JP6026425B2 - イソグルタミニルシクラーゼの結晶構造 - Google Patents
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Description
本発明は、イソグルタミニルシクラーゼ(isoQC)の新規結晶構造に関する。QCは、アンモニアの遊離下でのN-末端グルタミン残基のピログルタミン酸(5-オキソ-プロリル、pGlu*)への分子内環化、及び水の遊離下でのN-末端グルタミン酸残基のピログルタミン酸への分子内環化を触媒する。
グルタミニルシクラーゼ(QC、EC 2.3.2.5;Qpct;グルタミニルペプチドシクロトランスフェラーゼ)は、アンモニアの遊離下でのN-末端グルタミン残基のピログルタミン酸(5-オキソ-プロリン、pGlu*)への分子内環化、及び水の遊離下でのN-末端グルタミン酸残基のピログルタミン酸への分子内環化を触媒する。
本発明の第一の態様によれば、特性解析された空間群P1211、並びに単位格子寸法a=126.51Å、b=109.68Å、c=159.53Å、α=90.0°、β=104.9°、及びγ=90.0°の±5%を有するヒトイソグルタミニルシクラーゼを含む結晶が提供される。
(a)ヒトイソグルタミニルシクラーゼの溶液を、任意に、既知のイソグルタミニルシクラーゼ阻害剤の存在下で、25mMビス-トリスpH6.8/100mM NaCl緩衝液などの好適な緩衝液中に提供する工程;
(b)該溶液を、0.1Mクエン酸ナトリウム、0.1M硫酸アンモニウム、及び13%(w/v)35000 PEGを含む結晶化溶液と混合する工程;並びに
(c)該混合物を、ハンギングドロップ蒸気拡散を促進する条件下で、ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結晶を生成させるのに十分な時間、インキュベートする工程
を含む、方法が提供される。
(a)図1に記載の構造座標を用いて、ヒトイソグルタミニルシクラーゼの3次元モデルを作成する工程;
(b)図1の座標による配列番号:1の残基E226、D186、及びH351によって提供される結合ポケットを解析する工程;
(c)コンピュータモデリング解析を実施して、ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットと会合し得る阻害剤化合物を同定する工程
を含む、方法が提供される。
本発明は、ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結晶に関し、ここで、該結晶は、P1211空間群において、約3.4オングストロームの分解能まで、イソグルタミニルシクラーゼの3次元X線回折構造を決定することを可能にするのに十分な品質及びサイズである。本発明はまた、ヒトイソグルタミニルシクラーゼを調製し、結晶化する方法に関する。ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結晶、及びその結晶構造から得られる情報を用いて、イソグルタミニルシクラーゼを解析し、改変するだけでなく、イソグルタミニルシクラーゼと相互作用する化合物を同定することもできる。
(a)ヒトイソグルタミニルシクラーゼの溶液を、任意に、既知のイソグルタミニルシクラーゼ阻害剤の存在下で、25mMビス-トリスpH6.8/100mM NaCl緩衝液などの好適な緩衝液中に提供する工程;
(b)該溶液を、0.1Mクエン酸ナトリウム、0.1M硫酸アンモニウム、及び13%(w/v)35000 PEGを含む結晶化溶液と混合する工程;並びに
(c)該混合物を、ハンギングドロップ蒸気拡散を促進する条件下で、ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結晶を生成させるのに十分な時間、インキュベートする工程
を含む、方法が提供される。
(a)ヒトイソグルタミニルシクラーゼの溶液を、イソグルタミニルシクラーゼ阻害剤などの結合リガンドの存在下で、25mMビス-トリスpH6.8/100mM NaCl緩衝液などの好適な緩衝液中に提供する工程;
(b)該溶液を、0.1Mクエン酸ナトリウム、0.1M硫酸アンモニウム、及び13%(w/v)35000 PEGを含む結晶化溶液と混合する工程;並びに
(c)該混合物を、ハンギングドロップ蒸気拡散を促進する条件下で、イソグルタミニルシクラーゼ阻害剤などの結合リガンドに結合したヒトイソグルタミニルシクラーゼの共結晶を生成させるのに十分な時間、インキュベートする工程
を含む、方法が提供される。
(a)図1に記載の構造座標を用いて、ヒトイソグルタミニルシクラーゼの3次元モデルを作成する工程;
(b)図1の座標による配列番号:1の残基E226、D186、及びH351によって提供される結合ポケットを解析する工程;
(c)コンピュータモデリング解析を実施して、ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットと会合し得る阻害剤化合物を同定する工程
を含む、方法が提供される。
(a)該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの構造座標を、該構造座標から3次元構造情報を生成させる手段を備えるコンピュータに提供する工程;並びに
(b)該化学的実体と該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの全体又は一部の該3次元構造情報との間のフィッティング操作を実施することによって、該化学的実体を設計、選択、及び/又は最適化する工程
を含む、方法が提供される。
(a)該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの構造座標を、該構造座標から3次元構造情報を生成させる手段を備えるコンピュータに提供する工程;
(b)コンピュータ手段を利用して、該化学的実体と該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの全体又は一部との間のフィッティング操作を実施する工程;及び
(c)該フィッティング操作の結果を解析して、該化学的実体と該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの全体又は一部の間の会合を定量化する工程
を含む、方法が提供される。
(a)第一の化学的実体を、該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの全体又は一部の中に、該化学的実体及び該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの構造のグラフィカルな3次元表現を用いて位置付ける工程;
(b)該化学的実体と該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットとの間のフィッティング操作を、コンピュータ手段を利用することによって実施する工程;及び
(c)該フィッティング操作の結果を解析して、該化学的実体と該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの全体又は一部の間の会合を定量化する工程
を含む、方法が提供される。
(d)第二の化学的実体を用いて、工程(a)〜(c)を繰り返す工程;及び
(e)該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの該全体又は一部と会合する該第一又は第二の化学的実体のうちの少なくとも1つを、該第一又は第二の化学的実体の該定量された会合に基づいて選択する工程
をさらに含む。
(a)ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの3次元構造を用いて、化学的実体を設計又は選択する工程;
(b)該化学的実体をヒトイソグルタミニルシクラーゼと接触させる工程;
(c)該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの触媒活性をモニタリングする工程;及び
(d)該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの触媒活性に対する該化学的実体の効果に基づいて、該化学的実体をアゴニスト又はアンタゴニストに分類する工程
を含む、方法が提供される。
(a)該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの構造座標を、該構造座標から3次元構造情報を生成させる手段を備えるコンピュータに提供する工程;並びに
(b)該コンピュータを用いて、フィッティング操作を実施し、第一の化学的実体を該結合ポケットの全体又は一部と会合させる工程;
(c)フィッティング操作を実施して、少なくとも第二の化学的実体を該結合ポケットの全体又は一部と会合させる工程;
(d)該第一及び第二の化学的実体と該結合ポケットの全体又は一部の間の会合を定量化する工程;
(e)任意に、別の第一及び第二の化学的実体を用いて、工程(b)から工程(d)を繰り返し、該第一及び第二の化学的実体の全ての該定量化された会合に基づいて、第一及び第二の化学的実体を選択する工程;
(f)任意に、該第一及び第二の化学的実体の相互の関係を、該結合ポケットとの関連において、該結合ポケット並びに該第一及び第二の化学的実体の3次元グラフィカル表現を用いて、コンピュータスクリーン上で目視検査する工程;並びに
(g)モデル構築によって、該第一及び第二の化学的実体を、該結合ポケットの全体又は一部と会合する化合物又は複合体へとアセンブルする工程
を含む、方法が提供される。
4.0mmolの3,4-ジメトキシフェニルイソチオシアネート及び4.0mmolの3-(1H-イミダゾール-1-イル)アルキル-1-アミンを、10mLの無水エタノールに溶解させた。還流下で2時間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、得られた固形物をエタノールから再結晶化させた。
収量:0.66g(51.3%);融点:160.0〜161.0℃。
(ヒトイソグルタミニルシクラーゼの発現、精製、及び結晶化)
((A)P.パストリスでのヒトイソグルタミニルシクラーゼの発現及び精製)
(宿主株及び培地)
大腸菌株DH5αをプラスミドの増殖に用い、P.パストリス株X-33を酵母でのヒトisoQCの発現に用いた。大腸菌株及びP.パストリス株を、製造業者の指示に従って成長させ、形質転換し、解析した(Qiagen(DH5α), Invitrogen(X-33))。大腸菌に必要とされる培地、すなわち、ルリア-ベルターニ(LB)培地は、製造業者の奨めに従って調製した。ピキア・パストリスに必要とされる培地、すなわち、BMMY、BMGY、YPD、YPDS、及び抗生物質の濃縮物、すなわち、Zeocinは、ピキアマニュアル(Invitrogen, カタログ番号K1740-01)に記載の通りに調製した。このマニュアルには、酵母の取扱いのための全ての関連性のある記述も含まれている。
クローニング手順は全て、標準的な分子生物学の技術を適用して行なわれた。ピキア・パストリスX-33の発現のために、pPiCZαA(Invitrogen)を用いた。(メチオニンIIから数えて)コドン42から始まる成熟ヒトisoQCのcDNA を、タンパク質を分泌経路に向かわせるα-因子がコードされたプラスミドにインフレームで融合させた。プライマー
1〜2μgのプラスミドDNAを、製造業者の指示(BioRad社)に従うエレクトロポレーションによって、コンピテントなP.パストリス細胞の形質転換に適用した。100μg/mlのZeocinを含むプレート上で選択を行なった。isoQC発現時に組換え酵母クローンを試験するために、組換え体を、2mlのBMGYを含む10ml円錐チューブ中で24時間成長させた。その後、酵母を遠心分離し、0.5%メタノールを含む2mlのBMMYに再懸濁させた。24時間毎に、約72時間、メタノールを添加することによって、この濃度を維持した。その後、上清中のQC活性を測定した。最も高い活性を示したクローンをさらなる実験及び大規模発現のために選んだ。
ピキア・パストリスでのisoQCの大規模発現のために、条件を、小規模発現において記載した通りに保持したが、総量は8Lとした。発現を振盪フラスコ中で実施した。発現後、細胞を遠心分離(1500×g、20分)によって培地から分離し、ペレットを捨てた。上清のpH値を中性になるように調整し、再び遠心分離し、第一の精製工程に適用した。hisoQCタンパク質を3工程プロトコルを用いて精製した(表1)。この精製は、図3のSDS-PAGE解析によって示されている。精製収率は60%であった。見かけのタンパク質は、50kDa〜75kDaのhisoQCの移動から明らかなように、不均一にグリコシル化されていた(図3)。精製後、このタンパク質を、10kDaの分子量カットオフを有するU-Tube(商標)Concentrators(Novagen)を用いて12mg/mlにまで濃縮し、-80℃で保存した。
(結晶成長)
結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散技術を用いて、室温(21℃)で、Easyxtal 24-ウェルプレート(Qiagen社)中で成長させた。母液緩衝液は、0.1Mクエン酸ナトリウム、0.1M硫酸アンモニウム、及び13%(w/v)35000 PEGからなっていた。最大10mg/mlまで濃縮されたタンパク質溶液は、25mMビス-トリスpH6.8/100mM NaCl緩衝液の存在下の組換えヒトイソグルタミニルシクラーゼ(hisoQC)であった。結晶化の前に、hisoQCを、エンドグリコシダーゼHf(New England Biolabs社)を用いて脱グリコシル化した。糖鎖の除去は、hisoQCの溶解性の激減をもたらした。タンパク質を可溶性に保つために、hisoQCを洗剤MEGA-8(Fluka)(最終濃度100mM)で処理した。その後、エンドグリコシダーゼHfを添加した(最終活性4.8*103単位/ml)。反応を室温で一晩行なった。脱グリコシル化の後、阻害剤Aを添加した(最終濃度1mM)。
X線測定の前に、結晶を、母液緩衝溶液が15%(v/v)グリセロールで飽和している新しい極低温-緩衝溶液に速やかに浸漬させた。すぐに、結晶を、ピン状のナイロンループを用いて極低温-緩衝溶液から収集し、それらをゴニオメーターの上に取り付け、窒素流下、-180℃で瞬間凍結させた。
単結晶からのデータ収集は、回転陰極源(RA Micro 007;理学/MSC社、東京、日本)、及びVarimax(商標)Optics(理学社)を備えるCCD検出装置(CCD Saturn 944+、理学社)、及びAFC-11ゴニオメーターを用いることにより、Cu Kα線(λ=1.5418Å)によって行なわれた。
画像反射強度を、プログラムXDSを用いてインデキシングし、積分した。さらなるデータ処理は、結晶学パッケージソフトCCP4に含まれるプログラムを用いて実行した。積分した強度を、プログラムScalaを用いてスケーリングし、統合した。初期のmtzファイルを、マシューズ係数を計算することによって解析した。マシューズ係数は、水含量が約50%で11個の分子又は12個の分子のいずれかを含む非対称単位(AU)に対して最も高い確率を示した。
表2は、ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結晶を用いてベルリンのシンクロトロンBessyで得られたデータセットの統計、並びにデータ処理及びモデル構築に関するそれらの対応する統計をまとめたものである。使用したプログラムは、データ処理についてはXDS及びSCALA、分子置換についてはPHASER、精密化についてはREFMAC5、並びにモデル構築についてはCootであった(それらは全てCCP4パッケージソフトに含まれている)。括弧内の数字は、外側シェルの解像限界に属している。
Claims (15)
- 3.42Å〜34.72Åの分解能まで結晶の原子座標を決定するためのX線を回折する、請求項1記載の共結晶。
- 配列番号:19の残基E175、D135及びH301によって提供される結合ポケットを含み、該残基が、図1の座標による配列番号:1の残基E226、D186、及びH351に対応する、請求項2記載の結晶。
- 配列番号:19の残基C116とC140の間にジスルフィド架橋を含み、該残基が、配列番号:1の残基C167及びC191に対応する、請求項3記載の結晶。
- ヒトイソグルタミニルシクラーゼの阻害剤を同定する方法であって、以下の工程:
(a)請求項1記載の共結晶を調製し、該結晶から図1に記載の構造座標を取得する工程;
(b)該図1に記載の構造座標を用いて、ヒトイソグルタミニルシクラーゼの3次元モデルを作成する工程;
(c)配列番号:19の残基E175、D135及びH301によって提供される結合ポケットを解析する工程であって、該残基が、図1の座標による配列番号:1の残基E226、D186、及びH351に対応する、前記工程;
(d)コンピュータモデリング解析を実施して、ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットと会合し得る阻害剤化合物を同定する工程
を含む、前記方法。 - 前記阻害剤化合物を合成する工程、及び該化合物を前記ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットと接触させて、ヒトイソグルタミニルシクラーゼを阻害する該化合物の能力を決定する工程をさらに含む、請求項5記載の方法。
- 前記コンピュータモデリング解析を実施して、前記阻害剤化合物を同定する工程が、該化合物を化合物のライブラリーから同定することを含む、請求項5又は6記載の方法。
- 前記コンピュータモデリング解析を実施して、前記阻害剤化合物を同定する工程が、該化合物をデータベース中で同定することを含む、請求項5又は6記載の方法。
- 前記コンピュータモデリング解析を実施して、前記阻害剤化合物を同定する工程が、該化合物を既知のヒトイソグルタミニルシクラーゼ阻害剤から設計することを含む、請求項5又は6記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項記載のヒトイソグルタミニルシクラーゼの共結晶を調製する方法であって:
(a)ヒトイソグルタミニルシクラーゼの溶液を、阻害剤Aの存在下で、25mMビス-トリスpH6.8/100mM NaCl緩衝液などの好適な緩衝液中に提供する工程;
(b)該溶液を、0.1Mクエン酸ナトリウム、0.1M硫酸アンモニウム、及び13%(w/v)35000 PEGを含む結晶化溶液と混合する工程;並びに
(c)該混合物を、ハンギングドロップ蒸気拡散を促進する条件下で、ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結晶を生成させるのに十分な時間、インキュベートする工程
を含む、前記方法。 - 図1によるヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの全体又は一部に結合する化学的実体を設計、選択、及び/又は最適化する方法であって:
(a)請求項1記載の共結晶を調製し、該結晶から図1に記載の構造座標を取得する工程;
(b)該構造座標から3次元構造情報を生成させる手段を備えるコンピュータ上で、該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの構造座標を取得して提供する工程;並びに
(c)該化学的実体と該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの全体又は一部の該3次元構造情報との間のフィッティング操作を実施することによって、該化学的実体を設計、選択、及び/又は最適化する工程
を含む、前記方法。 - 図1によるヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの全体又は一部と会合する化学的実体の能力を評価する方法であって:
(a)請求項1記載の共結晶を調製し、該結晶から図1に記載の構造座標を取得する工程;
(b)該構造座標から3次元構造情報を生成させる手段を備えるコンピュータ上で、該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの構造座標を取得して提供する工程;
(c)コンピュータ手段を利用して、該化学的実体と該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの全体又は一部との間のフィッティング操作を実施する工程;及び
(d)該フィッティング操作の結果を解析して、該化学的実体と該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの全体又は一部の間の会合を定量化する工程
を含む、前記方法。 - 図1によるヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの全体又は一部と会合する化学的実体の能力を評価するためにコンピュータを使用する方法であって、該コンピュータが、該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットを規定する該構造座標でコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体、並びに該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの3次元グラフィカル表現を作成する手段を備え、かつ該方法が:
(a)請求項1記載の共結晶を調製し、該結晶から図1に記載の構造座標を取得し、該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットを取得する工程;
(b)第一の化学的実体を、該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの全体又は一部の中に、該化学的実体及び該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの構造のグラフィカルな3次元表現を用いて位置付ける工程;
(c)該化学的実体と該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットとの間のフィッティング操作を、コンピュータ手段を利用することによって実施する工程;及び
(d)該フィッティング操作の結果を解析して、該化学的実体と該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの全体又は一部の間の会合を定量化する工程
を含む、前記方法。 - 図1によるヒトイソグルタミニルシクラーゼのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法であって:
(a)請求項1記載の共結晶を調製し、該結晶から図1に記載の構造座標を取得し、該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットを取得する工程;
(b)前記ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの3次元構造を用いて、化学的実体を設計又は選択する工程;
(c)該化学的実体をヒトイソグルタミニルシクラーゼと接触させる工程;
(d)該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの触媒活性をモニタリングする工程;及び
(e)該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの触媒活性に対する該化学的実体の効果に基づいて、該化学的実体をアゴニスト又はアンタゴニストに分類する工程
を含む、前記方法。 - 図1によるヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの全体又は一部と会合する化合物又は複合体を設計する方法であって:
(a)請求項1記載の共結晶を調製し、該結晶から図1に記載の構造座標を取得し、該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットを取得する工程;
(b)該構造座標から3次元構造情報を生成させる手段を備えるコンピュータ上で、該ヒトイソグルタミニルシクラーゼの結合ポケットの構造座標を提供する工程;並びに
(c)該コンピュータを用いて、フィッティング操作を実施し、第一の化学的実体を該結合ポケットの全体又は一部と会合させる工程;
(d)フィッティング操作を実施して、少なくとも第二の化学的実体を該結合ポケットの全体又は一部と会合させる工程;
(e)該第一及び第二の化学的実体と該結合ポケットの全体又は一部の間の会合を定量化する工程;
(f)任意に、別の第一及び第二の化学的実体を用いて、工程(c)から工程(e)を繰り返し、該第一及び第二の化学的実体の全ての該定量化された会合に基づいて、第一及び第二の化学的実体を選択する工程;
(g)任意に、該第一及び第二の化学的実体の相互の関係を、該結合ポケットとの関連において、該結合ポケット並びに該第一及び第二の化学的実体の3次元グラフィカル表現を用いて、コンピュータスクリーン上で目視検査する工程;並びに
(h)モデル構築によって、該第一及び第二の化学的実体を、該結合ポケットの全体又は一部と会合する化合物又は複合体へとアセンブルする工程
を含む、前記方法。
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