BRPI0718507A2 - Genes relacionados à glutaminil ciclase - Google Patents

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BRPI0718507A2
BRPI0718507A2 BRPI0718507-3A BRPI0718507A BRPI0718507A2 BR PI0718507 A2 BRPI0718507 A2 BR PI0718507A2 BR PI0718507 A BRPI0718507 A BR PI0718507A BR PI0718507 A2 BRPI0718507 A2 BR PI0718507A2
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BR
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leu
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pro
arg
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BRPI0718507-3A
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Stephan Schilling
Holger Cynis
Jens-Ulrich Rahfeld
Hans-Ulrich Demuth
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Probiodrug Ag
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GENES RE- LACIONADOS À GLUTAMINIL CICLASE".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se às novas proteínas similares a ciclotransferase de peptídeo de glutaminil (QPCTLs) que são isoenzimas de glutaminil ciclase (QC, EC 2.3.2.5), e aos ácidos nucléicos isolados que codi- ficam para estas isoenzimas, todos estes são úteis para a descoberta de novos agentes terapêuticos para medir a atividade de ciclase, e para deter- minar a atividade inibidora dos compostos contra estas isoenzimas de glu- taminil ciclase.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Glutaminil ciclase (QC, EC 2.3.2.5) catalisa a ciclização intramo- Iecular de resíduos de glutamina N-terminais em amônia de liberação de á- cido piroglutâmico (pGIu*). Uma QC foi primeiro isolada por Messer do látex da planta tropical Carica papaya em 1963 (Messer, M., 1963 Nature 4874, 1299). 24 anos depois, uma atividade enzimática correspondente foi desco- berta na pituitária animal (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532- 8536; Fischer, W. H. e Spiess, J., 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84, 3628 - 3632). Para a QC mamífera, a conversão de Gln em pGIu por QC poderia ser mostrada para os precursores de TRH e GnRH (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. e Spiess, J., 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84, 3628 - 3632). Além disso, os experimentos iniciais de localização de QC revelaram uma colocalização com seus produtos putati- vos da catálise em pituitária bovina, também melhorando a função sugerida na síntese do hormônio de peptídeo (Bockers, Τ. M. et al. 1995 J Neuroen- docrinol 7, 445-453). Em contraste, a função fisiológica da QC vegetal está menos esclarecida. No caso da enzima de C. papaya, um papel na defesa da planta contra micro-organismos patogênicos foi sugerido (El Moussaoui, A., et al. Cell Mol Life Sci 58, 556 - 570). QCs putativas de outras plantas foram recentemente identificadas por comparações de seqüências (Dahl, S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36). A função fisiológica destas en- zimas, porém, ainda é ambígua. As QCs conhecidas de plantas e animais apresentam uma es- pecificidade rígida para L-glutamina na posição N-terminal dos substratos e seu comportamento cinético foi observado obedecer a equação de Michae- Iis-Menten (Pohl, T., et al. 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88, 10059 - 10063;
Co η salvo, A. P. et al. 1988 Anal Biochem 175, 131-138; Gololobov, Μ. Y. et al. 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377, 395-398). Uma comparação das es- truturas primárias das QCs de C. papaya e as da QC altamente conservada de mamíferos, porém, não revelou qualquer homologia de seqüência (Dahl, S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36). Embora as QCs vegetais pa- reçam pertencer a uma família de enzima nova (Dahl, S. W. et al. 2000 Pro- tein Expr Purif 20, 27-36), as QCs mamíferas foram observadas ter uma ho- mologia de seqüência pronunciada às aminopeptidases bacterianas (Bate- man, R. C. et al. 2001 Biochemistry 40, 11246-11250), levando à conclusão que as QCs de plantas e animais têm origens evolutivas diferentes. Recentemente, foi mostrado que QC humana recombinante co-
mo também atividade de QC de extratos cerebrais catalisa tanto a ciclização de glutaminil N-terminal como também de glutamato. Mais surpreendente é a descoberta que a conversão de Glu1 catalisada por ciclase é favorecida por volta de pH 6,0 enquanto a conversão de Gln1 para derivados de pGIu ocor- re com uma ótima de pH por volta de 8,0. Uma vez que a formação de pep- tídeos relacionados a pGlu-Αβ pode ser suprimida por inibição de QC huma- na recombinante e atividade de QC de extratos pituitários de porco, a enzi- ma QC é um alvo em desenvolvimento de fármaco para tratamento da mal de Alzheimer.
EP 02 011 349.4 descreve polinucleotídeos que codificam glu-
taminil ciclase de inseto, como também polipeptídeos codificados por estes. Este pedido de patente também provê células hospedeiras compreendendo vetores de expressão compreendendo os polinucleotídeos da invenção. Po- lipeptídeos isolados e células hospedeiras que compreendem QC de inseto são úteis em métodos de triagem para agentes que reduzem a atividade de glutaminil ciclase. Tais agentes são úteis como pesticidas.
Inibidores de QC que também poderiam ser úteis como inibido- res de isoenzimas de QC1 são descritos em WO 2004/098625, WO 2004/098591, WO 2005/039548 e WO 2005/075436, que são incorporados aqui em sua totalidade, especialmente com respeito à estrutura dos inibido- res, seu uso e sua produção.
DEFINIÇÕES
INIBIDORES ENZIMÁTICOS
INIBIDORES ENZIMÁTICOS REVERSÍVEIS: compreendem ini- bidores competitivos, inibidores reversíveis não-competitivos, inibidores de ligação lenta ou ligação apertada, análogos de estado de transição e análo- gos de multissubstrato.
INIBIDORES COMPETITIVOS apresentam
i) interações não-covalentes com a enzima,
ii) competem com o substrato para o sítio ativo da enzima,
O mecanismo principal de ação de um inibidor enzimático rever- sível e a definição da constante de dissociação podem ser visualizados co- mo segue:
^cn
E + I ^ E-I
kOff
+
S
\
E-S ^ E-P E + P
= Ki =^L
Kn
A formação do complexo de enzima-inibidor [E-l] impede a liga- ção dos substratos, portanto a reação não pode prosseguir para o produto fisiológico normal, P. Uma concentração de inibidor maior [I] leva a [E-l] mai- or, deixando a enzima menos livre à qual o substrato pode se ligar. INIBIDORES REVERSÍVEIS NÃO-COMPETITIVOS
i) ligam em um sítio diferente do sítio ativo (sítio de ligação alos- térico)
ii) causa uma alteração conformacional na enzima que diminui ou para a atividade catalítica.
INIBIDORES DE LIGAÇÃO LENTA OU LIGAÇÃO APERTADA i) são inibidores competitivos onde o equilíbrio entre o inibidor e
a enzima é alcançado lentamente,
ii) (kon é lenta), possivelmente devido às alterações conformacio- nais que têm que ocorrer na enzima ou inibidor
a) são freqüentemente análogos de estado de transição b) são eficazes em concentrações similares à concentração da
enzima, (valores K0 subnanomolares)
c) devido aos valores de k0ff serem tão baixos, estes tipos de inibidores são "quase" irreversíveis. ANÁLOGOS DO ESTADO DE TRANSIÇÃO São inibidores competitivos que imitam o estado de transição de
uma reação catalisada por enzima. Catálise enzimática ocorre devido a uma redução da energia do estado de transição, portanto, ligação do estado de transição é favorecida na ligação do substrato. ANÁLOGOS DE MULTISSUBSTRATO Para uma reação que envolve dois ou mais substratos, um inibi-
dor competitivo ou análogo de estado de transição pode ser projetado que contém as características estruturais que se assemelham a dois ou mais dos substratos.
INIBIDORES ENZIMÁTICOS IRREVERSÍVEIS: dirigem o equilíbrio entre a enzima não-ligada e o inibidor e o complexo de enzima-inibidor (Ε + I <—> E-I) sempre para a direita com uma ligação covalente (-100 kcal/mol), tor- nando a inibição irreversível. AGENTES DE MARCAÇÃO DE AFINIDADE
• Inibidores irreversíveis direcionados de sítio ativo (inibidor irre-
versível competitivo) são reconhecidos pela enzima (ligação reversível, es- pecífica) seguido por formação de ligação covalente, e
i)são estruturalmente similares ao substrato, estado de transição ou produto permitindo a interação específica entre o fármaco e enzima alva,
ii) contêm grupo funcional reativo (por exemplo um nucleó- filo, -COCH2Br) permitindo formação de ligação covalente
O esquema de reação abaixo descreve um reagente direcionado de sítio ativo com sua enzima alvo, onde K0 é a constante de dissociação e kinativação é a taxa de formação de ligação covalente.
/.;+ jf^Et/ >E— /
INATIVADORES enzimáticos com base EM mecanismo
(também chamados inibidores suicidas) são reagentes direcionados de sítio ativo (não-reativos) que se ligam ao sítio ativo da enzima onde são transfor- mados em uma forma reativa (ativada) pelas capacidades catalíticas da en- zima. Uma vez ativados, uma ligação covalente entre o inibidor e a enzima é formada.
O esquema de reação abaixo mostra o mecanismo de ação de um mecanismo com base inativador enzimático onde K0 é o complexo de dissociação, k2 é a taxa de ativação do inibidor uma vez ligado à enzima, k3 é a taxa de dissociação do inibidor ativado, P, da enzima (produto pode ser ainda reativo) da enzima e k4 é a taxa de formação de ligação covalente en- tre o inibidor ativado e a enzima.
K3
t
E + P
Inativação (formação de ligação covalente, k4) tem que ocorrer antes da dissociação (k3) do contrário o inibidor agora reativo é liberado no ambiente. Razão de divisão, k3/k4: razão do produto liberado para inativação deveria ser minimizada para inativação eficiente do sistema e reações cola- terais indesejáveis mínimas. Uma razão de partição grande (favorece disso- ciação) leva a reações não-específicas.
INIBIDORES ENZIMÁTICOS NÃO-COMPETITIVOS: da defini- ção de inibidor não-competitivo (um inibidor que liga apenas a complexos
20
25 ES) os equilíbrios a seguir podem ser escritos:
l
Kl
ESl
O complexo ES dissocia o substrato com uma constante de dis- sociação igual a Ks, enquanto que o complexo ESI não o dissocia (isto é, tem um valor Ks igual zero). As Kms das enzimas do tipo Michaelis-Menten são esperadas ser reduzidas. Concentração de substrato crescente leva à concentração de ESI crescente (um complexo incapaz de progredir para produtos de reação), portanto a inibição não pode ser removida.
Preferidos de acordo com a presente invenção são inibidores enzimáticos competitivos. Os mais preferidos são inibidores enzimáticos re- versíveis competitivos.
Os termos "k", ou "K" e "KD" são constantes de ligação, que descrevem a ligação de um inibidor e a liberação subsequente de uma en- zima. Outra medida é o valor "IC50" que reflete a concentração de inibidor que em uma concentração de substrato dada resulta em 50 % da atividade enzimática.
O termo "QC" como aqui usado compreende glutaminil ciclase (QC)1 que é sinônimo a ciclotransferase de peptídeo de glutaminil (QPCT); e enzimas similares a QC, que são sinônimas às proteínas similares a ciclo- transferase de peptídeo de glutaminil (QPCTLs). QC e enzimas similares à QC têm atividade enzimática idêntica ou similar, também definidas como atividade de QC. Nesta consideração, enzimas similares à QC fundamen- talmente podem diferir em sua estrutura molecular de QC.
"Atividade de QC" é definida como a atividade catalítica de glu- taminil ciclase (QC, QPCT) e enzimas similares à QC (QPCTLs). Estas en- zimas são encontradas em vários tecidos do corpo de um mamífero incluin- do rim, fígado, intestino, cérebro e fluidos do corpo tais como CSF, onde elas ciclizam glutamina ou glutamato no término N dos peptídeos biologicamente ativos com uma especificidade alta.
Em particular, o termo "atividade de QC", como aqui usado, é definido como ciclização intramolecular de resíduos de glutamina N- terminais em ácido piroglutâmico (pGIu *) ou de N-L-homoglutamina terminal ou L^-homoglutamina em um derivado de piro-homoglutamina cíclica sob liberação de amônia. Portanto, vide esquemas 1 e 2. ESQUEMA 1: CICLIZAÇÃO DE GLUTAMINA POR QC
peptídeo
peptídeo
NH,
X
QC
ESQUEMA 2: CICLIZAÇÃO DE L-HOMOGLUTAMINA POR QC
peptídeo | peptídeo
H7N.
NH3
X
QC
O termo "EC", como aqui usado, compreende a atividade lateral de glutaminil ciclase (QC, QPCT) e enzimas similares à QC (QPCTLs) como glutamato ciclase (EC), também definidas como atividade de EC.
O termo "atividade de EC", como aqui usado, é definido como ciclização intramolecular de resíduos de glutamato N-terminais em ácido pi- roglutâmico (pGIu*) por glutaminil ciclase (QC, QPCT) e enzimas similares à QC (QPCTLs). Portanto, vide esquema 3.
ESQUEMA 3: CICLIZAÇÃO A/-TERMINAL DE PEPTÍDEOS DE GLUTAMIL NÃO-CARREGADOS POR QC (EC)
peptídeo peptídeo
peptídeo peptídeo
HN HN
H3N , H2N .4 0 H2O O
O ""O / ι /
(~5.0<pH<7.0) t
-- -" —r" \
NH2 NH
(~7.0<pH<8.0) I QC/EC ^ ^ QC/EC
O O O OH H2N 0 o
O termo "inibidor de QC" ou "inibidor de glutaminil ciclase" é em geral conhecido a uma pessoa versada na técnica e significa inibidores en- zimáticos que inibem a atividade catalítica de glutaminil ciclase (QC, QPCT) ou enzimas similares à QC (QPCTLs) ou sua atividade de glutamil ciclase (EC), preferivelmente por interação direta do inibidor com a enzima.
O termo "inibidor de QC seletivo", como definido aqui, significa inibidores enzimáticos que inibem a atividade catalítica de glutaminil ciclase (QC, QPCT) mas não, ou com uma potência inferior, inibem pelo menos u- mas enzimas similares à QC (QPCTLs). Preferidos são inibidores de QC seletivos que inibem glutaminil ciclase (QC, QPCT) com um valor ki, que é uma ordem de magnitude inferior que seu valor ki para a inibição de pelo menos uma enzima similar à QC (QPCTL). Mais preferivelmente, o valor ki do dito inibidor de QC seletivo para a inibição de glutaminil ciclase (QC, QPCT) são duas ordens de magnitude inferior que seu valor ki para a inibi- ção de pelo menos uma enzima similar à QC (QPCTL). Até mesmo mais preferido são inibidores de QC seletivos, em que seu valor ki para a inibição de glutaminil ciclase (QC, QPCT) são três ordens de magnitude inferior que seu valor ki para a inibição de pelo menos uma enzima similar à QC (QPC- TL). Os mais preferido são inibidores de QC seletivos que não inibem enzi- mas similares à QC (QPCTLs).
O termo "inibidor seletivo de QPCTL", como definido aqui, signi- fica inibidores enzimáticos que inibem a atividade catalítica de pelo menos uma enzima similar à QC (QPCTL), mas não, ou com uma potência inferior, inibem a atividade de glutaminil ciclase (QC, QPCT). Preferidos são inibido- res de QPCTL seletivos que inibem pelo menos uma enzima similar à QC (QPCTL) com um valor ki que é uma ordem de magnitude inferior que seu valor ki para a inibição de glutaminil ciclase (QC, QPCT). Mais preferivel- mente, o valor ki do dito inibidor de QPCTL seletivo para a inibição de pelo menos uma enzima similar à QC (QPCTL) são duas ordens de magnitude inferior que seu valor ki para a inibição de glutaminil ciclase (QC, QPCT). Até mesmo mais preferido são inibidores de QPCTL seletivos, em que seu valor ki para a inibição de pelo menos uma enzima similar à QC (QPCTL) são três ordens de magnitude inferior que seu valor ki para a inibição de glutaminil ciclase (QC, QPCT). Os mais preferidos são inibidores de QPCTL seletivos que não inibem a atividade de glutaminil ciclase (QC, QPCT). POTÊNCIA DE INIBIÇÃO DE QC
Levando em conta a correlação com a inibição de QC, em moda- lidades preferidas, o método em questão e uso médico utilizam um agente com uma Ki para inibição de QC de 10 μΜ ou menos, mais preferivelmente de 1 μΜ ou menos, até mesmo mais preferivelmente de 0,1 μΜ ou menos ou 0,01 μΜ ou menos, ou o mais preferivelmente 0,01 μΜ ou menos. De fato, inibidores com valores Ki na faixa micromolar inferior, preferivelmente nano- molar e até mesmo mais preferivelmente picomolar, são contemplados. Des- se modo, embora os agentes ativos sejam descritos aqui, por conveniência, como "inibidores de QC", será entendido que tal nomenclatura não é inten- cionada a limitar o tema da invenção a um mecanismo particular de ação. PESO MOLECULAR DOS INIBIDORES DE QC
Em geral, os inibidores de QC do método em questão ou uso médico serão moléculas pequenas, por exemplo, com pesos moleculares de 1000 g/mol ou menos, 500 g/mol ou menos, preferivelmente de 400 g/mol ou menos, e até mesmo mais preferivelmente de 350 g/mol ou menos e até mesmo de 300 g/mol ou menos.
O termo "sujeito" como aqui usado, refere-se a um animal, prefe- rivelmente um mamífero, o mais preferivelmente um ser humano que foi o objeto de tratamento, observação ou experimento. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" como aqui usado,
significa aquela quantidade de composto ativo ou agente farmacêutico que suscita a resposta biológica ou medicinal em um sistema de tecido, animal ou humano sendo buscada por investigador, veterinário, médico ou outro clínico, que inclui alívio dos sintomas da doença ou distúrbio sendo tratado.
Como aqui usado, o termo "farmaceuticamente aceitável" abran- ge uso humano e veterinário: por exemplo o termo "farmaceuticamente acei- tável" abrange um composto veterinariamente aceitável ou um composto aceitável na medicina humana e cuidado médico. SÍNDROME DE GUILLAIN-BARRÉ (GBS)
Nomes alternativos são síndrome de Landry-Guillain-Barré, Poli- neurite idiopática aguda, Polineurite infecciosa ou Polineuropatia inflamatória aguda. Síndrome de Guillain-Barré é um distúrbio sério que ocorre quando o sistema de defesa do corpo (imune) erradamente ataca parte do sistema nervoso. Isto leva à inflamação nervosa que causa fraqueza muscular, que continua a piorar.
Síndrome de Guillain-Barré é um distúrbio autoimune. A causa exata da síndrome de Guillain-Barré é desconhecida. A síndrome pode ocor- rer em qualquer idade, mas é muito comum em pessoas de ambos os sexos entre as idades 30 e 50. Esta freqüentemente segue uma infecção secundá- ria, usualmente uma infecção respiratória (pulmão) ou infecção gastrintesti- nal (intestino). Usualmente, os sinais da infecção original desapareceram antes dos sintomas de Guillain-Barré começarem. Síndrome de Guillain- Barré causa inflamação que danifica partes dos nervos. Este dano dos ner- vos causa formigamento, fraqueza muscular, e paralisia. A inflamação usu- almente afeta o revestimento nervoso (bainha mielina). Tal dano é chamado desmielinação. Desmielinação reduz a sinalização dos nervos. Dano a ou- tras partes do nervo pode fazer o nervo deixar de funcionar.
Sintomas de Guillain-Barré ficam piores muito rapidamente. Po- de levar apenas algumas horas para alcançar os sintomas mais severos. Fraqueza muscular ou a perda da função muscular (paralisia) afeta ambos os lados do corpo. Se a fraqueza muscular inicia nas pernas e depois espar- rama para os braços, ela é chamada paralisia ascendente.
Pacientes podem notar formigamento, dor no pé ou na mão, e perda de coordenação motora. À medida que a perda da função muscular fica pior, o paciente pode precisar de ajuda para respirar. Não há nenhuma cura para síndrome de Guillain-Barré. Porém, muitos tratamentos estão dis- poníveis para ajudar a reduzir os sintomas, tratar as complicações, e acele- rar o restabelecimento. Quando os sintomas forem severos, o paciente ne- cessitará ir para o hospital para ajuda respiratória, tratamento, e terapia físi- ca. Um método chamado plasmaferese é usado para remover o sangue de uma pessoa e substituí-lo com fluidos intravenosos ou sangue doado que estejam livres de anticorpos. Terapia de imunoglobulina de dose alta é outro procedimento usado para reduzir a severidade e extensão dos sintomas de Guillain-Barré. Outros tratamentos são direcionados para impedir complica- ções.
POLIRRADICULONEUROPATIA DESMIELINIZANTE INFLAMATÓRIA CRÔNICA (CIDP)
Uma doença que se assemelha à GBS mas é caracterizada por um curso crônico é chamada polirradiculoneuropatia desmielinizante inflama- tória crônica (CIDP). Ainda não há nenhuma definição geral aplicável para CIDP com a exceção da observação que, em contraste com GBS, a fase progressiva dura muito mais tempo que quatro semanas, freqüentemente mais longo que seis meses, e que deficiências freqüentemente permanecem no paciente. O mecanismo que causa a paralisia severa com GBS e CIDP possivelmente inclui uma reação imune e inflamação mediada por linfócitos T seguindo desmielinização dos neurônios periféricos. Esta suposição é con- firmada por quantidades aumentadas de compostos complementares e cito- cinas observadas no soro e fluido cérebro-espinhal de pacientes de GBS. O processo de desmielinização, especialmente na região das raízes nervosas, é considerado correntemente como o mecanismo decisivo no desenvolvi- mento de bloco de condução do nervo. Uma teoria é com base em um dis- túrbio da barreira de sangue/fluido cérebro-espinhal (CSF) como uma etapa importante relativamente prematura no desenvolvimento da doença. Outra teoria reivindica que vazamentos desenvolvem na barreira de sangue/CSF como conseqüência da doença e causa o conteúdo de proteína aumentado no CSF. De qualquer modo, constituintes de soro não-específicos sem refe- rência direta ao sistema imune poderiam penetrar no CSF sangüíneo, causar disfunções neuronais ou gliais e/ou modificar a atividade neuronal. Um me- canismo alternativo é uma taxa de fluxo reduzida do CSF que poderia expli- car o conteúdo de proteína aumentado do CSF. Esta interpretação não re- quer nenhum prejuízo ou seletividade modificada da barreira de san- gue/CSF. Embora todos os efeitos mencionados pudessem ser de importân- cia para o curso de GBS e CIDP, sua contribuição atual para os sintomas ainda não foi esclarecida. Não foi possível estabelecer uma conexão entre as concentrações de proteína aumentadas no CSF e achados eletrofisiológi- cos específicos ou o quadro clínico. Fatores no CSF de pacientes de GBS e pacientes de esclerose múltipla, que interagem com canais de sódio depen- dentes de potencial, foram recentemente descritos (Wuz et al. 1995, Muscle and Nerve 18, 772 - 781). Bhnkmeier (Bhnkmeier et al. 1996, Muscle and Nerve 19, 54-62) relata que os fatores têm um peso molecular de menos de três kDa, e sob condições de teste mais rigorosas de menos de um kDa. Em base desta observação e o fato que a atividade dos fatores não foi reduzida substancialmente até mesmo após incubação de CSF com proteases, os autores concluíram que os fatores não eram nem anticorpos nem citocinas. ESCLEROSE MÚLTIPLA (EM) Esclerose múltipla é uma doença autoimune que afeta o sistema
nervoso central (o cérebro e espinha dorsal). Esclerose múltipla usualmente afeta mais mulheres que homens. O distúrbio começa comumente entre as idades de 20 e 40, mas pode atacar em qualquer idade. A causa exata não é conhecida, mas acredita-se que EM seja o resultado de dano à bainha mieli- na, o material protetor que circunda as células nervosas. É uma doença pro- gressiva, significando o dano fica pior com o passar do tempo. Inflamação destrói a mielina, deixando áreas múltiplas de tecido de cicatriz (esclerose). A inflamação ocorre quando as próprias células imunes do corpo atacam o sistema nervoso. A inflamação causa impulsos nervosos para diminuir ou é bloqueada, conduzindo aos sintomas de SRA. Episódios repetidos, ou exa- cerbações, de inflamação podem ocorrer ao longo de qualquer área do cé- rebro e espinha dorsal. Os sintomas variam porque a localização e extensão de cada ataca variam. Usualmente episódios que duram dias, semanas, ou meses alternam com tempos de sintomas reduzidas ou nenhum (remissão). Recorrência (recaída) é comum embora progressão ininterrupta sem perío- dos de remissão pode também ocorrer.
Não está claro o que desencadeia um ataque. Pacientes com
EM tipicamente têm um número mais alto de células imunes que uma pes- soa saudável sugerindo que uma resposta imune poderia representar um papel. As teorias mais comuns apontam para um vírus ou defeito genético, ou uma combinação de ambos. Também parece haver uma ligação genética à doença. EM é mais provável de ocorrer no norte da Europa, norte dos Es- tados Unidos, sul da Austrália, e Nova Zelândia que em outras áreas. Estu- dos geográficos indicam que pode haver um fator ambiental envolvido. Pes- soas com uma história familiar de EM e aqueles que vivem em uma área geográfica com uma taxa de incidência mais alta para EM têm um risco mais alto da doença.
Não há nenhuma cura conhecida para esclerose múltipla até agora. Porém, há várias terapias que podem reduzir a doença. A meta de tratamento é controlar os sintomas e manter uma qualidade de vida normal. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção provê proteínas com atividades de glutami-
nil ciclase que constituem os novos membros de uma família de proteínas relacionadas à glutaminil ciclase, incluindo as proteínas de comprimento to- tal, formas de divisão alternativa, subunidades, e mutantes, como também seqüências de nucleotídeo que codificam a mesma. A presente invenção também fornece métodos de triar substratos, interagir proteínas, agonistas, antagonistas ou inibidores das proteínas acima, e além disso, às composi- ções farmacêuticas compreendendo as proteínas e/ou mutantes, derivados e/ou análogos das mesmas e/ou Iigantes a estas.
Estas proteínas novas tendo similaridade de seqüência significa- tiva à glutaminil ciclase (seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1, se- qüência de proteína de SEQ ID NO: 10) são proteínas (QPCTLs) de humano (nomeada também como isoQC humana) (no. de acesso do GenBank ΝΜ_017659), camundongo (no. de acesso do GenBank NM_027455), Ma- caca fascicularis (no. de acesso do GenBank AB168255), Macaca mulatta (no. de acesso do GenBank XM_001110995), gato (no. de acesso do Gen- Bank XM_541552), rato (no. de acesso do GenBank XM_001066591), vaca (no. de acesso do GenBank BT026254) ou um análogo das mesmas tendo pelo menos 50 % / 75 % de identidade de seqüência / similaridade, preferi- velmente 70 % / 85 % de identidade de seqüência / similaridade, o mais pre- ferivelmente 90 % / 95 % de identidade de seqüência / similaridade.
As seqüências de proteína são dadas nas SEQ. ID NOS: 11a 18. Também descritas são seqüências de ácido nucléico que codificam para estas proteínas (SEQ. ID NOS: 2 a 9). Tabela 1 ilustra a similaridade entre as proteínas novas e a glutaminil ciclase conhecida. Tabela 2 ilustra a identi- dade entre as proteínas novas e a glutaminil ciclase conhecida.
TABELA 1: Similaridade das seqüências de proteína das novas proteínas similares à ciclotransferases de peptídeo de glutaminil com glutaminil ciclase
Fonte de QPCTL isoQC humana (SEQ ID NO: 11) QC humana (SEQ ID NO: 10) human isoQC _ 71,98% M_fascicularis (SEQ ID NO: 13) 99,48 % 72,24 % M_mulatta (SEQ ID NO: 14) 99,48 % 72,24 % C_familiaris (SEQ ID NO: 15) 95,82 % 72,31 % R_norvegicus (SEQ ID NO: 16) 95,30 % 70,77 % M_musculus (SEQ ID NO: 17) 95,04 % 70,77 % B_taurus (SEQ ID NO: 18) 96,08 % 72,31 %
TABELA 2: Identidade das seqüências de proteína das novas proteínas simi- lares à ciclotransferases de peptídeo de glutaminil com glutaminil ciclase Fonte de QPCTL isoQC humana (SEQ ID NO: 11) QC humana (SEQ ID NO: 10) isoQC humana (SEQ ID NO: 11) - 45,24 % M_fascicularis (SEQ ID NO: 13) 98,17% 44,99 % M_mulatta (SEQ ID NO: 14) 98,17% 44,99 % C_familiaris (SEQ ID NO: 15) 88,51 % 45,13 % R_norvegicus (SEQ ID NO: 16) 84,33 % 45,38 % M_musculus (SEQ ID NO: 17) 84,07 % 44,62 % BJtaurus (SEQ ID NO: 18) 84,60 % 45,64 %
Há uma similaridade alta de 95 a 99 % e uma identidade alta de
84 a 98 % entre às QPCTLs de fontes diferentes (vide figura 2). Em base da similaridade de seqüência com a glutaminil ciclase humana e murina (vide Figura 1), podería-se prognosticar que estas QPCTLs teriam funções que incluem, mas não são limitadas a, papéis como enzimas. Clonagem, expres- são, caracterização bioquímica e molecular confirmou esta hipótese.
O padrão de expressão das QPCTLs em cérebro, próstata e te- cido pulmonar é consistente com um papel nas doenças descritas abaixo. A atividade enzimática como glutaminil ciclase demonstra que moléculas ati- vadoras e inibidoras de QPCTLs terá numerosas aplicações terapêuticas como descritas abaixo.
Atividades de QPCTL descritas aqui e seus padrões de expres- são são compatíveis com seus papéis funcionais como reguladores fisiológi- cos dos sistemas imune e neuroendócrino através da modificação enzimáti- ca de mediadores bioquímicos como hormônios, peptídeos e quimocinas. As numerosas funções previamente descritas para QC com base no uso de ini- bidores podem ser em parte devidas à sua ação e à das proteínas similares, como as QPCTLs. Portanto, a descoberta de inibidores seletivos e potentes de QC, das QPCTLs e de outras enzimas relacionadas é considerada central para alcançar uso farmacêutico eficaz e seguro destas e quaisquer ciclo- transferases de peptídeo de glutaminil recentemente identificadas, como também outros compostos ativos que modificam a(s) função(ões) de tais proteínas.
A invenção desse modo fornece novas proteínas ou polipeptí- deos, os ácidos nucléicos codificando portanto, células que foram modifica- das com o ácido nucléico para expressar estas proteínas, anticorpos para estas proteínas, um método de triagem para a descoberta de agentes tera- pêuticos novos que são inibidores da atividade destas proteínas (ou que são inibidores de QC e não das proteínas), e agentes terapêuticos descobertos para tais métodos de triagem. As novas proteínas e os ácidos nucléicos co- dificando portanto, podem ser usados para descobrir agentes terapêuticos novos para o tratamento de certas doenças, tais como por exemplo, distúr- bios neurodegenerativos, reprodutivos, inflamatórios e metabólicos e tam- bém na preparação de anticorpos com valor terapêutico ou diagnóstico.
De acordo com um aspecto da presente invenção, são forneci- das novas proteínas biologicamente ativas, maduras, preferivelmente de ori- gem humana. Tais proteínas podem ser isoladas em quantidades pequenas de tecido animal adequado (incluindo humano) ou fluidos biológicos através de técnicas padrão; porém, quantidades maiores são mais convenientemen- te preparadas em culturas de células geneticamente modificadas para ex- pressar a proteína.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, são forne- cidas moléculas de ácido nucléico isoladas que codificam polipeptídeos da presente invenção incluindo mRNAs, DNAs, cDNAs, DNAs genômicos das mesmas.
De acordo com um outro aspecto da presente invenção, são for-
necidas sondas de ácido nucléico também compreendendo moléculas de ácido nucléico de comprimento suficiente para especificamente hibridar com a uma seqüência de ácido nucléico da presente invenção.
De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, são providos processos utilizando técnicas recombinantes para produzir tais po- lipeptídeos úteis para pesquisa científica in vitro, por exemplo, síntese de DNA e fabricação de vetores de DNA. Processos para produzir tais polipep- tídeos incluem cultivar células hospedeiras procarióticas e/ou eucarióticas recombinantes que foram transfeccionadas com vetores de DNA contendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica um tal polipeptídeo e/ou a pro- teína madura sob condições que promovem expressão de tal proteína e res- tabelecimento subsequente de tal proteína ou um fragmento do produto ex- presso.
De acordo com ainda outro aspecto, a invenção provê métodos para usar polipeptídeos e polinucleotídeos de QPCTL para o tratamento de doenças.
De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é for- necido um processo para utilizar tais polipeptídeos, ou polinucleotídeos que codificam tais polipeptídeos, para a descoberta de compostos que inibem a atividade biológica das proteínas maduras, por exemplo a atividade de QC ou a atividade de EC, e tais inibidores são desse modo também fornecidos.
De acordo com um aspecto mais específico, a invenção provê um ácido nucléico isolado que codifica (a) um polipeptídeo de QPCTL, sele- cionado das SEQ ID NOS: 11 a 18, ou (b) tendo uma seqüência de aminoá- cido que é pelo menos cerca de 75 % similar a esta e exibe a mesma função biológica, ou que é uma variante de divisão alternativa de uma das SEQ ID NOS: 2 a 9, ou que é uma sonda compreendendo pelo menos 14 nucleotí- deos contíguos do dito ácido nucléico que codifica (a) ou (b), ou que é com- plementar a qualquer um dos antecedentes.
De acordo com outro aspecto específico, a invenção provê um polipeptídeo que pode ser opcionalmente glicosilado, e que (a) tem a se- qüência de aminoácido de uma proteína madura exposta em qualquer uma das SEQ ID NOS: 10 a 18; preferivelmente de uma proteína madura exposta em qualquer uma das SEQ ID NOS: 11 a 18 (b) tem a seqüência de aminoá- cido de uma proteína madura tendo pelo menos cerca de 75 % de similari- dade a uma das proteínas maduras de (a) e que exibe a mesma função bio- lógica; (c) tem a seqüência de aminoácido uma proteína madura tendo pelo menos cerca de 50 % de identidade com uma proteína madura de qualquer das SEQ ID NOS: 10 a 18; preferivelmente de uma proteína madura exposta em qualquer uma das SEQ ID NOS: 11 a 18 ou (d) é um fragmento imunolo- gicamente reativo de (a).
De acordo com ainda outro aspecto específico, a invenção provê um método de triar um composto capaz de inibir a atividade enzimática de pelo menos uma proteína madura de acordo com a presente invenção, pre- ferivelmente selecionada das proteínas das SEQ ID NOS: 11 a 18, cujo mé- todo compreende incubar a dita proteína madura e um substrato adequado para a dita proteína madura na presença de um ou mais compostos de teste ou sais dos mesmos, medir a atividade enzimática da dita proteína madura, comparar a dita atividade com atividade comparável para determinar a au- sência de um composto de teste, e selecionar o composto de teste ou com- postos que reduzem a atividade enzimática.
Também, a presente invenção diz respeito aos kits de diagnósti- co e métodos com base no uso de um inibidor de QC, inibidor de QC seletivo ou inibidor de QPCTL seletivo.
Estes e outros aspectos da presente invenção deveriam ser evi- dentes àqueles versados na técnica da descrição detalhada que segue. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1 mostra o alinhamento de seqüência de QC humana (hQC), isoQC humana (hisoQC), QC murina (mQC) e isoQC murina (mi- soQC). Alinhamento de seqüência múltiplo foi executado usando CIustaIW a PBIL (Pôle Bioinformatique Lyonnais) (http://npsa-pbil.ibcp.fr) com ajustes predefinidos. A conservação do resíduos Iigantes de íon de zinco é mostrada para QC humana (hQC; GenBank X71125, SEQ ID NO: 10), isoQC humana (hisoQC, GenBank NM_017659, SEQ ID NO: 11), QC murina (mQC, Gen- Bank NM_027455, SEQ ID NO: 79) e isoQC murina (misoQC, GenBank BC058181, SEQ ID NO: 17) em negrito e sublinhado. Figura 2 mostra o alinhamento de seqüência de isoQC de Homo sapiens (hisoQC, GenBank NM_017659, SEQ ID NO: 11), Macaca fascicula- ris (M_fascicularis, GenBank AB168255, SEQ ID NO: 13), Macaca mulatta (M_mulatta, GenBank XM_001110995, SEQ ID NO: 14), Canis familiaris (CJamiliaris, GenBank XM_541552, SEQ ID NO: 15), Rattus norvegicus (Rji- orvegicus, GenBank XM_001066591, SEQ ID NO: 16), Mus musculus (Mj- nusculus, GenBank BC058181, SEQ ID NO: 17) e Bos taurus (B_Jaurus, GenBank BT026254, SEQ ID NO: 18). Alinhamento de seqüência múltiplo foi executado usando CIustaIW a PBIL (Pôle Bioinformatique Lyonnais) (http://npsa-pbil.ibcp.fr) com ajustes predefinidos. Os aminoácidos dos resí- duos Iigantes de íon de zinco conservados estão sublinhados e em negrito.
Figura 3 mostra o alinhamento de seqüência de QC humana (hQC, SEQ ID NO: 10) e isoQC humana (hisoQC, SEQ ID NO: 12) e outros membros da família de M28 do Clã de metalopeptidase MH. Alinhamento de seqüência múltiplo foi executado usando CIustaIW a ch.EMBnet.org com ajustes predefinidos. A conservação dos resíduos de aminoácido ligando o íon de zinco simples dentro da QC humana (hQC; Swiss-Prot Q16769, SEQ ID NO: 10), é mostrada para a isoQC humana (isoQC; Swiss-Prot Q53HE4, SEQ ID NO: 12) (resíduos 19-382), o aminopeptidase Zn-dependente de Streptomyces griseus (SGAP; Swiss-Prot P80561, SEQ ID NO: 80) e a Ieu- cil-aminopeptidase Zn-dependente madura de Vibrio proteolyticus (VpAP; Swiss-Prot Q01693, SEQ ID NO: 81). Os respectivos resíduos de aminoáci- do estão sublinhados e em negrito.
Figura 4 mostra o alinhamento de seqüência de QC humana (hQC, SEQ ID NO: 10) e isoQC humana (hisoQC, SEQ ID NO: 11), mos- trando dois inícios tranlacionais putativos (metionina I - em negrito, sublinha- do; metionina Il - em negrito). Alinhamento de seqüência múltiplo foi execu- tado usando CIustaIW a PBIL (Pôle Bioinformatique Lyonnais) http://npsa- pbil.ibcp.fr com ajustes predefinidos. O domínio de transmembrana, presente em isoQC humana, está indicado pela barra preta.
Figura 5 mostra o alinhamento de seqüência de QC humana (hQC, SEQ ID NO: 10) e isoQC humana (hisoQC, SEQ ID NO: 12), iniciando com metionina Il (em negrito). Alinhamento de seqüência múltiplo foi execu- tado usando CIustaIW em ch.EMBnet.org com ajustes predefinidos. Os ami- noácidos envolvidos na ligação de metal estão sublinhados e em negrito. O domínio de transmembrana, presente em isoQC humana, está indicado pela barra preta.
Figura 6 mostra a análise de expressão de isoQC por RT-PCR. Detecção em SH-SY5Y, LN405, HaCaT e Hep-G2.
Rotas: bp, DNA padrão; 1, produto de PCR amplificado de isoQC humana de SH-SY5Y; 2, produto de PCR amplificado de isoQC humana de LN405; 3, produto de PCR amplificado de isoQC humana de HaCaT; 4, produto de PCR amplificado de isoQC humana de Hep-G2.
Figura 7 mostra a análise da localização subcelular de isoQC (Met I, SEQ ID NO: 11) através de imuno-histoquímica. IsoQC humana inici- ando em metionina I (vide Figura 5) foi expressa como uma proteína de fu- são com EGFP (isoQC (Meti) EGFP) em LN 405. Contratingimento de Ma- nosidase Il foi executado usando AB3712 (Chemicon). Fusão representa a sobreposição de tingimento de isoQC (MetI)-EGFP e Manosidase II.
Figura 8 mostra a análise da localização subcelular de isoQC (Met I, SEQ ID NO: 11) através de imuno-histoquímica. IsoQC humana inici- ando em metionina I foi expressa como uma proteína de fusão com EGFP (isoQC (Meti) EGFP) em LN 405. Contratingimento mitocondrial foi executa- do usando MAB1273 (Chemicon). Fusão representa a sobreposição de tin- gimento de isoQC (MetI)-EGFP e mitocondrial.
Figura 9 mostra a análise da localização subcelular de isoQC (Met II, SEQ ID NO: 12) através de imuno-histoquímica. IsoQC humana ini- ciando na metionina Il foi expressa como uma proteína de fusão com EGFP (isoQC (MetII) EGFP) em LN 405. Contratingimento de Manosidase Il foi e- xecutado usando AB3712 (Chemicon). Fusão representa a sobreposição de tingimento de isoQC (MetII)-EGFP e Manosidase II. Figura 10 mostra a análise da localização subcelular de isoQC
(Met II, SEQ ID NO: 12) através de imuno-histoquímica. IsoQC humana ini- ciando em metionina Il foi expressa como uma proteína de fusão com EGFP (isoQC (MetII) EGFP) em LN 405. Contratingimento mitocondrial foi execu- tado usando MAB1273 (Chemicon). Fusão representa a sobreposição de tingimento de isoQC (MetII)-EGFP e mitocondrial.
Figura 11 mostra a análise da localização subcelular de isoQC (Met I, SEQ ID NO: 11) através de imuno-histoquímica. IsoQC humana inici- ando em metionina I foi expressa como uma proteína de fusão com EGFP (isoQC (Meti) EGFP) em COS-7. Contratingimento de Manosidase Il foi exe- cutado usando AB3712 (Chemicon). Fusão representa a sobreposição de tingimento de isoQC (MetI)-EGFP e Manosidase II. Figura 12 mostra a análise da localização subcelular de isoQC
(Met I, SEQ ID NO: 11) através de imuno-histoquímica. IsoQC humana inici- ando em metionina I foi expressa como uma proteína de fusão com EGFP (isoQC (Meti) EGFP) em COS-7. Contratingimento mitocondrial foi executa- do usando MAB1273 (Chemicon). Fusão representa a sobreposição de i- soQC (MetI)-EGFP e tingimento mitocondrial.
Figura 13 mostra a análise da localização subcelular de isoQC (Met II, SEQ ID NO: 12) através de imuno-histoquímica. IsoQC humana ini- ciando em metionina Il foi expressa como uma proteína de fusão com EGFP (isoQC (MetII) EGFP) em COS-7. Contratingimento de manosidase Il foi e- xecutado usando AB3712 (Chemicon). Fusão representa a sobreposição de tingimento de isoQC (MetII)-EGFP e Manosidase II.
Figura 14 mostra a análise da localização subcelular de isoQC (Met II, SEQ ID NO: 12) através de imuno-histoquímica. Expressão de isoQC humana iniciando em metionina Il como uma proteína de fusão com EGFP (isoQC (MetII) EGFP) em COS-7. Contratingimento mitocondrial foi executa- do usando MAB1273 (Chemicon). Fusão representa a sobreposição de tin- gimento de isoQC (MetII)-EGFP e mitocondrial.
Figura 15 mostra a inibição de conversão catalisada por isoQC humana de H-GIn-AMC em pGlu-AMC pelo inibidor P150/03. Os dados fo- ram avaliados de acordo com o modelo cinético de Michaelis-Menten consi- derando inibição competitiva linear. Concentrações do inibidor foram como segue: 0 μΜ 0,3125 μΜ —Δ— 0,625 μΜ —B— 1,25 μΜ —□— 2,5 μΜ —·— 5 μΜ
O valor Ki determinado foi 240 ± 8 nM.
Figura 16 mostra a conversão catalisada por isoQC humana de H-GIn-AIa-OH em pGlu-Ala-OH determinado usando um ensaio espectrofo- tométrico. Os dados foram avaliados de acordo com a cinética de Michaelis- Menten. Os parâmetros cinéticos foram 324 ± 28 μΜ e 7,4 ± 0,2 nM/min para Km e valor Vmax, respectivamente.
Figura 17 fornece uma representação esquemática das cons- tructos de proteína de isoQC humana que foram expressadas de forma hete- róloga na levedura P. pastoris. Duas mutações foram introduzidas em algu- mas proteínas, levando a um sítio de glicosilação na posição 55 (I55N) e um resíduo de cisteína mutado na posição 351 (C351A). Para expressão, o tér- mino N incluindo o domínio de transmembrana foi substituído por um sinal de secreção de levedura (YSS). As constructos contendo o sinal de secre- ção N-terminal deveriam ser eficientemente segregadas no meio. Figura 18 mostra a atividade de QC que foi determinada no meio
de expressão das células de levedura. Devido ao domínio de transmembra- na, as constructos nativas não foram segregadas no meio (não implementa- do). Causadas por glicosilação (I55N), as proteínas são mais eficientemente segregadas. A mutação C351A resultou também em atividade de QC mais alta detectada no meio. As constructos são descritas na Figura 17.
Figura 19 mostra a purificação da isoQC humana, com base na constructo YSShisoQCI55NC351A C-His, do meio de uma cepa de P. pasto- ris transgênica. A QC foi purificada por uma combinação de IMAC (cromato- grafia de afinidade de metal imobilizado, rota 3), HIC (cromatografia de inte- ração hidrofóbica, rota 4) e dessalgação (rota 5). A glicosilação da enzima foi evidência por desglicosilação enzimática resultando em um deslocamento na migração da proteína (rota 6). Rota 1, proteína padrão: Rota 2, meio antes da purificação.
Figura 20 mostra a purificação da isoQC humana, com base na constructo GST-hisoQC C-His, do homogeneizado celular de E. coli trans- formado. A isoQC foi purificada por uma combinação de IMAC (cromatogra- fia de afinidade de metal imobilizada, rota 3), afinidade de GST (rota 4), des- salgação (rota 5) e cromatografia de permuta de íons (rota 6). Rota 1, prote- ína padrão: Rota 2, homogeneizado celular antes da purificação. A diferença na massa molecular entre a hisoQC que foi expressa em levedura e E. coli é causada pela fusão de GST-marcador N-terminal. A constructo expressa é fornecida esquematicamente na parte superior da figura.
Figura 21 mostra as constantes de especificidade para conver- são de substitutos de dipeptídeo, dipeptídeos e oligopeptídeos através de isoQC humana (YSShisoQCI55NC351A C-His; comparar Figura 17), GST- hisoQC e QC humana. A especificidade de GST-hisoQC foi a mais baixa, seguida por YSShisoQCI55NC351A C-His. A especificidade mais alta exibiu QC humana, indicando uma atividade enzimática geral mais alta.
Figura 22 mostra a dependência de pH da catálise, investigada com isoQC humana (hisoQC) que foi expressa em levedura e QC humana (hQC). Ambas as proteínas exibem uma ótima de pH entre pH 7 e 8. A curva ajustada é com base em três grupos de dissociação que influenciam a catá- lise, um em pH acídico, dois em pH básico.
Figura 23 mostra a análise da conversão de ácido glutâmico que está presente no término N do peptídeo relacionado a amilóide-β Αβ(3-11). A análise foi executada usando espectrometria de massa de Maldi-Tof, o subs- trato e produto diferem em sua razão de massa/carga molecular da molécula carregada simples em cerca de 18Da, que é a massa da água liberada. Em ambos os casos, a mesma concentração da proteína estava presente nas amostras, sugerindo claramente que isoQC humana também converte ácido glutâmico N-terminal, mas mais lento que a QC humana.
Figura 24 mostra a distribuição de tecido de QC murina (mQC, SEQ ID NO: 79) e sua isoenzima misoQC (SEQ ID NO: 17), analisada usan- do PCR de tempo real. Ambas as enzimas são expressadas nos órgãos tes- tados. Porém, o nível de expressão de mQC foi mais alto no cérebro compa- rado com os órgãos periféricos. Em contrate, misoQC foi expressa em todos os órgãos e tecidos testados a um nível mais similar, indicando uma proteína "mantenedora", ubíqua.
Figura 25 mostra a inibição dependente de tempo de isoQC hu- mana (hisoQC) através de compostos quelantes de metal 1,10-fenantrolina (círculos) e EDTA (quadrados). Atividade de hisoQC residual foi diretamente determinada após adição (símbolos fechados) ou pré-incubação de hisoQC com respectivo reagente por 15 min. a 30° C (símbolos abertos).
Figura 26 mostra a análise bioquímica da localização subcelular da atividade de QC após expressão de pcDNA e as enzimas nativas hisoQC (Met I, SEQ ID NO: 11), hisoQC (Met II, SEQ ID NO: 12) e hQC (SEQ ID NO: 10) em células de HEK293. (A) atividade específica dentro das frações celu- lares em μηΊθΙ/min./g. (B) atividade absoluta em nM / min. (C) Expressão de h-isoQC (Met II, SEQ ID NO: 11), h-isoQC (Met II, SEQ ID NO: 12) e hQC (SEQ ID NO: 10) possuindo um marcador Flag C-terminal em HEK293 em comparação ao controle transfeccionado com vetor (pcDNA), seguido por análise de Western blot aplicando anticorpos específicos detectando ou epí- topo de Flag (anticorpo de anti-DYKDDDDK, Cell Signal), uma proteína de 65 kDa de mitocôndrias humanas (mitocôndrias anti-humanas, Chemicon) ou Sialiltransferase humana ST1GAL3 (Abnova).
Figura 27 mostra a localização subcelular de isoQC humana (hi- soQC) seqüências sinais (27A) metionina I - serina 53 e (27B) metionina Il - serina 53, fundidas com EGFP (1, 4). Complexo de Golgi foi tingido usando um anticorpo de anti-manosidase Il (2) e as mitocôndrias foram tingidas u- sando um anticorpo detectando uma proteína de 65 kDA de mitocôndrias humanas (5). Co-localização é mostrada por superimposição de fluorescên- cia de EGFP e fluorescência Vermelha X (3, 6). Figura 28 mostra a estrutura de domínio de isoQC humana (hi-
soQC) e isoQC murina (misoQC) em comparação com as seqüências publi- cadas de glicosiltransferases humanas: alfa-N-acetilgalactosaminida alfa- 2,6-sialil transferase 1 (ST6GalNAC1; E.C. 2.4.99.3); beta-1,4- galactosiltransferase 1 (b4Gal-T1, E.C. 2.4.1.-); Galactosídeo 3(4)-L- fucosiltransferase (FucT-lll; E.C. 2.4.1.65) e Glicoproteína- fucosilgalactosídeo alfa-N-acetilgalactosaminil transferase (NAGAT, E.
C.2.4.1.40). O número de aminoácidos como listados abaixo nas colunas. A parte citosólica está sombreada, a hélice de transmembrana está preta e parte Iuminal está ilustrada em branco.
Figura 29 mostra a quantificação de mRNA de isoQC humana (QPCTL) em linhagens celulares de carcinoma diferentes. A expressão de QPCTL foi normalizada a 50 ng de RNA total. A barra preta dentro das cai- xas representa a respectiva média.
Figura 30 mostra a quantificação da expressão de mRNA de i- soQC humana (QPCTL) em linhagens celulares de melanoma diferentes. A expressão de QPCTL foi normalizada para 50 ng de RNA total. Figura 31 mostra a quantificação da expressão de mRNA de i-
soQC humana (QPCTL) em amostras de carcinoma de tecido macio, carci- noma gástrico e carcinoma da tiróide de pacientes diferentes. A expressão de QPCTL foi normalizada para 50 ng de RNA total. A barra preta dentro das caixas representa a respectiva média. Figura 32 mostra a expressão de mRNA de isoQC humana
(QPCTL) em carcinomas gástricos diferentes contra seu estágio de diferen- ciação. Expressão de QPCTL foi normalizada para 50 ng de RNA total. A barra preta dentro das caixas representa a respectiva média.
Figura 33 mostra uma comparação da expressão de mRNA de QC humana (QPCT) em carcinomas da tiróide diferentes. Expressão de QPCT foi normalizada para 50 ng de RNA total. A barra preta dentro das caixas representa a respectiva média. (FTC: carcinoma folicular da tiróide; PTC: carcinoma papilar da tiróide; UTC: carcinoma indiferenciado da tiróide).
Figura 34 mostra uma comparação da expressão de mRNA de isoQC humana (QPCTL) em carcinomas da tiróide diferentes. Expressão de QPCTL foi normalizada para 50 ng de RNA total. A barra preta dentro das caixas representa a respectiva média. (FTC: carcinoma folicular da tiróide; PTC: carcinoma papilarda tiróide; UTC: carcinoma indiferenciado da tiróide).
Figura 35 mostra a influência de estímulos diferentes na expres- são de mRNA de QC humana (QPCT), isoQC humana (QPCTL) e CCL2 em células de HEK293. A quantidade de transcrições é descrita relativo à ex- pressão basal sem estímulo. A concentração usada de estímulo é declarada no desenho do eixo geométrico x.
Figura 36 mostra a influência de estímulos diferentes na expres- são de mRNA de QC humana (QPCT), isoQC humana (QPCTL) e CCL2 em células de FTC-133. A quantidade de transcrições é descrita relativo à ex- pressão basal sem estímulo. A concentração usada de estímulo é declarada no desenho do eixo geométrico x.
Figura 37 mostra a influência de estímulos diferentes na expres- são de mRNA de QC humana (QPCT), isoQC humana (QPCTL) e CCL2 em células de THP-1. A quantidade de transcrições é descrita com relação à expressão basal sem estímulo. A concentração usada de estímulo é decla- rada no desenho do eixo geométrico x.
Figura 38 mostra a influência de estímulos diferentes na expres- são de mRNA de QC humana (QPCT), CCL2, CCL7, CCL8 e CCL13 em células de THP-1. A quantidade de transcrições é descrita com relação à expressão basal sem estímulo. A concentração usada de estímulo é decla- rada no desenho do eixo geométrico x.
Figura 39 mostra a influência da hipoxia no nível de mRNA de QC humana (QPCT), isoQC humana (QPCTL) e HIFIa em HEK293 (A), FTC-133 (B) e THP-1 (C). LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS______
SEQ ID NO Descrição 1 QC humana, ácido nucléico 2 Met I de isoQC humana, ácido nucléico 3 Met Il de isoQC humana, ácido nucléico 4 QPCTL de Macaca fascicularis, ácido nucléico QPCTL de Macaca mulatta, ácido nucléico 6 QPCTL de Canis familiaris, ácido nucléico SEQ ID NO Descrição 7 QPCTL de rato, ácido nucléico 8 QPCTL de camundongo, ácido nucléico 9 QPCTL bovina, ácido nucléico QC humana, proteína 11 Met I de isoQC humana, proteína 12 Met Il de isoQC humana, proteína 13 QPCTL de Macaca fascicularis, proteína 14 QPCTL de Macaca mulatta, proteína QPCTL de Canis familiaris, proteína 16 QPCTL de rato, proteína 17 QPCTL de camundongo, proteína 18 QPCTL bovina, proteína 19 splice de isoQC humana forma 1, ácido nucléico splice de isoQC humana forma 2, ácido nucléico 21 splice de isoQC humana forma 1, proteína 22 splice de isoQC humana forma 2, proteína 23 Peptídeo beta amilóide (Abeta) (1-42) 24 Abeta (1-40) Abeta (3-42) 26 Abeta (3-40) 27 Abeta (11-42) 28 Abeta (11-40) 29 PGIu3-Abeta (3-42) PGIu3-Abeta (3-40) 31 PGIu3-Abeta (11-42) 32 PGIu3-Abeta (11-40) 33 ABri 34 ADan Gastrina 17 36 Gastrina 34 SEQ ID NO Descrição 37 pGlu-Abri 38 pGlu-ADan 39 pGlu-Gastrina 17 40 pGlu-Gastrina 34 41 Neurotensina 42 GnRH 43 CCL16 44 CCL8 45 CCL2 46 CCL18 47 Fractalcina 48 CCL7 49 Orexina A 50 Substância P 51 QYNAD 52 pGlu-YNAD 53 iniciador direto de isoQC humana usado para triagem de li- nhagem celular 54 iniciador reverso de isoQC humana usado para triagem de linhagem celular 55 iniciador direto usado para isolamento de isoQC humana 56 iniciador reverso usado para isolamento de isoQC humana 57 iniciador direto usada para clonagem de isoQC humana (iso- forma MET I) em vetor pEGFP-N3 58 iniciador direto usado para clonagem de isoQC humana (iso- forma MET II) em vetor pEGFP-N3 59 iniciador reverso usado para clonagem de isoQC humana (i- soformas Met I e Met II) em vetor pEGFP-N3 60 iniciador direto usado para clonagem de isoQC humana em vetor pET41a SEQ ID NO Descrição 61 iniciador reverso usado para clonagem de isoQC humana em vetor pET41a 62 iniciador direto para clonar isoQC humana em vetor pPICZaA com um marcador de histidina C-terminal 63 iniciador direto para clonar isoQC humana em vetor pPICZaA com um marcador de histidina N-terminal 64 iniciador reverso para clonar isoQC humana em vetor pPIC- ZaA com um marcador de histidina N-terminal 65 iniciador direto para análise de PCR de tempo real de isoQC 66 iniciador reverso para clonar isoQC humana em vetor pPIC- ZaA com um marcador de histidina C-terminal 67 iniciador reverso para análise de PCR de tempo real de i- soQC 68 iniciador direto para clonagem de cDNA de isoQC murina 69 iniciador reverso para clonagem de cDNA de isoQC murina 70 iniciador direto para clonagem de cDNA de isoQC murina 71 iniciador direto para análise de PCR de tempo real de QC mu- rina 72 iniciador reverso para análise de PCR de tempo real de QC murina 73 iniciador direto para análise de PCR de tempo real de QC mu- rina 74 iniciador reverso para análise de PCR de tempo real de QC murina 75 iniciador direto para hisoQC de mutagênese dirigida I55N 76 iniciador reverso para hisoQC de mutagênese dirigida I55N 77 iniciador direto para hisoQC de mutagênese dirigida C351A 78 iniciador reverso para hisoQC de mutagênese dirigida C351A 79 proteína de glutaminil ciclase de camundongo 80 SGAP de Streptomyces griseus SEQ ID NO Descrição 81 VpAP de Vibrio proteolyticus 82 iniciador direto para inserção de hQC nativa em pcDNA 3.1 83 iniciador reverso para inserção de hQC nativa em pcDNA 3.1 84 iniciador reverso para amplificação de hisoQC incluindo o có- don de parada para inserção em pcDNA 3.1 85 iniciador direto para amplificação de EGFP 86 iniciador reverso para amplificação de EGFP 87 iniciador reverso para amplificação de seqüência N-terminal de hisoQC para fusão com EGFP 88 iniciador reverso para amplificação de hQC C-FLAG para in- serção em pcDNA 3.1 89 iniciador reverso para amplificação de hisoQC C-FLAG para inserção em pcDNA 3.1
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
De acordo com um aspecto da presente invenção, são forneci- das seqüências de ácido nucléico isoladas (polinucleotídeos) das SEQ ID NOS: 2 a 9, 19 e 20 que codificam os polipeptídeos maduros tendo as se- quências de aminoácido deduzidas das QPCTLs de fontes diferentes (SEQ ID NOS: 11 a 18, 21 e 22).
Preferido de acordo com a presente invenção são seqüências de ácido nucléico isoladas (polinucleotídeos) das SEQ ID NOS: 2 e 3, 19 e 20 que codificam os polipeptídeos maduros tendo as seqüências de aminoácido deduzidas das QPCTLs humanas (SEQ ID NOS: 11 e 12, 21 e 22).
Mais preferido de acordo com a presente invenção são seqüên- cias de ácido nucléico isoladas (polinucleotídeos) das SEQ ID NOS: 2 e 3 que codificam os polipeptídeos maduros tendo as seqüências de aminoácido deduzidas das QPCTLs humanas das SEQ ID NOS: 11 e 12. Até mesmo preferido de acordo com a presente invenção são
seqüências de ácido nucléico isoladas (polinucleotídeos) das SEQ ID NOS: 19 e 20 que codificam os polipeptídeos maduros tendo as seqüências de aminoácido deduzidas das formas de divisão alternativas de QPCTLs huma- nas das SEQ ID NOS: 21 e 22.
O mais preferido de acordo com a presente invenção é a se- qüência de ácido nucléico isolada (polinucleotídeo) da SEQ ID NO: 2 que codifica o polipeptídeo maduro tendo a seqüência de aminoácido deduzida da QPCTL humana das SEQ ID NOS: 11.
Até mesmo mais preferido de acordo com a presente invenção é a seqüência de ácido nucléico isolada (polinucleotídeo) da SEQ ID NO: 3 que codifica o polipeptídeo maduro tendo a seqüência de aminoácido dedu- zida da QPCTL humana das SEQ ID NOS: 12. As modalidades acima mencionadas e preferências aplicam-se
aos ácidos nucléicos de QPCTL como também proteínas de QPCTL e qual- quer método desejado de uso, diagnóstico, tratamento, triagem, efetores, inibidores e outros usos e métodos de acordo com a presente invenção.
Os polinucleotídeos desta invenção foram descobertos através de pesquisa de similaridade usando Nucleotide BLAST em NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) aplicando QC humana como modelo. A pesquisa resultou em descoberta de um QPCTL putativa no cromossomo 19, que é codificado na região 19q 13.32. Em base da pesquisa, foram proje- tados iniciadores para uma triagem da linhagem celular de isoQC humana (Tabela 4). O cDNA isolado para QPCTL humana contém uma estrutura de leitura aberta que codifica uma proteína de 382 aminoácidos em comprimen- to que é relacionada à QC humana exibindo 45,24 % de identidade de se- qüência e 71,98 % de similaridade. Aplicando algoritmos bioinformáticos di- ferentes (www.expasy.ch) para predição da localização subcelular não resul- ta em um resultado seguro. A prognose, dependendo do programa de predi- ção, foi transferência para o aparelho de golgi ou mitocôndrias.
Alinhamentos de seqüência de aminoácido de QPCTL humana com outros membros dos membros da família de M28 do Clã de metallopep- tidase MH mostram que a proteína de QPCTL humana tem seqüência geral e homologia estrutural à QC humana e murina (Figura 1) e aminopeptidases bacterianas (Figura 3). Uma pesquisa de base de dados para genes huma- nos adicionais relacionados à QPCTL revelou a presença de QPCTLs de roedor, símio, boi e cachorro. Alinhamento destas seqüências com a QPCTL humana nova mostra que elas exibem homologia considerável com sua con- traparte humana. Os resíduos de complexação de zinco de QC humana (Asp-GIu-His) são conservados dentro das QPCTLs de orgins diferentes (Fi- gura 2).
O gene de isoQC humana contém pelo menos 8 éxons. A se- qüência que codifica para a proteína de isoQC humana fica localizada nos éxons 1 a 7. IsoQC humana mapeia para o cromossomo 19 na posição 19q13.32. Uma triagem da linhagem celular para isoQC humana revelou transcrições em células originadas do fígado (Hep-G2, carcinoma hepatoce- lular), pele (HaCaT, ceratinócito) e tecidos neuronais (LN405, astrocitoma; SH-SY5Y, neuroblastoma) (Figura 6).
O QPCTL-cDNA isolado foi testado na expressão funcional em vários hospedeiros de expressão. Expressão em P. pastoris, que foi de for- ma bem sucedida aplicado para QC humana, não resulta em uma proteína enzimaticamente ativa. Expressão em células mamíferas resultou em detec- ção da atividade, porém, os níveis de expressão foram muito baixos. Desse modo, o isolamento de uma proteína enzimaticamente ativa não era possível com o conhecimento do artesão versado. Proteína enzimaticamente ativa foi isolada apenas seguindo a expressão de uma proteína de fusão de GST- QPCTL em E. coli, aplicando condições de expressão muito incomuns: Ex- pressão por 4 h a 37° C na presença de 1 % de Glicose, indução da expres- são usando 20 μΜ de IPTG. As condições da expressão resultam em uma expressão de baixo nível em E. Coli, que é necessário para enrolamento funcional da cadeia de peptídeo.
Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a animais "knockout" de QPCTL, preferivelmente ratos ou camundongos. O uso de camundongos "knockout" em outra análise da função dos genes de QPCTL é uma ferramenta valiosa. Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser na forma
de RNA ou na forma de DNA; DNA deveria ser entendido incluir cDNA, DNA genômico, e DNA sintético. O DNA pode ser bifilamentar ou unifilamen- tar e, se unifilamentar, pode ser o filamento de codificação ou filamento de não-codificação (antissentido). A seqüência de codificação que codifica o polipeptídeo maduro pode ser idêntica à seqüência de codificação mostrada nas SEQ ID NOS: 2 a 9, ou pode ser uma seqüência de codificação diferente que codifica o mesmo polipeptídeo maduro, como resultado da redundância ou degeneração do código genético ou um polimorfismo de nucleotídeo sim- ples. Por exemplo, ela pode também ser uma transcrição de RNA que inclui o comprimento inteiro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 11 a 18.
Os polinucleotídeos que codificam as proteínas maduras das SEQ ID NOS: 2 a 9 podem incluir, mas não são limitados a, a seqüência de codificação para a proteína madura sozinha; a seqüência de codificação pa- ra o polipeptídeo maduro mais a seqüência de codificação adicional, tal co- mo uma seqüência líder ou secretória ou uma seqüência de proproteína; e a seqüência de codificação para a proteína madura (e opcionalmente seqüên- cia de codificação adicional) mais a seqüência de não-codificação, tal como íntrons ou uma seqüência de não-codificação 5' e/ou 3' da seqüência de co- dificação para a proteína madura.
Desse modo, o termo "polinucleotídeo que codifica um polipeptí- deo" ou o termo "ácido nucléico que codifica um polipeptídeo" deveria ser entendido abranger um polinucleotídeo ou ácido nucléico que inclui apenas a seqüência de codificação para a proteína madura como também um que in- clui seqüência de codificação e/ou de não-codificação adicional. Os termos polinucleotídeos e ácido nucléico são usados alternadamente.
A presente invenção também inclui polinucleotídeos onde a se- qüência de codificação para a proteína madura pode ser fundida na mesma estrutura de leitura com uma seqüência de polinucleotídeo que auxilia na expressão e secreção de um polipeptídeo de uma célula hospedeira; por exemplo, uma seqüência líder que funciona como uma seqüência secretória para controlar o transporte de um polipeptídeo da célula pode ser assim fun- dida. O polipeptídeo tendo uma tal seqüência líder é denominado uma pré- proteína ou uma pré-proproteína e pode ter a seqüência líder clivada, pela célula hospedeira para formar a forma madura da proteína. Estes polinucleo- tídeos podem ter uma região estendida 5' de forma que ela codifica uma proproteína que é a proteína madura mais resíduos de aminoácido adicio- nais no término Ν. O produto de expressão que tem uma tal pró-sequência é denominado uma proproteína, que é uma forma inativa da proteína madura;
porém, uma vez a pró-sequência é clivada, uma proteína madura ativa per- manece. Desse modo, por exemplo, os polinucleotídeos da presente inven- ção podem codificar proteínas maduras, ou proteínas que têm uma pró- sequência, ou proteínas que têm uma pró-sequência e uma pré-sequência (seqüência líder).
Os polinucleotídeos da presente invenção podem também ter a
seqüência de codificação fundida na estrutura com uma seqüência marcado- ra que permite purificação dos polipeptídeos da presente invenção. A se- qüência marcadora pode ser um marcador de poli-histidina, um marcador de hemaglutinina (HA), um marcador c-myc ou um marcador V5 quando hospe- deiro mamífero, por exemplo células COS-1, for usado.
O marcador HA corresponderia a um epítopo derivado da proteí- na de hemaglutinina de influenza (Wilson, I., et al., Cell, 37: 767 (1984)), e o marcador c-myc pode ser um epítopo de proteína de Myc humana (Evans, G., I. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3610-3616(1985)). O termo "gene" significa o segmento de DNA envolvido na pro-
dução de uma cadeia de polipeptídeo; inclui regiões precedendo e seguindo a região de codificação (líder e reboque) como também seqüências interve- nientes (íntrons) entre os segmentos de codificação individuais (éxons).
O termo "homologia de seqüência significativa" é intencionado denotar que pelo menos 25 %, preferivelmente pelo menos 40 %, dos resí- duos de aminoácido são conservados, e que, dos resíduos não- conservados, pelo menos 40 % são substituições conservadoras.
Fragmentos dos genes de comprimento total da presente inven- ção podem ser usados como uma sonda de hibridação para uma biblioteca de cDNA para isolar cDNA de comprimento total como também isolar outros cDNAs que têm homologia de seqüência significativa ao gene e codificará proteínas ou polipeptídeos tendo atividade ou função biológica similares. Por atividade ou função biológica similares, para propósitos deste pedido de pa- tente, é significado a habilidade para formar piroglutamato de uma glutamina N-terminal ou ácido glutâmico de peptídeos, proteínas, hormônios ou outros substratos, definida como atividade de QC e EC1 respectivamente. Um tal sonda deste tipo tem pelo menos 14 bases (pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma das SEQ ID NOS: 2 a 9), preferivelmente pelo menos 30 bases, e tais podem conter, por exemplo, 50 ou mais bases. Preferido são sondas das SEQ ID NOS: 53 a 61. Tal sonda pode também ser usada para identificar um clone de cDNA que corresponde a uma transcrição de com- primento total e/ou um clone ou clones genômicos contendo o gene comple- to, incluindo regiões de regulador e de promotor, éxons, e íntrons. Oligonu- cleotídeos marcados tendo uma seqüência complementar à do gene da pre- sente invenção são úteis para triar uma biblioteca de cDNA humano, DNA genômico ou mRNA ou bibliotecas similares de outras fontes ou animais pa- ra localizar os membros da biblioteca com os quais a sonda híbrida. Como um exemplo, uma seqüência de DNA conhecida pode ser usada para sinteti- zar uma sonda de oligonucleotídeo que é depois usada na triagem de uma biblioteca para isolar a região de codificação de um gene de interesse.
A presente invenção é considerada também fornecer polinucleo- tídeos que hibridam com às seqüências aqui acima descritas em que há pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 90 %, e mais preferivelmente pelo menos 95 % de identidade ou similaridade entre as seqüências, e desse modo codificam proteínas tendo atividade biológica similar. Além disso, co- mo conhecido na técnica, há "similaridade" entre dois polipeptídeos quando as seqüências de aminoácido contêm os mesmos substitutos de aminoácido ou conservados para cada resíduo individual na seqüência. Identidade e si- milaridade podem ser medidas usando software de análise de seqüência (por exemplo, CIustaIW a PBIL (Pôle Bioinformatique Lyonnais) http://npsa- pbil.ibcp.fr). A presente invenção particularmente fornece tais polinucleotí- deos que hibridam com sob condições rigorosas com os polinucleotídeos aqui acima descritos. Como aqui usado, o termo "condições rigorosas" signi- fica condições que permitem hibridação entre as seqüências de polinucleotí- deos e as seqüências de polinucleotídeo das SEQ ID NOS: 2 a 9, onde há pelo menos cerca de 70 % de identidade.
Condições adequadamente rigorosas podem ser definidas por, por exemplo, as concentrações de sal ou formamida nas soluções de pré- hibridização e de hibridação, ou pela temperatura de hibridação, e são bem- conhecidas na técnica. Em particular, severidade pode ser aumentada redu- zindo a concentração de sal, aumentando a concentração de formamida, e/ou elevando a temperatura de hibridação.
Por exemplo, hibridação sob condições de severidade alta pode empregar cerca de 50 % de formamida em cerca de 37° C a 42° C, enquan- to que hibridação sob condições de severidade reduzida poderia empregar cerca de 35 % a 25 % de formamida a cerca de 30° C a 35° C. Um conjunto particular de condições para hibridação sob condições de severidade alta emprega 42° C1 50 % de formamida, 5x. SSPE, 0,3 % de SDS, e 200 pg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado. Para hibridação sob severidade reduzida, condições similares como descritas acima podem ser usadas em 35 % de formamida em uma temperatura reduzida de 35° C. A faixa de temperatura que corresponde a um nível particular de severidade pode ser também estreitado calculando a razão de purina e pirimidina do ácido nucléico de interesse e ajustando a temperatura consequentemente. Variações nas faixas e condições acima são bem-conhecidas na técnica. Preferivelmente, hibridação deveria ocorrer apenas se houvesse pelo menos 95 %, e mais preferivelmente pelo menos 97 %, de identidade entre as se- qüências. Em uma modalidade preferida, os polinucleotídeos que hibridam com os polinucleotídeos aqui acima descritos codificam polipeptídeos que exibem substancialmente a mesma função ou atividade biológica que a pro- teína madura codificada por um dos cDNAs das SEQ ID NOS: 2 a 9.
Como mencionado, uma sonda de polinucleotídeo adequada pode ter pelo menos 14 bases, preferivelmente 30 bases, e mais preferivel- mente pelo menos 50 bases, e hibridará com um polinucleotídeo da presente invenção, que tem uma identidade com este como aqui acima descrito, e que pode ou não reter a atividade. Por exemplo, tais polinucleotídeos podem ser empregados como uma sonda para hibridar com os polinucleotídeos das SEQ ID NOS: 2 a 9 respectivamente, por exemplo, para restabelecimento de um tal polinucleotídeo, ou como uma sonda de diagnóstico, ou como um ini- ciador de PCR. Desse modo, a presente invenção inclui polinucleotídeos que têm pelo menos uns 70 % de identidade, preferivelmente pelo menos uns 90 % de identidade, e mais preferivelmente pelo menos uns 95 % de identidade para um polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos das SEQ ID NOS: 11 a 18 respectivamente, como também fragmentos dos mesmos, cujos frag- mentos preferivelmente têm pelo menos 30 bases e mais preferivelmente pelo menos 50 bases, e para polipeptídeos codificados por tais polinucleotí- deos.
Como é bem-conhecido na técnica, o código genético é redun- dante em que certos aminoácidos são codificados por mais de um tripleto de nucleotídeo (códon), e a invenção inclui aquelas seqüências de polinucleotí- deo que codificam os mesmos aminoácidos usando um códon diferente da- quele especificamente exemplificado nas seqüências aqui. Uma tal seqüên- cia de polinucleotídeo é referida aqui como uma seqüência de polinucleotí- deo "equivalente". A presente invenção também inclui variantes dos polinu- cleotídeos aqui acima descritos que codificam para fragmentos, tais como parte ou toda da proteína madura, análogos e derivados de um dos polipep- tídeos tendo a seqüência de aminoácido deduzida de qualquer uma das SEQ ID NOS: 11 a 18. As formas variantes dos polinucleotídeos podem ser uma variante alélica de ocorrência natural dos polinucleotídeos ou uma vari- ante de ocorrência não-natural dos polinucleotídeos. Por exemplo, a variante no ácido nucléico pode ser simplesmente uma diferença na seqüência de códon para o aminoácido resultante da degeneração do código genético, ou pode haver variantes de deleção, variantes de substituição e variantes de adição ou de inserção. Como conhecido na técnica, uma variante alélica é uma forma alternativa de uma seqüência de polinucleotídeo que pode ter uma substituição, deleção ou adição de um ou mais nucleotídeos que subs- tancialmente não altera a função biológica do polipeptídeo codificado.
A presente invenção também inclui polipeptídeos que têm a se- quência de aminoácido deduzida das SEQ ID NOS: 11 a 18, como também fragmentos, análogos e derivados de tais polipeptídeos. Os termos "frag- mento", "derivado" e "análogo", quando referir-se aos polipeptídeos das SEQ ID NOS: 11 a 18, significam polipeptídeos que retêm essencialmente a mesma função ou atividade biológica como tais polipeptídeos. Um análogo pode, por exemplo, incluir uma proproteína que pode ser ativada por cliva- gem da porção de proproteína para produzir uma proteína madura ativa. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser polipeptídeos recombinantes, polipeptídeos naturais ou polipeptídeo sintético; porém, eles são preferivel- mente polipeptídeos recombinantes, glicosilados ou não-glicosilados.
O fragmento, derivado ou análogo de um polipeptídeo de qual- quer uma das SEQ ID NOS: 11 a 18, pode ser (i) um em que um ou mais dos resíduos de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido conservado ou não-conservado (preferivelmente um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ou não ser codifi- cado pelo código genético, ou (ii) um em que um ou mais dos resíduos de aminoácido inclui um grupo de substituinte, ou (iii) um em que os aminoáci- dos adicionais são fundidos à proteína madura, tais como uma seqüência líder ou secretória ou uma seqüência que é empregada para purificação do polipeptídeo maduro ou uma seqüência de pró-proteína. Tais fragmentos, derivados e análogos são julgados estar dentro do escopo daqueles versa- dos na técnica para fornecer sob a base dos ensinamentos aqui.
Os polipeptídeos e polinucleotídeos da presente invenção deve- riam ser em uma forma isolada, e preferivelmente eles são purificados para homogeneidade ou pureza substancial. Por homogeneidade substancial uma pureza é significada de pelo menos cerca de 85 %.
O termo "isolado" é usado para significar que o material foi re- movido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se for de ocorrência natural). Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo de o- corrência natural presente em um animal vivo não é considerado estar isola- do, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, quando separado de substancialmente todos os materiais coexistentes no sistema natural, é con- siderado isolado. Para DNA, o termo inclui, por exemplo, um DNA recombi- nante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo ou vírus de forma autônoma replicante, ou no DNA genômico de um procarioto ou eucarioto; ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um genômico ou fragmento de cDNA produzido através de reação em cadeia de polimerase (PCR) ou digestão de endonuclease de restrição) independente de outras seqüências. Este também inclui um DNA recombinante que faz parte de um gene híbrido que codifica seqüência de polipeptídeo adicional por exemplo, uma proteína de fusão. Também incluiu é DNA recombinante que inclui uma porção dos nucleotídeos mostrados em uma das SEQ ID NOS: 2 a 9 que codifica uma variante de divisão alternativa das QPCTLs. Várias variantes de divisão alternativas são exemplificadas nas SEQ ID NOS: 19-22.
Os polipeptídeos da presente invenção incluem qualquer um dos polipeptídeos das SEQ ID NOS: 11 a 18 (em particular as proteínas madu- ras), como também polipeptídeos tendo pelo menos 75 % de similaridade (por exemplo preferivelmente pelo menos 50 % e mais preferivelmente pelo menos 70 % de identidade) a um dos polipeptídeos das SEQ ID NOS: 11 a 18, mais preferivelmente pelo menos 85 % de similaridade (por exemplo pre- ferivelmente pelo menos 70 % de identidade) a um dos polipeptídeos das SEQ ID NOS: 11 a 18, e o mais preferivelmente pelo menos 95 % de simila- ridade (por exemplo preferivelmente pelo menos 90 % de identidade) a qual- quer um dos polipeptídeos das SEQ ID NOS: 11 a 18. Além disso, eles de- vem preferivelmente incluem porções exatas de tais polipeptídeos contendo uma seqüência de pelo menos 30 aminoácidos, e mais preferivelmente pelo menos 50 aminoácidos.
Fragmentos ou porções dos polipeptídeos da presente invenção podem ser empregados como intermediários para produzir os polipeptídeos de comprimento total correspondentes através de síntese de peptídeo. Fragmentos ou porções dos polinucleotídeos da presente invenção podem também ser usados para sintetizar os polinucleotídeos de comprimento total da presente invenção. A presente invenção também inclui vetores que incluem tais po- linucleotídeos, células hospedeiras que são engenheiradas geneticamente com tais vetores e a produção de polipeptídeos através de técnicas recom- binantes usando o antecedente. As células hospedeiras são geneticamente engenheiradas (transduzidas ou transformadas ou transfeccionadas) com tais vetores que podem ser, por exemplo, um vetor de clonagem ou um vetor de expressão. O vetor pode ser, por exemplo, na forma de um plasmídeo, uma partícula viral, um fago, etc. As células hospedeiras engenheiradas po- dem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados como apropriado para ativar os promotores, selecionar transformantes ou amplifi- car os genes da presente invenção. As condições de cultura, tais como tem- peratura, pH e outros, são aquelas comumente usadas com a célula hospe- deira selecionada para expressão, como bem-conhecido ao artesão nor- malmente versado.
Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser emprega-
dos para produzir polipeptídeos através de técnicas recombinantes. Desse modo, por exemplo, os polinucleotídeos podem ser incluídos em qualquer uma de uma variedade de vetores de expressão para expressar os polipep- tídeos.
Tais vetores incluem seqüências de DNA cromossômicas, não-
cromossômicas e sintéticas, por exemplo, derivadas de SV40; plasmídeos bacterianos; DNA de fago; baculovírus; plasmídeos de levedura; vetores de- rivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago, DNA viral tal como vacínia, adenovírus, vírus de varíola de ave, e pseudorraivas. Porém, qual- quer outro vetor pode ser usado contanto que seja replicável e viável no hospedeiro.
A seqüência de DNA apropriada pode ser inserida no vetor por qualquer de uma variedade de procedimentos. Em geral, a seqüência de DNA é inserida em um/uns sítio(s) de endonuclease de restrição apropria- do(s) por procedimentos bem-conhecidos na técnica, cujos procedimentos são julgados estar dentro do escopo daqueles versados nesta técnica.
A seqüência de DNA no vetor de expressão é operativamente ligada a uma(s) sequência(s) de controle de expressão apropriada(s) (pro- motor) para direcionar a síntese de mRNA. Como exemplos representativos de tais promotores, podem ser mencionados: promotor de LTR ou de SV40, o Iac ou trp de E. coli, o promotor de P.sub.L de fago lambda, e outros pro- motores conhecidos para controlar a expressão dos genes em células proca- rióticas ou eucarióticas ou seus vírus.
O vetor de expressão deve também conter um sitio de ligação de ribossoma para iniciação de translação e um terminador de transcrição. O vetor pode também incluir seqüências apropriadas para amplificar a expres- são. Além disso, os vetores de expressão preferivelmente contêm um ou mais genes marcadores selecionáveis para prover um traço fenotípico para seleção de células hospedeiras transformadas, tais como di-hidrofolato re- ductase ou resistência à neomicina para cultura celular eucariótica, ou tal como resistência à tetraciclina ou ampicilina em E. coli. O vetor contendo a seqüência de DNA apropriada como mais
acima descrita, como também um seqüência de promotor ou de controle a- propriada, pode ser empregado para transformar um hospedeiro apropriado para permitir para o hospedeiro expressar a proteína. Como exemplos re- presentativos de hospedeiros apropriados, podem ser mencionados: células bacterianas, tais como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimuriurrr, célu- las fúngicas, tais como levedura; células de inseto, tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células animais, tais como CHO, COS ou melanoma de Bowes; adenovírus; células de planta, etc. A seleção de um hospedeiro a- propriado é julgada estar dentro do escopo daqueles versados na técnica dos ensinamentos aqui.
Produção sintética de seqüências de ácido nucléico é bem- conhecida na técnica como é evidente do Catálogo de CLONTECH 95/96, páginas 215-216, CLONTECH, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, Califór- nia. 94303. Desse modo, a presente invenção também inclui vetores de ex- pressão úteis para a produção das proteínas da presente invenção. A pre- sente invenção também inclui constructos recombinantes que compreendem uma ou mais das seqüências como amplamente descritas acima. As cons- tructos podem compreender um vetor, tal como um plasmídeo ou vetor viral ao qual uma seqüência da invenção foi inserida, em uma orientação direta ou reversa. Em um aspecto preferido desta modalidade, a constructo tam- bém compreende seqüências reguladoras, incluindo, por exemplo, um pro- motor, operavelmente ligado à seqüência. Números grandes de vetores e promotores adequados são conhecidos àqueles versados na técnica, e es- tão comercialmente disponíveis. Os vetores a seguir são fornecidos por via de exemplo: Bacteriano: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, pha- gescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNHI8A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 e pRIT5 (Pharmacia); e Eucariótico: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, e pSVL (Pharmacia). Porém, qualquer outro plasmí- deo ou vetor adequado pode ser usado contanto que seja replicável e viável no hospedeiro.
Regiões de promotor podem ser selecionadas de qualquer gene
desejado usando vetores CAT (cloranfenicol acetil transferase) ou outros vetores com marcadores selecionáveis.
Dois vetores apropriados são pKK232-8 e pCM7. Promotores bacterianos nomeados particulares incluem lacl, IacZ, T3, 17, gpt, P.sub.R lambda, P.sub.L e trp. Promotores eucarióticos incluem CMV precoce imedi- ato, HSV timidina cinase, SV40 precoce e tardio, LTRs de retrovírus, e meta- lotioneína I de camundongo. Seleção do vetor e promotor apropriados está bem dentro do nível de uma pessoa versada na técnica.
Componentes do vetor de expressão podem em geral incluir: 1) um gene de neomicina fosfotransferase (G418), ou higromicina B fosfotrans- ferase (hyg) como um marcador de seleção, 2) uma origem de replicação de £. coli, 3) uma seqüência de promotor de fago T7 e SP6, 4) seqüências de operador de lac, 5) o gene repressor de operon de Iactose (IacIq) e 6) uma região de Iigadorde sítio de clonagem múltipla. Uma tal origem de replicação (oriC) pode ser derivada de pUC19 (LTI, Gaithersburg, Md.).
Uma seqüência de nucleotídeo que codifica um dos polipeptí- deos das SEQ ID NOS: 2 a 9 tendo os sítios de restrição apropriados é ge- rada, por exemplo, de acordo com o protocolo de PCR descrito doravante nos Exemplos 1 e 2, usando iniciadores de PCR tendo sítios de restrição para EcoR I (como o iniciador de 5') e Sal I (como o iniciador de 3') para clo- nagem de Met I e Met Il de isoQC no vetor EGFP-N3, ou sítios para Spe I (como o iniciador de 5') e EcoR I (como o iniciador de 3') para clonagem de isoQC no vetor pET41a. As inserções de PCR são purificadas em gel e dige- ridas com enzimas de restrição compatíveis. A inserção e o vetor são ligados de acordo com os protocolos padrões.
Em uma outra modalidade, a presente invenção provê células hospedeiras contendo as constructos acima descritas. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica mais alta, tal como uma célula mamífera, ou uma célula eucariótica mais baixa, tal como uma célula de levedura, ou a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bac- teriana. Introdução da constructo na célula hospedeira pode ser realizada através de transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE- dextrana, lipofecção ou eletroporação (Davis, L. Dibner, M. Battey, I., Basic Metods in Molecular Biology, (1986)).
Tais constructos em células hospedeiras são preferivelmente usadas de uma maneira convencional para produzir o produto de gene codi- ficado pela seqüência recombinante. Alternativamente, os polipeptídeos da invenção podem ser produzidos sinteticamente através de sintetizadores de peptídeos convencionais ou por ligação química de fragmentos adequados desse modo preparados.
Proteínas maduras podem ser expressadas em células mamífe- ras, levedura, bactérias, ou outras células sob o controle de promotores a- propriados. Sistemas de translação livres de célula podem também ser em- pregados para produzir tais proteínas usando RNA derivado das constructos de DNA da presente invenção. Vetores de clonagem e expressão apropria- dos para o uso com hospedeiros procarióticos e eucarióticos são descritos por Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edi- ção, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989).
Transcrição do DNA que codifica os polipeptídeos da presente invenção através de eucariotes mais altos é aumentada inserindo uma se- qüência intensificadora no vetor.
Intensificadores incluem elementos de ação eis do DNA1 usual- mente cerca de 10 a 300 bp que atuam em um promotor para aumentar sua transcrição. Exemplos incluem o intensificador de SV40 no lado tardio da origem de replicação bp 100 a 270, intensificador de promotor prematuro de acitomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação, e intensificadores de adenovírus.
Em geral, vetores de expressão recombinantes incluirão origens de replicação e marcadores selecionáveis que permitem a transformação da célula hospedeira, por exemplo, o gene de resistência à ampicilina do gene de TRP1 de E. coli e S. cerevisiae, e um promotor derivado de um gene al- tamente expresso para direcionar a transcrição de uma seqüência estrutural a jusante. Tais promotores podem ser derivados de operons que codificam enzimas glicolíticas, tais como 3-fosfoglicerato cinase (PGK), alfa-fator, fos- fatase ácida, ou proteínas de choque térmico, entre outros. A seqüência es- trutural heteróloga é montada na fase apropriada com seqüências de inicia- ção e terminação de translação, e preferível mente, uma seqüência líder ca- paz de direcionar a secreção de proteína transladada no espaço periplásmi- co ou meio extracelular. Opcionalmente, a seqüência heteróloga pode codifi- car uma proteína de fusão incluindo um peptídeo de identificação N-terminal dando características desejadas, por exemplo, estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expresso.
Vetores de expressão úteis para uso bacteriano são construídos inserindo uma seqüência de DNA estrutural que codifica uma proteína dese- jada junto com iniciação de translação adequada e sinais de terminação em fase de leitura operável com um promotor funcional.
O vetor compreenderá um ou mais marcadores selecionáveis fenotípicos e uma origem de replicação para assegurar manutenção do vetor e para, se desejado, fornecer amplificação dentro do hospedeiro. Hospedei- ros procarióticos adequados para transformação incluem E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e várias espécies dentro dos gêneros Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus, embora outros possam também ser empregados como uma questão de escolha.
Como um exemplo representativo mas não-limitativo, vetores de expressão úteis para uso bacteriano podem compreender um marcador se- lecionável e origem bacteriana de replícação derivada de plasmídeos comer- cialmente disponíveis que compreendem elementos genéticos do vetor de clonagem bem-conhecido pBR322 (ATCC 37017). Tais vetores comerciais incluem, por exemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sué- cia) e GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wis., U. S. A.). Estas seções de "cadeia principal" de pBR322 são combinadas com um promotor apropriado e a seqüência estrutural a ser expressa.
Seguindo transformação de uma cepa hospedeira adequada e crescimento da cepa hospedeira para uma densidade de célula apropriada, o promotor selecionado é induzido através de meios apropriados (por exem- pio, deslocamento de temperatura ou indução química), e as células são cul- tivadas durante um período adicional.
Células são tipicamente colhidas através de centrifugação e de- pois rompidas por meios físicos ou químicos, com o extrato bruto resultante sendo retido para outra purificação. Células microbianas empregadas na expressão de proteínas
podem ser rompidas por qualquer método conveniente, incluindo ciclagem de congelamento-descongelamento, sonicação, rompimento mecânico e uso de agentes de Iise celular; tais métodos são bem-conhecidos àqueles versa- dos na técnica.
Vários sistemas de cultura celular mamífera podem também ser
empregados para expressar uma proteína recombinante. Exemplos de sis- temas de expressão mamíferos incluem as linhagens de COS-7 de fibroblas- tos de rim de macaco, descritas por Gluzman, Cell, 23: 175 (1981). Outras linhagens celulares capazes de expressar um vetor compatível incluem, por exemplo, as linhagens celulares C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK. Vetores de expressão mamíferos em geral compreenderão uma origem de replicação, um promotor adequado e intensificador, e também qualquer sítio de ligação de ribossoma necessário, sítio de poliadenilação, doador de divisão e sítios aceitantes, seqüências de terminação transcricional, e seqüências não- transcritas de flanqueamento de 5'. Seqüências de DNA derivadas da divi- são de SV40, e sítios de poliadenilação podem ser usados para fornecer elementos genéticos não-transcritos requeridos.
Os polipeptídeos podem ser restabelecidos e purificados de cul- turas de células recombinantes através de métodos incluindo precipitação de sulfato de amônio ou etanol, extração de ácido, cromatografia de permuta de ânions ou cátions, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de intera- ção hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. Restabelecimento pode ser facilitado se o poli- peptídeo for expressado na superfície das células, mas tal não é uma condi- ção prévia. Restabelecimento pode também ser desejável de produtos de clivagem que são clivados seguindo expressão de uma forma mais longa do polipeptídeo. Etapas de reenrolamento da proteína como conhecido nesta técnica podem ser usadas, conforme necessário, para completar a configu- ração da proteína madura. Cromatografia líquida de alto desempenho (H- PLC) pode ser empregada para etapas de purificação finais.
Os polipeptídeos da presente invenção podem ser produtos na- turais purificados, ou produzidos através de técnicas recombinantes de um hospedeiro procariótico ou eucariótico (por exemplo, por células bacterianas, de levedura, de planta mais alta, de insetos ou mamíferas em cultura). De- pendendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção re- combinante, os polipeptídeos da presente invenção podem ser glicosilados ou não-glicosilados. Polipeptídeos da invenção podem também incluir um resíduo de aminoácido de metionina inicial.
Em uma modalidade preferida, as proteínas da invenção são isoladas e purificadas para ser substancialmente livres de contaminação de outras proteínas. Por exemplo, as proteínas da invenção deveriam constituir pelo menos 80 % em peso da proteína total presente em uma amostra, mais preferivelmente pelo menos 90 %, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos 98 % em peso da proteí- na total.
Estas proteínas podem ser na forma de uma solução em água, outro solvente adequado, tais como dimetil sulfóxido (DMSO) ou etanol, ou uma mistura de solventes adequados.
Exemplos de misturas de solventes incluem 10 % (em peso) de
etanol em água e 2 % (em peso) de DMSO em água. Uma solução pode também compreender sais, agentes tamponantes, agentes caotrópicos, de- tergentes, conservantes e outros. Alternativamente, as proteínas podem ser na forma de um sólido, tal como um pó Iiofilizado ou um sólido cristalino que pode também compreender um solvente residual, um sal ou similares.
Como aqui usado, o termo "anticorpos" inclui anticorpos policlo- nais, anticorpos policlonais purificados em afinidade, anticorpos monoclo- nais, e fragmentos Iigantes de antígeno, tais como F (ab')2 e fragmentos de Fab' proteolíticos. Anticorpos ou fragmentos intactos geneticamente enge- nheirados, tais como anticorpos quiméricos, fragmentos de Fv, anticorpos de cadeia simples e outros, como também peptídeos de ligação de antígeno sintéticos e polipeptídeos, são também inclusos.
Anticorpos não-humanos podem ser humanizados enxertando as CDRs não-humana em estrutura humana e regiões constantes, ou incor- porando os domínios variáveis não-humanos inteiros (opcionalmente "disfar- çando" os mesmos com uma superfície similar à humana por substituição de resíduos expostos, em que o resultado é um anticorpo "embutido"). Em al- gumas circunstâncias, anticorpos humanizados podem reter resíduos não- humanos dentro dos domínios de estrutura de regiões variáveis humanas para intensificar as características de ligação apropriadas. Por anticorpos humanizados, a meia-vida biológica pode ser aumentada, e o potencial para reações imunes adversas sob administração em humanos deveria ser redu- zido.
Técnicas alternativas para gerar ou selecionar anticorpos úteis aqui incluem exposição in vitro de linfócitos à proteína de isoQC humana ou um peptídeo, e seleção de bibliotecas de exibição de anticorpo em fago ou vetores similares (por exemplo, através de uso de proteína de isoQC huma- na imobilizada ou marcada ou peptídeo).
Genes que codificam polipeptídeos tendo domínios de ligação de polipeptídeo de isoQC humana potenciais podem ser obtidos triando bi- bliotecas de peptídeo aleatórias exibidas em fago (exibição de fago) ou em bactérias, tais como E. coli. As seqüências de nucleotídeo que codificam tais polipeptídeos podem ser obtidas em vários modos bem-conhecidos na técni- ca.
Como seria evidente a alguém versado na técnica, anticorpos policlonais podem ser gerados de inocular uma variedade de animais de sangue quente, tais como cavalos, vacas, cabras, ovelhas, cachorros, gali- nhas, coelhos, camundongos e ratos, com um polipeptídeo de isoQC huma- na ou um fragmento do mesmo. A imunogenicidade de um polipeptídeo de isoQC humana pode ser aumentada pelo uso de um adjuvante, tal como a- Iume (hidróxido de alumínio) ou o adjuvante completo ou incompleto de Fre- und, ou substâncias ativas de superfície, tais como lisolecitina, polióis plurô- nicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, KLH ou dinitrofenol. Entre adjuvantes usados em seres humanos, BCG (Bacille Calmette-Guehn) e Corynebacterium parvum são especialmente preferíveis. Polipeptídeos úteis para imunização também incluem polipeptídeos de fusão, tais como fusões de isoQC ou uma porção do mesmo com um polipeptídeo de imunoglobulina ou com proteína Iigadora de maltose. O imunógeno de polipeptídeo pode ser uma molécula de comprimento total ou uma porção do mesmo. Se a porção do polipeptídeo for "similar a hapteno", tal porção pode ser vantajosamente unida ou ligada a um veículo macromolecular, tal como hemocianina de lapa (KLH), albumina de soro bovino (BSA) ou toxóide de tétano, para imuniza- ção. Anticorpos para isoQC podem também ser gerados usando métodos que são bem-conhecidos na técnica. Tais anticorpos podem incluir, mas não são limitados a, anticorpos de cadeia policlonais, monoclonais, quiméricos, e simples, fragmentos de Fab, e fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab.
Anticorpos neutralizantes (isto é, aqueles que bloqueiam ou mo- dificam as interações nos sítios ativos) são especialmente preferidos para o uso terapêutico.
Para a produção de anticorpos, proteínas ligadoras, ou peptí- deos que especificamente ligam à QPCTL, bibliotecas de anticorpos de ca- deia simples, fragmentos de Fab, outros fragmentos de anticorpo, domínios de proteína de não-anticorpo, ou peptídeos podem sertriados. As bibliotecas poderiam ser geradas usando exibição de fago, outros métodos de DNA re- combinantes, ou síntese de peptídeo (Vaughan, T. J. et al. Nature Biotech- nology 14: 309-314 (1966)). Tais bibliotecas seriam comumente tríadas u- sando métodos que são bem-conhecidos na técnica para identificar sequên- cias que demonstram ligação específica a QPCTL.
É preferido que os oligopeptídeos, peptídeos, ou fragmentos u- sados para induzir anticorpos a QPCTL tenham uma seqüência de aminoá- cido que consiste em pelo menos cerca de 5 aminoácidos e, mais preferi- velmente, de pelo menos cerca de 10 aminoácidos. É também preferível que estes oligopeptídeos, peptídeos, ou fragmentos sejam idênticos a uma por- ção da seqüência de aminoácido da proteína natural. Extensões curtas de aminoácidos de QPCTL podem também ser fundidas com aquelas de outra proteína, tais como KLH, e anticorpos podem ser produzidos para a molécu- la quimérica.
Anticorpos monoclonais para QPCTL podem ser preparados u-
sando qualquer técnica bem-conhecida que provê a produção de moléculas de anticorpo através de linhagens celulares contínuas na cultura. Estes in- cluem, mas não são limitados a, a técnica de hibridoma, a técnica de hibri- doma de células B humanas, e a técnica de hibridoma, embora anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma possam ser preferidos.
Além disso, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticor- pos quiméricos", tais como o splicing de genes de anticorpo de camundongo para genes de anticorpo humano para obter uma molécula com especificida- de de antígeno e atividade biológica apropriadas, podem ser usadas, vide Neuberger, M. S. et al. Nature 312: 604-608 (1984). Alternativamente, as técnicas descritas podem ser adaptadas para a produção de anticorpos de cadeia simples, usando métodos conhecidos na técnica, para produzir anti- corpos de cadeia simples QPCTL-específicos. Anticorpos com especificida- de relacionada, mas de composição idiotípica distinta, podem ser gerados por embaralhamento de cadeias das bibliotecas de imunoglobulina combina- tórias aleatórias. (Burton D. R. Proc. Natl. Acad. Sei. 88 : 11120- 11123 (1991)).
Anticorpos podem também ser produzidos induzindo produção in vivo na população de linfócitos ou triando bibliotecas de imunoglobulina ou painéis de reagentes de ligação altamente específicos como revelados na literatura. (Orlandi, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 86: 3833- 3837 (1989)).
Fragmentos de anticorpo que contêm sítios de ligação específi- cos para QPCTL podem também ser gerados. Por exemplo, tais fragmentos incluem, mas não são limitados a, fragmentos de F(ab')2 produzidos por di- gestão de pepsina da molécula de anticorpo e fragmentos de Fab gerados reduzindo as ligações em ponte de dissulfeto dos fragmentos de F(ab1)2. Alternativamente, bibliotecas de expressão de Fab podem ser construídas para permitir identificação rápida e fácil dos fragmentos de Fab monoclonais com a especificidade desejada. (Huse, W. D. et al. Science 254: 1275-1281 (1989)).
Vários imunoensaios podem ser usados para identificar anticor- pos tendo a especificidade desejada. Numerosos protocolos para ensaios de ligação competitiva ou imunorradiométricos usando anticorpos policlonais ou monoclonais com especificidades estabelecidas são bem-conhecidos na técnica. Tais imunoensaios tipicamente envolvem a medição de formação complexa entre QPCTL e seu anticorpo específico. Um imunoensaio com base monoclonal, de dois sítios utilizando anticorpos monoclonais reativos para dois epítopos de QPCTL não-interferentes é preferido, mas um ensaio de ligação competitiva pode também ser empregado.
Como mais cedo mencionado, as QPCTLs podem ser usadas no tratamento das Doenças.
Composições farmacêuticas adequadas para o uso neste aspec- to da invenção incluem composições em que os ingredientes ativos são con- tidos em uma quantidade eficaz para alcançar o propósito intencionado rela- tivo a uma das Doenças. A determinação de uma dose terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica e inici- almente ou pode ser estimada em ensaios de cultura celular, por exemplo de células neoplásticas, ou em modelos animais, usualmente camundongos, ratos, coelhos, cachorros, ou porcos. Um modelo animal pode também ser usado para determinar a faixa de concentração apropriada e rota de admi- nistração cuja informação é depois comumente usada para determinar doses úteis e rotas para administração em seres humanos.
Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se àquela quantidade de ingrediente ativo, por exemplo uma QPCTL ou fragmento da mesma, an- ticorpos de DPRP, ou um agonista, antagonista ou inibidor de QPCTL, que melhora os sintomas particulares ou condições da doença. Por exemplo, a quantidade a ser administrada pode ser eficaz para ciclizar Glu ou Gln N- terminais de um substrato alvo desejado sob contato com os mesmos. Eficá- cia terapêutica e toxicidade podem ser igualmente determinada através de procedimentos farmacêuticos padrões em culturas de célula ou com animais experimentais, tais como calculando as estatísticas de ED50 (a dose terapeu- ticamente eficaz em 50 % da população) ou LD50 (a dose letal para 50 % da população). A razão de dose tóxica para efeitos terapêuticos é o índice tera- pêutico, e pode ser expressada como a razão de LD50ZED50. Composições farmacêuticas que exibem índice terapêutico grande são preferidas. Os da- dos obtidos dos ensaios de cultura celulares e estudos de animais são usa- dos na formulação de uma faixa de dosagem para uso humano. A dosagem contida em tais composições é preferível mente dentro de uma faixa de con- centrações circulantes que incluem ED50 com pequena ou nenhuma toxici- dade. A dosagem varia dentro desta faixa dependendo da forma de dosa- gem empregada, da sensibilidade do paciente, e da rota de administração.
Uma dosagem exata normalmente será determinada pelo médi- co levando em conta fatores relacionados ao sujeito requerendo tratamento, com dosagem e administração sendo ajustadas para fornecer um nível sufi- ciente da metade ativa ou manter um efeito desejado. Fatores a serem leva- dos em conta incluem a severidade do estado de doença, a saúde geral do sujeito, a idade, peso, e sexo do sujeito, dieta, tempo e freqüência de admi- nistração, combinação de fármaco (s), sensibilidades de reação, e tolerân- cia/resposta à terapia. Composições farmacêuticas de ação duradoura po- dem ser administradas a cada 3 a 4 dias, todas as semanas, ou até mesmo uma vez cada duas semanas, dependendo da meia-vida e taxa de liberação da formulação particular.
Ainda outro aspecto da invenção provê moléculas de polinucleo- tídeo tendo seqüências que são antissentido às transcrições de mRNA de um polinucleotídeo das SEQ ID NOS: 2 a 9. Administração de uma molécula de polinucleotídeo antissentido pode bloquear a produção da proteína codifi- cada pelos genes de QPCTL das SEQ ID NOS: 2 a 9. As técnicas para pre- parar moléculas de polinucleotídeo antissentidos e administrar tais molécu- las são conhecidas na técnica. Por exemplo, moléculas de polinucleotídeo antissentidos podem ser encapsuladas em Iipossomas para fusão com célu- Ias.
Em particular, a expressão dos genes de QPCTL das SEQ ID NOS: 2 a 9 em tecido do cérebro, próstata, pulmão, coração, fígado, baço e do rim fornece evidência para um papel potencial na fisiopatologia das doen- ças descritas abaixo. Portanto em um outro aspecto, a invenção refere-se a ensaios diagnósticos para detectar doenças associadas à atividade ou níveis de expressão de QPCTL impróprios. Os anticorpos que especificamente li- gam QPCTL podem ser usados para a diagnose de distúrbios caracterizados por expressão de QPCTL, ou em ensaios para monitorar os pacientes sendo tratados com QPCTL ou com agonistas ou antagonistas (inibidores) de QPCTL. Anticorpos úteis para propósitos de diagnósticos pode ser prepara- dos da mesma maneira como aqueles descritos acima para terapêuticas. Ensaios de diagnóstico para QPCTL incluem métodos utilizando o anticorpo e uma marcação para detectar QPCTL em fluidos do corpo humano ou em extratos celulares ou tecidos. Os anticorpos podem ser usados com ou sem modificação, e eles podem ser marcados através de ligação covalente ou não-covalente com uma molécula repórter. Uma ampla variedade de molé- culas repórteres é conhecida na técnica. Proteínas de QPCTL recombinan- tes que foram modificadas para ser cataliticamente inativas podem também ser usadas como inibidores negativos dominantes. Tais modificações inclu- em, por exemplo, mutação do sítio ativo.
Uma variedade de protocolos para medir QPCTL, incluindo ELI- SAs, RIAs e FACS, é conhecida na técnica e provê uma base para diagnos- ticar níveis alterados ou anormais da expressão de QPCTL. Valores normais ou padrão para expressão de QPCTL são estabelecidos combinando os flui- dos do corpo ou extratos celulares tirados dos sujeitos mamíferos normais, preferivelmente o homem, com anticorpo para QPCTL sob condições ade- quadas para formação complexa. O método para detectar QPCTL em uma amostra biológica compreenderia as etapas de a) fornecer uma amostra bio- lógica; b) combinar a amostra biológica e um anticorpo de anti-QPCTL sob condições que são adequadas para formação complexa ocorrer entre QPC- TL e o anticorpo; e c) detectar formação complexa entre QPCTL e o anticor- po, assim estabelecendo a presença de QPCTL na amostra biológica.
A quantidade de formação complexa depois pode ser quantifica- da através de vários métodos, preferivelmente através de meios fotométri- cos. As quantidades de QPCTL expressas em um sujeito, controle, e amos- tras de doença de tecidos submetidas à biopsia são comparadas com os valores padrão. Desvio entre valores padrão e do sujeito estabelecem os parâmetros para diagnosticar a doença.
Em outra modalidade da invenção, os polinucleotídeos que codi- ficam QPCTL são usados para propósitos de diagnósticos cujos polinucleo- tídeos podem incluir seqüências de oligonucleotídeo, moléculas de RNA e de DNA complementares, e PNAs. Estes polinucleotídeos podem ser usados para detectar e quantificar a expressão de gene em tecidos submetidos à biopsia em que a expressão de QPCTL pode ser correlatada com uma das doenças. O ensaio diagnóstico pode ser usado para distinguir entre ausên- cia, presença, e expressão de excesso de QPCTL e para monitorar a regu- lação dos níveis de QPCTL durante a intervenção terapêutica. Além disso, análise farmacogenômica de polimorfismos de nucleotídeo simples (SNP) dos genes de QPCTL pode ser usada como um método para triar para mu- tações que indicam predisposição à doença ou resposta modificada aos fár- macos.
Seqüências de polinucleotídeo e de polipeptídeo de QPCTLs, fragmentos destas, anticorpos de QPCTLs, e agonistas, antagonistas ou ini- bidores de QPCTLs podem ser usados como ferramentas de descoberta para identificar eventos de reconhecimento molecular e portanto proteínas, polipeptídeos e peptídeos que interagem com proteínas de QPCTL. Um e- xemplo específico são bibliotecas de peptídeo de exibição de fago onde mais de 108 seqüências de peptídeo podem ser tríadas em um ciclo simples de panning. Tais métodos como também outros são conhecidos dentro da técnica e podem ser utilizados para identificar compostos que inibem ou in- tensificam a atividade de qualquer uma das QPCTLs das SEQ ID NOS: 11 - 18.
Ligações acopladas representam interações funcionais tais co- mo complexos ou vias, e proteínas que interagem com QPCTLs podem ser identificadas por um sistema de dois híbridos de levedura, proteômicos (aná- lise em gel 2D de diferencial e espectrometria de massa) e genômicos (ex- pressão de gene de diferencial por microarranjo ou análise em série da ex- pressão de gene SAGE). Proteínas identificadas como funcionalmente ligadas às QPCTLs
e o processo de interação formam a base dos métodos de triagem para ini- bidores, agonistas e antagonistas e moduladores destas interações de QPCTL-proteína.
O termo "antagonista", como é aqui usado, refere-se a uma mo- lécula de inibidor que, quando ligada à QPCTL, diminui a quantidade ou a duração do efeito da atividade biológica ou imunológica de QPCTL, por e- xemplo diminuindo a atividade enzimática da peptidase para ciclizar os resí- duos de Glu ou Gln nos términos N dos substratos de QPCTL. Antagonistas podem incluir proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos, anticorpos, ou qual- quer outra molécula que diminua o efeito de QPCTL; por exemplo, eles po- dem incluir moléculas pequenas e compostos orgânicos que ligam e inati- vam QPCTLs por um mecanismo do tipo competitivo ou não-competitivo. Preferidos são inibidores de molécula pequena de QPCTL. Os mais preferi- dos são inibidores competitivos de molécula pequena de QPCTL.
Exemplos específicos de inibidores da atividade enzimática de QPCTL são descritos no Exemplo 4. Inibidores podem ser, por exemplo, ini- bidores da atividade de QPCTL ciclase, ou alternativamente inibidores da atividade de ligação da QPCTL às proteínas com as quais eles interagem. Exemplos específicos de tais inibidores podem incluir, por exemplo, anticor- pos anti-QPCTL, peptídeos, fragmentos de proteína, ou inibidores de peptidil protease pequena, ou inibidores de molécula orgânica de não-peptídeo pe- quena, que são formulados em um meio que permite a introdução no tipo celular desejado. Alternativamente, tais inibidores podem ser presos a Iigan- tes alvos para introdução por endocitose mediada por célula e outros even- tos mediados por receptor. Tais métodos são descritos também abaixo e podem ser praticados por aqueles versados na técnica dada as seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de QPCTL descritas aqui.
Um outro uso das QPCTLs é para a triagem de antagonistas po- tenciais para o uso como agentes terapêuticos, por exemplo, para inibir liga- ção à QPCTL, como também para triagem para agonistas. QPCTL, seus fragmentos imunogênicos, ou oligopeptídeos da mesma, podem ser usados para triar bibliotecas de compostos que são agonistas ou antagonistas indi- cativos em qualquer de uma variedade de técnicas de triagem de fármaco. O fragmento empregado em tal triagem pode ser livre na solução, preso a um suporte sólido, nascido de uma superfície celular, ou localizado intracelular- mente. A formação de complexos Iigantes entre QPCTL e o agente sendo testados é depois medida. Outros ensaios para descobrir antagonistas que inibirão QPCTL são evidentes das revelações das Patentes Nos. WO 2004/098625, WO 2004/098591 e WO 2005/075436 que descrevem inibido- res de QC e que são incorporadas aqui em sua totalidade. Outro uso que vale a pena destas QPCTLs é a triagem dos inibidores de QC para mostrar que eles não terão efeitos colaterais indesejados em também inibir uma ou mais das QPCTLs.
Um método fornecido para triar uma biblioteca de moléculas pe- quenas para identificar uma molécula que liga à QPCTL em geral compre- ende: a) fornecer uma biblioteca de moléculas pequenas; b) combinar a bi- blioteca de moléculas pequenas com o polipeptídeo de quaisquer SEQ ID NOS: 11 a 18, ou com um fragmento das mesmas, sob condições que são adequadas para formação de complexo; e c) detectar formação de comple- xo, em que a presença de um tal complexo identifica uma molécula pequena que liga à QPCTL.
Um método para identificar um antagonista compreende liberar uma molécula pequena que liga à QPCTL em extratos de células transfor- madas com um vetor que expressa QPCTL junto com um substrato cromo- gênico (por exemplo, AIa-Pro-AFC ou Ala-Pro-AMC) sob condições onde clivagem normalmente ocorrerá, e depois ensaiar para inibição da clivagem pela enzima monitorando as alterações em fluorescência, ou absorção de luz UV, através de espectrofotometria para identificar moléculas que inibem a clivagem. Uma taxa reduzida de reação ou quantidade total de fluorescên- cia ou absorção de luz UV, na presença da molécula, estabelece que a mo- lécula pequena é um antagonista que reduz a atividade catalítica/enzimática de QPCTL. Uma vez tais moléculas são identificadas, elas podem ser admi- nistradas para reduzir ou inibir ciclização de resíduos Glu ou Gln N-terminais por uma QPCTL.
De acordo com ainda outro aspecto específico, a invenção provê um método de triar para um composto capaz de inibir a atividade enzimática de pelo menos uma proteína madura de acordo com a presente invenção, preferivelmente selecionada das proteínas das SEQ ID NOS: 11 a 18, cujo método compreende incubar a dita proteína madura e um substrato adequa- do para a dita proteína madura na presença de um ou mais compostos de teste ou sais dos mesmos, medindo a atividade enzimática da dita proteína madura, comparando a dita atividade com atividade comparável determinada na ausência de um composto de teste, e selecionando o composto ou com- postos de teste que reduzem a atividade enzimática.
Além disso, a invenção também fornece um método de triar para um inibidor de QC seletivo, isto é um composto capaz de inibir a atividade enzimática de QC1 em que a dita QC é preferivelmente a proteína da SEQ ID NO: 10, que não inibe a atividade enzimática de pelo menos uma proteína madura de acordo com a presente invenção, preferivelmente selecionada das proteínas das SEQ ID NOS: 11 a 18, cujo método compreende incubara dita proteína madura em um substrato adequado na presença de um ou mais inibidores ou sais dos mesmos de uma QC1 medir a atividade enzimáti- ca da dita proteína madura, comparar a dita atividade com atividade compa- rável determinada na ausência do inibidor de QC, e selecionar um composto que não reduz a atividade enzimática da dita proteína madura.
Além disso, a invenção também fornece um método de triar para
um inibidor de QPCTL seletivo, isto é, um composto capaz de inibir a ativi- dade enzimática de pelo menos uma proteína de QPCTL que é preferivel- mente selecionada das proteínas das SEQ ID NOS: 11 a 18; que não inibe a atividade enzimática de QC, em que a dita QC é preferivelmente a proteína
da SEQ ID NO: 10, cujo método compreende incubar a dita QC na presença de um ou mais inibidores ou sais dos mesmos de uma QPCTL, medir a ativi- dade enzimática de QC, comparar a dita atividade com atividade comparável determinada na ausência do inibidor de QPCTL, e selecionar um composto que não reduz a atividade enzimática da dita proteína de QPCTL.
Inibidores úteis de QC que também poderiam ser úteis como
inibidores de QPCTLs, são descritos em WO 2004/098625, WO 2004/098591, WO 2005/039548 e WO 2005/075436, que são incorporadas aqui em sua totalidade, especialmente com respeito à estrutura dos inibido- res e sua produção.
EXEMPLOS DE INIBIDORES DE QPCTL
Inibidores de QPCTL potenciais que são adequados para os u- sos e métodos de acordo com a presente invenção são descritos em WO 2005/075436, que é incorporada aqui em sua totalidade com respeito à es- trutura, síntese e métodos de uso dos inibidor de QCes.
Em particular:
Um composto adequado é aquele da fórmula 1*: fórmula 1'
Em uma outra modalidade, os inibidores de QPCTL podem ser aqueles da fórmula 1a,
Exemplo R ESI-EM (M+H) 1 Metila 199,3 2 terc-Butila 241,4 3 Benzila 275,4 4 Fenila 261,4 4-(flúor)-fenila 279,35 6 4-(cloro)-fenila 295,80 7 4-(etil)-fenila 289,41 8 4-(trifluorometil)-fenila 329,4 9 4-(metóxi-carbonil)-fenila 319,4 4-(acetil)-fenila 303,4 11 4-(metóxi)-fenila 291,4 12 biciclo[2,2,1lhept-5-en-2-ila 277,5 13 3,4-(dimetóxi)-fenila 321,5 14 2,4-(dimetóxi)-fenila 321,5 3,5-(dimetóxi)-fenila 321,5 16 2-(metóxi-carbonil)-fenila 319,4 17 4-(oxazol-5-i)-fenila 328,5 Exemplo R ESI-EM (M+H) 18 4-(pirazol-1 -il)-fenila 327,4 19 4-(isopropil)-fenila 303,5 4-(piperidino-1 -sulfonil)-fenila 408,6 21 4-(morfolin-4-il)-fenila 346,5 22 4-(ciano)-fenila 286,4 23 2,3-di-hidro-benzo[1,4ldioxin-6-ila 319,4 24 benzo[1,3]dioxol-5-ila 305,4 3,4,5(trimetóxi)-fenila 351,5 26 3-(metóxi)-fenila 291,4 27 4-(etóxi)-fenila 305,5 28 4-(benzilóxi)-fenila 367,5 29 4-(metóxi)-benzila 305,5 3,4-(dimetóxi)-benzila 335,5 31 2-( metóxi-ca rbo η i I )-tiofe ηο-3-i Ia 325,5 32 3-(etóxi-carbonil)-4,5,6,7- tetra-hidrobenzo[b]tio-feno-2-ila 392,6 33 2-(metóxi-carbonil)-4-(metil)-tiofeno-3-íla 339,5 34 Benzo[c][1,2,5ltiazol-4-ila 319,5 Benzo[c][1,2,5]tiazol-5-ila 319,5 36 5-(metil)-3-(fenil)-isooxazol-4-ila 342,5 37 3,5-(dimetil)-isooxazol-4-ila 280,4 38 4-(iodo)-fenila 387,3 39 4-(bromo)-fenila 340,3 40 4-(metil)-fenila 275,4 41 Naftalen-1-ila 311,5 42 4-(nitro)-fenila 306,4 43 Butila 241,4 44 Ciclo-octila 295,5 45 Furan-2-ilmetila 265,4 46 Tetra-hidrofuran-2-ilmetila 269,4 Exemplo R ESI-EM (M+H) 47 Benzo[1,3]dioxol-5-ilmetila 319,4 48 2-(morfolin-4-il)-etila 298,5 49 4-(metilsulfanil)-fenila 307,5 50 4-(dimetilamino)-fenila 304,5 51 4-(trif I uo ro metóxi )-fen i Ia 345,4 52 Benzoíla 288,3 53 Piridin-4-ila 261,1 Outros inibidores adequados de QPCTL podem ser aqueles da fórmula 1b, D1. N ^ ^ I r2 \J H H N (1b) em que R1 e R2 são definidos nos exemplos 54 a 95. Exemplo R1 R2 54 Ciano Metila 55 Ciano 3,4-(dimetóxi)-fenila 56 Ciano 2,4-(dimetóxi)-fenila 57 Ciano 3,5-(dimetóxi)-fenila 58 Ciano 2,3-diidrobenzo[b][1,4]dioxin-7-ila 59 Ciano Benzo[d][1,3]dioxol-6-ila 60 Ciano 3,4,5-(trimetóxi)-fenila 61 Ciano 3-(metóxi)-fenila 62 Ciano 4-(etóxi)-fenila 63 Ciano 4-(benzilóxi)-fenila 64 Ciano Fenila 65 Ciano 4-(metóxi)-fenila 66 Ciano 4-(acetil)-fenila 67 Ciano 4-(nitro)-fenila 68 Ciano Benzila 69 Ciano Naftalen-1-ila fórmula 1c,
Outros inibidores adequados de QPCTL podem ser aqueles da
N^N
H H
(1C)
em que R3 é definido nos exemplos 96 a 102.
Exemplo R3 ESI-EM (M+H) 96 Etila 197,3 97 6-fluoro-4H-benzo[d] [1,3]dioxin-8-ila 321,4 98 3-(cilopentilóxi)-4-(metóxi)-fenila 359,4 99 4-(heptilóxi)-fenila 359,5 100 3,4-di-hidro-2H-benzo[b][1,4]dioxepin-7-ila 317,4 101 4-(butóxi)-fenila 317,4 102 3,4-(dimetóxi)-fenila 305,4
Outros inibidores adequados de QPCTL podem ser aqueles da
fórmula 1d,
(1d)
em que a posição no anel é definida nos exemplos 103 a 105.
Exemplo Posição da substituição de benzila ESI-EM (M+H) 103 2 383,5 104 3 383,5 105 4 383,5
Outros inibidores adequados de QPCTL podem ser aqueles da
fórmula 1e,
\ J R4 R5
Ki---
(1e) em que R e R5 são definidos nos exemplos 106 a 109.
Exemplo R4 R5 ESI-EM (M+H) 106(S) H Metila 335,5 107(R) Metila H 335,5 108 Metila Metila 349,5 109 -CH2-CH2 347,5
Outros inibidores adequados de QPCTL podem ser aqueles da
fórmula 1f,
(1f)
em que R6 é definido nos exemplos 110a 112.
Exemplo R6 ESI-EM (M+H) 110 H 259,4 111 Cloro 293,8 112 Metóxi 289,4
Outros inibidores adequados de QPCTL podem ser aqueles da fórmula 1g,
s
Cg)
em que R7, R8 e R9 são dei Finidos nos exemplos 113 a 132. Exemplo R7 R8 R9 ESI-EM (M+H) 113 Fenila H H 260,4 114 Tiofen-2-ila H H 266,5 115(R) Fenila Metila H 274,5 116(S) Fenila H Metila 274,5 117 Fenila H Etil 288,5 118 Fenila H Fenila 336,5 119 3,4-(dimetóxi)-fenila H H 320,5 120 3,4-(dimetóxi)-fenila Metiia Metila 347,2 Exemplo R7 R8 R9 ESI-EM (M+H) 121 4-(cloro)-fenila -CH2-CH2-CH2- 334,9 122 4-(cloro)-fenila -CH2-C2H4-CH2- 349,0 123 4-(metóxi)-fenila -CH2-C3H6-CH2- 358,6 124 4-(metóxi)-fenila -CH2-CH2- 316,5 125 3,4-(dimetóxi)-fenila -CH2-CH2- 346,5 126 3,4,5-(trimetóxi)-fenila -CH2-CH2- 376,6 127 2,3,4-(trimetóxi)-fenila -CH2-CH2- 376,6 128 2-(metóxi)-fenila -CH2-CH2- 316,5 129 3-(metóxi)-fenila -CH2-CH2- 316,5 130 2,3-(dimetóxi)-fenila -CH2-CH2- 346,5 131 3,5-(dimetóxi)-fenila -CH2-CH2- 346,5 132 2,5-(dimetóxi)-fenila -CH2-CH2- 346,5
Outros inibidores adequados de QPCTL podem ser aqueles da
fórmula 1h,
(1h)
em que η é de inido nos exemplos 133 a 135. Exemplo N ESI-EM (M+H) 133 3 306,4 134 4 320,5 135 5 334,5
Outros inibidores adequados de QPCTL podem ser aqueles da fórmula 1i,
o
M--
N H
(1i)
Exemplo m ESI-EM (M+H) 136 2 307,4 137 4 335,5 Outros inibidores adequados de QPCTL podem ser aqueles da
fórmula 138 a 141. Exemplo Estrutura ESI-EM (M+H) 138 õ CT^Tf H 347,5 139 o S-Vr^ \ J N-— 347,2 140 NO2 \ I HH 226,3 141 /O-CH3 s 0-°°"' "Ò 370,4
O termo "agonista", como aqui usado, refere-se a uma molécula
que, quando ligada à QPCTL, aumenta ou prolonga a duração do efeito de QPCTL. Agonistas podem incluir proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos, ou qualquer outra molécula que ligam e modulam o efeito de QPCTL. Embo- ra seja menos provável que as moléculas pequenas provarão ser agonistas de QPCTL eficazes, um método para identificar uma tal molécula pequena que liga à QPCTL como um agonista compreende liberar uma forma cromo- gênica de uma molécula pequena que liga à QPCTL em células transforma- das com um vetor expressando QPCTL e ensaiar para alterações de fluo- rescência ou absorção de luz UV através de espectrofotometria. Uma quan- tidade aumentada de absorção de UV ou fluorescência estabeleceria que a molécula pequena é um agonista que aumenta a atividade de QPCTL. Outra técnica para triagem de fármaco que pode ser usada for-
nece triagem de processamento alto dos compostos tendo afinidade de liga- ção adequada à proteína de interesse como descrita no pedido de patente do PCT publicado WO 84/03564. Neste método, números grandes dos com- postos de teste pequenos diferentes são sintetizados em um substrato sóli- do, tal como pinos de plástico ou alguma outra superfície. Os compostos de teste são reagidos com QPCTL1 ou com fragmentos da mesma, e depois lavados. QPCTL ligada é depois detectada por métodos bem-conhecidos na técnica. QPCTL purificada pode também ser revestida diretamente sobre as placas para o uso nas técnicas de triagem de fármaco acima mencionadas. Alternativamente, anticorpos não-neutralizantes podem ser usados para cap- turar o peptídeo e imobilizá-lo em um suporte sólido.
Em outra modalidade, pode-se usar ensaios de triagem de fár- maco competitivos em que anticorpos neutralizantes capazes de especifica- mente ligar QPCTL competem com um composto de teste para ligar QPCTL. Desta maneira, anticorpos podem ser usados para detectar a presença de qualquer peptídeo que compartilha um ou mais determinantes antigênicos com QPCTL.
Como indicado acima, investigando os sítios de ligação, Iigantes podem ser projetados que, por exemplo, têm mais interações com QPCTL que seus Iigantes naturais. Tais Iigantes antagonistas ligarão à QPCTL com afinidade mais alta e assim funcionam como Iigantes competitivos. Alternati- vamente, proteínas sintéticas ou recombinantes homólogas ou análogas ao sítio de ligação de Iigante de QPCTL nativo podem ser projetadas, como também outras moléculas tendo afinidade alta por QPCTL. Tais moléculas devem também ser capazes de deslocar QPCTL e fornecer um efeito prote- tor.
Como indicado acima, o conhecimento das estruturas de QPCTL permite homólogos e análogos dos sítios de ligação sintéticos serem proje- tados. Tais moléculas facilitarão grandemente o uso das propriedades de ligação para alvejar agentes terapêuticos potenciais, e eles podem também ser usados para triar agentes terapêuticos potenciais. Além disso, eles po- dem ser usados como imunógenos na produção de anticorpos monoclonais cujos anticorpos podem ser usados em diagnose e/ou terapia como descrito anteriormente.
APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS
É conhecido na técnica que peptídeos amilóides, por exemplo Abeta 1-42 (SEQ ID NO: 23) e Abeta 1-40 (SEQ ID NO: 24), se tornam N- terminalmente truncados através das enzimas proteolíticas tais como por exemplo dipeptidil aminopeptidases ou aminopeptidases, resultando nos peptídeos Abeta- 3-42 (SEQ ID NO: 25), 3-40 (SEQ ID NO: 26), 11-42 (SEQ ID NO: 27) e 11 - 40 (SEQ ID NO: 28). Estes peptídeos Abeta truncados ini- ciam-se com um resíduo de glutamato no término N e são desse modo subs- tratos para QC (vide também WO 2004/09862) e possivelmente também pa- ra as QPCTLs das SEQ ID NOS: 11-18, 21 e 22, preferivelmente as isoQCs humanas das SEQ ID NOS: 11, 12, 21 e 22, o mais preferivelmente as i- soQCs humanas das SEQ ID NOS: 11 e 12. Os peptídeos de pGlu-Abeta resultantes das SED ID NOS 29-32 são muito mais hidrofóbicos que os pep- tídeos não tratados com piroglutamato, são muito mais propensos de formar agregados de peptídeos de Α-beta, tais como oligômeros e fibrilas, e foram mostrados altamente neurotóxicos. Por fim, os peptídeos Abeta das SEQ ID NOS: 29-32 representam um papel crucial no desenvolvimento do mal de Alzheimer e Síndrome de Down. Consequentemente, inibidores das QPCTLs das SEQ ID NOS: 11-18, 21 e 22, preferivelmente as isoQCs humanas das SEQ ID NOS: 11, 12, 21 e 22, o mais preferivelmente as isoQCs humanas das SEQ ID NOS: 11 e 12, podem ser usados para o tratamento de doenças relacionadas ao peptídeo amilóide, especialmente doenças neurodegenera- tivas, em particular mal de Alzheimer e Síndrome de Down.
Outros substratos fisiológicos potenciais de QPTCLs em mamí- feros são selecionados do grupo que consiste em GIu1-ABri (SEQ ID NO: 33), GIu1-ADan (SEQ ID NO: 34), e Gln1-Gastrinas (17 e 34) (SEQ ID NOS: 35 e 36). Sua forma tratada com piroglutamato (SEQ ID NOS: 37-40) causa patologias tais como aquelas selecionadas do grupo que consiste em câncer duodenal com ou sem infecções de Helicobacter pylori, câncer colorretal, síndrome de Zolliger-Ellison, Demência Britânica Familial (FBD) e Demência Dinamarquesa Familial (FDD). Consequentemente, inibidores de QPCTLs podem ser usados para tratar estes patologias.
Outros substratos fisiológicos potenciais de QPCTLs são mos- trados na tabela 3. TABELA 3: SEQÜÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE PEPTÍDEOS ATIVOS FISIOLÓGICOS COM UM RESÍDUO DE GLUTAMINA N-TERMINAL
Peptídeo Seqüência de aminoácido Função Grastrina 17 (SEQ ID NO: 35) Swiss- Prot: P01350 QGPWL EEEEEA YGWM DF (amida) Gastrina estimula a mucosa es- tomacal para produzir e secretar ácido hidroclórico e o pâncreas para secretar suas enzimas di- gestivas. Também estimula con- tração de músculos lisos e au- menta a circulação sangüínea e secreção de água no estômago e intestino Neurotensina (SEQ ID NO: 41) Swiss- Prot: P30990 QLYENKPRRP YIL Neurotensina representa um papel endócrino e parácrino na regulação do metabolismo de gordura. Causa contração dos músculos lisos. FPP Amida de QEP Um tripeptídeo relacionados ao hormônio de liberação de tirotro- fina (TRH)1 é encontrado no plasma seminal. Recente evi- dência obtida in vitro e in vivo mostrou que FPP representa um papel importante na regula- ção da fertilidade do esperma. TRH Swiss-Prot: P20396 Amida de QHP Funções de TRH como um re- gulador da biossíntese de TSH na glândula pituitária anterior e como um neurotransmissor / neuromodulador nos sistemas nervosos central e periférico. Peptídeo Seqüência de aminoácido Função GnRH (SEQ ID NO: 42) Swiss- Prot: P01148 QHWSYGL RP(G) Amida Estimula a secreção de gonado- tropinas; estimula a secreção de hormônios Iuteinizantes e esti- mulantes de folículos. CCL16 (citoci- na induzível pequena A16) (SEQ ID NO: 43) Swiss-Prot: 015467 QPKVPEW VNTPSTCCLK YYEKVLPRRL WGYR- KALNC HLPAIIFVTK RN- REVCTN P N DDWVQE- YIKD PNLPLLPTRN LSTVKIITAK NGQPQL- LNSQ Mostra atividade quimotática para linfócitos e monócitos mas não neutrófilos. Também mostra atividade mielossupressora po- tente, suprime proliferação de células progenitoras mielóides. SCYA16 recombinante mostra atividade quimotática para mo- nócitos e monócitos de THP-1, mas não linfócitos e neutrofilas em repouso. Induz um fluxo de cálcio em células THP-1 que foram dessensibilizadas através da expressão anterior a RAN- TES. CCL8 (citocina induzível pe- quena A8) (SEQ ID NO: 44) Swiss- Prot: P80075 QPDSVSI PITCCFNVIN RKIPIQRLES YTRIT- NIQCP KEAVIFKTKR GKEVCADPKE RW- VRDSMKHL DQIFQNLKP Fator quimotático que atrai mo- nócitos, linfócitos, basófilos e eosinófilos. Pode representar um papel em neoplasia e res- postas inflamatórias de hospe- deiro. Esta proteína pode ligar heparina. Peptídeo Seqüência de aminoácido Função CCL2 (citocina induzível pe- quena A2) (SEQ ID NO: 45) Swiss- Prot: P13500 qpdaina pvtccynftn rkisvqrlas yr- ritsskcp keavifktiv akeicadpkq kwvqdsmdhl dkqtqtpkt Fator quimotático que atrai mo- nócitos e basófilos mas não neutrófilos ou eosinófilos. Au- menta atividade antitumor dos monócitos. Foi implicado na pa- togênese de doenças caracteri- zadas por infiltrações monocíti- cas, como psoríase, artrite reu- matóide ou aterosclerose. Pode estar envolvido no recrutamento de monócitos na parede arterial durante o processo de doença de aterosclerose. Liga a CCR2 e CCR4. CCL18 (citoci- na induzível pequena a18) (SEQ ID NO: 46) Swiss- Prot: P55774 QVGTNKELC CLVYTSW- QIP QKFIVDYSET SPQCPKPGVI LLTKR- GRQIC ADPNKKWVQK YISDLKLNA Fator quimotático que atrai Iin- fócitos mas não monócitos ou granulócitos. Pode estar envol- vido em migração de células B em folículos de células B em linfonodos. Atrai linfócitos T pu- ros para as células dendríticas e macrófagos ativados nos linfo- nodos, tem atividade quimotáti- ca para células T puras, CD4+ e CD8+ células T e desse modo pode representar um papel em respostas de imunidade humo- ral e respostas de imunidade mediada por célula Peptídeo Seqüência de aminoácido Função Fractalcina QHHGVT KCNITCSKMT A forma solúvel é quimotática (neurotactina) SKIPVALLIH YQQN- para células T e monócitos, mas (SEQ ID NO: QASCGK RAIILETRQH não para neutrófilos. A forma 47) Swiss- RLFCADPKEQ WVK- ligada à membrana promove Prot: P78423 DAMQHLD RQAAAL- adesão daqueles leucócitos às TRNG GTFEKQIGEV K- células endoteliais. Pode repre- PRTTPAAGG MDESV- sentar um papel na regulação VLEPE ATGESSSLEP da adesão de leucócitos e pro- TPSSQEAQRA LGTS- cessos migratórios para o endo- PELPTG VTGSSGTRLP télio. Liga a cx3cr1 PTPKAQDGGP VGTEL- FRVPP VSTAATWQSS AFQPGPSLW AEAKTSE- APS TQDPSTQAST ASS- PAPEENA PSEG- QRVWGQ GQSPRPENSL EREEMGPVPA HT- DAFQDWGP GS- MAHVSWP VSSEGTPS- RE PVASGSWTPK AEE- pihatmd pqrlgvlitp VPDAQAATRR QAVGL- LAFLG LLFCLGVAMF TYQSLQGCPR KMAGE- MAEGL RYIPRSCGSN SYVLVPV Peptídeo Seqüência de aminoácido Função CCL7 (citocina induzível pe- quena A7) (SEQ ID NO: 48) Swiss- Prot: P80098 qpvgint sttccyrfin kkipkqrles yrrtts- shcp reavifktkl dke- icadptq kwvqdfmkhl dkktqtpkl Fator quimotático que atrai mo- nócitos e eosinófilos, mas não neutrófilos. Aumenta atividade antitumor dos monócitos. Tam- bém induz a liberação de gelati- nase B. Esta proteína pode ligar heparina. Liga a CCR1,CCR2 e CCR3 Orexina A (Hi- pocretina-1) (SEQ ID NO: 49) Swiss-Prot 043612 QPLPDCCRQK TCSCRL- YELL HGAGNHAAGI LTL Neuropeptídeo que representa um papel significativo na regu- lação de aporte alimentício e sono-vigilância, possivelmente coordenando o complexo das respostas comportamentais e fisiológicas destas funções ho- meostáticas complementares. Representa também um papel mais vasto na regulação home- ostática do metabolismo de e- nergia, função autonômica, e- quilíbrio hormonal e a regulação de fluidos do corpo. Orexina-A liga a 0X1R e 0X2R com uma afinidade7 alta. Peptídeo Seqüência de aminoácido Função Substância P (SEQ ID NO: 50) RPK PQQFFGLM Pertence às taquicininas. Taqui- cininas são peptídeos ativos que excitam os neurônios, evo- cam respostas comportamen- tais, são potentes vasodilatado- res e secretagogues, e contra- em (direta ou indiretamente) muitos músculos lisos.
Os peptídeos Gln1-Gastrina (17 e 34 aminoácidos em compri-
mento), Gln1-Neurotensina e GIn1-FPP foram identificados como substratos fisiológicos novos de QPCTLs. Gastrina, Neurotensina e FPP compreendem um resíduo de pGIu em sua posição N-terminal. Este resíduo de pGIu N- terminal pode ser formado de glutamina N-terminal por meio da catálise de QPCTL para todos os peptídeos. Como resultado, estes peptídeos são ati- vados em termos de sua função biológica na conversão do resíduo de glu- tamina N-terminal para pGIu.
Células transdutoras transepiteliais, particularmente a célula de gastrina (G)1 coordenadam a secreção de ácido gástrico com a chegada de alimento no estômago. Recente trabalho mostrou que múltiplos produtos ativos são gerados do precursor de gastrina, e que há pontos de controle múltiplos na biossíntese da gastrina. Precursores biossintéticos e intermediá- rios (progastrina e Gly-gastrinas) são fatores de crescimento putativos; seus produtos, as gastrinas amidadas, regulam a proliferação das células epiteli- ais, a diferenciação das células parietais produtoras de ácido e células simi- lares à enterocromafina secretoras de histamina (ECL), e a expressão dos genes associados à síntese de histamina e armazenamento nas células E- CL, como também secreção de ácido intensamente estimulante. Gastrina também estimula a produção dos membros da família do fator de crescimen- to epidérmico (EGF) que por sua vez inibe a função de célula parietal mas estimula o crescimento das células epiteliais superficiais. Concentrações de gastrina no plasma são elevadas em sujeitos com Helicobacter pylori que são conhecidos ter risco aumentado de doença de úlcera duodenal e câncer gástrico (Dockray, G. J. 1999 J Physiol 75315-324).
A gastrina hormonal peptídica, liberada de células G antrais, é conhecida estimular a síntese e liberação de histamina das células ECL na mucosa oxíntica por meio dos receptores de CCK-2. A histamina mobilizada induz secreção de ácido ligando aos receptores H(2) localizados nas células parietais. Recentes estudos sugerem que gastrina, em ambas suas formas completamente amidadas e menos processadas (progastrina e gastrina es- tendida com glicina), seja também um fator de crescimento para o trato gas- trintestinal. Estabeleceu-se que o efeito tráfico principal da gastrina amidada é para a mucosa oxíntica do estômago onde ela causa proliferação aumen- tada das células-tronco gástricas e células ECL, resultando em massa au- mentada de células parietais e ECL. Por outro lado, o alvo tráfico principal da gastrina menos processada (por exemplo gastrina estendida com glicina) parece ser a mucosa colônica (Koh, T. J. e Chen1 D., 2000 Regul Pept 9337- 44).
Em uma outra modalidade, a presente invenção provê o uso de efetores de aumento de atividade das QPCTLs para a estimulação de proli- feração de células do trato gastrintestinal, proliferação de células mucosas especialmente gástricas, proliferação de células epiteliais, a diferenciação de células parietais produtoras de ácido e células similares à enterocromafina secretoras de histamina (ECL), e a expressão dos genes associados à sín- tese de histamina e armazenamento nas células ECL, como também para a estimulação da secreção de ácido aguda em mamíferos mantendo ou au- mentando a concentração de pGlu1-Gastrina ativa (SEQ ID NOS: 39 e 40).
Em uma outra modalidade, a presente invenção provê o uso de inibidores de QPCTLs para o tratamento de doença de úlcera duodenal e câncer gástrico com ou sem infecções de Helicobacter pylori em mamíferos diminuindo a taxa de conversão de Gln1-Gastrina inativa (SEQ ID NOS: 35 e 36) para pGlu1-Gastrina ativa (SEQ ID NOS: 39 e 40).
Neurotensina (NT) (SEQ ID NO: 41) é um neuropeptídeo impli- cado na fisiopatologia de esquizofrenia que especificamente modula os sis- temas neurotransmissores previamente demonstrados para ficarem desregu- Iados neste distúrbio. Estudos clínicos em que as concentrações de NT do fluido cerebrospinhal (CSF) foram medidas revelaram um subconjunto de pacientes esquizofrênicos com concentrações de NT de CSF diminuídas que são restabelecidas através de tratamento de fármaco antipsicótico eficaz. Evidência considerável também existe concordante com o envolvimento de sistemas de NT no mecanismo de ação dos fármacos antipsicóticos. Os efei- tos comportamentais e bioquímicos de NT centralmente administrada nota- velmente se assemelham aos dos fármacos antipsicóticos sistemicamente administrados, e os fármacos antipsicóticos aumentam a neurotransmissão de NT. Esta concatenação de descobertas conduziu à hipótese que NT fun- cione como um antipsicótico endógeno. Além disso, fármacos antipsicóticos típicos e atípicos diferencialmente alteram a neurotransmissão de NT em regiões terminais de dopamina nigrostatais e mesolímbicas, e estes efeitos são preditivos da responsabilidade dos efeitos colaterais e eficácia, respecti- vamente (Binder, Ε. B. et al. 2001 Biol Psychiatry 50856-872).
Consequentemente, a presente invenção provê o uso de efeto- res de aumento da atividade de QPCTLs para a preparação de fármacos antipsicóticos e/ou para o tratamento de esquizofrenia em mamíferos. Os efetores de QPCTLs ou mantêm ou aumentam a concentração de pGIu1- neurotensina ativa.
Peptídeo promotor de fertilização (FPP), um tripeptídeo relacio- nado ao hormônio de liberação de tirotrofina (TRH), é encontrado no plasma seminal. Recente evidência obtida in vitro e in vivo mostrou que FPP repre- senta um papel importante na regulação da fertilidade espermática. Especifi- camente, FPP inicialmente estimula espermatozóídes não-fertilizante (inca- pacitados) para "ativarem-se" e se tornarem férteis mais rapidamente, mas depois detêm a capacitação de forma que os espermatozóides não sofrem perda acrossômica espontânea e portanto não perde o potencial fertilizador. Estas respostas são mimetizadas, e de fato aumentados, através da adeno- sina, conhecida regular a via de transdução de sinal de adenilil ciclase (AC)/cAMP. FPP e adenosina foram mostrados estimular a produção de cAMP em células incapacitadas mas a inibem em células capacitadas, com receptores de FPP interagindo de alguma maneira com os receptores de adenosina e proteínas G para alcançar a regulação de AC. Estes eventos afetam o estado de fosforilação de tirosina de várias proteínas, algumas 5 sendo importantes na "ativação" inicial, outras estando possivelmente envol- vidas na própria reação acrossômica. Calcitonina e angiotensina II, também encontradas no plasma seminal, têm efeitos similares in vitro em espermato- zóides incapacitados e podem aumentar as respostas a FPP. Estas molécu- las têm efeitos similares in vivo, afetando a fertilidade estimulando e depois 10 mantendo o potencial de fertilização. Quaisquer reduções na disponibilidade de FPP, adenosina, calcitonina, e angiotensina Il ou defeitos em seus recep- tores contribuem para a infertilidade masculina (Fraser, L. R. e Adeoya- Osiguwa, S. A. 2001 Vitam Horm 63, 1 -28).
Em uma outra modalidade, a presente invenção provê o uso de 15 inibidores de QPCTLs para a preparação de fármacos proibitivos de fertiliza- ção e/ou reduzir a fertilidade em mamíferos. Os inibidores de QPCTLs dimi- nuem a concentração de pGlu1-FPP ativo, conduzindo a uma prevenção de capacitação espermática e desativação das células espermáticas. Em con- traste pôde ser mostrado que os efetores de aumento de atividade de QC 20 podem estimular fertilidade em machos e tratar infertilidade.
Em uma outra modalidade, outros substratos fisiológicos de QPCTLs foram identificados dentro da presente invenção. Estes são Gln1- CCL2 (SEQ ID NO: 45), Gln1-CCL7 (SEQ ID NO: 48), Gln1-CCL8 (SEQ ID NO: 44), Gln1-CCL16 (SEQ ID NO: 43), Gln1-CCL18 (SEQ ID NO: 46) e 25 Gln1-fractalcina (SEQ ID NO: 47). Para detalhes vide Tabela 3. Estes poli- peptídeos representam um papel importante em condições patofisiológicas, tais como supressão de proliferação de células progenitoras mielóides, neo- plasia, respostas inflamatórias de hospedeiro, câncer, psoríase, artrite reu- matóide, aterosclerose, respostas de imunidade mediada por célula e humo- 30 ral, processos de adesão e migração de leucócitos no endotélio.
Várias vacinas com base em peptídeo de linfócitos T citotóxicos contra hepatite B, vírus da imunodeficiência humana e melanoma foram re- centemente estudadas em experimentações clínicas. Um candidato de vaci- na de melanoma interessante sozinho ou em combinação com outros antí- genos tumorais é o decapeptídeo ELA. Este peptídeo é um análogo de pep- tídeo imunodominante de antígeno de Melan-A/MART-1, com um ácido glu- tâmico N-terminal. Foi relatado que o grupo amino e grupos gama- carboxílicos de ácido glutâmico, como também o grupo amino e grupo gama- carboxamida de glutaminas, condensam-se facilmente para formar derivados piroglutâmicos. Para superar este problema de estabilidade, vários peptí- deos de interesse farmacêutico foram desenvolvidos com um ácido piroglu- tâmico em vez de glutamina N-terminal ou ácido glutâmico, sem perda das propriedades farmacológicas. Infelizmente comparado com ELA, o derivado de ácido piroglutâmico (PyrELA) e também o derivado revestido com acetil N-terminal (AcELA) não suscita a atividade dos linfócitos T citotóxicos (CTL). Apesar das modificações secundárias evidentes introduzidas em PyrELA e AcELA, estes dois derivados provavelmente têm afinidade inferior que ELA para o complexo de histocompatibilidade principal específico da classe I. Por conseguinte para conservar a atividade total de ELA, a formação de PyrELA deve ser evitada (Beck A. et al. 2001, J Pept Res 57(6):528-38.). Recente- mente, foi descoberto que também a enzima glutaminil ciclase (QC) é supra- expressada em melanomas (Ross D. T et al., 2000, Nat Genet 24:227 -35.).
Consequentemente, a presente invenção provê o uso de inibido- res de QPCTLs para a preparação de um medicamento para o tratamento de condições patofisiológicas, tais como supressão de proliferação de células progenitoras mielóides, neoplasia, respostas inflamatórias de hospedeiro, 25 câncer, metástase maligno, melanoma, psoríase, artrite reumatóide, ateros- clerose, respostas de imunidade mediadas por célula e humoral prejudica- das, processos de adesão e migração de leucócitos no endotélio.
Além disso, Gln1-Orexina A (SEQ ID NO: 49) foi identificada co- mo um substrato fisiológico de QPCTLs dentro da presente invenção. Orexi- na A é um neuropeptídeo que representa um papel significativo na regulação de aporte alimentício e sono-vigilância, possivelmente coordenando as res- postas comportamentais e fisiológicas complexas destas funções homeostá- ticas complementares. Ela representa também um papel na regulação ho- meostática do metabolismo de energia, função autonômica, equilíbrio hor- monal e a regulação dos fluidos do corpo.
Em uma outra modalidade, a presente invenção provê o uso de 5 inibidores de QPCTLs para a preparação de um medicamento para o trata- mento de aporte alimentício prejudicado e sono-vigilância, regulação home- ostática prejudicada do metabolismo de energia, função autonômica prejudi- cada, equilíbrio hormonal prejudicado e regulação prejudicada dos fluidos do corpo.
Expansões de poliglutamina em várias proteínas conduzem a
distúrbios neurodegenerativos, tais como doença de Parkinson e doença de Kennedy. O mecanismo permanece portanto grandemente desconhecido. As propriedades bioquímicas das repetições de poliglutamina sugerem uma possível explanação: clivagem endolítica em uma ligação de glutaminil- 15 glutaminil seguida por formação de piroglutamato pode contribuir para a pa- togênese aumentando a estabilidade catabólica, hidrofobicidade, amiloido- genicidade, e neurotoxidade das proteínas de poliglutaminila (Saido, T; Med Hypotheses (2000) mar;54(3):427-9). Consequentemente, a presente inven- ção provê portanto o uso de inibidores de QPCTLs para a preparação de um 20 medicamento para o tratamento de doença de Parkinson e doença de Hun- tington.
Um outro substrato de QPTCLs é o peptídeo QYNAD (SEQ ID NO: 51). Sua forma tratada com piroglutamato pGlu-Tyr-Asn-Ala-Asp (pEY- NAD) (SEQ ID NO: 52) é o agente eficaz com atividade de bloqueio dos ca- 25 nais de sódio dependentes de voltagem. Os canais de sódio são expressa- dos em densidade alta em axônios mielinados e representam um papel obri- gatório em conduzir potenciais de ação ao longo dos axônios dentro do cé- rebro e espinha dorsal mamíferos. Portanto, especulou-se que eles estão envolvidos em vários aspectos da fisiopatologia de esclerose múltipla (EM), 30 síndrome de Guillain-Barré e polirradiculoneuropatia desmielinizante inflama- tória crônica.
Em uma outra modalidade, a presente invenção provê o uso de inibidores de QPCTLs para a preparação de um medicamento para o trata- mento de doenças autoimunes inflamatórias, especialmente para esclerose múltipla, síndrome de Guillain-Barré e polirradiculoneuropatia desmielinizan- te inflamatória crônica, em que a formação do peptídeo pEYNAD de bloqueia dos canais de sódio dependentes da voltagem é inibida.
Além disso, a presente invenção provê um ensaio de diagnósti- co, compreendendo um inibidor de QC.
Em outra modalidade, a presente invenção provê um método de diagnosticar qualquer uma das doenças e/ou condições acima mencionadas, compreendendo as etapas
- colher uma amostra de um sujeito que é suspeito de estar afligido com a dita doença e/ou condição,
- contatar a dita amostra com um inibidor de QC, e
- determinar se ou não o dito sujeito está afligido pela dita doença e/ou con- dição.
Preferivelmente, a amostra no dito método de diagnóstico é uma amostra de sangue, uma amostra de soro, uma amostra do licor cerebrospi- nhal ou uma amostra de urina.
Preferivelmente, o sujeito no dito método de diagnóstico é um ser humano.
Preferivelmente, o inibidor de QC no dito método de diagnóstico é um inibi- dor de QC seletivo.
Outros preferidos para o uso no dito ensaio de diagnóstico são inibidores de QPCTL seletivos.
A presente invenção também refere-se a um kit de diagnóstico para levar a cabo o método de diagnóstico compreendendo como meio de detecção o ensaio de diagnóstico acima mencionado e um meio de determi- nação.
EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE isoQC HUMANA LINHAGENS CELULARES E MEIOS Linhagem celular de rim de macaco verde africano COS-7, li-
nhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, linhagem celular de asatrocitoma humano LN405, linhagem celular de ceratinocitoma humano HaCaT e linhagem celular de carcinoma hepatocelular humano Hep-G2 fo- ram cultivadas em meios de cultura celular apropriados (DMEM, 10 % FBS para Cos-7, SH-SY5Y, LN405, HaCaT), (RPMM 640, 10 % FBS para Hep- G2), em uma atmosfera umedecida de 5 % CO2 (HaCaT1 Hep-G2, COS - 7) ou 10 % CO2 (SH-SY5Y, LN405) a 37° C.
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE isoQC HUMANA USANDO RT-PCR
RNA total foi isolado de células SH-SY5Y, LN405, HaCaT e Hep- G2 usando o Kit RNeasy Mini (Qiagen) e inversamente transcrita por Su- perScript Il (Invitrogen).
Subsequentemente, isoQC humana foi amplificada em uma dilu-
ição 1:12,5 do produto de cDNA gerado em uma reação de 25 μΙ com Hercu- Iase Enhanced DNA-PoIymerase (Stratagene) usando iniciadores isoQCh-1 (sentido, SEQ ID NO: 53) e isoQCh-2 (antissentido, SEQ ID NO: 54). O pro- duto de PCR de Hep-G2 que utilizou o kit de Purificação de PCR Strataprep (Stratagene) foi purificado e confirmado por sequenciação.
RESULTADOS
ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE isoQC HUMANA USANDO RT-PCR
Transcrições de isoQC humana foram encontradas estar presen- tes em linhagens celulares SH-SY5Y (Figura 6, rota 1), LN405 (Figura 6, rota 2), HaCaT (Figura 6, rota 3) e Hep-G2 (Figura 6, rota 4). O produto de PCR de Hep-G2 foi confirmado por sequenciação.
ISOLAMENTO DE isoQC HUMANA
cDNA de comprimento total de isoQC humana foi isolado de cé- lulas Hep-G2 usando RT-PCR. Brevemente, RNA total de células Hep-G2 foi 25 inversamente transcrito por SuperScript Il (Invitrogen). Subsequentemente, isoQC humana foi amplificada em uma diluição 1:12,5 do produto de cDNA gerado em uma reação de 25 μΙ com Herculase Enhanced DNA-PoIymerase (Stratagene) usando iniciadores isoQChu-1 (sentido, SEQ ID NO: 55) e i- soQChu-2 (antissentido, SEQ ID NO: 56). O produto de PCR resultante foi 30 subclonado em vetor pPCRScript CAM SK (+) (Stratagene) e confirmado por sequenciação.
EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO E EXPRESSÃO DE isoQC HUMANA EM CULTURA CELULAR MAMÍFERA
CLONAGEM MOLECULAR DOS VETORES DE PLASMÍDEO QUE CODI- FICAM UMA PROTEÍNA DE FUSÃO DE isoQC-EGFP HUMANA
Todos os procedimentos de clonagem foram feitos aplicando técnicas de biologia molecular padrões. Para expressão da proteína de fu- são de isoQC humana-EGFP em células humanas, o vetor pEGFP-N3 (Invi- trogen) foi usado. O cDNA da isoQC humana nativa começando na metioni- na I ou na metionina Il foi N-terminalmente fundido na estrutura com a prote- ína fluorescente verde intensificada codificada com plasmídeo (EGFP). Os iniciadores EGFP-1 Met I de isoQC (SEQ ID NO: 57) e EGFP-3 de isoQC (SEQ ID NO: 59) foram usados para amplificação de isoQC humana come- çando com metionina I e iniciadores EGFP-2 Met Il de isoQC (SEQ ID NO: 58) e EGFP-3 de isoQC (SEQ ID NO: 59) foram usados para amplificação de isoQC humana começando com metionina II. Os fragmentos foram inseridos no vetor pEGFP-N3 (Invitrogen) empregando os sítios de restrição de EcoR\ e Sa/I e a inserção correta foi confirmada por sequenciação. Subsequente- mente, os vetores foram isolados para propósitos de cultura celular usando o Kit EndoFree Maxi (Qiagen).
PROCEDIMENTO DE CLONAGEM DAS SEQÜÊNCIAS N-TERMINAIS DE hisoQC
Além disso, a seqüência de EGFP do vetor pEGFP-N3 (Invitro- gen) foi introduzida no vetor pcDNA 3.1 (Invitrogen) usando EGFP-1 (senti- do) (SEQ ID NO: 85) e EGFP-2 (antissentido) (SEQ ID NO: 86) para amplifi- cação. O fragmento foi introduzido no sítio Xho\ de pcDNA 3.1. As sequên- 25 cias N-terminais de hisoQC começando com metionina I e Il cada terminan- do na serina 53 foram fundidas C-terminalmente com EGFP no vetor pcDNA
3.1 usando EGFP-1 Met I de isoQC (sentido, SEQ ID NO: 57) e pcDNA de EGFP de hisoQC SS as (antissentido) (SEQ ID NO: 87) para o fragmento N- terminal de hisoQC começando com metionina I e EGFP-2 Met Il de isoQC 30 (sentido, SEQ ID NO: 58) e pcDNA de EGFP de hisoQC SS as (antissentido) (SEQ ID NO: 87) para o fragmento N-terminal de hisoQC começando com metionina II. Os fragmentos foram inseridos nos sítios de restrição EcoR\ e Noti do vetor pcDNA 3.1. Subsequentemente, os vetores foram isolados pa- ra propósitos de cultura celular usando o Kit EndoFree Maxi (Qiagen). PROCEDIMENTO DE CLONAGEM PARA EXPRESSÃO NATIVA DE hi- soQC E hQC
HQC nativa foi inserida nos sítios de restrição HindWI e Not\ e
hisoQC nativa foi inserida nos sítios de restrição EcoRl e Noti do vetor pcD- NA 3.1 (+) (Invitrogen) após amplificação utilizando os iniciadores hQC-1 (sentido) (SEQ ID NO: 82) e hQC-2 (antissentido) (SEQ ID NO: 83) para hQC, EGFP-1 Met I de isoQC (sentido) (SEQ ID NO: 57) e pcDNA de hi-
soQC as (antissentido) (SEQ ID NO: 84) para hisoQC começando com meti- onina I e EGFP-2 Met Il de isoQC (sentido) (SEQ ID NO: 58) e pcDNA de hisoQC as (antissentido) (SEQ ID NO: 84) para hisoQC começando com metionina II.
PROCEDIMENTO DE CLONAGEM PARA hisoQC E hQC FLAG- MARCADAS
QC humana foi clonada com um Flag-marcador C-terminal após amplificação aplicando os iniciadores hQC-1 (sentido) (SEQ ID NO: 82) e pcDNA de C-FLAG de hQC as (antissentido) (SEQ ID NO: 88) nos sítios de restrição Hind\\\ e NotI do vetor pcDNA 3.1. IsoQC humana foi inserida com 20 um Flag-marcador C-terminal em pcDNA 3.1 após amplificação usando os iniciadores EGFP-1 Met I de isoQC (sentido) (SEQ ID NO: 57) e pcDNA de C-FLAG de hisoQC as (antissentido) (SEQ ID NO: 89) para hisoQC come- çando com metionina 1 e os iniciadores EGFP-2 Met Il de isoQC (sentido) (SEQ ID NO: 58) e pcDNA de C-FLAG de hisoQC as (antissentido) (SEQ ID 25 NO: 89) para hisoQC começando com metionina 2.
EXEMPLO 3: TINGIMENTO IMUNO-HISTOQUÍMICO DE ISOQC HUMANA EM CÉLULAS MAMÍFERAS
TRANSFECÇÃO E TINGIMENTO HISTOQUÍMICO DE COS-7 E LN405
Para expressão das proteínas de fusão de isoQC humana- EGFPs começando com metionina I ou metionina II, COS-7 e LN405 foram cultivadas em pratos de 6 poços contendo uma lâmina de cobertura. As célu- las foram crescidas até 80 % de confluência, transfeccionadas usando Lipo- fectamin2000 (Invitrogen) de acordo com o manual do fabricante e incuba- das na solução de transfecção durante 5 horas. Depois, a solução foi substi- tuída por meios de crescimento apropriados e as células foram crescidas durante a noite.
5 No próximo dia, as células foram lavadas duas vezes com D-
PBS (Invitrogen) e fixadas usando metanol esfriado em gelo por 10 min a - 20° C, seguido por 3 etapas de lavagem usando D-PBS durante 10 min em temperatura ambiente. COS-7 e LN405 foram incubados com anticorpo poli- clonal antimanosidase Il de coelho para tingimento da zona golgi, (Chemi- 10 con) em uma diluição 1:50 de anticorpo em D-PBS por 3 h. Para tingimento das mitocôndrias em COS-7 e LN405, as células foram incubadas com anti- corpo monoclonal de mitocôndrias antihumanas de camundongo (Chemicon) em uma diluição 1:100 de anticorpo em D-PBS por 3 h em temperatura am- biente. Subsequentemente, as células foram lavadas 3 vezes com D-PBS 15 durante 10 min. As células tingidas foram incubadas para zona golgi com anticorpo secundário de IgG de anticoelho de cabra conjugado com Rhoda- min - RedX (Dianova) por 45 min em temperatura ambiente na escuridão. As células tingidas para mitocôndrias foram incubadas com anticorpo secundá- rio de IgG de anticamundongo de cabra conjugado com Rhodamin-RedX 20 (Dianova) por 45 min em temperatura ambiente na escuridão. Depois, as células foram lavadas 3 vezes com D-PBS por 5 min em temperatura ambi- ente e pelo menos, as lâminas de cobertura foram montadas em uma lâmina de microscópio com Citiflour. As células foram observadas sob um micros- cópio de fluorescência (Carl-Zeiss).
RESULTADOS
1. TRANSFECÇÃO E TINGIMENTO HISTOQUÍMICO DE LN405
A expressão da proteína de fusão de isoQC humana-EGFP co- meçando com metionina I e metionina Il na linhagem celular LN405 (fluores- cência verde) conduz a uma compartimentalização da proteína resultante. Contratingimento da zona golgi de LN405 usando anticorpo de manosidase
Il (fluorescência vermelha) e superimposição subsequente de isoQC huma- na-EGFP com Manosidase Il sugere uma localização da proteína de fusão de isoQC humana-EGFP dentro do compartimento de golgi (coloração ama- rela das imagens fundidas) (Figura 7, 9). Assim, é evidente que isoQC hu- mana iniciando em metionina Il é suficiente para gerar uma localização de golgi da proteína de fusão de isoQC humana.
5 A expressão da proteína de fusão de isoQC humana-EGFP co-
meçando com metionina I e Il (fluorescência verde) e contratingimento para mitocôndrias (fluorescência vermelha) não revela uma localização da proteí- na de fusão de isoQC humana-EGFP começando com metionina I ou Il den- tro das mitocôndrias devido à ausência de uma coloração amarela das ima- gens fundidas após superimposição (Figura 8, 10).
2. TRANSFECÇÃO E TINGIMENTO HISTOQUÍMICO DE COS-7
Em analogia à expressão da proteína de fusão de isoQC huma- na-EGFP começando com metionina I e metionina Il na linhagem celular LN405, conduz à expressão da proteína de fusão de isoQC humana-EGFP 15 começando com metionina I e metionina Il em COS-7 para uma comparti- mentalização da proteína resultante (fluorescência verde). Contratingimento da zona de golgi da células COS-7 usando anticorpo de manosidase Il (fluo- rescência vermelha) e superimposição subsequente de isoQC humana- EGFP com Manosidase Il sugere uma localização da proteína de fusão de 20 isoQC humana-EGFP dentro do compartimento de golgi de COS-7 (colora- ção amarela das imagens fundidas) (Figura 11, 13). Novamente, em células COS-7 a expressão de proteína de fusão de isoQC humana-EGFP iniciando em metionina Il é suficiente para causar uma localização de golgi.
Como esperado, a expressão da proteína de fusão de isoQC 25 humana-EGFP começando com metionina I e Il em COS-7 (fluorescência verde) e Contratingimento para mitocôndrias (fluorescência vermelha) não resulta em uma localização da proteína de fusão de isoQC humana-EGFP começando com metionina I ou Il dentro das mitocôndrias devido à ausência de uma coloração amarela das imagens fundidas após superimposição (Fi- 30 gura 12,14).
EXEMPLO 4: EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE isoQC HUMANA EM E.
coli CEPAS HOSPEDEIRAS E MEIOS
Cepa de Escherichia coli DH5a foi usada para propagação de plasmídeos e cepa de E. coli BL21 foi usada para a expressão de isoQC humana. Cepas de E. coli foram cultivadas, transformadas e analisadas de 5 acordo com as instruções do fabricante (Qiagen(DH5a) Stratagene (BL21)). Os meios requeridos para E coli, isto é, meio de Luria-Bertani (LB)1 foram preparados de acordo com as recomendações do fabricante.
CLONAGEM MOLECULAR DE VETORES DE PLASMÍDEO QUE CODIFI- CAM QC HUMANA
Todos os procedimentos de clonagem foram feitas aplicando as
técnicas de biologia molecular padrões. Para expressão em BL21 de E. coli, o vetor pET41a (Novagen) foi usado. O cDNA da isoQC humana madura começando com o códon 30 (contando da metionina II) foi fundido na estru- tura com o plasmídeo codificado com marcador GST. Após amplificação uti- 15 Iizando os iniciadores pET41a-1 de hisoQC (SEQ ID NO: 60) e pET41a-2 de hisoQC (SEQ ID NO: 61) (Tabela 4) um sítio de clivagem de protease N- terminal para Enterocinase e um (His)6-marcador C-terminal foi introduzido. Após subclonar, o fragmento foi inserido no vetor de expressão empregando os sítios de restrição de Spel e EcoR\.
EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO EM BL21 DE E. coli
O constructo que codifica a isoQC humana foi transformado em células BL21 (Stratagene) e cultivadas em placas de ágar com LB seletivas a 37° C. Expressão da proteína foi realizada em meio LB contendo 1 % de glicose a 37° C. Após alcançar uma OD6oo de aproximadamente 0,8, expres- 25 são de isoQC foi induzida com 20 μΜ de IPTG por 4 h a 37° C. As células foram separadas do meio através de centrifugação (4000xg, 20 min), res- suspensas em PBS (140 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,3) e Iisadas por um ciclo de congelamento e descongelamen- to seguido por um ciclo de Prensa Francesa. O Iisado celular foi diluído para 30 um volume final de 1,5 L usando tampão contendo fosfato (50 mM Na2HPO4, 500 mM NaCI, pH 7,3) e centrifugado a 13.400 xg a 4o C por 1 h. Após cen- trifugação, a concentração da proteína do sobrenadante resultante é deter- minada usando o método de Bradford. Se necessário, a solução foi diluída novamente para obter uma concentração de proteína total final de 0,6 mg/ml. A proteína de fusão de GST-isoQC que utilizou um protocolo de 4 etapas foi purificada (Tabela 5). A purificação é ilustrada por análise de SDS-PAGE na 5 Figura 20.
EXEMPLO 5: ENSAIOS PARA ATIVIDADE DE GLUTAMINIL CICLASE ENSAIOS FLUOROMÉTRICOS
Todas as medições foram executadas com uma leitora de No- voStar para microplaca (BMG Labtechnologies) a 30° C. Atividade de QC foi 10 avaliada fluorometricamente usando H-Gln-βΝΑ. As amostras consistiram em 0,2 mM de substrato fluorogênico, 0,25 U de piroglutamil aminopeptidase (Qiagen, Hilden, Alemanha) em 0,05 M de Tris/HCI, pH 8,0 e uma alíquota de QC apropriadamente diluída em um volume final de 250 μΙ. Comprimen- tos das ondas de excitação/emissão foram 320/410 nm. As reações do en- 15 saio foram iniciadas por adição de glutaminil ciclase. Atividade de QC foi de- terminada de uma curva padrão de β-naftilamina sob condições de ensaio. Uma unidade é definida como a quantidade de QC que catalisa a formação de 1 pmol de pGlu-βΝΑ de H-Gln-βΝΑ por minuto sob as condições descri- tas.
Em um segundo ensaio fluorométrico, atividade de QC foi de-
terminada usando H-GIn-AMC como substrato. Reações foram realizadas a 30° C utilizando a leitora de NOVOStar para microplaca (BMG Labtechnolo- gies). As amostras consistiram em concentrações variadas do substrato fluo- rogênico, 0,1 U de piroglutamil aminopeptidase (Qiagen) em 0,05 M de 25 Tris/HCI, pH 8,0 e uma alíquota de QC apropriadamente diluída em um vo- lume final de 250 μΙ. Comprimentos das ondas de excitação/emissão foram 380/460 nm. As reações do ensaio foram iniciadas por adição de glutaminil ciclase. Atividade de QC foi determinada de uma curva padrão de 7-amino- 4-metilcumarina sob condições de ensaio. Os dados cinéticos foram avalia- 30 dos usando software de GraFit.
ENSAIO ESPECTROFOTOMÉTRICO DE isoQC
Este ensaio foi usado para determinar os parâmetros cinéticos para a maioria dos substratos de QC. Atividade de QC foi analisada espec- trofotometricamente usando um método contínuo (Schilling, S. et al., 2003 Biol Chem 384, 1583-1592) utilizando desidrogenase glutâmica como a en- zima auxiliar. As amostras consistiram do respectivo substrato de QC, 0,3 5 mM de NADH, 14 mM de ácido α-cetoglutárico e 30 U/ml de desidrogenase glutâmica em um volume final de 250 μΙ. As reações foram iniciadas por adi- ção de QC e acompanhadas monitorando a diminuição na absorbância a 340 nm por 8-15 min. As velocidades iniciais foram avaliadas e a atividade enzimática foi determinada de uma curva padrão de amônia sob condições 10 de ensaio. Todas as amostras foram medidas a 30° C, usando a leitora de Sunrise para microplacas. Os dados cinéticos foram avaliados usando soft- ware GraFit.
ENSAIO DE INIBIDOR
Para testagem do inibidor, a composição da amostra foi igual à 15 descrita acima, exceto do composto inibidor putativo adicionado. Para um teste rápido de inibição de QC, as amostras continham 4 mM do respectivo inibidor e uma concentração de substrato a 1 KM. Para investigações deta- lhadas da inibição e determinação dos valores K,, influência do inibidor nas enzimas auxiliares foi primeiro investigada. Em todo caso, não houve ne- 20 nhuma influência em qualquer enzima detectada, desse modo permitindo a determinação segura da inibição de QC. A constante inibidora foi avaliada ajustando o conjunto de curvas de progresso à equação geral para inibição competitiva usando software GraFit.
RESULTADOS
Uma variedade de substratos diferentes foi avaliada em conver-
são através de isoQC humana (Tabela 3). Todos substratos analisados fo- ram convertidos por isoQC, indicando uma especificidade geral relativamen- te relaxada similar à QC humana (Schilling, S., et al., 2003 Biol Chem 384, 1583 - 1592). Como previamente observado para QC humana (Schilling, S., 30 et al., 2003 Biol Chem 384, 1583-1592), constantes de especificidade mais altas (kcat/KM) foram observadas para substratos carregando aminoácidos hidrofóbicos grandes adjacentes ao resíduo de glutaminil N-terminal, por e- xemplo Gln-AMC. Em contraste, os resíduos negativamente carregados em que mera posição levou a uma queda drástica na especificidade, como ob- servado para Gln-Glu, indicando um sítio ativo negativamente carregado de isoQC. Comparado à QC humana, ambas as iosQCs recombinantes exerce- 5 ram uma atividade enzimática inferior (Figura 21). A diferença foi até uma ordem de magnitude. De acordo com a especificidade de isoQC, é razoável assumir que a enzima seja responsável pela conversão de substratos dife- rentes in vivo, isto é, isoQC está envolvida na geração de muitos substratos fisiológicos diferentes.
Atividade de isoQC humana foi competitivamente inibida por de-
rivados de imidazol (tabela 6, figura 15). As constantes de inibição K1 para imidazol e benzimidazol foram bem parecidas ao valor que foi previamente obtido para QC humana. Porém, uma queda de 10 vezes em K1 foi observa- da para o inibidor de QC potente P150/03. Assim, o modo de ligação da par- 15 te quelante, isto é, o anel de imidazol, parece ser bem similar. Presumivel- mente, este é o resultado da complexação do íon de zinco do sítio ativo de QC e isoQC pelo nitrogênio básico de imidazol. As diferenças nos valores K1 para P150/03 demonstram claramente que os sítios ativos de ambas as en- zimas exibem diferenças sutis. Portanto, é possível gerar inibidores que e- 20 xerçam seletividade para uma isoforma enzímica. Inibidores seletivos são benéficos para o tratamento das doenças.
TABELA 3: Avaliação cinética dos substratos de peptídeo de QC humana e isoQC humana. IsoQC humana foi expressada em BL21 de E. coli (hi- soQCdt) ou P. pastoris (YSShisoQC). Os substratos estão apresentados no código de uma letra dos aminoácidos.____
Substrato Km (mM) Km (mM) kcat(S-1) kcat (S'1) kcat/Km kcat/Km hisoQCdt YSShi- hisoQCdt YSShi- (mM'1*s'1) (mM'1*s‘1) soQC soQC hisoQCdt YSShi- soQC Q-βΝΑ 0,03 + 0,035 + 3,37 + 8,16 + 93,26 + 228,70 + 0,002 0,0005 0,12 0,87 6,68 22,22 Substrato Km (mM) Km (mM) kcat(S-1) kcat (S ) kcat/Km kcat^Km 1) hisoQCdt YSShi- hisoQCdt YSShi- (mM'1*s'1) (mM'1*s' soQC soQC hisoQCdt YSShi- soQC QAMC 0,01 + 0,03 + 1,07 + 3,72 + 62,57 + 102,87 + 0,0009 0,0064 0,03 0,44 5,68 29,22 QQ 0,11 + 0,11 + 2,72 + 6,08 + 24,50 + 54,32 + 0,027 0,007 0,25 0,17 4,009 4,61 QE 0,7 + 0,13 0,61 + 2,64 + 5,33 + 3,85 + 8,75 + 0,064 0,21 0,43 0,56 0,87 QG 0,42 + 0,36 + 1,65 + 3,24 + 3,93 + 9,01 + 0,04 0,047 0,04 0,18 0,31 1,75 QGP 0,21 + 0,23 + 4,01 + 8,98 + 18,82 + 38,42 + 0,016 0,02 0,14 0,07 1,26 3,55 QYA 0,22 + 0,08 + 7,7 + 0,4 16,47 + 66,48 + 206,9 + 0,01 0,022 0,72 13,07 57,54 QFA 0,11 + 0,104 + 7,49 + 11,68 + 33,03 + 116,99 + 0,016 0,025 0,28 2,39 2,38 34,37 QEYF 0,03 + 0,04 + 3,34 + 5,64 + 109,57 + 122,56 + 0,004 0,004 0,15 0,39 21,03 5,6 QEDL 0,63 + 0,16 + 6,41 + 9,24 + 10,2 + 55,04 + 0,052 0,01 0,15 0,65 0,84 5,14 TABELA 4: Iniciadores utilizados
Iniciador Seqüência 5' -> 3' Aplicação lsoQch-1 GGTCTACACCATTTG- Triagem de linha¬ (SEQ ID NO: 53) GAGCGGCTGGC gem celular lsoQch-2 GGGTTGGAAGTACAT - Triagem de linha¬ (SEQ ID NO: 54) CACTT CCT GGGG gem celular lsoQchu-1 AC- Isolamento de Hi¬ (SEQ ID NO: 55) CATGCGTTCCGGGGGCCGC soQC GGG Iniciador Seqüência 5' -> 3' Aplicação lsoQchu-2 ACGCTAGAGCCCCAGG- Isolamento de Hi¬ (SEQ ID NO: 56) TATTCAGCCAG soQC IsoQC EGPF-1 Met AT ATATGAATT - Clonar isoQC hu¬ 1 CATGCGTTCCGGGGGCCGC mana (Met I) SEQ ID NO: 57) no vetor pEGFP-N3 IsoQC EGFP-2 Met AT ATAT GAATT CAT GGAGC- Clonar isoQC hu¬ Il CACTCTTGCCGCCG mana (Met II) (SEQ ID NO: 58) no vetor pEGFP-N3 IsoQC EGFP-3 AT ATATGT CG ACG AG CCC- Clonar isoQC hu¬ (SEQ ID NO: 59) CAG GT ATT CAG CCAG mana (Met I e Met II) no vetor pEGFP- N3 HisoQC pET41a-1 AT AT ACT AGT GAT GACGAC Clonar isoQC hu¬ (SEQ ID NO: 60) G ACAAGTT CT ACACCATTT G- mana no vetor GAGCG pET41a HisoQC pET41a-2 T AT AGAATT CCT AGT G ATG GT Clonar isoQC hu¬ (SEQ ID NO: 61) GATGGTGATGGAGCCC- mana no vetor CAGGTATTCAGC pET41a hisoQC HIS C-Term ATA TGA ATT CTT CTA CAC Clonar isoQC hu¬ pPI CZAA-1 CAT TTG GAG C mana no vetor (SEQ ID NO: 62) PPICZaA hisoQC HIS N-Term ATA TGA ATT CCA TCA CCA Clonar isoQC hu¬ pPICZAA-1 TCA CCA TCA CTT CTA CAC mana no vetor (SEQ ID NO: 63) CAT TTG GAG CGG C PPICZaA hisoQC HIS N-Term 5'- ATA TAT GCG GCC GCC Clonar isoQC hu¬ pPICZAA-2 TAG AGC CCC AGG TAT TCA mana no vetor (SEQ ID NO: 64) GC-3' PPICZaA isoQCm RT s CCA GGA TCC AGG CTA TTG Análise de PCR de (SEQ ID NO: 65) AG tempo real de i- soQC Iniciador Seqüência 5' -> 3' Aplicação hisoQC HIS C-Term ATA TAT GCG GCC GCC TAG Clonar isoQC hu¬ pPICZAA-2 TGA TGG TGA TGG TGA TGG mana no vetor (SEQ ID NO: 66) AGC CCC AGG TAT TCA GCC PPICZaA AG isoQCm RT as TTC CAC AGG GCC GGG Análise de PCR de (SEQ ID NO: 67) GGG C tempo real de i- soQC isoQCm Metl s ATG AGT CCC GGG AGC CGC Clonagem de (SEQ ID NO: 68) cDNA de isoQC murina isoQCm Metl as CTA GAG TCC CAG GTA CTC Clonagem de (SEQ ID NO: 69) cDNA de isoQC murina isoQCm kurz s AGT TCC TGC CCC TGC TGC Clonagem de (SEQ ID NO: 70) TG cDNA de isoQC murina mQC RT s ATC AAG AGG CAC CAA CCA Análise de PCR de (SEQ ID NO: 71) AC tempo real de mQC mQC RT as CTG GAT AAT ATT TCC ATA G Análise de PCR de (SEQ ID NO: 72) tempo real de mQC mQC RT N-terminal ACA GCT GGG AAT CTG AGT Análise de PCR de S C tempo real de mQC (SEQ ID NO: 73) mQC RT N-terminal GAG CAG AAT AGC TTC CGG Análise de PCR de as GCG tempo real de mQC (SEQ ID NO: 74) lso-l55Ns CTG CGG GTC CCA TTG AAC Mutagênese Iocodi- (SEQ ID NO: 75) GGA AGC CTC CCC GAA rigida I55N de hi¬ soQC Iniciador Seqüência 5' -> 3' Aplicação lso-l55Nas TTC GGG GAG GCT TCC GTT Mutagênese Iocodi- (SEQ ID NO: 76) CAA TGG GAC CCG CAG rigida I55N de hisoQC lso-C351As ACG GTA CAC AAC TTG GCC Mutagênese Iocodi- (SEQ ID NO: 77) CGC ATT CTC GCT GTG rigida C351A de hisoQC lso-C351Aas CAC AGC GAG AAT GCG GGC Mutagênese Iocodi- (SEQ ID NO: 78) CAA GTT GTG TAC CGT rigida C351A de hisoQC hQC-1 AT AT AT AAGCTT AT GG- Inserção de (SEQ ID NO: 82) CAGGCGGAAGACAC hQC nativa em pcDNA3.1 hQC-2 ATATGCGGCCGCTTACAA- Inserção de (SEQ ID NO: 83) AT GAAGAT ATT CC hQC nativa em pcDNA3.1 hisoQC pcDNA as ATATATGCGGCCGCCTA- Amplificação (SEQ ID NO: 84) GAGCCCCAGGTATTCAGC de hisoQC incluindo o códon de parada para inserção em pcDNA3.1 EGFP-1 AT AT CT CGAGT CCAT CGC- Amplificação de (SEQ ID NO: 85) CACCATGGT GAGC EGFP EGFP-2 AT AT CT CGAGTT ACTT GT ACA Amplificação de (SEQ ID NO: 86) GCTCGTCCAT EGFP hisoQC SS EGFP ATAT G CG G CCG C AT GTC- Amplificação da pcDNA as GACGCTCCAAATGGTGTA- seqüência N- (SEQ ID NO: 87) GAACGC terminal de HisoQC hQC C-FLAG pcDNA ATATGCGGCCGCT- Amplificação de as TACTTGTCATCGT- hQC C-FLAG (SEQ ID NO: 88) CATCCTTGTAATC CAAATGA- AGATATTCCAA Iniciador Seqüência 5' -> 3' Aplicação hisoQC C-FLAG ATATGCGGCCGCC- Amplificação de h- pcDNA as TACTTGTCATCGT- isoQC C-flag (SEQ ID NO: 89) CATCCTTGTA ATCGAGCCC- CAGGTATTCAGC Hs_QPCT_1_SG Ensaio de Iniciador QuantiTect qPCRhQC (200), Qiagen, Hilden Hs_QPCTL_1_SG Ensaio de Inieiador QuantiTeet qPCR h-isoQC (200), Qiagen, Hilden CCL2-F GCCTCCAGCATGAAAGTCTC qPCR CCL2 (SEQ ID NO: 90) CAGAT CT CCTT G G CCACAAT CCL2-R (SEQ ID NO: 91) CCL7-F AT GAAAGCCT CT GCAG CACT qPCR CCL7 (SEQ ID NO: 92) TGGCTACTGGTGGTCCTTCT CCL7-R (SEQ ID NO: 93) CCL8-F TCACCTGCTGCI I IAACGTG qPCR CCL8 (SEQ ID NO: 94) AT CCCT GACCCAT CT CT CCT CCL8-R (SEQ ID NO: 95) CCL13-F ATCTCCTTGCAG AGGCTG AA qPCRCCL13 (SEQ ID NO: 96) AGAAGAGGAGGCCAGAG- CCL13-R GAG (SEQ ID NO: 97) HIFIa-F CACAGAAATGGCCTTGTGAA qPCR HIFIa (SEQ ID NO: 98) CCAAGCAGGTCATAGGTGGT HIFIa-R (SEQ ID NO: 99) Iniciador Seqüência 5' -> 3' Aplicação AIM1-F T CCTTT CAT CCTG GAACCT G qPCR AIM1 (SEQ ID NO: 100) CGCCTCTTCTG I I I CACCTC AIM1-R (SEQ ID NO: 101) AIM2-F AAGCGCTGTTTGCCAGTTAT qPCR AIM2 (SEQ ID NO: 102) CACACGTGAGGCGCTATTTA AIM2-R (SEQ ID NO: 103) MAGEA1-F GT CAACAG AT CCT CCCCAG A qPCR MAGEA1 (SEQ ID NO: 104) CAGCAI I I CTGCCTTTGTGA MAGEA1-R (SEQ ID NO: 105) MAGEA2-F AGGTGGAGAGCCTGAGGAAT qPCR MAGEA2 (SEQ ID NO: 106) CTCGGGTCCTACTTGTCAGC MAGEA2-R (SEQ ID NO: 107) MAGEA10-F AAGCGAGGTT CT CGTT CT GA qPCR MAGEA10 (SEQ ID NO: 108) T GACCT CTTGCT CT CCCT GT MAGEA10-R (SEQ ID NO: 109) MAGEB2-F CTT CAAG CT CTCCTG CTG CT qPCR MAGEB2 (SEQ ID NO: 110) CGACCCTGACTTCCTGGTTA MAGEB2-R (SEQ ID NO: 111) MART1-F GCTCATCGGCTGTTGGTATT qPCR MART1 (SEQ ID NO: 112) ATAAGCAGGTGGAGCATTGG MART1-R (SEQ ID NO: 113) Iniciador Seqüência 5' -> 3' Aplicação MCL1-F AT G CTT CG G AAACT G G AC AT qPCR MCL1 (SEQ ID NO: 114) ATGGTT CG ATG CAGCTTT CT MCL1-R (SEQ ID NO: 115) TYR-F TACGGCGTAATCCTGGAAAC qPCR TYR (SEQ ID NO: 116) ATT GT G CAT G CTG CTTT GAG TYR-R (SEQ ID NO: 117) TYRP1-F CCGAAACACAGTGGAAGGTT qPCR TYRP1 (SEQ ID NO: 118) TCTGTGAAGGTGTGCAGGAG TYRP1-R (SEQ ID NO: 119) TYRP2-F GGTTCCI I I CTTCCCTCCAG qPCR TYRP2 (SEQ ID NO: 120) AACCAAAGCCACCAGT GTT C TYRP2-R (SEQ ID NO: 121) TABELA 5: Purificação da proteína de fusão GST-isoQC seguindo expres- são em E. coli. A proteína de fusão purificada foi usada para determinação da atividade de QC.
Etapa de puri¬ 1 2 3 4 ficação Método Ni2+-IMAC MARCADOR GF IEX (EBA) GSTAC (Dessalgação) (UNOS) Tipo de colu¬ Fluxo rápido de Fluxo de Gluta- Sephadex Matriz de na (Amer- sefarose quelan- tion Sefarose G-25 Fina "leito contí¬ sham te 4Rápido nuo" Bio- Biosciences Rad AB1 Suécia) Tamanho da d = 2,5 cm d = 1,6 cm d = 2,6 cm d = 1,2 cm coluna I = 42 cm I = 10 cm I = 10 cm I = 5,3 cm CV = 206 cm3 CV = 20 cm3 CV = 53 cm3 CV = 6 cm3 Etapa de puri¬ 1 2 3 4 ficação Equilibração PBS PBS 25 mM Mes 25 mM Mes Tampão 7,3 7,3 6,0 6,0 PH 10CV 10CV 10CV 10CV Volume Intermediário PBS PBS 25 mM Mes (Lavagem) 0,5 mM Histidina Tampão PH 7,3 7,3 6,0 Volume 10 CV 10 CV 10 CV Elução PBS 50 mM Tris 25 m M Mes 25 mM Mes Tampão 100 mM Histidina 10 mM Glutation 6,0 Elução de PH 7,3 (reduzido) 1 CV gradiente Volume 1,5 CV 8,0 NaCI (fluxo reverso) 6,0 CV TABELA 6: Valores Ki para inibição competitiva de QC humana e isoQC hu- mana através de derivados de imidazol. IsoQC humana foi expressada em BL21 de E. coli (hisoQCdt) ou P. pastoris (YSShisoQC)._
Inibidor Ki (μΜ) hisoQCdt Ki (μΜ) YSShisoQC Ki (μΜ) hQC Imidazol 220 ± 1 235 ± 13 103 ±2 Benzimidazol 200 ±8 250 ±5 138 ±4 1-BenziIimidazoI 7,3 ±0,5 6,2 ±0,2 7,1 ±0,1 1-MetiIimidazoI 80 ±5 82 ±3 39,7 ±0,2 PBD150 1 -(3,4- 0,48 ± 0,03 0,519 ±0,001 0,0584 ± Dimetóxi-fenil)-3-(3- 0,0002 imidazol-1-il- propil)-tiouréia EXEMPLO 6: EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE ISOQC HUMANA EM P. pastoris
CEPAS HOSPEDEIRAS E MEIOS 5 Cepa de Escherichia coli DH5a foi usada para propagação dos
plasmídeos e cepa de P. pastoris X-33 foi usada para a expressão de isoQC humana em levedura. Cepas de E coli e P. pastoris foram cultivadas, transfor- madas e analisadas de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen (DH5a), invitrogen (X-33)). Os meios requeridos para E. coli, isto é, meio de 10 Luria-Bertani (LB)1 foram preparados de acordo com as recomendações do fa- bricante. Os meios requeridos para Pichia pastoris, isto é, BMMY, BMGY, YPD, YPDS e a concentração dos antibióticos, isto é, Zeocina, foram preparados co- mo descrito no manual Pichia (Invitrogen, catálogo. No. K1740-01). O manual também inclui todas as descrições relevantes para a manipulação de levedura. 15 CLONAGEM MOLECULAR DOS VETORES DE PLASMÍDEO QUE CODI- FICAM QC HUMANA
Todos os procedimentos de clonagem foram feitos aplicando as técnicas de biologia molecular padrões. Para expressão em Pichia pastoris X-33, o pPiCZaA (Invitrogen) foi usado. O cDNA do isoQC humana madura 20 começando com o códon 30 (contando da metionina II) foi fundido na estru- tura com o α-fator codificado com plasmídeo, direcionando a proteína na via secretória. Após amplificação utilizando os iniciadores HIS C-term pPICZAA-
1 de hisoQC (SEQ ID NO: 62) ou HIS N-term pPICZAA-1 de hisoQC (SEQ ID NO: 63) como iniciadores sentidos e HIS N-term pPICZAA-2 de hisoQC 25 (SEQ ID NO: 64) e HIS C-term pPICZAA-2 de hisoQC (SEQ ID NO: 66) (Ta- bela 4) como Iniciadores antissentidos, o fragmento foi inserido no vetor de expressão empregando os sítios de restrição de Not\ e EcoR\. Dependendo do constructo, as mutações foram introduzidas nos códons 55 (IIe) e 351 (Cys). A mutagênese foi executada de acordo com as técnicas de PCR pa- 30 drões seguida por digestão do DNA de origem usando DpnI (kit de mutagê- nese Iocodirigida de alteração Il da Quik, Stratagene1 Catálogo No. 200524). Os constructos gerados são ilustradas esquematicamente na Figura 17. TRANSFORMAÇÃO DE P. pastoris E EXPRESSÃO DE MINIESCALA
1-2 pg de DNA de plasmídeo foram aplicados para transforma- ção de células competentes de P. pastoris por eletroporação de acordo com as instruções do fabricante (BioRad). Seleção foi feita em placas contendo 5 100 Mg/ml de Zeocina. Para testar os clones de levedura recombinante na expressão de isQC, os recombinantes foram crescidos por 24 h em 10 ml de tubos cônicos contendo 2 ml de BMGY. Depois, a levedura foi centrifugada e ressuspensa em 2 ml de BMMY contendo 0,5 % de metanol. Esta concen- tração foi mantida por adição de metanol a cada 24 h durante cerca de 72 h. 10 Subsequentemente, a atividade de QC no sobrenadante foi determinada. Clones que exibiram a atividade mais alta foram escolhidos para outros ex- perimentos e fermentação. Dependendo da constructo expressa, a atividade de isoQC no meio diferiu-se (Figura 18).
EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE hisoQC EM P. pastoris Para expressão escalar grande de isoQC em Pichia pastoris, foi
mantida a condição como descrita na expressão de miniescala, porém, o volume total foi 8L. A expressão foi executada em frascos de agitação. Após expressão, as células foram separadas do meio através de centrifugação (1500xg, 20 min), e a pelota descartada. O valor pH do sobrenadante foi a- 20 justado para neutralidade, centrifugado novamente e aplicado à primeira e- tapa de purificação. A proteína de isoQC que utilizou um protocolo de 3 eta- pas foi purificada (Tabela 7). A purificação é ilustrada por análise de SDS- PAGE na Figura 19.
TABELA 7: Purificação de hisoQC (YSShisoQCN55IC351A C-His) seguindo expressão em P. pastoris. A proteína de fusão purificada foi usada para de- terminação da atividade de QC e dependência de pH.__
Etapa de purificação 1 2 3 Método Ni2+-IMAC HIC GF (Dessalgação) Tipo de coluna (Amer- Fluxo rápido de Fluxo de Butil Sefadex G-25 sham Biosciences AB, Sefarose quelan- Sefarose Fina Suécia) te 4Rápido Etapa de purificação 1 2 3 Tamanho da coluna d = 2,5 cm d = 1,6 cm d = 2,6 cm I = 42 cm I = 15,5 cm I = 10 cm CV = 206 cm3 CV = 23 cm3 CV = 53 cm3 Equilibração Tampão 50 mM NaH2PO4 30 mM 50 mM Bis-Tris NaH2PO4 100 mM NaCI PH 7,0 1M (NH4)2SO4 6,8 Volume 10 CV 7,0 10 CV 10 CV Intermediário (Lava¬ gem) 50 mM NaH2PO4 30 mM Tampão 0,5 mM Histidina NaH2PO4 7,0 1M (NH4)2SO4 - PH 10 CV 7,0 Volume 6 CV Elução Tampão 50 mM NaH2PO4 30 mM 50 mM Bis-Tris 100 mM Histidina NaH2PO4 100 mM NaCI PH 7,0 6,8 Volume 1,5 CV 7,0 1CV 5 CV RESULTADOS
IsoQC humana foi expressada na levedura metilotrófica de P. pastoris de forma bem sucedida. Vários constructos diferentes foram gera- dos para selecionar as melhores condições de expressão em levedura (Figu- 5 ra 17). Como ilustrado na figura 18, a atividade de QC que é expressada e presente no meio das células de expressão, varia, dependendo do construc- to expresso. Introdução de um sítio de glicosilação resultou em secreção apropriada, como pode ser observado das constructos YSShi- soQCN55IC351A C-His e YSShisoQCN55l C-His. Devido à atividade mais 10 alta no meio, constructo YSShisoQCN55IC351A C-His foi expressado em grande escala e purificada. A purificação foi realizada como descrita na Ta- bela 7, o rendimento da purificação foi 59 %. A proteína homogênea eviden- te foi glicosilada, como comprovado por um deslocamento na migração para diminuir a massa molecular (Figura 19). Glicosilação não influenciou a ativi- dade catalítica da enzima.
EXEMPLO 7: A DEPENDÊNCIA DE PH DE hisoQC
O ensaio fluorométrico usando H-Gln-βΝΑ (descrito no exemplo 5) foi aplicado para investigar a dependência de pH da especificidade catalí- tica. As reações foram realizadas em concentrações de substrato de 7 μΜ, 10 isto é, em [S]«KM. Portanto, as constantes de especificidade observadas poderiam ser deduzidas diretamente da velocidade inicial das curvas de pro- gresso da conversão do substrato. Nestes estudos, o tampão de reação consistia em 0,075 M de ácido acético, 0,075 M de Mes e 0,15 M de Tris, ajustado ao pH desejado usando HCI ou NaOH. O tampão assegura uma 15 resistência iônica constante em uma faixa de pH muito vasta. Avaliação dos dados cinéticos da enzima adquirida foi executada usando a equação a se- guir:
kCat/KM(pH) = kcat/KM( I imite)* 1/(1 + [H+]/Khs + KE1/[H+] + KE1/[H+]*KE2/[H+]) em que kcat/Kivi(pH) denota o parâmetro cinético pH-dependente (observa- 20 do). kCat/Kivi(limite) denota o valor pH-independente ("limitativo"). KHs, KEi e KE2 denotam as constantes de dissociação de um grupo de dissociação na faixa acídica de pH, e dois grupos de dissociação da enzima, respectivamen- te. Avaliação de todos os dados cinéticos foi executada usando software GraFit (versão 5.0.4. para janelas, ERITHACUS SOFTWARE Ltd., Horley, 25 UK).
RESULTADOS
A hisoQC exibe um ótimo pH da especificidade em pH 7-8. Des- se modo, a ótima de pH da catálise é bem parecida à da QC humana. Ajus- tando dos dados de acordo com um modelo que é com base em três grupos 30 de dissociação resultou em uma interpretação boa da dependência de pH de hisoQC e hQC (Figura 22). Desse modo, a catálise de ambas as reações enzimáticas é influenciada pelos grupos de dissociação similares, sugerindo um mecanismo catalítico similar em geral.
Os valores pKa determinados são exibidos na Tabela 8. É óbvio, que apenas um pKa difere entre hisoQC e hQC significativamente. Em hQC, o pKa corresponde ao pKa da constante de dissociação do substrato. Possi- 5 velmente, a diferença sutil entre hQC e hisoQC é causada por alterações estruturais que ocorrem na catálise de isoQC (ajuste induzido), influenciando a dependência de pH.
EXEMPLO 8: INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE DE GLUTAMIL CICLASE
Foi descrito para QC humana que a enzima catalisa a ciclização de ácido glutâmico N-terminal em ácido piroglutâmico. Portanto, QC está envolvido na geração de peptídeos amilóides pGlu-modificados.
Para investigar a ciclização de ácido glutâmico, QC humana e isoQC humana foram purificadas e a formação de β(3-11) amilóide pGlu- modificado [pGlu-AP(3-11)] de Αβ(3-11) foi monitorada. Reações consistiram 15 em 20 μΙ de substrato (Αβ(3-11), 2,5 mM de solução de matéria-prima em 50 mM de tampão de Mes, pH 6,5) e 80 μΙ de enzima (0,62 mg/ml de solução de matéria-prima de hQC; 0,61 mg/ml de solução de matéria-prima de hi- soQC em 50 mM de Mes pH 6,5). Amostras (15 μΙ) foram removidas após Oh, 6h, 24h, 48h e 72h e fervidas por 5 min para terminar a reação. A análise 20 de conversão do substrato foi monitorada através de espectrometria de massa Maldi-Tof. Substrato e produto diferem em sua massa molecular por 18 Da, a massa de água sendo liberada durante a ciclização.
Como mostrado na figura 23, QC humana e isoQC humana (YSShisoQCI55NC351 A C-His) catalisam a conversão de Αβ(3-11) em pGlu- 25 Αβ(3-11). Porém, com base nas concentrações protéicas iguais em ambas as amostras, pode-se concluir que a conversão de ácido glutâmico N- terminal através de hisoQC é muito mais lenta comparado com hQC. Desse modo, as constantes de especificidade inferiores para conversão dos subs- tratos de glutaminil são também observadas com substratos de glutamil. Ne- 30 nhuma ciclização foi observada sob estas condições com a enzima inativada (Schilling, S. et al., 2004 FEBS Lett. 563, 191-196).
EXEMPLO 9: ESPECIFICIDADE DE TECIDO DE isoQC MURINA A distribuição de tecido de QC murina e isoQC murina foi inves- tigada usando técnicas de PCR quantitativa de tempo real. Antes da análise de cDNA de vários órgãos e tecidos diferentes, a estrutura de leitura aberta de isoQC murina foi isolada aplicando os iniciadores específicos (isoQCm 5 Metl s (SEQ ID NO: 68), isoQCm Metl as (SEQ ID NO: 69) (tabela 4), que foram deduzidos da região de codificação cromossômica de isoQC murina.
A estrutura de leitura aberta foi clonada em vetor pPCR-Schpt CAM SK (+) (kit de clonagem PCR-script CAM1 Stratagene) e usada como um controle positivo nas determinações de PCR de tempo real e para prepa- 10 ração de uma curva padrão sob condições de ensaio. A caracterização da especificidade de tecido da expressão de misoQC foi alcançada aplicando cDNA de camundongos de 3-6 meses de idade. RNA total foi isolado de 30 mg de tecido, usando o kit de isolamento de RNA Il (Macherey e Nagel). A concentração e pureza do RNA foram avaliadas através de eletroforese em 15 gel (gel de agarose) e espectrofotometria. Para a síntese de cDNA, 1 pg de RNA foi usado. A reação foi feita aplicando a Transcriptase reversa SuperS- cript Il RT (Invitrogen) de acordo com as recomendações do fornecedor, o cDNA foi armazenado a -80° C.
A análise quantitativa da concentração de transcrição em tecidos 20 diferentes foi analisada usando "Light Cycler" (Corbett Research), aplicando "QuantiTect SYBR Green PCR" (Qiagen). O DNA padrão (isoQC de camun- dongo de cDNA clonado) foi usado para quantificação. O número de cópias foi calculado de acordo com a equação a seguir: (X 9/μι DNA) / (comprimento do Plasmídeo em bp*660)*6,022*1023 = Y Moléculas/Ml. o padrão de DNA con- 25 tinha 4 concentrações na faixa de IO7-IO1 lvloleculasZljIi e uma concentração Iimitativa (10°). O protocolo de reação é exibido na Tabela 8. Os resultados são exibidos na Figura 24.
Para amplificação de QC murina, o mesmo protocolo foi usado, aplicando os iniciadores mQC RT N-terminal s (SEQ ID NO: 73) e mQC RT N-terminal as (SEQ ID NO: 74).
TABELA 8: Protocolo de reação da PCR quantitativa de tempo real usando o Roto-Gene RG 3000 (Corbett Research) Ciclos de PCR Etapa Tem °C t em seg. 0 Desnaturação 95 900 1 Desnaturação 95 15 2 Enovelamento de Iniciador 55 20 3 Alongamento 72 20 Ciclos 45 RESULTADOS
Como mostrado na Figura 24, QC murina e isoQC murina são expressadas em todos os órgãos testados. Em contraste com QC murina, as variâncias na expressão de isoQC murina entre órgãos diferentes são meno- 5 res, indicando uma severidade inferior da regulação de transcrição. Os da- dos para expressão de mQC correspondem às análises anteriores de QC bovina, que foi analisada usando Nothern-Blot (Pohl, T. et al. 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88, 10059-10063). Expressão mais alta de QC foi observada no Tálamo, Hipocampo e Córtex. Desse modo, expressão de QC é detecta- 10 da primariamente em tecido neuronal. Expressão pequena de QC é detecta- da em órgãos periféricos como baço e rim. Também misoQC é expressada em tecido neuronal, mas em níveis inferiores comparados com mQC. Em contraste, os níveis de expressão nos órgãos periféricos são bem parecidos entre isoQC e QC. Concluindo, com base nos resultados da concentração de 15 transcrição, a atividade combinada (isoQC e QC) deveria ser mais alta em cérebro. Desse modo, os níveis de proteína de QC mais altos estão presen- tes nos órgãos que são afligidos por amiloidoses como mal de Alzheimer, demência britânica familial e demência dinamarquesa familial.
EXEMPLO 10: INIBIÇÃO DE isoOQC HUMANA ATRAVÉS DE QUELANTES HETEROCÍCLICOS RESULTADOS
A inibição tempo-dependente de QCs de fontes diferentes usan- do quelantes heterocíclicos, tais como 1,10-fenantrolina e ácido dipicolínico foi previamente investigada (6, 9). Em analogia, h-isoQC é também de modo tempo-dependente inativado pelos quelantes heterocíclicos 1,10-fenantrolina (Figura 25) e ácido dipicolínico (não mostrado), claramente apontando para uma atividade metal-dependente. Além disso, EDTA também inibiu h-isoQC (Figura 25). Esta está em contraste nítido com as QCs, uma vez que ne- nhum QC humana, QC porcina nem QC murina mostrou inibição discernível 5 por EDTA. Porém, inibição de hisoQC por EDTA até mais forte sugere uma catálise metal-dependente.
EXEMPLO 11: LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR DE hisoQC INVESTIGADA USANDO FRACIONAMENTO DE CÉLULA FRACIONAMENTO CELULAR O dia após a transfecção, células HEK293 de expressão foram
lavadas com D-PBS e colhidas através de centrifugação a 500 x g por 5 min a 4° C. Subsequentemente, D-PBS foi descartado e as células foram res- suspensas em 1 ml de tampão de rompimento (50 mM Tris, 50 mM KCI1 5 mM EDTA, 2 mM MgCI2, pH 7,6 ajustado com HCI) e fragmentadas através 15 de 30 esmagamentos em um homogeneizador de célula Potter. A suspensão foi centrifugada a 700 x g por 10 min a 4° C. A pelota obtida foi ressuspensa em 300 μΙ de tampão de rompimento e designada como fração de restos (D). O sobrenadante resultante foi também centrifugado a 20.000 x g por 30 min 4° C. A pelota ilustrou a fração de membrana pesada (HM) e foi ressuspensa 20 em 200 μΙ de tampão de rompimento. O sobrenadante resultante foi centrifu- gado a 100.000 x g por 1 h a 4o C usando uma ultracentrífuga (Beckmann). A pelota obtida foi ressuspensa em 200 μΙ tampão de rompimento e foi de- nominada como fração de membrana leve (LM). O sobrenadante foi desig- nado como fração solúvel (S). Restos, frações de membrana pesada e de 25 membrana leve foram sonicados durante 10 seg e o conteúdo de proteína de todas as frações foi determinado usando o método de Bradford. Subsequen- temente, as frações foram analisadas para atividade de QC e tingidas para proteínas marcadoras usando Western blot.
RESULTADOS
Para confirmação adicional, análise bioquímica da distribuição
da atividade de QC, derivada da expressão de hisoQC e hQC foi executada. hisoQC nativa começando com metionina I e Il e hQC foi expressada em células HEK293, respectivamente. Após fracionamento celular, a atividade de QC em cada fração foi determinada usando o ensaio de fluorescência aplicando H-Gln-βΝΑ como substrato. Em células, transfeccionadas com o vetor vazio (pcDNA), a atividade de QC específica é dificilmente mensurável.
5 Ao expressar hisoQC nativa (MetI) e hisoQC (Metll), a atividade de QC foi facilmente detectável com a atividade específica mais alta na fração de membrana pesada (Meti: 40 ± 2 pmol/min/g; Metll: 36 ± 1,5 pmol/min/g) e o meio (Meti: 30 ± 2 pmol/min/g; Metll: 54 ± 3 pmol/min/g). Em contraste, hQC mostra a atividade de QC específica mais alta dentro do meio (1339 ± 76 10 pmol/min/g) seguido pela fração de membrana pesada (251 ± 21 pmol/min/g) (Figura 26A).
Além disso, as atividades absolutas foram calculadas, ilustrando que a expressão de hisoQC (MetI) e hisoQC (Metll) conduziu principalmente a um aumento na atividade de QC intracelular, a saber, dentro dos restos 15 (Meti: 1032 ± 9 nM/min; Metll: 1110 ± 10 nM/min) e fração de membrana pesada (Meti: 374 ± 20 nM/min; Metll: 281 ± 12 nM/min). Apenas pequena atividade de QC foi encontrada dentro do meio (Meti: 27 ± 2 nM/min; Metll: 53 ± 3 nM/min). Em contraste, a atividade de QC deduzida por expressão de hQC mostra atividade alta dentro do meio (1138 ± 65 nM/min) e dentro dos 20 compartimentos intracelulares (restos: 1089 ±14 nM/min; fração de mem- brana pesada: 583 ± 38 nM/min) suportando uma localização de Golgi de hisoQC como mostrado por análise histoquímica (Figura 26B).
Os dados obtidos pela expressão das enzimas nativas foram também suportados pela expressão de hisoQC (Meti e Metll) e hQC que 25 possui um Flag-marcador C-terminal (Figura 26C). Análise de Western blot das proteínas Flag-marcadas resultantes em comparação com as proteínas marcadoras do complexo de Golgi e mitocôndrias revelou uma localização principalmente intracelular de hisoQC(Metl) e hisoQC (Metll) dentro dos res- tos e da fração de membrana pesada, enquanto que hQC é enriquecida den- 30 tro do meio mas também encontrada dentro dos restos e da fração de mem- brana pesada. Visualização das proteínas marcadoras do complexo de Golgi (ST1GAL3) e mitocôndrias revelou a presença destes compartimentos den- tro dos restos e da fração de membrana pesada. Além disso a proteína mito- condrial de 65 kDa foi também encontrada em uma porção menor dentro da fração solúvel.
EXEMPLO 12 - ANÁLISE SOBRE O SINAL DE RETENÇÃO DE GOLGI DE 5 hisoQC
Para esclarecer, se a hélice da transmembrana N-terminal prog- nosticada for responsável pela retenção de hisoQC dentro do complexo de Golgi, os peptídeos sinais começando em Metl e Metll, incluindo a hélice de transmembrana, foram clonado na estrutura com EGFP. Os vetores resultan- tes de (MetI) SS EGFP de hisoQC e (Metll) SS EGFP de hisoQC foram ex- pressados em células LN405 e examinados em analogia às proteínas de fusão de EGFP de hisoQC de comprimento total usando microscopia de varredura a laser confocal. A expressão de (MetI) SS EGFP de hisoQC conduziu à mesma localização do complexa de Golgi observada para a proteína de fusão de EGFP de hisoQC de comprimento total (Meti). Novamente, um transporte de (MetI) SS EGFP de hisoQC para as mitocôndrias não foi observado (Figura 27A). Além disso, a expressão do peptídeo truncado N-terminal de (Metll) SS EGFP de hisoQC também conduziu a um enriquecimento da proteína dentro do complexo de Golgi. Em analogia a (MetI) SS EGFP de hisoQC, nenhuma fluorescência de EGFP mitocondrial pôde ser registrada (Figura 27B). Por con- seguinte, a seqüência N-terminal de hisoQC leva à translocação cotranslacio- nal da proteína para a membrana de ER e para a retenção dentro do complexo de Golgi. Além disso, devido à expressão de (Metll) SS EGFP de hisoQC, o sinal de retenção de Golgi foi mapeado totalmente para residir entre a metioni- na 19 e a serina 53 (contagem dos aminoácidos começando em Meti).
Análise de topologia adicional revelou a possibilidade para uma homologia funcional do término N de hisoQC para glicosiltransferases. Gli- cosiltransferases são proteínas de transmembrana do tipo II, possuindo uma seqüência citoplasmática curta, seguido pela hélice de transmembrana e um 30 domínio catalítico Iuminal grande. Claramente, esta é essencialmente a mesma estrutura de domínio como encontrada para misoQC e hisoQC (Figu- ra 28). Para várias glicosiltransferases, o sinal de retenção de Golgi foi iden- tificado para residir dentro do domínio de transmembrana. Além disso, para algumas destas enzimas, mutilação da seqüência citoplasmática foi obser- vada não ter nenhuma influência na atividade ou na localização da proteína. Em resumo, evidência foi fornecida que hisoQC é uma proteína de trans- 5 membrana do tipo Il que mostra uma retenção dentro do complexo de Golgi similar às glicosiltransferases.
EXEMPLO 12 - DETECÇÃO DE mRNA DE QPCTL EM LINHAGENS CELU- LARES E TECIDOS DE CARCINOMA HUMANO DIFERENTES ANÁLISE DE gPCR
Análise de expressão de QPCTL humana em linhagens celula-
res de carcinoma humanas foi executada usando a técnica de PCR quantita- tiva de tempo real (qPCR), essencialmente como descrito no exemplo 9. Pa- ra determinar mRNA de QPCTL, os iniciadores do ensaio de iniciadores QuantiTect® foram aplicados cobrindo uma região de exon/exon para exclu-
são da coamplificação de DNA genômico. qPCR foi executada seguindo as recomendações dos fabricantes. A mistura de reação é descrita na Tabela 9 e o programa de PCR é ilustrado na Tabela 8.
TABELA 9: COMPOSIÇÃO DA MISTURA DE qPCR
Componente Volume em μΙ 2x Mistura de QuantiTect SYBR Green PCR Master (2,5 mM 7,5 MgCI2) 10x Ensaio de IniciadorQuantiTect 1,5 cDNA (<100 ng/Reação) 1 Aqua bidest. 5 A análise quantitativa da concentração de transcrição em tecidos diferentes foi analisada usando o "Light Cycler" (Corbett Research), aplicando
o "QuantiTect SYBR Green PCR" (Qiagen). O DNA padrão (isoQC humana de cDNA clonado) foi usado para quantificação. O número de cópias foi calculado de acordo com a equação a seguir: (X 9I^ DNA) / (Comprimento de plasmídeo em bp*660)*6,022*1023 = Y Moleculas/Ml. o padrão de DNA continha 4 concentra- ções na faixa de IO7-IO1 Moleculas/M| e uma concentração Iimitativa (10°).
Os resultados de qPCR foram avaliados usando o software ope- racional rotor-gene (Corbett Research).
RESULTADOS
EXPRESSÃO DE QPCTL EM LINHAGENS CELULARES DE CARCINOMA DIFERENTES
Entre as linhagens celulares de câncer testadas, células de me-
lanoma humano mostram a expressão mais alta de transcrições de QPCTL (aprox. 7000 cópias / 50 ng de RNA total), enquanto que as linhagens celula- res de sarcoma de tecido macio humano mostram a expressão mais baixa de QPCTL (365 cópias / 50 ng de RNA total). Carcinoma do pâncreas mos- 10 tra 2100 cópias, carcinoma da tiróide 3500 cópias e carcinoma gástrico pos- sui 4100 cópias na média (Figura 29).
EXPRESSÃO DE QPCTL EM LINHAGENS CELULARES DE MELANOMA DIFERENTES
Foi recentemente mostrado que as células de melanoma possu- 15 em expressão de QPCT alta comparável (Gillis, J. S., J. Transi. Med. 4 (2006), 4:27). Portanto, expressão de QPCTL em linhagens celulares de me- lanoma diferentes foi analisada. Como descrita na Figura 30, expressão de QPCTL foi detectada em todas as linhagens celulares de melanoma testa- das. A variação entre as linhagens celulares variou de 2025 cópias / 50 ng 20 de RNA total na linhagem Mel_ZL_11 a 18043 cópias / 50 ng de RNA total na linhagem Mel_ZL 12.
TABELA 10: Correlação de QPCT e QPCTL para antígenos de associados a tumores (taa) e correlação de taa entre si__
correlação significância correlação significância QPCT - MAGEB2 0,0436 AIM1 - MCL1 0,0163 QPCT - MART1 0,0020 MAGEA1 - MAGEA2 0,00002 QPCT - TYR 0,0023 MAGEA1 -MAGEB2 0,0058 QPCT - MAGEA1 0,0591 TYRP2 - MART1 0,0042 QPCTL - MART1 0,0008 TYR - MART1 0,0335 TYR -TYRP2 0,0408 AIM1 - AIM2 0,0082 TYR - MCL-1 0,0151 Além disso, expressão de QPCT e QPCTL foi correlatada com a expressão de antígenos associados ao tumor (taa). Os antígenos associa- dos ao tumor melanoma-especificos foram selecionados por banco de dados e os resultados publicados. Entre outros, AIM1 e AIM2 (ausentes em mela- noma), MAGEA1, -A2, -A10 e MAGEB2 (família de antígeno de melanoma A 5 e B), MART1 (antígeno de melanoma reconhecido por células T), TYR (tiro- sinase), TYRP1
e TYRP2 (proteína relacionada à tirosinase) e MCL-1 (leucemia de célula mielóide) são antígenos associados a tumores em melanoma. Os dados fo- ram comparados usando software estatístico SPSS. Correlação entre QPCT 10 e MAGEB2 foi significativa (p = 0,0436). Além disso, correlação entre QPCT e MART1 (p = 0,002), QPCTL e MART1 (p = 0,008) e QPCT e TYR (p = 0,0023) foi também estatisticamente altamente significativa. As correlações mostram uma dependência direta que implica: quanto mais alta a expressão de QPCT/QPCTL, mais alta a expressão de antígenos associados a tumo- 15 res. A única exceção é a correlação entre TYR e MCL1 que mostra uma de- pendência indireta.
EXPRESSÃO DE QPCT E QPCTL EM TECIDOS DE TUMOR DIFERENTES A expressão de QPCT e QPCTL foi avaliada em tecidos de tu- mor de sarcoma de tecido macio, carcinoma gástrico e carcinoma da tiróide. Expressão mais alta de QPCT foi observada em carcinoma da tiróide segui- do por carcinoma gástrico e carcinoma de tecido macio (Tabela 11). A mes- ma ordem foi observada para expressão de QPCTL, porém, o número de cópia de transcrições de QPCTL sempre foi inferior, que observado para transcrições de QPCT quando revelado pelo t-teste de Student (pcarcinoma de tecidos macios = 0,001; Pcarcinoma gástrico = 4,8E-7; Pcarcinoma da tiróide = 0,04) (Tabela 11; Figura 31).
TABELA 11: Comparação de expressão de QPCT e de QPCTL em tecidos de tumor diferentes _
sarcoma de tecido macio carcinoma gástrico carcinoma da tiróide (119 amostras) (47 amostras) (29 amostras) QPCT 1293 2985 8303 QPCTL 170 469 2540 Outras investigações também no nível de expressão de QPCT e QPCTL revelaram uma correlação bilateral significativa por Pearson em sar- coma de tecido macio (p = 2E-31) e carcinoma gástrico (p = 0,015). Nenhu- ma correlação foi observada para nível de expressão de QPCT e QPCTL em 5 carcinoma da tiróide (p = 0,46).
EXPRESSÃO DE QPCTL DEPENDENTE DO ESTÁGIO DE DIFERENCIA- ÇÃO EM CARCINOMA GÁSTRICO
Para carcinomas gástricos, expressão de QPCTL foi investigada em amostras que representam estágios diferentes de diferenciação de tu- 10 mor. Como controle serviu tecido normal circunvizinho ao tumor. A compara- ção do tecido normal com de tumor revelou uma expressão de QPCTL signi- ficativamente mais alta (p = 0,04) em tecidos de tumor. Carcinomas gástri- cos indiferenciados mostraram expressão de QPCTL inferior que o tecido normal. Gástricos diferenciados de modo ruim e bom a moderado não mos- 15 tra nenhuma diferença na média comparados ao tecido normal (Figura 32). EXPRESSÃO DE QPCT E QPCTL EM ESTÁGIOS DIFERENTES DE CAR- CINOMA DA TIRÓIDE
Estágios diferentes de carcinoma da tiróide foram investigados com relação à expressão de QPCT e QPCTL. Os estágios foram classifica- 20 dos de acordo com a nomenclatura da World Health Organization (WHO) como carcinoma folicular da tiróide (FTC), carcinoma papilar da tiróide (PTC) e carcinoma da tiróide indiferenciado (UTC). Amostras de pacientes que possuindo bócio serviram como controle.
O nível de mRNA de QPCT (média) em carcinomas da tiróide diferenciados 25 FTC (6700 cópias / 50 ng de RNA total) e PTC (16000 cópias / 50 ng de RNA total) foi mais alto que em tumor de não-tecido (bócio: 2100 cópias / 50 ng de RNA total). UTC possui 5400 cópias / 50 ng de RNA total e é 2,5 ve- zes mais alto que observado em bócio. O número de copias de mRNA de QPCT é em todos os tumores da tiróide significativamente mais alto que no 30 bócio (p = 0,04, o t-teste de Student) (Figura 33).
O nível de mRNA de QPCTL em carcinoma da tiróide é homogêneo. As a- mostras de FTC (2600 cópias / 50 ng de RNA total) e UTC (2500 cópias / 50 ng de RNA total) são similares às do bócio (2500 cópias / 50 ng de RNA to- tal). A expressão de QPCTL em PTC é diminuída ligeiramente para 1900 cópias / 50 ng de RNA total (Figura 34). Sob conclusão, QPCT e QPCTL são igualmente expressados em bócio. Porém, em tecidos de tumor a expressão 5 de QPCT aumenta, enquanto que a expressão de QPCTL permanece está- vel.
EXEMPLO 13
INVESTIGAÇÕES NA EXPRESSÃO DE QPCT E QPCTL EM LINHAGENS CELULARES HUMANAS APÓS INCUBAÇÃO COM ESTÍMULOS DIFE- RENTES
LINHAGENS CELULARES E MEIOS
Os experimentos de estimulação foram executados usando a linhagem celular de rim embrionário humano HEK293, linhagem celular de leucemia monocítica aguda humana THP-1 e a linhagem celular de carcino- 15 ma da tiróide folicular FTC-133. Células foram cultivadas em meios de cultu- ra apropriados (DMEM, 10 % FBS para HEK293, RPMM 640, 10 % FBS pa- ra THP-1 e DMEM/F12, 10 % FBS para FTC-133) em uma atmosfera ume- decida a 37° C e 5 % CO2.
ESTIMULAÇÃO USANDO PEPTÍDEOS BIOATIVOS, COMPOSTOS QUÍ- MICOS OU LPS
Células HEK293 e FTC-133 foram cultivadas como culturas ade- rentes e células THP-1 foi crescidas em suspensão. Para ensaio de estimu- lação 2x105 células FTC-133 e células HEK293 foram transferidas para pla- cas de 24 poços. No caso de HEK293, as placas foram revestidas com colá- geno I para assegurar aderência apropriada. Além disso, 2x106 células THP-
1 foram crescidas em placas de suspensão de 24 poços. Todos os experi- mentos de estimulação foram aplicados sob condições livres de soro. FTC- 133 foi crescida durante a noite. Depois, as células foram adaptadas aos meios livres de soro por mais 24 h e a estimulação foi iniciada substituindo 30 os meios condicionados através de meios livres de soro frescos. Células HEK293 foram crescidas durante noite e depois a estimulação usando os respectivos agentes foi iniciada sem uma adaptação às condições livres de soro devido às alterações morfológicas no caso de cultivo de HEK293 sob condições livres de soro por mais que 24 h. Células de THP-1 foram banha- das em meios livres de soro junto com o respectivo agente. Os estímulos aplicados e concentrações finais são listados na Tabela 12.
TABELA 12: Estímulos às investigações na regulação de hQC e hisoQC em
inhagens celulares humanas Nome Concentração final ácido butírico (BA) 2 mM fator de crescimento de hepatócitos (HGF) 10 ng/ml lipopolissacarídeo (LPS) 1,10 ug/ml fator β de crescimento de transformação (ΤΘΡβ) 10, 100 ng/ml fator α de necrose tumoral (TNFa) 10, 100 ng/ml Células foram incubadas com o respectivo estímulo por 24 h.
Depois, RNA total das células foi isolado usando o kit Nucleo-Spin® RNA Il (Macherey-NageI) e armazenado até o ensaio de qPCR.
ESTIMULAÇÃO USANDO HIPOXIA
Células THP-1, HEK293 e FTC-133 foram banhadas em dois frascos de cultura de tecido de 25 cm2, respectivamente. Assim, um frasco de cada linhagem celular serviu como controle negativo, cultivado sob condi- ções de crescimento normais por 24 h. Os outros frascos foram colocados 15 em um saco anaeróbio junto com um reagente anaeróbio (Anaerocult® P, Merck) e um indicador. O saco foi vedado para assegurar ar condições her- méticas. Células foram também crescidas por 24 h e subsequentemente, RNA total foi isolado usando o kit Nucleo-Spin® RNA Il (Macherey - Nagel) e armazenado até ensaio de qPCR.
RESULTADOS
EXPRESSÃO BASAL DE QPCT E QPCTL EM HEK293, FTC-133 E THP-1 A expressão basal nas linhagens celulares usadas HEK293, FTC-133 e THP-1 foi avaliada na preparação para os experimentos de esti- mulação a seguir. O número de cópias de transcrições de QPCT e QPCTL é resumido na Tabela 13.
TABELA 13: Expressão Basal de QPCT e QPCTL em linhagens celulares diferentes
linhagem celular Número de cópias de mRNA absoluto por 50 ng de RNA total QPCT QPCTL HEK-293 (8 amostras) 37196 ± 18928 3206 ± 855 FTC-133 (8 amostras) 24790 ± 7605 10262 ±1899 THP-1 (8 amostras) 3588 ± 853 6725 ±1763 INFLUÊNCIA DOS ESTÍMULOS SELECIONADOS SOBRE A EXPRESSÃO DE QPCT E QPCTL
Sítios de ligação regulacionais dos promotores de QPCT e 5 QPCTL e vias de transdução de sinal que conduzem a sua regulação não foram descritos até agora. Portanto, experimentos de estimulação usando linhagens celulares e estímulos diferentes foram conduzidos. Níveis de mR- NA de QPCT nas células de HEK293 foram aumentados por estimulação usando TNF-α, HGF e ácido butírico. Além disso, a regulação de CCL2 co- 10 mo substrato de QPCT/QPCTL foi investigada. TNF-α e ácido butírico au- mentaram a quantidade de transcrições de CCL2 em HEK293. HGF não te- ve nenhuma influência sobre a expressão de CCL2. Em contraste, QPCTL não foi regulado porTNF-α, HGF e ácido butírico (Figura 35).
Além disso, FTC-133 foi estimulado usando LPS e TGF-β e a regulação de QPCT, QPCTL e CCL2 foi monitorada. Em FTC-133, LPS e TGF-β estimula- ram a expressão de mRNA de QPCT, mas não induziu expressão de QPCTL e CCL2 (Figura 36).
Estes experimentos foram também colaborados por estimulação das células de THP-1 usando LPS (1 pg/ml), LPS (10 pg/ml), TGF-β e TNF-α. Como ob- 20 servado para FTC-133 e HEK293, a expressão de QPCT poderia ser induzi- da usando estímulos diferentes. Além disso, a expressão de CCL2 foi indu- zida usando LPS e TNF-α. Novamente, nenhuma indução ou repressão de mRNA de QPCTL pôde ser observada (Figura 37).
Em conclusão, os experimentos revelaram que QPCT pode ser regulada por um conjunto de estímulos em linhagens celulares diferentes (LPS, TNF-a, HGF, ácido butírico e similares). Em contraste, QPCTL não pôde ser nem estimulada nem reprimida pelos estímulos testados sugerindo uma função mantenedora de QPCTL.
INFLUÊNCIA DOS ESTÍMULOS SELECIONADOS SOBRE EXPRESSÃO DE QPCT E SEUS SUBSTRATOS
Considerando que expressão de QPCT foi induzida por vários estímulos, a pergunta foi levantada se indução de QPCT ocorre em combi- nação com uma indução dos substratos de QPCT CCL2, CCL7, CCL8 e CCL13. Portanto, a estimulação usando LPS (1 pg/ml), LPS (10 pg/ml), 10 TGF-β (100ng/ml) e TNF-a (100 ng/ml), respectivamente, foi executada u- sando monócitos de THP-1. THP-1 expressa todas as quimocinas a um nível basal, importante para comparação de células estimuladas com o controle negativo.
LPS e TNF-α conduziram à indução segura de todas quimocinas testadas e QPCT em células THP-1. TGF-β foi menos eficaz como estímulo e induziu a expressão da máxima de QPCT, CCL2, CCL7 e CCL8 duas vezes. CCL13 foi reprimida por estimulação de TGF-β (Figura 38).
ESTIMULAÇÃO DE EXPRESSÃO DE QPCT E QPCTL ATRAVÉS DE Hl- POXIA
Expressão de QPCTL não pôde ser regulada por agentes quími-
cos, peptídeos bioativos ou LPS. Portanto, nós testamos se a expressão de QPCTL é regulada através de hipoxia. Como resumido na Figura 39. Hipoxia seletivamente induziu a expressão de QPCTL mas não de QPCT. Em com- paração, fator 1a induzido por hipoxia (HIFIa) foi reprimido em 15 % (Figura 25 39A) e 45 % (Figura 39C). Os dados sugerem uma conexão de QPCTL à hipoxia.
SÍNTESE DOS INIBIDORES
ESQUEMA DE SÍNTESE 1: Síntese dos exemplos 1 -53, 96-102, 136-137. Reagentes e condições: (a) NaH1 DMF1 4h, TA; (b), 8h, 100° C; (c) H2N-NH2lEtOH, 8h, refluxo depois 4N HCI, 6h, refluxo, (d) R3-NCO, E- tOH, 6h, refluxo, (e) 3,4-dimetóxi-fenil-isotiocianato,
ESQUEMA DE SÍNTESE 2: Síntese dos exemplos 54-95
Reagentes e condições: (a) R-NCS, EtOH, 6h, refluxo; (b) WSCD, 1/-/-imidazol-1-propanamina, DMF, 2h, TA ESQUEMA DE SÍNTESE 3: Síntese dos exemplos 103-105
4 N-Vy,
NH2
Reagentes e condições: (a) NaH, DMF, TA, 3h; (b) LiAIH4, dio- xano, refluxo, 1 h; (c) R-NCS, EtOH, refluxo 6h.
ESQUEMA DE SÍNTESE 4: Síntese dos exemplos 106-109 Reagentes e condições: (a) EtOH1 2h, refluxo. ESQUEMA DE SÍNTESE 5: Síntese dos exemplos 110-112
r\-
S- ^r6 Ν<=ϊ/ s. ^ ^R0
Reagentes e condições: (a) 1/-/-imidazol-1-propanamina, trietila- mina, Tolueno, 12 h, refluxo.
ESQUEMA DE SÍNTESE 6: Síntese dos exemplos 113-132
« K„ -
Reagentes e condições: (a) CAIBE, 1/-/-imidazol-1-propanamina, Dioxano, 0° C, 12h; (b) Reagente de Laweson, EtOH1 refluxo, 8h.
ESQUEMA DE SÍNTESE 7: Síntese dos exemplos 133-135
M. * O
N " Cl
H2N
Reagentes e condições: (a) cloreto de 1H-imidazol-1-propano acídico, CH2CI2, -10° C, 1 h; (b) Reagente de Lawesson, Dioxano, refluxo, 8 h.
ESQUEMA DE SÍNTESE 8: Síntese do exemplo 138
Cfj ■ "lfec coòCC
Reagentes e condições: (a) EtOH, refluxo, 8 h. ESQUEMA DE SÍNTESE 9: Síntese do exemplo 139 O
o~:xxc λ
Reagentes e condições: (a) 75 % conc. H2SO4, 4h. ESQUEMA DE SÍNTESE 10: Síntese do exemplo 140
NO2
X
J ‘ ♦ >=\ -- Ql' ^ K'
-R NO2
"NH2 ^NH
HH
Reagentes e condições: (a) Acetonitrila, refluxo, 2h.
ESQUEMA DE SÍNTESE 11: Síntese do exemplo 141
Reagentes e condições: (a) NaH, DMF, 4h, TA; (b), 8h, 100° C;
(c) H2N-NH2jEtOH, 8h, refluxo depois 4N HCI, 6h, refluxo, (d) 3,4-dimetóxi- fenil-isotiocianato, EtOH, 6h, refluxo.
CONDIÇÕES ANALÍTICAS
Espectros de massa de ESI foram obtidos com um espectrôme- 10 tro SCIEX API 365 (Perkin Elmer). Os dados de 1H-RMN (500 MHz) foram registrados em um BRUKER AC 500, usando DMSO-D6 como solvente. Deslocamentos químicos são expressados como partes por milhões em campo abaixo de tetrametilsilano. Padrões intensos foram designados como segue: s (singleto), d (dupleto), dd (dupleto de dupleto), t (tripleto), m (multi- 15 pleto), e br (sinal vasto).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA SÍNTESE EXEMPLOS 1 - 12 e 14-53
1/-/-imidazol-1-propanamina foi reagido com o isotiocianato cor- respondente em etanol sob refluxo por 8h. Após o qual, solvente foi removi- do e o óleo restante foi dissolvido em cloreto de metileno. A camada orgâni- ca foi lavada duas vezes com uma solução saturada de NaHCOs seguida por NaHSO4 e salmoura, secada depois evaporada. O sólido restante foi re- 5 cristalizado de acetato de etila, rendendo a tiouréia exemplar em rendimen- tos de 80 - 98 %.
EXEMPLO 13
1-(3-(1/-/-imidazol-1-il)propil)-3-(3,4-dimetoxifenil)tiouréia
4,0 mmol de isotiocianato de 3,4-dimetoxifenila e 4,0 mmol de 3- (1H-imidazol-1-il)alquil-1-amina foram dissolvidos em 10 ml de etanol absolu- to. Após agitar por 2 h sob refluxo, o solvente foi evaporado e o sólido resul- tante foi recristalizado de etanol.
Rendimento: 0,66 g (51,3 %); mp: 160,0 - 161,0° C 1H RMN δ 1,8 - 2,0 (m, 2H), 3,4 - 3,5 (m, 2H), 3,75 (s, 6H), 3,9 - 4,0 (m, 2H), 6,7 - 6,8 (m, 1 H), 6,9 (br m, 2H), 6,95 (s, 1 H), 7,15 (s, 1 H), 7,55 (br s, 1 H), 7,6 (s, 1 H), 9,3 (s, 1 H); EM m/z 321,2 (M+H), 253,3 (M- C3H3N2*)
EXEMPLOS 96-102
1/-/-imidazol-1-propanamina foi reagida com o isocianato corres- 20 pondente em etanol sob refluxo por 8h. Após o qual, o solvente foi removido e o óleo restante foi dissolvido em cloreto de metileno. A camada orgânica foi lavada duas vezes com uma solução saturada de NaHCO3 seguida por NaHSO4 e salmoura, secada depois evaporada. O sólido restante foi recris- talizado de acetato de etila, rendendo a uréia do exemplo nos rendimentos 25 de 85 - 90 %.
EXEMPLOS 136, 137.
As 1/-/-imidazol-1-alquilaminas foram preparadas de acordo com a literatura de □-bromalquil-ftalimidas e sal de imidazólio e hidrazinólise sub- sequente. Os produtos resultantes foram transformados nas tiouréias de a- cordo com o exemplo 1 - 53 dando um rendimento de 88 % (exemplo 136) e 95 % (exemplo 137).
EXEMPLOS 54 - 95 Todos os exemplos foram feitos das tiouréias correspondentes reagindo com carbodiimida solúvel em água (WSCD) e 1/-/-imidazol-1- propanamina em formamida de dimetila seca por 2h em TA dando as guani- dinas trissubstituídas com rendimentos de 40 - 87 %.
EXEMPLOS 103-105
Imidazol foi reagido com o brommetilfenilcianeto correspondente em DMF, utilizando 1 equivalente de NaH por 3h sob TA, dando o 1H- imidazol-1-metilfenilcianetos. O solvente foi removido e o óleo resultante foi redissolvido em dioxano. Os cianetos foram convertidos nas aminas corres- 10 pondentes usando 1 equivalente de LiAIH4. Após adicionar uma solução sa- turada de KHSO4, dioxano foi evaporado e a camada aquosa foi extraída por meio de CHCI3. A camada orgânica foi concentrada a vácuo e a amina foi convertida nas tiouréias correspondentes de acordo com os exemplos 1-53 dando um rendimento de 78 % (exemplo 103) e 65 % (exemplo 104) e 81 % 15 (exemplo 105).
EXEMPLOS 106-109
A partir do metanossulfonato-2-metilpropil-ftalimidas correspon- dente as aminas foram sintetizadas como descrito para as aminas no exem- plo 136 - 137. Os produtos resultantes foram transformados nas tiouréias de acordo com o exemplo 1 - 53 dando os exemplos 106 - 109 em rendimentos totais de 25 - 30 %.
EXEMPLOS 110-112
1/-/-imidazol-1-propanamina foi reagida com o 2- clorobenzo[d]tiazol correspondente em toluol por 24h em uma temperatura de 130° C. Após remover o solvente e recristalização do metanol exemplos 110-112 foram rendidos em uma quantidade de 55 - 65 %.
EXEMPLOS 113- 118, 120 - 124 e 126 -132
1H-imidazol-1-propanarnina foi reagida com o ácido acético de
2-fenil correspondente em dioxano seco adicionando um equivalente de CAIBE e N-metilmorfolina em uma temperatura de 0° C. Após as 2h, a mistu- ra foi deixada aquecer para TA e a mistura foi agitada por 12h. Após remo- ver o solvente, o óleo resultante foi redissolvido em cloreto de metileno e a camada orgânica foi lavada por meio de uma solução aquosa de NaHCOs e água, secada e o solvente foi evaporado. O óleo restante foi dissolvido em dioxano adicionando Reagente de Laweson. Após agitar por 12h, uma solu- ção saturada de NaHCO3 foi adicionada. Dioxano foi evaporado e a camada 5 aquosa foi extraída por meio de acetato de etila. A camada orgânica foi se- parada, secada e o solvente foi evaporado. O sólido restante foi cristalizado de acetato de etila/éter, dando 113 - 118, 120 - 124 e 126 - 132 com rendi- mentos totais de 62 - 85 %.
EXEMPLO 119
N-(3-(1 H-imidazol-1 -il)propil)-2-(3,4-dimetoxifenil)etanotioamida
Uma mistura de 4,0 mmol de trietilamina e 4,0 mmol de 3-( 1 /-/- imidazol-1-il)alquil-1-amina 20 ml de dioxano foi adicionada a gotas a uma solução esfriada em gelo agitada de 4,0 mmol de cloreto de 2-(3,4- dimetoxifenil)acetila em 30 ml de dioxano. A mistura foi deixada aquecer-se para TA, e depois agitada por 1 h. Após remover o solvente através de pres- são reduzida o resíduo foi redissolvido em 50 ml de diclorometano. A cama- da orgânica foi lavada por meio de 30 ml de solução aquosa saturada de NaHCO3, e água. A solução orgânica foi secada, filtrada, e o solvente foi re- movido sob pressão reduzida. Após redissolver em 50 ml de dioxano seco, 2,2 mmol do reagente de Lawesson foram adicionados, e a mistura foi aque- cida para 90° C e agitada por 8 h. O solvente foi removido através de pres- são reduzida, e o resíduo foi redissolvido em 50 ml de diclorometano. A ca- mada orgânica foi lavada três vezes por meio de uma solução aquosa satu- rada de NaHCO3, seguido três vezes através de água, secada, filtrada, e depois o solvente orgânico foi removido. O composto foi purificado através de cromatografia usando um dispositivo de cromatografia com força centrí- fuga (Harrison Research Ltd.) utilizando placas de sílica de uma espessura de camada de 2 mm, e um gradiente de CHCI3/MeOH como sistema eluente. Rendimento: 0,14 g (10,6 %); ponto de fundição: 148,0 - 150,0° C 1H RMN δ 2,0 - 2,15 (br m, 2H), 3,4 - 3,5 (m, 2H), 3,7 (s, 6H), 6,75 - 6,8 (m, 2H), 4,1 -
4,2 (m, 2H), 6,8 - 6,9 (m, 2H), 6,95 - 7,0 (m, 1 H), 7,4 (s, 1 H), 7,75 - 7,85 (br m, 1 H), 8,6 (s, 1 H), 10,2 (s, 1 H); EM m/z 320,2 (M+H), 252,2 (M-C3H3N2*) EXEMPLO 125
N-(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)-1 -(3,4-dimetoxifenil)ciclopropano-carbotioamida
11,06 mmol de acetonitrila de 3,4-dimetoxifenil, 34,8 mmol de 2- Bromo-1-cloroetanol e 1,16 mmol de cloridrato de trietilbenzilamônio foram 5 dissolvidos em 10 ml de uma solução aquosa de KOH (60 %). A mistura foi transferida em um banho ultrassônico e vigorosamente agitada por 3h em temperatura ambiente. A suspensão resultante foi diluída com 40 ml de água e extraída três vezes por meio de 20 ml de diclorometano. As camadas or- gânicas combinadas foram lavadas por meio de uma solução aquosa de áci- 10 do clorídrico (1N), secadas em Na2SO4 e o solvente foi removido sob pres- são reduzida. O óleo restante foi purificado através de cromatografia instan- tânea usando sílica-gel e acetato de etila/heptano como sistema eluente, resultando em 0,81 g (34,4 %) de 1-(3,4-dimetoxifenil)ciclopropano- carbonitrila
3,9 mmol de 1-(3,4-dimetoxifenil)ciclopropanocarbonitrila e 11,2
mmol de KOH foram suspensos em 80 ml de etileno glicol. A mistura foi agi- tada por 12 h sob refluxo. Depois 80 ml de água foram adicionados e a ca- mada aquosa foi extraída duas vezes com éter. Após ajuste de pH para um valor de pH = 4 - 5 usando HCI (1N), a camada aquosa foi extraída três ve- 20 zes por meio de éter, depois as camadas orgânicas combinadas foram se- cadas em Na2SO4 e o solvente foi removido, resultando em 0,81 g (93,5 %) de ácido 1-(3,4-dimetoxifenil)ciclopropanocarboxílico.
3,44 mmol de ácido 1-(3,4-dimetoxifenil)ciclopropanocarboxílico,
3,5 mmol de N-Metil morfolina, e 3,5 mmol de cloroformiato de isobutila fo- 25 ram dissolvidos em tetraidrofurano seco e agitados por 15 min a -15° C. De- pois 3,5 mmol de 3-(1 /-/-imidazol-1 -il)alquil-1-amina foram adicionados e a mistura foi deixada aquecer-se para 0° C e foi agitada por 12h. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o óleo restante foi redissolvido em cloro- fórmio. Depois a camada orgânica foi lavada duas vezes por meio de uma 30 solução aquosa saturada de NaHCO3, depois secada em Na2SO4 e o sol- vente foi removido. Purificação foi executada por meio de cromatografia for- çada centrífuga usando um dispositivo Chromatotron® (Harrison Research Ltd.) utilizando placas de sílica de uma espessura de camada de 2 mm, e um gradiente de CHCI3/MeOH como sistema eluente resultando em 0,671 g (59,3 %) de N-(3-(1/-/-imidazol-1-il)propil)-1-(3,4-dimetoxifenil)ciclopropano- carboxamida.
Após redissolver em 30 ml de dioxano seco, 1,43 mmol do rea-
gente de Lawesson foi adicionado, e a mistura foi aquecida para 90° C e agi- tada por 8h. O solvente foi removido através de pressão reduzida, e o resí- duo que permanece foi dissolvido em 50 ml de diclorometano. A camada orgânica foi lavada três vezes por meio de uma solução aquosa saturada de 10 NaHCO3, seguido três vezes através de água, secada, filtrada, e depois o solvente orgânico foi removido. O composto foi purificado através de croma- tografia usando um dispositivo de cromatografia com força centrífuga, (Harri- son Research Ltd.) utilizando placas de sílica de uma espessura de camada de 2 mm, e um gradiente de CHCb/MeOH como sistema eluente. Rendimen- 15 to: 0,33 g (46,2 %); ponto de fundição: 127,0 - 127,5° C.
1H RMN δ 1,1 - 1,2 (t, 2H), 1,55 - 1,6 (t, 2H), 2,0 - 2,1 (m, 2H),
3,5 - 3,6 (m, 2H), 3,7 - 3,8 (s, 6H), 4,1 - 4,2 (t, 2H), 6,8 - 6,9 (m, 3H), 7,65 (s,
1 H), 7,75 (s, 1 H), 8,8 (m, 1 H), 9,05 (s, 1 H; EM m/z 346,0 (M+H), 278,2 (M- C3H3N2*), 177,1 (M-C6H8N3S*)
EXEMPLOS 133-135
Uma mistura de 1 equivalente de trietilamina e 3,4- dimetoxianilina em dioxano foi adicionada a uma solução agitada do cloreto acídico de ω-bromoalquila correspondente em uma temperatura de 0° C. A solução foi deixada aquecer-se para TA e agitada por 2h. O solvente foi e- 25 vaporado, e o óleo restante foi redissolvido em diclorometano. A camada orgânica foi lavada por meio de água, secada, filtrada, e o solvente foi remo- vido sob pressão reduzida.
Imidazol e hidreto de sódio foram suspensos e a mistura foi agi- tada sob condições inertes em TA por 3 h. üú-Bromo-N-(3,4-dimetóxi- fenil)alquilamida foi adicionado e a mistura foi aquecida para 100° C e agita- da por 8 h. Após o qual, o solvente foi evaporado, tolueno quente foi adicio- nado e a solução foi filtrada. Depois o solvente foi removido sob pressão re- duzida. A transformação nas tiomidas foi executada como descrito pelos e- xemplos 113-132 por meio do reagente de Laweson, dando 133 - 135 em rendimentos totais de 13 - 20 %.
Os dados analíticos para outros exemplos que foram sintetiza- dos de acordo com os esquemas de síntese geral descritos acima, são como segue:
EXEMPLO 1: 1-(3-(1/-/-imidazol-1-il)propil)-3-metiltiouréia ponto de fundição: 122 - 122,5° C 1H RMN δ 1,85 -1,95 (m, 2H), 2,8 (s, 3H), 3,2 - 3,5 (br d, 2H), 3,8 - 3,9 (m, 2H), 6,85 (d, 1 H), 7,15 (d, 1 H), 7,3 - 7,5 (br d, 2H), 7,65 (s, 1 H); EM m/z 199,1 (M+H), 221,3 (M+Na), 131,0 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 2: 1-(3-(1/-/-imidazol-1-il)propil)-3-terc-butiltiouréia ponto de fundição: 147,0 - 147,5° C
1H RMN δ 1,3 - 1,4 (s, 9H), 1,85 -1,95 (m, 2H), 3,5 (t, 2H), 3,8 (t, 2H), 6,85 (d, 1 H), 7,15 (d, 1 H), 7,3 - 7,5 (br d, 2H), 7,65 (s, 1 H); EM m/z 241,1 (M+H), 173,1 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 3: 1-(3-(1/-/-imidazol-1-il)propil)-3-benziltiouréia ponto de fundição: 127,0 - 128,0° C
1H RMN δ 1,85 - 1,95 (m, 2H), 3,2 - 3,5 (br d, 2H), 3,8 - 3,9 (m, 2H), 4,6 (s, 2H), 6,8 (d, 1 H), 7,15 (d, 1 H), 7,19 - 7,35 (m, 5H), 7,5 - 7,6 (br d, 2H), 7,85 (s, 1 H); EM m/z 275,3 (M+H), 207,1 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 5: 1-(3-(1/-/-imidazol-1-il)propil)-3-feniltiouréia ponto de fundição: 166,5 - 167,0° C
1H RMN δ 1,95 - 2,05 (m, 2H), 3,3 - 3,5 (br d, 2H), 3,9 - 4,0 (m, 2H), 6,85 (d, 1 H), 7,05 (m, 1 H) 7,15 (d, 1 H), 7,25 (m, 2H), 7,35 (m, 2H), 7,6 (s, 1 H), 7,8 (br s, 1 H), 9,5 (br s, 1 H); EM m/z 261,1 (M+H), 193,2 (M- C3H3N2*)
EXEMPLO 6: 1 -(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)-3-(4-fluorofenil)tiouréia ponto de fundição: 147,0 - 148,0°C
1H RMN δ 1,95 - 2,05 (m, 2H), 3,3 - 3,5 (br d, 2H), 3,9 - 4,05 (m, 2H), 6,85 (d, 1 H), 7,05 - 7,15 (m, 3H), 7,3 - 7,4 (m, 2H), 7,6 (s, 1 H), 7,7 - 7,8 (br s, 1 H), 9,4 (br s, 1 H); EM m/z 279,3 (M+H), 211,2 (M-C3H3N2*) EXEMPLO 7: 1-(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)-3-(4-etilfenil)tiouréia ponto de fundição: 100,0 - 100,5° C
1H RMN δ 1,15 - 1,2 (t, 3H), 1,9 - 2,0 (m, 2H), 2,5 - 2,6 (m, 2H),
3.3 - 3,5 (br d, 2H), 3,9 - 4,05 (m, 2H), 6,85 (d, 1 H), 7,1 - 7,2 (m, 3H), 7,25 -
7.3 (m, 2H), 7,6 (s, 1 H), 7,7 - 7,8 (br s, 1 H), 9,4 (br s, 1 H); EM m/z 289,3 (M+H), 221,1 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 8: 1-(3-(1/-/-imidazol-1-il)propil)-3-(4-(trifluorometil)fenil)tiouréia ponto de fundição: 154,5 - 155,0° C
1H RMN δ 1,9 - 2,1 (br m, 2H), 3,4 - 3,6 (br d, 2H), 3,95 - 4,1 (br m, 2H), 6,85 (d, 1 H), 7,2 (d, 1 H), 7,6 - 7,8 (m, 5H), 8,2 (br s, 1 H), 9,9 (br s, 1 H); EM m/z 329,3 (M+H), 261,2 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 10:1 -(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)-3-(4-acetilfenil)tiouréia ponto de fundição: 170,0 - 171,0° C
1H RMN δ 1,9 - 2,1 (br m, 2H), 2,4 - 2,5 (s, 3H), 3,2 - 3,5 (br m, 2H), 3,9 - 4,1 (m, 2H), 6,85 (d, 1 H), 7,15 (d, 1 H), 7,5 - 7,65 (br m, 3H), 7,8 - 7,9 (m, 2H), 8,1 (m, 2H), 9,8 (br s, 1 H); EM m/z 303,2 (M+H), 235,1 (M- C3H3N2*)
EXEMPLO 11:1 -(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)-3-(4-metoxifenil)tiouréia ponto de fundição: 125,0 - 125,5° C
1H RMN δ 1,8 - 2,0 (br m, 2H), 3,2 - 3,5 (br m, 2H), 3,7 (s, 3H), 3,9 - 4,0 (m, 2H), 6,7 - 6,9 (m, 3H), 7,1 - 7,2 (m, 3H), 7,5 (s, 1 H), 7,6 (s, 1 H),
9,2 (s, 1 H); EM m/z 291,1 (M+H), 223,2 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 14: 1-(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)-3-(2,4-dimetoxifenil)tiouréia ponto de fundição: 120,0 - 120,5° C
1H RMN δ 1,8 - 2,0 (br m, 2H), 3,4 - 3,5 (br m, 2H), 3,75 (s, 6H), 3,9 - 4,0 (m, 2H), 6,5 (d, 1 H), 6,6 (s, 1 H), 6,9 (s, 1 H), 7,15 (s, 1 H), 7,3 (d, 1 H), 7,5 (br s, 1 H), 7,6 (s, 1 H), 9,75 (s, 1 H); EM m/z 321,2 (M+H), 253,3 (M- C3H3N2*)
EXEMPLO 15:1 -(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)-3-(3,5-dimetoxifenil)tiouréia ponto de fundição: 142,0 - 143,0° C 1H RMN δ 1,8 - 2,0 (br m, 2H), 3,4 - 3,5 (br m, 2H), 3,6 (s, 6H),
3,95 - 4,0 (m, 2H), 6,25 (m, 1 H), 6,6 (m, 2H), 6,9 (s, 1 H), 7,2 (s, 1 H), 7,6 (s,
1 H), 7,8 (s, 1 H), 9,5 (s, 1 H); EM m/z 321,2 (M+H), 253,3 (M-C3H3N2*) EXEMPLO 23: 1-(3-(1 H-imidazol-1-il)propil)-3-(2,3-diidrobenzo[b][1,4]dioxin- 7-il)-tiouréia
ponto de fundição: 103,0 - 103,5° C
1H RMN δ 1,9 - 2,0 (br m, 2H), 3,3 - 3,5 (br d, 2H), 3,9 - 4,0 (m, 2H), 4,2 - 4,3 (m, 4H), 6,7 (m, 1 H), 6,8 - 6,8 (m, 1 H), 6,9 (m, 2H), 7,2 (s, 1 H), 7,6 (m, 2H), 9,3 (s, 1 H); EM m/z 319,3 (M+H), 251,3 (M-C3H3N2*) EXEMPLO 24: 1 -(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)-3-(benzo[d][1,3]dioxol-6- il)tiouréia
ponto de fundição: 115,0 - 115,6° C 1H RMN δ 1,9 - 2,1 (br m, 2H), 3,4 - 3,5 (br d, 2H), 4,05 - 4,15
(m, 2H), 6,0 (s, 2H), 6,7 (m, 1 H), 6,8 - 6,85 (m, 1 H), 6,95 (d, 1 H), 7,25 (s, 1 H), 7,45 (s, 1 H), 7,7 (br s, 1 H), 8,5 (br s, 1 H), 9,4 (br s, 1 H); EM m/z 305,2 (M+H), 237,2 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 25: 1 -(3-( 1 H-imidazol-1 -il)propil)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)tiouréia ponto de fundição: 124,5 - 125,5° C
1H RMN δ 1,8 - 2,0 (m, 2H), 3,4 - 3,5 (br m, 2H), 3,6 (s, 3H), 3,7 (s, 6H), 3,9 - 4,0 (m, 2H), 6,65 (m, 2H), 6,85 (s, 1 H), 7,2 (s, 1 H), 7,6 (s, 1 H), 7,7 (br s, 1 H), 9,4 (s, 1 H); EM m/z 351,3 (M+H), 283,2 (M-C3H3N2*) EXEMPLO 26: 1 -(3-( 1 H-imidazol-1 -il)propil)-3-(3-metoxifenil)tiouréia ponto de fundição: 89,5 - 90,0° C
1H RMN δ 1,9 - 2,1 (br m, 2H), 3,4 - 3,5 (br m, 2H), 3,7 (s, 3H),
3,9 - 4,0 (m, 2H), 6,6 - 6,7 (m, 1 H), 6,8 - 6,9 (m, 2H), 7,1 (m, 2H), 7,15 - 7,25 (br m, 1 H), 7,6 (s, 1 H), 7,8 (br s, 1 H), 9,5 (s, 1 H); EM m/z 291,1 (M+H),
223,2 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 27: 1-(3-(1 H-imidazol-1-il)propil)-3-(4-etoxifenil)tiouréia ponto de fundição: 126,0 - 126,5° C
1H RMN δ 1,5 (br m, 3H), 1,9 - 2,0 (br m, 2H), 3,4 - 3,5 (br m, 2H), 3,9 - 4,0 (br m, 4H), 6,8 - 6,9 (m, 2H), 6,95 (s, 1 H), 7,15 - 7,2 (m, 2H), 7,25 (s, 1 H), 7,55 - 7,6 (br s, 1 H), 7,8 (s, 1 H), 9,3 (s, 1 H); EM m/z 305,2 (M+H), 237,2 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 33: 1 -(3-(1 H-imidazol-1 -il)propil)-3-(4-(metiltio)fenil)tiouréia ponto de fundição: 140,0 - 140,5° C 1H RMN δ 1,8 - 2,05 (br m, 2H), 2,5 (s, 3H), 3,3 - 3,5 (br m, 2H),
3.9 - 4,1 (m, 2H), 6,9 (m, 1 H), 7,1 - 7,3 (br m, 5H), 7,6 (s, 1 H), 7,75 (br s, 1 H), 9,4 (s, 1 H); EM m/z 307,2 (M+H), 239,2 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 42: 1 -(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)-3-(4-nitrofenil)tiouréia ponto de fundição: 165,0, 166,0° C
1H RMN δ 1,9 - 2,05 (m, 2H), 3,3 - 3,5 (br d, 2H), 3,95 - 4,05 (m, 2H), 6,85 (d, 1 H), 7,15 (d, 1 H), 7,6 (d, 1 H), 7,7 (m, 2H), 8,1 (m, 2H), 8,3 (br s, 1 H), 10,1 (br s, 1 H); EM m/z 306,2 (M+H), 237,9 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 50: 1 -(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)-3-(4-(dimetilamino)fenil)tiouréia ponto de fundição: 146,5 - 147,0° C
1H RMN δ 1,9 - 2,0 (m, 2H), 2,9 (s, 6H), 3,4 (m, 2H), 3,9 - 4,0 (m, 2H), 6,7 (m, 2H), 6,9 (s, 1H), 7,05-7,1 (m, 2H), 7,15 (s, 1H), 7,4 (br s, 1H), 7,6 (s, 1H), 9,2 (s, 1H); EM m/z 304,2 (M+H), 236,0 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 102: 1 -(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)-3-(3,4-dimetoxifenil)uréia ponto de fundição: 114,5-115,0° C
1H RMN δ 1,7 - 1,9 (m, 2H), 2,9 - 3,1 (m, 2H), 3,7 (2s, 6H), 3,9 -
4.0 (m, 2H), 6,1 (t, 1 H), 6,7 (s, 2H), 6,8 (s, 1H), 7,15 (d, 2H), 7,6 (s, 1H), 8,2 (s, 1H); EM m/z 321,2 (M+H), 253,3 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 106: 1-((S)-3-(1/-/-imidazol-1-il)-2-metilpropil)-3-(3,4-
dimetoxifenil)-tiouréia
ponto de fundição:: 150,5 - 151,5° C
1H RMN δ 0,9 (d, 3H), 2,3 - 2,4 (m, 2H), 2,5 (s, 1H), 3,7 (d, 6H),
4.0 - 4,1 (br m, 1H), 4,15 - 4,25 (br m, 1H), 6,75 - 6,8 (m, 1H), 6,85 (m, 1H),
6.9 - 7,0 (m, 1H), 7,65 (s, 1 H), 7,75 (s, 2H), 9,1 (s,1H), 9,5 (s, 1H); EM m/z 335,6 (M+H), 267,1 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 107: 1-((R)-3-(1/-/-imidazol-1-il)-2-metilpropil)-3-(3,4-
dimetoxifenil)-tiouréia
ponto de fundição: 155,0 - 157,5° C
1H RMN δ 0,9 (d, 3H), 2,3 - 2,4 (m, 2H), 2,5 (s, 1H), 3,7 (d, 6H), 4,0 - 4,1 (br m, 1H), 4,15 - 4,25 (br m, 1H), 6,75 - 6,8 (m, 1H), 6,85 (m, 1H),
6.9 - 7,0 (m, 1H), 7,65 (s, 1 H), 7,75 (s, 2H), 9,1 (s,1 H), 9,5 (s, 1 H); EM m/z 335,4 (M+H), 267,2 (M-C3H3N2*) EXEMPLO 109: 1 -((1 -((1 /-/-imidazol-1 -il)metil)ciclopropil)metil)-3-(3,4- dimetóxi-fenil)tiouréia
ponto de fundição: 166,5 - 168,5° C
1H RMN δ 0,7 - 0,8 (br m, 2H), 1,85 - 1,9 (m, 1H), 2,15 - 2,2 (m, 5 1H), 2,2 - 2,3 (m, 1H), 3,4 - 3,5 (m, 1H), 3,7 (d, 6H), 4,2 (s, 1H), 4,95 (s, 1H), 6,75 - 6,8 (br m, 1H), 6,85 - 6,9 (br m, 1H), 7,0 (s, 1H), 7,5 (m, 1H), 7,6 (m, 1H), 7,7 (s, 0,5H), 7,8 (s, 0,5H), 8,85 (s, 0,5, 1H), 9,1 (s, 0,5H), 9,35 (s, 0,5H), 9,45 (s, 0,5H); EM m/z 347,2 (M+H), 279,2 (M - C3H3N2-), 137,5 (M- C9Hi3N4Sw-)
EXEMPLO 110: N-(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)benzo[d]tiazol-2-amina
1H RMN δ 1,95 - 2,15 (m, 2H), 3,25 - 3, 35 (m, 2H), 4,0 - 4,1 (t, 2H), 6,9 (s, 1 H), 6,95 - 7,05 (t, 1 H), 7,15 - 7,2 (m, 2H), 7,35 - 7,4 (d, 1 H), 7,60 - 7,70 (m, 2H), 8,0 - 8,1 (br s, 1 H); EM m/z 259,4 (M+H), 191,3 (M- C3H3N2-)
EXEMPLO 111: N-(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)-6-clorobenzo[d]tiazol-2-amina 1H RMN δ 1,95 - 2,15 (m, 2H), 3,25 - 3, 35 (m, 2H), 4,0 - 4,1 (t, 2H), 6,9 (s, 1 H), 7,1 - 7,2 (d, 2H), 7,3 - 7,4 (d, 1 H), 7,65 (s, 1 H), 7,8 (s, 1 H), 8,2 (s, 1 H); EM m/z 293,3 (M+H), 225,3 (M-C3H3N2-)
EXEMPLO 112: N-(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)-6-metoxibenzo[d]tiazol-2- a mi na
1H RMN δ 1,9 - 2,05 (m, 2H), 3,2 - 3, 3 (m, 2H), 3,7 (s, 3H), 4,0 -
4.1 (t, 2H), 6,7 - 6,8 (d, 1 H), 6,9 (s, 1 H), 7,15 - 7,2 (s, 1 H), 7,2 - 7,3 (m, 2H), 7,65 (s, 1 H), 7,8 (s, 1 H); EM m/z 289,1 (M+H), 221,4 (M-C3H3N2-) EXEMPLO 115: (R)-N-(3-(1 /-/-imidazol-1 -il)propil)-2-fenilpropanotioamida
ponto de fundição: 82,0 - 82,5° C
1H RMN δ 1,4 - 1,55 (d, 3H), 1,9 - 2,0 (m, 2H), 3,4 - 3,5 (m, 2H),
3,85 - 3,95 (m, 2H), 4,0 - 4,1 (q, 1 H), 6,8 - 6,9 (s, 1 H), 7,1 (s, 1 H), 7,15 -
7.2 (m, 1 H), 7,2 - 7,3 (m, 2H), 7,35 - 7,4 (m, 2H), 7,55 (s, 1 H), 10,1 (s, 1 H); EM m/z 274,4 (M+H), 206,3 (M-C3H3N2-)
EXEMPLO 116: (S)-N-(3-(1 AV-imidazol-1-il)propil)-2-fenilpropanotioamida
ponto de fundição: 82,5 - 83,5° C 1H RMN δ 1,4 - 1,55 (d, 3H),
1,9 - 2,0 (m, 2H), 3,4 - 3,5 (m, 2H), 3,85 - 3,95 (m, 2H), 4,0 - 4,1 (q, 1 H), 6,8 - 6,9 (s, 1 Η), 7,1 (s, 1 Η), 7,15 - 7,2 (m, 1 Η), 7,2 - 7,3 (m, 2Η), 7,35 - 7,4 (m, 2Η), 7,55 (s, 1 Η), 10,1 (s, 1 H); EM m/z 274,4 (Μ+Η), 206,3 (M-C3H3N2*) EXEMPLO 121: Ν-(3-(1 H-imidazol-1-il)propil)-1-(4-
clorofenil)ciclobutanecarbotiomida ponto de fundição: 137,5 - 139,0° C
1H RMN δ 1,55 - 1,75 (br m, 2H), 1,85 - 1,95 (br m, 2H), 2,4 - 2,5 (br m, 2H), 2,7 - 2,85 (br m, 2H), 3,3 - 3,5 (br m, 2H), 3,8 (m, 2H), 6,9 (s, 1 H), 7,0 (s, 1 H), 7,3 (m, 2H), 7,45 (s, 1 H), 7,5 (m, 2H), 9,6 (t, 1 H); EM m/z
334.3 (M+H), 266,1 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 122: N-(3-(1 H-imidazol-1-il)propil)-1-(4-
clorofenil)ciclopentanecarbotiomida
ponto de fundição: 140,0 - 141,0° C
1H RMN δ 1,5 - 1,65 (br m, 4H), 1,8 - 1,9 (m, 2H), 2,0 - 2,1 (m, 2H), 2,6 (m, 2H), 3,4 - 3,5 (m, 2H), 3,7 - 3,8 (m, 2H), 6,85 (s, 1 H), 7,0 (s, 1 H), 7,35 (m, 2H), 7,4 (m, 2H), 7,5 (s, 1 H), 9,4 (t, 1 H); EM m/z 348,2 (M+H),
280,2 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 123: N-(3-(1 H-imidazol-1 -il)propil)-1 -(4-metoxifenil)ciclo- hexanocarbotiomida
ponto de fundição: 162,5 - 164,0° C 1H RMN δ 1,2 - 1,3 (m, 1 H), 1,35 - 1,5 (br m, 5H), 1,85 - 2,0 (br
m, 4H), 2,4 - 2,6 (br m, 2H), 3,4 - 3,5 (m, 2H), 3,7 (s, 3H), 3,8 (m, 2H), 6,8 (m, 3H), 7,0 (s, 1 H), 7,3 (m, 2H), 7,5 (s, 1 H), 9,2 (t, 1 H); EM m/z 358,3 (M+H), 290,3 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 124: N-(3-(1 H-imidazol-1-il)propil)-1-(4-
metoxifenil)ciclopropanocarbotioamida
ponto de fundição:: 129,0 - 129,5° C
1H RMN δ 1,0 - 1,1 (m, 2H), 1,5 - 1,6 (m, 2H), 1,9 - 2,0 (br m, 2H), 3,4 - 3,5 (m, 2H), 3,7 (s, 3H), 3,9 (m, 2H), 6,9 (m, 3H), 7,1 (s, 1 H), 7,2 -
7.3 (m, 2H), 7,6 (s, 1 H), 8,9 (br s, 1 H); EM m/z 316,0 (M+H), 248,4 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 134: 5-(1 H-imidazol-1 -il)-N-(3,4-dimetoxifenil)pentanotioamida ponto de fundição:: 128,0 - 128,5° C 1H RMN δ 1,65 - 1,70 (m, 2Η), 1,75 - 1,80 (m, 2Η), 2,7 - 2,75 (m, 2Η), 3,7 (s, 3Η), 3,75 (s, 3Η), 4,0 - 4,05 (t, 2Η), 6,9 - 7,0 (m, 2Η), 7,2 (s, 1 Η),
7,3 (d, 1 Η), 7,5 (s, 1 Η), 7,75 (s, 1 Η), 11,0 (s, 1 H); EM m/z 320,2 (M+H),
252,2 (M-C3H3N2*)
EXEMPLO 136: 7-(2-(1 H-imidazol-1-il)etil)-3-(3,4-dimetoxifenil)tiouréia ponto de fundição: 157,5 - 159,0° C
1H RMN δ 3,7 (2 s, 6H), 3,8 (m, 2H), 4,2 (m, 2H), 6,7 (m, 1 H),
6,85 (m, 1 H), 6,9 (m, 2H), 7,15 (s, 1H), 7,5 (br s, 1H), 7,6 (s, 1H), 9,5 (s, 1H); EM m/z 307,2 (M+H), 239,1 (M - C3H3N2*)
ABREVIAÇÕES
0C grau Centígrado A, Ala alanina Αβ peptídeo β-amilóide ABri peptídeo amilóide em demência britânica familial AC adenilil ciclase ADan peptídeo amilóide em demência dinamarquesa familial AIM ausente em melanoma AMC amino metil cumarina as antissentido Asp aspartato βΝΑ beta-naftilamina BA ácido butírico bp pares de base BSA albumina de soro bovino C cisteína CAT cloranfenicol acetil transferase CAMP monofosfato de adenosina cíclica CCL2 MCP-1, proteína quimoatrativa de monócitos 1 CCL7 MCP-3, proteína quimoatrativa de monócitos 3 CCL8 MCP-2, proteína quimoatrativa de monócitos 2 CCL13 MCP-4, proteína quimoatrativa de monócitos 4 cDNA cópia-DNA C-His marcador de histidina C-terminal
CIDP polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica
Cl cloro
CSF fluido cerebrospinhal (licor cerebrospinalis)
término C término carbóxi
CTL linfócito T citotóxico
CV volume de coluna
d diâmetro
Da Dalton
DMSO dimetil sulfóxido
DNA ácido desoxirribonucléico
E enzima
EBV vírus Epstein Barr
ECL similar à enterocromafina
E. coli Escherichia coli
EC glutamil ciclase
ED dose eficaz
EGFP proteína fluorescente verde intensificada
ES complexo de enzima-substrato
FPP peptídeo promotor de fertilização
FTC carcinoma folicular da tiróide
g força centrífuga relativa
GBS síndrome de Guillain-Barré
GF filtração em gel
Gln glutamina
Glu ácido glutâmico
GnRH hormônio de liberação de gonadotropina (gonadoliberina)
GST glutation S-transferase
H hidrogênio humano
h humano, hora
HGF fator de crescimento de hepatócitos
HIC cromatografia de interação hidrofóbica HIFIa fator 1a induzido por hipoxia
His histidina
HPLC cromatografia líquida de alto desempenho
I inibidor, isoleucina
ID identificação
IMAC cromatografia de afinidade de metal imobilizada
IPTG Isopropil-p-D-tiogalactopiranosídeo
K potássio
k constante
kDA quilo-dalton
k, constante de inibidor
KLH Hemocianina de lapa
I comprimento
LB Luria-Bertani
LD dose letal
LPS lipopolisacarídeo
M molar
μΙ microlitro
μΜ micromolar
MAGEA família de antígeno de melanoma A
MAGEB família de antígeno de melanoma B
Maldi-tof dessorção a laser assistida por matriz/ionização, tempo de voo
MART1 antígeno de melanoma reconhecido por células T
max máximo
MCL-1 leucemia de célula mielóide 1
Met metionina
min minutos
mM milimolar
EM Esclerose múltipla
MRNA RNA mensageiro
N asparagina Na sódio
NADH dinucleotídeo de adenina de nicotinamida
nm nanômetro
NO número
NT Neurotensina
término N término amino
O oxigênio
OD densidade óptica
P produto, fósforo
PBS solução salina de fosfato sanfonado
PCR reação em cadeia de polimerase
pGlu ácido piroglutâmico
pH pondus hydrogenii
Pro prolina
PTC carcinoma da tiróide papilar
Pyr piroglutamato
QC glutaminil ciclase (ciclotransferase de peptídeo de glutaminila)
qPCR reação em cadeia de polimerase de tempo real quantitativa
QPCTL similar à ciclotransferase de peptídeo glutaminila
RNA ácido ribonucléico
TA transcrição reversa
RT transcriptase reversa
S substrato
S sentido
SAGE análise em série de expressão de gene
SDS dodecil sulfato de sódio SDS-PAGE eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida
SGAP amino peptidase de Streptomyces griseus
SEQ seqüência
SNP polimorfismo de nucleotídeo simples
taa antígeno associado a tumores
TGF-β fator beta de crescimento de transformação TNF-α fator alfa de necrose tumoral TRH hormônio de liberação de tireotropina (tireoliberina) TSH hormônio estimulante de tireóide TYR tirosinase TYRP proteína relacionada à tirosinase U unidade UTC carcinoma da tiróide indiferenciado UV ultravioleta V velocidade VpAP Vibrio proteolytica amino peptidase YSS seqüência sinal de levedura Zn zinco Listagem de Seqüência
<110> Probiodrug AG
<120> GENES RELACIONADOS À GLUTAMINIL CICLASE
<130> PBD OOO6O/WO
<150> US 60/846,244
<151> 2006-09-21
<150> US 60/947,780
<151> 2007-07-03
<160> 121
<210> 1 <211> 1086 <212> DNA <213> humano
<400> 1
atggcaggcg gaagacaccg gcgcgtcgtg ggcaccctcc acctgctgct gctggtggcc 60
gccctgccct gggcatccag gggggtcagt ccgagtgcct cagcctggcc agaggagaag 120
aattaccacc agccagccat tttgaattca tcggctcttc ggcaaattgc agaaggcacc 180
agtatctctg aaatgtggca aaatgactta cagccattgc tgatagagcg atacccggga 240
tcccctggaa gctatgctgc tcgtcagcac atcatgcagc gaattcagag gcttcaggct 300
gactgggtct tggaaataga caccttcttg agtcagacac cctatgggta ccggtctttc 360
tcaaatatca tcagcaccct caatcccact gctaaacgac atttggtcct cgcctgccac 420
tatgactcca agtatttttc ccactggaac aacagagtgt ttgtaggagc cactgattca 480
gccgtgccat gtgcaatgat gttggaactt gctcgtgcct tagacaagaa actcctttcc 540
ttaaagactg tttcagactc caagccagat ttgtcactcc agctgatctt ctttgatggt 600
gaagaggctt ttcttcactg gtctcctcaa gattctctct atgggtctcg acacttagct 660
gcaaagatgg catcgacccc gcacccacct ggagcgagag gcaccagcca actgcatggc 720
atggatttat tggtcttatt ggatttgatt ggagctccaa acccaacgtt tcccaatttt 780
tttccaaact cagccaggtg gttcgaaaga cttcaagcaa ttgaacatga acttcatgaa 840
ttgggtttgc tcaaggatca ctctttggag gggcggtatt tccagaatta cagttatgga 900
ggtgtgattc aggatgacca tattccattt ttaagaagag gtgttccagt tctgcatctg 960
ataccgtctc ctttccctga agtctggcac accatggatg acaatgaaga aaatttggat 1020 gaatcaacca ttgacaatct aaacaaaatc ctacaagtct ttgtgttgga atatcttcat 1080 ttgtaa 1086
<210> 2 <211> 1149 5 <212> DNA
<213> humano <4 00> 2
atgcgttccg ggggccgcgg gcgaccccgc ctgcggctgg gggaacgtgg cctcatggag 60 ccactcttgc cgccgaagcg ccgcctgcta ccgcgggttc ggctcttgcc tctgttgctg 120 gcgctggccg tgggctcggc gttctacacc atttggagcg gctggcaccg caggactgag 180 gagctgccgc tgggccggga gctgcgggtc ccattgatcg gaagcctccc cgaagcccgg 240 ctgcggaggg tggtgggaca actggatcca cagcgtctct ggagcactta tctgcgcccc 300 ctgctggttg tgcgaacccc gggcagcccg ggaaatctcc aagtcagaaa gttcctggag 360 - gccacgctgc ggtccctgac agcaggttgg cacgtggagc tggatccctt cacagcctca 420 acacccctgg ggccagtgga ctttggcaat gtggtggcca cactggaccc aagggctgcc 480 - cgtcacctca cccttgcctg ccattatgac tcgaagctct tcccacccgg atcgaccccc 540 tttgtagggg ccacggattc ggctgtgccc tgtgccctgc tgctggagct ggcccaagca 600 cttgacctgg agctgagcag ggccaaaaaa caggcagccc cggtgaccct gcaactgctc 660 ttcttggatg gtgaagaggc gctgaaggag tggggaccca aggactccct ttacggttcc 720 cggcacctgg cccagctcat ggagtctata cctcacagcc ccggccccac caggatccag 780 gctattgagc tctttatgct tcttgatctc ctgggagccc ccaatcccac cttctacagc 840 cacttccctc gcacggtccg ctggttccat cggctgagga gcattgagaa gcgtctgcac 900 cgtttgaacc tgctgcagtc tcatccccag gaagtgatgt acttccaacc cggggagccc 960 tttggctctg tggaagacga ccacatcccc ttcctccgca gaggggtacc cgtgctccat 1020 ctcatctcca cgcccttccc tgctgtctgg cacacccctg cggacaccga ggtcaatctc 1080 cacccaccca cggtacacaa cttgtgccgc attctcgctg tgttcctggc tgaatacctg 1140 gggctctag 114 9 <210> 3
<211> 1145
<212> DNA
<213> humano
<4 00> 3 atgcgttccg ggggccgcgg gcgaccccgc tcttgccgcc gaagcgccgc ctgctaccgc tggccgtggg ctcggcgttc tacaccattt tgccgctggg ccgggagctg cgggtcccat ggagggtggt gggacaactg gatccacagc tggttgtgcg aaccccgggc agcccgggaa cgctgcggtc cctgacagca ggttggcacg ccctggggcc agtggacttt ggcaatgtgg acctcaccct tgcctgccat tatgactcga taggggccac ggattcggct gtgccctgtg acctggagct gagcagggcc aaaaaacagg tggatggtga agaggcgctg aaggagtggg acctggccca gctcatggag tctatacctc ttgagctctt tatgcttctt gatctcctgg tccctcgcac ggtccgctgg ttccatcggc - tgaacctgct gcagtctcat ccccaggaag gctctgtgga agacgaccac atccccttcc tctccacgcc cttccctgct gtctggcaca cacccacggt acacaacttg tgccgcattc tctag <210> 4 <211> 1149 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 4 ggggccgcgg gcggccccgc atgcgttccg ccactcttgc ccccgaagcg ccgcctgcta gcgctggccg tgggctcggc gttctacacc gagctgccgc tgggccggga gctgcgggtc ctgcggaggg tggtgggaca actggaccca ctgctggttg tgcgaacccc aggcagcccg gccacgctgc ggtccctgac agcaggttgq ctgcggctgg gggaacgtgg atggagccac 60 gggttcggct cttgcctctg ttgctggcgc 120 ggagcggctg gcaccgcagg actgaggagc 180 tgatcggaag cctccccgaa gcccggctgc 240 gtctctggag cacttatctg cgccccctgc 300 atctccaagt cagaaagttc ctggaggcca 360 tggagctgga tcccttcaca gcctcaacac 420 tggccacact ggacccaagg gctgcccgtc 480 agctcttccc acccggatcg accccctttg 540 ccctgctgct ggagctggcc caagcacttg 600 cagccccggt gaccctgcaa ctgctcttct 660 gacccaagga ctccctttac ggttcccggc 720 acagccccgg ccccaccagg atccaggcta 780 gagcccccaa tcccaccttc tacagccact 840 tgaggagcat tgagaagcgt ctgcaccgtt 900 tgatgtactt ccaacccggg gagccctttg 960 tccgcagagg ggtacccgtg ctccatctca 1020 cccctgcgga caccgaggtc aatctccacc 1080 tcgctgtgtt cctggctgaa tacctggggc 1140 1145 ctgcggctag gggaacgtgg cgttatggag 60 ccgcgggttc ggctcttgcc cctgttgctg 120 atttggagcg gctggcaccg caggactgag 180 ccgttgatcg gaagccttcc cgaagcccgg 240 cagcgtctct ggggcactta tctgcgcccc 300 ggaaatctcc aagtcagaaa gttcctggag 360 cacgtggagc tggatccctt cacagcctcg 420 acgcccctgg ggccagtgga ctttggcaat cgtcacctca cccttgcctg ccattatgac tttgtagggg ccacggactc ggctgtgccc cttgacctgg agctgagcag ggccaaagaa ttcctggatg gtgaagaggc gctgaaggag cggcacctgg cccagctcat ggagtctata gctattgagc tctttatgct tcttgatctc cacttccctc gcacggtccg ctggttccat cgtttgaacc tgctgcagtc tcatccccag ttcggctctg tggaagacga ccacatcccc ctcatctcta cgcccttccc tgctgtctgg cacccgccca cggtacacaa cttaagccgc gggctctag <210> 5 <211> 1149 <212> DNA gcggccccgc <213> Macaca mulatta <400> 5 atgcgttccg ggggccgcgg ccactcttgc ccccgaagcg ccgcctgcta gcgctggccg tgggctcggc gttctacacc gagctgccgc tgggccggga gctgcgggtc ctgcggaggg tggtgggaca actggaccca ctgctggttg tgcgaacccc aggcagcccg gccacgctgc ggtccctgac agcaggttgg acgcccctgg gcccagtgga ctttggcaat cgtcacctca cccttgcctg ccattatgac tttgtagggg ccacagactc ggctgtgccc cttgacctgg agctgagcag ggccaaagaa ttcctggatg gtgaagaggc gctgaaggag cggcacctgg cccagctcat ggagtctata gctattgagc tctttatgct tcttgatctc gtggtggcca cgctggaccc gggggctgcc 480 tcgaagctct tcccacccgg atcgaccccg 540 tgtgccctgc tgctggagct ggcccaggca 600 caggcagccc cggtgaccct gcaactgctc 660 tggggaccca aggactccct ttacggttcc 720 cctcatagcc ccggccccac caggatccag 780 ctgggagccc ccaatcccac cttctacagc 840 cggctgagaa gcattgagaa gcgtctgcac 900 gaagtgatgt acttccaacc cggggagccc 960 ttcctccgca gaggggtccc cgtgctccat 1020 cacacccctg cggacacaga ggccaatctc 1080 attctggccg tgttcctggc tgaatacctg 1140 1149 ctgcggctag gggaacgtgg cgttatggag 60 ccgcgggttc ggctcttgcc cctgttgctg 120 atttggagcg gctggcaccg caggactgag 180 ccgttgatcg gaagccttcc cgaagcccgg 240 cagcgtctct ggggcactta tctgcgcccc 300 ggaaatctcc aagtcagaaa gttcctggag 360 cacgtggagc tggatccctt cacagcctcg 420 gtggtggcca cgctggaccc gggggctgcc 480 tcgaagctct tcccacccgg atcgaccccg 540 tgtgccctgc tgctggagct ggcccaggca 600 caggcagccc cggtgaccct gcaactgctc 660 tggggaccca aggactccct ttacggttcc 720 cctcatagcc ccggccccac caggatccag 780 ctgggagccc ccaatcccac cttctacagc 840 cacttccctc gcacggtccg ctggttccat cggctgagaa gcattgagaa gcgtctgcac 900 cgtttgaacc tgctgcagtc tcatccccag gaagtgatgt acttccaacc cggggagccc 960 tttggctctg tggaagacga ccacatcccc ttcctccgca gaggggtccc cgtgctccat 1020 ctcatctcta cgcccttccc tgctgtctgg cacacccctg cggacacaga ggccaatctc 1080 cacccgccca cggtacacaa cttaagccgc attctggccg tgttcctggc tgaatacctg 1140 gggctctag 1149 <210> 6
<211> 1152
<212> DNA
10 <213> Canis familiaris
<4 00> 6
atgccttccg ggggccgcgg gcggtcccgg ctacggctcg gggaacgtgg cctcttggag 60 ccgccctccc cgcccaagcg ccgcctgctc ccgcgggcgc acttcttgcc tctgcttctg 120 ctggccctgg ccctggcttc ggcgacctac accatctgga gcggctggca ccaccagact 180 gaggagctgc cgcggggccg ggagctgcgg ggccgcttga tcggaagcct ctccgaagcc 240 - cggctgcggc gggtggtggg gcaactggac ccacaccgtc tctggaacac ttatctgcgc 300 cccctgctgg ttgtgcggac cccgggcagc cccggcaatc tccaagtcag aaagttcctg 360 gaggctacac tacggacctt gacagcaggc tggcatgtgg aactggaccc cttcacagcc 420 ttgacacccc tggggccact ggactttggc aatgtggtgg ccacgctgga cccaggggct 480 gcccgtcacc tcacccttgc ctgccattat gactccaagc tcttcgcatc tgagtcggtt 540 ccctttgtgg gggcaacaga ttcggctgta ccttgcgccc tgctgctgga gctggctcag 600 gccctcgaca gggagttgag tagggccaag gagcaggaag ccccggtgac tctgcagctg 660 ctctttttgg atggtgaaga agcactgaag gagtggggac ccacagactc cctctatggc 720 tcccggcacc tggcccagct catggagtct gcaccccaca gcccgggccc caccaggatc 780 caggctatcg agctcttcat gctccttgat ctcctgggtg ccccgaatcc aaacttctac 840 agtcacttcc ctcatacagc ccgctggttc catcggctga ggagcatcga gaagcgcctt 900 caccgcatga acctgctgca gtctcatccc caggaagtga tgtacttcca gcccggggag 960 ccccctggtt ctgtggaaga tgaccacatc CCCttCCtCC gccgaggggt ccctgtgctc 1020 cacctcatct ccatgccctt cccctccgtc tggcacaccc ccgatgactc tgaggccaac 1080 ctgcacccac ccaccgtaca caatctgagc cgcatcctcg ccgtgttcct ggccgaatat 1140 ctggggctct ag 1152 <210> 7 <211> 1152
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 7
atgagtccgg ccagccgcgg gcggtctcgg cagcggctcg gggatcgcgg cctcatgaaa 60 ccaccctcac tttccaagcg ccgtcttctg ccgcgggtgc agctcctgcc cctgctgctg 120 ctggcgctgg ccctgggctt ggctttttat atcgtctgga atagctggca ccctggggtt 180 gaggaggtat cacggagccg ggatctgcgg gtcccgctga tcggaagcct ttcagaagcc 240 aagctgcggc ttgtggtagg gcagctggat ccacagcgtc tctggggaac ttttctgcgt 300 cccttgttga ttgtacgacc cccaggtagt cctggcaatc tccaagtgag aaagttcctg 360 gaggctacgt tgcagtccct atcggcaggc tggcacgtgg aactggaccc attcacagcc 420 tcaaccccct tggggccact ggacttcggg aacgtggtgg ccacccttga cccaggagct 480 gcccgtcacc tcaccctcgc ctgccattat gactctaagt tcttccctcc tgggttaccc 540 ccctttgtgg gggccacaga ttcagccgtg ccctgtgccc tgcttctgga gttagtccag 600 gcccttgatg tcatgctgag cagaatcaag cagcaggcag caccagtgac cctgcagctg 660 ctcttcttgg acggggagga ggcactgaag gagtggggac caaaggactc cctctatggt 720 tcccggcacc tagctcagat catggagtct ataccgcaca gccctggccc caccaggatc 780 caggctattg agctctttgt ccttcttgac cttctgggag cgcccagtcc aatcttcttc 840 agtcacttcc cccgcacagc ccgctggttc caacgactgc ggagcatcga gaagcgcctt 900 caccgtctga acctactgca gtctcacccc caggaagtga tgtacttcca acccggggag 960 ccccctggcc ctgtggaaga tgaccacatc cccttccttc gcagaggggt cccggtgctc 1020 cacctcattg cgatgccctt ccctgccgtg tggcacacac ctgctgacac tgaggctaac 1080 ctccacccgc ccacggtgca caacctgagc cgcatcctcg ccgtgttcct ggctgagtac 1140 ctgggtctct ag 1152 <210> 8 <211> 1152 <212> DNA <213> Mus musculus <4 0 0> 8 atgagtcccg ggagccgcgg gcggccccgg cagcggctcg aggatcgtgg cctcatgaaa 60 ccaccctcac tttccaagcg ccgtcttctg ccgcgagtgc agttcctgcc cctgctgctg 120 ctggcgctgg ctatgggctt ggctttctat atcgtctgga acagctggca ccctggggtt 180 gaggagatgt cacggagccg ggatctgcgg gtcccgctga tcggaagcct ttcagaagcc 240 aagctgcggc tggtggtagg gcagctggat ccgcagcgtc tctggggaac tttcctgcgt 300 cccttattga ttgtgcgacc cccgggtagt tctggcaatc tccaagtgag aaagttcctg 360 gaggctacgt tgcagtccct gtcggcaggc tggcatgttg aactggaccc attcacggcc 420 tcaaccccct tggggccact ggacttcggg aacgtggtgg ccacacttga cccaggagct 480 gcccgtcacc tcaccctcgc ctgccattat gactctaagt tcttccctcc ggggttgccc 540 ccctttgtgg gggccacaga ttcagctgtg ccctgtgccc tgcttctgga gttggtccag 600 gcccttgatg ccatgctgag cagaatcaag cagcaggcag caccggtgac cctgcagctg 660 cttttcttgg atggggagga ggcactgaag gagtggggac caaaggactc cctctatggc 720 tcccggcacc tagctcagat catggagtct ataccacaca gccctggccc caccaggatc 780 caggctattg agctctttgt cctcctcgac cttctgggag catccagtcc gatcttcttc 840 agtcacttcc ctcgcacagc ccgctggttc cagcgactga ggagcattga gaagcgcctt 900 caccggctga acctactgca gtctcacccc caggaagtga tgtacttcca acccggggag 960 ccccccggcc ctgtggaaga tgaccacatc cccttccttc gcagaggggt cccggtgctc 1020 cacctcattg ccacgccctt ccctgctgtg tggcacacac ctgctgacac cgaggccaac 1080 ctccacccac ccactgtgca taacctgagc cgcatccttg ctgtgttcct ggccgagtac 1140 ctgggactct ag 1152 <210> 9
<211> 1152
<212> DNA
<213> Bos taurus
<4 00> 9
atgccttccg ggggccgcgg gcggccccgg ctccaggtcg gggaacgcag ccttttggag 60 cgaccctcac cgcccaagcg ccgcctgata ccgcgggcac agctgttgcc ccagctgctg 120 ctggctctga cggtagcctc ggtgttctat accatttgga ggatctggca tagccagact 180 gaagagctac cgctggggcg ggagctgcgg ggccctttga tcggaagcct ccccgaagct 240 cgggtgcgga gggtagtggg gcaactggac cctcaccgtc tctggaacac tttcctgcgc 300 cctctgctgg ttgtacggac tccgggcagc ccgggcaatc tccaagtgag aaagttcctg 360 gaggctacgc tgcggacact ttcagcaggc tggcatatag aactcgactc cttcac tgcc 420 tccacacccg tggggccatt ggacttcagc aatgtggtgg ccacgctgga cccaggggct 480 gcccgccacc ttacccttgc ctgccattat gactccaagc tcttcccatc tgactcagcc 540 ccctttgtgg gggccacgga ttcggcagtg ccttgctccc tgctactgga gctggcccaa 600 gcccttgacc aggagctggg caaagccaag gagagggcag cgccaatgac cttgcagctg 660 atcttcctgg atggtgaaga ggcactgaag cagtggggac ccaaggactc gctttatggc 720 tcccggcacc tggcccagct catggagtct acaccccacg gcctgggctc caccaggatc 780 caggctattg agctctttat gcttcttgat ctcctgggag cccccaaccc gaccttctac 840 agtcacttcc ctcgcacggc ccgctggttc catcggctca ggagcattga gaagcgcctg 900 caccgtctga acctcctgca gtctcatcct tgggaagtga tgtacttcca gaccggggag 960 ccccccggct ccgtggaaga cgaccacatc ccgttcctcc gccgaggagt tcccgtgctc 1020 cacctcatcg ccacaccctt cccctctgtc tggcacacgt ccgatgactc cgaggccaac 1080 ctgcacccac ccacggtaca caacctgagc cgcatcctgg ccgtgttcct ggctgagtac 1140 ctggggctct ag 1152 <210> 10
<211> 361
<212> PRT
<213> humano
<400> 10
Met Ala Gly Gly Arg His Arg Arg Val Val Gly Thr Leu His Leu Leu 15 10 15
Leu Leu Val Ala Ala Leu Pro Trp Ala Ser Arg Gly Val Ser Pro Ser 20 25 30
Ala Ser Ala Trp Pro Glu Glu Lys Asn Tyr His Gln Pro Ala He Leu 35 40 45
Asn Ser Ser Ala Leu Arg Gln He Ala Glu Gly Thr Ser He Ser Glu 50 55 60
Met Trp Gln Asn Asp Leu Gln Pro Leu Leu He Glu Arg Tyr Pro Gly 65 70 75 80
Ser Pro Gly Ser Tyr Ala Ala Arg Gln His He Met Gln Arg He Gln 85 90 95
Arg Leu Gln Ala Asp Trp Val Leu Glu He Asp Thr Phe Leu Ser Gln 100 105 110
Thr Pro Tyr Gly Tyr Arg Ser Phe Ser Asn He He Ser Thr Leu Asn 115 120 125
Pro Thr Ala Lys Arg His Leu Val Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys 130
Tyr Phe Ser 145
Ala Val Pro
5
Lys Leu Leu
Leu Gln Leu 195
Pro Gln Asp 210
Ser Thr Pro 225
Met Asp Leu
15
Phe Pro Asn
Ala Ile Glu 275
Leu Glu Gly 290 Asp Asp His 305
Ile Pro Ser
25
Glu Asn Leu
Val Phe Val 355
<210> 11
<211> 382 <212> PRT
135
His Trp Asn Asn 150
Cys Ala Met Met 165
Ser Leu Lys Thr 180
Ile Phe Phe Asp
Ser Leu Tyr Gly 215
His Pro Pro Gly 230
Leu Val Leu Leu 245
Phe Phe Pro Asn 260
His Glu Leu His
Arg Tyr Phe Gln 295
Ile Pro Phe Leu 310
Pro Phe Pro Glu 325
Asp Glu Ser Thr 340
Leu Glu Tyr Leu
Arg Val Phe Val 155
Leu Glu Leu Ala 170
Val Ser Asp Ser 185
Gly Glu Glu Ala 200
Ser Arg His Leu
Ala Arg Gly Thr 235
Asp Leu Ile Gly
250
Ser Ala Arg Trp 265
Glu Leu Gly Leu 280
Asn Tyr Ser Tyr
Arg Arg Gly Val 315
Val Trp His Thr 330
Ile Asp Asn Leu 345 His Leu 360
140
Gly Ala Thr Asp
Arg Ala Leu Asp 175
Lys Pro Asp Leu 190
Phe Leu His Trp 205
Ala Ala Lys Met 220
Ser Gln Leu His
Ala Pro Asn Pro 255
Phe Glu Arg Leu 270
Leu Lys Asp His 285
Gly Gly Val Ile
300
Pro Val Leu His
Met Asp Asp Asn 335
Asn Lys Ile Leu 350
Ser
160
Lys
Ser
Ser
Ala
Gly
240
Thr
Gln
Ser
Gln
Leu
32 0 Glu
Gln <213> humano
<4 00> 11 Met Arg Ser I
Gly Leu Met
Val Arg Leu 35
Tyr Thr Ile
50
Gly Arg Glu
65
Leu Arg Arg
Tyr Leu Arg
Leu Gln Val 115
Gly Trp His 130
Pro Val Asp 145
Arg His Leu
Gly Ser Thr
Leu Leu Leu 195
Lys Lys Gln
210
Glu Glu Ala 225
Gly Gly Arg Gly
5
Glu Pro Leu Leu 20
Leu Pro Leu Leu
Trp Ser Gly Trp
55
Leu Arg Val Pro 70
Val Val Gly Gln 85
Pro Leu Leu Val 100
Arg Lys Phe Leu
Val Glu Leu Asp
135
Phe Gly Asn Val 150
Thr Leu Ala Cys 165
Pro Phe Val Gly 180
Glu Leu Ala Gln
Ala Ala Pro Val 215
Leu Lys Glu Trp 230
Arg Pro Arg Leu Arg 10
Pro Pro Lys Arg Arg 25
Leu Ala Leu Ala Val 40
His Arg Arg Thr Glu 60
Leu Ile Gly Ser Leu 75
Leu Asp Pro Gln Arg
90
Val Arg Thr Pro Gly 105
Glu Ala Thr Leu Arg 120
Pro Phe Thr Ala Ser
140
Val Ala Thr Leu Asp
155
His Tyr Asp Ser Lys 170
Ala Thr Asp Ser Ala 185
Ala Leu Asp Leu Glu 200
Thr Leu Gln Leu Leu 220
Gly Pro Lys Asp Ser 235
Leu Gly Glu Arg 15
Leu Leu Pro Arg 30
Gly Ser Ala Phe 45
Glu Leu Pro Leu
Pro Glu Ala Arg 80
Leu Trp Ser Thr 95
Ser Pro Gly Asn 110
Ser Leu Thr Ala 125
Thr Pro Leu Gly
Pro Arg Ala Ala 160
Leu Phe Pro Pro 175
Val Pro Cys Ala 190
Leu Ser Arg Ala 205
Phe Leu Asp Gly
Leu Tyr Gly Ser 240 Arg His Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly Pro 245 250 255
Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu Gly 260 265 270
Ala Pro Asn Pro Thr Phe Tyr Ser His Phe Pro Arg Thr Val Arg Trp 275 280 285
Phe His Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn Leu 290 295 300
Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu Pro 305 310 315 320
Phe Gly Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val 325 330 335
Pro Val Leu His Leu Ile Ser Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His Thr 340 345 350
Pro Ala Asp Thr Glu Val Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn Leu 355 360 365
Cys Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu 370 375 380
<210> 12 <211> 364 <212> PRT <213> humano <4 00> 12
Met Glu Pro Leu Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg Val Arg
1 5 10 15
Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly Ser Ala Phe Tyr Thr 20 25 30
Ile Trp Ser Gly Trp His Arg Arg Thr Glu Glu Leu Pro Leu Gly Arg 35 40 45
Glu Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu Ala Arg Leu Arg 50 55 60
Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Ser Thr Tyr Leu 65 70 75 80
Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly Asn Leu Gln 85 90 95
Val Arg Lys Phe Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ser Leu Thr Ala Gly Trp 100 105 110
His Val Glu Leu Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu Gly Pro Val 115 120 125
Asp Phe Gly Asn Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Arg Ala Ala Arg His 130 135 140
Leu Thr Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Pro Pro Gly Ser 145 150 155 160
Thr Pro Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys Ala Leu Leu 165 170 175
Leu Glu Leu Ala Gln Ala Leu Asp Leu Glu Leu Ser Arg Ala Lys Lys
180 185 190
Gln Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp Gly Glu Glu
195 200 205
Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly Ser Arg His
210 215 220
Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly Pro Thr Arg
225 230 235 240
Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu Gly Ala Pro
245 250 255
Asn Pro Thr Phe Tyr Ser His Phe Pro Arg Thr Val Arg Trp Phe His
260 265 270
Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn Leu Leu Gln
275 280 285
Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu Pro Phe Gly
290 295 300
Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val Pro Val
305 310 315 320
Leu His Leu Ile Ser Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His Thr Pro Ala 325 330 335
Asp Thr Glu Val Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn Leu Cys Arg 340 345 350
Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu 355 360
<210> 13 <211> 382 <212> PRT
<213> Macaca fascicularis <400> 13
Met Arg Ser Gly Gly Arg Gly Arg Pro Arg Leu Arg Leu Gly Glu Arg 15 10 15
Gly Val Met Glu Pro Leu Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg 20 25 30
Val Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly Ser Ala Phe 35 40 45
Tyr Thr Ile Trp Ser Gly Trp His Arg Arg Thr Glu Glu Leu Pro Leu 50 55 60
Gly Arg Glu Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu Ala Arg 65 70 75 80
Leu Arg Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Gly Thr 85 90 95
Tyr Leu Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly Asn 100 105 110
Leu Gln Val Arg Lys Phe Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ser Leu Thr Ala 115 120 125
Gly Trp His Val Glu Leu Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu Gly 130 135 140
Pro Val Asp Phe Gly Asn Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Gly Ala Ala 145 150 155 160
Arg His Leu Thr Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Pro Pro 165 170 175 Gly Ser Thr Pro Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys Ala 180 185 190
Leu Leu Leu Glu Leu Ala Gln Ala Leu Asp Leu Glu Leu Ser Arg Ala 195 200 205
Lys Glu Gln Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp Gly 210 215 220
Glu Glu Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly Ser 225 230 235 240
Arg His Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly Pro 245 250 255
Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu Gly 260 265 270
Ala Pro Asn Pro Thr Phe Tyr Ser His Phe Pro Arg Thr Val Arg Trp 275 280 285
Phe His Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn Leu 290 295 300
Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu Pro 305 310 315 320
Phe Gly Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val 325 330 335
Pro Val Leu His Leu Ile Ser Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His Thr 340 345 350
Pro Ala Asp Thr Glu Ala Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn Leu 355 360 365
Ser Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu 370 375 380
<210> 14 <211> 382 <212 > PRT <213> Macaca mulatta <400> 14
Met Arg Ser Gly Gly Arg Gly Arg Pro Arg Leu Arg Leu Gly Glu Arg 10 15
Gly Val Met Glu Pro Leu Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg 20 25 30
Val Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly Ser Ala Phe 35 40 45
Tyr Thr Ile Trp Ser Gly Trp His Arg Arg Thr Glu Glu Leu Pro Leu 50 55 60
Gly Arg Glu Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu Ala Arg 65 70 75 80
Leu Arg Arg Val VaI Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Gly Thr
85 90 95
Tyr Leu Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly Asn I00 105 110
Leu Gln Val Arg Lys Phe Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ser Leu Thr Ala 115 120 125
Gly Trp His Val Glu Leu Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu Gly 130 135 140
Pro Val Asp Phe Gly Asn Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Gly Ala Ala 145 150 155 160
Arg His Leu Thr Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Thr Pro Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys Ala 180 185 190
Leu Leu Leu Glu Leu Ala Gln Ala Leu Asp Leu Glu Leu Ser Arg Ala 195 200 205
Lys Glu Gln Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp Gly 210 215 220
Glu Glu Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly Ser 225 230 235 240
Arg His Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly Pro
245 250 255
Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu Gly 260 265 270
Ala Pro Asn Pro Thr Phe Tyr Ser His Phe Pro Arg Thr Val Arg Trp 275 280 285
Phe His Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn Leu 290 295 300
Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu Pro 305 310 315 320
Phe Gly Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val 325 330 335
Pro Val Leu His Leu Ile Ser Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His Thr 340 345 350
Pro Ala Asp Thr Glu Ala Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn Leu 355 360 365
Ser Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu 370 375 380
<210> 15 <211> 383 <212> PRT
<213> Canis familiaris <4 00> 15
Met Pro Ser Gly Gly Arg Gly Arg Ser Arg Leu Arg Leu Gly Glu Arg 15 10 15
Gly Leu Leu Glu Pro Pro Ser Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg 20 25 30
Ala His Phe Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ser Ala 35 40 45
Thr Tyr Thr Ile Trp Ser Gly Trp His His Gln Thr Glu Glu Leu Pro 50 55 60
Arg Gly Arg Glu Leu Arg Gly Arg Leu Ile Gly Ser Leu Ser Glu Ala 65 70 75 80
Arg Leu Arg Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro His Arg Leu Trp Asn 85 90 95 Thr Tyr Leu
Asn Leu Gln 115
Ala Gly Trp 130 Gly Pro Leu 145
Ala Arg His
10
Ser Glu Ser
Ala Leu Leu 195
Ala Lys Glu 210 Gly Glu Glu 225
Ser Arg His
20
Pro Thr Arg
Gly Ala Pro 275
Trp Phe His
290 Leu Leu Gln
305
Pro Pro Gly
30
Val Pro Val
Arg Pro Leu Leu 100
Val Arg Lys Phe
His Val Glu Leu 135
Asp Phe Gly Asn 150
Leu Thr Leu Ala 165
Val Pro Phe Val 180
Leu Glu Leu Ala
Gln Glu Ala Pro 215
Ala Leu Lys Glu 230
Leu Ala Gln Leu 245
Ile Gln Ala Ile 260
Asn Pro Asn Phe
Arg Leu Arg Ser 295
Ser His Pro Gln 310
Ser Val Glu Asp 325
Leu His Leu Ile 340
Val Val Arg Thr 105
Leu Glu Ala Thr 120
Asp Pro Phe Thr
Val Val Ala Thr 155
Cys His Tyr Asp 170
Gly Ala Thr Asp
185
Gln Ala Leu Asp 200
Val Thr Leu Gln
Trp Gly Pro Thr 235
Met Glu Ser Ala
250
Glu Leu Phe Met 265
Tyr Ser His Phe 280
Ile Glu Lys Arg
Glu Val Met Tyr 315
Asp His Ile Pro
330
Ser Met Pro Phe 345
Pro Gly Ser Pro 110
Leu Arg Thr Leu 125
Ala Leu Thr Pro 140
Leu Asp Pro Gly
Ser Lys Leu Phe 175
Ser Ala Val Pro 190
Arg Glu Leu Ser 205
Leu Leu Phe Leu 220
Asp Ser Leu Tyr
Pro His Ser Pro 255
Leu Leu Asp Leu
270
Pro His Thr Ala 285
Leu His Arg Met 300
Phe Gln Pro Gly
Phe Leu Arg Arg
335
Pro Ser Val Trp 350
Gly
Thr
Leu
Ala
160
Ala
Cys
Arg
Asp
Gly
240
Gly
Leu
Arg
Asn
Glu
320
Gly
His Thr Pro Asp Asp Ser Glu Ala Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn
355 360 365
Leu Ser Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu
370 375 380
<210> 16
<211> 383 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 16
Met Ser Pro Ala Ser Arg Gly Arg Ser Arg Gln Arg Leu Gly Asp Arg 15 10 15
Gly Leu Met Lys Pro Pro Ser Leu Ser Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg 20 25 30
Val Gln Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ala 35 40 45
Phe Tyr Ile Val Trp Asn Ser Trp His Pro Gly Val Glu Glu Val Ser 50 55 60
Arg Ser Arg Asp Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Ser Glu Ala 65 70 75 80
Lys Leu Arg Leu Val Val Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Gly
85 90 95
Thr Phe Leu Arg Pro Leu Leu Ile Val Arg Pro Pro Gly Ser Pro Gly 100 105 110
Asn Leu Gln Val Arg Lys Phe Leu Glu Ala Thr Leu Gln Ser Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Trp His Val Glu Leu Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu
130 135 140
Gly Pro Leu Asp Phe Gly Asn Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Gly Ala
145 150 155 160
Ala Arg His Leu Thr Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys Phe Phe Pro
165 170 175
Pro Gly Leu Pro Pro Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys 180 185 190
Ala Leu Leu Leu Glu Leu Val Gln Ala Leu Asp Val Met Leu Ser Arg 195 200 205
Ile Lys Gln Gln Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp
210 215 220
Gly Glu Glu Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly 225 230 235 240
Ser Arg His Leu Ala Gln Ile Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly 245 250 255
Pro Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Val Leu Leu Asp Leu Leu 260 265 270
Gly Ala Pro Ser Pro Ile Phe Phe Ser His Phe Pro Arg Thr Ala Arg 275 280 285
Trp Phe Gln Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn 290 295 300
Leu Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu 305 310 315 320
Pro Pro Gly Pro Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly 325 330 335
Val Pro Val Leu His Leu Ile Ala Met Pro Phe Pro Ala Val Trp His 340 345 350
Thr Pro Ala Asp Thr Glu Ala Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn 355 360 365
Leu Ser Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu 370 375 380
<210> 17 <211> 383 <212> PRT <213> Mus musculus
<4 00> 17
Met Ser Pro Gly Ser Arg Gly Arg Pro Arg Gln Arg Leu Glu Asp Arg 15 10 15 Gly Leu Met
Val Gln Phe 35
Phe Tyr Ile 50
Arg Ser Arg 65
Lys Leu Arg
10
Thr Phe Leu
Asn Leu Gln
H5
Ala Gly Trp 130
Gly Pro Leu 145
Ala Arg His
20
Pro Gly Leu
Ala Leu Leu 195
Ile Lys Gln 210 Gly Glu Glu
225
Ser Arg His
30
Pro Thr Arg
Lys Pro Pro Ser Leu 20
Leu Pro Leu Leu Leu 40
Val Trp Asn Ser Trp 55
Asp Leu Arg Val Pro 70
Leu Val Val Gly Gln 85
Arg Pro Leu Leu Ile 100
Val Arg Lys Phe Leu 120
His Val Glu Leu Asp 135
Asp Phe Gly Asn Val 150
Leu Thr Leu Ala Cys 165
Pro Pro Phe Val Gly 180
Leu Glu Leu Val Gln 200
Gln Ala Ala Pro Val
215
Ala Leu Lys Glu Trp 230
Leu Ala Gln Ile Met 245
Ile Gln Ala Ile Glu
260
Ser Lys Arg Arg
25
Leu Ala Leu Ala
His Pro Gly Val 60
Leu Ile Gly Ser 75
Leu Asp Pro Gln
90
Val Arg Pro Pro 105
Glu Ala Thr Leu
Pro Phe Thr Ala 140
Val Ala Thr Leu 155
His Tyr Asp Ser
170
Ala Thr Asp Ser
185
Ala Leu Asp Ala
Thr Leu Gln Leu 220
Gly Pro Lys Asp 235
Glu Ser Ile Pro 250
Leu Phe Val Leu 265
Leu Leu Pro Arg 30
Met Gly Leu Ala 45
Glu Glu Met Ser
Leu Ser Glu Ala 80
Arg Leu Trp Gly
95
Gly Ser Ser Gly 110
Gln Ser Leu Ser 125
Ser Thr Pro Leu
Asp Pro Gly Ala 160
Lys Phe Phe Pro 175
Ala Val Pro Cys 190
Met Leu Ser Arg 205
Leu Phe Leu Asp
Ser Leu Tyr Gly 240
His Ser Pro Gly
255
Leu Asp Leu Leu
270 Gly Ala Ser Ser Pro Ile Phe Phe Ser His Phe Pro Arg Thr Ala Arg 275 280 285
Trp Phe Gln Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn 290 295 300
Leu Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu 305 310 315 320
Pro Pro Gly Pro Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly 325 330 335
Val Pro Val Leu His Leu Ile Ala Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His 340 345 350
Thr Pro Ala Asp Thr Giu Aia Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn 355 360 365
Leu Ser Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu 370 375 380
<210> 18
<211> 383 <212> PRT <213> Bos taurus <4 00> 18
Met Pro Ser Gly Gly Arg Gly Arg Pro Arg Leu Gln Val Gly Glu Arg 15 10 15
Ser Leu Leu Glu Arg Pro Ser Pro Pro Lys Arg Arg Leu Ile Pro Arg 20 25 30
Ala Gln Leu Leu Pro Gln Leu Leu Leu Ala Leu Thr Val Ala Ser Val 35 40 45
Phe Tyr Thr Ile Trp Arg Ile Trp His Ser Gln Thr Glu Glu Leu Pro 50 55 60
Leu Gly Arg Glu Leu Arg Gly Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu Ala 65 70 75 80
Arg Val Arg Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro His Arg Leu Trp Asn
85 90 95
Thr Phe Leu Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly Asn Leu Gln 115
Ala Gly Trp
130
Gly Pro Leu 145
Ala Arg His
Ser Asp Ser
Ser Leu Leu 195
Ala Lys Glu
210
Gly Glu Glu 225
Ser Arg His
Ser Thr Arg
Gly Ala Pro 275
Trp Phe His
290
Leu Leu Gln 305
Pro Pro Gly Val Pro Val Thr Ser Asp
100
Val Arg Lys Phe
His Ile Glu Leu 135
Asp Phe Ser Asn
150
Leu Thr Leu Ala 165
Ala Pro Phe Val
180
Leu Glu Leu Ala
Arg Ala Ala Pro
215
Ala Leu Lys Gln 230
Leu Ala Gln Leu 245
Ile Gln Ala Ile 260
Asn Pro Thr Phe
Arg Leu Arg Ser 295
Ser His Pro Trp
310
Ser Val Glu Asp 325
Leu His Leu Ile 340
Asp Ser Glu Ala
105
Leu Glu Ala Thr 120
Asp Ser Phe Thr
Val Val Ala Thr 155
Cys His Tyr Asp 170
Gly Ala Thr Asp 185
Gln Ala Leu Asp 200
Met Thr Leu Gln
Trp Gly Pro Lys 235
Met Glu Ser Thr 250
Glu Leu Phe Met 265
Tyr Ser His Phe 280
Ile Glu Lys Arg
Glu Val Met Tyr
315
Asp His Ile Pro 330
Ala Thr Pro Phe 345
Asn Leu His Pro
110
Leu Arg Thr Leu 125
Ala Ser Thr Pro 140
Leu Asp Pro Gly
Ser Lys Leu Phe 175
Ser Ala Val Pro 190
Gln Glu Leu Gly
205
Leu Ile Phe Leu 220
Asp Ser Leu Tyr
Pro His Gly Leu 255
Leu Leu Asp Leu 270
Pro Arg Thr Ala 285
Leu His Arg Leu 300
Phe Gln Thr Gly
Phe Leu Arg Arg 335
Pro Ser Val Trp 350
Pro Thr Val His
Ser
Val
Ala
160
Pro
Cys
Lys
Asp
Gly
240
Gly
Leu
Arg
Asn
Glu
320
Gly
His
Asn 120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
12 60
1320
1380
1440
155
355 360 365
Leu Ser Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu 370 375 380
<210> 19 <211> 1457 <212> DNA <213> humano <4 00> 19
gtctggtaca ggtttcaggg caaagcggcc ctgcggctgg gggaacgtgg cctcatggag ccgcgggttc ggctcttgcc tctgttgctg atttggagcg gctggcaccg caggactgag ccattgatcg gaagcctccc cgaagcccgg cagcgtctct ggagcactta tctgcgcccc ggaaatctcc aagtcagaaa gttcctggag cacgtggagc tggatccctt cacagcctca gtggtggcca cactggaccc aagggctgcc tcgaagctct tcccacccgg atcgaccccc tgtgccctgc tgctggagct ggcccaagca caggcagccc cggtgaccct gcaactgctc tggggaccca aggactccct: ttacggttcc cctcacagcc ccggccccac caggatccag ctgggagccc ccaatcccac cttctacagc cggctgagga gcattgagaa gcgtctgcac gaagtgatgt acttccaacc cggggagccc ttcctccgca gaggggtacc cgtgctccat cacacccctg cggacaccga ggtcaatctc attctcgctg tgttcctggc tgaatacctg gagaggactg tgagagagaa ggtcccagcg tagggtgtgc tggtttgtcc ttttcatacc accttctttc ttttgattgt ctcaagctgc tgggatgaca gccagaggaa taagaacttg atgcgttccg ggggccgcgg gcgaccccgc ccactcttgc cgccgaagcg ccgcctgcta gcgctggccg tgggctcggc gttctacacc gagctgccgc tgggccggga gctgcgggtc ctgcggaggg tggtgggaca actggatcca ctgctggttg tgcgaacccc gggcagcccg gccacgctgc ggtccctgac agcaggttgg acacccctgg ggccagtgga ctttggcaat cgtcacctca cccttgcctg ccattatgac tttgtagggg ccacggattc ggctgtgccc cttgacctgg agctgagcag ggccaaaaaa ttcttggatg gtgaagaggc gctgaaggag cggcacctgg cccagctcat ggagtctata gctattgagc tctttatgct tcttgatctc cacttccctc gcacggtccg ctggttccat cgtttgaacc tgctgcagtc tcatccccag tttggctctg tggaagacga ccacatcccc ctcatctcca cgcccttccc tgctgtctgg cacccaccca cggtacacaa cttgtgccgc gggctctagc gtgcttggcc aatgactgtg ggggccagtg aagctcaggc aggatctgcc tttgtctcct aattgtgcta caattggaag cacccttcaa ggacagggaa gagaccactg ctccctcccc agaggtaaac acttggtcca 60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1088
156
aaggtttgca gggacca <210> 20 <211> 1088 <212> DNA <213> humano <400> 20
agcggccatg cgttccgggg gccgcgggcg accccgcctg cggctggggg aacgtggcct catggagcca ctcttgccgc cgaagcgccg cctgctaccg cgggttcggc tcttgcctct gttgctggcg ctggccgtgg gctcggcgtt ctacaccatt tggagcggct ggcaccgcag gactgaggag ctgccgctgg gccgggagct gcgggtccca ttgatcggaa gcctccccga agcccggctg cggagggtgg tgggacaact ggatccacag cgtctctgga gcacttatct gcgccccctg ctggttgtgc gaaccccggg cagcccggga aatctccaag tcagaaaggc agccccggtg accctgcaac tgctcttctt ggatggtgaa gaggcgctga aggagtgggg acccaaggac tccctttacg gttcccggca cctggcccag ctcatggagt ctatacctca cagccccggc cccaccagga tccaggctat tgagctcttt atgcttcttg atctcctggg agcccccaat cccaccttct acagccactt ccctcgcacg gtccgctggt tccatcggct gaggagcatt gagaagcgtc tgcaccgttt gaacctgctg cagtctcatc cccaggaagt gatgtacttc caacccgggg agccctttgg ctctgtggaa gacgaccaca tccccttcct ccgcagaggg gtacccgtgc tccatctcat ctccacgccc ttccctgctg tctggcacac ccctgcggac accgaggtca atctccaccc acccacggta cacaacttgt gc.cgcattct cgctgtgttc ctggctgaat acctggggct ctagcgtgct tggccaatga ctgtggagag gactgtgaga gagaaggtcc cagcgggggc cagtgaagct caggcaggat ctgcctaggg tgtgctggtt tgtccttttc atacctttgt ctcctaattg tgctacaatt ggaagacctt ctttcttttg attgtctcaa gctgccaccc ttcaaggaca gggaagagac cactgtggga tgacagcc <210> 21 <211> 481 <212> PRT <213> humano <400> 21
Val Trp Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Ala Ala Met Arg Ser Gly Gly Arg 10 15 Gly Arg Pro Arg Leu Arg Leu Gly Glu Arg Gly Leu Met Glu Pro 20 25 30
Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg Val Arg Leu Leu Pro 35 40 45
Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly Ser Ala Phe Tyr Thr Ile Trp Ser 50 55 60
Trp His Arg Arg Thr Glu Glu Leu Pro Leu Gly Arg Glu Leu Arg 65 70 75
Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu Ala Arg Leu Arg Arg Val Val 85 90 95
Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Ser Thr Tyr Leu Arg Pro Leu 100 105 110
Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly Asn Leu Gln Val Arg Lys 115 120 125
Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ser Leu Thr Ala Gly Trp His Val Glu 130 135 140
Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu Gly Pro Val Asp Phe Gly 145 150 155
Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Arg Ala Ala Arg His Leu Thr Leu 165 170 175
Cys His Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Pro Pro Gly Ser Thr Pro Phe 180 185 190
Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys Ala Leu Leu Leu Glu Leu 195 200 205
Gln Ala Leu Asp Leu Glu Leu Ser Arg Ala Lys Lys Gln Ala Ala 210 215 220
Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp Gly Glu Glu Ala Leu Lys 225 230 235
Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly Ser Arg His Leu Ala Gln 245 250 255
Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly Pro Thr Arg Ile Gln Ala 260 265 270
Leu
Leu
Gly
Val
80
Gly
Leu
Phe
Leu
Asn
160
Ala
Val
Ala
Pro
Glu
240
Leu
Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu Gly Ala Pro Asn Pro Thr 275 280 285
Tyr Ser His Phe Pro Arg Thr Val Arg Trp Phe His Arg Leu Arg 290 295 300
Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn Leu Leu Gln Ser His Pro 305 310 315
Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu Pro Phe Gly Ser Val Glu 325 330 335
Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val Pro Val Leu His Leu 340 345 350
Ser Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His Thr Pro Ala Asp Thr Glu 355 360 3 65
Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn Leu Cys Arg Ile Leu Ala 370 375 380
Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu Arg Ala Trp Pro Met Thr Val 385 390 395
Arg Thr Val Arg Glu Lys Val Pro Ala Gly Ala Ser Glu Ala Gln 405 410 415
Gly Ser Ala Gly Val Leu Val Cys Pro Phe His Thr Phe Val Ser 420 425 430
Cys Tyr Asn Trp Lys Thr Phe Phe Leu Leu Ile Val Ser Ser Cys 435 440 445
Pro Ser Arg Thr Gly Lys Arg Pro Leu Trp Asp Asp Ser Gln Arg 450 455 460
Lys Asn Leu Leu Pro Pro Gln Arg Thr Leu Gly Pro Lys Val Cys 465 470 475
Asp <210> 22 <211> 359 <212> PRT
<213> humano <4 00> 22
Phe
Ser
Gln
320
Asp
Ile
Val
Val
Glu
400
Ala
Leu
His
Asn
Arg
480 Ala Ala Met Arg Ser Gly Gly Arg Gly Arg Pro Arg Leu Arg Leu 15 10 15
Glu Arg Gly Leu Met Glu Pro Leu Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu 20 25 30
Pro Arg Val Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly 35 40 45
Ala Phe Tyr Thr Ile Trp Ser Gly Trp His Arg Arg Thr Glu Glu 50 55 60
Pro Leu Gly Arg Glu Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro 65 70 75
Ala Arg Leu Arg Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu 85 90 95
Ser Thr Tyr Leu Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser 100 105 110
Gly Asn Leu Gln Val Arg Lys Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu 115 120 125
Phe Leu Asp Gly Glu Glu Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp 130 135 140
Leu Tyr Gly Ser Arg His Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Ile Pro 145 150 155
Ser Pro Gly Pro Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu 165 170 175
Asp Leu Leu Gly Ala Pro Asn Pro Thr Phe Tyr Ser His Phe Pro 180 185 190
Thr Val Arg Trp Phe His Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu 195 200 205
Arg Leu Asn Leu Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe 210 215 220
Pro Gly Glu Pro Phe Gly Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe 225 230 235
Arg Arg Gly Val Pro Val Leu His Leu Ile Ser Thr Pro Phe Pro 245 250 255
Gly
Leu
Ser
Leu
Glu
80
Trp
Pro
Leu
Ser
His
160
Leu
Arg
His
Gln
Leu
240
Ala Val Trp His Thr Pro Ala Asp Thr Glu Val Asn Leu His Pro Pro Thr 260 265 270
Val His Asn Leu Cys Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu 275 280 285
Gly Leu Arg Ala Trp Pro Met Thr Val Glu Arg Thr Val Arg Glu Lys 290 295 300
Val Pro Ala Gly Ala Ser Glu Ala Gln Ala Gly Ser Ala Gly Val Leu 305 310 315 320
Val Cys Pro Phe His Thr Phe Val Ser Leu Cys Tyr Asn Trp Lys Thr 325 330 335
Phe Phe Leu Leu Ile Val Ser Ser Cys His Pro Ser Arg Thr Gly Lys 340 345 350
Arg Pro Leu Trp Asp Asp Ser 355
<210> 23
<211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 23
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 15 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 24 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 15 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser 20 25 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 25 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 25 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 1 5 10 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 26 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 26 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 1 5 10 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 30
30
15
30
15
30
Met Val Gly Gly Val Val 35
<210> 27 <211> 32 <212> PRT <213> seqüência artificial <22 0> <22 3> pept ideo sintético <400> 27
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser 15 10 15
Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 20 25 30
<210> 28 <211> 30 <212> PRT
<213> seqüência artificial <220>
<223> peptideo sintético <4 00> 28
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser 15 10 15
Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 20 25 30
<210> 29 <211> 40 <212> PRT <213> humano <220>
<221> MOD_RES <222> (1) .. (1)
<223> ACIDO PIRROLIDONA CARB0XÍLICO <400> 29
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val 15 10 15
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu 20 25 30
Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40
<210> 30 <211> 38
<212> PRT
<213> humano <220>
<221> MOD^RES
<222> (1)..(1)
<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO
<4 00> 30
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
1 5 10 15
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu 20 25 30
Met Val Gly Gly Val Val 35
<210> 31
<211> 32 <212> PRT
<213> humano <220>
<221> MOD__RES
<222> (1)..(1)
<223> ACIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO
<400> 31
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser
1 5 10 15
Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 20 25 30
<210> 32 <211> 30 <212> PRT
<213> humano <220> <221> MOD_RES <222> (I) . . (I)
<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO <400> 32
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser 15 10 15
Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 20 25 30
<210> 33 <211> 34
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 33
Glu Ala Ser Asn Cys Phe Ala Ile Arg His Phe Glu Asn Lys Phe Ala
1 5 10 15
Val Glu Thr Leu Ile Cys Ser Arg Thr Val Lys Lys Asn Ile Ile Glu
20 25 30
Glu Arg <210> 34
<211> 34
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Glu Ala Ser Asn Cys Phe Ala Ile Arg His Phe Glu Asn Lys Phe Ala
1 5 10 15
Val Glu Thr Leu Ile Cys Ser Arg Thr Val Lys Lys Asn Ile Ile Glu 20 25 30
Glu Arg
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens <220> <221> MOD RES <222> (17)..(17) <223> AMIDAÇÃO <4 00> 35 Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp 15 10 15
Phe
<210> 36 <211> 34
<212> PRT <213> humano <4 00> 36
Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys
1 5 10 15
Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met 20 25 30
Asp Phe <210> 37
<211> 34
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<22 0>
<221> M0D_RES
<222> (1) . . (1)
<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO <4 00> 37
Glu Ala Ser Asn Cys Phe Ala Ile Arg His Phe Glu Asn Lys Phe Ala 15 10 15
Val Glu Thr Leu Ile Cys Ser Arg Thr Val Lys Lys Asn Ile Ile Glu
20 25 30
Glu Arg <210> 38 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD RES <222> (1) · · (1) <223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO <400> 38 Glu Ala Ser Asn Cys Phe Ala Ile Arg ] 1 5 Val Glu Thr Leu Ile Cys Ser Arg Thr ' 20 25 Glu Arg <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> humano <220> <221> MOD RES <222> (D · · (D <223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO <400> 39 Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu ι 1 5 Phe <210> 40 <211> 34 <212> PRT <213> humano <220> 15
30
15 10
15
20
25
30
<221> MOD_RES <222> (I) . . (I)
<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO <400> 40
Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys 10 15
Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met 20 25 30
Asp Phe
<210> 41 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Gln Leu Tyr Glu Asn 1 5 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD RES <222> (10)..(10) <223> AMIDAÇÃO <400> 42 Gln His Trp Ser Tyr 1 5 <210> 43 <211> 97 <212> PRT <2 13> Homo sapiens <400> 43 10
10 Gln Pro Lys VaI Pro Glu Trp Val Asn Thr Pro Ser Thr Cys Cys 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Pro Arg Arg Leu Val Val Gly Tyr 20 25 30 Lys Ala Leu Asn Cys His Leu Pro Ala Ile Ile Phe Val Thr Lys 35 40 45 Asn Arg Glu Val Cys Thr Asn Pro Asn Asp Asp Trp Val Gln Glu 50 55 60 Ile Lys Asp Pro Asn Leu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Leu Ser 65 70 75 Val Lys Ile Ile Thr Ala Lys Asn Gly Gln Pro Gln Leu Leu Asn 85 90 95 Gln <210> 44 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val 1 5 10 15 Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile 20 25 30 Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg 35 40 45 Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser 50 55 60 Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro 65 7 0 7 5
<210> 45
<211> 76
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 45
Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe 15 10 15
Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile 20 25 30
45
Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys 35 40 Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val 50 55 60 Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 46 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Gln Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu Cys Cys Leu Val 1 5 10 Gln Ile Pro Gln Lys Phe Ile Val Asp Tyr Ser Glu 20 25 Cys Pro Lys Pro Gly Val Ile Leu Leu Thr Lys Arg 35 40 Cys Ala Asp Pro Asn Lys Lys Trp Val Gln Lys Tyr 15
20 25 30
45
50 55 60
Lys Leu Asn Ala 65
<210> 47 <211> 373 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 47
Gln His His Gly Val Thr Lys Cys Asn Ile Thr Cys Ser Lys Met
Thr
Thr
Ala
Met
Trp
Gln
Ile
Leu
Thr 10 15
Ser Lys Ile Pro Val Ala Leu Leu Ile His Tyr Gln Gln Asn Gln Ala 20 25 30
Ser Cys Gly Lys Arg Ala Ile Ile Leu Glu Thr Arg Gln His Arg Leu 35 40 45
Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Gln Trp Val Lys Asp Ala Met Gln His 50 55 60
Leu Asp Arg Gln Ala Ala Ala Leu Thr Arg Asn Gly Gly Thr Phe Glu 65 70 75 80
Lys Gln Ile Gly Glu Val Lys Pro Arg Thr Thr Pro Ala Ala Gly Gly
85 90 95
Met Asp Glu Ser Val Val Leu Glu Pro Glu Ala Thr Gly Glu Ser Ser 100 105 HO
Ser Leu Glu Pro Thr Pro Ser Ser Gln Glu Ala Gln Arg Ala Leu Gly 115 120 125
Thr Ser Pro Glu Leu Pro Thr Gly Val Thr Gly Ser Ser Gly Thr Arg 130 135 140
Leu Pro Pro Thr Pro Lys Ala Gln Asp Gly Gly Pro Val Gly Thr Glu 145 150 155 160
Leu Phe Arg Val Pro Pro Val Ser Thr Ala Ala Thr Trp Gln Ser Ser
165 170 175
Ala Pro His Gln Pro Gly Pro Ser Leu Trp Ala Glu Ala Lys Thr Ser 180 185 190
Glu Ala Pro Ser Thr Gln Asp Pro Ser Thr Gln Ala Ser Thr Ala Ser 195 200 205
Ser Pro Ala Pro Glu Glu Asn Ala Pro Ser Glu Gly Gln Arg Val Trp 210 215 220
Gly Gln Gly Gln Ser Pro Arg Pro Glu Asn Ser Leu Glu Arg Glu Glu 225 230 235 240
Met Gly Pro Val Pro Ala His Thr Asp Ala Phe Gln Asp Trp Gly Pro
245 250 255
Gly Ser Met Ala His Val Ser Val Val Pro Val Ser Ser Glu Gly Thr 260 265 270
Pro Ser Arg Glu Pro Val Ala Ser Gly Ser Trp Thr Pro Lys Ala 275 280 285
Glu Pro Ile His Ala Thr Met Asp Pro Gln Arg Leu Gly Val Leu 290 295 300
Thr Pro Val Pro Asp Ala Gln Ala Ala Thr Arg Arg Gln Ala Val 305 310 315
Leu Leu Ala Phe Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Gly Val Ala Met 325 330 335
Thr Tyr Gln Ser Leu Gln Gly Cys Pro Arg Lys Met Ala Gly Glu 340 345 350
Ala Glu Gly Leu Arg Tyr Ile Pro Arg Ser Cys Gly Ser Asn Ser 355 360 365
Val Leu Val Pro Val
370
<210> 48 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 48
Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe 15 10 15
Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr 20 25 30
Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu 35 40 45
Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe 50 55 60
Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu 65 70 75
<210 > 49 <211> 33
Glu
Ile
Gly
320
Phe
Met
Tyr
Ile
Thr
Asp
Met <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Gln Pro Leu Pro Asp Cys Cys Arg Gln Lys Thr Cys Ser Cys Arg Leu
10 15
y Asn His Ala Ala Gly Ile Leu Thr 25 30
I 5 Tyr Glu Leu Leu His Gly Ala 20 Leu <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe 1 5 <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> seqüência artificial <220> <223> peptideo sintético <4 00> 51 Gln Tyr Asn Ala Asp 1 5 <210> 52 <211> 5 <212> PRT <213> seqüência artificial <220> <223> peptideo sintético <220> <221> MOD RES 10 <222> (I) .. (I)
<223> ÁCIDO PIRROLIDONA CARBOXÍLICO <400> 52
Gln Tyr Asn Ala Asp
1 5 <210> 53 <211> 26 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> nucleotideo sintético <4 00> 53 ggtctacacc atttggagcg gctggc <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> nucleotideo sintético <4 00> 54 gggttggaag tacatcactt cctgggc <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> nucleotideo sintético <400> 55 accatgcgtt ccgggggccg cggg <210> 56 <211 > 27 <212> DNA <213> seqüência artificial <22 0>
<223> nucleotideo sintético
<400> 56
acgctagagc cccaggtatt cagccag 27
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> nucleotideo sintético
<4 00> 57
atatatgaat tcatgcgttc cgggggccgc 30
<210> 58
<211> 33
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> nucleotideo sintético
<400> 58
atatatgaat tcatggagcc actcttgccg ccg 33
<210> 59
<211> 33
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> nucleotideo sintético
<4 00> 59
atatatgtcg acgagcccca ggtattcagc cag 33
<210> 60
<211> 44
<212> DNA <213> seqüência artificial <220>
<223> nucleotideo sintético <4 00> 60
atatactagt gatgacgacg acaagttcta caccatttgg agcg <210> 61 <211> 49 <212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> nucleotideo sintético <400> 61
tatagaattc ctagtgatgg tgatggtgat ggagccccag gtattcagc <210> 62 <211> 28 <212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR <4 00> 62
atatgaattc ttctacacca tttggagc <210> 63 <211> 49 <212> DNA
<213> seqüência artificial <22 0>
<223> iniciador de PCR <4 00> 63
atatgaattc catcaccatc accatcactt ctacaccatt tggagcggc <210> 64 <211> 35 <212> DNA <213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 64
atatatgcgg ccgcctagag ccccaggtat tcagc
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <22 0>
<223> iniciador de PCR
<400> 65
ccaggatcca ggctattgag
<210> 66
<211> 56
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 66
atatatgcgg ccgcctagtg atggtgatgg tgatggagcc ccaggtattc agccag
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> iniciador de PCR
<400> 67
ttccacaggg ccggggggc
<210> 68
<211> 18
<212> DNA <213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 68
atgagtcccg ggagccgc
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 69
ctagagtccc aggtactc
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 70
agttcctgcc cctgctgctg
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 71
atcaagaggc accaaccaac
<210> 72
<211> 19
<212> DNA <213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 72
ctggataata tttccatag
<210> 73
<211> 19
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 73
acagctggga atctgagtc
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 74
gagcagaata gcttccgggc g
<210> 75
<211> 33
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 75
ctgcgggtcc cattgaacgg aagcctcccc gaa
<210> 76
<211> 33
<212> DNA <213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 76
ttcggggagg cttccgttca atgggacccg cag 33
<210> 77
<211> 33
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 77
acggtacaca acttggcccg cattctcgct gtg 33
<210> 78
<211> 33
<212> DNA
<213> seqüência artificial <22 0>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 78
cacagcgaga atgcgggcca agttgtgtac cgt 33
<210> 79 <211> 362 <212> PRT <213> Mus musculus <4 00> 79
Met Ala Gly Ser Glu Asp Lys Leu Val Val Gly Thr Leu His Leu Leu 10 15
Leu Leu Gln Ala Thr Val Leu Ser Leu Thr Ala Gly Asn Leu Ser Leu
20 25 30
Val Ser Ala Ala Trp Thr Gln Glu Lys Asn His His Gln Pro Ala His 40 45 Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Gln Val Ala Glu Gly Thr Ser Ile Ser
50 55 60
Glu Met Trp Gln Asn Asp Leu Arg Pro Leu Leu Ile Glu Arg Tyr Pro 65 70 75 80
Gly Ser Pro Gly Ser Tyr Ser Ala Arg Gln His Ile Met Gln Arg Ile
85 90 95
Gln Arg Leu Gln Ala Glu Trp Val Val Glu Val Asp Thr Phe Leu Ser
100 105 110
Arg Thr Pro Tyr Gly Tyr Arg Ser Phe Ser Asn Ile Ile Ser Thr Leu
115 120 125
Asn Pro Glu Ala Lys Arg His Leu Val Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser
130 135 140
Lys Tyr Phe Pro Arg Trp Asp Ser Arg Val Phe Val Gly Ala Thr Asp 145 150 155 160
Ser Ala Val Pro Cys Ala Met Met Leu Glu Leu Ala Arg Ala Leu Asp
165 170 175
Lys Lys Leu His Ser Leu Lys Asp Val Ser Gly Ser Lys Pro Asp Leu
180 185 190
Ser Leu Arg Leu Ile Phe Phe Asp Gly Glu Glu Ala Phe His His Trp
195 200 205
Ser Pro Gln Asp Ser Leu Tyr Gly Ser Arg His Leu Ala Gln Lys Met
210 215 220
Ala Ser Ser Pro His Pro Pro Gly Ser Arg Gly Thr Asn Gln Leu Asp 225 230 235 240
Gly Met Asp Leu Leu Val Leu Leu Asp Leu Ile Gly Ala Ala Asn Pro
245 250 255
Thr Phe Pro Asn Phe Phe Pro Lys Thr Thr Arg Trp Phe Asn Arg Leu
260 265 270
Gln Ala Ile Glu Lys Glu Leu Tyr Glu Leu Gly Leu Leu Lys Asp His
275 280 285
Ser Leu Glu Arg Lys Tyr Phe Gln Asn Phe Gly Tyr Gly Asn Ile Ile 290 295 300 Gln Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Lys Gly Val Pro Val Leu His 305 310 315 320
Leu Ile Ala Ser Pro Phe Pro Glu Val Trp His Thr Met Asp Asp Asn
325 330 335
Glu Glu Asn Leu His Ala Ser Thr Ile Asp Asn Leu Asn Lys Ile Ile
340 345 350
Gln Val Phe Val Leu Glu Tyr Leu His Leu
355 360
<210> 80 <211> 284 <212> PRT
<213> Strepromyces griseus <400> 80
Ala Pro Asp Ile Pro Leu Ala Asn Val Lys Ala His Leu Thr Gln Leu 10 15
Ser Thr Ile Ala Ala Asn Asn Gly Gly Asn Arg Ala His Gly Arg Pro
25 30
Gly Tyr Lys Ala Ser Val Asp Tyr Val Lys Ala Lys Leu Asp Ala Ala
40 45
Gly Tyr Thr Thr Thr Leu Gln Gln Phe Thr Ser Gly Gly Ala Thr Gly
50 55 60
Tyr Asn Leu Ile Ala Asn Trp Pro Gly Gly Asp Pro Asn Lys Val Leu 65 70 75 80
Met Ala Gly Ala His Leu Asp Ser Val Ser Ser Gly Ala Gly Ile Asn
85 90 95
Asp Asn Gly Ser Gly Ser Ala Ala Val Leu Glu Thr Ala Leu Ala Val
100 105 HO
Ser Arg Ala Gly Tyr Gln Pro Asp Lys His Leu Arg Phe Ala Trp Trp
115 120 125
Gly Ala Glu Glu Leu Gly Leu Ile Gly Ser Lys Phe Tyr Val Asn Asn
130 135 140
Leu Pro Ser Ala Asp Arg Ser Lys Leu Ala Gly Tyr Leu Asn Phe Asp 145 150 155 160
Met Ile Gly Ser Pro Asn Pro Gly Tyr Phe Val Tyr Asp Asp Asp Pro
165 170 175
Val Ile Glu Lys Thr Phe Lys Asn Tyr Phe Ala Gly Leu Asn Val Pro
180 185 190
Thr Glu Ile Glu Thr Glu Gly Asp Gly Arg Ser Asp His Ala Pro Phe
195 200 205
Lys Asn Val Gly Val Pro Val Gly Gly Leu Phe Thr Gly Ala Gly Tyr
210 215 220
Thr Lys Ser Ala Ala Gln Ala Gln Lys Trp Gly Gly Thr Ala Gly Gln 225 230 235 240
Ala Phe Asp Arg Cys Tyr His Ser Ser Cys Asp Ser Leu Ser Asn Ile
245 250 255
Asn Asp Thr Ala Leu Asp Arg Asn Ser Asp Ala Ala Ala His Ala Ile
260 265 270
Trp Thr Leu Ser Ser Gly Thr Gly Glu Pro Pro Thr
275 280
<210> 81 <211> 299 <212> PRT
<213> Vibrio proteolyticus <4 00> 81
Met Pro Pro Ile Thr Gln Gln Ala Thr Val Thr Ala Trp Leu Pro Gln 10 15
Val Asp Ala Ser Gln Ile Thr Gly Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Phe
25 30
Thr Asn Arg Phe Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Ala Gln Ala Ser Asp Trp
40 45
Ile Ala Ser Glu Trp Gln Ala Leu Ser Ala Ser Leu Pro Asn Ala Ser
50 55 60
Val Lys Gln Val Ser His Ser Gly Tyr Asn Gln Lys Ser Val Val Met 65 70 75 80 Thr Ile Thr Gly
His Leu Asp Ser 100
Pro Gly Ala Asp 115
Ile Arg Val Leu 130
Phe Met Ala Tyr 145
Leu Ala Asn Gln
Gln Leu Asp Met 180
Ile Thr Asp Tyr 195
Met Asp Glu Tyr 210
Tyr Ala Cys Ser 225
Ala Met Pro Phe
Thr Thr Gln Asp 260
Lys Lys Phe Thr 275
Ala Thr Gly Asp
290 <210> 82 <211> 30 <212> DNA <213> Sequêncií
Ser Glu Ala Pro 85
Thr Ile Gly Ser
Asp Asp Ala Ser 120
Ser Glu Asn Asn 135
Ala Ala Glu Glu 150
Tyr Lys Ser Glu 165
Thr Asn Tyr Lys
Thr Asp Ser Asn 200
Leu Pro Ser Leu 215
Asp His Ala Ser 230
Glu Ser Lys Phe 245
Thr Leu Ala Asn
Gln Leu Gly Leu 280
Thr Pro Thr Pro 295
artificial
Asp Glu Trp Ile 90
His Thr Asn Glu 105
Gly Ile Ala Ala
Phe Gln Pro Lys 140
Val Gly Leu Arg 155
Gly Lys Asn Val 170
Gly Ser Ala Gln 185
Phe Thr Gln Tyr
Thr Tyr Gly Phe 220
Trp His Asn Ala
235
Asn Asp Tyr Asn
250
Ser Asp Pro Thr 265
Ala Tyr Ala Ile Gly Asn Gln
Val Ile Gly Gly 95
Gln Ser Val Ala 110
Val Thr Glu Val 125
Arg Ser Ile Ala
Gly Ser Gln Asp 160
Val Ser Ala Leu 175
Asp Val Val Phe 190
Leu Thr Gln Leu 205
Asp Thr Cys Gly
Gly Tyr Pro Ala 240
Pro Arg Ile His 255
Gly Ser His Ala 270
Glu Met Gly Ser 285 <220>
<223> Iniciador de clonagem
<4 00> 82
atatataagc ttatggcagg cggaagacac 30
<210> 83
<211> 31
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Iniciador de clonagem
<4 00> 83
atatgcggcc gcttacaaat gaagatattc c 31
<210> 84
<211> 35
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 84
atatatgcgg ccgcctagag ccccaggtat tcagc 35
<210> 85
<211> 31
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 85
atatctcgag tccatcgcca ccatggtgag c 31
<210> 86
<211> 31
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 86
atatctcgag ttacttgtac agctcgtcca t 31
<210> 87
<211> 41
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 87
atatgcggcc gcatgtcgac gctccaaatg gtgtagaacg c 41
<210> 88
<211> 57
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 88
atatgcggcc gcttacttgt catcgtcatc cttgtaatcc aaatgaagat attccaa 57
<210> 89
<211> 57
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 89
atatgcggcc gcctacttgt catcgtcatc cttgtaatcg agccccaggt attcagc 57
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220> <223> iniciador de PCR
<4 00> 90
gcctccagca tgaaagtctc
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> CAGATCTCCTTGGCCACAAT
<4 00> 91
cagatctcct tggccacaat
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 92
atgaaagcct ctgcagcact
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 93
tggctactgg tggtccttct
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <22 0> <223> iniciador de PCR
<400> 94
tcacctgctg ctttaacgtg
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 95
atccctgacc catctctcct
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 96
atctccttgc agaggctgaa
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 97
agaagaggag gccagaggag
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificiai <220> <223> iniciador de PCR
<400> 98
cacagaaatg gccttgtgaa
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 99
ccaagcaggt cataggtggt
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 100
tcctttcatc ctggaacctg
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 101
cgcctcttct gtttcacctc
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <22 0> <223> iniciador de PCR
<4 00> 102
aagcgctgtt tgccagttat
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 103
cacacgtgag gcgctattta
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <22 0>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 104
gtcaacagat cctccccaga
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <22 0>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 105
cagcatttct gcctttgtga
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220> <223> iniciador de PCR
<4 00> 106
aggtggagag cctgaggaat
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 107
ctcgggtcct acttgtcagc
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 108
aagcgaggtt ctcgttctga
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 109
tgacctcttg ctctccctgt
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220> <223> iniciador de PCR
<400> 110
cttcaagctc tcctgctgct
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <22 0>
<223> iniciador de PCR
<400> 111
cgaccctgac ttcctggtta
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 112
gctcatcggc tgttggtatt
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<400> 113
ataagcaggt ggagcattgg
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <22 0> <223> iniciador de PCR
<400> 114
atgcttcgga aactggacat
<210> 115
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<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 115
atggttcgat gcagctttct
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
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tacggcgtaa tcctggaaac
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <22 0>
<223> iniciador de PCR
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attgtgcatg ctgctttgag
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<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência artificial <22 0> <223> iniciador de PCR
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ccgaaacaca gtggaaggtt
<210> 119
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<212> DNA
<213> seqüência artificial <22 0>
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tctgtgaagg tgtgcaggag
<210> 120
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<212> DNA
<213> seqüência artificial <22 0>
<223> iniciador de PCR
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ggttcctttc ttccctccag
<210> 121
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<212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> iniciador de PCR
<4 00> 121
aaccaaagcc accagtgttc

Claims (44)

1. Ácido nucléico isolado que codifica (a) um polipeptídeo, que inclui a seqüência de aminoácido de uma das SEQ ID NOS: 11 a 18, ou (b) um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos cer- ca de 75% similar a esta e exibe a mesma função biológica; ou que é uma variante de divisão alternativa de uma das SEQ ID NOS: 2 a 9; ou que é uma sonda compreendendo pelo menos 14 nucleotídeos contíguos do dito ácido nucléico que codifica (a) ou (b); ou que é complementar a qualquer um dos antecedentes.
2. Ácido nucléico isolado de acordo com a reivindicação 1, que é DNA ou RNA.
3. Ácido nucléico isolado de acordo com a reivindicação 1, que é uma transcrição de DNA que inclui o comprimento inteiro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2 a 9 ou que é complementar à região de codificação in- teira de uma das SEQ ID NOS: 2 a 9.
4. Oligonucleotídeo antissentido direcionado contra o DNA como definido na reivindicação 3.
5. Ácido nucléico isolado da reivindicação 1 que é uma transcri- ção de RNA, que inclui o comprimento inteiro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2 a 9.
6. Ácido nucléico isolado de acordo com a reivindicação 1, que é uma variante de divisão alternativa de uma das SEQ ID NOS: 2 a 9.
7. Variante de divisão de acordo com a reivindicação 6, corres- pondendo à SEQ ID NOS: 19 ou 20.
8. Polipeptídeo codificado por um ácido nucléico como definido na reivindicação 6 ou 7.
9. Ácido nucléico isolado de acordo com a reivindicação 1, que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos cerca de 85% similar a uma das SEQ ID NOS: 11 a 18.
10. Ácido nucléico isolado de acordo com a reivindicação 1, que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos cerca de 95% similar a uma das SEQ ID NOS: 11 a 18.
11. Ácido nucléico isolado de acordo com a reivindicação 1, que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 50% de identidade com uma das SEQ ID NOS: 11 a 18.
12. Sonda de ácido nucléico como definido na reivindicação 1, que compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos de uma das SEQ ID NOS: 2 a 9.
13. Sonda de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 12, correspondendo a qualquer uma das SEQ ID NOS: 53 a 61.
14. Molécula de polinucleotídeo recombinante isolada compre- endendo o ácido nucléico como definido na reivindicação 1, mais elementos de controle de expansão operavelmente ligados com o dito ácido nucléico para dirigir a expressão do mesmo.
15. Vetor de expressão compreendendo o ácido nucléico como definido na reivindicação 1, que codifica um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido inteira exposta em qualquer uma das SEQ ID NOS: 11 a 18 operavelmente ligado a um promotor, o dito vetor de expressão estando pre- sente em uma célula hospedeira compatível.
16. Célula hospedeira mamífera, de inseto ou bacteriana que foi geneticamente engenheirada pela inserção de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, que codifica para pelo menos a porção de proteína madu- ra de uma das seqüências de aminoácido das SEQ ID NOS: 11 a 18.
17. Processo para produzir um polipeptídeo que inclui a porção de proteína madura de uma das SEQ ID NOS: 11 a 18, cujo processo com- preende cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 16, sob condições suficientes para a produção do dito polipeptídeo.
18. Processo de acordo com a reivindicação 17, em que o dito polipeptídeo é expressado na superfície da dita célula e também inclui a eta- pa de restabelecer o polipeptídeo ou um fragmento do mesmo da cultura.
19. Polipeptídeo que pode ser opcionalmente glicosilado, e que (a) tem a seqüência de aminoácido de uma proteína madura exposta em qualquer uma das SEQ ID NOS: 11 a 18; (b) tem a seqüência de aminoácido de uma proteína madura tendo pelo menos cerca de 75% de similaridade a uma das proteínas maduras de (a) e que exibe a mesma função biológica; (c) tem a seqüência de aminoácido de uma proteína madura tendo pelo me- nos cerca de 50% de identidade com uma proteína madura de qualquer das SEQ ID NOS: 11 a 18; ou (d) é um fragmento imunologicamente reativo de (a).
20. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 19, que é uma proteína madura tendo pelo menos cerca de 85% de similaridade a uma pro- teína madura de (a).
21. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 19, que é uma proteína madura tendo pelo menos cerca de 95% de similaridade a uma pro- teína madura de (a).
22. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 19, tendo a se- qüência de aminoácido da proteína madura de uma das SEQ ID NOS: 11 a 18, ou é um fragmento da mesma que exibe a mesma função biológica que a respectiva proteína madura.
23. Anticorpo que reconhece um polipeptídeo ou um fragmento como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 22.
24. Anticorpo de acordo com a reivindicação 23, que reconhece um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido de uma das SEQ ID NOS: 11 a 18.
25. Método de triar para um composto capaz de inibir a atividade enzimática de pelo menos uma proteína madura como definido na reivindi- cação 19, cujo método compreende incubar a dita proteína madura e um substrato adequado para a dita proteína madura na presença de um ou mais compostos de teste ou sais dos mesmos, medir a atividade enzimática da dita proteína madura, comparar a dita atividade com atividade comparável determinada na ausência de um composto de teste, e selecionar o composto ou compostos de teste que reduzem a atividade enzimática.
26. Método de triar para um inibidor de QC seletivo que não ini- be a atividade enzimática de pelo menos uma proteína madura como defini- do na reivindicação 19, cujo método compreende incubar a dita proteína madura e um substrato adequado na presença de um ou mais inibidores ou sais dos mesmos de QC1 medir a atividade enzimática da dita proteína ma- dura, comparar a dita atividade com a atividade comparável determinada na ausência do inibidor de QC, e selecionar um composto que não reduz a ati- vidade enzimática da dita proteína madura.
27. Método de triar para um inibidor seletivo de QPCTL que não inibe a atividade enzimática de QC cujo método compreende incubar a dita QC na presença de um ou mais inibidores ou sais dos mesmos de uma QPCTL, medir a atividade enzimática de QC1 comparar a dita atividade com atividade comparável determinada na ausência do inibidor de QPCTL, e se- lecionar um composto que não reduz a atividade enzimática da dita proteína de QPCTL.
28. Antagonista de QPCTL que inibe a função biológica de uma das ditas proteínas maduras como definido em qualquer uma das reivindica- ções 19 a 22.
29. Antagonista de QPCTL de acordo com a reivindicação 28, que é um inibidor de molécula pequena.
30. Inibidor como definido na reivindicação 29, que foi identifica- do pelo método de triagem de acordo com a reivindicação 25 ou 27.
31. Inibidor de QC seletivo que foi identificado pelo método de triagem de acordo com a reivindicação 26.
32. Composição farmacêutica para administração parenteral, enteral ou oral, compreendendo pelo menos um inibidor de QPCTL, ou um sal farmacêutico aceitável do mesmo, opcionalmente em combinação com veículos e/ou excipientes habituais.
33. Uso de uma composição farmacêutica como definido na rei- vindicação 32, para a preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma doença selecionada de mal de Alzheimer, Demência bri- tânica familial, Demência dinamarquesa familial, Síndrome de Down, doença de Huntington, doença de Kennedy, doença de úlcera, câncer duodenal com ou sem infecções de Helicobacter pylori, câncer colorretal, síndrome de Zol- liger-EIlison, câncer gástrico com ou sem infecções de Helicobacter pylori, condições psicóticas patogênicas, esquizofrenia, infertilidade, neoplasia, respostas inflamatórias do hospedeiro, câncer, metástase maligno, melano- ma, psoríase, artrite reumatóide, aterosclerose, respostas humorais e imu- nes mediadas por célula prejudicadas, processos de adesão e migração de leucócitos no endotélio, aporte alimentício prejudicado, sono-vigília prejudi- cados, regulação homeostática prejudicada do metabolismo de energia, fun- ção autonômica prejudicada, equilíbrio hormonal prejudicado ou regulação prejudicada dos fluidos corporais, esclerose múltipla, a síndrome de Guillain- Barré e poliradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica.
34. Uso de um inibidor de QPCTL, ou um sal farmacêutico acei- tável do mesmo, para a preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma doença selecionada da mal de Alzheimer, Demência britânica familial, Demência dinamarquesa familial, Síndrome de Down, do- ença de Huntington, doença de Kennedy, doença de úlcera, câncer duode- nal com ou sem infecções de Helicobacter pylori, câncer colorretal, síndrome de Zolliger-Ellison, câncer gástrico com ou sem infecções de Helicobaeter pylori, condições psicóticas patogênicas, esquizofrenia, infertilidade, neopla- sia, respostas inflamatórias do hospedeiro, câncer, metástase maligno, me- lanoma, psoríase, artrite reumatóide, aterosclerose, respostas imunes e hu- morais mediadas por célula prejudicadas, processos de adesão e migração de leucócitos no endotélio, aporte alimentício prejudicado, sono-vigília preju- dicados, regulação homeostática prejudicada do metabolismo de energia, função autonômica prejudicada, equilíbrio hormonal prejudicado ou regula- ção prejudicada dos fluidos corporais, esclerose múltipla, a síndrome de Guillain-Barré e polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crônica.
35. Composição farmacêutica ou o uso como definido em qual- quer uma das reivindicações 32 a 34, em que o inibidor de QPCTL é um ini- bidor competitivo.
36. Composição farmacêutica ou o uso como definido em qual- quer uma das reivindicações 32 a 35, em que o inibidor de QPCTL liga ao íon de metal ligado ao sítio ativo da QPCTL.
37. Composição farmacêutica ou o uso como definido em qual- quer uma das reivindicações 32 a 36, em que a QPCTL é selecionada de uma das SEQ ID NOS: 11 a 18, 21 e 22.
38. Composição farmacêutica ou o uso como definido na reivin- dicação 37, em que a QPCTL é selecionada de uma das SEQ ID NOS: 11 e 12.
39. Composição farmacêutica ou o uso como definido em qual- quer uma das reivindicações 32 a 38, em que o inibidor como definido em qualquer uma das reivindicações 28 a 30, é usado.
40. Ensaio de diagnóstico, compreendendo um inibidor de QPC- TL.
41. Método de diagnosticar qualquer uma das doenças e/ou condições como definidas na reivindicação 33 ou 34, compreendendo as etapas de - colher uma amostra de um sujeito que está suspeito de estar afligido com a dita doença e/ou condição, - contatar a dita amostra com um inibidor de uma ciclotransfera- se de peptídeo de glutaminil, e - determinar se ou não o dito sujeito está afligido pela dita doen- ça e/ou condição.
42. Método de acordo com a reivindicação 41, em que o dito su- jeito é um ser humano.
43. Método de acordo com a reivindicação 41 ou 42, em que a dita amostra é uma amostra de sangue, uma amostra de soro, uma amostra de licor cérebro-espinhal ou uma amostra de urina.
44. Kit de diagnóstico para realizar o método como definido nas reivindicações 41 a 43, compreendendo como meios de detecção o ensaio de diagnóstico de acordo com a reivindicação 40 e um meio de determina- ção.
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