TR201808010T4 - RAF inhibitörlerine direnç veren C-RAF mutantları. - Google Patents

RAF inhibitörlerine direnç veren C-RAF mutantları. Download PDF

Info

Publication number
TR201808010T4
TR201808010T4 TR2018/08010T TR201808010T TR201808010T4 TR 201808010 T4 TR201808010 T4 TR 201808010T4 TR 2018/08010 T TR2018/08010 T TR 2018/08010T TR 201808010 T TR201808010 T TR 201808010T TR 201808010 T4 TR201808010 T4 TR 201808010T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
raf
cancer
polypeptide
inhibitor
resistance
Prior art date
Application number
TR2018/08010T
Other languages
English (en)
Inventor
Emery Caroline
Antony Rajee
A Garraway Levi
Original Assignee
Dana Farber Cancer Inst Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dana Farber Cancer Inst Inc filed Critical Dana Farber Cancer Inst Inc
Publication of TR201808010T4 publication Critical patent/TR201808010T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11001—Non-specific serine/threonine protein kinase (2.7.11.1), i.e. casein kinase or checkpoint kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

Bir mutant C-RAF dizisine sahip olan proteinler ve nükleik asitler ve bir kombinasyon terapisinden yararlanması muhtemel olan kansere sahip hastaların tespit edilme yöntemleri ve tedavi yöntemleri sağlanmaktadır.

Description

TARIFNAME RAF INHIBITÖRLERINE DIRENÇ VEREN C-RAF MUTANTLARI Bu bulus, Ulusal Saglik Enstitüleri tarafindan ödüllendirilen federal bagis numarasi DP2 OD002750 altindaki devlet destegi ile yapilmistir. Devlet, bulusta belirli haklara sahiptir.
ALT YAPI Serin/treonin kinaz B-RAF'taki (ayni zamanda BRAF olarak bilinmektedir) onkojenik mutasyonlar, %50-70 habis melanomlarda bulunmaktadir. (Davies, H. et al., Nature düsünülmektedir ve 2012 yilina yönelik olarak Ulusal Kanser Enstitüsü, Birlesik Devletlerde yaklasik olarak 9,180 kisinin ölümüne yol açabilecek 72,250 yeni vaka tahmin etmistir. Preklinik çalismalar, klinik testlerinde RAF veya MEK inhibitörlerinin basarisi ile onaylanmis olan bir gözlem (Flaherty, K. T. et al., N. Eng!. J. Med. 363, K. et al., J. Clin. Oncol. 27 (ek.), mutasyonunun, melanomda mitojen ile aktive olan protein kinazi (MAPK) sinyallesme kaskadina bir bagimliligi ön gördügünü göstermistir (Hoeflich, K. P. et al., Cancer Res. 69, 3042- (2007); Solit, D. B. et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature Son zamanlarda FDA, Raf inhibitörü Vemurafenib'i (PLX4032) onaylamistir. (Dummer birlikte, hedeflenen antikanser terapötiklerine klinik yanitlar siklikla, de novo veya bir paralel sinyallesme modülünün (CRAF, COT) asiri ifadesi (Montagut et al., Cancer sinyallesme yolunun (PDGFRb, IGF-1R) aktivasyonu (Nazarian et al., Nature 468: 973- amplifikasyonu (Shi et al., Nat Commun delesyon kendisinde (Mek) mutasyonlarin aktif hale getirilmesi (Emery et al., Proc NatlAcad Sci U 8 A ile yönetildigi gösterilmistir. Buna uygun olarak, etkili uzun vadeli tedavi stratejilerine yönelik olarak edilmesine yönelik yeni yöntemlere yönelik, tedavi stratejilerinden yararlanmasi muhtemel olan hastalarin yeni tespit edilme yöntemlerine yönelik ve etkili uzun vadeli tedavi stratejileri ile hastalarin tedavi edilme yöntemlerine yönelik bir ihtiyaç bulunmaktadir. inhibisyonuna potansiyel bir edinilmis direnç mekanizmasi olarak yükseltilmis CRAF'yi açiklamaktadir.
KISA AÇIKLAMA Mevcut bulus, kanser tedavisinde terapötik ajanlara direncin gelistirilmesi ve kanser tedavisine direnç veren hedeflerin tespit edilmesi ile ilgilidir. Mevcut bulus ayni zamanda, etkili bir uzun vadeli tedavi stratejisinin kolaylastirilmasina yönelik paralel ilaç hedeflerinin tespit edilmesi ve bu tür tedaviden yararlanabilecek hastalarin tespit edilmesi ile ilgilidir.
Bir açida, burada söz konusu mutant C-RAF polipeptidinin, SEQ. ID. N02 içeren bir dogal sus C- olusan gruptan seçilen en az bir amino asit sübstitüsyonunu içerdigi, bu en az bir amino asit sübstitüsyonunun, mutant C-RAF polipeptidini ifade eden bir hücre üzerinde bir veya daha fazla RAF inhibitörüne direnç verdigi, RAF inhibitörünün, PLX -metil 1-(4-(3-(5-kl0ro-2-flor0-3- (metilsülfonamido)fenil)-1-izopropil-1H-pirazol-4-il)pirimidin-2-ilamino)propan-2- ilkarbamat'tan seçildigi, C-RAF aktivitesine sahip olan bir mutant C-RAF polipeptidini kodlayan bir nükleik asit molekülü veya C-RAF aktivitesine sahip olan bir mutant C-RAF polipeptidi saglanmaktadir.
Bir diger açida, bir ifade vektörü saglanmaktadir. Ifade vektörü, Istem 1'in nükleik asit molekülünü içerir.
Bir diger açida, bir konak hücre saglanmaktadir. Konak hücre, ifade vektörünü içerir.
Bir diger açida, bir antikor preparati saglanmaktadir. Antikor preparati spesifik olarak, mevcut bulusun bir C-RAF polipeptidine baglanir.
Bir diger açida, bir RAF inhibitörüne dirence sahip olan kansere sahip bir öznenin bir tespit edilme yöntemi vardir, yöntem asagidaki adimlari içerir: (a) hastanin bir kanserinden elde edilen hücrelerden nükleik asidin özütlenmesi; ve (b) bir C-RAF polipeptidini kodlayan bir nükleik asit molekülünün en az bir kisminin analiz edilmesi, burada istem 1'de tanimlandigi üzere bir veya daha fazla C-RAF sübstitüsyonunun varligi, öznenin bir RAF inhibitörüne dirence sahip oldugunu belirtir.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, RAF Inhibitör PLX C-RAF mutant alelleri göstermektedir.
(A) PLX4720 mutagenez ekranindan C-RAF kodlama dizisi boyunca aday mutasyonlarin ortalama varyant skoru gösterilmektedir. Yüksek skorlama mutasyonlarindan (>%2) karsilik gelen amino asit sübstitüsyonlari belirtilmektedir. (B) Solda: C-RAF kinaz domeninin kristal yapisi (kalintilar 340-618; gri) (PDB kodu: 3OMV), bagli PLX4720'ye ait bir bosluk doldurma modeli ile birlikte temsilci C-RAF direnç mutantlari (çubuklar) dahil olmak üzere, gösterilmektedir. DFG motifi ve P- döngüsü ayrica belirtilmektedir. Sagda: dimer ara yüz kalintisi R401'e tabi tutulmak üzere 90° döndürülen C-RAF yapisi (Yapilar, PyMOL ile ekranda olusturulmaktadir).
(C) C-RAF domen yapisi temsili (CR, korunmus bölge; RBD, Ras baglama domeni ve CRD, sistein bakimindan zengin domen), C-RAF direnç mutantlarinin (yildiz isaretleri) ve C-RAF regülasyonuna yönelik önemli üç serin kalintisinin (daireler) Sekil 2, C-RAF direnç mutantlarinin fonksiyonel karakterizasyonunu göstermektedir.
(A) C-RAF (WT) ve C-RAF (tespit edilen aleller) ifade eden A375 hücreleri, 90 dakika boyunca doza bagli bir sekilde ( RAF inhibitör PLX4720 ile muamele edilmistir. Immünoblot, pErk1/2, pMek1/2, C-RAF göstermektedir. oi-tübilin, bir yükleme kontrolü olarak kullanilmistir. (B) Yüksek derecede dirençli C-RAF mutantlarini ifade eden A375 hücreleri, 16 saat boyunca 2 vemurafenib*e yanit olarak A375 ve C-RAF direnç alellerinin büyüme inhibisyonu egrileri. (E) Yüksek derecede C-RAF mutantlarini ifade eden A375 hücreleri, 16 saat boyunca 1 uM MEK inhibitörü AZD6244 ile muamele edilmistir. pMek1/2, pErk1/2, büyüme inhibisyonu egrileri.
Sekil 3, C-RAF direnç mutantlarinin, B-RAF ile artirilmis iliski sergiledigini göstermektedir.
(A) C-RAF direnç alellerini ifade eden 293/T hücreleri ve (B) C-RAF direnç alellerini ifade eden A375 hücreleri, toplam C-RAF ile immüno çöktürülmüstür. Bagli protein (B-RAF ve 14-3-3) seviyeleri, immünoblotlama ile degerlendirilmistir. Giris Iizati (alt göstermektedir. Sonuçlar, ikiden fazla bagimsiz deneyin temsilcisidir. pirazoI-4-il)pirimidin-2-ilamin0)propan-2-ilkarbamat kullanilarak C-RAF direnç alellerinin biyokimyasal karakterizasyonunu göstermektedir. (metilsülfonamid0)feniI)-1-izopropiI-1H-pirazol-4-il)pirimidin-2-ilamino)propan-2- ilkarbamat ve AZD6244 ile 16 saatlik tedaviye yanit olarak C-RAF direnç alellerini ifade eden A375 hücrelerinde pMek1/2, pErk1/2, Mek, Erk ve C-RAF seviyelerini temsil eder. Aktin, bir yükleme kontrolü olarak kullanilmistir. (B) PLX4720, (C) (8)- iI)pirimidin-2-ilamino)propan-2-ilkarbamat ve (D) AZD6244'e yanit olarak A375 ve C- RAF direnç alellerinin büyüme inhibisyonu egrileri.
Sekil 5. C-RAF direnç mutantlarinin, Vemurafenib'e (PLX4032)direnç verdigini göstermektedir.
(A) Vemurafenib'e (PLX4032) yanit olarak A375 ve C-RAF direnç alellerinin büyüme inhibisyonu egrileri. (B) 16 saat boyunca Vemurafenib varliginda ve yoklugunda WT, aktivitesi. Immünoblot, pMek1/2, pErk1/2, Mek, Erk ve aktini temsil etmektedir.
Sonuçlar, üç bagimsiz deneyin temsilcisidir. (C) PLX inhibisyonu egrileri.
Sekil 6, C-RAF direnç mutantlarinin homodimerizasyonunu ve kinaz aktivitesini göstermektedir.
(A) 48 saat boyunca His/V5-etiketli ve Bayrak-etiketli C-RAF direncini ifade eden Immüno çöktürülmüstür ve Bayrak etiketli C-RAF, immüno blotlama ile degerlendirilmistir. Giris Iizati ayni zamanda, Bayrak-C-RAF, V5-C-RAF, toplam C- RAF, p-MEK, p-ERK ve toplam ERK'yi saptamis olan antikorlar kullanilarak degerlendirilmistir. (B) HisN5-etiketli ve Bayrak-etiketli C-RAF direnç mutantlarini ifade eden veya 2 ;M vemurafenib ile muamele edilmistir ve His/V5-etiketli C-RAF, yukarida (A)'da oldugu üzere immüno çöktürülmüstür. Giris Iizati, C-RAF ( taniyan antikorlar kullanilarak Immüno blotlanmistir. (C) In vitro C-Raf kinaz aktivitesi, Bayrak-etiketli bos vektör ("C"), dogal sus C-RAF ("WT") ve direnç mutantlari 8257P, hücrelerinden derive edilen hücre özütlerinde ölçülmüstür. Analizler, 2 pM vemurafenib varliginda veya yoklugunda gerçeklestirilmistir (bakiniz Yöntemler). Giris saptayan antikorlar kullanilarak immüno blotlanmistir. (D) Iri vitro C-Raf kinaz aktivitesi, 2 ;M vemurafenib varliginda ve yoklugunda A (“C") ve stabil bir sekilde dogal susu C-RAF ("WT") ifade eden A375 ve direnç özütlerinde ölçülmüstür. Immünoblotlama çalismalari, p-MEK1/2, p-ERK1/2, toplam MEK, toplam ERK ve aktini taniyan antikorlar kullanilarak giris Iizati üzerinde gerçeklestirilmistir. Bütün sonuçlar, üç bagimsiz deneyin temsilcisidir.
Sekil 7, C-RAF direnç mutantlarinin heterodimerizasyonunu ve 14-3-3 baglama özelliklerini gösterir.
(A) 1 saat boyunca 2 iiM vemurafenib yoklugunda (-) veya varliginda (+) belirtilen C- RAF direnç mutantlarini kisa süreli olarak ifade eden 293/T hücreleri, C-RAF ile immüno çöktürülmüstür ve bagli protein (B-RAF ve 14-3-3 Ç) seviyeleri (üst paneller), immüno blotlama ile analiz edilmistir. Giris Iizati (alt paneller), 14-3-3 Ç, B-RAF, C- RAF, pMek1/2, pErk1/2, Mek, 8338 C-RAF ve aktini göstermektedir. Sonuçlar, ikiden fazla bagimsiz deneyin temsilcisidir. (B) 16 saat boyunca 2 uM vemurafenib varliginda ve yoklugunda belirtilen C-RAF direnç mutantlarini stabil olarak ifade eden A375 hücreleri C-RAF ile immüno çöktürülmüstür ve bagli protein (B-RAF ve 14-3-3 Ç) seviyeleri (üst paneller), imino blotlama ile analiz edilmistir. Giris Iizati, Sekil 7A'da oldugu üzere ayni sekilde blotlanmistir. Sonuçlar, ikiden fazla bagimsiz deneyin temsilcisidir.
Sekil 8, C-RAF direnç mutantlarinin, MEK/ERK sinyallemesine yönelik olarak dimerizasyon gerektirdigini göstermektedir.
(A) Dimerizasyonu yetersiz mutant R401H (pembe) yoklugunda (sol) veya varliginda (sag) Bayrak-etiketli, dogal sus C-RAF veya belirtilen C-RAF direnç mutantlarini ifade eden yapilar, 293T hücrelerinde ifade edilmistir. Lizatlar, p-MEK, p-ERK, toplam MEK veya toplam C-RAF`i taniyan antikorlar kullanilarak blotlanmistir. (B) Dimerizasyonu yetersiz (pembe) baglamda ve kendi baslarina His-etiketli C-Raf direnç mutantlarini birlikte ifade eden 293/T hücreleri, vemurafenib (2 uM, 1 saat) yoklugunda veya varliginda kültürlenmistir. Immünoçöktürmeler, Nikel boncuklar kullanilarak gerçeklestirilmistir ve Bayrak-etiketli C-RAF seviyeleri, immüno blotlama ile analiz edilmistir. Bayrak-C-RAF, V5-C-RAF, toplam C-RAF, p-MEK, p-ERK, S338-C-RAF ve aktini taniyan antikorlar ile blotlanan giris Iizatlari ayrica bilinmektedir.
Sekil 9, C-RAF direnç alellerinin biyokimyasal karakterizasyonunu göstermektedir.
(A) Rastgele mutagenez ekranlarindan ortaya çikan çesitli direnç alellerini içeren C- RAF'yi ifade eden A375 hücreleri kullanilarak pMek/pErk seviyelerinin karsilastirmasi, A375 hücrelerinde ifade edilmistir. Tübilin, pozitif bir kontrol olarak bulundurulmustur.
(B) Dogal sus C-RAF veya C-RAF direnç alellerini ifade eden A375 hücreleri, belirtilen dozlarda 90 dakika boyunca Raf inhibitörü PLX4720 ile muamele edilmistir.
Immüno blotlama çalismalari, p-ERK, p-MEK ve toplam C-RAF'a karsi antikorlar ile gerçeklestirilmistir. Tübilin, bir yükleme k0ntrolü olarak kullanilmistir.
Sekil 10, homodimerizasyon ve kinaz aktivitesini göstermektedir.
(A) Bayrak etiketli WT-C-RAF ile His/V5 etiketli C-RAF direnç mutantlarini birlikte ifade eden 293/T hücreleri, His ile 48 saat sonra immüno çöktürülmüstür ve Bayrak etiketli C-RAF etkilesimi seviyeleri, immüno blotlama ile analiz edilmistir. Giris Iizati Bayrak-C-RAF, V5-C-RAF, C-RAF, pMek, pErk ve Erk'i temsil etmektedir. (B) 293/T hücreleri, dimerizasyonu yetersiz C-RAF mutant R401H ile transfekte edilmistir ve bekçi mutant T421N ve Mek/Erk duyarliligi, 1 saat boyunca vemurafenib (2 uM) varliginda saptanmistir. T421 N, bir negatif kontrol olarak kullanilmistir ve G361A, bir pozitif kontrol olarak kullanilmistir.
BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Mevcut bulus, kanser tedavisinde terapötik ajanlara direncin gelistirilmesi ve kanser tedavisine direnç veren hedeflerin tespit edilmesi ile ilgilidir. Mevcut tarifname ayni zamanda, etkili bir uzun vadeli tedavi stratejisinin kolay hale getirilmesine yönelik paralel ilaç hedeflerinin tespit edilmesi ve bu tür tedaviden yararlanacak hastalarin Mevcut bulusun uygulamasi, aksi belirtilmedikçe, teknik uzmanligi dahilinde olan klasik moleküler biyoloji, immünoloji, mikrobiyoloji, hücre biyolojisi ve rekombinant DNA tekniklerini kullanacaktir. Bakiniz, örnegin, Sambrooki Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, (Current Edition); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds., (Current Edition)); METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.) serisi; PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (Current Edition); ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)). DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & ll (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); Fundamental Virology, 2nd edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, Mitojen ile aktive olan protein kinaz (MAPK) kaskadi, büyüme faktörleri, sitokinler ve proto-onkojenler dahil olmak üzere, çesitli hücre disi stimuliye yanit olarak sinyal iletimini regüle eden kritik bir hücre içi sinyallesme yoludur. Bu yolun aktivasyonu, sonuç olarak hücre profilerasyonu, hücre döngüsü regülasyonu, hücre hayatta kalimi, anjiyojenez ve hücre göçü dahil olmak üzere hücre fonksiyonlarinda degisikliklere yol açan, gen ifadesinde transkripsiyon faktörü aktivasyonu ve degisiklikleri ile sonuçlanir.
Klasik MAPK sinyalleme, hücre yüzeyinde reseptör tirozin kinazlari ile baslatilir, bununla birlikte birçok diger hücre yüzeyi molekülü, integrinler, heterotrimerik G- proteinleri ve sitokin reseptörleri dahil olmak üzere, MAPK kaskadini aktif etme yetenegine sahiptir.
Bir hücre yüzeyi reseptörüne, örnegin bir reseptör tirozin kinaza, Iigand baglanmasi tipik olarak, reseptörün fosforilasyonu ile sonuçlanir. Adaptör protein Grb2, aktif hale getirilen reseptörün fosforile hücre içi domeni ile birlesir ve bu birlesme, hücre membranina SOS-I ve CDC25 dahil guanin nükleotit degisimi faktörlerini alir. Bu guanin nükleotit degisim faktörleri, GTPaz Ras ile etkilesime girer ve bunu aktive eder.
Yaygin Ras izoformlari K-Ras, N-Ras, H-Ras ve digerlerini içerir. Ras aktivasyonunu takiben, serin/treonin kinaz Raf (örnegin A-Raf, B-Raf, C-Raf veya Raf-1), bunun 14-3- 3 gibi yapi iskelesi proteinlerine baglanma ve uyusumsal degisiklikler geçirdigi sitozolde Ras'tan bagimsiz bir sekilde veya Ras ile etkilesim yoluyla hücre membranina alinir negatif yük regülatör bölgesinde (N-bölgesi) 8338, Y341 ve kinaz domeni disarisinda, C-terminalde 8621 gibi aktif hale getirme kalintilarinin fosforilasyonu ve CR2 domeninde (Sekil 1C) ve ayrica bunun kompleks regülasyonunu yansitan protein boyunca dagitilan çok sayida diger fosforilasyon bölgesinde 8259 gibi negatif regülatör kalintilarin defosforilasyonu ile yönetilir (Avruch et al.,ld. (2001); Wellbrock et zamanda, yapay homodimer formasyonu ile indüklenir (Avruch et al.,ld. (2001); Wellbrock et al., Id., (2004).).
Raf akabinde fosforile edilir. Raf direkt olarak, 217 ve 221 konumlarinda iki serin kalintisinin fosforilasyonu ile MEKI ve MEK2'yi aktive eder. Aktivasyonu takiben, serin/treonin kinazlari Erkl ve Erk2'deki MEKI ve MEK2 fosforilat tirozin (Tyr-185) ve treonin (Thr-183) kalintilari, Erk aktivasyonu ile sonuçlanir. Aktive edilen Erk, sitozolde birçok hedefi regüle eder ve ayni zamanda, bunun gen ifadesini regüle eden birkaç transkripsiyon faktörünü fosforile ettigi nükleusa yer degistirir. Erk kinaz, Elk-l, c-Etsl, c- Et32, p90RSKI, MNKI, MNK2, MSKI, MSK2 ve TOB dahil olmak üzere çok sayida hedefe sahiptir. Daha önce belirtilen yol, klasik bir MAPK sinyallesmesinin temsiliyken, MAPK yolu ile diger sinyallesme kaskadlari arasinda kayda deger bir iletisim vardir.
MAPK sinyallesmesindeki aberasyonlar, kanser biyolojisinde önemli bir role sahiptir.
Degistirilmis Ras ifadesi, birçok kanserde yaygindir ve Ras'ta mutasyonlarin aktive edilmesi ayrica tespit edilmistir. Bu tür mutasyonlar, bütün kanserlerin %30'una kadar bulunmaktadir ve özellikle pankreatik (%90) ve kolon (%50) karsinomlarinda yaygindir.
Ek olarak, B-Raf mutasyonlarinin aktive edilmesi, melanom ve over kanserinde tespit edilmistir. En yaygin mutasyon, BRAFVBOÜE, alt MAP kinaz yolunun konstitütif aktivasyonu ile sonuçlanir ve melanom hücre profilasyonuna, yumusak agar büyümesine ve tümör ksenogreft formasyonuna yönelik olarak gereklidir. CRAF amplifikasyonu, mide kanseri ve piloaktik astositomalarda kromozomal translokasyonlarin yani sira (Shimizu et al., 1986; Jones et al., 2009), prostat kanseri ve mesane kanserinde bulunmustur (Edwards et al., 2003; Simon et al., 2001).
Bununla birlikte, insan kanserlerinde CRAF mutasyonlarinin meydana gelme orani kanserlerinde MAPK asiri aktivasyonunun tespit edilen rolüne bagli olarak, spesifik inhibitörler ile MAPK yolunun bilesenlerinin hedeflenmesi, kanser tedavisine umut veren bir yaklasimdir. Bununla birlikte hastalar, dogustan gelen dirence sahip olabilir veya bu umut veren terapilere direnç kazanabilir. Hedef kinazlarda direnç veren mutasyonlarin tespit edilmesi, dogustan gelen veya edinilmis dirence sahip bu hastalara yönelik diyagnostik ve/veya prognostik markörler ve tedavi terapileri asagida açiklanmaktadir.
C-RAF MUTASYONLARI Kanserin, PLX4032 gibi, RAF inhibitörleri ile tedavisi, umut veren bir terapötik yaklasimken, bu tür terapileri alan hastalar siklikla eski haline döner veya yanit vermede basarisiz olur ve sonuç olarak hastanin hastaligi ilerler. Burada açiklandigi üzere mevcut bulus, bazilarinin mevcut durumda klinik gelisimde oldugu, RAF inhibitörlerine direnç veren C-RAF'ta mutasyonlarin kesfi ile ilgilidir. Kanser hücrelerinde bu tür bir mutasyonun edinimi, hastanin hücrelerini belirli RAF inhibitörleri ile tedaviye dirençli hale getirir. Bulus, PLX -metil 1-(4-(3-(5- kIoro-2-floro-3-(metiIsülfonamid0)feniI)-1-izopropiI-1H-pirazol-4-il)pirimidin-2- ilamino)propan-2-ilkarbamat RAF inhibitörlerine direncin gelistirilmesi ile ilgilidir. Örnek yoluyla, Örnek niteligi tasiyan RAF inhibitörleri Tablo 1'de gösterilmektedir. (S)-metil 1- (4-(3-(5-kloro-2-floro-3-(metilsülfonamido)fenil)-1-izopropiI-1H-pirazol-4-il)pirimidin-2- ilamin0)propan-2-ilkarbamat RAF inhibitörü, jenerik olarak ve spesifik olarak kapsanmaktadir (bilesik 9, tablo 1, provizyonel sayfa 50; PCT yayini Burada açiklandigi üzere bir RAF inhibitörüne direnç veren bir C-RAF mutasyonunun klinik ortaya çikmasi, RAF/MEK ile iliskilendirilen bagimliligin biyolojik uygunlugunun, ilerlemis malignite asamalarinda dahi muhafaza edildigini önermektedir. Dolayisiyla, melanomlar dahil, RAF inhibitörlerinin birçok malignitede kalici tümör yanitlarini yaratmadaki basarisizligi, klinik ortamda standart alti ilaç potensini veya farmakodinamikleri belirtebilir. Burada açiklanan bulgulara bagli olarak, RAF- veya MEK- kaynakli tümörlerde hedeflenen ajanlari içeren tedavi modaliteleri, daha potent ilaçlardan, var olan ilaçlarin degistirilmis dozlamasindan veya kombine RAF ve MEK inhibisyonundan yararlanabilir. Örnek niteligi tasiyan RAF inhibitörleri, bununla sinirli olmamakla birlikte, Tablo I'de listelenen inhibitörleri içerir. MEK inhibitörlerinin metoksi-7-(3-m0rfolin-4-il-pr0p0ksi)-kin0lin-3-karbonitril içerir. Örnek niteligi tasiyan MEK inhibitörleri, Tablo 2'de gösterilmektedir. Bu terapötik yenilikler, hastalari siniflara ayirmak üzere dayanikli tümör genomik profilleme ile birlikte, "ilaçlanabilen" onkojen mutasyonlari ile kanserlerde hizlandirmalidir. kisisellestirilmis kanser tedavisinin ilerleyisini Tablo 1: Örnek Niteligi Tasiyan RAF inhibitörleri 1 RAF265 2 Sorafenib Tosilat Nexavar Bay 43- Sorafenib 4-[4-[[4-klor0-3- (triflorometil)fenil]karb amoilamino] fenoksi]-N-metiI-piridin-2- karboksamid 3 SB590885 4 PLX4720 PLX4032 92788 47520 7-59-1 28446 1-73-0 91 850 -84-7 1 0298 72-54- Isim CAS Yapi 1-76-7 / N` K1 / \N”OH 0-29-1 ”0 (metilsüIfonamid0)feniI)-1- Ü izopropiI-1H-pirazoI-4-il)pirimidin- 0 “H 2-ilamin0)propan-2-iIkarbamat " ”N N Tablo 2: Örnek Niteligi Tasiyan MEK inhibitörleri Isim CAS No. Yapi Isim CAS No. Yapi 52'6 HQ: ,- 21-8 4:* x 1;- " `IT . ./ `TR-;r L ` PD334581 fI0r0-4-iod0fenil)amin0]-6- 38-6 metoksifeniI]-1-[(2R)-2,3- dihidroksipropil]- Siklopropansülfonamid Isim CAS No. Yapi HO\/î\yßg? Ü 7 6-Met0ksi-7-(3-m0rf0lin-4-il- propoksi)-4-(4-fen0ksi- O/î fenilamino)-kin0lin-3-karb0nitril k/NWO N\ 8 4-[3-Klor0-4-(1-metiI-1H-imidazol- 2-ilsüIfanil)-fenilamin0]-6-metoksi- o& 7-(3-morf0lin-4-iI-propoksi)- k/NWO "k kinoIIn-3-karb0nitril `o / cn Burada, RAF aktivitesini inhibe eden ilaçlara C-RAF polipeptidini ifade eden hücreler Üzerinde direnç veren, C-RAF polipeptidini kodlayan bir nükleik asit molekülündeki mutasyonlarin veya bir C-RAF polipeptidindeki mutasyonlarin tespit edilme yöntemleri açiklanmaktadir. Bir "mutant C-RAF polipeptidi", burada referans verildigi üzere, bir veya daha fazla bilinen RAF inhibitörüne direnç veren bir veya daha fazla mutasyon içeren bir C-RAF polipeptidi içerir. Benzer sekilde, bir "mutant C-RAF nükleik asit molekülü", burada referans verildigi üzere, bir mutant C-RAF polipeptidini kodlayan bir nükleik asit molekülü içerir. Bir veya daha fazla mutasyon içeren C-RAF polipeptidlerini kodlayan nükleik asit molekülleri, örnegin, E. Coli”de yürütüleilen, bir dogal sus C-RAF nükleik asit dizisinin bölgeye yönlendirilmis mutagenezi veya rastgele mutagenezi dahil olmak üzere, teknikte bilinen herhangi bir uygun yöntem kullanilarak olusturulabilir.
Dogal sus C-RAF nükleik asit dizisi, bir insan dogal sus MEK1 nükleik asit dizisi olabilir.
Burada açiklanan dogal sus C-RAF nükleik asit dizisi, dogal sus insan C-RAF'dir (SEQ akabinde, RAF inhibitörü ile tedaviye dirençli olan bir dogal sus C-RAF polipeptidi ile karsilastirildiginda bir mutant C-RAF polipeptidi kodlayan bir nükleik asidi tespit etmek üzere baska türlü bir RAF inhibitörü ile tedaviye duyarli hücrelerde gösterilebilir. Burada açiklanan C-RAF polipeptidi, dogal sus inan C-RAF'dir (SEO ID NO: 2) (Isviçre-Prot lD Herhangi uygun yöntem, bir RAF inhibitörü ile tedaviye dirence yönelik olarak mutant C-RAF nükleik asitleri ve mutant C-RAF polipeptitleri göstermek üzere kullanilabilir. Örnegin, bir mutant C-RAF polipeptidi kodlayan bir nükleik asit molekülü, bir RAF ile tedaviye baska türlü duyarli hücrelerde ifade edilebilir. Bu amaca yönelik faydali bir örnek niteligi tasiyan hücre hatti, melanom hücre hatti A375`tir. Mutant C-RAF polipeptidin ifadesini takiben hücreler, bir RAF ile tedavi edilebilir. Mutant C-RAF polipeptidin aktivitesi akabinde ölçülebilir ve benzer bir sekilde ifade edilen ve RAF inhibitörü ile tedavi edilen bir dogal sus C-RAF polipeptidin aktivitesi ile karsilastirilabilir. Bir C-RAF polipeptidin aktivitesi, örnegin, RAF inhibitörü ile tedaviyi takiben hücrelerin proliferasyonu veya viyabilitesi ölçülerek belirlenebilir, burada proliferasyon veya viyabilite, pozitif olarak C-RAF aktivitesi ile iliskilendirilir. Hücre büyümesi, proliferasyonu veya viyabilitesi, teknikte bilinen herhangi uygun yöntem kullanilarak belirlenebilir. Hücre büyümesi, bir RAF inhibitörünün varliginda hücre büyümesinin, RAF inhibitörü yoklugunda kültürlenen tedavi edilmemis hücrelerde gözlemlenenin bir yüzdesi olarak ifade edildigi, MTS veya Hücre Titer GLo gibi saglam temelli hücre proliferasyonu/viyabilitesi analizleri kullanilarak belirlenebilir. Direnç, uygun bir kontrole göre en az 2 kat, daha çok tercihen en az 3 kat, en çok tercih edildigi üzere en az 4-5 katlik GI50 degerinde bir kayma olarak tanimlanir. Alternatif olarak direnç, ~1 uM'Iik bir GI50 degeri olarak tanimlanir.) Bir C-RAF polipeptidinin aktivitesi ayni zamanda, örnegin, RAF inhibitörü ile tedaviyi takiben hücrede mevcut olan nispi fosforile ERK1/2 miktari belirlenerek ölçülebilir. Bir dogal sus veya mutant C-RAF polipeptidinin aktivitesi ayni zamanda, MEK1 aktivitesinin, RAF veya MEK inhibitörü ile tedaviyi takiben analizde fosforile ERK 1/2 orani ölçülerek belirlendigi, bir in vitro fosforilasyon analizi kullanilarak belirlenebilir. Bir RAF inhibitörü ile tedaviyi takiben bir dogal sus C-RAF polipeptidinden daha büyük bir aktiviteye sahip olan bir mutant C- RAF polipeptidi, bir RAF inhibitörüne direnç veren bir mutasyonu içerdigi tespit edilir.
Bir RAF inhibitörüne direnç veren mutasyon akabinde, mutant C-RAF polipeptidini kodlayan nükleik asit dizilenerek veya mutant C-RAF polipeptidi direkt olarak dizilenerek saptanabilir.
Bu sekilde, çok büyük ölçekte paralel dizi yönemlerinin kullanilmasinin yani sira, Örnek 1'de açiklandigi üzerei amino asit sübstitüsyonlari, mutasyona ugratildiginda PLX4032, pirazoI-4-iI)pirimidin-2-ilamin0)pr0pan-2-iIkarbamat RAF inhibitörlerine direnç veren C- RAF polipeptidinde tespit edilmistir. Özellikle, insan C-RAF polipeptidinin asagidaki verir. Bir mutant C-RAF polipeptidi, bu amino asit kalintilarinin bir veya daha fazlasinda dogal sus insan C-RAF polipeptidine göre bir mutasyon içerebilir. Mutant C-RAF polipeptidi, asagidaki direnç mutasyonlarinin bir veya daha fazlasini içerebilir: 104E>K, Izole Edilmis Nükleik Asit Molekülleri Mevcut bulus, C-RAF geni ile ilgili olarak polinükleotitler veya nükleik asit molekülleri ve bunun ilgili gen ürünü ile ilgilidir. Bu polinükleotitler veya nükleik asit molekülleri, memeli hücrelerinden izole edilebilir ve saflastirilabilirdir. Burada açiklanan izole edilmis C-RAF nükleik asit molekülleri, bir veya daha fazla RAF inhibitörüne direnç veren bir mutasyon içerebilir. Bir "mutant C-RAF nükleik asit molekülü", burada referans verildigi üzere, bir mutant C-RAF polipeptidini, yani, bir veya daha fazla RAF inhibitörüne direnç veren bir veya daha fazla mutasyonu içeren bir C-RAF polipeptidini kodlayan bir C-RAF nükleik asit molekülü içerir.
Izole edilmis ve saflastirilmis bir C-RAF nükleik asit molekülünün, örnegin, bir mutant C-RAF nükleik asit molekülünün, RNA veya DNA formunu alabildigi düsünülmektedir.
Burada kullanildigi üzere, "RNA transkripti" terimi, bir DNA nükleik asit molekülünden transkripsiyon ürünü olan bir RNA molekülüne refere eder. Bu tür bir transkript, bir veya daha fazla proteine yönelik kodlayabilir.
Bu basvuruda kullanildigi üzere, "polinükleotit" terimi, toplam genomik nükleik asitteri serbest olan gibi izole edilmis olan bir nükleik asit molekülüne, RNA veya DNA, refere eder. Bu nedenle, bir "C-RAF kodlayan polinükleotit", C-RAF kodlama dizilerini içeren, yine de toplam genomik DNA ve proteinlerden uzaga izole edilen veya bundan saflastirilan ve yoksun olan bir nükleik asit segmentine refere eder. Mevcut basvuru, bir C-RAF kodlayan polinükleotit veya nükleik asidin fonksiyon veya aktivitesine refere ettiginde bu, polinükleotidin, bir dogal sus C-RAF polipeptidinin bir aktivitesini, örnegin, ERK1/2 substratinin fosforilasyonunu gerçeklestirme yetenegine sahip olan bir molekülü kodladigi anlamina gelir. istenir. Ayni zamanda, verilen bir hüvreden verilen bir C-RAF kodlayan nükleik asit veya C-RAF'in, hafif farkli nükleik asit dizilerine sahip olan, ancak, bununla birlikte, aktif bir C-RAF polipeptidini kodlayan dogal varyantlar veya suslar ile temsil edilebildigi düsünülmektedir. Aktif C-RAF polipeptidi, aktif bir insan C-RAF polipeptidi olabilir. Aktif C-RAF polipeptidi, bir dogal sus C-RAF polipeptidinin bir aktivitesine sahip olan, ancak bir veya daha fazla bilinen RAF inhibitörüne dirençli olan bir mutant C-RAF polipeptidi olabilir. Sonuç olarak, burada, minimal nükleik asit veya amino asit degisikliklerine sahip, ancak ayni biyolojik fonksiyona sahip olan C-RAF nükleik asitlerinin veya polipeptitlerin deriveleri açiklanmaktadir.
Bazi düzenlemelerde bulus, bulusun mutant C-RAF polipeptitlerini kodlayan DNA dizilerini birlestiren rekombinant vektörler ile ilgilidir. Burada, bir veya daha fazla RAF inhibitörüne direnç veren bir veya daha fazla mutasyon içeren bir C-RAF polipeptidinin bir komsu amino asit dizisini, bunun amino asit dizisi Içerisinde içeren bir C-RAF polipeptidini kodlayan DNA dizilerini birlestiren rekombinant vektörler ve izole edilmis DNA segmentleri açiklanmaktadir.
Kodlama dizisinin kendisinin uzunluguna bakilmaksizin nükleik asit segmentleri, bunlarin toplam uzunlugunun büyük ölçüde degisiklik gösterebilecegi bir sekilde, kolaylastiricilar, poliadenilasyon sinyalleri, ek restriksiyon enzimi bölgeleri, çoklu klonlama bölgeleri, diger kodlama segmentleri ve benzeri gibi diger DNA veya RNA dizileri ile kombine edilebilir. Bu nedenle, neredeyse herhangi bir uzunluktan bir nükleik asit fragmaninin kullanilabildigi düsünülmektedir, toplam uzunluk tercihen, istenilen rekombinant DNA protokolünde hazirlamanin ve kullanimin kolayligi ile sinirlandirilir.
Bir "heterolog" dizi, kalan diziye yabanci veya ekzojen olan bir diziye refere eder. Bir heterolog gen, bunun burada yerlestirildigi dizilere komsu, dogada bulunmayan bir gene refere eder.
Nükleik asit dizisi, tarifnameye göre, en az bir amino asit sübstitüsyonunun, asagidakiler dahil bir veya daha fazla amino asit pozisyonunda meydana geldigi C-RAF tarifnameye göre, asagidaki direnç mutasyonlarinin bir veya daha fazlasini içerebilir: 554R>K.
Bulusun mutant C-RAF molekülleri, Istem 1'de belirtildigi üzeredir.
Ifade Vektörleri ve Konak Hücreler Mevcut bulus, içine bu tür ifade vektörlerinin uygulandigi konak hücrelerin yani sira bulusun bir C-RAF polipeptidine yönelik kodlayan ifade vektörlerini kapsar. "Vektör" terimi, içine bir nükleik asit dizisinin, bunun kopyalanabildigi bir hücre içine uygulanmasina yönelik olarak yerlestirilebildigi bir tasiyici nükleik asit molekülüne veya dizinin, hücre içinde, ancak dizinin siradan bir sekilde bulunmadigi bir konak hücre nükleik asidi içerisindeki bir pozisyondaki bir diziye homolog oldugu hücreye yabanci oldugu anlamina gelen "ekzojen" olabilir. Vektörler plazmidleri, kozmidleri, virüsleri (bakteriyofaj, hayvan virüsleri ve bitki virüsleri) ve yapay kromozomlari (örnegin YAC'ler) içerir. Teknikte uzman kisi, standart rekombinant teknikler yoluyla bir vektör olusturmak üzere iyi donatilacaktir. azindan kismina yönelik kodlayan bir nükleik asit dizisi içeren bir vektöre refere eder.
Bazi durumlarda RNA molekülleri akabinde. bir protein, protein veya peptit içine çevrilebilir. Bazi durumlarda bu diziler, örnegin, antisens moleküllerinin veya ribozimlerin üretiminde çevrilmez. Ifade vektörleri, özel bir konak organizmada islevsel bir sekilde baglanan bir kodlama dizinin transkripsiyonuna ve muhtemelen translasyonuna yönelik gerekli nükleik asit dizilerine refere eden "kontrol dizilerinin" bir çesitliligini içerebilir. Transkripsiyon ve translasyonu yöneten kontrol dizilerine ek olarak, vektörler ve ifade vektörleri, ayni zamanda diger fonksiyonlari gösteren nükleik asit dizilerini içerebilir.
Burada kullanildigi üzere, "hücre", "hücre hatti" ve "hücre kültürü" terimleri, birbiri ile degistirilebilir bir sekilde kullanilabilir. Bir C-RAF polinükleotidini içeren bir hücre, mutasyona ugramis veya dogal sus olsun, bulusta kullanilabilir. Bu terimlerin hepsi ayni zamanda, herhangi ve bütün sonraki jenerasyonlara refere eden bunlarin soyunu içerir. Bütün soyun, kasitli veya kasitsiz mutasyonlar nedeniyle ayrii olmayabildigi anlasilmaktadir. Bir heterolog nükleik asit dizisinin ifade edilmesi baglaminda "konak hücre", bir prokaryotik veya ökaryotik hücreye refere eder ve bu, bir vektör tarafindan kodlanan bir heterolog geni ifade etme ve/veya bir vektörü kopyalama yetenegine sahip herhangi transforme edilebilen organizmayi içerir. Bir konak hücre, vektörlere yönelik bir resipiyan olarak kullanilabilir ve kullanilmistir. Bir konak hücre, ekzojen nükleik asidin, konak hücre içine aktarildigi veya uygulandigi bir prosese refere ederek, hücreyi ve bunun soyunu içerir. Bir "rekombinant konak hücre", bir rekombinant nükleik asit, yani' in vitro manipüle edilmis olan veya bu sekilde manipüle edilmis olan bir nükleik asidin kopyalanmis bir kopyasi olan bir nükleik asidi tasiyan bir konak hücreye refere eder. Bir konak hücre, istenen sonucun, vektörün kopyasi, kismin ifadesi veya vektör ile kodlanan nükleik asit dizilerinin tamami veya enfeksiyöz viral partiküllerin üretimi olmasina bagli olarak, prokaryotlardan veya ökaryotlardan derive edilebilir.
Izole Edilmis Polipeptit Molekülleri Ayni zamanda burada, izole edilmis ve/veya saflastirilmis C-RAF polipeptitleri ve bunlarin biyolojik olarak aktif kisimlari açiklanmaktadir. Burada açiklanan C-RAF polipeptitleri, bir veya daha fazla RAF inhibitörüne direnç veren bir veya daha fazla amino asitte bir mutasyon içerir. Bir "mutant C-RAF polipeptidi", burada referans verildigi üzere, bir veya daha fazla RAF inhibitörne direnç veren bir veya daha fazla amino asit pozisyonunda bir mutasyon içeren bir C-RAF polipeptidi içerir.
Bir C-RAF polipeptidinin biyolojik olarak aktif kisimlari, bir tam uzunlukta C-RAF polipeptidinden daha az amino asit içeren ve bir C-RAF polipeptidinin en az bir aktivitesini sergileyen, bir C-RAF polipeptidinin amino asit dizisinden, örnegin SEQ ID NO:2'de gösterilen amino asit dizisinden derive edilen amino asit dizilerini içeren peptitleri içerir. Tipik olarak, biyolojik olarak aktif kisimlar (peptitler, örnegin, uzunluk amino asit olan peptitler), bir C-RAF polipeptidinin en az bir aktivitesi ile bir domen veya motif içerir. Üstelik, proteinin diger bölgelerinin silindigi diger biyolojik olarak aktif kisimlar, rekombinant teknikleri ile hazirlanabilir ve burada açiklanan aktivitelerin bir veya daha fazlasina yönelik olarak degerlendirilebilir. Tercihen, bir C-RAF polipeptidinin biyolojik olarak aktif kisimlari, biyolojik aktiviteye sahip olan bir veya daha fazla seçilmis domen/motif veya bunlarin kisimlarini içerir.
C-RAF polipeptitleri, rekombinant DNA teknikleri ile üretilebilir. Örnegin, proteini kodlayan bir nükleik asit molekülü, bir ifade vektörü içine klonlanir (yukarida açiklandigi üzere), ifade vektörü, bir konak hücre içine uygulanir (yukarida açiklandigi üzere) ve C- RAF polipeptidi, konak hücrede ifade edilir. C-RAF polipeptidi akabinde, standart protein saflastirma teknikleri kullanilarak uygun bir saflastirma semasi ile hücrelerden izole edilebilir. Rekombinant ifadeye alternatif olarak, bir C-RAF polipeptidi, standart peptit sentezi teknikleri kullanilarak kimyasal olarak sentezlenebilir. Üstelik, bir natif C- RAF polipeptidi ve/veya bir mutant C-RAF polipeptidi, örnegin, bu bulusun bir C-RAF polipeptidi veya bunun fragmani kullanilarak standart teknikler ile üretilebilen bir anti-C- RAF antikoru kullanilarak, hücrelerden (örnegin kanser hücrelerinden) izole edilebilir.
C-RAF kimerik veya füzyon proteinleri ayrica kullanilabilir. Burada kullanildigi üzere, bir MEK1 "kimerik proteini" veya "füzyon proteini", C-RAF olmayan bir polipeptide islevsel bir sekilde bagli bir C-RAF polipeptidi içerir. Bir "C-RAF polipeptidi", bir C-RAF polipeptidine karsilik gelen bir amino asit dizisine sahip olan bir proteine refere ederken, bir "C-RAF olmayan polipeptit", C-RAF polipeptidine büyük ölçüde homolog olmayan bir proteine, örnegin, C-RAF polipeptidinden büyük ölçüde farkli olan, bir C- RAF aktivitesi sergilemeyen ve ayni veya farkli bir organizmadan derive edilen bir proteine karsilik gelen bir amino asit dizisine sahip olan bir proteine refere eder.
Füzyon proteini içerisinde, "islevsel bir sekilde bagli" teriminin, C-RAF polipeptidinin ve C-RAF olmayan polipeptidin birbirine çerçeve içinde kaynastirildigi anlamina gelmesi istenir. C-RAF olmayan polipeptit, C-RAF polipeptidin N-terminaline veya C-terminaline kaynastirilabilir. Füzyon proteini, C-RAF amino asitlerinin, GST polipeptidinin C- terminaline kaynastirildigi bir GST-C-RAF füzyon proteini olabilir. Bu tür füzyon proteinleri, rekombinant C-RAF polipeptidinin saflastirilmasini kolaylastirabilir. Füzyon proteini, bunun N-terminalinde bir heterolog sinyal dizisi içeren bir C-RAF polipeptidi olabilir. Belirli konak hücrelerde (örnegin, memeli konak hücreleri), bir MEK1 proteininin ifadesi ve/veya salgilanmasi, bir heterolog sinyal dizisinin kullanimi yoluyla artirilabilir.
Mutant C-RAF polipeptidi, bir dogal sus C-RAF polipeptidinin veya bir dogal sus C-RAF polipeptidini kodlayan nükleik asit molekülünün mutagenezi ile üretilebilir. Mutant C- RAF polipeptidi ayni zamanda, istenen bir aktiviteye, örnegin, bir veya daha fazla RAF inhibitörüne dirence sahip olan bir mutant C-RAF polipeptidine yönelik olarak C-RAF mutantlarinin kombinasyonal kütüphanelerinin görüntülenmesi ile tespit edilebilir.
Birkaç teknik, nokta mutasyonlari veya kisaltma yoluyla yapilan kombinasyonal kütüphanelerin gen ürünlerinin görüntülenmesine yönelik olarak ve seçilen bir özellige sahip olan gen ürünlerine yönelik cDNA kütüphanelerinin görüntülenmesine yönelik olarak bilinmektedir. Bu tür teknikler, kombinatoryal mutagenez ile üretilen gen kütüphanelerinin hizli görüntülenmesine yönelik olarak adapte edilebilirdir. Büyük gen kütüphanelerinin görüntülenmesine yönelik yüksek verimli görüntü analizine uyumlu olan, en yaygin sekilde kullanilan teknikler, tipik olarak gen kütüphanesinin, kopyalanabilen ifade vektörleri içine klonlanmasini, vektörlerin ortaya çikan kütüphaneleri ile uygun hücrelerin dönüstürülmesini ve istenen bir aktivitenin saptanmasinin ürününün saptandigi geni kodlayan vektörün izole edilmesini kolaylastirdigi kosullar altinda kombinasyonal genlerin ifade edilmesini içerir.
Antikorlar Bulusun polinükleotitlerinden ifade edilen polipeptitler, antikorlarin üretilmesine yönelik olarak kullanilabilir. Antikorlar, mutant C-RAF polipeptitlerinin ifadesini saptamak ve miktarini belirlemek üzere kullanilabilir. Antikorlar, bir mutant C-RAF polipeptidinin aktivitesini degistirmek üzere kullanilabilir. Birbirini izleyen en az alti, sekiz, on, on iki, on bes, yirmi veya otuz amino asit içeren bulusun polinükleotitlerinden ifade edilen polipeptitler, immünojenler olarak kullanilabilir. Polipeptitler, bulusun bir mutant C-RAF polipeptidine spesifik olarak baglanan antikorlarin bir preparatini elde etmek üzere kullanilabilir.
Antikorlar, hedef proteine veya bunun fragmanlarina yönelik spesifik olan, monoklonal veya poliklonal antikorlar, tek zincirli antikorlar, kimerik antikorlar, bifonksiyoneI/bispesifik antikorlar, hümanize antikorlar, Insan antikorlari ve tamamlayici belirleme bölgesi (CDR) ile grefte edilmis antikorlar olabilir ve ayrica Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, devegil antikorlari veya mikroantikorlar dahil olmak üzere antikor fragmanlarini içerir. Bir antikor ayni zamanda, bir anti-idyotip antikora, yani, bir antikorun dizisinin antijen spesifik kismina karsi yönlendirilen ve dolayisiyla diger antikorlarin baglanma bölgelerini taniyan bir antikora; veya bir anti-anti-idyotip antikora, yani, orijinal antikoru üretmek üzere kullanilmis olan antijen üzerindeki epitopu taklit eden bir kombine etme bölgesine sahip bir antikora refere edebilir. Antikorlari yükseltmeye yönelik teknikler, teknikte iyi bilinmektedir.
Tek zincirli antikorlar ayrica olusturulabilir. Bulusun polinükleotitlerinden ifade edilen bir polipeptide spesifik olarak baglanan tek zincirli antikorlar, örnegin, teknikte bilindigi üzere, tek zincirli immünoglobulin görüntüleme kütüphanelerinden izole edilebilir.
Kütüphane, bir polipeptide karsi "panlanir" ve yüksek afiniteye sahip polipeptidin farkli epitoplarini baglayan tek zincirli antikorlarin bir sayisi izole edilebilir. Hayashi et al., temin edilebilirdir. Antikorlar ayni zamanda, bir kalip olarak hibridom cDNA kullanilarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanilarak olusturulabilir. Thirion et al., 1996, Eur.
J. Cancer Prey. 5: 507-11.
Tek zincirli antikor, mono- veya bi- spesifik olabilir ve iki degerlikli veya dört degerlikli olabilir. Dört degerlikli bispesifik tek zincirli antikorlarin olusturulmasi, Coloma and tek zincirli antikorlarin olusturulmasi, Mallender and Voss, 1994, J. Bi'ol. Chem. 269: 199-206'da açiklanmaktadir.
Tek zincirli antikoru kodlayan bir nükleotit dizisi akabinde, asagida açiklandigi üzere, manüel veya otomatiklestirilmis nükleotit sentezi kullanilarak olusturulabilir, standart rekombinant DNA metodolojileri kullanilarak DNA ifade vektörleri içine klonlanabilir ve seçilen geni ifade eden hücreler içine uygulanabilir. Alternatif olarak antikorlar, filamentöz faj teknolojisi kullanilarak direkt olarak üretilebilir Verhaar and., 1995, Int. J.
Antikorlar, bulusun polinükleotitlerinden ifade edilen polipeptitlerin epitoplarina spesifik olarak baglanabilir. Tercih edilen bir düzenlemede epitoplar, diger insan proteinleri üzerinde mevcut degildir. Tipik olarak, bir epitopu kodlamak üzere minimum bir komsu amino asit sayisi 6, 8 veya 10'dur. Bununla birlikte, daha fazlasi, özellikle komsu olmayan kalintilari veya özel yapilari içeren epitoplari olusturmak üzere, örnegin en az , 25 veya 50 tanesi, kullanilabilir.
Polipeptitlere spesifik olarak baglanan antikorlar, tam uzunluktaki polipeptitlere baglananlari içerir. Spesifik baglama antikorlari, insan hücrelerinin Western blotlari üzerinde diger proteinleri saptamaz veya bulusun hedef proteini ile saglanan sinyalden en az on kat daha düsük bir sinyal saglar. Bu tür spesifiklige sahip olan antikorlar, rutin görüntüleme ile elde edilebilir. Antikorlar, hücre özütlerinden veya solüsyonundan, bulusun polinükleotitlerinden ifade edilen polipeptitleri immüno çöktürebilir. Ek olarak, antikorlar, doku kesitlerinde veya poliakrilamid jellerin Western blotlari üzerinde bulusun polinükleotitlerinden ifade edilen polipeptitler ile reakte olabilir. Tercihen antikorlar, immünositokimyasal analizlerde veya Western blotlari üzerinde diger insan proteinleri ile spesifik olmayan çapraz-reaktivite sergilemez.
Antikorlarin, bulusun polinükleotitlerinden ifade edilen polipeptitlere saflastirilmasina yönelik teknikler, teknikte temin edilebilirdir. Antikorlar, bulusun polinükleotitlerinden ifade edilen özel bir protein veya polipeptidin baglandigi bir kolon üzerinden geçirilebilir.
Bagli antikorlar akabinde, örnegin, bir yüksek tuz konsantrasyonuna sahip olan bir tampon ile ayristirilir.
Mutasyonlarin Saptanmasi Burada, bir numunede (örnegin bir kanser hastasindan biyolojik bir numune) bir mutant C-RAF polipeptit varliginin saptanma yöntemleri açiklanmaktadir. Çesitli görüntüleme yöntemleri, bir numunede, örnegin, bir nükleik asit ve/veya bir protein numunesinde bulusun bir mutant C-RAF polipeptidinin varligini saptamak üzere kullanilabilir.
Numune, bir hücre veya hücre özütü içerebilir.
Bulusa göre numune, kansere sahip olan bir özneden elde edilen hücrelerdir. bir C-RAF polipeptidini veya bunun biyolojik olarak aktif kismini kodlayan bir dizi içeren genomik DNA, cDNA veya RNA'da (yani mRNA) direnç mutasyonlarinin varliginin saptanmasina yönelik yöntemler kullanilabilir. Benzer bir sekilde, C-RAF polipeptidi veya bunun biyolojik olarak aktif kisimlarinda direnç mutasyonlarinin varliginin saptanmasina yönelik yöntemler kullanilabilir. Özellikle yöntemler, bununla sinirli olmamakla birlikte, dogal sus C-RAF polipeptidi (SEQ ID NO: 2) ile karsilastirildiginda bir veya daha fazla amino asit kisimlarina sahip olan, bir C-RAF polipeptidinin veya C- RAF polipeptidini kodlayan bir nükleik asit molekülünün varligini saptamak üzere kullanilabilenleri içerebilir. Bir mutant C-RAF polipeptidine yönlendirilen antikorlar, mutant polipeptidin varligini saptamak üzere kullanilabilir.
Nokta mutasyonlari, örnegin, denatüran gradyan jel elektroforezi ("DGGE"), restriksiyon fragman uzunluk polimorfizmi analizi ("RFLP"), kimyasal veya enzimatik klevaj yöntemleri, PCR ile amplifiye edilen hedef bölgelerin dogrudan dizilenmesi (bakiniz, yukari), tek sarmal dogrulama polimorfizmi analizi ("SSCP"), polimeraz zincir reaksiyonu, dizileme, hibridleme veya "hibrid yakalama", akabinde pirodizileme veya tek molekül dizileme dahil, teknikte bilinen herhangi bir uygun yöntem kullanilarak saptanabilir. Teknikte uzman kisice bilinen mutasyonlarin saptanmasina yönelik diger yöntemler ayrica kullanilabilir.
Görüntüleme yöntemleri, yukarida tanimlanan mutasyonlarin meydana gelmesine yönelik olarak bir bireyi görüntülemek üzere gerçeklestirilebilir. Örnegin hücreler, analize yönelik olarak bir hastadan alinir. Hasta, bir kanser hastasidir, Bir C-RAF nükleik asit veya bir C-RAF polipeptidinde bir mutasyonun saptanmasina yönelik olarak bu tür numunelerin isleme tabi tutulmasina yönelik uygun yöntemler, teknikte bilinmektedir ve uzman kisi, seçilen saptama yöntemine uygun olarak bu tür numunelerin isleme tabi tutulmasini adapte edebilir.
Burada açiklanan bir veya daha fazla mutasyonun varligi veya yoklugu, görüntülenen bireylerin bir RAF inhibitörü ile terapiye direnç gösterme egilimini belirler. Burada açiklanan yöntemlere göre bu sonuçlar, RAF inhibitörünün dozunu ayarlamak ve/veya degistirmek üzere veya bir ikinci inhibitör kullanilarak tedavinin seyrini seçmek üzere kullanilacaktir. Bazi düzenlemelerde ikinci inhibitör, bir MEK inhibitörü olabilir. Kansere sahip olan bir öznenin etkili tedavisi, bir kanser hücresinin eradikasyonunu, kanser (kati tümör gibi) büyüme hizinin durdurulmasi veya indirgenmesini veya en az bir kanser semptomunun gelistirilmesini içerebilir.
C-RAF polipeptidindeki veya C-RAF polipeptidini kodlayan nükleik asit moleküllerindeki direnç mutasyonlari, asagida açiklanan yöntemler dahil olmak üzere, teknikte bilinen herhangi uygun yöntemler veya bunlarin modifikasyonlari kullanilarak saptanabilir. Bu tür yöntemler, aIeI-spesifik polimeraz zincir reaksiyonunun kullanimini, bölgenin dogrudan veya dolayli dizilenmesini bölgenin ilgili alellerinin bir restriksiyon bölgesini olusturdugu veya tahrip ettigi restriksiyon enzimlerinin kullanimini, aIeI-spesifik hibridleme problarini, mutant C-RAF polipeptidine yönelik spesifik olan antikorlarin kullanimini veya diger herhangi biyokimyasal yorumlamayi içerir.
Hedeflenen Terapilerin Direncine yönelik Diyagnostik/Prognostik Markörleri Burada, bir numunede (örnegin bir kanser hastasindan biyolojik bir numune) bir veya daha fazla diagnostik veya prognostik markörün varliginin saptanma yöntemleri açiklanmaktadir. Teknikte uzman kisice bilinen görüntüleme yöntemlerinin bir çesitliligi, DNA, RNA ve protein saptamasi dahil numunede markörün varligini saptamak üzere kullanilabilir. Bu teknikler, bir hastadan elde edilen bir numunede bir mutasyonunun varligini veya yoklugunu belirlemek üzere kullanilabilir. Bazi düzenlemelerde hasta, B- RAF inhibitörleri veya pan-RAF inhibitörleri dahil olmak üzere, kinaz hedefli terapilere dogustan gelen veya edinilmis dirence sahip olabilir. Örnegin hasta, PLX4720 ve/veya izopropiI-1H-pirazoI-4-il)pirimidin-2-ilamino)pr0pan-2-ilkarbamat RAF inhibitörlerine dogustan gelen veya edinilmis bir dirence sahip olabilir. Bir düzenlemede, bir hastadan elde edilen numuneyi içeren bir kanser hücresinde burada açiklanan bir veya daha fazla mutasyonu içeren bir C-RAF nükleik asidinin veya polipeptidinin tespit edilmesi, hastanin, bir RAF inhibitörü ile tedaviye yanitin olmamasi veya nispeten yüksek nüksetme riskinde oldugunu belirtir. Bir hastada yukarida açiklanan bir veya daha fazla C-RAF mutasyonunun tespit edilmesi, hastaya yönelik bir tedavi protokolünün belirlenmesine ve uygulanmasinda hekime yardimci olur. Örnegin, yukarida tespit edilen C-RAF polipeptidinde bir veya daha fazla mutasyona sahip olan bir hastada hekim, asagida daha detayli bir sekilde açiklandigi üzere, bir kombinasyon terapisi ile hastayi tedavi edebilir.
C-RAF polipeptidinde direnç mutasyonlarinin tespit edilmesi, kanserde bir veya daha fazla amino asit pozisyonunda bir C-RAF direnç mutasyonunun varliginin veya yoklugunun belirlenmesi amaciyla, bir kansere sahip olan hastalarin görüntülenmesine olanak saglar. Bir kanserde bir veya daha fazla C-RAF direnç mutasyonunun varliginin veya yoklugunun belirlenmesi, bir kanser hastasinin tedavi stratejisinin degistirilmesine olanak saglar. Bu tür degisiklikler, örnegin, bir RAF inhibitörü veya bir MEK inhibitörü ile tedavinin baslatilmasi veya durdurulmasini, bir kombinasyon terapisinin verilmesini, bir RAF inhibitörünün ve bir ikinci inhibitörün ve benzerinin ardisik dozlanmasinin saglanmasini içerebilir.
Bazi düzenlemelerde, RAF direnç mutasyonlari, mutant C-RAF polipeptidinin, SEQ ID NO:2'de gösterilen bir dogal sus C-RAF polipeptidi ile karsilastirildiginda en az bir amino asit sübstitüsyonunu içerdigi ve Istem 1'de belirtildigi üzere bu en az bir amino asit sübstitüsyonunun, mutant RAF polipeptidini ifade eden bir hücre üzerinde bir veya daha fazla RAF inhibitörüne direnç verdigi, C-RAF aktivitesine sahip olan bir mutant C- RAF polipeptidini kodlayan bir nükleik asitte tespit edilebilir. Burada, mutant C-RAF polipeptidinin, SEQ NO ID:2'de gösterilen bir dogal sus C-RAF polipeptidi ile karsilastirildiginda en az bir amino asit sübstitüsyonunu içerdigi ve bu en az bir amino asit sübstitüsyonunun, mutant C-RAF polipeptidini ifade eden bir hücrede bir veya daha fazla RAF inhibitörüne direç verdigi, C-RAF aktivitesine sahip olan bir mutant C-RAF polipeptidinde tespit edilebilen RAF direnç mutasyonlari açiklanmaktadir. Burada ayni zamanda, dogal sus C-RAF polipeptidinin asagidaki amino asitlerinden bir veya daha 478E ve 554R dahil olmak üzere RAF inhibitörlerine direnç verdigi açiklanmaktadir.
Burada, dogal sus C-RAF polipeptidinin bir veya daha fazla amino asidinin 469M>l, 478E>K ve 554R>K*den olusan gruptan seçildigi açiklanmaktadir. Bazi düzenlemelerde, dogal sus C-RAF polipeptidinin bir veya daha fazla amino asidinin Tedavi Yöntemleri (talep edilmemistir) Burada, kansere sahip olan bir hastanin tedavisine yönelik yöntemler açiklanmaktadir.
Yöntem genel olarak, bir birinci inhibitörün ve bir ikinci inhibitörün uygulanmasini içerir.
Bir inhibitör, bir RAF inhibitörü olabilir. Örnek niteligi tasiyan RAF inhibitörleri, yukaridaki Tablo 1'de gösterilmektedir. Bir inhibitör, bir MEK inhibitörü olabilir (bakiniz, örnek niteligi tasiyan MEK inhibitörlerini gösteren Tablo 2). Burada, bir RAF inhibitörünün etkili bir miktarini ve bir ikinci inhibitörün etkili bir miktarini içeren, kansere yönelik bir kombinasyon terapisinin saglandigi açiklanmaktadir. Ikinci inhibitör, bir MEK inhibitörü olabilir.
Burda açiklanan bir RAF inhibitörü, PLX, zivi (metilsüIfonamid0)feniI)-1-izopropil-1H-pirazoI-4-il)pirimidin-2-ilamino)pr0pan-2- ilkarbamat veya CJ8352 olabilir. Kombinasyon terapisine yönelik faydali ek örnek niteligi tasiyan RAF inhibitörleri, pan-RAF inhibitörlerini, B-RAF inhibitörlerini, A-RAF inhibitörlerini ve RAF-1 inhibitörlerini içerir. Teknikte bilinen ek RAF inhibitörleri ayrica kullanilabilir.
Sinirlandirici olmayan bir örnek olarak, burada saglanan MEK inhibitörü Cl-1040, imidazoI-2-ilsülfanil)-fenilamino]-6-met0ksi-7-(3-morfolin-4-iI-propoksi)-kin0lin-3- karbonitril, Roche bilesik RG7420 veya kombinasyonlari olabilir. Teknikte bilinen ek MEK inhibitörleri ayrica kullanilabilir.
Kombinasyonun uygulanmasi, bir tek formülasyon veya birim dozaj formunun uygulanmasini, es zamanli ancak ayri olarak kombinasyonun ayri ajanlarinin uygulanmasini veya herhangi uygun yol ile ardisik olarak kombinasyonun ayri ajanlarinin uygulanmasini içerir. Kombinasyonun ayri ajanlarinin dozaji, kombinasyondaki diger ajan ile karsilastirildiginda ajanlardan birinin daha sik uygulanmasini gerektirebilir. Bu nedenle, uygun dozlamayi saglamak üzere, paketlenmis farmasötik ürünler, ajanlarin kombinasyonunu içeren bir veya daha fazla dozaj formunu ve kombinasyonun diger ajan(lar)i olmamak üzere ajanlarin kombinasyonlarindan birini içeren bir veya daha fazla dozaj formunu içerebilir.
Ajanlar, bilesiklerin farki stereoizomerik formlarda var olabilecegi bir sekilde, stereojenik merkezler veya stereojenik eksenler, örnegin asimetrik karbon atomlari gibi bir veya daha fazla asimetrik element içerebilir. Bu bilesikler, örnegin, rasematlar veya optik olarak aktif formlar olabilir. Iki veya daha fazla asimetrik elemente sahip bilesiklere yönelik olarak, bu bilesikler, ek olarak diastereomerlerin karisimlari olabilir.
Asimetrik merkezlere sahip olan bilesiklere yönelik olarak, optik izomerlerin ve karisimlarinin tamaminin kapsandigi anlasilmalidir. Ek olarak, karbon-karbon çift baglarina sahip bilesikler, 2- ve E- formlarda meydana gelebilir; bilesiklerin bütün izomerik formlari, mevcut tarifnamede dahil edilmektedir. Bu durumlarda, tek enantiomerler (optik olarak aktif formlar), optik olarak saf prekürsörlerden sentez olan asimetrik sentez ile veya rasematlarin yeniden çözülmesi ile elde edilebilir.
Rasematlarin yeniden çözülmesi ayni zamanda, örnegin, bir çözücü ajan varliginda kristalizasyon gibi klasik yöntemler veya örnegin bir kiral HPLC kolonu kullanilarak kromatografi ile elde edilebilir.
Aksi belirtilmedikçe veya metin ile açik bir sekilde belirtilmedikçe, burada açiklanan kombinasyon terapide faydali bilesiklere referans, hem bilesiklerin serbest bazini hem bilesiklerin bütün farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlarini içerir. Tercih edilen bir tuz, hidroklorid tuzudur. burada parent bilesik, toksik olmayan asit veya baz ilave tuzlari yapilarak modifiye edilir ve ayrica bu tür bilesiklerin ve bu tür tuzlarin, hidratlar dahil, farmasötik olarak kabul edilebilir solvatlarina refere eder. Farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlarin örnekleri, bununla sinirli olmamakla birlikte, aminler gibi bazik kalintilarin mineral veya organik asit ilave tuzlari; karboksilik asitler gibi asidik kalintilarin alkali veya organik ilave tuzlari ve benzeri ve daha önce belirtilen tuzlarin bir veya daha fazlasini içeren kombinasyonlari içerir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlar, toksik olmayan tuzlari ve örnegin, toksik olmayan inorganik veya organik asitlerden olusturulan parent bilesigin kuaterner amonyum tuzlarini içerir. Örnegin, toksik olmayan asit tuzlari, hidroklorik, hidrobromik, sülfürik, sülfamik, fosforik ve nitrik gibi inorganik asitlerden derive edilenleri içerir; diger kabul edilebilir inorganik tuzlar sodyum tuzu, potasyum tuzu ve sezyum tuzu gibi metal tuzlari; ve kalsiyum tuzu ve magnezyum tuzu gibi toprak alkali metal tuzlari; ve daha önce belirtilen tuzlardan bir veya daha fazlasini Farmasötik olarak kabul edilebilir organik tuzlar asetik, trifloroasetik, propiyonik, süksinik, glikolik, stearik, Iaktik, malik, tartarik, sitrik, askorbik, pamoik, maleik, hidroksimaleik, fenilasetik, glutamik, benzoik, salisilik, mesilik, esilik, besilik, sülfanilik, 2-aset0ksibenzoik, fumarik, toluensülfonik, metansülfonik, etari disülfonik, oksalik, izetiyonik, n'nin nCOOH gibi organik asitlerden hazirlanan tuzlari; trietilamin tuzu, piridin tuzu, pikolin tuzu, etanolamin tuzu, trietanolamin tuzu, disiklohekzilamin tuzu, N,N'-dibenziletilendiamin tuzu gibi organik amin tuzlarini; ve arjinat, asparjinat ve glutamat gibi amino asit tuzlarini ve daha önce belirtilen tuzlardan bir veya daha fazlasini içeren kombinasyonlari içerir.
Ajanlarin bir kombinasyonunun bir "etkili miktari", kombinasyon ile tedavi edilen rahatsizligin taban çizgisi klinik olarak gözlemlenebilen isaretleri ve semptomlari üzerinde gözlemlenebilen bir gelisim saglamak üzere yeterli bir miktardir.
Farmasötik ürünler, oral veya diger formlar ile, örnegin rektal olarak veya parenteral enjeksiyon ile uygulanabilir. "Oral dozaj formu", oral uygulamaya yönelik olarak istenen veya reçeteye yazilan bir birim dozaj formunu içermesi anlamina gelir. Bir oral dozaj formu, örnegin, tek bir dozda uygulamaya yönelik ambalajlanan mikrokapsüller veya mikro tabletler gibi birçok altbirimi içerebilir veya içermeyebilir.
Farmasötik ürünler, çesitli formlarda salinabilir. "Salinabilen formlar", anlik salim, hemen salim, kontrollü salim ve yavas salim formlarini içerdigi anlamina gelir. formunun modifiye edilmesi ile aktif ajanin hizli çözünmesini saglamak üzere tasarlanan bir dozaj formunu içerdigi anlamina gelir. bir saatlik uygulanma içerisinde salindigi klasik veya modifiye edilmemis bir salim formunu içerdigi anlamina gelir. aralik içerisinde, ancak sabit durumda uygulamadan sonra en az yaklasik 8 saat, tercihen en az yaklasik 12 saat, daha çok tercihen yaklasik 24 saat boyunca toksik seviyeler altinda muhafaza edildigi bir sekildeki bir hizda aktif ajanlarin salimini içerir. bir plazma seviyesinin elde edildigi ve minimum etkili terapötik seviyede veya bunun yukarisinda olan ve verilen bir aktif ajan(lar)a yönelik minimum toksik plazma seviyesinin altinda olan bir seviyede aktif ajan(lar)in sonraki dozlari ile muhafaza edildigi anlamina gelir. bir hastaligin en az bir semptomunu rahatlattigi, azalttigi veya hafiflettigi anlamina gelir. Örnegin, tedavi, kanser gibi bir rahatsizligin tam eradikasyonu veya bir rahatsizligin bir veya birkaç semptomunun azaltilmasi olabilir. Mevcut baglamin anlami içerisinde, "tedavi etmek" terimi ayni zamanda, bir hastaligin gelismesi veya kötülesmesini durdurdugunu, baslangicini (yani bir hastaligin klinik ortaya çikisi öncesindeki periyot) geciktirdigini ve/veya riskini azalttigini belirtir. "Korumak" terimi burada, bir öznede bir hastaligin gecikmesini veya tedavi edilmesini veya uygun oldugu üzere, bütün gelisimini veya devam etmesini veya agirlasmasini engelledigi anlamina gelmek üzere kullanilir Mevcut baglamin anlami içerisinde hastalik, bir kanser ile iliskilendirilir. kanser içeren herhangi bir rahatsizliga ugrayabilen veya muzdarip olabilen hayvanlari içermesi istenir. Öznelerin örnekleri memelileri, örnegin insanlar, köpekler, inekler, atlar, domuzlar, koyun, keçiler, kediler, fareler, tavsanlar, siçanlar ve trangenik insan olmayan hayvanlari içerir. Belirli düzenlemelerde özne, bir insandir, örnegin kanserlerden muzdarip olan, muzdarip olma riskindeki veya potansiyel olarak muzdarip olma yetenegine sahip bir insandir. yine %5'i içerisinde anlamina gelir. Alternatif olarak, özellikle biyolojik sistemlerde, (yani bir büyüklük sirasi) içerisinde anlamina gelir.
Mevcut baglamda "bir“ ve "bu" ve benzer göndergeler terimlerinin kullanimi, baglam ile burada aksi belirtilmedikçe veya açik bir sekilde tersi belirtilmedikçe, hem tekil hem çogulu kapsadigi yorumlanmalidir. "Içeren", "sahip olan", "dahil eden" ve "bulunduran" terimleri, aksi belirtilmedikçe açik uçlu terimler (yani, "bununla sinirli olmamakla birlikte içeren" anlamina geldigi) olarak yorumlanmalidir. Burada degerlerin araliklarinin belirtilmesinin sadece, burada aksi belirtilmedikçe, aralik içerisinde yer alan her ayri degere ayri olarak bir stenografi refere etme yöntemi olarak görev yapmasi istenir.
Yukarida belirtildigi üzere burada, bir RAF inhibitörünün ve bir ikinci inhibitörün etkili bir miktarini içeren, bir kombinasyon terapisinin özneye uygulanmasini içeren, bir öznede kanserin en az bir semptomunun tedavi edilmesine, önlenmesine, durdurulmasina, baslangicinin geciktirilmesine ve/veya gelisme veya tersine çevrilme riskinin azaltilmasina yönelik faydali bir ilaç kombinasyonu açiklanmaktadir. Bazi düzenlemelerde ikinci inhibitör, bir MEK inhibitörüdür. Tercihen bu inhibitörler, kombine edildiginde yararli bir etki saglayan terapötik olarak etkili dozajlarda uygulanir.
Uygulama es zamanli veya ardisik olabilir. spektrumunu kastetmek üzere kullanilir. Bu tür tümörlerin örnekleri, bununla sinirli olmamakla birlikte, lösemiler, Ienfomalar, miyelomlar, karsinomlar, metastatik karsinomlar, sarkomalar, adenomalar, sinir sistemi kanserleri ve genitoüriner kanserleri içerir. Burada açiklanan daha önce belirtilen yöntemler, yetiskin ve pediyatrik akut lenfoblastik lösemi, akut miyeloid lösemi, adrenokortikal karsinom, AIDS ile ilgili kanserler, anal kanser, apandis kanseri, astrositom, bazal hücre karsinomu, safra kanali kanseri, mesane kanseri, kemik kanseri, osteosarkom, fibröz histiyositom, beyin kanseri, beyin sapi gliyomasi, serebral astrositoma, malign gliyoma, epandimom, medülloblastom, supratentoryal primitif nöroektodermal tümörler, hipotalamik gliyoma, meme kanseri, erkek meme kanseri, bronsiyal adenomlar, Burkitt Ienfomasi, karsinoid tümörü, bilinmeyen kaynakli karsinom, merkezi sinir sistemi Ienfomasi, serebellar astrositom, habis gliyoma, serviks kanseri, çocukluk kanserleri, kronik Ienfotik lösemi, kronik miyelojenöz kösemi, kronik miyeloproliferatif rahatsizliklar, kolorektal kanser, kütanöz T-hücresi Ienfomasi, endometriyal kanser, epandimom, özofajal kanser, Ewin familyasi tümörler, ekstrakraniyal germ hücreli tümör, ekstragonadal germ hücreli tümör, ekstrahepatik safra kanali kanseri, intraoküler melanom, retinoblastom, safra kesesi kanseri, gastrik kanser, gastrointestinal stromal tümör, ekstrakraniyal germ hücreli tümör, ekstragonadal germ hücreli tümör, over'in germ hücreli tümörleri, gestasyonel trofoblastik tümör, gliyoma, saçakli hücreli lösemi, bas ve boyun kanseri, hepatoselüler kanser, Hodgkin Ienfomasi, Hodgkin olmayan Ienfoma, yutakalti kanseri, hipotalamik ve görme yollari gliyomasi, intraoküler melanom, islet hücre tümörleri, Kaposi sarkoma, böbrek kanseri, renal hücre kanseri, girtlak kanseri, dudak ve oral kavite kanseri, küçük hücreli akciger kanseri, küçük hücreli olmayan akciger kanseri, primer merkezi sinir sistemi Ienfomasi, Waldenstrom makroglobülinemi, habis tip fibröz histiyositoma, medülloblastom, melanom, Merkel hücreli karsinom, habis tip mezotelyoma, skuamöz boyun kanseri, multipl endokrin neoplazi sendromu, multipl miyeloma, mikozis fungoides, myelodisplastik sendromlar, miyeloproliferatif rahatsizliklar, kronik miyeloproliferatif rahatsizliklar, nazal kavite ve paranazal sinüs kanseri, nazofaranjeal kanseri, nöroblastom, orofaringeal kanser, over kanseri, pankreas kanseri, paratiroit kanseri, penis kanseri, farinjiyal kanser, feokromositom, pineoblastom ve supratentoryal primitif nöroektodermal tümörler, hipofiz kanseri, plazma hücreli neoplazmalar, plöropulmoner blastom, prostat kanseri, rektal kanser, rabdomiyosarkom, tükürük bezi kanseri, yumusak doku sarkomu, uterus sarkomu, Sezary sendromu, melanom olmayan cilt kanseri, ince bagirsak kanseri, skuamöz hücreli karsinom, skuamöz boyun kanseri, supratentoryal primitif nöroektodermal tümörler, testis kanseri, bogaz kanseri, timoma ve timus kanseri, tiroit kanseri, tranzisyonel hücreli kanser, trofoblastik tümörler, üretral kanser, rahim kanseri, uterus sarkomlari, vajina kanseri, vulvar kanser ve Wimls tümörünün tedavi edilmesinde faydali olabilir. Özel olarak kanser, B-RAF genindeki bir mutasyon ile iliskilendirilebilir. Kanser, bir RAF'ye bagli kanser olabilir. Bu kanserler, bununla sinirli olmamakla birlikte, melanom, meme kanseri, kolorektal kanserler, gliyoma, akciger kanseri, over kanseri, sarkoma ve tiroit kanserini içerir.
Burada açiklanan terapötik kombinasyon, bir öznede orta derece ila siddetli kanserin tedavisine yönelik etkili olabilir.
Dozajlar Kanser tedavisine yönelik ajanlarin kombinasyonunun optimum dozu, bilinen yöntemler kullanilarak her özneye yönelik olarak deneysel bir sekilde belirlenebilir ve ajanlarin aktivitesi; öznenin yasi, vücut agirligi, genel sagligi, cinsiyeti ve diyeti; uygulama süresi ve yolu; ve öznenin aldigi diger ilaçlar dahil olmak üzere, çesitli faktörlere bagli olacaktir. Optimum dozajlar, teknikte iyi bilinen rutin test etme ve prosedürler kullanilarak olusturulabilir.
Bir tekli dozaj formu üretmek üzere tasiyici materyaller ile kombine edilebilen ajanlarin kombinasyon miktari, tedavi edilen bireye ve özel uygulama moduna bagli olarak degisiklik gösterecektir. Burada açiklandigi üzere ajanlarin kombinasyonunu içeren birim dozaj formlari, ajanlar tek basina uygulandiginda tipik olarak uygulanan kombinasyonun her ajaninin miktarlarini içerecektir.
Teknikte siradan uzmanliga sahip olan bir hekim veya veteriner, gerekli farmasötik bilesimin etkili miktarini kolaylikla belirleyebilir ve reçeteye yazabilir. Örnegin, hekim veya veteriner, istenen terapötik etkinin elde edilmesi ve istenen etki elde edilene kadar dozajin asama asama artirilmasi amaciyla gerekli olandan daha düsük seviyelerde farmasötik bilesimde kullanilan, burada açiklanan bilesiklerin dozlarini baslatabilir.
Genel olarak, burada açiklanan bir bilesigin uygun bir günlük dozu, bir terapötik etki üretmek üzere etkili en düsük doz olan bilesigin bu miktari olacaktir. Bu tür bir etkili doz genel olarak, yukarida açiklanan faktörlere bagli olacaktir ve kolaylikla, teknikte uzmanliga sahip olan kisi tarafindan belirlenir.
Genel olarak, belirtilen analjezik etkilere yönelik olarak kullanildiginda, bir hastaya yönelik olarak burada açiklanan bilesiklerin terapötik olarak etkili dozlari, günde vücut agirliginin kilogrami basina yaklasik 0.0001 ila yaklasik 1000 mg, daha çok tercihen günde kg basina yaklasik 0.01 ila yaklasik 50 mg araliginda degisiklik gösterecektir. istenmesi halinde, aktif bilesigin etkili günlük dozu, istege bagli olarak, birim dozaj formlarinda, gün boyunca uygun araliklarda aryi olarak uygulanan iki, üç, dört, bes, alti veya daha fazla alt dozlar olarak uygulanabilir.
Farmasötik Formülasyonlar ve Uygulanma Yollari Burada saglananlar, kanseri, örnegin melanom, tedavisine yönelik ajanlarin bir kombinasyonunu içeren farmasötik formülasyonlardir. Farmasötik formülasyonlar ek olarak, bir tasiyici veya eksipiyan, stabilizatör, lezzetlendirici ajan ve/veya renklendirici ajan içerebilir.
Burada saglananlar, örnegin, ajanlarin iki tipinin bir kombinasyonu olabilen ajanlarin kombinasyonunu içeren farmasötik formülasyonlardir: (1) bir RAF inhibitörü ve/veya inhibitörün farmakolojik olarak aktif metabolitleri, tuzlari, solvatlari ve rasematlari ve (2) bir MEK inhibitörü ve/veya MEK inhibitörünün farmakolojik olarak aktif metabolitleri, tuzlari, solvatlari ve rasematlari.
Ajanlarin kombinasyonu, teknikte uzman kisilerce bilinen uygulama yollarinin bir çesitliligi kullanilarak uygulanabilir. Ajanlarin kombinasyonu, istendigi üzere klasik toksik olmayan farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar, adjuvanlar ve cihazlari içeren birirn dozaj formülasyonlarinda, insanlara ve diger hayvanlara oral olarak, parenteral olarak, sublingual olarak, aeorollestirme veya inhalasyon spreyi yoluyla, rektal olarak, intrasistemal olarak, intravajinal olarak, intraperitoneal olarak, bukal olarak veya topikal olarak uygulanabilir. Topikal uygulama ayni zamanda, transdermal yamalar veya Iyonoforez cihazlar gibi transdermal uygulamanin kullanimini içerebilir.
Burada kullanildigi üzere parenteral terimi, subkütanöz enjeksiyonlari, intravenöz, intramüsküler, intrasternal enjeksiyonu veya infüzyon tekniklerini içerir.
Formülasyon yöntemleri, teknikte iyi bilinmektedir ve örnegin, Remingto: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th Edition (1995)'de açiklanmaktadir. Burada açiklandigi üzere kullanima yönelik farmasötik bilesimler, steril, pirojenik olmayan sivi solüsyonlar veya süspansiyonlar, kaplanmis kapsüller, supozituarlar, Iiyofilize tozlar, transdermal yamalar formunda veya teknikte bilinen diger formlarda olabilir_ Enjekte edilebilen preparatlar, örnegin, steril enjekte edilebilen aköz veya oleajinöz süspansiyonlar, uygun disperse edici veya islatma ajanlari ve süspanse edici ajanlar kullanilarak bilinen teknige göre formüle edilebilir. Steril enjekte edilebilen preparat ayni zamanda, örnegin, 1,3 propandiol veya 1.3 bütandiol içinde bir solüsyon olarak, toksik olmayan parenteral olarak kabul edilebilir bir seyreltici veya solvent içinde steril, enjekte edilebilen bir solüsyon, süspansiyon veya emülsiyon olabilir. Kullanilabilen kabul edilebilir cihazlar ve solventler arasindakiler, su, Ringer solüsyonu, U.S.P ve izotonik sodyum klorid solüsyonudur. Ek olarak, steril, sabit yaglar klasik olarak, bir solvent veya süspanse etme ortami olarak kullanilabilir. Bu amaçla, herhangi bir tadi olmayan, sabit yag, sentetik mono veya di gliseritler dahil kullanilabilir. Ek olarak, oleik asit gibi yag asitleri, enjekte edilebilen maddelerin preparatinda kullanim bulur. Enjekte edilebilen formülasyonlar, örnegin, bir bakteri tutma filtresi yoluyla filtrasyonu ile veya kullanim öncesinde steril su veya diger steril enjekte edilebilen ortam içinde çözülebilen veya dagitilabilen steril kati bilesimler formunda sterilize etme ajanlar birlestirilerek sterilize edilebilir.
Bir ilacin etkisinin uzatilmasi amaciyla, siklikla, subkütanöz veya intramüsküler enjeksiyondan ilacin absorpsiyonunun yavaslatilmasi istenendir. Bu, zayif su çözünürlügüne sahip kristalin veya amoif materyalden bir sivi süspansiyonun kullanimi ile elde edilebilir. Ilacin absorpsiyon orani akabinde, sira ile, kristal boyuta ve kristalin formuna bagli olabilen bunun çözünürlük oranina baglidir. Alternatif olarak, parenteral olarak uygulanan bir ilacin geciktirilmis absorpsiyonu, bir yag cihazi çözülerek veya süspanse edilerek elde edilebilir. Enjekte edilebilen depo formlari, polilaktit poliglikolit gibi biyolojik olarak parçalanabilen polimerlerde Ilacin mikro enkapsüle matrisleri olusturularak yapilir. Kullanilan özel polimerin dogasi ve ilaç ila polimer oranina bagli olarak, ilacin salim hizi kontrole edilebilir. Diger biyolojik olarak parçalanabilen polimerlerin örnekleri poli(0rt0esterler) ve poli(anhidridler)i içerir. Depo enjekte edilebilen formülasyonlar ayni zamanda, vücut dokulari ile uyumlu olan, lipozomlar veya mikroemülsiyonlar içinde ilaç yakalanarak hazirlanabilir.
Rektal veya vajinal uygulamaya yönelik bilesimler tercihen, ortam sicakliginda kati ancak vücut sicakliginda sivi olan ve bu nedenle rektum veya vajinal kavitede eritilen ve aktif bilesigi salan, kakao yagi, polietilen glikol veya bir supozituar vaks gibi uygun, rahatsiz edici olmayan eksi-piyanlar veya tasiyicilar ile burada açiklanan bilesikler karistirilarak hazirlanabilen supozituarlardir.
Oral uygulamaya yönelik kati dozaj formlari kapsüller, tabletler, haplar, tozlar ve granülleri içerir. Bu tür kati dozaj formlarinda aktif bilesik, sodyum sitrat veya dikalsiyum fosfat gibi en az bir inert, farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyan veya tasiyici ve/veya a) nisastalar, Iaktoz, sükroz, glükoz, mannitol ve silisik asit gibi dolgu maddeleri veya katkilar b) örnegin karboksimetilselüloz, aljinatlar, jelatin, polivinilpirrolidinon, sükroz ve akasya gibi baglayicilar, c) gliserol gibi nemlendiriciler, d) agar-agar, kalsiyum karbonat, patates veya tapyoka nisastasi, aljinik asit, belirli silikatlar ve sodyum karbonat gibi ayristirici ajanlar, e) parafin gibi solüsyon geciktirici ajanlar, f) kuaterner amonyum bilesikleri gibi absorpsiyon hizlandiricilar, g) örnegin, asetil alkol ve gliserol monostearat gibi islatma ajanlari, h) kaolin ve bentonit kili gibi absorbanlar ve i) talk, kalsiyum stearat, magnezyum stearat, kati polietilen glikoller, sodyum Iauril sülfat gibi yaglayicilar ve bunlarin karisimlari ile karistirilir. Kapsüller, tabletler ve haplar durumunda dozaj formu ayrica tamponlama ajanlarini içerebilir.
Benzer bir türden kati bilesimler ayrica, Iaktoz veya süt sekerinin yani sira yüksek moleküler agirlikli polietilen glikoller ve benzeri gibi eksipiyanlar kullanilarak yumusak ve sert dolgulu jelatin kapsüllerde kullanilabilir.
Tabletler, drajeler, kapsüller, haplar ve granüllerin kati dozaj formlari, enterik kaplamalar gibi kaplamalar ve kabuklar ve farmasötik formülleme tekniginde iyi bilinen diger kaplamalar ile hazirlanabilir. Bunlar istege bagli olarak, opaklastirma ajanlarini içerebilir ve ayni zamanda, bunlarin, istege bagli olarak geciktirilmis bir sekilde, sadece veya tercihen intestinal yolun belirli bir kisminda aktif içerik maddesi(maddeleri) saldigi bir bilesimden olabilir. Kullanilabilen gömme bilesimlerinin örnekleri, polimerik maddeleri ve vakslari içerir.
Aktif bilesikler ayni zamanda, yukarida belirtildigi üzere, bir veya daha fazla eksipiyan ile mikro-enkapsüle formda olabilir. Tabletlerin, drajelerin, kapsüllerin, haplarin ve granüllerin kati dozaj formlari, enterik kaplamalar, salim kontrollü kaplamalar ve farmasötik formülleme tekniginde iyi bilinen diger kaplamalar gibi kaplamalar ve kabuklar ile hazirlanabilir. Bu tür kati dozaj formlarinda aktif bilesik, sükroz, Iaktoz veya nisasta gibi en az bir inert seyreltici ile karistirilabilir. Bu tür dozaj formlari ayni zamanda, normal uygulamada oldugu üzere, inert seyrelticiler, örnegin tabletleme yaglayicilari ve bir magnezyum stearat ve mikro kristalin selüloz gibi diger tabletleme yardimcilarinin disinda ilave maddeleri içerebilir. Kapsüller, tabletler ve haplar durumunda, dozaj formlari ayni zamanda tamponlama ajanlarini içerebilir. Bunlar istege bagli olarak, opaklastirma ajanlarini içerebilir ve ayni zamanda, bunlarin, istege bagli olarak geciktirilmis bir sekilde, sadece veya tercihen, intestinal yolun belirli bir kisminda aktif Içerik maddesini(maddelerini) saldigi bir bilesimden olabilir.
Kullanilabilen gömme bilesimlerinin örnekleri, polimerik maddeleri ve vakslari içerir.
Oral uygulamaya yönelik sivi dozaj formlari, farmasötik olarak kabul edilebilir emülsiyonlar, mikro emülsiyonlar, solüsyonlar, süspansiyonlar, suruplar ve eliksirleri içerir. Aktif bilesiklere ek olarak sivi dozaj formlari, örnegin, su veya diger solventler, çözücü ajanlar ve emülgatörler örnegin etil alkol, izopropil alkol, etil karbonat, EtOAc, benzil alkol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3 bütilen glikol, dimetilformamid, yaglar (özel olarak, pamuk çekirdegi, yer fistigi, misir, germ, zeytin, hintyagi ve susam yaglari), gliserol, tetrahidrofurfuril alkol, polietilen glikoller ve sorbitan yag asidi esterleri ve bunlarin karisimlari gibi teknikte yaygin bir sekilde kullanilan inert seyrelticileri içerebilir. Inert seyrelticilerin yani sira oral bilesimler ayrica, islatma ajanlari, emülsifiye edici ve süspanse edici ajanlar, tatlandirici, Iezzetlendirici ve koku verici ajanlar gibi adjuvanlari içerebilir.
Burada açiklanan bir bilesigin topikal veya transdermal uygulanmasina yönelik dozaj formlari merhemler, macunlar, kremler, losyonlar, jeller, tozlar, solüsyonlar, Spreyler, inhalanlar veya yamalari içerir. Aktif bilesen, gerekli olabildigi üzere farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici veya herhangi ihtiyaç duyulan koruyucular veya tamponlar ile steril kosullar altinda karistirilir. Oftalmik formülasyonlar, kulak damlalari ve benzeri ayrica tasarlanabilir.
Merhemler, macunlar, kremler ve jeller, burada açiklanan bir aktif bilesige ek olarak, hayvansal ve bitkisel yaglar, sivi yaglar, vakslar, parafinler, nisasta, kitre, selüloz deriveleri, polietilen glikoller, silikonlar, bentonitler, silisik asit, talk ve çinko oksit veya bunlarin karisimlari gibi eksipiyanlari içerebilir.
Burada açiklanan bilesimler ayni zamanda, bir sivi aerosol veya solunabilen kuru toz olarak dagitima yönelik olarak formüle edilebilir. Sivi aerosol formülasyonlari, terminal ve respiratuar bronsiyollere dagitilabilen partikül boyutlari halinde agirlikli olarak sprey haline getirilebilir.
Burada açiklanan aerosolize formülasyonlar, tercihen, agirlikli olarak 1 ila 1.5 um arasindaki bir kütle ortam ortalamali çapa sahip olan bir aerosol partiküllerinin formasyonuna olanak saglamak üzere seçilen, bir jet, titresimli gözenekli plaka veya ultrasonik nebulizatör gibi bir aerosol olusturma cihazi kullanilarak dagitilabilir. Ayrica, formülasyon tercihen, dengeli ozmolarite iyonik gücüne ve klorid konsantrasyonuna ve enfeksiyon bölgesine burada açiklanan bilesiklerin etkili bir dozunu dagitma yetenegine sahip en küçük aerosolize olabilen hacme sahiptir. Ek olarak, aerosolize formülasyon tercihen, hava yollarinin fonksiyonelligini negatif bir sekilde bozmaz ve istenmeyen yan etkilere neden olmaz.
Burada açiklanan aerosol formülasyonlarinin uygulanmasina yönelik uygun aerosolizasyon cihazlari, örnegin, agirlikli olarak 1 ila 5 um'lik boyut araliginda aerosol paritkül boyutu halinde burada açiklanan formülasyonu sprey haline getirme yetegine sahip olan jet, titresimli gözenekli plaka, ultrasonik nebulizörler ve enerji saglanmis kuru toz solunum cihazlarini içerir. Agirlikli olarak bu uygulamara, üretilen bütün aerosol partiküllerinin en az %70'inin, ancak tercihen %90'indan fazlasinin 1 ila 5 um araligi içerisinde oldugu anlamina gelir. Bir jet nebulizatör, bir sivi solüsyonu aerosol damlaciklar halinde kirmak üzere hava basinci ile çalisir. Titresimli gözenekli plakali nebulizatörler, gözenekli bir plaka yoluyla bir solvent damlacigini ekstrüde etmek üzere hizli bir sekilde titresimli, gözenekli bir plaka ile üretilen bir sonik vakum kullanilarak çalisir. Bir ultrasonik nebulizatör, bir siviyi küçük aerosol damlaciklari halinde küçülten bir piezoelektrik kristal ile çalisir. Çesitli uygun cihazlar, örnegin, AERONEB ve AERODOSE titresimli gözenekli plakali nebulizatörler (AeroGen, Inc., Sunnyvale, Kaliforniya), SIDESTREAM nebulizatörler (Medic Aid Ltd., West Sussex, Ingiltere), PARI LC ve PARI LC STAR jet nebulizatörler (Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Virjinya) ve AEROSONIC (DeViIbiss Medizinische Produkte (Almanya) GmbH, Heiden, Almanya) ve ULTRAAIRE (Omron Healthcare, Inc., Vernon Hills, Burada açiklanan bilesikler ayni zamanda, burada açiklanan bilesiklere ek olarak, eksipiyanlar veya bu maddelerin karisimlarini içerebilen topikal tozlar ve Spreyler olarak kullanima yönelik olarak formüle edilebilir. Spreyler ek olarak, kloroflorohidrokarbonlar gibi alisilmis itici gazlari içerebilir.
Transdermal yamalar, vücuda bir bilesigin kontrollü dagitiminin saglanmasina yönelik ek avantaja sahiptir. Bu tür dozaj formlari, uygun ortamda bilesigin çözülmesi veya dagitilmasi ile yapilabilir. Absorpsiyonu pekistiriciler ayni zamanda, deri boyunca bilesigin akisini artirmak üzere kullanilabilir. Hiz, bir hiz kontrol etme membrani saglanarak veya bir polimer matriks veya jel içinde bilesik dagitilarak kontrol edilebilir.
Burada açiklanan bilesikler ayni zamanda, Iipozomlar formunda uygulanabilir. Teknikte bilindigi üzere Iipozomlar genel olarak, fosfolipidler veya diger lipid maddelerinden derive edilir. Lipozomlar, bir aköz ortam içinde dagitilan mono veya multi Iamellar hidratlanmis sivi kristaller ile olusturulabilir. Lipozomlari olusturma yetenegine sahip herhangi toksik olmayan, fizyolojik olarak kabul edilebilir ve metabolik süreçte degisebilen lipid kullanilabilir. Lipozom formundaki mevcut bilesimler, burada açiklanan bir bilesige ek olarak, stabilizatörler, koruyucular, eksipiyanlar ve benzerini içerebilir.
Tercih edilen Iipidler, hem dogal hem sentetik fosfolipidler ve fosfatidil kolinlerdir (letisinler). Lipozomlari olusturmak üzere yöntemler teknikte bilinmektedir. Bakiniz, örnegin Prescott (ed.), "Methods in Cell Biology," Volume XIV, Academic Press, New York, 1976, p. 33 et seq. Örnekler Örnek 1: In vitro CRAF direnç mutasyonlarinin tespit edilmesi ve karakterizasyonu RAF inhibitörlerine direnç veren somatik RAF mutasyonlarini tespit etmek üzere, doyurucu rastgele mutagenez ekranlari, C-RAF cDNA'Iari ifade eden XL1-Kirmizi bakteriyel sistem ve retroviral vektörler kullanilarak gerçeklestirilmistir (Emery et al., Id. 2009, Wagle et al., Id. 2011). CRAF mutasyonlarinin ortaya çikan rastgele bir sekilde mutajenize doyurucu cDNA kütüphanesi, RAF inhibitörlerine yüksek derecede yanit verici olan BRAFVÖOOE mutasyonunu barindiran A375 melanom hücrelerinde ifade PLX4720 ( tam inhibitör konsantrasyonlarinin varliginda 4 hafta boyunca kültürlenmistir ve ortaya çikan dirençli klonlar havuzlanmistir ve masif paralel dizileme ile karakterize edilmistir (Emery et al., Id. 2009, Wagle et al., Id.2011). Incelenen bütün C-RAF mutasyonlari (Sekil 1A), A375 hücrelerinde stabil olarak ifade edilebilmistir (Sekil 9A). Ayrica, en çok öne çikan 10 C-RAF mutasyonundan 8'i, p-MEK ve p-ERK seviyeleri ile kanitlandigi üzere, A375'de PLX4720 RAF inhibitörüne biyokimyasal direnç vermistir (Sekil 98). Bu alellerden biri (CRAFG361A), yüksek PLX4720 konsantrasyonlarindaki p-MEK'in önemli "paradoksikal" aktivasyonunu vermistir (Sekil Ekran yoluyla elde edilen CRAF mutasyonlari, CRAF kinaz domeninin (340-618) kristal yapisi üzerinde haritalanmistir (Hatzivassiliou et al., (Sekil 18). Mutasyonlardan üçü, CRAF tam uzunluk yapisinin, günümüze kadar çözülmemis olmasi nedeniyle haritalanmamistir. CRAF direnç alelleri, regülatör bölgenin (N- terminal) disarisinda veya içerisinde ve kinaz domende (C-terminal) olmak üzere iki ayri bölgeye dogru kümelenmistir (Sekil 1C). CRAF. iki 14-3-3 konsensus baglanma bölgesinden olusur ve 8257P ve P261T olmak üzere iki direnç aleli, CR1 bölgesindeki E104K aIeIi haricinde CR2'de 14-3-3 konsensus baglanma bölgelerinden birini isgal etmistir (Sekil 18).
Direnç alellerinin ikinci kategorisi, gliserin bakimindan zengin döngü dahil kinaz domenini kapsar. G356E ve G361A gibi mutasyonlar, ATP-baglama P-döngüsü, GxGxxG deseninden gliserin kalintisinda bulunmustur. P-döngüsü mutasyonlari, Mek aktive edilerek hücresel transformasyon kapasitesine sahip olan (Wan et al., Cell 116: Örnek 2: C-RAF direnç mutasyonlarinin fonksiyonel karakterizasyonu Tespit edilen C-RAF direnç alellerinin fonksiyonel sonuçlarini çalismak üzere, temsilci mutasyonlar (Sekil 1A), A375 melanom hücreleri içine uygulanmistir ve burada ifade edilmistir. Biyokimyasal analiz akabinde Raf inhibitörü, PLX4720, ile tedavi, A375 hücrelerinde ve WT-C-RAF ifade eden hücrelerde 2 uM'Iik bir konsantrasyonda Mek fosforilasyonunu (pMek) ve Erk fosforilasyonunu (pErk) zayiflatmistir (Sekil 2A).
Bununla birlikte, direnç alelleri, ayni (Sekil 2A) konsantrasyonda sürekli pMek ve pErk göstermistir. Ayrica, direnç alelleri, 14-3-3 baglanma bölgesine dogru (8257P ve derin farmakolojik direnç vermistir. Bu mutantlar, WT ( ile karsilastirildiginda 30 (Sekil 2C). Ayrica, C-Raf stabilitesi, 8259 ve 8621 fosforilasyonu ile iliskilendirilmistir kalintilarinin fosforilasyonu ile iliskilendirilmistir (Sekil 1C) (Wellbrock et al., Id. 2004).
PLX4720, bu varyantlarda pMek paradoksikal aktivasyonu ile uyumlu olan özellikle fosforilasyonunu indüklemistir (Sekil 28). MEK/ERK sinyallesmesinin bu C-RAF aktivasyonu, farmakolojik MEK inhibisyonu ile baskilanmistir (Sekil 2G). WT ifade eden hücreler, 8621'de olmamak üzere 8338'de mütevazi bir artis sergilemistir. Aksine, 8259 bölgesi, bazal kosullar altinda fosforile edilmistir ve WT-C-RAF'in ektopik ifadesi, zamanda, direnç mutantlarinda 8259 fosforilasyonunu indüklemistir, ancak karsilastirilabilir bir sekilde bu mutantlar, daha düsük 8259 fosforilasyon seviyeleri sergilemistir (Sekil 2B). ancak bu etki, azalan pErk seviyeleri ile AZD6244 varliginda zayiflatilmistir (Sekil 2E). C-RAF yüksek derecede modüle edildiginden ve fosforilasyon ile aktive edildiginden bu veriler, MAPK sinyallesme çiktisina saglamlik ve sikisiklik muhafaza edilerek çalismada olan bir geri bildirim aktivasyonunun ve inhibisyon döngüsünün bulundugunu önermektedir. Dolayisiyla, C-RAF direnç alellerinin aktivitesi, ile elde edilen fosforilasyon miktari arasinda bir denge ile modüle edilebilir. Sadece bir alel (G361A), MEK inhibisyonuna farmakolojik direncin kanitini vermistir (Sekiller 2F ve Örnek 3: C-RAF direnç mutantlari, B-RAF ile artan iliski sergilemektedir. ve ATP baglanma bölgesini (G361A) kapsayan direnç alellerinin, (Sekil 1C), azaltilmis fosforile MEK ve ERK inhibisyonu nedeniyle direnç verdigini göstermektedir. Ayrica, bir 8259/8621A çift mutantinin tamamen, RAS veya MEK ile etkilesim etkilenmeksizin C- RAF ile 14-3-3 arasindaki etkilesimi kaldirdigi gösterilmistir (Tzivion et al., Nature 394: 88-92, 1998). Altta yatan mekanizmayi arastirmak üzere, ilk görüntüleme esnasinda tespit edilen bütün direnç alellerini ektopik olarak ifade eden 293/T hücrelerinden C- RAF immüno çöktürülmüstür. 14-3-3 ile etkilesimi azaltan ve B-RAF ile etkilesimi artiran mutasyonlar, WT ile karsilastirildiginda daha yüksek bir MEK ve ERK fosforilasyonu statüsünü (Sekil 3A) ve ayni zamanda artan in vitro C-RAF kinaz aktivitesini muhafaza etmistir (veriler gösterilmemistir). Bu sonuçlar, C-RAF alellerini ifade eden A375 hücrelerinde 14-3-3 ve B-RAF etkilesim statüsünü kanitlarla desteklemistir (Sekil SB). Dolayisiyla, bu direnç mutantlari, Ras gibi bir onkojenik sürücü yoklugunda dahi bunun substratina dogru daha yüksek aktiviteye sahiptir (Weber et al., 2001 ). Örnek 4: (S)-metil 1-(4-(3-(5-kloro-2-floro-3-(metiIsülfonamido)feniI)-1-izopropil- 1H-pirazol-4-il)pirimidin-2-ilamino)propan-2-ilkarbamat kullanilarak C-RAF direnç alellerinin biyokimyasal karakterizasyonu.
PLX4720'nin direnç mutantlarina etkisiz baglanmasi olasiligini harici tutmak üzere, A-metil 1-(4-(3-(5-kl0r0-2- flor0-3-(metilsüIfonamido)feniI)-1-izopropIl-1H-pirazoI-4-il)pirimidin-2-ilamin0)propan-2- ilkarbamat'a (Novartis) mutant C-RAF yanitlari (Sekil 3C) incelenmistir. C-RAF direnç 2-fl0r0-3-(metilsülfonamido)fenil)-1-izopropiI-1H-pirazoI-4-iI)pirimidin-2-ilamino)propan- 2-ilkarbamat GI50 degerlerini ve 20 kat ile G361A degerlerini artirmistir (Sekil 3C).
Sekiller 2C ve Elde gözlemlendigi üzere, PLX4720 ve AZD6244'e yanit ayni kalmistir (Sekiller SB ve D). Ayrica, biyokimyasal olarak C-RAF direnç mutantlari, 1 uM'lik izopropiI-1H-pirazoI-4-il)pirimidin-2-ilamino)propan-2-ilkarbamat'a direnç vermistir (Sekil Örnek 5: C-RAF direnç mutantlari, Vemurafenib'e (PLX4032) direnç verir.
Vemurafenib, BRAFVBOOE mutasyonlarina yüksek derecede yanit vericidir, ancak onkojenik Ras ifade eden hücrelerde paradoksikal bir Mek ve Erk aktivasyonuna neden direnç alelleri, C-RAF direnç alellerinin, onkojenik B-RAF varliginda Vemurafenib'e benzer yanit sergileyip sergilemedigini belirlemek üzere test edilmistir. WT-C-RAF (, PLX4720 ile tedavi edilmis WT-C-RAF hücrelerininki ile karsilastirilabilir Glso degerleri göstermistir (Sekil 2C). (3361A ile verilen direnç, WT`den 50 kat daha yüksek olurken, sasirtici bir sekilde 8257P ve P261T, Vemurafenib'e dogru artirilmis bir direnç göstermistir. Bu mutantlar, onkojenik Ras yoklugunda dahi direnç verdiginden, ayrica, Raf inhibitörüne direncin artirilmis bir aktivite nedeniyle olup olmadigi belirlenmistir. Toplam C-RAF, Vemurafenib varliginda ve yoklugunda C-RAF varyantlarini ifade eden A375 hücrelerinin özütlerinden immüno çöktürülmüstür. Farmakolojik inhibisyon esnasinda yüksek direnç gösteren mutasyonlar (8257P ve P261T) (Sekil 5A), WT ile karsilastirildiginda in vitro artirilmis kinaz aktivitesine sahip olmustur (Sekil 58); bununla birlikte G361A direnç mutanti, ilaç varliginda hatta daha yüksek kinaz aktivitesi göstermistir (Sekil SB). Ayrica, C-RAF direnç alellerinin, PLX4720 ve AZD6244 ile kombinasyonal tedaviye duyarli kaldigi gösterilmektedir (Sekiller 5C, D ve E).
Birlikte, bu veriler, safece bir optimum Erk sinyallesmesi miktarinin, direnç vermek üzere hücrelere yönelik olarak gerekli oldugu kavrami ile tutarlidir. Örnek 6: C-RAF direnç alelleri, paradoksikal C-RAF aktivasyonunu ve pekistirilmis dimerizasyonu saglar.
RAF inhibitörleri ile indüklenen paradoksikal MEK/ERK aktivasyonu, RAF proteinlerinin dimerizasyonunu içerir (Hatzivassiliou et al., 2010; Poulikakos et al., 2010). Ayrica, pekistirilmis dimerizasyon gösteren tepesi kesik bir BRAFVSOOE formu, RAF inhibitörlerine direnç verir (Poulikakos et al., 2011). C-RAF direnç mutantlarinin, artirilmis dimerizasyon yoluyla dirence aracilik yapip yapmadigini belirlemek üzere, ko- transfeksiyonlar, birkaç temsilci C-RAF direnç alelinin farkli açilardan iki ayri epitop (His/V5 veya Bayrak) ile etiketlendigi ifade yapilari kullanilarak 293/T hücrelerinde gerçeklestirilmistir. Immüno çöktürme reaksiyonlari, Ni2+ boncuklari (His-etiketli proteini yakalamak üzere) kullanilarak, akabinde anti-Bayrak antikoru kullanilarak immüno blotlama ile gerçeklestirilmistir. Bu deneylerde, RAF inhibitörlerine farmakolojik direnç E478K;) ile karsilastirildiginda artirilmis homodimerizasyon sergilemistir. Beklendigi üzere, artirilmis dimerizasyon genel olarak artirilmis p-MEK seviyeleri ile iliskilenmistir (Sekil 6A, giris Iizati). Benzer sonuçlar, MEK/ERK aktivasyonunun büyüklügünün niceliksel olarak indirgenmis görünmesine (Sekil 10A, giris Iizati) ragmen, His/V5- etiketli C-RAF mutantlari Bayrak-etiketli dogal sus C-RAF ile ko-transfekte edildiginde (Sekil 10A) gözlemlenmistir. PLX4720 ve vemurafenib'e en büyük farmakolojik direnci veren üç C-RAF mutanti ( ayrica, artirilmis toplam protein birikiminin kanidini göstermistir (Sekil 6A, giris Iizati). Dolayisiyla, C- RAF mutasyonlarina baglanan direnç fenotipi, güçlü bir sekilde RAF dimerizasyonu ile iliskilenmistir. mutasyonlarinin varligi ile ortaya çikan artirilmis C-RAF dimerizasyonu devam ettirilmistir, ancak RAF inhibitörüne transfekte hücrelerin tabi tutulmasi üzerine daha fazla pekistirilmemistir (vemurafenib; Sekil GB). Bununla birlikte, hem C-RAF aktivasyonu (8338 fosforilasyonu ile kanitlanmistir) hem asagi MEK/ERK sinyallesmesi, güçlü bir sekilde RAF inhibitörü ile indüklenmistir (Sekil 68, giris Iizati).
Intrinsik C-RAF kinaz aktivitesi üzerinde bu direnç mutasyonlarinin etkilerini belirlemek zere, in vitro kinaz reaksiyonlari, RAF inhibitörünün varliginda veya yoklugunda kültürlenen 293T hücrelerinden gerçeklestirilmistir. Ilaç yoklugunda, sabit durumdaki C- RAF kinaz aktivitesi (p-MEK), çogu durumda direnç mutasyonlari ile ölçülebilir bir sekilde artirilmamistir (Sekil GC). CRAFG351A, buna bir istisna olmustur; burada, karsilik gelen bütün hücre lizatlarinda dayanikli intrinsik p-MEK seviyeleri ile iliskilendirilen mütevazi sabit durumdaki kinaz aktivitesi saptanmistir (Sekil 60). Aksine, in vitro kinaz analizlari öncesinde 2 uM vemurafenib ile 293T hücrelerinin muamele edilmesi, incelenen bütün direnç alellerinde C-RAF kinaz aktivitesinin isaretlenmis bir yukari regülasyonu ile sonuçlanmistir (Sekil 60). BRAFVSOOE melanom hücrelerinde (A375) benzer deneyler, incelenen en önemli üç potent C-RAF direnç mutantindaki intrinsik kinaz aktivitesi ayrica, 293T hücrelerinde gözlemlendigi üzere, vemurafenib'e bu hücrelerin tabi tutulmasi üzerine artirilmistir (Sekil 6D). Birlikte, bu sonuçlar, potent C- RAF direnç mutantlariin, hem RAF dimerizasyonunu hem RAF inhibitörü aracili C-RAF kinaz aktivitesini pekistirdigini önermistir. Örnek 7: C-RAF direnç mutantlari, düsük 14-3-3 baglanmasi ve artirilmis B-RAF homodimerizasyonu sergilemektedir.
Yukaridaki kümülatif veriler, bunun 14-3-3 konsensus baglanma bölgesini (S257P ve P kapsayan C-RAF mutasyonlarinin, RAF inhibitörleri ile tedavi üzerine RAF inhibisyonuna farmakolojik ve biyokimyasal direnç, pekistirilmis RAF dimerizasyonu ve artirilmis C-RAF kinaz aktivitesi verdiligi önermistir. RAF dimerizasyonu ile ilgili olarak 14-3-3 protein baglanmasinin rolünü arastirmak üzere, immüno çkötürme deneyleri, ektopik olarak C- RAF direnç alelerini ifade etmek üzere tasarlanan hücrelerden gerçeklestirilmistir. 14-3- 3 baglanmasi ve B-RAF heterodimerizasyonu üzerinde farmakolojik RAF inhibisyonunun etkilerini arastirmak üzere bu deneylet, RAF inhibisyonunun (bu durumda vemurafenib) hem varliginda hem yoklugunda yürütülmüstür. RAF düsük etkilesimler ve hem 293T hücrelerinde (Sekil 7A) hem özel olarak, A B-RAF ile artirilmis etkilesimler gösterme egiliminde olmustur. 293T hücrelerinde, C-RAF mutasyonlari ile tetiklenen pekistirilmis C-RAF/B-RAF homodimerizasyonu, C-RAF protein stabilizasyonu ve dayanikli MEK/ERK fosforilasyonu ile iliskilenmistir (Sekil 7A). Diger taraftan, BRAFVBOOE melanom hücrelerinde gözlemlenen dayanikli MEK/ERK aktivasyonu, sadece marjinal olarak C-RAF direnç mutasyonlari ile pekistirilmistir (Sekil 78); bu sonucun, bu hücrelerde konstitütif B-RAF sinyallesmesini vermesi beklenmistir. Ilginç bir sekilde, C- RAF mutantlarindan biri (G356E), her iki hücresel baglamda oldukça düsük 14-3-3g baglanmasi sergilemistir (Sekil 7A ve 78); bununla birlikte, C-RAFG356E, sabit durum kosullari altinda hiçbir MEK/ERK sinyallesmesi ve B-RAF heterodimerizasyonunda hiçbir zenginlesme göstermemistir. Bu sonuçlar, 14-3-3 baglanmasinin, pekistirilmis mutant C-RAF dimerizasyonunu destekleyebilirken, 14-3-3 baglanmasinin bir derecesine (muhtemelen C-terminal domen içerisinde), maksimum RAF'a bagimli sinyallesmeyi desteklemek üzere ihtiyaç duyuldugunu önermektedir.
Beklendigi üzere, RAF inhibitörü vemurafenib, ektopik olarak dogal sus C-RAF ifade eden 293/T hücrelerinde B-RAF/C-RAF heterodimerizasyonunu indüklemistir (Sekil 7A), ancak A375 melanom hücrelerinde bu heterodimerizasyonu kaldirmistir (Sekil 78).
Aksine, en dayanikli C-RAF direnç mutantlarinin ektopik ifadesi, A375 hücrelerinde ilaç varliginda dahi sürekli B-RAF heterodimerizasyonunu saglamistir (Sekil 78). Bu sonuçlar, BRAFVGÜOE'in, direnç ile iliskilendirilen C-RAF varyantlari ile heterodimerizasyonu destekleyen dominant bir yapi varsaydigini önermektedir.
Farmakolojik RAF inhibitörü, hücresel genetik baglama bagli olarak 14-3-3/C-RAF etkilesimi üzerinde degisken etkilere sahip olmustur. A, vemurafenib, dogal sus C-RAF'ye 14-3-3( baglanmasini mütevazilikla azaltmistir, sahip olmamistir (Sekil TB). Diger taraftan vemurafenib, 293/T hücrelerinde bu 14-3- 3/C-RAF etkilesimlerini pekistirmistir (Sekil 7A). Bu bulgular, BRAFVGOOE baglaminda bu C-RAF mutantlari tarafindan verilen direnç fenotipinin, azaltilmis 14-3-3/C-RAF etkilesimleri ile iliskilendirilen, pekistirilmis RAF dimerizasyonunu içerdigi öncülüne destek vermistir. Örnek 8: C-RAF direnç mutantlari tarafindan pekistirilmis MEK/ERK sinyallesmesi, dimerizasyon gerektirmektedir.
C-RAF dimerizasyonunun, C-RAF direnç mutantlari tarafindan verilen pekistirilmis MEK/ERK sinyallesmesine yönelik gerekli olup olmadigini test etmek üzere, bir arjinin- histidin mutasyonu, R. Bu mutantin, daha önce C-RAF homodimerizasyonunu bozdugu gösterilmistir uygulanmistir. Beklendigi üzere, C-RAF çift mutantlari, pekistirilmis MEK/ERK sinyallesmesini büyük ölçüde gerçeklestiremez hale getirilmistir (Sekil 8A). Daha sonra, ko-transfeksiyonlar, diferansiyel olarak epitop-etiketli C-RAF direnç/R401H çift mutantlari kullanilarak gerçeklestirilmistir. Daha önce açiklandigi üzere, C-RAF direnç alelleri, RAF inhibitörü ile etkilenmemis bir sekilde C-RAF homodimerizasyonunu artirmistir (Sekil 88). Aksine, R401H alelinin uygulanmasi, C-RAF homodimerizasyonunu baskilamistir ve incelenen çogu C-RAF mutant baglamda MEK/ERK sinyallesmesini kaldirmistir. Buna istisna, dimerizasyonu yetersiz çift mutant ile birlikte ifade edildiginde dahi, vemurafenibe tabi tutma ile daha fazla indüklenmis olan konstitütif (yine de önemli derecede azaltilmis) MEK/ERK aktivasyonu sergilemis olan C-RAFG361A aleli olmustur. Yukaridaki in vitro kinaz aktivitesi sonuçlari ile birlikte bu veriler, C-RAFG3'51A/R401H alelinin ayni zamanda, artirilmis intrinsik kinaz aktivitesi içerebildigini önermektedir. Toplamda bu sonuçlar, C-RAF direnç mutantlari tarafindan verilen pekistirilmis MEK/ERK sinyallesmesinin RAF dimerizasyonunu gerektirdigine dair direkt kanit saglamaktadir. Bunlar ayni zamanda, RAF dimerizasyon ara yüzünü bozan alosterik RAF inhibitörlerinin daha fazla gelisimine yönelik bir temel saglayabilir.
Yöntemler Hücre Kültürü kültürlenmistir ve %5 C02 içeren nemlendirilmis bir atmosferde %10 fetal bovin serumu ile takviye edilen Dulbecco's modifiye Eagle ortaminda 37°C muhafaza edilmistir.
C-RAF Rastgele Mutagenez Görüntüleme C-RAF cDNA, rekombinasyonal klonlama (lnvitrogen) yoluyla pWZL-Blast vektörü içine klonlanmistir (J. Boehm ve W. C. Hahn'in bagisi). Spesifik mutasyonlar, QuickChange ll Bölgeye Yönelik Mutagenez (Stratagene) kullanilarak c-raf cDNA içine uygulanmistir.
Rastgele mutagenez, varolan protokole dayali olarak yapilir (Emery et al., Id. 2009).
Mutajenize C-RAF plazmidi, A375 melanom hücrelerini enfekte etmek üzere kullanilmistir. Blasticidin ile seçimi takiben, hücreler, 15-cm tabaklar üzerinde plakalanmistir ve dirençli klonlar ortaya çikana kadar 4 hafta boyunca PLX4720 RAF inhibitörü ( varliginda kültürlenmistir. c-RAF DNA Dizilemesi Rastgele mutagenez ekranlarindan ortaya çikan PLX4720'ye dirençli hücreler havuzlanmistir ve genomik DNA hazirlanmistir (Qiagen DNeasy). C-RAF cDNA, 5' ve 3' uçlarda komsu vektör dizisine spesifik primerler kullanilarak genomik DNA'dan amplifiye edilmistir ve varolan protokoller kullanilarak Sanger yöntemi ile dizilenmistir.
Masif Olarak Paralel Dizileme Analizi Masif olarak paralel dizileme seritlerinden ham veriler (Illumina; serit basina 2-3 milyon 36-baz-çifti dizisi), bir “yeni nesil" dizileme analizi hatti kullanilarak analiz edilmistir (Emery et al., PNAS, 2009). Baz kalite ölçümü basina, nükleotit dizisini temsil eden veri dosyalarindan çikti, saptanan varyantlar ve cDNA referans dizisine hizalandirma (ELAND algoritmasi ile hizalandirma ile belirlendigi üzere), her denemeye yönelik olarak entegre edilmistir ve isleme tabi tutulmustur. Içerik (yani cDNA referansin her bazi dahil fragmanlarin sayisi), bütün bazlara yönelik olarak belirlenmistir ve varyant aleller, referans dizi üzerine ayri DNA fragmanlarindan haritalanmistir. Her dogal sus olmayan alele yönelik varyasyonun frekansi belirlenmistir ve ortalama bir varyant skoru (AVS), söz konusu pozisyon ve varyant aleline yönelik bütün kalite skorlarinin ortalamasi olarak hesaplanmistir. Bütün kodlama mutasyonlari, amino asit varyasyonunu (bulunmasi halinde) belirlemek üzere çevrilmistir ve yüksek frekans (>%O.5) ve yüksek kalite (AVS > 7) mutasyonlarina yönelik veriler, CCGD sonuçlari veri tabani içine yüklenmistir.
Retroviral Enfeksiyonlar Phoenix hücreleri (%70 birlesen), Fugene 6 (Roche) kullanilarak mutantlar veya pWZLBlast-C-RAF ile transfekte edilmistir. Virüs içeren üst fazlar, bir 0.45-um siringa içinden geçirilmistir. A375 hücreleri, polibren (4 ug/mL, Sigma) ile birlikte virüs ile 16 saat boyunca enfekte edilmistir. Selektif markör blastisidin (3 ug/mL), enfeksiyon Western Blot Analizi Numuneler, iki sefer PBS ile yikandiktan ve %1 NP-4O varliginda 150 mM NaCI, 50 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, PMSF, Sodyum Florid, Sodyum Ortovanadat ve proteaz inhibitör kokteyli ile çözüldükten sonra özütlenmistir. Protein içerigi, üreticinin talimatlarina göre protein analizi reaktifi (Bio-Rad) ile tahmin edilmistir. Bütün hücre bununla ayrilmistir. Proteinler, bir Trans-Blot aparatinda poliviniliden diflorid membranlarina aktarilmistir. Membranlar, oda sicakliginda 1 saat boyunca veya 4°C`de bir gece %0.1 Tween 20 içeren TBS içinde %5 yagsiz süt ile bloklanmistir.
Membranlar akabinde, oda sicakliginda 1 saat boyunca veya 4°C”de bir gece söz konusu proteine karsi yükseltilen monoklonal veya poliklonal antikor ile inkübe edilmistir, bunu %01 Tween 20 içeren TBS ile üç yikama takip etmistir. C-RAF, (Cell Signaling), B-RAF (Santa Cruz Biotechnology) ve aktin (Sigma) primer antikorlarinin immünoreaktivitesi, yabanturpu peroksidaz ile konjuge edilen bir sekonder anti-tavsan (BD Transduction Laboratories) veya anti-fare (Santa Cruz Biotechnology) antikorlari ve ECL Plus (Amersham Biosciences) ve X-OMAR TAR filmleri üzerinde otoradyografi ile sonraki gelistirme ile görsellestirilmistir. Bantlar taranmistir ve Quantity One yazilimi kullanilarak Gel Doc sistemi ile miktari belirlenmistir.
Immünoçöktürme C-RAF antikoru (BD Biosciences) ile immünoçöktürmeye yönelik olarak protein G- Sefaroz sulu karisimi (Thermo Scientific), 1x PBS ile yikanmistir ve 4°'deC 1 saat boyunca C-RAF antikoru (BD Biosciences) veya normal fare IgG (kontrol) ile inkübe edilmistir. Lizis tamponu ile üç yikama sonrasinda boncuklar, 2 saat boyunca bütün hücre lizatlari (0.5 mg toplam protein) inkübe edilmistir ve akabinde Iizis tamponu ile üç sefer yikanmistir. Proteinler akabinde, 1 x SÜS-numune tamponu içinde kaynatilarak ayristirilmistir.
C-RAF Kinaz Analizi 293T hücreleri (%70 birlesen), C-RAF-WT ve C-RAF varyant alellerini içeren C- terminale dogru His veya V5 etiketine sahip 6 ug pc-DNA ile transfekte edilmistir.
Hücreler, transfeksiyon sonrasi 1 saat ve 48 saat vemurafenib (Allele Biotech) ile muamele edilmistir, Iizatlar genel protokol ile özütlenmistir. Kobalt boncuklar kullanilarak immünoçöktürme, 4°C”de 1 saat boyunca bir gece gerçeklestirilmistir.
Proteine bagli kobalt boncuklar, 30°C'de 30 dakika boyunca 20 pL ATP/magnezyum mM DTT, 75mM MgCl2 ve , 20 uL seyreltme tamponu (20 mM Mops, pH pg inaktif MEK (Milliporeiden elde edilmistir) ile inkübe edilmistir. Fosforile MEK ürünü, bir p-MEK antikoru (Hücre Sinyallesme Teknolojisi) kullanilarak immünoboyama yoluyla saptanmistir ve ilgili p-MEK sinyallerinin, yogunluk ölçümü kullanilarak miktari belirlenmistir, giris C-RAF miktarina normalize edilmistir ve bir referans olarak C-RAF- WT ile karsilastirilmistir.
C-RAF Kinaz Analizi (A375) WT ve mutant C-RAF alelleri ile enfekte edilen A375 hücreleri, 16 saat boyunca PLX varliginda ve yoklugunda kültürlenmistir. Lizatlar, %1 NP-40 varliginda 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, PMSF, Sodyum Florid, Sodyum Ortovanadat ve proteaz inhibitör kokteyli ile hazirlanmistir. C-RAF antikoru ile immünoçöktürme bir gece gerçeklestirilmistir ve bagli boncuklar, Iizis tamponu ile üç sefer yikanmistir, bunu, kinaz tamponu (1x) takip etmistir. Boncuklar, 30°C'de 30 dakika boyunca 20 ul ATP/Magnezyum karisimi (Millipore) ve 0.5 ug inaktif MEK (Millipore) ile inkübe edilmistir. Fosforile substrat MEK, immünoblotlama ile saptanmistir.
Farmakolojik Büyüme inhibisyonu Analizleri Kültürlenmis hücreler, A375 dahil bütün melanom kisa süreli kültürlere yönelik olarak göz basina 3,000 hücrelik bir yogunlukta 96 gözlü plakalar içine tohumlanmistir. 16 saat sonra, bilesigin ardisik seyretilmeleri, DMSO Içinde gerçeklestirilmistir ve DMSO son hacminin %1'i geçmemesi saglanarak, ilaç potensine bagli olarak ilaç konsantrasyonlarini elde etmek üzere hücrelere aktarilmistir. PLX4720 (Symansis'ten satin alinmistir, PLX, AZD6244 (Selleck Chemicalstan satin alinmistir) ve GSK B-RAF inhibitörü. Ilacin eklenmesini takiben hücre viyabilitesi, 4 gün sonra Cell-Titer-96 aköz radyoaktif olmayan proliferasyon analizi (Promega) kullanilarak ölçülmüstür.
Viyabilite, geri plan çikarimi sonrasinda kontrolün (muamele edilmemis hücreler) bir yüzdesi olarak hesaplanmistir. Minimum alti kopya, her hücreye yönelik olarak yapilmistir ve bütün deney, en az üç sefer tekrarlanmistir. Farmakolojik büyüme inhibisyonu analizinden veriler, kivrimli bir doz yaniti saglanan ile dogrusal olmayan bir gerileme egrisi kullanilarak modellenmistir. Bu egriler, Windows'a yönelik (GraphPad) GraphPad Prism 5 kullanilarak gösterilmistir. GI50 degerleri, %50 noktaya komsu olan veri noktalarini baglayan hattin egimi belirlenerek hesaplanmistir.
DIZI LISTESI <110> Emery, Caroline Antony, Rajee Garraway, Levi A. <120> RAF INHIBITÖRLERINE DIRENÇ VEREN C-RAF MUTANTLARI <160> 2 <170> Patentln versiyon 3.5 <210> 1 <211> 3216 <212> DNA <213>Insan <400> 1 tcgcagncgc (taggmgcc aîclîaqaîg ;cçggagîaa ;ama ama; af“.ntgagqc ISO ggcgiglgc: Big-aggcgcg 9390929!!! güacgeîgc gggggclg:: cg-;ggciscg mc tg-:aaizcaga gtgcîgtgca gîgîtcagai: lîclccacça agaçaaaggt aaaaaagcac 560 gcllagatlg gaataciçai gclg-:gîcll 193119939:: açaadtcaa gtagcmcc ?ZC 1ggalcergi !Cizsucaca acacacaaizi Mgclcggaa ga :gti-:clg aag-:îqizm 79.3 îizîçîiJaca'. cxg1cagaaa #magaza a'ggamzi; atgrwgacr tgrggmaca 840 sanicatga gceugisgc acceaagtac cia-:isigig tgtggaclçg agiaacatca EGO-J gacaadcll englitcca :aMa-:ada :igglgalag lgçagtccca gcaclacctl 9050 îci-:ciagag gizaigagglcg acaiccacai: ::sargi-:ca «:atggtcagi: accacciztg: 1 ML tglccaiilcg gatigggtca ggcictmg ;saclgîlta Bagggtaaa tgçcacggag 1440 atgngciag! &saçiniza aaggttgtizg 393193034::: agagiiaatîi: caggiicnsia 'iüCIS acmgariaaa aga-maçina amangîga iciciiaigîq-;ng ogagmqcagc agzxtctaça 1620 aacacctgca tglccaggag aûcaagmc agatgtîoza gmaangac atti; :cwgç 1650 agaoggcîca gggaatçgac :atitgoaig caaagaeca'. iiatiiiaîaga gacaîgeaa! TMO ggatggccc; agai; ;tgafc cgaaîgcagg als arsa-:in: aftcagîrc ::agîciggaîg S42' aagtaeieigiga aris-;iagnc-:t cntltixc: asamasini "uzatigag cmmcizwc 216:' <210>2 <211> 648 <212> PRT <213>Insan <400> 2 Met Glu His Ile Gln Gly Ala Trp Lys Thr Ile Ser Asn Gly Phe Gly 1 5 10 15 Phe Lys Asp Ala Val Phe Asp Gly Ser Ser Cys lle Ser Pro Thr Ile 41) 4-4; 1'irßsp Pro ::e-i Lys [hr Se( &sn Ihr iir: Arg vai whe Leu Piû As“.
SC 55 EU Ly'S Gln -'-.r;i 'h' 'dal 'dal ksn "a'al A'q Asn 'Stv ru'nt Sor Lci.. His #asp 55 ?0 75 BC Cys -eu Met Lys Ala Lei. L','s 'dal ârg 'IZ-l', Le.: C. r Pr:: GIU :::ya Cy's 85 ?:0 ?45 Ala Va! F'he Arg Lcu -eu His Gm His -rs GI',' Lys Lvs Ala »:79 -CJ Asp Iip »25" Ihr A5; A1:: Ala Ser Leu Ile Gly Glu Glu Leu G ri ":3 115 îP-II 1.35 Aßp :'ie -eu Asp HIS Val Pro Ltu Thr Thr 'MS "isn Phe :ala 3-3; U& 13 i 135. Mr.: T~ir :rc ch _ya Lcu :ala Phi: Cys .asp lic (335 ::iln Lys Phc eru Lcu Asr G ',- Ph:- Mg :ya GM Thr :ya GI) Tyr _~,-s ”we ~1isGIu H 9 Cys 1935 1.70 17 Ser Twr _ys 'u'a Ph: Thr'-;19'.Çg,is 'v'al &sp Trp Ser :sr- Ile A'g Gln 150 15'& 190 1 "95 203 ?'35 Lcu Pm .Sur Lou Thr Mut Ari; Arg N01 Aig Slu Sur 'dal Sor Ar; Me! Pro'c Ser Ever Gm His Aw; Ty' Si:- Thr Przi -1 s &Ja :re Tnr Phe A5" Th( Ser Se 260 265 27 A3:) Se A çML-I le Slu Asp Ala Ile mg Ser r-s Ser Glu Ser #ala 275› 280 285 Ser Pro Banka Leu &r Ser Se' `'-`r:i Asn 90.5' Leu. Ee' Pri: Trr Oy T':: Se: Gir` PIC: 1 ya "Y D'cîi 'ml Pm- .I\l.1 Gln hpg G'lu Im; i'xléi Pm 325 BSB 335 Asp 'r 5;' Ty' Tyr "p C:: J le ::lu Ala Ser i::: .i 'ual Me' 29,. `Sa' 340 345 350 T"i' Arg it 3 y Sar Gly' Str' Pr& Gl'; Th' 'mi "gr l ys GTI/13'!. 'tp 8... 8.... 3.70 .3.75 380 lii Lîlri Fhi- -Sln M:: ah!' .n :; »ven Glu 'Jul "ula `.i'al l nu .'ig ya& Thr ArgHis Kv'alf-srilla _GJ _9. 3'16ß.'18tI1I-,'T.'r`iiat TP' L,5A_ ÇP- sn 405 41L. 415 Leu J-,Ia Hc 'ixal Thr G ri Trp (Zi-y:: ':3 i_. Gly Scr ?Sor _cu *';r Lv; «is 425 430 Leu H 5 *Jal Gln .'_Hu rhr' Lys Phe üln `.hi-l Pne Sin Leu II:- P›p ile Ala ârçi Çin T'" Ala Cin ::ily ne! Asp T','r Leu His i*- a LyS .âsn le 45:- 455 &SD T'i' "sal Lys Ilr: City A3:) :H: 13,' Lou Ala 450 455 Ser GI', Ser Gir` Gm "ISI Glu Gln Piü 'Fr' '3 j.' SEI '.":i| Leu Trp Me! Ala F'ri'i Giu 'mi Ile fan; Me! Glii "iso Asu .Rs-i :ro Pr-e Sir 31"& Sir Sor Asp 've Tyr :Scr Tyr '3 -; Ilc 'v'al Leu 535 54':) Glii I nu Pin Tyi cm.! Hix Ir. fari Asli i'm; i'm:) G " IIi-. Ir: Phrs MH uai Gly Ar; Gly 'yr .-= 9 Ser PrCi Asp Leu er Lys Leu 'yr Lys .Asu 565 570 Ct::: 37:- I 3-" A 3 Nm I ip; Ari; l 0 530 585 var :da lwp (';ya' 'u'al I ip; I yâ "Jul LyS Ulu ;siu .::mg Pm Leu “ne Pro I;Sin le Leu ':;er Ser Ile Giu Leu 595 607.1 @35 610 615 620 Leu His Arg Ala Ala His Thr Glu Asp He Asn Ala Cys Thr Leu Thr Thr Ser Pro Arg Leu Pro Val Phe CRAF CDNA nüKIeIK asit poa'sy-onu mp: P döngüsü Aktivasyon imam& (3:35 mg:is2mm GR 2; .

Claims (1)

  1. ISTEMLER C-RAF aktivitesine sahip olan bir mutant C-RAF polipeptidi kodlayan bir nükleik asit molekülü veya C-RAF aktivitesine sahip olan bir mutant C-RAF polipeptidi olup, özelligi söz konusu mutant C-RAF polipeptidinin, SEQ. ID. No:2 içeren bir dogal sus C- RAF polipeptidi ile karsilastirildiginda 257S>P, 261P>T, 361G>A ve 478E>K'den olusan gruptan seçilen en az bir amino asit sübstitüsyonunu içermesidir, bu en az bir amino asit sübstitüsyonu, mutant C-RAF polipeptidi ifade eden bir hücre üzerindeki bir veya daha fazla RAF inhibitörüne direnç verir, RAF inhibitörü PLX-metil 1-(4-(3-(5-kl0ro-2-fl0ro-3- (metiIsülfonamido)fenil)-1-izopropiI-1H-pirazoI-4-il)pirimidin-2-ilamin0)pr0pan-2- ilkarbamatltan seçilir. Istem 1'in nükleik asidini içeren bir ifade vektörüdür. Istem 2'nin ifade vektörünü içeren bir konak hücredir. Istem 1'de tanimlanan bir mutant C-RAF polipeptidine spesifik olarak baglanan bir antikor preparatidir. Bir RAF ihbitörüne dirence sahip olan kansere sahip bir öznenin tanimlanmasina yönelik bir yöntem olup, özelligi yöntemin asagidaki adimlari içermesidir: (a) hastadan elde edilen bir kanserin hücrelerinden nükleik asidin özütlenmesi; (b) bir C-RAF polipeptidini kodlayan bir nükleik asit molekülünün en az bir kisminin analiz edilmesi, burada Istem 1'de tanimlandigi üzere bir veya daha fazla C-RAF sübstitüsyonunun varligi, öznenin bir RAF inhibitörüne dirence sahip oldugunu belirtir. Istem 5'e göre tanimlanan yöntem olup, özelligi Istem 1'de tanimlandigi üzere bir veya daha fazla C-RAF sübstitüsyonunun varliginin, öznenin bir RAF inhibitörü ve bir ikinci inhibitör ile tedavi edilmesine yönelik bir ihtiyaci belirtmesidir. Istem 6'ya göre tanimlanan yöntem olup, özelligi ikinci inhibitörün bir MEK inhibitörü olmasidir. Istem Tye göre tanimlanan yöntem olup, özelligi MEK inhibitörünün, CI- Metoksi-7-(3-morfolin-4-iI-propoksi)-4-(4-fenoksi-feniIamin0)-kinolin-3-karbonitril ve 4-[3-KIoro-4-(1-metiI-1H-imidazoI-2-ilsüIfaniI)-fenilamino]-6-metoksi-7-(3- morfolin-4-iI-propoksi)-kinolin-3-karbonitril'den olusan gruptan seçilmesidir. Istem 7 veya Istem 8'e göre tanimlanan yöntem olup, özelligi RAF inhibitörünün, pirazoI-4-il)pirimidin-2-ilamino)propan-2-iIkarbamat'tan olusan gruptan seçilmesidir. Istemler 6-9'dan herhangi birine göre tanimlanan yöntem olup, özelligi kanserin, melanom, meme kanseri, kolorektal kanserler, gliyoma, akciger kanseri, over kanseri, sarkoma ve tiroit kanserinden olusan gruptan seçilir ve/veya bir RAF'a bagli kanser olmasidir. Istemler 6-10”dan herhangi birine göre tanimlanan yöntem olup, özelligi öznenin, B-RAF'de bir mutasyon, tercihen bir B-RAFVBOOE mutasyonu içeren kanser hücrelerine sahip olmasidir. .Istemler 6-11'den herhangi birine göre tanimlanan yöntem olup, özelligi nükleik asidin analiz edilmesinin, nükleik asidin dizilenmesini içermesidir.
TR2018/08010T 2012-03-28 2013-03-07 RAF inhibitörlerine direnç veren C-RAF mutantları. TR201808010T4 (tr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261616999P 2012-03-28 2012-03-28
US201261708372P 2012-10-01 2012-10-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201808010T4 true TR201808010T4 (tr) 2018-06-21

Family

ID=47892065

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/08010T TR201808010T4 (tr) 2012-03-28 2013-03-07 RAF inhibitörlerine direnç veren C-RAF mutantları.

Country Status (15)

Country Link
US (5) US9629839B2 (tr)
EP (3) EP2831589B1 (tr)
JP (3) JP6348898B2 (tr)
KR (1) KR20140139510A (tr)
CN (1) CN104204806B (tr)
AU (1) AU2013240483B2 (tr)
BR (1) BR112014023496A2 (tr)
CA (1) CA2864169A1 (tr)
EA (1) EA028135B1 (tr)
ES (3) ES2908078T3 (tr)
MX (1) MX351945B (tr)
PL (1) PL2831589T3 (tr)
PT (1) PT2831589T (tr)
TR (1) TR201808010T4 (tr)
WO (1) WO2013148100A1 (tr)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2019008458A (es) 2017-01-17 2019-12-02 Heparegenix Gmbh Inhibidores de proteina cinasa para promover la regeneracion hepatica o reducir o prevenir la muerte de hepatocitos.
KR102537840B1 (ko) 2018-07-13 2023-05-31 삼성전자 주식회사 서버 장치 및 다른 장치들의 위치 정보를 수집하는 방법
WO2020163771A1 (en) * 2019-02-08 2020-08-13 Portage Glasgow Limited Structure, manufacturing and uses of hoxd12-pde8a cell-penetrating peptides
US20230183810A1 (en) * 2020-05-04 2023-06-15 Dna-Seq, Inc. Methods and systems for determination of an effective therapeutic regimen and drug discovery

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5618670A (en) * 1988-08-26 1997-04-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Detection method for c-raf-1 genes
WO2005009367A2 (en) 2003-07-17 2005-02-03 Ambit Biosciences Corporation Treatment of diseases with kinase inhibitors
US20070105114A1 (en) 2003-07-29 2007-05-10 Martha Li Biomarkers of cyclin-dependent kinase modulation
CN101516376A (zh) * 2006-09-18 2009-08-26 贝林格尔.英格海姆国际有限公司 用于治疗携带egfr突变的癌症的方法
MX2009002710A (es) 2006-09-18 2009-03-25 Boehringer Ingelheim Int Metodos para tratar canceres que portan mutaciones de egfr.
EP2102362B1 (en) 2006-11-16 2012-07-04 Mount Sinai School of Medicine of New York University Compositions and methods for detecting noonan syndrome
EP2370568B1 (en) 2008-12-10 2017-07-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Mek mutations conferring resistance to mek inhibitors
JO3002B1 (ar) 2009-08-28 2016-09-05 Irm Llc مركبات و تركيبات كمثبطات كيناز بروتين
CA2791247C (en) * 2010-03-09 2019-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods of diagnosing and treating cancer in patients having or developing resistance to a first cancer therapy

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140139510A (ko) 2014-12-05
AU2013240483B2 (en) 2018-07-26
PT2831589T (pt) 2018-06-20
JP2015513901A (ja) 2015-05-18
ES2673070T3 (es) 2018-06-19
EA201491780A1 (ru) 2015-01-30
EP3693741B1 (en) 2022-01-05
ES2908078T3 (es) 2022-04-27
EP3333575A1 (en) 2018-06-13
US11788151B2 (en) 2023-10-17
US20210388325A1 (en) 2021-12-16
JP2018110594A (ja) 2018-07-19
WO2013148100A1 (en) 2013-10-03
US9629839B2 (en) 2017-04-25
CN104204806A (zh) 2014-12-10
MX351945B (es) 2017-11-03
EP3693741A1 (en) 2020-08-12
US20240093310A1 (en) 2024-03-21
PL2831589T3 (pl) 2018-10-31
BR112014023496A2 (pt) 2017-07-18
JP2020103291A (ja) 2020-07-09
AU2013240483A1 (en) 2014-08-28
ES2790896T3 (es) 2020-10-29
CA2864169A1 (en) 2013-10-03
US20150133478A1 (en) 2015-05-14
EP2831589B1 (en) 2018-04-18
EP2831589A1 (en) 2015-02-04
JP6661685B2 (ja) 2020-03-11
US20190142830A1 (en) 2019-05-16
EP3333575B1 (en) 2020-02-26
US20170204383A1 (en) 2017-07-20
MX2014011686A (es) 2015-06-04
CN104204806B (zh) 2016-02-03
JP6348898B2 (ja) 2018-06-27
EA028135B1 (ru) 2017-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2714875T3 (es) Métodos de diagnóstico y tratamiento del cáncer en pacientes que presentan o desarrollan resistencia a una primera terapia del cáncer
US11788151B2 (en) C-RAF mutants that confer resistance to RAF inhibitors
CN112972492A (zh) Nk细胞中对细胞因子诱导的sh2蛋白的抑制
US20110230545A1 (en) Eml4-alk fusion gene
US20150346204A1 (en) MEK Mutations Conferring Resistance to MEK Inhibitors
JPWO2007026969A1 (ja) 創薬標的タンパク質及び標的遺伝子、並びにスクリーニング方法
US11186874B2 (en) ERK1 and ERK2 mutations that confer resistance to MAPK pathway inhibitors
US7297525B2 (en) Composition employing a novel human kinase
KR101462329B1 (ko) 디스코이딘 도메인 리셉터 2의 ｊｍ2 도메인의 발현 촉진제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
US20050059025A1 (en) Compositions, organisms and methodologies employing a novel human kinase