JP2012522977A - 変形性関節症の治療のための方法及び手段 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図1
Description
(1)アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉RNA(siRNA)の群から選択されるポリヌクレオチドを含む発現阻害薬(この中で、該ポリヌクレオチドは、TARGETポリペプチドをコードする天然のポリヌクレオチド配列と相補的なまたは前記ポリヌクレオチド配列から操作された核酸を含み、該ポリヌクレオチド配列は、配列番号22〜42からなる群から選択される配列を含む。)並びに
(2)ECM変性及び/又は変形性関節炎などの軟骨変性を特徴とする疾患の治療又は予防において有用な、該薬剤を含む医薬組成物にも関する。
以下の用語は、下記に表された意味を有するよう意図され、本発明の明細書及び意図された範囲を理解する上で有用である。
本発明は、TARGETSが、軟骨細胞の異化過程の制御における因子、特に阻害が軟骨及び/又はECMの異化作用の低下をもたらす因子であるという本発明者らの発見に基づいている。このような疾患は、軟骨及び/又はECMの分解と関連したタンパク質、例えば限定するわけではないが、MMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び/又はADAMTS4、特にMMP13の発現を追うことによってモニターされ得る。用語「TARGET」又は「TARGETS」は、ECM及び/又は軟骨の分解の阻害に関与することが下記に説明されているアッセイに従って同定されたタンパク質を意味する。
(a)軟骨細胞の集団を、TARGETポリペプチド又はその断片に対する結合親和性を呈する1つ以上の化合物と接触させること、並びに
(b)ECM及び/または軟骨の分解の阻害と関連した化合物‐ポリペプチド特性を測定すること。
(a)細胞の集団を、TARGETポリペプチド又はその断片に対する結合親和性を呈する1つ以上の化合物と接触させること、及び
(b)炎症の阻害と関連した化合物‐ポリペプチド特性を測定すること。
(a)化合物を、配列番号22〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること;
(b)該化合物の該ポリペプチドに対する結合親和性を決定すること;
(c)該ポリペプチドを発現する哺乳類細胞の集団を、少なくとも10マイクロモル濃度の結合親和性を呈する化合物と接触させること;及び
(d)IL‐1に対する応答を低下させる、あるいはECM及び/若しくは軟骨を分解するよう作用する酵素の合成並びに/又は該酵素の存在を示す関連マーカーを低下させる化合物を同定すること。
(a)化合物を、配列番号22〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド及びその断片と接触させること;並びに
(b)軟骨分解と関連した化合物‐ポリペプチド特性を測定すること。
a)化合物を、配列番号22〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する哺乳類細胞の集団と接触させ、この中で、該細胞は活性化されていること;
b)該細胞からのMMP13の発現を決定すること;及び
c)炎症又は軟骨及び/若しくはECMの分解を阻害する化合物を、該細胞からのMMP13の放出を抑制する化合物として同定すること。
a)化合物を、配列番号22〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること;
b)該化合物の該ポリペプチドに対する結合親和性を決定すること;
c)該ポリペプチドを発現する哺乳類細胞の集団を、少なくとも10マイクロモル濃度の結合親和性を呈する化合物と接触させること;及び
d)炎症又は軟骨及び/若しくはECMの分解を阻害する化合物を同定すること。
a)化合物を、配列番号22〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること;
b)該ポリペプチドの発現又は活性を阻害する化合物の能力を決定すること;
c)該ポリペプチドを発現する哺乳類細胞の集団を、ポリペプチドの発現又は活性を有意に阻害する化合物と接触させること;及び
d)炎症又は軟骨及び/若しくはECMの分解を阻害する化合物を同定すること。
導入において説明したように、MMP13は、変形性関節症患者の影響を受けた関節における軟骨の分解に至る異化事象に関与する鍵となる担い手のうちの1つとして、変形性関節症の文献において同定されている。それゆえ、疾患関連誘発因子を用いて活性化された初代ヒト軟骨細胞におけるMMP13の発現を調節する因子を同定するために、機能的ゲノミクスの尽力を開始するよう決定した。本アッセイはさらに、「MMP13アッセイ」として本明細書で言及される。本アッセイにおいて同定された因子は、変形性関節症のための新規の治療法の開発のための基礎として用いることができる。
・本アッセイは、初代ヒト関節軟骨細胞を用いて実施するが、最小の適用を用いて、初代軟骨細胞、軟骨細胞前駆細胞、又は軟骨細胞細胞株の任意の他の源について用いられ得る。
・本アッセイは、用いられる初代ヒト軟骨細胞が、可能な限り多くの正常環境(軟骨マトリックス)に類似した環境にあるよう実施される。細胞は、三次元培養において増殖し、培養容器への細胞接着を回避する。
・本アッセイは、機能的ゲノミクス目的のために整列したアデノウイルス回収物を用いた使用のために最適化されている。
・最小の適用を用いて、本アッセイはまた、化合物又は化合物回収物をスクリーニングすることができる。
・本アッセイは、高処理モードで実施することができる。
培養されたNHACによって産生されるMMP13量を検出するのに十分な感度でELISAを展開するために、種々の抗体及び基質を試験した。MMP13の測定についての384ウェルフォーマットELISAを展開した。種々の一次抗体を試験し、及び種々のELISAプロトコールは、384ウェルプレートにおけるMMP13レベルの測定について以下の検証されたプロトコールをもたらした。黒色マキシソルブ384ウェルプレート(Nunc 460518)を5μg/mL抗MMP13抗体MAB511(R&D System)で被覆する。抗体を炭酸‐重炭酸被覆緩衝液(1.59g Na2CO3(Sigma S‐7795)及び2.93g NaHCO3(Sigma S‐5761))含有1LミリQ、pH9.6に調整)で希釈する。4℃で一晩インキュベーション後、プレートを100μL PBST(80g NaCl、2g KCl(Sigma)、11.5g Na2HPO4・7H2O、及び2g KH2PO4含有10LミリQ;pH7.4+0.05%Tween‐20(Sigma))で3回洗浄し、100μL/ウェルのブロッキング緩衝液(5%無脂肪ドライミルク含有PBS)でブロッキングする。室温で2時間のインキュベーションの後、プレートを100μLのPBSTで3回洗浄する。次に、PBSTを除去し、35μLの試料をELISAプレートに移す。4℃で一晩インキュべ−ションの後、プレートをPBSTで3回洗浄し、35μL/ウェルの1.5mM APMAとともに37℃で1時間インキュベートする。10mM APMAストック溶液(前日に調製)を4℃で保存する(35.18mg APMA(Sigma A‐9563)含有10mL 0.1M NaOH(Merck 1.06469.1000))。10mM APMAストック溶液をAPMA緩衝液(10×APMA緩衝液:500mMトリス(Roche 708976)、50mM CaCl2(Sigma C‐5080)、500μM ZnCl2(Sigma Z‐0173)、1.5M NaCl(Calbiochem 567441)、0.5%Brij35(Sigma 430 AG‐6)、及びpH7.0に調整)において1.5mMに希釈する。APMAによるMMP13の活性化後、プレートを100μL PBST/ウェルで再度3回洗浄する。OmniMMP Fluorescent基質(Biomol P‐126)をOmniMMP緩衝液(10×OmniMMP緩衝液:500mM Hepes(Sigma H4034)、100mM CaCl2(Sigma C5080)、0.5%Brij35(Sigma 430 AG‐6;pH7.0に調整))に溶解し、0.01mMの終濃度にする。この基質35μLを各ウェルに添加する。37℃での一晩のインキュベーション後、試料中の活性のあるMMP13は基質を切断し、蛍光を放出する。読み出しを、320nm励起/405nm発光フィルターを用いるEnVision(Perkin Elmer)において実施する。
正常ヒト関節軟骨細胞(NHAC)継代1を商業源から獲得した(カタログ番号CC‐2250、Cambrex Verviers, BE)。実験ごとについて、ウイルス含有初代NHACを製造元のプロトコールに従って解凍し、細胞を標準的な条件(37℃、5%CO2)下で軟骨細胞増殖培地(CGM、カタログ番号CC3216、Cambrex、Verviers)においてT80細胞培養容器において単層で培養する。この培養がコンフルエンスに到達すると、細胞を製造元のプロトコールに従ってトリプシン処理し(試薬パックカタログ番号CC‐3233、Cambrex、Verviers、BEを使用)、新たなT175培養容器(1×10E+05個の細胞/T175フラスコ)に転移させた。これらの培養物がコンフルエンスに到達すると、細胞をトリプシン処理し、MMP13アッセイに供した。それゆえ、MMP13アッセイに用いた細胞は、解凍後2回の継代について継代したのみであった。
最適なスクリーニングプロトコールは、以下のとおりである:96ウェル組織培養プレートを、5%FBS並びに100単位/mLペニシリン(Invitrogen)及び100μg/mLストレプトマイシン(Invitrogen)の混合物を補充したDMEM‐F12培地(この培地はさらに、「アッセイ培地」と呼ばれる。)において調製された50μLの1.5%低融点アガロースで被覆する。NHACをトリプシン処理し、5%FBS並びにペニシリン及びストレプトマイシンの混合物を含むDMEM‐F12において7500個の細胞/20μL/ウェルの密度でポリプロピレン96ウェルプレートに蒔種する(細胞接着を回避するため)。次に、細胞をヒトコクサッキー/アデノウイルス受容体(hCAR)の発現を仲介するアデノウイルスに(およそ250のMOI(感染多重度、アッセイにおける細胞あたりに用いられるウイルス粒子の量を指す。)で)感染させて、SilenceSelect回収物に含まれるAd‐SiRNAウイルスによるその後の感染を容易にする。ヒトコクサッキー/アデノウイルス受容体は、ヒト細胞膜へのアデノウイルスの付着に関与する共受容体である。細胞におけるこの受容体の発現は、例えばT細胞におけるアデノウイルスによるその後の感染を容易にするために説明されている(Schmidtらの文献(2000))。翌日、384ウェルプレート(1mLあたり1×109のウイルス粒子の概算力価)に保存されたSilenceSelect(登録商標)回収物(WO03/020931)の各ウェルからの12μLのAd‐SiRNAウイルスを96/384チャネルディスペンサーの助力で、NHACを含む96ウェルプレートの個々のウェルに転移させた。アデノウイルスライブラリーの平均力価が1×109のウイルス粒子/mLであるので、このことは、約1600の平均MOIを表す。Ad‐siRNAのウェルへの添加後、37℃で1時間のインキュベーション工程を実施する。感染を、各ウェルがSilenceSelect(登録商標)回収物由来のAd‐siRNAの1つの個々の種類で感染すると、整列した様式で実施する。次に、8%FBS並びにペニシリン及びストレプトマイシンの混合物を補充したDMEMF12培地において調製した40μLの0.8%低融点アガロースをウェルに添加する。ウェルの内容物を多重チャネルロボットを用いたピペッティングによって上下にすることによって混合し、50μLの混合物をアガロースで被覆した96ウェルプレートに転移させる。アガロースの凝固の速度を上げるために、プレートを4℃でおよそ15分間保存する。150μLのアッセイ培地をウェルに添加する。次に、感染したNHACを4日間インキュベートし、細胞におけるshRNA発現を十分なレベルに到達させておき、細胞における遺伝子サイレンシングの機構を完全に刺激しかつ有効にしておく。感染4日後、細胞における培地をアッセイ培地で改める。翌日、細胞を、10ng/mL組換えヒトIL1bを含むアッセイ培地の添加によって刺激する。誘発因子の添加2日後、上清を回収し、MMP13 ELISAに供するまで−80℃で保存する。35μLの上清をMMP13 ELISAに供し、MMP13 ELISAを384ウェルプレートフォーマットにおいて実施する。高処理量適合性ELISAに適用されるプロトコールは実施例1.1に説明されている。感染、培地交換、及び培地回収の工程をTECAN Freedomピペッター(TeMO96、TeMO384、及びRoMaを装備したTecan Freedom 200、Tecan AG、Switzerland)を用いて実施した。
96ウェル対照プレートを、本アッセイの質を評価するために作製する。対照プレートは、SilenceSelect(登録商標)回収物と同じ方法で作製する。この対照プレートの複数の一定分量を生じ、−80℃で保存する。スクリーニングの施行ごとについて、スクリーニングプレートの新たな一定分量を解凍し、スクリーニング試行すべての性能を比較させる。このプレートの組成は以下のとおりである。ウェルを、SilenceSelect(登録商標)アデノウイルス回収物(WO03/020931)と同じ条件下で産生された対照ウイルスで満たす。この対照プレートは、4セットの陽性対照ウイルス(陽性対照ウイルスあたり8ウェル;P1(Ad5‐R1T1_v5_KD)、P2(Ad5‐SLC26A8_v2_KD)、P3(Ad5‐TRAF6_v4_KD)、P4(Ad5‐NFKBIA_KI)、列に配置、3セットの陰性対照ウイルス(陰性対照ウイルスにつき16ウェル;N1(Ad5‐空_KD)、N2(Ad5‐M6PR_v1_KD)、N3(Ad5‐LacZ_KI))で間を配置)を含む。陰性対照ウイルスをIL1の存在下(8ウェル)又はIL1の不在下(8ウェル)のいずれかで試験する。陽性対照試料を、文献情報(P3(Ad5‐TRAF6_v4_KD)、P4(Ad5‐NFKBIA_KI))に基づいて、又は限定されたAd‐siRNAウイルスの予備スクリーニング(P1(Ad5‐RIT1_v5_KD)、P2(Ad5‐SLC26A8_v2_KD))に基づいてのいずれかで選択する。TRAF6は、IL1βの下流のシグナル伝達に必要であることが公知であり(Caoらの文献(1996))、NFKBIAの過剰発現は、MMP13の発現に必要であることが公知の転写因子であるNFカッパBを阻害することが公知である(Karinの文献(1999))。
合計10946のウイルスのSilenceSelect回収物を、実施例1.3において説明されたプロトコールに従って3次元フォーマットにおけるアガロースにおいて培養した初代NHACに関して実施したMMP13アッセイにおいてスクリーニングする。これらの10946ウイルスは、6308の転写産物を網羅し、SilenceSelect(登録商標)回収物において構築される重複性を反映する。これらの重複性は、SilenceSelect(登録商標)回収物内に含まれる複数の独立したAd‐siRNAによって標的とされるほとんどの転写産物を結果として生じる。スクリーニングバッチの1つの間に得られるデータを図4に示す。スクリーニングバッチの間、SilenceSelect(登録商標)回収物の4384ウェルプレートにおいて含まれる1536のAd‐siRNAを、MMP13アッセイにおける二つ組においてスクリーニングする。実施例1において与えられるNHACに関するMMP13アッセイの説明において記述されているように、NHAC細胞培養、Ad5‐siRNAによる感染、及びIL1による活性化を96ウェルフォーマットにおいて実施する。このように、SilenceSelect(登録商標)回収物に含まれる384ウェルプレートのあらゆる四半分を用いて、NHACを含む2つの96ウェルプレートを並行して感染させる。次に、得られた上清を384ウェルプレートに転移させて、実施例1.1に説明されたMMP13 ELISAにおけるMMP13レベルを決定する。転移は、二つ組試料が、同じMMP13 ELISAプレートに関して測定されるよう計画される。データ分析を以下の通り実施する:
(3.1 再スクリーニングプロトコール)
最初の的中物を確認した的中物にするために、元の的中物Ad‐siRNAを独立して2倍に再増殖させて、独立したAd‐siRNA材料を生じる。次に、これらの再増殖したウイルスを3MOIでNHACに関するMMP13 ELISAにおいて試験する。再増殖材料が、SilenceSelect(登録商標)回収物に含まれる元の最初の的中物と比較して異なる力価を有するウイルス材料を生じ得るので、元の最初の新たなウイルス材料を3MOIでスクリーニングする。2つの再増殖物を3MOIで試験すると、6つのデータポイントを、「3MOI再スクリーン」に供したあらゆるAd‐siRNAについて生じる。両再増殖材料について少なくとも1MOIをスコア化する的中物のみが、確認された的中物と考えられる。
標準化されたMMP13値の試料A=[((生のMMP13シグナルの試料A)−(ネガティブコントロールにわたるMMP13シグナルの中央値))/(ネガティブコントロールのMMP13シグナルにわたる標準偏差)]。
標準化されたMMP13値のポジティブコントロール=[((ポジティブコントロールにわたるMMP13シグナル中央値))−(ネガティブコントロールにわたるMMP13シグナル中央値)/(ネガティブコントロールのMMP13シグナルにわたる標準偏差)]。
的中物Ad‐siRNAの品質及び同一性をPCRによってチェックし、さらに説明されるとおり配列決定する。標的Ad‐siRNAを96ウェルプレートにおいてPER.C6(登録商標)細胞の誘導体(Crucell, ライデン、オランダ)を用いて増殖させた後、標的Ad‐siRNAウイルスによってコードされるsiRNAを配列決定する。PER.C6/E2A細胞を180μLのPER.C6/E2A培地において40,000個の細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに蒔種する。次に、細胞を10%CO2加湿インキュベーターにおいて39℃で一晩インキュベートする。翌日、細胞に、標的Ad‐siRNAを含むSilenceSelect(登録商標)ストック由来の1μLの粗細胞可溶化液を感染させる。(典型的には感染7日後、細胞の膨潤及び丸みを帯びることによって明らかとなる)細胞病理効果の出現まで、細胞を34℃、10%CO2でさらにインキュベートする。上清を回収し、1mg/mLのプロテイナーゼK(Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号745 723)及び0.45%Tween‐20(Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号1335465)を補充したMgCl2を有する4μLの溶解緩衝液(1×Expand High Fidelity緩衝液)を滅菌済みPCRチューブに12μLの粗可溶化液に添加することによって、ウイルス粗可溶化液をプロテイナーゼKで処理する。これらのチューブを55℃で2時間インキュベートした後、95℃での15分間の失活工程に続く。PCR反応のために、1μLの溶解物を、MgCl2を有する5μLの10×Expand High Fidelity緩衝液、0.5μLのdNTP混合物(各dNTPにつき10mM)、1μLの「順方向プライマー」(10mMストック、
siRNA技術の強み及び利点は、本技術が科学界を通じて広がった速度によって十分に認識され及び立証される。なおも、本技術の使用は、1)siRNAが、部分的な配列のみの相補性と関連していない遺伝子を非特異的に標的にし得(オフターゲット効果)、かつ2)siRNAの有効性が予測困難である(Peiらの文献(2006))ので、必要とされる技術及び知識を要する。このように、独立した設定においてノックダウンウイルススクリーンにおいて同定された最初の的中物の活性を確認することが重要なままである。この目的のために2つのアプローチが取られた。第一に、異なる標的配列を通じてある遺伝子の発現を低下させるよう設計された1セットの追加的なノックダウンウイルスを作製した。第二に、合成siRNAを購入し(Dharmacon)、軟骨細胞株SW1353における標的検証について用いた。
異なる標的配列を通じて選択された好ましい的中物の発現を低下させるよう設計された1セットのノックダウンウイルスを作製した。これらのノックダウンウイルスをその後、ポジティブコントロールウイルス及びネガティブコントロールウイルスとともに、96ウェルプレートに整列させた。3MOI再スクリーン(実施例3)について説明した再増殖プレートについて説明したのと同じ対照を用いた。特定の的中物を標的にするすべての追加的な異なるノックダウンウイルスを、最初のスクリーンの間にこの標的について同定された元の的中物ノックダウンウイルスとともにプレートにおいて再グループ化した。これらのプレートを2回再増殖させた。次に、あらゆる再増殖したプレートの2つのコピーを二つ組で2回の独立した試行において、最初のスクリーンについて先に説明したNHAC MMP13アッセイにおいて、12μLのMOIを用いて試験した。このように、8個のデータポイントをあらゆるノックダウンウイルスについて生じた。データを3MOI再スクリーン(実施例3)について先に説明したとおり分析し、データを%阻害に変換した。生じた8個のデータポイントのうちの4つについて35%のMMP13レベルの低下を生じているノックダウンウイルスを、本アッセイにおいて検証されたと考えた。このように、NHACにおけるIL1により誘導されるMMP13発現レベルを低下させる能力を有する1つの追加的なノックダウンウイルスを、以下の標的について同定し:ADAM15、GRP34、EPHA5、MAP2K2、MET、GPR43、2つの追加的なノックダウンウイルスをADAMTS6について、3つをSTK32Bについて、4つをMC3Rについて同定した。
本実験の目的は、合成siRNA二本鎖を用いてIL1により刺激されたMMP13放出に及ぼすアデノウイルスshRNA仲介性ノックダウン効果をさらに検証することであった。検証は、IL1刺激に対する応答におけるMMP13発現を上方制御することがすでに示されている軟骨肉腫SW1353細胞株において実施した。
ヒト軟骨肉腫SW1353細胞(カタログ番号HTB‐94、ATCC)を37℃の加湿した5%CO2インキュベーターにおいて、10%熱失活FBS(Hyclone)及び1×ペニシリン/ストレプトマイシンDMEM(カタログ番号15140‐122、Gibco)を補充したDMEM(カタログ番号41966‐029、Gibco)において増殖させ、トリプシン処理の1週間後に2回経代する(1:5の分岐比)。
最適化された条件下で、siRNA二本鎖をSW1353細胞に送達する。SW1353細胞を、96ウェルプレート(Nunc)において、10000個の細胞/100μLの細胞培地でトランスフェクションの24時間前に蒔種する。細胞に、本質的に製造元の説明書に従って、1μL/ウェルの終濃度でINTERFERin(商標)(カタログ番号409‐10、Polyplus‐トランスフェクション)を用いてsiRNA試薬(30nM又は10nM終濃度)を形質移入する。簡潔には、siRNAストック試薬を50μLの無血清OptiMEM(カタログ番号51985‐026、Gibco)に希釈し、1μLのINTERFERin(商標)試薬を添加した後、10秒間即時均質化し、室温で10〜45分間インキュベーションして、INTERFERin(商標)/siRNA複合体を形成しておいた。複合体形成の間、SW1353細胞の上部の培地を、抗生物質を含まない100μLのあらかじめ加温しておいた細胞培地と交換する。次に、50μLの形成されたINTERFERin(商標)/siRNA混合物を細胞に添加し、プレートを37℃及び5%CO2のインキュベーターに戻す。
%PIN=100−((シグナル試料−Avシグナル刺激されていない対照)/(Avシグナルネガティブコントロール−Avシグナル刺激されていない対照)×100)
式中、
Avシグナル刺激されていない対照は、同じ384ELISAに関して分析された4つの96ウェルプレートすべての刺激されていない対照の平均である。
Avシグナルネガティブコントロールは、同じ384ELISAに関して分析された4つの96ウェルプレートすべての説明されたネガティブコントロールの平均である。
%PIN=100−((シグナル試料−Avシグナル背景)/(Avシグナルネガティブコントロール−Avシグナル背景)×100)
式中、
Avシグナル背景は、TIMP2 ELISAの背景シグナル、すなわちTIMP2の不在下で得られたシグナルである。
Avシグナルネガティブコントロールは、同じ384ELISAに関して分析された4つの96ウェルプレートのすべてのネガティブコントロールの平均である。
好ましい標的として検証されるために、遺伝子は、軟骨細胞において発現すべきである。このことは、定量的リアルタイムPCRを用いて評価され得る。関節軟骨(NHAC)(Cambrex、Verviers、Belgium)由来の正常ヒト軟骨細胞を、5%ウシ胎仔血清(HighClone、Perbio、Erembodegem、Belgium)を補充したDMEM/F12培地において3百個の細胞/皿で9cm培養皿へと蒔種する。2日後、培地を、10ng/mLのIL‐1βを有する若しくは有さない5%ウシ胎仔血清を補充したDMEM/F12培地によって、又は10ng/mLのIL‐1βを有するか若しくは有さない軟骨細胞分化培地(CDM、Cell Applications、San Diego、CA)と交換する。各条件を二つ組で実施する。48時間のインキュベーション後、培地を除去し、細胞を、製造元の説明書に従ってRNeasy midiキット(Qiagen、Venlo Netherlands)を用いたRNA単離のために加工し、精製されたRNAを一定分量で−20℃で保存する。
典型的な先のTARGET EPHA5を、EPHA5を阻害し、かつNHACにおけるMMP13活性も阻害する、EPHA5に対して配向する化合物によって検証及び確認した。EPHA5に対する活性は、下記の実施例6.1及び6.2において説明されるアッセイを用いて試験され得、NHACにおけるMMP13活性を阻害する能力は、実施例7において説明されるとおり試験され得る。
組換えEpha5(Milliporeカタログ番号14‐639)を、0.1mg/mLのポリ(Glu, Tyr)ナトリウム塩(4:1)、分子量20000〜50000(Sigmaカタログ番号P0275)含有キナーゼ反応緩衝液(10mM MOPS pH7.0 、1mM DTT、0.01%Triton‐X100、2.5mM MnCl2、0.5mM Na3VO4、5mMβ‐グリセロールホスファート、0.5μM非放射性ATP、0.25μCi 33P‐ガンマ‐ATP)(Perkin Elmer, カタログ番号NEG602K)とともに、5μLの試験化合物又はビヒクル(DMSO、1%終濃度)を含むか又は含まない終濃度で、総容積25μLで、ポリプロピレン96ウェルプレート(Greiner、V底)においてインキュベートする。30℃で45分後、反応を、25μL/ウェルの150mMリン酸を添加することによって停止する。終止したキナーゼ反応物をすべて、あらかじめ洗浄しておいた(75mMリン酸)96ウェルフィルタープレート(Perkin Elmerカタログ番号6005177)へと細胞回収機(Perkin Elmer)を用いて転移させる。プレートをウェルあたり300μLの75mMリン酸溶液で6回洗浄し、プレートの底部を密封する。40μL/ウェルのMicroscint‐20を添加し、プレートの上部を密封し、読み出しを、Topcount(Perkin Elmer)を用いて実施する。キナーゼ活性は、ポジティブコントロール阻害薬(10μMスタウロスポリン)の存在下で得られた1分間あたりの計数(cpm)を、ビヒクルの存在下で得られたcpmから減算することによって算出する。この活性を阻害する試験化合物の能力を以下のとおり決定する:
本アッセイの原理は、STAT3及びEPHA5で一過性に形質移入したHEK293細胞におけるSTAT3(Tyr705)リン酸化レベルに関する阻害活性を決定することである。
本明細書で同定されたTARGETのうちの1つに対して活性があるものとして同定された化合物を、MMP13阻害アッセイにおいて直接試験し得る。
8.1 バフィーコートからの好中球の単離
ヒトバフィーコートを等容積の氷冷DPBS(Invitrogenカタログ番号14190169)で希釈する。20mLの希釈したバフィーコートダウンを50mLコニカルチューブにおいて、140mMクエン酸、200mMクエン酸ナトリウム、及び220mMデキストロース4mLと穏やかに混合する。12mLの6%デキストラン/0.9%NaCl溶液(w/v)含有水を穏やかに添加し、チューブを最高20回転倒混和する。次に、総容積を新鮮チューブに転移させ、2相の完全な分離のために、室温で1時間インキュベートする。次に、黄色の上清を新たなチューブに転移させ、1300rpmで12分間、標準的な卓上遠心分離機において4℃でブレーキなしで遠心分離する。上清を廃棄し、残りの細胞ペレットを12mLの氷冷水において上下にピペッティングすることによって迅速に再懸濁する。20秒後、4mLの氷冷0.6M KClを添加し、注意深く混合し、1300rpmで12分間、標準的な卓上遠心分離機において、4℃でブレーキなしで遠心分離する。この手順を赤血球が残らなくなるまで反復する。最終的に、ペレットを15mLのチューブにおいて4mLのDPBSに再懸濁し、5mLのLymphoprep(商標)(Nycomed Pharma、カタログ番号1114545)上で層状にする。標準的な卓上遠心分離機において、4℃で低ブレーキで1300rpmで12分間の遠心分離後、上清を除去し、細胞ペレットを10mMのHEPES(Invitrogen、カタログ番号15630)を補充した25mLの走化性緩衝液(RPMI1640(Invitrogen、カタログ番号21875))において再懸濁する。
遊走アッセイを、5.0μMの孔サイズのポリカーボネートメンブレン(Corningカタログ番号3387)を有するCorning HTSトランスウェル96透過性支持システムにおいて実施する。180μLの8.9×106個の細胞/mLの細胞懸濁液を、ポリプロピレン96ウェルV底プレートにおいて、20μLの化合物溶液含有走化性緩衝液に添加する。細胞を30分間インキュベートした15分後に中間的な再懸濁をして、細胞がプレートの底部に定着するのを防止する。この後、70μLの細胞懸濁液をトランスウェルシステムの上部区画に転移させる。受容ウェルを、化合物及び走化剤を含有する200μLの走化性緩衝液で満たす。37℃で5%CO2において1時間のインキュベーション後、受容プレートに遊走する細胞の量を溶解と、ルミノメーターにおいてATP‐lite(Promega、カタログ番号6016739)を用いて可溶化液のATP含有量を測定することとによって測定する。
化合物の効果を、下記式を用いたパーセント阻害として表す:
[(ビヒクル及び走化剤の存在下でのRLU−化合物及び走化剤の存在下でのRLU)/(ビヒクル及び走化剤の存在下でのRLU−走化剤の不在下でのRLU)]×100
RLU=相対的発光単位。
GPR43に対する活性を、下記に説明されるアッセイを用いて試験し得る。
EDG4に対する化合物の活性を、下記に説明されるアッセイを用いて試験し得る。
0.75mUの組換えCSNK1G2(Milliporeカタログ番号14‐712)を0.1mg/mLカゼイン(Sigmaカタログ番号C4765)含有キナーゼ反応緩衝液(10mM MOPS pH7.0、0.01% Triton‐X‐100、0.5mM EDTA、1mM DTT、0.5mM Na3VO4、5mMベータ‐グリセロホスファート、10mM MgCl2、0.5μM非放射性ATP、0.25μCi 33P‐ガンマ−ATP(Perkin Elmer, カタログ番号NEG602K)終濃度で、試験化合物又はビヒクル(DMSO、1%終濃度)を5μL含有する又は含有しない。)とともに、総容積25μLでポリプロピレン96ウェルプレート(Greiner, V底)においてインキュベートする。30℃で45分後、25μL/ウェルの150mMリン酸を添加することによって、反応を停止させる。終止したキナーゼ反応物をすべて、あらかじめ洗浄しておいた(75mMリン酸)96ウェルフィルタープレート(Perkin Elmerカタログ番号6005177)へと、細胞回収機(Perkin Elmer)を用いて転移させる。プレートを、ウェルあたり300μの75mMリン酸溶液で6回洗浄し、プレートの底部を密封する。40μL/ウェルのMicroscint‐20を添加し、プレートの上部を密封し、Topcount(Perkin Elmer)を用いて読み出しを実施する。
Wntシグナル伝達アッセイにおいて、Wntルシフェラーゼリポーターコンストラクトを、LRP6及びCSNK1G2についての発現べクターとともにSW1353細胞へと、JetPEIトランスフェクション剤(Polyplus Transfection, カタログ番号101‐40)を用いて形質移入する。CSNK1G2過剰発現は、LRP6により誘導されるWnt‐リポーター活性を増強する。ルシフェラーゼリポーター遺伝子のCSNK1G2仲介性及びLRP6仲介性発現を、ルシフェラーゼ基質を用いて測定する。CSNK1G2活性を阻害する化合物は、リポーター活性を低下させるであろう。
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(1)アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉RNA(siRNA)の群から選択されるポリヌクレオチドを含む発現阻害薬(この中で、該ポリヌクレオチドは、TARGETポリペプチドをコードする天然のポリヌクレオチド配列と相補的なまたは前記ポリヌクレオチド配列から操作された核酸を含み、該ポリヌクレオチド配列は、配列番号1〜21からなる群から選択される配列を含む。)並びに
(2)ECM変性及び/又は変形性関節炎などの軟骨変性を特徴とする疾患の治療又は予防において有用な、該薬剤を含む医薬組成物にも関する。
Claims (33)
- ECM及び/又は軟骨変性を阻害する化合物を同定する方法であって:
(a)化合物を、配列番号39、40、27、42、22〜26、28〜38及び41並びにその断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること;及び
(b)ECM及び/又は軟骨変性と関連した化合物‐ポリペプチド特性を測定すること
を含む、前記方法。 - 前記ポリペプチドが、インビトロでの無細胞調製物中にある、請求項1記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、哺乳類細胞に存在する、請求項1記載の方法。
- 前記特性が、前記化合物の前記ポリペプチドに対する結合親和性である、請求項2記載の方法。
- 前記方法が、軟骨細胞の異化過程を阻害する化合物を同定するために用いられる、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 下記の工程を追加的に含む、請求項4記載の方法:
c)前記ポリペプチドを発現する哺乳類細胞の集団を、少なくとも10マイクロモル濃度の結合親和性を呈する化合物と接触させる工程;及び
d)ECM及び/又は軟骨変性を阻害する化合物を同定する工程。 - 前記特性が、MMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び/又はADAMTS4の発現及び/又は活性である、請求項1又は3記載の方法。
- 前記特性が、MMP13の発現及び/又は活性である、請求項7記載の方法。
- 前記特性が、前記ポリペプチドの活性である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 前記特性が、前記ポリペプチドの発現である、請求項1又は3記載の方法。
- 下記の工程を追加的に含む、請求項9又は10記載の方法:
c)前記ポリペプチドを発現する哺乳類細胞の集団を、該ポリペプチドの発現又は活性を有意に阻害する化合物と接触させる工程;及び
d)ECM及び/又は軟骨変性を阻害する化合物を同定する工程。 - 試験されるべき化合物を対照と比較する工程を追加的に含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- 前記対照が、前記ポリペプチドが前記化合物と接触しなかった場合のものである、請求項12記載の方法。
- 前記化合物を対照と比較する工程を追加的に含み、この中で、該対照が、前記ポリペプチドを発現しない哺乳類細胞の集団である、請求項6又は11記載の方法。
- 前記化合物が、市販のスクリーニングライブラリーの化合物、及び配列番号39、40、27、42、22〜26、28〜38、及び41からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対する結合親和性を有する化合物からなる群から選択される、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 前記化合物が、ファージディスプレイライブラリー又は抗体断片ライブラリーにおけるペプチドである、請求項1記載の方法。
- アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、および低分子干渉RNA(siRNA)からなる群から選択される、ECM及び/又は軟骨変性を阻害する上で有効な薬剤であって、配列番号18、19、6、21、1〜5、7〜17、及び20からなる群から選択される核酸配列の約17〜約30の連続したヌクレオチドの天然ポリヌクレオチド配列と相補的なまたは前記天然ポリヌクレオチド配列から操作された核酸配列を含む、前記薬剤。
- 哺乳類細胞におけるベクターが前記薬剤を発現する、請求項17記載の薬剤。
- ECM及び/又は軟骨変性を阻害する、請求項17記載の薬剤。
- 前記ベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はセンダイウイルスベクターである、請求項18記載の薬剤。
- 前記アンチセンスポリヌクレオチド及び前記siRNAが、センス鎖と相補的な17〜25のヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、この中で、該センス鎖が、配列番号18、19、6、21、1〜5、7〜17、及び20からなる群から選択される核酸配列の17〜25の連続したヌクレオチドから選択される、請求項17記載の薬剤。
- 前記siRNAがさらに前記センス鎖を含む、請求項21記載の薬剤。
- 前記センス鎖が、配列番号55、46、47、57、43〜45、48〜54、及び56からなる群から選択される、請求項22記載の薬剤。
- 前記siRNAが、前記センス及び前記アンチセンス鎖を接続するループ領域をさらに含む、請求項21記載の薬剤。
- 前記薬剤が、配列番号39、40、27、42、22〜26、28〜38、及び41からなる群から選択される核酸配列と相補的な核酸配列を含むアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、又はsiRNAである、請求項17〜25のいずれか一項記載の薬剤。
- 請求項17〜26のいずれか一項記載の治療有効量の薬剤を、医薬として許容し得る担体との混合物において含む医薬組成物。
- ECM及び/又は軟骨変性を包含する疾患の治療及び/又は予防における使用のための、請求項17〜26のいずれか一項記載の薬剤。
- 前記疾患が、変形性関節症である、請求項28記載の薬剤。
- ECM及び/又は軟骨変性を特徴とする容態の治療又は予防における使用のための、請求項17〜26のいずれか一項記載の薬剤。
- 対象におけるECM及び/又は軟骨変性を包含する病理学的容態の治療及び/又は予防のための方法であって、該対象に、配列番号39、40、27、42、22〜26、28〜38、及び41からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド及びその断片、並びに配列番号18、19、6、21、1〜5、7〜17、及び20からなる群から選択される核酸配列の約17〜約30の連続したヌクレオチドの天然ポリヌクレオチド配列と相補的な核酸配列または該天然ポリヌクレオチド配列から操作された核酸配列を含むアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉RNA(siRNA)と結合親和性を有する薬剤からなる群から選択される治療有効量の薬剤を投与することを含む前記方法。
- ECM及び/又は軟骨変性を包含する病理学的容態を診断する方法であって、前記対象から得られた生物学的試料中に存在する配列番号39、40、27、42、22〜26、28〜38、及び41からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの第一の量又は活性を決定することと、該第一の量又は活性を、健常対象の集団において決定されたポリペプチドの量又は活性の範囲と比較することとを含み、この中で、健常対象について決定された量又は活性の範囲と比較した該生物学的試料中のポリペプチドの量又は活性の増大が、前記病理学的容態の存在を示す、前記方法。
- 病理学的容態が変形性関節症である、請求項31又は32記載の方法。
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