KR20190064591A - 치료적 단백질의 불균일성을 감소시키기 위한 연속 공정 - Google Patents

치료적 단백질의 불균일성을 감소시키기 위한 연속 공정 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감소된 불균일성을 가진 치료적 단백질의 연속 제조를 가능하게 하는 생물-제조 공정에 관한 것이다. 본원에 개시된 생물-제조 공정은 치료적 단백질에서 불균일성을 감소시키고, 상기 치료적 단백질을 포획하고 바이러스를 불활성화시키며, 상기 치료적 단백질을 정제하며, 상기 정제된 치료적 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는 다중 컬럼 크로마토그래피 시스템을 이용한다. 본원에 개시된 공정은 치료적 단백질의 염기 동형(isoform)의 비율을 감소시킴으로써, 상기 치료적 단백질의 불균일성을 감소시킬 수 있다.

Description

치료적 단백질의 불균일성을 감소시키기 위한 연속 공정
본 발명은 치료적 단백질의 생물-공정의 기술분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 감소된 불균일성을 가진 치료적 단백질을 제조하기 위한 연속 공정에 관한 것이다.
배경 기술은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 어떤 정보가 선행기술 또는 현재 청구된 발명과 관련이 있거나, 특정 또는 암시적으로 언급된 어떤 출판물이 선행기술임을 인정하는 것은 아니다.
치료적 단백질의 중요성의 확인은 생물약학 산업에서 새로운 혁명을 이끌고 있다. 그러나, 치료적 단백질의 생산은 그 제품에서 높은 수율 및 품질을 획득하기 위해 필요한 분리 및 정제 공정에서 큰 방해인 그들의 하전된 동형(isoform)을 관찰한다.
카복시펩티다제 효소는 C-말단 펩타이드 결합의 가수분해를 촉매함에 따라, 모노클로날 항체와 같은 치료적 단백질의 균일한 형태의 제조를 위해 일반적으로 사용된다. 카복시펩티다제 B는 아르기닌 및 라이신과 같은 염기 아미노산에 우선적으로 작용하는 카복시펩티다제이다.
치료적 단백질에서 불균일성의 양을 감소시키기 위한 다양한 방법은 선행기술에 개시되어 있다. 예를 들면, US5126250은 정제 전에 대부분 불균일한 항체를 하나의 실질적으로 균일한 형태로 전환시킴으로써 항체-생산 세포로부터 분비된 항체의 불균일성을 감소시키는 방법을 개시하고 있다.
WO20120147053는 세포 배양에 의해 획득된 항체에서 불균일성을 감소시키는 방법을 개시한다.
US9062337은 펩타이드의 C-말단 잔기를 절단하기 위한 펩티딜글리신 알파 아미데이팅 모노옥시제나제 효소(peptidylglycine alpha amidating monooxigenase enzyme)의 이용을 개시한다.
또한, 다양한 선행기술 문헌은 치료적 단백질의 정제 및 생산을 위한 효소의 고정화를 개시하고 있다. Chemuru et al., Biopolymers 2014 Mar; 102(2): 206-221은 아가로스 비드 상에 고정화된 카복시펩티다제 B를 사용한 Aβ 펩타이드의 lys 잔기의 제거를 개시한다.
Kudryavtseva et al., Pharm Chem J (1995) 29: 70은 인슐린 내로 프로인슐린의 전환을 위한 변형된 실리카 상에 트립신 및 카복시펩티다제 B의 고정화를 개시한다. Yasuhara and Ohashi, Appl Biochem Biotechnol (1994) 44: 151은 펩타이드의 C-말단 잔기의 제거를 위한 세파로스 상에 포카복시펩티다제 B의 고정화를 개시한다.
US9657056은 치료적 단백질 의약 물질을 제조하기 위한 통합된 연속 공정을 개시하고, 이때, 관류 생물반응기로부터 액체 배양 배지는 4개 컬럼 중 처음 3개 컬럼 상에 포획하기 위해 MCCS1 상에 이동시키고, 이들로부터 용출액은 바이러스 불활성화를 위해 제4 컬럼 상에 공급되고 배양된다. 재조합 치료적 단백질을 함유하는 MCCS1의 용출액은 제2 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템(MCCS2) 내로 연속적으로 공급되고; 상기 MCCS2를 이용하여 상기 재조합 치료적 단백질을 정제 및 폴리싱한다.
C- 말단 잔기로부터 불균일성의 제거는 상기 배양 배지에서 상기 생물반응기에 직접적으로 또는 크로마토그래피 단계 직후에 카복시펩티다제를 첨가함으로써 공급 회분 배양에서 일반적으로 수행된다. 그러나, 효소의 첨가는 배양 시간, 온도, pH 등의 측면에서 많은 최적화 단계를 필요로 한다. 더욱이, 효소의 높은 비용은 공정의 전체 비용을 증가시킨다.
연속 생물-공정은 최근 평형 상태 조작, 작은 장비 크기, 높은 용적 생산성, 유선형 공정 흐름, 낮은 사이클 시간 및 감소된 자본 비용과 같은 다양한 이점 때문에 큰 관심을 얻고 있다.
치료적 단백질의 불균일성을 감소시키기 위한 다수의 접근법이 선행기술에 개시되어 있음에도 불구하고, 감소된 불균일성을 가진 치료적 단백질을 제조하기 위한 연속 공정에 대한 개시는 없다. 또한, 선행기술은 정제 전에 단백질에서 불균일성을 감소시킬 수 있는 공정을 제공하지 못한다.
본 발명은 상이한 것들뿐만 아니라 존재하는 요구를 만족시키고, 선행기술에서 발견된 결함을 일반적으로 극복한다.
본원에서 모든 출판물은 개별 출판물 또는 특허 출원 각각이 참고문헌으로서 통합되기 위해 구체적이고 개별적으로 나타내어지는 것처럼, 동일한 범위로 참고문헌으로서 통합된다. 통합된 참고문헌에서 용어의 정의 또는 사용이 일관성이 없거나 본원에서 제공되는 용어의 정의와 상반되는 경우, 본원에서 제공되는 용어의 정의가 적용되고, 참고문헌에서 용어의 정의는 적용되지 않는다.
본 발명의 목적은 감소된 불균일성을 가진 치료적 단백질의 연속 생산을 가능하게 하는 생물-제조 공정을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 정제 단계 전에 치료적 단백질에서 불균일성의 감소를 가능하게 하는 연속 공정을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 치료적 단백질 생산의 전체 수율을 타협하지 않고 치료적 단백질의 불균일성을 감소시키기 위한 연속 공정을 제공하는 것이다.
본 발명의 여전히 다른 목적은 감소된 불균일성을 가진 치료적 단백질을 연속적으로 제조하기 위해 사용될 수 있는 높은 유연성 및 경제성 생물-제조 공정을 제공하는 것이다.
본 발명은 감소된 불균일성을 가진 치료적 단백질의 연속 생산을 가능하게 하는 생물-제조 공정에 관한 것이다. 본원에 개시된 생물-제조 공정은 치료적 단백질에서 불균일성을 감소시키고, 상기 치료적 단백질을 포획하고 바이러스를 불활성화시키며, 상기 치료적 단백질을 정제하며, 상기 정제된 치료적 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는 다중 컬럼 크로마토그래피 시스템을 이용한다.
일 측면에서, 본 발명은 치료적 단백질의 불균일성을 감소시키기 위한 연속 공정을 제공하고, 상기 공정은 단일 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템에서 상기 치료적 단백질의 하나 이상의 염기 동형(isoform)을 감소시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템은 적어도 둘의 크로마토그래피 컬럼을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템은 세파로스 상에 고정화된 카복시펩티다제 B(carboxypeptidase B)를 포함하는 컬럼을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료적 단백질의 불균일성을 감소시키기 위한 연속 공정을 제공하고, 상기 공정은 (a) 제1 컬럼, 제2 컬럼, 제3 컬럼 및 제4 컬럼을 포함하는 다중-컬럼 크로마토그래피를 제공하는 단계;
(b) 상기 제1 컬럼 내로 치료적 단백질을 포함하는 세포 배양 산물을 공급함으로써, 상기 치료적 단백질의 불균일성을 감소시키는 단계;
(c) 상기 제2 컬럼 내로 상기 제1 컬럼으로부터 통과액을 공급함으로써, 상기 제1 컬럼의 통과액에서 상기 치료적 단백질을 포획하는 단계;
(d) 상기 치료적 단백질을 정제하기 위해 상기 제3 컬럼 내로 상기 제2 컬럼으로부터 상기 치료적 단백질을 포함하는 용출액을 공급하는 단계; 및
(e) 상기 치료적 단백질을 폴리싱하기 위해 상기 제4 컬럼 내로 상기 제3 컬럼으로부터 상기 치료적 단백질을 포함하는 통과액을 공급하는 단계를 포함하고,
상기 제1 컬럼은 세파로스 상에 고정화된 카복시펩티다제 B(carboxypeptidase B)를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 제2 컬럼으로부터 치료적 단백질을 포함하는 용출액은 수집되고, 바이러스 불활성화를 위한 낮은 pH에서 저장소에서 유지된다. 바이러스 불활성화 후에, 상기 제2 컬럼으로부터 상기 용출액은 상기 제3 컬럼 내로 공급하기 전에 pH 및 전도도 조절에 적용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제3 컬럼으로부터 치료적 단백질을 포함하는 통과액은 상기 제4 컬럼 내로 공급하기 전에 pH 및 전도도 조절에 적용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템의 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 컬럼은 직렬로 또는 병렬로 순차적으로 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제1 컬럼은 상기 치료적 단백질의 염기 동형(isoform)의 비율을 감소시킴으로써 상기 치료적 단백질의 불균일성을 감소시킨다.
일 구현예에서, 상기 제2 컬럼은 친화성 크로마토그래피 컬럼일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제3 컬럼 및 제4 컬럼 각각은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 및 다중모달 크로마토그래피 컬럼으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 공정에 의해 준비/사용될 수 있는 치료적 단백질은 항체 단편, 모노클로날 항체, 효소, 조작된 단백질, 면역원성 단백질, 단백질 단편, 면역글로불린 또는 그 어떤 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명의 공정에 의해 처리/도출될 수 있는 치료적 단백질은 어떤 추가적인 정제 및/또는 오염제거 단계 없이 약학적 조성물 내로 제형화될 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명의 공정에서 사용되는 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템은 연속 모드 및 정상 상태로 수행될 수 있다.
본 발명의 다양한 목적, 특징, 측면 및 이점은 바람직한 구현예의 다음 상세한 설명으로부터 보다 명백해질 것이다.
수반되는 도면은 본 발명의 추가적인 이해를 제공하기 위해 포함되고, 본 명세서의 일부에 통합되고 본 명세서의 일부를 구성한다. 상기 도면은 상세한 설명과 함께 본 발명의 예시적인 구현예를 설명하고, 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1은 본 발명의 구현예에 따른, 4개 컬럼 상에 치료적 단백질의 연속 공정을 위한 예시적인 공정 흐름을 설명한다.
도 2는 단일 정제 시스템에서 연속적으로 연결된 2개 컬럼에 대한 크로마토그램을 보여준다.
도 3은 CPB-CNBR-활성화된 세파로스 TM 4B 컬럼 다음에 단백질 A 컬럼의 크로마토그램 프로파일이 약 25분 RT에서 연속 모드로 mAb A에 대해 작동함을 보여준다.
도 4는 동일한 유속에서 조작하는 경우, 컬럼 1 및 컬럼 2의 연속 공정 설정을 보여준다.
도 5는 CPB-CNBR-활성화된 세파로스 TM 4B 컬럼 다음에 단백질 A 컬럼의 크로마토그램 프로파일이 20분 RT에서 연속 모드로 mAb A에 대해 작동함을 보여준다.
도 6은 대조군 및 CPB-PA 용출액에 대한 WCEX 분석 오버레이를 도시한다.
도 7은 상이한 유속에서 조작하는 경우, 컬럼 1 및 컬럼 2의 연속 공정 설정을 보여준다.
도 8은 CPB-CNBR-활성화된 세파로스 TM 4B 컬럼 다음에 단백질 A 컬럼의 크로마토그램 프로파일이 2분 RT에서 연속 모드로 mAb A에 대해 작동함을 보여준다.
도 9는 2분 RT에서 대조군 및 CPB-PA 용출액에 대한 WCEX 분석 오버레이를 도시한다.
도 10은 mAb A에 대해 컬럼 1 상에 20분 RT 및 2분 RT에서 각각 CPB-PA 용출액에 대한 WCEX 분석 오버레이를 도시한다.
도 11은 CPB-CNBR-활성화된 세파로스 TM 4B 컬럼 다음에 단백질 A 컬럼의 크로마토그램 프로파일이 2분 RT에서 연속 모드로 mAb B에 대해 작동함을 보여준다.
도 12는 2분 RT에서 mAb B 대조군 및 mAb B CPB-PA 용출액에 대한 WCEX 분석 오버레이를 도시한다.
도 13은 단백질 A 컬럼의 크로마토그램 프로파일이 AKTA pcc(3C pcc) 상에 대조군으로서 mAb A에 대해 작동함을 보여준다.
도 14는 CPB-CNBR-활성화된 세파로스 TM 4B 컬럼(컬럼 1) 다음에 단백질 A 컬럼 상에 10mg/ml, 20mg/ml 및 30mg/ml 각각의 로딩 밀도에 대한 크로마토그램 프로파일이 AKTA pcc(3C pcc) 상에 연속 모드로 mAb A에 대해 작동함을 보여준다.
도 15는 CPB-CNBR-활성화된 세파로스 TM 4B 컬럼(컬럼 1) 다음에 단백질 A 컬럼 상에 80mg/ml 각각의 로딩 밀도에 대한 크로마토그램 프로파일이 AKTA pcc(3C pcc) 상에 연속 모드로 mAb A에 대해 작동함을 보여준다.
도 16은 대조군과 함께 개별적인 로딩 밀도에 대한 중화된 CPB-PA 용출액의 WCEX 분석 오버레이를 도시한다.
도 17은 WCEX 분석 데이터가 mAb A에 대한 컬럼 1 상에 상이한 로딩 밀도에서 대조군과 함께 CPB-PA 용출액을 오버레이함을 도시한다.
도 18은 mAb A의 연속 공정에 대한 AKTA pcc(3C pcc) 설정을 보여준다.
도 19는 AKTA pcc(3C pcc) 상에 mAb A에 대한 연속 공정을 위한 크로마토그램 프로파일을 보여준다.
도 20은 WCEX 분석 데이터가 연속 공정으로부터 컬럼 2 용출액 및 컬럼 4 용출액과 함께 대조군을 오버레이함을 보여준다.
다음은 본 발명의 구현예의 상세한 설명이다. 본 개시를 명확하게 전달하기 위해, 상기 구현예는 그 정도로 상세하다. 그러나, 제공되는 상세의 양은 구현예의 예상되는 변이를 제한하기 위해 의도되지 않는다; 반대로, 상기 의도는 상기 첨부된 청구항에 의해 정의되는 바와 같이, 본 발명의 사상 및 범위 내에 있는 모든 변형, 등가 및 대안을 포함한다.
상기 문맥이 요구되지 않은 이상, 상기 명세서를 통하여, 단어 “포함하다” 및 “포함하다” 및 “포함하는”과 같은 그 변이는 “포함하나, 이에 제한되지 않는다”와 같은 개방적이고 포괄적인 의미로 해석되어야 한다.
이러한 명세서를 통하여 “일 구현예” 또는 “구현예”로 참고는 상기 구현예와 연결되어 설명된 특별한 특징, 구조 또는 특성이 적어도 하나의 구현예에 포함되는 것을 의미한다. 따라서, 이러한 명세서를 통하여 다양한 곳에서 “일 구현예에서” 또는 “구현예에서” 문구의 출현은 동일한 구현예에 대한 모든 언급을 필요로 하지 않는다. 더욱이, 특별한 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떤 적절한 방법으로 조합될 수 있다.
본원 설명에서 사용된 바와 같은 및 상기 청구항을 통하여, “하나(a, an)” 및 “그(the)” 의 의미는 상기 문맥이 명확하게 지시하지 않는 이상, 복수 참고를 포함한다. 또한, 본원 설명에서 사용된 바와 같이, “내(in)”의 의미는 상기 문맥이 명확하게 지시하지 않은 이상, “내(in)” 및 “상(on)”을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 특정 구현예를 설명하고 청구하기 위해 사용되는 성분의 양, 농도와 같은 물성, 공정 조건 등을 표현하는 수치는 상기 용어 “약”에 의해 일부 실시예에서 변형되는 바와 같이 이해된다. 따라서, 기재된 설명에서 제시된 수치 파라미터는 특별한 구현예에 의해 획득되기 위해 추구되는 원하는 물성에 의존하여 변할 수 있는 근사치이다. 일부 구현예에서, 수치 파라미터는 보고된 유효 자리수의 수 및 일반적인 반올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다. 본 발명의 일부 구현예의 넓은 범위를 제시하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 기재된 수치 값은 가능한 정확하게 보고된다.
본원 값의 범위의 설명은 단지 그 범위 내에 속하는 각각 개별 값에 개별적으로 참고하는 약식 방법으로서 가능하도록 의도된다. 본원에서 지시되지 않는 이상, 각각 개별 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 상기 명세서 내로 통합된다.
본원에서 지시되지 않거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않은 이상, 본원에 서술된 모든 방법은 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원 특정 구현예에 대하여 제공되는 어떤 및 모든 실시예, 예시적인 언어(예컨대, “와 같은”)의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 나타내도록 의도된 것이며, 청구되지 않은 이상, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 상기 명세서에서 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로서 해석되어서는 안된다.
본원에 제공된 상기 발명의 제목 및 요약은 오직 편의를 위한 것이고, 상기 구현예의 범위 또는 의미를 해석하지 않는다.
다양한 용어가 본원에서 사용된다. 청구항에서 사용된 용어의 정도가 하기 정의되지 않은 한, 당업자는 제출 당시 인쇄된 출판물 및 발행된 특허에 반영된 바와 같이 용어에 가장 넓은 정의를 제공해야 합니다.
본원에서 사용되는 “연속 공정”은 연속하여 둘 이상의 공정 단계를 가지는 어떤 공정을 나타내고, 상류 단계(단위 조작)로부터 상기 산물은 상기 최종 크로마토그래피 단계까지 연속적으로 하류 단계(단위 조작)로 이동되며, 다음 공정 단계가 시작되기 전에 상기 공정 단계는 완료되기 위해 작동할 필요가 없다. 연속 공정에서, 타겟 제품의 일부분은 상기 공정 시스템을 통해 항상 이동한다. 이상적으로, 가능한 한 최대로, 상기 연속 공정의 매 단계 또는 단위 조작이 동일한 시간 및 실질적으로 동일한 생산 속도로 작동하도록 연속 공정은 규제된다. 이러한 방법에서, 상기 사이클 시간의 압축은 최대화되고 가능한 가장 짧은 완료 시간이 달성된다.
상기 용어 “연속 이동”은 상류 단위 조작으로부터 하류 단위 조작으로 이동하는 제품 흐름을 나타내고, 둘의 단위 조작 사이에 연결 또는 링크가 상류 장치 조작이 제품 흐름(직접적으로 또는 다른 구성을 통하여)을 제2(하류) 단위 조작으로 이동하고, 상기 상류 단위 조작이 완료되기 전에 상기 하류 단위 조작이 시작하도록 있음을 의미한다(즉, 둘의 연속적인 단위 조작은 둘의 단위 조작이 하나의 부분을 포함하는 전체 공정의 일부에 대해 그들을 동시에 유입시키는 상기 제품 흐름을 처리함).
본원에서 사용된 용어 "관류 세포 배양 공정"은 상기 생물반응기에 새로운 배지를 연속적으로 공급하고 상기 반응기에 상기 세포를 보유하는 동안 상기 세포-프리 폐 배지를 끊임없이 제거함으로써, 수행되는 관류 배양을 나타낸다; 따라서, 세포가 세포 보유 장치를 통해 상기 반응기 내에 보유됨에 따라, 보다 높은 세포 밀도는 연속 배양과 비교하여 관류 배양에서 획득될 수 있다. 상기 관류 속도는 세포주의 요구, 상기 공급 내 영양분의 농도 및 독성의 수준에 의존한다.
상기 용어 "세포 배양 배지"는 배양하는 세포와 관련하여 사용된느 모든 종류의 배지를 나타낸다. 전형적으로, 세포 배양 배지는 아미노산, 에너지원으로서의 적어도 하나의 탄수화물, 미량 원소, 비타민, 염 및 가능한 추가 성분(예컨대, 세포 성장 및/또는 생산성 및/또는 제품 품질에 영향을 주기 위해)을 포함한다.
상기 용어 “치료적 단백질”은 액체 배양 배지에서 또는 숙주세포(예컨대, 포유동물, 효모 또는 세균 숙주세포) 및 생물학적 오염물질(예컨대, 바이러스 및 박테리아 오염물질)로부터 존재하는 오염 단백질, 지질 및 핵산으로부터 충분히 제거되거나 분리된 재조합 단백질을 의미하고, 약학적 제품으로 제형화될 수 있다. 치료적 단백질의 대표적인 예시는 항체, 항체 단편, 모노클로날 항체, 효소, 조작된 단백질, 면역원성 단백질, 단백질 단편 및 면역글로불린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 용어 “항체”는 혈청의 기능적 구성을 나타내며, 분자(항체 또는 면역글로블린, 단편 등)의 집합 또는 분자 중 하나를 보통 나타낸다. 항체 분자는 특정 항원 결정 요인에 결합하거나 반응할 수 있는 능력을 가지고, 이는 차례로 특정 면역학적 효과 또는 메커니즘을 유도할 수 있다.
상기 용어 “모노클로날 항체”는 세포 또는 세포주의 단일 클론에 의해 생산되고, 동일한 항체 분자로 구성된 항체를 나타낸다.
상기 용어 “동형(isoform)”은 유사하나 동일하지 않은 아미노산 서열을 가지고, 상이한 유전자에 의해 또는 상이한 엑손이 제거된 동일한 유전자로부터 RNA 전사에 의해 암호화되는 둘 이상의 기능적으로 유사한 단백질을 나타낸다.
상기 용어 “불균일성”은 현상을 나타내고, 이때, 분비된 항체는 상기 항체 중쇄의 하나 또는 모두의 카복시 말단 상에 여분 아미노산 또는 산과 같은 다양한 별개 생화학적 형태를 가진다.
본원에서 사용되는 상기 용어 “불균일성 감소”는 모노클로날 항체의 불균일한 형태가 실질적으로 순수하고 균일한 형태로 전환시키기 위한 공정을 나타낸다.
본원에서 사용되는 상기 용어“보유 시간”은 용질의 양의 절반이 상기 크로마토그래피 시스템으로부터 용출되는 시간을 나타낸다. 이는 상기 컬럼의 길이 및 상기 용질의 이동 속도에 의해 결정되고; 이는 1-30 분의 범위에 있을 수 있다.
상기 용어 “다중컬럼 크로마토그래피 시스템” 또는 “MCCS”는 둘 이상의 서로 연결되거나 스위칭 크로마토그래피 컬럼 및/또는 크로마토그래피 막의 시스템을 의미한다. 다중-컬럼 크로마토그래피의 비제한적인 예시는 둘 이상의 서로 연결되거나 스위칭 크로마토그래피 컬럼 및/또는 크로마토그래피 막의 전체를 함유하는 주기적 역류 크로마토그래피 시스템(PCC)을 포함한다.
상기 용어 “용출액/여과액”은 기술 용어로서, 재조합 치료적 단백질의 검출가능한 양을 포함하는 크로마토그래피 컬럼 또는 크로마토그래피 막으로부터 방출되는 유체를 의미한다.
본 발명의 구현예는 감소된 불균일성을 가진 치료적 단백질의 연속 생산을 가능하게 하는 생물-제조 공정에 관한 것이다. 본원에 개시된 생물-제조 공정은 치료적 단백질에서 불균일성을 감소시키고, 상기 치료적 단백질을 포획하고 바이러스를 불활성화시키며, 상기 치료적 단백질을 정제하며, 상기 정제된 치료적 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는 다중 컬럼 크로마토그래피 시스템을 이용한다.
일 측면에서, 본 발명은 치료적 단백질의 불균일성을 감소시키기 위한 연속 공정을 제공하고, 상기 공정은 단일 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템에서 치료적 단백질의 하나 이상의 염기 동형을 감소시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템은 적어도 둘의 크로마토그래피 컬럼을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템은 세파로스 상에 고정화된 카복시펩티다제 B(carboxypeptidase B)를 포함하는 컬럼을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료적 단백질의 불균일성을 감소시키기 위한 연속 공정을 제공하고, 상기 공정은
(a) 제1 컬럼, 제2 컬럼, 제3 컬럼 및 제4 컬럼을 포함하는 다중-컬럼 크로마토그래피를 제공하는 단계;
(b) 상기 제1 컬럼 내로 치료적 단백질을 포함하는 세포 배양 산물을 공급함으로써, 상기 치료적 단백질의 불균일성을 감소시키는 단계;
(c) 상기 제2 컬럼 내로 상기 제1 컬럼으로부터 통과액을 공급함으로써, 상기 제1 컬럼의 통과액 에서 상기 치료적 단백질을 포획하는 단계;
(d) 상기 치료적 단백질을 정제하기 위해 상기 제3 컬럼 내로 상기 제2 컬럼으로부터 상기 치료적 단백질을 포함하는 용출액을 공급하는 단계; 및
(e) 상기 치료적 단백질을 폴리싱하기 위해 상기 제4 컬럼 내로 상기 제3 컬럼으로부터 상기 치료적 단백질을 포함하는 통과액을 공급하는 단계를 포함하고,
상기 제1 컬럼은 세파로스 상에 고정화된 카복시펩티다제 B(carboxypeptidase B)를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템의 제1, 제2, 제3 및 제4 컬럼은 직렬로 또는 병렬로 순차적으로 연결될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 제1 컬럼은 상기 치료적 단백질의 염기 동형의 비율을 감소시킴으로써 상기 치료적 단백질의 불균일성을 감소시킨다.
일 구현예에서, 상기 제2 컬럼은 친화성 크로마토그래피 컬럼일 수 잇다.
일 구현예에서, 상기 제3 컬럼 및 제4 컬럼 각각은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 및 다중모달 크로마토그래피 컬럼으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 본 공정에서 사용되는 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템은 연속 모드 및 정상 상태로 수행될 수 있다.
상기 연속 공정의 바람직한 구현예에서, 감소된 불균일성을 가진 재조합 단백질을 포함하는 상기 제1 컬럼으로부터 통과액은 수집되거나 상기 제2 컬럼 상에 연속적으로 공급된다. 상기 제2 컬럼으로부터 용출액은 동일한 것에 대한 pH가 상기 낮은 pH 바이러스 불활성화를 위해 요구되는 범위에서 있도록 수집되고, 요구된 배양 시간을 위한 저장소에서 동일한 것을 유지한다. 바이러스 불활성화 후에, 상기 다중 컬럼 크로마토그래피 시스템의 제2 컬럼으로부터 용출액의 pH는 인라인 완충액/용액 첨가에 의해 제3 컬럼 상에 공급하기 위해 요구되는 pH 및 전도도에 조절된다. 제2 컬럼으로부터 용출액은 예를 들어, HCP, HcDNA 및 바이러스와 같은 상이한 불순물의 제거를 위한 중간 정제 단계에 대한 사전-평형된 제3 컬럼 상에 공급된다. 제3 컬럼은 흐름 통과 또는 바인드(bind) 및 용출액 모드로 조작될 수 있다. 상기 제3 컬럼으로부터 통과액은 저장소에서 수집된 다음, 제4 컬럼 상에 공급되기 전에 시스템 상에 pH 및 전도도 인라인을 위해 조절된다. 상기 시료 조건이 각각 치료적 단백질에 대한 연속 공정의 것과 동일하다면, 제4 컬럼 상에 직접적으로 공급될 수 있다. 그 다음, 상기 치료적 단백질은 바인드(bind) 및 용출액 모드로 조작되는 경우, 제4 컬럼으로부터 용출될 수 있거나, 상기 통과액은 흐름 통과 모드로 조작되는 경우, 수집될 수 있다. 그래서, 치료적 재조합 단백질을 제조하기 위한 전체 연속 공정은 다중 컬럼 크로마토그래피 시스템의 단일 단위 조작 상에서 완성될 수 있다. 상기 공정으로부터 획득된 치료적 단백질은 순수한, 높은 용적 생산성, 유선형 공정 흐름, 낮은 사이클 시간 및 감소된 자본 비용이다. 4개 컬럼 상에 치료적 단백질의 연속 공정을 위한 예시적인 공정 흐름은 도 1에서 보여준다.
일 구현예에서, 상기 다중컬럼 크로마토그래피 시스템의 제1 컬럼은 상기 치료적 단백질의 염기 하전 동형을 제거함으로써 치료적 단백질에서 불균일성을 감소시키는 단위 조작을 수행한다.
일 구현예에서, 불균일성 제거의 공정은 다중 컬럼이 AKTA Avant 150, AKTA pcc 2 컬럼, AKTA pcc 3 컬럼, AKTA pcc 4 컬럼 및 BioSMB PALL을 포함하여 연결될 수 있는 다중 컬럼 상에 어떤 크로마토그래피 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 중간 정제 및 폴리싱 단계는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 다중모달 크로마토그래피와 같은 상이한 크로마토그래피 방법을 사용하여 연속적인 방법으로 수행될 수 있다. 적절한 크로마토그래피는 공정 파라미터, 원하는 품질, 순도, 회수율 및 생산성에 기반하여 선택될 수 있다.
본 발명의 공정에 의해 준비/사용될 수 있는 치료적 단백질의 예시는 항체, 항체 단편, 모노클로날 항체, 효소, 조작된 단백질, 면역원성 단백질, 단백질 단편, 면역글로불린 또는 그 어떤 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 모노클로날 항체는 자연적으로 발생한 항체 또는 모노클로날 항체, 변형된 항체, 항체의 유도체 및 항체의 단편 또는 그 어떤 조합으로부터 선택된 재조합 항체로부터 선택된다.
일 구현예에서, 상기 치료적 단백질은 파니투무맙(panitumumab), 오말리주맙(omalizumab), 아바고보맙(abagovomab), 압시시맙(abciximab), 악토수맙(actoxumab), 아달리무맙(adalimumab), 아데카투무맙(adecatumumab), 아페리모맙(afelimomab), 아푸투주맙(afutuzumab), 아라시주맙(alacizumab), 아렘투주맙(alemtuzumab), 아릴로쿠맙(alirocumab), 알투모맙(altumomab), 아마투시맙(amatuximab), 아난투모맙(anatumomab), 안루킨주맙(anrukinzumab), 아폴리주맙(apolizumab), 알시투모맙(arcitumomab), 아티누맙(atinumab), 토시리주맙(tocilizumab), 바시리지맙(basilizimab), 벡투모맙(bectumomab), 베리무맙(belimumab), 베바시주맙(bevacizumab), 베시레소맙(besilesomab), 베즈로토수맙(bezlotoxumab), 비시로맙(biciromab), 브리나투모맙(blinatumomab), 카나키누맙(canakinumab), 세르토리주맙(certolizumab), 세투시맙(cetuximab), 시수투무맙(cixutumumab), 닥리주맙(daclizumab), 데노수맙(denosumab), 에쿠리주맙(eculizumab), 에드레코로맙(edrecolomab), 에파리주맙(efalizumab), 에푼구맙(efungumab), 에프라투주맙(epratuzumab), 에르투마소맙(ertumaxomab), 에타라시주맙(etaracizumab), 피지투무맙(figitumumab), 고리무맙(golimumab), 이브리투모맙 티우세탄(ibritumomab tiuxetan), 이고보맙(igovomab), 임가투주맙(imgatuzumab), 인프리시맙(infliximab), 이노리모맙(inolimomab), 이노투주맙(inotuzumab), 라베투주맙(labetuzumab), 레브리키주맙(lebrikizumab), 모세투모맙(moxetumomab), 나타리주맙(natalizumab), 니보루맙(nivolumab), 오비누투주맙(obinutuzumab), 오레고보맙(oregovomab), 파리비주맙(palivizumab), 파니투무맙(panitumumab), 페르투주맙(pertuzumab), 라무시루맙(ramucirumab), 라니비주맙(ranibizumab), 리투시맙(rituximab), 세쿠키누맙(secukinumab), 토시리주맙(tocilizumab), 토시투모맙(tositumomab), 트라로키누맙(tralokinumab), 투코투주맙(tucotuzumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 우스테키누맙(ustekinumab), 베도리주맙(vedolizumab), 벨투주맙(veltuzumab), 자루투무맙(zalutumumab), 자투시맙(zatuximab), 효소(예컨대, 갈락토시다제(galactosidase)(예컨대, 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase)), 미오자임(Myozyme), 또는 세레자임(Cerezyme)), 단백질(예컨대, 인간 에리트로포이에틴(human erythropoietin), 종양 괴사 인자(TNF), 또는 인터페론 알파 또는 베타(interferon alpha or beta)), 면역원성 또는 항원성 단백질 또는 단백질 단편(예컨대, 백신에서 사용되는 단백질), 알글루코시다제 알파(alglucosidase alfa), 라로니다제(laronidase), 아바타셉트(abatacept), 갈설파제(galsulfase), 루트로핀 알파(lutropin alfa), 항혈우병성 인자(antihemophilic factor), 아갈시다제 베타(agalsidase beta), 인터페론 베타-1a(interferon beta-la), 다르베포에틴 알파(darbepoetin alfa), 테넥테플라제(tenecteplase), 에타네르셉트(etanercept), 코아굴레이션 인자 IX(coagulation factor IX), 여포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone), 이미글루세라제(imiglucerase), 도르나제 알파(dornase alfa), 에포에틴 알파(epoetin alfa), 인슐린 또는 인슐린 유사체, 메카세르민(mecasermin), 인자 VIII(factor VIII), 인자 VIIa(factor VIIa), 항-트롬빈 III(anti-thrombin III), 단백질 C, 인간 알부민(human albumin), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 그라누로쿠테 콜로니 자극 인자(granulocute colony stimulating factor), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor), 인터류킨-11(interleukin-11), 라로니다제(laronidase), 이두르서파제(idursuphase), 갈설파제(galsulphase), α-1-프로테이나제 저해제(α-1-proteinase inhibitor), 락타제(lactase), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), 조직 플라스미노겐 활성화제(tissue plasminogen activator), 티로트로핀 알파(thyrotropin alpha), 산 β-갈락토시다제(acid β-galactosidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase), 뉴라미니다제(neuraminidase), 헤소사미니다제 A(hexosaminidase A) 및 헤소사미니다제 B(hexosaminidase B)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직한 실시예에서, 치료적 단백질의 배양 배지는 어떤 공급원, 예를 들면, 제조합 세포 배양(예컨대, 재조합 박테리아, 효모 또는 포유류 세포 배양)으로부터 유래될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 배양 배지는 공급-회분 세포 배양, 재조합 치료적 단백질을 분비하는 세포의 배양을 함유하는 공급-회분 생물반응기 또는 관류 세포 배양으로부터 획득될 수 있다. 또한, 상기 액체 배양 배지는 상기 재조합 치료적 단백질을 분비하는 박테리아 또는 효모 세포의 배양으로부터 정화된 액체 배양 배지일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 모노클로날 항체의 중쇄 상에 C-말단 라이신 잔기는 세파로스 상에 고정화된 카복시펩티다제 B 효소를 가지는 컬럼 상에 관류 세포 배양으로부터 회수되는 산물을 통과시킴으로써 연속 공정에서 절단될 수 있다. 상기 반응으로부터 생산된 균일한 산물은 모노클로날 항체의 추가적인 정제를 위한 친화성 크로마토그래피 컬럼에 연속적인 방법으로 추가적으로 이동된다.
본 발명의 일 구현예에서, 본원에 개시된 연속 공정은 모노클로날 항체의 C-말단 라이신 잔기의 감소를 위해 요구되는 효소의 양을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 대안적인 접선 여과액을 통해 생물반응기로부터 연속적으로 오는 산출된 세포 배양 유체는 pH에서 카복시펩티다제 B 고정화된 컬럼 상에 공급될 수 있고, 그 다음, 이는 연속 크로마토그래피 시스템에서 동시에 또는 MCCS 상에 직렬 또는 병렬로 연결된 친화성 컬럼 상에 연속적으로 공급될 수 있다.
특정 바람직한 구현예에서, 배양된 세포에서 단백질 농도는 수확된 세포 배양 유체의 50-2500 mg/ml의 농도 범위에 있다.
일 구현예에서, 모노클로날 항체의 염기 동형은 50-100 퍼센트에서 감소될 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명의 공정에 의해 처리/도출될 수 있는 치료적 단백질은 어떤 추가적인 정제 및/또는 오염제거 단계 없이 약학적 조성물 내로 제형화될 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 본원에서 개시된 공정은 치료적 단백질을 위한 연속 생물학적 제조 시스템을 형성한다.
또한, 본 발명은 카복시펩티다제-결합된 세포로스 컬럼을 위한 수지의 준비 공정 및 치료적 단백질의 제조를 위해 사용되는 수지의 안정성을 제공한다.
실시예
본 개시는 추가적인 제한으로서 해석되어서는 안되는 다음 실시예에 의해 추가적으로 설명된다. 당업자는 구체적인 방법 및 결과가 단지 예시적인 것으로 쉽게 이해할 것이다.
실시예 1: 공정을 위한 수지의 제조
수지를 다음 공정으로 제조하였다:
1) CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 동결건조된 분말을 물에 부었고, 1mM HC1로 세척하였다. 수지를 0.1M 중탄산나트륨 완충액, pH 10으로 추가적으로 세척하였다.
2) 완충액 교환 효소 카복시펩티다제 B(Carboxypeptidase B)를 부드러운 교반 하에 2-8℃에서 하룻밤 동안, pH 10.0에서 2:1(CPB:수지)의 비율로 수지와 함께 배양하였다.
3) 반응 혼합물을 주위 온도로 가져왔고 수소화붕소나트륨을 커플된 수지의 4mg/mL의 비율로 첨가하였다. 현탁액을 주위 온도에서 1시간 동안 배양하였다.
4) 수지를 컬럼 상에 로딩하였고 50mM 인산나트륨 완충액, pH 7.0으로 광범위하게 세척하였다.
5) 컬럼을 사용 전에 20mM 트리스 HCl, 150mM NaCl, pH 9.0으로 추가적으로 세척하였다.
내부 CNBR -활성화된 세파로스 ™ 4B 수지의 안정성 및 저장성:
이러한 수지는 많은 사이클을 가지고 1년 이상 안정적이고, 2-8℃에서 저장될 때 여전히 실행가능한 것으로 확인되었다. 이러한 수지는 성능의 저하 없이 연속 공정을 위한 상온에서 연속 공정을 위해 사용될 수 있다.
실시예 2: 항체 변이를 감소시키기 위한 공정
2개 컬럼을 CPB-세파로스 컬럼의 입구가 시스템에 연결되고 동일한 컬럼의 출구가 단백질 A 컬럼의 입구로서 사용되는 1개 정제 시스템에서 연속적으로 연결하였다. CPB-세파로스 컬럼으로부터 나오는 통과액을 포획 단계를 위해 단백질 A 컬럼에 직접적으로 로딩하였다. 마침내, 용출 완충액을 사용하여 단백질을 용출하였다(도 2).
1. CPB-세파로스 컬럼을 친화성 컬럼에 직렬 연결하였고, 관류 세포 배양으로부터 정화된 세포 배양 산물을 pH 7.0에서 사전평형된 컬럼 상에 로딩하였고, 이를 컬럼 1 상에 약 25분 접촉 시간 이상 동안 pH 6.5-9에서 평형시킬 수 있다.
2. CPB-세파로스 컬럼으로부터 나오는 통과액을 치료적 단백질의 포획을 위해 CPB-세파로스 수지의 출구와 연결된 친화성 컬럼 상에 직접적으로 로딩하였다.
3. 마침내, 친화성 컬럼이였던 제2 컬럼 상에 포획된 항체를 0.1M 아세트산, pH 3.0으로 용출하였고, 2M 트리스 염기로 중화하였다.
1개 대조군 작동을 관류 생물반응기로부터 나오는 동일한 산물과 함께 수행하였고 포획 단계를 위해 단백질 A 상에 직접적으로 로딩하였다. 단백질 A 용출 시료 모두는 하전 변이의 분석을 위한 WCEX-HPLC에 의해 분석되었다.
도 2는 1개 정화 시스템에서 연속적으로 연결된 2개 컬럼에 대한 크로마토그램을 보여준다.
도 3은 CPB-CNBR-활성화된 세파로스 TM 4B 컬럼 다음에 단백질 A 컬럼의 크로마토그램 프로파일이 약 25분 RT에서 연속 모드로 mAb A에 대해 작동함을 보여준다.
실시예 3: 치료적 단백질( mAb A)의 연속 공정
체류 시간 연구 1:
초기 크로마토그래피 작동을 컬럼 1 상에 약 25 분 상에 접촉 시간으로 수행하였기 때문에, 치료적 단백질의 불균일성에서 최적화된 감소를 획득하기 위해 주여진 최소 접촉 시간을 평가하기 위해 좀 더 작동을 거의 수행하지 않았다.
크로마토그래피 작동을 연속 모드에서 내부 CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼(컬럼 1, CV=10mL) 다음에 단백질 A(Mab Select SuRe™ pec) 컬럼(컬럼 2, CV=1ml)(직렬로 CPB-PA)을 사용하여 수행하였다(도 4). 각각 컬럼 1 상에 20분 및 컬럼 2 상에 2분의 체류 시간을 유지하는 0.5 ml/분의 유속에서 세포 배양 유체(약 40mg)로 정화된 치료적 단백질(mAb A)을 가진, AKTA Avant 150 공정 크로마토그래피 시스템, GE Healthcare 상에서 공정을 수행하였다. AKTA Avant 시스템은 AKTA PCC 시스템으로 교체될 수 있다.
도 4는 동일한 유속으로 조작할 때 컬럼 1 및 컬럼 2의 연속 공정 설정을 보여준다.
중화된 시료(CPB-PA 용출액)을 대조군(CPB 없이 오직 단백질 A 용출액)과 함께 WCEX 분석을 위해 제출하였다(도 5).
도 5는 CPB-CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼 다음에 단백질 A 컬럼의 크로마토그램 프로파일이 20분 RT에서 연속 모드로 mAb A에 대해 작동함을 보여준다.
CPB-PA 용출액은 WCEX 분석 비교 데이터에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 mAb A에서 염기 변이의 소화/제거를 보여준다(도 6).
도 6은 대조군 및 CPB-PA 용출액에 대한 WCEX 분석 데이터 오버레이를 보여준다. 이러한 실험은 컬럼 상에 CPB가 20분 RT에서 염기 변이의 활성 또는 절단/소화를 보여준다고 결론 내렸다.
체류 시간 연구 2:
컬럼 상에 최소 체류 시간(RT)를 평가하기 위해, CPB-CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼(컬럼 1) 상에 2분의 RT를 유지하면서, 유속을 0.5ml/분으로부터 10ml/분으로 변경하였고, 반면, 단백질 A 컬럼(컬럼 2) 상에서 2분의 RT를 유지하면서, 0.5ml/분으로 하였다. 이러한 경우에, 컬럼 1의 통과액을 수집한 다음, 컬럼 부피가 다름에 따라 상이한 RT 및 유속을 유지하기 위해 연속 모드에서 컬럼 2 상으로 다시 로딩하였다(도 7).
도 7은 상이한 유속에서 조작할 때, 컬럼 1 및 컬럼 2의 연속 공정 설정을 보여준다. 중화된 시료(2분 RT에서 CPB-PA 용출액)을 대조군(CPB 없이 오직 단백질 A 용출액) 및 20분 RT에서 CPB-PA 용출액의 것과 함께 WCEX 분석을 위해 제출하였다(도 8).
도 8은 CPB-CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼 다음에 단백질 A 컬럼의 크로마토그램 프로파일이 2분 RT에서 연속 모드로 mAb A에 대해 작동함을 보여준다.
CPB-PA 용출액은 WCEX 분석 비교 데이터에서 보여진 컬럼 1과 마찬가지로, 2분 RT에서 대조군과 비교하여 mAb A에서 염기 변이의 소화/제거를 보여준다(도 9).
도 9는 2분 RT에서 대조군 및 CPB-PA 용출액에 대한 WCEX 분석 데이터 오버레이를 보여준다.
2개 상이한 RT에서 감소의 비교
컬럼 1 상에 2 분 체류 시간에서, 소화는 컬럼 1 상에 20 분 RT에서 것과 유의하게 유사하였다(도 10). 도 10은 mAb A에 대한 컬럼 1 상에 20분 RT 및 2분 RT 각각에서 WCEX 분석 데이터 오버레이 CPB-PA 용출을 보여준다. 이런 이유로, 크로마토그래피 작동 역시 2분 체류 시간에서 성공적으로 조작할 수 있다. 2분 미만 체류 시간 역시 평가될 수 있다.
실시예 4: mAb B 상에 염기 동형을 감소시키기 위한 공정
카복시펩티다제 B(carboxypepridase B)가 우선적으로 아르기닌 및 라이신과 같은 염기 아미노산에 따라 행동한다. 따라서, IgGs 또는 모노클로날 항체의 어떤 등급에 속하는 하전된 동형의 제거를 위해 수지를 사용할 수 있다. 연속 공정에서 스스로 제1 단계에서 그러한 하전된 동형의 제거는 높은 회수율을 가진, 높은 품질, 순도를 가진 제품을 산출할 수 있다. 2분 RT에서 연속 모드로 CPB-CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼 다음에 단백질 A 컬럼을 사용하여 하전된 동형/염기 변이의 제거를 위해 평가된 다른 mAb 모델은 mAb B였다(도 11).
도 11은 CPB-CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼 다음에 단백질 A 컬럼의 크로마토그램 프로파일이 2분 RT에서 연속 모드로 mAb B에 대해 작동함을 보여준다.
CPB-PA 용출액은 WCEX 분석 비교 데이터에서 보여진 바와 같이, 대조군(오직 CPB-CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼 없이 중화된 단백질 A 용출액)과 비교하여 mAb B에서 염기 변이의 소화/제거를 보여준다(도 12). 이런 이유로, 이러한 전략은 염기 하전 변이의 제거를 위한 IgGs의 모든 등급에 속하는 어떤 모노클로날 항체에 대해 적용될 수 있다.
실시예 5: 3개 컬럼 상에 상이한 로딩 밀도에서 mAb A상에 염기 동형을 감소시키기 위한 공정
CPB-CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼 상에 최대 로딩 용량을 평가하기 위해, 상이한 로딩 밀도를 표 1에서 언급된 바와 같은 mAb A 정화된 세포 배양 유체를 사용하여 연속 모드에서 평가하였다. 크로마토그래피 작동을 연속 모드로 내부 CPB-CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼(컬럼 1) 다음에 단백질 A(Mab Select SuRe LX) 컬럼(직렬로 CPB-PA)을 사용하여 평가하였다. 1개 CPB-CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼(컬럼 1) 및 2개 단백질 A 컬럼(컬럼 2)가 병렬적으로 연결될 때, 5ml/분의 유속에서 관류 배양으로부터 mAb A 정화된 세포 배양 유체를 가진, AKTA pcc(3개 컬럼 주기적 역류 크로마토그래피, 3C PCC) 상에서 공정을 수행하였다. 컬럼 1 상에 유지된 체류 시간은 이전 연구보다 적은 1.7분과 동등하고, 컬럼 2 상에서는 약 4.4 분이였다(수지는 MabSelect SuRe LX로 사용됨).
컬럼 1 및 컬럼 2 상에 로딩 상세
번호 로딩의 부피(ml) 총 단백질(mg) 컬럼 1의 컬럼 부피(ml) 컬럼 1 상에 로딩 밀도(mg/ml) 컬럼 2의 컬럼 부피(ml) 컬럼 2 상에 로딩 밀도(mg/ml) 로딩을 위한 시간
1* 30 40 10 4 1 40.0 80
2** 60 85 NA NA 22 4 12
3 60 85 8.5 10 22 4 12
4 120 170 8.5 20 22 8 24
5 240 341 8.5 40 22 15 48
6 480 682 8.5 80 22 31 96
* 번호 1에 언급된 조건 당 크로마토그래피 작동을 보다 일찍 수행하였음(도 5).
** 대조군 작동
대조군 작동을 표 1에 언급된 WCEX 분석 비교를 위한 오직 단백질 A 컬럼을 사용하여 수행하였다. 컬럼 1 상에 로딩 밀도가 각각 10mg/ml, 20mg/ml, 40mg/ml 및 10mg/ml일 때 번호 3, 4, 5 및 6에 언급된 조건 당 크로마토그래피 작동을 연속적으로 수행하였다. 이러한 크로마토그래피 작동에서, 1개 CPB-CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼(컬럼 1) 및 2개 단백질 A 컬럼(컬럼 2)가 병렬적으로 연결되었고, 컬럼 1 및 컬럼 2가 연속적으로 작동하였다(크로마토그래피 프로파일에 대한 도 13 및 도 14), 중화된 시료는 대조군과 비교를 위한 WCEX 분석을 위해 제공되었다.
도 13은 단백질 A 컬럼의 크로마토그램 프로파일은 AKTA pcc(3C pcc) 상에 대조군으로서 mAb 에 대해 작동함을 보여준다.
도 14는 CPB-CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼(컬럼 1) 다음에 단백질 A 컬럼 상에 각각 10mg/ml, 20mg/ml 및 40mg/ml의 로딩 밀도에 대한 크로마토그램 프로파일이 AKTA pcc(3C pcc) 상에 연속 모드로 mAb A에 대해 작동함을 보여준다.
도 15는 CPB-CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼(컬럼 1) 다음에 단백질 A 컬럼 상에 80mg/ml의 로딩 밀도에 대한 크로마토그램 프로파일이 AKTA pcc(3C pcc) 상에 연속 모드로 mAb A에 대해 작동함을 보여준다.
도 16은 대조군과 함께 개별적인 로딩 밀도에 대한 중화된 CPB-PA 용출액의 WCEX 분석 오버레이를 도시한다. 도 16에서 관찰된 바와 같이, 수지는 대조군과 비교할 때, 염기 하전 동형에서 활성 또는 감소를 보여주었다. 그래서, 이러한 수지는 역시 컬럼 1 상에 80mg/ml 이상의 로딩 밀도를 작용할 수 있고, 이때, 단백질 A의 컬럼 부피가 역시 CPB-CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼과 동일하게 유지된다면, 그다음에, 병렬의 단백질 A의 2개 컬럼은 1개 컬럼 1의 것으로부터 산물의 품질을 충분하게 하도록 요구될 것이다.
도 17은 WCEX 분석 데이터가 mAb A에 대한 컬럼 1 상에 상이한 로딩 밀도에서 대조군과 함께 CPB-PA 용출액을 오버레이함을 보여준다. 모든 상이한 로딩 밀도에 대한 WCEX 분석 오버레이가 비교될 때, 모든 시료에서 염기 하전된 동형에서 감소가 있음에도 불구하고, 산성 변이에서 약한 증가는 컬럼 1 상에 80mg/ml의 로딩 밀도의 경우에 보여졌다(도 17). 이는 보다 높은 로딩 밀도, 즉, 단백질: CPB의 보다 높은 비율로 인한 것이거나, 보다 높은 로딩 시간으로 인한 것일 수 있다. 그러나, 모든 작동에서 체류 시간이 1.7분으로 동일함에 따라, 조건 1을 가진 1개 비교 데이터는 표 1에 언급된다. 로딩 시간이 컬럼 1 상에 80 분인 경우, 산성 동형의 증가는 없었다(도 5). 따라서, 가능한 이유는 컬럼 2 상에 전진할 때(통과액 모드) 컬럼 1 상에 로딩된 총 단백질일 수 있고, 산성 변이에서 시간 및 로딩된 단백질의 양이 점진적으로 증가할 수 있고, 컬럼 2 상에 축적될 수 있으며(바인드(bind) 및 용출액 모드), 용출된 총 단백질은 증가된 산성 형태를 포함한다. 이런 이유로, 컬럼 1이 50mM 아세트산 나트륨, pH 5.0 또는 다른 유사한 완충액을 포함하는 pH 3.0 이상의 완충액으로 재생되는 경우, 필요한 품질과 수량을 획득하는데 더 바람직할 것이다.
실시예 6: 1개 -단위 조작에서 4개 컬럼 상에 치료적 단백질( mAb A)의 불균일성을 감소시키기 위한 연속 공정
5 ml/분의 유속에서 관류 배양으로부터 mAb A 정화된 세포 배양액과 함께, AKTA pcc(3개 컬럼 주기적 역류 크로마토그래피, 4C PCC), GE Healthcare 상에서 연속적으로 작동하는 4개 컬럼을 병렬로 가진 연속 모드를 사용하여 크로마토그래피 작동을 수행하였다(도 18 및 19). 내부 CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼(컬럼 1) 다음에 단백질 A (MabSelect SuRe LX) 컬럼(컬럼 2), 다음에 바이러스 불활성화 및 음이온 교환 크로마토그래피(Q Sepharose Fast Flow)(컬럼 3), 다음에 양이온 교환 크로마토그래피(SP Sepharose Fast Flow)(컬럼 4)를 연속 모드로 사용하였다. 공정은 상기 주어진 계획에 제한되지 않고, 또한, 다른 크로마토그래피 기술 및 수지 화학은 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 품질, 순도 및 생산성 또는 회수의 요건에 기반하는 혼합 모드 크로마토그래피와 같이 혼입될 수 있다. 크로마토그래피 단계의 순서를 요구에 기반하여 변경할 수도 있다.
도 18은 mAb A에 대한 연속 공정을 위한 AKTA pcc(4C PCC) 설정을 보여준다.
사용된 컬럼 와이즈 버퍼는 하기 설명된다. 버퍼의 다른 조합 역시 원하는 품질 및 생산성을 위해 pH 및 전도도의 동일한 범위에서 사용될 수 있다.
1) 컬럼 1: 컬럼 부피 = 8.5ml, 로딩 밀도 = 60mg / ml
평형 및 사후 로드 세척: 50mM 트리스 HCl, pH 7.0±0.2, 전도도 4.0±1.0mS/cm
재생: 50mM 아세트산 나트륨, pH 5.0±0.2, 전도도 3.6±1.0mS/cm
2) 컬럼 2: 컬럼 부피 = 22 ml, 로딩 밀도 = 23 mg/ml
평형 및 사후 로드 세척: 50mM 트리스 HCl, pH 7.0±0.2, 전도도 4.0±1.0 mS/cm
용출액: 100mM 아세트산, pH 3.0±0.2
재생: 500mM 수산화나트륨
3) 컬럼 3: 컬럼 부피 = 20 ml, 로딩 밀도 = 25 mg/ml
평형 및 사후 로드 세척 : 50mM 트리스 HCl, pH 7.0±0.2, 전도도 4.0±1.0 mS/cm
재생: 500mM 수산화나트륨
4) 컬럼 4: 컬럼 부피 = 20 ml, 로딩 밀도 = 25 mg/ml
평형 및 사후 로드 세척: 50mM 아세트산 나트륨, pH 5.0±0.2, 전도도 3.6±1.0 mS/cm
용출액: 50mM 아세트산 나트륨, 150mM NaCl pH 5.0, 전도도 15.0±1.0mS/cm
재생: 500mM 수산화나트륨
이러한 연속 공정에서, 컬럼 1을 8.5ml CV 칼럼 상에 60 ㎎/㎖의 로딩 밀도로 로딩하였고 통과액을 mAb A의 포획을 위해 컬럼 2상에서 연속적으로 통과하였다. 용출액의 pH가 바이러스 불활성화를 위해 요구되는 pH와 동등하도록, 결합된 단백질을 CV 부피를 가진 100mM 아세트산으로 용출하였다. 바이러스 불활성화를 1시간 동안 유지시키면서, pH ≤3.6에서 수행하였고, 그 다음, 2M 트리스 염기의 요구된 부피를 인라인 첨가함으로써, 단백질 A 용출액의 중화를 수행하였다. 중화된 단백질 A 용출액의 pH 및 전도도는 HCP, HcDNA 및 그 바이러스 제거, pH 7.0±0.2 및 10mS/cm 미만의 전도도를 청구하는 컬럼 3 상에 로딩하기 위해 요구되는 것과 동동하였다. 중화된 단백질 A 용출액을 사전평형된 컬럼 3 상에 통과시켰고, 통과액 모드에서 작동하였으며, 동일의 통과액을 수집하였다. 컬럼 4가 pH 5.0 및 전도도 ≤6.0mS/cm(오직 이러한 조건에만 한정되지 않음)에서 바인드(bind) 및 용출액 모드로 조작됨에 따라, 산의 요구되는 양의 인라인 첨가를 추가하였고, 이러한 경우, 100mM 아세트산을 컬럼 4 로딩을 위한 로드 준비 단계로서 수행하였다. 로드의 pH는 5.0±0.2이고 전도도는 ≤3.5mS/cm이며 컬럼 4 상에 로딩하였고, 결합된 단백질을 50mM 아세트산나트륨, 150mM NaCl pH 5.0, 전도도 15.0±1.0 mS/cm로 용출하였으며, 샘플을 하전 동형의 제거에서 비교를 위한 WCEX 분석을 위해 제출하였다. 모든 컬럼의 재생 및 다음 작동을 위한 준비가 완료되었다. 크로마토그램 프로파일 및 분석 데이터는 도 18 및 19에 각각 나타내었다.
도 19는 AKTA pcc(3C pcc) 상에 mAb A에 대한 연속 공정을 위한 크로마토그램 프로파일을 보여준다. 불순물과 관련된 다른 제품의 제거가 요구되는 경우, 그 다음, 컬럼 4 공정 조건은 선형 또는 단계 구배 또는 상호작용의 다른 모드를 위해 수정될 수 있다. 이러한 공정 파라미터는 치료적 단백질의 성질, 등전점, 품질, 순도 및 생산성, 비용 효율성, 조작의 용이성과 같은 인자에 의존하여 수정될 수 있다.
컬럼 2 용출액(중화된 단백질 A 용출액 시료) 및 컬럼 4 용출액 시료 모두 로딩 밀도 실험에 속하는 대조군 시료와 함께 WCEX 분석을 위해 주어졌다(도 20).
도 20은 WCEX 분석 데이터가 연속 공정으로부터 컬럼 2 용출액 및 컬럼 4 용출액과 함께 대조군을 오버레이함을 보여준다. 컬럼 2 및 컬럼 4는 동일한 WCEX 프로파일을 보여주고 염기 동형의 제거를 보여주고, 80 mg/ml의 로딩 밀도에서 관찰되었던 이러한 로딩 밀도(60mg/ml)에서 산성 변이에서 증가가 없다. 따라서, 이러한 내부 CNBR-활성화된 세파로스™ 4B 컬럼에 대한 최적 작동 조건은 ≤80 mg/ml의 로딩 밀도, mAb A에 대한 약 1-2시간의 공급 시간 및 ≥1.7분의 RT가 포함되나, 일관된 결과를 얻기 위해 작동 사이에 통합될 수 있는 재생 후에 이러한 조건으로 제한되지 않는다.

Claims (15)

  1. 단일 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템에서 치료적 단백질의 하나 이상의 염기 동형(isoform)을 감소시키는 단계를 포함하는, 치료적 단백질의 불균일성을 감소시키기 위한 연속 공정.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템은 적어도 둘의 크로마토그래피 컬럼을 포함하는, 공정.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단일 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템은 세파로스(sepharose) 상에 고정화된 카복시펩티다제 B(carboxypeptidase B)를 포함하는 컬럼을 포함하는, 공정.
  4. (a) 제1 컬럼, 제2 컬럼, 제3 컬럼 및 제4 컬럼을 포함하는 다중-컬럼 크로마토그래피를 제공하는 단계;
    (b) 상기 제1 컬럼 내로 치료적 단백질을 포함하는 세포 배양 산물을 공급함으로써, 상기 치료적 단백질의 불균일성을 감소시키는 단계;
    (c) 상기 제2 컬럼 내로 상기 제1 컬럼으로부터 통과액을 공급함으로써, 상기 제1 컬럼의 통과액에서 상기 치료적 단백질을 포획하는 단계;
    (d) 상기 치료적 단백질을 정제하기 위해 상기 제3 컬럼 내로 상기 제2 컬럼으로부터 상기 치료적 단백질을 포함하는 용출액을 공급하는 단계; 및
    (e) 상기 치료적 단백질을 폴리싱하기 위해 상기 제4 컬럼 내로 상기 제3 컬럼으로부터 상기 치료적 단백질을 포함하는 통과액을 공급하는 단계를 포함하고,
    상기 제1 컬럼은 세파로스 상에 고정화된 카복시펩티다제 B(carboxypeptidase B)를 포함하는, 치료적 단백질의 불균일성을 감소시키기 위한 연속 공정.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제2 컬럼으로부터 상기 치료적 단백질을 포함하는 용출액을 수집하는 단계; 및 바이러스 불활성화를 위한 낮은 pH에서 상기 치료적 단백질을 포함하는 용출액을 유지하는 단계를 추가로 포함하는, 공정.
  6. 제4항에 있어서, 상기 제3 컬럼 내로 공급하기 전에 pH 및 전도도 조절에 상기 제2 컬럼으로부터 상기 치료적 단백질을 포함하는 용출액을 적용시키는 단계를 추가로 포함하는, 공정.
  7. 제4항에 있어서, 상기 제4 컬럼 내로 공급하기 전에 pH 및 전도도 조절에 상기 제3 컬럼으로부터 상기 치료적 단백질을 포함하는 통과액을 적용시키는 단계를 추가로 포함하는, 공정.
  8. 제4항에 있어서, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 컬럼은 직렬로 또는 병렬로 순차적으로 연결된, 공정.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 컬럼은 상기 치료적 단백질의 염기 동형(isoform)의 비율을 감소시킴으로써 상기 치료적 단백질의 불균일성을 감소시키는, 공정.
  10. 제4항에 있어서, 상기 제2 컬럼은 친화성 크로마토그래피 컬럼인, 방법.
  11. 제4항에 있어서, 상기 제3 컬럼 및 제4 컬럼 각각은 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 및 다중모달 크로마토그래피 컬럼으로 이루어진 군으로부터 선택된, 공정.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료적 단백질은 항체, 항체 단편, 모노클로날 항체, 효소, 조작된 단백질, 면역원성 단백질, 단백질 단편, 면역글로불린 또는 그 어떤 조합으로부터 선택된, 공정.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료적 단백질은 파니투무맙(panitumumab), 오말리주맙(omalizumab), 아바고보맙(abagovomab), 압시시맙(abciximab), 악토수맙(actoxumab), 아달리무맙(adalimumab), 아데카투무맙(adecatumumab), 아페리모맙(afelimomab), 아푸투주맙(afutuzumab), 아라시주맙(alacizumab), 아렘투주맙(alemtuzumab), 아릴로쿠맙(alirocumab), 알투모맙(altumomab), 아마투시맙(amatuximab), 아난투모맙(anatumomab), 안루킨주맙(anrukinzumab), 아폴리주맙(apolizumab), 알시투모맙(arcitumomab), 아티누맙(atinumab), 토시리주맙(tocilizumab), 바시리지맙(basilizimab), 벡투모맙(bectumomab), 베리무맙(belimumab), 베바시주맙(bevacizumab), 베시레소맙(besilesomab), 베즈로토수맙(bezlotoxumab), 비시로맙(biciromab), 브리나투모맙(blinatumomab), 카나키누맙(canakinumab), 세르토리주맙(certolizumab), 세투시맙(cetuximab), 시수투무맙(cixutumumab), 닥리주맙(daclizumab), 데노수맙(denosumab), 에쿠리주맙(eculizumab), 에드레코로맙(edrecolomab), 에파리주맙(efalizumab), 에푼구맙(efungumab), 에프라투주맙(epratuzumab), 에르투마소맙(ertumaxomab), 에타라시주맙(etaracizumab), 피지투무맙(figitumumab), 고리무맙(golimumab), 이브리투모맙 티우세탄(ibritumomab tiuxetan), 이고보맙(igovomab), 임가투주맙(imgatuzumab), 인프리시맙(infliximab), 이노리모맙(inolimomab), 이노투주맙(inotuzumab), 라베투주맙(labetuzumab), 레브리키주맙(lebrikizumab), 모세투모맙(moxetumomab), 나타리주맙(natalizumab), 니보루맙(nivolumab), 오비누투주맙(obinutuzumab), 오레고보맙(oregovomab), 파리비주맙(palivizumab), 파니투무맙(panitumumab), 페르투주맙(pertuzumab), 라무시루맙(ramucirumab), 라니비주맙(ranibizumab), 리투시맙(rituximab), 세쿠키누맙(secukinumab), 토시리주맙(tocilizumab), 토시투모맙(tositumomab), 트라로키누맙(tralokinumab), 투코투주맙(tucotuzumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 우스테키누맙(ustekinumab), 베도리주맙(vedolizumab), 벨투주맙(veltuzumab), 자루투무맙(zalutumumab), 자투시맙(zatuximab), 효소, 단백질, 면역원성 또는 항원성 단백질 또는 단백질 단편, 알글루코시다제 알파(alglucosidase alfa), 라로니다제(laronidase), 아바타셉트(abatacept), 갈설파제(galsulfase), 루트로핀 알파(lutropin alfa), 항혈우병성 인자(antihemophilic factor), 아갈시다제 베타(agalsidase beta), 인터페론 베타-1a(interferon beta-la), 다르베포에틴 알파(darbepoetin alfa), 테넥테플라제(tenecteplase), 에타네르셉트(etanercept), 코아굴레이션 인자 IX(coagulation factor IX), 여포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone), 이미글루세라제(imiglucerase), 도르나제 알파(dornase alfa), 에포에틴 알파(epoetin alfa), 인슐린 또는 인슐린 유사체, 메카세르민(mecasermin), 인자 VIII(factor VIII), 인자 VIIa(factor VIIa), 항-트롬빈 III(anti-thrombin III), 단백질 C, 인간 알부민(human albumin), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 그라누로쿠테 콜로니 자극 인자(granulocute colony stimulating factor), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor), 인터류킨-11(interleukin-11), 라로니다제(laronidase), 이두르서파제(idursuphase), 갈설파제(galsulphase), α-1-프로테이나제 저해제(α-1-proteinase inhibitor), 락타제(lactase), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), 조직 플라스미노겐 활성화제(tissue plasminogen activator), 티로트로핀 알파(thyrotropin alpha), 산 β-갈락토시다제(acid β-galactosidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase), 뉴라미니다제(neuraminidase), 헤소사미니다제 A(hexosaminidase A) 및 헤소사미니다제 B(hexosaminidase B)로 이루어진 군으로부터 선택된, 공정.
  14. 제4항에 있어서, 약학적 조성물 내로 상기 폴리싱된 치료적 단백질을 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 공정.
  15. 제4항에 있어서, 상기 다중-컬럼 크로마토그래피 시스템은 연속 모드로 수행되는, 공정.
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