JP2005504766A - プロリンエンドペプチダーゼ阻害剤の、細胞内シグナルカスケード依存性イノシトール（１，４，５）トリホスフェート濃度調節への使用。 - Google Patents

Abstract

本発明は、人の様々な組織におけるプロリルエンドペプチダーゼの酵素活性の調節方法および細胞内イノシトール（１，４，５）トリホスフェート濃度へのその生物学的影響について開示する。本発明はまた、プロリルエンドペプチダーゼの阻害活性による内因性神経学的および細胞内シグナル発信カスケードの相乗作用について開示する。本発明はさらに、プロリンエンドペプチダーゼ活性の阻害によるＩＰ₃濃度のサブスタンスＰ仲介刺激の増幅について開示する。ＰＥＰ活性減少の第２メッセンジャー濃度における効果は、ＰＥＰ阻害による認識増強に重要な影響を与えるこのペプチダーゼの新たな細胞内作用を示す。さらに、本発明は、ニューロン性疾患、例えば、学習および記憶障害、自己免疫疾患およびＴリンパ球仲介免疫疾患、並びに活性化線維芽細胞および／またはＴリンパ球によって仲介される創傷治癒のような組織再生過程の治療について開示する。

Description

【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、様々なヒトの組織におけるプロリンエンドペプチダーゼの作用、および細胞内イノシトール（１，４，５）トリホスフェート（ＩＰ₃）濃度へのそれらの生物学的影響に関する。本発明はまた、内因性神経学的および細胞内シグナルカスケードの相乗作用に関する。この発明はさらに、プロリルエンドペプチダーゼ活性阻害によるＩＰ₃濃度のサブスタンスＰ仲介刺激の増幅に関する。ＰＥＰ活性減少の第２メッセンジャー濃度への影響は、ＰＥＰ阻害による認識増強に重要な効果を有するこのペプチダーゼの新たな細胞内作用を示す。さらに、この発明は、学習および記憶障害のようなニューロン性疾患、自己免疫疾患およびＴリンパ球仲介免疫疾患、並びに活性化線維芽細胞および／またはＴリンパ球によって仲介される創傷治癒のような組織再生過程の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ；ＥＣ．３．４．２１．２６；プロリルオリゴペプチダーゼとも呼ばれる）はオリゴペプチダーゼ活性を特徴とするセリンペプチダーゼである。それはｃｌａｎＳＣにおいて系Ｓ９Ａの酵素、プロリンオリゴペプチダーゼであることを示す名称である（１）。ｃｌａｎＳＣに属する酵素は、トリプシン−またはサブチリシン型セリンペプチダーゼとは構造の点でおよび主要配列における触媒性三つ組残基の順序の点で異なる（２；３）。最近報告されたＰＥＰの３次元構造から２つのドメイン構成が明らかになった（４）。触媒性ドメインは、触媒性三つ組（Ｓｅｒ５５４、Ｈｉｓ６８０、Ａｓｐ６４１）がいわゆるβ推進ドメインで覆われているα／β加水分解酵素ホールドを示す。十中八九、推進ドメインは潜在的基質が酵素の活性部位へアクセスするのを制御し、３０以上のアミノ酸を有するペプチドを排除する。
【０００３】
ＰＥＰの酵素的および構造的性質に関する知識は詳しく知られているにもかかわらず、この酵素の生物学的作用は十分に理解されているとは決して言えない。哺乳動物において高度に保存されているＰＥＰは偏在分布されている。
【０００４】
ここで、我々は、長期相乗作用（ＬＴＰ）並びに学習および記憶に関係するＰＥＰ阻害の新しい利用法を示す。本発明は、ＰＥＰ発現の少ないアンチセンス細胞並びに特異的阻害剤を用いて、ＩＰ₃濃度とＰＥＰ活性との間の逆の相互関係を証明するものである。データは、ニューロペプチドによって仲介されるシグナル形質導入への混線（cross-talk）を伴う第２メッセンジャー経路におけるＰＥＰの間接的なかかわりを示す。
【０００５】
ＪＰ０７１６３３６７、ＪＰ０４０６６０８５、ＪＰ０５２１９９６２には、組換えプロリルエンドペプチダーゼの製造法が開示されている。
ＪＰ０６０１４７７６およびＥＰ０５２２４２８には、微生物の培養によるアスペルギルス オリゼー（Aspergillus oryzae）ＦＳ１−３２（ＦＥＲＭ１２１９３）からのプロリルエンドペプチダーゼの製造が開示されている。
ＪＰ０７０６７６３８には、シュードモナス属に属するバクテリア株の培養によるプロリルエンドペプチダーゼの製造が開示されている。
ＪＰ１００６６５７０には、スフィンゴモナス属に属するバクテリア株の培養によるプロリルオリゴペプチダーゼの製造が開示されている。単離されたプロリルオリゴペプチダーゼは調味料および調味料用材料の製造に有用であることが特許請求されている。
ＪＰ０５０１５３１４には、ペプチドの苦味の目的除去にプロリルエンドペプチダーゼまたはカルボキシペプチダーゼを含むプロテアーゼ配合物を使用することが特許請求されている。
【０００６】
参考文献
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【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
細胞内作用を調べるために、プロリルエンドペプチダーゼの発現をアンチセンス技術によって星状神経膠腫細胞系Ｕ３４３において減少させた。イノシトール（１，４，５）トリホスフェート（ＩＰ₃）の測定から、生じたアンチセンス細胞系においてＩＰ₃濃度とＰＥＰ発現との間の逆の相互関係が分かった。特異的ＰＥＰ阻害剤Ｆｍｏｃ−アラニル−ピロリン−２−ニトリル（５μＭ）によるＰＥＰ活性の完全な抑制は、Ｕ３４３野生型細胞において、ＩＰ₃濃度の遅いが増強された増加を誘導した。このことは、ＰＥＰのたんぱく分解活性が観察された効果を招いていることを示唆している。さらに、ＰＥＰ活性の減少がＩＰ₃濃度のサブスタンスＰ仲介刺激を増幅することが分かった。減少したＰＥＰ活性の第２メッセンジャー濃度への影響は、ＰＥＰ阻害により認識増強を生じるというこのペプチダーゼの新たな作用を示す。これは、プロリルエンドペプチダーゼの特に経口活性な低分子量阻害剤を用いる本発明によって達成しうる。
【０００８】
図面の簡単な説明
添付の図面を参照することにより本発明はさらに理解されうる。
図１は、ＲＴ−ＰＣＲを嵌め込んだ後のヒト神経膠腫細胞系Ｕ３４３からのＰＥＰの触媒性ドメインのｃＤＮＡについてのアガロースゲル電気泳動を示す。｛全体のＲＮＡは１×１０⁷Ｕ３４３細胞から調製した。ＰＥＰのコーディング領域はＲＴ−ＰＣＲによって増幅され、触媒性ドメイン（アミノ酸４４２−７３１）のｃＤＮＡは嵌め込まれたプライマーによって得た（レーン１）。アクチンｍＲＮＡの検出は正の対照として用いた（レーン２）。｝
【０００９】
図２は、樹立アンチセンス細胞系におけるＰＥＰ発現のウエスターンブロット分析を示す。｛各アンチセンス細胞系の残留ＰＥＰ活性はウエスターンブロット分析におけるシグナル強度に相当する。下記の「実験手順」のように各細胞系からの１×１０⁷細胞を抽出し、分析した。１レーン当たり２０μｇの合計たんぱく質を加えた。精製組換えヒトＰＥＰを正の対照として用いた（７５ｎｇ）。ウエスターンブロットはＰＥＰ特異的抗体Ｓ４４９（１：４００）および抗アクチン（１：２５００）でプローブし、化学ルミネセンスによって検出した。｝
【００１０】
図３は、各種Ｕ３４３細胞系におけるＩＰ₃濃度の分析を示す。｛Ａ）ＰＥＰ活性の減少は安定な形質移入細胞系におけるＩＰ₃濃度の増加を誘導する。ヒト神経膠腫細胞系Ｕ３４３はアンチセンス方向にＰＥＰ触媒性ドメイン（アミノ酸４４２−７３１）のコーディング配列を含むベクター（ｐＩＲＥＳ）で形質移入された。挿入物（ｐＩＲＥＳ）を含まないベクターで形質移入した細胞系は負の対照として用いた。Ｂ）特異的ＰＥＰ阻害剤Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮ（５μＭ）で処理した野生型Ｕ３４３細胞はＩＰ₃濃度の増加を示す；データは４組づつで得（平均±ＳＤ）、不対ｔ−検定によって分析した（^***ｐ＜０．００１；^**ｐ＜０．０１；^*ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．有意性なし）。｝
【００１１】
図４は、ＰＥＰ阻害剤Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮで処理したＵ３４３細胞におけるＰＥＰ活性およびＩＰ₃濃度の時間経過を示す。｛ＰＥＰ活性（▲）は５μＭＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮでただ１回処理した１分後にすでに全体的に阻害されているのが分かったが、ＩＰ₃濃度（○）は最高濃度に達するのに１２時間要した。結果は４組づつの実験からの平均±標準誤差として示す。｝
【００１２】
図５は、ヒト神経膠腫細胞系Ｕ３４３のニューロキニンレセプターｍＲＮＡの検出を示す。｛全体のＲＮＡは１×１０⁷Ｕ３４３細胞から製造した。ＮＫ−Ｒ ｍＲＮＡの発現は、特異的プライマー（レーン１ ＮＫ−１Ｒ、レーン２ ＮＫ−２Ｒ、レーン３ ＮＫ−３Ｒ）を用いてＲＴ−ＰＣＲで検出した。｝
【００１３】
図６は、ヒト神経膠腫細胞系Ｕ３４３の様々な細胞区分で測定されたＰＥＰ活性を示す。｛ＰＥＰ活性はＵ３４３細胞のサイトゾルに主に存在する。さらに、わずかなＰＥＰ活性が他の細胞構造内で検出され、これらは十中八九、区分の不十分な分離によるものである。状態調節した培地および細胞は、下記の「実験手順」のように細胞溶解および細胞分別に従って分離した。ＰＥＰ活性は状態調節した培地（ＣＭ）、全細胞抽出物（ＣＥ）、および核の濃縮フラクション（Ｐ１）、液胞（Ｐ１０）、細胞構造成分（Ｐ１００）、および細胞質たんぱく質（Ｓ１００）中で測定し、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして示す；ｎ．ｄ．は検出不可。｝
【００１４】
図７は、サブスタンスＰで刺激した各種Ｕ３４３細胞系のＩＰ₃濃度を示す。｛ＩＰ₃濃度は、５μＭ Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮの存在下、１２時間、インキュベーションありまたはなしでＵ３４３野生型細胞においておよび細胞系ａｓ２において測定した。各細胞系は１μＭサブスタンスＰで５秒間刺激し、次いで、ＩＰ₃抽出および測定を行った。データ（平均±ＳＤ）は４組で得，有意分析は対のｔ−検定によって行った（^**ｐ＜０．０１；^*ｐ＜０．０５）。｝
【００１５】
図８は、Ｕ３４３細胞におけるサブスタンスＰによるＩＰ₃刺激の動的特徴を示す。｛Ａ）サブスタンスＰによるＩＰ₃刺激の動的特徴はわずかな増加を示すが、阻害剤処理細胞（○）および対照細胞（●）のパターンは似ている。Ｕ３４３野生型細胞は実験前に１２時間、５μＭ Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮ（Υ）で処理した。Ｂ）Ｕ３４３からのアンチセンス細胞系２（△）は野生型細胞と同様の刺激パターンを示す；細胞は１μＭサブスタンスＰで刺激し、様々な時点で採取してＩＰ₃を抽出した。平均±ＳＤとして示した全ての時点は４組の実験によるものである。｝
【００１６】
図９は、各種ヒト細胞系におけるＰＥＰ発現のウエスターンブロット分析を示す。｛６つの培養ヒト細胞系（１ Ｕ３４３、２ＬＮ−４０５；３ ＳＨ−ＳＹ５Ｙ；４ ＢｅＷｏ；５ Ｕ−１３８−ＭＧ；６ ＣＡＣＯ−２）で検出されたＰＥＰシグナルは、これらにおいて測定されたＰＥＰ活性と相互に関連する。非培養凍結ストックではシグナルは全く検出できなかった。各細胞系からのサイトゾル上澄み液を分析した。レーン毎に１０μｇ（レーン１〜３）、２０μｇ（レーン５）および４０μｇ（レーン４、６）のサイトゾル上澄み液を加えた。ウエスターンブロットはＰＥＰ特異的抗体Ｓ４４９（１：４００）と共にインキュベートし、化学ルミネセンス法で検出した。
【００１７】
図１０は、ラットの脳におけるＰＥＰ発現のウエスターンブロット分析を示す。｛各脳領域で測定されたＰＥＰ活性はウエスターンブロット分析のシグナルと相互に関連する。各脳領域（１ 皮質、２ 海馬、３ 延髄、４ 小脳、５ 視床、前頭葉）からの組織を分析した。３０μｇの全部のたんぱく質をレーン毎に加えた。サイトゾルＵ３４３細胞系上澄み液を正の対照として用いた（Ｍ、２０μｇ／レーン）。ウエスターンブロットはＰＥＰ特異的抗体Ｓ４４９（１：４００）と共にインキュベートし、化学ルミネセンス法で検出した。｝
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は特に、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の、イノシトール（１，４，５）トリホスフェートの細胞内レベル調節用薬剤製造への使用に関する。
【００１９】
プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ；ＥＣ．３．４．２１．２６；プロリルオリゴペプチダーゼとも呼ばれる）はオリゴペプチダーゼ活性を特徴とするセリンペプチダーゼである。そのペプチダーゼ活性により、ＰＥＰは細胞内シグナル発信および細胞内シグナル発信カスケードの仲介にかかわる。
【００２０】
意外なことに、我々は細胞培養実験で、細胞外スペースのＰＥＰを測定することはできず、ＰＥＰが主に細胞内に局在することを見出した。本発明では、細胞内ＰＥＰ活性の阻害がペプチドホルモン依存性細胞内イノシトール（１，４，５）トリホスフェート（ＩＰ₃）濃度の調節に用いうることを示す。さらに意外なことに、ペプチドホルモンは細胞外にあり、細胞内にある酵素にアクセスできないので、ＰＥＰはシグナル発信ペプチドホルモンを開裂しないが、ＰＥＰはペプチドホルモン誘導レセプターシグナルの細胞内仲介にかかわる。さらに、ＰＥＰ活性の阻害はサブスタンスＰ濃度に影響を与えないが、細胞内ＩＰ₃濃度変更のサブスタンスＰ−レセプター誘導シグナルを増強する。
【００２１】
１９７１年にオキシトシン不活性化酵素として初めて報告されたとき（１２）、プロリルエンドペプチダーゼについての我々の知識は酵素的および構造的性質に関して高まっただけであり、生理学的作用は依然として不明のままである。
【００２２】
ＰＥＰ阻害剤は、基質のＰ₁位置にあるプロリン残基により一般に非常に特異的である（Berger and Schlechter nomenclature、（１６））。しかしながら、２つの異なる阻害法が用いられてきた。ＰＥＰの発現が少ないアンチセンス細胞系によって、この２つのドメインたんぱく質についての非酵素的性質の生物学的作用に関する研究が可能となる。さらに、この方法は阻害剤内の反応性基の予想される非特異的作用を回避するものである。ＰＥＰ発現量の減少が様々な８つの安定したアンチセンス細胞系が開発された。全ての細胞系において、ＰＥＰ発現減少と残留酵素活性との間に強力な相互関係が観察された（表１）。これらの細胞系における培養および形態の差異は観察することができたが、表現型における共通の変化はなかった。観察された変化は、アンチセンスコーディングＤＮＡがランダムにゲノムに挿入されなければならない、アンチセンス細胞系をつくるのに用いられた方法に、関係があると思われる。Ｕ３４３細胞における表現型変化は、細胞がＰＥＰ阻害剤の存在下で培養されたときには見られなかった。
【００２３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、定義では、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列である。いったん細胞に導入されると、相補的ヌクレオチドは、細胞によってつくられた自然の配列と組み合わさって、複合体を形成し、そして転写または翻訳のいずれかを妨害する。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは長さが少なくとも１１のヌクレオチドであり、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０以上のヌクレオチドの長さであってもよい。さらに長い配列も用いうる。上記のようにアンチセンスオリゴヌクレオチド分子をＤＮＡ組み立てに提供し、そして細胞に導入して、細胞内のプロリルエンドペプチダーゼ遺伝子産物のレベルを減じることができる。
【００２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または両者の組み合わせでもよい。オリゴヌクレオチドは、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミデート、ホスフェートエステル、カルバメート、アセタミデート、カルボキシメチルエステル、カルボネート、およびホスフェートトリエステルのような非ホスホジエステルヌクレオチド間結合で、１つのヌクレオチドの５`末端を別のヌクレオチドの３`末端へ共有結合することによって、手でまたはオートメーション化合成器で合成することができる。Brown, Meth. Mol. Biol. 20, 18, 1994; Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26,1-72, 1994; Uhlmann et al. Chem. Rev. 90, 543-583 1990参照。
【００２５】
プロリルエンドペプチダーゼ酵素遺伝子発現の変更は、プロリルエンドペプチダーゼ酵素遺伝子の制御５´または調節領域へ二重鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することによって得ることができる。転写開始部位、例えば出発部位から位置１０と＋１０との間から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、阻害は、「三重らせん」塩基ペアリング法を用いて達成することができる。三重らせんペアリングは、結合ポリメラ−ゼ、転写因子、またはチャペロン（chaperon）に対して二重らせんを十分に開く能力を阻害するので有用である。三重ＤＮＡを用いる治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Gee et al., in Huber & Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., ニューヨーク マウントキスコ, 1994）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、トランスクリプトのリボソームへの結合を妨げることによって、ｍＲＮＡの翻訳を妨害するようにすることもできる。
【００２６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとプロリルエンドペプチダーゼ酵素ポリヌクレオチドの相補的配列との間の複合体をうまく形成するのに、正確な相補性は必要ではない。隣接プロリルエンドペプチダーゼ酵素ヌクレオチドに対して相補的ではない１伸びの隣接ヌクレオチドによってそれぞれ分離されている、プロリルエンドペプチダーゼ酵素ポリヌクレオチドに対して正確に相補的である、例えば２、３、４または５以上の伸びの隣接ヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、プロリルエンドペプチダーゼ酵素ｍＲＮＡに十分な目標特異性をもたらすことができる。好ましくは、相補的隣接ヌクレオチドの各伸びは、少なくとも４、５、６、７または８以上のヌクレオチドの長さである。非相補的介在配列は１、２、３または４ヌクレオチドの長さであるのが好ましい。本技術分野における当業者であれば、アンチセンス−センス対の計算された融点を用いて、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定のプロリルエンドペプチダーゼ酵素ポリヌクレオチド配列との間で許容されるミスマッチ度を容易に判定することができる。
【００２７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズする能力をプロリルエンドペプチダーゼ酵素ポリヌクレオチドへ影響させることなく、修飾することができる。これらの修飾はアンチセンス分子の内部でもまたは一端もしくは両端でもよい。例えば、ヌクレオチド間ホスフェート結合は、アミノ基と末端リボースとの間に様々な数の炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン部分を加えることによって、修飾することができる。修飾された塩基および／または糖、例えばリボースの代わりにアラビノースまたは３’置換オリゴヌクレオチド（３’ヒドロキシ基または５’ホスフェート基が置換されている）を修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに用いてもよい。これらの修飾されたオリゴヌクレオチドは、本技術分野で周知の方法で製造しうる。例えば、Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10, 152158, 1992; Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543584, 1990; Uhlmann et al., Tetrahedron Lett. 215, 35393542, 1987参照。
【００２８】
Ｕ３４３細胞の培養中、我々はＰＥＰの有意な細胞外活性を検出することができなかった。全ての活性は細胞質フラクション中に見られた（図６）。さらに、ＰＥＰ−ＧＦＰ融合たんぱく質の過剰発現は酵素の細胞内局在を示した。関連の可能性が不明瞭であるのは、ニューロペプチドのレセプター仲介シグナル発信カスケードにＰＥＰが細胞内でかかわっているからかもしれない。
【００２９】
興味深いことに、哺乳動物の神経膠腫細胞系Ｕ３４３において、ＩＰ₃濃度が、ＰＥＰの発現減少に応じて、かつ阻害剤によって抑制されるたんぱく分解活性に依存して、増加することを見出した（図３）。しかしながら、アンチセンス細胞系で観察されるＩＰ₃の増加量からは、ＰＥＰのどのドメインがこの効果を招いたのかについては依然として疑問のままである。特異的阻害剤で観察される結果は、酵素内の触媒性ドメインのかかわり合いを示す。用いた阻害剤Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮは基質のように酵素と互いに作用しあい、酵素の活性部位への変化を制限する（９；１７）。このことは、ＰＥＰのたんぱく分解活性の低下がＩＰ₃濃度の上昇を招くことを強く示唆している。内質レチクリウム（ＥＲ）からのＣａ²⁺の放出はＩＰ₃レセプターおよびリアノジンレセプターによって制御される。それゆえ、ＰＥＰ阻害によるＩＰ₃の増幅は、ＥＲからのＣａ²⁺の細胞内の放出に寄与しているかもしれない。
【００３０】
星状神経膠腫細胞系Ｕ３４３はニューロペプチドサブスタンスＰに対する特異的レセプターであるＮＫ−Ｒ １を発現する（図４）。Ｕ３４３アンチセンス細胞系およびＰＥＰ阻害剤と共にインキュベートした細胞はいずれもサブスタンスＰ刺激後にＩＰ₃シグナルの増幅を示した（図７）が、刺激の動的特徴は変化のないままである（図８）。この増幅は、ＰＥＰがサブスタンスＰのようなニューロペプチドのシグナル発信カスケードに影響を与えることを裏づけている。しかしながら、ＩＰ₃シグナルの増幅は、一部は第２メッセンジャーのベースラインレベルの増加により、そして一部はサブスタンスＰの効力の増大による。さらに、観察される効果は間接的である：ＰＥＰの全体的阻害に対するＩＰ₃濃度の極めて遅い反応はその示唆を裏づけている（図３）。さらに、ＰＥＰの酵素活性はＰ₁プロリン残基に隣接するホスホリル化残基によって抑制することができる。
【００３１】
ＰＥＰの分布は偏在する。全ての試験細胞系において、表２ａおよび２ｂに示すように、相応なＰＥＰ活性を検出することができた。しかしながら、神経膠腫細胞系ＬＮＺ３０８を除いて、脳細胞系は最高活性を示す。脳におけるＰＥＰの高い分布は、ラットの脳の様々な区分での高濃度によってさらに裏づけられる（図１０）。
【００３２】
要するに、この結果は、サブスタンスＰのようなニューロペプチドのシグナル形質導入カスケードとセリンペプチダーゼ、プロリルエンドペプチダーゼとの間の新しいタイプの相互作用を示している。その細胞内局在により、ＰＥＰのシグナル発信カスケードへの影響は、そのような方法でＰＥＰ阻害剤が学習および記憶を増強しうる新しい可能性を提供する。従って、プロリルエンドペプチダーゼの阻害剤は、学習および／または記憶障害の治療に用いうる。さらに、ＰＥＰの阻害は、ＩＰ₃濃度の調節による細胞内シグナル発信カスケードがかかわる他の疾患において役割を演じる。そのような疾患は自己免疫疾患、Ｔ−リンパ球仲介免疫疾患、ならびに活性化線維芽細胞および／またはＴリンパ球によって仲介される創傷治癒のような組織再生過程である。ＰＥＰ阻害剤はこれら疾患の治療に用いうる。
【００３３】
本技術分野において提案された他の方法とは対照的に、本発明はプロリルエンドペプチダーゼの低分子量阻害剤での任意に経口的に用いうる治療を提供する。本発明は、ニューロン性疾患、例えば、学習および記憶障害、自己免疫疾患、Ｔ−リンパ球仲介免疫疾患、ならびに活性化線維芽細胞および／またはＴリンパ球によって仲介される創傷治癒のような組織再生過程を治療するための新規な対処法である。
【００３４】
公知のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、例えば、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮおよび以下に挙げるものである：
【００３５】
【化１】

【００３６】
他のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤は、ＪＰ０１０４２４６５、ＪＰ０３０３１２９８、ＪＰ０４２０８２９９、ＷＯ００７１１４４、ＵＳ５８４７１５５、ＪＰ０９０４０６９３、ＪＰ１００７７３００、ＪＰ０５３３１０７２、ＪＰ０５０１５３１４、ＷＯ９５１５３１０、ＷＯ９３００３６１、ＥＰ０５５６４８２、ＪＰ０６２３４６９３、ＪＰ０１０６８３９６、ＥＰ０７０９３７３、ＵＳ５９６５５５６、ＵＳ５７５６７６３、ＵＳ６１２１３１１、ＪＰ６３２６４４５４、ＪＰ６４００００６９、ＪＰ６３１６２６７２、ＥＰ０２６８１９０、ＥＰ０２７７５８８、ＥＰ０２７５４８２、ＵＳ４９７７１８０、ＵＳ５０９１４０６、ＵＳ４９８３６２４、ＵＳ５１１２８４７、ＵＳ５１００９０４、ＵＳ５２５４５５０、ＵＳ５２６２４３１、ＵＳ５３４０８３２、ＵＳ４９５６３８０、ＥＰ０３０３４３４、ＪＰ０３０５６４８６、ＪＰ０１１４３８９７、ＪＰ１２２６８８０、ＥＰ０２８０９５６、ＵＳ４８５７５３７、ＥＰ０４６１６７７、ＥＰ０３４５４２８、ＪＰ０２２７５８５８、ＵＳ５５０６２５６、ＪＰ０６１９２２９８、ＥＰ０６１８１９３、ＪＰ０３２５５０８０、ＥＰ０４６８４６９、ＵＳ５１１８８１１、ＪＰ０５０２５１２５、ＷＯ９３１３０６５、ＪＰ０５２０１９７０、ＷＯ９４１２４７４、ＥＰ０６７０３０９、ＥＰ０４５１５４７、ＪＰ０６３３９３９０、ＵＳ５０７３５４９、ＵＳ４９９９３４９、ＥＰ０２６８２８１、ＵＳ４７４３６１６、ＥＰ０２３２８４９、ＥＰ０２２４２７２、ＪＰ６２１１４９７８、ＪＰ６２１１４９５７、ＵＳ４７５７０８３、ＵＳ４８１０７２１、ＵＳ５１９８４５８、ＵＳ４８２６８７０、ＥＰ０２０１７４２、ＥＰ０２０１７４１、ＵＳ４８７３３４２、ＥＰ０１７２４５８、ＪＰ６１０３７７６４、ＥＰ０２０１７４３、ＵＳ４７７２５８７、ＥＰ０３７２４８４、ＵＳ５０２８６０４、ＷＯ９１１８８７７、ＪＰ０４００９３６７、ＪＰ０４２３５１６２、ＵＳ５４０７９５０、ＷＯ９５０１３５２、ＪＰ０１２５０３７０、ＪＰ０２２０７０７０、ＵＳ５２２１７５２、ＥＰ０４６８３３９、ＪＰ０４２１１６４８およびＷＯ９９４６２７２に開示されており、これらの教示は、全て（特にこれらの阻害剤、それらの定義、使用およびそれらの製造に関する）を参照することによってここに記載されたものとする。
【００３７】
別の態様では、本発明は、
ａ）ペプチドホルモン、および／または
ｂ）プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤
の組み合わせ使用に関する。従って、ａ）とｂ）のどのようなプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤とのどのような組み合わせも本発明により可能である。
【００３８】
サブスタンスＰのようなペプチドホルモンの日用量は、１ｎＭ〜１０μＭ／ｋｇ体重／日、好ましくは１００ｎＭ〜１μＭ／ｋｇ／日、より好ましくは３００ｎＭ〜５００ｎＭ／ｋｇ／日の広い範囲で変えうる。
【００３９】
ペプチドホルモンは、例えば、アンギオテンシンＩ、ブラジキニン増強ペプチド（ＢＰＰ）、ブラジキニン、ルリベリン、メラノトロピン、ニューロテンシン、オキシトシン、サブスタンスＰ、チロリベリン、タフトシン、またはバソプレシンである。
【００４０】
少なくとも２種の上記化合物を組み合わせて用いることは、各患者または病気に最適な活性成分の作用持続期間、作用の開始および部位特異性を選択調節しうる点で有利である。さらに、サブスタンスＰと少なくとも１種のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を組み合わせて投与すると、サブスタンスＰまたはプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤のいずれかを単独で用いた場合と比較して、ＩＰ₃濃度が増加する相乗効果を予想外にもたらす。さらに詳しくは、サブスタンスＰおよび／またはプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の投与により、イノシトールポリホスフェート、例えばＩＰ₃、ＩＰ₄、ＩＰ₅、ＩＰ₆等の細胞内濃度のバランスがＩＰ₃過剰に変化する。ＩＰ₄、ＩＰ₅、ＩＰ₆等のような高級イノシトールポリホスフェートは、イノシトールホスフェート結合たんぱく質の調節剤である。そのようなイノシトールポリホスフェート結合たんぱく質は、例えば、シナプトタグミン、ＧＴＰａｓｅ−活性化たんぱく質Ｇａｐｌ^IP4BPおよびＧａｐｌ^m、ブルトンのチロシンキナーゼ（ＢｔＫ）、プロテオリピド−たんぱく質（ＰＬＰ）、ビンクリン、センタウリンα、ゴルジコアトマー、ｐ１３０、ＡＰ−２およびＡＰ−３である。上記イノシトールポリホスフェート結合たんぱく質が、細胞骨格の構築において、細胞内小胞移送プロセス、特に神経伝達物質の放出にかかわっていること、そして従って、神経変性疾患、特定組織の疾患および細胞サイクル再生にかかわっていることを我々は見出した。
【００４１】
従って、学習および記憶障害、自己免疫疾患、Ｔ−リンパ球仲介免疫疾患、ならびに活性化線維芽細胞および／またはＴ−リンパ球によって仲介される組織再生過程（例えば創傷の治癒）のようなニューロン性疾患を非常に特異的な方法で治療することができる。サブスタンスＰをＰＥＰ阻害剤と組み合わせて用いると、ただちに改善される。
【００４２】
さらに、ニューロン性疾患、例えば学習および記憶障害、自己免疫疾患、Ｔ−リンパ球仲介免疫疾患および組織再生過程（例えば創傷の治癒）の長期治療と組み合わせた治療／改善のただちの始まりは、ＰＥＰ阻害剤をサブスタンスＰ含有薬剤と組み合わせて用いることによって得られる。
【００４３】
学習および記憶障害、自己免疫疾患、Ｔ−リンパ球仲介免疫疾患、ならびに活性化線維芽細胞および／またはＴ−リンパ球によって仲介される組織再生過程（例えば創傷の治癒）のようなニューロン性疾患のようないくつかの疾患にかかわる細胞内ＩＰ₃濃度、およびその後の細胞内シグナル発信カスケードを調節するＰＥＰ阻害剤として有効な化合物の有用性は、実施例２および３に記載の手順に従って測定することができる。従って、本発明は、ＰＥＰ活性の調節によって仲介される症状の治療を必要とする患者におけるそのような症状の治療法を提供するものであり、その方法は、ここで定義されるような化合物または医薬組成物をそのような症状の治療に有効な量でおよび薬学的に許容される組成物の形で投与することを含む。さらに、本発明には、そのような化合物の、ＰＥＰ活性の調節によって仲介される症状の治療用薬剤製造への使用が含まれる。化合物は一般的な投与ルート、限定されるものではないが、例えば静脈内、経口、皮下、筋肉内、経皮および非経口ルートで患者に投与しうる。
【００４４】
好ましいＰＥＰ阻害剤は置換されたアミノケトン、例えば、ベンジル−Ｎ−［１−（シクロペンチルカルボニル）−２−メチルブチル］カルバメートである。
【００４５】
本発明はさらに、プロリルエンドペプチダーゼに結合するあるいはこれの活性または発現を調節する試験化合物のスクリーニング法を提供する。好ましくは、試験化合物はプロリルエンドペプチダーゼまたはプロリルエンドペプチダーゼコーディング遺伝子に結合する。さらに好ましくは、試験化合物不在に対して、試験化合物はプロリルエンドペプチダーゼ活性を、少なくとも約１０％、好ましくは約５０％、より好ましくは約７５、９０または１００％まで減じる。最も好ましくは、試験化合物不在に対して、試験化合物はプロリルエンドペプチダーゼ活性を少なくとも約１０％、好ましくは約５０％、より好ましくは約７５、９０または１００％まで減じ、そして細胞内イノシトール（１，４，５）トリホスフェート濃度を少なくとも約１倍、好ましくは約２倍、より好ましくは約３倍、４倍またはそれ以上増加する。
【００４６】
スクリーニング法は次の工程を組み合わせる：
− イノシトール（１，４，５）トリホスフェートおよびプロリルエンドペプチダーゼを含む細胞を準備する工程、例えば、限定されないが、ヒト神経膠腫細胞系Ｕ３４３、ヒト神経芽腫細胞系ＳＨ−ＳＹ５Ｙおよびヒト星状神経膠腫細胞系ＬＮ−４０５から選択する、
− 細胞のイノシトール（１，４，５）トリホスフェートおよびプロリルエンドペプチダーゼ活性を測定する工程、サブスタンスＰ濃度およびプロリルエンドペプチダーゼ活性の基本レベルはそれぞれ０．３ｐｍｏｌ／１０⁶細胞および２０〜４０ｍＵ／ｍｇ細胞抽出物である、
− 細胞を試験化合物と共にインキュベートする工程、
− イノシトール（１，４，５）トリホスフェート濃度を測定する工程、
− 任意に、残留プロリルエンドペプチダーゼ活性を測定する工程、および
− 任意に、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を単離する工程。
【００４７】
任意に、ＩＰ₃濃度が上昇する可能性についての試験化合物の効力をサブスタンスＰのようなペプチドホルモンの投与と組み合わせてスクリーンすることもできる：
− イノシトール（１，４，５）トリホスフェートおよびプロリルエンドペプチダーゼを含む細胞を準備する工程、例えば、限定されるものではないが、ヒト神経膠腫細胞系Ｕ３４３、ヒト神経芽腫細胞系ＳＨ−ＳＹ５Ｙおよびヒト星状神経膠腫細胞系ＬＮ−４０５から選択する、
− 細胞のイノシトール（１，４，５）トリホスフェート濃度およびプロリルエンドペプチダーゼ活性を測定する工程、ペプチドホルモン（例えば、サブスタンスＰ）濃度およびプロリルエンドペプチダーゼ活性の基本レベルはそれぞれ０．３ｐｍｏｌ／１０⁶細胞および２０〜４０ｍＵ／ｍｇ細胞抽出物である、
− 細胞をサブスタンスＰのようなペプチドホルモンと組み合わせた試験化合物と共にインキュベートする工程
− イノシトール（１，４，５）トリホスフェート濃度を測定する工程、
− 任意に、残留プロリルエンドペプチダーゼ活性を測定する工程、および
− 任意に、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を単離する工程。
【００４８】
公知のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤より高いイノシトール（１，４，５）トリホスフェート濃度をもたらすプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が単離されるのが好ましい。
【００４９】
試験化合物は本技術分野ですでに知られている薬理学的薬剤でも、どのような薬理学的活性を有する未知の化合物でもよい。化合物は天然由来のものでも、実験室で設計されたものでもよい。それらは微生物、動物、または植物から単離されても、組換え生成されても、あるいは本技術分野における化学的方法で合成されてもよい。望ましいならば、試験化合物は本技術分野において公知の多くの組み合わせライブラリー法、例えば、限定されるものではないが、生物学的ライブラリー、立体的に指示可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー、脱回旋を必要とする合成ライブラリー法、「ワン−ビード−ワン−コンパウンド」ライブラリー法、および親和性クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法のいずれかを用いて得てもよい。生物学的ライブラリー法はポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つの方法はポリペプチド、非ペプチドオリゴマ−、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる。Lam, Anticancer Drug Des., 12, 145, 1997参照。
【００５０】
本発明はまた、１種以上の本発明の化合物、特にＰＥＰ阻害剤および／またはサブスタンスＰのようなペプチドホルモンと薬学的に有効な担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００５１】
本発明の医薬組成物を製造するには、活性成分としての１種以上の本発明の活性化合物またはそれらの塩を薬学的担体と、一般的な薬剤配合技術により、均質に混合する。担体は、経口または非経口（例えば、筋肉内）のような投与に望ましい製剤の形により様々な形をとりうる。経口投与形の組成物の製造では、通常のどのような薬学的培媒質を用いてもよい。従って、液体経口製剤、例えば懸濁液、エリキシルおよび溶液の場合、適した担体および添加剤には、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、防腐剤、着色剤等が含まれ；固体経口製剤、例えば粉剤、カプセル、ゲルキャップおよび錠剤の場合、適した担体および添加剤には、デンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等が含まれる。投与が容易であるので、錠剤およびカプセルは最も有利な経口投与単位形であり、その場合、固体薬剤担体が用いられるのは明らかである。望ましいならば、錠剤は標準技術によって糖衣または腸内分解性被覆されてもよい。非経口の場合、担体は滅菌水を通常含み、他の成分を通して、例えば、溶解を促すような目的でまたは防腐のために、滅菌水を含んでいてもよい。
【００５２】
注射可能な懸濁液も製造しうる。この場合、適した液体担体、懸濁化剤等を用いてもよい。ここでの医薬組成物は、投与単位、例えば錠剤、カプセル、粉剤、注射剤、茶さじ１杯等当たり、上記のような有効投与量を放出するのに必要な活性成分の量を含有する。ここでの医薬組成物は、、投与単位、例えば錠剤、カプセル、粉剤、注射剤、座薬、茶さじ１杯等当たり、約０．０３〜１００ｍｇ／ｋｇ（好ましくは、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ）の活性成分を含有し、約０．１〜３００ｍｇ／ｋｇ／日（好ましくは、１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日）で投与しうる。しかしながら、投与量は患者、治療される症状の重さおよび用いる化合物の要件により変えうる。毎日投与しても、あるいは周期的（post-periodic）投与でもよい。
【００５３】
好ましくは、これらの組成物は、錠剤、ピル、カプセル、粉剤、顆粒剤、滅菌非経口溶液もしくは懸濁液、計量エアーゾルもしくは液体スプレー、ドロップ、アンプル、自動インジェクターまたは座薬のような単位投与形である（経口、非経口、鼻内、舌下もしくは直腸投与のため、または吸入もしくは吹き付けによる投与のため）。あるいは、組成物は週に１回または月に１回投与するのに適した形にしてもよい（例えば、デカン酸塩のような活性化合物の不溶性塩を、筋肉内注射用の貯蔵製剤に適応させてもよい）。錠剤のような固体組成物を製造するためには、主要活性成分を薬学的担体、例えば、一般的な錠剤製造成分、例えばトウモロコシデンプン、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガム、および他の薬剤希釈剤、例えば、水と混合して、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の均質混合物を含有する固体予備配合組成物を形成する。これらの予備配合組成物を均質と言うとき、それは、活性成分が組成物全体に均一に分散し、そのため組成物が錠剤、ピルおよびカプセルのような均等に有効な投与形に容易に小分けしうることを意味する。その後、この固体予備配合組成物は０．１〜約５００ｍｇの本発明の活性成分を含有する上記のタイプの単位投与形に小分けされる。
【００５４】
新規組成物の錠剤またはピルは被覆してもまたは別の方法で配合して、作用が長く持続するのに都合のよい投与形にしてもよい。例えば、錠剤またはピルは内部投与および外部投与成分を含み、後者が前者を包む形にしてもよい。２つの成分を腸内分解性層によって分離すると、この層は、胃での崩壊に耐えて、内部成分が損なわれずに十二指腸へ進むようにする、あるいは放出を遅らせるようにすることができる。そのような腸内分解性層または被覆には様々な材料を用いることができる。それらの例は、セラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースのような物質との多くの重合酸である。
【００５５】
経口投与または注射による投与のために本発明の新規組成物を混合しうるこの液体形には、水溶液、適当に香味をつけたシロップ、水性もしくは油性懸濁液、および綿実油、ゴマ油、ココナッツ油もしくはピーナッツ油のような食用油並びにエリキシルおよび類似の薬学的賦形剤で香味をつけたエマルジョンが含まれる。水性懸濁液に適した分散剤または懸濁化剤には、合成および天然ガム、例えばトラガカント、アラビアゴム、アルギン酸塩、デキストラン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンが含まれる。
【００５６】
本発明による化合物の製造法で立体異性体の混合物が生じる場合、これらの異性体は調製クロマトグラフィーのような一般的な技術によって分離しうる。化合物はラセミ形で製造されてもよく、あるいは個々の光学的対掌体は光学的対掌特異的合成または分割のいずれかによって製造されてもよい。化合物は、標準的な技術、例えば、（−）−ジ−ｐ−トルオイル−ｄ−酒石酸および／または（＋）−ジ−ｐ−トルオイル−ｌ−酒石酸のような光学的に活性な酸での塩の形成によってジアステレオマー対を形成し、その後、分別結晶および遊離塩基の再生を行うことによって、それらの成分の光学的対掌体に分割しうる。化合物はまた、ジアステレオマーエステルまたはアミドを形成し、その後、クロマトグラフィー分離およびキラル補助体の除去を行うことによって分割してもよい。あるいは、化合物はキラルＨＰＬＣカラムを用いて分割してもよい。
【００５７】
本発明の化合物のどのような製造過程においても、関係分子の上の敏感なまたは反応性の基を保護することが必要および／または望ましい。これは、一般的な保護基によって行うことができる。そのような基については、例えば、Protective Groups in Organic Chemistry, ed. J. F. W. McOmie, Plenum Press 1973; およびT. W.Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1991に記載されている。保護基は本技術分野で公知の一般的な方法を用いて都合のよいその後の段階で除去しうる。
【００５８】
本発明に記載のプロリルエンドペプチダーゼによって調節される症状の治療法はまた、ここで定義された通りの化合物またはそれらの組み合わせおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を用いて行いうる。医薬組成物は約０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは約５〜５０ｍｇの化合物を含み、そして選択された投与方式に適した形にしうる。担体には、必要なかつ不活性な薬剤賦形剤、限定されるものではないが、例えば、結合剤、懸濁化剤、潤滑剤、香味剤、甘味剤、防腐剤、染料およびコーティングが含まれる。経口投与に適した組成物には、固体形、例えばピル、錠剤、キャプレット、カプセル（それぞれ、直後放出、時間限定放出および持続放出を含む）、顆粒、および粉剤、並びに液体形、例えば溶液、シロップ、エリキシル、エマルジョン、および懸濁液が含まれる。非経口投与に有用な形には、滅菌溶液、エマルジョンおよび懸濁液が含まれる。
【００５９】
都合のよいことに、本発明の化合物、混合物または組成物は１日に１回の投与でもよく、あるいは１日の合計投与量を１日に２、３または４回に分けて投与してもよい。さらに、本発明の化合物、混合物または組成物は、適当な鼻内賦形剤の局所使用によるまたは本技術分野における当業者に周知の経皮パッチによる鼻内形で投与してもよい。経皮放出形式で投与するには、投与量はもちろん、投与の間、断続してではなく連続して投与する。
【００６０】
例えば、錠剤またはカプセルの形での経口投与の場合、活性薬剤成分、混合物または組成物は、経口非毒性の薬学的に許容される不活性担体、例えばエタノール、グリセロール、水等と組み合わせることができる。さらに、望ましいまたは必要なとき、適した結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤を混合物に配合してもよい。適した結合剤には、限定されるものではないが、デンプン、ゼラチン、天然の糖、例えばグルコースまたはベータラクトース、トウモロコシ甘味剤、天然および合成ガム、例えばアラビアゴム、トラガカントまたはオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が含まれる。崩壊剤には、限定されるものではないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が含まれる。
【００６１】
液体形には適当に香味をつけた懸濁液またはエマルジョンが含まれ、懸濁化剤または分散剤は、例えば、トラガカント、アラビアゴム、メチルセルロース等のような合成および天然ガムである。非経口投与の場合、滅菌懸濁液および溶液が望ましい。一般に適した防腐剤を含む等張製剤は、静脈内投与が望ましいときに用いられる。
【００６２】
本発明の化合物、混合物または組成物はまた、リポソーム放出形式、例えば小さい単ラメラ小胞、大きい単ラメラ小胞、および多重ラメラ小胞の形で投与することもできる。リポソームは様々なリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンから形成しうる。
【００６３】
本発明の化合物、混合物または組成物はまた、化合物分子を結合させる個々の担体としてのモノクローナル抗体を用いることによって放出しうる。本発明の化合物、混合物または組成物はまた、標的薬剤担体としての可溶性ポリマーと結合させうる。そのようなポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンが含まれる。さらに、本発明の化合物、混合物または組成物は、薬剤の調整放出を行うのに有用なある種の生分解性ポリマー、例えば、ポリアクチックアシッド（polyactic acid）、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーに結合させうる。
【００６４】
本発明の化合物、混合物または組成物は、ここで触れている疾患の治療が必要なときはいつでも、どのような先行組成物に投与してもよく、かつ本技術分野で確立されている投与方式に従って投与しうる。
【００６５】
生成物の日用量は０．０１〜１，０００ｍｇ／成人／日の広い範囲で変えうる。経口投与の場合、組成物は、治療すべき患者の症状にあわせて０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、１５０、２００、２５０および５００ｍｇの活性成分を含有する錠剤の形で提供するのが好ましい。薬剤の有効量は約０．１〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与レベルで投与される。約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲が好ましい。化合物は１日に１〜４回の投与でもよい。
【００６６】
最適投与量は本技術分野における当業者であれば容易に決定でき、個々の使用化合物、投与方式、製剤濃度、投与方式、および疾患状態の進行によって変えうる。さらに、治療される個々の患者に関係するファクター、例えば患者の年齢、体重、食餌および投与時間によって投与量を調整する必要がある。
【００６７】
一般に、本発明の医薬組成物を製造するには、活性成分としての１種以上の本発明の活性化合物またはそれらの塩を、薬剤担体と、一般的な薬剤配合技術により均質に混合する。担体は、経口または非経口（例えば、筋肉内）のような投与に望ましい製剤の形により様々な形をとりうる。組成物を経口投与形で製造するには、どのような通常の薬学的材料も用いうる。従って、液体経口製剤、例えば懸濁液、エリキシルおよび溶液の場合、適した担体および添加剤には、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、防腐剤、着色剤等が含まれ；固体経口製剤、例えば粉剤、カプセル、キャプレット、ゲルキャップおよび錠剤の場合、適した担体および添加剤には、デンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等が含まれる。投与が容易であるので、錠剤およびカプセルは最も有利な経口投与単位形であり、その場合、固体薬剤担体が用いられるのは明らかである。望ましいならば、錠剤は標準技術によって糖衣または腸内分解性被覆されてもよい。非経口の場合、担体は滅菌水を通常含み、他の成分を通して、例えば、溶解を促すような目的でまたは防腐のために、滅菌水を含んでいてもよい。注射可能な懸濁液も製造しうる。この場合、適した液体担体、懸濁化剤等を用いてもよい。ここでの医薬組成物は、投与単位、例えば錠剤、カプセル、粉剤、注射剤、茶さじ１杯等当たり、上記のような有効投与量を放出するのに必要な活性成分の量を含有する。ここでの医薬組成物は、投与単位、例えば錠剤、カプセル、粉剤、注射剤、座薬、茶さじ１杯等当たり、約０．０３〜１００ｍｇ／ｋｇ（好ましくは、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ）の活性成分を含有し、約０．１〜３００ｍｇ／ｋｇ／日（好ましくは、１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日）で投与しうる。しかしながら、投与量は患者、治療される症状の重症度および用いる化合物の要件により変えうる。毎日投与しても、あるいは周期的投与でもよい。
【実施例】
【００６８】
発明の実施例
実施例１
Ｕ３４３細胞におけるプロリルエンドペプチダーゼ発現の抑制
十分に高いＰＥＰ濃度を示す細胞系がプロリルエンドペプチダーゼの細胞の役割を調べるのに必要であった。６種の細胞系（ＣａＣｏ、ＥＦＥ、ＳＮＢ１９、Ｕ３４３、Ｕ９３７、ＳＹ５Ｙ）から活性ＰＥＰの最高量を示した星状神経膠腫細胞系Ｕ３４３を、蛍光性基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨＭｅｃにおける細胞溶解産物の加水分解活性を測定することによって調べた。さらに、ウエスターンブロット分析でＰＥＰ発現が高いことを確認した。Ｕ３４３細胞はプロリルエンドペプチダーゼを約５ｍＵ／ｍｇ総たんぱく質の濃度で発現し、我々の方法によって濃度および活性の変化を検出することができる。
【００６９】
Ｕ３４３細胞におけるＰＥＰの細胞内活性に影響を与える２つの異なる方法を選択した。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮはＰＥＰに対して有効かつ特異的な阻害剤であり（９）、組換えヒトＰＥＰに対して７０ｐＭの観察Ｋｉ値を有する（データは示されていない）。この阻害剤が細胞膜を通過し、ＰＥＰを細胞内で阻害することができることは示されている（１０）。Ｕ３４３細胞をＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮ含有培地（５μＭ）中でインキュベートすると、細胞内ＰＥＰ活性の全体阻害は５分以内に達成される。この阻害は、新たな阻害剤を加えることなく、１２時間まで観察される。さらに、ＰＥＰ活性を減じる全く異なる方法は、標的酵素の発現を減じるアンチセンス細胞系を産生することによって用いられる。
【００７０】
ＰＥＰの触媒性ドメインに対するコーディング配列を得るために、ヒト神経膠腫細胞系Ｕ３４３からの１×１０⁷細胞の全体ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（GIBCO BRL）で単離した。４μｇの得られた全体ＲＮＡを、ヘキサヌクレオチドプライマーおよびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素〔プロメガ（Promega）〕を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによってｃＤＮＡに変えた。次に、得られたｃＤＮＡプール（４μｌ）を、１対のＰＥＰ特異的プライマー（５`−ＣＡＴＡＴＧＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＡＧＴＡＣＣ−３`；５`−ＧＡＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＡＣＧ−３`）を用いて、Ｅｘｐａｎｄ^TMＰＣＲシステム〔ロシュ（Roche）〕で増幅した。得られたＰＣＲ断片は全読み取り枠を含んでいた。２つの嵌め合わせプライマー（５`−ＣＡＴＡＴＧＧＧＡＡＴＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＡＣ−３`；５`−ＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＴＣＣＡＧＴＣＧＡＣＡＴＴＣＡＧ−３`）を用いてＰＣＲにより、酵素の触媒性ドメイン（ヒトＰＥＰのアミノ酸４４２−７３１）を含む０．９ｋｂ断片が産生された。この断片をｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ〔ストラタジーン（Stratagene）〕へクローンした。サブクローンされたベクターのおよび嵌め合わされた逆転写プライマーのＥｃｏＲＩ制限部位を用いて、断片を哺乳動物の発現ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏ〔クロンテック（Clontech）〕へ連結した。得られた形質転換細胞をＰＣＲで分析して、挿入がアンチセンス配列に存在するかどうかを判定し、正しいヌクレオチド配列はＤＮＡ配列決定（GATC Biotech AG）により証明された。
【００７１】
ウエスターンブロット分析の場合、ヒトＰＥＰに対するポリクローナル抗体が産生された。従って、ウサギにアミノ酸１０−２５のＮ−末端ＰＥＰ配列を含むペプチドで免疫性を与えた。固定化ペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーで特異的抗体（Ｓ４４９）をウサギの血清から精製した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動分析は、Laemmliによる記載のように１２％アクリルアミドを含有する分離ゲルを用いて行った（７）。分離された細胞抽出物は標準的な手順（８）に従ってニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell）に移した。ＰＥＰおよびアクチンはそれぞれポリクローナル抗体Ｓ４４９（１：４００）およびモノクローナル抗体ＡＮＴＩ−ＡＣＴＩＮ（１：２５００、シグマ（Sigma）、Ａ２０６６）により検出し、製造業者のプロトコル（SuperSignal^TM West Pico、PIERCE）に従って化学ルミネッセンスによって可視化した。ウエスターンブロット結果のセミ定量分析はデンシトメトリーソフトウェア（Gelscan 3D、BioSciTec）によって行った。
【００７２】
正しい配列を実証した後、Ｕ３４３細胞をベクターで形質移入した。従って、ヒト神経膠腫細胞系Ｕ３４３は、５％ＣＯ₂雰囲気中、３７℃の１０％ウシ胎児血清（GIBCO BRL）および６０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（GIBCO BRL）を含有するＤＭＥＭ培地に維持された。哺乳動物発現ベクターは、製造業者のプロトコルに従いポリフェクチン試薬（BIONTEX）を用いてＵ３４３細胞に形質移入した。安定なトランスフェクタントを４００μｇ／ｍｌＧ４１８含有培地（Duchefa）に選び入れた。正の形質転換細胞のネオマイシン耐性の利点を取って、クローニングリングを用いて１２０クローンを単離した。これらのクロ−ンから、８種の安定な細胞系が認められ、それらの全てはＰＥＰ活性の減少を示した（表１）。しかしながら、アンチセンス細胞系１、１３および１１０は、長い培養時間の間にアンチセンス効果をなくした。認められた細胞系のほとんどは約５０％のＰＥＰ活性減少を示した。
【００７３】
ＰＥＰ活性の測定のため、Ｕ３４３野生型およびＰＥＰアンチセンス細胞（１×１０⁷）を、リン酸塩バッファー食塩水（GIBCO BRL）中で２回洗浄し、２００μｌ分析バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５；２００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁させることによって採取した。細胞溶解は、解凍および凍結の３サイクルによって行い、その後、細胞を細胞スクレイパーによってインキュベーションフラスコから取り出した。得られた溶解産物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上澄み液を新しい試験管に移した。全ての工程は氷上で行った。上澄み液のたんぱく質濃度はブラッドフォードの方法（５）に従って測定した。ＰＥＰ活性は、４つのセル交換器を備えＩＢＭ互換性パソコンによってコントロールされるコントロン（Kontron）分光蛍光測定器ＳＦＭ２５（励起３８０、発光４６０）で蛍光性基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨＭｅｃ（１０μＭ）〔バッケム（Bachem）〕を用いて、分析バッファー中で測定した。得られたデータはソフトウェアFlucol（６）で分析した。
【００７４】
細胞系ａｓ−１１は、ＰＥＰ活性の最も著しい減少を示し、野生型Ｕ３４３細胞に較べて残留活性は３０％であった。活性測定で得られた結果はウエスターンブロット分析を用いて確認できた（図２、表１）。全てのアンチセンス細胞系において、たんぱく分解活性減少はＰＥＰ発現の減少による。対照として、挿入遊離ベクターｐＩＲＥＳで形質転換された細胞はＰＥＰ活性および発現の変化を示さなかった（図２）。生じたアンチセンス細胞系は表現型に共通の変化は示さなかったが、個々の変化は観察された（表１）。Ｕ３４３ａｓ−１１細胞系はトリプシン感受性の増加、細胞の体積増加（３倍）を示し、もはや１００％集密成長はできなかった。
【００７５】
【表１】

【００７６】
実施例２
プロリルエンドペプチダーゼ依存性ＩＰ₃濃度の調節
ＰＥＰの細胞内作用を特徴づけるために、アンチセンス細胞系におけるＩＰ₃濃度を測定した。細胞は２５ｃｍ²培養フラスコ内でほぼ１００％集密成長した。ＩＰ₃濃度は、１回の測定当たり０．５×１０⁶細胞を用いて、同位体希釈法〔アマーシャム・ファーマシア・バイオテック（Amersham Phamacia Biotech）〕によって測定した。細胞内ＰＥＰを阻害するのに、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５μＭ ＰＥＰ阻害剤Ｆｍｏｃ−アラニル−ピロリン−２−ニトリル（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮ）を補充したOptimem １培地（GIBCO BRL）中で４時間インキュベートした。測定は全て４組づつ行った。ＩＰ₃濃度の計算および統計分析（ｔ−検定）はPrism３．０（グラフ・パッド・ソフトウェア）を用いて行った。
【００７７】
Ｕ３４３野生型細胞で検出されたＩＰ₃濃度は約０．２６±０．０２ｐｍｏｌ／１０⁶細胞（ｎ＝４）であった。挿入遊離ベクターｐＩＲＥＳによって形質移入された細胞系はＩＰ₃濃度の有意な変化を示さなかった。しかしながら、第２メッセンジャー濃度は、生じた全てのアンチセンス細胞系で増加したことが分かった（図３ａ）。約０．１５±０．０４ｐｍｏｌ／１０⁶細胞（ｎ＝４）のわずかではあるが有意な上昇が、ＰＥＰ活性のもっぱら穏やかな減少を示す細胞系ａｓ−１１０で観察された。ＩＰ₃濃度の著しい増加は残留ＰＥＰ活性が５０％以下のアンチセンス細胞系で観察された（図２）。Ｕ３４３細胞系ａｓ−２（５３％残留活性、５７％残留発現）はＩＰ₃濃度の２．５倍までの増加を示した。細胞系ａｓ−１１（３０％残留活性、２０％残留発現）では、ＩＰ₃濃度はさらに高い約３．５倍であることが分かった。総合して、このデータはＰＥＰ濃度の減少とＩＰ₃濃度の増加との間に互いに関連があることを示している。
【００７８】
Ｕ３４３細胞におけるＰＥＰ活性を抑制する別の方法を用いるために、特異的阻害剤Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮ（５μＭ）を存在させて、細胞を３時間インキュベートした。阻害剤の溶解に必要なＤＭＳＯの影響は、同量（０．０５％）のＤＭＳＯを対照細胞の培地へ加えることによって除いた。アンチセンス細胞系で得られた結果の確認で、基本ＩＰ₃濃度がＰＥＰ阻害剤処理した細胞で増加することが分かった（図４）。しかしながら、観察されたＩＰ₃濃度変化はわずか０．１６ｐｍｏｌ／１０⁶細胞であった。これは依然として３０％の残留ＰＥＰ活性を有する細胞系ａｓ−１１において観察されたＩＰ₃濃度変化よりもずっと低く、ＰＥＰ活性とＩＰ₃濃度との間の相互関係に疑いをはさむ。従って、第２メッセンジャーの量を全体阻害について長時間にわたって調べた。図４に示すように、ＩＰ₃濃度はインキュベーション時間中、増加した。１２時間の全体阻害後に達した最高濃度は、新たな阻害剤を加えることなく達成された全体阻害時間と一致する。さらに、２４時間後に測定したより低いＩＰ₃濃度は、その時点でのＰＥＰ活性のわずかな回復を示す。１２時間後のＩＰ₃の総量（１．６９±０．１ｐｍｏｌ／１０⁶細胞；ｎ＝４）は細胞系ａｓ−１１で測定された濃度（０．９±０．０７ｐｍｏｌ／１０⁶細胞；ｎ＝４）より高く、３０％残留酵素活性を示している。
【００７９】
実施例３
サブスタンスＰによる刺激の後のプロリルエンドペプチダーゼ依存性ＩＰ₃蓄積
ＩＰ₃濃度への観察された影響がニューロペプチドの生物学的活性とＰＥＰとの間の新たな相互作用を表すのかどうかを調べるために、サブスタンスＰを選んでＵ３４３細胞を刺激した。
【００８０】
野生型およびＰＥＰアンチセンスＵ３４３細胞系を、集密状になるまで２１ｃｍ²培養皿〔グライナー（Greiner）〕で２組づつ培養した。刺激する前に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１．６μｇ／ｍｌロイペプチン（シグマ）、０．８６μｇ／ｍｌキモスタチン（シグマ）、および４０μｇ／ｍｌバシトラシン（シグマ）を含有するOptimem １培地中で３７℃および５％ＣＯ₂にて１０時間予備インキュベートした。サブスタンスＰ（バッケム）を加えて、１×１０^-6Ｍの最終濃度にし、培地を急速吸引しそして０．４ｍｌの氷冷トリ塩酸を加えることにより指示時間でインキュベーションを停止した。試料の調製およびＩＰ₃濃度の測定は上記のように行った。
【００８１】
ＲＴ−ＰＣＲを用いて、サブスタンスＰ特異的ニューロキニンレセプター（ＮＫ−Ｒ）のＵ３４３細胞における出現を調べた。ＰＣＲ生成物は適切な大きさを示す２つのレセプターに対して得られた（図５）。ＰＣＲ生成物の配列決定分析から、ＮＫ−Ｒ１およびＮＫ−Ｒ３のｍＲＮＡがＵ３４３細胞に存在することが分かった。サブスタンスＰがＰＥＰに対する優れた試験管内基質であることを知っているので、我々は、MALDI-TOF MS分析によってＵ３４３細胞の血清遊離Optimem １培地におけるインキュベーション時間中のサブスタンスＰの潜在的な分解を調べた。しかしながら、１０分のインキュベーション時間中、ＰＥＰ特異的分解は観察されなかった（データは示されていない）。これは、ＰＥＰ活性が培地中で測定不能である事実と一致する（図６）。
【００８２】
Ｕ３４３細胞の１μＭサブスタンスＰでの５秒間の刺激で、ＩＰ₃濃度の上昇がもたらされる。野生型Ｕ３４３細胞の場合、サブスタンスＰ刺激で約１４倍のＩＰ₃濃度、５．４±０．４９ｐｍｏｌ／１０⁶細胞（ｎ＝４）の値に上昇した（図７）。平行して、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮで処理されたＵ３４３細胞および細胞系ａｓ−２はサブスタンスＰ刺激後、より高いＩＰ₃濃度を示した。サブスタンスＰ刺激後の全体の値を比較すると、ＩＰ₃濃度は低下したＰＥＰ活性とさらにまた相互に関連しており（図７）、濃度差はさらに大きい。非刺激および刺激細胞における差異はそれぞれ１．７ｐｍｏｌ／１０⁶細胞対７．９ｐｍｏｌ／１０⁶細胞であった。しかしながら、ＩＰ₃濃度を比例評価すると、観察される阻害による差異は非刺激対刺激細胞においてそれぞれ５．５倍から１．７倍に減少した。
【００８３】
図８では、サブスタンスＰ刺激時間にわたるＩＰ₃濃度の変化を示す。ＩＰ₃濃度の刺激依存性増加を比較するために、非刺激状態におけるＩＰ₃の量をベースラインとして引き算した。３種の全ての細胞系、Ｕ３４３野生型の非処理または阻害剤処理およびａｓ−２細胞は、その時間を通じて似た刺激パターンを示した（図８ａ、ｂ）。ＩＰ₃濃度は常に刺激後５秒で最高になった。刺激は、第２メッセンジャ−濃度の急速な上昇に続いて、緩慢な低下を示す。４０秒後ではベースラインに達していない。Ｕ３４３野生型とａｓ−２との差はＩＰ₃濃度においてばらついた差を示さなかった（図８ｂ）；阻害剤処理細胞はインキュベーションの全時間中、サブスタンスＰによるＩＰ₃の刺激の増加を示した（図８ａ）。
【００８４】
実施例４
様々な哺乳動物細胞系におけるプロリルエンドペプチダーゼの分布
いくつかのヒトの組織におけるプロリルエンドペプチダーゼ活性の分布を見出すために、単層で成長させた様々な細胞培養凍結ストックおよび細胞を試験した。
【００８５】
均質化のために、Ｕ３４３野生型およびＰＥＰアンチセンス細胞（１×１０⁷）を、リン酸塩バッファー食塩水（GIBCO BRL）で２回洗浄することによって採取し、そして２００μｌの分析バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５；２００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁させた。凍結細胞培養ストックを３７℃で急速解凍し、５００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを１００μｌ分析バッファーに再懸濁した。細胞溶解は、解凍および凍結の３サイクルによって行い、その後、細胞を細胞スクレイパーによってインキュベーションフラスコから取り出した。得られた溶解産物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上澄み液を新しい試験管に移した。全ての工程は氷上で行った。上澄み液のたんぱく質濃度はブラッドフォードの方法（５）に従って測定した。ＰＥＰ活性は、４つのセル交換器を備えＩＢＭ互換性パソコンによってコントロールされるコントロン分光蛍光測定器ＳＦＭ２５（励起３８０、発光４６０）で蛍光性基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＮＨＭｅｃ（１０μＭ）（バッケム）を用いて、分析バッファー中で測定した。得られたデータはソフトウェアFlucol（６）で分析した。
【００８６】
ウエスターンブロット分析（図９参照）を実施例１に記載の方法に従って行った。６種類の培養したヒト細胞系（１ Ｕ３４３；２ ＬＮ−４０５；３ ＳＨ−ＳＹ５Ｙ；４ ＢｅＷｏ；５ Ｕ−１３８−ＭＧ；６ ＣＡＣＯ−２）で検出されたＰＥＰシグナルは、これらにおいて測定されたＰＥＰ活性と互いに関連がある。非培養凍結ストックではシグナルは全く検出できなかった。各細胞系からのサイトゾル上澄み液を実施例１に記載のように抽出し、分析した。１０μｇ（レーン１〜３）、２０μｇ（レーン５）および４０μｇ（レーン４、６）のサイトゾル上澄み液をレーン毎に加えた。ウエスターンブロットはＰＥＰ特異的抗体Ｓ４４９（１：４００）と共にインキュベートし、化学ルミネセンス法で検出した。
【００８７】
【表２Ａ】

【００８８】
【表２Ｂ】

【００８９】
実施例５
メスのウイスターラットの脳におけるプロリルエンドペプチダーゼの分布
いくつかのヒトの組織におけるプロリルエンドペプチダーゼ活性の分布を見出すために、単層で成長させた様々な細胞培養凍結ストックおよび細胞を試験した。
凍結ラット組織試料をマイクロモーター〔ロス（Roth）〕で均質化し、４００μｌの分析バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５；２００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁させた。
懸濁液を１３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を新しい試験管に移した。それ以上の手順は実施例４の「単層成長させた細胞の均質化」を参照。
ラットの脳におけるＰＥＰ−発現のウエスターンブロット分析（図１０参照）の後、各脳領域で測定されたＰＥＰ濃度はウエスターンブロット分析におけるシグナルと相互に関連する。各脳領域（１ 皮質、２ 海馬、３ 延髄、４ 小脳、５ 視床、前頭葉）からの組織を実施例１に記載のように抽出し、分析した。３０μｇの全部のたんぱく質をレーン毎に加えた。サイトゾルＵ３４３細胞系上澄み液を正の対照として用いた（Ｍ、２０μｇ／レーン）。ウエスターンブロットはＰＥＰ特異的抗体Ｓ４４９（１：４００）と共にインキュベートし、化学ルミネセンス法で検出した。
【００９０】
実施例６
ベンジル−Ｎ−［１−（シクロペンチルカルボニル）−２−メチルブチル］カルバメートの合成
【００９１】
【化２】

【００９２】
Ｚ−イソロイシナル ２
塩化オキサリル（７１４μｌ、８．２８ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解し、−７８℃にした。次に、ＤＭＳＯ（８１７μｌ、８．２８ｍｍｏｌ）を滴加した。溶液を−７８℃で２０分間攪拌した。次に、１（１．２２ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２０分間攪拌した。その後、ＴＥＡ（２．５８ｍｌ、１８．４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温にした。混合物をヘキサン／酢酸エチル（２／１ ｖ／ｖ）で希釈し、１０ｍｌのＨＣｌ（水中１０％）を加えた。有機層を分離し、水性相を２０ｍｌの塩化メチレンで抽出した。全ての有機層を集め、ブライン、次いで水で洗浄し、乾燥した。生成物はシリカゲルおよびヘプタン／クロロホルムを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。
収量：０．５９ｇ、５２％
【００９３】
ベンジル−Ｎ−１−［シクロペンチル（ヒドロキシ）メチル］−２−メチルブチルカルバメート ３
２（０．５９ｇ、２．４２ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解し、０℃に冷却した。次に、臭化シクロペンチルマグネシウム（１．４５ｍｌの２Ｍ溶液）を加えた。反応が完了した後、水（２ｍｌ）を加え、水性ＨＣｌを加えることによって溶液を中和した。次いで、塩化メチレンを加え、有機層を分離し、乾燥した（Ｎａ₂ＳＯ₄）。蒸発させた後、得られた油状物をさらに特性決定することなく用いた。
【００９４】
ベンジル−Ｎ−［１−（シクロペンチルカルボニル）−２−メチルブチル］カルバメート ４
３（０．６８３ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）を１のように処理した。塩化オキサリル（３３３μｌ、３．８７ｍｍｏｌ）、ＤＭＳＯ（３８２μｌ、５．３７ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（１．２ｍｌ、８．５９ｍｍｏｌ）
収量：０．２０３ｇ、３０％
【００９５】
実施例７
ベンジル−Ｎ−［１−（シクロペンチルカルボニル）−２−メチルブチル］カルバメートのＩＣ₅₀値の測定
１００μｌの阻害剤ストック溶液を１００μｌのバッファー（ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６）および５０μｌの基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ、最終濃度１０μＭ）と混合した。反応は、２０μｌの精製組換えヒトプロリルエンドペプチダーゼの添加によって開始した。蛍光測定は、平板培養読み取り器（ＨＴＳ７０００Ｐｌｕｓ、アプライド・バイオシステムズ、ドイツ、バイテルスタット）を用いて、３７℃およびλ（励起）＝３８０ｎｍ、λ（発光）＝４６５ｎｍで６０分間行った。最終阻害剤濃度は１ｐＭ〜１０μＭであった。ＩＣ₅₀値の計算にプリズム３“（グラフパッド）を用いた。ベンジル−Ｎ−［１−（シクロペンチルカルボニル）−２−メチルブチル］カルバメートのＩＣ₅₀値はＩＣ₅₀＝８．９１^*１０^-7Ｍと計算された。
【００９６】
脚注
略号は次の意味を有する：
ＡＶＰ：アルギニン−バソプレシン
ＥＲ：小胞体
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮ：Ｆｍｏｃ−アラニル−ピロリン−２−ニトリル
ＩＰ₃：イノシトール（１，４，５）トリホスフェート
ＬＴＰ：長期相乗作用
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：マトリックス補助レーザー脱着／イオン化−飛行時間
ＭＩＰＰ：マルチプルイノシトールポリホスファターゼ
ＭＳ：質量分析法
ＮＨＭｅｃ：７−（４−メチル）クマリル−アミド
ＰＥＰ：プロリルエンドペプチダーゼ
ＰＬＣ：ホスホリパーゼＣ
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ＲＴ−ＰＣＲを嵌め込んだ後のヒト神経膠腫細胞系Ｕ３４３からのＰＥＰの触媒性ドメインのｃＤＮＡについてのアガロースゲル電気泳動を示す。
【図２】樹立アンチセンス細胞系におけるＰＥＰ発現のウエスターンブロット分析を示す。
【図３】各種Ｕ３４３細胞系におけるＩＰ₃濃度の分析を示す。
【図４】ＰＥＰ阻害剤Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮで処理したＵ３４３細胞におけるＰＥＰ活性およびＩＰ₃濃度の時間経過を示す。
【図５】ヒト神経膠腫細胞系Ｕ３４３のニューロキニンレセプターｍＲＮＡの検出を示す。
【図６】ヒト神経膠腫細胞系Ｕ３４３の様々な細胞区分で測定されたＰＥＰ活性を示す。
【図７】サブスタンスＰで刺激した各種Ｕ３４３細胞系のＩＰ₃濃度を示す。
【図８】Ｕ３４３細胞におけるサブスタンスＰによるＩＰ₃刺激の動的特徴を示す。
【図９】各種ヒト細胞系におけるＰＥＰ発現のウエスターンブロット分析を示す。
【図１０】ラットの脳におけるＰＥＰ発現のウエスターンブロット分析を示す。

Claims (12)

1. プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の、イノシトール（１，４，５）トリホスフェートの細胞内レベル調節用薬剤製造への使用。
2. 上記プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤がペプチドホルモンと組み合わせて用いられる請求項１に記載の使用。
3. 上記プロリルエンドペプチダーゼが細胞内に存在し、上記プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が細胞に浸透してプロリルエンドペプチダーゼ酵素活性に作用し、それによってイノシトール（１，４，５）トリホスフェートの細胞内レベルが調節される上記請求項のいずれかに記載の使用。
4. 学習および記憶障害、自己免疫疾患およびＴリンパ球仲介免疫疾患、並びに活性化線維芽細胞および／またはＴリンパ球によって仲介される組織再生過程から選択される状態の予防または治療のためである請求項１、２または３のいずれか１項に記載の使用。
5. 上記プロリンエンドペプチダーゼ阻害剤が生理学的に適合性の薬剤放出賦形剤を含む上記請求項のいずれか１項に記載の使用。
6. 上記プロリンエンドペプチダーゼ阻害剤が、非経口、腸内、経口、吸入および座薬から選択されるルートによってイノシトール（１，４，５）トリホスフェートと接触させられる上記請求項のいずれか１項に記載の使用。
7. 上記プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤がサブスタンスＰと組み合わせて用いられる上記請求項のいずれか１項に記載の使用。
8. 上記プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤がＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒｒ−ＣＮである上記請求項のいずれか１項に記載の使用。
9. 上記プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤が、（４Ｒ）−３−（インダン−２−イルアセチル）−４−（１−ピロリジニル−カルボニル）−１，３−チアゾリジン（Ｚ−３２１、ゼリア製薬）；（Ｓ）−１−［Ｎ−（４−クロロベンジル）−スクシナモイル］ピロリジン−２−カルブアルデヒド（ＯＮＯ−１６０３、小野薬品）；（Ｓ）−２−｛［（Ｓ）．（ヒドロキシアセチル）−１−ピロリジニル］カルボニル｝−Ｎ−（フェニルメチル）−１−ピロリジン−カルボキサミド（ＪＴＢ−４８１９、日本たばこ）および（２Ｓ，３ａＳ，７ａＳ）−１｛［（Ｒ，Ｒ）−２−フェニルシクロプロピル］カルボニル｝−２−［（チアゾリジン−３−イル）カルボニル］オクタヒドロ−１Ｈ−インドール（Ｓ−１７０９２、サービール（Servier））から選択される上記請求項のいずれか１項に記載の使用。
10. プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤のスクリーニング法であって、
    − イノシトール（１，４，５）トリホスフェートおよびプロリルエンドペプチダーゼを含む細胞を準備し、
    − 細胞のイノシトール（１，４，５）トリホスフェート濃度およびプロリルエンドペプチダーゼ活性を測定し、
    − 細胞を試験化合物と共にインキュベートし、
    − イノシトール（１，４，５）トリホスフェート濃度を測定し、そして
    − 任意にプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を単離する
    方法。
11. プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤のスクリーニング法であって、
    − イノシトール（１，４，５）トリホスフェートおよびプロリルエンドペプチダーゼを含む細胞を準備し、
    − 細胞のイノシトール（１，４，５）トリホスフェート濃度およびプロリルエンドペプチダーゼ活性を測定し、
    − 細胞を、サブスタンスＰと組み合わせた試験化合物と共にインキュベートし、
    − イノシトール（１，４，５）トリホスフェート濃度を測定し、そして
    − 任意にプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を単離する
    方法。
12. 公知のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤よりも高いノシトール（１，４，５）トリホスフェート濃度をもたらすプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤を単離する、請求項１０または１１のいずれか１項に記載のスクリーニング法。

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