JP2006524496A - 骨関節炎の診断および処置のためのチロシンキナーゼを標的化する方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＴＹＲＯ３、Ａｘｌ、ｃＭｅｒを含む受容体チロシンキナーゼのサブファミリーのメンバーおよびＧＡＳ６などのそれらのリガンドが、ＯＡを処置、予防または改善するための新しい治療剤の開発に適する標的であることを開示する。本発明はまた、ＯＡを処置および／または改善する方法、および、そのための、この受容体チロシンのサブファミリーのメンバーおよび関連リガンドの発現または活性に対する阻害効果を有する調整物質を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、例えばこれらのポリペプチドの活性および／または発現を阻害できる化合物を同定することを含む、ＯＡを処置するための治療的有用性を有する化合物を同定する方法に関する。

Description

発明の詳細な説明

発明の背景
本発明は、骨関節炎（ＯＡ）の診断および処置のための方法および組成物に関する。特に、本発明は、ＴＹＲＯ３、ＡｘｌおよびｃＭｅｒを含む受容体チロシンキナーゼのサブファミリー、およびこれらの遺伝子、遺伝子産物およびこれらに対するリガンドの、ＯＡの新しい治療的処置を開発するために適する薬物標的として、そしてＯＡの診断用マーカーとしての使用を開示する。本発明はまた、ＯＡの処置に有用な化合物を同定するためのスクリーニングアッセイおよび該化合物を含む医薬組成物にも関する。

発明の分野
ＯＡは、主として、関節の軟骨の進行的減少に起因する関節の疼痛および硬直を特徴とする非炎症性疾患である。ＯＡは、最も一般的な加齢関連疾患に含まれ、全世界の５千６００万人を、または６０歳以上の人口の８０％を冒していると推定される。ＯＡは一般的に変性障害と見なされるが、この疾患は、正常な関節の軟骨に存在する主要な細胞タイプである、軟骨細胞の活性化と関連している。この細胞の活性化の顕著な特徴には、肥大、増殖、脱分化、その存在している細胞外マトリックスの分解、および、最終的なアポトーシスが含まれる。

ＯＡの分子的病因論は不明である。従って、ＯＡを処置するための現行の治療方法は、疾患の根底にある原因を処置することよりも、むしろ、関節疼痛および二次的炎症性変化の低減など、症状の軽減を指向している。疾患の進行を防止する薬理的介入は、現在利用できない。故に、多くの患者は、全関節の置換手術が必要となる疾患の進行段階へ進む。総説として、Pritzker, in: Brandt et al., Eds., Osteoarthritis, Oxford University Press, pp. 50-61 (1998) 参照。また、Sandell & Aigner, Arthritis Res., Vol. 3, No. 2, pp. 107-113 (2001) 参照。

大規模なＯＡｃＤＮＡライブラリーの配列解読により、疾患のある軟骨細胞により発現されるいくつかの推定的遺伝子産物または「マーカー遺伝子」が同定された。Stokes et al., Arthritis Rheum., Vol. 46, No. 2, pp. 404-419 (2002); Hu et al., J. Biol. Chem., Vol. 273, No. 51, pp. 34406-34412 (1998); Aigner et al., Arthritis Rheum., Vol. 44, No. 12, pp. 2777-2789 (2001); および Kumar et al., Osteoarthritis Cartilage., Vol. 9, No. 7, pp. 641-653 (2001) 参照。しかしながら、これらの遺伝子産物についての機能的情報は現在入手不可能であり、それらのＯＡにおける役割は、あるとしても、不明なままである。従って、ＯＡの分子的基礎は不明なままであり、非常に限られた数の潜在的薬物標的しか知られていない。

従って、ＯＡおよび関連疾患を処置するための治療的化合物および方法に対する要望が存続している。さらに、例えばＯＡの処置用のかかる治療方法のための薬物の標的として、有用であり得る新規遺伝子および遺伝子産物への要望がある。また、そのような薬物標的を同定するための新規方法、特に新規スクリーニングアッセイへの要望もある。

本発明の要旨
本発明は、ＯＡの処置および診断のための方法および組成物に関する。特に、本発明は、ＴＹＲＯ３、ＡｘｌおよびｃＭｅｒを含む受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーおよびそれらのリガンド、例えば、ＧＡＳ６およびＰＲＯＳ１の新規使用を提供する。出願人は、驚くべきことに、ＴＹＲＯ３およびそのリガンド、特にＧＡＳ６が、ＯＡを有する個体の軟骨からの細胞および組織に上昇したレベルで発現されることを見出した。さらに、軟骨細胞におけるＴＹＲＯ３またはＡｘｌの発現の上昇および／またはＴＹＲＯ３リガンドによる軟骨細胞の処置が、ＯＡに関連するいくつかの異なる遺伝子の発現を誘導し、一方、例えばＲＮＡ干渉によるＴＹＲＯ３、ＡｘｌまたはｃＭｅｒの抑制は、ＩＬ−１またはＴＮＦに媒介されるＯＡの遺伝子マーカーの誘導を阻止する。このことは、受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーが、インビボでの軟骨分解の媒介において鍵となる役割を有し得ること、従ってＯＡを処置、予防または改善するための新しい治療剤の開発に有用な薬物標的であることを示唆している。

従って、本発明は、受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバー、例えば、ＴＹＲＯ３、ＡＸＬおよびｃＭｅｒ、および／またはそれらに対するリガンド、例えば、ＧＡＳ６またはＰＲＯＳ１を使用して、ＯＡの処置用の化合物を同定する新規スクリーニングアッセイを提供する。ある態様では、これらの方法は、試験化合物を、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドおよびそれらに対するリガンドを含有する反応混合物に、好ましくはそのリガンドがポリペプチドに結合して結合複合体を形成することを可能にする条件下で、接触させることを含む。好ましい態様では、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドはＴＹＲＯ３であり、リガンドはＴＹＲＯ３リガンドである。次いで、結合複合体形成のレベルを、試験化合物の存在下の反応混合物中で検出でき、これらのレベルを試験化合物の非存在下で形成される結合複合体のレベルと比較する。このような方法では、試験化合物の存在下で形成される結合複合体のレベルの低下は、その試験化合物がＯＡの処置に使用できることを示す。

これらの方法の好ましい実施態様では、ＴＹＲＯ３ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。他の好ましい実施態様では、ＴＹＲＯ３リガンドは、ＧＡＳ６ポリペプチドであり、好ましくは配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

他の態様では、本発明はまた、ＯＡを有する個体を同定するための診断方法も提供する。ある実施態様では、これらの方法は、個体（例えば、患者または他のＯＡを有すると疑われる個体）に由来する生物学的サンプル中（例えば、軟骨細胞、軟骨組織および／または滑液もしくは血清中）の、受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドメンバーをコードする核酸、好ましくはＴＹＲＯ３核酸を検出し、該生物学的サンプル中の該核酸のレベルを、ＯＡを有さない個体中の核酸のレベルと比較することを含む。そのような実施態様では、その個体からの該生物学的サンプル中の該核酸のレベルの上昇は、その個体がＯＡを有するか、あるいは、その個体がＯＡを発症するリスクが高いことを示す。

他の実施態様では、本発明の診断的態様は、個体（例えば、患者または他のＯＡを有すると疑われる個体）に由来する生物学的サンプル中（例えば、軟骨細胞、軟骨組織および／または滑液もしくは血清中）の、受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーに属するポリペプチド、好ましくはＴＹＲＯ３ポリペプチドのレベルを検出し、該生物学的サンプル中の該ポリペプチドのレベルを、ＯＡを有さない個体中の該ポリペプチドのレベルと比較することを含む。そのような実施態様では、その個体からの該生物学的サンプル中の該ポリペプチドのレベルの上昇は、その個体がＯＡを有するか、あるいは、その個体がＯＡを発症するリスクが高いことを示す。

これらの診断方法の特に好ましい実施態様では、ＴＹＲＯ３ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり得、ＴＹＲＯ３核酸は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸であり得る。

あるいは、本発明はまた、受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのリガンド、好ましくは、ＧＡＳ６またはＰＲＯＳ１などのＴＹＲＯ３リガンドを使用して、ＯＡを有する個体を同定する診断方法も提供する。例えば、ある実施態様では、そのような方法は、個体（例えば、患者または他のＯＡを有すると疑われる個体）に由来する生物学的サンプル中（例えば、軟骨細胞、軟骨組織および／または滑液もしくは血清中）の、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーに対するリガンドをコードする核酸を検出し、該生物学的サンプル中の核酸のレベルを、ＯＡを有さない個体中の核酸のレベルと比較することを含む。そのような実施態様では、該リガンドをコードする核酸のレベルの上昇は、その個体がＯＡを有するか、あるいは、その個体がＯＡを発症するリスクが高いことを示す。

他の実施態様では、本発明の診断的態様は、個体（例えば、患者または他のＯＡを有すると疑われる個体）に由来する生物学的サンプル中（例えば、軟骨細胞、軟骨組織および／または滑液もしくは血清中）の、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのリガンドのポリペプチド、好ましくはＴＹＲＯ３リガンドのポリペプチドを検出し、該生物学的サンプル中の該リガンドのポリペプチドのレベルを、ＯＡを有さない個体中のリガンドのポリペプチドのレベルと比較することを含む。そのような実施態様では、その個体からの該生物学的サンプル中の該リガンドのポリペプチドのレベルの上昇は、その個体がＯＡを有するか、あるいは、その個体がＯＡを発症するリスクが高いことを示す。

これらの診断方法の特に好ましい実施態様では、ＴＹＲＯ３リガンドは、好ましくは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドなどのＧＡＳ６ポリペプチドである。同様に、ＴＹＲＯ３リガンドをコードする核酸は、好ましくは、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする核酸などの、ＧＡＳ６をコードする核酸である。特に好ましい実施態様では、ＴＹＲＯ３リガンドをコードする核酸は、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む。

別の態様では、本発明は、ＯＡを処置、予防または改善する方法に関し、それは、それを必要としている対象に、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーおよび／またはそれらのリガンドの調整物質の有効量を含む医薬組成物を投与することを含む。様々な好ましい実施態様では、該医薬組成物は、ＴＹＲＯ３、Ａｘｌ、ｃＭｅｒおよび／またはそれらのリガンドに対する１またはそれ以上の調整物質を含む。

別の態様では、本発明は、それを必要としている対象においてＯＡを処置、予防または改善するのに有効な量で、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーおよび／またはそれらのリガンドの調整物質を含む医薬組成物に関し、該調整物質は、例えば、１またはそれ以上のこのサブファミリーのメンバー、例えば、ＴＹＲＯ３、ＡｘｌおよびｃＭｅｒの、活性、発現またはリガンド結合を阻害できる。ある実施態様では、該医薬組成物は、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーまたはそれらのリガンドの核酸配列に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーまたは二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される１またはそれ以上の物質を含み、ここで、該物質は、該ファミリーのメンバーまたはリガンドの発現を阻害するように設計されている。さらなる実施態様では、該医薬組成物は、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーまたはそれらのリガンドに対する抗体またはそれらのフラグメントを含み、ここで、該抗体は、例えば、該メンバーおよび／またはリガンドの活性を阻害できる。

本発明のさらに別の態様では、患者に由来する生物学的サンプル中の、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーまたはそれらのリガンドをコードするポリヌクレオチドの発現、または該メンバーもしくはそれらのリガンドまたはそれらのフラグメントのポリペプチドのレベルの検出に必要な成分を含むアッセイ方法およびキットが提供され、かかるキットは、例えば、該ポリペプチドまたはそれらのフラグメントに結合する抗体、または該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを含む。好ましい実施態様では、かかるキットはまた、そのキットの成分を使用するための操作を詳述する指示書も含む。

発明の詳細な説明
本発明は、本明細書で受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーと呼ばれる受容体チロシンキナーゼのサブファミリーに関し、それは、相同タンパク質のＴＹＲＯ３、ＡｘｌおよびｃＭｅｒを含む。本明細書で開示されるデータは、これらのポリペプチドがＯＡの病因に関与することを示し、従って、本発明ではこれらのポリペプチドおよびそれらのリガンドがＯＡおよび関連症状を処置、予防または改善するための治療剤の開発に適する薬物標的であることを意図している。

ＴＹＲＯ３ポリペプチドは、例えば、Polvi et al., Gene, Vol. 134, No. 2, pp. 289-293 (1993); および Schultz et al., Mol. Brain Res., Vol. 28, pp. 273-280 (1995) に記載された。ＴＹＲＯ３はまた、ＳＫＹ、ＴＩＦ、ＲＳＥ、ＤＴＫおよびＢＲＴとしても知られている。Ohashi et al., Oncogene, Vol. 9, pp. 699-705 (1994); Dai et al., Oncogene, Vol. 9, pp. 975-979 (1994); Mark et al., J. Biol. Chem., Vol. 269, pp. 10720-10728 (1994); および Fujimoto et al., Oncogene, Vol. 9, pp. 693-698 (1994) 参照。好ましいＴＹＲＯ３アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能であり、受託番号ＮＰ＿００６２８４（配列番号２）を有する。このＴＹＲＯ３ポリペプチドをコードする好ましいｃＤＮＡ配列も、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能であり、受託番号ＮＭ＿００６２９３（配列番号１）を有する。このｃＤＮＡ配列のヌクレオチド２２５−２８９７は、配列番号２のアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード配列」（ＣＤＳ）に相当する。

ＴＹＲＯ３受容体は、ＵＦＯまたはＡＲＫとしても知られる受容体チロシンキナーゼＡｘｌ（説明には、O'Bryan et al., Mol. Cell Biol., Vol. 11, pp. 5016-5013 (1991); Janssen et al., Oncogene, Vol. 6, pp. 2113-2120 (1991); および Rescigno et al., Oncogene, Vol. 6, pp. 1909-1913 (1991)；Ａｘｌのスプライスバリアント（splice variant）のＡｘｌｖ１およびＡｘｌｖ２のＧｅｎＢａｎｋ受託番号、各々ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１９１３；配列番号３２およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１６９９、配列番号３０参照）と；そして、ＥＹＫとしても知られる受容体チロシンキナーゼｃＭｅｒ（Graham et al., Cell Growth Differ., Vol. 5, pp. 647-657 (1994); Jia et al., J. Biol. Chem., Vol. 269, pp. 1839-1844 (1994)；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６３４３およびＮＰ＿００６３３４；並びに配列番号３４および配列番号３５参照）と、構造および配列相同性を有する。一緒になって、これらの３つのポリペプチドは、各々が類似する外部ドメインを有し、約３５％のアミノ酸配列同一性を共有し、２つの免疫グロブリン様ドメインおよび２つのフィブロネクチンＩＩＩ型反復を含むチロシンキナーゼ受容体のサブファミリーを定義する。Schulz et al., Mol. Brain Res., Vol. 28, pp. 273-280 (1995) 参照。

ＴＹＲＯ３に特異的に結合し、活性化する少なくとも１つのリガンドが記載された。例えば、Varnum et al., Nature, Vol. 373, pp. 623-626 (1995); Stitt et al., Cell, Vol. 80, No. 4, pp. 661-670 (1995); および Manfioletti et al., Mol. Cell Biol., Vol. 13, pp. 4976-4985 (1993) 参照。「増殖停止特異的タンパク質６」または「ＧＡＳ６」として知られるこのリガンドの例示的アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能であり、受託番号ＮＰ＿０００８１１（配列番号３）を有する。このＧＡＳ６ポリペプチドをコードする好ましいヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００８２０（配列番号４）から入手可能である。特に、このｃＤＮＡ配列は、配列番号４のヌクレオチド残基１３５−２１７１を含むオープンリーディングフレームを含有する。ＧＡＳ６はまた、他のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーであるＡｘｌおよびｃＭｅｒのリガンドであることも示された。例えば、Nagata et al., J. Biol. Chem., Vol. 271, pp. 30022-30027 (1996) 参照。

ＴＹＲＯ３に特異的に結合する別のリガンドは、プロテインＳと呼ばれるタンパク質である。Stitt et al. (1995), 前出; および Wimmel et al., Cancer, Vol. 86, No. 1, pp. 43-49 (1999) 参照。このプロテインＳポリペプチド（ＰＲＯＳ１）をコードする好ましいヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３１３から入手可能であり、また、本明細書において配列番号２８で提供される。例示的な好ましいＰＲＯＳ１のアミノ酸配列も、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００３０４（配列番号２９）から入手可能である。

下記実施例に開示する通り、出願人は、ＴＹＲＯ３、Ａｘｌ、ｃＭｅｒおよびＧＡＳ６が、ＯＡの病因に関与することを見出した。例えば、データは、軟骨細胞におけるＴＹＲＯ３遺伝子の発現が、アグリカナーゼ（Aggrecanase）−１、ＭＭＰ−１３、ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２を含むＯＡに関連するいくつかの遺伝子マーカーを誘導し、一方軟骨細胞におけるＴＹＲＯ３の阻害は、これらのマーカー遺伝子の発現を低下させることを示す。出願人は、また、ＴＹＲＯ３とＧＡＳ６の両方が、ＯＡ患者からの軟骨細胞において、正常な軟骨細胞で見られるこの遺伝子の発現と比較して上昇したレベルで発現されることも見出した。さらに、ＧＡＳ６による軟骨細胞の処理も、ＯＡマーカー遺伝子を誘導する。加えて、ｓｉＲＮＡを用いる実験も、ＯＡの病因におけるｃＭｅｒおよびＡｘｌのスプライスバリアントの役割を支持する。

これらの驚くべき知得は、これらの受容体チロシンキナーゼ並びにそれらに対するリガンド、例えば、ＧＡＳ６およびＰＲＯＳ１が、ＯＡ並びに他の軟骨障害の媒介に重要な役割を果たし得ることを立証する。特に、これらの知見は、これらの受容体チロシンキナーゼ並びにそれらに対するリガンドを、例えば、ＯＡを処置、予防または改善する（本明細書では、簡潔さのためにＯＡを「処置する」とも言う）ための治療剤を開発するための薬物標的として使用し得ることを立証する。

従って、本発明は、ＯＡの処置用の薬物および他の治療的化合物を同定し得るスクリーニングアッセイを提供する。特に、本発明のスクリーニングアッセイには、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーをコードする遺伝子、好ましくはＴＹＲＯ３遺伝子、または遺伝子産物に特異的に結合し、その発現または活性を阻害する化合物を同定するものが含まれる。あるいは、本発明はまた、ＴＹＲＯ３サブファミリーに特異的なリガンド、例えばＧＡＳ６、の遺伝子または遺伝子産物に結合し、そのリガンドの発現または活性を阻害する化合物を同定するスクリーニングアッセイも提供する。加えて、本発明はまた、ＴＹＲＯ３受容体のＴＹＲＯ３リガンドへの、例えばＧＡＳ６への結合を阻害するか、または他のやり方で調整する化合物を同定するスクリーニングアッセイも提供する。そのようなアッセイで同定される化合物および調整物質は、それら自体、例えば、ＯＡを処置するための医薬組成物および／または治療方法で使用できる。従って、そのような医薬組成物および治療方法が下記で提供され、これも本発明の一部である。

最後に、出願人の知得はまた、本明細書で開示されるＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドのメンバーおよびそられに対するそれぞれのリガンド（群）を、骨関節炎の細胞の同定および／またはＯＡを有する個体、例えば患者の同定のための予後および診断方法に使用できることも立証する。そのような診断および予後方法の例は下記に提供され、これも本発明の一部である。

本発明およびその説明は、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術の分野の様々な従来技法を用い得る。かかる技法は当分野で周知であり、文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fitsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), 本明細書で「Sambrook et al. (1989)」と呼ばれる; D.N. Glover et al., DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (1985); Gait, Ed., Oligonucleotide Synthesis (1984); Hames & S.J. Higgins, Eds., Nucleic Acid Hybridization (1984); Freshney, Ed., Animal Cell Culture (1986); Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); および Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 参照。

ＴＹＲＯ３ポリペプチド
本発明は、ＴＹＲＯ３、Ａｘｌ、ｃＭｅｒおよびそれらの変異体を含む、チロシンキナーゼのサブファミリーに関する。より具体的には、本発明は、例えば、Polvi et al., Gene, Vol. 134, No. 2, pp. 289-293 (1993) により記載されているポリペプチドＴＹＲＯ３に関する。特に、本発明は、ＯＡおよび他の軟骨障害を処置するための薬剤および医薬組成物におけるＴＹＲＯ３、ｃＭｅｒおよびＡｘｌの使用を提供する。従って、本発明は、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーを使用してＯＡおよび他の軟骨障害を診断および／または処置する方法および組成物を提供する。

ある特別な実施態様では、ＴＹＲＯ３ポリペプチドは、ヒトの細胞に由来し、かつ／または、ヒトの細胞に由来するＴＹＲＯ３ポリペプチドのアミノ酸配列を有する。例えば、特に好ましいＴＹＲＯ３ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６２８４（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を含み得る。しかしながら、ＴＹＲＯ３ポリペプチドが、この特定の配列に限定されず、当業者になじみのある相同体および変異体も含むことが理解される。

故に、ＴＹＲＯ３ポリペプチドはまた、全長ＴＹＲＯ３ポリペプチドの１またはそれ以上のエピトープまたはドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドも含む。ポリペプチドのエピトープは、それに対して抗体を産生し得、それに対して抗体が結合する、ポリペプチド上の部位を表す。従って、ＴＹＲＯ３エピトープのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、ＴＹＲＯ３ポリペプチドに対する抗体を作成するのに有用である。好ましくは、エピトープは、少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、１５、２０、２５または５０のアミノ酸残基の長さの配列を含む。従って、ＴＹＲＯ３のエピトープを含むポリペプチドは、好ましくは、全長ＴＹＲＯ３ポリペプチド配列の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも５０のアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を含有する。

ＴＹＲＯ３ポリペプチドはまた、配列番号２で提供される例示的全長ＴＹＲＯ３ポリペプチド配列の類似体および誘導体も含む。ＴＹＲＯ３ポリペプチドの類似体および誘導体は、配列番号２に記載の例示的ＴＹＲＯ３ポリペプチドと同一または相同の特徴を有する。融合ポリペプチドのＴＹＲＯ３部分が１またはそれ以上のＴＹＲＯ３ポリペプチドの特徴を有するキメラまたは融合ポリペプチドも調製できる。従って、そのような融合ポリペプチドは、ＴＹＲＯ３ポリペプチドの実施態様を表す。そのような融合ポリペプチドはまた、マーカーポリペプチドのアミノ酸配列も含み得る；例えば、いくつかを挙げると、ＦＬＡＧ、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＩｇＧのＦｃ部分である。加えて、融合ポリペプチドは、チオリダクターゼのアミノ酸配列または１もしくはそれ以上の免疫グロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）の配列などの、ポリペプチドの溶解度を高めるアミノ酸配列を含んでもよい。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドの類似体または変異体はまた、コードしている核酸分子を変更することにより、例えば置換、付加または欠失により、作成できる。具体的には、ＴＹＲＯ３ポリペプチドの好ましい類似体または変異体は、配列番号２で特定される特定のＴＹＲＯ３ポリペプチド配列の「機能保存的変異体」を含む。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「機能保存的変異体」は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸残基またはポリヌクレオチドのコドンによりコードされるアミノ酸残基が、そのポリペプチドの全体的な構造および機能を変更せずに、変化または変更されたものである。そのような変化は、そのポリペプチドの見かけの分子量または等電点に影響を殆どまたは全く与えないと期待される。故に、そのような変更された核酸分子は、好ましくは、機能的に類似の分子（即ち、ＴＹＲＯ３ポリペプチドの１またはそれ以上の機能を果たす、および／または、１またはそれ以上のＴＹＲＯ３ポリペプチドの生物活性を有する分子）をコードする。

本明細書で保存されていると特別に同定されているもの以外のアミノ酸残基は、タンパク質またはポリペプチドの変異体の間で異なっていてもよい。従って、ＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドのメンバーの任意の２つの変異体または類似体の間のタンパク質またはアミノ酸配列の類似性の割合は異なり得る。典型的には、Ｃｌｕｓｔｅｒ法および／またはＭＥＧＡＬＩＧＮもしくはＧＣＧアラインメントアルゴリズムなどのアラインメント理論に従い決定される通りのこれらのポリペプチドの変異体または類似体の間のタンパク質またはアミノ酸配列の類似性の割合は、７０％−９９％であり得る。これらのポリペプチドの好ましい変異体および類似体は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒ、ＣＬＵＳＴＡＬなどの配列比較アルゴリズムにより測定して、少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性である。

機能保存的変異体には、上記定義の通り、本明細書で論じる全長ＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドの変異体（例えば、下記実施例で特定されるＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチド配列を含むポリペプチドの変異体）のみならず、修飾されたＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチド（例えば、切断および欠失）および全長ＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドのフラグメント（例えば、ドメインまたはエピトープに相当する）の機能保存的変異体も含まれる。

さらに他の実施態様では、ＴＹＲＯ３ポリペプチドの類似体は、配列番号２で提供されるＴＹＲＯ３ポリペプチド配列の対立遺伝子変異体または突然変異体である。対立遺伝子変異体および突然変異体の用語は、本明細書でポリペプチドを記載するのに使用する場合、対立遺伝子変異体または突然変異体の遺伝子によりコードされるポリペプチドに言及する。従って、対立遺伝子変異体および突然変異体のＴＹＲＯ３ポリペプチドは、ＴＹＲＯ３核酸の対立遺伝子変異体または突然変異体によりコードされるポリペプチドである。

さらに他の実施態様では、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドの類似体は、同一の種からの（例えば、対立遺伝子変異体）、または、他の種からの（例えば、オルソロガス（orthologous）なポリペプチド）実質的に相同なポリペプチドである。用語「相同」は、あらゆる文法的形態および綴りの変形において、「共通の進化上の起源」を有する２つのタンパク質間または核酸間の関係に言及し、同一種の生物におけるスーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）のタンパク質、並びに異なる生物種からの相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖ポリペプチドなど）を含む。Reeck et al., Cell, Vol. 50, p. 667 (1987) 参照。そのようなタンパク質（およびそれらをコードしている核酸）は、それらの配列類似性に反映されている通り、パーセント同一性の観点で、または特定の残基またはモチーフおよび保存された位置の存在により、配列相同性を有する。本発明の好ましい相同ポリペプチドは、本発明の他の変異体および類似体のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドより高い、特定された通りの配列類似性または同一性のレベルを有する。これらのポリペプチドの相同体およびオルソログは、例えば、いくつかを挙げると、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマおよびウシなどの哺乳動物から入手し得る。

他の実施態様では、ＴＹＲＯ３ポリペプチドの変異体（類似体、相同体などを含む）は、配列番号２に記載の１またはそれ以上の特定のＴＹＲＯ３ポリペプチド配列をコードする核酸分子の相補鎖にハイブリダイズする核酸分子にコードされるポリペプチドである。核酸分子の一本鎖形態が他の核酸分子に適切な温度および溶液イオン濃度の条件下でアニーリングできるとき、核酸分子は、他の核酸分子（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）に「ハイブリダイズ可能」である。例えば、Sambrook et al., 前出、参照。温度とイオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー（stringency）」を決定する。相同核酸の予備的スクリーニングには、約５５℃の融点に相当する、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を使用できる（例えば、５ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、０.２５％ミルクおよびホルムアミドなし；あるいは、３０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣおよび０.５％ＳＤＳ）。中度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴ_ｍに相当し、例えば４０％ホルムアミド、５ｘまたは６ｘＳＳＣである。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴ_ｍに相当し、例えば、５０％ホルムアミド、５ｘまたは６ｘＳＳＣである。１ｘＳＳＣ溶液は、０.１５Ｍ ＮａＣｌおよび０.０１５Ｍ クエン酸Ｎａを含有する溶液と理解される。

ハイブリダイゼーションは、相補的配列を含有する２つの核酸を必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さと相補性の程度によって決まり、変数は当業者に周知である。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高ければ高いほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴ_ｍの値は高くなる。

１００ヌクレオチドより長いハイブリッドには、Ｔ_ｍを算出するための式が導かれている。Sambrook et al., 前出, pp. 9.50-9.51 参照。

特別な実施態様では、用語「標準的ハイブリダイゼーション条件」は、約５５℃のＴ_ｍを表し、上記の条件を利用する。好ましい実施態様では、Ｔ_ｍは６０℃である；より好ましい実施態様では、Ｔ_ｍは６５℃である。特別な実施態様では、用語「高ストリンジェンシー」は、０.２ｘＳＳＣ中６８℃、５０％ホルムアミド、４ｘＳＳＣ中４２℃のハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件、またはこれらの２条件のいずれかで観察されるものと均等なハイブリダイゼーションのレベルを与える条件下を表す。

なお他の実施態様では、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドの変異体（類似体、相同体およびオルソログを含む）は、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子の変異体を単離することにより同定できる。これは、例えば、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドのアミノ酸配列をベースとして設計された変性オリゴヌクレオチドプライマーを用いる、後述する通りのＰＣＲを使用することによる。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドの誘導体には、さらに、リン酸化ポリペプチド、ミリスチル化ポリペプチド、メチル化ポリペプチドおよび化学修飾された他のポリペプチドが含まれる。ＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドには、さらに、例えば、ヨウ素またはリンで放射性標識したもの（例えば、ＥＰ３７２７０７Ｂ参照）、または、限定的ではないが、ビオチン、蛍光染料（例えば、Ｃｙ５またはＣｙ３）、金属イオンと錯体化したキレート化基、発色団またはフルオロフォア、金コロイド、ラテックスビーズなどの粒子、またはポリ（エチレン）−グリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーに結合したものなどの、他の検出可能な分子により標識化された変異体が含まれる。ＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドの化学修飾は、ある種の状況では付加的な利点を提供し得る。例えば、米国特許第４,１７９,３３７号参照。総説として、Abuchowski et al., Enzymes as Drugs, Holcerberg & Roberts, Eds., pp. 367-383 (1981) も参照。タンパク質の修飾および融合タンパク質を記載している総説記事は、Fracis, Focus on Growth Factors, Vol. 3:, pp. 4-10, Mediscript: Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK (1992) にも見出される。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸
一般に、チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドのメンバーをコードする核酸は、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドをコードする核酸配列の相補鎖をコードする核酸配列、およびこれらのフラグメントを含む。従って、ある好ましい実施態様では、ＴＹＲＯ３核酸分子は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。この実施態様の特に好ましい態様では、ＴＹＲＯ３核酸分子は、コード部分（即ち、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６２９３に記載され、本明細書で配列番号１で提供されるヌクレオチド配列のＯＲＦ）を含むヌクレオチド配列を有する。特に好ましい核酸分子は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチド２２５−２８９７の配列を含む。同様に、Ａｘｌキナーゼポリペプチド変異体ＡＸＬｖ１およびＡＸＬｖ２は、各々配列番号３０および３２で、ｃＭｅｒは配列番号３４で、本明細書で提供されるヌクレオチド配列を有する。

さらに他の実施態様では、ＴＹＲＯ３サブファミリーの核酸分子は、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドの１またはそれ以上の鍵となるドメイン（例えば、受容体結合部位、キナーゼ、細胞外および膜貫通ドメインを含む）をコードするヌクレオチド配列を含む。

ＴＹＲＯ３サブファミリーの核酸分子はまた、ＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチド配列の１またはそれ以上のフラグメントをコードする配列を含む核酸も含む。

ＴＹＲＯ３サブファミリーの核酸分子はまた、修飾されたポリペプチド（例えば、アミノ酸置換、欠失または切断を有する）および変異体（同一または異なる種に由来する対立遺伝子変異体、類似体および相同体を含む）のポリペプチドのコード配列を含む核酸分子も含む。好ましい実施態様では、かかる核酸分子は、ＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドをコードする配列（例えば、配列番号１、配列番号３０、配列番号３２または配列番号３４に記載のコード配列）に対して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する。

加えて、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドをコードする核酸分子には、例えば、定められた条件下のサザンブロットアッセイで、他の核酸分子にハイブリダイズするものが含まれる。例えば、特別な実施態様では、ＴＹＲＯ３の核酸分子は、配列番号１に記載のＴＹＲＯ３コード配列などの特定の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。あるいは、核酸分子は、同じ定められたハイブリダイゼーション条件下で、全長ＴＹＲＯ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のフラグメントの相補鎖にハイブリダイズし得る。好ましいハイブリダイゼーションの例には、上記のものが含まれる。

他の実施態様では、核酸分子は、全長ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸配列のフラグメントを含む。かかる核酸フラグメントは、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの全長ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の、少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの配列に相当するヌクレオチド配列を含む。好ましい実施態様では、核酸フラグメントは、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの全長核酸配列またはそのフラグメントに相補的な、および／またはこれらにハイブリダイズする、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの配列を含む。より短い核酸、即ちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションには、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する。Sambrook et al., 前出, pp. 11.7-11.8 参照。ハイブリダイズ可能な核酸の最短の長さは、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドである。

そのようなフラグメントを含む核酸分子は、例えば、変異体ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドをコードする他の核酸分子を検出および増幅するためのオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）として有用である。オリゴヌクレオチドフラグメントは、例えば、細胞中のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子の発現または転写のレベルを調整するアンチセンス核酸としても使用し得る。

核酸分子には、また、「キメラ」核酸分子も含まれる。かかるキメラ核酸分子は、少なくとも１つのＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸配列（例えば、上記の全長または部分的なＴＹＲＯ３、ＡＸＬまたはｃＭｅｒの核酸配列のいずれかであり得る）、および、さらに少なくとも１つのＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーではない核酸配列（即ち、天然産生のサブファミリーのメンバーの遺伝子に通常は伴っていない核酸配列）を含むポリヌクレオチドである。例えば、サブファミリーのメンバーではない核酸配列は、別の遺伝子に由来し、天然産生のサブファミリーのメンバーの遺伝子に通常は伴っていない異種調節配列（例えば、プロモーター配列）であり得る。サブファミリーのメンバーではない核酸配列は、ＦＬＡＧ、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘマグルチニン、β−ガラクトシダーゼ、チオリダクターゼまたは１つの免疫グロブリンドメインもしくは複数のドメイン（例えば、Ｆｃ領域）などの他のポリペプチドのコード配列であってもよい。好ましい実施態様では、キメラ核酸分子は、本発明の融合ポリペプチドをコードする。

核酸分子は、ゲノムＤＮＡでも、ｃＤＮＡでも他のものでも、例えば、所望のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子を有する生物の細胞または細胞株に由来するｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを含む、いかなる供給源からでも単離できる。ｃＤＮＡライブラリーの場合、そのようなライブラリーは、好ましくは、特定のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子を発現する細胞または細胞株に由来するものである。遺伝子を得るための方法は、当分野で周知である。例えば、Sambrook et al. (1989), 前出、参照。

ＤＮＡは、クローン化されたＤＮＡから（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」から）、当分野で既知の標準的操作により入手し得、好ましくは、そのタンパク質の発現レベルが高い組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから入手する。ある好ましい実施態様では、ＤＮＡは、ライブラリーを特定の細胞タイプまたはある種の条件下で特異的に発現される遺伝子のｃＤＮＡで富むようにするために、「サブトラクション」ライブラリーから入手する。そのようなサブトラクションライブラリーの使用は、特定の遺伝子のｃＤＮＡを単離する見込みを高め得る。さらに他の実施態様では、ライブラリーは、化学合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、または所望の細胞から精製したゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントのクローニングにより、調製し得る。例えば、Sambrook et al. (1989), 前出; Glover, Ed., DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd. Oxford, U.K., Vols. I and II (1985) 参照。

ある実施態様では、ｃＤＮＡライブラリーは、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチド（例えば、配列番号２に記載のＴＹＲＯ３ポリペプチド）に相同であるか実質的に類似しているポリペプチドをコードするｃＤＮＡインサートを同定することにより、所望のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸についてスクリーニングし得る。同様に、ｃＤＮＡライブラリーは、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのヌクレオチド配列に相同であるか、または実質的に類似している核酸配列を有するｃＤＮＡインサートを同定することにより、所望のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸についてスクリーニングし得る。

ゲノムＤＮＡに由来するクローンは、コード領域に加えて、調節およびイントロンＤＮＡ領域を含有し得る。ｃＤＮＡに由来するクローンは、一般的にイントロン配列を含有しない。供給源が何であれ、遺伝子は、好ましくはその遺伝子の増殖に適するベクター中に分子的にクローン化される。所望のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子を含有する特異的ＤＮＡフラグメントの同定は、数々のやり方で達成し得る。例えば、標識化プローブを調製するために、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子の一部を精製し、標識化できる。Benton & Davis, Science, Vol. 196, p. 180 (1977); および Grunstein & Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, p. 3961 (1975) 参照。例えば別の個体からの対立遺伝子変異体などの、そのプローブに対して実質的な相同性を有するＤＮＡフラグメントは、ハイブリダイズする。特別な実施態様では、最高のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を使用して相同なＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子を同定する。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子の誘導体および類似体をコードする遺伝子は、当分野で知られる様々な方法により産生できる。それらの産生をもたらす操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで行うことができる。例えば、クローン化された配列は、当分野で知られる無数の戦略のいずれかにより修飾できる。Sambrook et al. (1989), 前出参照。配列を制限エンドヌクレアーゼ（群）により適切な部位で切断し、続いて所望によりさらなる酵素的修飾を行い、単離し、インビトロで連結できる。所望の遺伝子の誘導体または類似体をコードする遺伝子の産生では、修飾された遺伝子が、それが由来する遺伝子と同じ翻訳リーディングフレーム内にあることを確実にし、所望の活性がコードされている遺伝子の領域内で翻訳停止シグナルにより妨害されないように、注意を払うべきである。

さらに、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーをコードする核酸配列は、インビトロまたはインビボで突然変異させて、翻訳、開始および／または停止配列を創生および／または破壊し、または、コード領域に変異を創生し、および／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成し、または、予め存在するものを破壊し、さらなるインビトロ修飾を助長することができる。修飾は、制限部位を導入し、発現ベクターへの遺伝子のクローニングを助長するためにも行うことができる。インビトロの部位特異的突然変異誘発（Hutchinson et al., J. Biol. Chem., Vol. 253, p. 6551 (1978); Zoller and Smith, DNA, Vol. 3, pp. 479-488 (1984); Oliphant et al., Gene, Vol. 44, p. 177 (1986）および Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 83, p. 710 (1986) 参照）、ＴＡＢリンカーの使用などを含むがこれに限定されるものではない、当分野で知られる突然変異誘発のためのいかなる技法も使用できる。Pharmacia Corp., Peapack, NJ, などを参照。ＰＣＲ技法は、部位特異的突然変異誘発に好ましい。Higuchi, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Erlich, Ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70 (1989) 参照。

同定し単離した遺伝子を、次いで、適切なクローニングベクターに挿入できる。当分野で知られている多数のベクター−宿主系を使用し得る。可能なベクターには、プラスミドまたは修飾ウイルスが含まれるがこれらに限定されるわけではなく、しかし、ベクター系は、使用する宿主細胞に適合しなくてはならない。ベクターの例には、大腸菌、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２誘導体もしくはｐＵＣプラスミド誘導体などのプラスミド、例えば、ｐＧＥＸベクター、ｐｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧ、ｐＫＫプラスミド（Clonetech, Palo Alto, CA）、ｐＥＴプラスミド（Novagen, Inc., Madison, WI）、ｐＲＳＥＴまたはｐＲＥＰプラスミド、ｐｃＤＮＡ（Invitrogen, Carlsbad, CA）またはｐＭＡＬプラスミド（New England Biolabs, Beverly, MA）などが含まれるがこれらに限定されるものではない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、ＤＮＡフラグメントを、相補的粘着末端を有するクローニングベクターに連結することにより達成できる。しかしながら、ＤＮＡを断片化するのに使用した相補的制限部位がクローニングベクターに存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾し得る。あるいは、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することにより、いかなる所望の部位でも産生し得る。これらの連結されるリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特別に化学合成されたオリゴヌクレオチドを含んでもよい。

組換え分子は、遺伝子配列の多数のコピーが生成されるように、形質転換、形質移入、感染、電気穿孔法などにより宿主細胞に導入できる。好ましくは、クローン化した遺伝子は、クローニング細胞（例えば、大腸菌）中での拡大および所望であれば後の適切な発現細胞株への挿入のための容易な精製をもたらす、シャトルベクタープラスミドに含有される。例えば、１タイプより多い生物中で複製できるベクターであるシャトルベクターは、大腸菌プラスミド由来の配列を酵母の２ｍプラスミド由来の配列と連結することにより、大腸菌および出芽酵母の両方での複製のために調製できる。

本明細書で開示のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーをコードする核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、一本鎖、二本鎖または三本鎖（例えば、ＴＹＲＯ３一本鎖ＴＹＲＯ３核酸および／またはそれらの相補鎖（群）の三重らせん）でさえあり得ることが理解される。ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡなど；並びに合成および遺伝子操作されたポリヌクレオチドおよびセンスとアンチセンスのポリヌクレオチドの両方が含まれる。かかる合成ポリヌクレオチドには、例えば、ヌクレオチドの塩基をアミノ酸主鎖にコンジュゲートすることにより形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。他の例示的合成核酸には、チオ−ウラシル、チオ−グアニンおよびフルオロ−ウラシルなどの修飾塩基を含有する核酸が含まれる。便宜上、本記載で提供される例示的ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列として提供される。しかしながら、他のタイプの核酸（例えば、ＲＮＡ）の同一の配列も使用し得、均等であることが理解される。従って、例えば、この記載中で特定のヌクレオチド配列がいくつかの位置でチミン（Ｔ）を特定する場合、その位置でウラシル（Ｕ）が置換され得、機能的均等物であることが理解される。他の均等な置換も当業者に明らかであり、従って、本明細書で開示のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸に包含される。

ポリヌクレオチドは、天然の調節配列に隣接してもよく、または、プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５'および３'−非コード領域などの異種配列を伴ってもよい。用語「異種」は、この文脈では、天然産生ではないエレメント（例えば、配列）の組合せを表す。故に、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸は、通常はＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子に関連しないプロモーターなどの配列を有してもよい。

核酸は、当分野で知られているいかなる手段によっても修飾し得る。そのような修飾の非限定的な例には、メチル化、「キャップ」、１またはそれ以上の天然産生ヌクレオチドの類似体による置換、およびヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結（例えば、メチルホスホネート類、ホスホトリエステル類、ホスホルアミデート（phosphoroamidate）類、カルバメート類など）および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類など）によるもの、が含まれる。核酸は、いくつかを挙げると、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、干渉物質（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレーター（例えば、金属、放射活性金属、鉄、酸化金属など）およびアルキレーター（alkylator）などの１またはそれ以上のさらなる共有結合部分を含有し得る。ポリヌクレオチドは、メチルまたはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホルアミダイド連結の形成により誘導体化し得る。さらに、本発明では、ポリヌクレオチドは直接または間接的に検出可能なシグナルを提供できる標識により修飾してもよい。例示的標識には、放射性同位元素、蛍光分子、ビオチンなどが含まれる。

ＴＹＲＯ３リガンドポリペプチドおよび核酸：
本発明はまた、本明細書で開示の受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーに属するポリペプチドのリガンドにも関する。従って、該リガンドポリペプチドおよび核酸も提供され、本発明の有用な態様と考えられる。

「リガンド」は、広く言うと、他の分子に結合するいかなる分子でもある。好ましい実施態様では、リガンドは、可溶性分子であるか、２つの結合分子の小さい方であるか、またはその両方である。他方の分子は、「受容体」と呼ばれる。好ましい実施態様では、リガンドとその受容体の両方は、細胞により産生される分子（好ましくはポリペプチド）である。好ましくは、リガンドは可溶性分子であり、受容体は内在性膜タンパク質、即ち、細胞表面に発現されるタンパク質である。

好ましくは、リガンドは、その受容体に「特異的に結合」し、かつ／または、逆もまた真である。用語「特異的に結合」は、生理条件下で、その受容体とその他の物質（例えば、他の分子）とを区別するリガンドの能力を表す。リガンドがその受容体にある程度の親和性で結合し、逆も真であるのが好ましい。典型的には、リガンドのその受容体に対する結合親和性は、解離定数Ｋ_ｄにより定義される。好ましくは、解離定数Ｋ_ｄは、約１０μＭより低い、より好ましくは約１μＭより低い、さらにより好ましくは約１００ｎＭより低い値を有する。特に好ましい実施態様では、解離定数Ｋｄは、１０ｎＭより低い値を有する。

リガンドのその受容体への結合は、頻繁に、細胞内のシグナル伝達の一段階である。リガンド−受容体相互作用の非限定的な例には、ホルモンのホルモン受容体への結合（例えば、エストロゲンのエストロゲン受容体への結合）；および神経伝達物質の神経細胞表面上の受容体への結合が含まれるがこれらに限定されるものではない。この場合、ＴＹＲＯ３リガンドは、ＴＹＲＯ３受容体に結合すると、チロシンキナーゼ活性を刺激する。チロシンキナーゼ活性のアッセイは当分野で周知であり、リガンドの同定に使用できる。

ＴＹＲＯ３に特異的に結合し、活性化する特に好ましいリガンドは、例えば、Varnum et al. (1995) 前出、により記載されている；また、Stitt et al. (1995), 前出; およびManfioletti et al. (1993), 前出も参照。一般的に「増殖停止特異的タンパク質６」または「ＧＡＳ６」と呼ばれるこのリガンドの例示的アミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿０００８１１でＧｅｎＢａｎｋに記載されており、また、本明細書で配列番号３でも提供される。このアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００８２０に記載され、本明細書で配列番号４で提供される全長ｃＤＮＡ配列の残基１３５−２１７１を含むオープンリーディングフレームによりコードされる。

従って、好ましいＴＹＲＯ３サブファミリーのリガンドのポリペプチドには、そのアミノ酸配列が配列番号３に記載されているＧＡＳ６ポリペプチドなどのＧＡＳ６ポリペプチドが含まれる。本発明は、当業者がさらに他のＴＹＲＯ３リガンドのポリペプチドおよびそのようなＴＹＲＯ３リガンドのポリペプチドをコードする核酸を同定する下記のアッセイを提供する。ＴＹＲＯ３サブファミリーのリガンドのポリペプチドはまた、変異体ＧＡＳ６ポリペプチドを含む変異体ＴＹＲＯ３サブファミリーリガンドポリペプチドも包含する。これらには、ＴＹＲＯ３サブファミリーのリガンドのポリペプチドの相同体、オルソログ、誘導体、突然変異体、キメラ、融合体、フラグメント、切断形などの変異体が含まれる。かかるＴＹＲＯ３サブファミリーのリガンドの変異体は、前記でＴＹＲＯ３サブファミリーの受容体のポリペプチドについて提供した通りに定義される。

同様に、本発明はまた、配列番号３のＧＡＳ６ポリペプチドをコードする核酸を含むＴＹＲＯ３サブファミリーのリガンドの核酸、例えば、配列番号４のヌクレオチド１３５−２１７１の配列を含む核酸を、本明細書に開示する通りのＯＡに適する薬物標的として提供する。さらに他のＴＹＲＯ３サブファミリーのリガンドの核酸は、下記のスクリーニングアッセイを使用して同定し得、そのようなＴＹＲＯ３サブファミリーのリガンドの核酸は、本発明の方法に従って使用し得る。ＴＹＲＯ３サブファミリーのリガンドの核酸は、変異体ＧＡＳ６核酸を含む変異体ＴＹＲＯ３サブファミリーのリガンドの核酸も包含する。これらには、ＴＹＲＯ３サブファミリーのリガンドの核酸の相同体、オルソログ、誘導体、突然変異体、キメラ、融合体、フラグメント、切断形などの変異体が含まれる。かかる変異体ＴＹＲＯ３サブファミリーのリガンドの核酸は、前記でＴＹＲＯ３サブファミリーの受容体の核酸について提供した通りに定義される。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーおよびそれらに対するリガンドの発現：
チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドのメンバーまたはそれらに対するリガンド（それらのキメラタンパク質、抗原性フラグメント、誘導体または類似体を含む）をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター、即ち、挿入されたタンパク質をコードする配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入し得る。従って、例えばＴＹＲＯ３サブファミリーの受容体またはリガンドをコードする核酸は、発現ベクター中でプロモーターと作動可能に関連できる。ｃＤＮＡおよびゲノム配列の両方を、かかる調節配列の制御下でクローン化および発現できる。従って、かかるベクターは、機能的な、または機能的に不活性化されたＴＹＲＯ３サブファミリーの受容体またはリガンドの発現に使用できる。
必要な転写および翻訳シグナルは、組換え発現ベクター上で提供できる。

可能性のある宿主−ベクター系には、発現プラスミドで形質移入された、またはウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなど）に感染した哺乳動物または他の脊椎動物の細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物；または、バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質移入した細菌が含まれるがこれらに限定されるものではない。ベクターの発現エレメントは、それらの強度と特異性において違いがある。利用する宿主−ベクター系に応じて、数々の適する転写および翻訳エレメントのいずれかを使用し得る。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドまたはそれらのリガンドの発現は、当分野で知られている任意のプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御され得るが、これらの調節エレメントは、発現のために選択された宿主で機能するものでなくてはならない。遺伝子発現を制御するのに使用し得るプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５,３８５,８３９号および第５,１６８,０６２号）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Benoist and Chambon, Nature, Vol. 290, pp. 304-310 (1981) 参照）、ラウス肉腫ウイルスの３'末端反復配列に含まれるプロモーター（Yamamoto, et al., Cell, Vol. 22, pp. 787-797 (1980) 参照）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 78, pp. 1441-1445 (1981) 参照）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., Nature, Vol. 296, pp. 39-42 (1982) 参照）；ｂ−ラクタマーゼプロモーター（Villa-Komaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 75, pp. 3727-3731 (1978) 参照）またはｔａｃプロモーター（DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 80, pp. 21-25 (1983) 参照）などの原核生物発現ベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない；また、"Useful Proteins from Recombinant Bacteria", Sci. Am., Vol. 242, pp. 74-94 参照。使用し得るさらに他の有用なプロモーターエレメントには、Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターなどの酵母または他の菌類由来のプロモーターエレメント；および造血組織特異性を示す転写制御領域、特に：骨髄細胞で活性であるベータ−グロビン遺伝子制御領域（Mogram et al., Nature, Vol. 315, pp. 338-340 (1985); and Kollias et al., Cell, Vol. 46, pp. 89-94 (1986) 参照）、造血幹細胞分化因子プロモーター、エリスロポエチン受容体プロモーター（Maouche et al., Blood, Vol. 15, p. 2557 (1991) 参照）などが含まれる。

別の実施態様では、本発明は、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドおよびリガンドの発現方法を提供し、それは、該ポリペプチドおよびリガンドをコードする内在性遺伝子の細胞内での発現を制御するために非内在性プロモーターを使用することによる。細胞内の内在性遺伝子は、普通に（即ち、天然に）その細胞のゲノム中に見出される遺伝子である。しかしながら、非内在性プロモーターは、遺伝子発現の制御に使用し得るが、普通または天然にはその内在性遺伝子を伴わないプロモーターまたは他のヌクレオチド配列である。一例として、増幅可能な遺伝子または他の調節配列を内在性遺伝子の近傍に挿入するために、相同組換えの方法を用い得る（好ましくは、タンパク質をコードしていない本発明の核酸配列を使用する）。次いで、挿入された配列を、例えば、その細胞で通常に起こるものよりも高いレベルの遺伝子発現をもたらすために、または、内在性遺伝子の調節配列にある、正常な遺伝子発現レベルを妨げている１またはそれ以上の突然変異を克服するために、使用し得る。そのような相同組換えの方法は、当分野で周知である。例えば、１９９１年５月１６日に公開された Skoultchi の国際特許公開番号ＷＯ９１／０６６６６；１９９１年７月１１日に公開された Chappel の国際特許公開番号ＷＯ９１／０９９５５５；および１９９０年１１月２９日に公開された Kucherlapati および Campbell の国際特許公開番号ＷＯ９０／１４０９２参照。

可溶性形態のタンパク質は、培養液を収集することにより、または、封入体を可溶化することにより（例えば、界面活性剤による処理、そして所望により、超音波処理または他の機械的加工による）、上記の通りに得ることができる。可溶化された、または可溶性のタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、等電点電気泳動、２次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、免疫親和性およびサイズによるカラムクロマトグラフィー）；遠心分離；可溶性の差異（differential solubility）；免疫沈降；またはタンパク質精製の任意の他の標準的技法などの様々な技法を使用して、単離できる。

好ましいベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、および所望の細胞指向性を有する他の組換えウイルスなどのウイルスベクターである。従って、機能的または突然変異のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドまたはリガンドをコードする、またはそのドメインまたはフラグメントをコードする遺伝子を、ウイルスベクターを使用して、またはＤＮＡの直接的導入により、インビボ、エクスビボまたはインビトロで導入できる。標的組織での発現は、遺伝子組換えのベクターを、ウイルスベクターまたは受容体のリガンドを用いるなどして、または組織特異的プロモーターを使用して、またはその両方により、特定の細胞に標的化することで実行できる。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドおよびそれらのリガンドに対する抗体
ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドおよび／またはリガンドに対する抗体は、なかんずく、下記の診断および治療方法に有用である。本発明によると、例えば、組換えまたは化学合成により産生されたＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドまたはリガンド、およびそれらのフラグメントまたは他の誘導体もしくは類似体（融合タンパク質を含む）は、これらのポリペプチドまたはリガンドを認識する抗体を生成するために、免疫原として使用し得る。そのような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーが含まれるがこれらに限定されるものではない。そのような抗体は、好ましくは、特定のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドまたはリガンド（例えば、各々配列番号２および３に記載のアミノ酸配列を有するＴＹＲＯ３受容体またはリガンド）に特異的である（即ち、特異的に結合する）。しかしながら、あるいは、抗体は、他の生物種、好ましくは、いくつかを挙げると、マウス、ラットまたはハムスターなどの他の哺乳動物種由来のオルソログに特異的であってもよい。抗体は、野生型、突然変異体、または両方の形態のポリペプチドまたはそのリガンドを認識し得る。

ポリクローナル抗体の産生には、当分野で知られている様々な操作を使用し得る。ポリクローナル抗体の産生のために、ポリペプチドまたは誘導体（例えば、フラグメントまたは融合タンパク質）の注射により、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが含まれるがこれらに限定されるものではない、様々な宿主動物を免役できる。ある実施態様では、ＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドまたはそのフラグメントを、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性担体にコンジュゲートできる。免疫応答を高めるために、宿主の種に応じて様々なアジュバントを使用し得る。これには、フロイントのもの（完全または不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油乳液類、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよびＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（bacille Calmette-Guerin））およびコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトのアジュバントが含まれるが、これらに限定されるものではない。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドもしくはリガンド、またはそれらのフラグメント、類似体もしくは誘導体に対するモノクローナル抗体の調製のために、培養中の継続的細胞株により抗体分子の産生をもたらすいかなる技法も使用し得る。これらには、Kohler and Milstein, Nature, Vol. 256, pp. 495-497 (1975) により最初に開発されたハイブリドーマ技法、並びにトリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor et al., Immunol. Today, Vol. 4, p. 72 (1983); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 80, pp. 2026-2030 (1983) 参照）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技法（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985) 参照）が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明のさらなる実施態様では、モノクローナル抗体は、無菌動物で産生できる。国際特許公開番号ＷＯ８９／１２６９０参照。実際に、本発明によると、「キメラ抗体」の産生のために開発された技法（Morrison et al., J. Bacteriol., Vol. 159, p. 870 (1984); Neuberger et al., Nature, Vol. 312, pp. 604-608 (1984); Takeda et al., Nature, Vol. 314, pp. 452-454 (1985) 参照）も使用し得る。簡単に述べると、そのような技法は、特定の受容体またはリガンドに特異的な第１の生物種（例えば、マウス）由来の抗体分子からの遺伝子を、第２の生物種に由来する（例えば、ヒト由来）適切な生物学的活性の抗体分子からの遺伝子と繋ぎ合わせることを含む。そのようなキメラ抗体は、本発明の範囲内にある。

抗体分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、既知技法により生成できる。例えば、そのようなフラグメントには、以下が含まれるがこれらに限定されるものではない：抗体分子のペプシン切断により産生できるＦ（ａｂ'）_２フラグメント；Ｆ（ａｂ'）_２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成できるＦａｂ'フラグメント、およびパパインおよび還元剤で抗体分子を処理することにより生成できるＦａｂフラグメント。

本発明によると、一本鎖抗体の産生のために記載された技法（米国特許第５,４７６,７８６号、第５,１３２,４０５号および第４,９４６,７７８号参照）を、特定のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドまたはリガンドに特異的に結合する特異的一本鎖抗体の産生に適合させることができる。本発明のさらなる実施態様は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために記載された技法（Huse et al., Science, Vol. 246, pp. 1275-1281 (1989) 参照）を利用して、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドもしくはリガンド、またはそれらの誘導体もしくは類似体に対して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にする。

抗体の産生と使用において、所望の抗体のスクリーニングまたはそれを用いる試験は、例えば、放射性免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）；「サンドイッチ」免疫アッセイ；免疫放射線測定法；ゲル内拡散沈降反応（gel diffusion precipitin reaction）；免疫拡散法；例えば、コロイド金、酵素または放射性同位元素標識を使用するインサイチュ免疫アッセイ；ウエスタンブロット；沈降反応；凝集アッセイ、例えば、ゲル凝集アッセイおよび血球凝集アッセイ；補体固定アッセイ；免疫蛍光アッセイ；プロテインＡアッセイ；および免疫電気泳動アッセイなどの、当分野で知られている技法により達成できる。ある実施態様では、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することにより検出する。他の実施態様では、一次抗体を、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出する。さらなる実施態様では、二次抗体を標識する。免疫アッセイにおける結合の検出のために多数の手段が当分野で知られており、本発明の範囲内にある。

前述の抗体は、例えば、上述または当分野で知られている検出技法のいずれかを使用して、ウエスタンブロット、ポリペプチドのインサイチュの画像化、適切な生理的サンプル中でのそのレベルの測定など、関心のあるポリペプチドまたはリガンドの局在および活性に関する当分野で知られている方法において使用できる。そのような抗体は、例えば米国特許第５,６７９,５８２号に記載の通り、リガンドの受容体への結合のアッセイでも使用できる。一般的に、抗体の結合は、例えば、約７ないし８のｐＨおよび生理的イオン強度などの生理条件下で最も容易に起こる。緩衝液中の担体タンパク質の存在は、アッセイを安定化する。イオン強度、温度またはｐＨの上昇または低下、または界面活性剤またはカオトロピックな塩の添加などの、最適条件の撹乱への許容度はいくらかあるが、そのような撹乱は、一般的に結合の安定性を低下させる。

なお他の実施態様では、抗体は、パニングまたは関連する免疫吸着技法により、関心のあるポリペプチドまたはリガンドを発現する細胞（例えば、ＯＡ軟骨細胞）を単離するのにも使用し得る。

特別な実施態様では、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドの活性を作動させる（agonize）または打ち消す（antagonize）抗体を生成できる。特に、細胞内一本鎖Ｆｖ抗体は、ポリペプチドの活性を調節（阻害）するのに使用できる。Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90, pp. 7884-7893 (1993); Chen, Mol. Med. Today, Vol. 3, pp. 160-167 (1997); Spitz et al., Anticancer Res., Vol. 16, pp. 3415-3422 (1996); Indolfi et al., Nat. Med., Vol. 2, pp. 634-635 (1996); および Kijma et al., Pharmacol. Ther., Vol. 68, pp. 247-267 (1995) 参照。そのような抗体は、リガンドを同定するための下記のアッセイを使用して試験できる。

適用および使用
ここで記載するのは、上記の通りのＴＹＲＯ３、Ａｘｌ、ｃＭｅｒ、ＧＡＳ６およびＰＲＯＳ１の核酸、ポリペプチドおよびそれらに対する抗体の適用および使用を含む、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドおよびそれらのリガンドの様々な適用および使用である。加えて、ここで記載する適用および方法には、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドおよびリガンドを調整する化合物、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストなどの調整物質、並びに、これらのポリペプチドおよびリガンドの発現を調整する化合物、例えば、アンチセンスおよび／または阻害核酸などの調整物質、を使用するものが含まれる。

出願人は、受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバー、並びにそれらのリガンドを、ＯＡおよび他の病的軟骨分解を特徴とする症状を処置、予防または改善する新規治療剤を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、薬物標的として使用し得、そしてＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーおよび関連リガンドの核酸および／またはポリペプチドをこの観点で利用する方法は、ここに含まれることを定めた。例えば、ＴＹＲＯ３サブファミリーの受容体のＧＡＳ６などのリガンドに対する結合に干渉するか、またはそれを調整する化合物を使用する方法を下記に記載する。他の実施態様では、そのような方法は、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのリガンドの適切なＴＹＲＯ３サブファミリー受容体への結合により生じる下流のシグナル伝達事象を調整する化合物を使用し得る。そのような化合物は、例えば、本発明のスクリーニングアッセイを使用することにより、当業者により容易に同定できる。

加えて、ＴＹＲＯ３サブファミリーの遺伝子およびそれらの遺伝子産物、並びにＧＡＳ６またはＰＲＯＳ１などのＴＹＲＯ３サブファミリーのリガンドの遺伝子および遺伝子産物は、ＯＡ軟骨細胞などのＯＡ軟骨または組織を検出および／または同定するための組織特異的マーカーとしても使用できる。従って、前記のＴＹＲＯ３サブファミリーの受容体およびリガンド（群）の核酸およびポリペプチドは、例えば、ＴＹＲＯ３、Ａｘｌおよび／またはｃＭｅｒの遺伝子および遺伝子産物（変異体を含む）を使用して、例えば生検に由来する；個体に由来する組織サンプルなどのサンプルにおけるＴＹＲＯ３、Ａｘｌおよび／またはｃＭｅｒの発現を検出することによる診断および予後適用において、ＯＡを検出するための方法で使用し得る。本発明では、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸およびポリペプチドを使用して、ＯＡおよび他の関節炎の症状に関連する分解などの軟骨分解を検出する方法が提供される。

薬物スクリーニングアッセイ
下記のもののようなスクリーニングアッセイを使用して、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの受容体および／またはリガンドに結合するか、または他のやり方で相互作用する化合物を同定することが可能であり、これには、細胞内化合物（例えば、タンパク質またはタンパク質の部分）；ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの受容体またはそのリガンドの遺伝子と相互作用する化合物、他の天然および合成ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのリガンドまたは受容体；ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子産物の相互作用に干渉する化合物、例えば、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子産物のＧＡＳ６または別のリガンドへの特異的結合に干渉する化合物；および、例えば、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの受容体またはリガンドの遺伝子発現レベルを調整することにより、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子の活性を、または、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの受容体またはリガンドの活性、例えば生物学的活性を、調整する化合物が含まれる。

従って、本発明のスクリーニングアッセイは、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子または遺伝子産物に特異的に結合し、かくして発現を調整できる化合物を同定するのに使用し得る。例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイは、ＴＹＲＯ３遺伝子のプロモーターまたは他の調節配列に結合し、そうしてＴＹＲＯ３の発現レベルを調整し得る化合物を同定するのに使用し得る。例えば、Platt, J. Biol. Chem., Vol. 269, pp 28558-28562 (1994) 参照。そのスクリーニングアッセイは、ＴＹＲＯ３核酸またはポリペプチドに結合し、それにより安定化する化合物を同定するのにも使用し得る。加えて、これらのスクリーニングアッセイは、そのような結合相互作用を阻害または調整し、従って、例えば、ＴＹＲＯ３の特異的転写因子またはエンハンサーへの結合、またはＴＹＲＯ３の安定化物質への結合のアゴニストまたはアンタゴニストとして有用な化合物を同定するのに使用し得る。従って、これらまたは類似のスクリーニングアッセイで同定される化合物は、ＯＡを含むがこれに限定されるわけではない、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの異常な遺伝子発現および／または発現されるタンパク質の異常なレベルに関連する疾患および障害の処置に使用し得る。

そのようなスクリーニングアッセイにより同定され得る化合物のクラスには、低分子（例えば、約２ｋＤａより低い分子量の、より好ましくは約１ｋＤａより低い分子量の、および／または、血液脳関門を越えられるか、または、適切な細胞に入ることができ、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子またはそのサブファミリーの調節経路に関与するいくつかの遺伝子の発現に影響を与える、有機または無機分子）、並びに高分子（例えば、約２ｋＤａより高い分子量の分子）が含まれるがこれらに限定されるものではない。これらのスクリーニングアッセイで同定される化合物には、核酸、ペプチドおよびポリペプチドも含まれ得る。そのような化合物（ペプチドを含む）の例には以下のものが含まれるがこれらに限定されるものではない；可溶性ペプチド；組合せの（combinatorial）ライブラリーの融合ペプチドのメンバー（Lam et al., Nature, Vol. 354, pp. 82-84 (1991); and by Houghten et al., Nature, Vol. 354, pp. 84-86 (1991) により記載されたものなど）；Ｄ−および／またはＬ−配置アミノ酸の分子ライブラリーなどの、コンビナトリアル・ケミストリー（combinatorial chemistry）により得られるライブラリーのメンバー；ランダムまたは部分的に変性した、指向性の（directed）ホスホペプチドライブラリーのメンバーなどの、ホスホペプチド（例えば、Songyang et al., 細胞, Vol. 72, pp. 767-778 (1993) 参照）；ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖抗体を含むがこれらに限定されるものではない、抗体；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）_２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメントおよびそれらのエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されるものではない、抗体フラグメント。これらのスクリーニングアッセイで使用される核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、または合成核酸であり得る。具体例には、アンチセンス核酸およびリボザイム、並びに二本鎖および三重らせん核酸分子が含まれるが、決してこれらに限定されるものではない。

結合化合物のアッセイ
本発明のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子産物に結合できる化合物を同定するためのインビトロ系は、容易に設計できる。そのような化合物は、例えば、野生型ＴＹＲＯ３遺伝子産物の発現、安定性または活性の調整において、あるいは、突然変異体または他の変異体ＴＹＲＯ３遺伝子産物の発現、安定性または活性の調整に有用であり得る。

一般的に、そのようなスクリーニングアッセイは、ＴＹＲＯ３サブファミリーの遺伝子産物および試験化合物を、２つの化合物を相互作用（例えば、結合）させて、それにより検出し得る複合体を形成するのに十分な条件および時間で含む、反応混合物の調製を含む。アッセイは、様々な異なるやり方のいずれでも実行し得る。例えば、ある実施態様は、ＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドまたは試験化合物を固相に固着させ、反応終了時、結合していない化合物の除去（例えば、洗浄による）後に、固相上にあるＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドと試験化合物の複合体を検出することを含む。例えば、かかる方法のある好ましい実施態様では、ＴＹＲＯ３遺伝子産物を固体表面に固着させてもよく、標識した化合物（例えば、前記の方法のいずれかに従い標識したもの）を、その表面に接触させる。ＴＹＲＯ３遺伝子産物と試験化合物との間で複合体が形成し得るのに十分な時間、十分な条件下で試験化合物をインキュベートした後、試験化合物の結合していない分子を表面から除去し（例えば、洗浄による）、残っている標識化分子を検出する。

別の代替的実施態様では、１またはそれ以上の異なる試験化合物の分子を固相に取り付け、標識化ＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドの分子をそこに接触させてもよい。そのような実施態様では、異なる試験化合物の分子は、好ましくは、固相上の特定の位置で固相に取り付け、固相または表面上に結合したＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドの位置を判定することにより、ＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドに結合する試験化合物を同定し得るようにする。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドおよびリガンドと相互作用する化合物のアッセイ
受容体またはそのリガンドと相互作用するタンパク質を検出および／または同定するために、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための様々な既知技法のいずれも使用し得る。例えば、勾配またはクロマトグラフィーのカラムによる、共免疫沈降、クロスリンクおよび共精製、並びに当分野で知られている他の技法を用い得る。そのようなアッセイを使用して同定し得るタンパク質には、細胞外タンパク質（新規なＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのリガンドなど）、並びに細胞内タンパク質（シグナル伝達タンパク質など）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドおよび／またはリガンドと相互作用する化合物（他の細胞のタンパク質および核酸を含む）は、それら自体、例えば、ＴＹＲＯ３、ＡｘｌまたはｃＭｅｒの遺伝子または遺伝子産物の活性を調整し、軟骨の分解を処置または予防する、本発明の方法で使用し得る。あるいは、そのような相互作用する化合物は、それら自体、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの活性を、例えばＴＹＲＯ３リガンドに結合することにより調整する、および／またはそれに由来する下流のシグナル事象を調整する他の化合物を同定するための、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用し得、次に軟骨の分解の処置または予防に使用し得る。

一例として、限定的なものではなく、ＴＹＲＯ３受容体と特異的に相互作用する新規ＴＹＲＯ３リガンドおよび他のタンパク質を同定するために、発現クローニングアッセイを使用し得る。そのようなアッセイでは、ＴＹＲＯ３特異的リガンドを発現するいかなる細胞株からでも、例えばＧＡＳ６を発現する細胞から、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを生成し得る。そのような発現ライブラリー由来のクローンを、次いで、ＴＹＲＯ３特異的リガンドを通常は発現しない細胞に形質移入または感染させ得る。ＴＹＲＯ３特異的リガンドをコードするクローンで形質移入された細胞は、次いで、この遺伝子産物を発現し得、ＦＡＣＳなどの標準的技法を使用して、または付着したＴＹＲＯ３ポリペプチド（例えば、ＴＹＲＯ３ポリペプチドのＦｃ融合体）を有する磁気ビーズを使用して、同定および単離できる。

あるいは、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドおよび／またはリガンドは、当分野で周知の免疫沈降技法を使用して、細胞株から単離し得る。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドおよび／またはリガンドは、結合する化合物を同定するための前記で議論したスクリーニングアッセイのいずれを使用しても単離し得る。例えば、ＴＹＲＯ３−Ｆｃ融合ポリペプチドを、固体表面に結合させるか、または他の方法で取り付け、標識化化合物（例えば、ＴＹＲＯ３リガンド）を、融合ポリペプチドと試験化合物との間で複合体を形成させるに十分な時間および条件下で、その表面に接触させ得る。次いで、結合していない試験化合物の分子をその表面から除去し（例えば、洗浄により）、結合したままの標識化化合物を検出できる。

一度そのように単離したら、標準的技法を使用して、そのようなアッセイで検出されたいかなるタンパク質も同定し得る。例えば、ＴＹＲＯ３、ＡＸＬまたはｃＭｅｒの遺伝子産物と相互作用するタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部を、エドマン分解技法などの当分野で周知の技法を使用して確かめることができる（例えば、Creighton, Peroteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., NY, pp. 34-49 (1983) 参照）。

一度そのようなタンパク質が同定されたら、そのようなタンパク質をコードする遺伝子配列をスクリーニングするために、オリゴヌクレオチド混合物の生成のための指針として、それらのアミノ酸配列を使用し得る；例えば、前記の標準的ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲの技法を使用する。そのようなオリゴヌクレオチド混合物の生成およびスクリーニングアッセイにおけるそれらの使用のための技法の説明には、例えば、Ausubel 前出; および PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Eds., Academic Press, Inc., NY (1990) 参照。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子または遺伝子産物と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子を同時に同定するのに使用し得る他の方法が当分野で知られている。例えば、発現ライブラリーを、標識化ＴＹＲＯ３ポリペプチドで探索（probe）し得る。

別の例として、限定するものではなく、ツーハイブリッド系を使用して、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子産物とのタンパク質相互作用をインビボで検出し得る。簡単に述べると、そのような系を利用して、２つのハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドを構築し得る。その一方は、好ましくは、ＴＹＲＯ３（または場合によりＡＸＬもしくはｃＭｅｒ）遺伝子産物に融合した転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む。他方のハイブリッドタンパク質は、好ましくは、第１のハイブリッドで使用した転写活性化タンパク質の活性化ドメインを含み、それは、ｃＤＮＡライブラリーの一部としてプラスミドライブラリーに組み込まれたｃＤＮＡによりコードされる未知のタンパク質に融合されている。ＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミドとｃＤＮＡライブラリーの両方を、レポーター遺伝子（例えば、ＨＢＳ、ｌａｃＺ、ＨＩＳ３またはＧＦＰ）を含有する出芽酵母または他の適する生物の系統に共形質移入し得る。好ましくは、このレポーター遺伝子の調節領域は、２つのハイブリッドタンパク質の転写活性化因子の部分の結合部位を含む。そのようなツーハイブリッド系では、２つのハイブリッドタンパク質のいずれか単独の存在は、レポーター遺伝子の転写を活性化できない。特に、ＤＮＡ結合ドメインのハイブリッドタンパク質は、必要な活性化機能に局在化できないので、転写を活性化できない。同様に、活性化ドメインのハイブリッドタンパク質は、レポーター遺伝子上のＤＮＡ結合部位に局在化できないので、転写を活性化できない。しかしながら、２つのハイブリッドタンパク質間の相互作用は、機能的転写活性化タンパク質を再構成し、レポーター遺伝子の発現をもたらす。故に、ここで記載したもののようなツーハイブリッド系では、ＴＹＲＯ３ポリペプチド（即ち、転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインに融合したＴＹＲＯ３ポリペプチド）と試験ポリペプチド（即ち、転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインに融合したタンパク質）との相互作用は、単純にレポーター遺伝子の遺伝子産物の発現を検出することにより検出し得る。

このようなツーハイブリッドおよび他のアッセイにおけるスクリーニングのためのｃＤＮＡライブラリーは、当分野で知られている任意の適する技法によって作成し得る。特定かつ非限定的な例として、ＧＡＬ４の転写活性化ドメインに翻訳的に融合するようにｃＤＮＡフラグメントをベクターに挿入し得、「ベイト」ＧＡＬ４融合プラスミド（ＴＹＲＯ３遺伝子産物のＧＡＬ４融合体をコードする）と共に、ＧＡＬ４活性化配列を含むプロモーターにより駆動するＨＩＳ３遺伝子を含む出芽酵母または他の適する生物の系統に共形質転換し得る。ＧＡＬ４融合のＴＹＲＯ３ポリペプチド部分と相互作用する、ＧＡＬ４転写活性化ドメインに融合したこのｃＤＮＡライブラリーからのタンパク質は、ＧＡＬ４タンパク質を再構成および活性化し、それによりＨＩＳ３遺伝子の発現を駆動する。ＨＩＳ３遺伝子を発現するコロニーは、半固体寒天をベースとするヒスチジンを欠く培地を含むペトリ皿上での生育により検出し得る。次いで、これらの系統からｃＤＮＡを精製し、配列解読し、ＴＹＲＯ３ポリペプチドと相互作用するコードされているタンパク質を同定するのに使用し得る。

一度本発明のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子または遺伝子産物に結合する化合物を同定したら、これらの方法で記載したスクリーニング方法を、これらの結合化合物に結合する他の化合物（例えば、低分子、ペプチドおよびタンパク質）を同定するのにも使用し得る。そのような化合物は、例えば、天然のリガンドに結合し、その遺伝子産物との相互作用を防止することにより、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバー遺伝子およびその遺伝子産物に関連する生物学的活性を調整するのにも有用であり得る。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのリガンドとの相互作用に干渉する化合物のアッセイ
前記の通り、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーは、１またはそれ以上の分子と（例えば、特異的リガンドと）インビボまたはインビトロで相互作用し得る。従って、この結合相互作用を撹乱するか、または他のやり方で干渉する化合物は、例えば軟骨の分解を含む、このチロシンキナーゼのサブファミリーに関連する生物学的活性または活性群、例えば、チロシンキナーゼ活性、の調整において有用である。従って、そのような化合物は、例えば、ＴＹＲＯ３発現および／または活性の異常なレベルに関連する、ＯＡなどの障害を処置、予防または改善するために有用であり得る。

そのような化合物には、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドに結合する化合物を同定するための前記のスクリーニングアッセイに従って同定される化合物が含まれ、そこで記載される多数の例示的クラスの化合物のいずれもが含まれるが、これらに限定されるものではない。

一般に、遺伝子産物と結合パートナー（例えば、リガンド）との間の相互作用に干渉する化合物を同定するためのアッセイは、遺伝子産物およびその結合パートナーを、遺伝子産物とその結合パートナーが結合して複合体を形成するのに十分な条件および時間で含有する試験反応混合物を調製することを含む。阻害活性（即ち、結合複合体の形成を阻害する、または一度形成された結合複合体を撹乱する能力）について化合物を試験するために、好ましくは、試験化合物も試験反応混合物中に存在する。ある例示的実施態様では、試験化合物は、最初に、遺伝子産物およびその結合パートナーと共に、試験反応混合物に含まれてもよい。しかしながら、あるいは、遺伝子産物およびその結合パートナーの添加に続いて、後で、試験化合物を試験反応混合物に添加してもよい。好ましい実施態様では、試験化合物を含有しない１またはそれ以上の対照反応混合物も調製し得る。典型的には、対照反応混合物は、試験反応混合物にあるのと同じ遺伝子産物および結合パートナーを含有するが、試験化合物を含有しない。対照反応混合物はまた、試験化合物の代わりに、試験反応混合物中に存在しない偽薬を含有してもよい。次いで、遺伝子産物と結合パートナーとの間の複合体の形成を、反応混合物中で検出し得る。試験化合物の非存在下（例えば、対照反応混合物中）でそのような複合体が形成するが、試験化合物の存在下ではしないことは、その試験化合物が遺伝子産物とその結合パートナーの相互作用に干渉するか、またはそれを調整するものであることを示す。

遺伝子産物と結合パートナーの相互作用を調整する化合物についてのそのようなアッセイは、不均質な形式で、あるいは、均質な形式で実行し得る。不均質なアッセイは、典型的には、遺伝子産物または結合パートナーのいずれかを、固相に固着させ、反応終了時に固相に固着した化合物を検出することを含む。従って、そのようなアッセイは、核酸および遺伝子産物の検出および／または同定のための、そしてリガンドの検出または同定のための、前記の固相アッセイに類似する。実際に、当業者は、これらのアッセイために上記した原理および技法の多くを、遺伝子産物と結合パートナーとの間の相互作用（群）を調整する化合物の同定のために、過度の実験をせずに、本明細書に記載した固相アッセイに改変および適用し得ることを認識するであろう。

使用する特定のアッセイに関わらず、例えば、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子産物の結合パートナーとの相互作用に競合により干渉する化合物を同定するために、または、予め形成された結合複合体を撹乱する化合物を同定するために、反応物を反応混合物に添加する順序を変えてもよい。遺伝子産物の結合パートナーとの相互作用に競合により干渉する化合物は、反応を試験化合物の存在下で行うことにより同定し得る。特に、そのようなアッセイでは、試験化合物を、遺伝子産物および結合パートナーに先立ち、またはそれらと同時に、反応混合物に添加し得る。予め形成された遺伝子産物と結合パートナーの複合体を撹乱する試験化合物は、複合体が形成された後に試験化合物を反応混合物に添加することにより試験し得る。

本明細書に記載のスクリーニングアッセイは、全長ＴＹＲＯ３、ＡｘｌもしくはｃＭｅｒポリペプチドまたはタンパク質の部分に相当するペプチドまたはポリペプチドを使用して、または、そのようなペプチドまたはポリペプチド配列を含む融合タンパク質を用いて、実施してもよい。例えば、ＴＹＲＯ３ポリペプチドの結合パートナーとの相互作用を調整する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイは、結合パートナーに結合する全長ＴＹＲＯ３ポリペプチドの特定の領域またはドメイン（例えば、受容体「結合部位」）に相当するペプチドまたはポリペプチドを使用して実施し得る。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドの特定の結合部位を同定するために、当分野で知られている様々な方法を使用し得る。例えば、結合部位は、ＴＹＲＯ３遺伝子を突然変異させ、上記の通りに結合の撹乱をスクリーニングすることにより同定し得る。ＴＹＲＯ３遺伝子の突然変異に起因する撹乱を埋め合わせる突然変異体を同定するために、結合パートナーをコードする遺伝子を、そのようなアッセイで突然変異させてもよい。次いで、これらの突然変異体の配列解析により、２つのタンパク質の結合領域に対応する突然変異を明らかにできる。

代替的実施態様では、タンパク質（例えば、ＴＹＲＯ３タンパク質またはＴＹＲＯ３タンパク質へのタンパク質結合パートナー）を、本明細書で上記した方法を使用して、固体表面または支持体に固着させてもよい。固体表面に固着されたタンパク質に結合する別の標識化タンパク質を、タンパク質分解酵素で処理し、そのフラグメントを前記の結合アッセイの方法に従って固体表面に固着されたタンパク質と相互作用させ得る。洗浄後、処理されたタンパク質の短い標識化されたペプチドフラグメントは、固着したタンパク質と会合したままであり得る。これらのペプチドを単離でき、それらが由来する全長タンパク質の領域をアミノ酸配列により同定し得る。

さらに他の実施態様では、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリペプチドとそれらに対するリガンドとの間の相互作用に干渉する化合物は、そのポリペプチド（例えば、ＴＹＲＯ３ポリペプチドのＦｃ融合コンストラクト）の、それに対する特異的リガンドを発現する細胞への結合を調整する化合物のスクリーニングにより同定してもよい。

診断および予後的適用
前記のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸およびポリペプチド並びにそのような核酸およびポリペプチドに対する抗体などの試薬を使用する診断および予後的適用には、様々な方法を用いることができる。例えば、本明細書に記載の方法を使用して、個体からの生物学的サンプルにおける、例えば、個々の対象または患者から得られるかまたは彼らに由来するサンプル（例えば、生検）中の細胞または組織における、ＴＹＲＯ３サブファミリーの核酸またはタンパク質の発現を検出することが可能である。そのような適用に使用される好ましい細胞または組織は、ＯＡに関与するもの、例えば、軟骨細胞または軟骨、滑液および／または血清などの関節の組織（群）である。上記説明の通り、ＴＹＲＯ３受容体およびそのリガンドのＧＡＳ６は、両方ともそのようなＯＡ細胞および組織において高いレベルで発現される。

故に、本明細書に記載の方法、並びに当分野で知られている他の方法を使用して、当業者は、個体からの細胞または組織のサンプルにおけるＴＹＲＯ３またはＧＡＳ６の核酸またはポリペプチドのレベルの上昇を検出し得、それによりそのサンプル中の細胞または組織をＯＡの徴候のあるものとして検出および／または同定し得る。ある種の好ましい実施態様では、かかる方法で同定される特定のタイプの組織は、軟骨組織である。かかる方法を使用して個体中のそのような細胞または組織を検出することにより、技術のある使用者は、それによりその個体中のＯＡの存在を診断し得る。好ましい実施態様では、本明細書に記載の方法は、予めひとまとめにされた診断キットを使用して実施する。そのようなキットは、少なくとも１つの特異的ＴＹＲＯ３核酸またはＴＹＲＯ３遺伝子産物に特異的な抗体の試薬を含み得る。例えば、該診断キットは、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子または遺伝子産物のｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルの検出に使用し得、該キットは、（ａ）ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのポリヌクレオチドまたはそのフラグメント；（ｂ）（ａ）のものに相補的なヌクレオチド配列；（ｃ）該ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子の発現産物またはそのフラグメント；または、（ｄ）該発現産物に対する抗体を含み、ここで、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が実質的成分（substantial component）を構成し得る。

好ましい実施態様では、キットは、その使用のための、例えば、疾患のある細胞または組織を検出するための、または、ＴＹＲＯ３遺伝子または遺伝子産物の異常な発現に関連するＯＡなどの障害を診断するための、指示書も含む。好ましい実施態様では、かかる指示書は、キットに直接包装されていてもよい。しかしながら、他の実施態様では、指示書は別に提供されてもよい。例えば、本発明は、キットを使用するための指示書を、例えばインターネットからダウンロードし得る、キットの実施態様を提供する。本発明のキットは、また、好ましくは分離した容器に、試薬（例えば、ＴＹＲＯ３遺伝子または遺伝子産物に特異的な核酸または抗体）を使用してＴＹＲＯ３遺伝子または遺伝子産物を検出するために適するバッファーおよび他の溶液を含み得る。キットおよびそこに含まれる任意の試薬（群）は、例えば、ＯＡを示すか、または有すると疑われる患者を診断するために、臨床的に設定して使用し得る。

かかる診断方法では、ＴＹＲＯ３遺伝子が発現されるいかなる細胞タイプの細胞またはいかなる組織タイプの組織を含むサンプルも、例えば、ＴＹＲＯ３遺伝子発現またはＴＹＲＯ３遺伝子産物（ＴＹＲＯ３ポリペプチドなど）の検出、並びにＴＹＲＯ３遺伝子またはＴＹＲＯ３遺伝子産物を発現する細胞（例えば軟骨細胞）の同定のために、使用し得る。従って、ある実施態様では、本明細書に記載の方法は、例えば、生検中のものなどの個体から得られる細胞または組織を使用して、インサイチュで実施し得る。

本明細書に記載の方法は、診断的適用に限定されないが、例えば、ＴＹＲＯ３サブファミリーの遺伝子または遺伝子産物の異常な発現に関連するＯＡなどの疾患の進行をモニターするために、または、そのための治療をモニターするために、予後的適用でも使用し得る。従って、本発明の予後方法は、ある例示的実施態様では、ＯＡの処置または治療、例えば、薬物処置または運動療法の過程で、個体におけるＴＹＲＯ３核酸またはポリペプチドのレベルをモニターすることを含み得る。同様に、本発明の方法は、治療の過程で、疾患のある細胞および組織の、例えば、非ＯＡ細胞または組織と比較して、ＴＹＲＯ３を過剰発現している細胞の、検出および同定にも使用し得る。そのような実施態様では、疾患のある細胞数の減少は、一般的に、効果的な処置を示すものである。本発明の方法は、さらに、例えば、候補薬物または化合物をスクリーニングし、例えば抗ＯＡ薬物として有効であり得るものを同定するために使用し得る。そのような方法は、例えば動物モデルを使用してインビボで、または、例えば細胞培養アッセイにおいてインビトロで、実施し得る。ある実施態様では、そのような方法は、試験化合物を細胞に接触させ、その細胞によるＴＹＲＯ３遺伝子または遺伝子産物の発現が阻害されたか否かを同定することを含み得る。別の実施態様では、試験化合物を細胞に接触させるか、または生物に投与し、例えば、細胞培養アッセイでは細胞培養培地中、または、動物モデルアッセイでは、組織、血液または他の体液中で、ＴＹＲＯ３核酸またはポリペプチドの細胞外レベルを測定し得る。

ＴＹＲＯ３サブファミリーの核酸の検出
本発明の診断および予後方法には、ＴＹＲＯ３サブファミリー、好ましくはＴＹＲＯ３の遺伝子発現レベルのアッセイ方法が含まれる。当分野で知られている様々な方法を使用して、サンプル中の核酸配列のアッセイレベルを検出し得る。例えば、特定の遺伝子を発現すると知られているか、または疑われる細胞タイプまたは組織からのＲＮＡを単離し得、当分野で知られているハイブリダイゼーションまたはＰＣＲの技法を利用して試験し得る。単離する細胞は、例えば、細胞培養または個体に由来する細胞であり得る。細胞培養から採られた細胞の分析は、例えば、遺伝子の発現に対する化合物の効果を試験するのに、あるいは、その細胞が関心のある遺伝子を発現する特定の細胞タイプのものであることを確認するのに、有用であり得る。

一例として、限定的ではなく、例えばＴＹＲＯ３核酸を検出するための診断方法は、サンプルから得られた核酸（組換えＤＮＡ分子、クローン化した遺伝子またはそれらの変性した変異体を含む）を、組換えＴＹＲＯ３ＤＮＡ分子、クローン化した遺伝子またはそれらの変性した変異体などの１またはそれ以上の標識化核酸試薬と、これらの試薬がサンプル核酸中のそれらに相補的な配列に特異的にアニーリングまたはハイブリダイズするのに好都合な条件下で接触させ、インキュベートすることを含み得る。インキュベーション後、全てのアニーリングしていないか、またはハイブリダイズしていない核酸を除去する。ハイブリダイズした核酸の存在を、そのような分子が存在するならば、次いで検出し、核酸試薬がアニーリングしたＴＹＲＯ３核酸配列のレベルを、対照サンプルから、例えば、正常な非ＯＡ細胞または組織のサンプルから予想されるアニーリングのパターンまたはレベルと比較して、ＴＹＲＯ３核酸が上昇したレベルで発現されているか否かを判定し得る。

このような検出計画の好ましい実施態様では、関心のある細胞タイプまたは組織からの核酸を、例えば、メンブレンまたはプラスチックの表面（例えば、ナイロンメンブレン、マイクロタイタープレートまたはポリスチレンビーズ）などの固体支持体に固定し得る。インキュベーション後、アニーリングしていない標識化ＴＹＲＯ３サブファミリーの核酸試薬を容易に除去し得、残っているアニーリングした標識化ＴＹＲＯ３サブファミリーの核酸試薬の検出を、当分野で周知の標準的技法を使用して達成し得る。

患者のサンプルまたは他の細胞または組織供給源中のＴＹＲＯ３サブファミリーの核酸を検出するための代替的診断方法は、例えば、ＰＣＲ（例えば、米国特許第４,６８３,２０２号に教示の実験の実施態様を参照）によるそれらの増幅と、それに続く、当業者に周知の技法を使用する増幅された分子の検出を含み得る。得られる増幅されたＴＹＲＯ３サブファミリーの核酸のレベルを、増幅されたサンプルが正常細胞または組織のように正常レベルだけのＴＹＲＯ３サブファミリーの核酸（群）を含有する場合に予想されるレベル、例えば健康な軟骨細胞におけるレベルと比較して、上昇したレベルのいずれかのＴＹＲＯ３サブファミリーの核酸（群）が発現されたか否かを判定し得る。

そのような検出計画のある好ましい実施態様では、関心のあるＲＮＡ分子から、例えば逆転写により、ｃＤＮＡ分子を合成する。次いで、ｃＤＮＡ内の配列を、ＰＣＲなどの核酸増幅反応の鋳型として使用し得る。そのようなアッセイの逆転写および増幅段階で合成開始試薬として使用される核酸試薬、例えばプライマーは、好ましくは、本明細書に記載のＴＹＲＯ３サブファミリーの核酸配列から選択されるか、またはそれらのフラグメントである。好ましくは、核酸試薬は、少なくとも約９ないし３０ヌクレオチドの長さである。増幅は、検出のために、例えば放射性標識化または蛍光標識化したヌクレオチドを使用して、実施し得る。あるいは、産物を標準的臭化エチジウムまたは他の染色方法により可視化できるように、十分に増幅された産物を作成し得る。

本発明のＴＹＲＯ３サブファミリーの遺伝子発現アッセイを、インサイチュで、即ち、固定および／または凍結されていてもよい患者の組織の組織切片上で直接実施し、それにより核酸精製の必要をなくしてもよい。ＴＹＲＯ３サブファミリーの核酸試薬は、そのようなインサイチュ操作用のプローブまたはプライマーとして使用し得る。例えば、Nuovo, PCR In Situ Hybridization: Protocols And Application, Raven Press, NY (1992) 参照。あるいは、十分量の適切な細胞を入手できるならば、標準的ノザン分析を実施して、ＴＹＲＯ３サブファミリーのｍＲＮＡのレベルを検出することにより、ＴＹＲＯ３サブファミリーの遺伝子発現レベルを判定できる。

ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子産物の検出
本発明の診断および予後方法はまた、機能的に保存された変異体およびそのフラグメントを含むＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのタンパク質または他のポリペプチドのレベルを検出することを含むものも包含する。例えば、無傷の野生型または突然変異体のＴＹＲＯ３（またはＡｘｌもしくはｃＭｅｒ）遺伝子産物に対する、または、ＴＹＲＯ３遺伝子産物の機能的に保存された変異体またはペプチドフラグメントに対する抗体を、診断および予後試薬として使用し得る。そのような試薬は、例えば、ＴＹＲＯ３遺伝子産物の合成または発現レベルの異常の検出、または、ＴＹＲＯ３サブファミリーの遺伝子産物の構造、時間的発現もしくは生理的局在の異常の検出に使用し得る。本明細書中で記載するもののような抗体および免疫アッセイの方法も、例えばＯＡの処置の有効性を評価するための重要なインビトロ適用を有する。例えば、抗体または抗体のフラグメントを、ＴＹＲＯ３の発現およびＴＹＲＯ３ポリペプチドの産生に対する化合物の効果を確かめるために、潜在的治療化合物のインビトロでのスクリーニングに使用できる。かかるアッセイを使用して、異常なＴＹＲＯ３サブファミリーの発現に関連する障害に有利な効果を有し得る化合物を同定でき、そのような化合物の治療的有効用量を判定し得る。

一例として、例えば、蛍光標識化抗体を、光学顕微鏡、流動細胞計測法または蛍光定量的検出方法と組み合わせて用いる免疫蛍光技法により、抗体または抗体のフラグメントを使用して、ＴＹＲＯ３サブファミリーの遺伝子産物、該遺伝子産物の変異体、またはそれらのフラグメントの存在を検出し得る。

特に好ましい実施態様では、抗体またはそのフラグメントを、組織学的にも、例えば、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡技法において、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子産物のインサイチュでの検出のために用い得る。インサイチュでの検出は、患者から組織学的試料、例えば組織サンプルを取り、そこに本発明の標識化抗体またはそのような抗体のフラグメントを適用することにより達成し得る。抗体または抗体フラグメントは、好ましくは、標識化抗体または抗体フラグメントを生物学的サンプルに重ねることにより適用する。そのような操作の使用を介して、例えばＴＹＲＯ３サブファミリーの遺伝子産物の存在だけでなく、調べた組織におけるその遺伝子産物の分布も検出することが可能である。当分野で周知の幅広い様々な組織学的方法、例えば染色操作を、当業者は、かかるインサイチュでの検出を達成するために、過度の実験をせずに容易に改変できる。

遺伝子産物の同定に有用な免疫アッセイは、典型的には、生物学的サンプル、例えば組織抽出物を、例えば、機能的に保存された変異体またはそのペプチドフラグメントを含む関心のある遺伝子産物に特異的に結合する能力のある、検出可能に標識化した抗体の存在下でインキュベートすることを含む。次いで、結合した抗体を、当分野で周知の数々の技法のいずれかにより検出し得る。

治療方法および医薬組成物
ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸およびポリペプチド、それらの調整物質（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害因子）並びにそれらに特異的な抗体は、例えば、異常な（好ましくは上昇した）レベルのＴＹＲＯ３の発現と関連する疾患および障害、例えばＯＡを、処置、予防または改善するための、治療方法および組成物においても使用し得、医薬として、または薬剤の製造において使用し得る。

従って、ある好ましい実施態様では、本発明の治療方法は、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの発現または活性を調整、例えば阻害する、１またはそれ以上の化合物または調整物質、例えば、本発明のＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸またはポリペプチドに結合する化合物、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子の発現を調整する化合物、および／またはＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸またはポリペプチドの、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーに特異的なリガンドなどの結合パートナー、例えば、ＰＲＯＳ１またはＧＡＳ６、との結合に干渉するか、または調整する化合物を含む、医薬組成物を投与することを含む。

別の好ましい実施態様では、本発明の治療方法は、化合物、例えば、薬物、プロドラッグ、毒素または細胞毒を、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸またはポリペプチドを発現している細胞に標的化する、１またはそれ以上の細胞標的化療法を含み得る。

阻害アプローチ
代替的実施態様では、本発明は、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子またはその遺伝子産物の発現または活性を調整する（例えば、増加または減少させる）ことによる、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子または遺伝子産物の異常な発現または活性と関連する疾患または障害、例えばＯＡを、処置するための方法および組成物を提供する。そのような方法は、単純に、例えばＴＹＲＯ３、ＡＸＬまたはｃＭｅｒ遺伝子の発現、合成または活性を調整する１またはそれ以上の化合物を投与することを含み得る。好ましくは、これらの１またはそれ以上の化合物は、障害の１またはそれ以上の症状が除去されるか、少なくとも改善されるまで投与する。

関心のあるＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸の活性、発現または合成を調整する能力を示し得る化合物には、アンチセンス分子がある。そのような分子は、野生型核酸およびポリペプチドを低減または阻害するために設計し得るか、または、突然変異体の核酸またはポリペプチドを標的化し得る。アンチセンス分子はまた、リガンドの核酸の発現を阻害するのにも使用し得る。

アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズし、タンパク質の翻訳を防止することにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接防止するのに作用する。アンチセンスのアプローチは、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドの設計を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を防止する。絶対的な相補性は、好ましいが、必要ではない。この説明で使用するとき、「アンチセンス」は、広くＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、三重らせん相互作用、リボザイムおよびＲＮａｓｅ−Ｈ介在性停止を含む。アンチセンス核酸分子は、細胞での発現のために、組換え遺伝子によりコードされ得る（例えば、米国特許第５,８１４,５００号および第５,８１１,２３４号参照）か、あるいは、合成的に調製できる（米国特許第５,７８０,６０７号参照）。

ある核酸の一部に「相補的」な配列は、その核酸とハイブリダイズして安定な二本鎖を形成できるのに十分な相補性を有する配列を表す。核酸がハイブリダイズする能力は、配列の相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。しかしながら、一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、より多くの塩基ミスマッチを含有し、かつ依然として安定な二本鎖（または、三重らせんの方法では、三重鎖）を形成し得る。許容し得るミスマッチの程度は、例えば、ハイブリダイズした複合体の融点を判定する標準的操作の使用により、容易に確認できる。

ある好ましい実施態様では、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの遺伝子の非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドを、内在性ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害するために、アンチセンスのアプローチで使用し得る。アンチセンス核酸は、好ましくは、少なくとも６ヌクレオチドの長さ、そしてより好ましくは、約６ないし約５０ヌクレオチドの長さの範囲にある。具体的実施態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも５０ヌクレオチドの長さであり得る。

一般的に、インビトロの研究を最初に実施し、遺伝子発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量するのが好ましい。これらの研究は、アンチセンスの遺伝子阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的生物学的効果とを区別する対照を利用するのが好ましい。これらの研究が、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを、内部対照ＲＮＡまたはタンパク質のものと比較するのも好ましい。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して得られた結果を、対照オリゴヌクレオチドを使用して得られたものと比較することが構想される。対照オリゴヌクレオチドは、試験オリゴヌクレオチドとおおよそ同じ長さであり、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的ｍＲＮＡ配列への特異的ハイブリダイゼーションを防止するのに必要なだけ、アンチセンス配列と異なるのが好ましい。

標的遺伝子のコード領域の配列のどの部分に相補的なアンチセンスヌクレオチドも使用し得るが、転写され、翻訳されない領域に相補的なものが最も好ましい。

アンチセンス分子は、好ましくは、標的遺伝子をインビボで発現する軟骨細胞などの細胞に送達される。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達するための数々の方法が開発されてきた。例えば、アンチセンス分子を組織の部位に直接、例えば、腫瘍に直接、注射できるか、または、修飾したアンチセンス分子を、所望の細胞を標的化するように設計でき、例えば、標的細胞の表面に発現される受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結したアンチセンスを、全身的に投与できる。

好ましい実施態様は、内在性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンス核酸分子の細胞内濃度を達成する。例えば、ある好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下に置かれる組換えＤＮＡコンストラクトを使用する。標的細胞に形質移入するためのかかるコンストラクトの使用は、内在性標的遺伝子転写物と相補的塩基対を形成する十分な量の一本鎖ＲＮＡの転写をもたらし、それにより標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を防止する。例えば、上記のようなベクターは、例えば、細胞に取り込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写を導くように導入できる。そのようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生できる限り、エピソームに留まっても、染色体に組み込まれてもよい。そのようなベクターは、当分野で標準的な組換えＤＮＡ技術の方法により構築できる。ベクターは、哺乳動物細胞での複製および発現に使用される、プラスミド、ウイルスまたは当分野で知られる他のものであり得る。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、特定の細胞タイプで、例えば造血細胞で、作用すると当分野で知られているいかなるプロモーターによるものでもよい。例えば、組換えＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーの核酸の発現に関して前記で議論したプロモーターのいずれも、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのアンチセンス核酸の発現にも使用できる。

アンチセンス技術に加えて、ＲＮＡアプタマー（Good et al., Gene Ther., Vol. 4, pp. 45-54 (1997) 参照）、二本鎖ＲＮＡ（ＷＯ９９／３２６１９）、リボザイム（Cech, Amer. Med Assn., Vol. 260, p. 3030 (1988); Cotton et al., EMBO J., Vol. 8, pp. 3861-3866 (1989); Grassi and Marini, Ann. Med., Vol. 28, pp. 499-510 (1996) および Gibson, Cancer Metast. Rev., Vol. 15, pp. 287-299 (1996) 参照）および／または三重らせんＤＮＡ（Gee et al., Molecular and Immunologic Approaches, Huber and Carr, Eds., Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY (1994) 参照）を使用して、当業者になじみのある方法に従い、標的核酸の活性、発現または合成を調整し得る。

あるいは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子も、関心のあるポリペプチドまたはリガンドの核酸の発現を阻害するのに使用できる。ＲＮＡ干渉は、外来性の短いＲＮＡ二本鎖を投与する方法であり、ここで、一方の鎖は、標的ｍＲＮＡのコード領域に相当する。Elbashir et al., Nature, Vol. 411, pp. 494-498 (2001) 参照。細胞に入ると、ｓｉＲＮＡ分子は、外来性ＲＮＡ二本鎖のみならず、内在性メッセンジャーＲＮＡを含む同一配列を有する一本鎖ＲＮＡの分解も引き起こす。従って、ｓｉＲＮＡは、この技法が触媒的メカニズムを介して作用すると考えられるので、伝統的なアンチセンスＲＮＡの方法論よりも強力かつ有効であり得る。

好ましいｓｉＲＮＡ分子は、典型的には、約１９ヌクレオチドより長く、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーまたはそのリガンドの核酸配列を含む。ｓｉＲＮＡを標的細胞に送達するための有効な戦略には、アンチセンス核酸の送達のために前記したいずれの方法も含まれる。例えば、ｓｉＲＮＡは、物理的または化学的形質移入を使用する形質導入により細胞に導入できる。あるいは、ｓｉＲＮＡは、例えば、機能的ｓｉＲＮＡまたはその前駆体の転写を可能にする様々なＰｏｌ ＩＩＩプロモーター発現カセットを使用して、細胞に発現させ得る。例えば、Scherr et al., Curr. Med. Chem., Vol. 10, No. 3, pp. 245-256 (2003); Turki et al., Hum. Gene Ther., Vol. 13, No. 18, pp. 2197-2201 (2002); and Cornell et al., Nat. Struct. Biol., Vol. 10, No. 2, pp. 91-92 (2003) 参照。

医薬製剤
本発明の治療方法で使用される組成物は、異常なＴＹＲＯ３サブファミリーの遺伝子発現および／または活性と関連するＯＡなどの疾患または障害を処置するための治療的有効用量で、例えば、インビトロまたはエクスビボで細胞培養に、または、より好ましくは、インビボで個体に、投与し得る。例えば、上記のようなスクリーニング方法で同定された化合物を含む、本発明のＴＹＲＯ３サブファミリーの遺伝子または遺伝子産物に結合する化合物は、その遺伝子または遺伝子産物の発現および／または活性が阻害されるように、細胞または個体に投与し得る。従って、本発明は、例えば、異常なＴＹＲＯ３サブファミリーの遺伝子発現または活性に関連する、ＯＡを含む障害を処置するための治療用化合物として使用するための、医薬製剤も提供する。

用語「治療的有効用量」および「有効量」は、治療応答をもたらすのに十分な化合物の量を表す。薬物または毒素などの化合物が、例えば特異的抗体との複合体で投与される実施態様では、用語「治療的有効用量」および「有効量」は、治療応答をもたらすのに十分な複合体の量を表し得る。治療応答は、医師などの使用者が、治療への有効な応答と認識するであろういかなる応答でもあり得る。従って、治療応答は、一般的に、疾患または障害の１またはそれ以上の症状の改善である。好ましい実施態様では、医薬製剤がＯＡの処置に使用される場合、治療応答は、例えば、処置中の患者の生検中の、観察される軟骨分解量の減少であり得る。

化合物の毒性および治療有効性は、例えば、細胞培養アッセイにおいて、または実験動物を使用して、ＬＤ_５０およびＥＤ_５０を判定する標準的医薬操作により判定できる。パラメーターＬＤ_５０およびＥＤ_５０は、当分野で周知であり、各々、集団の５０％に致死的である、そして、集団の５０％で治療的に有効である、化合物の用量を表す。毒性と治療効果の用量比は治療係数と呼ばれ、比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０として表現し得る。大きい治療係数を示す化合物が好ましい。

毒性の副作用を示す化合物を使用し得るが、しかしながら、そのような場合、起こりえる他の細胞、組織または器官への損傷を最小にし、副作用を減らすために、そのような化合物を冒された組織の部位に特異的に標的化する送達系を使用するのが特に好ましい。

細胞培養アッセイまたは動物研究から得られたデータを、ヒトで使用するための投与量の範囲を決定するのに使用し得る。本発明の治療方法で使用する化合物の投与量は、好ましくは、ＥＤ_５０濃度を含むが、殆どまたは全く毒性のない、例えば、ＬＤ_５０濃度より低い、循環濃度の範囲内にある。任意の適用で使用される具体的投与量は、用いる具体的投与形、利用する投与経路、患者などの個体の状態などの要因に応じて、この範囲内で変動し得る。

治療的有効用量は、ＩＣ_５０を含む循環濃度範囲を達成するために、最初に細胞培養アッセイから見積もられ、動物モデルで公式化され得る。化合物のＩＣ_５０濃度は、例えば、細胞培養アッセイから判定される通り、最大の半分の症状の阻害を達成する濃度である。次いで、特定の個体で、例えばヒトの患者で使用するための適切な投与量を、そのような情報を使用してより厳密に判定し得る。

血漿中の化合物の測定値は、患者などの個体中で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフィーなどの技法により、日常的に測定し得る。

本発明に従い使用するための医薬組成物は、１またはそれ以上の生理的に許容し得る担体または賦形剤を使用して、常套のやり方で製剤化し得る。

従って、化合物およびそれらの生理的に許容し得る塩および溶媒和物は、吸入またはガス注入（口または鼻のいずれかを通して）、または経口、頬側、非経腸もしくは直腸投与により投与するために製剤化し得る。

経口投与のために、医薬組成物は、例えば、結合剤、例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース；増量剤、例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ；崩壊剤、例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム；または湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなどの医薬的に許容し得る賦形剤を用いて常套の手段で製造される錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当分野で周知の方法により被覆し得る。経口投与用の液体製剤は、例えば、液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態をとり得るか、または、それらは水または他の適する媒体により使用前に構成するための乾燥製品として与えられ得る。そのような液体製剤は、懸濁化剤、例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用油脂；乳化剤、例えば、レシチンまたはアカシア；非水性媒体、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画した植物油；および防腐剤、例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸などの医薬的に許容し得る添加物を用いて、常套の手段で製造し得る。製剤は、適するならば、バッファーの塩、風味剤、着色剤および甘味料も含有してもよい。

経口投与用の製剤は、活性化合物の制御放出をもたらすように、適切に製剤化し得る。頬側投与のために、組成物は、常套のやり方で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。吸入による投与のために、本発明に従い使用するための化合物は、エアゾルスプレー製剤の形態で、加圧パックまたは噴霧器から、適する噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適するガスを用いて、好都合に送達される。加圧エアゾル剤の場合、投与単位は、計量された量を送達するバルブを提供することにより決定し得る。化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適する粉末基剤の粉末混合物を含有する、吸入器またはガス注入器で使用するための、例えばゼラチンのカプセル剤およびカートリッジを製剤化し得る。

注射による、例えばボーラス注射または継続的点滴による非経腸投与用に、化合物を製剤化し得る。注射用の製剤は、防腐剤を添加して、例えばアンプルまたは複数用量の容器中の単位剤型で与えられ得る。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁剤、液剤または乳剤などの形態をとり得、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤（formulatory agent）を含有し得る。あるいは、有効成分は、適する媒体で、例えば滅菌されたパイロジェンを含まない水で、使用前に構成するための粉末形態であり得る。

化合物は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリド類などの常套の坐剤基剤を含有する、坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物にも製剤化し得る。

以前に記載した製剤に加えて、化合物をデポー製剤としても製剤化し得る。そのような長期作用製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与し得る。従って、例えば、適する重合性または疎水性材料（例えば許容し得る油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂を用いて、またはやや溶けにくい（sparingly soluble）誘導体として、例えば、やや溶けにくい塩として、化合物を製剤化し得る。

所望により、組成物は、有効成分を含有する１またはそれ以上の単位剤型を含有し得る包装またはディスペンサー装置中に与えられ得る。包装は、例えば、ブリスター包装などの金属またはプラスチックの箔を含み得る。包装またはディスペンサー装置は、投与の指示書を伴ってもよい。

特許、特許出願および様々な刊行物を含む多数の参照文献を、本発明の説明において引用し、議論する。このような参照文献の引用および／または議論は、本発明の説明を明確にするためにのみ提供され、そのような参照文献のいずれも本明細書に記載の本発明の「先行技術」であることを認めるものではない。本明細書で引用し、議論する全参照文献（ＧｅｎＢａｎｋまたは他の公的データベースに寄託された生物学的配列への参照を含む）を、各参照文献を個々に出典明示により本明細書の一部とするのと同程度に、出典明示によりそれらの全体を本明細書の一部とする。

実施例
また、以下の実施例を利用して本発明を記載する。しかしながら、明細書のどこでこれらまたは他の実施例を使用しても、例示的なだけであり、決して本発明または例示されたいかなる用語の範囲および意味を限定するものではない。同様に、本発明は、本明細書に記載のいかなる特定の好ましい実施態様にも限定されない。実際に、当業者には、本明細書を読めば本発明の多くの改変および変形が明らかであり、その精神と範囲を逸脱せずにそれを成すことができる。

実施例１
ＯＡマーカー遺伝子
以下の材料と方法を使用して下記の実施例を実施する:
全長ｃＤＮＡクローンからのプラスミドＤＮＡの調製
ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６ベクター中の全長ＴＹＲＯ３ ＯＡ ｃＤＮＡを含有する細菌ストックを、深い９６ウェルのブロック（Qiagen, Valencia, CA）中で増殖させる。各ウェルは、Terrific ブロス (Sigma, St. Louis, MO) １.０ｍＬおよびアンピシリン（４０μｇ／ｍＬ）を含有する。培養物は、最初に２４時間３７℃で、３００ＲＰＭで震盪しながら増殖させ、新しいブロックに再播種し、さらに終夜増殖させ、確実に全ウェルで細菌が均一に増殖するようにする。製造業者により記載された標準的プロトコールに従い、Biorobot 8000 (Qiagen, Valencia CA）を用いて細菌からプラスミドＤＮＡを単離する。

全長ｃＤＮＡクローンのＧＡＴＥＷＡＹ^（商標）移動
ＴＹＲＯ３をＲＴ−ＰＣＲアッセイで試験するために、ＴＹＲＯ３のｃＤＮＡを、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６ベクターからレトロウイルスベクターにＧＡＴＥＷＡＹ^（商標）プラットフォーム（Invitrogen, Carlsbad, CA）を使用して移動させる。

ＧＡＴＥＷＡＹ ＢＰ反応を以下の通りに実行する。簡単に述べると、プラスミドＤＮＡ１.０μＬ（１００−１２０ｎｇ）を、ｐＤＯＮＲ２０１エントリーベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）１μＬ（１００−１２０ｎｇ）、ＢＰ反応バッファー（Invitrogen, Carlsbad, CA）１μＬ、ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ１μＬおよび BP Clonase 酵素混合物（Invitrogen, Carlsbad, CA）１μＬを含有する氷上のマイクロタイターウェルに添加する。マイクロタイタープレートを２５℃で３日間インキュベートする。

０.７５Ｍ ＮａＣｌ０.２５μＬ、線状化レトロウイルスベクター１.０μＬ（１００−１２０ｎｇ）および LR Clonase 酵素混合物（Invitrogen, Carlsbad, CA）１.５μＬからなるＧＡＴＥＷＡＹ ＬＲ 反応混合物を、ＢＰ反応に添加する。この研究で使用するレトロウイルスベクターは、ハイブリッドＣＭＶ／Moloney マウス白血病ウイルス５'ＬＴＲ、Moloney マウス白血病ウイルス３'ＬＴＲおよびレトロウイルスパッケージングΨ部位を含有し、常套の方法に従って構築した。また、同じベクターを購入できる（Clontech）。サンプルを徹底的に混合し、さらに２時間２５℃でインキュベートする。１０分の１量（０.８μＬ；２ｍｇ／ｍＬ）のプロテアーゼＫ溶液（Invitrogen, Carlsbad, CA）を添加し、３７℃で１０分間インキュベートする。

最大効率のＤＨ５α細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA）４０μＬを、氷上の平底９６ウェルブロック（Qiagen, Valencia, CA）のウェルに分注する。次いで、ＬＲ反応混合物１μＬを細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートする。細胞に３０秒間４２℃で熱ショックを与え、氷上に１−２分間置き、Ｓ.Ｏ.Ｃ.培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）６５μＬを各ウェルに添加する。９６ウェルブロックを３７℃で１時間、震盪しながらインキュベートする。最終形質転換混合物３５μＬを、４０μｇ／ｍＬゼオシン（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含むＬＢ寒天の入ったマイクロタイターウェルに添加し、３７℃で終夜増殖させる。

単一のコロニーを９６ウェル形式の Terrific ブロス／ゼオシン（４０μｇ／ｍＬ）１ｍＬに播種し、３７℃、ロータリーシェーカー中、３００ＲＰＭで終夜増殖させる。製造業者により記載された標準的プロトコールに従い、Biorobot 8000 (Qiagen, Valencia, CA）を使用してプラスミドＤＮＡを単離する。

上清の産生
ＧＰ２−２９３パッケージング細胞（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）を９６ウェルＰＤＬプレート（BD Biosciences Clontech, Palo Alto CA）に、形質転換の１６−２４時間前に、１０％ＦＢＳ（Invitrogen, Carlsbad CA）を含有する抗生物質を含まないＤＭＥＭ中に播く（５ｘ１０^４細胞／ウェル）。総体積２５μＬのＯＰＴＩＭＥＭ（Invitrogen, Calsbad CA）中、９６ウェル形式で、ＧＡＴＥＷＡＹ^（商標）コンストラクト１５０ｎｇをエンベローププラスミド１５０ｎｇと合わせることにより、ＧＡＴＥＷＡＹ^（商標）コンストラクト並びにエンベロープベクターｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇ（Stratagene, La Jolla CA）を、パッケージング細胞に同時形質移入する。別のプレートで、ＯＰＴＩＭＥＭ^（商標）２５μＬを Lipofectamine 2000 試薬 (Invitrogen, Carlsbad CA）１μＬと合わせる。この第２の溶液を５分間室温でインキュベートし、次いで２つの溶液を合わせる。細胞に添加する前に、２０分間、ＤＮＡ−リポフェクタミン複合体を形成させる。形質移入操作の１６−２４時間後に、抗生物質を含有する完全培地に培地を置き換える。ウイルス上清を含有する培地を、形質移入の２４および４８時間後に集める。

初代軟骨細胞への形質導入
初代軟骨細胞（関節置換手術から得られた軟骨組織から単離、Mullenberg Hospital, Plainfield, NJ）を、形質導入の２４時間前に、９６−ウェルプレートに二重に（in duplicates）、１.１ｘ１０^４細胞／ウェルで播く。形質導入時に、培地をウイルス上清１００μＬ並びに２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１６μｇ／ｍＬポリブレンを添加した完全培地１００μＬで置き換える。細胞をスイングバケットローター中、３２℃、１０００ｘｇで、１.５時間遠心分離する。培地を１６−２４時間後に新鮮な培地と置き換え、細胞をさらに４８時間インキュベートする。

ＲＮＡの単離とＲＴ−ＰＣＲ
貯めておいた二重の９６−ウェルプレートから、BioRobot 8000 (Qiagen, Valencia CA) および Qiagen RNeasy 96 Biorobot 試薬を製造業者の指示に従って使用して、総細胞ＲＮＡを単離する。Qiagen (Valencia CA）により公開されている標準的プロトコールに準じてカラム上でのＤＮａｓｅＩ切断を用い、混入しているゲノムＤＮＡを除去する。第１の鎖のｃＤＮＡを、ランダムプライマーを使用して、High-Capacity cDNA Archive キット (PE Applied Biosystems, Foster City CA）で、１００μＬ反応容量で合成する。リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を３８４−ウェル形式で、ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City CA）上で実施する。ｃＤＮＡの鋳型およびＰＣＲ混合物を、Biomek FX 液体操作自動装置を使用して分配する。２０μＬの反応は、ｃＤＮＡ５μＬ、２００ｎＭフォワードおよびリバースプライマー、および SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City CA）を含有する。初期設定のサイクリングプログラム（９５℃−１０分間、９５℃−１５秒間を４０サイクル、６０℃−１分間）に続いて、解離段階を行い、それにより融解曲線を生成してＰＣＲ産物の特異性とプライマーダイマーの不在を確認する。

下記表１は、当業者になじみのある例示的ＯＡ「マーカー遺伝子」を特定する。特に、このアッセイで使用される「マーカー遺伝子」の各々は、軟骨細胞においてＯＡに関連する遺伝子である。各マーカー遺伝子について、例示的ヌクレオチド配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号も提供する。

ＲＴ−ＰＣＲ実験は、表Ｉで特定されるプライマー（初期設定のパラメーターおよび反応条件下で Primer Express ソフトウエア (Applied Biosystems, Foster City, CA) を用いて設計する）を使用して列挙した遺伝子の各々を増幅する。加えて、遺伝子ＧＡＰＤＨ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ ００５３７１）を、普遍的に発現される「ハウスキーピング」遺伝子として選択し、それに対して全サンプルを標準化する。

受動的基準としてＲＯＸ染料 (Applied Biosystems, Foster City, CA) を使用し、蛍光シグナル中のＰＣＲに関係のないゆらぎを標準化する。製造者の指示に従い、標準物質サンプル（即ち、他の全部をそれと比較するサンプル）を利用する比較Ｃ_ｔ法を使用し、遺伝子発現の変化を算出する。他の全サンプルの発現レベルを、標準物質サンプルについて測定された発現レベルの倍数として定義するように、標準物質サンプルの値を１.０として標準化する。この実施例で記載するＲＴ−ＰＣＲ実験では、ｃＤＮＡ挿入を含有しないレトロウイルスベクターを標準物質サンプルとして使用する。簡単に述べると、標準物質ｍＲＮＡと比較した標的ｍＲＮＡの量は、式：２^{−ΔΔＣｔ}（式中、Ｃｔ＝閾値サイクル（増幅された標的の量が固定された閾値に達するサイクル数））に従って算出する。

細胞の処理
ＲＴ−ＰＣＲ条件を最適化し、この試験で選択されるマーカーを確認するために、関節置換手術で得られた膝関節の軟骨からのヒト関節の軟骨細胞を、１０％ＦＢＳ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含有するＤＭＥＭ培地を使用して、９６ウェルプレート（１１,０００細胞／ウェル）に播いた。２日後、細胞をＩＬ−１（５ｎｇ／ｍＬ；Peprotech, UK, London）およびＯＳＭ（５０ｎｇ／ｍＬ）またはＰＤＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）またはＴＧＦ−β（５０ｎｇ／ｍＬ）で終夜、無血清培地中で処理する。ＯＳＭ、ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−βは、R&D systems (Minneapolis, MN）から購入する。これらの細胞からＲＮＡを単離し、上記の方法を使用してＲＴ−ＰＣＲにより評価する。

ＥＬＩＳＡ
Amersham (Piscataway, NJ) のヒト MMP13 ELISA システムおよび R&D Systems (Minneapolis, MN)のヒト IL-6 ELISA システムを製造業者の標準的プロトコールに従って使用し、細胞培養上清中のＭＭＰ１３およびＩＬ−６のタンパク質レベルを測定する。

結果
ＯＡの処置に有用な薬物標的を同定するために、軟骨細胞における候補遺伝子の過剰発現の、いくつかの既知のＯＡの遺伝子マーカーに対する効果を観察した。下表ＩＩは、例示的ＯＡマーカー遺伝子および関連するＯＡの特徴をまとめたものである。

候補遺伝子（この場合はＴＹＲＯ３）を軟骨細胞に形質移入し、ＯＡマーカー遺伝子に対する発現の効果を評価する前に、特定のＯＡマーカー遺伝子で使用しようとするプライマーおよびＲＴ−ＰＣＲの条件を確認する。これは、ＯＡの特徴を誘導すると知られている様々な化合物で処理した軟骨細胞におけるＯＡマーカー遺伝子の発現の変化をアッセイすることにより行う。

特に、ヒト関節の軟骨細胞を、軟骨細胞でＯＡの特徴を誘導すると知られている、上記の材料と方法に記載の様々なサイトカインおよび増殖因子で処理する。Tardif et al., Arthritis Rheum., Vol. 42, No. 6, pp. 1147-1158 (1999); および Smith et al., Arthritis Rheum., Vol. 34, No. 6, pp. 697-706 (1991) 参照。次いで、本明細書に記載のプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲ実施し、１またはそれ以上のマーカー遺伝子の発現に検出可能な変化があるか否かを判定する。下記表ＩＩＩは、（ｉ）ＩＬ−１およびＯＳＭ；（ｉｉ）ＴＧＦ−β；および（ｉｉｉ）ＰＤＧＦによる軟骨細胞の処理に媒介される、各マーカーのｍＲＮＡレベルの例示的変化をまとめたものである。発現レベルは、非処理軟骨細胞で測定した標準化した発現レベルの倍数として（即ち、ｍＲＮＡレベルの「変化倍率」として）示す。

表ＩＩＩ中のデータは、様々なＯＡマーカー遺伝子が、軟骨細胞でＯＡの特徴を誘導すると知られている処理に応答して、それらの発現レベルにおける予期された変化を経ることを示す。故に、これらのデータは、用いたプライマーおよび方法論の有用性を立証する。

ＲＴ−ＰＣＲアッセイをさらに確認するために、構成的に活性な遺伝子産物ＡＫＴ／ＰＫＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰＬ−００１９０７）を、レトロウイルスに媒介される遺伝子移入により軟骨細胞で過剰発現させる（実施例１に記載の通りの方法）。この遺伝子の生化学的経路の活性化は、軟骨細胞でアグリカナーゼ−１およびＭＭＰ−１３を誘導すると知られている。常套の方法を使用して、形質導入の４８時間および７２時間後に細胞のＲＮＡを回収し、ＭＭＰ−１３およびアグリカナーゼ−１のｍＲＮＡの発現の変化を、ＲＴ−ＰＣＲにより検出する。ＡＫＴ／ＰＫＢの過剰発現は、アグリカナーゼ−１の１２倍の誘導およびＭＭＰ−１３の９倍の誘導をもたらす（データは示さない）。

実施例２
ＴＹＲＯ３
ＴＹＲＯ３がＯＡにおいて果たす役割を、もしあれば、判定するために、全長ＴＹＲＯ３ｃＤＮＡを初代ヒト関節軟骨細胞（ＨＡＣ）に形質移入し、これらの細胞においてＯＡの遺伝子マーカーの発現に対する結果的な効果をＲＴ−ＰＣＲにより分析し、形質移入していない細胞で測定されるこれらのマーカー遺伝子の発現レベルと比較する。

結果は、ＴＹＲＯ３遺伝子の形質移入は、少なくとも４つのＯＡマーカー遺伝子の発現を強力に誘導することを示し、ＴＹＲＯ３がＯＡの疾患の過程に関与することを示唆する（下表ＩＶ参照）。

ＴＹＲＯ３がこれらの「マーカー」遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現の上昇を誘導したことを確認するために、ＭＭＰ−１３タンパク質のレベルを、ＴＹＲＯ３ ｃＤＮＡで形質転換された軟骨細胞でＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、細胞上清のＥＬＩＳＡにより測定される通り、ＴＹＲＯ３の過剰発現こそがＭＭＰ−１３タンパク質分泌の誘導を導くことを示す（データは示さない）。

実施例３
ＧＡＳ６
この実施例は、ＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーに結合し、活性化するリガンドであるＧＡＳ６が、軟骨細胞においてＯＡマーカー遺伝子を誘導する能力を調べる実験を記載する。

以下の材料と方法を使用して、下記の実施例を実施した：
免疫組織化学的分析
正常またはＯＡのヒト膝軟骨の全厚の外植片（full thickness explants）を、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で培養する。軟骨を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンで包埋し、５ミクロンの切片を切る。組織切片をスライドに置き、トルエン中で脱パラフィンし、エタノールの段階的系列で水和し、次いで、ＰＢＳおよび０.２％ペルオキシダーゼ中で洗浄する。組織切片を正常血清またはＢＳＡで３０分間ブロックした後、切片をＧＡＳ６（R&D Systems, Minneapolis, MN のヤギ抗ヒト組換え抗体）に対する一次抗体またはヒトＴＹＲＯ３に対する抗体（R&D Systems, Minneapolis, MN のヒトＴＹＲＯ３細胞外ドメインに対するヤギ抗体）と、２μｇ／ｍＬ、１−２時間室温で、または、終夜４℃で、インキュベートする。このＴＹＲＯ３抗体は、ＡｘｌまたはｃＭｅｒと交差反応しない。

切片をＰＢＳ中で５分間、３回洗浄した後、２回目のブロッキング反応を１０分間実施する。切片を希釈したビオチン化二次抗体と３０分間インキュベートする。スライドをＰＢＳ中で３回洗浄し、Vectastain ABC-AP (Vector Labs, Burlingame, CA) またはペルオキシダーゼをベースとする Elite ABC システム (Vector Labs, Burlingame, CA) と３０分間インキュベートする。スライドを洗浄し、切片をアルカリホスファターゼ基質溶液 (Vector Labs, Burlingame, CA) または３,３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質と４−２０分間インキュベートする。スライドを水ですすぎ、希釈した Hematoxylin または Methyl Green で対比染色し、段階的エタノールまたは３回交換する１−ブタノールで再度水和し、ヘモ・デー（hemo-de）処理し、Refrax マウント用媒体 (Anatech Ltd., Battle Creek, MI)でマウントする。一次抗体を免疫前血清または免疫グロブリンで置き換えることにより、負の対照を実施した。

組換えＧＡＳ６の産生
ＧＡＳ６タンパク質を生成させるために、所内のクローンコレクションからの全長ＧＡＳ６ＤＮＡクローンを、Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) を製造業者の推奨するプロトコールに従って使用して、２９３Ｈ細胞 (Invitrogen, Carlsbad, CA) に形質移入する。ＧＡＳ６ポリペプチドをコードする好ましいＧＡＳ６のｃＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋから各々受託番号ＮＭ＿００８２０（配列番号２８）およびＮＰ＿０００８１１（配列番号２９）で入手可能である。ＧＡＳ６タンパク質は、形質移入された細胞により上清に分泌され、形質移入の７２時間後に回収される。

軟骨細胞の処理
軟骨細胞を２４ウェルプレートに播き、そのままの、または連続的に希釈した、組換えＧＡＳ６タンパク質を含有する２９３Ｈ細胞の上清で終夜処理する。総ＲＮＡを単離し、上記実施例１に記載のＲＴ−ＰＣＲ方法に従ってＲＴ−ＰＣＲを実施し、アグリカナーゼ−１、ＭＭＰ−１３およびｉＮＯＳの発現を検出する。あるいは、上記のＥＬＩＳＡの材料と方法に従い、タンパク質ＭＭＰ−１３またはＩＬ−６に対してＥＬＩＳＡを実施する。

結果
ＴＹＲＯ３およびＧＡＳ６は、ヒトの関節疾患で過剰発現される
ＴＹＲＯ３およびそのリガンドのＧＡＳ６が実際にヒトの関節疾患で過剰発現されているか否かを判定するために、免疫組織化学を使用して正常およびＯＡのヒト軟骨組織におけるＴＹＲＯ３およびＧＡＳ６のレベルを直接調べる。結果は、ＯＡ軟骨におけるＴＹＲＯ３およびＧＡＳ６の両方の存在を示すが、正常ヒト軟骨組織では示さない。さらに、培養した中部および深部領域のＯＡ患者の軟骨細胞は、ＴＹＲＯ３およびＧＡＳ６の高い免疫染色を示す（データは示さない）。これらのデータは、（少なくとも）ＴＹＲＯ３およびＧＡＳ６ＯＡの発現が上昇するので、軟骨細胞がインビボでオートクリン様式で活性化されるという結論を支持する。故に、ＴＹＲＯ３およびＧＡＳ６の両方とも、インビボでＯＡの重要な調整因子であり、例えば、そのような障害を処置するための薬物標的として使用できる。

ＧＡＳ６はＯＡマーカー遺伝子および遺伝子産物を誘導する
組換えＧＡＳ６を使用して内在性ＴＹＲＯ３が活性化され得るか否か、そしてそのような活性化がＯＡを示すマーカー遺伝子（プロテイナーゼおよび炎症調整物質）の誘導を導くか否かを判定するために、ＧＡＳ６を発現する２９３Ｈ細胞の上清で、上記の通りに軟骨細胞を処理する。結果は、そのような処理が、ＲＴ−ＰＣＲにより判定される通り、アグリカナーゼ−１、ＭＭＰ−１３およびｉＮＯＳの誘導を導くことを示す。対照的に、空のベクターで形質移入された２９３Ｈ細胞からの上清は、これらの遺伝子を誘導しない。ＥＬＩＳＡ実験も、ＧＡＳ６含有上清での軟骨細胞の処理がＩＬ−６タンパク質の発現も誘導することを立証する（データは示さない）。

これらの実験の結果は、軟骨細胞のＧＡＳ６による処理がＯＡマーカー遺伝子の発現を誘導することだけでなく、ＴＹＲＯ３と同様に、ＧＡＳ６がＯＡの軟骨細胞で高いレベルで発現されることを示す。

実施例４
ＴＹＲＯ３の阻害はＯＡマーカー遺伝子の発現を低下させる
この実施例は、ＲＮＡ干渉を使用して軟骨細胞におけるＴＹＲＯ３遺伝子発現を特異的に阻害する実験を記載する。

以下の材料と方法を下記実施例に使用する：
初代ヒト関節軟骨細胞（膝関節置換手術から入手した軟骨組織から単離、Mullenberg hospital, Plainsfield, NJ) を、形質移入の２４時間前に３０−５０％コンフルエンス（約１.５ｘ１０^４細胞／ウェル）で播く。細胞を１回洗浄し、抗生物質の痕跡を除去し、OPTIMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) ３５０μＬを各ウェルに添加する。２０μＭｓｉＲＮＡ二本鎖（Dharmacon, Lafayette, CO) ３μＬを Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) ５０μＬに添加する。別のチューブで、Oligofectamine (Invitrogen, Carlsbad CA) ３μＬを Opti-MEM １２μＬに希釈し、９分間インキュベートする。ｓｉＲＮＡ二本鎖の溶液およびオリゴフェクタミンの溶液を一緒にし、さらに２０分間インキュベートする。生じる溶液の体積を１００μＬに合わせ、各ウェルのオリゴヌクレオチド二本鎖の最終濃度が１３３ｎＭであり、Oligofectamine 濃度が０.６７％であるように軟骨細胞に添加する。

形質移入媒体で細胞を１６時間インキュベートし、そのとき培地を抗生物質（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含有するＤＭＥＭ（Invitrogen, Carsbad, CA）中の１０％熱非動化血清 (Invitrogen, Carlsbad, CA) に切り替える。細胞をさらに４８時間インキュベートして標的遺伝子を沈黙させる。次いで、１０％鉄添加ウシ血清 (Omega Scientific, Tarzana, CA）を含有するＤＭＥＭ中で、ＩＬ−１またはＴＮＦ（各々５ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬ）により、細胞に１６時間負荷を与える。培地を回収し、ＭＭＰ−１３産生（MMP-13 ELISA システム、Amersham, Piscataway, NJ) についてアッセイする。細胞塊からＲＮＡを単離し (Qiagen RNeasy, Valencia, CA）、選択された遺伝子のメッセージのレベルを上記の通りにＲＴ−ＰＣＲにより測定する。

以下のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を使用する：

結果
ＲＮＡ干渉は、１またはそれ以上の特定の遺伝子の機能を細胞の状況において評価し得るように、特定の遺伝子の転写後の発現を選択的に阻害し得る方法である。これらの実験では、化学合成した二本鎖２１ｍｅｒを細胞に送達する。これらのオリゴマーは、正常な細胞の過程を活性化し、特定のｍＲＮＡ（群）の高度に特異的な分解を導く。

この実施例では、上記の通りにｓｉＲＮＡをＯＡ軟骨細胞に添加し、ＴＹＲＯ３の発現を阻害する。その発現がＯＡ軟骨細胞で上方調節されることが知られている２つの遺伝子である、ＩＬ−６およびＭＭＰ−１３（Vincenti et al., Arthritis Res., Vol. 4, No. 3, pp. 157-164 (2002); Bau et al., Arthritis Rheum., Vol. 46, No. 10, pp. 2648-2657; Flannery et al., Matrix Biol., Vol. 18, No. 3, pp. 225-237 (1999); および Mengshol et al., Arthritis Rheum., Vol. 43, No. 4, pp. 801-811 (2000) 参照）のｍＲＮＡレベルを、ＴＹＲＯ３ｍＲＮＡレベルと同様に、ＴＹＲＯ３特異的ｓｉＲＮＡ投与の４８時間後にＲＴ−ＰＣＲにより測定する。結果は、ＩＬ−６およびＭＭＰ−１３の両方の基底発現レベルが、ＴＹＲＯ３発現に伴って有効に低下することを示す。負の対照として、ＯＡ軟骨細胞を、軟骨細胞で通常は発現されない遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子を特異的に阻害するｓｉＲＮＡでも処理する。期待通り、このルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡの投与は、ＲＴ−ＰＣＲにより測定される通り、ＴＹＲＯ３、ＩＬ−６またはＭＭＰ−１３のいずれの発現も阻害しない。

さらに他の実験は、ＴＹＲＯ３の沈黙が、ＯＡ軟骨細胞においてＩＬ−１に媒介される効果に対して有する効果を立証する。特に、軟骨細胞を上記の通りにＴＹＲＯ３特異的ｓｉＲＮＡで処理し、続いてＩＬ−１またはＴＮＦで処理する。ＭＭＰ−１３およびＩＬ−６のｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲにより測定する。データは、ＴＹＲＯ３のｓｉＲＮＡ阻害は、通常はＴＮＦおよび／またはＩＬ−１により誘導されるＭＭＰ−１３およびＩＬ−６の両方のｍＲＮＡの発現を有効に阻害することを示す。これらの知見は、軟骨細胞中のＭＭＰ−１３タンパク質のＥＬＩＳＡ測定により裏付けられる。再度、ＴＹＲＯ３の阻害は、通常はＩＬ−１および／またはＴＮＦにより誘導されるＭＭＰ−１３タンパク質の分泌を有効に阻害する。このことは、ＴＹＲＯ３のシグナル伝達が、軟骨細胞におけるＩＬ−１および／またはＴＮＦによる異化酵素の誘導の調整に重要な役割を有し得ることを示唆する。これは、ＯＡの病因におけるＴＹＲＯ３シグナル伝達の重要な役割を含意する。

実施例５
ＡＸＬ、ｃＭｅｒおよびＯＡ
上記の通り、ＴＹＲＯ３は、少なくとも２つの他の受容体チロシンキナーゼ、ＡｘｌおよびｃＭｅｒに、相当な配列および構造の相同性を有し、これらの３つの遺伝子は、受容体チロシンキナーゼのサブファミリーを構成する。故に、ＴＹＲＯ３に加えて、ｃＭｅｒおよびＡｘｌも、例えば、ＯＡを診断および／または処置、予防もしくは改善するために、またはそれら自体ＯＡの診断および／または処置に有用な化合物の薬物標的として、本発明の組成物および方法において有用であると期待される。

Ａｘｌ遺伝子の少なくとも２つのスプライスバリアントが知られており、その一方（本明細書で「Ａｘｌ変異体２」または「Ａｘｌｖ２」と呼ばれる）は、１またはそれ以上の他のＡｘｌスプライスバリアントに存在する１つのエクソン（エクソン１０）を欠く。例示的Ａｘｌｖ２核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１６９９から入手可能であり、本明細書でも配列番号３０で提供される。配列番号３０のＡｘｌｖ２核酸によりコードされる例示的Ａｘｌｖ２ポリペプチドは、またＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１６９０から入手可能であり、本明細書で配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含む。別のＡｘｌスプライスバリアントが知られており、本明細書で「Ａｘｌ変異体１」または「Ａｘｌｖ１」と呼ばれる。例示的Ａｘｌｖ１核酸は、本明細書で配列番号３２およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１９１３に記載のヌクレオチド配列を含む。この核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６８７１３（配列番号３３）に記載のアミノ酸配列を含むＡｘｌｖ１ポリペプチドをコードする。

ＴＹＲＯ３についての前記したものと同一の方法論（上記実施例参照）を用いる実験において、軟骨細胞におけるＡｘｌｖ１核酸（所内のｃＤＮＡライブラリー）の発現の上昇は、Ａｇｇ−１およびＭＭＰ−１３のｍＲＮＡの発現を、各々約１２および１５倍上昇させる。同様に、軟骨細胞におけるＡｘｌｖ２核酸（所内のｃＤＮＡライブラリー）の発現の上昇は、同じＯＡ「マーカー」遺伝子、即ち、Ａｇｇ−１およびＭＭＰ−１３の発現を、各々約３倍および８倍上昇させる。

加えて、ＡｘｌおよびｃＭｅｒのｓｉＲＮＡ（Dharmacon, Lafayette, CO）（実施例４で使用した方法に従って軟骨細胞に送達される）は、軟骨細胞において、ＩＬ−１に媒介されるアグリカナーゼ−１およびＭＭＰ−１３のｍＲＮＡの誘導を妨害した。このことは、この受容体チロシンキナーゼのサブファミリーの３つ全てのメンバーが、ＯＡの病因において重要な役割を有し得ることを示唆する。

このように、ｃＭｅｒおよびＡＸＬ（変異体を含む）は、本発明の方法および組成物において、ＴＹＲＯ３（およびその変異体）と同じやり方で、本発明の方法および組成物に準じて使用でき、従って、そのような使用は、本発明の一部と見なされる。

【配列表】

Claims (38)

1. ＯＡの処置用の化合物を同定する方法であって、
   ａ）試験化合物を、
   （ｉ）受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドのメンバー、および、
   （ｉｉ）該ポリペプチドに対するリガンド、
   を含む反応混合物に接触させること、
   ここで、反応混合物の条件は、ポリペプチドがリガンドに結合して結合複合体を形成することを可能にするものである；
   ｂ）試験化合物の存在下の反応混合物における結合複合体の形成のレベルを検出すること；および
   ｃ）試験化合物の存在下で形成される結合複合体のレベルを、該試験化合物の非存在下で形成される結合複合体のレベルと比較すること、ここで、試験化合物の存在下で形成される結合複合体のレベルの低下は、その試験化合物をＯＡの処置に使用し得ることを示すものである、
   を含む方法。
2. 該受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドのメンバーが、ＴＹＲＯ３、ＡｘｌおよびｃＭｅｒからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 骨関節炎の処置用の化合物を同定する方法であって、
   ａ）試験化合物を、
   （ｉ）ＴＹＲＯ３ポリペプチド、および、
   （ｉｉ）ＴＹＲＯ３リガンド、
   を含む反応混合物に接触させること、
   ここで、反応混合物の条件は、ＴＹＲＯ３ポリペプチドがＴＹＲＯ３リガンドに結合して結合複合体を形成することを可能にするものである；
   ｂ）試験化合物の存在下の反応混合物における結合複合体の形成のレベルを検出すること；および
   ｃ）試験化合物の存在下で形成される結合複合体のレベルを、該試験化合物の非存在下で形成される結合複合体のレベルと比較すること、ここで、試験化合物の存在下で形成される結合複合体のレベルの低下は、その試験化合物をＯＡの処置に使用し得ることを示すものである、
   を含む方法。
4. ＴＹＲＯ３ポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
5. ＴＹＲＯ３リガンドが、ＰＲＯＳ１およびＧＡＳ６ポリペプチドからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
6. ＧＡＳ６ポリペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
7. 骨関節炎を有する個体を同定する方法であって、
   ａ）個体に由来する生物学的サンプル中の受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドのメンバーをコードする核酸を検出すること；および
   ｂ）その個体における該核酸のレベルを、骨関節炎を有さない個体における該核酸のレベルと比較すること、ここで、その個体に由来する該生物学的サンプルにおける該核酸のレベルの上昇は、その個体がＯＡを有することを示すものである、
   を含む方法。
8. 該受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドのメンバーが、ＴＹＲＯ３、ＡｘｌおよびｃＭｅｒからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 該生物学的サンプルが、軟骨細胞、軟骨、滑液および血清からなる群から選択される生物学的物質を含む、請求項７に記載の方法。
10. 骨関節炎を有する個体を同定する方法であって、
    ａ）個体に由来する生物学的サンプル中のＴＹＲＯ３核酸を検出すること；および
    ｂ）その個体におけるＴＹＲＯ３核酸のレベルを、ＯＡを有さない個体におけるＴＹＲＯ３核酸のレベルと比較すること、ここで、その個体に由来する該生物学的サンプルにおけるＴＹＲＯ３核酸のレベルの上昇は、その個体がＯＡを有することを示すものである、
    を含む方法。
11. ＴＹＲＯ３核酸が配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１０に記載の方法。
12. ＴＹＲＯ３核酸が配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の方法。
13. 該生物学的サンプルが、軟骨細胞、軟骨、滑液および血清からなる群から選択される生物学的物質を含む、請求項１０に記載の方法。
14. 骨関節炎を有する個体を同定する方法であって、
    ａ）個体に由来する生物学的サンプル中の受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドのレベルを検出すること；および
    ｂ）その個体における該ポリペプチドのレベルを、ＯＡを有さない個体における該ポリペプチドのレベルと比較すること、ここで、その個体に由来する該生物学的サンプルにおける該ポリペプチドのレベルの上昇は、その個体がＯＡを有することを示すものである、
    を含む方法。
15. 該受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドが、ＴＹＲＯ３、ＡｘｌおよびｃＭｅｒからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 該生物学的サンプルが、軟骨細胞、軟骨、滑液および血清からなる群から選択される生物学的物質を含む、請求項１４に記載の方法。
17. ＯＡを有する個体を同定する方法であって、
    ａ）個体に由来する生物学的サンプル中のＴＹＲＯ３ポリペプチドを検出すること；および
    ｂ）その個体におけるＴＹＲＯ３ポリペプチドのレベルを、ＯＡを有さない個体におけるＴＹＲＯ３ポリペプチドのレベルと比較すること、ここで、その個体に由来する該生物学的サンプルにおけるＴＹＲＯ３ポリペプチドのレベルの上昇は、その個体がＯＡを有することを示すものである、
    を含む方法。
18. ＴＹＲＯ３ポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 該生物学的サンプルが、軟骨細胞、軟骨、滑液および血清からなる群から選択される生物学的物質を含む、請求項１５に記載の方法。
20. 骨関節炎を有する個体を同定する方法であって、
    ａ）個体に由来する生物学的サンプル中の、受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドのメンバーのリガンドをコードする核酸を検出すること；および
    ｂ）その個体におけるその核酸のレベルを、ＯＡを有さない個体におけるその核酸のレベルと比較すること、ここで、その個体に由来する該生物学的サンプルにおけるその核酸のレベルの上昇は、その個体がＯＡを有することを示すものである、
    を含む方法。
21. 該受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのポリペプチドのメンバーが、ＴＹＲＯ３、ＡｘｌおよびｃＭｅｒからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
22. 該生物学的サンプルが、軟骨細胞、軟骨、滑液および血清からなる群から選択される生物学的物質を含む、請求項２０に記載の方法。
23. 骨関節炎を有する個体を同定する方法であって、
    ａ）個体に由来する生物学的サンプル中の、ＴＹＲＯ３リガンドをコードする核酸を検出すること；および
    ｂ）その個体におけるその核酸のレベルを、ＯＡを有さない個体におけるその核酸のレベルと比較すること、ここで、その個体に由来する該生物学的サンプルにおけるその核酸のレベルの上昇は、その個体がＯＡを有することを示すものである、
    を含む方法。
24. ＴＹＲＯ３リガンドが、ＰＲＯＳ１およびＧＡＳ６からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
25. ＴＹＲＯ３リガンドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
26. 該ＴＹＲＯ３リガンドをコードする核酸が、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載の方法。
27. 該生物学的サンプルが、軟骨細胞、軟骨、滑液および血清からなる群から選択される生物学的物質を含む、請求項２３に記載の方法。
28. ＯＡを有する個体を同定する方法であって、
    ａ）個体に由来する生物学的サンプル中の、受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーのリガンドのレベルを検出すること；および
    ｂ）その個体における該リガンドのレベルを、ＯＡを有さない個体における該リガンドのレベルと比較すること、ここで、その個体に由来する該生物学的サンプルにおける該リガンドのレベルの上昇は、その個体がＯＡを有することを示すものである、
    を含む方法。
29. 該受容体チロシンキナーゼのＴＹＲＯ３サブファミリーのメンバーが、ＴＹＲＯ３、ＡｘｌおよびｃＭｅｒからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
30. 該生物学的サンプルが、軟骨細胞、軟骨、滑液および血清からなる群から選択される生物学的物質を含む、請求項２５に記載の方法。
31. 該リガンドが、ＰＲＯＳ１およびＧＡＳ６からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
32. 該リガンドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。
33. 該リガンドをコードする核酸が、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載の方法。
34. 骨関節炎を有する個体を同定する方法であって、
    ａ）個体に由来する生物学的サンプル中の、ＴＹＲＯ３リガンドのレベルを検出すること；および
    ｂ）その個体における該ＴＹＲＯ３リガンドのレベルを、ＯＡを有さない個体におけるＴＹＲＯ３リガンドのレベルと比較すること、ここで、その個体に由来する該生物学的サンプルにおけるＴＹＲＯ３リガンドのレベルの上昇は、その個体がＯＡを有することを示すものである、
    を含む方法。
35. ＴＹＲＯ３リガンドが、ＰＲＯＳ１およびＧＡＳ６からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
36. ＴＹＲＯ３リガンドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の方法。
37. 該ＴＹＲＯ３リガンドをコードする核酸が、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載の方法。
38. 該生物学的サンプルが、軟骨細胞、軟骨、滑液および血清からなる群から選択される生物学的物質を含む、請求項３４に記載の方法。