PL162260B1 - Sposób zmniejszania heterogenicznosci przeciwcial monoklonalnych PL - Google Patents
Sposób zmniejszania heterogenicznosci przeciwcial monoklonalnych PLInfo
- Publication number
- PL162260B1 PL162260B1 PL89281598A PL28159889A PL162260B1 PL 162260 B1 PL162260 B1 PL 162260B1 PL 89281598 A PL89281598 A PL 89281598A PL 28159889 A PL28159889 A PL 28159889A PL 162260 B1 PL162260 B1 PL 162260B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antibodies
- heterogeneity
- fluid
- incubation
- culture
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
Abstract
1. Sposób zmniejszania heterogenicz- nosci przeciwcial monoklonalnych wydziela- nych z komórek wytwarzajacych przeciwciala, znamienny tym, ze usuwa sie lub dodaje sie aminokwas lub aminokwasy z lub do jednego lub obu ciezkich lancuchów przeciwciala od strony C-konca. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest soosób zmniejsznma hetrrgeniiczoości przcciwciłł monoklonalnych.
Wytwarzanie na dużą okale przeciwciał momoklomalmych z komórek hybrydowych spowodowało rewolucje w prognozowaniu, diagnozowaniu i leczeniu różnych etanów chorobowych. Przeciwciała monrklomalmh wykorzystuje eie również do oznaczania stadiów różnych etanów naturalnych, takich jak ciąża. Odkryto jednak, że wiele przeciwciał pochodzących z komórek hybrydowych występuje w formach heterogenicznych, co znacznie utrudnia procesy wyizolowania i oczyszczania, konieczne dla uzyskania ich z wysoką wydajnością ze szczepów produkcyjnych. Chromatografia katirnriymiemma wykazuje, że istnieją co najmniej trzy odrębne formy heterogeniczne przeciwciała wydzielonego z komórek hodowlanych in vierr.
Formy te mogą występować w różnych ilościach względnych. Form tych nie stwierdza się w tym samym stopniu w przeciwciałach pochodzących z wybrzusza, ale wytwarzanie dużych ilości tych przeciwciał jest o wiele za uciążliwe i kosztowne dla celów handlowych.
Podstawa biochemiczna takiej heterrgenicsmoOci wynika z obecności dodatkowego aminokwasu lub aminokwasów przyłączonych do C-końca ciężkich łańcuchów przecwciała. Końcowy aminokwas jest najprawdopodobniej zwykle usuwany podczas wewnętrznego przetwarzania lub wydzielania przeciwciała z komórki, ponieważ powstała sekwencja aminokwas^a pochodząca z sekwencji DNA genu przeciwciała nie zawiera dodatkowego aminokwasu. Jedną z trzech form heterogenicznych jest przeciwciało, które nie zawiera dodatkowego końcowego aminokwasu na żadnym ze swoich ciężkich łańcuchów. Druga z trzech odrębnych form heterogenicznych zawiera dodatkowy aminokwas na jednym ze swoich ciężkich łańcuchów gdy trzecia forma zawiera dodatkowy aminokwas na obu ciężkich łańcuchach.
Obecnie opracowano sposób specyficznego rdsscseslanla dodatkowego aminokwasu od ciężkich łańcuchów heterogenicznych przeciwciał dowolnego isreysu, umożliwiający przeprowadzenie wszystkich trzech form w jedną, w zasadzie czystą miessamimę homogeniczną. Rozwój i wykorzystanie technologii przeciwciał mmoklonalnych zależy od dostępności dużych ilości zasadniczo homogenicznych przeciwciał. Rozwój ten został nieco zahamowany wskutek niemożności łatwego oczyszczenia i scharakteryzowania różnych heterogenicznych form wydzielonych przeciwciał. Sposób według wynalazku jest przydatny i szczególnie ważny dlatego, że umożliwia przemianę większości heterogenicznych przeciwciał w zasadniczo jednorodną formę przed oczyszczeniem. W wyniku tej przemiany uzyskuje się z wyzszą wydajnością przeciwciała o bardziej zdefiniowanych cechach biochemicznych, zmniejszając stopień zanieczyszczenia heterogenicznymi formami przeciwciała, co ułatwia dalsze oczyszczanie. Ponadto posiadanie srjedyńcstj formy przeciwciał o wysokiej czystości pozwala zwiększyć powtarzalność i zgodność następnych modyfikacji, takich jak reakcja immunokoniugacji lub unieruchomienia.
162 260
Stosowane w niniejszym opisie określenia zdefiniowano poniżej. Komórka wytwarzająca przeciwciało - jakakolwiek komórka, komórka po transformacji lub komórka hybrydowa, która wytwarza przeciwciała zarówno in vitro jak in vivo.
Płyn puchlinowy - płyn pobrany z jamy brzusznej zwierzęcia zakażonego nowotworem powodującym wodobrzusze CP-karboksypeptydaza.
Stosunek CPIP - liczba jednostek enzymu karboksypeptydazy na miligram proteiny immunoglobulinowej.
Płyn hodowlany - każdy płyn zawierający przeciwciała, w tym, lecz nie tylko, płyn pobrany bezpośrednio z hodowli, płyn usunięty z hodowli i następnie zatężony lub płyn zawierający przeciwciała, które wcześniej wyizolowano i oczyszczono.
G - reszta glicyny
Heterogeniczność - zjawisko, polegające na tym, że wydzielone przeciwciała mają różne odrębne formy biochemiczne, takie jak, lecz nie wyłącznie, formy zawierające dodatkowy aminokwas lub aminokwasy przy C - końcu jednego lub obu ciężkich łańcuchów przeciwciała.
Heterogeniczne przeciwciała - przeciwciała, wykazujące różne odrębne formy biochemiczne, takie jak formy zawierające dodatkowy aminokwas lub aminokwasy przy C-końcu jednego lub obu ciężkich łańcuchów przeciwciała.
Komórka hybrydowa - komórka lub linia komórek wydzielających przeciwciała monoklonalne, przy czym linia tych komórek została wytworzona przez fuzję komórek szpiczakowych i komórek śledziony odpowiednio uodpornionego zwierzęcia.
K - reszta lizyny
P - reszta proliny
Początkowa forma homogeniczna - forma, w której ciężkie łańcuchy przeciwciała nie zawierają dodatkowych aminokwasów przy C-końcu.
Wektor klonowania rekombinatu DNA - każda substancja autonomicznie replikująca się lub integrująca, włącznie, lecz nie tylko z plazmidami, zawierająca cząsteczkę DNA, do której mogą się przyłączać lub zostały przyłączone jeden lub większa liczba dodatkowych segmentów DNA.
Transfekcja - wprowadzenie DNA do przyjmującej komórki gospodarza poprzez cząstki fagowego DNA.
Transformant- przyjmująca komórka gospodarza, która uległa transformacji.
Transformacja - wprowadzenie DNA do przyjmującej komórki gospodarczej, zmieniające genotyp i powodujące zmianę w komórce przyjmującej.
Figura podana na rysunku przedstawia schematycznie różnice pomiędzy heterogenicznymi formami monoklonalnego przeciwciała CEM 231, przy czym liczby 1,2,3 oznaczają numery pików.
Zgodny z wynalazkiem sposób zmniejszania heterogeniczności wydzielonych przeciwciał z komórek wytwarzających przeciwciała polega na zmianie aminokwasu lub aminokwasów przy C-końcu jednego lub obu ciężkich łańcuchów przeciwciała. Najlepiej jest go zrealizować przez selektywne usunięcie aminokwasu lub aminokwasów z jednego lub obu ciężkich łańcuchów przeciwciała od strony C-końca. Jeden wariant spowodowania tego pożądanego efektu polega na obniżeniu pH płynu hodowlanego zawierającego przeciwciała do pH odpowiedniego dla zmniejszenia heterogeniczności tych przeciwciał, a następnie inkubowaniu płynu hodowlanego przez pewien czas w temperaturze odpowiedniej dla umożliwienia zmniejszenia heterogeniczności przeciwciał. Na ogół pH można obniżyć do pH około 3,0-5,5 pH, chociaż reakcja może zajść wydajniej przy pH około 3,5-4,5. Reakcja zachodzi jeszcze wydajniej przy pH około 4,0-4,5, podczas gdy pH korzystnym dla zmniejszenia heterogeniczności wielu przeciwciał jest pH około 4,0.
Temperatura i szybkość inkubacji także wpływają na szybkość usuwania aminokwasu lub aminokwasów z ciężkich łańcuchów heterogenicznych przeciwciał od strony C-końca. Okres inkubacji może wynosić od kilku sekund do wielu dni, chociaż korzystnie jest umożliwić zajście reakcji w ciągu około 1-72 godzin. W wielu przypadkach najkorzystniej
162 260 jest umożliwić zajście reakcji w ciągu około 4-24 godzin. Jednak w zależności od cech biochemicznych przeciwciała i innych parametrów reakcji, proces inkubacji może być w około 95% zakończony już w ciągu około 24 godzin lub może trwać około 48-72 godzin. Inkubacją można prowadzić w szerokim zakresie temperatury, jednak reakcja zachodzi najlepiej w około 2-37°C. Reakcja korzystni.e zactodzi także w okołto 4-37°c oraz także w około 4-30°C. Najkorzystniejszy zakres temperatury reakcji dla wielu przewwc^ wynosi około 4-25°C, a najjęorzystniejszą temperaturą jest około +25°C.
Inny sposób zmniejszania heterogeniczności wydzielonych przeciwciał polega na dodawaniu płynu puchlinowego do płynu hodowlanego zawierającego wydzielone przeciwciała w ilości odpowiedniej dla zmniejszenia heterogeniczności tych przeciwciał, a następnie inkubowaniu płynu hodowlanego przez okres czasu, w temperaturze i przy pH odpowiednich, dla umożliwienia zmniejszenia heterogeniczności tych przeciwciał. Chociaż reakcja może zachodzić przy użyciu płynu puchlinowego w ilości w bardzo szerokim zakresie, to bardziej wydajne jest stosowanie mieszaniny, w której płyn puchlinowy dodaje się w ilości około 2:1-1:20 na objętość płynu hodowlanego. Ze względu na szybkość reakcji i jej zajście do końca lepiej jest dodać płyn puchlinowy w ilości około 1:1-1:10, a jeszcze lepiej w ilości około 1:1-1:10, a jeszcze lepiej w ilości około 1:1-1:2. Korzystnie stosunek objętości płynu puchlinowego do płynu hodowlanego powinien wynosić około 1:1. Okres inkubacji, temperatura inkubacji i pH płynu hodowlanego także wpływają na szybkość i wydajność wyżej wspomnianego procesu z użyciem płynu puchlinowego. Korzystny okres inkubacji wynosi od kilku sekund do wielu dni, lecz reakcja zachodzi wydajniej w okresie około 1-72 godzin. Często reakcja zachodzi korzystniej, jeżeli okres inkubacji wynosi około 16-72 godzin, a jeszcze lepiej, jeżeli wynosi on około 16-48 godzin. Najkorzystniej okres ten wynosi około 16 godzin. Reakcję można prowadzić w prawie nieograniczonym zakresi-e temperatury, lecz zartoiizi ona wydajniej w około 2-42°C. Reakcja przebiega korzystniej w temperaturze około 2-37°^ a jeszcze lepiej w około 26-37°C. Najkorzystniejszą temperaturą reakcji jest 37°C. Wartość pH płynu hodowlanego może również mieć wpływ na przyspieszenie i spowolnienie reakcji i jest także ważna ze względu na zapobieżenie dysocjacji przeciwciał. Wartość pH hodwol szerokim zakresie, lecz reakcja zachodzi całkiem wydajnu Reakcja biegnie lepiej przy pH około 7,5-8,5, a jeszcze pH płynu kulturowego jest prowadzonego przy niskim puchlinowego może być stosowany w praktyce przy fizjologicznych wartościach pH.
Jeszcze inny sposób zmniejszania heterogeniczności wydzielonych przeciwciał polega na dodawaniu karboksypeptydazy do płynu hodowlanego zawierającego wydzielone przeciwciała przy stosunku CPIP odpowiednim dla zmniejszenia heterogeniczności tych przeciwciał, a następnie inkubowaniu płynu hodowlanego przez okres czasu, w temperaturze i przy pH odpowiednich dla umożliwienia zmniejszenia heterogeniczności przeciwciał. Chociaż reakcja zachodzi w szerokim zakresie stosunków CPIP to zachodzi ona wydajniej przy stosunku CPIP około 0,01-10,0. Lepiej jest prowadzić reakcję przy stosunku CPIP około 0,2-8,0, a jeszcze lepiej przy stosunku CPIP około 0,2-1,0. Na ogół najkorzystniejszy jest stosunek około 0,4, a fachowcy wiedzą, że wyższy poziom enzymu spowoduje zajścia w reakcji z większą szybkością. Fachowcy zorientują się także, iż wiele różnych typów karboksypeptydazy, takich jak CpA, CpB, CpC, CpG, CpP, CpW, CpY i inne, jest w tej dziedzinie dobrze znanych i można je wszystkie stosować w sposobie według wynalazku. Ponadto jednostki karboskypeptydazy są znormalizowane i dobrze znane, dlatego tez stosowanie wynalazku w praktyce nie jest ograniczone przez konkretnego dostawę karboksypeptydazy. Fachowcy wiedzą także, ze enzym można unieruchomić na stałym nośniku aby zapobiec konieczności usuwania go podczas oczyszczania.
Okres inkubacji, temperatura inkubacji i pH płynu hodowlanego także wpływają na szybkość i.wydajność opisanego powyżej procesu z użyciem karboksypeptydazy. Korzystny okres
może się | zmieniać w bardzo | |
w zakresie | pH | około 4,0-9,0. |
lepiej przy | pH | około 7,5-8,0. |
pH około | 7,5, | a ponadto, w |
pH, proces | z | użyciem płynu |
Najkorzystniejszą wartością przeciwieństwie do procesu
162 260 inkubacji wynosi od kilku sekund do wielu dni, lecz reakcja zachodzi wydajniej w okresie około 1-48 godzin. Często reakcja przebiega korzystniej, jeżeli okres inkubacji wynosi około 1-24 godzin, a jeszcze lepiej około 1-16 godzin. Reakcja przebiega jeszcze korzystniej, jeżeli okres inkubacji wynosi około 5-16 godzin, a najkorzystniej około 5 godzin. Reakcje można prowadzić w prawie nieograniczonym zakresie temperatury, ale korzystnie prowadzi sie ja w temperaturze około 1-42°C, korzystniej około 15-37°C, a jeszcze korzystniej °koło 20~3°°C^. Najkorzystniejsza UmperaUra reakcji wynosi około 23°C. Wartość pH płynu hodowlanego może również mieć wpływ na przyspi.eszenie lut> spowolnienie reakcji i może się zmieniać w bardzo szerokim zakresie, lecz reakcja zachodzi wydajnie w zakresie pH około 6,0-9,0. Reakcja biegnie lepiej przy pH około 7,0-8,0, a jeszcze lepiej przy pH około 7,5-8,0. Najkorzystniejszą wartością pH płynu hodowlanego jest pH około 7,5.
Fachowcy wiedzą, że przez zmianę wartości pH płynu hodowlanego, okresu inkubacji, temperatury inkubacji, ilości płynu puchlinowego lub stosunku CPIP, każdy z powyższych spsobów można dostosować w miarę potrzeby do każdego schematu oczyszczania immunoglobuliny. Po reakcji zmniejszającej heterogeniczność można wyizolować przeciwciała w formie o zmniejszonej heterogeniczności z płynu hodowlanego, stosując sposoby dobrze znane w tej dziedzinie. Fachowcy z łatwością stwierdzą, że wyżej wspomniane sposoby można także stosować do zmniejszania heterogeniczności przeciwciał, które właśnie zostały oczyszczone.
Te same wyniki można w zasadzie uzyskać różnymi metodami chemicznymi, pozwalającymi usunąć z peptydu resztę C-terminalną. Na przykład w niektórych przypadkach można będzie stosować hydrazynolizę, miareczkowanie i tworzenie hydantoiny, a następnie traktowanie kwasem acetohydroksamowym. Faktycznie każda reakcja chemiczna, pozwalająca usunąć peptyd lub peptydy z fragmentu immunoglobuliny od strony C-końca znalazłaby się w zakresie niniejszego wynalazku. W szczególności dwupeptydylokarboksypeptydazy, które usuwają dwupeptydy z C-końca będą także przydatne w praktycznej realizacji sposobu według wynalazku, jak każdy inny enzym, który może specyficznie rozszczepiać cząsteczkę w C-terminalnym rejonie, wewnętrznym w stosunku do reszty lizyny.
Jeszcze inny sposób praktcznej realizacji wynalazku wynika z selektywnego stosowania kodonu lub kodonów, które kodują C-terminalną lizynę lub lizyny z genu kodującego ciężki łańcuch immunoglobuliny. Fachowcy wiedzą, że skoro pozna się sekwencję DNA kodującą przeciwciało, wówczas zastosowanie rekombinacyjnych technik DNA w celu usunięcia kodonu lub kodonów kodujących peptydy C-terminalną, to sprawa normalnej praktyki. Po ekspresji tego obciętego genu w komórce, która uległa transfekcji lub transformacji, produkt genowy będzie zawierał łańcuch przeciwciała różniący się od łańcucha dzikiego przeciwciała jedynie usuniętym peptydem C-terminalnym. Alternatywnie można także stosować rekombinacyjne techniki DNA w celu dodania kodonów kodujących różne reszty polipeptydu od strony C-końca, przez co zmienia się ładunek C-końca i zmniejsza heterogeniczność populacji przeciwciała. Tak więc jakakolwiek manipulacja tak chemiczna jak i biologiczna, która zmienia C-koniec przeciwciała i przez to zmniejsza heterogeniczność populacji objęte jest zakresem niniejszego wynalazku.
Korzystny wariant realizacji sposobu według wynalazku najlepiej ilustruje przemiana monoklonalnego przeciwciała CEM 231. Monoklonalne przeciwciało CEM 231 wydziela się z komórek hybrydowych CEM 231.6.7, szczepu złożonego 7 stycznia 1988 roku i stanowiącego część stałej kolekcji kultur American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. Jest on powszechnie dostępny jako źródło i magazyn tego przeciwciała pod numerem ATCC HB 9620.
Po wzroście komórek hybrydowych w środowisku bezsurowicznym zatęzono hodowle bezkomórkową 40-115 razy, a następnie pH płynu obniżono do pH około 4,0 przez miareczkowana za pomocą ^POj. Po inkubacji płynu przez 24 godziny w 25°C ponad 95% przeciwciał w płynie hodowlanym uległo przemianie w początkową formę homogeniczną. Ta
162 260 początkowa forma homogeniczna, jak stwierdzono za pomocą chromatografii kationowymiennej, jest formą w której łańcuchy przeciwciała nie zawierają obcych aminokwasów od strony C-końca. Ponadto wydajność tej przemiany można w niektórych przypadkach zwiększyć przez dodanie środka chelatującego, takiego jak EDTA (1-10 mM) do mieszaniny reakcyjnej.
Sposób z użyciem płynu puchlinowego można także stosować do przeprowadzenia heterogenicznego CEM 231 w początkową formę homogeniczną. Zatężony płyn hodowlany CEM 231 zmieszano w stosunku objętościowym 1:1 z płynem puchlinowym, następnie inkubowano w 37°C przy pH 7,4. Reakcja ta pozwoliła przeprowadzić hętęrogęnicznę prz^iwciało w ponad 80% w pierwotne homogeniczne przeciwciało w okresie 16 godzin, prawie w stężeniu równomolowym. Wydajność tej przemiany można w niektórych przypadkach zwiększyć przez dodanie środka chelatującego, takiego jak EDTA (1-10 mM) do mieszaniny reakcyjnej. Każdy płyn puchlinowy można wykorzystać w procesie przemiany, chociaż korzystne jest stosowanie takiego, który zawiera przeciwciało o zasadniczo innych cechach biochemicznych niż przeciwciało ulegające przemianie. Te różne cechy wykorzystuje się podczas procesu oczyszczania, aby zapobiec krzyżowemu zanieczyszczeniu przeciwciał wytwarzanych przy wodobrzuszu i przeciwciał które uległy przemianie.
Sposób z użyciem karboksypeptydazy można także wykorzystać w celu przemiany heterogenicznego CEM 231 w początkową formę homogeniczną. Po wzroście komórek hybrydowych w środowisku bezsurownicznym zateżono hodowle bezkomórkową 70 razy i wówczas dodano do hodowli karboksypeptydaze B przy stosunku CPIP wynoszącym 3,0. Po inkubacji płynu przez 5 go<3zin w 23°C ponad 95% przeciwciał z płynu hodowlanego u^gło przemiale w formę homogeniczną
Oprócz przemiany monoklonalnego przeciwciała CEM 231 powyższe metody stosowano do zmniejszania hętęrogęniczności wielu przeciwciał zarówno z komórek hybrydowych jak i takich, które uległy transformacji i transfekcji. W poniższej tabeli przedstawiono reprezentatywne próbki różnych badanych przeciwciał oraz uzyskane wyniki.
Tabela
Przeciwciało | Sposób | Wyniki | |||||||
CEV12— | pH 4 | > | 80% | pik | po | 4-24 | godz | W | 4°C |
QC1054 | pH 4 | 60% | pik | po | 43 | godz | w | 4°C | |
TSE031 | pH 4 (niskie steżenie) | > | 80% | pik | Po | 48 | godz | w | 4°C |
TSE031 | pH 4(wysokie steżenie) | > | 80% | pik | P° | 14 | godz | w | 4°C |
AFU212 | pH 4 | > | 80% | pik | po | 56 | godz | w | 4°C |
ZHB068 | pH 4 | > | 80% | pik | P° | 72 | godz | w | 4°C |
CEV124 | wodobrzusze | > | 80% | pik | po | 16 | godz | w | 37°C |
QC1054 | wodobrzusze | 69% | pik | PO | 25 | godz | w | 37°C | |
HOV061 | wodobrzusze | > | 80% | pik | po | 17 | godz | w | 37°C |
CEV124 | CP | > | 80% | pik | po | 5 | godz | w | 23°C |
QC1054 | CP | > | 80% | pik | PO | 16 | godz | w | 2 2°C |
CEM231 chimeryczne | CP | > | 80% | pik | PO | 16 | godz | w | 22°C |
CEM231/CHA225 dwufunkcyjne | CP | > | 80% | pik | Po | 16 | godz | w | 22°C |
162 260
Fachowcy łatwo się zorientują, że sposób według wynalazku jest także przydatny do zmniejszania heterogeniczności przeciwciał wytwarzanych z komórek innych niż hybrydowe. W szczególności geny kodujące przeciwciało monoklonalne można związać z różnymi wektorami klonującymi, rekombinantami DNA, następnie transformować lub transfekować do odpowiednich komórek gospodarza łącznie z bakteriami lub drożdżami. W odpowiednich warunkach komórki które uległy transformacji lub transfekcji, będą wówczas wytwarzać i wydzielać przeciwciała monoklonalne- Chimeryczne przeciwciała, które zawierają zmienne obszary z jednych gatunków połączone ze stałymi obszarami z innych gatunków mogą być także budowane i wydzielane w rekombinacyjnie transformowanych lub transfekowanych komórkach gospodarza (Boulianne i inni, 1984, Naturę 312:643-646). Ponadto sposób według wynalazku nadaje sie do zmniejszania heterogeniczności ludzkich przeciwciał lub przeciwciał dwufunkcyjnych. Sposób według wynalazku można także stosować do zmniejszania heterogeniczności przeciwciał wydzielanych z krwi, surowicy lub innych płynów ustrojowych.
Fachowcy zorientują się, że do obniżenia pH płynu hodowlanego można zastosować wiele różnych związków i że wszystkie objęte są zakresem wynalazku. Przy realizacji sposobu z użyciem nowotworu powodującego wodobrzusze można stosować wiele różnych stosunków płynu hodowlanego przeciwciała do płynu puchlinowego i wszystkie one znajdują się w zakresie wynalazku. Ponadto przy realizacji sposobu z użyciem karboksypeptydazy, w celu zmniejszenia heterogeniczności przeciwciał można stosować różne stosunki CPIP i one wszystkie znajdą się w zakresie wynalazku. Ponadto okres i temperatura inkubacji oraz pH płynu hodowlanego konieczne dla optymalnej przemiany będą się zmieniać zgodnie z określonymi cechami biochemicznymi stosowanego przeciwciała. Może być także korzystne zatężenie płynu hodowlanego przed rozpoczęciem procesu przemiany w leczniczym sposobie można stosować próbki stężone jak i rozcieńczone, tak więc wynalazek nie ogranicza się do użycia próbek stężonych.
Komórki hybrydowe i inne komórki wydzielające przeciwciała można hodować w kolbie lub w fermentorach o stałym przepływie. Można stosować pożywki bezsurowicze, a pH kultury utrzymuje się w zakresie około 6,5-8,5 w temperaturze 30-40°C. Każda linia komórek wydzielających przeciwciała wymaga własnych optymalnych warunków, które dobry fachowiec łatwo ustali.
Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.
Przykład I. Hodowla komórek hybrydowych CEM 231.6.7
Komórki hybrydowe CEM 231.6.7 wydzielające monoklonalne przeciwciało CEM 231 otrzymano z American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. Komórki hybrydowe CEM 231.6.7 stanowią część stałej kolekcji kultur ATCC i są powszechnie dostępne jako źródło i magazyn tego przeciwciała pod numerem ATCC HB 9620. Zamrożone komórki szybko rozmrożono i natychmiast przemyto je około 10 ml pożywki HL1 z dodatkiem 4mM glutaminy. Pożywkę HL1 nabyto w Ventrex, Portland, Maine. Komórki umieszczono w kolbie T i poddano inkubacji, aż do uzyskania dużej gęstości komórek.
Do dwóch stożkowatych butelek o pojemności 250 ml, zawierających pożywkę HL1 z dodatkiem 4mM glutaminy wprowadzono, w ilości około 300000 komórek na mililitr, komórki CEM 231.6.7 wydzielające firzeciwciiaJio. Komórki irnkubowano w 37°C przez 48 godzin, aż gęstość komórkowa osiągnęła około 900000 komórek na mililitr. Do każdej butelki dodano podwielokrotną ilość glutaminy do uzyskania końcowego stężenia 4mM glutaminy w hodowli. Butelki zawierające CEM 231.6.7 inkubowano następnie w 37°C przez 8-10 dni..
Po końcowej inkubacji hodowlę komórkową przelano do dwóch butelek o pojemności 250 ml i odwirowano z szybkością około 10000 obrotów na minutę przez 20 minut w wirniku Beckmann JA8 wirówki Beckmann J2-21. Uzyskano około 375 ml supernatantu i wstępne oznaczenia ilościowe wykazały, że stężenie przeciwciała wynosi około 80 ^ig na mililitr. Następnie zatężono płyn hodowlany do około 40 ml stosując zatężacz o pojemności 400 ml. wyosażony w mieszadło i filtr YM10 76 mm (Amicon Corporation, Scientific Systems
162 260
Division, 21 Hartwell Avenue, Lexington, MA 02173) . Hodowlę o objętości 40 ml zatężono do około 3,27 ml stosując zatężacz Amicon o pojemności 50 ml, wyposażony w mieszadło i filtr YM10. Zatężony supernatant przesączono przez Acrodisc (1,2 ^un, 25 mm). Zebrany supernatant można było w razie potrzeby zamrozić do - 70°C.
Przykład II. Przemiana przeciwciała CEM231 z zastosowaniem sposobu z niskim pH.
Bezkomórkowy koncentrat przeciwciała CEM231 doprowadzono do pH 4,0 przez miareczkowanie za pomocą IN HjPO^. próbkę inkubowano następnie przez 24 godziny w 25°C i dokonano oceny heterogeniczności za pomocą chromatografii kationowymiennej w kolumnie Mono-S H R 5/5 przy pH 4,5 w stanowiącym bufor 0,17 M roztworze octanu sodowego z dodatkiem 0,0-0,2M NaCl. Dane doświadczalne wykazały, że po 24 godzinach nie wykryto heterogeniczności w próbce.
Przykład III. Przemiana przeciwciała CEM231 z zastosowaniem płynu puchlinowego.
Płyn puchlinowy wyizolowano z myszy wytwarzających płyn puchlinowy w zasadzie według metody podanej przez Galfre'a Milstreina, Methods in Enzymology (1981) 73:43-44, podwielokrotne porcje oczyszczonego monoklonalnego przeciwciała CEM231, zawierające około 200 yug przeciwciała na porcje, zmieszano z płynem puchlinowym w stosunku 1:2 płyn puchlinowy f płyn hodowlany przeciwciała. Próbkę inkubowano w 24°C przez 24 godziny i dokonano oceny heterogeniczności za pomocą chromatografii kationowymiennej w kolumnie Mono-S H R 5/5, przy pH 4,4 w stanowiącym bufor roztworze octanu sodowego z dodatkiem 0,0-0,2 M NaCl. Dane doświadczalne wykazały, że po 24 godzinach ponad 80% przeciwciał uległo przemianie w pierwotną formę homogeniczną, podczas gdy próbki kontrolne inkubowane bez płynu puchlinowego pozostały prawie równomolowe we wszystkich trzech formach heterogeniczny ch.
Przykład IV. Przemiana przeciwciała CEM231 z zastosowaniem sposobu z
CP.
Około 5 mg podwielokrotną porcje koncentratu przeciwciała CEM231 inkubowano w 23°C przez 5 godzin z około 50 ^ig karboksypeptydazy B. Karboksypeptydazę B zakupiono w Calbiochem, Ρ.Ο.Βοχ 12087, San Diego, California 92112 i miała ona aktywność enzymatyczną wynoszącą 295IU/mg. W reakcji tej stosunek CPIP wynosił więc około 3,0. Po 5 godzinach inkubacji oceniono heterogeniczność próbki za pomocą chromatograffi kationowymiennej w kolumnie Mono-S H R 5/5, przy pH w stanowiącym bufor 0,17 M roztworze octanu sodowego z dodatkiem 0,0-0,2M NaCl. Dane doświadczalne wykazały, że ponad 95% przeciwciał w próbce uległo przemianie w pierwotną formę homogeniczną, podczas gdy nie traktowane przeciwciała pozostały w postaciach heterogenicznych w prawie równomolowym stosunku.
162 260
Zakład Wydawnictw UPRP. Nakład 90egz.
Cena 10 000 zł
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób zmniejszania heterogeniczności przeciwciał monoklonalnych wydzielanych z komórek wytwarzających przeciwciała, znamienny tym, że usuwa się lub dodaje się aminokwas lub aminokwasy z lub do jednego lub obu ciężkich łańcuchów przeciwciała od strony C-końca.
- 2. Sposób według zastrz. 1,znamienny tym, że selektywnie usuwa się aminokwas lub aminokwasy z jednego lub obu ciężkich łańcuchów przeciwciała od strony C-końca.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że a) dodaje się karboksypeptydazę do płynu hodowlanego zawierającego wydzielone przeciwciała przy stosunku CPIP odpowiednim dla zmniejszenia heterogeniczności tych przeciwciał, b) inkubuje się płyn hodowlany przez okres czasu, w temperaturze i przy pH odpowiednich dla umożliwienia zmniejszenia heterogeniczności tych przeciwciał, a następnie izoluje się te przeciwciała w postaci o zmniejszonej heterogeniczności z hodowli.
4. Sposób według zastrz. 3, z n a m i e n n y t y m, że karboksypeptydazę dodaje się przy stosunku CPIP około 0 ,01-10, ,0. 5. Sposób według zastrz. 4, z n a m i e n n y t y m, ze inkubacje prowadzi się przez około 1-48 godzin. 6. Sposób według zastrz. 5, z n a m x e n n y t y m, że inkubację prowadzi się w temperaturze okoi:o 1-42°C. 7. Sposób według zastrz. 6, z n a m i e n n y t y m, że inkubuje płyn hodowlany o pH około 6,0-9,0. 8. Sposób według zastrz. 4 albo 5, albo 7, z n a m i e n n y t y m, że stosuje się stosunek CPIP około 3,0, okres i inkubacji około 5 godzin temperaturę inkubacji. około 23°C i PH płynu hodowlanego około 7,5. 9. Sposób według zastrz. 2, z n a m i e n n y t y m, że a) dodaje się płyn puchlinowy do płynu hodowlanego zawierającego wydzielone przeciwciała w objętości odpowiedniej dla zmniejszenia heterogeniczności tych przeciwciał, b) inkubuje się ten płyn hodowlany przez okres czasu, w temperaturze i pH odpowiednich dla umożliwienia zmniejszenia heterogeniczności tych przeciwciał, a następnie izoluje się te przeciwciała w formie o zmniejszonej heterogeniczności z hodowli.10. Sposób według zastrz. 9, zn a m i e nny tym, się w objętości około 2:1 - 1:20 na objętość płynu hodowlanego.11. Sposób według zastrz. 10, znamien ny tym, że płyn puchlinowy dodaje że inkubację prowadzi się11, znamien ny t y m, że inkubację prowadzi się12 , znamien ny tym, że inkubację prowadzi się przez około 1-72 godzin.12. Sposób według zastrz. w tempera-turze okoł:o 2-42°C.13. Sposób według zastrz.przy pH płynu hodowlanego około 4,0-9,0.14. Sposób według zastrz. 10 albo 11 albo 12 albo 13, z na mlenny tym że płyn puchlinowy dodaje się w objętości 1:1 na objętość płynu hodowlanego, a inkubację prowadzi się przez około 16 godzin w temperaturze około 37°C, przy pH płynu hodowl.anego około 7,5.15. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że a) zmniejsza się pH hodowli zawierającej wydzielone przeciwciała do pH odpowiedniego dla zmniejszenia heterogeniczności tych przeciwciał, b) inkubuje się ten płyn hodowlany przez okres czasu i w temperaturze odpowiedniej dla umożliwienia zmniejszenia heterogeniczności tych przeciwciał, a następnie izoluje się te przeciwciała o zmniejszonej heterogeniczności z hodowli.162 26016. Sposób według zaetrz. 15, z n a m i e η n y tym, że pH hodowli zmniejsza się do pH około 3,0-5,! 5. 17. Sposób według zast^. 16, z n a m i e η n y tym, że inkubacje prowadzi się przez około 1-72 godziny. 18. Sposób według sastrz. 17, z n a m i e η n y tym, że inkubację prowadzi się w ^m^ra^rze okoł:o 2-37°C. 19. Sposób według zast^. 16 albo 17 albo 18 z n a m i e η ny tym, że pH płynu hodowlanego zmmiheeza się do około 4 ,0 a inkubację prowadzi się w temperaturze około 40°C ^zez około 72 godziny. 20. Sposób według zaotrz. 1-19, z n a m i e η n y tym, że stosuje się wydzielone przeciwciała wybrane z grupy zawierającej chimeryczne, dwufunkcyjne i ludzkie przeciwciała monoklonalne.* * *
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US25078788A | 1988-09-28 | 1988-09-28 | |
US25078888A | 1988-09-28 | 1988-09-28 | |
US25078688A | 1988-09-28 | 1988-09-28 | |
US07/364,056 US5126250A (en) | 1988-09-28 | 1989-06-09 | Method for the reduction of heterogeneity of monoclonal antibodies |
CA000613379A CA1332367C (en) | 1988-09-28 | 1989-09-26 | Method for the reduction of heterogeneity of monoclonal antibodies |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL162260B1 true PL162260B1 (pl) | 1993-09-30 |
Family
ID=27508376
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL89281598A PL162260B1 (pl) | 1988-09-28 | 1989-09-27 | Sposób zmniejszania heterogenicznosci przeciwcial monoklonalnych PL |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0361902B1 (pl) |
JP (1) | JP2925181B2 (pl) |
CN (1) | CN1041392A (pl) |
AR (1) | AR242986A1 (pl) |
AT (1) | ATE101876T1 (pl) |
AU (1) | AU615576B2 (pl) |
BG (1) | BG60017A3 (pl) |
CA (1) | CA1332367C (pl) |
DE (1) | DE68913251T2 (pl) |
DK (1) | DK475389A (pl) |
ES (1) | ES2049332T3 (pl) |
IE (1) | IE63562B1 (pl) |
IL (1) | IL91778A (pl) |
MX (1) | MX170441B (pl) |
NZ (1) | NZ230786A (pl) |
PL (1) | PL162260B1 (pl) |
RO (1) | RO105652B1 (pl) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2568436T3 (es) | 2006-03-31 | 2016-04-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procedimiento para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos |
EP1878747A1 (en) | 2006-07-11 | 2008-01-16 | greenovation Biotech GmbH | Glyco-engineered antibodies |
EP2031064A1 (de) * | 2007-08-29 | 2009-03-04 | Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG | Verfahren zur Steigerung von Proteintitern |
EP3689912A1 (en) | 2007-09-26 | 2020-08-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr |
SG10201605394SA (en) | 2007-09-26 | 2016-08-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Modified Antibody Constant Region |
EP4238993A3 (en) | 2008-04-11 | 2023-11-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly |
TWI440469B (zh) | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
JP5787446B2 (ja) | 2009-03-19 | 2015-09-30 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
US9228017B2 (en) | 2009-03-19 | 2016-01-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody constant region variant |
SG190727A1 (en) | 2010-11-30 | 2013-07-31 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly |
RU2615448C2 (ru) * | 2010-12-28 | 2017-04-04 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Описание способа культивирования животной клетки |
PT2970512T (pt) * | 2013-03-12 | 2019-01-17 | Biocon Ltd | Proteínas de fusão imunomoduladoras e métodos para produção das mesmas |
WO2014200018A1 (ja) | 2013-06-11 | 2014-12-18 | 独立行政法人 国立精神・神経医療研究センター | 再発寛解型多発性硬化症(rrms)患者の治療予後予測方法、及び新規治療適応判断方法 |
TW202339800A (zh) | 2015-02-27 | 2023-10-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途 |
US10697883B2 (en) | 2015-05-19 | 2020-06-30 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Method for determining application of therapy to multiple sclerosis (MS) patient |
HUE054420T2 (hu) * | 2016-10-17 | 2021-09-28 | Enzene Biosciences Ltd | Folyamatos eljárás terápiás fehérje heterogenitásának csökkentésére |
US11851486B2 (en) | 2017-05-02 | 2023-12-26 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils |
US11692037B2 (en) | 2017-10-20 | 2023-07-04 | Hyogo College Of Medicine | Anti-IL-6 receptor antibody-containing medicinal composition for preventing post-surgical adhesion |
-
1989
- 1989-09-26 IL IL9177889A patent/IL91778A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-09-26 BG BG89846A patent/BG60017A3/xx unknown
- 1989-09-26 AR AR89310004A patent/AR242986A1/es active
- 1989-09-26 CA CA000613379A patent/CA1332367C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-26 RO RO141765A patent/RO105652B1/ro unknown
- 1989-09-26 NZ NZ230786A patent/NZ230786A/xx unknown
- 1989-09-27 AU AU42343/89A patent/AU615576B2/en not_active Ceased
- 1989-09-27 DE DE68913251T patent/DE68913251T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-27 AT AT89309851T patent/ATE101876T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-09-27 DK DK475389A patent/DK475389A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-09-27 MX MX017721A patent/MX170441B/es unknown
- 1989-09-27 ES ES89309851T patent/ES2049332T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-27 PL PL89281598A patent/PL162260B1/pl unknown
- 1989-09-27 IE IE309489A patent/IE63562B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-09-27 EP EP89309851A patent/EP0361902B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-28 CN CN89107508.9A patent/CN1041392A/zh active Pending
- 1989-09-28 JP JP1256890A patent/JP2925181B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
MX170441B (es) | 1993-08-23 |
IL91778A (en) | 1994-10-07 |
DE68913251D1 (de) | 1994-03-31 |
JPH02163096A (ja) | 1990-06-22 |
ATE101876T1 (de) | 1994-03-15 |
AR242986A1 (es) | 1993-06-30 |
EP0361902A3 (en) | 1990-08-16 |
EP0361902A2 (en) | 1990-04-04 |
CA1332367C (en) | 1994-10-11 |
AU615576B2 (en) | 1991-10-03 |
JP2925181B2 (ja) | 1999-07-28 |
NZ230786A (en) | 1991-11-26 |
DE68913251T2 (de) | 1994-06-23 |
DK475389A (da) | 1990-03-29 |
IE63562B1 (en) | 1995-05-17 |
AU4234389A (en) | 1990-04-05 |
ES2049332T3 (es) | 1994-04-16 |
IE893094L (en) | 1990-03-28 |
DK475389D0 (da) | 1989-09-27 |
EP0361902B1 (en) | 1994-02-23 |
CN1041392A (zh) | 1990-04-18 |
RO105652B1 (ro) | 1992-11-30 |
BG60017A3 (en) | 1993-06-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5126250A (en) | Method for the reduction of heterogeneity of monoclonal antibodies | |
PL162260B1 (pl) | Sposób zmniejszania heterogenicznosci przeciwcial monoklonalnych PL | |
JP2979172B2 (ja) | α−アミド化酵素組成物およびそれらの製造方法ならびに利用 | |
CN102791726B (zh) | 纯化免疫球蛋白溶液的方法 | |
EP0732404A1 (en) | Novel expression screening vector | |
CA2213331A1 (en) | Chemokine receptors 88-2b [ckr-3] and 88c and their antibodies | |
CN112209995B (zh) | 一种SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区制备方法 | |
US4659666A (en) | Pure alkaline phosphatase, its preparation and use | |
WO1986004336A1 (en) | Monoclonal antibodies against core proteins of lymphadenopathy-associated-viruses | |
JPH0588116B2 (pl) | ||
EP0511978B1 (en) | Method of purifying recombinant polypeptides | |
DE69431068D1 (de) | Das polypeptid eines membran-proteins mit der funktion zur unterstützung des wachstums von prä-b zellen und sein gen | |
CN115992103A (zh) | 酶突变体及类蛇毒三肽的制备方法 | |
KR0161656B1 (ko) | 글루카곤의 생산방법 | |
EP0527778B1 (en) | Improved process of purifying recombinant proteins and compounds useful in such process | |
CN116179582A (zh) | 一种通用型基因重组蛋白质a亲和纯化填料制备方法和应用 | |
EP0300459A2 (en) | Human pancreatic secretory trypsin inhibitor | |
EP0244147A2 (en) | Purification process for hybrid proteins | |
CN113564185B (zh) | 一种碱性磷酸酶基因及其cho稳定细胞株和alp制备方法 | |
CN114836368B (zh) | 一种线粒体纯化试剂盒 | |
CN108314740B (zh) | 一种蛋白固定化修饰的细胞培养容器 | |
JPH0576384A (ja) | 抗ヒト神経成長因子モノクローナル抗体 | |
Cone | Non-MHC-restricted T cell antigen-binding proteins | |
JP3053513B2 (ja) | ハイブリドーマと、このハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体、およびこのモノクローナル抗体が認識するマウスリンパ球活性化抗原 | |
CN116199742A (zh) | 一种重组人绒毛膜促性腺激素Fc融合蛋白制备方法 |