EA028135B1 - Мутанты c-raf, придающие резистентность к ингибиторам raf - Google Patents

Мутанты c-raf, придающие резистентность к ингибиторам raf Download PDF

Info

Publication number
EA028135B1
EA028135B1 EA201491780A EA201491780A EA028135B1 EA 028135 B1 EA028135 B1 EA 028135B1 EA 201491780 A EA201491780 A EA 201491780A EA 201491780 A EA201491780 A EA 201491780A EA 028135 B1 EA028135 B1 EA 028135B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
car
polypeptide
cancer
inhibitor
nucleic acid
Prior art date
Application number
EA201491780A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491780A1 (ru
Inventor
Кэролайн Эмери
Раджи Энтони
Леви А. Гаррауэй
Original Assignee
Дана-Фарбер Кэнсер Инститьют, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дана-Фарбер Кэнсер Инститьют, Инк. filed Critical Дана-Фарбер Кэнсер Инститьют, Инк.
Publication of EA201491780A1 publication Critical patent/EA201491780A1/ru
Publication of EA028135B1 publication Critical patent/EA028135B1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11001—Non-specific serine/threonine protein kinase (2.7.11.1), i.e. casein kinase or checkpoint kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к нуклеиновым кислотам и белкам, имеющим мутантную последовательность C-RAF, и способам идентификации пациентов, имеющих рак, которые, вероятно, получат пользу от комбинированной терапии, и способам лечения.

Description

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США № 61/616999, поданной 28го марта 2012 г., и № 61/708372, поданной 1-го октября 2012 г., которые полностью включены в данный документ путем ссылки.
Финансированное правительством исследование или разработка
Это изобретение было осуществлено при правительственной поддержке в виде федерального гранта под номером ΌΡ2 ΘΌ002750, выданного Национальным институтом здравоохранения США. Правительство имеет некоторые права на это изобретение.
Предпосылки создания изобретения
Онкогенные мутации в серин/треониновой-киназе В-КАР (также известной как ВКАР) обнаруживаются в 50-70% злокачественных меланом ГОг-паек, Н. е! а1., №йиге 417, 949-954 (2002)). Меланома считается самой опасной формой рака кожи, и в 2012 г. по данным Национального института рака было выявлено 72250 новых случаев, которые могут привести к смерти примерно 9180 человек в Соединенных Штатах Америки. Доклинические исследования показали, что присутствие мутации У600Е в В-КАР предсказывает зависимость меланомы от сигнального каскада митоген-активированной протеинкиназы (МАРК) (НоеШсй, К. Ρ. е! а1., Сапсег Ке8. 69, 3042-3051 (2009); МсОеттой, и. е! а1., Ргос. Ν;·ιΐ1 Асаб. δει. И8А 104, 19936-19941 (2007); δοϊίΐ, Ό. В. е! а1. ВКАР ти!айоп ргебю!к кепкШуйу !о МЕК ίηΠίΗίΙίοη. Ыа1иге 439, 358-362 (2006); Аап, Р. Т. е! а1., Се11 116, 855-867 (2004); Ае11Ъгоск, С. е! а1., Сапсег Кек. 64, 23382342 (2004)) - наблюдение, которое было подтверждено успехом ингибиторов КАР или МЕК в клинических испытаниях (Р1айет1у, К. Т. е! а1., N. Епд1. 1. Меб. 363, 809-819 (2010); 1пРап!е, 1. К. е! а1., 1. С1ш. Опсо1. 28 (кирр1.), 2503 (2010); Зсй^ати, О. К. е! а1., 1. С1ш. Опсо1. 27 (кирр1.), 3513 (2009)).
Недавно РЭЛ одобрило ингибитор КаР Вемурафениб (РЬХ4032) (Оиттет е! а1., 2008; 1пРап!е е! а1., 2010; 1окерй е! а1., 2010; Р1айейу е! а1., 2010)). Однако клинические ответы на противораковые терапевтические препараты направленного действия часто искажаются в результате возникающей бе поуо или приобретенной резистентности. (Епде1тап, 1. А. е! а1., 8шепсе 316, 1039-1043 (2007); Оогге, М. Е. е! а1., §аепсе 293, 876-880 (2001); НешпсЬ, М. С. е! а1., 1. С1ш. Опсо1. 24, 4764-4774 (2006); ОаиЪ, Н., 8ресй!, К. & ИПпсй, А. №йиге Кеу. Эгид Эйсоу. 3, 1001-1010 (2004)). Недавно в клинической практике и в условиях ш уйго было показано, что это явление обусловлено либо сверхэкспрессией параллельного сигнального модуля (СКАР, СОТ) (Моп!ади! е! а1., Сапсег Кек 68:4853-4861 (2008); 1ойаппеккеп е! а1., №!ите 468: 968972 (2010)), либо активацией параллельного сигнального пути (РООРКЪ, 1ОР-1К) (№-1/апап е! а1., №йиге 468: 973-977 (2010); УШапиеуа е! а1., Сапсег Се11 18: 683-695 (2010)), либо амплификацией находящейся выше по сигнальному каскаду мишени (ВКАР) (δΐιί е! а1., №й Соттип 3:724 (2012)), либо удалением мишени (р61ВКАР) (Роийкакок е! а1., №йиге 480: 387-390 (2011)), либо путем появления активирующих мутаций в находящейся ниже по сигнальному каскаду мишени или самом белке-мишени (Мек) (Етегу е! а1., Ргос №!1 Асаб δοΐ И8А 106: 20411-20416 (2009); \\ад1е е! а1., ГСО 29: 3085-3096 (2011)). Соответственно все еще необходимы: новые способы идентификации механизмов резистентности, которые позволяют выявить мишени, восприимчивые к терапевтическому вмешательству, для эффективных долгосрочных стратегий лечения; новые способы выявления пациентов, которые, скорее всего, получат пользу от стратегий лечения; и способы лечения пациентов с применением эффективных долгосрочных стратегий лечения.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к развитию резистентности к терапевтическим агентам при лечении рака и к идентификации мишеней, которые придают резистентность к противораковой терапии. Настоящее изобретение относится также к идентификации параллельных мишеней лекарственных препаратов для усиления эффективной долгосрочной стратегии лечения и к идентификации пациентов, которые получат пользу от такого лечения.
Один аспект относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид С-КАР, имеющий активность С-КАР. Мутантный полипептид С-КАР включает по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с диким типом полипептида С-КАР, содержащим 5ЕО ГО NО: 2, причем замена по меньшей мере одной аминокислоты придает резистентность клетке, экспрессирующей мутантный полипептид КАР, к одному или нескольким ингибиторам КАР.
Другой аспект относится к экспрессионному вектору. Экспрессионный вектор включает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантный полипептид С-КАР, имеющий активность С-КАР, причем мутантный полипептид С-КАР включает по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с диким типом полипептида С-КАР, содержащим 5ЕО ГО NО: 2, и замена по меньшей мере одной аминокислоты придает резистентность клетке, экспрессирующей мутантный полипептид КАР, к одному или нескольким ингибиторам КАР.
Другой аспект относится к клетке-хозяину. Клетка-хозяин включает в себя экспрессионный вектор.
Другой аспект относится к выделенному мутантному полипептиду С-КАР, имеющему активность С-КАР. Мутантный полипептид С-КАР включает по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с диким типом полипептида С-КАР, содержащим 5ЕО ГО NО: 2, и замена по меньшей мере одной аминокислоты придает резистентность клетке, экспрессирующей мутантный полипептид КАР, к
- 1 028135 одному или нескольким ингибиторам КАР.
Другой аспект относится к препарату антител. Препарат антител специфически связывается с выделенным мутантным полипептидом С-КАР по настоящему изобретению.
Еще один аспект относится к способу лечения субъекта, имеющего рак. Способ включает в себя выделение нуклеиновой кислоты из раковых клеток пациента и анализ по меньшей мере участка молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид С-КАР, на наличие одной или нескольких мутаций в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид С-КАР, которые меняют идентичность аминокислотного остатка в одной или нескольких аминокислотах кодируемого полипептида С-КАР по сравнению с диким типом полипептида С-КАР в одной или нескольких позициях, выбранных из группы, состоящей из 104Е, 2578, 261Р, 356С, 3610, 4278, 447Ό, 469М, 478Е и 554К. Способ также включает в себя введение субъекту эффективного количества ингибитора КАР и эффективного количества второго ингибитора, когда молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотиды, которые изменяют аминокислотный остаток в одной или нескольких аминокислотах кодируемого полипептида С-КАР по сравнению с полипептидом С-КАР дикого типа.
Другой аспект относится к способу идентификации субъекта, имеющего рак, который вероятно получит пользу от лечения с использованием комбинированной терапии ингибитором КАР и вторым ингибитором. Способ включает в себя выделение нуклеиновой кислоты из раковых клеток пациента и анализ, по меньшей мере, участка молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид С-КАР. Наличие одного или нескольких нуклеотидов, которые меняют идентичность аминокислотного остатка в одной или нескольких аминокислотах кодируемого мутантного полипептида С-КАР относительно аминокислоты в одной или нескольких позициях полипептида С-КАР дикого типа в одной или нескольких аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из 104Е, 2578, 261Р, 3560, 3610, 4278, 447Ό, 478Е, 469М и 554К, указывает на необходимость лечения субъекта с использованием ингибитора КАР и второго ингибитора.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показаны мутантные аллели С-КАР в клетках А375 (ВКАРУ600Е), резистентных к ингибитору КАР, РЬХ4720.
(А) Показана средняя вариантная оценка потенциальных резистентных мутаций по всей последовательности, кодирующей С-КАР, выявленных при воздействии на панель мутантов ингибитора РЬХ4720. Указаны соответствующие аминокислотные замены для часто встречающихся (имеющих высокую оценку) мутаций (>2%). (В) Слева: показана кристаллическая структура киназного домена С-КАР (остатки 340-618; серый цвет) (ΡΌΒ код: 30МУ), включая типичные резистентные мутанты С-КАР (линии) вместе с заполняющей пространство моделью связанного РЬХ4720. Также показаны ЭРО-мотив и Р-петля. Справа: структура С-КАР повернута на 90°, чтобы показать остаток К401 на поверхности раздела в димере (структуры собраны с помощью РуМОЬ). (С) Доменная структура С-КАР, на которой представлены СК (консервативная область), ΡΒΌ (Как-связывающий домен) и СРП (богатый цистеином домен) и показано расположение резистентных мутаций в С-КАР (звездочки) и трех остатков серина, важных для регулирования С-КАР (кружки).
На фиг. 2 показана функциональная характеристика резистентных мутантов С-КАР.
(А) Клетки А375, экспрессирующие С-КАР (^Т) и С-КАР (идентифицированные аллели), обрабатывали ингибитором КАР, РЬХ4720, в разных дозировках (0,08, 0,4, 2, 5 и 10 мкМ) в течение 90 мин. На иммуноблоте показаны рЕгк1/2, рМек1/2, С-КАР. α-тубулин использовали в качестве контроля нанесения белка. (В) Клетки А375, экспрессирующие высоко резистентные мутанты С-КАР, обрабатывали 2 мкМ РЬХ4720 в течение 16 ч. Показаны уровни рМек1/2, рЕгк1/2, МЕК, 8259 С-КАР, 8338 С-КАР, 8621 С-КАР и актина. (С) Кривые ингибирования роста А375 и резистентных аллелей С-КАР в ответ на РЬХ4720 и (Ό) Вемурафениб. (Е) Клетки А375, экспрессирующие высоко резистентные мутанты С-КАР, обрабатывали 1 мкМ ингибитором МЕК, А2И6244, в течение 16 ч. Показаны уровни рМек1/2, рЕгк1/2, Мек, 8259 С-КАР, 8338 С-КАР, 8621 С-КАР и актина. (Р) Кривые ингибирования роста А375 и резистентных аллелей С-КАР в ответ на А2И6244 и (О) Мек-О8К 1202121.
На фиг. 3 показано, что резистентные мутанты С-КАР более сильно связываются с В-КАР.
(А) Из клеток 293/Т, экспрессирующих резистентные аллели С-КАР, и (В) клеток А375, экспрессирующих резистентные аллели С-КАР, иммунопреципитировали тотальный С-КАР. Уровни связавшихся белков (В-КАР и 14-3-3) оценивали с помощью иммуноблоттинга. Для исходного лизата клеток (нижние панели) показаны 14-3-3, В-КАР, С-КАР, рМек1/2, рЕгк1/2, МЕК, актин и 8259 С-КАР, 8338 С-КАР и 8621 С-КАР (верхние правые панели). Результаты являются типичными для более чем двух независимых экспериментов.
На фиг. 4 показана биохимическая характеристика резистентных аллелей С-КАР с использованием (8)-метил 1-(4-(3-(5-хлор-2-фтор-3-(метилсульфонамидо)фенил)-1-изопропил-1Н-пиразол-4-ил)пиримидин-2-иламино)пропан-2-илкарбамата.
(А) На иммуноблоте представлены уровни рМек1/2, рЕгк1/2, МЕК, ЕКК и С-КАР в клетках А375, экспрессирующих резистентные аллели С-КАР, в ответ на 16-часовую обработку 1 мкМ РЬХ4720, (8)метил 1-(4-(3-(5-хлор-2-фтор-3-(метилсульфонамидо)фенил)-1-изопропил-1Н-пиразол-4-ил)пиримидин- 2 028135
2-иламино)пропан-2-илкарбаматом и ΆΖΌ6244. Актин использовали в качестве контроля нанесения белка. (В) Кривые ингибирования роста А375 и резистентных аллелей С-КАР в ответ на РЬХ4720; (С) - (8)метил 1-(4-(3-(5-хлор-2-фтор-3-(метилсульфонамидо)фенил)-1-изопропил-1Н-пиразол-4-ил)пиримидин2-иламино)пропан-2-илкарбамат; и (Ό) - ΑΖΌ6244.
На фиг. 5 показано, что резистентные мутанты С-КАР придают устойчивость к Вемурафенибу (РБХ4032).
(А) Кривые ингибирования роста А375 и резистентных аллелей С-КАР в ответ на Вемурафениб (РБХ4032). (В) Киназная активность С-КАР в клеточных экстрактах А375, экспрессирующих \УТ (дикий тип), мутанты 8257Р, Р261Т и О361А белка С-КАР в присутствии и в отсутствие Вемурафениба в течение 16 ч. На иммуноблоте представлены рМек1/2, рЕгк1/2, Мек, Егк и актин. Результаты являются типичными для трех независимых экспериментов. (С) Кривые ингибирования роста А375 и резистентных аллелей С-КАР в ответ на РЬХ4720, (Ό) - ΑΖ^6244 и (Е) - РЬХ4720 и ΑΖ^6244.
На фиг. 6 показана гомодимеризация и киназная активность резистентных мутантов С-КАР.
(А) Клетки 293Т, совместно экспрессирующие Н18/У5-меченые и Р1ад-меченные резистентные мутанты С-КАР в течение 48 ч, иммунопреципитировали на никеле (см. раздел Способы), чтобы осадить Ηίδ-меченный С-КАР, и Р1ад-меченный С-КАР оценивали с помощью иммуноблоттинга. Исходный лизат также оценивали с помощью антител, узнающих Р1ад-С-КАР, У5-С-КАР, тотальный С-КАР, р-МЕК, рЕКК и тотальный ЕКК. (В) Клетки 293Т, совместно экспрессирующие Н18/У5-меченые и Р1ад-меченные резистентные мутанты С-КАР, обрабатывали или носителем (ИМ8О), или 2 мкМ Вемурафенибом в течение 1 ч, а Н18/У5-меченый С-КАР иммунопреципитировали, как в (А) выше. Иммуноблоттинг исходных лизатов проводили с использованием антител, узнающих С-КАР (8338), р-МЕК, р-ЕКК и актин (контроль нанесения). (С) Киназную активность С-КАР ίη νίΐτο измеряли в клеточных экстрактах, полученных из клеток 293Т, транзиентно экспрессирующих РЬАО-меченный пустой вектор (С), С-КАР дикого типа (^Т) и варианты С-КАР, несущие резистентные мутации 8257Р, Р261Т, О361А и Е478К. Анализы проводили в присутствии или в отсутствие 2 мкМ Вемурафениба (см. раздел Способы). Иммуноблоттинг исходных лизатов проводили с использованием антител, узнающих р-МЕК1/2, р-ЕКК1/2, тотальную МЕК, тотальную ЕКК и актин. (Ό) Киназную активность С-КАР ίη νίΐτο измеряли в клеточных экстрактах, полученных из клеток А375 (В-КАР^00Е) (С) и А375, стабильно экспрессирующих СКАР дикого типа (^Т) и варианты С-КАР, несущие резистентные мутации 8257Р, Р261Т и О361А, в присутствии и отсутствие 2 мкМ Вемурафениба. Исследования с помощью иммуноблоттинга проводили на исходных лизатах с использованием антител, узнающих р-МЕК1/2, р-ЕКК1/2, тотальную МЕК, тотальную ЕКК и актин. Все результаты типичны для трех независимых экспериментов.
На фиг. 7 показана гетеродимеризация и способность резистентных мутантов С-КАР связываться с 14-3-3.
(А) Клетки 293/Т, транзиентно экспрессирующие указанные резистентные мутанты С-КАР в отсутствие (-) или в присутствии (+) 2 мкМ Вемурафениба в течение 1 ч, иммунопреципитировали с антителами на С-КАР, и оценивали уровни связанных белков (В-КАР и 14-3-3ζ) (верхние панели) с помощью иммуноблоттинга. В исходном лизате (нижние панели) показаны 14-3-3ζ, В-КАР, С-КАР, рМек1/2, рЕгк1/2, Мек, 8338 С-КАР и актин. Результаты являются типичными для более чем двух независимых экспериментов. (В) Клетки А375, стабильно экспрессирующие указанные резистентные мутанты С-КАР в присутствии и в отсутствие 2 мкМ Вемурафениба в течение 16 ч, иммунопреципитировали с антителами на С-КАР, и оценивали уровни связанных белков (В-КАР и 14-3-3ζ) (верхние панели) с помощью иммуноблоттинга. Иммуноблоттинг исходного лизата проводили так же, как на фиг. 7А. Результаты являются типичным для более чем двух независимых экспериментов.
На фиг. 8 показано, что резистентным мутантам С-КАР требуется димеризация для участия в МЕК/ЕКК-сигнальном каскаде. (А) Конструкции, экспрессирующие либо Р1ад-меченную С-КАР дикого типа, либо указанные резистентные мутанты С-КАР в отсутствие (слева) или в присутствии (справа) в неспособного к димеризации мутанта К401Н (показан розовым цветом), экспрессировали в клетках 2 93Т. Иммуноблоттинг лизатов проводили с помощью антител, узнающих р-МЕК, р-ЕКК, тотальную МЕК или тотальную С-КАР. (В) Клетки 293/Т, экспрессирующие Н18-меченые резистентные мутанты СКАР отдельно и совместно с неспособным к димеризации мутантом (показан розовым цветом), культивировали в отсутствие или в присутствии Вемурафениба (2 мкМ, 1 ч). Иммунопреципитацию проводили с использованием никелевых шариков, и уровни Р1ад-меченой С-КАР оценивали с помощью иммуноблоттинга. Также показан иммуноблоттинг исходных лизатов с использованием антител, узнающих Р1адС-КАР, У5-С-КАР, тотальную С-КАР, р-МЕК, р-ЕКК, 8338-С-КАР и актин.
На фиг. 9 показаны биохимические характеристики резистентных аллелей С-КАР.
(А) Сравнение уровней рМек/рЕгк с использованием клеток А375, экспрессирующих С-КАР, содержащую различные резистентные аллели из панели мутантов С-КАР, полученной случайном мутагенезом. Тубулин был включен в качестве положительного контроля. (В) Клетки А375, экспрессирующие либо С-КАР дикого типа, либо резистентные аллели С-КАР, обрабатывали ингибитором Как, РЬХ4720, в течение 90 мин в указанных дозах. Иммуноблоттинг проводили с антителами на р-ЕКК, р-МЕК, тоталь- 3 028135 ную С-КАР. Тубулин использовали в качестве контроля нанесения белка.
На фиг. 10 показаны гомодимеризация и киназная активность.
(А) Клетки 293/Т, совместно экспрессирующие Шз/У5-меченые резистентные мутанты С-КАР и Р1ад-меченный \¥Т С-КАР (дикого типа), иммунопреципитировали через 48 ч на гистидин, и уровень взаимодействия с Р1ад-меченной С-КАР оценивали иммуноблоттингом. В исходном лизате представлены Р1ад-С-КАР, У5-С-КАР, С-КаР, рМек, рЕгк и Егк. (В) Клетки 293/Т трансфецировали неспособным к димеризации мутантом С-КАР К401Н и мутантом по контролирующему треонину Τ421Ν, и чувствительность Мек/Егк детектировали в присутствии Вемурафениба (2 мкМ) через 1 ч. Т421Н использовали в качестве отрицательного контроля, а О361А использовали в качестве положительного контроля.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к развитию резистентности к терапевтическим агентам при лечении рака и к идентификации мишеней, которые придают резистентность к противораковой терапии. Настоящее изобретение относится также к идентификации параллельных терапевтических мишеней для усиления эффективной долгосрочной стратегии лечения и к идентификации пациентов, которые получат пользу от такого лечения.
В практике настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иное, обычные методики молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, клеточной биологии и рекомбинантных ДНК, которые известны специалистам в данной области техники. См., например, 8атЬгоок, Ргйзсй апб Матабз, МОЬЕСиЬАК СЕОМХС: А ЬАВОКАТОКУ ΜΆΝΕΆΙ.. (последнее издание); СИККЕЭТ РКОТОСОЬ8 ΙΝ МОЬЕСиЬАК ВЮЬООУ (Р. М. Аи8иЬе1 е! а1. ебз., (последнее издание)); серии изданий МЕТНОЭ8 ΙΝ Е\'/¥\1ОЕОС.¥ (Аеабешк Рге55, 1пс.); РСК 2: А РКАСПСАЬ АРРКОАСН (последнее издание); Л\Т1ВО1)1Е¥ А ЬАВОКАТОКУ МАХЕАЕ апб АММАЕ СЕЬЬ СиЬТиКЕ (К. I. Ргезйпеу, еб. (1987)). ЭХА С1оп1пд: А Ргас!юа1 АрргоасЬ, νο1. I & II (Ό. С1оуег, еб.); ОПдопис1еоОбе 8уп1Ьез1з (Ν. Сай, еб., последнее издание); №с1ею Ааб НуЬпб1/абоп (В. Натез & 8. Шддшз, ебз., последнее издание); Тгапзспрбоп апб Тгап81абоп (В. Натез & 8. Нщдиъ. ебз., последнее издание); Рипбатеп!а1 УЬо1о§у, 2пб Ебйюп, νο1. I & II (В. Ν. Р1е1бз апб Ό. М. Ктре, ебз.).
Каскад митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК) является критическим внутриклеточным сигнальным путем, который регулирует передачу сигнала в ответ на различные внеклеточные стимулы, в том числе факторы роста, цитокины и протоонкогены. Активация этого пути приводит к активации транскрипционных факторов и к изменениям в экспрессии генов, которые в конечном итоге приводят к изменениям в клеточных функциях, включая пролиферацию клеток, регуляцию клеточного цикла, выживание клеток, ангиогенез и клеточную миграцию. Классический сигнальный каскад МАРК инициируется рецепторными тирозинкиназами на клеточной поверхности, однако МАРК-каскад способны активировать многие другие молекулы на клеточной поверхности, в том числе интегрины, гетеротримерные С-белки и рецепторы цитокинов.
Связывание лиганда с рецептором на клеточной поверхности, например, рецепторной тирозинкиназой, как правило, приводит к фосфорилированию рецептора. Адаптерный белок СгЬ2 связывается с фосфорилированным внутриклеточным доменом активированного рецептора, и это связывание привлекает факторы обмена гуаниновых нуклеотидов, включая 8О8-1 и СОС25, к клеточной мембране. Эти факторы обмена гуаниновых нуклеотидов взаимодействуют с ГТФазой Каз и активируют ее. Стандартные изоформы Каз включают К-Каз, Ν-Каз, Н-Каз и другие. После активации Каз, серин/треониновая киназа КаР (например, А-КаР, В-КаР, С-КаР или КаР-1) привлекается к клеточной мембране в результате взаимодействия с Каз или Каз-независимым образом в цитозоль, где она претерпевает конформационные изменения и связывается с каркасными белками, такими как 14-3-3 (Кш§ е! а1., №!иге 396; 180-183 (1998); СЬаибйагу е! а1., Сигг Вю1 10: 551-554 (2000); АνшсЬ е! а1., Епбо Кет 56: 127-156 (2001), \Уе11Ьгоск е! а1., ΝηΙ Кет Мо1 Се11 Вю1 5: 875-885 (2004)). Связывание с 14-3-3 и стабилизация/активация СКАР регулируются фосфорилированием активирующих аминокислотных остатков, таких как 8338 и Υ341 в отрицательно заряженной регуляторной области (в Ν-концевой области) и 8621 в С-концевой области за пределами киназного домена, и дефосфорилированием отрицательно регулирующих аминокислотных остатков, таких как 8259 в СК2-области (фиг. 1С), а также других многочисленных сайтов фосфорилирования, расположенных по всему белку, что дополнительно демонстрирует его сложную регуляцию (АтгпсН е! а1., И. (2001); №е11Ьгоск е! а1., И. (2004); Сагпе!! е! а1., Мо1. Се11 20: 963-969 (2005)). Активация СКАР также индуцируется образованием искусственного гомодимера (АтшсИ е! а1., И. (2001); \Уе11Ьгоск е! а1., И., (2004)).
После этого фосфорилируется КаР. КаР непосредственно активирует МЕК1 и МЕК2 путем фосфорилирования двух остатков серина в положениях 217 и 221. После активации МЕК1 и МЕК2 фосфорилируют тирозиновый (Туг-185) и треониновый (ТЬг-183) остатки в серин/треониновых киназах Егк1 и Егк2, в результате чего активируется Егк. Активированная Егк регулирует многие мишени в цитозоле, а также перемещается в ядро, где она фосфорилирует ряд транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов. Егк-киназы имеют многочисленные цели, в том числе Е1к-1, С-Е!з1, с-Е!з2, р90К8Кф МЛК1, МЛК2, М8К1, М8К2 и ТОВ. Тогда как приведенный выше путь является классическим представлением МАРК-сигнального каскада, существует значительное перекрывание между МАРК- 4 028135 сигнальным каскадом и другими сигнальными каскадами.
Нарушения в МАРК-сигнальном каскаде играют значительную роль в биологии рака. Изменение экспрессии Как часто встречается при многих раковых заболеваниях, и также были идентифицированы множественные активирующие мутации в Как. Такие мутации встречаются до 30% всех случаев рака, и особенно распространены при карциномах поджелудочной железы (90%) и толстой кишки (50%). Кроме того, активирующие мутации В-КаГ были идентифицированы при меланоме и раке яичников. Наиболее распространенная мутация, ΒΚΑΡν600Ε, приводит к конститутивной активации расположенного ниже МАР-киназного сигнального пути и необходима для пролиферации клеток меланомы, роста в мягком агаре и образования опухолевого ксенотрансплантата.
Амплификация СКАР участвует в развитии рака простаты и рака мочевого пузыря (Ебтатбк е! а1., 2003; §1тои е! а1., 2001), помимо хромосомных транслокаций при раке желудка и волосовидной астроцитоме (81ιίιηίζιι е! а1., 1986; 1оиек е! а1., 2009). Тем не менее, скорость появления мутаций в СКАР при раковых заболеваниях у человека составляет 1% (данные по каталогу соматических мутаций при раковых заболеваниях, СО8М1С), что связано с ее низкой базальной киназной активностью по сравнению с ВКАР (Мага1к е! а1., 8с1епсе 280: 109-112 (1997); Етикк е! а1., Сапсег Кек 65: 9719-9726 (2005); Оатпей е! а1., Мо1. Се11 20: 963-969 (2005)). Исходя из известной роли сверхактивации МАКК в раковых клетках человека, направленное воздействие на компоненты МАРК-сигнального пути с использованием специфических ингибиторов является перспективным подходом в терапии рака. Тем не менее, пациенты могут иметь врожденную резистентность или приобретают резистентность к этим перспективным методам лечения. Идентификация придающих резистентность мутаций в киназах-мишенях, диагностических и/или прогностических маркеров и методов лечения для таких пациентов с врожденной или приобретенной резистентностью описаны ниже.
Мутации в с-гаГ
Хотя лечение рака с использованием ингибиторов КАР, таких как РЙХ4032, является перспективным терапевтическим подходом, у пациентов, получающих такую терапию, часто возникают рецидивы, или они не отвечают на лечение, и в результате заболевание пациента прогрессирует. Как описано в настоящем документе, данное изобретение относится к обнаружению мутаций в С-КАР, придающих резистентность к ингибиторам КАР, некоторые из которых в настоящее время находятся в клинической разработки. Появление такой мутации в раковых клетках делает клетки пациента устойчивыми к лечению с использованием некоторых ингибиторов КАР. В иллюстративных вариантах осуществления, данное изобретение относится к развитию резистентности к ингибиторам КАР, которые могут включать, но не ограничиваются ими, КАР265, сорафениб, 8В590885, РЬХ 4720, РЙХ4032, ОЭС-0879, 2М 336372 и (8)метил 1-(4-(3-(5 -хлор-2 -фтор-3 -(метилсульфонамидо)фенил)-1 изопропил-1Н-пиразол-4 -ил)пиримидин-2иламино)пропан-2-илкарбамат. В качестве неограничивающего примера, иллюстративные ингибиторы КАР показаны в табл. 1. Ингибитор КАР, (8)-метил 1-(4-(3-(5-хлор-2-фтор-3-(метилсульфонамидо)фенил)-1-изопропил-1Н-пиразол-4-ил)пиримидин-2-иламино)пропан-2-илкарбамат в общем и конкретно защищен патентом (соединение 9, табл.1, страница 50 в предварительной заявке; соединение 9 на стр. 72 публикации РСТ \\'О 2011/025927).
Клиническое возникновение мутации в С-КАР, придающей устойчивость к ингибитору КАР, описанное в настоящем документе, позволяет предположить, что биологическая значимость КАР/МЕКассоциированной зависимости сохраняется даже на поздних стадиях злокачественных заболеваний. Таким образом, неспособность ингибиторов КАР вызывать долговременные ответы опухолей при многих злокачественных заболеваниях, включая меланомы, может указывать на неоптимальное действие лекарственного соединения или неоптимальную фармакодинамику в клинических условиях. На основе выводов, описанных в настоящем документе, методы лечения, включающие агенты направленного действия в случае КАР-или МЕК-обусловленных опухолей, могут стать более эффективными в результате использования более сильнодействующих препаратов, изменения дозирования существующих препаратов или сочетанного ингибирования КАР и МЕК. Примеры ингибиторов КАР включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы, перечисленные в табл.1. Неограничивающие примеры ингибиторов МЕК, включают ΛΖΌ6244, С1-1040, РЭ184352, РЭ318088, РЭ98059, РЭ334581, КЭЕА119, 6-метокси-7-(3-морфолин-4-илпропокси)-4-(4-феноксифениламино)хинолин-3-карбонитрил и 4-[3-хлор-4-(1-метил-1Н-имидазол-2-илсульфонил)фениламино] -6-метокси-7-(3 -морфолин-4-ил-пропокси)хинолин-3 -карбонитрил. Примеры ингибиторов МЕК приведены в табл. 2. Эти терапевтические инновации в совокупности с надежным определением генного профиля опухоли для стратификации пациентов должны ускорить появление персонализированной противораковой терапии в случае раковых заболеваний с восприимчивыми к терапевтическому вмешательству онкогенными мутациями.
- 5 028135
Таблица 1. Примеры ингибиторов КАТ
Название САЗ Νο. Структура
1 92788 0-90- У 4 „ -ί Г
2 Сорафениб тозилат Нексавар Вау 439006 47520 7-59-1 ° : ! 1 ' 1 > ί'
Сорафениб 4- [4-[[4-хлор-З- (трифторметил)фенил]карбамоиламино] фенокси]-Ы-метил-пиридин-2- карбоксамид 28446 1-73-0
3 ЗВ590885 \ 4
4 РЬХ4720 91850 5-84-7 1 С 1 х н
5 РЬХ4032 10298 72-54-5 Ч к ч. Г 44
6 6ϋΟ-0879 90528 1-76-7 /—/ НО
7 ΖΜ 336372 20826 0-29-1 ч 0 I
8 (3)-метил 1- (4-(3-(5-хлор-2-фтор-3- (метилсульфонамидо)фенил)-1- изопропил-1Н-пиразол-4- ил)пиримидин-2-иламино)пропан-2- илкарбамат Ά„ Λ 4
Таблица 2. Примеры ингибиторов МЕК
Название САЗ Νο. Структура
1 С1-1040/РВ184352 212631- 79-3 - 1 г, ·· .С1 ι: ΐ!
2 ΑΖΌ6244 606143- 52-6 ш с ίί
3 Ρϋ318088 391210- 00-7 ™ ьг ί 1Ί '
4 Ρϋ98059 167869- 21-8 _ я '-к
5 Ρϋ334581 О 4+
6 ΚϋΕΑ119 Ν- [3,4-дифтор-2- [ (2-фтор-4- йодофенил)амино]-6-метоксифенил]-1- [ (2К)-2,3-дигидроксипропил]- циклопропансульфонамид 9233032- 38-6 4 н %
7 6-метокси-7-(З-морфолин-4-ил- пропокси)-4-(4-фенокси-фениламино)- хинолин-3-карбонитрил о
8 4- [3-хлор(4)-(1-метил-1Н-имидазол- 2-илсульфанил)фениламино]-6- метокси-7-(З-морфолин-4-ил- пропокси)-хинолин-3-карбонитрил о
- 6 028135
В различных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам идентификации мутаций в полипептиде С-КАР, или мутаций в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид С-КАР, которые придают резистентность клеткам, экспрессирующим полипептид С-КАР, к лекарствам которые ингибируют активность КАР. Мутантный полипептид С-КАР, указанный в настоящем документе, включает в себя полипептид С-КАР, содержащий одну или несколько мутаций, которые придают резистентность к одному или нескольким известным ингибиторам КАР. Аналогичным образом, мутантная молекула нуклеиновой кислоты С-КАР, указанная в настоящем документе, включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный полипептид С-КАР. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды С-КАР, которые включают одну или несколько мутаций, могут быть созданы с использованием любого подходящего способа, известного в данной области, в том числе, например, случайного мутагенеза или сайт-направленного мутагенеза последовательности нуклеиновой кислоты С-КАР дикого типа, которые могут быть проведены в Е. сой. В примерах вариантов осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты С-КАР дикого типа представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты дикого типа МЕК1 человека. В конкретных вариантах осуществления изобретения последовательностью дикого типа нуклеиновой кислоты С-КАР является дикий тип С-КАР человека (8ЕО ГО N0: 1) (номер доступа ВС018119.2). Скрининг молекул нуклеиновых кислот мутантных С-КАР может проводиться в клетках, в ином случае чувствительных к воздействию ингибитора КАР, для того чтобы идентифицировать нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантный полипептид С-КАР, (в сравнении с диким типом полипептида С-КАР), которые являются резистентными к воздействию ингибитора КАР. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидом С-КАР является дикий тип С-КАР человека (8Е0 ГО N0: 2) (идентификационный № Р04049-10 в базе данных 8Μδδ-Ρτοΐ).
Для скрининга мутантных нуклеиновых кислот С-КАР и мутантных полипептидов С-КАР на резистентность к воздействию ингибитора КАР может использоваться любой подходящий способ. Например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутантный полипептид С-КАР, может быть проэкспрессирована в клетках, в противном случае чувствительных к воздействию ингибитора КАР. Примером клеточной линии, пригодной для этой цели, является линия А375 клеток меланомы. После экспрессии мутантного С-КАР полипептида, клетки могут быть обработаны ингибитором КАР. Активность мутантного полипептида С-КАР может быть измерена и сравнена с активностью полипептида С-КАР дикого типа, аналогичным образом проэкспрессированного и обработанного ингибитором КАР. Активность полипептида С-КАР можно определить, например, путем измерения пролиферации или жизнеспособности клеток после обработки ингибитором КАР, где пролиферация или жизнеспособность клеток положительно коррелируют с активностью С-КАР. Рост клеток, пролиферация или жизнеспособность могут быть определены с использованием любого подходящего способа, известного в данной области. В одном варианте осуществления изобретения рост клеток может быть определен с использованием хорошо известных методов анализа клеточной пролиферации/жизнеспособности, например, МТ8 или Се11 ТПег СЬо, в которых рост клеток в присутствии ингибитора КАР выражается в виде доли от роста, наблюдаемого для необработанных клеток, культивируемых без ингибитора КАР. В некоторых вариантах осуществления изобретения, резистентность определяется как сдвиг в значении С150, по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно по меньшей мере 3 раза, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 4-5 раз, относительно подходящего контроля. В других вариантах осуществления изобретения, резистентность определяется как величина С150, составляющая приблизительно 1 мкМ. Активность полипептида С-КАР также может быть измерена, например, определением относительного количества фосфорилированных ЕКК1/2, присутствующих в клетке после обработки ингибитором КАР. Активность полипептида С-КАР дикого типа или мутантного полипептида С-КАР также может быть определена с использованием анализа фосфорилирования ίη νίίτο, в котором активность МЕК1 определяется путем измерения доли фосфорилированного субстрата Егк1/2 после обработки ингибитором КАР или МЕК. Мутантный полипептид С-КАР, имеющий большую активность, чем дикий тип полипептида С-КАР после обработки ингибитором КАР, идентифицируется, как содержащий мутацию, придающую резистентность к ингибитору КАР. Мутация, придающая резистентность к ингибитору КАР, может быть определена с помощью секвенирования нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид С-КАР, или путем секвенирования непосредственно мутантного полипептида С-КАР.
Аналогичным образом, а так же с использованием способов массового параллельного секвенирования, как описано в примере 1, были идентифицированы аминокислотные замены в полипептиде С-КАР, которые при мутации придают резистентность к ингибиторам КАР: РЬХ4032, РЬХ4720 и (8)-метил 1-(4(3-(5-хлор-2-фтор-3-(метилсульфонамидо)фенил)-1-изопропил-1Н-пиразол-4-ил)пиримидин-2-иламино)пропан-2-илкарбамату. В частности, замены в одной или нескольких из следующих аминокислот в полипептиде С-КАР человека придают устойчивость к ингибиторам КАР, в том числе 104Е, 2578. 261Р, 3610, 3560, 4278, 447Ό, 469М, 478Е и 554К. В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид С-КАР включает мутацию в одном или нескольких из этих аминокислотных остатков относительно дикого типа полипептида С-КАР человека. В иллюстративных вариантах осуществления изобретения, мутантный полипептид С-КАР включает одну или несколько из следующих резистент- 7 028135 ных мутаций: 104Е>К, 2578>Р, 261Р>Т, 3560>Е, 3610>А, 4278>Т, 447Ό>Ν, 469М>1, 478Е>К и 554Р>К.
Выделенные молекулы нуклеиновых кислот
Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам или молекулам нуклеиновых кислот, связанным с геном С-РАР и его соответствующим генным продуктом. Эти полинуклеотиды или молекулы нуклеиновых кислот могут быть выделены и очищены из клеток млекопитающих. В конкретных аспектах изобретения, выделенные молекулы нуклеиновых кислот С-РАР, описанные в настоящем документе, содержат мутации, придающий устойчивость к одному или нескольким ингибиторам РАР. Мутантная молекула нуклеиновой кислоты С-РАР, указанная в настоящем документе, включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты С-РАР, которая кодирует мутантный полипептид С-РАР, т.е. полипептид С-РАР, включающий одну или нескольких мутаций, которые придают устойчивость к одному или нескольким ингибиторам РАР.
Следует понимать, что выделенная и очищенная молекула нуклеиновой кислоты С-РАР, например, мутантная молекула нуклеиновой кислоты С-РАР, может существовать в форме РНК или ДНК. Используемый в настоящем документе термин РНК-транскрипт относится к молекуле РНК, которая является продуктом транскрипции с молекулы ДНК. Такой транскрипт может кодировать один или несколько белков.
Используемый в настоящем документе термин полинуклеотид относится к молекуле нуклеиновой кислоты, РНК или ДНК, которая была выделена, например освобождена от общих геномных нуклеиновых кислот. Поэтому полинуклеотид, кодирующий С-РАР относится к сегменту нуклеиновой кислоты, который включает в себя последовательности кодирующие С-РАР, но отделенные от, или очищенные и свободные от общей геномной ДНК и белков. Когда настоящая заявка относится к функции или активности полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, кодирующих С-РАР, это означает, что полинуклеотид кодирует молекулу, способную выполнять действия полипептида С-РАР дикого типа, например, фосфорилировать субстрат ЕРК1/2.
Предполагается, что термин кДНК относится к ДНК, полученной с использованием РНК в качестве матрицы. Кроме того, предполагается, что данная нуклеиновая кислота, кодирующая С-РАР или ген С-РАР из данной клетки, может быть представлена природными вариантами или штаммами, которые имеют немного другую нуклеотидную последовательность, но, тем не менее, кодируют активный полипептид С-РАР. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, активным полипептидом СРАР является активный полипептид С-РАР человека. В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения активным полипептидом С-РАР является мутантный полипептид С-РАР, который обладает активностью полипептида С-РАР дикого типа, но который устойчив к одному или нескольким известным ингибиторам РАР. Следовательно, некоторые аспекты настоящего изобретения включают производные нуклеиновых кислот или полипептидов С-РАР с минимальными изменениями в нуклеотидной или аминокислотной последовательности, но имеющие такую же биологическую функцию.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к рекомбинантным векторам, включающим последовательности ДНК, которые кодируют мутантные полипептиды С-РАР или пептиды, которые включают в свою аминокислотную последовательность непрерывную аминокислотную последовательность, соответствующую или по существу соответствующую мутантным полипептидам С-РАР. В иллюстративных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным сегментам ДНК и рекомбинантным векторам, включающим последовательности ДНК, которые кодируют полипептид С-РАР, который включает в своей аминокислотной последовательности непрерывную аминокислотную последовательность полипептида С-РАР, содержащую одну или несколько мутаций, придающих устойчивость к одному или нескольким ингибиторам РАР.
Эти сегменты нуклеиновой кислоты, используемые в настоящем изобретении, независимо от длины самой кодирующей последовательности, могут быть объединены с другими последовательностями ДНК или РНК, такими как промоторы, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты рестрикции, множественными сайтами клонирования, другими кодирующими сегментами и т.п., так что их общая длина может значительно варьировать. Поэтому предполагается, что может использоваться фрагмент нуклеиновой кислоты практически любой длины, с общей длиной, предпочтительно ограниченной легкостью получения и применения в предполагаемом протоколе рекомбинантной ДНК.
Гетерологичная последовательность относится к последовательности, которая является внешней или экзогенной по отношению к оставшейся последовательности. Г етерологичный ген относится к гену, который не встречается в природе прилегающим к последовательностям, с которыми он теперь находится.
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать мутантный полипептид С-РАР, имеющий активность С-РАР, в котором по меньшей мере одна аминокислотная замена встречается в одной или нескольких аминокислотных позициях, включая следующие позиции: 104Е, 2578, 261Р, 356С, 3610, 4278, 447Ό, 469М, 478Е и 554Р. В других вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид С-РАР включает одну или несколько из следующих резистентных мутаций: 104Е>К, 2578>Р, 261Р>Т, 3560>Е, 3610>А, 4278>Т, 447Ό>Ν, 469М>1, 478Е>К и 554Р>К.
- 8 028135
Векторы экспрессии и клетки-хозяева
Настоящее изобретение охватывает композиции экспрессионного вектора и применение таких векторов для кодирования полипептида С-КАР, например, мутантного полипептида С-КАР, а также композиции клеток-хозяев, в которые такие были введены экспрессионные векторы. Термин вектор используется для обозначения молекулы-носителя нуклеиновой кислоты, в которую последовательность нуклеиновой кислоты может быть вставлена для введения в клетку, в которой она может воспроизводиться. Последовательность нуклеиновой кислоты может быть экзогенной, что означает, что она является чужеродной клетке, в которую вводится вектор, или что последовательность гомологична последовательности в клетке, но находится в нуклеиновой кислоте клетки-хозяина в позиции, в которой последовательность обычно не находится. Векторы включают плазмиды, космиды, вирусы (бактериофаги, вирусы животных и растений) и искусственные хромосомы (например, УАС (дрожжевые искусственные хромосомы). Специалист в данной области техники будет легко способен сконструировать вектор с использованием стандартных рекомбинантных методик.
Термин экспрессионный вектор или экспрессионная конструкция относится к вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере часть генного продукта, способного транскрибироваться. В некоторых случаях, молекулы РНК затем транслируются в белок или пептид. В других случаях эти последовательности не транслируются, например при получении антисмысловых молекул или рибозимов. Экспрессионные векторы могут содержать разнообразные регулирующие последовательности, которые относятся к последовательностям нуклеиновых кислот, необходимых для транскрипции и, возможно трансляции, функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. В дополнение к регулирующим последовательностям, которые управляют транскрипцией и трансляцией, векторы и экспрессионные векторы могут содержать последовательности нуклеиновых кислот, которые выполняют также и другие функции.
Используемые в данном документе термины клетка, клеточная линия и клеточная культура могут использоваться взаимозаменяемо. Клетка, содержащая полинуклеотид С-КАР, мутированный или дикого типа, может использоваться в изобретении. Все эти термины также включают их потомство, которое относится к любому и всем последующим поколениям. Понятно, что все потомство может не быть идентичным вследствие преднамеренных или случайных мутаций. В контексте экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, клетка-хозяин относится к прокариотической или эукариотической клетке, и включает в себя любые трансформируемые организмы, способные к репликации вектора и/или экспрессии гетерологичного гена, кодируемого вектором. Клетка-хозяин может использоваться и используется в качестве реципиента для векторов. Клетка-хозяин может быть трансфецирована или трансформирована, что относится к процессу, с помощью которого экзогенная нуклеиновая кислота переносится или вводится в клетку-хозяина. Трансформированная клетка содержит исходную клетку и ее потомство. Рекомбинантная клетка-хозяин относится к клетке-хозяину, которая несет рекомбинантную нуклеиновую кислоту, т.е. нуклеиновую кислоту, с которой проводились манипуляции ίη νίίτο, или которая является реплицированной копией нуклеиновой кислоты, с которой были проведены эти манипуляции. Клетка-хозяин может быть получена из прокариот или эукариот, в зависимости от того, является ли желаемым результатом репликация вектора, экспрессия части или всех кодируемых вектором последовательностей нуклеиновых кислот или производство инфекционных вирусных частиц.
Выделенные полипептидные молекулы
Другой аспект изобретения относится к выделенным и/или очищенным полипептидам С-КАР, и их биологически активным участкам. В конкретных аспектах изобретения полипептиды С-КАР, описанные в настоящем документе, содержат мутации одной или нескольких аминокислот, придающие резистентность к одному или нескольким ингибиторам КАР. Мутантный полипептид С-КАР, указанный в настоящем документе, включает в себя полипептид С-КАР, содержащий мутации по одной или нескольким аминокислотным позициям, которые придают резистентность к одному или нескольким ингибиторам КАР.
Биологически активные участки полипептида С-КАР включают пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, полученные из аминокислотной последовательности полипептида С-КАР, например, аминокислотной последовательности, показанной в §ЕЦ ГО N0: 2, которые включают в себя меньшее количество аминокислот чем полноразмерный полипептид С-КАР и проявляют по меньшей мере одну активность полипептида С-КАР. Как правило, биологически активные участки (пептиды, например, пептиды, которые имеют длину, например, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 или более аминокислот) включают домен или мотив по меньшей мере с одной активностью полипептида СКАР. Более того, другие биологически активные участки, в которых удалены другие участки белка, могут быть получены с помощью рекомбинантных методик и оценены по одному или нескольким типам активности, описанным в данном документе. Предпочтительно, чтобы биологически активные участки полипептида С-КАР включали в себя один или несколько выбранных доменов/мотивов или его участков, обладающих биологической активностью.
Полипептиды С-КАР могут быть получены с помощью методик рекомбинантных ДНК. Например, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, клонируют в экспрессионный вектор (как описано
- 9 028135 выше), экспрессионный вектор вводят в клетку-хозяина (как описано выше), и полипептид С-КАР экспрессируется в клетке-хозяине. Затем полипептид С-КАР может быть выделен из клеток с помощью соответствующей схемы очистки с использованием стандартных методик очистки белков. В качестве альтернативы рекомбинантной экспрессии, полипептид С-КАР может быть синтезирован химически с использованием стандартных методик пептидного синтеза. Более того, нативный полипептид С-КАР и/или мутантный полипептид С-КАР может быть выделен из клеток (например, раковых клеток), например, с использованием антител против С-КАР, которые могут быть получены с помощью стандартных методик с использованием полипептида С-КАР или его фрагмента по настоящему изобретению.
Также могут использоваться химерные или слитые белки С-КАР. В контексте настоящего изобретения химерный белок или слитый белок МЕК1 включает в себя полипептид С-КАР, функционально связанный с полипептидом, не являющимся С-КАР. Термин полипептид С-КАР относится к белку, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую полипептиду С-КАР, тогда как термин полипептид, не являющийся С-КАР, относится к белку, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую белку, который по существу не гомологичен полипептиду С-КАР, например, белку, который существенно отличается от полипептида С-КАР, который не проявляет активность С-КАР, и который получен из того же или из другого организма. В слитом белке термин функционально связанный предназначен для обозначения того, что полипептид С-КАР и полипептид, не являющийся СКАР, слиты друг с другом с сохранением рамки считывания. Полипептид, не являющийся С-КАР, может быть слит с Ν-концом или С-концом полипептида С-КАР. Например в одном варианте осуществления изобретения, слитый белок представляет собой слитый белок 08Т-С-КАР, в котором аминокислоты СКАР слиты с С-концом полипептида 08Т. Такие слитые белки могут облегчать очистку рекомбинантного полипептида С-КАР. В другом варианте осуществления изобретения, слитый белок представляет собой полипептид С-КАР, содержащий гетерологичную сигнальную последовательность на своем Ν-конце. В некоторых клетках-хозяевах (например, клетках-хозяевах млекопитающих), экспрессия и/или секреция белка МЕК1 может быть увеличена за счет использования гетерологичной сигнальной последовательности.
Мутантный полипептид С-КАР может быть получен путем мутагенеза полипептида С-КАР дикого типа или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид С-КАР дикого типа. Мутантный полипептид С-КАР может быть также идентифицирован путем скрининга комбинаторных библиотек мутантов С-КАР на мутантный полипептид С-КАР, имеющий желаемую активность, например, резистентность к одному или нескольким ингибиторам КАР. В данной области известны несколько методик скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, созданных путем внесения точечных мутаций в последовательности или усечения последовательностей, а также методик скрининга библиотек кДНК на генные продукты, имеющие выбранное свойство. Такие методики могут быть адаптированы для быстрого скрининга библиотек генов, созданных путем комбинаторного мутагенеза. Наиболее широко используемые методики скрининга крупных библиотек генов, которые подходят для высокопропускного анализа, обычно включают клонирование библиотеки генов в реплицируемые экспрессионные векторы, трансформацию подходящих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, при которых обнаружение желаемой активности облегчает выделение вектора, кодирующего ген, чей продукт был обнаружен.
Антитела
Полипептиды, экспрессированные с полинуклеотидов по изобретению, могут использоваться для получения антител. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут использоваться для обнаружения и количественной оценки экспрессии мутантных полипептидов С-КАР. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут использоваться для изменения активности мутантного полипептида С-КАР. Полипептиды, экспрессированные с полинуклеотидов по изобретению, содержащие по меньшей мере шесть, восемь, десять, двенадцать, пятнадцать, от двадцати до тридцати последовательных аминокислот, могут использоваться в качестве иммуногенных агентов. Полипептиды могут использоваться для получения препарата антител, которые специфически связываются с мутантным полипептидом С-КАР по изобретению, имеющим одну или несколько аминокислотных замен в одной или нескольких из следующих аминокислот полипептида С-КАР человека, которые придают устойчивость к ингибиторам КАР, включая 104Е, 2578, 261Р, 356С, 3610, 4278, 447Ό, 469М, 478Е и 554К. В иллюстративных вариантах осуществления изобретения, мутантный полипептид С-КАР включает одну или несколько из следующих резистентных мутаций: 104Е>К, 2578>Р, 261Р>Т, 3560>Е, 3610>А, 4278>Т, 447Ό>Ν, 469М>1, 478Е>К и 554К>К.
Антитела могут быть моноклональными и поликлональными антителами, одноцепочечными антителами, химерными антителами, бифункциональными/биспецифическими антителами, гуманизированными антителами, антителами человека и антителами с пересаженными определяющими комплементарность областями (СОК), которые являются специфическими к целевому белку или его фрагментам; а также включают фрагменты антител, в том числе РаЬ-, РаЬ'-, Р(аЬ')2-, 8сРу- и Ру-фрагменты, верблюжьи антитела или микроантитела. Антитело может также относиться к антиидиотипическим антителам, т.е. может являться антителом, направленным против антиген-специфичной части последовательности анти- 10 028135 тела, и, таким образом, может узнавать связывающие сайты других антител; или может относиться к анти-антиидиотипическим антителам, т.е. может являться антителом со связывающим сайтом, имитирующим эпитоп на антигене, который использовался для создания исходного антитела. Методики получения антител хорошо известны в данной области.
Также могут быть сконструированы одноцепочечные антитела. Одноцепочечные антитела, которые специфически связываются с полипептидом, экспрессированным с полинуклеотидов по изобретению, могут быть выделены, например, из библиотек, представляющих одноцепочечные иммуноглобулины, известных в данной области техники. Библиотеку просеивают против полипептида, и таким образом может быть выделен ряд одноцепочечных антител, которые высокоаффинно связываются с различными эпитопами полипептида. НауавЫ е! а1., 1995, Оеие, 160: 129-30. Такие библиотеки известны и доступны специалистам в данной области техники. Антитела также могут быть сконструированы с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием гибридомной кДНК в качестве матрицы (ΤΗίποη е! а1., 1996, Еиг. 1. Сапсег Ргеу. 5: 507-11).
Одноцепочечное антитело может быть моно- или биспецифическим, и может быть двухвалентным или четырехвалентным. Конструирование четырехвалентных биспецифичных одноцепочечных антител приведено в Со1ота апй Μοττίβοη, 1997, ΝηΙ. Вю1ес1ию1. 15: 159-63. Конструирование двухвалентных биспецифичных одноцепочечных антител приведено в Ма11епйег апй Уовв, 1994, 1. Βίο1. С1ет. 269: 199206.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая одноцепочечное антитело, может быть сконструирована с использованием ручного или автоматизированного нуклеотидного синтеза, клонирована в векторы для экспрессии ДНК с использованием стандартных методик рекомбинантных ДНК и введена в клетки, которые экспрессируют выбранный ген, как описано ниже. В альтернативном варианте, антитела могут быть получены напрямую с помощью методики с использованием нитевидных фагов в соответствии с Уетйаат е! а1., 1995, Ιη!. 1. Сапсег 61:497-501; №с1ю11з е! а1., 1993. 1. Iттиηο1. МеЙг 165:81-91.
Антитела специфически связываются с эпитопами полипептидов, экспрессированных с полинуклеотидов по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эпитопы не присутствуют на других белках человека. Как правило, минимальным числом последовательных аминокислот, создающих эпитоп, является 6, 8 или 10. Тем не менее, может использоваться большее число аминокислот, например, по меньшей мере, 15, 25 или 50, в особенности, образующих эпитопы, которые включают несмежные остатки или определенные конформации.
Антитела, которые специфически связываются с полипептидами, включают те, которые связываются с полноразмерными полипептидами. Специфически связывающие антитела не обнаруживают другие белки на Вестерн-блотах клеток человека или дают сигнал по меньшей мере в десять раз меньше сигнала, исходящего от целевого белка по настоящему изобретению. Антитела, которые имеют такую специфичность, могут быть получены путем рутинного скрининга. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, антитела иммунопреципитируют полипептиды, экспрессируемые с полинуклеотидов по изобретению, из клеточных экстрактов или раствора. Кроме того, антитела могут реагировать с полипептидами, экспрессированными с полинуклеотидов по изобретению, в срезах тканей или на Вестерн-блотах после переноса из полиакриламидных гелей. Предпочтительно, чтобы антитела не проявляли неспецифической перекрестной реактивности с другими белками человека на Вестерн-блотах или в иммуноцитохимических анализах.
Методики очистки антител к полипептидам, экспрессированным с полинуклеотидов по изобретению, доступны в данной области техники. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитела пропускают через колонку, с которой связан конкретный белок или полипептид, экспрессированный с полинуклеотидов по изобретению. Связанные антитела затем элюируют, например, используя буфер с высокой концентрацией соли.
Обнаружение мутаций
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам обнаружения присутствия мутантного С-КАЕ полипептида в образце (например, биологическом образце от больного раком). Для обнаружения присутствия мутантного полипептида С-КАЕ по изобретению в образце, например, нуклеотидном и/или белковом образце, могут использоваться различные способы скрининга. В конкретных вариантах осуществления изобретения образец включает в себя клетку или клеточный экстракт. В примерах вариантов осуществления изобретения, образец получен от субъекта, например, от субъекта, имеющего рак.
В рамках настоящего изобретения могут использоваться способы обнаружения присутствия резистентных мутаций в геномной ДНК, кДНК и РНК (то есть, мРНК), содержащих последовательность, кодирующую полипептид С-КАЕ или его биологически активный участок. Аналогичным образом, в рамках настоящего изобретения могут использоваться способы обнаружения присутствия резистентных мутаций в полипептиде С-КАЕ или его биологически активных участках. В конкретных вариантах осуществления изобретения, способы, которые включают нижеследующие способы, но не ограничиваются ими, могут использоваться для обнаружения присутствия полипептида С-КАЕ или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид С-КАЕ, имеющий мутацию в одной или нескольким аминокислотных позициях по сравнению с полипептидом С-КАЕ дикого типа (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2). В некоторых вариантах осуществле- 11 028135 ния изобретения для обнаружения присутствия мутантного полипептида могут использоваться антитела против мутантного полипептида С-КАР.
Точечные мутации могут быть обнаружены с использованием любого подходящего способа, известного в данной области, включая, например, денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ΌΟΟΕ), анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (КРЬР), химические или ферментативные способы расщепления, прямое секвенирование целевых областей, амплифицированных с помощью ПЦР (см. выше), анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (88СР), полимеразную цепную реакцию, секвенирование, гибридизацию или гибридизационный захват с последующим пиросеквенированием или секвенированием одиночных молекул. Также могут использоваться другие способы для обнаружения мутаций, известные специалисту в данной области.
Поиск у индивидуума указанных выше мутаций может выполняться способами скрининга. Например, в одном варианте осуществления изобретения, у пациента для проведения анализа отбирают образец (например, крови или другой жидкости организма, или образец клеток или ткани). В примере варианта осуществления изобретения пациент болен раком. Способы, подходящие для обработки таких образцов для обнаружения мутации в нуклеиновой кислоте С-КАР или в полипептиде С-КАР, известны в данной области, и специалист в данной области может адаптировать обработку таких образцов в соответствии с выбранным способом обнаружения.
Присутствие или отсутствие одной или нескольких мутаций, описанных в данном документе, определяет вероятность резистентности исследуемых индивидуумов к терапии с использованием ингибитора КАР. В соответствии со способами по изобретению эти результаты будут использованы для подбора и/или изменения дозы ингибитора КАР, или для выбора курса лечения с использованием второго ингибитора. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вторым ингибитором может быть ингибитор ΜΕΚ. Эффективное лечение субъекта, имеющего рак, может включать в себя удаление раковой клетки, остановку или снижение роста раковой опухоли (например, солидной опухоли) или улучшение по меньшей мере одного симптома ракового заболевания.
Резистентные мутации в полипептиде С-КАР или в молекулах нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид С-КАР, могут быть обнаружены с использованием любых подходящих способов, известных в данной области, или их модификаций, включая способы, описанные ниже. Такие способы включают использование аллель-специфической полимеразной цепной реакции, прямого или непрямого секвенирования участка, использование рестрикционных ферментов, когда соответствующие аллели участка создают или разрушают сайт рестрикции, использование гибридизации аллель-специфических зондов, использование антител, специфичных к мутантному полипептиду С-КАР или любую другую биохимическую методику.
Диагностические/прогностические маркеры резистентности к направленным методам терапии
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам обнаружения присутствия одного или нескольких диагностических или прогностических маркеров в образце (например, биологическом образце от пациента с раковым заболеванием). Различные способы скрининга, известные специалисту в данной области техники, могут использоваться для обнаружения присутствия маркера в образце, включая обнаружение ДНК, РНК и белка. Методики могут использоваться для того, чтобы определить присутствие или отсутствие мутации в образце, полученном от пациента. В некоторых вариантах осуществления изобретения пациент может иметь врожденную или приобретенную резистентность к направленным на киназы методам терапии, включая ингибиторы В-КАР или пан-ингибиторы КАР. Например, пациент может иметь врожденную или приобретенную резистентность к ингибиторам КАР - РЬХ4720 и/или РЬХ4032, и/или (§)-метил 1-(4-(3-(5-хлор-2-фтор-3-(метилсульфонамидо)фенил)-1-изопропил-1Нпиразол-4-ил)пиримидин-2-иламино)пропан-2-илкарбамату. В одном варианте осуществления изобретения, идентификация нуклеиновой кислоты или полипептида С-КАР, включающих одну или несколько мутаций, описанных в данном документе, в содержащем раковую клетку образце, полученном от пациента, указывает на то, что пациент имеет относительно высокий риск рецидива или отсутствия ответа на лечение ингибитором КАР. Идентификация у пациента одной или нескольких мутаций С-КАР, описанных выше, помогает врачу определить и реализовать протокол лечения пациента. Например, пациента, имеющего одну или несколько мутаций в полипептиде С-КАР, указанных выше, врач может лечить с использованием комбинированной терапии, описанной более подробно ниже.
Идентификация резистентных мутаций в полипептиде С-КАР также позволяет провести скрининг пациентов, имеющих рак, для того чтобы определить присутствие или отсутствие резистентных мутаций по одной или нескольким аминокислотным позициях в С-КАР при раке. Определение присутствия или отсутствия одной или нескольких резистентных мутаций в С-КАР при раке позволяет провести изменение стратегии лечения больного раком. Такие изменения могут включать в себя, например, начало или остановку терапии с использованием ингибитора КАР или ингибитора ΜΕΚ, введение комбинированной терапии, применение непрерывного введения ингибитора КАР и второго ингибитора и т.п.
В некоторых вариантах осуществления изобретения резистентные мутации КАР могут быть идентифицированы в нуклеиновой кислоте, кодирующей мутантный полипептид С-КАР, имеющий активность С-КАР, где мутантный полипептид С-КАР включает по меньшей мере одну аминокислотную за- 12 028135 мену по сравнению с полипептидом С-КАР дикого типа, показанным в 8Еф ГО N0: 2, и где замена по меньшей мере одной аминокислоты придает резистентность к одному или нескольким ингибиторам КАР клетке, экспрессирующей мутантный полипептид КАР. В некоторых вариантах осуществления изобретения резистентные мутации КАР могут быть идентифицированы в мутантном полипептиде С-КАР, имеющем активность С-КАР, где мутантный полипептид С-КАР включает замену по меньшей мере одной аминокислоты по сравнению с полипептидом С-КАР дикого типа, показанным в 8Еф ГО N0: 2, и где замена по меньшей мере одной аминокислоты придает резистентность к одному или нескольким ингибиторам КАР клетке, экспрессирующей мутантный полипептид С-КАР. В некоторых вариантах осуществления изобретения, замена одной или нескольких из следующих аминокислот полипептида С-КАР дикого типа придает устойчивость к ингибиторам КАР, включая 104Е, 2578, 261Р, 3560, 3610, 4278, 447Ό, 478Е, 469М и 554К. В некоторых вариантах осуществления изобретения замена одной или нескольких аминокислот полипептида С-КАР дикого типа выбрана из группы, состоящей из 104Е>К, 2578>Р, 261Р>Т, 3560>Е, 3610>А, 4278>Т, 447Ό>Ν, 469М>1, 478Е>К и 554К>К. В некоторых вариантах осуществления изобретения, замена одной или нескольких аминокислот полипептида С-КАР дикого типа выбрана из группы, состоящей из 2578, 261Р и 3610.
Способы лечения
В различных вариантах осуществления изобретение относится к способам лечения пациента, имеющего рак. Способы обычно включают введение первого ингибитора и второго ингибитора. Одним ингибитором может быть ингибитор КАР. Примеры ингибиторов КАР приведены в табл. 1 выше. Одним ингибитором может быть ингибитор МЕК (см. табл. 2, иллюстрирующую примеры ингибиторов МЕК). В некоторых вариантах осуществления изобретения предусмотрена комбинированная терапия рака, включающая в себя эффективное количество ингибитора КАР и эффективное количество второго ингибитора. В некоторых вариантах осуществления изобретения вторым ингибитором является ингибитор МЕК.
В примерах вариантов осуществления описанных выше аспектов, ингибитором КАР в настоящем изобретении являются РЬХ4720, РЬХ4032, ВАУ 43-9006 (Сорафениб), ΖΜ 336372, КАР 265, ААЬ-881, ЬВТ-613, (8)-метил 1 -(4-(3 -(5-хлор-2-фтор-3 -(метилсульфонамидо)фенил)-1-изопропил-1Н-пиразол-4ил)пиримидин-2-иламино)пропан-2-илкарбамат или С18352.
Дополнительные примеры ингибиторов КАР, пригодные для комбинированной терапии, включают в себя пан-ингибиторы КАР, ингибиторы В-КАР, ингибиторы А-КАР и ингибиторы КАР-1. Также могут использоваться дополнительные ингибиторы КАР, известные в данной области.
В качестве неограничивающего примера ингибитором МЕК в настоящем изобретении могут быть С1-1040, АΖ^6244, РЭ318088, РЭ98059, РЭ334581, КЭЕА119, 6-метокси-7-(3-морфолин-4-ил-пропокси)4-(4-фенокси-фениламино)хинолин-3 -карбонитрил или 4-[3 -хлор-4-( 1 -метил-1Н-имидазол-2-илсульфанил)фениламино] -6-метокси-7-(3 -морфолин-4-ил-пропокси)-хинолин-3 -карбонитрил, соединение К07 420 от компании КоеНс или их комбинации. Также могут использоваться дополнительные ингибиторы МЕК, известные в данной области.
Введение комбинации включает введение комбинации в одном составе или стандартной лекарственной форме, введение отдельных агентов в комбинации одновременно, но по отдельности, или введение отдельных агентов в комбинации последовательно любым подходящим способом. Дозировка отдельных агентов в комбинации может требовать более частого введения одного из агентов по сравнению с другим агентом в комбинации. Поэтому для обеспечения соответствующей дозировки, упакованные фармацевтические препараты могут содержать одну или несколько лекарственных форм, которые содержат комбинацию агентов, и одну или несколько лекарственных форм, которые содержат один агент, но не другие агенты из комбинации.
Агенты могут содержать один или несколько асимметричных элементов, таких как стереогенные центры или стереогенные оси, например, асимметричные атомы углерода, таким образом, что эти соединения могут существовать в различных стереоизомерных формах. Эти соединения могут являться, например, рацематами или оптически активными формами. Для соединений с двумя или несколькими асимметричными элементами, эти соединения могут дополнительно являться смесями диастереомеров. В случае соединений, имеющих асимметричные центры, следует понимать, что все оптические изомеры и их смеси входят в изобретение. Кроме того, соединения с углеродными двойными связями могут существовать в Ζ- и Е-формах; все изомерные формы соединений включены в настоящее изобретение. В таких ситуациях, отдельные энантиомеры (оптически активные формы) могут быть получены путем асимметрического синтеза, синтезом из оптически чистых предшественников или разделением рацематов. Разделение рацематов также может быть достигнуто, например, стандартными способами, такими как кристаллизация в присутствии разделяющего агента или хроматография с использованием, например, хиральной ВЭЖХ-колонки.
Если не описано иное или явно не указано в тексте, то ссылка на соединения, используемые в комбинированной терапии по настоящему изобретению, включает в себя как свободные основания соединений, так и все фармацевтически приемлемые соли соединений. Предпочтительной солью является гидрохлорид.
- 13 028135
Термин фармацевтически приемлемые соли включает в себя производные раскрытых соединений, в которых исходное соединение модифицировано путем получения его нетоксичных солей присоединения кислот или оснований, и дополнительно относится к фармацевтически приемлемым сольватам, в том числе гидратам, таких соединений и таких солей. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, но не ограничиваются ими, соли присоединения минеральных или органических кислот к основным остаткам, таким как амины; соли присоединения щелочных или органических соединений к кислотным остаткам, таким как карбоновые кислоты; и тому подобное, а также комбинации, содержащие одну или несколько из вышеуказанных солей. Фармацевтически приемлемые соли включают нетоксичные соли и четвертичные аммониевые соли исходного соединения, образованные, например, из нетоксичных неорганических или органических кислот. Например, соли нетоксичных кислот включают соли, полученные из неорганических кислот, таких как хлористоводородная, бромисто-водородная, серная, сульфаминовая, фосфорная и азотная; другие приемлемые неорганические соли включают соли металлов, такие как натриевая соль, калиевая соль и цезиевая соль; и соли щелочноземельных металлов, такие как кальциевая соль и магниевая соль; и комбинации, включающие одну или несколько из вышеуказанных солей.
Фармацевтически приемлемые соли включают органические соли, полученные из органических кислот, таких как уксусная, трифторуксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, стеариновая, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, памовая, малеиновая, гидроксималеиновая, фенилуксусная, глутаминовая, бензойная, салициловая, мезиловая (метансульфоновая), эзиловая (этансульфоновая), безиловая (бензолсульфоновая), сульфаниловая, 2-ацетоксибензойная, фумаровая, толуолсульфоновая, метансульфоновая, этандисульфоновая, щавелевая, изэтионовая, НООС(СН2)ПСООН, где η равно 0-4; соли органических аминов, такие как триэтиламиновая соль, пиридиновая соль, пиколиновая соль, этаноламиновая соль, триэтаноламиновая соль, дициклогексиламиновая соль, Ν,Ν'-дибензилэтилендиаминовая соль; и соли аминокислот, такие как аргинат, аспарагинат и глутамат, и комбинации, включающие одну или несколько из вышеуказанных солей.
Эффективным количеством комбинации агентов является количество, достаточное, чтобы обеспечить наблюдаемое улучшение по сравнению с исходными клиническими наблюдаемыми симптомами и признаками заболевания, против которого проводилось лечение комбинацией.
Фармацевтические продукты могут вводиться перорально или другим образом, например, ректально или парентеральной инъекцией. Пероральная лекарственная форма включает стандартную лекарственную форму, предписанную или предназначенную для перорального введения. Пероральная лекарственная форма может содержать множество субъединиц, таких как, например, микрокапсулы или микротаблетки, упакованные для введения в виде одной дозы.
Фармацевтические продукты могут выпускаться в различных формах. Высвобождаемая форма включает лекарственные формы мгновенного высвобождения, немедленного высвобождения, контролируемого высвобождения и замедленного высвобождения.
Форма мгновенного высвобождения включает лекарственную форму, созданную для обеспечения быстрого растворения действующего агента путем модификации нормальной формы кристаллов действующего вещества, для того чтобы получить более быстрое растворение.
Форма немедленного высвобождения включает стандартную или немодифицированную форму высвобождения действующего вещества, в которой больше или около 50%, предпочтительно около 75% действующих агентов высвобождается в течение 2 ч после введения, предпочтительно в течение одного ч после введения.
Форма замедленного высвобождения или пролонгированного высвобождения включает высвобождение действующих агентов с такой скоростью, что их уровень в крови (например, в плазме) поддерживаются в пределах терапевтического диапазона (но ниже токсического уровня) в течение по меньшей мере примерно 8 ч, предпочтительно по меньшей мере примерно 12 ч, более предпочтительно примерно 24 ч после введения в равновесном состоянии. Термин равновесное означает, что уровень в плазме для данного действующего агента или комбинации действующих агентов, достигнут и поддерживается последующими дозами действующего (действующих агентов) на уровне, равном или выше минимального эффективного терапевтического уровня и ниже минимального токсического уровня в плазме для данного действующего агента (действующих агентов).
Термин лечить, получивший лечение, лечащий или лечение используется в данном документе для обозначения облегчения, уменьшения или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания у субъекта. Например, лечением может быть уменьшение одного или нескольких симптомов заболевания или полное избавление от заболевания, такого как рак. В контексте настоящего изобретения термин лечить также обозначает остановку, задержку начала (например, увеличение периода до клинического проявления заболевания) и/или снижение риска развития или обострения заболевания. Термин защитить используется в данном документе для обозначения предупреждения, задержки или лечения, или всего вместе, в соответствующих случаях развития или продолжения, или обострения заболевания у субъекта. В контексте настоящего изобретения заболевание связано с раком.
Термин субъект или пациент включает животных, которые могут иметь раковые заболевания
- 14 028135 или страдают от раковых заболеваний или любого заболевания, включающего прямо или косвенно, рак. Примеры субъектов включают млекопитающих, например, людей, собак, коров, лошадей, свиней, овец, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных животных. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъектом является человек, например человек, страдающий от, подверженный риску или потенциально способный иметь раковое заболевание.
Термин примерно или приблизительно означает обычно в пределах 20%, более предпочтительно в пределах 10% и наиболее предпочтительно в пределах 5% от заданного значения или диапазона. В альтернативном варианте, особенно в биологических системах, термин примерно означает в пределах примерно 10-кратного отклонения (то есть, на порядок), предпочтительно в пределах двукратного отклонения от заданного значения.
Использование терминов в единственном или множественном числе в контексте описания изобретения (особенно в контексте нижеследующей формулы изобретения) следует истолковывать как охватывающее и единственное и множественное число, если иное не указано в данном описании или четко противоречит контексту. Термины содержащий, имеющий, включающий и включающий в себя следует истолковывать как открытые термины (т.е. означающие включающий, но не ограниченный этим), если не указано иное. Указание диапазонов значений в данном документе предназначено только для использования в качестве краткого способа индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение в пределах диапазона, если в данном документе не указано иное, и каждое отдельное значение включено в описание, также как если бы оно было индивидуально приведено в данном документе.
Как указано выше, в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает комбинацию лекарств, пригодных для лечения, профилактики, остановки, задержки начала и/или снижения риска развития, или уменьшения по меньшей мере одного симптома рака у субъекта, в том числе введение субъекту комбинированной терапии, включающей в себя эффективное количество ингибитора РАР и второго ингибитора. В некоторых вариантах осуществления изобретения вторым ингибитором является ингибитор МЕК. Предпочтительно, чтобы эти ингибиторы вводили в терапевтически эффективных дозах, которые совместно обеспечивают благоприятное воздействие. Введение может быть одновременным или последовательным.
Термин рак используется в настоящем документе для обозначения широкого спектра опухолей, в том числе всех солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований. Примеры таких опухолей включают, но не ограничиваются этим, лейкозы, лимфомы, миеломы, карциномы, метастатические карциномы, саркомы, аденомы, раковые заболевания нервной и мочеполовой систем. В примерах вариантов осуществления изобретения приведенные выше способы могут использоваться при лечении взрослых и детей от острого лимфобластного лейкоза, острого миелобластного лейкоза, карциномы коры надпочечников, связанных со СПИДом раковых заболеваний, анального рака, рака аппендикса, астроцитомы, базально-клеточной карциномы, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, рака костей, остеосаркомы, фиброзной гистиоцитомы, рака головного мозга, глиомы ствола мозга, астроцитомы мозжечка, злокачественной глиомы, эпендимомы, медуллобластомы, супратенториальных примитивные нейроэктодермальных опухолей, глиомы гипоталамуса, рака молочных желез, рака молочных желез у мужчин, бронхиальных аденом, лимфомы Беркитта, карциноидной опухоли, карциномы неизвестного происхождения, лимфомы центральной нервной системы, астроцитомы мозжечка, злокачественной глиомы, рака шейки матки, раковых заболеваний у детей, хронического лимфолейкоза, хронического миелолейкоза, хронических миелопролиферативных расстройств, колоректального рака, кожной Тклеточной лимфомы, эндометриального рака эпендимомы, рака пищевода, семейства опухолей Юинга, экстракраниальных опухолей зародышевых клеток, внегонадной опухоли зародышевых клеток, внепеченочного рака желчных протоков, внутриглазной меланомы, ретинобластомы, рака желчного пузыря, рака желудка, рака стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта, экстракраниальных опухолей зародышевых клеток, внегонадной опухоли зародышевых клеток, опухоли яичников зародышевых клеток, гестационной трофобластической опухоли, глиомы, волосатоклеточного лейкоза, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярного рака, лимфомы Ходжкина, неходжскинской лимфомы, гипофарингеального рака, глиомы гипоталамуса и зрительного пути, внутриглазной меланомы, опухоли островковых клеток, саркомы Капоши, рака почки, почечно-клеточного рака, рака гортани, рака губ и полости рта, мелкоклеточного рака легких, немелкоклеточного рака легкого, первичной лимфомы ЦНС, макроглобулинемии Вальденстрема, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, медуллобластомы, меланомы, карциномы Меркеля, злокачественной мезотелиомы, сквамозного рак шеи, множественного эндокринного неопластического синдрома, множественной миеломы, грибовидного микоза, миелодиспластических синдромов, миелопролиферативных расстройств, хронических миелопролиферативных расстройств, рака носовой полости и околоносовых пазух, рака носоглотки, нейробластомы, рака ротоглотки, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака паращитовидной железы, рака полового члена, рака глотки, феохромоцитомы, пинеобластомы и супратенториальных примитивные нейроэктодермальных опухолей, рака гипофиза, новообразований плазматических клеток, плевролегочной бластомы, рака предстательной железы, рака прямой кишки, рабдомиосаркомы, рака слюнных желез, саркомы мягких тканей, саркомы матки, синдрома Сезари, немеланомного рака кожи, рака тонкого кишечника, сквамозно-клеточной кар- 15 028135 циномы, сквамозно-клеточного рака шеи, супратенториальных примитивные нейроэктодермальных опухолей, рак яичка, рак горла, тимомы и карциномы вилочковой железы, рака щитовидной железы, переходно-клеточного рака, трофобластических опухолей, рака уретры, рака матки, саркомы матки, рака влагалища, рака вульвы и опухоли Вильмса.
В частности, рак может быть связан с мутацией в гене В-КАР. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак может представлять собой КАР-зависимый рак. Эти виды рака включают, но не ограничиваются этим, меланому, рак молочных желез, колоректальный рак, глиому, рак легких, рак яичников, саркому и рак щитовидной железы.
В конкретном варианте осуществления изобретения терапевтическая комбинация, представленная в настоящем документе, эффективна для лечения субъекта от ракового заболевания от умеренной до тяжелой степени.
Дозировки
Оптимальная доза комбинации агентов для лечения рака может быть определена эмпирически для каждого субъекта с использованием известных способов и зависит от множества факторов, в том числе: действия агентов; возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и диеты субъекта; времени и пути введения и других лекарственных средств, принимаемых субъектом. Оптимальные дозы могут быть установлены с помощью рутинного тестирования и процедур, хорошо известных в данной области.
Количество комбинации агентов, которое может быть объединено с материалами-носителями для получения единичной дозированной формы, будет изменяться в зависимости от личности пациента и конкретного способа введения. В некоторых вариантах осуществления изобретения стандартные лекарственные формы, содержащие комбинации агентов, описанные в настоящем документе, будут содержать такое количество каждого агента комбинации, которое вводят обычно при индивидуальном приеме агентов.
Лечащий врач или ветеринар, имеющие стандартную квалификацию в данной области, могут легко определить и прописать эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар могут начать с дозировок соединений по изобретению, используемых в фармацевтической композиции, меньших, чем требуемые для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно могут увеличивать дозу до тех пор, пока желаемый эффект не будет достигнут.
В общем, подходящей суточной дозой соединения по настоящему изобретению будет то количество соединения, которое является наименьшей дозой, эффективной для получения терапевтического эффекта. Такая эффективная доза обычно зависит от факторов, описанных выше, и легко определяется опытным специалистом в данной области.
В общем, терапевтически эффективные дозы соединений по настоящему изобретению для пациента при указанном использовании для обезболивания будут находиться в диапазоне от примерно 0,0001 до примерно 1000 мг на килограмм веса тела в сутки, более предпочтительно от примерно 0,01 до примерно 50 мг на кг в сутки.
При желании, эффективную суточную дозу действующего соединения можно вводить в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или большего количества дробных доз, вводимых по отдельности через соответствующие промежутки времени в течение суток, при необходимости, в стандартных лекарственных формах.
Фармацевтические составы и пути введения
Данное изобретение относится к фармацевтическим составам, содержащим комбинацию агентов для лечения рака, например, меланомы. Фармацевтические составы могут дополнительно содержать носитель или вспомогательное вещество, стабилизатор, ароматизатор и/или краситель.
Данное изобретение относится к фармацевтическим составам, содержащим комбинацию препаратов, которые могут являться, например, комбинацией двух типов агентов: (1) ингибитора КАР и/или фармакологически активных метаболитов, солей, сольватов и рацематов ингибитора и (2) ингибитора МЕК и/или фармакологически активных метаболитов, солей, сольватов и рацематов ингибитора МЕК.
Комбинацию агентов можно вводить различными путями, известными специалистам в данной области. Комбинацию агентов можно вводить человеку и другим животным перорально, парентерально, сублингвально, в виде аэрозоля или с помощью ингаляции, ректально, интрацистернально, интравагинально, внутрибрюшинно, трансбуккально или местно в виде стандартных лекарственных составов, содержащих обычные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и среды, если желательно. Местное введение может также включать в себя применение трансдермального введения, например, трансдермальных пластырей или ионофорезных устройств. Термин парентеральный, используемый в настоящем документе, включает подкожные, внутривенные, внутримышечные, интрастернальные инъекции или инфузии.
Способы изготовления лекарственных форм хорошо известны в данной области и описаны, например, в Кеш1пд1ои: ТЬе 8с1епсе аий РгасЬсе οί РЬагтасу, Маек РиЬЬкЫид Сотрапу, ЕакЮп. Ра., 19ΐ1ι ЕФЬои (1995). Фармацевтические композиции для использования в настоящем изобретении, могут представлять собой стерильные, апирогенные жидкие растворы или суспензии, покрытые оболочкой капсулы, суппозитории, лиофилизированные порошки, трансдермальные пластыри или другие формы, известные в дан- 16 028135 ной области.
Препараты для инъекций, например стерильные водные или масляные суспензии для инъекций, могут быть составлены в соответствии с признанными методиками с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильным препаратом для инъекций может также быть стерильный раствор, суспензия или эмульсия для инъекций в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, раствор в 1,3-пропандиоле или 1,3-бутандиоле.
Некоторыми из приемлемых носителей и растворителей, которые могут использоваться, являются вода, раствор Рингера (в соответствии с Фармакопеей США) и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные нелетучие масла. Для этой цели может использоваться любое нейтральное нелетучее масло, включая синтетические моно или диглицериды. Кроме того, при изготовлении препаратов для инъекций могут использоваться жирные кислоты, такие как олеиновая кислота. Составы для инъекций можно стерилизовать, например, фильтрованием через удерживающий бактерии фильтр или включением стерилизующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые могут быть растворены или диспергированы в стерильной воде или другой стерильной среде для инъекций перед использованием.
Для пролонгирования действия препарата часто желательно замедлить всасывание препарата при подкожной или внутримышечной инъекции. Это может быть достигнуто путем использования жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала с плохой растворимостью в воде. Таким образом, скорость абсорбции препарата будет зависеть от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. В альтернативном варианте, замедленное всасывание вводимой парентерально лекарственной формы может быть осуществлено путем растворения или суспендирования лекарственного средства в масляном носителе. Депо-формы для инъекций получают путем изготовления микроинкапсулированных матриц лекарственного средства в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарственного средства и полимера, а также от природы конкретного используемого полимера, можно регулировать скорость высвобождения лекарственного средства. Примеры других биоразлагаемых полимеров включают полиортоэфиры и полиангидриды. Депо-составы для инъекций также можно получить путем включения лекарственного средства в липосомы или микроэмульсии, которые совместимы с тканями организма.
Композициями для ректального или вагинального введения предпочтительно являются суппозиториями, которые могут быть получены путем смешивания соединения по настоящему изобретению с подходящими нераздражающими вспомогательными веществами или носителями, такими как масло какао, полиэтиленгликоль или воск для суппозиториев, которые являются твердыми при комнатной температуре, но жидкими при температуре тела и, следовательно, плавятся в прямой кишке или вагинальной полости и высвобождают действующее соединение.
Твердые лекарственные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах действующее соединение смешивают по меньшей мере с одним инертным, фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом или носителем, таким как цитрат натрия или дикальцийфосфат, и/или а) наполнителями или разбавителями, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота, Ь) связующими веществами, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и гуммиарабик, с) увлажнителями, такими как глицерин, б) дезинтегрирующими (способствующими распадаемости) агентами, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия, е) замедляющими растворение агентами, такими как парафин, £) ускорителями всасывания, такими как четвертичные аммониевые соединения, д) смачивающими агентами, такими как, например, ацетиловый спирт и моностеарат глицерина, к) абсорбентами, такими как каолин и бентонитовая глина, и ί) смазывающими веществами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственная форма может также содержать буферные агенты.
Твердые композиции подобного типа могут также использоваться в качестве наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах с использованием таких вспомогательных веществ, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п.
Твердые лекарственные формы в виде таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул могут быть получены с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия и другие покрытия, хорошо известные в области изготовления фармацевтических препаратов. Необязательно, они могут содержать агенты, придающие непрозрачность, и могут также иметь композицию, которая высвобождает действующий ингредиент (действующие ингредиенты) только (или предпочтительно) в определенной части кишечника, необязательно, замедленным образом. Примеры используемых композиций для заключения в них действующих ингредиентов включают полимерные вещества и воски.
Действующие соединения также могут представлять собой микрокапсулы с одним или несколькими вспомогательными веществами, указанными выше. Твердые дозированные формы в виде таблеток, дра- 17 028135 же, капсул, пилюль и гранул могут быть получены с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия, контролирующие высвобождение покрытия и другие покрытия, хорошо известные в области изготовления фармацевтических препаратов. В таких твердых лекарственных формах действующее соединение может быть смешано по меньшей мере с одним инертным разбавителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие лекарственные формы могут также включать, в соответствии с обычной практикой, дополнительные вещества, отличные от инертных разбавителей, например, смазывающие вещества для таблетирования и другие добавки для таблетирования, такие как стеарат магния и микрокристаллическая целлюлоза. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственные формы могут также содержать буферные агенты. Они, необязательно, могут содержать агенты, придающие непрозрачность, и также могут представлять собой композицию, которая высвобождает действующий ингредиент (действующие ингредиенты) только (или предпочтительно) в определенной части кишечника, необязательно, замедленным образом. Примеры используемых композиций для заключения в них действующих ингредиентов включают полимерные вещества и воски.
Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к действующим соединениям жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как, например, вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, зародышевое, оливковое, касторовое и кунжутное), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана, и их смеси. Кроме инертных разбавителей, пероральные композиции могут также включать адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подсластители, вкусовые и ароматизирующие агенты.
Лекарственные формы для местного или трансдермального введения соединения по настоящему изобретению включают мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, порошки, растворы, спреи, ингалируемые составы или пластыри. Действующий компонент смешивают в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и любыми необходимыми консервантами или буферами, которые могут потребоваться. Офтальмологические лекарственные формы, ушные капли и тому подобное, также рассматриваются, как входящие в объем настоящего изобретения.
Мази, пасты, кремы и гели могут содержать (в дополнение к действующему соединению по настоящему изобретению) вспомогательные вещества, такие как животные и растительные жиры, масла, воски, парафины, крахмал, трагакант, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, кремниевую кислоту, тальк и оксид цинка, или их смеси.
Композиции по изобретению также могут быть составлены для доставки в виде жидкого аэрозоля или сухого порошка для ингаляции. Жидкие аэрозольные составы можно распылять преимущественно до таких размеров капель, которые могут доставляться в терминальные и респираторные бронхиолы.
Аэрозольные композиции по изобретению могут быть доставлены с помощью устройства для получения аэрозоля, например, струйного распылителя, вибрирующей пористой пластины или ультразвукового распылителя, предпочтительно выбираемого, чтобы получить аэрозольные частицы, имеющие средний массовый медианный диаметр преимущественно в пределах от 1 до 5 мкм. Кроме того, предпочтительно, чтобы композиция имела сбалансированные осмолярность (ионную силу) и концентрацию хлорида, и наименьший объем аэрозоля, способный обеспечивать эффективную дозу соединений по изобретению в месте инфекции. Кроме того, предпочтительно, чтобы аэрозольный состав не ухудшал функции дыхательных путей и не вызывал нежелательных побочных эффектов.
Аэрозольные устройства, подходящие для введения аэрозольных составов по изобретению, включают, например, струйный распылитель, вибрирующую пористую пластину, ультразвуковые распылители и ингаляторы сухого порошка с подзарядкой, которые способны распылять состав по изобретению до аэрозольных частиц с размером преимущественно в диапазоне от 1 до 5 мкм. Преимущественно в данной заявке означает, что размер по меньшей мере 70%, предпочтительно более чем 90% всех получаемых аэрозольных частиц находится в пределах диапазона от 1 до 5 мкм. Струйный распылитель работает под давлением воздуха, разбивающего жидкий раствор в аэрозольные капели. Распылители с вибрирующей пористой пластиной работают с использованием ультразвукового вакуума, получаемого с помощью быстро вибрирующей пористой пластины, для того чтобы продавить каплю растворителя через пористую пластину. Ультразвуковой распылитель работает с помощью пьезоэлектрического кристалла, который разбивает жидкость на мелкие аэрозольные капли. Доступны разнообразные подходящие устройства, включая, например, распылители с вибрирующей пористой пластиной АЕКОЖВ и АЕКОЭО8Е (АегоОеи, 1пс., 8иипууа1е, СаШотта), распылители 8ГОЕ8ТКЕАМ (МеШс Άίά ИТ. Ае51 8и88ех, Епд1аиф, струйные распылители РАК1 ЬС и РАК1 ЬС 8ТАК (Рап КезрпаЮгу ЕсциртеШ, 1ис., КюЬтоиф Уицииа) и ультразвуковые распылители Аетокоию (ЭеУПЫзз МеШ/йизсНе РгсЛикЮ (ОеШзсЫаиф ОтЬН, НеШеи, Оегтаиу) и иЬТКААШЕ (Отгои НеаИЪсате, 1ис., Уетиои Ηί11δ, ΙΙΙίηοίδ).
Соединения по изобретению также могут быть составлены для использования в качестве порошков
- 18 028135 и аэрозолей для местного применения, которые могут содержать, в дополнение к соединениям по настоящему изобретению, вспомогательные вещества, такие как лактоза, тальк, кремниевая кислота, гидроксид алюминия, силикаты кальция и полиамидный порошок, или смеси этих веществ. Спреи могут дополнительно содержать обычные пропелленты, такие как хлорфторуглеводороды.
Трансдермальные пластыри имеют дополнительное преимущество, обеспечивая контролируемую доставку соединения в организм. Такие лекарственные формы могут быть изготовлены путем растворения или диспергирования соединения в соответствующей среде. Усилители всасывания также могут использоваться для увеличения переноса соединения через кожу. Скорость можно регулировать с помощью либо регулирующей скорость мембраны либо диспергирования соединения в полимерной матрице или геле. Соединения по настоящему изобретению также может вводиться в форме липосом. Как известно в данной области, липосомы обычно получают из фосфолипидов или других липидных веществ. Липосомы образуются из монослойных или многослойных гидратированных жидких кристаллов, которые диспергированы в водной среде. Может использоваться любой нетоксичный, физиологически приемлемый и метаболизируемый липид, способный образовывать липосомы. Настоящие композиции в липосомной форме могут содержать (в дополнение к соединению по настоящему изобретению) стабилизаторы, консерванты, вспомогательные вещества и т.п. Предпочтительными липидами являются фосфолипиды и фосфатидилхолины (лецитины), как природные, так и синтетические. Способы получения липосом известны в данной области техники. См., например, Ртексой (ей.), Мейюйк ίη Се11 Вю1оду, Уо1ите XIV, Асайетю Рге88, №ν Уотк, 1976, р. 33 и далее.
Примеры
Пример 1. Определение и характеристика резистентных мутаций СКАР ίη νίΙΐΌ.
Для определения соматических мутаций КАР, которые придают устойчивость к ингибиторам КАР, получали панели мутантов с помощью насыщающего случайного мутагенеза с использованием бактериальной системы ХЫ-Кей и ретровирусных векторов, экспрессирующих кДНК С-КАР (Етегу е! а1., 1й. 2009, Аад1е е! а1., 1й. 2011). Полученную случайным мутагенезом насыщенную кДНК-библиотеку мутаций СКАР экспрессировали в клетках меланомы А375, несущих мутацию ВКАР''6001'', которая весьма чувствительна к ингибиторам КАР (Н е! а1., 2007; Тка1 е! а1., 2008, Етегу е! а1., 1й. 2009). Эти клетки культивировали в течение 4 недель в присутствии полностью ингибирующих концентраций РЬХ4720 (1,5 мкМ), и появившиеся резистентные клоны объединяли и характеризовали с помощью массивного параллельного секвенирования (Етегу е! а1., 1й. 2009, Аад1е е! а1., 1й. 2011). Все полученные мутанты С-КАР (фиг. 1А) могли стабильно экспрессироваться в клетках А375 (фиг. 9А). Кроме того, 8 из 10 самых выделяющихся мутаций С-КАР придавали клеткам А375 биохимическую резистентность к ингибитору КАР, РЬХ4720, о чем свидетельствуют уровни р-МЕК и р-ЕКК (фиг. 9В). Одна из этих аллелей (СКАРО361А) придавала значительную парадоксальную активацию р-МЕК при высоких концентрациях РЬХ4720 (фиг. 9В).
Мутации СКАР, полученные при скрининге, картировали на кристаллической структуре киназного домена СКАР (340-618) (НаПйаккПюи е! а1., 2010) (код РОВ: 30М^ (фиг. 1В). Три мутации не отображены, так как полноразмерная структура СКАР не разрешена до сих пор. Резистентные аллели СКАР сгруппированы в двух различных областях - за пределами или в пределах регуляторной области (Νконец) и в киназном домене (С-конец) (фиг. 1С). СКАР состоит из двух консенсусных сайтов связывания 14-3-3, и два из резистентных аллелей §257Р и Р261Т занимают один из консенсусных сайтов связывания 14-3-3 в СК2, за исключением аллеля Е104К в СК1-области (фиг. 1В).
Вторая категория резистентных аллелей охватывает киназный домен, включая глицин-богатую петле. Мутации, такие как 0356Е и 03 61А были найдены в остатках глицина в АТФ-связывающей Р-петле, мотиве ОхОххО. Мутации Р-петли были обнаружены у нескольких протеинкиназ (СЬт18!орйег е! а1., 2007), включая ВКАР, которая обладают способностью трансформировать клетки путем активации МЕК (Аап е! а1., Се11 116: 855-867, 2004; Оатпей е! а1., 1й. 2005). Другая подгруппа мутаций (§427Т, Ό447Ν, М4691, Е478К и К554К) расположена вне активационного сегмента (фиг. 1В).
Пример 2. Функциональная характеристика резистентных мутантов С-КАР.
Для изучения функциональных последствий выявленных резистентных аллелей С-КАР, представительные мутации (фиг. 1А) вводили в клетки меланомы А375 и экспрессировали в них. Биохимический анализ после обработки ингибитором КАР, РБХ4720, показывает ослабление фосфорилирования Мек (рМек) и Егк (рЕгк) при концентрации ингибитора 2 мкМ (фиг. 2А) в клетках А375 и клетках, экспрессирующих АТ-С-КАР. Тем не менее, резистентные аллели показывали устойчивое фосфорилирование Мек и Егк при той же концентрации (фиг. 2А). Кроме того, резистентные аллели, сгруппированные в области связывания 14-3-3 (§257Р и Р261Т), один аллель в области связывания АТФ, а именно О361А, придавали выраженную фармакологическое резистентность к РБХ4720. Эти мутанты повышали 0150 для РБХ4720 примерно в 100 раз (§257Р и Р261Т) и в 30 раз (О361А) по сравнению с белком дикого типа (АТ) (0,4 мкМ) (фиг. 2С). Кроме того, стабильность С-КаР коррелирует с фосфорилированием §259 и §621 (фиг. 1С) и последующим связыванием 14-3-3, а активация С-КаР коррелирует с фосфорилированием остатков §338 и §621 (фиг. 1С) (Ае11Ьгоск и е! а1., 1й. 2004). РБХ4720 индуцировал фосфорилирование §338 и небольшое увеличение фосфорилирования §621, в частности в резистентных мутантах §257Р, Р261Т и
- 19 028135
О361, что согласуется с парадоксальной активацией рМек в этих вариантах (фиг. 2В). Эта активация МЕК/ЕКК-сигнального пути с помощью С-КАР подавлялась фармакологическим ингибированием МЕК (фиг. 2О). Клетки, экспрессирующие белок дикого типа (АТ) показывали небольшое увеличение фосфорилирования 8338, но не 8621. Напротив, сайт 8259 фосфорилировался в базальных условиях, и эктопическая экспрессии АТ-С-КАР усиливала эффект при отсутствии РЬХ4720 (фиг. 2В). Однако РЬХ4720 также индуцировал фосфорилирование 8259 у резистентных мутантов, но эти мутанты имели сравнительно меньшие уровни фосфорилирования 8259 (фиг. 2В), и этот эффект ослаблялся в присутствии ΛΖΌ6244 с уменьшением уровней рЕгк (фиг. 2Е). Поскольку С-КАР сильно модулируется и активируется путем фосфорилирования, эти данные свидетельствуют о том, что существует активация путем обратной связи и ингибирующая петля, которая постоянно работает, поддерживая устойчивость и жесткость в исходящем МАРК-сигнальном пути. Следовательно, активность резистентных аллелей С-КАР можно модулировать с помощью баланса между степенью фосфорилирования сайтов, контролирующих активность С-КАР (8338, 8621), и ингибирующими сайтами (8259). Только для одного аллеля (О361) были получены данные фармакологической устойчивости к ингибированию МЕК (фиг. 2Р и 2О).
Пример 3. Резистентные мутанты С-КАР сильнее ассоциированы с В-КАР.
Совокупные данные приведенные выше, показывают, что резистентные аллели, охватывающие консенсусный сайт связывания 14-3-3 (8257Р и Р261Т) и область связывания АТФ (О361А) (фиг. 1С), придают устойчивость за счет уменьшения ингибирования фосфорилированных МЕК и ЕКК. Кроме того, было показано, что двойной мутант 8259/8621 полностью блокирует взаимодействие С-КАР и 14-3-3, не влияя при этом на взаимодействие с КА8 или МЕК (Τζίνίοη и е! а1., Ма!иге 394: 88-92, 1998). Для исследования механизма, лежащего в основе этого явления, авторы иммунопреципитировали С-КАР из 2 93/Т-клеток, эктопически экспрессирующими все резистентные аллели, выявленные в ходе первичного скрининга. Мутации, которые снижали взаимодействие с 14-3-3 и повышали взаимодействие с В-КАР, поддерживали более высокий статус фосфорилирования МЕК и ЕКК по сравнению с белком дикого типа (АТ) (фиг. 3А), а также увеличивали киназную активность С-КАР ίη νί!το (данные не представлены). Эти результаты подтвердили статус взаимодействия 14-3-3 и В-КАР в клетках А375, экспрессирующих аллели С-КАР (фиг. 3В). Следовательно, эти резистентные мутанты обладают более высокой активностью в отношении своего субстрата даже в отсутствие онкогенного инициатора, такого как (АеЪет е! а1., 2001).
Пример 4. Биохимическая характеристика резистентных аллелей С-КАР с использованием (8)метил 1-(4-(3-(5-хлор-2-фтор-3-(метилсульфонамидо)фенил)-1-изопропил-1Н-пиразол-4-ил)пиримидин2-иламино)пропан-2-илкарбамата.
Для того чтобы исключить возможность неэффективного связывания РБХ4720 резистентными мутантами, были исследованы ответы мутантов С-КАР на (8)-метил 1-(4-(3-(5-хлор-2-фтор-3-(метилсульфонамидо)фенил)-1-изопропил-1Н-пиразол-4-ил)пиримидин-2-иламино)пропан-2-илкарбамат (ΝονηΠίκ) в клетках А375 и клетках, экспрессирующих АТ-С-КАР (фиг. 3С). Резистентные аллели С-КАР (8257Р, Р261 Т) увеличивали значения О150 для (8)-метил 1-(4-(3-(5-хлор-2-фтор-3-(метилсульфонамидо)фенил)1-изопропил-1Н-пиразол-4-ил)пиримидин-2-иламино)пропан-2-илкарбамата приблизительно в 10000 и 30000 раз соответственно, а О361А - в 20 раз (фиг. 3С). Как видно из фиг. 2С и Е, ответ на РБХ4720 и АΖ^6244 оставался таким же (фиг. 3В и Ό). Кроме того, биохимически резистентные мутанты С-КАР придавали резистентность к (8)-метил 1-(4-(3-(5-хлор-2-фтор-3-(метилсульфонамидо)фенил)-1-изопропил-1Н-пиразол-4-ил)пиримидин-2-иламино)пропан-2-илкарбамату даже в концентрации 1 мкМ (фиг. 3А).
Пример 5. Резистентные мутанты С-КАР придают устойчивость к Вемурафенибу (РБХ4032).
Вемурафениб высоко чувствителен к мутациям ВКАР^0®, но вызывает парадоксальную активацию Мек и Егк в клетках, экспрессирующих онкогенный Как (НаМБ'аккПюи е! а1., 2010; НеИогп е! а1., 2010; РоиБкакок е! а1., 2010). Были протестированы резистентные аллели С-КАР, для того чтобы определить, дают ли они аналогичный ответ на Вемурафениб в присутствии онкогенного В-КАР. Клетки А375, экспрессирующие АТ-С-КАР (0,4 мкМ) (фиг. 5А) показали сравнимые значения 0150 относительно обработанных РБХ4720 клеток АТ-С-КАР (фиг. 2В). Резистентность, придаваемая О361А, была в 50 раз выше, чем для АТ, в то время как ни удивительно, 8257Р и Р261Т проявляли повышенную резистентность к Вемурафенибу. Поскольку эти мутанты придавали резистентность даже в отсутствие онкогенного Как, дополнительно определяли, связана ли резистентность к ингибитору КаГ с повышенной активностью. Иммунопреципитировали тотальный С-КАР из экстрактов клеток А375, экспрессирующих варианты СКАР в присутствии и в отсутствие Вемурафениба. Мутации, которые показывали высокую резистентность (8257Р и Р261Т) во время фармакологического ингибирования (фиг. 5А), имели повышенную киназную активность ίη νίΙΐΌ по сравнению с АТ (фиг. 5В); однако резистентный мутант О361А показывал даже еще более высокую киназную активность в присутствии препарата (фиг. 5В). Более того, было показано, что резистентные аллели С-КАР остаются чувствительными к комбинированной терапии с использованием РБХ4720 и АΖ^6244 (фиг. 5С, Ό и Е).
В совокупности эти данные согласуются с идеей, что только оптимальная степень активации Егксигнального пути требуется клеткам для придания устойчивости.
- 20 028135
Пример 6. Резистентные аллели С-КАР обеспечивают возможность парадоксальной активации СКАР и повышенной димеризации
Парадоксальная активация МЕК/ЕКК, индуцируемая ингибиторами КАР, включает димеризацию белков КАР (Ηαΐζίναδδίΐίοιι с1 а1., 2010; РоиРкакок с1 а1., 2010). Более того, укороченная форма ΒΚΑΡν600Ε, которая дает повышенную димеризацию, придает устойчивость к ингибиторам КАР (РоиБкакок с1 а1., 2011). Для того чтобы определить, опосредуют ли резистентные мутации С-КАР резистентность за счет увеличения димеризации, клетки 293/Т ко-трансфецировали с использованием экспрессионных конструкций, в которых несколько представительных резистентных аллелей С-КАР были дифференциально помечены двумя различными эпитопами (Ηίδ/ν5 или Р1ад). Реакции иммунопреципитации проводили с использованием №2+-шариков (для захвата Ηίδ-меченного белка) с последующим иммуноблоттингом с использованием анти-Р1ад антител. В этих экспериментах все мутации С-КАР, которые придавали фармакологическую устойчивость к ингибиторам КАР, также показали повышенную гомодимеризацию по сравнению с С-КАР дикого типа (8257Р, Р261Т, С361А и Е478К). Как и ожидалось, повышенная димеризация обычно коррелирует с повышенным уровнем р-МЕК (фиг. 6А, исходный лизат). Аналогичные результаты были получены, когда Н18^5-меченные мутанты С-КАР ко-трансфецировали с Р1ад-меченным С-КАР дикого типа (фиг. 10А), хотя степень активации МЕК/ЕКК была как будто качественно снижена (фиг. 10А, исходный лизат). Три мутанта С-КАР, которые придавали наиболее выраженную фармакологическую резистентность к РБХ4720 и Вемурафенибу (8257Р, Р261Т и С361А) (фиг. 2С и 2Р) также показали наличие повышенного накопления общего белка (фиг. 6А, исходный лизат). Таким образом, резистентный фенотип, связанный с мутациями С-КАР, сильно коррелировал с димеризацией КАР.
В клетках 293Т (которые не имеют онкогенных мутаций ВКАР), повышенная димеризация С-КАР, определяемая присутствием резистентных мутаций, была устойчивой, но дополнительно не усиливалась при воздействии на трансфецированные клетки ингибитора КАР (Вемурафениба; фиг. 6В). Однако ингибитор КАР сильно индуцировал активацию С-КАР (подтверждаемую фосфорилированием 8338) и находящийся ниже МЕК/ЕКК-сигнальный путь (фиг. 6В, исходный лизат). Для определения влияния этих резистентных мутаций на собственную киназную активность С-КАР, проводили киназную реакцию ίη νίίτο на клетках 293Т, культивируемых в присутствии или в отсутствие ингибитора КАР. В случае отсутствия препарата, базальная киназная активность С-КАР (р-МЕК) заметно не увеличилась в результате присутствия резистентных мутаций в большинстве случаев (фиг. 6С). Единственным исключением являлся мутант СКАРО361А: в этом случае слабая базальная киназная активность коррелировала с высоким уровнем р-МЕК в соответствующих тотальных лизатах клеток (фиг. 6С). В отличие от этого, обработка клеток 293Т 2 мкМ Вемурафенибом до проведения анализа киназной активности ίη νίίτο приводила к заметному повышению киназной активности С-КАР для всех исследованных резистентных аллелей (фиг. 6С). Подобные эксперименты на клетках меланомы А375 (ВКАР'600Е) клеток выявили увеличение собственной киназной активности для трех самых сильных исследованных резистентных мутантов С-КАР (8257Р, Р261Т и С361А; фиг. 6Ό). Эта киназная активность дополнительно увеличивалась при воздействии на эти клетки Вемурафениба (фиг. 6Ό), что наблюдалось и в клетках 293Т. В совокупности, эти результаты свидетельствуют о том, что сильные резистентные мутанты С-КАР увеличивают как димеризацию КАР, так и опосредованную ингибитором КАР киназную активность С-КАР.
Пример 7. Резистентные мутанты С-КАР слабее связываются с 14-3-3 и сильнее гетеродимеризуются с В-КАР.
Приведенные выше совокупные данные свидетельствуют о том, что мутации С-КАР, охватывающие его консенсусный сайт связывания с 14-3-3 (8257Р и Р261Т) и АТФ-связывающую область в Р-петле (С361А), придают фармакологическую и биохимическую резистентность к ингибированию КАР, усиливают димеризацию КАР и увеличивают активацию киназы С-КАР после обработки ингибиторами КАР. Чтобы исследовать роль связывания с белком 14-3-3 в отношении димеризации КАР, проводили эксперименты по иммунопреципитации с использованием клеток, сконструированных для эктопической экспрессии резистентных аллелей С-КАР. Для изучения влияния фармакологического ингибирования КАР на связывание с 14-3-3 и гетеродимеризацию с В-КАР, эти эксперименты проводили с или без ингбирования КАР (в данном случае, с помощью Вемурафениба). В отсутствие ингибитора КАР, резистентные аллели С-КАР (8257Р, Р261Т и С361А), как правило, демонстрируют снижение взаимодействия с 14-3-3 £ и увеличение взаимодействия с В-КАР как в клетках 293Т (фиг. 7А), так и, в частности, в клетках меланомы А375 (ВКАР'600Е) (фиг. 7В). В клетках 293Т, усиленная гетеродимеризация С-КАР/В-КАР, вызванная мутациями С-КАР, коррелирует со стабилизацией белка С-КАР и сильным фосфорилированием МЕК/ЕКК (фиг. 7А). С другой стороны, сильная активации МЕК/ЕКК, наблюдаемая в клетках меланомы ВКАР'600Е, лишь незначительно повышалась за счет резистентных мутантов С-КАР (фиг. 7В); этот результат был ожидаем с учетом конститутивного онкогенного сигнального пути В-КАР в этих клетках. Интересно, что один из мутантов С-КАР (С356Е) демонстрировал очень низкое связывание с 14-3-3ζ в обоих типах клеток (фиг. 7А и 7В); однако С-КАРС356Е не показывал усиления гетеродимеризации с ВКАР, ни усиления МЕК/ЕКК-сигнального пути в нормальных условиях. Эти результаты свидетельствуют о том, что в то время как снижение связывания с 14-3-3 может способствовать усилению димеризации мутантного С-КАР, некоторая степень связывания с 14-3-3 (возможно в С-концевом домене) необходима
- 21 028135 для максимального усиления КАР-зависимого сигнального пути.
Как и ожидалось, ингибитор КАР Вемурафениб индуцировал гетеродимеризацию В-КАР/С-КАР в клетках 293/Т, эктопически экспрессирующих С-КАР дикого типа (фиг. 7А), но блокировал эту гетеродимеризацию в клетках меланомы А375 (фиг. 7В). В противоположность этому, эктопическая экспрессия самых сильных резистентных мутантов С-КАР позволяла поддерживать гетеродимеризацию с В-КАР даже в присутствии лекарственного препарата в клетках А375 (фиг. 7В). Эти результаты позволяют предположить, что ВКАР''6001'' принимает доминирующую конформацию, которая способствует гетеродимеризации со связанными с резистентностью вариантами С-КАР. Фармакологическое ингибирование КАР оказывало различное воздействие на взаимодействие 14-3-3/С-КАР в зависимости от клеточного генетического контекста. В клетках А375 (ВКАРУ600Е), Вемурафениб слабо снижал связывание 14-3-3ζ с С-КАР дикого типа, но не оказывал никакого эффекта на мутантов С-КАР8257Р, С-КАРР261Т и С-КАРО361А (фиг. 7В). С другой стороны, Вемурафениб усиливал это взаимодействие 14-3-3/С-КАР в клетках 293/Т (фиг. 7А). Эти данные обеспечили дополнительные свидетельства в пользу предпосылки, что резистентный фенотип, придаваемый этими мутантами С-КАР в контексте ВКЛР’'600Е. включал усиленную димеризацию КАР, которая коррелировала со снижением взаимодействия 14-3-3 и С-КАР.
Пример 8. Димеризация требуется для усиления МЕК/ЕКК-сигнального пути резистентными мутантами С-КАР
Для проверки того, является ли димеризация С-КАР необходимой для усиления МЕК/ЕККсигнального пути, придаваемого резистентными мутантами С-КАР, по остатку К401 вводили мутацию аргинин->гистидин (С-КАРК401Н) (фиг. 10В). Ранее было показано, что этот мутант разрушает гомодимеризацию С-КАР (На1/каззПюи с1 а1., Иа1иге 464: 431-435, 2010; Роийкакоз с1 а1., Иа1иге 464:427-430, 2010). Нарушающую димеризацию мутацию, К401Н, вводили в соответствующие резистентные аллели С-КАР. Как и ожидалось, оказалось, что двойные мутанты С-КАР были в основном не в состоянии активировать МЕК/ЕКК-сигнальный путь (фиг. 8А). Затем проводили ко-трансфекции с использованием дифференциально меченных различными эпитопами резистентных С-КАР/К401Н-двойных мутантов. Как описано выше, резистентные аллели С-КАР усиливали гомодимеризацию С-КАР независимо от ингибитора КАР (фиг. 8В). В противоположность этому, введение аллеля К401Н подавляло гомодимеризацию С-КАР и блокировало МЕК/ЕКК-сигнальный путь для большинства исследуемых мутантов С-КАР. Исключением из этого правила был аллель С-КАРО361А, который проявлял конститутивную (хотя и заметно сниженную) активацию МЕК/ЕКК, которая дополнительно индуцировалась воздействием Вемурафениба, даже при совместной экспрессии с двойным мутантом с нарушенной димеризацией. В совокупности с результатами анализа киназной активности ίη νίίΓο, приведенными выше, эти данные позволяют предположить, что аллель С-КАР0361'''К''|0|Н может также включают повышенную собственную киназную активность. В целом, эти результаты прямо свидетельствуют о том, что усиление МЕК/ЕККсигнального пути, придаваемое резистентными мутантами С-КАР, требует димеризации КАР. Они могут также обеспечить обоснование для будущего развития аллостерических ингибиторов КАР, которые нарушают интерфейс димеризации КАР.
Способы
Культуры клеток
Клетки 293/Т, А375 (АТСС) и РНоешх (А11е1е Вю1есН) культивировали и поддерживали при 37°С в модифицированной Дульбекко среде Игла, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2.
Получение панели случайных мутантов С-КАР кДНК С-КАР клонировали в вектор ρ\νΖΡ-ΒΗ·ΐ3ΐ (дар от ί. ВоеЬт апй V. С. НаЬп) рекомбинационным клонированием (ίηνίΐΐΌ^η). Направленные мутации были введены в С-КАР кДНК с использованием набора ЦшскСЬапде §йе ίί БйесЮй Ми1адепез13 (81га1адепе). Случайный мутагенез выполняли на основании установленного протокола (Етегу е1 а1., И. 2009). Плазмиды с мутантными вариантами С-КАР использовали для инфицирования клеток меланомы А375. После отбора на бластицидине, клетки высевали на чашки диаметром 15-см и культивировали в присутствии ингибитора КАР, РЬХ4720 (1,5 мкМ) в течение 4 недель до появления резистентных клонов.
Секвенирование ДНК с-КАР
Клетки резистентные к РЬХ4720 объединяли из панели случайных мутантов, и выделяли геномную ДНК (с помощью набора Ц1адеп ИИеазу). кДНК С-КАР амплифицировали на геномной ДНК с использованием праймеров, специфичных к последовательностям вектора, фланкирующим 5'- и 3'-концы, и секвенировали по методу Сэнгера, используя известные протоколы.
Анализ массивного параллельного секвенирования
Необработанные данные из дорожек массивного параллельного секвенирования (Шипина; 2-3 млн последовательностей по 36 пар оснований на дорожку) были проанализированы с помощью алгоритма для секвенирования нового поколения (Етегу е1 а1., РИА§, 2009). Выходные данные из файлов данных, представляющих последовательность нуклеотидов, степень качества для каждого основания, обнаруженные варианты и выравнивание с эталонной последовательностью кДНК (с использованием для выравнивания алгоритма ЕЬАИИ) были интегрированы и обрабатывались для каждого прогона. Для всех
- 22 028135 оснований было определено покрытие (то есть, число фрагментов, включающий каждое основание из эталонной кДНК), и вариантные аллели были картированы из отдельных фрагментов ДНК на эталонной последовательности. Была определена частота изменения для каждого типа аллеля, не соответствующего дикому типу, и средний балл для варианта (АУ8) вычисляли как среднее значение всех оценок качества для данной позиции и данного вариантного аллеля. Все мутации в кодирующей области были транслированы, для того чтобы определить аминокислотные вариации (при возникновении таковых), и данные для часто встречающихся (>0,5%) и высокого качества (АУ8 >7) мутаций были загружены в базу данных ССОО.
Ретровирусные инфекции
Клетки РЬоешх (с конфлюентностью 70%) трансфецировали р^Ζ^ВIа8ΐ-С-КΑР или мутантами с использованием Ридепе 6 (КосЬе). Супернатанты, содержащие вирус, пропускали через фильтрующую насадку на шприц с мембраной 0,45-мкм. Клетки А375 были инфицированы в течение 16 ч вирусом совместно с полибреном (4 мкг/мл, 81дта). Селективный маркер, бластицидин (3 мкг/мл) вводили через 48 ч после инфекции.
Вестерн-блот анализ
Образцы экстрагировали после двукратной промывки РВ8 и лизировали буфером, содержащим 150 мМ №С1. 50 мМ Тг18, рН 7,5, 1 мМ ЕИТА, РМ8Р, фторид натрия, ортованадат натрия и коктейль протеазных ингибиторов, в присутствии 1% ΝΓ-40. Содержание белка оценивали с помощью реагента для анализа белков (Вю-Кай) в соответствии с инструкциями изготовителя. Равное количество тотальных клеточных лизатов наносили на 8-16%-е готовые ДСН-полиакриламидные гели и разделяли в них. Белки переносили на поливинилидендифторидные мембраны в аппарате Тгап8-В1о1. Мембраны блокировали 5%-м обезжиренным молоком в ТВ8, содержащем 0,1% Т\\ееп 20, в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. Мембраны инкубировали с моноклональными или поликлональными антителами, выработанными против белка, представляющего интерес, в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С с последующими тремя промывками с ТВ8, содержащем 0,1% Тмееп 20. Иммунореактивность с первичными антителами на С-КАР, 8259С-КАР, 8338С-КАР, 8621СКАР, рЕКК, ЕКК, рМЕК, МЕК, 14-3-3ζ, Р1ад (Се11 81дпа1шд), В-КАР (8ап1а Сгн/ Вю1есЬпо1оду) и актин (81дта) визуализировали с использованием вторичных антикроличьих (ВИ Тгапкйисйоп лаборатории) или анти-мышиных (8ап1а Сгн/ Вю1есЬпо1оду) антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, и последующей проявкой с помощью набора ЕСЬ Р1и8 (Атег8Ьат Вю8шепсе8) и авторадиографии на пленке Х-ОМАК ТАК. Полосы были отсканированы и количественно оценены в системе Иос Ое1 с использованием программного обеспечения ОиаШЦу Опе.
Иммунопреципитация
Для иммунопреципитации с С-КАР антителом (ВИ Вю8шепсе8) суспензию белка О, конъюгированного с сефарозой (ТЬегто 8аепЬйс), промывали 1хРВ8 и инкубировали с антителом к С-КАР (ВИ Вю8шепсе8) или нормальными 1дО мыши (контроль) в течение 1 ч при 4°С. После трех промывок буфером для лизиса, сефарозу инкубировали с тотальными клеточными лизатами (0,5 мг тотального белка) в течение 2 ч, а затем три раза промывали буфером для лизиса. Затем белки элюировали путем кипячения в 1х буфере для образцов, содержащем ДСН.
Анализ киназной активности С-КАР
Клетки 293Т (с конфлюентностью 70%) трансфецировали 6 мкг плазмид рс-^NΑ с Н18- или У5тегом на С-конце, содержащих К-КАР-^Т и вариантные аллели С-КАР. Клетки обрабатывали Вемурафенибом (А11е1е В1о1есЬ) в течение 1 и 48 ч после трансфекции, лизаты экстрагировали по общему протоколу. Иммунопреципитацию с использованием кобальтовых шариков выполняли в течение ночи или в течение 1 ч при 4°С. Связавшие белок кобальтовые шарики инкубировали с 20 мкл смеси АТР/магний (в буфере, содержащем 20 мМ Мор8 рН 7,2, 25 мМ β-глицерофосфат, 5 мМ ЕОТА, 1 мМ №3УО4, 1 мМ ИТТ, 75 мМ МдС12 и 0,5 мМ АТФ), 20 мкл буфера для разведения (20 мМ Мор8, рН 7,2, 25 мМ глицерофосфата, 5 мМ ЕОТА, 1 мМ ортованадата натрия, 1 мМ ИТТ) и 1 мкг неактивной МЕК (полученной от компании МйЬроге) в течение 30 мин при 30°С. Фосфорилированный продукт МЕК был обнаружен иммуноокрашиванием с использованием антител к р-МЕК (Се11 81дпа1шд ТесЬпо1оду) и относительный сигнал от р-МЕК количественно определяли с помощью денситометрии, нормализуя количество на суммарный исходный С-КАР и сравнивая с С-КАР-^Т в качестве эталона.
Анализ киназной активности С-КАР (А375)
Клетки А375, инфицированные диким типом и мутантными аллелями С-КАР, культивировали в отсутствие и в присутствии РБХ4032 (А11е1е В1о1есП) в течение 16 ч. Лизаты получали в буфере, содержащем 150 мМ №С1, 50 мМ Тп8, рН 7,5, 1 мМ ЕИТА, РМ8Р, фторид натрия, ортованадат натрия и коктейль протеазных ингибиторов, в присутствии 1%-го ΝΓ-40. Иммунопреципитацию с антителами к СКАР проводили в течение ночи и связавшие белки шарики промывали три раза буфером для лизиса с последующей однократной промывкой киназным буфером. Шарики инкубировали с 20 мкл смеси АТФ/магния (МйЬроге) и 0,5 мкг неактивной МЕК (МйЬроге) в течение 30 мин при 30°С. Фосфорилированный субстрат МЕК детектировали с помощью иммуноблоттинга.
- 23 028135
Анализы фармакологического подавления роста
Культивируемые клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 3000 клеток на лунку для всех краткосрочных культур меланомы, включая А375. Через 16 ч, выполняли серийные разведения соединения в ΌΜδΟ и переносили к клеткам, получая концентрации лекарственного средства, основанные на его эффективности, гарантируя при этом, чтобы финальная концентрация ΌΜδΟ не превышала 1%. Ингибитор Β-КАЕ, РЬХ4720, был приобретен от 8утапз15, РЬХ4032 был приобретен от (А11е1е Вю!есЬ), ΛΖΌ6244 был приобретен от 8е11еск Скеткак), и ΟΞΚ1120212 был приобретен от Асйуе Вюскет). Через 4 дня после добавления лекарственного средства жизнеспособность клеток измеряли с использованием водного нерадиоактивного анализа пролиферации Се11-Тйет-96 (Рготеда). Жизнеспособность рассчитывали как процент от контроля (необработанных клеток) после вычитания фона. Для каждой клеточной линии было сделано как минимум шесть повторов, и весь эксперимент был повторен по меньшей мере три раза. Данные из анализа фармакологического ингибирования роста моделировали с использованием нелинейной регрессионной аппроксимации с сигмоидальной зависимостью доза-реакция. Эти кривые были отображены с помощью программы ОгарНРай Ргкт 5 для \νίιΠο\Υ5 (ОгарНРай). Значения ΟΙ50 вычисляли путем определения наклона линии, соединяющей точки, фланкирующие точку 50%.
Определения и описания, представленные в настоящем документе, превалируют над и заменяют собой все другие, включенные посредством ссылки. Хотя изобретение в настоящем документе описано в связи с предпочтительными вариантами осуществления изобретения, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что конкретно не описанные добавления, модификации, замены и исключения могут быть осуществлены без отступления от сути и объема настоящего изобретения, определенных в прилагаемой формуле изобретения. Поэтому предполагается, что приведенное выше подробное описание должно рассматриваться как иллюстративное, а не ограничивающее, и следует понимать, что суть и объем настоящего изобретения определяются нижеследующей формулой изобретения, включая ее эквиваленты.

Claims (35)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант полипептида С-КАЕ, имеющий активность С-КАЕ, причем указанный вариант содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с диким типом полипептида С-КАЕ, имеющим ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2, при этом указанная замена придает устойчивость клеткам, экспрессирующим вариант полипептида С-КАЕ, к одному или нескольким ингибиторам КАЕ.
  2. 2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, в которой по меньшей мере одна аминокислотная замена встречается в одной или нескольких аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из 104Е, 257δ, 261Р, 356О, 361О, 427δ, 447Ό, 469М, 478Е и 554К.
  3. 3. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, в которой по меньшей мере одна замена выбрана из группы, состоящей из 104Е>К, 2578>Р, 261Р>Т, 356О>Е, 361О>А, 427δ>Τ, 447Ό>Ν, 469М>1, 478Е>К и 554К>К.
  4. 4. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, в которой по меньшей мере одна замена выбрана из группы, состоящей из 257δ, 261Р и 361О.
  5. 5. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-4, в которой ингибитор КАЕ выбран из группы, состоящей из КАЕ265, сорафениба, δΒ590885, РЬХ4720, РЬХ4032, ОЭС-0879, ΖΜ 336372 и (З)-метил 1-(4-(3-(5-хлор-2-фтор-3-(метилсульфонамидо)фенил)-1-изопропил-1Н-пиразол-4ил)пиримидин-2-иламино)пропан-2-илкарбамата.
  6. 6. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-4, в которой ингибитором КАЕ является РЬХ4032.
  7. 7. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.1.
  8. 8. Клетка-хозяин, содержащая экспрессионный вектор по п.7.
  9. 9. Выделенный вариант полипептида С-КАЕ, имеющий активность С-КАЕ, причем указанный полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с диким типом полипептида С-КАЕ, имеющим ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2, при этом указанная замена придает устойчивость клеткам, экспрессирующим вариант полипептида С-КАЕ, к одному или нескольким ингибиторам КАЕ.
  10. 10. Вариант полипептида С-КАЕ по п.9, в котором по меньшей мере одна аминокислотная замена встречается в одной или нескольких аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из 104Е, 257δ, 261Р, 356О, 361О, 427δ, 447Ό, 469М, 478Е и 554К.
  11. 11. Вариант полипептида С-КАЕ по п.9, в котором по меньшей мере одна замена выбрана из группы, состоящей из 104Е>К, 2578>Р, 261Р>Т, 356О>Е, 361О>А, 427δ>Τ, 447Ό>Ν, 469Μ>Ι, 478Е>К и 554К>К.
  12. 12. Вариант полипептида С-КАЕ по п.9, в котором по меньшей мере одна замена выбрана из группы, состоящей из 257δ, 261Р и 361О.
  13. 13. Вариант полипептида С-КАЕ по любому из пп.9-12, в котором ингибитор КАЕ выбран из группы, состоящей из КАЕ265, сорафениба, δΒ590885, РБХ4720, РБХ4032, ОЭС-0879, ΖΜ 336372 и (δ)- 24 028135 метил 1-(4-(3-(5-хлор-2-фтор-3-(метилсульфонамидо)фенил)-1-изопропил-1Н-пиразол-4-ил)пиримидин2-иламино)пропан-2-илкарбамата.
  14. 14. Вариант полипептида С-КАР по любому из пп.9-12, в котором ингибитором КАР является РБХ4032.
  15. 15. Антитело, которое специфически связывается с полипептидом по п.9.
  16. 16. Способ лечения субъекта, имеющего рак, причем способ включает:
    (a) выделение нуклеиновой кислоты из раковых клеток пациента;
    (b) анализ, по меньшей мере, участка молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид СКАР, на наличие одной или нескольких мутаций в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид С-КАР, которые меняют идентичность аминокислотного остатка в одной или нескольких аминокислотах кодируемого полипептида С-КАР по сравнению с диким типом полипептида С-КАР в одной или нескольких позициях, выбранных из группы, состоящей из 104Е, 2578, 261Р, 3560, 3610, 4278, 447Ό, 469М, 478Е и 554К;
    (c) введение субъекту эффективного количества ингибитора КАР и эффективного количества второго ингибитора, когда молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотиды, которые изменяют аминокислотный остаток в одной или нескольких аминокислотах кодируемого полипептида С-КАР по сравнению с диким типом полипептида С-КАР.
  17. 17. Способ по п.16, в котором вторым ингибитором является ингибитор МЕК.
  18. 18. Способ по п.16 или 17, в котором ингибитор КАР выбран из группы, состоящей из КАР265, сорафениба, 8В590885, РБХ4720, РБХ4032, 0ПС-0879, ΖΜ 336372 и (8)-метил 1-(4-(3-(5-хлор-2-фтор-3(метилсульфонамидо)фенил)-1-изопропил-1Н-пиразол-4-ил)пиримидин-2-иламино)пропан-2-илкарбамата.
  19. 19. Способ по любому из пп.16-18, в котором ингибитор МЕК выбран из группы, состоящей из С11040/ΓΌ184352, АΖ^6244, РП318088, РП98059, РП334581, КЭЕА119, 6-метокси-7-(3-морфолин-4-илпропокси)-4-(4-феноксифениламино)хинолин-3-карбонитрила и 4-[3-хлор-4-(1-метил-1Н-имидазол-2-илсульфонил)фениламино] -6-метокси-7-(3 -морфолин-4-ил-пропокси)хинолин-3 -карбонитрила.
  20. 20. Способ по любому из пп.16-19, в котором рак выбран из группы, состоящей из меланомы, рака молочных желез, колоректального рака, глиомы, рака легких, рака яичников, саркомы и рака щитовидной железы.
  21. 21. Способ по любому из пп.16-20, в котором раком является КАР-зависимый рак.
  22. 22. Способ по любому из пп.16-21, в котором раком является меланома.
  23. 23. Способ идентификации субъекта, имеющего рак, и прогнозирования эффективного лечения с использованием комбинированной терапии ингибитором КАР и вторым ингибитором, причем способ включает:
    (a) выделение нуклеиновой кислоты из раковых клеток пациента и (b) анализ, по меньшей мере, участка молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид СКАР;
    причем наличие одного или более нуклеотидов, которые изменяют идентичность аминокислотного остатка в одной или нескольких аминокислотах кодируемого варианта полипептида С-КАР относительно аминокислоты в одной или нескольких позициях дикого типа полипептида С-КАР в одной или нескольких аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из 104Е, 2578, 261Р, 3560, 3610, 4278, 447Ό, 469М, 478Е и 554К, указывает на необходимость лечения субъекта с использованием ингибитора КАР и второго ингибитора.
  24. 24. Способ по п.23, дополнительно включающий введение субъекту ингибитора КАР и второго ингибитора.
  25. 25. Способ по п.23 или 24, в котором один или несколько нуклеотидов, которые изменяют идентичность аминокислотного остатка в одной или нескольких аминокислотах кодируемого варианта полипептида С-КАР, появляются в одной или нескольких аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из 104Е>К, 2578>Р, 261Р>Т, 3560>Е, 3610>А, 4278>Т, 447Ό>Ν, 469М>1, 478Е>К и 554К>К.
  26. 26. Способ по любому из пп.23-25, в котором один или несколько нуклеотидов, которые изменяют идентичность аминокислотного остатка в одной или нескольких аминокислотах кодируемого варианта полипептида С-КАР, появляются в одной или нескольких аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из 2578, 261Р и 3610.
  27. 27. Способ по любому из пп.23-26, в котором вторым ингибитором является ингибитор МЕК.
  28. 28. Способ по любому из пп.23-26, в котором ингибитор МЕК выбран из группы, состоящей из С11040/ΓΌ184352, АΖ^6244, РП318088, РП98059, Γϋ334581, КЭЕА119, 6-метокси-7-(3-морфолин-4-илпропокси)-4-(4-феноксифениламино)хинолин-3-карбонитрила и 4-[3-хлор-4-(1-метил-1Н-имидазол-2-илсульфонил)фениламино] -6-метокси-7-(3 -морфолин-4-ил-пропокси)хинолин-3 -карбонитрила.
  29. 29. Способ по любому из пп.23-28, в котором ингибитор КАР выбран из группы, состоящей из КАР265, сорафениба, 8В590885, РБХ4720, РБХ4032, 0ПС-0879, ΖΜ 336372 и (8)-метил 1-(4-(3-(5-хлор2-фтор-3-(метилсульфонамидо)фенил)-1-изопропил-1Н-пиразол-4-ил)пиримидин-2-иламино)пропан-2илкарбамата.
    - 25 028135
  30. 30. Способ по любому из пп.23-29, в котором рак выбран из группы, состоящей из меланомы, рака молочных желез, колоректального рака, глиомы, рака легких, рака яичников, саркомы и рака щитовидной железы.
  31. 31. Способ по любому из пп.23-30, в котором раком является КАР-зависимый рак.
  32. 32. Способ по любому из пп.23-31, в котором раком является меланома.
  33. 33. Способ по любому из пп.23-32, в котором субъект имеет раковые клетки, содержащие мутацию в В-КАР.
  34. 34. Способ по любому из пп.23-33, в котором субъект имеет раковые клетки, содержащие мутацию в-карУ600Е.
  35. 35. Способ по любому из пп.23-34, в котором анализ нуклеиновой кислоты включает секвенирование нуклеиновой кислоты.
EA201491780A 2012-03-28 2013-03-07 Мутанты c-raf, придающие резистентность к ингибиторам raf EA028135B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261616999P 2012-03-28 2012-03-28
US201261708372P 2012-10-01 2012-10-01
PCT/US2013/029513 WO2013148100A1 (en) 2012-03-28 2013-03-07 C-raf mutants that confer resistance to raf inhibitors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491780A1 EA201491780A1 (ru) 2015-01-30
EA028135B1 true EA028135B1 (ru) 2017-10-31

Family

ID=47892065

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491780A EA028135B1 (ru) 2012-03-28 2013-03-07 Мутанты c-raf, придающие резистентность к ингибиторам raf

Country Status (15)

Country Link
US (5) US9629839B2 (ru)
EP (3) EP3333575B1 (ru)
JP (3) JP6348898B2 (ru)
KR (1) KR20140139510A (ru)
CN (1) CN104204806B (ru)
AU (1) AU2013240483B2 (ru)
BR (1) BR112014023496A2 (ru)
CA (1) CA2864169A1 (ru)
EA (1) EA028135B1 (ru)
ES (3) ES2790896T3 (ru)
MX (1) MX351945B (ru)
PL (1) PL2831589T3 (ru)
PT (1) PT2831589T (ru)
TR (1) TR201808010T4 (ru)
WO (1) WO2013148100A1 (ru)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX351945B (es) * 2012-03-28 2017-11-03 Dana Farber Cancer Inst Inc Mutantes c-raf que confieren resistencia a inhibidores raf.
JP7300394B2 (ja) 2017-01-17 2023-06-29 ヘパリジェニックス ゲーエムベーハー 肝再生の促進又は肝細胞死の低減もしくは予防のためのプロテインキナーゼ阻害
KR102537840B1 (ko) 2018-07-13 2023-05-31 삼성전자 주식회사 서버 장치 및 다른 장치들의 위치 정보를 수집하는 방법
WO2020163771A1 (en) * 2019-02-08 2020-08-13 Portage Glasgow Limited Structure, manufacturing and uses of hoxd12-pde8a cell-penetrating peptides
US20230183810A1 (en) * 2020-05-04 2023-06-15 Dna-Seq, Inc. Methods and systems for determination of an effective therapeutic regimen and drug discovery

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5618670A (en) * 1988-08-26 1997-04-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Detection method for c-raf-1 genes
US20060234931A1 (en) * 2003-07-17 2006-10-19 Biggs William H Iii Treatment of diseases with kinase inhibitors
AU2004262369A1 (en) 2003-07-29 2005-02-10 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers of cyclin-dependent kinase modulation
CN101516376A (zh) * 2006-09-18 2009-08-26 贝林格尔.英格海姆国际有限公司 用于治疗携带egfr突变的癌症的方法
CA2663599A1 (en) 2006-09-18 2008-03-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Method for treating cancer harboring egfr mutations
CA2669384C (en) 2006-11-16 2019-03-19 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for detecting noonan syndrome
US9084781B2 (en) 2008-12-10 2015-07-21 Novartis Ag MEK mutations conferring resistance to MEK inhibitors
AR077975A1 (es) 2009-08-28 2011-10-05 Irm Llc Derivados de pirazol pirimidina y composiciones como inhibidores de cinasa de proteina
JP5985401B2 (ja) 2010-03-09 2016-09-06 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド 第一の癌療法に対する耐性を現に有するか、または、そのような耐性を生じる患者において癌を診断および治療する方法
MX351945B (es) * 2012-03-28 2017-11-03 Dana Farber Cancer Inst Inc Mutantes c-raf que confieren resistencia a inhibidores raf.

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DO-HEE KIM, SIM TAEBO: "Novel small molecule Raf kinase inhibitors for targeted cancer therapeutics", ARCHIVES OF PHARMACAL RESEARCH, SPRINGER, vol. 35, no. 4, 1 April 2012 (2012-04-01), pages 605 - 615, XP055062447, ISSN: 02536269, DOI: 10.1007/s12272-012-0403-5 *
G MAURER, TARKOWSKI B, BACCARINI M: "Raf kinases in cancer–roles and therapeutic opportunities", ONCOGENE, SCIENTIFIC & MEDICAL DIVISION, MACMILLAN PRESS, vol. 30, no. 32, 11 August 2011 (2011-08-11), pages 3477 - 3488, XP055062448, ISSN: 09509232, DOI: 10.1038/onc.2011.160 *
M. HEKMAN: "Dynamic Changes in C-Raf Phosphorylation and 14-3-3 Protein Binding in Response to Growth Factor Stimulation: DIFFERENTIAL ROLES OF 14-3-3 PROTEIN BINDING SITES", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 279, no. 14, pages 14074 - 14086, XP055062449, ISSN: 00219258, DOI: 10.1074/jbc.M309620200 *
MATHEW J. GARNETT, RANA SAREENA, PATERSON HUGH, BARFORD DAVID, MARAIS RICHARD: "Wild-Type and Mutant B-RAF Activate C-RAF through Distinct Mechanisms Involving Heterodimerization", MOLECULAR CELL, CELL PRESS, vol. 20, no. 6, 1 December 2005 (2005-12-01), pages 963 - 969, XP055062446, ISSN: 10972765, DOI: 10.1016/j.molcel.2005.10.022 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013240483B2 (en) 2018-07-26
JP2015513901A (ja) 2015-05-18
EP2831589B1 (en) 2018-04-18
PT2831589T (pt) 2018-06-20
PL2831589T3 (pl) 2018-10-31
EA201491780A1 (ru) 2015-01-30
EP3693741A1 (en) 2020-08-12
TR201808010T4 (tr) 2018-06-21
US20150133478A1 (en) 2015-05-14
CN104204806B (zh) 2016-02-03
JP6348898B2 (ja) 2018-06-27
US20210388325A1 (en) 2021-12-16
CN104204806A (zh) 2014-12-10
JP2020103291A (ja) 2020-07-09
US20170204383A1 (en) 2017-07-20
US20240093310A1 (en) 2024-03-21
US20190142830A1 (en) 2019-05-16
WO2013148100A1 (en) 2013-10-03
ES2790896T3 (es) 2020-10-29
BR112014023496A2 (pt) 2017-07-18
US11788151B2 (en) 2023-10-17
EP3333575A1 (en) 2018-06-13
EP3333575B1 (en) 2020-02-26
KR20140139510A (ko) 2014-12-05
ES2673070T3 (es) 2018-06-19
CA2864169A1 (en) 2013-10-03
MX2014011686A (es) 2015-06-04
MX351945B (es) 2017-11-03
JP2018110594A (ja) 2018-07-19
ES2908078T3 (es) 2022-04-27
JP6661685B2 (ja) 2020-03-11
US9629839B2 (en) 2017-04-25
AU2013240483A1 (en) 2014-08-28
EP2831589A1 (en) 2015-02-04
EP3693741B1 (en) 2022-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11788151B2 (en) C-RAF mutants that confer resistance to RAF inhibitors
CN112972492A (zh) Nk细胞中对细胞因子诱导的sh2蛋白的抑制
KR20120139767A (ko) 1차 암 요법에 대한 저항성을 갖는 또는 발달시키는 환자에서 암을 진단 및 치료하는 방법
WO2011151461A2 (en) Autotaxin pathway modulation and uses thereof
EA016584B1 (ru) Новые гены, родственные гену глутаминилциклазы
JP4139214B2 (ja) Ｃｄ３８により調節される走化性
JPWO2007026969A1 (ja) 創薬標的タンパク質及び標的遺伝子、並びにスクリーニング方法
US20170291958A1 (en) Compositions and Methods For the Modulation of Ras Proteins
EP3884948A1 (en) Cathepsin inhibitors and uses thereof
US11186874B2 (en) ERK1 and ERK2 mutations that confer resistance to MAPK pathway inhibitors
US5871961A (en) Nucleic acids encoding CR2 polypeptides, vector and transformed cell thereof, and expression thereof
CN113498341A (zh) 使用多靶点激酶抑制剂结合蛋白激酶生物标志物的癌症治疗
KR101462329B1 (ko) 디스코이딘 도메인 리셉터 2의 ｊｍ2 도메인의 발현 촉진제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
JP2004002404A (ja) 細胞死抑制剤

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU