	监测以下安全性测定：副作用(AE)；严重的副作用(SAE)；身体检查数据；生命指征；异常的实验值
药动学测定：	给药前(给药前15分钟内)或给药后(输液结束后1小时)对所有患者进行药动学(PK)测定：第0天、第2、4和6周，每隔一月一次(第8、16、24、32、40、48周)、第52周、研究退出随访、以及3-个月随访(如果可能)。如果合适，使用PK的样品进行抗-Ab分析。

免疫原性：	第0天、第8周、研究退出随访和3个月随访(如果可能)时，给药前15分钟内对所有患者进行抗-Ab测定。如果合适，使用PK的样品进行抗-Ab分析。
		其它测定：	探索性分析将评价血清和血浆中生物标记的存在。分析中包括以下癌症标记：CEA、CA 19-9、Syndecan、IGFBP-2和LFL2。包括以下细胞因子/生长因子：MIA、IL-6、TNF-α、PGF、VEGF、EGF和bFGF。
统计学方法：	本研究设计检测总响应率≥20％、显示稳定疾病(SD)的响应者高达20％的能力至少为79.5％。为二歧终点提供总结的统计学结果和95％置信区间。采用Kaplan-Meier方法总结临时变量。

应理解，上述实施例绝非用于限制本发明的范围，而是示例性的目的。本说明书所引用的所有出版物、登录号序列和专利申请包括在此作为参考，如同各个出版物或专利申请被具体且独立地包括在此作为参考那样。

Claims (20)

1.含有以下成分的水性液体制剂在制备在患者中抑制癌细胞增殖用的药物组合物中的用途，其中，所述癌细胞在其表面表达α5β1整联蛋白：

1.0-15mg/mL抗-α5β1抗体；

22-27mM柠檬酸盐；

145-165mM氯化钠；

0.04-0.06％聚山梨酯80；

且pH为5.5-7.5。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗-α5β1抗体选自：M200、F200和IIA1。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述pH为6.3-6.7。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述癌细胞选自：乳腺癌细胞、肺癌细胞、转移性黑色素瘤细胞、胰腺癌细胞和肾细胞癌细胞。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述癌症是肾细胞癌或转移性黑色素瘤。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述液体制剂中抗-α5β1抗体的浓度为10mg/mL。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述水性液体制剂含有：

10mg/mL抗-α5β1抗体；

25mM柠檬酸盐；

150mM氯化钠；

0.05％聚山梨酯80；

且pH为6.5。

8.含有以下成分的水性液体制剂在制备治疗怀疑发生细胞表面表达α5β1的癌症用的药物组合物中的用途，其中，所述对象还未发展成肿瘤：

1.0-15mg/mL抗-α5β1抗体；

22-27mM柠檬酸盐；

145-165mM氯化钠；

0.04-0.06％聚山梨酯80；

且pH为5.5-7.5。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述癌症选自：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、纤维肉瘤、肺癌、转移性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾细胞癌和脾脏癌。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述癌症是肾细胞癌或转移性黑色素瘤。

11.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述pH为6.3-6.7。

12.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述水性液体制剂中抗-α5β1抗体的浓度为10mg/mL。

13.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述水性液体制剂含有：

10mg/mL抗-α5β1抗体；

25mM柠檬酸盐；

150mM氯化钠；

0.05％聚山梨酯80；

且pH为6.5。

14.一种包括含有以下成分的水性液体制剂的药物组合物：

1.0-15mg/mL抗-α5β1抗体；

22-27mM柠檬酸盐；

145-165mM氯化钠；

0.04-0.06％聚山梨酯80；

且pH为5.5-7.5。

15.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述水性液体制剂中抗-α5β1抗体的浓度为10mg/mL。

16.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述抗-α5β1抗体选自M200、F200和IIA1。

17.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述抗-α5β1抗体是M200。

18.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物还包含化疗剂。

19.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述pH为6.3-6.7。

20.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述水性液体制剂含有：

10mg/mL抗-α5β1抗体；

25mM柠檬酸盐；

150mM氯化钠；

0.05％聚山梨酯80；

且pH为6.5。