KR20090059163A - 글루타미닐 사이클라제에 관련된 신규한 유전자 - Google Patents

글루타미닐 사이클라제에 관련된 신규한 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루타미닐 사이클라제(QC, EC 2.3.2.5)의 이소효소인 신규한 글루타미닐-펩티드 사이클로트랜스퍼라제-유사 단백질(QPCTL), 및 이러한 글루타미닐 사이클라제 이소효소에 대한 새로운 치료학적 제제의 발견, 사이클라제 활성 측정, 및 화합물의 억제 활성-확인을 위한 이소효소를 코딩하는 분리된 핵산에 관한 것이다.
글루타밀 사이클라제, QPCTL

Description

글루타미닐 사이클라제에 관련된 신규한 유전자 {NOVEL GENES RELATED TO GLUTAMINYL CYCLASE}
본 발명은 글루타미닐 사이클라제(QC, EC 2.3.2.5)의 이소효소인 글루타미닐-펩티드 사이클로트랜스퍼라제-유사 단백질 (QPCTLs), 및 이들 이소효소를 코딩하는 분리된 핵산에 관한 것으로, 이들 모두는 글루타미닐 사이클라제 이소효소(isoenzyme)에 대한 새로운 치료학적 제제의 발견, 사이클라제 활성 측정 및 화합물의 억제 활성의 확인에 유용하다.
글루타미닐 사이클라제 (QC, EC 2.3.2.5)는 암모니아를 유리시키면서 N-말단 글루타민 잔기를 피로글루타믹 산 (pGlu*)에서 분자 내 고리화 (intramolecular cyclization)를 촉진시킨다. QC는 1963년에 열대식물 카리카 파파야 (Carica papaya)의 유액 (latex)으로부터 처음 분리되었다 (Messer, M. 1963, Nature 4874, 1299). 24년 후, 동물의 뇌하수체에서 이에 대한 효소적 활성이 발견되었다 (Busby, W.H.J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. and Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84, 3628-3632). 포유류의 QC에 있어서, QC에 의한 Gln의 pGlu로의 전환은 TRH 및 GnRH의 전구체에서 나타난다 (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. and Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84, 3628-3632). 아울러, QC의 초기 편재화 실험은 우태 뇌하수체 (bovine pituitary)에서 촉매현상 (catalysis)의 추정 생성물 (putative product)과 공동-편재화 (co-localization)를 나타내었을 뿐만 아니라, 펩티드 호르몬 합성에 예상되는 기능을 증진시킨다는 사실이 밝혀졌다 (Bockers, T.M. et al. 1995 J Neuroendocrinol 7, 445-453). 반면, 식물 QC의 생리학적 기능은 보다 덜 명확하다. C. 파파야 (C. papaya) 효소의 경우, 병원성 미생물에 대한 식물 방어 역할이 보고되었다 (El Moussaoui, A et al. 2001 Cell Mol Life Sci 58, 556-570). 다른 식물의 추정 QCs는 최근 서열비교에 의해 동정되었다 (Dahl, S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36). 그러나, 이러한 효소의 생리학적 기능은 아직 불명확하다.
식물 및 동물로부터 알려진 QCs는 기질의 N-말단 위치의 L-글루타민에 완전한 특이성을 나타내고, 그들의 동역학 (kinetic behavior)은 미카엘리스-멘텐 (Michaelis-Menten) 방정식에 따르는 것으로 밝혀졌다 (Pohl, T. et al. 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88, 10059-10063; Consalvo, A. P. et al. 1988 Anal Biochem 175 131-138; Gololobov, M. Y. et al. 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377, 395-398). 그러나, C.파파야에서 QCs 초기 구조 및 포유류에서 고도로 보존된 (highly conserved) 초기 구조 비교는, 어떠한 서열적 상동성도 나타내지 않았다 (Dahl, S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36). 식물 QCs는 새로운 효소 패밀리 (family)에 속하는 것으로 나타나는 반면 (Dahl, S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36), 포유류 QCs는 박테리아 아미노펩티다제 (bacterial aminopeptidases)에 알려진(pronounced) 서열 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌으며 (Bateman, R. C. et al. 2001 Biochemistry 20, 11246-11250), 식물 및 동물로부터의 QCs는 서로 다른 진화적 기원 (evolutionary origins)을 갖는다는 결론에 이른다.
최근, 뇌 추출물 (brain extract)로부터, QC-활성 뿐만 아니라 재조합 인간 QC 모두가 글루타메이트 고리화 (glutamate cyclization) 뿐만 아니라 N-말단 글루타미닐 고리화 모두를 촉진시킨다는 사실이 밝혀졌다. 가장 놀라운 발견은, pGlu-유사체로의 Gln1-전환은 약 8.0에서 pH-최적화가 일어남에 반하여, 사이클라제-촉매된 Glu1-전환은 약 pH 6.0에서 선호된다는 것이다. pGlu-Aβ-관련 펩티드의 형성은 돼지 뇌하수체 추출물 (pig pituitary extracts)로부터 재조합 인간 QC 및 QC-활성 억제에 의해 억제될 수 있으므로, QC 효소는 알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease)의 치료에 대한 약제 개발에 있어서의 타겟이다.
유럽특허출원 제02 011 349.4호는 곤충 글루타미닐 사이클라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 개시하고 있다. 상기 출원은 해당 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 추 가적으로 제공한다. 곤충 QC를 포함하는 분리된 폴리펩티드 및 숙주세포는 글루타미닐 사이클라제 활성을 감소시키는 제제를 스크리닝하는 방법에 유용하다. 이러한 제제는 살충제로 유용하다.
QC 이소효소의 억제제로서 유용할 수 있는, QC의 억제제는 국제공개특허 제2004/098625호, 국제공개특허 제2004/098591호, 국제공개특허 제2005/039548호 및 국제공개특허 제2005/075436호에 개시되어 있고, 특히 억제제의 구조, 그들의 용도 및 그들의 생산과 관련하여 상기 문헌들은 전체로서 본원에 포함된다.
정의
효소 억제제
가역적 효소 억제제 (Reversible enzyme inhibitors): 경쟁적 억제제, 비-경쟁적 가역적 억제제, 느린-결합 (slow-bindging) 또는 강한-결합 (tight-bindgin) 억제제, 전이 상태 유사체 (transition state analogs) 및 다기질 유사체 (multisubstrate analogs)를 포함한다.
경쟁적 억제제는
ⅰ) 효소와 비-공유결합성 상호작용
ⅱ) 효소 활성 부위에 대하여 기질과의 경쟁
을 나타낸다.
가역적 효소 억제제 활성의 주요 메카니즘 및 해리 상수 (dissociation constant) 정의는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112009023886404-PCT00001
효소-억제제 [E-I] 복합체의 형성은 기질의 결합을 저해하므로, 일반적인 생리학적 생산물, P로의 반응이 수행될 수 없다. 더 높은 억제제 농도 [I]는 더 많은 [E-I]로 이끌게 되며, 기질이 결합할 수 있는 유리 효소는 더욱 적어지게 된다.
비-경쟁적 가역적 억제제
ⅰ) 활성 부위 (알로스테릭 [allosteric] 결합 부위) 보다 다른 부위에 결합하고,
ⅱ) 촉매적 활성을 감소 또는 정지시키는 효소에서 입체형태적 변화 (conformational change)를 야기한다.
느린-결합 또는 강한-결합 억제제
ⅰ) 억제제 및 효소 사이의 평형이 느리게 도달되는 경쟁적 억제제이고,
ⅱ) (kon은 느리다), 하기와 같은 효소 또는 억제제에서 일어나야 하는 입체형태적 변화에 기인할 수 있다.
a) 종종 전이 상태 유사체이고,
b) 효소 농도 (subnaomolar KD 값)와 유사한 농도에서 효과적이며,
c) 낮은 koff 값으로 인하여, 이러한 억제제 타입이 “대부분” 비가역적인 효소 또는 억제제.
전이 상태 유사체
전이 상태 유사체는 효소 촉매된 반응의 전이 상태를 의태하는 (mimic) 경쟁적 억제제이다. 효소 촉매작용은 전이 상태의 에너지 저하에 기인하여 일어나므로, 전이 상태 결합은 기질 결합 이상으로 선호된다.
다기질 유사체
둘 또는 그 이상의 기질을 포함하는 반응을 위하여, 경쟁적 억제제 또는 전이 상태 유사체를 제조할 수 있는데, 이는 둘 또는 그 이상의 기질과 유사한 구조적 특징들을 포함한다.
비가역적 효소 억제제:
비가역적 효소 억제제는 결합되지 않은 효소 (unbound enzyme) 및 효소 억제제 복합체 사이의 평형 (E + I <---> E-I)을 공유결합(~ 100 ㎉/mole)을 가지는 억제를 비가역적으로 만든다.
친화력 표지 제제 (Affinity labeling agents)
활성-부위 지향성 비가역적 억제제 (Active-site directed irreversible inhibitors, 경쟁적 비가역적 억제제)는 공유 결합 형성에 있어서 효소 (가역적, 특이적 결합)에 의해 인식되고,
ⅰ) 약물 및 표적 효소 사이의 특이적 상호작용을 가능하게 하는 기질, 전이 상태, 또는 생성물에 구조적으로 유사하고,
ⅱ) 공유 결합 형성을 가능하게 하는 반응성 기능 그룹 (예. 친핵체, -COCH2Br)을 포함한다.
그의 표적 효소와 활성-부위 지향성 시약의 반응 개요는 아래에 개시되어 있으며, 여기에서 KD는 해리 상수이고 kinactivation은 공유 결합 형성 비율이다.
Figure 112009023886404-PCT00002
메카니즘-기반 효소 비활성제 (Mechanism-based enzyme inactivators) 또는 (자멸 억제제 (suicide inhibitors)라고도 함)
메카니즘-기반 효소 비활성제는 효소 촉매능에 의한 반응성 형태(활성화 된 형태)로 변형되는 효소 활성 부위에 결합하는 활성-부위 지향적 시약 (비반응성)이다. 한번 활성화되면, 억제제 및 효소 간 공유 결합이 형성된다.
메카니즘 기반 효소 비활성화제의 작용 메카니즘의 반응 식은 아래에 나타내었으며, 여기에서 KD는 해리 복합체이고, k2는 효소에 한 번 결합된 억제제의 활성화 비율이며, k3는 효소로부터 활성화된 억제제, P (생성물은 여전히 반응성일 수 있다)의 효소로부터의 해리 비율이고, k4는 활성화된 억제제 및 효소 사이의 공유 결합 형성 비율이다.
Figure 112009023886404-PCT00003
비활성화(공유 결합 형성, k4)는 해리 (k3) 이전에 일어나야만 하고 그렇지 않으면 현재 반응성 억제제가 주변으로 방출된다. 분할 비율, k3/k4: 비활성으로 방출되는 생성물의 비율은 시스템의 효과적인 비활성화 및 최소의 원치 않는 부반응 을 위하여 최소화 되어야 한다. 높은 분할 비율 (large partition ratio [해리 우위])은 비특이적 반응으로 이끈다.
비경쟁적 효소 억제제:
비경쟁적 효소 억제제 (ES 복합체에만 결합하는 억제제)의 정의로부터, 다음의 평형으로 나타낼 수 있다:
Figure 112009023886404-PCT00004
ESI 복합체는 기질을 해리시키지 않는 반면, ES 복합체는 Ks와 동일한 해리 상수로 기질을 해리시킨다 (즉, 0과 동일한 Ks 값을 갖는다). 미카엘리스-멘텐 (Michaelis-Menten) 타입 효소의 Km값은 감소되는 것으로 예상된다. 기질 농도가 증가하면 ESI 농도(반응 생성물로 진행할 수 없는 복합체)는 증가하기 때문에 억제반응은 제거될 수 없다.
본 발명에 따르면, 경쟁적 효소 억제제가 바람직하다.
가장 바람직하게는 경쟁적 가역적 효소 억제제이다.
용어 "ki", 또는 "KI" 및 "KD"는 결합상수이며, 억제제가 효소에 결합하고 이어서 효소로부터 방출되는 것을 나타낸다. 억제제 농도를 나타낼 수 있는 다른 측정법은 "IC50" 이고, 이는 주어진 기질 농도에서 효소 활성이 50%일 때의 농도값을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어, "QC"란, 글루타미닐 사이클라제(QC)를 포함하며, 이는 글루타미닐-펩티드 사이클로트랜스퍼라제(QPCT)와 동의어이고; 및 QC-유사 효소는; 글루타미닐-펩티드 사이클로트랜스퍼라제-유사 단백질(QPCTLs)과 동의어이다. QC 및 QC-유사 효소는 동일하거나 유사한 효소적 활성을 가지며, 더 나아가 QC 활성으로 정의된다. 이와 관련하여, QC-유사 효소는 QC의 그 분자 구조와 기본적으로 상이하다.
"QC 활성"은 글루타미닐 사이클라제(QC, QPCT) 및 QC-유사 효소(QPCTLs)의 촉매적 활성으로 정의된다. 이러한 효소는 신장, 간, 장(intestine), 뇌 및 CSF와 같은 체액을 포함하는 포유류 신체의 다양한 조직에서 발현되는데, 그들은 높은 특이성을 가지고 생물학적 활성 펩티드의 N-말단에 글루타민 또는 글루티메이트를 고리화한다.
특히, 본 발명에서 사용된 용어, "QC 활성"은 암모니아 방출시 N-말단 글루타민 잔기를 피로글루탐산(pGlu*)으로 분자내 고리화 또는 N-말단의 L-호모글루타민 또는 L-β-호모글루타민의 고리형 피로-호모글루타민 유도체로 분자내 고리화로서 정의된다. 따라서, 반응 개요 1 및 2를 참조.
반응 개요 1: QC에 의한 글루타민의 고리화
Figure 112009023886404-PCT00005
반응 개요 2: QC에 의한 L-호모글루타민의 고리화
Figure 112009023886404-PCT00006
본 발명에서 사용된 용어, "EC"는 글루타메이트 사이클라제 (EC)로서 글루타미닐 사이클라제(QC, QPCT) 및 QC-유사 효소(QPCTLs)의 부수적 활성을 포함하고, 또한 EC 활성으로 정의된다.
본 발명에서 사용된 용어, "EC 활성"은 글루타미닐 사이클라제(QC, QPCT) 및 QC 유사 효소(QPCTLs)에 의한 N-말단 글루타메이트 잔기의 피로글루탐산(pGlu*)으로의 분자내 고리화로 정의된다. 따라서, 반응 개요 3을 참조.
반응 개요 3: QC(EC)에 의한 전하를 띠지 않는 글루타밀 펩티드의 N-말단 고리화
Figure 112009023886404-PCT00007
용어 "QC-억제제" 또는 "글루타미닐 사이클라제 억제제"는 일반적으로 당업자에게 알려져 있고, 바람직하게 효소와 억제제의 직접적 상호 작용에 의한 글루타미닐 사이클라제(QC, QPCT) 또는 QC-유사 효소(QPCTLs)의 촉매적 활성 또는 그의 글루타밀 사이클라제 (EC) 활성을 억제하는 효소 억제제를 의미하다.
본 발명에서의 용어, "선택적 QC-억제제"란, 글루타미닐 사이클라제(QC, QPCT)의 촉매적 활성을 억제하지만, 적어도 하나의 QC-유사 효소(QPCTLs)의 촉매적 활성은 억제하지 않거나, 더 낮은 역가로 억제하는 효소 억제제를 의미하는 것으로 정의된다. 바람직하게, 적어도 하나의 QC-유사 효소 (QPCTL)의 억제를 위한 ki-값 보다 한 배 낮은 ki-값을 갖는 글루타미닐 사이클라제 (QC, QPCT)를 억제하는 선택적 QC-억제제이다. 보다 바람직하게는, 글루타미닐 사이클라제 (QC, QPCT)의 억제를 위한 상기 선택적-QPCTL 억제제의 ki-값은 적어도 하나의 QC-유사 효소 (QPCTLs)의 억제를 위한 ki-값보다 두 배 더 적다. 더욱 바람직하게, 글루타미닐 사이클라제 (QC, QPCT)의 억제를 위한 ki-값은 적어도 하나의 QC-유사 효소 (QPCTL)의 억제를 위한 ki-값 보다 세 배 낮은 선택적 QC-억제제이다. 가장 바람직하게, 선택적 QPCTL-억제제는 QC-유사 효소 (QPCTLs)를 억제하지 않는다.
본 발명에서의 용어, "선택적 QPCTL-억제제"는 적어도 하나의 QC-유사 효소(QPCTL)의 촉매적 활성을 억제하지만, 글루타미닐 사이클라제(QC, QPCT)의 활성은 억제하지 않거나 적게 억제하는 억제제를 의미하는 것으로 정의된다. 바람직하게 글루타미닐 사이클라제(QC, QPCT)의 억제를 위한 ki-값보다 한 배 더 낮은 ki-값을 갖는 적어도 하나의 QC-유사 효소(QPCTL)인 선택적 QPCTL-억제제이다. 보다 바람직하게는, 적어도 하나의 QC-유사 효소(QPCTL)의 억제를 위한 상기 선택적-QPCTL 억제제의 ki-값은 글루타미닐 사이클라제(QC, QPCT)의 억제를 위한 ki-값 보다 두 배 더 낮다. 더욱 바람직하게, 선택적 QPCTL-억제제는, 적어도 하나의 QC-유사 효소(QPCTL)의 억제를 위한 ki-값이 글루타미닐 사이클라제 (QC, QPCT)의 억제를 위한 ki-값 보다 세 배 더 낮다. 가장 바람직하게, 선택적 QPCTL-억제제는 글루타미닐 사이클라제(QC, QPCT)의 활성을 억제하지 않는다.
QC 억제능
QC 억제와의 관련성에 비추어, 바람직한 양태에서, 대상 방법 및 의학적 용도는 10 μM 또는 그 이하, 보다 바람직하게는 1 μM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 μM 또는 그 이하 또는 0.01 μM 이하 또는 그 이하, 또는 가장 바람직하게는 0.01 μM또는 그 이하의 QC 억제를 위한 Ki를 갖는 제제를 이용한다. 실제로, 마이크로몰(micromole) 이하, 바람직하게는 나노몰(nanomole) 및 보다 더 바람직하게는 피코몰(picomole) 범위의 Ki 값을 갖는 억제제가 고려된다. 따라서, 활성 제제는 본 발명에서 편의상 "QC 억제제"로서 기술되어 있으나, 이러한 명명이 활성의 특정 기전에 본 발명의 대상을 한정하는 것이 아니라는 점은 자명하다.
QC 억제제의 분자량
일반적으로 대상 방법 또는 의학적 용도의 QC 억제제는, 예를 들면 1000 g/mole 또는 그 이하, 500 g/mole 또는 그 이하, 바람직하게는 400 g/mole 또는 그 이하, 및 보다 더 바람직하게는 350 g/mole 또는 그 이하, 및 300 g/mole 또는 그 이하의 분자량을 가지는 소분자 화합물일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "대상(subject)"은 치료(treatment), 관찰(observation) 또는 실험(experiment)의 목적이 되는 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해서 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 일으키는 활성 화합물 또는 약제학적 제제의 양을 의미하며, 치료되는 질환 또는 이상 징후의 완화를 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어, "약제학적으로 허용가능한"은 인간 및 수의적 용도를 모두 포함한다: 예를 들면, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 수의적으로 허용가능한 화합물 또는 인간에서 의학 및 건강관리에 허용가능한 화합물을 포함한다.
길랑-바레 증후군
또 다른 명칭으로는 란드리-길랑-바레 증후군(Landry-Guillain-Barre syndrome), 급성 특발성 다발신경염, 감염성 다발성 신경염 또는 급성 염증성 다발신경병증이 있다.
길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)은 신체 방어(면역) 시스템이 신경계의 부분을 실수로 공격할 때 일어나는 심각한 질환이다. 이는 근력을 약화시키는, 신경 염증을 유발하고 지속적으로 악화된다.
길랑-바레 증후군은 자기면역성 질환이다. 길랑-바레 증후군의 정확한 원인은 밝혀지지 않았다. 상기 증후군은 모든 연령대에서 발생할 수 있으나, 30 내지 50세 사이 남녀 모두에서 가장 통상적으로 발생한다. 이는 종종 일반적으로 소감염, 호흡기(폐) 감염 또는 위장관(위) 감염을 수반한다. 일반적으로, 원 감염(original infection) 징후는 길랑-바레 증후군이 시작하기 전에 사라진다.
길랑-바레 증후군은 신경 부분을 손상시키는 염증을 야기한다. 상기 신경계 손상은 저림(tingling), 근육 약화, 및 마비를 야기한다. 염증은 일반적으로 신경계를 덮고 있는 부분(수초)에 영향을 미친다. 이러한 손상을 탈수초화(demyelination)라고 한다. 탈수초화는 신경 신호를 느리게 한다. 신경의 다른 부분의 손상은 신경의 작용을 정지시킬 수 있다.
길랑-바레의 증후군은 매우 빠르게 악화된다. 가장 심각한 징후에 도달하는 데 불과 몇 시간 걸리지 않을 수 있다. 근육 기능의 약화 또는 손상(마비)은 신체의 양 측면을 공격한다. 근육 약화가 다리에서 시작하여 그 후 팔로 진행되는 경우, 이를 상행성 마비(ascending paralysis)라고 한다. 환자는 저림, 발 또는 손의 통증, 및 어눌함(clumsiness)을 나타낼 수 있다. 근육의 손실에 따라, 기능은 더욱 악화되고, 환자는 호흡 보조(breathing assistance)가 필요할 수 있다. 길랑-바레 증후군의 치료 방법은 존재하지 않는다. 그러나, 많은 치료법이 증상을 완화시키고, 합병증을 치료하며, 회복을 빠르게 하는데 도움을 줄 수 있다. 증상이 심각한 경우, 환자는 호흡 도움, 치료 및 물리 치료를 위해 병원에 가야 한다. 혈장 사혈(plasmapheresis)이라 불리는 방법은 환자의 혈액을 제거하고, 정맥내 수액(intravenous fluids)으로 대체시키기 위하여, 또는 항체가 없는 혈액을 기증 받기 위하여 사용된다. 고용량 면역글로불린 치료는 길랑-바레 증후군의 심각성과 기간을 감소시키기 위해 사용되는 또 다른 방법이다. 다른 치료법으로는 합병증을 예방하는 것이다.
만성 염증성 탈수초 다발 신경근병증(CIDP)
GBS와 유사하나 만성 진행에 의해 특징지워지는 이 질환은 CIDP(Chronic inflammatory demyelinizing polyradiculoneuropathy)로 불린다. GBS와는 달리, 4주 이상 진행 단계가 지속되고, 종종 6 개월 이상 지속되며, 종종 환자에게 결핍증이 지속되는 등의 예외성을 보이는 CIDP에 대해 일반적으로 적용가능한 정의는 아직까지 존재하지 않는다. GBS 및 CIDP에서 나타나는 심각한 불완전 마비를 야기하는 메커니즘은 말초신경의 탈수초화(demyelinization)에 따른 면역 반응 및 T-림프구에 의해 매개되는 염증을 포함할 수 있다. 이러한 가설은 GBS 환자의 혈청과 뇌척수액(cerebrospinal fluid)에서 관찰되는 보체 화합물(complement compounds) 및 사이토카인의 증가된 양에 의해 확인된다. 특히 신경근 영역에서, 탈수초화 과정은, 일반적으로 신경 전도 차단(nerve conduction block)의 개발에 중요한 메커니즘으로 여겨진다. 하나의 이론은 상기 질환의 발견에 있어서 상대적으로 초기에서 나타나는 중요한 단계로서, 혈액/CSF 장벽의 이상을 기초로 하고 있다. 또 다른 하나의 이론은 질환에 따라 혈액/CSF 장벽에서 누출이 진행되고, 뇌척수 액(CSF)내 단백질의 함량이 증가된다는 주장이다. 적어도, 면역체계에 직접적으로 관련되지 않은 비-특이적 혈청 구성 성분은 혈액으로부터 CSF로 침투할 수 있으며, 신경 또는 교세포 기능 이상(glial dysfunctions)을 야기하고/야기하거나 신경 활성을 변형시킨다. 또 다른 메커니즘은 CSF의 유량이 감소되는 것인데, 이는 CSF의 단백질 성분이 증가하는 것으로 설명할 수 있다. 이러한 해석은 혈액/CSF 장벽의 손상이 없거나 변형된 선택성이 없을 것을 요구한다. 비록 언급된 모든 효과들은 GBS와 CIDP의 과정에 있어서 중요할 수 있으나, 증상에 대한 그것들의 실질적인 기여는 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. CSF에서의 증가된 단백질 농도와 특이적 전기 생리학적 발견 또는 임상 사진과의 관계를 정립할 수 없다. 전위-의존성 나트륨 채널(potential-dependent sodium channel)과 상호작용하는 GBS 환자 및 다발성 경화증 환자에서의 CSF내 인자가 최초로 보고되었다(Wuz et al. 1995, Muscle and Nerve 18, 772- 781). Bhnkmeier (Bhnkmeier et al. 1996, Muscle and Nerve 19, 54-62)는 3 kDa 이하의 분자량, 및 1 kDa 이하의 더욱 엄격한 시험 조건하에서 상기 인자를 보고하고 있다. 상기 인자들의 활성이 프로테아제가 있는 CSF의 배양 후에도 실질적으로 감소되지 않았다는 이러한 관찰 및 사실에 기초하여, 본 발명자들은 상기 인자들이 항체 또는 사이토카인이 아니라고 결론을 내었다.
다발성 경화증
다발성 경화증(Multiple sclerosis)은 중추신경계(뇌 및 척추)에 영향을 미치는 자가 면역 질환이다. 다발성 경화증은 보통 남성보다는 여성에게 영향을 미친다. 상기 질환은 대부분 20 내지 40 대에 시작되나, 어떤 연령층에 있어서도 발병할 수 있다. 정확한 원인은 밝혀지지 않았으나, MS는 신경 세포를 둘러싸고 있는 보호 물질인 수초에 손상을 일으킨 결과로 여겨진다. 시간의 경과함에 따라 손상이 더욱 악화되며 질환이 진행된다. 염증은 손상조직(scar tissue)의 다중 영역에 남아있는 미엘린(myelin)을 파괴한다. 염증은 신체의 자가 면역 세포가 신경계를 공격할 때 발생한다. 염증은 신경 흥분을 느리게 하거나 차단되도록 하며, MS 증상을 유발시킨다. 염증의 반복되는 발병(Repeated episodes), 또는 급격한 발병(flare ups)은 뇌와 척수(spinal cord)의 어느 영역에서도 발생할 수 있다. 각 공격의 위치와 범위가 변화하므로 증상의 징후는 다양하다. 일반적으로 며칠, 몇주, 또는 몇달을 지속하는 발병은 증상이 교대로 감소되거나 증상이 없는 시기와 교대로 반복된다. 비록 완화 기간 없이 논-스톱으로 진행(non-stop progression)될 수 있으나, 일반적으로는 재발(relapse)하는 것이 통상적이다.
공격을 유도하는 것이 무엇인지는 분명하지 않다. MS 환자는 전형적으로 건강한 사람보다 많은 수의 면역 세포를 갖고 있으며, 이는 면역 반응이 기능을 하고 있음을 암시한다. 가장 보편적인 이론은 바이러스 또는 유전적 결함, 또는 그 둘의 조합이다. 이는 상기 질환에 대한 유전적 관련성을 의미한다. MS는 다른 지역 보다 유럽 북부, 미국 북부, 호주 남부 및 뉴질랜드에서 일어날 수 있다. 지질학 연구는 환경적 인자가 관련 있을 수 있음을 나타내고 있다. MS에 대한 가족력이 있고 MS에 대한 높은 발병률을 갖는 지질학 영역에 사는 사람들은 상기 질환에 대한 보다 높은 위험성을 갖는다. 현재 다발성 경화증에 대한 알려진 치료 방법은 없다. 그러나, 상기 질환을 늦출 수 있는 다수의 치료법이 존재한다. 치료 목적은 증상을 조절하고 정상적인 삶의 질을 유지하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 전장(full-length) 단백질, 교호 스플라이스 형(alternative splice forms), 서브유닛, 및 돌연변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 상기 저장 단백질, 교호 스플라이싱, 아형 및 돌연변이체를 포함하는, 글루타미닐 사이클라제에 관련된 단백질 패밀리의 신규한 멤버를 구성하는 글루타미닐 사이클라제의 활성을 갖는 단백질을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은, 상기 단백질의 기질, 상호작용 단백질, 작동제(agonist), 길항제(antagonist) 또는 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 추가적으로 상기 단백질 및/또는 돌연변이체, 그의 유도체 및/또는 유사체 및/또는 그의 리간드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
글루타미닐 사이클라제(서열번호 1의 핵산 서열, 서열번호 10의 단백질 서열)에 현저한 유사성을 갖는 신규한 단백질은 인간 (또한 인간 isoQC로 명명된) (GenBank accession no. NM_017659), 마우스(mouse) (GenBank accession no. NM_027455), 짧은 꼬리 원숭이(Macaca fascicularis) (GenBank accession no. AB168255), 붉은 털 원숭이(Macaca mulatta) (GenBank accession no. XM_001110995), 고양이 (GenBank accession no. XM_541552), 래트(rat) (GenBank accession no. XM_001066591 ), 젖소(cow) (GenBank accession no. BT026254)의 단백질 또는 적어도 50%/75% 서열 동일성/유사성, 바람직하게는 70%/85% 서열 동일성/유사성, 가장 바람직하게는 90%/95% 서열 동일성/유사성을 갖는 그의 유사체인 단백질이다.
상기 단백질 서열은 서열번호 11 내지 18에 제시되어 있다. 나아가 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열(서열번호 2 내지 9)을 나타낸다. 표 1은 신규한 단백질 및 공지된 글루타미닐 사이클라제 간의 유사성을 나타낸다. 표 2는 신규한 단백질 및 공지된 글루타미닐 사이클라제 간의 동일성을 나타낸다.
Figure 112009023886404-PCT00008
Figure 112009023886404-PCT00009
서로 다른 기원으로부터의 QPCTLs간에는 95 내지 99%의 높은 유사성 및 84 내지 98%의 높은 동일성을 나타낸다(도 2참조). 인간 및 뮤린(murine) 글루타미닐 사이클라제의 서열 유사성(도 1 참조)에 기초로 하여, QPCTLs이 효소로서의 역할을 포함하는 기능을 가짐을 예상할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
클로닝, 발현, 생화학 및 분자적 특징은 이러한 가설을 뒷받침한다.
뇌, 전립선 및 폐 조직의 QPCTLs 발현 패턴은 하기에 개시되어 있는 질환에서 일관된 역할을 한다. 글루타미닐 사이클라제로서 효소적 활성은 QPCTLs-활성 또는 분자들을 억제하는 것이 하기 기재된 바와 같이 다양한 치료학적인 용도를 가질 것이라는 것을 의미한다.
본 명세서에 개시된 QPCTL 활성 및 그의 발현 패턴은 호르몬, 펩티드 및 케모카인(chemokine)과 같은 생화학적 매개자(mediator)들의 효소적 변형을 통해 면역 및 신경 내분비 시스템의 생리적 조절자로서 그의 기능적인 역할을 하는 것과 일치한다. 억제제로의 용도에 기초한 상기 개시된 QC의 다양한 기능들은 그 작용의 일부 및 QPCTLs와 같은 유사한 단백질의 작용에 기인할 수 있다. 따라서, QC, QPCTLs 및 다른 관련 효소의 선택적이고 잠재적인 억제제의 발견은 상기 단백질들의 기능을 변화시키는 다른 활성 화합물 뿐만 아니라 이들 및 새롭게 분리된 글루타미닐-펩티드 사이클로트랜스퍼라제의 효과적이고 안전한 약제학적 용도를 달성하는데 중요하게 고려된다.
따라서 본 발명은 신규한 단백질 또는 폴리펩티드, 이를 코딩하는 핵산, 이러한 단백질, 이들 단백질을 발현시키기 위한 핵산으로 변형된 세포, 상기 단백질에 대한 항체, 이러한 단백질(또는 QC의 억제제이고, 상기 단백질이 아닌 것) 활성 억제제인 새로운 치료학적 제제를 발현하기 위한 스크리닝 방법, 및 상기 스크리닝 방법에 의해 발견된 치료학적 제제를 제공한다. 신규한 단백질 및 그를 코딩하는 핵산은 예를 들면, 신경 퇴행성, 재생성(reproductive), 염증성 및 대사 이상과 같은 특정 질환을 치료하기 위한 새로운 치료학적 제제를 발견하는데 사용할 수 있고, 치료학적 또는 진단학적 가치가 있는 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태로서, 신규하고, 성숙한, 생물학적 활성 단백질, 바람직하게는 인간 기원의 단백질을 제공한다. 상기 단백질은 표준 기술에 의해(인간을 포함한) 적절한 동물 조직 또는 생물학적 체액의 소량으로부터 동정될 수 있다; 그러나 더 많은 양은, 단백질을 발현시키기 위해서 유전적으로 변형된 세포 배양에 의해 보다 편리하게 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, mRNAs, DNAs, cDNAs, 그의 게놈 DNAs를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명의 핵산 서열에 특이적으로 혼성화 하는데 충분한 길이의 핵산 분자를 포함하는 핵산 프로브를 제공한다.
더 나아가 본 발명의 다른 양태로서, 예를 들어, DNA 합성 및 DNA 벡터 제조와 같이 시험관 내(in vitro) 과학적 연구에 유용한 상기 폴리펩티드를 생산하기 위한 재조합 기술을 사용하는 방법을 제공한다. 상기 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법은 상기 단백질의 발현을 촉진시키는 조건 및 상기 단백질 또는 발현된 생성물의 단편을 순차적인 회복을 촉진시키는 조건 하에서 상기 폴리펩티드 및/또는 성숙 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA로 형질 감염된 재조합 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.
또 다른 양태로서 본 발명은 질병을 치료하기 위한 QPCTL 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 예를 들면 QC 활성 또는 EC 활성과 같은 성숙 단백질의 생물학적 활성을 억제하는 화합물을 발견하기 위한 상기, 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법을 제공하며, 따라서, 상기 억제제를 또한 제공한다.
특정 양태로서, 본 발명은 (a) 서열번호 11 내지 18로부터 선택되는 QPCTL 폴리펩티드, 또는 (b) 그에 적어도 약 75% 유사성이 있는 아미노산 서열을 포함하고 동일한 생물학적 기능을 나타내거나, 서열번호 2 내지 9 중 하나의 교호 스플라이스 변이체이거나, 또는 (a) 또는 (b)를 코딩하는 상기 핵산으로부터 적어도 14개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브이거나, 또는 상기의 어느 하나에 상보적인 분리된 핵산을 제공한다.
또 다른 특정한 하나의 양태로서, 본 발명은 선택적으로 당화될 수 있고, (a) 서열번호 10 내지 18 중 어느 하나로 제시되는 성숙 단백질의 아미노산 서열; 바람직하게는 서열번호 11 내지 18 중 어느 하나로 제시되는 성숙 단백질의 아미노산 서열을 포함하거나, (b) (a)의 성숙 단백질 중 하나에 적어도 약 75%의 유사성을 갖는 성숙 단백질이고 동일한 생물학적 기능을 나타나는 아미노산 서열을 포함하거나; (c) 서열번호 10 내지 18 중 어느 성숙 단백질에 적어도 약 50% 동일성을 갖는 성숙 단백질의 아미노산 서열; 바람직하게 서열번호 11 내지 18 중 어느 하나로 제시되는 성숙 단백질의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 (d) (a)의 면역학적으로 작용하는 단편인 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
또 다른 하나의 특정 양태로서, 본 발명은 바람직하게 서열번호 11 내지 18 인 단백질로부터 선택되는, 본 발명에 따른 적어도 하나의 성숙 단백질의 효소적 활성을 억제할 수 있는 화합물을 스크리닝 하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은, 하나 또는 그 이상의 후보 화합물 또는 그의 염의 존재하에서 상기 성숙 단백질 및 상기 성숙 단백질에 대한 적절한 기질을 배양하는 단계, 상기 성숙 단백질의 효소적 활성을 측정하는 단계, 후보 화합물의 부재하에 측정된 비교 활성과 상기 활성을 비교하는 단계, 및 효소적 활성을 감소시키는 후보 화합물 또는 화합물들을 선별하는 단계를 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 QC-억제제, 선택적 QC-억제제 또는 선택적 QPCTL-억제제의 용도에 기초한 진단 키트 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 양태 및 다른 양태들은 다음과 같은 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백하다.
Figure 112009023886404-PCT00010
Figure 112009023886404-PCT00011
Figure 112009023886404-PCT00012
발명의 상세한 설명
본 발명의 양태에 따르면, 서로 다른 기원으로부터 QPCTLs의 추정되는 아미노산(서열번호 11 내지 18, 21 및 22)을 포함하는 성숙 폴리펩티드 (mature polypeptides)를 코딩하는, 서열번호 2 내지 9, 19 및 20의 분리된 핵산 서열 (폴리뉴클레오티드)을 제공한다.
본 발명에 따라 바람직하게는, 인간으로부터의 QPCTLs의 추정되는 아미노산 서열 (서열번호 11 및 12, 21 및 22)을 포함하는 성숙 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 2 및 3, 19 및 20의 분리된 핵산 서열 (폴리뉴클레오티드)이다.
본 발명에 따라 보다 바람직하게는, 서열번호 11 및 12인 인간 QPCTLs로 추정되는 아미노산 서열을 포함하는 성숙 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 2 및 3의 분리된 핵산 서열 (폴리뉴클레오티드)이다.
본 발명에 따라 더욱 바람직하게는, 서열번호 21 및 22의 인간 QPCTLs의 교호 스플라이스 형 (alternative splice forms)으로 추정되는 아미노산 서열을 포함하는 성숙 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 19 및 20의 분리된 핵산 서열 (폴리뉴클레오티드)이다.
본 발명에 따라 가장 바람직하게는, 서열번호 11의 인간 QPCTL으로 추정되는 아미노산 서열을 포함하는 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 2의 분리된 핵산 서열 (폴리뉴클레오티드)이다.
본 발명에 따라 더욱 가장 바람직하게는, 서열번호 12의 인간 QPCTL로 추정되는 아미노산 서열을 포함하는 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 3의 분리된 핵산 서열 (폴리뉴클레오티드)이다.
상기 언급된 양태들 및 바람직한 형태는 QPCTL 단백질 뿐만 아니라 QPCTL 핵산에도 적용되고, 다른 바람직한 사용, 진단, 치료, 스크리닝, 효과기, 억제제 및 다른 용도 및 본 발명에 따른 방법에 적용된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 인간 QC를 주형으로 적용 하여 NCBI에서 뉴클레오티드 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 사용한 유사성 검색에 의해 확인될 수 있다. 검색 결과, 19q13.32 영역에서 코딩되는, 19번 염색체 상의 추정 QPCTL을 발견하였다. 검색에 기초하여, 인간 isoQC의 세포주 스크리닝을 위한 프라이머를 제작하였다 (표 4). 인간 QPCTL에 대한 분리된 cDNA는, 인간 QC에 45.24%의 서열 동일성, 및 71.98% 유사성을 나타내는, 382 아미노산 길이의 단백질을 코딩하는 ORF (open reading frame)를 포함한다. 세포 이하의 편재화 (subcellular localization)를 예상하기 위하여 다른 생물정보적 알고리즘 (bioinformatic algorithms)을 적용 (www.expasy.ch)하는 것은 신뢰성 높은 결과를 얻지 못하였다. 예상 프로그램 (prediction program)에 의거한 예후 (prognosis)는 골지체 (golgi-apparatus) 또는 미토콘드리아 (mitochondra)로 이동하였다.
메탈로펩티다제 (metallopeptidase) Clan MH의 M28 패밀리 멤버의 다른 멤버와 인간 QPCTL의 아미노산 서열을 정렬한 결과, 인간 QPCTL 단백질이 인간 및 뮤린 QC와(도 1) 및 박테리아 아미노펩티다제에 전체 서열 및 구조적 상동성을 갖는다는 사실을 밝혀 내었다(도 3). 추가적인 인간 QPCTL-관련 유전자에 대한 데이터베이스 검색으로 설치류, 유인원 (simian), 가금류 (cattle) 및 개 (dog)의 QPCTLs가 존재함을 확인하였다. 신규한 인간 QPCTL과 이러한 서열 정렬은 인간에 대응 (human counterpart)하여 높은 상동성을 보임을 확인하였다. 인간 QC (Asp-Glu-His)의 아연-복합체형성 (zinc-complexing) 잔기는 서로 다른 기원의 QPCTLs 사이에 보존되어 있다 (도 2).
인간 isoQC 유전자는 적어도 8개의 엑손 (exon)을 포함한다. 인간 isoQC 단백질을 코딩하는 서열은 엑손 1 내지 7 상에 위치한다. 인간 isoQC는 인간의 19번 염색체 19q13.32에 위치한다. 인간 isoQC에 대한 세포주 스크리닝은 간 (Hep-G2, hepatocellular carcinoma), 피부 (HaCaT, keratinocyte) 및 신경 조직 (LN405, astrocytoma; SH-SY5Y, neuroblastoma)으로부터의 세포에서 기원한 전사체 (transcripts)임이 드러났다(도 6).
몇몇의 발현 숙주에서 분리된 QPCTL-cDNA가 기능적으로 발현되는지를 실험하였다. 인간 QC에 성공적으로 적용되는 P. 파스토리스(P.pastoris)에서의 발현은 효소적으로 활성인 단백질을 나타내지 않았다. 포유류 세포에서의 발현은 활성의 검출을 가져 오지만, 그 발현 수준이 매우 낮다. 그러므로 효소적으로 활성인 단백질을 분리하는 것은 당업계의 지식으로는 불가능하다. 효소적으로 활성인 단백질은 오직 대장균에서 GST-QPCTL 융합 단백질의 발현에 따라, 매우 통상적이지 않은 발현 조건 (1% 글루코스의 존재하, 37℃에서 4시간 동안 발현, 20 μM IPTG를 사용하여 발현을 유도)을 적용하는 경우에만 분리될 수 있다. 발현 조건은 대장균에서 낮은-수준 발현을 가져오는데, 이는 펩티드 사슬의 기능적 폴딩 (folding)에 필수적이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 QPCTL 넉아웃 (knockout) 동물, 바람직하게는 QPCTL 넉아웃 래트 또는 QPCTL 넉아웃 마우스(mice)에 관한 것이다. 넉아웃 마우스는 QPCTL 유전자 기능의 추가적인 분석에 유용한 도구이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있다; DNA는 cDNA, 게놈 DNA (genomic DNA), 및 합성 DNA (synthetic DNA)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. DNA는 이중-나선(double-stranded) 또는 단일 나선(single-stranded)일 수 있고, 단일 나선인 경우 코딩 나선 (coding strand) 또는 비-코딩 (안티센스) (non-coding[antisense]) 나선일 수 있다. 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열은, 서열번호 2 내지 9로 표현되는 코딩 서열과 동일할 수 있으며, 또는 유전적 코드의 중복 또는 퇴화, 또는 SNP (single nucleotide polymorphism)의 결과로서 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 다른 코딩 서열일 수 있다. 예를 들면, 코딩 서열은 또한 서열번호 11 내지 18 중 어느 하나의 전장을 포함하는 RNA 전사체일 수 있다.
서열번호 2 내지 9의 성숙 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함될 수 있으나, 성숙 단백질 자체에 대한 코딩 서열이 있는 제한되는 것은 아니다; 성숙 폴리펩티드에 대한 코딩서열은, 리더 또는 분비 서열 또는 프로프로틴 서열과 같은 추가적인 코딩 서열을 더 가질 수 있고; 성숙 단백질에 대한 코딩 서열 (및 선택적으로 추가한 코딩 서열)은 인트론 또는 성숙 단백질에 대한 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 비-코딩 서열과 같은 비-코딩 서열을 더 가질 수 있다.
그러므로, 용어 "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드" 또는 용어 "폴리펩티드를 코딩하는 핵산"은 추가적인 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 것 뿐만 아니라 성숙 단백질에 대한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 폴리뉴클레오티드 및 핵산은 혼용하여 (상호교환적으로) 사용된다.
본 발명은, 성숙 단백질에 대한 코딩 서열이 숙주 세포로부터 폴리펩티드의 발현 및 분비를 돕는 폴리뉴클레오티드 서열과 동일한 리딩 프레임 (reading frame) 내에 융합될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 또한 포함한다; 예를 들면, 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 조절하기 위하여 분비 서열로서 기능하는 리더 서열을 융합할 수 있다. 이러한 리더 서열을 포함하는 폴리펩티드는 프리프로틴(preprotein) 또는 프리프로프로틴 (preproprotein)이라 명명되고, 단백질의 성숙 형태를 형성하기 위하여 숙주 세포에 의해 리더 서열이 절단될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 5' 신장 영역을 포함할 수 있으므로, 성숙 단백질이 N-말단에 추가적인 아미노산 잔기를 더 가지는 프로프로틴을 코딩한다. 상기 프로서열(prosequence)을 포함하는 발현 생성물은 프로프로틴으로 명명되는데, 이는 성숙 단백질의 비활성형 이다; 그러나, 프로서열이 한번 절단되면, 활성형 성숙 단백질이 된다. 그러므로, 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 성숙 단백질, 프로서열을 포함하는 단백질, 또는 프로서열 및 프리서열 (리더 서열) 모두를 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명의 폴리펩티드의 정제를 위한 마커 서열 (marker sequence)이 프레임 내에 융합된 코딩 서열을 포함할 수 있다. 마커 서열은 포유류 숙주, 즉 COS-1 세포가 사용될 때, 폴리히스티딘 태그 (polyhistine tag), 헤마글루티닌 (hemagglutinin [HA]) 태그, c-myc 태그 또는 V5 태그일 수 있다.
HA 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프(epitope)에 대응하고 (Wilson, I., et al., Cell, 37: 767 (1984)), c-myc 태그는 인간 Myc 단백질로부터의 에피토프 일 수 있다 (Evans, G. I. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3610-3616 (1985)).
용어 "유전자 (gene)"는 폴리펩티드 사슬 (polypeptide chain)을 생산하는데 관여하는 DNA의 단편을 의미한다; 유전자는 개별적인 코딩 단편들 (엑손 [exons]) 사이의 인터베닝 서열 (인트론) (intervening sequences [intron]) 뿐만 아니라 코딩 영역의 전 및 후의 영역 (리더 및 트레일러 [leader and trailer])을 포함한다.
용어 "현저한 서열 상동성 (significant sequence homology)"이란 아미노산 잔기의 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 40%가 보존되어 있고, 비보존 영역의 적어도 40%가 보존적 치환인 것을 의미한다.
본 발명의 전장 (full-length) 유전자의 단편은, 다른 cDNAs를 동정하기 위해서 뿐만 아니라, 전장 cDNA를 분리하기 위하여 cDNA 라이브러리에 대한 혼성화 프로브 (hybridization probe)로서 사용될 수 있고, 이는 유전자에 대해 현저한 서열 상동성을 가지며 유사한 생물학적 활성 또는 기능을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 본 출원의 목적으로서, 유사한 생물학적 활성 또는 기능에 대해, 각각 QC- 및 EC-활성으로 정의되는 펩티드, 단백질, 호르몬 또는 다른 기질의 N-말단 글루타민 또는 글루타민산으로부터 피로글루타메이트 (pyroglutamate)의 를 형성하는 능력을 의미한다. 이러한 타입의 상기 프로브는 적어도 14개의 염기 (서열번호 2 내지 9 중 하나로부터의, 적어도 14개의 연속적인 뉴클레오티드)를 포함하며, 바람직하게는 적어도 30개의 염기를 포함할 수 있으며, 예를 들면 50개 또는 그 이상의 염기를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 53 내지 61의 프로브이다. 상기 프로브는 또한, 전장 전사체 및/또는 전체 유전자를 포함하는 게놈 클론 또는 클론들에 대응하고, 조절 및 프로모터 영역, 엑손, 및 인트론을 포함하는 cDNA 클론을 동정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 유전자에 대해 서열 상보성을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드는 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리 또는 다른 기원 또는 동물들에 의한 유사한 라이브러리들을 스크리닝하는데, 또는 상기 프로브가 혼성화하는 라이브러리 멤버를 결정하는데 유용하다. 예로써, 알려진 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 그 후 목적 유전자의 코딩 영역을 본리하기 위한 라이브러리 스크리닝에 이용된다.
본 발명은 상기-기술된 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열간 동일성 또는 유사성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 제공할 수 있고, 따라서 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 코딩할 수 있다. 또한, 당업계에 알려진 바와 같이, 아미노산 서열이, 서열 내 각 개별적 잔기에 대해 동일하거나 보존된 아미노산 치환을 포함하고 있는 경우 두 폴리펩티드 간의 "유사성"이 있다. 동일성 및 유사성은 서열 분석 소프트웨어 (e.g., ClustalW at PBIL (Pole Bioinformatique Lyonnais) http://npsapbil.ibcp.fr)를 사용하여 측정될 수 있다. 상세하게 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 이는 상기-기술된 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "엄격한 조건 (stringent conditions)"은 적어도 약 70%의 동일성이 있는 서열번호 2 내지 9의 폴리뉴클레오티드 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열간 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다.
적절한 엄격한 조건은, 예를 들면, 사전 혼성화 및 혼성화 용액에서 염 또는 포름아마이드 (formamide)의 농도에 의해, 또는 혼성화 온도에 의해 정의될 수 있고, 당업계에 잘 알려져 있다. 구체적으로는, 엄격성은 염의 농도 감소에 의해, 포름아마이드 농도의 증가로 인해, 및/또는 혼성화 온도 증가에 의해 증가될 수 있다.
예를 들면, 높은 엄격성 조건 하에서의 혼성화는 약 37℃ 내지 42℃에서 약 50% 포름아마이드를 사용하는 반면, 감소된 엄격성 조건 하에서의 혼성화는 약 30℃ 내지 35℃에서 약 35% 내지 25%의 포름아마이드를 사용할 수 있다. 하나의 높은 엄격성 조건 하에서 하나의 구체적인 혼성화 조건은 42℃, 50% 포름아마이드, 5x. SSPE, 0.3% SDS, 및 200㎍/㎖ 절단되고(sheared), 변성된 연어 정자 DNA를 사용할 수 있다. 감소된 엄격성 하에서의 혼성화는 상기 기술된 것과 유사한 조건을 35℃의 감소된 온도에서 35%의 포름아마이드에서 사용할 수 있다. 엄격성의 특정 수준에 대응하는 온도 범위는 목적 핵산의 피리미딘에 대한 퓨린의 비율을 계산함으로써, 및 그에 따른 온도를 조절함으로써 보다 좁아질 수 있다. 상기 범위 및 조건의 다양성은 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게, 혼성화는 서열간 동일성이 적어도 95%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 97%을 보이는 경우에만 일어날 수 있다. 바람직한 양태로서 상기 기술된 폴리뉴클레오티드에 대한 혼성화 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 내지 9의 cDNA 중 하나에 의해 코딩되는 성숙 단백질로서 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보이는 폴리펩티드를 코딩한다.
언급한 것과 같이, 적절한 폴리뉴클레오티드 프로브는 적어도 14개의 염기를 포함할 수 있고, 바람직하게는 30개의 염기, 및 더욱 바람직하게는 적어도 50개의 염기를 포함할 수 있으며, 상기 기술된 바와 같이 그와 동일성을 갖고 활성을 보유하거나 보유하지 않을 수 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 혼성화된다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 2 내지 9의 뉴클레오티드에 혼성화 하기 위한 프로브로서, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드의 회복을 위하여, 또는 진단 프로브로서, 또는 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 서열번호 11 내지 18의 폴리펩티드 및 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 70%의 동일성, 바람직하게는 각각 적어도 90% 동일성, 및 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
당업계에 잘 알려진 바와 같이, 하나 이상의 뉴클레오티드 트리플렛 (코돈) (nucleotide treiplet [codon])에 의해 특정 아미노산이 코딩된다는 점에서 유전 코드는 매우 다양하고, 본 발명은 여기에 제시된 서열을 특히 예시로함으로써 다른 코돈을 사용하여 동일한 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 "동등한" 폴리뉴클레오티드 서열로서 여기에 제시된다. 본 발명은 서열번호 11 내지 18중 어느 하나의 추정되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 중 하나의 성숙 단백질, 유사체 및 유도체의 전부 또는 일부와 같은 단편을 코딩하는 상기 서술된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 추가적으로 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 변이체 형태는 폴리뉴클레오티드의 대립형질 변이체를 자연적으로 일으키거나, 폴리뉴클레오티드의 변이체를 비-자연적으로 일으킨 것일 수 있다. 예를 들면, 핵산의 변이체는 단순히 유전 코드의 퇴화에 의한 아미노산 코돈 서열의 차이일 수 있거나, 결손 병이체, 치환 변이체 및 부가 또는 삽입 변이체일 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 대립인자 변이체는 폴리뉴클레오티드 서열의 교호 형태 (alternative form)이며, 이는 코딩된 폴리펩티드의 생물학적 기능을 실질적으로 변화시키지 않는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.
본 발명은 서열번호 11 내지 18의 추정되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 단편들, 유사체 및 유도체를 더 포함한다. 서열번호 11 내지 18의 폴리펩티드에 대한, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 상기 폴리펩티드로서 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면, 유사체는 프로프로틴을 포함할 수 있는데, 이는 활성 성숙 단백질을 생산하는 프로단백질 부분의 절단에 의해 활성화될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다; 그러나, 바람직하게는 당화되거나, 당화되지 않은 (unglycosylated) 재조합 폴리펩티드이다.
서열번호 11 내지 18 중 어느 하나의 펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체는, (ⅰ) 보존되거나 보존되지 않은 (non-conserved) 아미노산 잔기 (바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기이고, 상기 치환된 아미노산 잔기는 유전 코드에 의해 코딩된 것이거나 그렇지 않을 수 있으며, 또는 (ⅱ) 치환 그룹을 포함하는 아미노산 잔기의 하나 또는 그 이상의 잔기이거나, 또는 (ⅲ) 성숙 폴리펩티드 또는 프로단백질 서열의 정제를 위해 도입된 리더 또는 분비 서열과 같은 성숙 단백질에 융합된 추가적인 아미노산 일 수 있다. 상기 단편들, 유도체 및 유사체는 본 명세서에서 개시하고 있는 내용을 제공하기 위하여 당업계의 기술로써 본 발명에 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 분리된 형태일 수 있으며, 바림작하게는 실질적인 동질성 (homogeneity)은 적어도 약 85%의 순도를 의미한다.
용어 "분리된 (isolated)"은 그 본래의 환경 (예를 들면 자연적으로 발생하는 경우, 자연 환경)으로부터 물질을 제거시키기 위한 수단으로 사용된다. 예를 들면, 살아있는 동물에 존재하는 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리된 것을 의미하지 않으나, 천연 시스템에서 함께 존재하는 물질들의 실질적인 전부로부터 분리된 경우의 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리되었다고 여겨진다. 예를 들면, DNA의 경우, 상기 용어는 벡터 내, 자연적으로 복제된 플라스미드 또는 바이러스 내, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 포함되는 재조합 DNA; 또는 다른 서열과 독립적인 분리된 분자로서 존재하는 (예, PCR (폴리머라제 연쇄 반응)에 의해 생산되는 cDNA 또는, 게놈 또는 cDNA 단편) 재조합 DNA를 포함한다. 또한 예를 들면, 융합 단백질과 같은 추가적인 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다. 또한 QPCTLs의 교호 스플라이스 변이체 (alternaive splice variant)를 코딩하는 서열번호 2 내지 9 중 하나로 구성되는 뉴클레오티드의 부분을 포함하는 재조합 DNA를 추가적으로 포함한다. 다양한 교호 스플라이스 변이체는 서열번호 19-22에 예시되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 11 내지 18의 폴리펩티드중 하나에 적어도 75% 유사성을 갖는 폴리펩티드 (예. 바람직하게는 적어도 50%이고, 더욱 바람직하게는 적어도 70%의 동일성), 및 더욱 바람직하게는 서열번호 11 내지 18의 폴리펩티드 중 하나에 적어도 85% 유사성 (예. 바람직하게는 적어도 70%의 동일성), 및 가장 바람직하게는 서열번호 11 내지 18 중 어느 하나에 적어도 95% 유사성 (예, 바람직하게는 적어도 90%의 동일성)을 갖는 폴리펩티드 뿐만 아니라 서열번호 11 내지 18 의 폴리펩티드 (특히, 성숙 단백질) 중 어느 하나를 포함한다. 더욱이, 이들은 바람직하게 적어도 30개의 아미노산, 및 더욱 바람직하게는 적어도 50개의 아미노산 서열을 포함하는 상기 폴리펩티드 추출 부분을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 부분은 펩티드 합성에 의해 대응하는 전장 폴리펩티드를 생산하기 위하여 중간체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편 또는 부분은 또한 본 발명의 전장 폴리뉴클레오티드를 합성하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터에 의해 유전적으로 조작된 숙주 세포 및 상기 서술된 것들을 사용하여 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 생성물을 포함한다. 상기 벡터를 사용하여 유전적으로 숙주세포를 조작(형질도입된 (transduced) 또는 형질전환된 (trasformed) 또는 형질감염된 할 수 있는데, 상기 벡터는 예를 들면, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다. 예를 들면, 벡터는 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 (phage) 등의 형태일 수 있다. 본 발명의 프로모터의 활성화, 형질전환체의 선별, 또는 유전자 증폭을 위하여 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에 조작된 숙주 세포를 배양할 수 있다. 온도, pH 및 이와 같은 배양 조건은, 당업계에 통상적으로 잘 알려진 바에 따라, 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 통상적으로 사용된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 기술에 의해 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 그러므로, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 발현하기 위한 다양한 발현 벡터 중 어느 하나에 포함될 수 있다.
상기 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열을 포함하며, 예를 들면, SV40의 유도체; 파지 DNA; 바큘로바이러스; 효소 플라스미드; 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터, 백시니아 (vaccinia), 아데노바이러스 (adenovirus), 파울 폭스 바이러스 (fowl pox virus), 및 슈도래비스 (pseudorabies) 와 같은 바이러스 DNA (viral DNA) 등이 있다. 그러나, 숙주에서 복제 및 생존이 가능한 한 다른 어떤 벡터도 사용될 수 있다.
적절한 DNA 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당업계의 공지된 방법에 의해 적절한 제한 엔도뉴클리아제 부위 (restriction endonuclease site) 내에 삽입되며, 상기 방법은 본 기술이 속하는 분야에 잘 알려져 있다.
발현 벡터 내에서의 DNA 서열은 직접적인 mRNA 합성을 위해 적절한 발현 조절 서열 (프로모터 [promoter])에 작동 가능하게 연결된다. 상기 프로모터의 대표적인 예는, 하기에 언급된 것일 수 있다: LTR 또는 SV40 프로모터, 대장균 lac 또는 trp, 파지 람다 P_L (phage lambda P.sub.L) 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 그의 바이러스에서 유전자 발현을 조절한다고 알려진 다른 프로모터.
발현 벡터는 또한 번역 개시 (translation initiation) 및 전사 종결자 (transcription terminator)에 대한 라이보좀 결합 부위를 포함할 수 있다. 벡터는 또한 발현을 증폭시키기 위한 적절한 서열을 포함할 수 있다. 추가적으로, 바람직하게 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포를 선별하기 위한, 진핵 세포 배양을 위한 디하이드로폴레이트 환원효소 (dihydrofolate reductase) 또는 네오마이신-저항성 (neomycin-resistance), 또는 대장균에서 테트라사이클린- (tetracycline-) 또는 앰피실린-저항성 (ampicillin-resistance)과 같은 표현형 특징 (phenotypic trait)을 제공하기 위한 하나 또는 그 이상의 선택 마커 유전자를 포함한다.
적절한 프로모터 또는 조절 서열 뿐만 아니라, 본 명세서에 기술한 바와 같은 적절한 DNA 서열을 포함하는 벡터는, 숙주세포가 단백질을 발현시킬 수 있도록 적절한 숙주를 형질전환할 수 있다. 적절한 숙주의 대표적인 예로는, 다음에 언급된 것일 수 있다: 대장균 (E.coli), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)과 같은 박테리아 세포; 효모 (yeast)와 같은 균류 세포 (fungal cells); 초파리 S2 (Drosophila S2) 및 스포돕테라 Sf9 (Spodoptera Sf9)과 같은 곤충 세포; CHO, COS 또는 보웨스 흑색종 (Bowes melanoma)와 같은 동물 세포; 아데노바이러스; 식물 세포 등. 적절한 숙주의 선택은 본 명세서에 개시된 것으로부터 당업자의 영역 내에 포함된다.
핵산 서열의 합성 생성물은 CLONTECH 95/96 Catalogue, 215-216 페이지, CLONTECH, 1020 Ease Meadow Circle, Palo Alto, Calif. 94303으로부터 명백하므로, 기술적으로 잘 알려져 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 본 발명의 단백질 생산을 위하여 유용한 발현 벡터를 포함한다. 본 발명은 상기 넓게 기술된 서열의 하나 또는 그 이상을 포함하는 재조합 구조물을 추가적으로 포함한다. 구조물은, 본 발명의 서열이 정방향 또는 역방향으로 삽입된 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터를 포함할 수 있다. 바람직한 하나의 양태로서, 구조물은 예를 들면, 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 같은 조절 서열을 추가적으로 포함한다. 많은 수의 적절한 벡터 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있으며, 상업적으로 이용 가능하다. 다름의 벡터들이 그 예로서 제공된다: 박테리아: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNHI8A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 및 pRIT5 (Pharmacia); 및 진핵생물: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVL (Pharmacia). 그러나, 숙주에서 복제 및 생존이 가능한 한 다른 적절한 플라스미드 또는 벡터가 사용될 수 있다.
프로모터 영역은 CAT (chloramphenicol acetyl transferase) 벡터 또는 선택 마커가 존재하는 다른 벡터들을 사용하여 원하는 유전자로부터 선택될수 있다.
두 가지 적절한 벡터는 pKK232-8 및 pCM7이다. 특정 명명된 박테리아 프로모터는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_R, P_L 및 trp을 포함한다. 진핵생물 프로모터는 CMV 이미디에이트 얼리 (CMV immediate early), HSV 티미딘 키나제 (HSV thymidine kinase), 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스의 LTRs 및 마우스 메탈로티오닌-Ｉ(mouse metallothionein-Ｉ)을 포함한다.
발현 벡터의 구성성분들은 유전적으로 다음의 것들을 포함한다: 1) 선택 마커로서 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (neomycin phosphotransferase, G418) 또는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 (hygromycin B phophotransferase, hyg) 유전자, 2) E.coli 복제 원점, 3) T7 및 SP6 파지 프로모터 서열, 4) lac 조절자 서열 (lac operator sequence), 5) 락토오즈 오페론 억제자 유전자 (lactose operon repressor gene, lacＩq) 및 6) 다클론부위 연결자 영역 (multiple cloning site linker region). 상기 본제 원점 (origin of replication, oriC)은 pUC19 (LTI, Gaithersburg, Md.)로부터 유래할 수 있다.
적절한 제한 부위를 갖는 서열번호 2 내지 9의 폴리펩티드 중 하나를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들면 이하에서 기술되는 실시예 1 및 2의 PCR 방법 (PCR protocol)에 따라 제조되는데, EGFP-N3 벡터 내에 isoQC MetＩ 및 MetⅡ의 클로닝을 위하여 (5' 프라이머로서) EcoRＩ 및 (3' 프라이머로서) SalＩ에 대한 제한 부위, 또는 pET41a 벡터에 isoQC의 클로닝을 위하여 (5' 프라이머로서) SpeＩ 및 (3' 프라이머로서) EcoRＩ제한 부위를 포함하는 PCR 프라이머를 사용하였다. PCT 삽입물을 겔-정제하였고, 인식가능한 제한 효소 (compatible restriction enzymes)로 분해하였다. 삽입물 및 벡터를 표준 프로토콜 (standard protocols)에 따라 결찰하였다.
추가적인 양태로서, 본 발명은 상기-기술된 구조물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는, 포유류 세포와 같은 고등 진핵 세포, 또는 효모와 같은 하등 진핵 세포일 수 있으며, 숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵세포일 수 있다. 숙주 세포 내의 구조물 도입은 인산 칼슘 형질감염 (calcium phosphate transfection), DEAE-덱스트란 매개 형질감염 (DEAE-Dextran transfection), 리포펙션 (lipofection) 또는 전기천공(electroporation)에 의할 수 있다 (Davis, L., Dibner, M., Battery, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
바람직하게 숙주 세포에서의 상기 구조물들은 재조합 서열에 의해 코딩되는 유전자 생성물을 생산하기 위해 통상적인 조건에서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 통상적인 펩티드 합성에 의해, 또는 적절한 단편의 화학적 결찰 (chemical ligation)에 의해 합성적으로 생산되고, 제조될 수 있다.
성숙 단백질은 적절한 프로모터의 조절하에 포유류 세포, 효모, 박테리아 또는 다른 세포에서 발현될 수 있다. 무-세포 번역 시스템 (Cell-free translation systems)은 또한 본 발명의 DNA 구조물로부터 유래되는 RNAs를 사용하여 상기 단백질을 제조하기 위해 이용될 수 있다. 원핵 및 진핵 숙주에 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Mnual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989)에 개시되어 있다.
고등 진핵생물에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 벡터 내에 인핸서 (enhancer) 서열을 삽임함으로써 증가시킬 수 있다.
인핸서는, 그 전사를 증가시키기 위해 프로모터 상에 작용하는, 일반적으로 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스-활성 요소 (cis-acting element)를 포함한다. 그 예로, 복제원점 bp 100 내지 270의 후면 (late side) 상의 SV40 인핸서, 아시토메갈로바이러스 얼리 프로모터 인핸서 (acytomegalovirus early promoter enhancer), 복제원점 후면 상의 폴리오마 인핸서 (polyoma enhancer), 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 하는 복제원점 (origin of replication) 및 선택 마커를 포함하는데, 예를 들면, 대장균 및 S.세레비지애(cereviseae) TRP1 유전자의 앰피실린 저항성 유전자 (ampicillin resistance gene), 및 다운스트림 (downstream) 구조 서열의 직접적 전사에 있어서 고발현시키는 유전자로부터 유래된 프로모터가 있다. 상기 프로모터들은 PGK (3-phosphoglycerate kinase), 알파-인자, 산성 포스파타아제 (acid phosphatase), 또는 열충격 단백질 (heat shock protein)과 같은 당분해 효소 (glycolytic enzymes)를 코딩하는 오페론 (operons) 또는 다른 것들로부터 유래될 수 있다. 이종유래 (heterologous) 구조 서열은 번역 개시 및 종결의 적절한 단계에서 연결되는데, 바람직하게는 원형질막 주위공간 (periplasmic space) 또는 세포막 배지 (extracellular medium) 내로 번역된 단백질의 분비를 직접적으로 가능하게 하는 리더 서열 (leader sequence)과 연결될 수 있다. 선택적으로, 이종유래 서열은, 예를 들면 발현된 재조합 생성물의 안정화 및 간단한 정제와 같은 원하는 특징을 부여한 N-말단 동정 펩티드 (N-terminal identification peptide)를 포함하는 융합 단백질을 코딩할 수 있다.
박테리아 용도로의 유용한 발현 벡터는, 기능적 프로모터로 작동 가능한 리딩 단계 (operable reading phase)에서 원하는 단백질을 적절한 번역 개시 및 정렬 신호와 함께 코딩하는 구조 DNA 서열을 삽입함으로서 제조될 수 있다.
벡터는 벡터가 유지되는 것을 확인하고 원하는 경우 숙주 내에서 증폭시키기 위하여, 하나 또는 그 이상의 표현형 선택 마커 및 복제원점를 포함한다. 형질 전환을 위한 적절한 원핵 숙주는 대장균, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 및 스타필로코커스 (Staphylococcus) 속 내의 다양한 종들을 포함하나, 선택에 따라 다른 것들 또한 포함될 수 있다.
대표적이나, 제한되는 것은 아닌 예로써, 박테리아 용도로 유용한 발현 벡터는 잘 알려진 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 유전적 요소들을 포함하는 상업적으로 이용 가능한 플라스미드로부터 유래한 선택 마커 및 박테리아 복제원점을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 상업적 벡터들은 pKK223- 3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wis., U. S. A.)를 포함한다. 이러한 pBR322 "골격 (backbone)" 섹션은 적절한 프로모터 및 발현되기 위한 구조 서열과 결합된다.
적절한 숙주 균주의 형질 전환 및 적절한 세포 밀도로의 숙주 균주의 성장 후, 적절한 수단에 의해 선택된 프로모터를 유도하며(예, 온도 변화 또는 화학적 유도), 추가적인 시간 동안 세포를 배양한다.
원심분리에 의해 통상적으로 세포를 수득하였고, 이후 물리적 또는 화학적 수단으로 파쇄하였다. 조추출물을 사용하여, 추가적인 정제를 위해 보관하였다.
단백질의 발현에서 이용된 미생물 세포는 응결-해동 사이클링 (freeze-thaw cycling), 초음파분해 (sonication), 기계적인 파쇄 및 세포-용해제 (cell-lysing agents)의 사용을 포함하는 통상적인 방법에 의해 파쇄될 수 있으며; 상기 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
다양한 포유류 세포 배양 시스템은 또한 재조합 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있다. 포유류 발현 시스템의 예는 Gluzman, Cell, 23: 175 (1981)에 개시되어 있는 원숭이 신장 섬유아세포 (monkey kidney fibroblasts)의 COS-7 주 (COS-7 lines)를 포함한다. 컴패터블 벡터 (compatible vector)를 발현시킬 수 있는 다른 세포주의 예로는, C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 포함한다. 포유류 발현 벡터는 일반적으로 복제원점, 적절한 프로모터 및 인핸서를 포함하며, 또한 다른 필요한 라이보좀 결합 부위, 폴리아데닐레이션 부위 (polyadenylation site), 스플라이스 공여체 (splice donor) 및 수용체 (acceptor) 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 플랭킹 비전사 서열 (5' flanking nontranscribed sequences)을 포함할 수 있다. SV40 스플라이스로부터 유래된 DNA 서열, 및 폴리아데닐 부위는 필요한 비전사적 유전적 요소들을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
폴리펩티드는 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산성 추출, 음이온 또는 양이온 전환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오즈 크로마토그래피 (phosphocellulose chromatography), 소수성 결합 크로마토그래피 (hydrophobic interacion chromatography), 친화 크로마토그래피, 하이드록실아파티트 크로마토그래피 (hydroxylapatite chromatography) 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포로부터 폴리펩티드를 정제하거나 회수할 수 있다.
회수는 폴리펩티드가 세포의 표면에 발현되는 경우 촉진될 수 있으나, 이러한 것이 전제되어야 하는 것은 아니다. 회수는 더 긴 폴리펩티드 형태의 발현에 따라 절단되는 절단 생성물일 수 있다. 필요하다면, 성숙 단백질의 구조를 완성하기 위해 당업계에서 잘 알려진 단백질 리폴딩 (refolding) 단계가 사용될 수 있다. 최종 정제 단계를 위하여 HPLC (고성능 액체 크로마토그래피)를 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 정제된 자연 생성물일 수 있고, 또한 원핵 또는 진핵 숙주 (예를 들면, 배양에서의 박테리아, 효소, 고등 식물, 곤충 또는 포유류 세포)로부터 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다. 재조합 생산 방법에서 도입된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 당화되거나, 당화되지 않을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
바람직한 양태로서, 본 발명의 단백질은 다른 단백질로부터의 오염으로부터 실질적으로 분리시키기 위하여 분리되거나 정제된다. 예를 들면, 본 발명의 단백질은 샘플에 존재하는 전체 단백질 중량에 적어도 80%을 구성하며, 더욱 바람직하게는 전체 단백질 중량에 적어도 90%, 더더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98%를 구성할 수 있다.
이러한 단백질들은 물, DMSO (dimethyl sulphoxide) 또는 에탄올과 같은 다른 적절한 용매, 또는 적절한 용매의 혼합물에서 용액 형태로 존재할 수 있다.
용매의 혼합물의 예는 물에 (중량의) 10% 에탄올 및 물에 (중량의) 2% DMSO를 포함한다. 용액은 염, 완충제, 무질서유발제 (chaotropic agents), 계면활성제, 보존제 및 이의 유사한 것들을 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 단백질은 동결건조된 파우더 또는 결정성 고체와 같은 고체 형태일 수 있으며, 상기 단백질은 잔용매인 염 또는 이와 유사한 것들을 또한 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "항체"는 다클론 항체 (polyclonal antigodies), 친화력-정제된 다클론 항체, 단일클론 항체 (monoclonal antibodies), 및 F(ab')2 및 Fab' 단백 분해 단편들과 같은 항원-결합 단편을 포함한다. 합성 항원-결합 펩티드 및 폴리펩티드 뿐만 아니라 키메릭 항체 (chimeric antibodies)와 같은 유전적으로 조작된 완전한 항체 또는 단편, Fv 단편, 단일 사슬 항체 및 이와 유사한 것들 또한 포함된다.
비-인간 항체는 인간 골격 (framework)상의 비-인간 CDRs 및 불변 영역 (constant region)을 이식함으로써 인간화 될 수 있거나, 전체 비-인간 가변 도메인을 포함시킴으로써 인간화 될 수 있다 (노출된 잔기를 대체함으로써 인간-유사 표면에 선택적으로 그것들을 "클락킹 (cloaking)"하며, 그 결과로 "베니어드(veneered)" 항체가 된다). 몇 가지 예로, 인간화 항체는 고유한 결합 특성 (proper binding characteristecs)을 증가시키기 위하여 인간 가변 영역 골격 도메인 내에 비-인간 잔기를 보유할 수 있다. 항체를 인간화시킴으로써, 생물학적 반감기를 증가시킬 수 있고, 인간에게 투여됨으로써 역 면역 반응 (adverse immune reaction)의 잠재성을 감소시킬 수 있다.
본 발명에 유용한 항체를 제조하거나 선택하기 위한 또 다른 기술은, 인간 isoQC 단백질 또는 그의 펩티드에 대한 림프구의 시험관 내 (in vitro) 노출, 및 (예를 들면, 고정화되거나 표지된 인간 isoQC 단백질 또는 펩티드에 의한 파지 또는 유사한 벡터 내의 항체 디스플레이 라이브러리의 선택 을 포함한다.
잠재적 인간 isoQC 폴리펩티드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 파지 (파지 디스플레이)상에 또는 대장균과 같은 박테리아 상에 제시된 무작위적 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당업계에 잘 알려진 수많은 방법에 의해 수득할 수 있다.
당업자에게 자명한 바와 같이, 다클론 항체는, 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 토끼, 마우스 및 래트 등과 같은 다양한 온혈 동물에 인간 isoQC 폴리펩티드 또는 그의 단편을 주입함으로써 제조될 수 있다. 인간 isoQC 폴리펩티드의 면역원성은, 알룸 (alum, aluminum hydroxide) 또는 프로인트 완전 또는 불완전 애쥬번트 (Freund's complete or incomplete adjuvant)와 같은 애쥬번트, 또는 라이소렉틴 (lysolecthin), 플루로닉 리올스 (pluronic polyols), 폴리어나이온 (polyanion), 펩티드, 오일 에멀젼, KLH 또는 디나이트로페놀 (dinitrophenol)과 같은 표면 활성 물질을 사용함으로써 증가될 수 있다. 인간에서 사용되는 애쥬번트 중, BCG (bacilli Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum)이 특히 바람직하다. 면역화에 유용한 폴리펩티드는 면역글로불린 폴리펩티드에, 또는 말토즈 결합 단백질에 isoQC 또는 그의 부분의 융합과 같은 융합 폴리펩티드 또는 그의 부분과 같은 융합 폴리펩티드를 또한 포함한다. 폴리펩티드 면역원은 전장 분자 또는 그의 부분일 수 있다. 만약 폴리펩티드 부분이 "헵텐-유사체 (hapten-like)"라면, 상기 부분은 면역화를 위하여, KLH (keyhole limpet hemocyanin), BSA (bovine serum albumin) 또는 테타누스 톡소이드 (tetanus toxoid)와 같은 거대분자 운반체 (macromolecular carrier)에 유리하게 결합되거나 연결될 수 있다. isoQC에 대한 항체는 또한 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 상기 항체는 다클론, 단클론, 키메릭, 및 단일 사슬 항체, Fab 단편, 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 생산되는 단편을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
항체의 중화 (즉, 활성 부위에 상호작용을 차단하거나 변형하는 것)는 치료학적 용도에 있어 특히 바람직하다.
QPCTL에 특이적으로 결합하는 항체, 결합 단백질, 또는 펩티드의 생산을 위하여, 단일 사슬 항체, Fab 단편들, 다른 항체 단편들, 비-항체 단백질 도메인, 또는 펩티드 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 라이브러리는 파지 디스플레이, 다른 재조합 DNA 방법, 또는 펩티드 합성 (Vaughan, T. J. et al. Nature Biotechnology 14: 309-314)을 사용하여 제조될 수 있다. 상기 라이브러리는 QPCTL에 특이적 결합을 나타내는 서열을 동정하는, 당업계에서 잘 알려진 방법을 사용하여 일반적으로 스크리닝할 수 있다.
QPCTL에 대한 항체를 유도하기 위하여 사용되는 올리고펩티드, 펩티드, 또는 단편들은 적어도 약 5개의 아미노산 및, 더욱 바람직하게는 적어도 약 10개의 아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 포함한다. 또한 바람직하게 이러한 올리고펩티드, 펩티드 또는 단편들은 천연 단백질의 아미노산 서열의 부분과 동일하다. QPCTL 아미노산의 짧은 스트레치 (stretches)는 KLH와 같은 다른 단백질의 짧은 스트레치에 융합될 수 있고, 키메릭 분자에 대한 항체가 생산될 수 있다.
QPCTL에 대한 단일클론 항체는 배양에서 연속 세포주에 의해 항체 분자의 생산을 위하여 제공되는, 잘 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 방법은 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론항체가 바람직할 수 있으나, 하이브리도마 기술 (hybridoma technique), 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (human B-cell hybridoma technique), 및 EBV-하이브리도마 기술 (EBV-hybridoma technique) 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
아울러, 적절한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 갖는 분자를 수득하기 위하여 인간 항체 유전자에 대한 마우스 항체 유전자의 스플라이싱 (splicing)과 같은 "키메릭 항체 (chimeric antibodies)" 생산을 위해 개발된 기술은 Neuberger, M. S. et al. Nature 312: 604-608 (1984)와 같은 기술을 사용할 수 있다. 또한 단일 사슬 항체의 생산을 위하여 공지된 기술이 적용될 수 있는데, QPCTL-특이적 단일 사슬 항체를 생산하기 위하여 기술적으로 알려진 방법을 사용할 수 있다. 특정 이디오타입 조성물 (distinct idiotypic composition)이지만, 특이성과 관련된 항체들은, 임의 조합의 면역글로불린 라이브러리(random combinatorial immunoglobulin liraries)로부터 사슬 셔플링 (chain shuffling)에 의해 생산될 수 있다.
또한, 림프구 군에서의 시험관 내 생산을 유도함으로써, 또는 면역글로불린 라이브러리 또는 문헌 (Orlandi, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837 (1989))에 개시되어 있는 높은 특이적 결합 제제의 패널을 스크리닝 함으로써 항체를 생산할 수 있다.
또한 QPCTL의 특이적 결합 부위를 포함하는 항체 단편들은 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 단편들은 항체 분자의 펩신 분해 (pepsin digestion)에 의해 생산되는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 이황화 결합 (disulfide bridges)의 감소에 의해 생산되는 Fab 단편들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 Fab 발현 라이브러리는 원하는 특이성을 가진 단일클론 Fab 단편의 빠르고 편리한 분리를 가능하게 함으로써 제조될 수 있다. (Huse, W. D. et al. Science 254: 1275-1281(1989)).
원하는 특이성을 가지는 항체를 분리하기 위하여 다양한 면역분석 (immunoassays)이 사용될 수 있다. 특이성을 갖는 다클론 항체 또는 단클론 항체를 사용한 경쟁적 결합 또는 면역방사측정 분석 (immunoradiometric assays)을 위한 많은 프로토콜 (protocols)은 기술적으로 잘 알려져 있다. 상기 면역분석은 일반적으로, QPCTL 및 그의 특이적 항체간의 복합체 형성 측정을 포함한다. 두 개의 비-간섭 QPCTL 에피토프 (epitope)에 작용하는 단일클론 항체를 사용한 두-부위, 단일클론-기초 면역 분석이 바람직하나, 경쟁적 결합 분석 또한 사용될 수 있다.
상기에 언급한 바와 같이, QPCTLs는 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 하나의 양태로 사용하기 위한 적절한 약제학적 조성물을 포함하는데, 여기에서 활성 성분 (active ingredients)은 질환들 중 하나와 관련된 의도적 목적을 성취하기 위한 유효량을 포함한다. 치료학적 유효량 (therapeutically effective dose)을 결정하는 것은 당업계에 가능한 범위로 잘 알려져 있으며, 예를 들면 초기의 종양 세포와 같은 세포의 세포 배양 분석, 또는 일반적으로 마우스, 래트, 토끼, 개, 또는 돼지 같은 동물 모델에서 측정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하기 위해 사용될 수 있으며, 그 후 이러한 정보는 인간에게 유용한 양 및 투여 경로에 일반적으로 사용될 수 있다.
치료학적 유효량은, 질환의 특정 징후 (symptoms) 또는 증상 (conditions)을 경감시키는, 예를 들면, QPCTL 또는 그의 단편, DPRP에 대한 항체, 또는 QPCTL의 작동제, 길항제 또는 억제제의 활성 성분량을 의미한다. 예를 들면, 투여되는 양은 그것이 접촉하는, 원하는 표적 기질의 사이클리즈 (cyclise) N-말단 Glu 또는 Gln에 유효할 수 있다. 한편으로, 치료학적 효과 및 독성은 ED50 (the dose therapeutically effective in 50% of the population) 또는 LD50 (the dose lethal to 50% of the population) 통계를 계산하는 것과 같이, 세포 배양에서의 또는 실험 동물의 표준 약학적 방법에 의해 결정될 수 있다. 치료학적 유효성에 대한 독성 비율량 (dose ratio of toxic to therapeutic effects)은 치료학적 기준 (therapuetic index)이고, 이는 LD50/ED50 비율로 나타낼 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻어진 데이타는 인간에 사용하기 위한 복용량의 범위를 결정하는 데 사용될 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 복용량은 바람직하게는, 독성이 거의 또는 전혀 없는 상태에서 ED50을 포함하는 농도를 계산하는 범위 내이다. 복용량은 사용하는 제형 (dosage form), 환자의 민감성 (sensitivity of the patient), 및 투여 경로에 따라 그 범위가 변화될 수 있다.
정확한 복용량은, 활성 부위의 충분한 수준을 제공하기 위하여 또는 원하는 효과를 유지하기 위하여 조절되는 복용량 및 투여에 따라, 치료가 요구되는 대상에 따른 인자들에 비추어 의사 (medical practitioner)에 의해 일반적으로 결정될 수 있다. 고려되는 인자들은 질환 상태의 심각성, 대상의 총체적인 건강 수준, 나이, 중량, 및 대상의 성별, 식이섭취 상태, 투여 시간 및 횟수, 약물 조합, 반응 민감성, 및 치료에 대한 내성/반응성을 포함한다. 지속성 약제학적 조성물 (long-acting pharmaceutical composition)은 특정 제형의 반감기 및 제거율 (clearance rate)에 따라 매 3 내지 4일, 매주, 또는 2주에 한 번씩 투여될 수 있다.
본 발명의 또다른 양태는 서열번호 2 내지 9의 폴리뉴클레오티드의 mRNA 전사체에 대한 안티센스인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 안티센스 폴리뉴클레오티드 분자의 투여는 서열번호 2 내지 9의 QPCTL에 의해 코딩되는 단백질의 생산을 차단할 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드 분자의 제조 및 상기 분자를 투여하는 기술은 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 안티센스 폴리뉴클레오티드 분자는 세포와의 융합을 위해 리포좀 내에 캡슐화 (encapsulated)될 수 있다.
특히, 뇌, 전립선, 폐, 심장, 간, 비장 및 신장 조직에서의 서열번호 2 내지 9의 QPCTL 유전자의 발현은 하기에 기술된 질환의 병태생리학에서의 잠재적 역할에 대한 증거를 제공한다. 그러므로, 추가적인 양태로서, 본 발명은 비정상적인 QPCTL 활성 또는 발현 수준과 관련된 질환을 검출하기 위한 진단학적 분석에 관련된 것이다. QPCTL과 특이적으로 결합하는 항체들은 QPCTL의 발현됨으로써 나타나는 이상 (disorders)의 진단, QPCTL 또는 QPCTL의 작동제 또는 길항제 (억제제)로 처리된 환자를 모니터하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 진단학적 목적으로 유용한 항체들은, 치료를 위하여 상기 서술된 것들과 같은 동일한 조건에서 제조될 수 있다. QPCTL을 위한 진단학적 분석은, 인간 체액 (human body fluids) 또는 세포 또는 QPCTL을 검출하기 위한 항체 및 표지자를 사용하는 방법을 포함한다. 항체들은 변형하거나 변형하지 않고 사용될 수 있고, 그들은 리포터 분자 (reporter molecule)과 결합하는 공유결합 또는 비-공유결합에 의해 표지될 수 있다. 리포터 분자의 광범위한 다양성은 당업계에 알려져 있다. 촉매적으로 비활성화시키기 위하여 변형된 재조합 QPCTL 단백질은 우성 음성 억제제 (dominant negative inhibitors)로서 사용될 수 있다. 상기 변형은 예를 들면, 활성 부위의 돌연변이를 포함한다.
QPCTL을 측정하기 위한 프로토콜의 다양성은, ELISAs, RIAs 및 FACS를 포함하며, 당업계에 공지되어 있고, QPCTL 발현의 변형된 수준 또는 이상 수준 (altered or abnormal levels) 을 진단하기 위한 기반으로 제공된다. QPCTL 발현의 정상값 또는 표준값은, 복합체 형성을 위하여 적절한 조건하에서 QPCTL에 대한 항체와, 포유류 대상들, 바람직하게는 인간으로부터 수득한 체액 또는 세포 추출물의 결합으로써 달성될 수 있다. 생물학적 샘플에서 QPCTL의 검출 위한 방법은 a) 생물학적 샘플을 제공하는 단계; b) QPCTL 및 항체간에 일어나는 복합체 형성을 위한 적절한 조건하에서 생물학적 샘플 및 항-QPCTL 항체를 결합시키는 단계; 및 c) QPCTL 및 항체 간의 복합체 형성을 검출함으로써, 생물학적 샘플에서 QPCTL의 존재를 확인하는 단계를 포함한다.
그 후 복합체 형성량은 다양한 방법에 의해 정량될 수 있으며, 바람직하게는 광도측정 수단에 의할 수 있다. 생검 조직 (biopsied tissues)으로부터의 대상, 대조군 및 질환 샘플에서 발현되는 QPCTL의 양은 표준값과 비교된다. 기준값 및 개체 값의 편차는 진단 질환에 대한 파라미터를 결정한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, QPCTL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 진단학적 목적으로 사용되는데, 상기 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 서열, 상보적 RNA 및 DNA 분자 및 PNAs를 포함할 수 있다. 이러한 폴리뉴클오티드는 질환 중 어느 하나와 관련될 수 있는 QPCTL의 발현에 있어서, 생검 조직에서 유전자 발현을 검출하고 정량하는데 사용될 수 있다. 진단학적 분석은 치료적 간섭 (therapeutic intervention) 동안 QPCTL의 결여, 존재 및 과다 발현을 구별하고, QPCTL의 조절을 모니터하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 약리유전학적 (pharmacogenomic), QPCTL 유전자의 SNP (single nucleotide polymorphisms) 분석은 질환에 대한 소인 (prodispositionto disease) 또는 약물에 대한 변형된 반응을 가리키는 돌연변이를 스크리닝하기 위한 방법으로서 사용될 수 있다.
QPCTL 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열, 그의 단편들, QPCTL에 대한 항체, 및 QPCTLs의 작동제, 길항체 또는 억제제는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드가 QPCTL 단백질과 상호작용함으로써 분자 인식을 동정하기 위한 발견 도구로서 사용될 수 있다. 특정 예로는 단회 패닝 (single round of panning)으로 108 펩티드 서열 이상을 스크리닝 할 수 있는 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리이다. 다른 방법 뿐만 아니라 상기 방법은 당업계에 공지 기술이며, 서열번호 11 내지 18의 QPCTLs 중 어느 하나의 활성을 억제 또는 증가시키는 화합물을 분리하기 위해 사용될 수 있다.
결합 연결 (coupled links)은 복합체 또는 경로와 같은 기능적인 상호작용을 나타내며, QPCTLs과 상호작용하는 단백질들은 효모 이종-혼성 시스템 (yeast two-hybrid system), 프로테오믹스 (차등 2D 겔 분석 및 질량 분광법)(proteomics (differntial 2D gel analysis and mass spectrometry) 및 지노믹스 (마이크로 어레이에 의한 차등 유전자 발현 또는 유전자 분석 SAGE의 시리얼 분석)에 의해 분리될 수 있다.
QPCTLs과 기능적으로 연결되었고 동정된 단백질 및 상호작용 과정은 억제제, 작동제 및 길항제, 및 이러한 QPCTL-단백질 상호작용의 조절자에 대한 스크리닝 방법의 기반이 된다.
본 발명에서 사용된 용어 "길항제"는 예를 들면, QPCTL 기질의 N-말단에 Glu- 또는 Gln-잔기를 순환시키기 위한 사이클리즈(clcylise) 펩티다아제의 효소적 활성을 감소시키는 것과 같이, QPCTL과 결합할 때, QPCTL의 생물학적 또는 면역학적 활성 효과의 양 또는 지속시간을 감소시키는 억제제 분자를 의미한다. 길항제는 단백질, 핵산, 탄수화물, 항체, 또는 QPCTL의 효과를 감소시키는 다른 분자를 포함하며; 예를 들면, 경쟁적 또는 비-경쟁적 타입 메카니즘에 의해 QPCTLs에 결합하고 QPCTLs를 비활성화 시키는 소분자 및 유기 화합물을 포함한다. 바람직하게는 QPCTL의 소분자 억제제이다. 가장 바람직하게는, QPCTL의 경쟁적 소분자 억제제이다.
QPCTL 효소 활성 억제제의 특정한 예들은 실시예 4에 기재되어 있다. 예를 들면, 억제제는 QPCTL 사이클라제 활성의 억제제, 또는 그와 상호작용하는 단백질에 대한 QPCTL 결합 활성의 대체적 억제제들 일 수 있다. 상기 억제제들의 특정한 예들은 항-QPCTL 항체, 펩티드, 단백질 단편, 또는 작은 펩티딜 프로테아제 억제제 (small peptidyl protease inhibitors), 또는 원하는 세포 타입 내로 도입이 가능한 배지에서 형성된 비-펩티드, 유기 분자 억제제들을 포함한다. 또한, 상기 억제제들은 세포-매개 엔도시토시스 (cell-mediated endocytosis) 또는 다른 수용체 매개 과정에 의해 도입되기 위해 타겟팅 리간드에 부착될 수 있다. 상기 방법들은 이하에 더 개시되어 있고, 본 발명에 개시된 QPCTL 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 의해 당업계의 기술로써 실시될 수 있다.
QPCTL의 추가적인 용도는 치료학적 제제로 사용하는 용도로써 잠재적 길항제의 스크리닝에 관한 것으로, 예를 들면, 길항제를 스크리닝 하는 것 뿐만 아니라 QPCTL에 결합하는 것을 억제하기 위한 것이다. QPCTL, 그의 면역원성 단편, 그의 올리고펩티드는 약물 스크리닝 기술의 다양성 중 하나로서, 예상되는 작동제 또는 길항제인 화합물 라이브러리를 스크리닝 하기 위해 사용될 수 있다. 상기 스크리닝에 도입되는 단편은 용액에 유리되어 있을 수 있고, 고체 지지체 (solid support)에 부착되어 있을 수 있으며, 세포 표면에서 부유하고 있을 수 있고, 또한 세포 내 (intracellularly)에 위치하고 있을 수 있다. 그 후, QPCTL 및 시험되는 제제간의 결합 복합체 형성을 측정한다. QPCTL을 억제하는 길항제를 검출하기 위한 다른 분석법은 국제공개특허 제2004/098625호, 제2004/098591호 및 제2005/075436호의 기재로부터 자명한데, 이들에는 QC의 억제제를 개시하고 있으며, 상기 문헌 전체로서 본원에 포함된다. 이러한 QPCTL의 또 다른 유용한 용도는, QPCTLs의 하나 또는 그 이상을 억제함으로써 원치 않는 부작용을 나타내지 않는 QC의 억제제를 스크리닝하는 것이다.
QPCTL와 결합하는 분자를 동정하기 위하여 소분자 라이브러리를 스크리닝 하기 위해 제공되는 방법은 일반적으로 하기의 방법을 포함한다: a) 소분자의 라이브러리를 제공하는 단계; b) 복합체 형성에 적절한 조건 하에서 서열번호 11 내지 18 중 하나의 폴리펩티드, 또는 그의 단편과 소분자 라이브러리를 결합하는 단계; 및 c) 복합체 형성을 확인하는 단계, 여기에서 상기 복합체의 존재는 QPCTL에 결합하는 소분자를 의미한다.
길항제를 동정하기 위한 하나의 방법은, 절단이 일반적으로 일어나는 조건 하에서 발색 기질 (chromogenic substrate) (예, Ala-Pro-AFC 또는 Ala-Pro-AMC)에 따라 QPCTL를 발현하는 벡터로 형질전환된 세포로부터의 추출물에 QPCTL와 결합하는 소분자를 전달하고, 절단을 억제하는 분자를 동정하기 위한 분광광도계에 의해 형광, 또는 UV 흡광의 변화를 모니터함으로써 효소에 의한 절단 억제를 분석하는 것을 포함한다. 분자의 존재 하에서 감소된 반응 비율, 또는 감소된 형광 또는 UV 흡광의 전체량은 QPCTL 촉매적/효소적 활성을 감소시키는 소분자가 길항제임을 의미한다. 일단 상기 분자가 동정되면, 그들은 QPCTL에 의해 Glu- 또는 Gln-잔기의 사이클리세이션 (cyclisation)을 감소 또는 억제하기 위해 투여될 수 있다.
또 다른 특정 양태에 따르면, 본 발명은 바람직하게는 서열번호 11 내지 18의 단백질로부터 선택되는, 본 발명에 따른 적어도 하나의 성숙 단백질의 효소적 활성을 억제할 수 있는 화합물을 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 테스트 화합물 (test compound) 또는 그의 염 내에 상기 성숙 단백질 및 상기 단백질에 대한 적절한 기질을 배양하고, 상기 단백질의 효소적 활성을 측정하며, 후보 화합물의 결여 환경에서 검출된 유사한 활성을 상기 활성을 비교하고, 효소적 활성을 감소시키는 후보 화합물 또는 화합물을 선별하는 것을 포함한다.
더욱이, 본 발명은 또한 QC의 효소적 활성을 억제할 수 있는 화합물인, 선택적 QC-억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하고, 바람직하게 상기 QC는 본 발명에 따른 적어도 하나의 성숙 단백질, 바람직하게는 서열번호 11 내지 18의 단백질로부터 선택되는 단백질의 효소적 활성을 억제하지 않는 서열번호 10의 단백질이며, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 QC의 억제제 또는 그의 염의 존재하에서 상기 성숙 단백질 및 적절한 기질을 배양하는 단계, 상기 성숙 단백질의 효소적 활성을 측정하는 단계, QC 억제제가 존재하지 않는 환경에서 관찰되는 활성과 유사한 상기 활성을 비교하는 단계, 상기 성숙 단백질의 효소 활성을 감소시키지 않는 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.
아울러, 본 발명은 또한 바람직하게 서열번호 11 내지 18의 단백질로부터 선택되는 적어도 하나의 QPCTL 단백질의 효소적 활성을 억제할 수 있으며; QC 의 효소적 활성은 억제시키지 않는 화합물인, 선택적 QPCTL-억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하고, 여기에서 상기 QC는 바람직하게는 서열번호 10의 단백질이고, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 QPCTL의 억제제 또는 그의 염이 존재하는 환경에서 상기 QC를 배양하는 단계, QC의 효소적 활성을 측정하며, QPCTL 억제제가 존재하지 않는 환경에서 관찰되는 활성과 유사한 상기 활성을 비교하는 단계, 상기 QPCTL 단백질의 효소적 활성을 감소시키지 않는 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.
QPCTLs의 억제제로서도 유용할 수 있는, QC의 유용한 억제제는 국제공개특허 제2004/098625호, 국제공개특허 제2004/098591호 및 국제공개특허 2005/075435호에 기술되어 있으며, 특히 억제제의 구조 및 그들의 생산과 관련하여 본 명세서에 전체로서 포함된다.
QPCTL-억제제의 예
본 발명에 따른 용도 및 방법에 적절한 잠재적 QPCTL-억제제는 국제공개특허 2005/075436에 기재되어 있으며, 이는 구조, 합성 및 QC-억제제의 용도의 방법과 관련하여 전체로서 본 발명에 포함된다.
특히:
적절한 화합물은 화학식 1* 이다:
Figure 112009023886404-PCT00013
또 다른 양태로서, QPCTL의 억제제는 화학식 1a 중 하나일 수 있다.
Figure 112009023886404-PCT00014
여기에서 R은 1 내지 53의 예에 정의된 것과 같다.
Figure 112009023886404-PCT00015
Figure 112009023886404-PCT00016
Figure 112009023886404-PCT00017
Figure 112009023886404-PCT00018
추가적으로 적절한 QPCTL의 억제제는 화학식 1b 중 하나일 수 있다.
Figure 112009023886404-PCT00019
여기에서 R1 및 R2는 54 내지 95의 예에 정의된 것과 같다.
Figure 112009023886404-PCT00020
Figure 112009023886404-PCT00021
추가적으로 적절한 QPCTL의 억제제는 화학식 1c 중 하나일 수 있다.
여기에서 R3는 96 내지 102의 예에 정의된 것과 같다.
Figure 112009023886404-PCT00022
추가적으로 적절한 QPCTL의 억제제는 화학식 1d 중 하나일 수 있다.
Figure 112009023886404-PCT00023
여기에서 고리상의 위치는 103 내지 105의 예에 정의된 것과 같다.
Figure 112009023886404-PCT00024
추가적으로 적절한 QPCTL의 억제제는 화학식 1e 중 하나일 수 있다.
Figure 112009023886404-PCT00025
여기에서 R4 및 R5는 106 내지 109의 예에 정의된 것과 같다.
Figure 112009023886404-PCT00026
추가적으로 적절한 QPCTL의 억제제는 화학식 1f 중 하나일 수 있다.
Figure 112009023886404-PCT00027
여기에서 R6은 110 내지 112의 예에 정의된 것과 같다.
Figure 112009023886404-PCT00028
추가적으로 적절한 QPCTL의 억제제는 화학식 1g 중 하나일 수 있다.
Figure 112009023886404-PCT00029
여기에서 R7,R8 및 R9는 113 내지 132의 예에 정의된 것과 같다
Figure 112009023886404-PCT00030
추가적으로 적절한 QPCTL의 억제제는 화학식 1h 중 하나일 수 있다.
Figure 112009023886404-PCT00031
여기에서 n은 133 내지 135의 예에 정의된 것과 같다.
Figure 112009023886404-PCT00032
추가적으로 적절한 QPCTL의 억제제는 화학식 1h 중 하나일 수 있다.
Figure 112009023886404-PCT00033
여기에서 m은 136 및 137의 예에 정의된 것과 같다.
Figure 112009023886404-PCT00034
추가적으로 적절한 QPCTL의 억제제는 화학식 138 내지 141 중 하나일 수 있다.
Figure 112009023886404-PCT00035
Figure 112009023886404-PCT00036
본 발명에서 사용된 용어 "길항제"란 QPCTL에 결합할 때, QPCTL 효과의 지속시간을 증가시키거나 연장시키는 분자를 의미한다. 길항제는 단백질, 핵산, 탄수화물 또는 결합하여 QPCTL의 효과를 조절하는 다른 분자들을 포함할 수 있다. 소분자가 효과적인 QPCTL 길항제임을 입증하는 것은 아니나, 길항제로서 QPCTL과 결합하는 상기 소분자를 동정하기 위한 방법은 QPCTL을 발현하는 벡터로 형질전환된 세포 내에 QPCTLS과 결합하는 소분자의 발색 형태를 전달하는 단계, 분광광도계에 의해 형광 또는 UV 빛 흡수 변화를 분석하는 단계를 포함한다. UV 흡수 또는 형광의 증가량은 소분자가 QPCTL 활성을 증가시키는 길항제임을 의미한다.
사용될 수 있는 약물 스크리닝을 위한 또 다른 기술은 국제공개특허 제84/03564호에 공개된 문헌에 기술된 바와 같이 목적하는 단백질에 적절한 결합 친화력을 갖는 화합물의 초고속 스크리닝을 제공한다. 이러한 방법에서, 서로 다른 작은 후보 화합물 다수는 플라스틱 핀과 같은 고체 기질 또는 몇몇 다른 표면 상에서 합성된다. 후보 화합물을 QPCTL 또는 그의 단편과 반응시킨 후, 세척한다. 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 결합된 QPCTL을 검출하였다. 정제된 QPCTL은 또한, 상기 언급된 약물 스크리닝 기술을 사용하여 플레이트 상에서 직접적으로 코팅될 수 있다. 또한, 비-중화 항체는 펩티드를 포획 (capture)하고, 고체 지지체 상에 그것을 고정하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서, QPCTL과 결합할 수 있는 중화 항체가 QPCTL과 결합하는 후보 화합물과 특히 경쟁함으로써, 경쟁적 약물 스크리닝 분석을 수행할 수 있다. 이러한 조건에서, 항체는 하나 또는 그 이상의 QPCTL에 대한 항원 결정자를 공유하는 다른 펩티드의 존재를 검출하는 데 사용할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 예를 들면, 천연 리간드보다 QPCTL과 더 잘 상호작용하는 결합부위를 조사함으로써 리간드를 디자인할 수 있다. 상기 길항제 리간드는 높은 결합력으로 QPCTL에 결합할 수 있고, 경쟁적 리간드로서 기능할 수 있다. 또한, QPCTL에 높은 결합력을 갖는 다른 가능한 분자로서, 천연 QPCTL의 리간드 결합 부위에 대한 합성 또는 재조합 단백질 상동체 또는 유사체를 디자인할 수 있다. 상기 분자는 또한 QPCTL을 대체할 수 있고, 방어 효과를 제공한다.
상기 언급한 바와 같이, QPCTL의 구조에 대한 정보는 디자인되는 합성 결합 부위 상동체 및 유사체를 가능하게 한다. 상기 분자들은, 잠재적 치료학적 제제를 타게팅하는 결합 특성의 용도를 매우 촉진시키며, 또한 잠재적 치료학적 제제를 스크리닝 하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 상기 분자들은, 위에서 기술한 바와 같이 진단 및/또는 치료에 사용될 수 있는 단일클론 항체의 생산에서 면역원 (immunogens)으로서 사용될 수 있다.
치료학적 응용
예를 들면, 아베타 (Abeta) 1-42 (서열번호 23) 및 아베타 1-40 (서열번호 24)와 같은 아밀로이드 펩티드 (amyloid peptides)가 아미노펩티다아제 또는 디펩티딜 아미노펩티다아제 예와 같은 단백분해 효소에 의해 N-말단으로 잘리게 되고, 아베타-펩티드 3-42 (서열번호 25), 3-40 (서열번호 26), 11-42 (서열번호 27) 및 11-40 (서열번호 28)을 결과한다는 사실은 잘 알려져 있다. 이러한 잘린 아베티 펩티드들은 N-말단의 글루타메이트 잔기로 시작하므로 QC의 기질이며 (국제공개특허 2004/09862를 보라), 또한 서열번호 11-18, 21 및 22의 QPCTLs일 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 11 및 12의 인간 isoQCs일 수 있다. 서열번호 29-32의 pGlu-아베타 펩티드 결과는 비-피로글루타메이트 펩티드 (non-pyroglutamated peptides)보다 훨씬 더 소수성이고, 올리고머 및 피브릴과 같은 아베티 펩티드 응집체를 훨씬 더 형성시키기 쉬우며, 매우 높은 신경독성을 나타내었다. 마지막으로 서열번호 29-32의 아베타-펩티드는 알츠하이머 질환 및 다운증후군 (Down syndrome)의 진행에 있어서 중요한 역할을 한다.
따라서, 서열번호 11-18, 21 및 22의 QPCTLs의 억제제, 바람직하게는 서열번호 11, 12 21 및 22의 인간 isoQCs이며, 가장 바람직하게는 서열번호 11 및 12의 인간 isoQCs는 아밀로이드 펩티드 관련 질환에 사용할 수 있으며, 특히 신경퇴화 질환, 특히 알츠하이머 질환 및 다운 증후군에 사용될 수 있다.
포유동물에서 QPCTLs의 다른 잠재적 생리학적 기질은 Glu1-ABri (서열번호 33), Glu1-ADan (서열번호 34, 및 Gln1-Gastrins (17 및 34) (서열번호 35 및 36)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 그들의 피로글루타메이트 형태 (서열번호 37-40)는 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 감염이 있거나 또는 없는 감염성 또는 비감염성 십이지장 암 (duodenal cancer), 대장암 (colorectal cancer), 졸리거-엘리슨 증후군 (Zolliger-Ellison syndrome), FBD (Familial British dementia) 및 FDD (Familial Danish Dementia)로 구성된 군으로부터 선택되는 것들과 같은 병리를 야기한다.
추가적인 QPCTLs의 잠재적 생리학적 기질은 표 3에 나타낸 바와 같다.
[표 3]
Figure 112009023886404-PCT00037
Figure 112009023886404-PCT00038
Figure 112009023886404-PCT00039
Figure 112009023886404-PCT00040
펩티드 Gln1-가스트린 (Gln1-Gastrin) (17 및 34 개 길이의 아미노산), Gln1-뉴로텐신 (Gln1-Neurotensin) 및 Gln1-FPP는 QPCTLs의 신규한 생리학적 기질로서 동정되었다. 가스트린, 뉴로텐신 및 FPP는 그들의 N-말단 위치에 pGlu 잔기를 포함한다. 이러한 N-말단 pGlu 잔기는 모든 펩티드에 대해 QPCTL 촉매에 의해 N-말단 글루타민으로부터 형성될 수 있다. 결과적으로, 이러한 펩티들은 pGlu에 N-말단 글루타민 잔기의 전환에 의해 그들의 생물학적 기능에 있어서 활성화된다.
특히 가스트린 (G) 세포인, 경상피 도입 세포 (transepithelial transducing cells)는 위에 음식물이 도달과 위산 분비를 통합시킨다. 최근 연구는 다중 활성 생성물은 가스트린 전구체로부터 제조되며, 가스트린 생합성에 다중 제어점 (muliple control points)이 있다는 사실을 밝혔다. 생합성 전구체 및 중간체 (프로가스트린 및 Gly-가스트린)는 추정되는 성장 인자이고; 그들의 생성물인 아미데이트 가스트린 (the amidated gastrins)은 상피 세포 증식, 산-생산 벽 세포 (acid-producing parietal cells) 및 ECL (histamine-secreting enterochromaffin-like) 세포의 분화, 및 산 분비를 급성으로 자극할 뿐만 아니라 ECL 세포에서 히스타민 합성 및 저장과 관련된 유전자의 발현을 조절한다. 가스트린은 또한 차례로 표면 상피 세포의 성장을 자극하지만, 벽 세포 기능을 억제하는 EGF (epidermal growth factor) 패밀리의 구성원 생산을 자극한다. 혈장 가스트린 농도는 헬리코박터 파이로리를 가진 대상에서 증가하는데, 이들은 십이지장 궤양 질환 및 위암의 위험이 증가하는 것으로 알려져 있다 (Dockray, G.J 1999 J Physiol 15 315-324).
전정 G 세포 (antral G cell)로부터 분비되는 펩티드 호르몬 가스트린은, CCK-2 수용체를 통한 산분비 점막층 (oxyntic mucosa)에 ECL 세포로부터 히스타민의 합성 및 분비를 자극하는 것으로 알려져 있다. 이동되는 히스타민은 벽세포상에 존재하는 H(2) 수용체에 결합함으로써 산 분비를 유도한다. 최근 연구는 그의 완전한 아미데이트된 형태 및 덜 진행된 형태 모두에 있어서, 가스트린 또한 위장관에 대한 성장 인자임을 보고하고 있다. 증가된 벽 세포 및 ECL 세포 질량의 결과, 위의 줄기 세포 및 ECL 세포의 증가된 증식을 야기하는 부위에서, 아미데이트 가스트린의 주요 영양학적 효과 (major trophic effect)는 위의 산분비 점막을 위한 것임을 나타낸다. 반면, 덜 진행된 가스트린 (예, 글라이신-증가된 가스트린 (glycine-extended gastrin))의 주요 영양학적 타겟은 결장 점막 (colonic mucosa)로 나타났다 (Koh, T.J. 및 Chen, D. 2000 Regul Pept 9337-44).
추가적인 양태로서, 본 발명은 위장관 세포 증식, 특히 위장 점막 세포 증식, 상피 세포 증식, 산-생산 벽 세포의 분화 및 ECL (histamine-secreting enterochromaffin-like) 세포의 자극 및 활성 pGlu1-가스트린 (서열번호 39 및 40) 농도를 유지 또는 증가시킴으로써 포유류에서 급성 산 분비의 자극을 위한 것일 뿐만 아니라 ECL 세포에서의 히스타민 합성 및 저장과 관련된 유전자의 발현을 위하여 QPCTLs의 효과기 (effectors)를 증가시키는 활성의 용도를 제공하는 것이다.
추가적인 양태로서, 본 발명은 불활성 Gln1-가스트린 (서열번호 35 및 36)을 활성 pGlu1-가스트린 (서열번호 39 및 40)으로 전환하는 비율을 감소시킴으로써 포유류에서 헬리코박터 파일로리 감염성 또는 비감염성 십이지장 궤양 질환 및 위암의 치료를 위한 QPCTLs의 억제제의 용도를 제공한다.
NT (neurotensin) (서열번호 41)은 정신분열증 질환에서 이상 조절된다고 알려진 신경전달물질 시스템을 특이적으로 조절하는 정신분열증 (schizophrenia)의 병리생리학에 관련된 신경펩티드이다. CSF (cerebrospinal fluid) NT 농도를 측정한 임상 연구는 정신분열증 환자의 일부는 효과적인 항정신성 약물 치료에 의해 회복되는, 감소된 CSF NT 농도를 가진다는 사실이 드러났다. 또한 상당한 증거들은 항정신성 약물의 작용 기전에서 NT 시스템이 연루되어 있다는 사실과 일치한다. 중추로 투여된 NT의 행동적 및 생화학적 효과는 전신에 투여된 항정신성 약물의 그것과 매우 유사하다. 이러한 발견의 연관성(concatenation)은 내재성 항정신성치료제로서 NT 기능을 수행한다는 가설에 이르게 된다. 더욱이 전형적 및 비전형적 항정신성 약물은 흑질 선조체 (nigrostriatal) 및 중변연계 (mesolimbic) 도파민 말단 영역에서 NT 신경전달을 서로 다르게 변형시키고, 이러한 효과는 부작용 (side effect liability) 및 효능 (efficacy), 각각에서 예상 가능하다 (Binder, E. B. et al. 2001 Biol Psychiatry 50 856-872).
따라서, 본 발명은 포유류에서 항정신성 약물을 제조하기 위하여 및/또는 정신분열증을 치료하기 위하여 QPCTLs의 효과기를 증가시키는 활성의 용도를 제공한다. QPCTLs의 효과기는 활성 pGlu1-뉴로텐신의 농도를 유지 또는 증가 시킨다.
FPP (Fertilization promoting peptide), TRH (Thyrotrophin releasing hormone)에 관련된 트리펩티드는 정액 혈장에서 발견된다. 최근 시험관 내 (in vitro) 및 생체 내 (in vivo)로부터 수득된 증거는 FPP가 정자 수정 능력 (fertility)을 조절하는 중요한 역할을 한다는 사실을 밝혔다. 특히, FPP는 불임성 정자 (nonfertilizing (uncapacitated) spermatozoa)에 "스위치를 켬으로써 (switch on)" 초기에 자극하고, 더욱 빠르게 수정될 수 있게 하나, 그 후 정자가 자발적으로 아크로좀 (acrosome) 파괴를 수행하지 않으면 능력을 저지함으로써 수정 잠재력을 잃지 않는다. 이러한 반응은 AC (adenylyl cyclase)/cAMP 신호 전달 경로 (AC/cAMP signal transduction pathway)를 조절한다고 알려진 아데노신 (adenosine)에 의해 의태되고, 확연히 증가된다. FPP 및 아데노신 양쪽 모두, AC의 조절을 가능하게 하기 위해 아데노신 수용체 및 G 단백질과 상호작용하는 FPP 수용체를 가진 가능 세포 (capacitated cells)에서는 cAMP의 생산을 억제하나, 불능 세포 (uncapacitated cells)에서 cAMP 생산을 자극하는 것으로 나타났다. 이러한 이벤트 (event)는 다양한 단백질의 티로신 인산화 상태 (tyrosine phosphorylation state)에 영향을 미치며, 몇몇은 초기 "스위치를 켜는 (switching on)" 것에서 중요하고, 다른 것들은 그 자체의 아크로좀 반응 (acrosome reacion)에 포함될 수 있다. 칼시토닌 (calcitonin) 및 안지오텐신 II은 또한 정액 혈장에서 발견되고, 불가능화된 정자 (uncapacitated spermatozoa) 상에서 시험관 내 유사한 효과를 가지며, FPP에 대한 반응을 증가시킬 수 있다. 이러한 분자는 생체 내에서도 유사한 효과를 가지며, 자극에 의해 수정에 영향을 미치고, 그 후 수정 잠재력 (fertilizing potential)을 유지한다. FPP, 아데노신, 칼시토닌, 및 안지오텐신 II의 이용가능성에 있어서 양쪽 중 하나의 감소 또는 그들의 수용체에 있어서의 결함은 수컷 불임 (male infertility)에 기여한다.
추가적인 양태로서, 본 발명은 포유류에서 수정 저해 약물 (fertilization prohibitive drugs)의 제조를 위한 QPCTLs의 억제제의 용도를 제공하고/하거나, 포유류에서 수정을 감소시키기 위한 QPCTLs의 억제제의 용도를 제공한다. QPCTLs의 억제제는 활성 pGlu1-FPP의 농도를 감소시키며, 정자 세포의 정자 능력 및 비활성화를 저지시키도록 이끄는 것을 감소시킨다. 반면, 활성 증가 효과기 QC는 수컷에서의 수정능력을 자극할 수 있고, 불임 치료에 사용할 수 있음을 보여준다.
추가적인 양태로서, QPCTLs의 추가적인 생리학적 기질은 본 발명 내에서 분리될 수 있다. 이러한 것들은 Gln1-CCL2 (서열번호 45), Gln1-CCL7 (서열번호 48), Gln1-CCL8 (서열번호 44), Gln1-CCL16 (서열번호 43), Gln1-CCL18 (서열번호 46) 및 Gln1-프락탈킨 (Gln1-fractalkine) (서열번호 47)이다. 자세한 사항은 표 3을 참조하라. 이러한 폴리펩티드들은 골수 선구 세포 (myeloid progenitor cells)의 증식, 종양형성 (neoplasia), 염증 숙주 반응, 암, 건선 (psoriasis), 류마티즘, 아테롬성 동맥경화증, 체액성 및 세포-매개성 면역 반응(humoral and cell-mediated immunity response), 내피에의 백혈구 부착 및 이동 과정의 억제와 같은 병리생리학적 조건에서 중요한 역할을 수행한다.
B형 간염, 인간 면역결핍 바이러스 및 흑색종 (melanoma)에 대한 몇몇 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte) 펩티드-기초한 백신은 임상적 시도로 최근 연구되었다. 단독의 또는 다른 종양 항원과의 병용한 하나의 주목할 만한 흑색종 백신 후보는 데카펩티드 ELA (decapeptide ELA)이다. 이 펩티드는 N-말단 글루타민산를 가진 Melan-A/MART-1 항원 면역우세 (immunodominant) 펩티드 유사체 (analog)이다. 이 펩티드는 글루타민 (glutamines)의 아미노 그룹 및 감마-카르복스 아마이드 뿐만 아니라, 글루타민산의 아미노 그룹 및 감마-카르복실 그룹은 피로글루타믹 유도체 (pyroglutamic derivatives)를 형성하기 위해 쉽게 응축된다. 이러한 안정성 문제를 극복하기 위하여, 약제학적 목적의 몇몇 펩티드들은, 약동학적 특성의 손실 없이, N-말단 글루타민 또는 글루타민산 대신 피로글루타믹산으로 개발되었다. 불행히도, ELA과 비교하여 피로글루타믹산 유도체 (PyrELA) 및 N-말단 아실-캡화된 유도체 (AcELA)는 CTL (cytotoxic T lumphocyte) 활성을 유발시킬 수 없다. PyrELA 및 AcELA에 도입된 명백한 부수적 변형 (apparent minor modification)에도 불구하고, 이러한 두 유도체는 아마도 특이적 클래스 I 주요 조직적합성 복합체 (class I major histocompatibility complex)에 대한 ELA 보다 더 낮은 결합력을 가진다고 여겨진다. 결과적으로 ELA의 전 활성을 보유하기 위해서는, PyrELA의 형성을 반드시 피하여야 한다 (Beck A. et al. 2001, J Pept Res 57(6):528-38). 최근에는, 효소 QC (enzyme glutaminyl cyclase)가 흑색종에서 과발현된다는 사실이 밝혀졌다 (Ross D. T et al., 2000, Nat Genet 24:227-35.).
따라서, 본 발명은 골수 선구 세포의 증식, 종양형성, 염증 숙주 반응, 암, 악성 종양 전이(malign metastasis), 흑색종, 건선, 류마티즘, 아테롬성 동맥경화증, 체액성 및 세포-매개 면역 부전 (impaired humoral and cell-mediated immunity response), 내피세포에의 백혈구 부착 및 이동 과정의 억제와 같은 병리생리학적 조건의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 QPCTLs 억제제의 용도를 제공한다.
추가적으로, Gln1-오렉신 A (Gln1-orexin A) (서열번호 49)는 본 발명의 QPCTLs의 생리학적 기질로서 동정되었다. 오렉신 A는 섭식 및 수면-각성 (sleep-sakefulness)에서 중요한 역할을 하는 신경 펩티드이며, 이러한 상보적인 항상성 (homeostatic) 기능의 행동적 및 생리학적 반응 복합체를 조정함으로써 가능하게 한다. 그것은 또한 에너지 대사의 항상성 조절, 자율신경 기능 (autonomic function), 호르몬 균형 및 체액의 조절 (regulation of body fluids)에서 기능한다.
추가적인 양태로서, 본 발명은 섭식 장애(impaered food intake) 및 수면-각성 장애, 에너지 대사의 항상성 조절 부전, 자율신경계 기능 부전, 호르몬 균형 부전 및 체액 조절 부전의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 QPCTLs의 억제제의 용도를 제공한다.
몇몇 단백질에서 폴리글루타민 확장은 파킨슨 질환 및 케네디 질환 (Kennedy's disease)과 같은 신경퇴화성 질환을 유도한다. 그러므로 상기 기전은 잘 알려져 있지 않다. 폴리글루타민 반복의 생화학적 특징으로 하나의 가능한 설명이 제시되었다: 피로글루타메이트 형성에 따라 결합된 글루타미닐-글루타미닐 결합에서 내부적 절단 (endolytic cleavage)은 폴리글루타미닐 단백질의 대사 안정성, 소수성, 아밀로이드제네시티 (amyloidogenicity) 및 신경독성 조절을 통한 병인에 기여할 수 있다(Saido, T; Med Hypotheses (2000) Mar; 54(3):427-9).
QPTCLs의 추가적인 기질은 QYNAD (서열번호 51) 펩티드이다. 그의 피로글루타메이트 형태 pGlu-Tyr-Asn-Ala-Asp (pEYNAD) (서열번호 52)는 전위-개폐 나트륨 채널 (voltage-gated sodium channels)의 활성을 억제하는 효과적인 제제이다. 나트륨 채널은 수초화된 축삭 (myelinated axon)에서 높은 밀도로 발현되고, 포유류의 뇌 및 척수에서 축삭을 따라 활동 전위 (action potentials)를 전도시키는(conducting) 필수적인 역할을 수행한다. 그러므로, 그들은 MS (multiple sclerosis), 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome) 및 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증 (chronic inflammatory demyelinizing polyradiculoneropathy)의 병리생리학적인 몇 가지 양태에 속하는 것으로 여겨진다.
추가적인 양태로서, 본 발명은 염증성 자가 면역 질환, 특히 MS, 길랑-바레 증후군 및 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 QPCTLs의 억제제의 용도를 제공하며, pEYNAD 펩티드를 억제하는 전위-개폐 나트륨 채널의 형성이 저해된다.
더욱이, 본 발명은 QC-억제제를 포함하는, 진단학적 분석을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 언급된 질환 및/또는 상태 중 어느 하나를 진단하는 방법을 제공하며, 다음의 단계를 포함한다.
- 상기 질환 및/또는 상태를 겪는 것으로 추정되는 대상으로부터 샘플을 수집하는 단계,
- QC-억제제와 상기 샘플을 접촉시키는 단계, 및
- 상기 대상이 상기 질환 및/또는 상태를 겪는지 여부를 단계.
바람직하게 상기 진단 방법의 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 중추신경액 (cerebrospinal liquor)의 샘플 또는 뇨 샘플 (urine smaple)이다.
바람직하게, 상기 진단 방법에서의 대상은 인간이다.
바람직하게, 상기 진단 방법에서의 QC 억제제는 선택적 QC 억제제이다.
상기 진단학적 분석에서 더욱 바람직한 용도는 선택적 QPCTL 억제제이다.
본 발명은 추가적으로 검출수단으로서 상기 언급한 진단학적 분석 및 확인 수단을 포함하는 진단 방법을 수행하기 위한 진단 키트를 포함한다.
도 1은 인간 QC (hQC), 인간 isoQC (hisoQC), 뮤린 QC (mQC) 및 뮤린 isoQC (misoQC)의 서열 정렬을 나타낸 것이다. 다중의 서열 정렬은 초기 설정값(default settings)을 갖는 PBIL (Pole Bioinformatique Lyonnais) (http://npsa-pbil.ibcp.fr)에서 ClustalW를 사용하여 수행하였다. 진하게 밑줄로 표시된 인간 QC (hQC; GenBank X71125, 서열번호 10), 인간 isoQC (hisoQC, GenBank NM_017659, 서열번호 11), 뮤린 QC (mQC, GenBank NM_027455, 서열번호 79) 및 뮤린 isoQC (misoQC, GenBank BC058181 , 서열번호 17)에 대한 아연-이온 결찰 잔기의 보존은 진하게 표시하고 밑줄 그었다.
도 2는 호모 사피엔스 (hisoQC, GenBank NM_017659, 서열번호 11), 짧은 꼬리 원숭이 (Macaca fascicularis) (M_fascicularis, GenBank AB168255, 서열번호 13), 붉은털원숭이(Macaca mulatta) (M_mulatta, GenBank XM_001110995, 서열번호 14), 개(Canis familiaris) (C_familiaris, GenBank XM_541552, 서열번호 15), 집쥐(Rattus norvegicus) (R_norvegicus, GenBank XM_001066591 , 서열번호 16), 생쥐(Mus musculus) (M_musculus, GenBank BC058181 , 서열번호 17) 및 보스 토러스(Bos taurus) (B_taurus, GenBank BT026254, 서열번호 18)의 서열 정렬을 나타낸 것이다. 다중 서열은 초기 설정값(default settings)을 갖는 PBIL (Pole Bioinformatique Lyonnais) (http://npsa- pbil.ibcp.fr)에서 ClustalW를 사용하여 수행하였다. 보존된 아연-이온 결찰 잔기의 아미노산들은 밑줄로 표시하고, 굵게 나타내었다.
도 3은 인간 QC (hQC, 서열번호 10) 및 인간 isoQC (hisoQC, 서열번호 12) 및 메탈로펩티다제 Clan MH의 다른 M28 패밀리 멤버의 서열 정렬을 나타낸다. 다중 서열 정렬은 초기 설정값을 갖는 ch.EMBnet.org에서 ClustalW을 사용하여 수행하였다. 인간 QC (hQC; Swiss-Prot Q16769, 서열번호 10) 내에 있는 단일 아연-이온을 결찰시키는 아미노산 잔기의 보존은 인간 isoQC (isoQC; Swiss-Prot Q53HE4, 서열번호 12) (19-382 잔기), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)로부터 아연-의존성 아미노펩티다제 (SGAP; Swiss-Prot P80561 , 서열번호 80) 및 비브리오 프로테오리티쿠스(Vibrio proteolyticus)로부터 성숙 아연-의존성 류실-아미 노펩티다제(VpAP; Swiss-Prot Q01693, 서열번호 81)로 나타내었다. 각 아미노산 잔기들은 밑줄로 표시하고, 굵게 나타내었다.
도 4는 두 개의 추정 번역 시작점(메티오닌 I - 굵게, 밑줄; 메티오닌 Ⅱ - 굵게)을 나타낸, 인간 QC (hQC, 서열번호 10) 및 인간 isoQC (hisoQC, 서열번호 11)의 서열 정렬을 나타낸다. 다중 서열 정렬은 초기 설정값을 갖는 PBIL (Pole Bioinformatique Lyonnais) http://npsa-pbil.ibcp.fr에서 ClustalW를 사용하여 수행하였다. 인간 isoQC에 존재하는 횡단 도메인은 검정색 선(black bar)으로 나타내었다.
도 5는 메티오닌 Ⅱ (굵게)로 시작하는, 인간 QC (hQC, 서열번호 10) 및 인간 isoQC (hisoQC, 서열번호 12)의 서열 정렬을 나타낸다. 다중의 서열 정렬은 초기 설정값을 갖는 ch.EMBnet.org에서 ClustalW를 사용하여 수행되었다. 금속 결합에 연관된 아미노산들은 밑줄을 긋고 표시하였다. 인간 isoQC에 존재하는 횡단 도메인은 검정색 선(black bar)으로 나타내었다.
도 6은 RT-PCR에 의한 isoQC 발현 분석을 나타낸다. SH-SY5Y, LN405, HaCaT 및 Hep-G2에서 검출.
레인들(Lanes): 표준 DNA 염기쌍; 1 , SH-SY5Y로부터 인간 isoQC의 증폭된 PCR 생성물; 2, LN405로부터 인간 isoQC의 증폭된 PCR 생성물; 3, HaCaT로부터 인 간 isoQC의 증폭된 PCR 생성물; 4, Hep-G2로부터 인간 isoQC 증폭된 PCR 생성물.
도 7은 면역조직화학에 의한 isoQC (MetI, 서열번호 11) 세포 이하 편재화 분석을 나타낸다. 메티오닌 I로 시작하는 인간 isoQC(도 5 참조)는 LN 405에서 EGFP를 갖는 융합 단백질(isoQC (Metl) EGFP)로 발현되었다. 만노시다제(Mannosidase)Ⅱ 대비염색은 AB3712 (Chemicon)를 사용하여 수행되었다. 병합은 isoQC (Metl)-EGFP 및 만노시다제(Mannosidase) Ⅱ 염색의 오버레이(overlay)를 나타낸다.
도 8은 면역조직화학에 의한 isoQC (MetI, 서열번호 11) 세포이하 편재화 분석을 나타낸다. 메티오닌 I로 시작하는 인간 isoQC는 LN 405에서 EGFP를 갖는 융합 단백질(isoQC (Metl) EGFP)로 발현되었다. 미토콘드리아 대비염색은 MAB1273 (Chemicon)을 사용하여 수행되었다. 병합은 isoQC (MetI)-EGFP 및 미토콘드리아 염색의 오버레이를 나타낸다.
도 9는 면역조직화학에 의한 isoQC (MetⅡ, 서열번호 12) 세포이하 편재화 분석을 나타낸다. 메티오닌 Ⅱ로 시작하는 인간 isoQC는 LN 405에서 EGFP를 갖는 융합 단백질(isoQC (Metll) EGFP)로 발현되었다. 만노시다제(Mannosidase)Ⅱ 대비염색은 AB3712 (Chemicon)를 사용하여 수행되었다. 병합은 isoQC (MetⅡ)-EGFP 및 만노시다제 Ⅱ 염색의 오버레이를 나타낸다.
도 10은 면역조직화학에 의한 isoQC (MetⅡ, 서열번호 12) 세포 이하 편재 분석을 나타낸다. 메티오닌 Ⅱ로 시작하는 인간 isoQC는 LN 405에서 EGFP를 갖는 융합 단백질(isoQC (MetⅡ) EGFP)로 발현되었다. 미토콘드리아 대비염색은 MAB1273 (Chemicon)을 사용하여 수행되었다. 병합은 isoQC (MetⅡ)-EGFP 및 미토콘드리아 염색의 오버레이를 나타낸다.
도 11은 면역조직화학에 의한 isoQC (MetI, 서열번호 11) 세포 이하 편재 분석을 나타낸다. 메티오닌 I로 시작하는 인간 isoQC는 COS-7에서 EGFP를 갖는 융합 단백질(isoQC (Metl) EGFP)로 발현되었다. 만노시다제 Ⅱ 대비염색은 AB3712 (Chemicon)를 사용하여 수행되었다. 병합은 isoQC (MetI)-EGFP 및 만노시다제 Ⅱ 염색의 오버레이를 나타낸다.
면역조직화학적 방법에 의한 isoQC (MetI, 서열번호 11) 세포 이하의 편재 분석을 나타낸다. 메티오닌 I으로 시작하는 인간 isoQC는 COS-7에서 EGFP를 갖는 융합 단백질(isoQC (MetI) EGFP)로 발현되었다. 미토콘드리아 대비염색은 MAB1273 (Chemicon)을 사용하여 수행되었다. 병합은 isoQC (MetI)-EGFP 및 미토콘드리아 염색의 오버레이를 나타낸다.
도 13은 면역조직화학에 의한 isoQC (MetⅡ, 서열번호 12) 세포 이하 편재 분석을 나타낸다. 메티오닌 Ⅱ으로 시작하는 인간 isoQC는 COS-7에서 EGFP를 갖는 융합 단백질(isoQC (MetⅡ) EGFP)로 발현되었다. 만노시다제 Ⅱ 대비염색은 AB3712 (Chemicon)를 사용하여 수행되었다. 병합은 isoQC (MetI)-EGFP 및 만노시다제 Ⅱ 염색의 오버레이를 나타낸다.
도 14는 면역조직화학에 의한 isoQC (MetⅡ, 서열번호 12) 세포 이하 편재 분석을 나타낸다. 메티오닌 Ⅱ로 시작하는 인간 isoQC의 COS-7에서 EGFP를 갖는 융합 단백질(isoQC (MetⅡ) EGFP)로 발현되었다. 미토콘드리아 대비염색은 MAB1273 (Chemicon)를 사용하여 수행되었다. 병합은 isoQC (Metll)-EGFP 및 미토콘드리아 염색의 오버레이를 나타낸다.
도 15는 억제제 P150/03에 의해 pGlu-AMC 내로 H-Gln-AMC의 인간 isoQC-촉매된 전환의 억제를 나타낸다. 선형 경쟁적 억제를 고려하여 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 동역학 모델(kinetic model)에 따라 데이터를 계산하였다. 억제제 농도는 다음과 같다.
Figure 112009023886404-PCT00041
측정된 Ki-값(Ki-value)은 240 ± 8 nM이었다.
도 16은 분광 광도계 분석을 사용하여 확인된 pGln-Ala-OH 내 H-Gln-Ala-OH의 인간 isoQC-촉매된 전환을 나타낸다. 데이터는 미카엘리스-멘텐 동역학에 따라 측정되었다. 동역학적 파라미터는 KM 및 Vmax-값 각각에 대하여 324 ± 28 μM 및 7.4 ± 0.2 nM/min을 나타낸다.
도 17은 효모 P. 파스토리스(pastoris)에서 이종조직적(heteroligously)으로 발현된 인간 isoQC 단백질 구조물의 도식적 그림을 나타낸 것이다. 두 개의 돌연변이는 몇몇 단백질에서 도입되며, 위치 55(I55N)에서 당화 및 위치 351(C351A)에서 돌연변이된 시스테인 잔기를 유도한다. 발현을 위해서, 막횡단 도메인을 포함하는 N-말단을 효모의 분비 신호(YSS)로 교체하였다. N-말단 분비 신호를 포함하는 구조물은 배지 낼로 효과적으로 분비되었다.
도 18은 QC 활성을 나타낸 것으로서, 이는 효모 세포를 발현하는 배지에서 확인되었다. 막횡단 도메인에 의해, 천연 구조물은 배지 내로 분비되지 않았다(제공되지 않음). 당화(I55N)로 인하여 단백질이 가장 효율적으로 분비되었다. 배지에서 검출결과 돌연변이 C351A는 높은 QC 활성을 나타내었다. 상기 구조물은 도 17에 개시되어 있다.
도 19는 트랜스제닉 P. 파스토리스 균주의 배지로부터 YSShisoQCI55NC351A C-His 구조물을 기초로 한 인간 isoQC의 정제를 나타낸 것이다. QC는 IMAC (immobilized metal affinity chromatography, 레인 3), HIC (hydrophobic interaction chromatography, 레인 4) 및 탈염(desalting, 레인 5)의 조합에 의해 정제되었다. 효소의 당화는 단백질 이동에서의 변화를 야기하는 효소적 탈당화에 의해 입증된다(레인 6). 레인 1, 표준 단백질: 레인2, 정제 전 배지.
도 20은 형질 전환된 대장균의 세포 균질 현탁액으로부터의 GST-hisoQC C-His 구조물에 기초한 인간 isoQC의 정제를 나타낸 것이다. isoQC는 IMAC (레인 3), GST-친화력 (레인 4), 탈염(레인 5) 및 이온 교환 크로마토그래피(레인 6)의 조합에 의해 정제되었다.
레인 1, 표준 단백질: 레인 2는, 정제 전 세포 균질 현탁액. 효모 및 대장균에서 발현되는 hisoQC간의 분자량의 차이는 N-말단 GST-tag 융합에 의해 야기된다. 발현된 구조물을 도면의 상단 부분에 도식화하였다.
도 21은 인간 isoQC (YSShisoQCI55NC351A C-His; 도 17과 비교), GST-hisoQC 및 인간 QC에 의한 디펩티드-대용물(dipeptide-surrogates), 디펩티드 및 올리고펩티드의 전환에 대한 특이성 상수를 나타낸 것이다. GST-hisoQC의 특이성은 YSShisoQCI55NC351A C-His 다음으로 가장 낮았다. 가장 높은 특이성은 보다 높은 총괄적인 효소적 활성을 나타내는 인간 QC로 나타났다.
도 22는 효모에서 발현되는 인간 isoQC(hisoQC) 및 인간 QC(hQC)에서 관찰되는 촉매의 pH-의존성을 나타낸다. 두 개의 단백질은 pH 7 및 8사이에서 pH-최적 조건을 나타낸다. 고정 곡선(fitted curve)은 촉매 작용에 영항을 미치는 세 개의 해리 그룹에 기초한 것인데, 그 중 하나는 산성 pH이고, 두번째는 염기성 pH이다.
도 23은 펩티드 Aβ(3-11)에 연관된 아밀로이드-β의 N-말단에 존재하는 글루타믹 산의 전환 분석을 나타낸 것이다. 분석은 Maldi-Tof 질량 분석을 사용하여 수행하였으며, 기질 및 생성물은 약 18Da의 단일 전하 분자의 그 분자적 질량/전하 비율에서 차이를 보인다. 두 경우 모두에서, 동일한 단백질 농도가 샘플 내에 존재한다는 것은, 인간 QC보다 느리지만, 인간 isoQC 또한 N-말단 글루타믹 산을 전환시킨다는 사실을 의미한다.
도 24는 실시간 PCR을 사용하여 분석된 뮤린 QC (mQC, 서열번호 79) 및 그의 이소 효소 misoQC (서열번호 17)의 조직 분포를 나타낸 것이다. 두 효소 모두 시험 테스트에서 발현되었다. 그러나, mQC의 발현 수준이 말초 기관에 비하여 뇌에서 더 높다. 반대로, misoQC는 모든 테스트 기관 및 조직에서 유사한 수준으로 발현되었으며, 이는 어디에나 편재하는 "하우스키핑(housekeeping)" 단백질을 가리킨다.
도 25는 금속-킬레이팅 화합물 1,10-페난트롤린 (원형) 및 EDTA (사각형)에 의한 인간 isoQC (hisoQC)의 시간-의존적 억제를 나타낸 것이다. 잔여 hisoQC 활성은 30℃에서 15분 동안 각 시약을 포함하는 hisoQC의 첨가(닫힌 부호) 또는 전-배양 후 직접적으로 확인되었다.
도 26은 pcDNA 및 HEK293 세포 내 천연 효소 hisoQC (MetI, 서열번호 11), hisoQC (MetⅡ, 서열번호 12) 및 hQC (서열번호 10)의 발현 후 QC 활성의 세포 이하 편재화의 생화학적 분석을 나타낸 것이다. (A) μmole / min / g 로 나타낸 세포 분획물 내의 특이적 활성 (B) nM /min에서 절대적 활성 (C) FLAG-에피토프 (항-DYKDDDDK-항체, 세포 신호), 인간 미토콘드리아(항-인간 미토콘드리아, Chemicon)의 65 kDa 단백질 또는 인간 시알릴트랜스퍼라제 ST1GAL3 (Sialyltransferase ST1GAL3 (Abnova))를 검출하는 특이적 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 따른, 벡터-형질 감염된 대조군과 비교한 HEK293에서 C-말단 FLAG-태그를 포함하는 h-isoQC (Met Ⅰ 서열번호 11), h-isoQC (MetⅡ, 서열번호 12) 및 hQC (서열번호 10)의 발 현.
도 27은 EGFP (1, 4)와 융합된, 인간 isoQC (hisoQC) 신호 서열 (27A) 메티오닌 I - 세린 53 및 (27B) 메티오닌 Ⅱ - 세린 53의 세포 이하 편재를 나타낸 것이다. 항-만노시다제 Ⅱ 항체를 사용하여 골지 복합체를 염색하였고, 인간 미토콘드리아의 65 kDA 단백질을 검출하는 항체를 사용하여 미토콘드리아를 염색하였다(5). 공동-편재화(Co-localization)는 EGFP 형광 및 Red X 형광의 첨가(superimposition)에 의한 것을 나타내었다(3, 6).
도 28은 인간 글라이코실트랜스퍼라제(glycosyltransferases) : 알파-N-아세틸갈락토사미니드 알파-2,6-시알릴 트랜스퍼라제 1(ST6GalNAC1 ; E.C. 2.4.99.3); 베타-1,4 갈락토실트랜스퍼라제 1(b4Gal-T1, E.C. 2.4.1.-); 갈락토시드 3(4)-L-푸코실트랜스퍼라제(FucT-Ⅲ; E.C. 2.4.1.65)) 및 당단백질-푸코실갈락토시드 알파-N-아세틸갈락토사미닐 트랜스퍼라제 (NAGAT, E. C.2.4.1.40)의 공지된 서열과 비교해 볼 때, 인간 isoQC (hisoQC) 및 뮤린 isoQC (misoQC)의 도메인 구조를 나타낸 것이다. 아미노산 수를 컬럼 아래에 표시하였다. 세포질 부분은 어둡게 표시하였고, 막 횡단 나선(transmembrane helix)은 검정색으로, 루미널 부분(luminal part)은 흰색으로 표시하였다.
도 29는 서로 다른 암 세포 주에서 인간 isoQC (QPCTL) mRNA의 정량을 나타 낸 것이다. QPCTL 발현은 50 ng 전체-RNA로 표준화하였다. 박스 안에 있는 검정색 선(black bar)은 각 중간값(respective median)을 나타낸다.
도 30은 서로 다른 흑색종 세포 주에서 인간 isoQC (QPCTL) mRNA 발현의 정량을 나타낸 것이다. QPCTL 발현은 50 ng 전체-RNA로 표준화하였다.
도 31은 서로 다른 환자로부터의 연 조직 육종, 위암 및 갑상선 암 샘플에서 인간 isoQC (QPCTL) mRNA의 정량을 나타낸 것이다. QPCTL 발현은 50 ng 전체-RNA로 표준화하였다. 박스 안에 있는 검정색 선(black bar)은 각 중간값(respective median)을 나타낸다.
도 32는 분화 단계에 대한 서로 다른 위암에서 인간 isoQC (QPCTL) mRNA 발현을 나타낸 것이다. QPCTL 발현은 50 ng 전체-RNA로 표준화하였다. 박스 안에 있는 검정색 선(black bar)은 각 중간값(respective median)을 나타낸다.
도 33은 서로 다른 갑상선 암에서 인간 QC (QPCT) mRNA 발현의 비교를 나타낸 것이다. QPCTL 발현은 50 ng 전체-RNA로 표준화하였다. 박스 안에 있는 검정색 선(black bar)은 각 중간값(respective median)을 나타낸다.(FTC: 여포상 갑상선 암(folicular thyroid carcinoma); PTC: 갑상선 유두암(papillary thyroid carcinoma); UTC: 미분화된 갑상선 암(undifferentiated thyroid carcinoma)).
도 34는 서로 다른 갑상선 종양에서 인간 isoQC (QPCTL) mRNA 발현을 비교를 나타낸 것이다. QPCTL 발현은 50 ng 전체-RNA로 표준화하였다. 박스 안에 있는 검정색 선(black bar)은 각 중간값(respective median)을 나타낸다.(FTC: 여포상 갑상선 암; PTC: 갑상선 유두암; UTC: 미분화된 갑상선 암).
도 35는 HEK293 세포 내 인간 QC (QPCT), 인간 isoQC (QPCTL) 및 CCL2의 mRNA 발현에 있어서 서로 다른 자극의 영향을 나타낸 것이다. 자극 없는 기본 발현에 대하여 전사체의 양을 나타내었다. 상기 사용된 자극의 농도는 X 축상에 표시되어 있다.
도 36은 FTC-133 세포 내 인간 QC (QPCT), 인간 isoQC (QPCTL) 및 CCL2의 mRNA 발현에 있어서 서로 다른 자극의 영향을 나타낸 것이다. 전사체의 양은 자극 없는 기본 발현에 대하여 전사체의 양을 나타내었다. 사용된 자극의 농도는 X 축상 에 표시되어 있다.
도 37은 THP-1 세포 내 인간 QC (QPCT), 인간 isoQC (QPCTL) 및 CCL2의 mRNA 발현에 있어서 서로 다른 자극의 영향을 나타낸 것이다. 자극 없는 기본 발현에 대하여 전사체의 양을 나타내었다. 사용된 자극의 농도는 X 축상에 표시되어 있다.
도 38은 THP-1 세포 내 인간 QC (QPCT), CCL2, CCL7, CCL8 및 CCL13의 mRNA 발현에 있어서 서로 다른 자극의 영향을 나타낸 것이다. 자극 없는 기본 발현에 대하여 전사체의 양을 나타내었다. 사용된 자극의 농도는 X 축상에 표시되어 있다.
도 39는 HEK293 (A), FTC-133 (b) 및 THP-1 (C)에서 인간 QC (QPCT), 인간 isoQC (QPCTL) 및 HlF1α의 mRNA 수준에서 저산소증의 영향을 나타낸 것이다.
실시예 1: 인간 isoQCP의 준비
세포 주 및 배지
아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 COS-7, 인간 신경아세포종 세포주 SH-SY5Y, 인간 성상아교세포종 LN405(human asatrocytoma cell line LN405), 인간 케라틴 형성 세포주 HaCaT(human keratinocytoma cell line HaCaT) 및 인간 간세포 암 세포주 Hep-G2(human hepatocellular carcinoma cell line Hep-G2)를 37℃, 5% CO2(HaCaT, Hep-G2, COS- 7) 또는 10% CO2 (SH-SY5Y, LN405)의 습한 대기에서 적절한 세포 배양 배지(DMEM, 10 % FBS for Cos-7, SH-SY5Y, LN405, HaCaT), (RPMI 1640, 10% FBS for Hep-G2)에서 배양하였다.
RT-PCR을 사용한 human isoQC Expression 분석
RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 전체 RNA를 SH-SY5Y, LN405, HaCaT 및 Hep-G2 세포로부터 분리하였으며 Superscript Ⅱ (Invitrogen)에 의해 역전사하였다. 그 후, isoQChu-1 프라이머(sense, 서열번호 53) 및 isoQChu-2 프라이머(antisense, 서열번호54)를 사용하여 Herculase Enhanced DNA-Polymerase (Stratagene)로 25 ㎕ 반응에서 제조된 cDNA 생성물의 5배 희석으로 인간 isoQC(human isoQC)를 1:12로 증폭하였다. Strataprep PCR Purification Kit (Stratagene)를 사용하여 Hep-G2의 PCR 산물을 정제하였고 시퀀싱(sequencing)으로 확인하였다.
결과
RT-PCR을 사용한 인간 isoQC 발현 분석
인간 isoQC 전사체는 SH-SY5Y (도 6, 레인 1 ), LN405 (도 6, 레인 2), HaCaT (도 6, 레인 3) 및 Hep-G2 (도 6, 레인 4) 세포주에 존재함을 확인하였다. Hep-G2의 PCR 산물을 시퀀싱(sequencing)으로 확인하였다.
인간 isoQC 의 동정
인간 isoQC의 전장 cDNA를 RT-PCR을 사용하여 Hep-G2 세포로부터 분리하였다. 즉, Superscript Ⅱ (Invitrogen)로 Hep-G2 세포의 전체 RNA를 역전사시켰다. 그 후, isoQChu-1 프라이머(sense, 서열번호 55) 및 isoQChu-2 프라이머(antisense, 서열번호 56)를 사용하여 Herculase Enhanced DNA-Polymerase (Stratagene)로 25 ㎕ 반응에서 제조된 cDNA 생성물의 5배 희석으로 인간 isoQC(human isoQC)를 1:12로 증폭하였다. pPCRScript CAM SK (+) (Stratagene) 벡터에 벡터 PCR-생성물 결과를 서브클로닝(subcloned) 하였고, 시퀀싱(sequencing)으로 확인하였다.
실시예 2 : 포유 동물 세포 배양에서 인간 isoQC의 준비 및 발현
인간 isoQC-EGFP 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드 벡터 분자 클로닝
모든 클로닝 과정은 표준 분자 생물학 기술을 적용하였다. 인간 세포내에 있는 인간 isoQC-EGFP 융합 단백질의 발현을 위해, pEGFP-N3(Invitrogen)벡터를 사용하였다. 메티오닌Ⅰ또는 메티오닌Ⅱ로 시작하는 천연 인간 isoQC(native human isoQC)의 cDNA를 EGFP (enhanced green fluorescent protein)가 코딩된 플라스미드 프레임에서 N-말단으로 융합시켰다. 메티오닌Ⅰ에서 시작하는 인간 isoQC(human isoQC)의 증폭을 위하여 프라이머 isoQC EGFP-1 MetI (서열번호 57) 및 isoQC EGFP-3 (서열번호 59)을 사용하였고, 메티오닌Ⅱ(methionine Ⅱ)에서 시작하는 인간 isoQC(human isoQC)의 증폭을 위하여 프라이머 isoQC EGFP-2 MetⅡ (서열번호 58) 및 isoQC EGFP-3 (서열번호 59)를 사용하였다. EcoRⅠ 및 SalⅠ의 제한 부위를 이용하여 pEGFP-N3 벡터(Invitrogen)에 단편들을 삽입하였고, 시퀀싱(sequencing) 에 의해 정확한 삽입을 확인하였다. 그 후, 세포 배양 목적을 위해 EndoFree Maxi Kit (Qiagen)를 사용하여 벡터를 분리하였다.
hisoQC의 N-말단의 클로닝 과정
추가적으로, 증폭을 위해 EGFP-1 (sense) (서열번호 85) 및 EGFP-2 (antisense) (서열번호 86)를 사용하여 pcDNA 3.1 벡터(Invitrogen)에 pEGFP-N3 벡터(Invitrogen)의 EGFP 서열을 도입하였다. pcDNA 3.1의 XhoI 부위에 단편을 도입하였다. 각각 메티오닌 I 및 Ⅱ에서 시작하고, 세린 53(serine 53)에서 끝나는 hisoQC N-말단 서열 EGFP-1 (sense) (서열번호 85) 및 EGFP-2 (antisense) (서열번호 86)를 메티오닌 I에서 시작하는 isoQC EGFP-1 MetI (sense, 서열번호 57) 및 hisoQC의 N-말단 단편에 대한 (antisense) (서열번호 87)로서 hisoQC SS EGFP pcDNA, 및 isoQC EGFP-2 MetⅡ (sense, 서열번호 58) 및 메티오닌 Ⅱ에서 시작하는 hisoQC의 N-말단 단편에 대한 (antisense) (서열번호 87)로서 hisoQC SS EGFP pcDNA를 사용하여 pcDNA 3.1 벡터내에 EGFP와 C-말단으로 융합하였다. 단편은 pcDNA 3.1 벡터의 EcoRI 및 NotI 제한 부위 내로 단편들을 삽입하였다. 그 후, EndoFree Maxi Kit (Qiagen)을 사용하여 세포 배양 목적으로 벡터를 분리하였다.
hisoQC 및 hQC의 자가 발현(native expression)을 위한 클로닝 방법
hQC에 대한 프라이머 hQC-1 (sense) (서열번호 82) 및 hQC-2 (antisense) (서열번호 83), 메티오닌 I에서 시작하는 hisoQC에 대한 프라이머 isoQC EGFP-1 MetI (sense) (서열번호 57) 및 (antisense) (서열번호 84)로서 hisoQC pcDNA를 이용하여 증폭한 후, 천연 hQC를 pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen) 벡터의 Hind Ⅲ와 NotⅠ의 제한부위에 삽입하였고, 천연 hisoQC를 pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen) 벡터의 EcoRI과 NotI의 제한부위에 삽입하였다.
FLAG-태그된 hisoQC 및 hQC에 대한 클로닝 방법
pcDNA 3.1 벡터의 Hind Ⅲ 및 NotⅠ제한 부위에 프라이머 hQC-1 (sense) (서열번호 82) 및 (antisense) (서열번호 88)로서 hQC C-FLAG pcDNA를 적용하여 증폭한 후, C 말단의 FLAG-태그로 인간 QC(Human QC)를 클론하였다. 프라이머 isoQC EGFP-1 MetI (sense) (서열번호 57) 및 메티오닌 Ⅰ에서 시작하는 (antisense) (서열번호 89)로서 hisoQC C-FLAG pcDNA 및 프라이머 isoQC EGFP-2 MetⅡ (sense) (서열번호 58) 및 메티오닌 Ⅱ로 시작하는 hisoQC에 대한 (antisense) (서열번호89)로서 hisoQC C-FLAG pcDNA를 사용하여 증폭한 후, 인간 isoQC를 pcDNA 3.1 내로 C-말단 FLAG-태그와 함께 삽입하였다.
실시예 3: 포유 동물 세포에 있는 인간 isoQC의 면역조직화학적 염색
COS-7 및 LN405의 형질감염 및 조직화학적 염색
메티오닌 I 또는 메티오닌 Ⅱ에서 시작하는 인간 isoQC-EGFP 융합 단백질의 발현을 위하여, 커버 슬립(cover slip)을 포함하는 6-웰 디쉬(6-well dishes)에 COS-7 및 LN405를 배양하였다. 세포를 80% 포화도가 될 때까지 키웠으며, 제조사의 설명서(manufacturer's manual)에 따라 리포펙타2000(Lipofectamin2000(Invitrogen))을 사용하여 형질감염시키고, 5시간 동안 형질 감염 용액에 배양하였다. 그 다음, 상기 용액을 적합한 성장 배지로 교체하였고, 세포를 하룻밤 동안 배양하였다. 다음 날, D-PBS (Invitrogen)를 사용하여 두 차례 세포를 세척하였고, -20℃에서 10분 동안 냉 메탄올을 사용하여 고정하였으며, 이어서 실온에서 10분 동안 D-PBS를 사용하여 세 차례 세척하였다. 골지-영역(golgi-zone)의 염색을 위해서, COS-7 및 LN4053을 3시간 동안 D-PBS에서 항체를 1:50 희석액에서 토끼 항-만노시다제 Ⅱ 다클론 항체 (Chemicon)를 사용하여 배양하였다. COS-7 및 LN405에서 미토콘드리아를 염색하기 위해, 세포를 실온에서 3시간 동안 D-PBS에 항체의 1:100 희석액 내에 마우스 항-인간 미토콘드리아 단클론 항체 (Chemicon)와 함께 배양 하였다. 그 후, 상기 세포를 10분 동안 D-PBS를 사용하여 세 차례 세척하였다. 골지-영역(golgi-zone)에 대하여 염색된 세포는 암실, 실온에서 45분 동안 로다민(Rhodamin)-RedX (Dianova)가 결합된 염소 항-래빗 IgG 2차 항체와 함께 배양하였다. 미토콘드리아(mitochondria)에 대하여 염색된 세포는 암실, 실온에서 45분 동안 로다민(Rhodamin)-RedX (Dianova)가 결합된 염소 항-마우스 IgG 2차 항체와 함께 배양하였다. 그 다음, 세포를 실온에서 5분 동안 D-PBS로 세 차례 세척하였으며, 시티플로어(citiflour)가 있는 현미경 슬라이드 상에 커버 슬립(cover slips)을 마운트(mount) 하였다. 형광 현미경(Carl-Zeiss)으로 세포를 관찰하였다.
결과
1. LN405의 감염 및 조직화학적 염색
LN405 세포주 내의 메티오닌 I 및 메티오닌 Ⅱ로 시작으로 인간 isoQC-EGFP 융합 단백질의 발현(녹색 형광)은 결과물 단백질의 구획화(compartmentalization)를 유도한다. 만노시다제 Ⅱ 항체(적색 형광)를 사용하여 LN405 골지-영역의 대비 염색(Counterstaining) 및 만노시다제 Ⅱ를 이용한 인간 isoQC-EGFP의 순차적인 첨가(superimposition)는 인간 isoQC-EGFP 융합단백질의 편재화를 제시한다(병합된 이미지의 노란색 착색) (도 7 및 9). 따라서, 이는 메티오닌 Ⅱ로 시작하는 인간 isoQC가 인간 isoQC 융합 단백질의 골지-편재화를 산정하는 데 충분하다는 것을 의미한다.
메티오닌 I 및 Ⅱ로 시작하는 인간 isoQC-EGFP의 발현 및 미토콘드리아에 대한 대비염색(적색 형광) 첨가 후 병합된 이미지의 노란색 착색을 나타내지 않았으므로 미토콘드리아 내에 메티오닌 I 또는 Ⅱ로 시작하는 인간 isoQC-EGFP 융합 단백질의 편재화를 드러내지 않았다(도 8, 10).
2. COS-7의 형질감염 및 조직화학적 염색
LN405 세포 내의 메티오닌 I 및 메티오닌 Ⅱ로 시작하는 인간 isoQC-EGFP 융합 단백질의 발현과 유사하게, 결과 단백질(녹색 형광)의 구획화에서 COS-7 내 메티오닌 I 및 메티오닌 Ⅱ로 시작하는 인간 isoQC-EGFP 융합 단백질의 발현을 유도한다. 만노시다제 Ⅱ 항체(적색 형광) 및 만노시다제 Ⅱ를 이용한 인간 isoQC-EGFP의 순차적인 첨가는 COS-7 세포의 골지-구획 내에 인간 isoQC-EGFP 융합 단백질의 편재화를 제시한다(병합된 이미지의 노란색 착색)(도 11 ,13). 또한, COS-7 세포에서 메티오닌 Ⅱ로 시작하는 인간 isoQC-EGFP 융합 단백질의 발현은 골지-편재화를 야기시키기에 충분하다.
예상한대로, COS-7 (녹색 형광)에서 메티오닌 I 및 Ⅱ로 시작하는 인간 isoQC-EGFP 융합 단백질의 발현 및 미토콘드리아에 대한 대비염색(적색 형광)은 첨가 후, 병합된 이미지의 노란색 착색을 나타내지 않았으므로 미토콘드리아 내 메티오닌 I 또는 Ⅱ로 시작하는 인간 isoQC-EGFP 융합 단백질의 편재화를 나타내지 않았다(도 12,14).
실시예 4 : 대장균(E. coli)에서 인간 isoQC의 발현 및 정제
숙주 균주 및 배지
플라스미드의 증식을 위하여 대장균 세포 균주 DH5α(Escherichia coli strain DH5α)를 사용하였으며, 인간 isoQC의 발현을 위하여 대장균 균주 BL21(E. coli strain BL21)를 사용하였다. 제조사의 설명(Qiagen(DH5α) Stratagene (BL21))에 따라 대장균 균주를 키우고, 형질전환 및 분석하였다. 대장균에 요구되는 배지, 즉, Luha-Bertani (LB) 배지를 제조사의 권장사항에 따라 준비하였다.
인간 QC를 코딩하는 플라스미드 벡터의 분자 클로닝
모든 클로닝 과정은 표준 분자 생물학 기술을 적용하였다. 대장균 BL21에서 발현을 위해, pET41a 벡터(Novagen)를 사용하였다. (메티오닌 Ⅱ에서부터 계산 한) 30개의 코돈으로 시작하는 성숙 인간 isoQC의 cDNA를 GST-태그가 코딩된 플라스미드 구조에 융합시켰다. hisoQC pET41a-1 프라이머(서열번호 60) 및 hisoQC pET41a-2 프라이머(서열번호 61) (표 4)를 사용하여 증폭한 후, 엔테로키나아제에 대한 N-말단 프로테아제 절단 부위(cleavage site) 및 C-말단 (His)6-태그를 도입하였다. 서브클로닝(subcloning) 후, 단편을 Spe I 및 EcoR I의 제한부위를 도입한 발현 벡터 내로 삽입하였다.
대장균 BL21에서의 발현 및 정제
인간 isoQC를 코딩하는 구조물을 BL21 세포 내로 형질전환시켰고, 37℃, 선택적 LB 아가 플레이트상에서 키웠다. 단백질 발현은 37℃, 1% 글루코오스를 포함하는 LB 배지에서 수행하였다. 약 0.8의 OD6oo에 도달한 후, 37℃에서, 4시간 동안 20 μM IPTG를 사용하여 isoQC 발현을 유도하였다. 원심분리(4000xg, 20분)에 의해 배지로부터 세포를 분리하고, PBS(14O mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1O mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.3)에서 재현탁하였으며, 동결 및 해동을 1주기(cycle) 후 프렌치 프레스(French Press) 1주기를 수행하여 용해시켰다. 세포 용해물을 인산-포함 완충액(phosphate-containing buffer (5O mM Na2HPO4, 50OmM NaCl, pH 7.3))을 사용하여 최종 부피가 1.5ℓ가 되도록 희석하였고, 1시간 동안 4℃, 13,400 x g에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 상청액의 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 방법을 사용하여 확인하였다. 필요한 경우, 상기 용액을 0.6 mg/㎖의 최종 전체 단백질 농도를 얻기 위해 재희석하였다. 4-단계 프로토콜(4-step protocol)을 사용하여 GST-isoQC 융합 단백질을 정제하였다(표 5). 상기 정제를 도 20의 SDS-PAGE 분석에 의해 도식화하였다.
실시예 5 : 글루타미닐 사이클라제 활성 분석
형광 활성 측정법(Fluorometric assays)
모든 측정 방법은 30℃에서 NovoStar reader for microplates (BMG Labtechnologies)를 사용하여 수행하였다. QC 활성은 H-Gln-βNA를 사용하여 형광광도 방법으로 측정되었다. 샘플은 0.2 mM 형광 기질, pH 8.0, 0.05 M Tris/HCl내 25 U 피로글루타밀 아미노펩티다제(Qiagen, Hilden, Germany) 및 최종 부피 250 ㎕ 내에 적절하게 희석된 QC 분취액(aliquot)으로 구성되어 있다. 여기/방출 파 장(excitation/emission wavelength)은 320/410 nm였다. 상기 분석 반응은 글루타미닐 사이클라제를 추가에 의해 시작되었다. QC 활성은 분석 조건 하에서 β-나프탈아민의 표준 곡선으로부터 결정되었다. 단위(One unit)는 상기 개시된 조건하에서 1분당 H-Gln-βNA로부터 1 μmol pGlu-βNA의 형성을 촉진시키는 QC양으로 정의된다.
2차 형광광도 분석(fluorometric assay)에서, QC 활성은 기질로서 H-Gln-AMC를 사용하여 확인하였다. NOVOStar reader for microplates (BMG Labtechnologies)를 사용하여 30℃에서 반응을 수행하였다. 샘플은 형광기질, pH 8.0, 0.05 M Tris/HCl내 0.1 U 피로글루타미닐 아미노펩티다제 (Qiagen) 및 최종 부피 250 ㎕ 내에 적절하게 희석된 QC 분취액의 다양한 농도로 샘플을 구성하였다. 여기/방출 파장은 380/460 nm였다. 분석 반응은 글루타미닐 사이클라제를 추가에 의해 시작되었다. QC 활성은 분석 조건 하에서 7-아미노-4-메틸쿠마린의 표준 곡선으로부터 결정되었다. GraFit sofware를 사용하여 동역학적 데이터를 계산하였다.
isoQC의 분광광도 분석
분석은 대부분의 QC 기질에 대해 동역학적 파라미터를 측정하기 위하여 사용되었다. 보조효소로서 글루타믹 디하이드로게나제를 이용한 연속방법(Schilling, S. et al., 2003 Biol Chem 384, 1583-1592)을 사용하여 QC 활성을 분석하였다. 샘플은 최종 부피 250 ㎕ 내에 각각의 QC 기질, 0.3 mM NADH, 알파-케토글루타르 산 및 30 U/㎖ 글루타믹 디하이드로게나제로 구성되어 있다. 반응은 QC를 추가함으로서 시작되었고 8-15분 동안 340 nm에서 흡광도의 감소를 모니터링함으로써 추적하였다. 초기 속도를 측정하였고, 분석 조건 하에서 암모니아의 표준 곡선으로부터 효소 활성을 확인하였다. 모든 샘플은 Sunrise reader for microplates를 사용하여 30℃에서 측정하였다. GraFit software를 사용하여 동역학 데이터를 계산하였다.
억제 분석
억제제 테스트를 위해, 샘플 구성은 상기 기재된 바와 같으며, 추정 억제 화합물을 제외하고 첨가하였다. QC-억제의 빠른 테스트를 위하여, 샘플은 각 억제제 4mM 및 기질 농도 1KM을 포함시켰다. Ki-값(Ki-values)의 저해 및 측정을 위한 상세한 시험을 위하여, 보조 효소에서의 억제제의 효과를 처음으로 조사하였다. 모든 경우에 있어서, 검출된 효소 어디에서도 효과가 없었으며, 따라서 QC 억제의 신뢰성을 확인할 수 있었다. GraFit software를 사용하여 경쟁적 억제에 대한 일반적 방정식에 추이 곡선(progress curve)을 맞춤으로써 억제 상수를 측정하였다.
결과
서로 다른 기질의 다양성을 인간 isoQC에 의한 전환으로 측정하였다(표 3). 분석된 모든 기질은 인간 QC (Schilling, S. et al., 2003 Biol Chem 384, 1583- 1592)와 유사하게 상대적으로 완화된 전반적인 특이성을 나타내는 isoQC에 의해 전환되었다. 인간 QC에 대해 이미 관찰된 바와 같이(Schilling, S. et al., 2003 Biol Chem 384, 1583-1592), 예를 들면 Gln- AMC와 같은 N-말단 글루타미닐 잔기에 가까운 커다란 소수성 아미노산을 운반하는 기질에서 가장 높은 특이성 상수(kcat/KM)가 나타났다. 반면, 해당 위치에서 음전하를 띠는 잔기는 음으로 하전된 isoQC의 활성 부위인 Gln-Glu로 관찰됨으로써, 특이성면을 현저하게 떨어뜨린다. 인간 QC와 비교하여, 재조합 iosQCs 모두 낮은 효소적 활성을 나타낸다(도 21). 상기 차이점은 매우 크다. isoQC의 특이성에 따라, 효소는 생체 내(in vivo)에서 서로 다른 기질로 전환하는데 관여함을 추정할 수 있다. 즉, isoQC가 많은 다른 생리적 기질을 양산하는데 관련이 있다고 추정할 수 있다.
인간 isoQC 활성은 이미다졸 유도체(표 6, 도 15)에 의해 경쟁적으로 억제되었다. 이미다졸(imidazole)과 벤지미다졸에 대한 억제 불변상수 Ki는 이전의 인간 QC에 대한 값과 매우 유사하였다. 그러나, 강한 QC 저해제 P150/03대해서는 Ki가 10배 감소됨을 확인하였다. 따라서, 킬레이트 일부에의 결합 형태, 즉, 이미다졸 고리는 매우 유사하게 나타난다. 추측하건데, 이는 이미다졸 염기성 질소에 의해 QC 및 isoQC의 활성 부위 아연 이온의 복합화(complexation)로부터 기인한다. P150/03에 대한 Ki-값에 있어서 차이점은 두 효소 모두의 활성 부위가 미세한 차이를 나타낸다는 것을 명확하게 제시한다. 그러므로, 하나의 효소적 이소형태(enzymic isoform)에 대해 선택성을 나타내는 억제제를 생산할 수 있다. 선택적 억제제는 질 병의 치료에 효과적이다.
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실시예 6 : P. 파스토리스에서 인간 isoQC의 발현 및 정제
숙주 균주 및 배지
플라스미드의 증식을 위하여 대장균 균주 DH5α(Escherichia coli strain DH5α)를 사용하였으며 효모에서 인간 isoQC의 발현을 위하여 P. 파스토리스 균주 X-33을 사용하였다. 제조사의 설명(Qiagen (DH5α), invitrogen (X-33))에 따라 대장균 균주를 키우고, 형질전환 및 분석되었다. 대장균에 요구되는 배지, 즉, Luria-Bertani (LB) 배지를 제조사의 권장사항에 따라 준비하였다. 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 즉 BMMY, BMGY, YPD, YPDS에 필요한 배지 및 항생제, 즉 제오신(Zeocin)의 농도는 피키아 설명서(Pichia manual (invitrogen, 카달로그. No. K1740-01))에 기재된 바에 따라 제조하였다. 설명서는 또한 효모의 취급을 위한 모든 관련된 기재를 포함하고 있다.
인간 QC를 코딩하는 플라스미드 벡터의 분자 클로닝
모든 클로닝 과정은 표준 분자 생물학 기술을 적용하였다. 피키아 파스토리스 X-33의 발현을 위해, pPiCZαA (invitrogen)를 사용하였다. (메티오닌 Ⅱ에서부터 계산한) 30개 코돈으로 시작하는 성숙 인간 isoQC의 cDNA를 분비 경로(secretory pathway)내 단백질인, 플라스미드 코딩된 α-인자(α-factor)와 함께 프레임에 융합시켰다. 센스-프라이머로서 hisoQC HIS C-Term pPICZAA-1 프라이머 (서열번호 62) 또는 hisoQC HIS N-Term pPICZAA-1 프라이머(서열번호 63) 및 안티센스 프라이머로서 hisoQC HIS N-Term pPICZAA-2 프라이머(서열번호 64) 및 hisoQC HIS C-Term pPICZAA-2 프라이머(서열번호 66) (표 4)를 사용하여 증폭한 후, 상기 단편을 Not I 및 EcoR I의 제한 부위를 도입한 발현 벡터 내로 삽입하였다. 상기 구조물에 의해, 돌연변이는 코돈(codons) 55 (Ile) 및 351 (Cys)에 도입 되었다. 돌연변이 유발(mutagenesis)은 표준 PCR 기술에 따라 수행되었고, DpnＩ(quik-change Ⅱ site-directed mutagenesis kit, Stratagene, Catalog No. 200524)을 사용하여 모체 DNA(parent DNA)를 절단하였다. 생산된 구조물은 도 17에 개략적으로 도식화하였다.
P. 파스토리스의 소규모(Mini-Scale) 및 형질 전환
제조사의 설명서(BioRad)에 따라 전기천공(electroporation)에 의해 컴피턴트(competent) P. 파스토리스 세포의 형질전환에 플라스미드 DNA 1-2 ㎍을 사용하였다. 제오신(Zeocin) 100 ㎍/㎖를 포함하는 플레이트에서 선별을 수행하였다. isQC 발현에 의한 재조합 효모 클론을 테스트하기 위해, 2 ㎖ BMGY를 포함하는 10 ㎖ 코니컬 튜브에서 24시간 동안 재조합체를 배양하였다. 그 후, 효모를 원심분리하고, 0.5 % 메탄올을 포함하는 2 ㎖ BMMY에 재현탁하였다. 약 72시간 동안 매 24시간 마다 메탄올을 추가하여 상기 농도를 유지시켰다. 이어서, 상청액에 있는 QC 활성을 확인하였다. 고 활성을 나타내는 클론을 추가 실험하고 발효를 위해 선택하였다. 발현 구조물에 따라, 배지에서 isoQC 활성이 상이하였다(도 18).
P. 파스토리스에서 hisoQC의 발현 및 정제
피키아 파스토리스에서 isoQC의 대규모-발현을 위해, 상기 조건을 소-규모 발현에 기재한 바와 같이 유지하였으나, 전체 볼륨은 8ℓ로 하였다. 상기 발현은 쉐이크-플라스크(shake-flask)에서 수행하였다. 발현 후, 원심분리(1500xg, 20분)된 배지로부터 세포를 분리하였고, 펠렛을 제거하였다. 상청액의 pH-값을 중성으로 조절하였고, 다시 원심분리하였으며, 첫 번째 정제 단계에 이용하였다. 3-단계의 프로토콜(표 7)을 사용하여 isoQC 단백질을 정제하였다. 상기 정제는 도 19에 도시된 바와 같이, SDS-PAGE 분석으로 확인하였다.
Figure 112009023886404-PCT00050
결과
인간 isoQC는 성공적으로 메탄올자화 효모(methylotrophic yeast) P. 파스토리스에서 발현되었다. 효모에서 최상의 발현 조건을 선택하기 위해 몇몇 다른 구조물을 제조하였다(도 17). 도 18에서 나타난 것과 같이, QC 활성은 발현 세포의 배지에서 발현되고, 존재하는 발현된 구조물에 따라 변화한다. 적절한 분비를 유도하는 당화 부위의 도입은, YSShisoQCN55IC351A C-His 및 YSShisoQCN55I C-His 구조물로부터 관찰될 수 있다. 배지내 최상의 활성으로 인하여, YSShisoQCN55IC351A C- His 구조물은 대규모로 발현되었고, 정제되었다. 표 7에서 기재된 바에 따라 정제 하였고, 정제 수득률은 59%였다. 명백한 균질 단백질은 저분자량의 이동 변화로 나타나면서 당화되었다(도 19). 당화는 효소의 촉매적 활성에 영향을 미치지 않는다.
실시예 7 : hisoQC의 pH-의존성
(실시예 5에서 기재된) H-Gln-βNA을 사용한 형광광도 분석은 촉매적 특이성의 pH-의존성을 조사하기 위하여 수행되었다. 7 μM 기질 농도, 즉 [S]<<KM에서 상기 반응을 수행하였다. 그러므로, 상기 관찰된 특이성 상수는 기질 전환 추이 곡선의 초기 속도로부터 직접적으로 감소될 수 있다. 본 발명에서 반응 완충액은 0.075 M 아세트 산, 0.075 M Mes 및 0.15 M Tris로 구성되고 HCl 또는 NaOH를 사용하여 원하는 pH에 맞추었다. 상기 완충액은 넓은 pH-범위에 걸쳐 일정한 이온 강도를 가진다. 다음 식을 사용하여 획득된 효소 동역학 데이터의 측정을 수행하였다: kCat/KM(pH) = kCat/KM(limit)*1/(1 + [H+]/KHS + KE1/[H+] + KE1/[H+]*KE2/[H+]), 여기에서 kCat/KM(pH)는 pH-의존적(관찰된) 동역학 파라미터(kinetic parameter)를 나타낸다. kCat/KM(limit)는 pH-독립적("제한하는") 값을 나타낸다. KHS, KE1 및 KE2는 각각 산성 pH-범위에서 해리 그룹의 해리 상수, 및 효소의 두 해리 그룹들을 나타낸다. 모든 동역학 데이터의 값은 GraFit software (version 5.0.4. for windows, ERITHACUS SOFTWARE Ltd., Horley, UK)를 사용하여 수행되었다.
결과
hisoQC는 pH 7-8에서 특이성의 pH-최적 조건을 나타낸다. 그러므로, 촉매작용의 pH-최적 조건은 인간 QC와 매우 유사하다. 세 개의 해리 그룹에 기초한 모델에 따른 데이터의 적용은 hisoQC 및 hQC의 pH-의존성의 적절한 해석에 의하였다(도 22). 따라서, 양 효소적 반응 촉매 작용은 일반적으로 유사한 촉매적 메커니즘을 제시하는 유사한 해리 그룹에 의해 영향을 받는다.
결정된 pKa-값은 표 8에 나타나 있다. 오직 하나의 pKa만이 hisoQC 및 hQC 사이에서 현저하게 다르다는 사실은 자명하다. hQC에서, pKa는 기질의 해리 상수인 pKa와 일치힌다. hQC 및 hisoQC 사이의 미세한 차이는 pH-의존성에 영향을 미치는 isoQC 촉매 작용(induced fit)에서 일어나는 구조적인 변화를 야기할 것이다.
실시예 8 : 글루타미닐 사이클라제 활성 조사
인간 QC에 대해 기술한 바와 같이, 상기 효소는, 피로글루타믹 산으로 N-말단 글루타믹 산의 고리화를 촉매한다. 그러므로, QC는 pGlu-변형된 아밀로이드 펩티드의 생산과 연관이 있다.
글루타믹 산의 고리화를 조사하기 위하여, 인간 QC 및 인간 isoQC를 정제하였고, Aβ(3-11)로부터 pGlu-변형된 아밀로이드 β(3-11) [pGlu-Aβ(3-11)]의 형성을 모니터하였다. 반응은 20㎕ 기질(5OmM Mes buffer 내에 Aβ(3-11), 2.5mM 저장 용액, pH 6.5) 및 80 ㎕효소(0.62 mg/㎖ hQC 저장 용액; 5OmM Mes pH 6.5 내 0.61 mg/㎖ hisoQC 저장 용액)로 구성되어 있다. 샘플(15 ㎕)을 Oh, 6h, 24h, 48h 및 72h 후 제거하였고, 반응을 종료시키기 위하여 5분 동안 가열하였다. 기질 전환 분석은 Maldi-Tof 질량 분석기(Maldi-Tof mass spectrometry)에 의해 모니터되었다. 기질 및 생성물이 고리화되는 동안, 분비된 물 질량, 18 Da에 의해 그들의 분자량에 있어 차이가 난다.
도 23에 기재된 바와 같이, 인간 QC 및 인간 isoQC (YSShisoQCI55NC351A C-His)는 pGlu-Aβ(3-11)내로 Aβ(3-11)의 전환을 촉매한다. 그러나 두 샘플 모두에서 동일한 단백질 농도에 기초하여, hisoQC에 의한 N-말단 글루타믹 산의 전환이 hQC에 비하여 훨씬 느리다고 결론 내릴 수 있다. 따라서, 글루타미닐 기질의 전환에 대한 낮은 특이성 상수 역시 글루타미닐 기질로 관찰되었다. 어떤 고리화도 비활성화된 효소가 있는 조건하에서는 관찰되지 않는다(Schilling, S. et al., 2004 FEBS Lett. 563, 191-196).
실시예 9 : 뮤린 isoQC의 조직 특이성
뮤린(murine) QC 및 뮤린 isoQC의 조직 분포를 정량적 실시간 PCR 기술을 사용하여 조사하였다. 몇몇 다른 기관과 조직으로부터의 cDNA를 분석하기 전에, 뮤린 isoQC 열린 해독 틀(open reading frame)을 특이적 프라이머(서열번호 68로 isoQCm MetⅠ, 서열번호 69로 isoQCm MetⅠ(표 4))를 사용하여 분리하였고, 이는 뮤린 isoQC의 염색체 코딩 영역으로부터 유래하였다. pPCR-Schpt CAM SK (+) 벡터(PCR-Script CAM Cloning Kit, Stratagene) 내로 열린 해독 틀을 클론하였고, 실시간 PCR 확인에 있어서의 양성 대조군으로 사용하였으며, 분석조건하에서 표준 곡선으로 사용하였다.
misoQC 발현의 조직 특이성의 특징은 3-6개월 된 마우스로부터 얻은 cDNA를 사용하여 얻었다. RNA-isolation kit Ⅱ (Macherey 및 Nagel)를 사용하여, 30 mg 조직으로부터 전체 RNA를 분리하였다. RNA 농도 및 순도를 겔전기영동 (아가로스겔) 및 분광광도로 측정하였다. cDNA의 합성을 위하여, RNA 1 ㎍을 사용하였다. 반응은 공급자의 권장사항에 따른 reverse Transcriptase Superscript Ⅱ RT (Invitrogen)를 사용하였으며, cDNA를 영하 80℃에 저장하였다.
서로 다른 조직에서 전사체 농도의 정량 분석은 "Light Cycler" (Corbett research)를 사용하였으며, "QuantiTect SYBR Green PCR" (Qiagen)을 사용하여 분석하였다. DNA 표준(쿨론된 cDNA isoQC 마우스)을 정량하기 위해 사용하였다. 카피 수를 다음의 식으로 계산하였다:(X g/㎕ DNA) / (염기쌍 내의 플라스미드 길이*660)*6.022*1023 = Y Molecules/㎕. DNA 표준을 107-101 분자/㎕ 범위 내에 있는 4 농도 및 한계 농도(10°)를 포함한다. 반응 프로토콜은 표 8에 나타나 있다. 그 결과는 도 24에 나타나 있다.
뮤린 QC의 증폭을 위하여, 서열번호 73으로 mQC RT N-말단 프라이머 및 서열번호 74로 mQC RT N-말단 프라이머를 사용하였다.
Figure 112009023886404-PCT00051
결과
도 24에서 보는 바와 같이, 뮤린 QC 및 뮤린 isoQC는 실험된 모든 기관에서 발현되었다. 뮤린 QC와 달리, 다른 기관들 사이에서 뮤린 isoQC의 발현의 다양성은 전사조절이 엄격하지 않음을 의미한다. mQC의 발현에 대한 데이터는 노던 블롯을 사용하여 분석된 우태(bovine) QC에 대한 이전의 분석과 일치한다(Pohl, T. et al. 1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88, 10059-10063). QC의 가장 높은 발현은 시상(Thalamus), 해마(Hippocampus) 및 피질(Cortex)에서 관찰되었다. 따라서, 우선 신경 조직에서 QC-발현을 측정하였다. 비장 및 신장과 같은 말초 기관에서 낮은 QC-발현을 관찰하였다. 또한, mQC에 비하여 낮은 수준이나 신경 조직에서는 misoQC가 발현된다. 반면, 말초 기관에서 발현 수준은 isoQC 및 QC간에 매우 유사하다. 결론적으로, 전사 농도 결과에 기초하여, 결합된 활성(isoQC 및 QC)은 뇌에서 가장 높다. 따라서, 가장 높은 QC-단백질 수준은 알츠하이머 질환, 가족성 브리티시 치매(familial british dementia) 및 가족성 대니시 치매(familial danish dementia)와 같은 아밀로이도지스(amyloidoses)를 가진 신체 기관에서 나타난다.
실시예 10 : 이종고리 킬레이터(heterocyclic chelators)에 의한 인간 isoQC의 저해
결과
1 ,10-페난트롤린 및 디피콜 산과 같은, 이종고리 킬레이터를 사용한 서로 다른 기원으로부터 QCs의 시간-의존성 억제는 이미 연구되고 있다 (6, 9). 유사하게, h-isoQC 역시 금속 의존적 활성을 분명하게 가리키는 이종고리 킬레이 1 ,10-페난트롤린(도 25) 및 디피콜 산(나타내지 않음)에 의해, 시간 의존적으로 비활성화된다. 더욱이, EDTA 또한 h-isoQC (도 25)를 억제하였다. 인간 QC, 돼지 QC 및 쥐 QC는 EDTA에 의해 식별가능한 억제를 나타내지 않으므로, QCs에 대해 정확히 반대되는 것이다. 그러나, EDTA에 의한 hisoQC 억제는 더 강한 금속-의존성 촉매임을 암시한다.
실시예 11 : 세포 분획을 이용하여 조사된 hisoQC의 세포 이하의 편재화(Subcellular localization)
세포 분획법
형질감염(The day followig transfection)에, 발현 HEK293 세포를 D-PBS로 세척하였고, 4℃에서 5분 동안 500 x g로 원심분리하였다. 그 다음, D-PBS를 제거하고, 세포를 분해 완충액 1 ㎖ (50 mM Tris, 50 mM KCl, 5 mM EDTA, 2 mM MgCl2, HCl로 pH 7.6에 맞춤)로 재현탁하였으며 Potter cell homogenisator에서 30회 분쇄하였다. 현탁액을 4℃, 10분 동안 700 x g로 원심분리하였다. 수득된 펠랫을 분해 완충액 300 ㎕로 재현탁하였고, 잔여물 분획(debris fraction (D))을 얻었다. 결과 상청액을 4℃, 30분 동안, 20,000xg에서 추가적으로 원심분리하였다. 펠렛을 HM(heavy membrane fraction)으로 나타내었고, 분해 완충액 200 ㎕ 로 재현탁하였다. 결과 상청액은 초원심분리(Beckmann)를 사용하여 4℃, 1시간 동안 100,000xg 로 원심분리하였다. 수득된 펠랫은 200 ㎕ 분해 완충액으로 재현탁하였고, LM(light membrane fraction)으로 명명하였다. 상청액은 가용성 분획물(S)로 나타내었다. 잔여물, HM 및 LM을 10초 동안 초음파처리 하였으며, 모든 분획물 중 단백질 함량을 브래드포드(Bradford) 방법을 사용하여 확인하였다. 그 다음, 분획물을 QC 활성에 대해 분석하였으며, 웨스턴 블롯(Western Blot)을 사용하여 마커 단백질을 염색하였다.
결과
추가적인 입증을 위하여, hisoQC 및 hQC 발현으로부터, QC 활성 분포의 생화학적 분석을 수행하였다. 메티오닌 I 및 Ⅱ로 시작하는 천연 hisoQC 및 hQC를 HEK293 세포에 각각 발현시켰다. 세포 분획 후에, 각 분획물 내의 QC 활성을 기질로서 H-Gln-βNA를 적용한 형광 분석을 사용하여 측정하였다. 세포에, 빈 벡터(pcDNA)로 형질감염된, 특이적 QC 활성은 거의 측정되지 않았다. 천연 hisoQC (MetⅠ)와 hisoQC (MetⅡ)를 발현시키는 경우, HM(MetⅠ: 40 ± 2 μmole/min/g; MetⅡ: 36 ± 1.5 μmole/min/g) 및 배지(MetⅠ: 30 ± 2 μmole/min/g; MetⅡ: 54 ± 3 μmole/min/g)에서 가장 높은 특이적 활성을 가진 QC 활성이 쉽게 측정되었다. 반면, hQC는 HM(251 ± 21 μmole/min/g)에 따른 배지(1339 ± 76 μmole/min/g) 내에서 가장 높은 특이적 QC 활성을 나타낸다(도 26A).
추가적으로 hisoQC (MetⅠ) 및 hisoQC (MetⅡ) 발현이 즉, 잔여물 (MetⅠ: 1032 ± 9 nM/min; MetⅡ: 1110 ± 10 nM/min) 및 HM (MetⅠ: 374 ± 20 nM/min; MetⅡ: 281 ± 12 nM/min) 사이에서 세포내 QC 활성이 증가하는 주요원인이라는 것을 나타내는, 절대적 활성을 측정하였다. QC 활성은 배지(MetⅠ: 27 ± 2 nM/min; MetⅡ: 53 ± 3 nM/min) 내에서 거의 발견되지 않았다. 반대로, hQC 발현에 의해 추정된 QC 활성은 배지(1138 ± 65 nM/min) 내에서 및 조직화학적 분석에 의해 나타난 것과 같이 hisoQC의 골지 편재화를 뒷받침하는 세포 내 구획(잔여물: 1089 ± 14 nM/min; heavy membrane fraction: 583 ± 38 nM/min)내에서 높은 활성을 보인다(도 26B).
천연 효소의 발현에 의해 수득된 데이터는 C-말단 FLAG-태그를 갖는 hisoQC (MetⅠ 및 MetⅡ) 및 hQC의 발현에 의해 추가적으로 뒷받침 된다(도 26C). hQC는 배지 내에서 풍부하지만 잔여물 및 HM 내에서 또한 발견되는 반면, 골지 복합체 및 미토콘드리아의 마커 단백질에 비교하여 FLAG-태그된 단백질 결과의 웨스턴 블롯은 hisoQC(MetⅠ) 및 hisoQC (MetⅡ)의 주요 세포내 편재를 나타냈다. 골지 복합체(ST1GAL3) 및 미토콘드리아의 마커 단백질의 시각화는 잔여물 및 HM 내에서 이러한 구획의 존재를 나타낸다. 추가로 미토콘드리아 단백질 65 kDa은 가용성 분획물 내 작은 부분에서 발견되었다.
실시예 12 : hisoQC의 골지 체류 신호 분석
예상되는 N-말단 막 횡단 나선이 골지 복합체 내에서 hisoQC의 체류를 담당하고 있는지 여부를 확인하기 위하여, 막 횡단 나선을 포함하는, MetⅠ및 MetⅡ를 시작으로 하는 신호 펩티드를 분명하게 하기 위하여, EGFP가 있는 구조에 클론하였다. hisoQC (MetⅠ) SS EGFP 벡터 및 hisoQC (MetⅡ) SS EGFP 벡터를 LN405 세포에서 발현시켰고, 공초점 레이저 주사현미경을 사용하여 전장 hisoQC EGFP 융합 단백질과의 유사성을 조사하였다. hisoQC (MetⅠ) SS EGFP의 발현은 전장 hisoQC(MetⅠ) EGFP 융합 단백질에 대하여 확인된 동일한 골지 복합체 편재화를 나타냈다. 또한, 미토콘드리아로의 hisoQC (MetⅠ) SS EGFP의 이동은 관찰되지 않았다(도 27A). 추가적으로, N-말단 절단된 펩티드 hisoQC (MetⅡ) SS EGFP의 발현 또한 골지 복합체 내 단백질을 풍부하게 하였다. hisoQC (MetⅠ) SS EGFP와 유사하게, 미토콘드리아 EGFP 형광은 기록되지 않았다(도 27B). 결론적으로, hisoQC의 N-말단 서열은 ER 막으로 단백질의 상호-번역 전좌(co-translational translocation)를 유도하고, 골지 복합체 내에서의 체류를 유도한다. 더욱이, hisoQC (MetⅡ) SS EGFP의 발현에 의해, 골지 체류 신호는 메티오닌 19 및 세린 53 (MetⅠ에서 시작하는 아미노산을 카운팅)사이의 잔기에 대부분 편재하였다.
추가적인 토폴로지 분석은 글라이코실트랜스퍼라제 hisoQC N-말단의 기능적 상동성에 대한 가능성을 나타냈다. 글라이코실트랜스퍼라제는 막 횡단 나선형 및 커다란 루미널 촉매 도메인(large luminal catalytic domain)에 따른 짧은 세포질 서열을 포함하는 타입 Ⅱ 막 횡단 단백질이다. 확실히, 상기 단백질은 misoQC 및 hisoQC에 대해 확인되는, 본질적으로 동일한 도메인 구조이다(도 28). 많은 글라이코실트랜스퍼라제에 대해, 막 횡단 도메인 내에서 골지 체류 신호를 동정하였다. 또한, 이러한 효소들 중 몇몇에 대해서는 세포질 서열의 절단이 단백질의 활성 또는 편재에 어떠한 영향도 미치지 않음을 관찰하였다. 요컨대, hisoQC는 글라이코실트랜스퍼라제에 유사한 골지 복합체 내에 체류하고 있는 것으로 보이는 타입 Ⅱ 막 횡단 단백질임을 입증하였다.
실시예 12 : 서로 다른 인간 종양 세포 주 및 조직에서 QPCTL mRNA의 검출
정량적 PCR 분석(qPCR 분석)
실시예 9에 기재된 바와 같이, 정량적 실시간 PCR(qPCR)을 사용하여 인간 암 세포주에서 인간 QPCTL 발현 분석을 수행하였다. QPCTL mRNA를 확인하기 위해, 게놈 DNA의 동시-증폭(co-amplification)을 배제하기 위하여 엑손/엑손 영역을 커버하는 QuantiTect® 분석 프라이머(primer assay)를 이용하였다. 제조사의 권장사항에 따라 QPCR을 수행하였다. 반응 혼합물은 표 9에 개시하였고, PCR 프로그램을 표 8에 기재하였다.
Figure 112009023886404-PCT00052
서로 다른 조직에서의 전사체 농도 정량 분석은 "Light Cycler" (Corbett research)을 사용하였고, "QuantiTect SYBR Green PCR" (Qiagen)을 적용하여 분석하였다. DNA 표준(클론된 cDNA isoQC 인간)은 정량을 위해 사용되었다. 다음 식에 따라 카피수를 계산하였다 : (X g/㎕ DNA) / (염기쌍 내 플라스미드 길이*660)*6.022*1023 = Y Molecules/㎕. DNA 표준은 107-101 Molecules/㎕ 범위 내에서 4 개의 농도 및 한계 농도(100)를 포함한다. rotor-gene operating software (Corbett research)를 사용하여 qPCR의 결과를 계산하였다.
결과
서로 다른 종양 세포주에서 QPCTL의 발현
테스트된 암 세포주 간, 인간 흑색종 세포는 가장 높은 QPCTL 전사체 발현(약 7000 카피 / 50 ng 전체-RNA)을 나타낸 반면, 인간 연조직 육종 세포주는 가장 낮은 QPCTL 발현(365 카피 / 50 ng 전체-RNA)이 나타났다. 평균적으로 췌장암은 2100 카피를 보이고, 갑상선 암종은 3500 카피 및 위암은 4100카피를 나타낸다(도 29).
서로 다른 흑색종 세포에서 QPCTL의 발현
최근 흑색종 세포가 비교적 높은 QPCT 발현을 보인다는 사실이 보고 되고 있다(GiIMs, J. S., J. Transl. Med. 4 (2006), 4:27). 따라서, 다른 흑색종 세포주에서 QPCTL 발현을 분석하였다. 도 30에 나타낸 바와 같이, 테스트된 모든 흑색종 세포에서 QPCTL 발현이 검출되었다. 세포들 간의 변화는 Mel_ZL_11주에서 2025 카피 / 50 ng 전체-RNA에서부터 Mel_ZL12주에서 18043 카피 / 50 ng 전체-RNA까지 다양하였다.
Figure 112009023886404-PCT00053
더욱이, QPCT 및 QPCTL 발현은 종양-연관 항원(taa)의 발현에 관련이 있다. 흑색종-특이적 종양-연관 항원을 데이타 베이스를 추출 및 공지 결과에 의해 선별하였다. 다른 것들 간에, AIM1 및 AIM2 (absent in melanoma), MAGEA1 , -A2, -A10 및 MAGEB2 (melanoma antigen familiy A and B), MART1 (melanoma antigen recognized by T-cells), TYR (tyrosinase), TYRP1 및 TYRP2 (tyrosinase related protein), 및 MCL-1 (myeloid cell leukemia)은 흑색종에서 종양-연관 항원과 관련이 있다. SPSS 통계 소프트웨어(SPSS statistic software)를 사용하여 데이터를 비교하였다. QPCT와 MAGEB2 간의 관련성은 현저하였다(p = 0.0436). 더욱이, QPCT 및 MART1 (p = 0.002), QPCTL 및 MART1 (p = 0.008), 및 QPCT및 TYR (p = 0.0023)간의 관련성 또한 통계적으로 상당히 유의하게 나타났다. 상호 작용은 직접적 의존성을 나타내었고, 이는: QPCT/QPCTL 발현이 높아질수록, 종양-연관 항원의 발현이 높아짐을 의미한다. 유일한 예외는 TYR 및 MCL1간 관련성이며, 이는 간접적 의존성을 보인다.
서로 다른 종양 조직에서 QPCT 및 QPCTL의 발현
QPCT 및 QPCTL 발현을 연 조직 육종, 위암 및 갑상선 암의 종양 조직에서 측정하였다. QPCT의 가장 높은 발현은 위암과 연조직 육종에 따른 갑상선 암에서 발견되었다(표 11). 동일한 순서로 QPCTL 발현을 관찰하였으며, QPCTL 전사체의 카피 수는 Student's t-test (psoft tissues carcinoma = 0.001 ; pgastric carcinoma = 4.8E-7; pthyroid carcinoma = 0.04)에 의해 나타남으로서 QPCT 전사체에 대해 관찰된 것보다 항상 낮았다(표 11; 도 31).
Figure 112009023886404-PCT00054
더욱이 QPCT 및 QPCTL의 발현 수준에 관한 연구는 연 조직 육종(p = 2E-31) 및 위암 (p = 0.015)에서 Pearson에 의한 두 측면의 현저한 관련성이 나타났다. 갑상선 암(p = 0.46)에서 QPCT 및 QPCTL 발현 수준에 대해서 어떠한 관련성도 관찰되지 않았다.
위암 분화 단계에 의존적인 QPCTL 발현
위암에 대하여, 종양 분화의 다른 단계를 대표하는 샘플에서 QPCTL의 발현을 조사하였다. 대조군으로서 종양-주변 정상 조직이 제공되었다. 종양 조직과 정상 대조군의 비교는 종양 조직에서 현저히 높은 QPCTL 발현(p = 0.04)을 나타내었다.미분화된 위암은 정상 조직보다 낮은 QPCTL 발현을 나타낸다. 정상조직에 비교하여 평균적으로 분화된 위암을 완화시키기에 불충분 및 충분한 어떠한 차이점도 나타나지 않았다(도 32).
갑상선 암의 분화 단계에서 QPCT 및 QPCTL의 발현
갑상선 암의 분화 단계를 QPCT 및 QPCTL 발현과 관련하여 연구하였다. 여포상갑상선 암(follicular thyroid carcinoma, FTC), 유두 갑상선 암(papillary thyroid carcinoma, PTC) 및 미분화된 갑상선 암(undifferentiated thyroid carcinoma, UTC)으로, 세계 보건 기구(WHO)의 명명법에 따라 단계를 분류하였다. 갑상선 종(goiter)을 가진 환자로부터 얻은 샘플을 대조군으로 제공하였다.
분화된 갑상선 종 FTC(6700 카피 / 50 ng 전체-RNA) 및 PTC (16000 카피 / 50 ng 전체-RNA)에서 QPCT mRNA(평균) 수준은 비-종양 조직에서보다 (갑상선 종: 2100 카피 / 50 ng 전체-RNA) 더 높았다. UTC는 5400 카피 / 50 ng 전체-RNA를 보유하고 있고, 갑상선 종에서 관찰된 것 보다 2.5배 더 높다. QPCT의 mRNA 카피 수는 갑상선 종에서 보다 모든 갑상선 종양에서 현저히 높게 나타난다 (p = 0.04, Student's t- test)(도 33).
갑상선 암에서 QPCTL mRNA 수준은 균일하다. FTC (2600 카피 / 50 ng 전체-RNA)와 UTC (2500 카피 / 50 ng 전체-RNA)로부터의 샘플은 갑상선 종(2500 카피 / 50 ng 전체-RNA)에 와 유사하다. PTC에서 QPCTL 발현이 1900 copies / 50 ng total-RNA 로 약간 감소한다(도 34).
결론적으로, 갑상선 종에서 QPCT 및 QPCTL이 동일하게 발현된다. 그러나, 종양 조직에서 QPCTL 발현이 안정적으로 유지되는 반면, QPCT 발현은 증가하였다.
실시예 13 : 서로 다른 자극으로 배양 후 인간 세포주에서 QPCT 및 QPCTL 발현 조사
세포 주 및 배지
인간 배아 신장 세포주 HEK293, 인간 급성 단핵구성 백혈구 세포주 THP-1 및 여포 갑상선 암 세포주 FTC-133을 사용하여 자극 실험을 하였다. 세포를 37℃ 및 5 % CO2의 습한 대기에서, 적절한 배지(DMEM HEK293에 대해 10 % FBS, RPMI 1640, THP-1, 및 DMEM/F12에 대해 10 % FBS, FTC-133에 대해 10 % FBS)에 키웠다.
생물활성 펩티드, 화학물질 또는 LPS를 사용한 자극
HEK293 및 FTC-133 세포를 부착성 배양으로 배양하였고, THP-1 세포는 현탁액에서 배양했다. 자극 분석을 위해 FTC-133 및 HEK293 세포의 2x105 세포를 24 웰 플레이트에 옮겼다. HEK293의 경우, 적절한 부착을 확인하기 위해 플레이트를 콜라겐 I(collagen I)으로 코팅하였다. 추가로, THP-1의 2x106 세포를 24 웰 현탁 플레이트(suspension plates)에서 키웠다. 모든 자극 실험은 무-혈청 조건 하에서 실시하였다. FTC-133은 하룻밤 동안 키웠다. 그 다음, 세포를 또 다시 24 시간 동안 무-혈청 배지에 적응시켰고, 새로운 무-혈청 배지로 상기 조건 배지(conditioned media)를 대체시킴으로써 자극을 개시하였다. HEK293 세포를 하룻 밤동안 키우고, 24시간 이상 무-혈청인 조건하에서 HEK293을 배양하는 경우 형태적인 변화를 야기하므로 그 후 각 제제(respective agent)를 사용하여 무-혈청 조건에서 적응 없이 자극을 시작하였다. THP-1 세포를 각 제제와 함께 무-혈청 배지에 플레이팅하였다. 적용된 자극 및 최종 농도는 표 12에 나타나 있다.
Figure 112009023886404-PCT00055
세포를 24시간 동안 각 자극하여 배양하였다. 그 다음, 세포로부터 전체-RNA를 Nucleo-Spin® RNA Ⅱ Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 분리하였고, 정량 PCR 분석(qPCR assay)시까지 저장하였다.
저산소증을 이용한 자극
THP-1 , HEK293 및 FTC-133 세포를 각각 두 개의 25 cm2 조직 배양 플라스크에 플레이팅하였다. 그로부터, 음성 대조군으로 제공된 각 세포주 중 하나의 플라스크는, 24시간 동안 정상 성장 조건하에서 배양하였다. 다른 플라스크들은 혐기성 시약(anaerobic reagent (Anaerocult®P, Merck))과 지시약(indicator)을 함께 사용하여 혐기성 백(anaerobic bag)에 방치하였다. 상기 백(bag)의 공기 차단 상태를 확실히 하기 위해 밀봉하였다. 세포를 24시간 동안 키우고, 그 후, 전체-RNA를 Nucleo-Spin® RNA Ⅱ Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 분리하였으며 qPCR 분석시까지 저장하였다.
결과
HEK293, FTC-133 및 THP-1에서 QPCT 및 QPCTL의 기본적 발현
후속적인 자극 실험을 위해 준비된 상태에서 사용된 세포 주 HEK293, FTC-133 및 THP-1에서 기본적 발현을 측정하였다. QPCT 및 QPCTL 전사체의 카피 수를 표 13에 요약하였다.
Figure 112009023886404-PCT00056
QPCT 및 QPCTL의 발현상에서 선택된 자극의 영향
QPCT 및 QPCTL의 프로모터의 조절 결합 부위 및 그의 조절을 유도하는 신호 전달 경로는 현재까지 알려진 바 없다. 따라서, 다른 세포주 및 자극을 사용한 자극 실험을 수행하였다. HEK293 세포에서 QPCT mRNA 수준을 TNF-α, HGF 및 부티르 산(butyric acid)을 사용하여 자극함으로써 증가시켰다. 추가로 QPCT/QPCTL 기질로써 CCL2의 조절을 조사하였다. TNF-α 및 부티르 산은 HEK293에서 CCL2 전사체의 양을 증가시켰다. HGF는 CCL2 발현에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 반대로 QPCTL은 TNF-α, HGF 및 부티르 산에 의해 조절되지 않았다(도 35).
추가로 LPS 및 TGF-β를 사용하여 FTC-133을 자극시켰고, QPCT, QPCTL 및 CCL2의 조절을 관찰하였다. FTC-133, LPS 및 TGF-β에서 QPCT mRNA의 발현이 자극되지만, QPCTL 및 CCL2 발현을 유도하는 데는 실패하였다(도 36).
이러한 실험은 LPS (1 ㎍/㎖), LPS (10 ㎍/㎖), TGF-β 및 TNF-α를 사용한 THP-1 세포의 자극에 의해 더욱 확실해졌다. FTC-133 및 HEK293에 대해 관찰된 바와 같이, QPCT 발현은 다른 자극을 사용하여 유도될 수 있었다. 추가로, CCL2 발현을 LPS 및 TNF-α를 사용하여 유도하였다. 또한, QPCTL mRNA의 유도 또는 억제는 확인할 수 없었다(도 37).
결론적으로, 상기 실험은 QPCT가 다른 세포 주(LPS, TNF-α, HGF, 부티르산 및 다른 것들)에서 자극의 집합(set)에 의해 조절받을 수 있다는 사실을 나타낸다. 반대로, QPCTL은 QPCTL의 하우스-키핑 기능(house-keeping function)을 의미하는 테스트 자극에 의해 자극받거나 억제되지 않을 수 있다.
QPCT 자신의 기질의 발현상에서 선택된 자극의 영향
다수의 자극에 의해 유도된 QPCT 발현 때문에, QPCT 유도가 QPCT 기질 CCL2, CCL7, CCL8 및 CCL13의 유도와 함께 발생하는지에 대한 의문점이 생겼다. 따라서, LPS (1 ㎍/㎖), LPS (10 ㎍/㎖), TGF-β (100ng/㎖) 및 TNF-α (100 ng/㎖)를 사용한 자극을 각각 THP- 1 단핵구를 사용하여 수행하였다. THP-1은 기본적 수준의 모든 케모카인들을 발현하며, 음성 대조군으로 자극된 세포에 비하여 중요하다.
LPS 및 TNF-α는 THP-1 세포에서 모두 테스트된 케모카인 및 QPCT를 확실히 유도한다. TGF-β는 자극으로서 덜 효과적이었으며, QPCT, CCL2, CCL7 및 CCL8의 최고 2배의 발현을 유도하였다. CCL13은 TGF-β 자극에 의해 억제되었다(도 38).
저산소증(hypoxia)에 의한 QPCT 및 QPCTL 발현의 자극
QPCTL 발현은 화학 물질, 생물활성 펩티드 또는 LPS에 의해 조절 받을 수 없다. 따라서, 본 발명자는 QPCTL 발현이 저산소증에 의해 조절 받는지 여부를 실험하였다. 이는 도 39에 요약되어 있다. 저산소증은 QPCTL의 발현을 선택적으로 유도하지만 QPCT에 의해서는 그렇지 않다. 비교하면, 저산소증이 유도된 인자 1a(HIF 1a)에 의해 15 % (도 39A) 및 45 % (도 39C)로 나타났다. 상기 데이터는 저산소증에 QPCTL이 관련이 있다는 것을 의미한다.
억제제 합성
합성개요 1: 예 1-53, 96-102, 136-137의 합성
Figure 112009023886404-PCT00057
시약 및 조건: (a) NaH, DMF, 4h, 실온; (b) 8h, 100℃; (c) H2N-NH2, 에탄올(EtOH), 8h, 환류 후 4N HCl, 6h, 환류; (d) R3-NCO, EtOH, 6h, 환류; (e) 3,4-디메톡시-페닐-이소티오시안네니트(3,4 dimethoxy-phenyl-isothiocyanate)
합성개요 2: 예 54-95의 합성
Figure 112009023886404-PCT00058
시약 및 조건: (a) R-NCS, EtOH, 6h, 환류; (b) WSCD, 1H-이미다졸-1-프로판아민, DMF, 2h, 실온
합성개요 3: 예 103-105의 합성
Figure 112009023886404-PCT00059
시약 및 조건: (a) NaH, DMF, 실온., 3h; (b) LiAlH4, 디옥산(dioxane), 환류, 1h; (c) R-NCS, EtOH, 환류 6h,
합성개요 4: 예 106-109의 합성
Figure 112009023886404-PCT00060
시약 및 조건: (a) EtOH, 2 h, 환류
합성개요 5: 예 110-112의 합성
Figure 112009023886404-PCT00061
시약 및 조건: (a) 1H-이미다졸-1-프로판아민, 트리에틸아민, 톨루엔, 12h, 환류
합성개요 6: 예 113-132의 합성
Figure 112009023886404-PCT00062
시약 및 조건: (a) CAIBE, 1H-이미다졸-1-프로판아민, 디옥산, 0℃, 12h; (b) 로슨시약(Lawesson's Reagent), EtOH, 환류, 8h
합성개요 7: 예 133-135의 합성
Figure 112009023886404-PCT00063
시약 및 조건: (a) 1H-이미다졸-1-프로판 산성 염화물, CH2Cl2,-10℃., 1h; (b) 로슨시약, 디옥산, 환류, 8h
합성개요 8: 예 138의 합성
Figure 112009023886404-PCT00064
시약 및 조건: (a) EtOH, 환류, 8h
합성개요 9: 예 139의 합성
Figure 112009023886404-PCT00065
시약 및 조건: (a) 75% 농도, H2SO4, 4h
합성개요 10: 예 140의 합성
Figure 112009023886404-PCT00066
시약 및 조건: (a) 아세토니트릴, 환류, 2h
합성개요 11: 예 141의 합성
Figure 112009023886404-PCT00067
시약 및 조건: (a) NaH, DMF, 4h, 실온; (b) 8h, 100℃; (c) H2N-NH2, EtOH, 8h, 환류 후 4N HCl, 6h, 환류; (d) 3,4-디메톡시-페닐-이소티오시안네이트, EtOH, 6h, 환류
분석조건
ESI-질량 스펙트럼은 SCIEX API 365 분광광도계(Perkin Elmer)를 이용하여 얻었다. 용매로 DMSO-D6를 이용하여, BRUKER AC 500 상에 1H-NMR(500 MHz) 데이타를 기록하였다. 화학적 이동은 테트라메틸실란으로부터 백만 다운필드씩 부분(part)으로서 표현된다. 갈라짐 양식(splitting pattern)은 다음과 같이 표시하였다: s(단일선), d(이중선), dd(이중선의 이중선), t(삼중선), m(다중선), 및 br(넓은 신호).
합성의 세부사항
예 1-12 및 14-53
1H-이미다졸-1-프로판아민을 에탄올에서 이소티오시안네이트와 환류조건하에서 8시간 동안 반응시켰다. 용매를 제거한 후 남아있는 오일은 메틸렌 염화물에 용해하였다. 유기층은 NaHCO3의 포화용액으로 2회 세척하고 NaHSO4 및 식염수로 세척한 후 건조 증발시켰다. 생성된 고체를 에틸 아세테이트로부터 재결정화하여 80-98% 수율의 티오우레아를 수득하였다.
예 13
1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(3,4-디메톡시페닐)티오우레아
4.0 mmol의 3,4-디메톡시페닐 이소시안네이트와 4.0 mmol의 3-(1H-이미다졸-1-일)알킬-1-아민을 10 ㎖의 무수 에탄올에 용해하였다. 환류조건하에서 2시간 동안 교반한 후, 용매를 증발시키고 생성된 고체는 에탄올로부터 재결정화하였다.
수율: 0.66 g(51.3%); mp:160.0-161.0℃
1H NMR δ 1.8-2.0 (m, 2H), 3.4-3.5 (m, 2H), 3.75 (s, 6H), 3.9-4.0 (m, 2H), 6.7-6.8 (m, 1H), 6.9 (br m, 2H), 6.95 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.55 (br s, 1H), 7.6 (s, 1H), 9.3 (s, 1 H); MS m/z 321.2 (M+H), 253.3 (M-C3H3N2ㆍ)
예 96-102
1H-이미다졸-1-프로판아민을 이소티오시안네이트와 환류조건하에서 8시간 동안 에탄올에서 반응시켰다. 용매를 제거한 후 남아있는 오일은 메틸렌 염화물에 용해하였다. 유기층은 NaHCO3의 포화용액으로 2회 세척하고 NaHSO4 및 소금물로 세척한후 건조 증발시켰다. 생성된 고체를 에틸 아세테이트로부터 재결정화하여 85-90% 수율의 우레아를 수득하였다.
예 136, 137
1H-이미다졸-1-아킬아민을 문헌에 따라서 ω-브롬-알킬-프탈이미드 및 이미다졸 염으로부터 제조한 후 히드라진 분해를 실시하였다. 생성된 산물을 예 1-53에 따라 티오우레아로 변환시켰고, 이때의 수율은 각각 88%(예 136), 95%(예 137)였다.
예 54-95
모든 실시예에서 건조상태 디메틸 포름아미드에서 티오우레아를 WSCD(water-soluble-carbodiimide)와 1H-이미다졸-1-프로판아민과 반응시킴으로써 40-87% 수율의 삼중치환된 구아니딘을 수득하였다.
예 103-105
1 당량의 NaH을 이용하여 이미다졸을 브롬메틸페닐시아니드와 실온에서 3시간 동안 DMF에서 반응시켜 1H-이미다졸-1-메틸페닐시아니드를 수득하였다. 용매를 제거한 후 남아있는 오일을 디옥산에 용해하였다. 1 당량의 LiAlH4를 이용하여 시아니드를 아민에서 전환하였다. KHSO4의 포화용액을 첨가한 후, 디옥산을 증발시키고, 수층을 CHCl3을 이용하여 추출하였다. 유기층은 진공상태에서 농축하고 아민은 예 1-53에서 제조한 티오우레아에서 전환하였고, 이때의 수율은 각각 78%(예 103), 65%(예 104) 및 81%(예 105)였다.
예 106-109
메탄술포네이트-2-메틸프로필-프탈이미드(methansulfonate-2-methylpropyl-phthalimides)를 시작으로 하여 예 136-137에 기술된 아민 제조방법에 따라서 아민을 합성하였다. 생성된 산물을 예 1-53에 따라서 티오우레아로 변환시켜 25-30%의 총수율로 예 106-109의 화합물을 수득하였다.
예 110-112
1H-이미다졸-1-프로판아민을 2-클로로벤조[d]티아졸과 130℃에서 24시간 동안 톨루올에서 반응시켰다. 용매를 제거한 후 메탄올로부터 재결정화함으로써 예 110-112의 화합물을 55-65%의 양으로 수득하였다.
예 113-118, 120-124 및 126-132
0℃에서 1 당량의 CAIBE 및 N-메틸몰포린(N-methylmorpholine)을 첨가함으로써 1H-이미다졸-1-프로판아민을 2-페닐 아세트산과 무수 디옥산에서 반응시켰다. 2시간 후, 상기 혼합물의 온도를 실온까지 높인 후 12시간 동안 교반하였다. 용매를 제거한 후 남아있는 오일을 메틸렌 염화물에 다시 용해시키고, 유기층을 NaHCO3의 수용액 및 물을 이용하여 세척하고 건조한 후 용매를 증발시켰다. 남아있는 오일을 로슨시약이 첨가된 디옥산에 용해하였다. 12시간 동안 교반한 후, NaHCO3의 포화용액을 첨가하였다. 디옥산을 증발시킨 후, 수층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 분리한 후 건조한 후 용매를 증발시켰다. 생성된 고체를 아세틸 아세테이트/에테르로부터 결정화함으로써 62-85%의 총수율로 예 113-118, 120-124 및 126-132의 화합물을 수득하였다.
예 119
N-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-2-(3,4-디메톡시페닐)에탄티오아미드
30 ㎖의 디옥산에 용해되어 있는 4.0 mmol의 2-(3,4-디메톡시페닐)아세틸 클로리드(chloride)를 얼음 위에서 냉각하고 교반한 후 여기에 20 ㎖의 디옥산에 용해된 4.0 mmol의 트리에틸아민과 4.0 mmol의 3-(1H-이미다졸-1-일)알킬-1-아민을 한 방울씩 첨가하였다. 상기 혼합물의 온도를 실온까지 높인 후 1시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거한 후, 잔존물을 50 ㎖의 디클로로메탄에 다시 용해하였다. 유기층을 30 ㎖의 NaHCO3의 포화수용액 및 물로 세척하였다. 유기용액을 건조, 여과시키고, 용매를 감압하에서 제거하였다. 50 ㎖의 건조상태의 디옥산에 2.2 mmol의 로슨시약을 용해시킨 후, 이 혼합물의 온도를 90℃까지 올린 후 8시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거한 후, 잔존물을 50 ㎖의 디클로로메탄에 다시 용해하였다. 유기층을 NaHCO3의 포화수용액으로 3회, 물로 3회 세척하고 건조, 여과한 후 유기용매를 제거하였다. 화합물은 층 두께가 2 mm인 실리카 플레이트와 용출시스템으로서 CHCl3/MeOH 구배를 이용하는 원심력 크로마토그래피 장치(Harrison Research사)를 이용한 크로마토그래피에 의해서 정제하였다.
수율: 0.14 g(10.6 %); 녹는점: 148.0-150.0℃
1H NMR δ 2.0-2.15 (br m, 2H), 3.4-3.5 (m, 2H), 3.7 (s, 6H), 6.75-6.8 (m, 2H), 4.1-4.2 (m, 2H), 6.8-6.9 (m, 2H), 6.95-7.0 (m, 1H), 7.4 (s, 1H), 7.75-7.85 (br m, 1H), 8.6 (s, 1H), 10.2 (s, 1H); MS m/z 320.2 (M+H), 252.2 (M-C3H3N2ㆍ)
예 125
N-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-1-(3,4-디메톡시페닐)사이클로프로판카르보티오아미드
11.06 mmol 3, 4-디메톡시페닐 아세토니트릴, 34.8 mmol의 2-브로모-1-클로로에탄올 및 1.16 mmol의 트리에틸벤질아모늄 하이드로클로라이드를 10 ㎖의 KOH 수용액(60%)에 용해하였다. 이 혼합물을 초음파 처리용기(ultrasonic bath)로 이동시킨 후 상온에서 3시간 동안 심하게 교반하였다. 생성된 현탁액을 40 ㎖의 물로 희석한 후 20 ㎖의 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 결합된 유기층을 염화 수소산 수용액(1N)으로 세척하고, Na2SO4로 건조하였고, 감압하에서 용매를 제거하였다. 남아있는 오일을 용출 시스템으로서 실리카 겔 및 에틸 아세테이트/헵탄을 사용한 플래쉬-크로마토그래피에 의해서 정제함으로써 0.81 g(34.4 %)의 1-(3,4-디메톡시페닐)사이클로프로판카르보니트릴을 수득하였다.
3.9 mmol의 1-(3,4-디메톡시페닐)사이클로프로판카르보니트릴 및 11.2 mmol의 KOH를 80 ㎖의 에틸렌 글리콜에 현탁하였다. 이 혼합물을 환류조건하에서 12시간 동안 교반하였다. 80 ㎖의 물을 첨가하고, 수용액 층을 에테르로 2회 추출하였다. HCl (1 N)을 이용하여 pH 4-5로 맞춘 후, 수층을 에테르로 3회 추출하고, 결합된 유기층을 Na2SO4에서 건조하여 용매를 제거함으로써 0.81 g(93.5%)의 1-(3,4-디메톡시페닐)사이클로프로판카르복실산을 수득하였다.
3.44 mmol의 1-(3,4-디메톡시페닐)사이클로프로판카르복실산, 3.5 mmol의 N- 메틸 몰핀, 및 3.5 mmol의 이소부틸 클로로포르미아트를 건조상태의 테트라히드로퓨란에 용해하여 -15℃에서 15분 동안 교반하였다. 3.5 mmol의 3-(1H-이미다졸-1-일)알킬-1-아민을 첨가한 후, 이 혼합물의 온도를 0℃까지 높인 후 12시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거한 후, 남아있는 오일을 클로로포름에 다시 용해하였다. 유기층을 NaHCO3의 포화수용액으로 2회 세척한 후, Na2SO4에서 건조하고 용매를 제거하였다. 화합물은 2 mm의 층 두께 실리카 플레이트를 사용한 chromatotron® 장치(Harrison Research사), 및 용출시스템으로서 CHCl3/MeOH 농도 구배를 이용한 원심력 크로마토그래피에 의해서 정제함으로써 0.671 g(59.3%)의 N- (3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-1-(3,4-디메톡시페닐)사이클로판-카르복사미드를 수득하였다.
30 ㎖의 건조상태의 디옥산에 1.43 mmol의 로슨시약을 용해시킨 후, 이 혼합물의 온도를 90℃까지 올린 후 8시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거한 후, 잔여물을℃ 50 ㎖의 디클로로메탄에 용해하였다. 유기층을 NaHCO3의 포화수용액으로 3회, 물로 3회 세척하고 건조, 여과한 후 유기용매를 제거하였다. 화합물은 2 mm 층 두께 실리카 플레이트를 사용한 원심력 크로마토그래피 장치(Harrison Research사) 및 용출시스템으로서 CHCl3/MeOH 농도 구배를 이용한 크로마토그래피로 정제하였다.
수율: 0.33 g(46.2 %); 녹는점: 127.0-127.5℃
1H NMR δ 1.1-1.2 (t, 2H), 1.55-1.6 (t, 2H), 2.0-2.1 (m, 2H), 3.5-3.6 (m, 2H), 3.7- 3.8 (s, 6H), 4.1-4.2 (t, 2H), 6.8-6.9 (m, 3H), 7.65 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 8.8 (m, 1H), 9.05 (s, 1H; MS m/z 346.0 (M+H), 278.2 (M-C3H3N2ㆍ), 177.1 (M-C6H8N3Sㆍ)
예 133-135
0℃에서 디옥산에 용해되어 있는 1 당량의 트리에틸아민 및 3,4-디메톡시아닐린의 혼합물을 ω-브로모알킬 산성 염소의 교반 용액에 첨가하였다. 이 용액의 온도를 실온까지 높인 후 2시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 남아있는 오일을 디클로로메탄에 다시 용해하였다. 유기층을 물로 세척하고, 건조, 여과한 후, 용매를 감압하에서 제거하였다.
이미다졸 및 수소화나트륨을 현탁시키고, 이 혼합물을 비활성 조건하의 실온에서 3시간 동안 교반하였다. ω-브로모-N-(3,4-디메톡시-페닐)알킬아미드를 첨가하고, 이 혼합물의 온도를 100℃까지 가열한 후 8시간 동안 교반하였다. 그 후, 용매를 증발시키고, 뜨거운 톨루엔을 첨가시킨 후, 상기 용액을 여과하였다. 그 뒤, 용매를 감압하에서 제거하였다. 티오아미드로의 변환을 로슨시약을 이용하여 예 113-132에서 기술한 바와 같이 수행함으로써 13-20%의 총수율로 예 133-135의 화합물을 수득하였다.
상기에서 기술한 일반적일 합성개요에 따라서 합성한, 추가적 예에 대한 분석데이타는 다음과 같다.
예 1: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-메틸티오우레아
녹는점: 122-122.5℃
1H NMR δ 1.85-1.95 (m, 2H), 2.8 (s, 3H), 3.2-3.5 (br d, 2H), 3.8-3.9 (m, 2H), 6.85 (d, 1H), 7.15 (d, 1H), 7.3-7.5 (br d, 2H), 7.65 (s, 1H); MS m/z 199.1 (M+H), 221.3 (M+Na), 131.0 (M-C3H3N2ㆍ)
예 2: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-tert-부틸티오우레아
녹는점: 147.0-147.5℃
1H NMR δ 1.3-1.4 (s, 9H), 1.85-1.95 (m, 2H), 3.5 (t, 2H), 3.8 (t, 2H), 6.85 (d, 1H), 7.15 (d, 1H), 7.3-7.5 (br d, 2H), 7.65 (s, 1H); MS m/z 241.1 (M+H), 173.1 (M-C3H3N2ㆍ)
예 3: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-벤질티오우레아
녹는점: 127.0-128.0℃
1H NMR δ 1.85-1.95 (m, 2H), 3.2-3.5 (br d, 2H), 3.8-3.9 (m, 2H), 4.6 (s, 2H), 6.8 (d, 1H), 7.15 (d, 1H), 7.19-7.35 (m, 5H), 7.5-7.6 (br d, 2H), 7.85 (s, 1H); MS m/z 275.3 (M+H), 207.1 (M-C3H3N2ㆍ)
예 5: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-페닐티오우레아
녹는점: 166.5-167.0℃
1H NMR δ 1.95-2.05 (m, 2H), 3.3-3.5 (br d, 2H), 3.9-4.0 (m, 2H), 6.85 (d, 1H), 7.05 (m, 1H) 7.15 (d, 1H), 7.25 (m, 2H), 7.35 (m, 2H), 7.6 (s, 1H), 7.8 (br s, 1H), 9.5 (br s, 1H); MS m/z 261. 1 (M+H), 193.2 (M-C3H3N2ㆍ)
예 6: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(4-플루오로페닐)티오우레아
녹는점: 147.0-148.0℃
1H NMR δ 1.95-2.05 (m, 2H), 3.3-3.5 (br d, 2H), 3.9-4.05 (m, 2H), 6.85 (d, 1H), 7.05-7.15 (m, 3H), 7.3-7.4 (m, 2H), 7.6 (s, 1H), 7.7-7.8 (br s, 1H), 9.4 (br s, 1 H); MS m/z 279.3 (M+H), 211.2 (M-C3H3N2ㆍ)
예 7: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(4-에틸페닐)티오우레아
녹는점: 100.0-100.5℃
1H NMR δ 1.15-1.2 (t, 3H), 1.9-2.0 (m, 2H), 2.5-2.6 (m, 2H), 3.3-3.5 (br d, 2H), 3.9-4.05 (m, 2H), 6.85 (d, 1H), 7.1-7.2 (m, 3H), 7.25-7.3 (m, 2H), 7.6 (s, 1H), 7.7-7.8 (br s, 1H), 9.4 (br s, 1 H); MS m/z 289.3 (M+H), 221.1 (M-C3H3N2ㆍ)
예 8: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(4-(트리플루오로메틸)페닐)티오우레아
녹는점: 154.5-155.0℃
1H NMR δ 1.9-2.1 (br m, 2H), 3.4-3.6 (br d, 2H), 3.95-4.1 (br m, 2H), 6.85 (d, 1H), 7.2 (d, 1H), 7.6-7.8 (m, 5H), 8.2 (br s, 1H), 9.9 (br s, 1H); MS m/z 329.3 (M+H), 261.2 (M-C3H3N2ㆍ)
예 10: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(4-아세틸페닐)티오우레아
녹는점: 170.0-171.0℃
1H NMR δ 1.9-2.1 (br m, 2H), 2.4-2.5 (s, 3H), 3.2-3.5 (br m, 2H), 3.9-4.1 (m, 2H), 6.85 (d, 1H), 7.15 (d, 1H), 7.5-7.65 (br m, 3H), 7.8-7.9 (m, 2H), 8.1 (m, 2H), 9.8 (br s, 1 H); MS m/z 303.2 (M+H), 235.1 (M-C3H3N2ㆍ)
예 11: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(4-메톡시페닐)티오우레아
녹는점: 125.0-125.5℃
1H NMR δ 1.8-2.0 (br m, 2H), 3.2-3.5 (br m, 2H), 3.7 (s, 3H), 3.9-4.0 (m, 2H), 6.7-6.9 (m, 3H), 7.1-7.2 (m, 3H), 7.5 (s, 1H), 7.6 (s, 1H), 9.2 (s, 1H); MS m/z 291.1 (M+H), 223.2 (M-C3H3N2ㆍ)
예 14: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(2,4-디메톡시페닐)티오우레아
녹는점: 120.0-120.5℃
1H NMR δ 1.8-2.0 (br m, 2H), 3.4-3.5 (br m, 2H), 3.75 (s, 6H), 3.9-4. 0 (m, 2H), 6.5 (d, 1H), 6.6 (s, 1H), 6.9 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.3 (d, 1H), 7.5 (br s, 1H), 7.6 (s, 1H), 9.75 (s, 1 H); MS m/z 321.2 (M+H), 253.3 (M-C3H3N2ㆍ)
예 15: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(3,5-디메톡시페닐)티오우레아
녹는점: 142.0-143.0℃
1H NMR δ 1.8-2.0 (br m, 2H), 3.4-3.5 (br m, 2H), 3.6 (s, 6H), 3.95-4. 0 (m, 2H), 6.25 (m, 1H), 6.6 (m, 2H), 6.9 (s, 1H), 7.2 (s, 1H), 7.6 (s, 1H), 7.8 (s, 1H), 9.5 (s, 1H); MS m/z 321.2 (M+H), 253.3 (M-C3H3N2ㆍ)
예 23: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(2,3-디히드로벤조[b][1,4]디옥신-7-일)-티오우레아
녹는점: 103.0-103.5℃
1H NMR δ 1.9-2.0 (br m, 2H), 3.3-3.5 (br d, 2H), 3.9-4.0 (m, 2H), 4.2-4.3 (m, 4H), 6.7 (m, 1H), 6.8-6.8 (m, 1H), 6.9 (m, 2H), 7.2 (s, 1H), 7.6 (m, 2H), 9.3 (s, 1H); MS m/z 319.3 (M+H), 251.3 (M-C3H3N2ㆍ)
예 24: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(벤조[d][1,3]디옥솔-6-일)티오우레아
녹는점: 115.0-115.6℃
1H NMR δ 1.9-2.1 (br m, 2H), 3.4-3.5 (br d, 2H), 4.05-4.15 (m, 2H), 6.0 (s, 2H), 6.7 (m, 1 H), 6.8-6.85 (m, 1 H), 6.95 (d, 1 H), 7.25 (s, 1 H), 7.45 (s, 1 H), 7.7 (br s, 1 H), 8.5 (br s, 1 H), 9.4 (br s, 1 H); MS m/z 305.2 (M+H), 237.2 (M-C3H3N2ㆍ)
예 25: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(3,4,5-트리메톡시페닐)티오우레아
녹는점: 124.5-125.5℃
1H NMR δ 1.8-2.0 (m, 2H), 3.4-3.5 (br m, 2H), 3.6 (s, 3H), 3.7 (s, 6H), 3.9-4.0 (m, 2H), 6.65 (m, 2H), 6.85 (s, 1 H), 7.2 (s, 1 H), 7.6 (s, 1 H), 7.7 (br s, 1 H), 9.4 (s, 1 H); MS m/z 351.3 (M+H), 283.2 (M-C3H3N2ㆍ)
예 26: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(3-메톡시페닐)티오우레아
녹는점: 89.5-90.0℃
1H NMR δ 1.9-2.1 (br m, 2H), 3.4-3.5 (br m, 2H), 3.7 (s, 3H), 3.9-4.0 (m, 2H), 6.6-6.7 (m, 1H), 6.8-6.9 (m, 2H), 7.1 (m, 2H), 7.15-7.25 (br m, 1H), 7.6 (s, 1H), 7.8 (br s, 1 H), 9.5 (s, 1 H); MS m/z 291.1 (M+H), 223.2 (M-C3H3N2ㆍ)
예 27: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(4-에톡시페닐)티오우레아
녹는점: 126.0-126.5℃
1H NMR δ 1.5 (br m, 3H), 1.9-2.0 (br m, 2H), 3.4-3.5 (br m, 2H), 3.9-4.0 (br m, 4H), 6.8-6.9 (m, 2H), 6.95 (s, 1H), 7.15-7.2 (m, 2H), 7.25 (s, 1H), 7.55-7.6 (br s, 1 H), 7.8 (s, 1 H), 9.3 (s, 1 H); MS m/z 305.2 (M+H), 237.2 (M-C3H3N2ㆍ)
예 33: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(4-(메틸티오)페닐)티오우레아
녹는점: 140.0-140.5℃
1H NMR δ 1.8-2.05 (br m, 2H), 2.5 (s, 3H), 3.3-3.5 (br m, 2H), 3.9-4. 1 (m, 2H), 6.9 (m, 1H), 7.1-7.3 (br m, 5H), 7.6 (s, 1H), 7.75 (br s, 1 H), 9.4 (s, 1H); MS m/z 307.2 (M+H), 239.2 (M-C3H3N2ㆍ)
예 42: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(4-니트로페닐)티오우레아
녹는점: 165.0-166.0℃
1H NMR δ 1.9-2.05 (m, 2H), 3.3-3.5 (br d, 2H), 3.95-4.05 (m, 2H), 6.85 (d, 1H), 7.15 (d, 1H), 7.6 (d, 1H), 7.7 (m, 2H), 8.1 (m, 2H), 8.3 (brs, 1H), 10.1 (brs, 1H); MS m/z 306.2 (M+H), 237.9 (M-C3H3N2ㆍ)
예 50: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(4-(디메틸아미노)페닐)티오우레아
녹는점: 146.5-147.0℃
1H NMR δ 1.9-2.0 (m, 2H), 2.9 (s, 6H), 3.4 (m, 2H), 3.9-4.0 (m, 2H), 6.7 (m, 2H), 6.9 (s, 1H), 7.05-7.1 (m, 2H), 7.15 (s, 1H), 7.4 (brs, 1H), 7.6 (s, 1H), 9.2 (s, 1H); MS m/z 304.2 (M+H), 236.0 (M-C3H3N2ㆍ)
예 102: 1-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-3-(3,4-디메톡시페닐)우레아
녹는점: 114.5-115.0℃
1H NMR δ 1.7-1.9 (m, 2H), 2.9-3.1 (m, 2H), 3.7 (2s, 6H), 3.9-4.0 (m, 2H), 6.1 (t, 1H), 6.7 (s, 2H), 6.8 (s, 1H), 7.15 (d, 2H), 7.6 (s, 1H), 8.2 (s, 1H); MS m/z 321.2 (M+H), 253.3 (M-C3H3N2ㆍ)
예 106: 1-((S)-3-(1H-이미다졸-1-일)-2-메틸프로필)-3-(3,4-디메톡시페닐)티오우레아
녹는점: 150.5-151.5℃
1H NMR δ 0.9 (d, 3H), 2.3-2.4 (m, 2H), 2.5 (s, 1H), 3.7 (d, 6H), 4.0-4.1 (br m, 1H), 4.15-4.25 (br m, 1H), 6.75-6.8 (m, 1H), 6.85 (m, 1H), 6.9-7. 0 (m, 1H), 7.65 (s, 1 H), 7.75 (s, 2H), 9.1 (s, 1H), 9.5 (s, 1H); MS m/z 335.6 (M+H), 267.1 (M-C3H3N2ㆍ)
예 107: 1-((R)-3-(1H-이미다졸-1-일)-2-메틸프로필)-3-(3,4-디메톡시페닐)티오우레아
녹는점: 155.0-157.5℃
1H NMR δ 0.9 (d, 3H), 2.3-2.4 (m, 2H), 2.5 (s, 1H), 3.7 (d, 6H), 4.0-4.1 (br m, 1H), 4.15-4.25 (br m, 1H), 6.75-6.8 (m, 1H), 6.85 (m, 1H), 6.9-7. 0 (m, 1H), 7.65 (s, 1 H), 7.75 (s, 2H), 9.1 (s, 1 H), 9.5 (s, 1 H); MS m/z 335.4 (M+H), 267.2 (M-C3H3N2ㆍ)
예 109: 1-((1-((1H-이미다졸-1-일)메틸)사이클로프로필)메틸)-3-(3,4-디메톡시페닐)티오우레아
녹는점: 166.5-168.5℃
1H NMR δ 0.7-0.8 (br m, 2H), 1.85-1.9 (m, 1H), 2.15-2.2 (m, 1H), 2.2-2.3 (m, 1 H), 3.4-3.5 (m, 1 H), 3.7 (d, 6H), 4.2 (s, 1 H), 4.95 (s, 1 H), 6.75-6.8 (br m, 1 H), 6.85-6.9 (br m, 1H), 7.0 (s, 1H), 7.5 (m, 1H), 7.6 (m, 1H), 7.7 (s, 0.5H), 7.8 (s, 0.5H), 8.85 (s, 0.5 H), 9.1 (s, 0.5H), 9.35 (s, 0.5H), 9.45 (s, 0.5H); MS m/z 347.2 (M+H), 279.2 (M-C3H3N2ㆍ), 137.5 (M-C9H13N4Sㆍ)
예 110: N-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)벤조[d]티아졸-2-아민
1H NMR δ 1.95-2.15 (m, 2H), 3.25-3.35 (m, 2H), 4.0-4.1 (t, 2H), 6.9 (s, 1H), 6.95-7.05 (t, 1H), 7.15-7.2 (m, 2H), 7.35-7.4 (d, 1H), 7.60-7.70 (m, 2H), 8.0-8.1 (br s, 1 H); MS m/z 259.4 (M+H), 191.3 (M-C3H3N2ㆍ)
예 111: N-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-6-클로로벤조[d]티아졸-2-아민
1H NMR δ 1.95-2.15 (m, 2H), 3.25-3.35 (m, 2H), 4.0-4.1 (t, 2H), 6.9 (s, 1H), 7.1-7.2 (d, 2H), 7.3-7.4 (d, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.8 (s, 1H), 8.2 (s, 1H); MS m/z 293.3 (M+H), 225.3 (M-C3H3N2ㆍ)
예 112: N-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-6-메톡시벤조[d]티아졸-2-아민
1H NMR δ 1.9-2.05 (m, 2H), 3.2-3.3 (m, 2H), 3.7 (s, 3H), 4.0-4.1 (t, 2H), 6.7-6.8 (d, 1H), 6.9 (s, 1H), 7.15-7.2 (s, 1 H), 7.2-7.3 (m, 2H), 7.65 (s, 1H), 7.8 (s, 1H); MS m/z 289.1 (M+H), 221.4 (M-C3H3N2ㆍ)
예 115: (R)-N-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-2-페닐프로판티오아미드
녹는점: 82.0-82.5℃
1H NMR δ 1.4-1.55 (d, 3H), 1.9-2.0 (m, 2H), 3.4-3.5 (m, 2H), 3.85-3. 95 (m, 2H), 4.0-4.1 (q, 1H), 6.8-6.9 (s, 1H), 7.1 (s, 1H), 7.15-7.2 (m, 1H), 7.2-7.3 (m, 2H), 7.35-7.4 (m, 2H), 7.55 (s, 1H), 10.1 (s, 1H); MS m/z 274.4 (M+H), 206.3 (M-C3H3N2ㆍ)
예 116: (S)-N-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-2-페닐프로판티오아미드
녹는점: 82.5-83.5℃
1H NMR δ 1.4-1.55 (d, 3H), 1.9-2.0 (m, 2H), 3.4-3.5 (m, 2H), 3.85-3. 95 (m, 2H), 4.0-4.1 (q, 1H), 6.8-6.9 (s, 1H), 7.1 (s, 1H), 7.15-7.2 (m, 1H), 7.2-7.3 (m, 2H), 7.35-7.4 (m, 2H), 7.55 (s, 1H), 10.1 (s, 1H); MS m/z 274.4 (M+H), 206.3 (M-C3H3N2ㆍ)
예 121: N-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-1-(4-클로로페닐)사이클로부탄카르보티오아미드
녹는점: 137.5-139.0℃
1H NMR δ 1.55-1.75 (br m, 2H), 1.85-1.95 (br m, 2H), 2.4-2.5 (br m, 2H), 2.7-2.85 (br m, 2H), 3.3-3.5 (br m, 2H), 3.8 (m, 2H), 6.9 (s, 1 H), 7.0 (s, 1 H), 7.3 (m, 2H), 7.45 (s, 1H), 7.5 (m, 2H), 9.6 (t, 1H); MS m/z 334.3 (M+H), 266.1 (M-C3H3N2ㆍ)
예 122: N-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-1-(4-클로로페닐)사이클로펜탄카르보티오아미드
녹는점: 140.0-141.0℃
1H NMR δ 1.5-1.65 (br m, 4H), 1.8-1.9 (m, 2H), 2.0-2.1 (m, 2H), 2.6 (m, 2H), 3.4-3.5 (m, 2H), 3.7-3.8 (m, 2H), 6.85 (s, 1 H), 7.0 (s, 1H), 7.35 (m, 2H), 7.4 (m, 2H), 7.5 (s, 1 H), 9.4 (t, 1H); MS m/z 348.2 (M+H), 280.2 (M-C3H3N2ㆍ)
예 123: N-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-1-(4-메톡시페닐)사이클로헥산카르보티오아미드
녹는점: 162.5-164.0℃
1H NMR δ 1.2-1.3 (m, 1H), 1.35-1.5 (br m, 5H), 1.85-2.0 (br m, 4H), 2.4-2.6 (br m, 2H), 3.4-3.5 (m, 2H), 3.7 (s, 3H), 3.8 (m, 2H), 6.8 (m, 3H), 7.0 (s, 1H), 7.3 (m, 2H), 7.5 (s, 1 H), 9.2 (t, 1 H); MS m/z 358.3 (M+H), 290.3 (M-C3H3N2ㆍ)
예 124: N-(3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)-1-(4-메톡시페닐)사이클로프로판카르보티오아미드
녹는점: 129.0-129.5℃
1H NMR δ 1.0-1.1 (m, 2H), 1.5-1.6 (m, 2H), 1.9-2.0 (br m, 2H), 3.4-3. 5 (m, 2H), 3.7 (s, 3H), 3.9 (m, 2H), 6.9 (m, 3H), 7.1 (s, 1H), 7.2-7.3 (m, 2H), 7.6 (s, 1H), 8.9 (br s, 1H); MS m/z 316.0 (M+H), 248.4 (M-C3H3N2ㆍ)
예 134: 5-(1H-이미다졸-1-일)-N-(3,4-디메톡시페닐)펜탄티오아미드
녹는점: 128.0-128.5℃
1H NMR δ 1.65-1.70 (m, 2H), 1.75-1.80 (m, 2H), 2.7-2.75 (m, 2H), 3.7 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 4.0-4.05 (t, 2H), 6.9-7.0 (m, 2H), 7.2 (s, 1H), 7.3 (d, 1H), 7.5 (s, 1H), 7.75 (s, 1 H), 11.0 (s, 1 H); MS m/z 320.2 (M+H), 252.2 (M-C3H3N2ㆍ)
예 136: 1-(2-(1H-이미다졸-1-일)-3-(3,4-디메톡시페닐)티오우레아
녹는점: 157.5-159.0℃
1H NMR δ 3.7 (2 s, 6H), 3.8 (m, 2H), 4.2 (m, 2H), 6.7 (m, 1H), 6.85 (m, 1H), 6.9 (m, 2H), 7.15 (s, 1H), 7.5 (br s, 1H), 7.6 (s, 1H), 9.5 (s, 1H); MS m/z 307.2 (M+H), 239.1 (M-C3H3N2ㆍ)
약자
℃ 섭씨 온도
A, A1a 알라닌
Aβ 아밀로이드-베타 펩티드
ABri 가족성 브리티시 치매(Familial British Dementia)에 있는 아밀로이드 펩티드
AC 아데닐일 사이클라제
ADan 가족성 대니시 치매(Familial Danish Dementia)에 있는 아밀로이드 펩티드
AIM 흑색종에 부재
AMC 안티센스로서 아미노 메틸 쿠마린
Asp 아스파르트산
βNA 베타-나프틸아민
BA 부티르 산
bp 염기 쌍
BSA 소 혈청 알부민
C 시스테인
CAT 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제
cAMP 사이클릭 아데노신 모노포스페이트
CCL2 MCP-1, 단핵세포 유도 단백 1
CCL7 MCP-3, 단핵세포 유도 단백 3
CCL8 MCP-2, 단핵세포 유도 단백 2
CCL13 MCP-4, 단핵세포 유도 단백 4
cDNA 복제-DNA
C-His C-말단 히스티딘 태그
CIDP 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증
Cl 염소
CSF 뇌척수액(liquor cerebrospinalis)
C-terminus 카르복시-말단
CTL 세포 독성 T-림프구
CV 컬럼 부피
d 직경
Da 돌턴
DMSO 디메틸 설폭사이드
DNA 디옥시리보핵산
E 효소
EBV 엡스테인 바 바이러스
ECL 장크롬친화성-유사
E. coli 대장균
EC 글루타밀 사이클라제
ED 유효량
EGFP 강화된 녹색 형광 단백질
ES 효소-기질 복합체
FPP 수정 촉진 펩티드
FTC 소포성 갑상샘 암종
g 상대 원심력
GBS 길랑-바레 증후군
GF 겔 여과(gel filtration)
GIn 글루타민(glutamine)
Glu 글루탐산(glutamic acid)
GnRH 성선자극호르몬-릴리징 호르몬
GST 글루타티온 S-트랜스퍼라제
H 수소
h 인간, 시간
HGF 간 세포 성장인자
HIC 소수성 상호작용 크로마토그래피
HIF1a 저산소증 유도성 인자 1a
His 히스티딘
HPLC 고성능액체크로마토그래피
I 억제제, 이소루신
ID 동정
IMAC 고정화 금속 친화성 크로마토그래피
IPTG 이소프로필-베타-디-티오갈락토피로노시드
K 칼륨
k 상수
kDA 킬로-달톤
ki 저해 상수
KLH 키홀 림팻 헤모시아닌
l 길이
LB 루리아-버타니
LD 치사량(lethal dose)
LPS 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)
M 몰의
㎕ 마이크로-리터
μM 마이크로-몰
MAGEA 흑색종 항원 패밀리 A
MAGEB 흑색종 항원 패밀리 B
Maldi-tof 매트릭스 지원 레이저 이탈/비행 시간형 이온화
MART1 T-세포 1에 의해 인식된 흑색종 항원
max 최고치
MCL-1 골수성 백혈병 1
Met 메티오닌
min 분
mM 밀리-몰
MS 다발성 경화증
mRNA 전령-RNA
N 아스파라긴
Na 나트륨
NADH 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드
nm 나노미터
NO 숫자
NT 뉴로텐신
N-terminus 아미노-말단
O 산소
OD 광학 밀도
P 생성물, 인광체
PBS 인산염생리식염완충액
PCR 중합효소 연쇄 반응
pGlu 피로글루타믹 산
PH 수소 중량
Pro 프로린
PTC 유두갑상샘암종
Pyr 피로글루타메이트
QC 글루타미닐 사이클라제(glutaminyl-peptide cyclotransferase)
qPCR 정량 실시간 중합효소 연쇄반응
QPCTL 글루타미닐-펩티드 사이클로프랜스퍼라제-유사
RNA 리보뉴클레익 산
RT 역전사; 역전사 효소
S 기질
s 센스
SAGE 유전자 발현 직렬분석
SDS 소디움 도데실 설페이트
SDS-PAGE SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동
SGAP 스트랩토마이세스 그리제우스 아미노 펩티다제
SEQ 서열
SNP 단일 염기 다형성
taa 종양-연관 항원
TGF-β 전환 성장 인자 베타
TNF-α 종양 괴사 인자 알파
TRH 타이레오트로핀-릴리징 호르몬 (thyreoliberin)
TSH 갑상선-자극 호르몬
TYR 티로시나제
TYRP 티로시나제 연관 단백질
U 단위
UTC 미분화 갑상선 종양
UV 자외선
V 속도
VpAP 비브리오 프로테오리틱 아미노 펩티다제
YSS 효모 신호 서열
Zn 아연
<110> Probiodrug AG <120> Novel Genes Related to Glutaminyl Cyclase <130> IPA090062 <150> US 60/846,244 <151> 2006-09-21 <150> US 60/947,780 <151> 2007-07-03 <160> 121 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1086 <212> DNA <213> human <400> 1 atggcaggcg gaagacaccg gcgcgtcgtg ggcaccctcc acctgctgct gctggtggcc 60 gccctgccct gggcatccag gggggtcagt ccgagtgcct cagcctggcc agaggagaag 120 aattaccacc agccagccat tttgaattca tcggctcttc ggcaaattgc agaaggcacc 180 agtatctctg aaatgtggca aaatgactta cagccattgc tgatagagcg atacccggga 240 tcccctggaa gctatgctgc tcgtcagcac atcatgcagc gaattcagag gcttcaggct 300 gactgggtct tggaaataga caccttcttg agtcagacac cctatgggta ccggtctttc 360 tcaaatatca tcagcaccct caatcccact gctaaacgac atttggtcct cgcctgccac 420 tatgactcca agtatttttc ccactggaac aacagagtgt ttgtaggagc cactgattca 480 gccgtgccat gtgcaatgat gttggaactt gctcgtgcct tagacaagaa actcctttcc 540 ttaaagactg tttcagactc caagccagat ttgtcactcc agctgatctt ctttgatggt 600 gaagaggctt ttcttcactg gtctcctcaa gattctctct atgggtctcg acacttagct 660 gcaaagatgg catcgacccc gcacccacct ggagcgagag gcaccagcca actgcatggc 720 atggatttat tggtcttatt ggatttgatt ggagctccaa acccaacgtt tcccaatttt 780 tttccaaact cagccaggtg gttcgaaaga cttcaagcaa ttgaacatga acttcatgaa 840 ttgggtttgc tcaaggatca ctctttggag gggcggtatt tccagaatta cagttatgga 900 ggtgtgattc aggatgacca tattccattt ttaagaagag gtgttccagt tctgcatctg 960 ataccgtctc ctttccctga agtctggcac accatggatg acaatgaaga aaatttggat 1020 gaatcaacca ttgacaatct aaacaaaatc ctacaagtct ttgtgttgga atatcttcat 1080 ttgtaa 1086 <210> 2 <211> 1149 <212> DNA <213> human <400> 2 atgcgttccg ggggccgcgg gcgaccccgc ctgcggctgg gggaacgtgg cctcatggag 60 ccactcttgc cgccgaagcg ccgcctgcta ccgcgggttc ggctcttgcc tctgttgctg 120 gcgctggccg tgggctcggc gttctacacc atttggagcg gctggcaccg caggactgag 180 gagctgccgc tgggccggga gctgcgggtc ccattgatcg gaagcctccc cgaagcccgg 240 ctgcggaggg tggtgggaca actggatcca cagcgtctct ggagcactta tctgcgcccc 300 ctgctggttg tgcgaacccc gggcagcccg ggaaatctcc aagtcagaaa gttcctggag 360 gccacgctgc ggtccctgac agcaggttgg cacgtggagc tggatccctt cacagcctca 420 acacccctgg ggccagtgga ctttggcaat gtggtggcca cactggaccc aagggctgcc 480 cgtcacctca cccttgcctg ccattatgac tcgaagctct tcccacccgg atcgaccccc 540 tttgtagggg ccacggattc ggctgtgccc tgtgccctgc tgctggagct ggcccaagca 600 cttgacctgg agctgagcag ggccaaaaaa caggcagccc cggtgaccct gcaactgctc 660 ttcttggatg gtgaagaggc gctgaaggag tggggaccca aggactccct ttacggttcc 720 cggcacctgg cccagctcat ggagtctata cctcacagcc ccggccccac caggatccag 780 gctattgagc tctttatgct tcttgatctc ctgggagccc ccaatcccac cttctacagc 840 cacttccctc gcacggtccg ctggttccat cggctgagga gcattgagaa gcgtctgcac 900 cgtttgaacc tgctgcagtc tcatccccag gaagtgatgt acttccaacc cggggagccc 960 tttggctctg tggaagacga ccacatcccc ttcctccgca gaggggtacc cgtgctccat 1020 ctcatctcca cgcccttccc tgctgtctgg cacacccctg cggacaccga ggtcaatctc 1080 cacccaccca cggtacacaa cttgtgccgc attctcgctg tgttcctggc tgaatacctg 1140 gggctctag 1149 <210> 3 <211> 1145 <212> DNA <213> human <400> 3 atgcgttccg ggggccgcgg gcgaccccgc ctgcggctgg gggaacgtgg atggagccac 60 tcttgccgcc gaagcgccgc ctgctaccgc gggttcggct cttgcctctg ttgctggcgc 120 tggccgtggg ctcggcgttc tacaccattt ggagcggctg gcaccgcagg actgaggagc 180 tgccgctggg ccgggagctg cgggtcccat tgatcggaag cctccccgaa gcccggctgc 240 ggagggtggt gggacaactg gatccacagc gtctctggag cacttatctg cgccccctgc 300 tggttgtgcg aaccccgggc agcccgggaa atctccaagt cagaaagttc ctggaggcca 360 cgctgcggtc cctgacagca ggttggcacg tggagctgga tcccttcaca gcctcaacac 420 ccctggggcc agtggacttt ggcaatgtgg tggccacact ggacccaagg gctgcccgtc 480 acctcaccct tgcctgccat tatgactcga agctcttccc acccggatcg accccctttg 540 taggggccac ggattcggct gtgccctgtg ccctgctgct ggagctggcc caagcacttg 600 acctggagct gagcagggcc aaaaaacagg cagccccggt gaccctgcaa ctgctcttct 660 tggatggtga agaggcgctg aaggagtggg gacccaagga ctccctttac ggttcccggc 720 acctggccca gctcatggag tctatacctc acagccccgg ccccaccagg atccaggcta 780 ttgagctctt tatgcttctt gatctcctgg gagcccccaa tcccaccttc tacagccact 840 tccctcgcac ggtccgctgg ttccatcggc tgaggagcat tgagaagcgt ctgcaccgtt 900 tgaacctgct gcagtctcat ccccaggaag tgatgtactt ccaacccggg gagccctttg 960 gctctgtgga agacgaccac atccccttcc tccgcagagg ggtacccgtg ctccatctca 1020 tctccacgcc cttccctgct gtctggcaca cccctgcgga caccgaggtc aatctccacc 1080 cacccacggt acacaacttg tgccgcattc tcgctgtgtt cctggctgaa tacctggggc 1140 tctag 1145 <210> 4 <211> 1149 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 4 atgcgttccg ggggccgcgg gcggccccgc ctgcggctag gggaacgtgg cgttatggag 60 ccactcttgc ccccgaagcg ccgcctgcta ccgcgggttc ggctcttgcc cctgttgctg 120 gcgctggccg tgggctcggc gttctacacc atttggagcg gctggcaccg caggactgag 180 gagctgccgc tgggccggga gctgcgggtc ccgttgatcg gaagccttcc cgaagcccgg 240 ctgcggaggg tggtgggaca actggaccca cagcgtctct ggggcactta tctgcgcccc 300 ctgctggttg tgcgaacccc aggcagcccg ggaaatctcc aagtcagaaa gttcctggag 360 gccacgctgc ggtccctgac agcaggttgg cacgtggagc tggatccctt cacagcctcg 420 acgcccctgg ggccagtgga ctttggcaat gtggtggcca cgctggaccc gggggctgcc 480 cgtcacctca cccttgcctg ccattatgac tcgaagctct tcccacccgg atcgaccccg 540 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tgggccggga gctgcgggtc ccgttgatcg gaagccttcc cgaagcccgg 240 ctgcggaggg tggtgggaca actggaccca cagcgtctct ggggcactta tctgcgcccc 300 ctgctggttg tgcgaacccc aggcagcccg ggaaatctcc aagtcagaaa gttcctggag 360 gccacgctgc ggtccctgac agcaggttgg cacgtggagc tggatccctt cacagcctcg 420 acgcccctgg gcccagtgga ctttggcaat gtggtggcca cgctggaccc gggggctgcc 480 cgtcacctca cccttgcctg ccattatgac tcgaagctct tcccacccgg atcgaccccg 540 tttgtagggg ccacagactc ggctgtgccc tgtgccctgc tgctggagct ggcccaggca 600 cttgacctgg agctgagcag ggccaaagaa caggcagccc cggtgaccct gcaactgctc 660 ttcctggatg gtgaagaggc gctgaaggag tggggaccca aggactccct ttacggttcc 720 cggcacctgg cccagctcat ggagtctata cctcatagcc ccggccccac caggatccag 780 gctattgagc tctttatgct tcttgatctc ctgggagccc ccaatcccac cttctacagc 840 cacttccctc gcacggtccg ctggttccat cggctgagaa gcattgagaa gcgtctgcac 900 cgtttgaacc tgctgcagtc tcatccccag gaagtgatgt acttccaacc cggggagccc 960 tttggctctg tggaagacga ccacatcccc ttcctccgca gaggggtccc cgtgctccat 1020 ctcatctcta cgcccttccc tgctgtctgg cacacccctg cggacacaga ggccaatctc 1080 cacccgccca cggtacacaa cttaagccgc attctggccg tgttcctggc tgaatacctg 1140 gggctctag 1149 <210> 6 <211> 1152 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 6 atgccttccg ggggccgcgg gcggtcccgg ctacggctcg gggaacgtgg cctcttggag 60 ccgccctccc cgcccaagcg ccgcctgctc ccgcgggcgc acttcttgcc tctgcttctg 120 ctggccctgg ccctggcttc ggcgacctac accatctgga gcggctggca ccaccagact 180 gaggagctgc cgcggggccg ggagctgcgg ggccgcttga tcggaagcct ctccgaagcc 240 cggctgcggc gggtggtggg gcaactggac ccacaccgtc tctggaacac ttatctgcgc 300 cccctgctgg ttgtgcggac cccgggcagc cccggcaatc tccaagtcag aaagttcctg 360 gaggctacac tacggacctt gacagcaggc tggcatgtgg aactggaccc cttcacagcc 420 ttgacacccc tggggccact ggactttggc aatgtggtgg ccacgctgga cccaggggct 480 gcccgtcacc tcacccttgc ctgccattat gactccaagc tcttcgcatc tgagtcggtt 540 ccctttgtgg gggcaacaga ttcggctgta ccttgcgccc tgctgctgga gctggctcag 600 gccctcgaca gggagttgag tagggccaag gagcaggaag ccccggtgac tctgcagctg 660 ctctttttgg atggtgaaga agcactgaag gagtggggac ccacagactc cctctatggc 720 tcccggcacc tggcccagct catggagtct gcaccccaca gcccgggccc caccaggatc 780 caggctatcg agctcttcat gctccttgat ctcctgggtg ccccgaatcc aaacttctac 840 agtcacttcc ctcatacagc ccgctggttc catcggctga ggagcatcga gaagcgcctt 900 caccgcatga acctgctgca gtctcatccc caggaagtga tgtacttcca gcccggggag 960 ccccctggtt ctgtggaaga tgaccacatc cccttcctcc gccgaggggt ccctgtgctc 1020 cacctcatct ccatgccctt cccctccgtc tggcacaccc ccgatgactc tgaggccaac 1080 ctgcacccac ccaccgtaca caatctgagc cgcatcctcg ccgtgttcct ggccgaatat 1140 ctggggctct ag 1152 <210> 7 <211> 1152 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 7 atgagtccgg ccagccgcgg gcggtctcgg cagcggctcg gggatcgcgg cctcatgaaa 60 ccaccctcac tttccaagcg ccgtcttctg ccgcgggtgc agctcctgcc cctgctgctg 120 ctggcgctgg ccctgggctt ggctttttat atcgtctgga atagctggca ccctggggtt 180 gaggaggtat cacggagccg ggatctgcgg gtcccgctga tcggaagcct ttcagaagcc 240 aagctgcggc ttgtggtagg gcagctggat ccacagcgtc tctggggaac ttttctgcgt 300 cccttgttga ttgtacgacc cccaggtagt cctggcaatc tccaagtgag aaagttcctg 360 gaggctacgt tgcagtccct atcggcaggc tggcacgtgg aactggaccc attcacagcc 420 tcaaccccct tggggccact ggacttcggg aacgtggtgg ccacccttga cccaggagct 480 gcccgtcacc tcaccctcgc ctgccattat gactctaagt tcttccctcc tgggttaccc 540 ccctttgtgg gggccacaga ttcagccgtg ccctgtgccc tgcttctgga gttagtccag 600 gcccttgatg tcatgctgag cagaatcaag cagcaggcag caccagtgac cctgcagctg 660 ctcttcttgg acggggagga ggcactgaag gagtggggac caaaggactc cctctatggt 720 tcccggcacc tagctcagat catggagtct ataccgcaca gccctggccc caccaggatc 780 caggctattg agctctttgt ccttcttgac cttctgggag cgcccagtcc aatcttcttc 840 agtcacttcc cccgcacagc ccgctggttc caacgactgc ggagcatcga gaagcgcctt 900 caccgtctga acctactgca gtctcacccc caggaagtga tgtacttcca acccggggag 960 ccccctggcc ctgtggaaga tgaccacatc cccttccttc gcagaggggt cccggtgctc 1020 cacctcattg cgatgccctt ccctgccgtg tggcacacac ctgctgacac tgaggctaac 1080 ctccacccgc ccacggtgca caacctgagc cgcatcctcg ccgtgttcct ggctgagtac 1140 ctgggtctct ag 1152 <210> 8 <211> 1152 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 atgagtcccg ggagccgcgg gcggccccgg cagcggctcg aggatcgtgg cctcatgaaa 60 ccaccctcac tttccaagcg ccgtcttctg ccgcgagtgc agttcctgcc cctgctgctg 120 ctggcgctgg ctatgggctt ggctttctat atcgtctgga acagctggca ccctggggtt 180 gaggagatgt cacggagccg ggatctgcgg gtcccgctga tcggaagcct ttcagaagcc 240 aagctgcggc tggtggtagg gcagctggat ccgcagcgtc tctggggaac tttcctgcgt 300 cccttattga ttgtgcgacc cccgggtagt tctggcaatc tccaagtgag aaagttcctg 360 gaggctacgt tgcagtccct gtcggcaggc tggcatgttg aactggaccc attcacggcc 420 tcaaccccct tggggccact ggacttcggg aacgtggtgg ccacacttga cccaggagct 480 gcccgtcacc tcaccctcgc ctgccattat gactctaagt tcttccctcc ggggttgccc 540 ccctttgtgg gggccacaga ttcagctgtg ccctgtgccc tgcttctgga gttggtccag 600 gcccttgatg ccatgctgag cagaatcaag cagcaggcag caccggtgac cctgcagctg 660 cttttcttgg atggggagga ggcactgaag gagtggggac caaaggactc cctctatggc 720 tcccggcacc tagctcagat catggagtct ataccacaca gccctggccc caccaggatc 780 caggctattg agctctttgt cctcctcgac cttctgggag catccagtcc gatcttcttc 840 agtcacttcc ctcgcacagc ccgctggttc cagcgactga ggagcattga gaagcgcctt 900 caccggctga acctactgca gtctcacccc caggaagtga tgtacttcca acccggggag 960 ccccccggcc ctgtggaaga tgaccacatc cccttccttc gcagaggggt cccggtgctc 1020 cacctcattg ccacgccctt ccctgctgtg tggcacacac ctgctgacac cgaggccaac 1080 ctccacccac ccactgtgca taacctgagc cgcatccttg ctgtgttcct ggccgagtac 1140 ctgggactct ag 1152 <210> 9 <211> 1152 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 9 atgccttccg ggggccgcgg gcggccccgg ctccaggtcg gggaacgcag ccttttggag 60 cgaccctcac cgcccaagcg ccgcctgata ccgcgggcac agctgttgcc ccagctgctg 120 ctggctctga cggtagcctc ggtgttctat accatttgga ggatctggca tagccagact 180 gaagagctac cgctggggcg ggagctgcgg ggccctttga tcggaagcct ccccgaagct 240 cgggtgcgga gggtagtggg gcaactggac cctcaccgtc tctggaacac tttcctgcgc 300 cctctgctgg ttgtacggac tccgggcagc ccgggcaatc tccaagtgag aaagttcctg 360 gaggctacgc tgcggacact ttcagcaggc tggcatatag aactcgactc cttcactgcc 420 tccacacccg tggggccatt ggacttcagc aatgtggtgg ccacgctgga cccaggggct 480 gcccgccacc ttacccttgc ctgccattat gactccaagc tcttcccatc tgactcagcc 540 ccctttgtgg gggccacgga ttcggcagtg ccttgctccc tgctactgga gctggcccaa 600 gcccttgacc aggagctggg caaagccaag gagagggcag cgccaatgac cttgcagctg 660 atcttcctgg atggtgaaga ggcactgaag cagtggggac ccaaggactc gctttatggc 720 tcccggcacc tggcccagct catggagtct acaccccacg gcctgggctc caccaggatc 780 caggctattg agctctttat gcttcttgat ctcctgggag cccccaaccc gaccttctac 840 agtcacttcc ctcgcacggc ccgctggttc catcggctca ggagcattga gaagcgcctg 900 caccgtctga acctcctgca gtctcatcct tgggaagtga tgtacttcca gaccggggag 960 ccccccggct ccgtggaaga cgaccacatc ccgttcctcc gccgaggagt tcccgtgctc 1020 cacctcatcg ccacaccctt cccctctgtc tggcacacgt ccgatgactc cgaggccaac 1080 ctgcacccac ccacggtaca caacctgagc cgcatcctgg ccgtgttcct ggctgagtac 1140 ctggggctct ag 1152 <210> 10 <211> 361 <212> PRT <213> human <400> 10 Met Ala Gly Gly Arg His Arg Arg Val Val Gly Thr Leu His Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Val Ala Ala Leu Pro Trp Ala Ser Arg Gly Val Ser Pro Ser 20 25 30 Ala Ser Ala 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Claims (44)

  1. (a) 서열번호 11 내지 18중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 (b) 적어도 약 75%의 유사성을 가지며, 동일한 생물학적 기능을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는; 또는 서열번호 2 내지 9 중 하나의 교호 스플라이스 변이체인; 또는 (a) 또는 (b)를 코딩하는 상기 핵산으로부터 적어도 14개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프로브인; 또는 상기 어느 하나에 상보적인, 분리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, DNA 또는 RNA인 분리된 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 2 내지 9 중 어느 하나의 전장을 포함하는 DNA 전사체인, 또는 서열번호 2 내지 9 중 하나의 전체 코딩 영역에 상보적인 분리된 핵산.
  4. 제3항의 DNA에 대해 직접적인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  5. 제1항에 있어서, 서열번호 2 내지 9 중 어느 하나의 전장을 포함하는 RNA 전사체인 분리된 핵산.
  6. 제1항에 있어서, 서열번호 2 내지 9 중 하나의 교호 스플라이스 변이체인 분리된 핵산.
  7. 서열번호 19 또는 20에 대응하는 제6항의 스플라이스 변이체.
  8. 제6항 또는 제7항의 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
  9. 제1항에 있어서, 서열번호 11 내지 18 중 하나에 적어도 약 85%의 유사성이 있는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산.
  10. 제1항에 있어서, 서열번호 11 내지 18 중 하나에 적어도 약 95%의 유사성이 있는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산.
  11. 제1항에 있어서, 서열번호 11 내지 18 중 하나에 적어도 약 50%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산.
  12. 서열번호 2 내지 9 중 하나로부터 적어도 14개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1항의 핵산 프로브.
  13. 서열번호 53 내지 61 중 어느 하나에 대응하는 제12항의 핵산 프로브.
  14. 제1항에 따른 핵산 및 그의 발현을 이끌기 위하여 상기 핵산에 작동 가능하도록 연결된 발현-조절 요소를 포함하는 분리된 재조합 폴리뉴클레오티드 분자.
  15. 프로모터에 작동가능하도록 연결된 서열번호 11 내지 18 중 어느 하나로 표현되는 전체 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제1항의 핵산을 포 함하는 발현 벡터로서, 컴패터블 숙주 세포에 존재하는 발현 벡터.
  16. 성숙 단백질의 적어도 한 부분을 코딩하기 위하여 서열번호 11 내지 18의 아미노산 서열을 코딩하는 제1항에 따른 핵산의 삽입에 의해 유전자적으로 조작된 포유류, 곤충 또는 박테리아 숙주 세포.
  17. 서열번호 11 내지 18 중 하나의 성숙 단백질 부분을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 폴리펩티드의 생산을 위하여 충분한 조건하에서 제16항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 세포 표면에서 발현되고, 배양으로부터 폴리펩티드 또는 그의 단편을 회복하는 단계를 추가적으로 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  19. 선택적으로 당화될 수 있고,
    (a) 서열번호 11 내지 18중 어느 하나로 표현되는 성숙 단백질의 아미노산 서열을 포함하거나,
    (b) (a)의 성숙 단백질 중 하나에 적어도 약 75%의 유사성을 갖고, 동일한 생물학적 기능을 나타내는 성숙 단백질의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (c) 서열번호 11 내지 18 중 어느 하나의 성숙 단백질에 적어도 약 50%의 동일성을 갖는 성숙 단백질의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (d) (a)의 면역학적 반응성 단편인, 폴리펩티드.
  20. 제19항에 있어서, (a)의 성숙 단백질에 적어도 약 85%의 유사성을 갖는 성숙 단백질인 폴리펩티드.
  21. 제19항에 있어서, (a)의 성숙 단백질에 적어도 약 95%의 유사성을 갖는 성숙 단백질인 폴리펩티드.
  22. 제19항에 있어서, 서열번호 11 내지 18 중 하나의 성숙 단백질의 아미노산 서열, 또는 각 성숙 단백질로서 동일한 생물학적 기능을 나타내는 그의 단편인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 단편을 인식하는 항체.
  24. 제23항에 있어서, 서열번호 11 내지 18 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인식하는 항체.
  25. 하나 또는 그 이상의 테스트 화합물 또는 그의 염의 존재하에서 상기 성숙 단백질 및 상기 성숙 단백질에 적절한 기질을 배양하는 단계, 상기 성숙 단백질의 효소적 활성을 측정하는 단계, 테스트 화합물의 부재하에서의 확인된 활성과 비교되는 상기 활성을 비교하는 단계, 및 효소적 활성을 감소시키는 테스트 화합물 또는 화합물들을 선별하는 단계를 포함하는 제19항의 적어도 하나의 성숙 단백질의 효소적 활성을 억제할 수 있는 화합물을 스크리닝하는 방법.
  26. QC의 하나 또는 그 이상의 억제제 또는 그의 염의 존재하에서 상기 성숙 단백질 및 적절한 기질을 배양하는 단계, 상기 성숙 단백질의 효소적 활성을 측정하 는 단계, QC 억제제의 부재하에서 확인된 활성과 비교되는 상기 활성을 비교하는 단계, 및 상기 성숙 단백질의 효소적 활성을 감소시키지 않는 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, 제19항의 적어도 하나의 성숙 단백질의 효소적 활성을 억제하지 않는 선택적 QC-억제제를 스크리닝하는 방법.
  27. QPCTL의 하나 또는 그 이상의 억제제 또는 그의 염의 존재하에서 상기 QC를 배양하는 단계, QC의 효소적 활성을 측정하는 단계, QPCTL 억제제의 부재하에서확인된 활성과 비교되는 상기 활성을 비교하는 단계, 및 상기 QPCTL 단백질의 효소적 활성을 감소시키지 않는 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, QC의 효소적 활성을 억제하지 않는 선택적 QPCTL-억제제를 스크리닝하는 방법.
  28. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항의 상기 성숙 단백질 중 하나의 생물학적 기능을 억제시키는 QPCTL 길항제.
  29. 제28항에 있어서, 소분자 억제제인 QPCTL 길항제.
  30. 제29항에 있어서, 제25항 또는 제27항의 스크리닝 방법에 의해 동정된 길항제.
  31. 제26항의 스크리닝 방법에 의해 동정된 선택적 QC 억제제.
  32. 적어도 하나의 QPCTL 억제제, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, 통상의 담체 및/또는 첨가제의 조합을 선택적으로 포함하는 비경구, 장관 또는 경구 투여를 위한 약제학적 조성물.
  33. 알츠하이머병, 가족성 브리티시 치매, 가족성 대니시 치매, 다운증후군, 헌팅턴병(Huntington's disease), 케네디병, 궤양병, 헬리코박터 파이로리 감염 또는 비감염성 십이지장암(duodenal cancer), 직장암, 졸리저-엘리슨 증후군(Zolliger-Ellison syndrome), 헬리코박터 파이로리 감염 또는 비감염성 위암, 병원성 정신이상 상태, 정신분열증, 불임, 종양 형성, 염증성 숙주 반응, 암, 악성 전이, 흑색종, 건선, 류마티스 관절염, 아테롬성 동맥 경화증, 체액성 및 세포-매개성 면역 부전, 내피에의 백혈구 유착 및 이동 과정, 섭식 장애, 수면-각성 장애, 에너지 대사의 항상성 조절 장애, 자율신경 기능 장애, 호르몬 균형 장애 또는 체액 조절 장 애, 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군 및 만성 염증 탈수초화 다발신경병증으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 제32항의 약제학적 조성물의 용도.
  34. 알츠하이머병, 가족성 브리티시 치매, 가족성 대니시 치매, 다운증후군, 헌팅턴병(Huntington's disease), 케네디병, 궤양병, 헬리코박터 파이로리 감염 또는 비감염성 십이지장암(duodenal cancer), 직장암(colorectal cancer), 졸리저-엘리슨 증후군(Zolliger-Ellison syndrome), 헬리코박터 파이로리 감염 또는 비감염성 위암, 병원성 정신이상 상태, 정신분열증(schizophrenia), 불임, 종양 형성, 염증성 숙주 반응, 암, 악성 전이, 흑색종, 건선, 류마티스 관절염, 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), 체액성 및 세포-매개성 면역 부전, 내피에의 백혈구 유착 및 이동 과정, 섭식 장애, 수면-각성 장애, 에너지 대사의 항상성 조절 장애, 자율신경 기능 장애, 호르몬 균형 장애 또는 체액 조절 장애, 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군 및 만성 염증 탈수초화 다발신경병증으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료용 QPCTL 억제제 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염의 용도.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 QPCTL 억제제는 경쟁적 억제제인 약제학적 조성물 또는 용도.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 QPCTL 억제제는 QPCTL의 활성-부위에 결합된 금속 이온에 결합하는 약제학적 조성물 또는 용도.
  37. 제32항 내지 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 QPCTL은 서열번호 11 내지 18, 21 및 22 중 하나로부터 선택된 약제학적 조성물 또는 용도.
  38. 제37항에 있어서, 상기 QPCTL은 서열번호 11 및 12 중 하나로부터 선택된 약제학적 조성물 또는 용도.
  39. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항의 억제제가 사용되는 약제학적 조성물 또는 용도.
  40. QPCTL 억제제를 포함하는 진단 분석.
  41. - 상기 질환 및/또는 상태를 겪는 것으로 추정되는 대상으로부터 샘플을 얻는 단계,
    -글루타미닐 펩티드 사이클로트랜스퍼라제의 억제제를 상기 샘플에 접촉시키는 단계, 및
    -상기 대상이 상기 질환 및/또는 상태를 겪는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 제33항 또는 제34항에서 정의된 질환 및/또는 상태 중 어느 하나를 진단하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 대상은 인간인 방법.
  43. 제41항 또는 42항에 있어서, 상기 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 뇌척수액 샘플 또는 소변 샘플인 방법.
  44. 검출 수단으로서 제40항의 진단 분석 및 확인 수단을 포함하는 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 진단 키트.
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