CN104244977A - Mica结合剂 - Google Patents

Mica结合剂 Download PDF

Info

Publication number
CN104244977A
CN104244977A CN201380017820.5A CN201380017820A CN104244977A CN 104244977 A CN104244977 A CN 104244977A CN 201380017820 A CN201380017820 A CN 201380017820A CN 104244977 A CN104244977 A CN 104244977A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
mica
seq
cell
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380017820.5A
Other languages
English (en)
Inventor
M·布莱瑞
L·高蒂尔
I·佩罗特
C·邦纳福斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Innate Pharma SA
Original Assignee
Innate Pharma SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Innate Pharma SA filed Critical Innate Pharma SA
Publication of CN104244977A publication Critical patent/CN104244977A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56977—HLA or MHC typing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及用于使用特异性结合MICA的抗体、抗体片段及其衍生物治疗由MICA表达细胞介导的障碍的方法。本发明还涉及抗体，产生此类抗体的细胞；制造此类抗体的方法；这些抗体的片段、变体以及衍生物；包括其的药物组合物。

Description

MICA结合剂
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年2月7日提交的美国临时申请号61/595,902和于2012年4月18日提交的美国临时申请号61/625,841的权益；将其全部通过引用以其全文结合在此，包括任何附图。
对序列表的引用
本申请将与电子格式的序列表一起提交。将该序列表提供为标题为“PCT Seqlist MICA_ST25”、创建于2013年2月7日、大小为77KB的文件。电子格式的序列表中的信息通过引用以其全文结合在此。
发明领域
本发明提供了能够与MICA多肽结合的抗原结合蛋白。这些抗原结合蛋白在由MICA表达细胞——特别是肿瘤细胞——表征的障碍的治疗方面具有增加的活性。
背景
免疫受体NKG2D正常表达于人类T细胞(例如CD8+T细胞、γδT细胞)和NK细胞上。在预激活的CD8+细胞上，NKG2D经由DAP10缔合作为CD28和TCR信号传导的协同共刺激物起作用，而在NK细胞中，它作为直接激活剂起作用。连接配体后，NKG2D因此经由成对的DAP10衔接蛋白传达直接激活或共刺激信号，由此提升癌症和感染性疾病免疫力。
已经鉴定并表征了人类NKG2D(hNKG2D)的不同配体，包括主要组织相容性复合体I类相关链A和B多肽(MICA和MICB)、UL16结合蛋白(ULBP)家族以及视黄酸早期转录物1(RAET1)家族。MICA经常与由微生物感染诱导的上皮肿瘤相关，并且异常表达于某些自身免疫性疾病损害中。MICA的结构类似于MHC I类的蛋白质折叠，具有一个α1α2平台结构域和一个近膜端(membrane-proximal)Ig样α3结构域(Li(李)等人2001Nat.Immunol.(自然免疫学)2:443)。MICA及其近亲MICB(还作为NKG2D的配体)两者都是多态的并且已经显示这种多态性影响对NKG2D的亲和力(Steinle(施泰因勒)等人2001Immunogenetics(免疫遗传学)53:279)。
在缺乏MHC I类链(MIC)基因的小鼠中，结构上与ULBP相关的蛋白质家族视黄酸早期(RAE-1)分子作为NKG2D的配体起作用。已经显示RAE-1表达是由致癌物诱导的并且刺激T细胞的抗肿瘤活性。然而，鼠类NKG2D识别人类MICA多肽(Wiemann(威曼尼)(2005)J.Immunol.(免疫学杂志)175:820-829)。
MICA在癌症生物学中的作用由于以下事实复杂化，MICA作为可溶态从肿瘤细胞的细胞表面(例如，*019等位基因)并且在外来体的表面(*08等位基因)上被释放(Ashiru(阿斯茹)等人(2010)Cancer Res.(癌症研究)70(2):481-489))。可溶性MICA(sMICA)可以例如在罹患胃肠道恶性肿瘤的患者的血清中以高水平检测到(Salih(萨利赫)等人，2002J.Immunol.(免疫学杂志)169:4098)。已经报道MMPs ADAM10和ADAM17连同二硫化物异构酶Erp5在MICA的裂解和脱落方面具有作用(Waldhauer(瓦尔德豪尔)(2008)Cancer Research(癌症研究)68(15)6368-76；Kaiser(凯泽)等人(2007)Nature(自然)；已经Salih(萨利赫)(2002)J.Immunol(免疫学杂志)169:4098-4102)。已经报道膜结合MICA下调NKG2D在NK和/或T细胞上的表达(Von Lilienfeld-Toal(冯利林菲尔德-托尔)等人(2010)Cancer Immunol.Immunother.(癌症免疫学，免疫疗法))。值得注意地，Wiemann(威曼尼)(2005)(同上)检查了MICA Tg小鼠并且总结到表面NKG2D在非转基因脾细胞上的下调在与来自MICA转基因小鼠的脾细胞体外共培养后是最明显的，并且在用来自H2Kb-MICA小鼠的血清处理后仅是少量的，然而分别用对照细胞和来自nontgLM的血清温育没有影响并且总结到整体数据说明在H2-K-MICA NK细胞上的减少的表面NKG2D导致NKG2D功能异常并且总结到NKG2D下调主要由向细胞结合MICA的持续体内暴露导致。
报道还透露NK细胞上的NKG2D被sMICA下调(Groh(格罗)等人(2002)Nature(自然)；Arreygue-Garcia(阿莱伊格-加西亚)(2008)BMC；Jinushi(基纳施)等人(2005)J.Hepatol.(肝病学杂志))，导致更小反应性的NK细胞。因为已经在其他蛋白质家族(如Ig样和TNF超家族)中观察到类似的系统，所以可以出现这一基本原理，其他蛋白质家族已经显示作为可溶态而被释放并且这些分子的释放通过减少配体密度影响细胞间相互作用并且调节携带各自的受体的NK细胞(Salih(萨利赫)2002)。因此，用于产生抗MICA抗体的尝试已经聚焦于抑制MICA脱落的抗体的研发。
还已经报道NKG2D配体MICA和MICB在健康细胞上的表达可以打破免疫激活与耐受之间的平衡，并且触发自身免疫。遗传连锁研究已经显示一些MICA等位基因与1型糖尿病呈正相关，并且疾病在其胰岛细胞上表达Rae1的前糖尿病NOD小鼠中的发展可以通过用NKG2D阻断mAb进行治疗而被完全阻止，这些NKG2D阻断mAb减少自身反应性CD8+T细胞的膨胀和功能。MICA和MICB分子在RA滑膜细胞中还被显著上调并且以一种NKG2D依赖性方式激活T细胞。此外，已经报道类风湿性关节炎患者在血清和发炎的关节中具有高水平的IL-15和TNF-a，这诱导NKG2D在T细胞的CD4+CD28-亚群上的表达。在乳糜泻中，已经报道上皮内NKG2D+CD8+cd T淋巴细胞大量浸润在肠中，并且MIC蛋白在罹患活动性疾病的患者中的上皮细胞的表面上变得强烈表达。在炎性肠障碍中，可以在肠道上皮细胞上发现增加水平的MIC表达，并且发现表达NKG2D的肠道上皮CD4+T细胞的数目与肠道炎症相关联。
迄今，基于NKG2D系统的用于治疗炎症的途径已经聚焦于NKG2D自身而非其配体的阻断(Ogasawara(小笠原)等人(2004)Immunity(免疫力)20(6):757-767；Andersson(安德森)等人(2011)Arthritis.Rheum.(关节炎与风湿病)63(9):2617-2629；Steigerwald(斯泰格沃德)等人(2009)MAbs 1(2):115-127)。这一焦点在NKG2D而非其配体上的一种可能性归因于靶向NKG2D配体系统的感知到的难度，该配体系统包括多种配体并且在一些情况下包括大量的等位基因。
对于MICA和MICB而言，存在超过50个MICA等位基因以及至少13个识别的MICB等位基因。跨越α1α2结构域(该结构域被包含在NKG2D界面中)中的MIC多肽仅存在43％氨基酸同一性，并且80％的氨基酸取代是非保守的(Steinle(施泰因勒)等人(2001)Immunogenetics(免疫遗传学)53:279-287；Steinle(施泰因勒)等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国科学院院刊)95:12510-12515)，说明获得对一个群体中的大部分个体而言有效的抗体将是不太可能的。另外，MICA中的位置129处的甲硫氨酸/缬氨酸双同态决定了NKG2D结合方面的差异，并且尽管残基129的侧链被部分掩埋并且与谷氨酰胺136、丙氨酸139以及甲硫氨酸140在第一α2螺旋延伸(helical stretch)中形成疏水相互作用，但是与MICA的缬氨酸129形式相比，它可能与这一结构域中的构象方面的差异相关(Steinle(施泰因勒)等人(2001)Immunogenetics(免疫遗传学)53:279-287)。
总之，对用治疗剂靶向MICA的新途径存在需要。
发明概述
在一个方面中，本发明尤其源自跨越人类MICA等位基因(以及在非人灵长类MICA上)发现具有高亲和力的抗体。
这些抗体值得注意地结合来自两个主要MICA类群中每一个的一个或多个MICA等位基因，这两个主要MICA类群被确定代表MICA的主要家族：强烈结合NKG2D的类群1等位基因(包括MICA*001、*002、*007、*012、*017以及*018)和微弱结合NKG2D的类群2等位基因(MICA*004、*006、*008、*009以及*019)。通过与存在于亚群MICA*001、*004、*007以及*008或*001、*004、*007、*008以及*019上的表位结合，这些抗体覆盖存在于几乎全部个体中的两个类群的等位基因。任选地，这些抗体对于与在其表面表达*001的细胞、与在其表面表达*004的细胞、与在其表面表达*007的细胞以及与在其表面表达*008的细胞的结合而言具有至多5μg/ml，任选地至多3μg/ml、至多2μg/ml、至多1μg/ml或至多0.5μg/ml的EC50。
对于有效介导CDC和ADCC的抗体而言，高亲和力结合是尤其有利的。本发明提供了位于α1和/或α2结构域内的MICA上的表位，这些结构域对于诱导高ADCC和/或CDC活性而言是最佳抗体结合区，然而仍跨越主要MICA等位基因发现了这些表位。这些表位通常在α1和/或α2结构域的侧面上并且整个在NKG2D结合表面外面或部分与NKG2D结合表面重叠。另外，鉴定α3表位展示出增强的ADCC/CDC和多等位基因结合特征。
还鉴定抗体的亚组阻断MICA与NKG2D的相互作用。除了当包括被Fcγ受体结合的Fc结构域诱导ADCC和CDC活性或当包括基本不被Fcγ受体结合的Fc结构域阻断前炎性活性之外，这些抗体由于其能够阻断sMICA诱导的NKG2D的下调的能力是有用的。
还鉴定抗体的其他亚组不阻断细胞(例如肿瘤细胞、转染子)的表面上的MICA在NKG2D表达免疫细胞中诱导NKG2D活性的能力，该免疫细胞在抗MICA抗体的存在下与所述MICA表达细胞进行接触。除了诱导ADCC和CDC活性以外，这些抗体由于其避免抑制NKG2D，这样使得NKG2D表达免疫效应细胞仍能够经由NKG2D溶解靶细胞的能力是有用的(例如，除了任何Fcγ受体介导的机制以外)。
重组体和细胞表面结合MICA似乎能够具有不同构象并且结合细胞结合MICA对MICA蛋白可以具有远程效应。特别出人意料地，当使用重组蛋白时，细胞(例如肿瘤细胞、转染子)的表面上的MICA通过NKG2D诱导信号转导的能力的阻断不经常与阻断MICA-NKG2D相互作用的能力相关联(Biacore studie)。还特别出人意料地，虽然发现全等位基因抗体未完全位于α1α2结构域的平台(plateau)上的NKG2D结合区域内，但是MICA通过NKG2D阻断细胞(例如肿瘤细胞、转染子)的表面上的MICA诱导信号转导的能力不与结合表位的位置相关联。一些远离NKG2D交互区的抗体能够阻断NKG2D活性的诱导，而一些靠近NKG2D结合区或与其部分重叠的抗体不阻断NKG2D活性的诱导。抗体此外在随其表位而变的介导CDC的能力方面存在不同。
MICA的类群1等位基因通常在残基129处具有M，而类群2等位基因在残基129处具有V。在一个实施方式中，MICA类群的特征在于该MICA多肽的位置129处的甲硫氨酸(M)或缬氨酸(V)残基的存在，其中M与强烈结合NKG2D的MICA形式相关并且V与较低的结合NKG2D相关。
在一个实施方式中，本发明提供了以下抗体，这些抗体与在位置129处具有甲硫氨酸的MICA等位基因和在位置129处具有缬氨酸的MICA等位基因交叉反应。在一个方面中，本发明提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体与在位置129处具有甲硫氨酸的人类MICA多肽和在位置129处具有缬氨酸的人类MICA多肽特异性结合。任选地，这些抗体对于与在其表面表达在位置129处具有甲硫氨酸的人类MICA多肽的细胞以及与在其表面表达在位置129处具有缬氨酸的人类MICA多肽的细胞的结合而言具有至多5μg/ml，任选地至多3μg/ml、至多2μg/ml、至多1μg/ml或至多0.5μg/ml的EC50。
在一个实施方式中，该抗体进一步与在位置152处具有缬氨酸的MICB多肽结合(例如，与SEQ ID NO:6的MICB多肽结合)。
发现的这些结合区仍存在于糖基化的MICA上，值得注意地是由人类肿瘤细胞优先表达的具有糖基化作用的MICA。
在一个实施方式中，本发明尤其源自在阻断MICA与NKG2D的相互作用的同时在体外和体内有效诱导MICA表达肿瘤细胞的效应细胞(例如NK细胞和/或T细胞)溶解的抗体的发现。阻断NKG2D-MICA相互作用的抗体是有利的，因为此类抗体可以阻止sMICA诱导的NKG2D的下调，如在此所示。此类阻断抗体对于具有高水平的可溶性MICA(例如在循环中)的患者的治疗而言可以是特别有用的。在另一个实施方式中，本发明提供了以下抗体，这些抗体在体外和体内有效诱导MICA表达肿瘤细胞的效应细胞(例如NK细胞和/或T细胞)溶解并且抑制sMICA诱导的NKG2D在免疫效应细胞的表面上的表达的下调而不实质阻断MICA自MICA表达细胞(例如肿瘤细胞)脱落。此类抗体可以通过抑制MICA与NKG2D的相互作用来抑制sMICA诱导的NKG2D表达的下调。任选地，该抗体包括9C10、19E9、12A10、18E8、14B4或10F3的轻链和重链CDR，任选地在CDR中具有一个或多个氨基酸修饰。
在另一个实施方式中，本发明提供了以下抗体，这些抗体在体外和体内有效诱导MICA表达肿瘤细胞的效应细胞(例如NK细胞和/或T细胞)溶解而不实质阻断MICA自MICA表达细胞(例如肿瘤细胞)脱落并且不实质阻断MICA与NKG2D的相互作用。任选地，该抗体包括6E4、20C6、16A8、15F9、10A7或14B4的轻链和重链CDR，任选地在CDR中具有一个或多个氨基酸修饰。
在一个实施方式中，提供了与α1α2结构域(该结构域被包含在NKG2D界面中)结合的抗体，这些抗体与多个MICA等位基因(例如在位置129处具有甲硫氨酸的MICA等位基因和在位置129处具有缬氨酸的MICA等位基因；MICA*001、*004、*007以及*008等位基因)交叉反应并且以高亲和力与此类MICA等位基因结合(例如对于与在其表面表达人类MICA多肽的所述等位基因的细胞的结合而言至多5μg/ml，任选地至多3μg/ml、至多2μg/ml、至多1μg/ml或至多0.5μg/ml的EC50)。任选地，这些抗体结合至以下区域，这些区域在α1α2结构域上，位于或部分位于NKG2D界面的外面，但是未完全在NKG2D界面内。
可以根据在此的实施例3的方法，使用例如流式细胞术评价与MICA等位基因的结合以及相关的EC50值。
在另一个实施方式中，本发明源自以下抗体的发现，这些抗体结合MICA的α1和/或α2结构域而不实质阻断MICA与NKG2D的相互作用(例如其中MICA和NKG2D被各自表达在细胞的表面)。任选地此类抗体的特征可以在于不与hNKG2D竞争与MICA的结合。任选地，这些抗体不抑制MICA在NKG2D表达细胞中诱导NKG2D活性的能力。任选地此类抗体的特征可以在于不降低或阻断NKG2D表达效应细胞(例如CD16负效应细胞)溶解MICA表达靶细胞的能力。这些抗体将任选地不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落。
在一个实施方式中，非阻断α1α2结构域抗体结合在SEQ ID NO:1的MICA多肽上的表位，该表位包括一个或两个选自由K81和D82组成的组的残基，一个或两个选自由Q83和K84组成的组的残基，一个、两个或三个选自由H109、Y111和L116(任选地残基D113)组成的组的残基，一个、两个或三个选自由Q131、S132和Q136组成的组的残基，一个、两个或三个选自由S133、R134和T137组成的组的残基，和/或1个、2个、3个或4个选自由M140、N141、R143和N144组成的组的残基(例如抗体20C6和10A7)。
在一个实施方式中，非阻断α1α2结构域抗体结合这样的表位，该表位包括一个或两个选自由R6和N8组成的组的残基，一个或两个选自由E97和H99组成的组的残基，一个、两个或三个选自由E100、D101和N102组成的组的残基，一个、两个或三个选自由S103、T104和R105(任选地残基E115)组成的组的残基，和/或一个、两个或三个选自由L178、R179和R180组成的组的残基(例如抗体15F9)。
在一个实施方式中，非阻断α1α2结构域抗体结合这样的表位，该表位包括一个或两个选自由SEQ ID NO:1的MICA多肽的Q48和W49组成的组的残基和/或1个、2个、3个或4个选自由SEQ ID NO:1的MICA多肽的E51、D52、V53和L54组成的组的残基(例如抗体6E4)。
在另一个实施方式中，本发明尤其源自以下抗体的发现，这些抗体结合MICA的α3结构域，其中这些抗体不抑制MICA与NKG2D的相互作用(例如其中MICA和NKG2D被各自表达在细胞的表面)。任选地，这些抗体不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落。任选地，这样的抗体的特征可以在于不与hNKG2D竞争与MICA的结合。
在一个实施方式中，非阻断α3结构域抗体结合这样的表位，该表位包括一个、两个或三个选自由S224、H225和D226组成的组的残基，一个、两个或三个选自由T227、Q228和Q229组成的组的残基，和/或一个或两个选自由W230和D232组成的组的残基(例如抗体16A8)。
在另一个实施方式中，本发明源自以下抗体的发现，这些抗体结合MICA的α1和/或α2结构域并且抑制MICA与NKG2D的相互作用(例如其中MICA和NKG2D被各自表达在细胞的表面)。任选地这样的抗体的特征可以在于不与hNKG2D竞争与MICA的结合。这些抗体将任选地抑制sMICA诱导的NKG2D在免疫效应细胞的表面上的表达的下调而不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落。
在一个实施方式中，阻断α1α2结构域抗体结合这样的表位，该表位包括一个、两个或三个选自由E100、D101和N102组成的组的残基，一个、两个或三个选自由S103、T104和R105组成的组的残基，一个或两个选自由N121和E123组成的组的残基，和/或一个或两个选自由T124和E126组成的组的残基(例如抗体19E9、18E8以及10F3)。
在一个实施方式中，阻断α1α2抗体结合这样的表位，该表位包括1个、2个或3个选自由SEQ ID NO:1的MICA多肽的N56、K57和T58组成的组的残基，和/或一个或两个选自由SEQ ID NO:1的MICA多肽的R61和R64组成的组的残基(例如抗体9C10和12A10)。
在另一个实施方式中，本发明尤其源自以下抗体的发现，这些抗体结合MICA的α3结构域，其中这些抗体抑制MICA与NKG2D的相互作用(例如其中MICA和NKG2D被各自表达在细胞的表面)。任选地，这些抗体不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落。任选地，这样的抗体可以任选地被表征为与hNKG2D竞争与MICA的结合。这些抗体将任选地抑制sMICA诱导的NKG2D在免疫效应细胞的表面上的表达的下调。这些抗体可以实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落或可以任选地阻断MICA自肿瘤细胞脱落。
在一个实施方式中，阻断α3结构域抗体结合这样的表位，该表位包括一个、两个或三个选自由T227、Q228和Q229组成的组的残基(抗体14B4)。
不希望被理论束缚，相信尽管科学文献假定在MICA(例如，sMICA或膜结合MICA)和NKG2D下调与效应细胞的损伤之间存在因果关系，但是肿瘤情形(tumor settings)中的MICA自身不总是导致效应细胞的实质损伤。具体而言，虽然sMICA可以导致NKG2D的下调，但是在许多情况下出现在体内的sMICA的浓度太低以至于自身不能导致显著的NKG2D下调(参见实施例9)。此外，在肿瘤情形中(例如确立的疾病或晚期疾病)，患者经由多种非MICA组分(例如TGF-β)通常处于免疫抑制状态，这些组分在其他效应之间具有导致NKG2D的下调的潜力。因此，阻断或不阻断NKG2D-MICA相互作用并且不抑制MICA脱落的试剂在癌症的治疗方面是有效的，只要它们能够诱导CDC和/或ADCC。不阻断NKG2D-MICA相互作用的抗体是有利的，因为MICA表达肿瘤细胞具有保留可被存在的免疫活性效应细胞上的NKG2D识别的潜力(例如由于在治疗过程中或随后重建免疫活性，对于具有较长持续时间、重复给予或以高剂量给予的治疗而言)。阻断NKG2D-MICA相互作用的抗体是有利的，因为此类抗体可以阻止MICA诱导的NKG2D的下调(参见实施例9)。此类阻断抗体对于具有高水平的可溶性MICA(例如在循环中)的患者的治疗而言可以是特别有用的。
在一个实施方式中，本发明提供了MICA结合化合物，优选与MICA多肽特异性结合的抗体(抗MICA抗体)，而不可检测地减少MICA与NKG2D之间的结合(例如，肿瘤细胞上的表面MICA与效应细胞上的表面NKG2D的相互作用)，例如，而不实质阻断MICA与NKG2D的相互作用。在一个实施方式中，本发明提供了MICA结合化合物(例如MICA结合多肽)，该化合物与MICA多肽结合而不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落。在一个实施方式中，本发明提供了MICA结合化合物，该化合物与MICA多肽结合而不实质阻断MICA与NKG2D的相互作用并且不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落。
在另一个实施方式中，本发明提供了以下抗体，这些抗体结合人类MICA(特别是在α1和/或α2结构域中)、识别主要的MICA等位基因MICA*001、MICA*004、MICA*008并且任选地进一步识别MICA*007和/或MICA*019。在一个实施方式中，这些抗体任选地进一步识别非人灵长类物种(例如食蟹猴)的MICA。在一个实施方式中，这些抗体任选地进一步识别以下MICB多肽，该多肽包括SEQ ID NO 6的氨基酸序列。任选地，在另一个实施方式中，这些抗体不进一步识别MICB。任选地，这些抗体不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落。任选地，这些抗体不实质阻断MICA与NKG2D的相互作用。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与由人类肿瘤细胞表达的糖基化MICA多肽特异性结合。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与由非人灵长类细胞表达的MICA多肽特异性结合。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与MICA多肽特异性结合(抗MICA抗体)，其中该抗体结合SEQ ID NO 2的多肽(MICA*004)和/或SEQID NO 4的多肽(MICA*008)。在一个实施方式中，该抗体进一步结合SEQ ID NO1的多肽(MICA*001)。在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与MICA多肽特异性结合，其中该抗体结合SEQ ID NO 5的多肽(MICA*019)。在一个实施方式中，该抗体进一步结合SEQ ID NO 3的多肽(MICA*007)。在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与MICA多肽特异性结合，其中该抗体结合SEQ ID NO 2的多肽(MICA*004)、SEQ ID NO 4的多肽(MICA*008)以及SEQ ID NO 5的多肽(MICA*019)。在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与MICA多肽特异性结合，其中该抗体结合SEQ ID NO 1的多肽(MICA*001)、SEQ ID NO 2的多肽(MICA*004)、SEQ ID NO 4的多肽(MICA*008)以及SEQ ID NO 5的多肽(MICA*019)，任选地进一步其中该抗体结合SEQ ID NO 3的多肽(MICA*007)。通过与跨越MICA等位基因的类群1和类群2两者的等位基因MICA*001、-*004和*008结合(并且有利地进一步*007和*019)，几乎整个人类群体都将适于用本发明的这样的抗MICA剂的治疗。在任一实施方式中，SEQ ID NO 1-5的多肽可以包括O-聚糖(连接至丝氨酸或苏氨酸的N-乙酰乳糖胺)。在任一实施方式中，SEQ ID NO 1-5的多肽可以包括核心2O-聚糖(包括连接至N-乙酰半乳糖胺的N-乙酰葡糖胺分支的O-聚糖)和/或N联聚糖。在一个实施方式中，该抗体与MICA多肽结合而不实质阻断MICA与NKG2D的相互作用和/或不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落。在一个实施方式中，该抗体结合MICA的α1和/或α2结构域。在一个实施方式中，该抗体结合MICA的α3结构域。
优选地，该化合物是一种抗体，任选地包括两条Ig重链和两条Ig轻链的四聚体抗体。优选地，针对人类MICA多肽，该抗体具有小于10-9M，优选小于10-10M或优选小于10-11M的结合亲和力(KD)，任选地其中结合亲和力是二价的。优选地，该抗体是一种消耗性抗体，任选地其中该抗体针对MICA表达肿瘤细胞诱导ADCC和/或CDC。
在一个具体实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体通过NK或T细胞介导MICA表达肿瘤细胞的消耗(例如在体外或在体内)而不实质抑制NKG2D介导的hNKG2D表达NK或T细胞的细胞毒性。
在一个具体实施方式中，本发明的抗体不与hNKG2D竞争与MICA的结合。
在一个具体实施方式中，当本发明的抗体结合至MICA表达细胞上的MICA时，该MICA表达细胞经由例如刺激hNKG2D的下调和/或内化而在结合后不实质减少细胞表面hNKG2D的量，具有高亲和力和缓慢的解离率，与食蟹猴和/或恒河猴MICA交叉反应，并且具有消耗性同种型(如例如人类IgG1)。
在一个方面中，本发明提供了特异性结合MICA的抗体，其中该抗体具有以下特性中的一个或多个(包括其任何组合，或全部特性)：
(a)针对与MICA多肽的结合而言，具有小于10-8M，优选小于10-9M，或优选小于10-10M的Kd；
(b)与对应于以下结构域的残基的区段中的至少一个残基结合，该结构域选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1的MICA多肽的1-88、89-181和182-274和/或与如在此所描述的表位(MICA上的一个或多个氨基酸残基)结合；
(c)与MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的两个、三个、四个或五个结合，分别包括SEQ ID NO:1-5的序列；
(d)不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落；
(e)不实质阻断MICA与NKG2D的相互作用(例如，肿瘤细胞上的表面MICA与效应细胞上的表面NKG2D的相互作用)；
(f)不导致由效应细胞(例如，NKG2D+CD16-NK细胞)溶解的MICA表达细胞的实质降低；
(g)针对在其表面表达MICA的细胞，诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；以及
(h)与抗体6E4、20C6、16A8、15F9以及10A7竞争结合MICA多肽。
在本文实施方式的任一个中，本发明抗体的特征可以在于以上(a)-(h)中的任何一个或多个特征。
在一个实施方式中，提供了一种测试抗MICA抗体的方法，所述方法包括：(i)评价该抗体是否阻断MICA自MICA表达细胞脱落和/或(ii)评价该抗体是否阻断MICA与NKG2D的相互作用。步骤(i)可以任选地包括使结合MICA多肽的该抗体与表达MICA多肽的细胞接触。步骤(ii)可以任选地包括使结合MICA多肽的该抗体与MICA多肽(例如分离的多肽或表达于细胞的表面上的多肽)在NKG2D多肽(例如分离的多肽或表达于细胞的表面上的多肽)的存在下接触。
在另一个实施方式中，提供了一种产生抗体的方法，该抗体结合哺乳动物对象体内的MICA多肽，任选地用于癌症的治疗，所述方法包括以下步骤：a)提供多个抗体，任选地用包括MICA多肽的免疫原免疫非人哺乳动物；并且b)进行一个选择步骤以从该多个抗体中选择抗体，该步骤包括：
(i)测试抗体是否与人类MICA多肽结合，任选地SEQ ID NO 1-5的多肽中的一个、两个、三个、四个或所有，并且如果该抗体与这一种或多种人类MICA多肽结合，则选择该抗体；和/或
(ii)测试抗体是否阻断MICA自MICA表达细胞脱落，并且如果该抗体不阻断脱落，则选择该抗体；和/或
(iii)测试抗体是否阻断MICA(例如表面MICA)与NKG2D的相互作用，优选地测试其中该抗体是否导致由效应细胞(例如，NKG2D+CD16-NK细胞)溶解的MICA表达细胞的实质降低，并且如果该抗体不阻断MICA(例如表面MICA)与NKG2D的相互作用，优选地其中该抗体不导致MICA表达细胞的溶解的实质降低，则选择该抗体。
在一个方面中，本发明尤其源自阻断性抗MICA抗体的发现，这些抗体跨越来自两个主要类群的MICA等位基因的主要人类MICA非人灵长类(以及在非人灵长类MICA和MICB上)具有高亲和力。在一个实施方式中，MICA类群的特征在于该MICA多肽的位置129处的甲硫氨酸(M)或缬氨酸(V)残基的存在，其中M与强烈结合NKG2D的MICA形式相关并且V与较低的结合NKG2D相关。在一个实施方式中，本发明提供了以下阻断抗体，这些阻断抗体与在位置129处具有甲硫氨酸的MICA等位基因和在位置129处具有缬氨酸的MICA等位基因交叉反应。在一个方面中，本发明提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体与在位置129处具有甲硫氨酸的人类MICA多肽和在位置129处具有缬氨酸的人类MICA多肽特异性结合，其中所述抗体抑制MICA介导的hNKG2D活性。在一个实施方式中，该抗体进一步与在位置152处具有缬氨酸的MICB多肽结合(例如，与SEQ ID NO:1的MICB多肽结合)。优选地，所述抗体抑制MICB介导的hNKG2D活性。报道在位置152处具有缬氨酸的MICB多肽显示出与可溶性NKG2D的强烈结合。结合在位置152处具有缬氨酸的MICB多肽以及在位置129处具有甲硫氨酸的MICA多肽的抗体在以下个体中可以是有利的，这些个体具有较大的敏感性或由与NKG2D强烈结合的等位基因引起的严重疾病。
本发明的阻断性抗MICA抗体还与来自两个主要MICA类群中的每一个的一个或多个高普遍性等位基因交叉反应(结合)，这两个主要MICA类群被确定代表MICA的主要家族：强烈结合NKG2D的类群1等位基因(包括MICA*001、*002、*007、*012、*017以及*018)和微弱结合NKG2D的类群2等位基因(MICA*004、*006、*008、*009以及*019)。通过与存在于亚群MICA*001、*004、*007、*008以及*019上的表位结合，这些抗体覆盖存在于几乎全部个体中的两个类群的等位基因。MICA的类群1等位基因通常在残基129处具有M，而类群2等位基因在残基129处具有V。
在另一个方面中，本发明尤其源自以下发现，跨越MICA(以及在非人灵长类MICA和MICB上)针对某些表位的抗体在NKG2D阻断方面比其他抗MICA抗体或抗NKG2D抗体显著更有效，并且还比由其结合MICA的能力预期的更有效地阻断NKG2D介导的细胞毒性。具体而言，具有皮摩尔范围内的亲和力的抗MICA抗体在抑制方面比具有2-log较少亲和力(KD)的抗MICA抗体好4-log。
本发明的阻断性MICA抗体可以由阻止与NKG2D的任何竞争、被其置换、或其残留结合的能力表征。其他高亲和力NKG2D或MICA抗体可以通过其配体(例如分别为MICA/ULPBs/RAET1或NKG2D)留下一些开放的置换。而且，如由NKG2D-MICA相互作用的晶体结构所观察到的，NKG2D作为同源二聚体起作用并且具有两个对称表面(每条NKG2D链上一个)，这些表面与MICAα1α2平台结构域的顶部相互作用。这两条NKG2D链通过结合至不对称MICA平台结构域的明显不同的表面都有助于该相互作用(参见例如，Li(李)等人(2001)Nature Immunol.(自然免疫学)2(5):443-450)。本发明的这些抗体因此可以任选地完全阻断MICA-NKG2D相互作用，例如通过阻断(例如干扰、竞争)NKG2D同源二聚体中的两个NKG2D单体与MICA多肽的结合。其他MICA抗体(或NKG2D抗体)可以仅完全阻断两个NKG2D结合位点中的一个。
除了当被用作消耗性抗体(例如IgG1或IgG3同种型)其用于消耗MICA表达细胞的用途以外，用本发明的阻断性抗MICA抗体进行治疗为靶向相信由MICA和/或B介导的NKG2D的激活驱动的炎性病症中的MICA(和MICB)提供了一种手段，而不减少引起不想要的更宽的免疫系统抑制，通过减少可供与其他配体(例如ULBP)的结合使用的NKG2D受体的数目以及随后的激活。此类完全阻断性抗MICA抗体的可能性还打开了向炎症位点局部递送抗MICA抗体的可能性(例如，递送进关节炎患者的炎症的关节或其他位点)，而不导致由NKG2D抗体的给予引起的泛发性免疫抑制效应。
在一个实施方式中，本发明提供了以下抗体，这些抗体在体外和体内抑制MICA表达细胞的效应细胞(例如NK细胞和/或T细胞)溶解方面是有效的并且实质阻断MICA与NKG2D的相互作用。
在一个实施方式中，特别是当用于治疗炎性障碍或自身免疫性障碍时，本发明的抗体是一种非消耗性抗体，该非消耗性抗体实质减少或抑制NKG2D激活、NKG2D信号转导、NKG2D表达NK或T细胞的激活、或效应细胞(例如，NKG2D+CD16-NK细胞)对MICA表达细胞的溶解。
在一个实施方式中，本发明提供了一种MICA结合化合物，优选与MICA多肽特异性结合并且减少(例如基本消除)MICA与hNKG2D之间的结合(例如，细胞上的表面MICA与效应细胞的表面NKG2D的相互作用)的抗体(抗MICA抗体)。
在一个实施方式中，抗MICA抗体或结合化合物进一步与MICB多肽特异性结合并且减少(例如基本消除)MICB与hNKG2D之间的结合。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与hNKG2D竞争与MICA(以及任选地MICB)结合并且阻止hNKG2D与MICA(以及任选地MICB)结合。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体抑制或阻断MICA(以及任选地MICB)多肽与hNKG2D同源二聚体的两条hNKG2D链的相互作用。任选地，该抗体阻断MICA多肽(以及任选地MICB多肽)的α1结构域和MICA多肽(以及任选地MICB多肽)的α1结构域两者与hNKG2D同源二聚体的相互作用(例如，该抗体抑制MICAα1α2平台与hNKG2D同源二聚体的两条hNKG2D链的相互作用)。
在一个实施方式中，本发明的抗体不实质与HCMV、UL18、ULBP 1、ULBP2、ULBP 3、ULBP 4、ULBP 5或ULBP 6多肽结合(参见Champsaur(沙姆普斯劳)等人(2010)Immunol.Rev.(免疫学评论)235:267-285)。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与在位置129处具有甲硫氨酸的人类MICA多肽(例如天然存在的MICA等位基因)和在位置129处具有缬氨酸的人类MICA多肽(例如天然存在的MICA等位基因)上的共同决定子特异性结合，任选地进一步与在位置152处具有缬氨酸的人类MICB多肽(例如天然存在的MICB等位基因)上的共同决定子特异性结合，其中该抗体减少(例如基本消除)MICA与NKG2D之间(以及任选地MICB与NKG2D之间)的结合。
在另外的实施方式中，本发明尤其源自以下抗体的发现，这些抗体结合人类MICA，优选在α1α2平台结构域(即α1和/或α2结构域)中，并且识别主要的MICA等位基因MICA*001、MICA*004、MICA*008并且任选地进一步识别MICA*007和/或MICA*019，并且任选地进一步识别非人灵长类物种(例如食蟹猴)的MICA，并且任选地进一步识别MICB。在一个实施方式中，这些抗体进一步识别以下MICB多肽，该多肽包括SEQ ID NO 6的氨基酸序列。任选地，这些抗体此外不实质抑制MICA自肿瘤细胞脱落。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与MICA多肽特异性结合(抗MICA抗体)，其中该抗体减少(例如基本消除)MICA与NKG2D之间的结合并且该抗体结合SEQ ID NO 2的多肽(MICA*004)和/或SEQ ID NO 4的多肽(MICA*008)。在一个实施方式中，该抗体进一步结合SEQ ID NO:1的多肽(MICA*001)。在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与MICA多肽特异性结合，其中该抗体结合SEQ ID NO:5的多肽(MICA*019)。在一个实施方式中，该抗体进一步结合SSEQ ID NO:3的多肽(MICA*007)。在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与MICA多肽特异性结合，其中该抗体结合SEQ ID NO:2的多肽(MICA*004)、SEQ ID NO:4的多肽(MICA*008)以及SEQID NO:5的多肽(MICA*019)。在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体，该抗体与MICA多肽特异性结合，其中该抗体结合SEQ ID NO:1的多肽(MICA*001)、SEQ ID NO:2的多肽(MICA*004)、SEQ ID NO:4的多肽(MICA*008)以及SEQ ID NO:5的多肽(MICA*019)，任选地进一步其中该抗体结合SEQ ID NO:3的多肽(MICA*007)。通过与跨越MICA等位基因的类群1和类群2两者的等位基因MICA*001、-*004和*008结合(并且有利地进一步*007和*019)，几乎整个人类群体都将适于用本发明的这样的抗MICA剂的治疗。在一个实施方式中，该抗体结合MICA的α1和/或α2结构域。
优选地，该化合物是一种抗体，任选地包括两条Ig重链和两条Ig轻链的四聚体抗体。
优选地，针对人类MICA和/或MICB多肽(例如在此述及的MICA和/或MICB等位基因中的任何一个或多个或所有)，该抗体具有小于10-9M，优选小于10-10M，优选小于10-11M，优选小于10-12M，或优选小于10-13M的结合亲和力(KD)，任选地其中结合亲和力是单价的或二价的。优选地，该抗体是包括两条Ig重链和两条Ig轻链的四聚体抗体并且KD是二价的。任选地，对于与表达具体的MICA和/或MICB多肽(例如在此述及的MICA和/或MICB等位基因中的任何一个或多个或所有)的细胞的结合而言，该抗体具有至多10μg/ml、5μg/ml或1μg/ml的EC50。适合的细胞的实例是C1R-MICA细胞。
在一个实施方式中，特别是当该抗体被用于治疗或预防炎性疾病或自身免疫性疾病时，该化合物是非消耗性抗体(不消耗结合至其上的细胞的抗体)。优选地，该抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。优选地，该抗体不包括能够被Fcγ3A受体(CD16)结合的恒定区，例如人类IgG4亚型的抗体或缺少Fc结构域的抗体片段。优选地，该抗体包括人类IgG4同种型的重链恒定区。
在一个实施方式中，该抗体与由非人灵长类细胞表达的MICA多肽特异性结合。在一个具体实施方式中，本发明的抗体对于结合人类MICA而言具有高亲和力和缓慢的解离率，并且与食蟹猴(cynomolgus，Macaca fascicularis)和/或恒河猴(猕猴)MICA交叉反应。
在一个方面中，本发明提供了特异性结合MICA的抗体，其中该抗体具有以下特性中的一个或多个(包括其任何组合，或全部特性)：
(a)对于与MICA多肽的结合而言，具有小于10-9M，优选小于10-10M，优选小于10-11M，优选小于10-12M，或优选小于10-13M的KD，优选地其中针对每个MICA多肽等位基因MICA*001、*004和*008，优选地进一步针对*007和/或*019，该抗体具有所述KD的亲和力；
(b)与对应于以下结构域的残基的区段中的至少一个残基结合，该结构域选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1的MICA多肽的1-88或89-181，和/或与如在此所描述的表位(MICA上的残基)结合；
(c)与在位置129处具有甲硫氨酸的人类MICA多肽(例如天然存在的MICA等位基因)和在位置129处具有缬氨酸的人类MICA多肽(例如天然存在的MICA等位基因)结合，其中该抗体减少(例如基本消除)MICA与NKG2D之间的结合；和/或与在位置152处具有缬氨酸的人类MICB多肽(例如天然存在的MICA等位基因)结合；
(d)与MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的两个、三个、四个或五个结合，分别包括SEQ ID NO:1-5的序列；
(e)不实质阻断MICA自肿瘤细胞脱落；
(f)抑制和/或实质阻断MICA与NKG2D的相互作用(例如，肿瘤细胞上的表面MICA与效应细胞上的表面NKG2D的相互作用)，任选地其中这些抗体阻断MICA与NKG2D同源二聚体内的两条NKG2D链的相互作用；
(g)能够减少或抑制MICA介导的NKG2D激活、NKG2D信号转导、NKG2D表达NK或T细胞的激活、或效应细胞(例如，NKG2D+CD16-NK细胞)对MICA表达细胞的溶解；
(h)针对在其表面表达MICA的细胞，实质诱导或不实质诱导(例如，取决于该mAb是否被CD16发现，取决于该抗体的Fc区的性质)补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；
(i)能够减少或抑制sMICA介导的NKG2D在NKG2D表达细胞(例如T细胞或NK细胞)的表面上的表达的下调；
以及
(j)与抗体9C10、19E9、12A10、18E8或10F3竞争与MICA多肽的结合。
在本文实施方式的任一个中，本发明抗体的特征可以在于以上(a)-(j)中的任何一个或多个特征。
在一个实施方式中，提供了一种测试抗MICA抗体的方法，所述方法包括：(i)评价该抗体是否以高亲和力与在残基129处具有甲硫氨酸的MICA多肽和在残基129处具有缬氨酸的MICA多肽两者(以及任选地进一步，在残基152处具有甲硫氨酸的MICB多肽)结合，并且(ii)评价该抗体是否阻断MICA(以及任选地MICB)与NKG2D的相互作用。在一个实施方式中，提供了一种测试抗MICA抗体的方法，所述方法包括：(i)评价该抗体是否以高亲和力与MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的两个、三个、四个或五个结合，这些多肽分别包括SEQ IDNO:1-5的序列并且(ii)评价该抗体是否阻断MICA与NKG2D的相互作用。步骤(i)可以任选地包括使结合MICA多肽的该抗体与表达MICA多肽的细胞接触。步骤(ii)可以任选地包括使结合MICA多肽的该抗体与MICA多肽(例如分离的多肽或表达于细胞的表面上的多肽)在NKG2D多肽(例如分离的多肽或表达于细胞的表面上的多肽)的存在下接触。在步骤(i)中结合所述MICA多肽并且在步骤(ii)中阻断MICA与NKG2D的相互作用的抗体可以被鉴定和/或选择为用于炎性障碍或自身免疫性障碍的候选治疗。
在另一个实施方式中，提供了一种产生抗体的方法，该抗体结合哺乳动物对象体内的MICA多肽，任选地用于癌症的治疗，所述方法包括以下步骤：a)提供多个抗体，任选地用包括MICA多肽的免疫原免疫非人哺乳动物或产生抗体的噬菌体展示文库；并且b)进行一个选择步骤以从所述多个抗体中选择抗体，该步骤包括：
(i)测试抗体是否以高亲和力与人类MICA多肽，任选地MICA*001、*004、*007、*008以及*019等位基因中的一个、两个、三个或所有，例如分别包括SEQ IDNO:1-5的序列的多肽结合，并且如果抗体以高亲和力与所述MICA多肽结合，则选择该抗体；和/或
(ii)测试抗体是否阻断MICA(例如，表面MICA，MICA*001、*004、*007、*008以及*019等位基因中的任何一个、两个、三个或所有)与hNKG2D的相互作用，和/或是否减少或抑制NKG2D激活、NKG2D信号转导、NKG2D表达NK或T细胞的激活、或效应细胞(例如，NKG2D+T细胞、NKG2D+CD16+NK细胞、NKG2D+CD16-NK细胞)对MICA表达细胞的溶解，并且如果抗体阻断MICA与hNKG2D的相互作用，则选择该抗体；和/或。
(iii)当NKG2D表达细胞与可溶性MICA多肽在抗体的存在下进行接触时，测试该抗体是否减少或抑制所述NKG2D表达细胞中的NKG2D下调(降低细胞表面表达)，并且如果抗体减少或抑制NKG2D下调，则选择该抗体。
该方法可以任选地包括选择步骤(iv)，其包括测试抗体是否阻断MICA自MICA表达细胞脱落，并且如果该抗体不阻断脱落，则选择该抗体。
在一个实施方式中，本发明的抗体结合表位，该表位包括选自以下组的人类MICA多肽的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个残基，该组由以下各项组成：R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230以及D232(参照SEQ IDNO 1-5中的任一个的MICA)。
在一个实施方式中，本发明提供了MICA结合化合物(优选抗MICA抗体)，该化合物至少部分地、或任选地完全地结合在MICA多肽的α1和/或α2结构域内。α1和α2结构域分别位于氨基酸残基1至88(任选地1-85)和89至181(任选地86-181)内，参照SEQ ID NO 1的MICA多肽。任选地，在本文实施方式的任一个中，该抗体与在MICA多肽的α1结构域内的氨基酸残基(SEQ ID NO 1的残基氨基酸残基1至88(任选地1-85))结合。任选地，在本文实施方式的任一个中，该抗体与在MICA多肽的α2结构域内的氨基酸残基(SEQ ID NO 1的残基氨基酸残基89至181(任选地86-181))结合。任选地，在本文实施方式的任一个中，该抗体与MICA多肽的α1和α2结构域内的氨基酸残基结合。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括一个或两个选自由Q48和W49组成的组的残基，和/或1个、2个、3个或4个选自由E51、D52、V53和L54组成的组的残基(抗体6E4)。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括1个、2个或3个选自由N56、K57和T58组成的组的残基，和/或一个或两个选自由R61和R64组成的组的残基(抗体9C10和12A10)。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括一个或两个选自由K81和D82组成的组的残基，一个或两个选自由Q83和K84组成的组的残基，一个、两个或三个选自由H109、Y111和L116(任选地残基D113)组成的组的残基，一个、两个或三个选自由S133、R134和T137组成的组的残基，和/或1个、2个、3个或4个选自由M140、N141、R143和N144组成的组的残基(抗体20C6)。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括一个或两个选自由K81和D82组成的组的残基，一个或两个选自由Q83和K84组成的组的残基，一个、两个或三个选自由H109、Y111和L116(任选地残基D113)组成的组的残基，一个、两个或三个选自由Q131、S132和Q136组成的组的残基，和/或1个、2个、3个或4个选自由M140、N141、R143和N144组成的组的残基(抗体10A7)。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括一个、两个或三个选自由E100、D101和N102组成的组的残基，一个、两个或三个选自由S103、T104和R105组成的组的残基，一个或两个选自由N121和E123组成的组的残基，和/或一个或两个选自由T124和E126组成的组的残基(抗体19E9和18E8)。
在一个实施方式中，这些抗体结合表位，该表位包括一个或两个选自由R6和N8组成的组的残基，一个或两个选自由E97和H99组成的组的残基，一个、两个或三个选自由E100、D101和N102组成的组的残基，一个、两个或三个选自由S103、T104和R105(任选地残基E115)组成的组的残基，和/或一个、两个或三个选自由L178、R179和R180组成的组的残基(抗体15F9)。
在一个实施方式中，本发明提供了MICA结合化合物(优选抗MICA抗体)，该化合物至少部分地结合在MICA多肽的α3结构域内。α3结构域分别位于氨基酸残基182至274内，参照SEQ ID NO 1的MICA多肽。在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括一个、两个或三个选自由T227、Q228和Q229组成的组的残基(抗体14B4和16A8)。在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括一个、两个或三个选自由S224、H225和D226组成的组的残基，一个、两个或三个选自由T227、Q228和Q229组成的组的残基，和/或一个或两个选自由W230和D232组成的组的残基(抗体16A8)。
任选地，与SEQ ID NO:1的野生型MICA多肽的结合相比，该抗体与在α1和/或α2结构域内的上述残基中的任一个处具有突变的MICA多肽的结合被实质减少。
本发明提供抗MICA抗体的使用对于例如人类对象的癌症、炎性障碍以及自身免疫性障碍的治疗而言可以是有用的。
在一个方面中，不抑制NKG2D与MICA之间的相互作用的抗体、或抑制NKG2D与MICA之间的相互作用的抗体将是消耗性抗体。此类抗体在癌症的治疗方面是特别有用的，但是也可以用于炎症和自身免疫性障碍。抗体可以在或不在偶联至毒剂或其他试剂的情况下使用，取决于这些抗体的所希望的效果或用途。在一个实施方式中，该抗MICA抗体是“裸抗体”并且未被偶联至毒剂，任选地该裸抗体包括被修饰以增加与Fcγ受体(例如CD16)的结合的Fc区。在一个实施方式中，裸抗体或偶联抗体包括重链，该重链包括结合Fcγ受体(例如CD16)的人类Fc区(例如IgG1)。任选地，针对在其表面表达MICA的细胞，这样的抗体诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
任选地，在任一实施方式中，该抗体(例如IgG1、抗体片段等)进一步包括对细胞有毒的毒剂(例如化疗剂)。
在一个方面中，抑制MICA诱导的NKG2D在效应细胞中的活性的抗体将是非消耗性抗体(不消耗结合至其上的细胞的抗体)。在一个方面中，该抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。在一个方面中，该抗体不包括能够被Fcγ3A受体(CD16)结合的恒定区，例如人类IgG4亚型的抗体或缺少Fc结构域的抗体片段。在一个实施方式中，该抗体包括IgG4重链，根据EU索引(EU-index)，该重链在残基228中包含丝氨酸至脯氨酸突变。优选地，该抗体包括人类IgG4同种型的重链恒定区。此类抗体在炎症和自身免疫性障碍的治疗方面是特别有用的。
本披露进一步提供了特异性结合人类MICA的抗体、抗体片段以及衍生物。本发明提供了此类抗体组合物，同样提供了它们在本发明的这些方法的任一个中治疗、预防以及诊断癌症、炎性障碍以及自身免疫性障碍的用途。
在一个实施方式中，针对人类MICA多肽(例如，SEQ ID NO 1-5的MICA*001、*004、*007、*008以及*019等位基因中的一个、两个、三个或所有的多肽，优选地针对MICA*001、*004以及*008中的每一个)而言，这些抗体具有小于10-8M，优选小于10-9M，或优选小于10-10M的结合亲和力(KD)。
在本发明的实施方式的任一个的一个方面中，该抗体可以具有重链和/或轻链，该重链和/或轻链具有一个、两个或三个选自下组的抗体的对应的重链和/或轻链的CDR，该组由以下各项组成：6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9以及14B4。
在本发明的实施方式的任一个的一个方面中，该抗体与以下单克隆抗体中的任一个或任何组合竞争与MICA多肽的结合，这些单克隆抗体是6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9以及14B4。在一个实施方式中，本发明的抗体与选自下组的抗体竞争与MICA多肽的结合，该组由以下各项组成：
(a)分别具有SEQ ID NO:7和8的VH和VL区的抗体(6E4)；
(b)分别具有SEQ ID NO:20和21的VH和VL区的抗体(20C6)；
(c)分别具有SEQ ID NO:33和34的VH和VL区的抗体(16A8)；
(d)分别具有SEQ ID NO:46和47的VH和VL区的抗体(19E9)；
(e)分别具有SEQ ID NO:57和58的VH和VL区的抗体(9C10)；
(f)分别具有SEQ ID NO:68和69的VH和VL区的抗体(12A10)；
(g)分别具有SEQ ID NO:79和80的VH和VL区的抗体(10A7)；
(h)分别具有SEQ ID NO:90和91的VH和VL区的抗体(18E8)；
(i)分别具有SEQ ID NO:101和102的VH和VL区的抗体(10F3)；
(j)分别具有SEQ ID NO:112和113的VH和VL区的抗体(15F9)；以及
(k)分别具有SEQ ID NO:123和124的VH和VL区的抗体(14B4)。
在一个实施方式中，该抗体是适合人类的。在一个实施方式中，该抗体是嵌合的，例如包含非鼠类(优选人类)恒定区。在一个实施方式中，该抗体是人类的或人源化的。在本发明的实施方式的任一个的一个方面中，该抗体的同种型是人类IgG，任选人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个实施方式中，该抗体包括人类Fc结构域或具有被FcγR(例如FcγRIIIA)结合的同种型，例如IgG1或IgG3同种型的抗体。
在本发明的实施方式的任一个的一个方面中，该抗体是选自以下各项的抗体片段：Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、双抗体、单链抗体片段、或包括多个不同抗体片段的多特异性抗体。任选地，本发明的抗体此外是四聚体的(两条重链和两条轻链)并且因此是二价的(例如IgG抗体)。
在某些实施方式中，本发明的这些抗体进一步包括毒剂。在一个实施方式中，这些抗体包括能够直接导致表达MICA的细胞死亡的毒剂。在一个实施方式中，例如在体外测定中，这些抗体能够直接诱导(例如不存在免疫效应细胞时)至少20％、30％、40％或50％MICA表达细胞的细胞死亡。
在一个方面中，本发明提供了使用本发明的抗MICA抗体进行治疗的方法。这些抗体可以被用作预防性或治疗性治疗；在本文实施方式的任一个中，治疗有效量的该抗体可以与预防有效量的抗体交换。在一个方面中，本发明提供了一种治疗罹患癌症、自身免疫性障碍或炎性障碍的患者的方法，该方法包括向该患者给予药学有效量的根据本发明的与MICA多肽特异性结合的抗原结合化合物。
本发明的治疗方法以及根据本发明的抗MICA抗体可以被用于与第二治疗剂组合治疗个体，该第二治疗剂包括当用于治疗癌症时的抗癌剂(例如化疗药物、肿瘤疫苗、与肿瘤细胞上的肿瘤特异性抗原结合的抗体、针对肿瘤细胞诱导ADCC的抗体、增强免疫应答的抗体等)，或用于治疗自身免疫或炎症的试剂。在一个实施方式中，该第二治疗剂是结合并激活活化受体或结合并阻断效应细胞(例如NK细胞、T细胞)上的抑制性受体的试剂(例如抗体)。在一个实施方式中，该第二治疗剂是上调NKG2D配体在肿瘤细胞上的表达的试剂(例如化疗剂)。例如，可以使用组蛋白脱乙酰酶抑制剂。例如，丙戊酸钠和肼酞嗪增加MICA/B表达并且降低脱落。(Chavez-Blanco(查韦斯-布兰科)2011Int J Oncol(国际肿瘤学杂志)39(6):1491-1499)。
循环中增加水平的sMIC的存在与预后不良和/或MIC表达肿瘤相关。本发明进一步涉及用于选择罹患对使用本发明的抗MICA剂(例如与MICA多肽结合的抗体)的治疗应答的癌症的对象的方法，该方法包括确定所述对象体内的肿瘤细胞是否放出(shed)MICA多肽(例如，如通过循环中的sMIC的水平所评价的)，MICA多肽自肿瘤细胞脱落的存在是应答对象的指征。
本发明进一步涉及一种用于选择罹患对使用本发明的抗MICA剂(例如与MICA多肽结合的抗体)的治疗应答的障碍(例如，癌症、自身免疫性障碍、炎性障碍)的对象的方法，该方法包括确定所述对象体内的细胞(例如肿瘤细胞、前炎性细胞等)是否表达MICA多肽，MICA多肽的表达是应答对象的指征。在一个实施方式中，该方法包括确定所述对象体内的细胞(例如肿瘤细胞、前炎性细胞等)是否表达选自由SEQ ID NO 1-5组成的组的MICA多肽。在一个实施方式中，该方法包括确定所述对象体内的细胞是否表达选自下组的MICA多肽，该组由以下各项组成：MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽，这些多肽分别包括SEQ ID NO:1-5的序列，其中MICA多肽的表达是应答对象的指征。在一个实施方式中，确定所述对象体内的细胞是否表达MICA多肽的步骤包括使来自该对象的生物样品(例如，通过进行活检和/或获得癌细胞细胞、血液或任何组织样品等)与本发明的抗MICA抗体(例如与MICA*001、*004、*007、*008以及*019多肽中的一个、两个、三个、四个或所有结合的抗体)接触。在一个实施方式中，该方法包括确定所述对象是否包括脱落的MICA(例如检测循环中的sMICA或检测外来体(例如，等位基因*008)的表面上的MICA的存在)。
任选地，在这些方法的任一个中，该方法进一步包括向应答对象给予与MICA多肽结合的抗体(例如本发明的抗MICA抗体)。
在一个优选实施方式中，使用MICA特异性配体确定MICA多肽在疾病相关细胞中的表达。优选地，该配体是抗体或其片段或衍生物。
在另一个方面中，本发明包括一种方法(例如，一种进行诊断测定、应答测定等的方法)，该方法包括评价患者是否具有表达MICA多肽(例如被本发明的抗体结合的MICA多肽(一个或多个MICA等位基因))的疾病相关细胞(例如，肿瘤细胞)。所述方法可以包括例如从包括疾病相关细胞的患者获得生物样品，使所述疾病相关细胞与这样抗体接触并且评价该抗体是否与疾病相关细胞结合。疾病相关细胞表达MICA的发现表明该患者罹患由MICA表达细胞表征和/或适于用本发明的抗MICA抗体治疗的病症。可以进一步用适于由MICA表达细胞表征的具体疾病的疗法治疗该患者。任选地，用该抗MICA抗体治疗该患者。在一个实施方式中，该方法用于选择罹患癌症的对象，并且这些疾病相关细胞是癌细胞。
本发明还提供了一种治疗患者的方法，该方法包括：
a)确定该患者是否具有致病的MICA表达细胞，并且
b)如果确定该患者具有致病的MICA表达细胞，则给予本发明的抗原结合化合物(例如，抗体)。
本发明还提供了一种治疗患者的方法，该方法包括：
a)确定该患者体内脱落的MICA的水平，并且
b)如果确定该患者具有升高水平的脱落的MICA，则给予本发明的抗原结合化合物(例如，抗体)，该化合物抑制sMICA导致NKG2D在免疫效应细胞上的下调的能力。
可以在别处进一步描述本发明的这些以及另外的有利方面和特征。
附图简述
图1A和1B示出了获得自第一、第二以及第三免疫系列的抗体与MICA表达CR1转染子细胞C1R-MICA*001、C1R-MICA*004、C1R-MICA*007以及C1R-MICA*008的结合，如通过流式细胞术所分析。
图2A-2G示出了MICA多肽的视图，包括处于黑暗阴影中的突变的氨基酸残基，这些突变的氨基酸残基导致(以不同组合)抗体结合的损失。NKG2D结合位点示于中等阴影的MICA多肽的顶部(并且还在结合至MICA的带状图(ribbondiagram)中)。
图3示出了叠合的传感图，示出了单独在NKG2D-Fc芯片上注射MICA*01-BirA或与同种型对照或嵌合的抗MICA抗体一起预温育。在注射结束时，将传感图在Y轴归一化并且在X轴对齐。传感图代表两个独立的实验。
图4示出了针对MICA-NKG2A阻断的功能测定的结果，示出了抗MICA抗体减少或抑制NKG2D+CD16-NK92细胞介导的MICA*019转染的BaF/3的杀伤的能力，如通过测量靶细胞释放的51Cr所确定。
图5A、5B和5C示出了叠合的传感图，示出了在ULBP-1-Fc(Fc1)、MICB-Fc(Fc2)、ULBP-2-Fc(Fc3)以及ULBP-3-Fc(Fc4)上注射抗MICA抗体。在注射开始时，将传感图在X轴对齐。
图6示出了抗MICA抗体与食蟹猴MICA的结合。
图7示出了在针对阻断MICA脱落的能力的测定中，由抗α3结构域BAM03而非由16A8介导的MICA脱落的抑制，如通过在将MICA表达细胞与抗MICA抗体温育过夜后测量上清液中可溶性MICA浓度所评价。
图8显示NKG2D在增加剂量的重组体二价MICA*019*Fc蛋白(R&D系统)的存在下被下调了其初始水平的30％至40％，并且显示在实施例5B的细胞毒性测定(表E)中阻断NKG2D-MICA相互作用的抗MICA抗体阻断表达于NK细胞上的NKG2D与MICA*019-Fc的相互作用，从而逆转由MICA*019-Fc蛋白诱导的NKG2D下调。
图9示出了指示Raji-MICA*01细胞在人类补体的存在下的生活力。结果显示抗MICA(同种型匹配的)导致死细胞数目增加并且能够以表位依赖性方式诱导CDC。
图10A显示与阴性对照(人类IgG1同种型对照抗体)相比，抗MICA各自通过人类KHYG-1hCD16V NK细胞系诱导C1R-MICA*008细胞的特异性溶解，由此显示这些抗体针对MICA*008表达靶细胞诱导ADCC。图10B示出了结合至细胞的抗体的水平。
图11示出了在小鼠长期RAJI-MICA*01肿瘤模型中的测试的结果。用嵌合的抗MICA或IC(300μg IP 2x/周，持续3周)或PBS处理植入Raji-MICA01 High15M IV的Nod SCID小鼠的存活。本发明的抗MICA抗体增加存活。
发明详述
介绍
本发明的抗体能够直接并特异性靶向MICA表达细胞，值得注意地是肿瘤细胞以及在炎性或自身免疫过程中涉及的细胞。本发明提供了多种具有这样的特性的抗体，这些抗体结合类群1和类群2等位基因两者并且此外跨越这些类群内的主要人类MICA等位基因。进一步提供了用于具体途径的不同抗体。一些抗体阻断MICA-NKG2D相互作用并且阻止可溶性MICA(sMICA)诱导的NKG2D表面表达的下调；这些抗体由此用于重建患者体内的NKG2D表达。此类抗体还可以由于其阻断由被淋巴细胞上的NKG2D结合MICA而导致的NKG2D激活的能力而被使用并且在炎症和自身免疫性障碍的治疗方面将是特别有利的。其他抗体不与NKG2D竞争与MICA的结合并且在其中希望维持NKG2D对效应细胞的功能的情况下的癌症的治疗方面将是有利的。任选地，这些抗体将不阻断MICA自MICA表达肿瘤细胞脱落。任选地，这些抗体结合MICA的α1α2结构域(由α1结构域和α2结构域形成的MICA蛋白的部分)。进一步提供了跨MICA等位基因存在的α1α2结构域和α3结构域上的表位并且可以被抗体以高结合亲和力靶向。
MICA(PERB11.1)是指MHC I类多肽相关序列A(参见例如，UniProtKB/Swiss-Prot Q29983)，其基因和cDNA及其基因产物，或其天然存在的变体。MICA基因和蛋白的命名法连同参照不同等位基因的序列的登录号描述于Frigoul(弗里洛尔)A.和Lefranc(勒弗朗)，M-P.Recent Res.Devel.Human Genet.(人类遗传学的最新研究与进展)，3(2005):95-145ISBN:81-7736-244-5中，将其公开内容通过引用结合在此。MICA基因和蛋白质序列(包括在蛋白质和DNA水平的多态性)还可获得自由巴赫拉姆博士(Dr.Bahram)的实验室维护的http://mhc-x.u-strasbg.fr/human.htm。
MICA的氨基酸序列首先被描述于Bahram(巴赫拉姆)等人(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.(科学院院刊)91:6259-6263和Bahram(巴赫拉姆)等人(1996)Immunogenetics(免疫遗传学)44:80-81中，将其公开内容通过引用结合在此。MICA基因是多态的，在其细胞外α1、α2以及α3结构域中展示出多种变体氨基酸的不寻常分布。为了进一步定义MICA的多态性，Petersdorf(彼得斯多夫)等人(1999)在275个具有常见和稀有HLA基因型的个体之间检查了其等位基因。人类MICA的细胞外α1、α2以及α3结构域的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1-5中。完整的MICA序列进一步包括具有23个氨基酸的前导序列连同跨膜结构域和胞质结构域。所选的人类MICA等位基因的细胞外α1、α2以及α3结构域的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1-5中。MICA*001的氨基酸序列示于SEQ ID NO 1中，对应于Genbank登录号AAB41060。人类MICA等位基因MICA*004的氨基酸序列示于SEQ ID NO2中，对应于Genbank登录号AAB41063。人类MICA等位基因MICA*007的氨基酸序列示于SEQ ID NO 3中，对应于Genbank登录号AAB41066。人类MICA等位基因MICA*008的氨基酸序列示于SEQ ID NO 4中，对应于Genbank登录号AAB41067。人类MICA等位基因MICA*019的氨基酸序列示于SEQ ID NO 5中，对应于Genbank登录号AAD27008。人类MICB的氨基酸序列示于SEQ ID NO 6中，对应于Genbank登录号CAI18747。
该MICA基因编码属于MhcSF并且属于IgSF的蛋白质。该蛋白质是跨膜MHC-I-α-样(I-α-样)链，该链包括三个细胞外结构域-两个远端G-样结构域，G-α-样(也被称为“D1”或“α1”)和G-α2-样(也被称为“D2”或“α2”)，以及临近细胞膜的C-样-结构域(也被称为“D3”或“α3”)，以及三个区——连接区、跨膜区及胞质区(标记是根据IMGT(国际免疫遗传学信息系统)的IMGT科学图表，http://imgt.org以及LeFranc(勒弗朗)等人In Silico Biology(电子生物学)，2005；5:45-60)。包括前导区、ECD、TM以及CY结构域的MICA成熟蛋白由360至366个氨基酸组成，差异是由跨膜区中的微卫星多态性引起的。可以根据任何适合的编号系统(例如，IMGT编号系统)定义α1、α2以及α3。在一个实施方式中，α1结构域包括SEQ ID NO 1的MICA多肽的残基位置1至88；α2结构域包括SEQ ID NO 1的MICA多肽的残基位置89至181；并且α3结构域包括SEQ ID NO 1的MICA多肽的残基位置182至274。α1和α2结构域各自包括A、B、C和D链、AB、BC和CD转角以及螺旋。α3结构域包括A、B、C、D、E、F和G链、BC环、CD链、DE转角以及FG环。MICA蛋白的八个潜在糖基化位点被高度糖基化，两个在α1中，一个在α2中并且五个在α3结构域中，包括O-聚糖(连接至丝氨酸或苏氨酸的N-乙酰乳糖胺)和/或N-聚糖。虽然MICA在某些细胞中组成性地表达，但是低水平的MICA表达通常不引起宿主免疫细胞贴附。然而，MICA在迅速增殖的细胞(例如肿瘤细胞)中被上调。MICA是所有NKG2D配体中被最高度表达的，并且已经跨宽范围的肿瘤类型被发现(例如一般癌、膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、肝细胞癌、恶性胶质瘤、前列腺癌、一般血液恶性肿瘤、急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病以及慢性淋巴细胞白血病)。最近，Tsuboi(坪井)等人(2011)(EMBO J:1-13)报道O-聚糖分支酶核心2β-1,6-N-乙酰葡糖胺转移酶(C2GnT)在MICA表达肿瘤细胞中是有活性的并且报道来自肿瘤细胞的MICA包含核心2O-聚糖(包括连接至N-乙酰半乳糖胺的N-乙酰葡糖胺分支的O-聚糖)。
Bauer(鲍尔)等人Science(科学)285:727-729,1999提供了MICA作为NKG2D的应激-可诱导的配体的作用。如在此使用，“MICA”是指任何MICA多肽，包括适用于其的MICA基因或编码的一种或多种蛋白质任何变体、衍生物或同种型。MICA基因是多态的，在其细胞外α1、α2以及α3结构域中展示出多种变体氨基酸的不寻常分布。已经针对MICA多肽(例如MICA)报道了不同等位基因变体，这些中的每一个都被对应的术语涵盖，包括例如人类MICA多肽MICA*001、MICA*002、MICA*004、MICA*005、MICA*006、MICA*007、MICA*008、MICA*009、MICA*010、MICA*011、MICA*012、MICA*013、MICA*014、MICA*015、MICA*016、MICA*017、MICA*018、MICA*019、MICA*020、MICA*022、MICA*023、MICA*024、MICA*025、MICA*026、MICA*027、MICA*028、MICA*029、MICA*030、MICA*031、MICA*032、MICA*033、MICA*034、MICA*035、MICA*036、MICA*037、MICA*038、MICA*039、MICA*040、MICA*041、MICA*042、MICA*043、MICA*044、MICA*045、MICA*046、MICA*047、MICA*048、MICA*049、MICA*050、MICA*051、MICA*052、MICA*053、MICA*054、MICA*055以及MICA*056。还涵盖与野生型全长MICA分别享有一种或多种生物学特性或功能，并且享有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核苷酸或氨基酸同一性的任何核酸或蛋白质序列。
如在此使用，除非另外说明或与上下文矛盾，否则“hNKG2D”以及术语“NKG2D”、“NKG2-D”、“CD314”、“D12S2489E”、“KLRK1”、“杀伤细胞类凝集素受体亚家族K，成员1”或“KLRK1”是指一种人类杀伤细胞活化受体基因、其cDNA(例如，Genbank登录号NM_007360)及其基因产物(Genbank登录号NP_031386)，或其天然存在的变体。在NK和T细胞中，hNKG2D可以与蛋白质(例如DAP10(Genbank登录号AAG29425，AAD50293))形成异源二聚体或高阶复合物。在此归于hNKG2D的任何活性(例如，细胞激活、抗体识别等)也可以归于处于异源二聚体(例如hNKG2D-DAP10)或具有这两种(和/或其他)组分的高阶复合物形式的hNKG2D。
已经确定了与NKG2D复合的MICA的3D结构(参见例如，Li(李)等人，Nat.Immunol.(自然免疫学)2001；2:443-451；code 1hyr，以及在IMGT/3D结构-DB(Kaas(卡斯)等人Nucl.Acids Res.(核酸研究)2004；32:D208-D210)中)。当MICA与NKG2D同源二聚体复合时，MICAα2的残基63至73(IGMT编号)被顺序化，从而添加几乎两圈螺旋。NKG2D的两个单体同等地有助于与MICA的相互作用，并且每个NKG2D单体中的七个位置与MICAα1或α2螺旋结构域之一相互作用。
本发明提供了使用本发明的抗原结合化合物的方法；例如，本发明提供了用于抑制细胞增殖或活性，用于向细胞递送分子(例如毒性分子、可检测的标记物等)，用于靶向、鉴定或纯化细胞，用于消耗、杀死或消除细胞，用于减少细胞增殖的方法，该方法包括将细胞(例如表达MICA多肽的肿瘤细胞)暴露于本发明的结合MICA多肽的抗原结合化合物。将领会的是，出于本发明的目的，“细胞增殖”是指细胞的生长或增殖的任何方面，例如细胞生长、细胞分裂、或细胞周期的任何方面。细胞可以在细胞培养物中(体外)或在哺乳动物中(体内)，例如罹患MICA表达病理学的哺乳动物。本发明还提供了一种用于诱导表达MICA多肽的细胞死亡或抑制表达MICA多肽的细胞的增殖或活性的方法，该方法包括将该细胞暴露于处于有效诱导该细胞死亡和/或抑制其增殖的量的抗原结合化合物，该抗原结合化合物结合连接至毒剂的MICA多肽。因此，本发明提供了一种用于治疗罹患增生性疾病以及由表达MICA多肽的细胞的致病性扩增表征的任何病症的哺乳动物的方法，该方法包括向该哺乳动物给予药学有效量的在此披露的抗原结合化合物，例如用于癌症的治疗。
定义
如在本说明书中所使用，“一个(种)(a或an)”可以意指一个(种)或多个(种)。如在权利要求(书)中所使用，当与单词“包括”结合使用时，单词“一个(种)(a或an)”可以意指一个(种)或多个(种)而非一个(种)。如在此使用，“另一个(种)”可以意指至少第二个(种)或更多。
在使用“包括”的情况下，这可以优选地被“主要由...组成”，更优选地被“由...组成”替换。
无论何时在该整个说明书内，“增生性疾病的治疗”或“肿瘤的治疗”或“癌症的治疗”等参照抗MICA结合剂(例如抗体)而提及，意指：(a)增生性疾病的治疗方法，所述方法包括向需要这样的治疗的温血动物(尤其是人)给予(用于至少一个治疗)抗MICA结合剂(优选在药学上可接受的载体材料中)，处于允许所述疾病的治疗的剂量(治疗有效量)，优选处于如在上文和在下文指定为优选的剂量(量)；(b)抗MICA结合剂用于治疗增生性疾病的用途，或抗MICA结合剂用于在所述治疗(尤其在人中)使用；(c)抗MICA结合剂用于生产治疗增生性疾病的药物制剂的用途，使用抗MICA结合剂用于生产治疗增生性疾病的药物制剂的方法，该方法包括将抗MICA结合剂与药学上可接受的载体或包括有效剂量的适合治疗增生性疾病的抗MICA结合剂的药物制剂混合；或(d)根据可允许在该申请提交的国家取得专利权的主题，a)、b)、和c)的任何组合。
如在此使用，术语“癌症”和“肿瘤”被定义为细胞或组织的新生长，包括不受控制的并且进行性的增殖。在一个具体实施方式中，在自然病程中，癌症是致命的。在具体定实施方式中，癌症是侵入性的、转移性的、和/或退行发育的(损失了分化和定向至彼此以及至它们的轴向框架)。
如在此使用，术语“活检”被定义为为了检查的目的，例如为了建立诊断，从器官移除组织。活检类型的实例包括通过应用抽吸，例如通过附接至注射器的针；通过组织片段的器械移除；通过用适当器械借助内窥镜移除；通过手术切除，例如全病变的手术切除；等。
如在此使用，术语“抗体”是指多克隆的和单克隆的抗体。取决于重链中恒定域的类型，将抗体分为五个主要类别之一：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM。这些中的若干个被进一步分为多个小类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、等。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两个相同对的多肽链组成，每个对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每个链的N端限定了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别被称为“α”、“δ”、“ε”、“γ”和“μ”。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。IgG和/或IgM是本发明中采用的优选类别的抗体，其中IgG是特别优选的，因为它们是生理学情况下最常见抗体并且因为它们在实验室环境下最容易制造。优选地，本发明的抗体是单克隆抗体。特别优选的抗体是人源化抗体、嵌合抗体、人类抗体、或另外适合人类的抗体。“抗体”还包括任何在此描述的抗体的片段或衍生物。
术语“特异性结合”是指在竞争性结合测定中，如使用重组形式的蛋白、其中的表位、抑或在分离的靶细胞表面上存在的天然蛋白进行评价，抗体可以优选地结合至结合配偶体，例如MICA。竞争性结合测定和用于确定特异性结合的其他方法将在以下进一步描述并且是本领域熟知的。
当抗体被称为与具体单克隆抗体(例如6E4、20C6或16A8)“竞争”，这是指在使用重组MICA分子或表面表达的MICA分子的结合测定中，抗体与单克隆抗体竞争。例如，如果在结合测定中，测试抗体减少了6E4、20C6或16A8与MICA多肽或MICA表达细胞的结合，那么该抗体被称为分别与6E4、20C6或16A8“竞争”。
如在此使用，术语“亲和力”是指抗体与表位的结合的强度。由离解常量KD给出抗体的亲和力，定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度。[Ab]是未结合抗体的摩尔浓度，并且[Ag]未结合抗原的摩尔浓度。由1/Kd定义亲和力常数Ka。在Harlow(哈洛)等人，Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，N.Y.(纽约州)，(1988)，Coligan(科利根)等人编辑，Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Greene PublishingAssoc.(格林出版协会)和Wiley Interscience(威利国际科学)，N.Y.(纽约州)，(1992，1993)，和Muller(穆勒)，Meth.Enzymol.(酶学方法)92:589-601(1983)中可以发现用于确定mAbs亲和力的优选方法，将这些参考文献通过引用完整结合在此。本领域熟知的用于确定mAbs亲和力的一个优选并且标准的方法是使用表面等离子共振(SPR)筛选(例如通过用BIAcoreTM SPR分析装置进行分析)。
在本发明的上下文内，“决定子”是指在多肽上相互作用或结合的位点。
术语“表位”是指抗原决定子，并且是抗原上结合抗体的区或区域。蛋白表位可以包括在结合中直接涉及的氨基酸残基连同由特异性抗原结合抗体或肽有效阻断的氨基酸残基，即抗体的“足迹”内的氨基酸残基。它是可以与例如抗体或受体结合的复合抗原分子上的最简单形式的或最小结构的区。表位可以是线性的或构象的/结构的。术语“线性表位”被定义为氨基酸的线性序列(一级结构)上连续的氨基酸残基组成的表位。术语“构象的或结构的表位”被定义为由不是都连续的氨基酸残基组成的表位，并且因此代表通过分子折叠(二级、三级和/或四级结构)而变得彼此接近的氨基酸线性序列的分开的部分。构象表位取决于3维结构。因此，术语‘构象的’通常与‘结构的’可互换地使用。
关于MICA表达细胞，术语“消耗”是指可以杀死、消除、溶解或诱导磁力诶杀死、消除或溶解，以便负面影响样品或对象中存在的多个MICA表达细胞的过程、方法、或化合物。
根据本发明的“剂”或“化合物”包括小分子、多肽、蛋白、抗体或抗体片段。在本发明的上下文中，小分子在一个实施方式中是指具有小于1000道尔顿、特别是小于800道尔顿、更特别是小于500道尔顿的分子量的化学制剂。术语“治疗剂”是指具有生物活性的剂。术语“抗癌剂”是指具有针对癌细胞的生物活性的剂。
关于抗体，术语“适合人类的”是指用于例如在此所描述的治疗方法，可以在人体内安全使用的任何抗体、衍生化抗体、或抗体片段。适合人类的抗体包括所有类型的人源化抗体、嵌合抗体、或完全人类抗体、或其中抗体的至少一部分衍生自人类或另外被修饰的任何抗体，以便避免当使用天然非人类抗体时通常激起的免疫应答。
出于本发明的目的，“人源化抗体”或“人类抗体”是指其中一个或多个人类免疫球蛋白的恒定或可变结构区与结合区(例如动物免疫球蛋白的CDR)融合的抗体。设计此类抗体来维持从其衍生结合区的非人类抗体的结合特异性，而且用来避免针对非人类抗体的免疫反应。可以从已经“工程化”用来响应抗原激发产生特定人类抗体的转基因小鼠或其他动物获得此类抗体(参见例如Green(格林)等人(1994)Nature Genet(自然遗传)7:13；Lonberg(伦贝格)等人(1994)Nature(自然)368:856；Taylor(泰勒)等人(1994)Int Immun(国际免疫学)6:579，将它们的完整教授内容通过引用结合在此)。可以通过遗传的或染色体的转染方法连同噬菌体展示技术构建完全人类抗体，所有这些都是本领域已知的(参见例如McCafferty(麦考夫迪)等人(1990)Nature(自然)348:552-553)。还可以通过体外激活B细胞产生人类抗体(参见例如美国专利号5,567,610和5,229,275，将它们通过引用以其全文结合在此)。
“嵌合抗体”是一种抗体分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，这样使得抗原结合位点(可变区)连接至不同的或改变的类别、效应子功能和/或种类的恒定区，或赋予嵌合抗体新特性的完全不同分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物、等；或(b)用具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换可变区或其一部分。
术语“Fc结构域”、“Fc部分”、和“Fc区”是指抗体重链的C末端片段，例如从人类γ(gamma)重链的约氨基酸(aa)230至约aa450，或其他类型的抗体重链(例如对于人类抗体是α、δ、ε和μ)中的它的配对序列或其天然存在的同种异型。除非另外说明，贯穿本公开内容使用针对免疫球蛋白的普遍接受的Kabat(卡巴)氨基酸编号(参见Kabat(卡巴)等人(1991)Sequences of Protein ofImmunological Interest(具有免疫性兴趣的蛋白序列)，第5版，United States PublicHealth Service(美国公共卫生署)，National Institute of Health(国立卫生研究院)，Bethesda(贝塞斯达)，马里兰州，也称为“Kabat(卡巴)EU”)。
术语“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是本领域普遍理解的术语，并且指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，并且随后导致靶细胞溶解。介导ADCC的非特异性细胞毒性细胞包括自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性细胞、和嗜酸性细胞。
术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是本领域普遍理解的术语，并且指在补体存在下，分子溶解靶的能力。通过补体系统的第一组分结合至与同源抗原复合的分子(例如抗体)引发了补体激活通路。
当提及MICA时，术语“脱落”是指MICA的可溶性细胞外结构域(ECD)片段从表达MICA的细胞的细胞表面释放。细胞表面MICA的蛋白酶剪切(例如通过基质金属蛋白酶(MMP)(例如ADAM10和/或ADAM17)的作用)，致使ECD片段从细胞表面释放，可以导致此类脱落，或者可溶性ECD或其片段可以由替代转录物编码。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”是指实质上或基本上不含有在其天然状态发现时正常伴随它的组分。典型地使用分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法确定纯度和同质性。为制剂中存在的超优势种的蛋白是实质上纯化的。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在此可互换地使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语应用至其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，连同应用至天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
当引用例如细胞、或核酸、蛋白、或载体使用时，术语“重组”表明该细胞、核酸、蛋白或载体已经通过引入异源核酸或蛋白或改变天然核酸或蛋白进行修饰，或该细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因或表达另外异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。
如在此使用，术语“NK细胞”是指在非常规免疫中涉及的淋巴细胞亚群。可以借助某些特征和生物学特性，例如表达特异性表面抗原(包括针对人类NK细胞的CD56和/或CD16)、在细胞表面上不存在α/β或γ/δTCR复合物、通过激活特定细胞溶解机构而结合并且杀死不能表达“自我”MHC/HLA抗原的细胞的能力、杀死肿瘤细胞或表达针对NK活化受体的配体的患病细胞的能力、以及释放称为刺激或抑制免疫应答的细胞因子的蛋白分子的能力来鉴定NK细胞。使用本领域熟知的方法，任何这些特征和活性可以用于鉴定NK细胞。术语NK细胞还将涵盖NK细胞的任何亚群。在本发明的上下文内，“活性”NK细胞是指生物活性的NK细胞，包括具有溶解靶细胞或增强其他细胞的免疫功能的能力的NK细胞。例如，“活性”NK细胞可以能够杀死表达针对活化NK受体的配体和/或不能表达NK细胞上的KIR识别的MHC/HLA抗原的细胞。可以通过本领域已知的不同技术，例如从血样、细胞单采术、组织或细胞收集进行分离而获得NK细胞。对于涉及NK细胞的测定有用的实验方案可以发现于Natural Killer Cells Protocols(天然杀伤细胞实验方案)(Campbell(坎贝尔)KS和Colonna(科隆纳)M编辑)，Human Press(人类出版社)，219-238页(2000)。
如在此使用，“T细胞”是指在胸腺中成熟的，并且在其细胞表面上展示T细胞受体等分子的淋巴细胞亚群。可以借助某些特征和生物学特性，例如表达特异性表面抗原(包括TCR、CD4或CD8)、某些T细胞杀死肿瘤细胞或感染细胞的能力、某些T细胞激活免疫系统的其他细胞的能力、以及释放称为刺激或抑制免疫应答的细胞因子的蛋白分子的能力来鉴定T细胞。使用本领域熟知的方法，任何这些特征和活性可以用于鉴定T细胞。在本发明的上下文内，“活性”或“激活的”T细胞或NK细胞是指生物活性的T细胞或NK细胞，更具体地，是指具有通过例如分泌细胞因子来溶解细胞或刺激免疫应答的能力的T细胞或NK细胞。可以按多种熟知方法，包括功能测定和基于表达的测定(例如表达细胞因子)中的任一种检测活性细胞。
在本发明的上下文内，术语“结合”多肽或表位的抗体是指具有特异性和/或亲和力来结合所述决定子的抗体。
抗体
本发明的抗体是结合跨越不同等位基因的人类MICA的抗体。在一个实施方式中，抗体结合MICA多肽(抗MICA抗体)，而不实质阻断MICA与NKG2D的相互作用(例如在肿瘤细胞上表面MICA与效应细胞上表面NKG2D的相互作用)。在另一个实施方式中，抗体结合MICA多肽(抗MICA抗体)并且抑制MICA与NKG2D的相互作用；优选地，抗体抑制免疫细胞表面上由sMICA导致的NKG2D下调。在一个实施方式中，抗体结合细胞表面上的MICA多肽而不实质阻断MICA从细胞表面(例如肿瘤细胞的细胞表面)脱落。在一个实施方式中，抗体结合MICA的α1和/或α2结构域。在一个实施方式中，抗体结合MICA的α3结构域。在一个实施方式中，抗体具有针对人类MICA等位基因*001、*004和*008、任选地另外*007和/或*019的亲和力，任选地其特征在于小于10-9M、优选小于10-10M的Kd。
在一个实施方式中，对于结合MICA多肽，该抗体与抗体6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9和14B4中的任意一个或多个竞争。优选地，对于MICA多肽上实质上或基本上相同的、或相同的表位或“表位位点”，抗体识别它、结合它、或对其具有免疫特异性。
抗体表位
在另一个实施方式中，这些抗体结合与抗体6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9和14B4实质上相同的表位。在另一个实施方式中，这些抗体与以下项至少部分重叠、或包括其中至少一个残基：对应于包括SEQ ID NO:1至5的氨基酸序列的MICA多肽的残基1-88、残基89-181、或残基182-274的区段。在一个实施方式中，该表位的所有关键残基是在对应于包括SEQID NO:1至5的氨基酸序列的MICA多肽的残基1-88、残基89-181、或残基182-274的区段中。在一个实施方式中，抗体结合横跨(a)α1和/或α2结构域以及(b)α3结构域的连接的表位，其中该表位的所有关键残基在对应于包括SEQ ID NO:1至5的氨基酸序列的MICA多肽的残基1-181(例如残基1-88(任选地1-85)或89-181(任选地86-181))的区段中。在一个实施方式中，抗体结合包括区段中的1、2、3、4、5、6、7个或更多个残基的表位，该区段对应于包括SEQ ID NO:1至5的氨基酸序列的MICA多肽的残基1-88(任选地1-85)或残基89-181(任选地86-181)。优选地，抗体结合的残基存在于MICA多肽的表面上，例如细胞表面上表达的MICA多肽中。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5、6、7个或更多个残基，该组由以下各项组成：R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230和D23(参照SEQ ID NO 1-5中任一个的MICA)。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括：
(a)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：R6和N8；
(b)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：N56、K57、T58；
(c)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：R61和R64；
(d)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82；
(e)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：Q83、K84；
(f)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：E97、H99；
(g)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：E100、D101、N102；
(h)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：S103、T104、R105；
(i)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：D113、E115；
(j)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：N121、E123；
(k)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：T124和E126；
(l)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：H109、Y111、L116；
(m)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：H109、Y111、L116；
(n)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：S133、R134、T137；或
(o)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：M140、N141、R143和N144；
(p)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：S224、H225和D226；
(q)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：T227、Q228和Q229；和/或
(r)选自下组的一个或多个残基，该组由以下各项组成：W230和D232。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括(a)至(r)中2、3或4个的任何组合。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5、或6个或更多个残基，该组由以下各项组成：Q48、W49、E51、D52、V53和L54。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5、或6个或更多个残基，该组由以下各项组成：N56、K57、T58、R61和R64。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5或6个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84、H109、Y111、D113、L116、S133、R134、T137、M140、N141、R143和N144。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5或6个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84、H109、Y111、D113、L116、Q131、S132、Q136、M140、N141、R143和N144。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5、或6个或更多个残基，该组由以下各项组成：E100、D101、N102、S103、T104、R105、N121、E123、T124和E126。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5、或6个或更多个残基，该组由以下各项组成：R6、N8、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、E115、L178、R179和R180。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5、或6个或更多个残基，该组由以下各项组成：S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230和D232。在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括选自下组的1、2、3、4、5、或6个或更多个残基，该组由以下各项组成：T227、Q228和Q229。
在一个实施方式中，抗体结合表位，该表位包括：
(a)选自下组的1个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82，和选自下组的1个或更多个残基，该组由以下各项组成：Q83、K84；
(b)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84，和选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：H109、Y111、L116；
(c)残基D113，和选自下组的1、2、3或4个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84；
(d)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84，和选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：Q131、S132、Q136；
(e)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84，和选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：S133、R134、T137；
(f)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84，和选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：M140、N141、R143和N144；
(g)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84，选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：H109、Y111、L116；任选地D113；和选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：Q131、S132、Q136；
(h)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84，选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：H109、Y111、L116；任选地D113；和选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：S133、R134、T137；
(i)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84，选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：H109、Y111、L116；任选地D113；和选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：M140、N141、R143和N144；
(j)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84，选自下组的1、2、或3个残基，该组由以下各项组成：H109、Y111、L116；任选地D113；选自下组的1、2或3个残基，该组由以下各项组成：S133、R134、T137；和选自下组的1、2、3或4个残基，该组由以下各项组成：M140、N141、R143和N144；
(k)选自下组的1个或更多个残基，该组由以下各项组成：R6、N8，和选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：E100、D101、N102、S103、T104、R105；
(l)选自下组的1、2、3或4个残基，该组由以下各项组成：N121、E123、T124和E126，和选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：E100、D101、N102、S103、T104、R105；或
(m)选自下组的1、2或3个残基，该组由以下各项组成：S224、H225和D226；选自下组的1、2或3个残基，该组由以下各项组成：T227、Q228和Q229，和选自下组的一个或两个残基，该组由以下各项组成：W230和D232。
任选地，本发明的抗体的表位可以完全地在MICA的α1和/或α2结构域内。任选地，另外，这些抗体可以特征为实质上结合MICA脱落所需的α3结构域区。
在一个实施方式中，本发明的抗体结合MICA多肽等位基因*001、*004和*008(以及任选的另外的*007和*019)的表面上存在的一个或多个氨基酸。
可以测量抗MICA抗体结合至MICA突变体转染的细胞，并且将其与抗MICA抗体结合野生型MICA多肽(例如SEQ ID NO:1至5中的任何一个或多个)的能力进行比较。抗MICA抗体和突变体MICA多肽之间结合的减少意味着存在结合亲和力的减少(例如，如通过已知方法，例如表达具体突变体的细胞的FACS测试，或通过结合突变体多肽的Biacore测试进行测量)，和/或抗MICA抗体的总结合能力减少(例如，如通过抗MICA抗体浓度对比多肽浓度的图中的Bmax降低证实)。结合的显著减少表明当抗MICA抗体结合MICA时，突变残基直接涉及结合抗MICA抗体或非常接近结合蛋白。
在一些实施方式中，结合的显著减少意味着相对于抗体和野生型MICA多肽之间的结合，抗MICA抗体和突变体MICA多肽之间的结合亲和力和/或能力减少了大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。在某些实施方式中，结合减少到低于可检测极限。在一些实施方式中，当抗MICA抗体结合突变体MICA多肽小于抗MICA抗体和野生型MICA多肽之间观察到的结合的50％(例如小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％)时，证实结合显著减少。
在一些实施方式中，提供了抗MICA抗体，其展示了对突变体MICA多肽的显著更低的结合，在该突变体MICA多肽中，对应于野生型MICA多肽(例如包括SEQ ID NO:1至5中的序列)中的残基1-88(任选地1-85)、残基89-181(任选地86-181)、或残基182-274(或其子序列)的区段中的残基被取代为不同的氨基酸。在一些实施方式中，提供了抗MICA抗体，其展示了对突变体MICA多肽的显著更低的结合，在该突变体MICA多肽中，对应于野生型MICA多肽(例如包括SEQ IDNO:1至5中的序列)中的残基1-88(任选地1-85)、残基89-181(任选地86-181)、或残基182-274(或其子序列)的区段中的残基被取代为不同的氨基酸。
在一些实施方式中，提供了抗MICA抗体，其展示了对突变体MICA多肽的显著更低的结合，在该突变体MICA多肽中，与野生型MICA多肽相比，选自下组的残基被取代为不同的氨基酸，该组由以下各项组成：R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230和D232。
在一些实施方式中，提供了抗MICA抗体，其展示了对突变体MICA多肽的显著更低的结合，在该突变体MICA多肽中：
(a)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：Q48、W49、E51、D52、V53和L54；
(b)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：N56、K57、T58、R61和R64；
(c)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84、H109、Y111、D113、L116、S133、R134、T137、M140、N141、R143和N144；
(d)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84、H109、Y111、D113、L116、Q131、S132、Q136、M140、N141、R143和N144；
(e)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：E100、D101、N102、S103、T104、R105、N121、E123、T124和E126；
(f)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：R6、N8、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、E115、L178、R179和R180；或
(g)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230和D232；
与野生型MICA多肽相比，被取代为不同的氨基酸。
在一些实施方式中，提供了抗MICA抗体，其展示了对突变体MICA多肽的显著更低的结合，在该突变体MICA多肽中：
(a)选自下组的残基，该组由以下各项组成：R6和N8；
(b)选自下组的残基，该组由以下各项组成：N56、K57、T58；
(c)选自下组的残基，该组由以下各项组成：R61和R64；
(d)选自下组的残基，该组由以下各项组成：K81、D82；
(e)选自下组的残基，该组由以下各项组成：Q83、K84；
(f)选自下组的残基，该组由以下各项组成：E97、H99；
(g)选自下组的残基，该组由以下各项组成：E100、D101、N102；
(h)选自下组的残基，该组由以下各项组成：S103、T104、R105；
(i)选自下组的残基，该组由以下各项组成：D113、E115；
(j)选自下组的残基，该组由以下各项组成：N121、E123；
(k)选自下组的残基，该组由以下各项组成：T124和E126；
(l)选自下组的残基，该组由以下各项组成：H109、Y111、L116；
(m)选自下组的残基，该组由以下各项组成：Q131、S132、Q136；
(n)选自下组的残基，该组由以下各项组成：S133、R134、T137；
(o)选自下组的残基，该组由以下各项组成：M140、N141、R143和N144；
(p)选自下组的残基，该组由以下各项组成：S224、H225和D226；
(q)选自下组的残基，该组由以下各项组成：T227、Q228和Q229；和/或
(r)选自下组的残基，该组由以下各项组成：W230和D232，
与野生型MICA多肽相比，被取代为不同的氨基酸。
在任一实施方式中，R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S194、E195、N197、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230或D232取代可以被规定为分别是R6A、N8A、W14A、Q48A、W49S、E51S、D52A、V53S、L54A、N56A、K57S、T58A、R61A、R64A、K81A、D82A、Q83A、K84A、E85A、E97A、H99A、E100A、D101S、N102A、S103A、T104S、R105A、H109A、Y111A、D113A、E115A、L116A、N121A、E123S、T124A、E126A、Q131A、S132A、S133A、R134S、Q136S、T137A、M140S、N141A、R143S、N144A、L178A、R179S、R180A、S224A、H225S、D226A、T227A、Q228S、Q229A、W230A或D232A取代。
在一些实施方式中，抗MICA抗体特征在于与野生型MICA多肽(除了如实施例4中所示的具体抗MICA抗体对其具有显著更低的结合的一个或多个突变体或残基)相比，对突变体MICA多肽(例如表D的突变体1-61中的任何一个的突变体)或对具有表D的突变体1-61中任一个的突变残基的多肽不展示显著更低的结合。
产生抗MICA抗体
可以通过本领域已知的大量技术产生本发明的抗体。典型地，通过用包含MICA多肽(优选是人类MICA多肽)的免疫原免疫非人类动物(优选是小鼠)来产生它们。MICA多肽可以包括人类MICA多肽的全长序列，或其片段或衍生物，典型地免疫原片段，即包括表达MICA多肽的细胞的表面上暴露的表位的多肽的一部分，优选地，由6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4抗体识别该表位。此类片段典型地包含成熟多肽序列的至少约7个连续氨基酸，甚至更优选地，包含它的至少约10个连续氨基酸。片段典型地基本上衍生自受体的细胞外结构域。在一个优选实施方式中，免疫原包含脂膜中的、典型地在细胞表面上的野生型人MICA多肽。在一个具体实施方式中，免疫原包含完整细胞，特别是完整人类细胞，这些细胞任选地被处理或溶解。在另一个优选实施方式中，该多肽是重组MICA多肽。在一个具体实施方式中，免疫原包含完整肿瘤细胞。
可以按本领域熟知的用于刺激小鼠中抗体产生的任何方式进行用抗原免疫非人类哺乳动物的步骤(参见例如E.Harlow(哈洛)和D.Lane(莱恩)，Antibodies:ALaboratory Manual(抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，N.Y.(纽约州)，(1988)，将其完整公开内容通过引用结合在此)。将免疫原悬浮或溶解在缓冲剂中，任选地用佐剂，例如完全或不完全弗氏佐剂。用于确定免疫原的量、缓冲剂类型和佐剂的量的方法是本领域普通技术人员熟知的并且不以任何方式限制本发明。对于不同免疫原这些参数可能是不同的，但是都是容易解释的。
类似地，足以刺激产生抗体的免疫位置和频率也是本领域熟知的。在典型的免疫实验方案中，在第一天用抗原腹膜内注射非人类动物，并且约一周后再注射一次。随后大约在第20天进行抗原回忆注射，任选地用佐剂，例如不完全弗氏佐剂。静脉内进行这些回忆注射，并且可以重复进行，持续若干个连续天。随后在第40天进行加强注射，静脉内注射抑或腹膜内注射，典型地不用佐剂。该实验方案导致在约40天后，抗原特异性抗体产生B细胞的产生。还可以使用其他实验方案，只要它们导致表达针对免疫中使用的抗原的抗体的B细胞的产生。
对于多克隆抗体制剂，血清获得自免疫的非人类动物，并且通过熟知的技术分离其中存在的抗体。可以使用连接至固相支撑体的上述任何免疫原对血清进行亲和力纯化，以便获得与MICA多肽反应的抗体。
在一个替代实施方式中，分离来自非免疫的非人类哺乳动物的淋巴细胞，在体外生长，并且然后暴露于细胞培养物中的免疫原。然后收获淋巴细胞，并且进行以下描述的融合步骤。
对于优选的单克隆抗体，下一步是从免疫的非人类哺乳动物分离脾细胞，并且随后那些脾细胞与无限增殖化细胞融合，以形成产生抗体的杂交瘤。从非人类哺乳动物分离脾细胞是本领域熟知的，并且典型地涉及从麻醉的非人类哺乳动物移除脾脏，将它切成小块并且通过细胞筛的尼龙网将来自脾被膜的脾细胞挤入适当缓冲剂中，以便产生单细胞悬浮液。洗涤这些细胞，离心并且重新悬浮在溶解任何红细胞的缓冲剂中。将该溶液再次离心，并且最终将团块中的剩余淋巴细胞重新悬浮在新鲜缓冲剂中。
一旦分离并且存在于单细胞悬浮液中，可以将淋巴细胞融合进无限增殖细胞系。这典型地是小鼠骨髓瘤细胞系，虽然对于产生杂交瘤而言有用的许多其他无限增殖细胞系也是本领域已知的。优选的鼠类骨髓瘤系包括但不局限于衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些(可得自Salk Institute Cell Distribution Center(索尔克研究所细胞分配中心)，San Diego(圣迭戈)，美国)和X63Ag8653和SP-2细胞(可得自American Type Culture Collection(美国典型微生物保藏中心)，Rockville(罗克维尔)，Maryland(马里兰州)，美国)。使用聚乙二醇等造成该融合。然后在包含抑制未融合亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质的选择性培养基中生长生成的杂交瘤。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型地将包含次黄嘌呤、氨喋呤、和胸苷(HAT培养基)，这些物质防止HGPRT缺陷型细胞的生长。
典型地在巨噬细胞的饲养层上生长杂交瘤。在平铺杂交瘤之前，巨噬细胞优选地来自用于分离脾细胞的非人类哺乳动物的同窝出生仔畜并且典型地用不完全弗氏佐剂等致敏这些巨噬细胞若干天。融合方法描述于Goding(戈丁)“MonoclonalAntibodies:Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)”，59-103页(Academic Press(学术出版社)，1986)，将其公开内容通过引用结合在此。
允许这些细胞在选择培养基中生长足够的时间，以便集落形成和抗体产生。这通常在约7天和约14天之间。
然后针对特异性结合MICA多肽基因产物的抗体的产生测定杂交瘤集落，任选地由抗体6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4特异性识别该表位。该测定典型地是比色ELISA型测定，虽然可以采用能适合生长杂交瘤的孔的任何测定。其他测定包括放射免疫测定或荧光激活细胞分选术。检查对于希望的抗体产生呈阳性的孔，以确定是否存在一个或多个明显的集落。如果存在多于一个集落，则这些细胞可以重新克隆并且生长，以确保只有单个细胞已经引起产生希望的抗体的集落。
可以在适当培养基，例如DMEM或RPMI-1640中，按更大量逐渐形成确认为产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤。可选地，杂交瘤细胞可以在体内生长为动物中的腹水瘤。
在用来产生希望的单克隆抗体的充分生长后，从这些细胞分离走包含单克隆抗体(或腹水)的生长培养基，并且纯化其中存在的单克隆抗体。典型地通过使用蛋白A或蛋白G琼脂糖(Sepharose)或连接至固相载体(例如琼脂糖(agarose或Sepharose)珠粒)的抗小鼠Ig的凝胶电泳、透析、色谱法实现纯化(所有这些都描述于例如Antibody Purification Handbook(抗体纯化手册)，Biosciences(生物科学)，出版号18-1037-46，AC版中，将其公开内容通过引用结合在此)。典型地通过使用具有含抗体部分的直接中和作用的低pH缓冲剂(pH 3.0或更小的甘氨酸或乙酸缓冲剂)，从蛋白A/G柱洗脱结合的抗体。按需要，收集、透析并且浓缩这些部分。
典型地重新克隆具有单个明显集落的阳性孔，并且重新测定以确保检测到并且产生唯一一种单克隆抗体。
还可以通过选择免疫球蛋白组合文库来产生抗体，如例如披露于(Ward(瓦尔德)等人，Nature(自然)，341(1989)544页，将其完整公开内容通过引用结合在此)。
结合MICA，特别是结合与单克隆抗体6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4实质上或基本上相同的表位的一种或多种抗体的鉴定会是使用其中可以评价抗体竞争的大量免疫筛选测定中的任意一种容易地确定的。许多此类测定是常规实践的并且是本领域熟知的(参见例如美国专利号5,660,827，1997年8月26日发布，将其通过引用确切地结合在此)。将理解，鉴定结合与在此所述的单克隆抗体相同或实质上相同的表位的抗体不以任何方式需要实际确定在此所述的抗体结合的表位。
例如，当待检查的抗体获得自不同来源动物，或甚至具有不同Ig同种型时，可以采用简单的竞争测定，其中对照抗体(例如6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4)和测试抗体经过混合(或预吸收)并且应用至含MICA多肽样品。基于蛋白质印迹法和BIACORE分析的使用的实验方案是适合用于此类竞争研究的。
在某些实施方式中，在应用至MICA抗原样品之前，将对照抗体(例如6E4、20C6或16A8)与不同量的测试抗体预混合(例如约1:10或约1:100)一个时段。在其他实施方式中，可以在暴露于MICA抗原样品期间，将对照抗体与不同量的测试抗体简单混合。只要可以区别来自游离抗体的结合(例如通过使用分离或洗涤技术以消除未结合抗体)和来自测试抗体的6E4、20C6或16A8(例如通过使用物种特异性或同种型特异性二抗或通过用可检测标记特异性标记6E4、20C6或16A8)，就可以确定测试抗体是否减少了6E4、20C6或16A8与抗原的结合，指示测试抗体识别与6E4、20C6或16A8实质上相同的表位。在不存在完全无关的抗体的情况下，(标记的)对照抗体的结合可以用作对照高值。可以通过将标记的(6E4、20C6或16A8)抗体与严格相同类型的未标记抗体(6E4、20C6或16A8)一起温育而获得对照低值，其中将发生竞争并且减少标记抗体的结合。在测试测定中，在测试抗体存在下，标记抗体反应性的显著减少是识别实质上相同的表位的测试抗体(即与标记的(6E4、20C6或16A8)抗体“交叉反应”或竞争的测试抗体)的指征。减少6E4、20C6或16A8与MICA抗原的结合至少约50％(例如至少约60％、或更优选至少约80％或90％(例如约65％-100％))的、处于约1:10和约1:100之间的6E4、20C6或16A8：测试抗体的任何比率的任何测试抗体被认为是结合与6E4、20C6或16A8实质上相同的表位或决定子的抗体。优选地，此类测试抗体将减少6E4、20C6或16A8与MICA抗原的结合至少约90％(例如约95％)。
还可以通过例如流式细胞术测试评价竞争。在这样的测试中，例如可以首先将携带给定MICA多肽的细胞与6E4、20C6或16A8一起温育，并且然后与用荧光染料或生物素标记的测试抗体一起温育。如果当与饱和量的6E4、20C6或16A8预温育时获得的结合是用不与6E4、20C6或16A8一起预温育的抗体所获得的结合(如借助荧光测量)的约80％、优选约50％、约40％或更少(例如约30％、20％或10％)，则该抗体被称为与6E4、20C6或16A8竞争。可选地，如果用与饱和量的测试抗体一起预温育的细胞上的标记的6E4、20C6或16A8抗体所获得的结合是不与测试抗体预温育所获得的结合的约80％、优选约50％、约40％、或更少(例如约30％、20％、或10％)，则抗体被称为与6E4、20C6或16A8竞争。
还可以采用其中测试抗体被预吸收并且以饱和浓度被应用至其上固定MICA抗原的表面上的简单的竞争测定。简单的竞争测定中的表面优选是BIACORE芯片(或适合表面等离子共振分析的其他介质)。然后以MICA饱和浓度使对照抗体(例如6E4、20C6或16A8)与该表面接触，并且测量对照抗体的MICA和表面的结合。将对照抗体的结合与不存在测试抗体时对照抗体与含MICA表面的结合进行比较。在测试测定中，在存在测试抗体时，用对照抗体的含MICA表面的结合的显著减少指示测试抗体识别与对照抗体实质上相同的表位，这样使得测试抗体与对照抗体“交叉反应”。减少对照抗体(例如6E4、20C6或16A8)与MICA抗原的结合至少约30％或更多、优选约40％的任何测试抗体可以被认为是结合与对照抗体(例如6E4、20C6或16A8)实质上相同的表位或决定子的抗体。优选地，这样的测试抗体将减少对照抗体(例如6E4、20C6或16A8)与MICA抗原的结合至少约50％(例如至少约60％、至少约70％、或更多)。将理解，在竞争测定中，对照抗体和测试抗体的顺序可以颠倒：即对照抗体可以首先结合该表面并且此后使测试抗体与该表面接触。优选地，对MICA抗原具有更高亲和力的抗体首先结合该表面，因为将预期对第二抗体所见的结合下降(假定这些抗体是交叉反应的)将具有更大幅值。在例如Saunal(萨纳尔)(1995)J.Immunol.Methods(免疫方法期刊)183:33-41中提供了此类测定的另外实例，将其公开内容通过引用结合在此。
优选地，识别MICA表位的单克隆抗体将与按相当大的百分比的或甚至所有的相关MICA等位基因上存在的表位反应。在一个方面，本发明的抗MICA抗体结合MICA*004和*008，任选地另外的MICA*001、*007和/或*0019。
在优选实施方式中，抗体将结合来自患有特征在于MICA阳性细胞的表达的疾病的一个或多个的个体(即是使用本发明的抗MICA抗体用在此所述的方法之一治疗的候选人的个体)的MICA表达细胞。因此，一旦获得特异性识别细胞上的MICA的抗体，可以测试它结合MICA阳性细胞(例如癌细胞)的能力。具体地，在用本发明的抗体之一治疗患者之前，测试该抗体结合取自患者的恶性细胞(例如在血样或肿瘤活检中)的能力将是有益的，以最大化在患者中将是有益的治疗的可能性。
在一个实施方式中，本发明的抗体是在用来测试它们结合MICA表达细胞(例如恶性细胞)的能力的免疫测定中验证的。例如，进行肿瘤活检并且收集肿瘤细胞。然后使用本领域普通技术人员熟知的标准方法评价给定抗体结合细胞的能力。发现结合来自显著百分比的个体或患者(例如5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多)的相当大的部分(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多)的已知表达MICA的细胞(例如肿瘤细胞)的抗体适合用于本发明，都出于诊断目的，以确定患者中恶性细胞的存在或水平，或适合用于在此所述的治疗方法，例如适合用于增加或减少恶性细胞个数或活性。为了评价抗体与细胞的结合，直接抑或间接标记这些抗体。当间接标记时，典型地添加第二标记抗体。
可以按本领域普通技术人员已知的方式进行抗体结合是否在表位区内的测定。作为此类作图/表征方法的一个实例，可以通过使用MICA蛋白中暴露的氨基/羧基的化学修饰的表位“足迹法”确定抗MICA抗体的表位区。这种足迹法技术的一个具体实例是使用HXMS(通过质谱法检测氢-氘交换)，其中发生受体和配体蛋白酰胺部分的氢/氘交换、结合、和回交换，其中参与蛋白结合的主链酰胺基团被保护免受回交换并且因此将保留氘化。可以通过消化性蛋白水解、快速微内径高效液相色谱分离、和/或电喷雾离子化质谱法在这一点上鉴定相关区。参见例如Ehring(埃林)H，分析生物化学，卷267(2)252-259页(1999)Engen(恩金)，J.R和Smith(史密斯)，D.L.(2001)Anal.Chem.(分析化学)73,256A-265A。适合的表位鉴定技术的另一个实例是核磁共振表位作图(NMR)，其中典型地，对在游离抗原和与抗原结合肽(例如抗体)复合的抗原的二维NMR图谱中的信号的位置进行比较。典型地用15N选择性地同位素标记抗原，这样使得在NMR图谱中只看见对应于抗原的信号并且没有来自抗原结合肽的信号。与游离抗原的图谱相比，源自与抗原结合肽相互作用所涉及氨基酸的抗原信号典型地在复合物的图谱中移位，并且可以按此方式鉴定结合所涉及的氨基酸。参见例如Ernst Schering Res Found Workshop(厄恩斯特先灵葆雅研究基金会研讨会)2004；(44):149-67；Huang(黄)等人，Journalof Molecular Biology(分子生物学杂志)，卷281(1)61-67页(1988)；以及Saito(齐藤)和Patterson(帕特森)，Methods(方法)，1996年6月；9(3):516-24。
还可以使用质谱法方法进行表位作图/表征。参见例如Downard(道尔德)，JMass Spectrom(质谱法杂志)2000年4月；35(4):493-503以及Kiselar(奎莱尔)和Downard(道尔德)，Anal Chem.(分析化学1999年5月1；1；71(9):1792-1801。在表位作图和鉴定的背景下，蛋白酶消化技术也会是有用的。可以通过蛋白酶消化，例如通过在pH 7-8使用按与MICA约1:50的比率使用胰蛋白酶或o/n消化，随后是用于肽鉴定的质谱法(MS)分析，确定抗原决定子相关区/序列。可以随后通过比较经受胰蛋白酶消化的样品和与抗体一起温育并且然后经受例如胰蛋白酶消化的样品，鉴定受抗MICA结合剂保护免受胰蛋白酶切割的肽(由此揭示该结合剂的足迹)。而且或可选地，其他酶，像胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等可以用于类似表位表征方法。此外，酶消化可以提供用于分析潜在抗原决定子序列是否在未表面暴露的并且因此在免疫原性/抗原性方面最可能不相关的MICA多肽的一个区内的快速方法。
定点诱变是对解释结合表位有用的另一技术。例如，在“丙氨酸扫描”中，蛋白区段内的每个残基都被替换为丙氨酸残基，并且测量结合亲和力的结果。如果突变导致结合亲和力显著减少，则它最可能涉及结合。特异性针对结构表位的单克隆抗体(即并不结合未折叠蛋白的抗体)可以用于验证丙氨酸替换并不影响蛋白的整体折叠。参见例如Clackson(克拉克森)和Wells(韦尔斯)，Science(科学)1995；267:383-386；以及Wells(韦尔斯)，Proc Natl Acad Sci USA(美国国家科学院院刊)1996；93:1-6。
电子显微镜还可以用于表位“足迹法”。例如，Wang(王)等人，Nature(自然)1992；355:275-278使用冷冻电子显微镜术、三维图象重构、和X射线结晶学的配合应用来确定在天然豇豆花叶病毒的衣壳表面上的Fab片段的物理足迹。
用于表位评估的其他形式的“无标记”测定包括表面细胞质基因组反响(SPR，BIACORE)和反射干涉频谱法(RifS)。参见例如(法格尔斯塔姆)等人，Journal Of Molecular Recognition(分子识别杂志)1990；3:208-14；Nice(耐斯)等人，J.Chroma-togr.(色谱法杂志)1993；646:159-168；Leipert(莱佩特)等人，Angew.Chem.Int.Ed.(Angewandte Chemie International Edition(应用化学国际版)1998；37:3308-3311；(克罗格尔)等人，Biosensors and Bioelectronics(生物传感器和生物电子学)2002；17:937-944。
还应注意到，可以在本文所述的一种或多种示例性竞争测定鉴定结合与本发明的抗体相同的或实质上相同的表位的抗体。
在脊椎动物或细胞中免疫接种并且产生抗体时，可以进行具体的选择步骤来分离要求保护的抗体。在此方面，在一个具体实施方式中，本发明还涉及产生此类抗体的方法，该方法包括：(a)用包含MICA多肽的免疫原免疫非人类哺乳动物；以及(b)制备来自所述免疫动物的抗体；以及(c)选择能够结合MICA的来自步骤(b)的抗体。
典型地，由本发明提供的抗MICA抗体具有在约104至约1011M-1(例如约108至约1010M-1)的范围中的对MICA多肽的亲和力。例如，在一个具体方面中，如通过例如表面细胞质基因组反响(SPR)筛选(例如通过用BIAcoreTM SPR分析装置进行分析)所确定，本发明提供了具有关于MICA的小于1x 10-9M的平均解离常数(KD)的抗MICA抗体。在一个更具体的示例性方面中，本发明提供了具有对MICA的约1x 10-8M至约1x 10-10M、或约1x 10-9M至约1x 10-11M的KD的抗MICA抗体。
例如可以用不大于约(即亲和力好于)100、60、10、5、或1纳摩尔，优选亚纳摩尔或任选地不大于约500、200、100或10皮摩尔的平均KD表征抗体。例如可以通过在芯片表面上固定重组产生的人类MICA蛋白，随后应用溶液中的待测试抗体，确定KD。在一个实施方式中，该方法进一步包括步骤(d)，选择对于结合MICA，能够与抗体6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4竞争的来自(b)的抗体。
在任何实施方式的一个方面中，根据本发明的方法制备的抗体是单克隆抗体。在另一个方面中，用于产生根据本发明的方法的抗体的非人类动物是哺乳动物，例如啮齿动物、牛、猪、禽类、马、兔、山羊、或绵羊。本发明的抗体涵盖6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4。额外地，本发明的抗体可以任选地被指定为除了在Salih(萨利赫)等人(2003)(Blood(血液)102(4):1389-1396)中描述的抗体BAMO1或BAMO3，在Groh(格罗)等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA(美国国家科学院院刊)93:12445-12450、Groh(格罗)等人(1998)Science(科学)279:1737-1740或WO 2008/131406中描述的抗体2C10、3H5、6D4或6G6(这些参考文献中的每一个的公开内容通过引用结合在此)，或以上内容的衍生物，例如完整或部分地包括这些CDR或抗原结合区的衍生物中的任一种的抗体。
根据本发明的替代实施方式，从本发明的杂交瘤中分离编码结合存在于MICA多肽上的表位的抗体的DNA，并且将其放入用于转染进适当宿主的适当表达载体中。然后将宿主用于重组产生抗体、或其变体，例如单克隆抗体的人源化版本、抗体的活性片段、包含抗体的抗原识别部分的嵌合抗体、或包含可检测部分的版本。
可任意容易地分离编码本发明的单克隆抗体，例如抗体6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4的DNA，并且使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的寡核苷酸探针)对其进行测序。一旦分离，可以将DNA放入表达载体，然后将这些表达载体转染进不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞，以获得重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。如在本说明书的其他地方所述，此类DNA序列可以被修饰用于大量目的中的任一个，例如用于人源化抗体，产生片段或衍生物，或用于修饰抗体序列(例如在抗原结合位点中)，以优化抗体的结合特异性。在一个实施方式中，本发明包括编码抗体(例如6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4)的轻链和/或重链的分离的核酸序列，连同包含此类核酸(例如在其基因组中)的重组宿主细胞。
编码抗体的DNA的细菌中重组表达是本领域熟知的(参见例如Skerra(斯凯拉)等人，Curr.Opinion in Immunol.(免疫学当前观点)，5,256页(1993)；以及Pluckthun(普吕克通)，Immunol.(免疫学)130,151页(1992)。
评价活性
一旦获得抗原结合化合物，将通常评价它阻断NKG2D和MICA(例如sMICA或膜结合MICA)之间的相互作用、阻断MICA从细胞脱落、抑制sMICA诱导的NKG2D下调、导致MICA表达细胞的死亡、诱导ADCC或CDC指向、和/或抑制MICA表达靶细胞的增殖和/或导致它们的消除的能力。
可以在本方法的任何适合的阶段进行抗原结合化合物的减少MICA和NKG2D之间的结合或阻断它们之间的相互作用的能力的评价，例如，如在此提供的实例中。例如，可以使在它们的表面上表达MICA的肿瘤细胞与在它们的表面上表达NKG2D的细胞(例如效应细胞)接触，其中添加或不添加候选抗MICA抗体。可以评价MICA表达细胞和NKG2D表达细胞之间的结合，并且选择并不减少结合的抗体。另一种可能性涉及使分离的MICA多肽与分离的NKG2D多肽接触，或与在其表面上表达NKG2D多肽的细胞接触，并且评价MICA和NKG2D多肽或表达NKG2D的细胞之间的结合。另一种可能性涉及使分离的NKG2D多肽与在其表面上表达MICA多肽的细胞接触，并且评价MICA多肽或表达MICA的细胞之间的结合。
例如，为了确定一种剂是否阻断MICA与NKG2D的相互作用，进行以下测试：在增加浓度的测试抗MICA mAb存在或不存在下，将用MICA转染的细胞系C1R或RMA与可溶性NKG2D-Fc融合蛋白一起温育。洗涤这些细胞，然后与识别NKG2D-Fc融合蛋白的Fc部分的二抗一起温育，再次洗涤，并且在流式细胞仪(FACScalibur，Beckton Dickinson公司)上用标准方法进行分析。当不存在抗MICA mAb时，NKG2D-Fc蛋白很好地结合C1R或RMA细胞。在阻断MICA与NKG2D结合的抗MICA mAb存在时，存在NKG2D-Fc与细胞的结合的减少。
优选地，还可以通过评价抗MICA抗体对NKG2D表达细胞(例如NK或T细胞)的功能的影响，进行抗原结合化合物的减少MICA和NKG2D之间的结合或阻断它们之间的相互作用的能力的评价。优选地，使用表达NKG2D而不表达CD16的NK细胞或T细胞，以便避免CD16介导的ADCC作用的任何贡献。如果抗MICA抗体减少或阻断了MICA-NKG2D相互作用，则它将被预期用于抑制NKG2D介导的NK细胞或T细胞的激活。因此，并不减少MICA和NKG2D之间的结合或阻断它们之间的相互作用的抗体将不实质上减少或阻断NKG2D介导的NK细胞或T细胞的激活。可以通过典型的细胞毒性测定对此进行评估，本文描述了它的实例。可以使用多种基于细胞的测定中的任一种来评价NKG2D活性，这些测定包括基于基因表达的测定，基于细胞毒性的测定，以及增殖测定。在一个方面中，体外测定将使用来自人类患者的NK细胞或T细胞，例如用NKG2D编码转基因转染的T细胞系，只要受体的表达以可检测方式改变细胞活性，例如使它们被NKG2D配体可激活。反映NKG2D活性的任何适合的生理学变化可以用于评价测试化合物或抗体的功用。例如，可以测量大量作用，例如基因表达、细胞因子产生、细胞生长、细胞增殖、pH、细胞内第二信使(例如Ca2+、IP3、cGMP、或cAMP)、活性(例如细胞毒性活性)或激活其他T细胞的能力中的变化。在一个实施方式中，可以通过检测NKG2D响应基因(例如CD25、IFN-γ、或TNF-α)的表达来评价受体的活性(参见例如Groh(格罗)等人(2003)PNAS(美国国家科学院院刊)100:9452-9457；André(安德烈)等人(2004)Eur.J.Immunol(欧洲免疫学杂志)34:1-11)。在一个实施方式中，通过在MICA表达细胞和抗MICA抗体存在下温育NKG2D+T细胞或NK细胞评价NKG2D活性，并且评价化合物或测试抗体抑制由T细胞或NK细胞释放TNF-α或IFN-γ的能力。
在本文的实施例中也描述了示例性细胞毒测定，其中评价了NKG2D介导的靶细胞的杀灭。在此，通过测量51Cr的靶细胞释放，抗MICA抗体减少或抑制NKG2D+CD16-NK92细胞的能力被用于评价NK细胞介导的MICA*019转染的BaF/3的杀灭。通过本领域熟知的标准方法进行体外细胞毒性测定，例如，如在Coligan(科利根)等人编辑，Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Greene Publishing Assoc.(格林出版协会)和Wiley Interscience(威利国际科学)，N.Y.(纽约州)，(1992，1993)中所述。在添加NK细胞之前用51Cr标记MICA表达靶细胞，然后杀灭被估计为与由于杀灭的结果的从细胞至培养基的51Cr的释放成比例。减少MICA和NKG2D之间的结合或阻断它们之间的相互作用的剂的添加导致防止了经由NKG2D的活化信号传递的引发和蔓延。因此，此类剂的添加导致靶细胞的NK介导的杀灭减少。
不减少或阻断通过NKG2D的细胞激活(例如细胞因子产生、细胞生长、细胞增殖、pH、细胞内第二信使、NK介导的MICA表达细胞的杀灭)的抗原结合化合物(例如不减少或减少小于5％、10％、20％或30％)被称为“非阻断”mAb。减少或阻断通过NKG2D的细胞激活的抗原结合化合物被称为“阻断”mAb。
可以在本方法的任何适合的阶段进行抗原结合化合物的阻断MICA从MICA表达细胞的脱落的能力的评价，例如，如在此提供的实例中。在一个实例中，提供了细胞样品并且使用ELISA方法检测可溶性细胞外MICA。在一个实例中，将本发明的抗原结合化合物给予哺乳动物，并且测量循环sMICA的存在或不存在或其水平。体外检测的实例描述于Nolting(诺尔廷)等人(2010)Virology(病毒学)406(1):12-20中。简要地，可以使用可商购的MICAELISA药盒(Bamomab，慕尼黑，德国)。用PBS中的按2μg/ml的捕获抗MICA mAb BAMO-1将平板涂覆过夜，然后通过添加100μl的15％BSA在37℃封闭2h并且洗涤。添加标准物和样品并且将平板在37℃温育2h。洗涤平板并且添加在7.5％BSA-PBS中的按5μg/ml的检测mAb BAMO-3，在37℃持续2h。然后洗涤平板并且添加抗小鼠IgG2a-HRP(在7.5％BSA-PBS中1:8000)，在37℃持续1h。然后洗涤平板并且使用过氧化物酶底物系统(KPL公司，Gaithersburg(盖瑟斯堡)，马里兰州)进行显影。在450nm测量吸光度。
可以在本方法的任何适合的阶段进行抗原结合化合物诱导ADCC、CDC或另外(例如通过递送毒剂)导致MICC表达靶细胞的活性的消除或抑制的能力的评价，例如，如本文提供的实施例中。这一评价在为了治疗用途涉及的抗体(或其他化合物)的鉴定、产生和/或开发中涉及的不同步骤中的一个或多个上会是有用的。例如，可以在用来鉴定候选抗原结合化合物的筛选方法的背景下，或者在其中将抗原结合化合物选择并制造为适合人类(例如在抗体的情况下制成嵌合抗体或人源化抗体)的方法中评价活性，其中已经获得表达抗原结合化合物的细胞(例如表达重组抗原结合化合物的宿主细胞)，并且评价它产生功能抗体(或其他化合物)的能力，和/或其中已经产生一些抗原结合化合物，并且要评价其活性(例如至测试批次或大量产品)。通常将已知抗原结合化合物特异性结合MICA多肽。该步骤可以涉及测试多个(例如使用高通量筛选方法的非常大量的或更小量的)抗原结合化合物。
可以通过包括本文的实验实施例中所述的那些的不同测定来确定可以进行CDC和ADCC的测试。典型地，测试ADCC涉及评价细胞介导的细胞毒性，其中由效应细胞(例如携带Fc受体的白细胞)识别具有结合的抗MICA抗体的MICA表达靶细胞(例如癌细胞或其他MICA表达细胞)，而不涉及补体。任选地可以使用不表达MICA抗原的细胞作为对照。通过测量细胞因子产生(例如IFN-γ产生)或细胞毒性标记物(例如CD107转移)中的增加来评价NK细胞的细胞毒性的激活。优选地，与对照抗体(例如不结合MICA的抗体、具有鼠恒定区的MICA抗体)相比，在靶细胞(例如MICA表达细胞)存在下，本发明的抗体将诱导至少20％、50％、80％、100％、200％或500％的细胞因子产生、细胞毒性标记物的表达、或靶细胞溶解中的增加。在另一个实例中，例如在铬释放测定中，检测到靶细胞溶解，优选地，本发明的抗体将诱导至少10％、20％、30％、40％或50％的靶细胞的溶解。
抗体CDR序列
抗体6E4
抗体6E4的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:7，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:8。融合进人类链恒定区(分别是重链和轻链)的抗体6E4的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别被列出为SEQ ID NO:9和10。在一个具体实施方式中，本发明提供了结合与单克隆抗体6E4基本上相同的表位或决定子的抗体，任选地该抗体包括抗体6E4的抗原结合区。在本文的任何实施方式中，抗体6E4可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括6E4的Fab或F(ab')2部分。还提供了包括6E4的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括6E4的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括6E4的可变轻链可变区，或6E4的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括抗体6E4的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是人类IgG1或IgG3同种型。
在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDR1区，该HCDR1区包括如在SEQ ID NO:11-13中列出的氨基酸序列SYYAMS、GFTFSY或GFTFSYYAMS，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO:14-15中列出的氨基酸序列TISRGGNYIYYTDSVKG或TISRGGNYIY，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列ISDYDGAWLAY，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR1区，该LCDR1区包括如在SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列RSSQSIIHTNGNTYLE，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:18列出的氨基酸序列KISNRFS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR3区，该LCDR3区包括如在SEQ ID NO:19中列出的氨基酸序列FQGSHVPWT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
(a)SEQ ID NO:7的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(b)SEQ ID NO:8的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(c)SEQ ID NO:7的重链可变区，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；以及SEQ ID NO:8的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(d)如SEQ ID NO:11至16中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(e)如SEQ ID NO:17、18和19中所示的轻链CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(f)如SEQ ID NO:11至16中所示的重链CDR1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID NO:17、18和19中所示的轻链CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(g)与具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的重链可变区，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(h)与具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的轻链可变区，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸。
在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上(a)至(h)的单克隆抗体竞争的抗体。
抗体20C6
抗体20C6的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:20，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:21。融合进重链恒定区(分别是重链和轻链)的抗体20C6的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别被列出为SEQ ID NO:22和23。在一个具体实施方式中，本发明提供了结合与单克隆抗体20C6基本上相同的表位或决定子的抗体，任选地该抗体包括抗体20C6的抗原结合区。在本文的任何实施方式中，抗体20C6可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括20C6的Fab或F(ab')2部分。还提供了包括20C6的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括20C6的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括20C6的可变轻链可变区，或20C6的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括抗体16A8的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是IgG1或IgG3同种型。
在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDR1区，该HCDR1区包括如在SEQ ID NO:24-26中列出的氨基酸序列TSGMGVG、GFSLSTSG或GFSLSTSGMGVG，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO:27-28中列出的氨基酸序列HIWWDDDKYYNPSLK或HIWWDDDK，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列RTQGYFDY，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR1区，该LCDR1区包括如在SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列RASQSISDYLH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:31列出的氨基酸序列YASQSIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR3区，该LCDR3区包括如在SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列QNGHSFPWT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸，或其中该序列可以包括一个或多个氨基酸的插入。
在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
(a)SEQ ID NO:20的重链可变区，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(b)SEQ ID NO:21的轻链可变区，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(c)SEQ ID NO:20的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个可以被取代为不同的氨基酸；以及SEQ ID NO:21的轻链可变区，其中一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(d)如SEQ ID NO:24-29中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(e)如SEQ ID NO:30、31和32中所示的轻链CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(f)如SEQ ID NO:24至29中所示的重链CDR1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID NO:30、31和32中所示的轻链CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(g)与具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(h)与具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸。
在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上(a)至(h)的单克隆抗体竞争的抗体。
抗体16A8
抗体16A8的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:33，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:34。融合进重链恒定区(分别是重链和轻链)的抗体16A8的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别被列出为SEQ ID NO:35和36。在一个具体实施方式中，本发明提供了结合与单克隆抗体16A8基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体16A8的抗原结合区。在本文的任何实施方式中，抗体16A8可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括16A8的Fab或F(ab')2部分。还提供了包括16A8的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括16A8的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括16A8的可变轻链可变区，或16A8的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括抗体16A8的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是IgG1或IgG3同种型。
在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDR1区，该HCDR1区包括如在SEQ ID NO:37-39中列出的氨基酸序列RYAMS、GFTFSR或GFTFSRYAMS，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO:40-41中列出的氨基酸序列TIFSGGSYTYYPDSV或TIFSGGSY，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列PNWERTFDY，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR1区，该LCDR1区包括如在SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列KSSQSLLNSSNQKNYL，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:44列出的氨基酸序列FASTRES，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR3区，该LCDR3区包括如在SEQ ID NO:45中列出的氨基酸序列QQHYSTPPT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸，或其中该序列可以包括一个或多个氨基酸的插入。
在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
(a)SEQ ID NO:33的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(b)SEQ ID NO:34的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(c)SEQ ID NO:33的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个可以被取代为不同的氨基酸；以及SEQ ID NO:34的轻链可变区，其中一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(d)如SEQ ID NO:37-42中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(e)如SEQ ID NO:43、44和45中所示的轻链CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(f)如SEQ ID NO:37-42中所示的重链CDR1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID NO:43、44和45中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(g)与具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(h)与具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸。
在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的CDR1、2和3中的任一个可以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上(a)至(h)的单克隆抗体竞争的抗体。
抗体19E9
抗体19E9的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:46，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:47。
在一个具体实施方式中，本发明提供了结合与单克隆抗体19E9基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体19E9的抗原结合区。在本文的任何实施方式中，抗体19E9可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括19E9的Fab或F(ab')2部分。还提供了包括19E9的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括19E9的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括19E9的可变轻链可变区，或19E9的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括抗体19E9的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是人类IgG1或IgG3同种型。
在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDR1区，该HCDR1区包括如在SEQ ID NO:48-50中列出的氨基酸序列SDYAWN、GYSITSD或GYSITSDYAWN，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO:51-52中列出的氨基酸序列FVSYSGTTKYNPSLKS或FVSYSGTTK，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO:53中列出的氨基酸序列GYGFDY，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR1区，该LCDR1区包括如在SEQ IDNO:54中列出的氨基酸序列SATSSISSIYFH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:55列出的氨基酸序列RTSNLAS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR3区，该LCDR3区包括如在SEQ ID NO:56中列出的氨基酸序列QQGTTIPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
(a)SEQ ID NO:46的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(b)SEQ ID NO:47的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(c)如SEQ ID NO:48-53中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(d)如SEQ ID NOS:54、55和56中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(e)如SEQ ID NO:48-53中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID NO:54、55和56中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(f)与具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(g)与具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸。
在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上(a)至(g)的单克隆抗体竞争的抗体。
抗体9C10
抗体9C10的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:57，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:58。在一个具体实施方式中，本发明提供了结合与单克隆抗体9C10基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体9C10的抗原结合区。在本文的任何实施方式中，抗体9C10可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括9C10的Fab或F(ab')2部分。还提供了包括9C10的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括9C10的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括9C10的可变轻链可变区，或9C10的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括抗体9C10的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是人类IgG1或IgG3同种型。
在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDR1区，该HCDR1区包括如在SEQ ID NO:59-61中列出的氨基酸序列RYWMN、GYSFTR或GYSFTRYWMN，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO:62-63中列出的氨基酸序列MIHPSDSETRLNQKFKD或MIHPSDSETR，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO:64中列出的氨基酸序列GNFFYVMDY，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR1区，该LCDR1区包括如在SEQ ID NO:65中列出的氨基酸序列RASQSIGTSIH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:66列出的氨基酸序列ASESISG，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR3区，该LCDR3区包括如在SEQ ID NO:67中列出的氨基酸序列QQSNFWPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
(a)SEQ ID NO:67的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(b)SEQ ID NO:68的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(c)如SEQ ID NO:59-64中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(d)如SEQ ID NOS:65、66和67中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(e)如SEQ ID NO:59-64中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID NO:65、66和67中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(f)与具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(g)与具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸。
在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的CDR1、2和3中的任一个可以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上(a)至(g)的单克隆抗体竞争的抗体。
抗体12A10
抗体12A10的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:68，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:69。在一个具体实施方式中，本发明提供了结合与单克隆抗体12A10基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体12A10的抗原结合区。在本文的任何实施方式中，抗体12A10可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括12A10的Fab或F(ab')2部分。还提供了包括12A10的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括12A10的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括12A10的可变轻链可变区，或12A10的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括抗体12A10的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是人类IgG1或IgG3同种型。
在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDR1区，该HCDR1区包括如在SEQ ID NO:70-72中列出的氨基酸序列NYWMN、GYSFTN或GYSFTNYWMN，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO:73-74中列出的氨基酸序列MIHPSDSETRLNQKFKD或MIHPSDSETR，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO:75中列出的氨基酸序列DDFFTMDY，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR1区，该LCDR1区包括如在SEQ ID NO:76中列出的氨基酸序列RASQNIVTSIH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:77列出的氨基酸序列YASESIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR3区，该LCDR3区包括如在SEQ ID NO:78中列出的氨基酸序列QQSNIWPLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
(a)SEQ ID NO:68的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(b)SEQ ID NO:69的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(c)如SEQ ID NO:70-75中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(d)如SEQ ID NOS:76、77和78中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(e)如SEQ ID NO:70-75中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID NO:76、77和78中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(f)与具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(g)与具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸。
在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上(a)至(g)的单克隆抗体竞争的抗体。
抗体10A7
抗体10A7的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:79，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:80。在一个具体实施方式中，本发明提供了结合与单克隆抗体10A7基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体10A7的抗原结合区。在本文的任何实施方式中，抗体10A7可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括10A7的Fab或F(ab')2部分。还提供了包括10A7的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括10A7的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括10A7的可变轻链可变区，或10A7的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括抗体10A7的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是人类IgG1或IgG3同种型。
在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDR1区，该HCDR1区包括如在SEQ ID NO:81-83中列出的氨基酸序列TSGMGVG、GFSLSTSG或GFSLSTSGMGVG，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO:84-85中列出的氨基酸序列HIWWDDDRYYNPSLKS或HIWWDDDRY，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO:86中列出的氨基酸序列RLNGYFDY，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR1区，该LCDR1区包括如在SEQ ID NO:87中列出的氨基酸序列RASQSISDYLH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:88列出的氨基酸序列YASQSIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR3区，该LCDR3区包括如在SEQ ID NO:89中列出的氨基酸序列QNGHSFPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
(a)SEQ ID NO:79的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(b)SEQ ID NO:80的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(c)如SEQ ID NO:81-86中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(d)如SEQ ID NOS:87、88和89中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(e)如SEQ ID NO:81至86中所示的重链CDR1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID NO:87、88和89中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(f)与具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(g)与具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸。
在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上(a)至(g)的单克隆抗体竞争的抗体。
抗体18E8
抗体18E8的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:90，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:91。在一个具体实施方式中，本发明提供了结合与单克隆抗体18E8基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体18E8的抗原结合区。在本文的任何实施方式中，抗体18E8可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括18E8的Fab或F(ab')2部分。还提供了包括18E8的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括18E8的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括18E8的可变轻链可变区，或18E8的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括抗体18E8的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是人类IgG1或IgG3同种型。
在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDR1区，该HCDR1区包括如在SEQ ID NO:92-94中列出的氨基酸序列SDYSWH、GYSITSD或GYSITSDYSWH，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO:95-96中列出的氨基酸序列NIHYSGRINYNPSLRS或NIHYSGRIN，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO:97中列出的氨基酸序列RRTFGNFEDY，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR1区，该LCDR1区包括如在SEQ ID NO:98中列出的氨基酸序列RSSSSVNYMH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:99列出的氨基酸序列ATSTLAS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR3区，该LCDR3区包括如在SEQ ID NO:100中列出的氨基酸序列QQWSSNPLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
(a)SEQ ID NO:90的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(b)SEQ ID NO:91的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(c)如SEQ ID NO:92-97中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(d)如SEQ ID NOS:98、99和100中所示的轻链CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(e)如SEQ ID NO:92-97中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID NO:98、99和100中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(f)与具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(g)与具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸。
在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的CDR1、2和3中的任一个可以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上(a)至(g)的单克隆抗体竞争的抗体。
抗体10F3
抗体10F3的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:101，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:102。在一个具体实施方式中，本发明提供了结合与单克隆抗体10F3基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体10F3的抗原结合区。在本文的任何实施方式中，抗体10F3可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括10F3的Fab或F(ab')2部分。还提供了包括10F3的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括10F3的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括10F3的可变轻链可变区，或10F3的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括抗体10F3的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是人类IgG1或IgG3同种型。
在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDR1区，该HCDR1区包括如在SEQ ID NO:103-105中列出的氨基酸序列SYTMH、GYTFTS或GYTFTSYTMH，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO:106-107中列出的氨基酸序列YINPSSGYTEYNQKFKD或YINPSSGYTE，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO:108中列出的氨基酸序列GGDWDVDWFVY，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR1区，该LCDR1区包括如在SEQ ID NO:109中列出的氨基酸序列SASSSISYMH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:110列出的氨基酸序列STSKLAS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR3区，该LCDR3区包括如在SEQ ID NO:111中列出的氨基酸序列QHRSTYPFT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
(a)SEQ ID NO:101的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(b)SEQ ID NO:102的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(c)如SEQ ID NO:103-108中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(d)如SEQ ID NOS:109、110和111中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(e)如SEQ ID NO:103-108中所示的重链CDR1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID NO:109、110和111中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(f)与具有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(g)与具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸。
在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的CDR1、2和3中的任一个可以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上(a)至(g)的单克隆抗体竞争的抗体。
抗体15F9
抗体15F9的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:112，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:113。在一个具体实施方式中，本发明提供了结合与单克隆抗体15F9基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体15F9的抗原结合区。在本文的任何实施方式中，抗体15F9可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括15F9的Fab或F(ab')2部分。还提供了包括15F9的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括15F9的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括15F9的可变轻链可变区，或15F9的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括抗体15F9的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是人类IgG1或IgG3同种型。
在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDR1区，该HCDR1区包括如在SEQ ID NO:114-116中列出的氨基酸序列SGYSWH、GYSITSG或GYSITSGYSWH，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO:117-118中列出的氨基酸序列FIHYSGSTDYNPSLKS或FIHYSGSTD，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO:119中列出的氨基酸序列DYGHWYFDV，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR1区，该LCDR1区包括如在SEQ ID NO:120中列出的氨基酸序列KASQSVSYDVA，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:121列出的氨基酸序列YASNRYT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR3区，该LCDR3区包括如在SEQ ID NO:122中列出的氨基酸序列QQDYSSLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
(a)SEQ ID NO:112的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(b)SEQ ID NO:113的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(c)如SEQ ID NO:114-119中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(d)如SEQ ID NOS:120、121和122中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(e)如SEQ ID NO:114-119中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID NO:120、121和122中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(f)与具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(g)与具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸。
在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上(a)至(g)的单克隆抗体竞争的抗体。
抗体14B4
抗体14B4的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:123，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:124。在一个具体实施方式中，本发明提供了结合与单克隆抗体14B4基本上相同的表位或决定子的抗体；任选地该抗体包括抗体14B4的抗原结合区。在本文的任何实施方式中，抗体14B4可以特征在于它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列。在一个优选实施方式中，该单克隆抗体包括14B4的Fab或F(ab')2部分。还提供了包括14B4的重链可变区的单克隆抗体。根据一个实施方式，该单克隆抗体包括14B4的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体进一步包括14B4的可变轻链可变区，或14B4的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个可以包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。任选地，提供的是：其中轻链可变区和/或重链可变区中的任一个包括抗体14B4的抗原结合区的一部分或全部的抗体被融合进人类IgG型的免疫球蛋白恒定区，任选地是人类恒定区，任选地是人类IgG1或IgG3同种型。
在另一个方面，本发明提供了编码抗体的纯化的多肽，其中该抗体包括：HCDR1区，该HCDR1区包括如在SEQ ID NO:125-127中列出的氨基酸序列SYWMN、GYSFTS或GYSFTSYWMN、或G，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR2区，该HCDR2区包括如在SEQ ID NO:128-129中列出的氨基酸序列MIHPSDSETRLNQKFKD或MIHPSDSETR，或它们的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；HCDR3区，该HCDR3区包括如在SEQ ID NO:130中列出的氨基酸序列EMGPYTLDY，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR1区，该LCDR1区包括如在SEQ ID NO:131中列出的氨基酸序列RASQNIDTSIH，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR2区，该LCDR2区包括如在SEQ ID NO:132列出的氨基酸序列YASESIS，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被取代为不同的氨基酸；LCDR3区，该LCDR3区包括如在SEQ ID NO:133中列出的氨基酸序列QQSNYWPLT，或它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，其中这些氨基酸中的一个或多个可以被缺失或取代为不同的氨基酸。
在另一个方面，本发明提供了结合人类MICA的抗体，该抗体包括：
(a)SEQ ID NO:123的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(b)SEQ ID NO:124的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(c)如SEQ ID NO:125-130中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(d)如SEQ ID NOS:131、132和133中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(e)如SEQ ID NO:125-130中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个或多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；以及如SEQ ID NO:131、132和133中所示的轻链CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中CDR中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(f)与具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的重链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸；和/或
(g)与具有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的可变区至少60％、70％、80％、85％、90％或95％相同的轻链可变区，其中一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被取代为不同的氨基酸。
在本文的任何实施方式的另一个方面，重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个可以特征在于它的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的序列，和/或特征为具有与对应SEQ ID NO中列出的具体CDR或CDR组共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了对于MICA结合，与以上(a)至(g)的单克隆抗体竞争的抗体。
在本发明的任何抗体，例如6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4中，指定的可变区和CDR序列可以包括保守性序列修饰(1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个序列修饰)。保守性序列修饰是指并不显著影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守性修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰引入本发明的抗体中。典型地，保守性氨基酸取代是其中氨基酸残基被替换为具有侧链的氨基酸残基，该侧链具有类似的理化特性。指定的可变区和CDR序列可以包括一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或取代。当做出取代时，优选的取代将是保守性修饰。在本领域已经限定了具有类似侧链的氨基酸残基的多个家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)，β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以使用在此所述的测定来测试改变的抗体的保留功能(即在此列出的特性)。
当在两个或更多个多肽的序列之间的关系中使用时，术语“同一性”或“同一的”是指多个多肽之间序列相关性的程度，如通过两个或更多个氨基酸残基的链之间的匹配数进行确定。“同一性”测量了具有通过具体的数学模型或计算机程序(即“算法”)解决的间隙配准(如果有的话)的两个或更多个序列中的更小的序列之间的同一性匹配的百分数。可以通过已知方法容易地计算相关多肽的同一性。相关方法包括但不局限于，在以下文献中描述的那些：Computational Molecular Biology(计算分子生物学)，Lesk(莱斯克)，A.M.，编辑，Oxford University Press(牛津大学出版社)，纽约，1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(生物计算：信息学和基因组工程)，Smith(史密斯)，D.W.，编辑，Academic Press(学术出版社)，纽约，1993；Computer Analysis of Sequence Data(序列数据的计算机分析)，部分1，Griffin(格里芬)，A.M.，和Griffin(格里芬)，H.G.，编辑，Humana Press(人类出版社)，新泽西州，1994；Sequence Analysis in MolecularBiology(分子生物学中的序列分析)，von Heinje(冯海因切)，G.，AcademicPress(学术出版社)，1987；Sequence Analysis Primer(序列分析引物)，Gribskov(哥博斯科夫)，M.和Devereux(德弗罗.)，J.，编辑，M.Stockton Press(M.斯托克顿出版社)，纽约，1991；以及Carillo(卡里罗)等人，SIAM J.Applied Math.(工业与应用数学学会应用数学杂志)48,1073(1988)。
优选的用于确定同一性的方法被设计为给出所测试序列之间的最大匹配。确定同一性的方法描述于公开可获得的计算机程序中。优选的用于确定两个序列之间同一性的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux(德弗罗)等人，Nucl.Acid.Res.(核酸研究)12,387(1984)；Genetics Computer Group(遗传学计算机组)，University of Wisconsin(威斯康星州大学)，Madison(麦迪逊)，威斯康星州)，BLASTP，BLASTN，以及FASTA(Altschul(阿特休尔)等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)215,403-410(1990))。BLASTX程序是从生物技术信息国家中心(NCBI)和其他来源(BLAST手册，Altschul(阿特休尔)等人，NCB/NLM/NIH Bethesda(贝塞斯达)，马里兰州20894；阿特休尔等人，同上)公开可获得的。还可以使用熟知的史密斯-沃特曼算法确定同一性。
根据AbM(Oxford Molecular's AbM antibody modelling software definition(牛津分子AbM抗体建模软件定义))，Kabat and Chothia definitions systems(卡巴特和乔西亚定义体系)，CDR的序列已经概述于下表A中。虽然可以使用任何适合的编号体系来指定CDR区，但在任何其他指示不存在的情况下，在此使用的编号是Abm。已经使用以下指示建立了这样的编号：CDR-L1：起始：大约残基24，残基前：总是Cys，残基后：总是Trp(典型地为Trp-Tyr-Gln，而且为Trp-Leu-Gln，Trp-Phe-Gln，Trp-Tyr-Leu)，长度：10至17个残基；CDR-L2：起始：在L1的末端之后总是16个残基，残基前：通常为Ile-Tyr(并且还有Val-Tyr、Ile-Lys、Ile-Phe)，长度：总是7个残基；CDR-L3，起始：在L2的末端之后总是33个残基，残基前：总是Cys，残基后：总是Phe-Gly-Xaa-Gly，长度：7至11个残基；CDR-H1，起始：大约残基26(总是在Cys之后4个)(乔西亚/AbM定义，卡巴特定义开始于5个残基之后)，残基前：总是Cys-Xaa-Xaa-Xaa，残基后：总是Trp(典型地为Trp-Val，并且还有Trp-Ile，Trp-Ala)，长度：10至12个残基(AbM定义，乔西亚定义排除最后4个残基)；CDR-H2，起始：在CDR-H1的卡巴特/AbM定义的末端之后总是15残基，残基前：典型地为Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(但有多个变化，在Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala之后的残基)，长度：卡巴特定义16至19个残基；AbM(和乔西亚)定义在7个残基前终止；CDR-H3，起始：在CDR-H2末端之后总是33残基(在Cys之后总是2个)，残基前：总是Cys-Xaa-Xaa(典型地为Cys-Ala-Arg)，残基后：总是Trp-Gly-Xaa-Gly，长度3至25个残基。
根据本发明的抗体可变链的序列列于下表B中，前导子序列在每个序列的开始处加有下划线(任何抗体链可以被指定为在紧随于前导子序列末端之后的氨基酸位置处起始)，并且每个CDR加有下划线。在此处的任何实施方式中，VL或VH序列可以被指定或编号从而使得包含或缺乏信号肽或其任何部分。
在一个实施方式中，本发明的抗体具有人类IgG1或IgG3同种型。在一个实施方式中，本发明的抗体是保持其结合和/或功能特性的抗体片段。
表A
表B
在本发明的实施方式的任一个的一方面中，本发明的任何抗体可以包括具有根据选自式(I)至(VIII)的各自式的CDR 1、2和/或3序列的重链和/或轻链。在此处的任何实施方式中，具体的HCDR1-3或LCDR-1-3可以被指定为具有式(I)至(VIII)的序列。在一个优选实施方式中，抗体包括含有三个LCDR的轻链以及含有三个HCDR的重链。
在一个实施方式中，HCDR1包括具有式(I)的氨基酸序列：
G-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5(SEQ ID NO:261)，
其中Xaa1可以是Phe或Tyr，Xaa2可以是Thr或Ser，Xaa3可以是Ile、Leu或Phe，Xaa4可以是Ser或Thr，并且Xaa5可以是Asn、Tyr、Ser、Thr或Arg。可任选地所述Xaa1-5的任何1、2或3可以是指示的氨基酸的任一个的保守或非保守性取代，或缺失或插入。
在一个实施方式中，HCDR1包括具有式(II)的氨基酸序列：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5(SEQ ID NO:262)，
其中Xaa1可以是Asn、Ser、Thr或Arg，Xaa2可以是Gly、Asp、Ser或Tyr，Xaa3可以是Thr、Tyr、Ala、Gly、Trp，Xaa4可以是Ser、Ala或Met，并且Xaa5可以是His、Trp、Gln、Ser或Asn。可任选地所述Xaa1-5的任何1、2或3可以是指示的氨基酸的任一个的保守或非保守性取代，或缺失或插入。
在一个实施方式中，HCDR1包括具有式(III)的氨基酸序列：
Xaa1-Y-Xaa2-M-Xaa3(SEQ ID NO:263)，
其中Xaa1-3可以各自是指示的氨基酸的任一个的保守性或非保守性取代，或缺失或插入，其中Xaa1可以是Asn、Ser、Thr或Arg，Xaa2可以是Thr、Tyr、Ala、Gly、Trp，并且Xaa3可以是His、Trp、Gln、Ser或Asn。
在一个实施方式中，HCDR2包括具有式(IV)的氨基酸序列：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10(SEQ ID NO:264)，
其中Xaa1可以是Phe、Thr、His、Asn、Tyr或Met，Xaa2可以是Val或Ile，Xaa3可以是Ser、Phe、His、Asn或Trp，Xaa4可以是Arg、Tyr、Ser、Trp或Pro，Xaa5可以是Gly、Asp或Ser，Xaa6可以是Thr、Gly、Asp或Ser，Xaa7可以是Asn、Thr、Ser、Asp、Arg或Gly，Xaa8可以是Tyr、Lys、Glu、Arg、Ile或Thr，Xaa9可以是Ile、Thr、Tyr、Asn或Asp，并且Xaa10可以是Tyr、Arg或Glu。可任选地所述Xaa1-10的任何1、2、3或4可以是指示的氨基酸的任一个的保守或非保守性取代，或缺失或插入。
在一个实施方式中，HCDR3包括具有式(V)的氨基酸序列：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9(SEQ ID NO:265)，
其中Xaa1可以是Ile、Pro、Arg、Gly、Asp或Glu，Xaa2可以是Ser、Tyr、Thr、Asn、Asp、Leu、Arg、Glu或Met，Xaa3可以是Asp、Glu、Trp、Gln、Phe、Asn或Thr，Xaa4可以是Tyr、Glu、Gly、Phe、Trp、His或Pro，Xaa5可以是Asp、Arg、Tyr、Thr、Gly或Trp，Xaa6可以是Gly、Tyr、Thr、Phe、Val、Met或Asn，Xaa7可以是Ala、Phe、Asp、Met或Leu，Xaa8可以是Trp、Tyr、Asp或Glu，并且Xaa9可以是Leu、Tyr、Asp、Phe或Val。可任选地所述Xaa1-9的任何1、2、3或4可以是指示的氨基酸的任一个的保守或非保守性取代，或缺失或插入。
在一个实施方式中，LCDR1包括具有式(VI)的氨基酸序列：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11(SEQ ID NO:266)，
其中Xaa1可以是Ser、Lys或Arg，Xaa2可以是Ser或Ala，Xaa3可以是Thr或Ser，Xaa4可以是Ser或Gln，Xaa5可以是Asn或Ser，Xaa6可以是Val、Leu或Ile，Xaa7可以是Asp、Asn、Val、Leu、Gly或Ser，Xaa8可以是Tyr、Ser、Asn、Thr或Asp，Xaa9可以是Asp、Met、Ile、Ser或Tyr，Xaa10可以是Val、His、Tyr、Ser、Ile、或Leu，并且Xaa11可以是Ala、Phe、Asn或His。可任选地所述Xaa1-11的任何1、2、3或4可以是指示的氨基酸的任一个的保守或非保守性取代，或缺失或插入。
在一个实施方式中，LCDR2包括具有式(VII)的氨基酸序列：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7(SEQ ID NO:267)，
其中Xaa1可以是Ser、Lys、Arg、Phe、Tyr或Ala，Xaa2可以是Ile、Thr、Ala或Ser，Xaa3可以是Ser或Glu，Xaa4可以是Lys、Glu、Asn、Thr、Gln或Ser，Xaa5可以是Leu、Arg、Ser或Ile，Xaa6可以是Tyr、Phe、Ala、Glu、Ile或Ser，并且Xaa7可以是Thr、Ser或Gly。可任选地所述Xaa1-7的任何1、2、3或4可以是指示的氨基酸的任一个的保守或非保守性取代，或缺失或插入。
在一个实施方式中，LCDR3包括具有式(VIII)的氨基酸序列：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9(SEQ ID NO:268)，
其中Xaa1可以是Phe或Gln，Xaa2可以是His、Asn或Gln，Xaa3可以是Ser、Gly、His、Trp或Arg，Xaa4可以是Asn、His、Tyr、Thr或Ser，Xaa5可以是Phe、Ser、Thr、His、Ile或Tyr，Xaa6可以是Trp、Phe、Thr、Ile、Val、Asn或Try，Xaa7是Pro，Xaa8可以是Phe、Trp、Pro或Leu，并且Xaa9是Thr。可任选地所述Xaa1-9的任何1、2、3或4可以是指示的氨基酸的任一个的保守或非保守性取代，或缺失或插入。
在一个实施方式中，本发明的抗体可以包括轻链，该轻链包括：
a包含SEQ ID NO:266的氨基酸序列的轻链CDR1(LCDR1)；和/或
b包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列的轻链CDR2(LCDR2)；和/或
c包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列的轻链CDR3(LCDR3)。
在一个实施方式中，本发明的抗体可以包括重链，该重链包括：
d包含选自SEQ ID NO:261、262和263的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)；和/或
e包含SEQ ID NO:264的氨基酸序列的重链CDR2(HCDR2)；和/或
f包含SEQ ID NO:265的氨基酸序列的重链CDR3(HCDR3)。
片段及衍生物
本发明的抗体的片段和衍生物(被如在本说明书中使用的术语“抗体(antibody或antibodies)”涵盖，除非另外指明或与上下文明显冲突)，优选地可以通过本领域中已知的技术产生6E4、20C6、16A8、9C10、19E9、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9或14B4-样抗体。“片段”包括完整抗体的一部分，通常包括抗原结合位点或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、以及Fv片段；双功能抗体；为具有以下初级结构的多肽的任何抗体片段(在此称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，该初级结构由一个不间断的连续氨基酸残基序列组成，包括但不限于(1)单链Fv分子，(2)包含仅一个轻链可变结构域的单链多肽，或其包含轻链可变结构域的三个CDR的片段，而不含关联的重链部分，以及(3)包含仅一个重链可变区的单链多肽，或其包含重链可变区的三个CDR的片段，而不含关联的轻链部分；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。除此之外还包括纳米抗体、域抗体、单域抗体或“dAb”。
可以使用标准方法获得在此的抗体的片段。例如，可以根据常规技术，通过分离的抗体的蛋白酶降解来产生Fab或F(ab')2片段。将理解的是免疫反应片段可以使用已知的方法来修饰，例如用以减慢体内清除率并且获得更希望的药代动力学曲线，片段可以用聚乙二醇(PEG)来修饰。
可选地，产生本发明的抗体的杂交瘤的DNA可以被修饰而使其编码本发明的片段。修饰的DNA进而插入表达载体中，并且用于转化或转染适当的细胞，然后该细胞表达所希望的片段。
在某些实施方式中，产生本发明的抗体的杂交瘤的DNA可以在插入表达载体中之前被修饰，例如，通过用人类重-和轻-链恒定结构域编码序列取代同源非人类序列，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价地连接至免疫球蛋白编码序列。以此方式，“嵌合”或“杂合”抗体被制备为具有原始抗体的结合特异性。典型地，此类非免疫球蛋白多肽被取代为本发明的抗体的恒定结构域。
因此，根据另一个实施方式，本发明的抗体被人源化。根据本发明的抗体的“人源化”形式是特定的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2，或抗体的其他抗原结合子序列)，包含衍生自鼠类免疫球蛋白的最小序列。对于大多数部分，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自原始抗体(供体抗体)的CDR的残基取代，而同时保留原始抗体的所希望的特异性、亲和力以及能力。
在一些例子中，人类免疫球蛋白的Fv框架残基可以被相应的非人类残基取代。另外，人源化抗体可以包括没有在受体抗体或导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰被制成为进一步精炼和优化抗体性能。大体上，人源化抗体将基本上包括至少一个、并且典型地为两个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部CDR区对应于原始抗体的那些，并且全部或基本上全部FR区是人类免疫球蛋白一致序列的那些。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Fc)，典型地为人类免疫球蛋白的至少一部分。对于更多的细节，参见Jones(琼斯)等人，Nature(自然)，321,522页(1986)；Reichmann(赖克曼)等人，自然，332,323页(1988)；Presta(普雷斯塔)，Curr.Op.Struct.Biol.(当前结构生物学观点)，2,593页(1992)；Verhoeyen(费尔海恩)科学，239,1534页；以及美国专利号4,816,567，将其全部公开内容通过引用结合于此。
用于制造人源化抗体的人类可变结构域(不论是轻还是重)的选择对于降低抗原性是非常重要的。根据所谓的“最佳匹配(best-fit)”方法，本发明的抗体的可变结构域的序列被针对已知的人类可变结构域序列的整个文库来筛选。然后最接近小鼠序列的人类序列被接受作为人源化抗体的人类框架(FR)(Sims(西姆斯)等人，J.Immunol.(免疫学杂志)151,2296页(1993)；Chothia(乔西亚)和Lesk(莱斯克)，J.Mol.(分子学杂志)196,1987,901页)。另外的方法使用来自轻或重链的特定亚组的全人类抗体的一致序列的特定框架。相同的框架可以用于若干不同的人源化抗体(Carter(卡特)等人，PNAS 89,4285页(1992)；Presta(普雷斯塔)等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，151,2623页(1993))。
另外重要的是抗体被人源化同时保留对MICA受体的高度亲和力以及其他有利的生物特性。为了实现这个目标，根据优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型对亲本序列以及不同的概念人源化产物进行分析的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型一般是可获得的，并且对于本领域的技术人员而言是熟悉的。计算机程序是可获得的，阐述和展示了所选择的候选免疫球蛋白序列的可信的三维结构。这些展示的检查允许对残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用进行分析，即对影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基进行分析。以此方式，可以从一致序列和导入序列选择和合并FR残基，从而实现所希望的抗体特征，例如对一种或多种靶标抗原增加的亲和力。大体上，CDR残基直接地并且大多数基本上涉及影响抗原结合。
制造“人源化”单克隆抗体的另一个方法是使用转基因鼠(XenoMouse)(安根尼克斯(Abgenix)，菲蒙市(Fremont)，加利福尼亚州)作为用于免疫的小鼠。转基因鼠是根据本发明的的鼠类宿主，它的免疫球蛋白基因已经被功能人类免疫球蛋白基因替代。因此，由这种小鼠或在从这种小鼠的B细胞制得的杂交瘤中产生的抗体已经被人源化。转基因鼠描述于美国专利号6,162,963中，将其通过引用以其全文结合于此。
还可以根据不同的用于免疫的其他技术，例如通过使用已经被工程化为表达人类抗体谱系的其他转基因动物(Jakobovitz(雅各博维茨)等人，自然362(1993)255)或通过使用噬菌体展示方法选择抗体谱系来产生人类抗体。此类技术对于技术人员而言是已知的，并且可以通过从单克隆抗体起始来实施，如在本申请中披露的。
本发明的抗体还可以衍生化为“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中一个或多个重/轻链的一部分与原始抗体中的相应序列一致或同源，而该链或这些链的其余部分与衍生自其他物种或属于其他抗体类别或子类的抗体中连同此类抗体片段的相应序列一致或同源，只要它们展现希望的生物活性和结合特异性(Cabilly(卡比利)等人，同上；Morrison(莫里森)等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国科学院院刊)，6851页(1984))。
本发明提供了被引导并且在一些实施方式中被内化进细胞内的抗-MICA抗体分子。它们能够将治疗剂或可检测剂递送至或递送进表达MICA的细胞中，但不是递送至或递送进不表达MICA多肽的细胞中。因此，本发明还提供了包含如在此所述的抗MICA抗体的抗MICA免疫轭合物，该抗体轭合至治疗剂或可检测剂(或充当有待被递送至表达MICA的细胞中的感兴趣的有效载荷的任何其他部分)。在实施方式中，抗MICA抗体免疫轭合物对MICA的亲和力是未轭合抗体对于MICA的亲和力的至少10％、25％、50％、75％、80％、90％、或95％。这可以使用细胞表面MICA或分离的MICA来确定。
其中本发明的抗体或抗体部分可以被衍生化(或标记)的有用的可检测剂包括荧光化合物、各种酶、辅基、发光材料、生物发光材料、荧光发射金属原子(例如铕(Eu)以及其他镧系元素)、以及放射性材料(上文所述)。示例性荧光可检测剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-l-萘磺酰基氯化物、藻红蛋白以及类似物。抗体还可以用可检测的酶衍生化，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡糖氧化酶以及类似物。在抗体用可检测酶来衍生化时，通过添加另外的试剂来对其检测，其中该酶使用这些另外的试剂来产生可检测反应产物。例如，当可检测剂辣根过氧化物酶存在时，过氧化氢和二氨基联苯胺的添加导致可检测的发色的反应产物。还可以用辅基(例如，链霉亲和素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素)来衍生化抗体。例如，抗体可以用生物素来衍生化，并且通过抗生物素蛋白或链霉亲和素结合的间接测量来检测。适合的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；并且生物发光材料的实例包括荧光素酶、虫荧光素以及水母发光蛋白。可选地，抗MICA抗体可以与结合至抗-MICA抗体的第二抗体相关联，其中该第二抗体是用可检测标记来衍生化；体外或体内结合与抗-MICA抗体接触的所述第二抗体将允许抗-MICA充当标记抗体。
除此之外，当本发明的抗体用于诊断目的时，与可检测部分的轭合是有用的。此类目的包括但不限于对于存在表达MICA的细胞的情况下测定生物样品，例如血液样品或组织活检，以及检测个体中表达MICA的细胞的存在、水平、或活性。此类测定和检测方法可以用于本发明的诊断/治疗方法中，例如涉及检测患者的细胞中的MICA表达、并且如果患者细胞被确定为表达MICA，随后给予本发明的MICA调节抗体。
在某些实施方式中，在此的抗体用于纯化来自生物样品的表达MICA的细胞。可以从患者获得生物样品，例如用于诊断或离体治疗目的，或从个体或非人类灵长类获得，从而获得用于研究目的的此类细胞的来源。
在这样的一个实施方式中，本发明的标记抗体可以用于FACS分选中，以从生物样品纯化或分离表达MICA的细胞。可选地，在一些实施方式中，本发明的抗体轭合至固体支持物可以用作从生物样品(例如，来自个体的血液样品、或来自组织活检的细胞)中对细胞表面具有MICA受体的细胞进行亲和纯化的手段。这种纯化的方法是本发明的另一个替代实施方式，按原样是所得的细胞的纯化群体。
不论用来分离或纯化表达MICA的细胞的方法如何，如此做的能力用于很多目的，例如用以通过评估表达MICA的细胞的数目或活性来诊断与MICA关联的失调，例如在给予如在此所述的抗-MICA抗体之前。另外，纯化的表达MICA的细胞在研究背景中是有用的，例如，用以更好地表征细胞以及它们不同的特性和行为，并且用以鉴别可以用于调节它们行为、活性、存活或增殖的化合物或方法。
修饰的恒定区
鉴于本发明的抗MICA抗体诱导ADCC和CDC的能力，本发明的抗体还可以制成为具有增加它们结合Fc受体的能力的修饰，这些修饰可以影响效应子功能例如抗体依赖性细胞毒性、肥大细胞脱颗粒作用、以及吞噬作用，连同免疫调节信号(例如，淋巴细胞增殖和抗体分泌的调节)。典型的修饰包括修饰的人类IgG1恒定区，该恒定区包括至少一个氨基酸修饰(例如，取代、缺失、插入)和/或改变的糖基化类型(例如，低岩藻糖基化)。此类修饰可以影响与Fc受体的相互作用。FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、以及FcγRIII(CD 16)。FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)和FcγRIII(CD 16)是激活型(即，免疫系统增强型)受体，而FcγRIIB(CD32B)是抑制型(即免疫系统抑制型)受体。修饰可以例如增加Fc结构域与效应子(例如，NK)细胞上的FcγRIIIa的结合。
抗-MICA抗体优选包括人类IgG1或IgG3同种型的Fc结构域(或其部分)，可任选地被修饰的。人类IgG1Fc区(GenBank登录号：J00228)的位置230至447序列的氨基酸序列显示如下：
PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:134)；
残基230-341(卡巴特EU)是Fc CH2区。残基342-447(卡巴特EU)是FcCH3区。抗MICA抗体可以包括在一个或多个部分中具有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代、缺失、插入)的变体Fc区，这些修饰增加变体Fc区对FcγR(包括激活和抑制型FcγR)的亲和力和活动性。在一些实施方式中，所述一个或多个氨基酸修饰增加了变体Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲和力。在另一个实施方式中，与可比亲本抗体的Fc区相比，变体Fc区进一步以更低的亲和力特异性地结合FcγRIIB(即，具有与本发明抗体的氨基酸序列相同的氨基酸序列的抗体，除了在Fc区有一个或多个氨基酸修饰)。例如，在位置310和435处的组氨酸残基的一个或两个可以是经取代的，例如被赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代(参见，例如PCT公开号WO 2007/080277)；此类取代的恒定区提供了对抑制型FcγRIIB降低的结合，而不会降低对激活型FcγRIIIA的结合。在一些实施方式中，此类修饰增加了变体Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲和力，并且相对于亲本抗体还增强了变体Fc区对FcγyRIIB的亲和力。在其他实施方式中，所述一个或多个氨基酸修饰增加了变体Fc区对FcγRIIIA和/或FcγRIIA的亲和力，但相对于亲本抗体的Fc区不会改变变体Fc区对FcγRIIB的亲和力。在另一个实施方式中，所述一个或多个氨基酸修饰增强了变体Fc区对FcγRIIIA和FcγRIIA的亲和力，但相对于亲本抗体降低了对FcγRIIB的亲和力。当亲本分子(没有经修饰的Fc区)的结合活性不能在细胞中被检测到时，增加的亲和力和/或活动力导致可检测的与表达低水平FcγR的细胞中FcγR的结合或这些细胞中的FcγR-相关活性。
在一个实施方式中，对Fc区的氨基酸的所述一个或多个修饰降低了抗体对一种或多种FcγR受体的亲和力和活动性。在一个具体实施方式中，本发明涵盖了包含变体Fc区的抗体，其中所述变体Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，所述变体Fc区仅结合一个FcγR，其中所述FcγR是FcγRIIIA或FcγRIIA。
本发明的分子例如抗体对于FcγR的亲和力和结合特性可以使用本领域中已知的用于确定抗体-抗原或Fc-FcγR相互作用(例如，对应地，抗原与抗体的特异性结合，或Fc区与FcγR的特异性结合)的体外测定(基于生物化学或免疫学的测定)来确定，包括但不限于ELISA测定、表面等离子体共振测定、免疫沉淀测定。
在一些实施方式中，含有变体Fc区的本发明的分子在Fc区的CH3结构域中包括至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或更多个氨基酸修饰)。在其他实施方式中，含有变体Fc区的本发明的分子在Fc区的CH2结构域(被定义为从氨基酸231-341延伸)中包括至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或更多个氨基酸修饰)。在一些实施方式中，本发明的分子包括至少两个氨基酸修饰(例如，具有2、3、4、5、6、7、8、9、或更多个氨基酸修饰)，其中至少一个这种修饰是在CH3区中，并且至少一个这种修饰是在CH2区中。本发明进一步涵盖在铰链区中的氨基酸修饰。在具体实施方式中，本发明涵盖Fc区的CH1结构域(被定义为从氨基酸216-230延伸)中的氨基酸修饰。
可以制造Fc修饰的任何组合，例如披露于以下文献中的不同的修饰的任何组合:美国专利号US,7,632,497；7,521,542；7,425,619；7,416,727；7,371,826；7,355,008；7,335,742；7,332,581；7,183,387；7,122,637；6,821,505以及6,737,056；PCT公开号WO 2011/109400；WO 2008/105886；WO 2008/002933；WO2007/021841；WO 2007/106707；WO 06/088494；WO 05/115452；WO 05/110474；WO 04/1032269；WO 00/42072；WO 06/088494；WO 07/024249；WO 05/047327；WO 04/099249以及WO 04/06335；以及Presta(普雷斯塔)，L.G.等人(2002)Biochem.Soc.Trans.(生物化学学会会报)30(4):487-490；Shields(希尔兹)，R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.(生物化学杂志)26；277(30):26733-26740以及希尔兹，R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.(生物化学杂志)276(9):6591-6604。
本发明涵盖抗MICA抗体，这些抗体包含变体Fc区，其中相对于野生型Fc区而言，变体Fc区包含至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或更多个氨基酸修饰)，从而相对于包含野生型Fc区的分子而言该分子具有增强的效应子功能，可任选地其中变体Fc区包含在位置221、243、247、255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、308、309、310、311、312、316、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、370、373、376、378、392、396、399、402、404、416、419、421、430、434、435、437、438和/或439的任何一个或多个处的取代。
本发明涵盖抗MICA抗体，这些抗体包含变体Fc区，其中相对于野生型Fc区而言，该变体Fc区包含至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或更多个氨基酸修饰)，从而相对于包含野生型Fc区的分子而言，该分子具有增强的效应子功能，可任选地其中该变体Fc区包含在位置329、298、330、332、333和/或334的任何一个或多个处的取代(例如S239D、S298A、A330L、I332E、E333A和/或K334A取代)。
在一个实施方式中，具有变体或野生型Fc区的抗体可以具有增加抗体的Fc受体结合能力的改变的糖基化模式。此类碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机制的细胞已经描述于本领域中，并且可以用作表达本发明的重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体的宿主细胞。参见，例如希尔兹，R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.(生物化学杂志)277:26733-26740；Umana(乌马纳)等人(1999)Nat.Biotech.(自然生物技术)17:176-1，以及欧洲专利号EP 1,176,195；PCT公开案WO 06/133148；WO03/035835；WO 99/54342，将各自通过引用以其全文结合于此。
一般地，此类具有改变的糖基化的抗体是“糖-优化的”，从而使得抗体具有产生某些希望特性的特定的N-多糖结构，这些希望特性包括但不限于当与非修饰抗体或具有天然存在的恒定区的抗体相比时增强的ADCC以及效应子细胞受体结合活性，并且这些抗体由鼠类骨髓瘤NSO和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Chu(楚)和Robinson(罗宾逊)，Current Opinion Biotechnol.(当前生物技术观点)2001,12:180-7)产生(如在实施例部分在此产生的HEK293T表达的抗体)或由其他常用于产生重组治疗抗体的哺乳类宿主细胞系产生。
在哺乳类宿主细胞中产生的单克隆抗体在每个重链的Asn297处包含N-连接的糖基化位点。在抗体上的多糖典型地是复合双触角结构，具有非常低的或没有等分型N-乙酰葡糖胺(等分型GlcNAc)以及高水平的核心岩藻糖基化。多糖末端包含非常低的或不包含末端唾液酸以及可变量的半乳糖。对于糖基化对抗体功能的作用的评论，参见例如Wright(赖特)和Morrison(莫里森)，Trend Biotechnol.(生物技术趋势)15:26-31(1997)。大量工作显示对抗体多糖结构的糖组成的改变可以改变Fc效应子功能。贡献于抗体活性的重要的碳水化合物结构被认为是经由α-1,6连键附接至Fc区N-连接的寡糖的最内部的N-乙酰葡糖胺(GlacNAc)残基的岩藻糖残基(希尔兹等人，2002)。
FcγR结合需要在人类IgGl、IgG2或IgG3类型的Fc区中保守的Asn297处共价地附接的寡糖的存在。近来非岩藻糖基化寡糖结构已经与体外ADCC活性显著增加相关联。根据本发明的“Asn 297”意为位于Fc区的大约位置297处的氨基酸天冬酰胺；基于抗体的较小的序列变化，Asn297还可以位于上游或下游的一些氨基酸处(通常不多于+3个氨基酸)。
从先前来看，在CHO细胞中产生的抗体包含大约2％至6％的非岩藻糖基化的群体。YB2/0(大鼠骨髓瘤)和缺乏GDP-甘露糖4,6-脱水酶(导致α6-岩藻糖转移酶的底物GDP-岩藻糖或GDP糖中间体的缺乏)的Lecl3细胞系(CHO系的凝集素突变体)已经被报道产生具有78％至98％非岩藻糖基化种类的抗体。在其他实例中，RNA干扰(RNAi)或敲除技术可以用来工程化细胞，以降低FUT8mRNA转录水平或完全敲除基因表达，并且此类抗体已经被报道为包含高达70％的非岩藻糖基化多糖。
本发明包含结合至MICA的在Asn297处被糖链糖基化的抗体，所述抗体显示经由其Fc部分而与FcγRIII的增加的结合亲和力。在本发明的一个实施例中，抗体将包括在Fc区中含有至少一个氨基酸改变的恒定区，该改变改进抗体与FcyRIIIa和/或ADCC的结合。
在一方面，本发明的抗体在其恒定区中被低岩藻糖基化。此类抗体可以包含氨基酸改变或可以不包含氨基酸改变，但是在产生这种低岩藻糖基化的条件下得以产生或处理。在一个方面，本发明的抗体组合物包括在此所述的嵌合的人类或人源化抗体，其中在该组合物中的至少20％、30％、40％、50％、60％、75％、85％、90％、95％或基本上全部的抗体种类具有含核心碳水化合物结构(例如，复合的杂合的以及高甘露糖结构，缺乏岩藻糖)的恒定区。在一个实施方式中，提供了这样一种抗体组合物，该抗体组合物不具有包括含岩藻糖的核心碳水化合物结构的抗体。核心碳水化合物将优选是在Asn297处的糖链。
在一个实施方式中，本发明包括本发明的抗体组合物，例如包含结合至MICA的抗体的组合物在Asn297处被糖链糖基化，其中这些抗体是部分岩藻糖基化的。部分岩藻糖基化的抗体的特征在于：在组合物中，在Asn297处的糖链内缺乏岩藻糖的抗MICA抗体的比例是在20％与90％之间，优选在20％与80％之间，优选在20％与50％、55％、60％、70％或75％之间，在35％与50％、55％、60％、70％或75％之间，或在45％与50％、55％、60％、70％或75％之间。优选地，该抗体具有人类IgGl或IgG3类型。
糖链显示可以进一步显示任何特征(例如，复合的、杂合的以及高甘露糖结构的存在和比例)，包括附接至来自人类细胞的抗体的Asn297的N-连接的多糖的特征，或在啮齿类细胞、鼠类细胞(例如CHO细胞)或鸟类细胞中重组表达的抗体的Asn297的N-连接的多糖的特征。
在一个实施方式中，抗体表达于缺乏岩藻糖转移酶的细胞中，从而使得该细胞系产生在其核心碳水化合物中缺乏岩藻糖的蛋白质。例如，细胞系Ms704、Ms705、和Ms709缺乏岩藻糖转移酶基因FUT8(α(1,6)岩藻糖转移酶)，从而在Ms704、Ms705、以及Ms709细胞系中表达的抗体在其核心碳水化合物上缺乏岩藻糖。这些细胞系是使用两个置换载体通过CHO/DG44细胞中FUT8基因的靶向破坏而创造的(参见Yamane(山根)等人的美国专利公开号20040110704；以及Yamane-Ohnuki(山根-大贯)等人(2004)生物技术与生物工程87:614-22，将其公开内容通过引用结合于此)。其他实例已经包含反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA(hpRNA)干扰或包含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰的使用，以功能性地破坏FUT8基因。在一个实施方式中，抗体表达于具有功能性地被破坏的FUT8基因的细胞系中，该基因编码岩藻糖基转移酶，从而通过减少或清除α1,6键相关酶而使得在这种细胞系中表达的抗体展示低岩藻糖基化。
在一个实施方式中，抗体表达于被工程化为表达糖蛋白-修饰糖基转移酶(glycoprotem-modifying glycosyl transferase)(例如，β(l,4)-N-乙酰葡糖胺-转移酶III(GnTHI))的细胞系中，从而在工程化细胞系中表达的抗体展示出增加的等分型GlcNac结构，这导致抗体的增加的ADCC活性(乌马纳等人的PCT公开案WO99/54342；以及乌马纳等人(1999)Nat.Biotech.(自然生物技术)17:176-180，将其公开内容通过引用结合于此)。
在其他实施方式中，抗体得以表达，并且一个或多个岩藻糖基残基用岩藻糖苷酶来裂解。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶将岩藻糖基残基从抗体移除(Tarentino(塔伦蒂诺)等人(1975)生物化学14:5516-5523)。在其他实例中,产生抗体的细胞系可以用糖基化抑制剂处理；Zhou(周)等人，生物技术与生物工程99:652-665(2008)描述了将CHO细胞用α-甘露糖苷酶I抑制剂kifunensine进行处理，导致产生了具有非岩藻糖基化的寡甘露糖型N-葡聚糖的抗体。
在一个实施方式中，抗体表达于天然具有低的用于将岩藻糖基添加至与抗体Fc区结合的N-乙酰葡糖胺的酶活性的细胞系中，或不具有该酶活性的细胞系中，例如大鼠杂交瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。细胞系的其他实例包括变体CHO细胞系、Led3细胞，具有降低的将岩藻糖基附接至Asn(297)-连接的碳水化合物的能力，还导致表达于该宿主细胞中的抗体的低岩藻糖基化(WO 03/035835(Presta(普雷斯塔)等人)；以及希尔兹，RX.等人(2002)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277:26733-26740，将其公开内容通过引用结合于此)。在其他实施方式中，抗体表达于鸟类细胞中，优选细胞(Vivalis，法国)，该细胞天然地产生具有低岩藻糖含量的抗体，例如WO 2008/142124。低岩藻糖基化多糖还可以产生于植物来源的细胞系中，例如WO 07/084926A2(Biolex公司)、WO 08/006554(创绿生物技术(Greenovation Biotech GMBH))，将其公开内容通过引用结合于此。
在诊断和治疗中的使用
在某些实施方式中，在此的抗体用于纯化或鉴别来自生物样品的MICA阳性细胞。可以从患者获得生物样品，例如用于诊断或离体治疗目的，或从个体或非人类灵长类获得，从而获得用于研究目的的此类细胞的来源。
MICA阳性细胞可以使用在此的抗体用多种标准方法中的任一种来纯化或鉴别。例如，可以使用FACS扫描仪使用针对MICA以及可任选地典型存在于细胞上的其他细胞表面分子具有特异性的标记抗体来分选外周血细胞。
此外，本发明的抗体可以轭合或共价连接至固体支持物，并且用于从生物样品(例如，从来自患者或其他个体的血液样品或组织活检)纯化或鉴别MICA阳性细胞或任何表达MICA的细胞。确切地，在允许样品内的细胞结合至抗体的条件下，将生物样品放置为与抗体接触，并且然后将这些细胞从固体支持物结合的抗体洗脱出。
不论用以分离、纯化或鉴别MICA阳性细胞的方法如何，这样做的能力对于多种目的是有用的，例如用以通过评估获得自患者的MICA阳性细胞的数目或活性或其他特征来诊断特征在于表达MICA的细胞的病原性扩张的失调，或用以在例如使用这些抗体进行的在此所述治疗之一之前评价本发明的抗体、或其片段或衍生物调节患者细胞的活性或行为的能力。另外，纯化的MICA阳性细胞在研究背景中是有用的，例如，用以更好地表征细胞以及它们不同的特性和行为，并且用以鉴别可以用于调节它们行为、活性、或增殖的化合物或方法。本发明的抗体还可以用于诊断方法中，例如用于检测细胞(例如，来自患者的疾病细胞)上的MICA多肽的方法中。
本发明还提供了药物组合物，这些药物组合物包括根据本发明的特异性结合至细胞表面上的MICA多肽的抗原结合剂(例如抗体)。优选地抗体抑制细胞的生长或活性，和/或导致MICA阳性细胞的清除，优选经由CDC和/或ADCC的诱导。该组合物进一步包括药学上可接受的载体。
本发明进一步提供了在有需要的患者中抑制MICA阳性细胞的生长或活性、和/或减少MICA阳性细胞的方法，包括将根据本发明的组合物给予所述患者的步骤。此类治疗方法可以用于多种失调中，包括但不限于癌症的治疗。
如在此证实的，非阻断型抗MICA抗体在通过效应子细胞诱导表达MICA的细胞的裂解中是特别有效的。这些抗体具有作用的双重模式，通过结合MICA和啮合效应子细胞上的激活型Fcγ受体，它们经由效应子细胞诱导裂解，并且通过不阻断NKG2D信号传导，它们防止NK细胞反应性的NKG2D介导的激活的中和，或通过阻断NKG2D信号传导和减小sMICA诱导的NKG2D下调。抗体优选地包含人类重链恒定区序列，这些人类重链恒定区序列导致与其结合的MICA表达细胞(例如，肿瘤细胞)的减少，并且优选包括诱导CDC和/或ADCC的Fc部分。该组合物进一步包括药学上可接受的载体。此类组合物还称为本发明的“抗体组合物”。在一个实施方式中，本发明的抗体组合物包括在以上抗体实施例中披露的抗体。
在一方面，本发明的治疗的方法包括将以治疗有效量结合MICA的抗原结合化合物的组合物给予个体。治疗有效量可以是例如足以导致体内MICA细胞减少量增加或足以导致针对表达MICA的肿瘤细胞而言激活的、反应性的、细胞毒性的NKG2D+效应子细胞(例如，NK细胞)和/或NKG2D+效应子细胞的IFNγ-产生增加的量。
本发明的方法有利地用于癌症(cancer)和其他增生性疾病，包括但不限于癌(carcinoma)，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；淋巴系统的造血性肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤以及伯基特氏淋巴瘤；骨髓系统的造血性肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病以及前髓细胞性白血病；间叶细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括成神经细胞瘤；其他肿瘤，包括成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢神经系统和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、以及神经鞘瘤；间叶细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤、以及骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌以及畸胎癌。可以根据本发明来治疗的其他示例性失调包括淋巴系统的造血性肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞失调，例如T-前淋巴细胞性白血病(T-PLL)，包括小细胞和中大型脑回样细胞类型的这种失调；大颗粒性淋巴细胞白血病(LGL)，优选T细胞类型的；塞扎里综合征(SS)；成人T细胞白血病淋巴瘤(ATLL)；a/d T-NHL肝脾性淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形性与成免疫细胞亚型；血管成免疫细胞性T细胞淋巴瘤；血管中心性(鼻)T细胞淋巴瘤；间变性(Ki 1+)细胞淋巴瘤；肠T细胞淋巴瘤；T-成淋巴细胞；以及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)。
在一些实施方式中，在给予抗MICA抗体或组合物之前，MICA在患者细胞(例如，肿瘤细胞)上的存在将被评估，例如，以确定在患者中MICA阳性细胞的相对水平和活性以及确证抗体对患者细胞的结合效力。可以进而用抗MICA抗体或组合物来治疗其肿瘤细胞表达MICA的患者。这可以通过以下方式来完成：从失调部位获得PBL或肿瘤细胞的样品、并且例如使用免疫测定测试，以便确定MICA和可任选地在细胞上的另外其他标志物的相对显著性。还可以使用其他方法来检测MICA和其他基因的表达，例如基于RNA的方法，例如RT-PCR或RNA印迹法。
在一个实施方式中，在寻求抑制患者MICA阳性细胞的活性或生长或减少这些MICA阳性细胞时，对于抗MICA抗体抑制患者MICA阳性细胞的增殖或减少这些MICA阳性细胞的能力进行评估。如果MICA阳性细胞被抗MICA抗体或组合物减少，则确定患者对于用抗MICA抗体或组合物的治疗有反应，并且可任选地将该患者用抗MICA抗体或组合物进行治疗。
该治疗可以涉及多轮抗体或化合物的给予。例如，在起始轮的给予之后，在患者中表达MICA的细胞(例如，在恶性肿瘤细胞上)的水平和/或活性将大体上被重新测量，并且如果仍然升高，则可以进行另外一轮的给予。以此方式，可以进行多轮MICA检测以及抗体或组合物给予，例如直到该失调处于控制之中。
在一些实施方式中，该方法可以包括将适当的另外(第二)治疗剂给予至所述患者的另外步骤，该治疗剂选自免疫调节剂、激素剂、化学治疗剂、或结合至存在于MICA表达细胞上的多肽的第二抗体(例如，消耗抗体)。此类另外的药剂可以作为单一剂型连同所述抗体或者作为单独的剂型给予至所述患者。抗体的剂量(或抗体以及另外的治疗剂的合计剂量)是足以可检测地诱导、促进和/或增强患者中的治疗反应。在单独给予时，在导致对患者可检测的组合的治疗益处的条件(例如，相对于时间设置、服药次数、等)下，抗体、片段、或衍生物以及另外的治疗剂被合宜地给予。
对于肿瘤(例如实体肿瘤)治疗，例如本发明的组合物的给予可以与经典途径(例如，手术、放射疗法、化学疗法等)组合使用。本发明因此提供了组合疗法，其中将在此的抗体与手术或放射治疗同时使用，或在手术或放射治疗之前或之后使用；或与常规的化学治疗、放射治疗或抗血管生成剂、或靶向的免疫毒素或凝血配体(coaguligand)一起或在其之前或之后给予。
示例性抗癌的抗血管生成剂抑制受体酪氨酸激酶进行的信号传导，包括但不限于FGFR(成纤维生长因子受体，FGF-1,2)、PDGFR(血小板衍生的生长因子受体)、血管生成素受体(Ang-1,2)、HGFR(肝细胞生长因子受体)、ephrin受体(Eph)、VEGFR1、VEGFR-2,3PDGFR-α、PDGFR-β、CSF-1R、MET、Flt-3、c-Kit、bcr/abl、p38α以及FGFR-1。另外的抗血管生成剂可以包括抑制VEGF表达和生产的一个或多个不同调节剂，例如EGFR、flt-1、KDR、HER-2、COX-2、或HIF-1α。另外优选的药剂类别包括IMiD(免疫调节药)、衍生自沙利度胺的具有广泛作用(包括免疫和非免疫相关作用两者)的类似物。IMiD类别的代表包括CC-5013(雷利度胺，雷利米得(Revlimid)TM)、CC-4047(艾克提米德(Actimid)TM)、以及ENMD-0995。另一类的抗血管生成剂包括西仑吉肽(EMD 121974，整合素抑制剂)、金属蛋白酶(MPP)(例如marinastat，BB-251)。另一类的抗血管生成剂包括法尼基化抑制剂，例如洛那法尼(SarasarTM)、替吡法尼(ZarnestraTM)。其他抗血管生成剂也可以是适合的，例如贝伐珠单抗(mAb，抑制型VEGF-A，基因科技(Genentech))；IMC-1121B(mAb，抑制型VEGFR-2，免疫克隆系统公司(ImClone Systems))；CDP-791(聚乙二醇化DiFab，VEGFR-2，细胞科技公司(Celltech))；2C3(mAb，VEGF-A，百富勤制药(PeregrinePharmaceuticals))；VEGF-trap(可溶性杂合受体VEGF-A，PlGF(胎盘生长因子)安内特/再生元(Aventis/Regeneron)。另一类优选的药剂包括酪氨酸激酶抑制剂(TKI)类，包括例如PTK-787(TKI，VEGFR-1,-2，瓦他拉尼，诺华公司)；AEE788(TKI，VEGFR-2以及EGFR，诺华公司)；ZD6474(TKI，VEGFR-1,-2,-3，EGFR，凡德他尼，阿斯利康)；AZD2171(TKI，VEGFR-1,-2，阿斯利康)；SU11248(TKI，VEGFR-1,-2，PDGFR，舒尼替尼，辉瑞)；AG13925(TKI，VEGFR-1,-2，辉瑞)；AG013736(TKI，VEGFR-1,-2，辉瑞)；CEP-7055(TKI，VEGFR-1,-2,-3，瑟法隆)；CP-547,632(TKI，VEGFR-1,-2，辉瑞)；GW786024(TKI，VEGFR-1,-2,-3，葛兰素史克)；GW786034(TKI，VEGFR-1,-2,-3，葛兰素史克)；索拉非尼(TKI，Bay 43-9006，VEGFR-1,-2，PDGFR拜耳/Onyx)；SU4312(TKI，VEGFR，PDGFR，辉瑞)AMG706(TKI，VEGFR-1,-2,-3，安进(Amgen))XL647(TKI，EGFR，HER2，VEGFR，ErbB4，Exelixis)XL999(TKI，FGFR，VEGFR，PDGFR，Flt-3，Exelixis)PKC412(TKI，KIT，PDGFR，PKC，FLT3，VEGFR-2，诺华)AEE788(TKI，EGFR，HER2，VEGFR，诺华)OSI-930(TKI，c-kit，VEGFR，OSI制药)OSI-817(TKI，c-kit，VEGFR，OSI制药)DMPQ(TKI，ERGF，PDGFR，erbB2，p56，pkA，pkC)MLN518(TKI，FLT3，PDGFR，c-KIT，CT53518，千禧制药(MillenniumPharmaceuticals))lestaurinib(TKI，FLT3，CEP-701，瑟法隆)ZD1839(TKI，EGFR，吉非替尼，易瑞沙，阿斯利康)OSI-774(TKI，EGFR，Erlotininb，特罗凯(Tarceva)，OSI制药)拉帕替尼(TKI，ErbB-2，EGFR，GD-2016，拉帕替尼(Tykerb)，葛兰素史克)。最优选的是抑制选自下组的一种或多种受体酪氨酸激酶的酪氨酸激酶抑制剂，该组由以下各项组成：VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-α、β、Flt-3、c-Kit、p38α、MET、c-RAF、b-RAF、bcr/abl以及FGFR-1。
在一个实施方式中，第二药剂是效应子细胞(例如，NK细胞)激活型受体的天然配体，或者是结合并激活NK细胞激活型受体(而不是NKG2D)的抗体。在一个实施方式中，该药剂是增加靶标细胞(例如，感染细胞、肿瘤细胞、促炎性细胞)表面上的NK细胞激活型受体(而不是NKG2D)的天然配体的存在的药剂。NK细胞激活型受体包括例如天然细胞毒性受体，例如NKp30、NKp46、NKp44或激活型KIR受体(KIR2DS受体，KIR2DS2，KIR2DS4)。如在此使用的，术语“激活型NK受体”是指在NK细胞表面上的任何分子，当该分子受刺激时，导致如与NK活性相关联的本领域中已知的任何特性或活性方面(例如细胞因子如IFN-γ和TNF-α的产生)的可测量的增加、在细胞内游离钙水平的增加、在如例如在本说明书中另外的地方描述的重导向杀伤测定中靶向细胞的能力、或者刺激NK细胞增殖的能力。术语“激活型NK受体”包括但不限于激活形式或KIR蛋白质(例如，KIR2DS蛋白)、NKp30、NKp46、NKp44、NKG2D、IL-2R、IL-12R、IL-15R、IL-18R和IL-21R。
在一个实施方式中，抗癌剂是上调肿瘤细胞表面上的NKG2D配体的表达的化学治疗剂或放射法。这包括熟知的化学疗法，包括电离放射和UV放射，DNA复制的抑制剂，DNA聚合酶的抑制剂，染色质修饰治疗，以及凋亡诱导剂(例如HDAC抑制剂曲古抑菌素A和丙戊酸)。优选的疗法是激活DNA损伤响应途径的那些，更优选是激活ATM(共济失调毛细血管扩张，突变的)或ATR(ATM-和Rad3-相关的)蛋白质激酶、或CHK1、或又另外的CHK2或p53的那些。后者的实例包括电离放射，DNA复制的抑制剂，DNA聚合酶抑制剂以及染色质修饰剂或治疗(包括HDAC抑制剂)。上调NKG2D配体的组合物进一步描述于加瑟(Gasser)等人(2005)自然(Nature)436(7054):1186-90。NKG2D是激活型受体，除了其他配体外，它还与MHC I类相关的MICA和MICB糖蛋白相互作用。MICA和MICB(鲍尔(Bauer)等人(1999)科学285:727-729，将其公开内容通过引用结合于此)对抗原呈递没有作用，一般仅发现于肠上皮中，并且可以在许可类型的细胞中通过病毒和细菌的感染、恶性转化以及增殖而经胁迫诱导。NKG2D是一种C-型凝集素样激活受体，它通过关联的DAP 10适配子蛋白进行信号传导，类似于CD28。它表达于大多数自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、γδT细胞CD8T细胞、以及T细胞，但通常不是在CD4T细胞上。其他NKG2D配体包括ULBP蛋白质,例如ULBP-1,-2,和-3,最初被鉴别为用于人类巨细胞病毒糖蛋白UL16的配体(Cosman(科斯曼)等人，(2001)Immunity(免疫学)14:123-133，将其公开内容通过引用结合于此)。其他NKG2D配体包括RAE1TG，ULBP样家族蛋白质的成员(Bacon(培根)等人(2004)J.Immunol.(免疫学杂志)173:1078-1084)。
另外的抗癌剂包括烷基化剂、细胞毒性抗生素，例如拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、植物衍生物、RNA/DNA抗代谢物、以及抗有丝分裂剂。优选的实例可以包括例如顺铂(CDDP)、卡铂、甲苄肼、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、瘤可宁、白消安、亚硝基脲、更生霉素、道诺霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、它莫西芬、雷洛昔芬、紫杉酚(taxol)、吉西他滨、长春瑞滨、反铂、5-氟尿嘧啶、新长春碱、长春碱和氨甲喋啉、或前述物质的任何类似物或衍生变体。
烷基化剂是可形成与适合的物质具有高度化学反应性并且快速形成共价键的化合物。一种这样的靶标是DNA(并非处于其正常状态)，而是当双螺旋已经被解旋酶解除配对时。这暴露了DNA的‘内部’，易于进行烷基化。大多数烷基化剂是双极性的，即它们包含两个能够与DNA反应的基团。因此它们可以形成DNA单链的两个部分之间或两个单独的链之间的‘桥’；不论哪种情况，这干扰了涉及复制过程的酶的作用，使得这些酶不能完成其作用。然后细胞由于不能在物理上分裂、或因为异常的DNA刺激凋亡而死亡。实例包括氮芥(例如，瘤可宁，环磷酰胺)，亚硝基脲(例如卡莫司汀，洛莫司汀)、金属盐(例如，顺铂，卡铂，奥沙利铂)、乙烯胺衍生物(例如，噻替哌)、烷基磺酸酯(例如，白消安)以及三氮烯(例如，达卡巴嗪)。
抗代谢物是在结构或功能上与核酸合成所需要的天然存在的代谢物类似的一组化学品。抗代谢物分子模拟这些正常的代谢物，并且阻断负责核酸合成的酶或变成整合入DNA中，产生不正确的遗传密码并且导致凋亡。存在三种主要类别的抗代谢物。叶酸是一种对于嘌呤分子的合成而言必需的物质。叶酸类似物(例如氨甲喋呤，雷替曲塞(raltritrexed))类似于叶酸分子-例如氨甲喋呤的物质可以用于抑制二氢叶酸还原酶，导致嘌呤胸腺嘧啶的不足的产生。嘧啶类似物(例如，阿糖胞苷，氟尿嘧啶(5-FU)，吉西他滨)类似于嘧啶分子，并且通过抑制核酸合成(例如，氟尿嘧啶)或通过变得整合入DNA中(例如，阿糖胞苷)而发挥作用。嘌呤类似物(例如巯基嘌呤，硫代鸟嘌呤，克拉屈滨，氟达拉滨)以与嘧啶类似物相似的方式发挥作用，但可以具有另外的(以及疾病表征的)作用机制。
细胞毒性抗生素被如此称谓是因为它们全部衍生自天然来源，即链霉菌属组的细菌。它们以不同的方式影响核酸功能和合成。蒽环霉素组包括多柔比星、道诺霉素以及伊达比星。它们插入DNA并且影响拓扑异构酶II酶。这种DNA旋转酶分开DNA双螺旋，并且一旦扭转力解除则将其重新连接；蒽环霉素稳定DNA-拓扑异构酶II复合体并且因此防止链的重新连接。更生霉素和米托蒽醌具有相似的作用机制。博来霉素导致DNA链的片段化。丝裂霉素类似于烷基化剂发挥功能，导致DNA交联。
植物衍生物包括长春花生物碱，例如长春新碱以及长春花碱，结合至微管的前体，防止微管的形成。这抑制了有丝分裂的过程。紫杉烷(紫杉醇和多西他赛)也对微管起作用。它们将微管稳定为其聚合状态，也导致阻止有丝分裂。鬼臼衍生物例如依托泊苷和替尼泊苷被认为抑制拓扑异构酶II，而伊立替康和拓扑替康抑制拓扑异构酶I。
当治疗感染性疾病时，治疗可以采取根据本发明的组合物，单独或与其他已知的用于治疗此类疾病的治疗和/或治疗剂组合，包括抗病毒剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗生素、抗寄生虫剂、以及抗原生动物剂。当这些方法涉及用另外的治疗剂进行另外的治疗时，那些药剂可以连同本发明的抗体一起给予，作为单一剂型或作为单独的多重剂型。当作为单独的剂型给予时，这种另外的药剂可以在本发明的抗体的给予之前、同时或之后给予。
本发明的方法和抗体，特别是阻断MICA与NKG2D之间的相互作用和/或抑制MICA-诱导的NKG2D活性的非耗尽型抗体还可以有利地用于炎性失调和自身免疫失调的治疗。有待用多肽、抗体和其他本发明的化合物治疗的示例性自身免疫或炎性病症或失调包括但不限于系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，幼年慢性关节炎，银屑病关节炎，骨关节炎，脊椎关节病(强直性脊柱炎)，系统性硬化病(硬皮病)，特发性炎性肌病(皮肌炎，多肌炎)，肖格伦氏综合征(Sjogren'ssyndrome)，血管炎，系统性血管炎，颞动脉炎，动脉粥样硬化，肉状瘤病，重症肌无力，自身免疫性溶血性贫血(免疫全血细胞减少症，阵发性睡眠性血红蛋白尿症)，恶性贫血，自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜，免疫介导的血小板减少症，甲状腺炎(格雷夫斯病，桥本氏甲状腺炎，幼淋巴细胞性甲状腺炎，萎缩性甲状腺炎)，糖尿病(diabetes mellitus)，免疫介导的肾病(血管球性肾炎，小管间质性肾炎，自身免疫性卵巢炎(autoimmune oophiritis))，自身免疫性睾丸炎，自身免疫性葡萄膜炎，抗磷脂综合征，中枢和外周神经系统的脱髓鞘病(例如多发性硬化、特发性脱髓鞘多神经病或格林-巴利综合征、以及慢性炎性脱髓鞘多神经病)，肝胆疾病(例如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎、以及其他非肝性病毒)、自身免疫慢性活动性肝炎、病毒性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、韦格纳肉芽肿病、贝西氏病、以及硬化性胆管炎)，炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎或克罗恩氏病、乳糜泻、谷蛋白敏感性肠病、以及惠普耳氏病)，自身免疫或免疫介导的皮肤病(包括大疱性皮肤病、多形性红斑以及接触性皮炎)，泡疹样皮炎，银屑病，寻常性天疱疮，白癜风(白斑病)，过敏性疾病(例如哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮肤炎、食物过敏以及荨麻疹)，肺部免疫性疾病(例如嗜酸性肺炎、特发性肺间质纤维化以及过敏性肺炎)，慢性阻塞性肺病，以及移植相关疾病(包括移植排斥和移植物抗宿主疾病)。
当炎性疾病或自身免疫疾病用抗MICA抗体治疗时，本发明的治疗方法可以进一步包括用第二治疗剂治疗个体，该第二治疗剂包括正常地用于特定治疗目的(抗体被给予所指向的目的)的药剂。第二治疗剂将正常地以用于被治疗的特定疾病或病症的单一疗法中以典型针对该药剂的量给予。在一个实施方式中，将第二治疗剂以小于通常被接受的有效剂量进行给予；例如，在不同实施例中，该组合物包括小于大约10％至75％的通常被接受的有效剂量的剂量而被给予。优选地，第二治疗剂是减少蛋白水解酶、炎症介质、或促炎细胞因子(例如TNF-α和/或白介素-1(IL-1))的药剂。优选地，第二治疗剂是DMARD或DMD，可任选地进一步其中该第二治疗剂是氨甲喋呤(RheumatrexTM，TrexallTM)，羟化氯喹(PlaquenilTM)，柳氮磺胺吡啶来氟米特(阿拉瓦TM)，肿瘤坏死因子抑制剂(例如，可溶的TNFα受体，如依那西普(恩利))，中和型(优选非耗尽型)抗-TNFα抗体(例如阿达木单抗(修美乐TM)或赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)(CimziaTM))，T-细胞共刺激阻断剂(例如阿巴西普(奥瑞希纳TM))，白介素-1(IL-1)受体拮抗剂疗法(阿那白滞素(KineretTM))，抗-BlyS抗体(BenlystaTM)，蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)，酪氨酸激酶抑制剂，肌内金，或其他免疫调节剂或细胞毒性剂(例如硫唑嘌呤(依木兰TM)，环磷酰胺，环孢霉素A(内奥拉尔(Neoral)TM，山地明TM))或激酶抑制剂(例如SYK激酶抑制剂，如福斯替马替尼(fostimatinib)(R788)或JAK1，JAK2抑制剂，如INCB28050、他尼珠或塔索茨替尼(tasocitinib)(CP-690,550))。
在本发明的治疗方法中，本发明的抗原结合化合物以及第二治疗剂可以分开、一起或顺序地给予，或者混合给予。在一些实施方式中，将本发明的抗原结合化合物在给予第二治疗剂之前给予。例如，本发明的抗原结合化合物可以在给予第二治疗剂之前大约0至30天给予。在一些实施方式中，将本发明的抗原结合化合物在给予第二治疗剂之前从大约30分钟至大约2周、从大约30分钟至大约1周、从大约1小时至大约2小时、从大约2小时至大约4小时、从大约4小时至大约6小时、从大约6小时至大约8小时、从大约8小时至1天、或从大约1至5天给予。在一些实施方式中，将本发明的抗原结合化合物在给予这些治疗剂的同时给予。在一些实施方式中，将本发明的抗原结合化合物在给予第二治疗剂之后给予。例如，本发明的抗原结合化合物可以在给予第二治疗剂之后大约0至30天给予。在一些实施方式中，将本发明的抗原结合化合物在给予第二治疗剂之后从大约30分钟至大约2周、从大约30分钟至大约1周、从大约1小时至大约2小时、从大约2小时至大约4小时、从大约4小时至大约6小时、从大约6小时至大约8小时、从大约8小时至1天、或从大约1至5天给予。
本发明的抗原结合化合物可以被包括在试剂盒中。这些试剂盒可任选地包括任何数目的抗体和/或其他化合物，例如1、2、3、4或任何其他数目的抗MICA抗体和/或其他化合物。将理解的是这些试剂盒的内容物的此说明不以任何方式具有限制性。例如，该试剂盒可以包含其他类型的治疗剂或诊断剂。优选地，这些试剂盒还包括用于使用抗体和/或药剂的说明书，例如详述在此所述的方法。
药物制剂
可以用于这些组合物中的药学上可接受的载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如，人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮)、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧化丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇以及羊毛脂。本发明的抗体可以用于患者的MICA表达细胞的活性的调节例如抑制的方法中。该方法包括使所述组合物与所述患者接触的步骤。这种方法将对于预防和治疗目的两者均是有用的。
为了用于给予患者，该组合物将针对给患者的给予而配制。本发明的组合物可以口服、肠胃外、吸入气雾式地、局部地、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入的容器给予。在此使用的包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内注射或输注技术。抗体可以按单剂量以例如在大约25mg与500mg之间的量存在。
本发明的组合物的无菌可注射形式可以是水性的或油质的悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域中已知的技术使用适合的分散剂或润湿剂以及助悬剂来配制。无菌可注射的制品还可以是在非毒性的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射的溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的媒介物和溶剂有水、林格氏溶液、和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油惯例上用作溶剂或悬浮介质。出于这一目的，可采用任何一种温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，例如油酸，及其甘油酯衍生物在注射剂的制备中是有用的，如天然的药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是处于其聚氧乙醇化形式的。这些油溶液或悬浮液还可以包括长链醇稀释剂或分散剂，例如常用于药学上可接受的剂型(包括乳液和悬浮液)的配制中的羧甲基纤维素或类似的分散剂。其他常用的表面活性剂，例如吐温、斯潘(Span)以及其他常用于药学上可接受的固体、液体或其他剂型的制造中的乳化剂或生物利用增强剂也可以用于配制的目的。
本发明的组合物可以经口以任何口服可接受的剂型给予，包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在口服使用的片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。还典型地添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服给予，有用的稀释剂包括例如乳糖。当需要水性悬浮液用于口服使用时，将活性成分与乳化和悬浮剂组合。如果希望的话，还可以添加某些甜味剂、调味剂或调色剂。
可选地，对于直肠给予，本发明的组合物可以按栓剂的形式给予。这些可以通过将药剂与适合的非刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在室温是固体但在直肠温度下为液体，并且因此将在直肠中融化以释放药物。此类材料包括可可脂、蜂蜡以及聚乙二醇。
还可以局部给予本发明的组合物，尤其是当治疗靶标包括局部施用可易于达到的区域或器官时，包括眼睛、皮肤、或下肠道的疾病。适合的局部制剂易于针对这些区域或器官的每一个来制备。对于局部施用，这些组合物可以按适合的药膏来配制，该药膏包含悬浮或溶解于一种或多种载体中的活性组分。用于本发明的化合物的局部给予的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林(petrolatum)、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯化合物、乳化蜡和水。可选地，这些组合物可以配制为适合的洗剂或乳，该洗剂或乳包含悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分。适合的载体包括但不限于矿物油、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六醇酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二醇、苄醇以及水。
在此的抗体可以被包含在试剂盒中。这些试剂盒可任选地包括任何数目的抗体和/或其他化合物，例如1、2、3、4或任何其他数目的治疗抗体和/或化合物。将理解的是这些试剂盒的内容物的此说明不以任何方式具有限制性。例如，该试剂盒可以包含其他类型的治疗化合物。优选地，这些试剂盒还包括用于使用抗体的说明书，例如详述在此所述的方法。
剂型
根据本发明使用的拮抗剂的治疗制剂被通过以下方式制备以便储存：将具有希望纯度的拮抗剂与可任选的药学上可接受的处于冻干制剂或水性溶液的载体、赋形剂或稳定剂进行混合。关于涉及制剂的一般信息，参见例如Gilman(希尔曼)等人(编)，The Pharmacological Bases of Therapeutics(治疗学的药理学基础)，第8版(Pergamon Press(帕加马出版社)，1990)；Gennaro(真纳罗)(编)，Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)，第18版(Mack PublishingCo.(麦克出版公司)，伊斯顿,宾夕法尼亚州，1990)；Avis(阿维斯)等人(编)，Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications(药物剂型：肠胃外用药)(Dekker(德克)，纽约，1993)；Lieberman(利伯曼)等人(编)，Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets(药物剂型：片剂)(德克，纽约，1990)；Lieberman(利伯曼)等人(编)药物剂型：分散系统(德克，纽约，1990)；以及Walters(沃尔特斯)(编)，Dermatological and Transdermal Formulations(皮肤病学和经皮制剂)(药物与制药科学)，119卷(德克，纽约，2002)。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对于受体是非毒性的，并且包括：缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐以及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八基二甲基苄基铵氯化物；六甲氯铵(hexamethonium chloride)；氯化苯甲烃铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；烷基对羟基苯甲酸酯，例如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于大约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖、以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖、或山梨糖醇；形成盐的反离子，例如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如吐温TM、普郎尼克TM、或PEG。
示例性抗体制剂描述于例如WO 1998/56418中，该文献描述了对于抗CD20抗体的液体多剂量制剂，包括40mg/mL利妥昔单抗、25mM乙酸盐、150mM海藻糖、0.9％苄醇、以及0.02％聚山梨醇酯20TM，pH 5.0，具有两年2℃-8℃储存的最低保质期。另一种感兴趣的抗CD20制剂包括9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨醇酯80TM以及用于注射的无菌水中的10mg/mL利妥昔单抗，pH 6.5。
适用于皮下给予的冻干制剂描述于例如美国专利号6,267,958(Andya(安迪亚)等人)中。此类冻干制剂可以用适合的稀释剂重构为高蛋白浓度，并且重构的制剂可以皮下给予至在此有待治疗的哺乳动物中。
在此的制剂还可以包括多于一种的活性化合物(如上所指出的第二药剂)，优选是具有互补活性的不会不利地影响彼此的那些。此类药剂的类型和有效量取决于例如存在于制剂中的B细胞拮抗剂的量和类型以及对象的临床参数。以上指出了优选的此类第二药剂。
活性成分还可以被包含在制备的微胶囊中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合，例如分别在胶体递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒以及纳米胶囊)中或在粗乳状液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术披露于例如雷明顿制药科学(同上)中。
可以配制持续释放型制剂。适合的持续释放型制品的实例包括含有拮抗剂的固体疏水聚合物的半渗透性基质，这些基质是处于成形的物品如膜或微胶囊的形式。持续释放型基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(如LupronDepotTM(可注射的微球，由乳酸-乙醇酸共聚物以及乙酸亮丙瑞林组成)、以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
有待用于体内给予的制剂必须是无菌的。这易于通过无菌过滤膜的过滤来完成。可以用于这些组合物中的药学上可接受的载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如，人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮)、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧化丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇以及羊毛脂。
本发明的其他方面和优势将披露于以下实验部分，该实验部分应被认为是说明性的而非限制本申请的范围。
实施例
实施例1：抗MICA抗体的产生
免疫#1
为了获得抗人类MICA抗体，用重组人类MICA细胞外结构域重组-Fc蛋白(MICA*019等位基因，可获得自R&D系统)免疫Balb/c小鼠。小鼠腹膜内地接受用50μg MICA蛋白和完全弗氏佐剂的乳剂的第一免疫，腹膜内地接受用50μgMICA蛋白和不完全弗氏佐剂的乳剂的第2免疫，并且最后静脉内地接受用10μgMICA蛋白的加强。加强后3天，将免疫脾细胞与X63.Ag8.653永生B细胞融合，并且在辐射处理的脾细胞的存在下进行培养。
初级筛选：通过流式细胞术，使用用MICA*019构建体转染的Baf/3细胞系，在初级筛选中测试生长的克隆的上清液(SN)。选择阳性上清液并且通过流式细胞术针对与未转染的Baf/3细胞系的结合的缺乏进行测试。简言之，用于FACS筛选，通过用PE标记的羊抗鼠多克隆抗体(pAb)揭示反应性抗体在上清液中的存在。
次级筛选：还使用ELISA测定测试克隆的上清液，以评估阻断MICA细胞外结构域重组-Fc蛋白(R&D系统)与NKG2D细胞外结构域重组-Fc蛋白之间的相互作用的能力。通过有限稀释技术在96孔板中克隆选自初始筛选的潜在感兴趣的杂交瘤。获得所得抗体上清液IgG2b同种型的9C10和IgG1同种型的6E4、20C6和19E9。
免疫#2
为了获得抗人类MICA抗体，用重组人类MICA细胞外结构域重组-His蛋白(MICA*001等位基因)免疫Balb/c小鼠。小鼠腹膜内地接受用50μg MICA蛋白和完全弗氏佐剂的乳剂的第一免疫，腹膜内地接受用50μg MICA蛋白和不完全弗氏佐剂的乳剂的第2免疫，并且静脉内地接受一个用10μg MICA蛋白的加强。将免疫脾细胞与X63.Ag8.653永生B细胞融合，并且在辐射处理的脾细胞的存在下进行培养。
初级筛选：通过流式细胞术，使用不同C1R基细胞系的细胞的混合物，在初级筛选中测试生长的克隆的上清液(SN)，其中用不同的构建体(MICA*001、MICA*004、MICA*007或MICA*008)转染每个细胞系。简言之，用于FACS筛选，通过用PE标记的羊抗鼠多克隆抗体(pAb)揭示反应性抗体在上清液中的存在。
次级筛选：还使用ELISA测定测试克隆的上清液，以评估结合MICA细胞外结构域α3重组蛋白而不结合至重组人类MICA完全细胞外结构域重组-His蛋白(MICA*001等位基因)的能力。通过有限稀释技术在96孔板中克隆选自初始筛选的潜在感兴趣的杂交瘤。
获得MICA细胞外结构域α3抗体，包括IgG2a同种型的克隆16A8。
免疫#3
为了获得抗人类MICA抗体，用1:1:1:1比例的MICA*01、MICA*04、MICA*07或MICA*08转染的1000万个C1R细胞的混合物(250万的每种转染子细胞)免疫Balb/c小鼠。小鼠腹膜内地接受一个用总共1000万个转染子细胞和完全弗氏佐剂的第一免疫，腹膜内地接受用1000万个转染子细胞(250万的每种转染子细胞)和不完全弗氏佐剂的第2免疫，并且静脉内地接受一个用100万个转染子细胞(25万的每种转染子细胞)的加强。将免疫脾细胞与X63.Ag8.653永生B细胞融合，并且在辐射处理的脾细胞的存在下进行培养。
初级筛选：通过流式细胞术，使用不同C1R基细胞系和Baf/3细胞系的细胞的混合物，在初级筛选中测试生长的克隆的上清液(SN)，其中用不同的构建体(用于C1R的MICA*001、MICA*004、MICA*007或MICA*008以及用于Baf/3的MICA*019)转染每个细胞系。简言之，用于FACS筛选，通过用PE标记的羊抗鼠多克隆抗体(pAb)揭示反应性抗体在上清液中的存在。
次级筛选：还使用ELISA测定测试克隆的上清液，以评估结合MICA细胞外结构域α3重组蛋白而不结合至重组人类MICA完全细胞外结构域重组-Fc蛋白(MICA*019等位基因)的能力。通过有限稀释技术在96孔板中克隆选自初始筛选的潜在感兴趣的杂交瘤。
获得所得抗体上清液IgG1同种型的12A10、10A7、18E8、10F3和15F9以及IgM同种型的14B4。
将抗体9C10、19E9、6E4、20C6、16A8、12A10、10A7、18E8、10F3、15F9以及14B4随后嵌合至人类IgG1同种型(也分别称为CHG1-M-MIA-9C10、CHG1-M-MIA-19E9、CHG1-M-MIA-6E4、CHG1-M-MIA-20C6、CHG1-M-MIA-16A8、CHG1-M-MIA-12A10、CHG1-M-MIA-10A7、CHG1-M-MIA-18E8、CHG1-M-MIA-10F3、CHG1-M-MIA-15F9以及CHG1-M-MIA-14B4)。
实施例2-结合至固定的MICA蛋白
通过表面等离子体共振(SPR)，使用Biacore T100装置分析6E4、20C6和16A8至重组人类MICA细胞外结构域重组蛋白单体或二聚体(MICA*019等位基因-Fc蛋白或MICA*001-His蛋白)以及其他NKG2D配体MICB和ULBP1-2的结合，以分别获得单价和二价亲和力。
用于蛋白质固定化，将重组蛋白MICA-Fc MICB-Fc(R&D系统1599-MB，A登录号CAI18747，SEQ ID NO:6)、ULBP1-Fc、ULBP2-Fc共价地固定至SensorChip CM5(芯片)上的葡聚糖层中的羧基基团。将芯片表面用EDC/NHS(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(Biacore GE医疗)活化。将蛋白质在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH 5.6)中稀释至10μg/ml并注射，直到达到适当的固定化水平(即，用于结合研究的1000至1600RU)。使用100mM乙醇胺pH 8(Biacore GE医疗)失活剩余的活化基团。
使用HBS-EP+(中性pH)进行抗体结合分析。将抗MICA抗体(以10μg/ml的浓度稀释于运行缓冲液中)以10μl/min的恒定流速注入在包含固定的重组靶蛋白的葡聚糖层上、持续2min，并且在通过以40μl/min的流速的10mM NaOH，500mM NaCl再生缓冲液的十秒注射再生之前允许解离2min。
用于二价亲和力测量，经由Ni2+/NTA螯合作用将MICA-His蛋白固定在Sensor Chip NTA(用次氨基三乙酸(NTA)预固体的羧甲基化葡聚糖)上。将抗MICA抗体在运行缓冲液HBS-P中稀释至一个浓度系列(0.01至100nM)并且注射在固定抗原上。
每个循环由三个步骤组成。首先，用NiSO4(500mM)活化NTA芯片。其次，经由10μL/min的恒定流速的2min注射将MICA-His蛋白(在运行缓冲液HBS-P中稀释至10μg/ml)固定在表面上。然后，以40μl/min的流速将抗体注射在固定抗原上、持续2min。随后地，以40μl/min注射运行缓冲液、持续5min，用于抗体解离分析。在每个循环后，通过一个0.5M EDTA，pH 8.3的60s注射再生该表面，以将剩余的抗原和抗体完全剥离该表面。通过全局拟合，使用适当的模型分析所得传感图。
用于单价亲和力测量，将嵌合的抗MICA抗体捕获到蛋白-G芯片上。
使用单循环动力学(SCK)确定亲和力。SCK循环如下：升序的MICA-His或MICA-BirA(或在分析过程中用于待减去的空白注射的缓冲液)的5个系列稀释(0.01至100nM)的30μl/min的连续120s注射。在注射最后浓度后，在通过按40μl/min 10s注射适当再生缓冲液进行再生之前，使复合物解离600s。再生后，在电泳缓冲液中使芯片稳定60s。使用Biacore T100软件拟合曲线。
在pH 7.4，对于生物素共轭的小鼠抗体6E4的MICA结合，二价平均值KD(M)(在MICA*001-His上)为3.099-11M，而一价亲和力为2.0*10-9M。在pH 7.4，对于生物素共轭的小鼠抗体20C6，二价平均值KD(M)(在MICA*001-His上)为3.3- 10M，而一价亲和力为6.5*10-9M。
在pH 7.4，对于生物素共轭的小鼠抗体9C10的MICA结合，二价平均值KD(M)(在MICA*001-His上)为6.2*10-13M。在pH 7.4，对于生物素共轭的小鼠抗体19E9的MICA结合，二价平均值KD(M)(在MICA*001-His上)为3.2-13M，而一价亲和力为7.8*10-10M。
在pH 7.4，在MICA-BirA上，对于CHG1-M-MIA-19E9抗体，一价亲和力(平均KD)为6.5*10-9M(n＝3)
在pH 7.4，在MICA-BirA上，对于CHG1-M-MIA-20C6抗体，一价亲和力(平均KD)为4*10-8M(n＝3)
在pH 7.4，在MICA-BirA上，对于CHG1-M-MIA-6E4抗体，一价亲和力(平均KD)为8.9*10-9M(n＝4)
在pH 7.4，在MICA-BirA上，对于CHG1-M-MIA2-16A8抗体，一价亲和力(平均KD)为1.15*10-8M(n＝4)
在pH 7.4，在MICA-BirA上，对于CHG1-M-MIA-15F9抗体，一价亲和力(平均KD)为6.1*10-8M(n＝1)
在pH 7.4，在MICA-BirA上，对于CHG1-M-MIA-12A10抗体，一价亲和力(平均KD)为5.3*10-8M(n＝1)
在pH 7.4，在MICA-BirA上，对于CHG1-M-MIA-18E8抗体，一价亲和力(平均KD)为5.4*10-8M(n＝1)
在pH 7.4，在MICA-BirA上，对于CHG1-M-MIA-10F3抗体，一价亲和力(平均KD)为8.3*10-9M(n＝1)
实施例3-结合MICA等位基因
获得自第一、第二和第三免疫系列(包括CHG1-M-MIA-19E9、CHG1-M-MIA-9C10、CHG1-M-MIA-6E4、CHG1-M-MIA-20C6、CHG1-M-MIA-16A8、CHG1-M-MIA-12A10、CHG1-M-MIA-10A7、CHG1-M-MIA-18E8、CHG1-M-MIA-10F3、CHG1-M-MIA-15F9和CHG1-M-MIA-14B4)抗体的结合，对它们结合MICA表达CR1转染子细胞C1R-MICA*001、C1R-MICA*004、C1R-MICA*007和C1R-MICA*008进行测试(Pr.A.Steinle(斯特尼)，Eberhard-Karls University(蒂宾根大学)Tuebingen(蒂宾根)，德国)，描述于Salih(萨利赫)等人(2003)Blood(血液)102(4):1389-91396中。通过流式细胞术分析结合。
流式细胞术收获细胞，并且在4℃，使用剂量范围的抗MICA mAb，在30分钟期间，在PBS 1X/BSA 0,2％/EDTA 2mM缓冲液中对细胞进行染色。在染色缓冲液中洗涤两次后，在4℃，用小鼠抗人类IgG1-PE单克隆抗体(1/11)将细胞染色30min。洗涤两次后，在BD FACS Canto II上获得染色，并且使用FlowJo软件进行分析。
结果抗体CHG1-M-MIA-19E9、CHG1-M-MIA-9C10、CHG1-M-MIA-6E4、CHG1-M-MIA-20C6、CHG1-M-MIA-12A10、CHG1-M-MIA-10A7、CHG1-M-MIA-18E8、CHG1-M-MIA-10F3、andCHG1-M-MIA-15F9结合C1R-MICA*001、C1R-MICA*004、C1R-MICA*007和C1R-MICA*008细胞中的每一种(参见针对抗体CHG1-M-MIA-19E9、CHG1-M-MIA-9C10、CHG1-M-MIA-6E4、CHG1-M-MIA-20C6、CHG1-M-MIA-12A10、CHG1-M-MIA-10F3的图1A，以及针对抗体CHG1-M-MIA-18E8、CHG1-M-MIA-15F9、CHG1-M-MIA-10A7的图1B)。然而，测试了其他抗体的等位基因特异性，并且并不识别MICA*001、*004、*007和*008中的全部。作为并不识别所有测试的MICA等位基因的抗体的实例，图1B中示出了两个抗α3结构域抗体CHG1-M-MIA-16A8和CHG1-M-MIA-14B4。在表C中按μg/ml示出了EC50值(使用4参数逻辑拟合进行计算)。
表C：按μg/ml，表明的嵌合抗MICA抗体对C1R转染子细胞的EC50值
实施例4-表位作图
进一步测试抗体对不同MICA*001突变体的结合。通过PCR产生MICA突变体(参见下表D)。与以下5’引物TACGACTCACAAGCTTACCGCCACCATGGGGCT GGGACCGGTCTTC(SEQ IDNO:135)一起使用所有Mx-R引物。与以下3’引物CCGCCCCGACTCTAGATTACTAGGCGCCCTCAGTGGAGC(SEQ ID NO:136)一起使用所有Mx-F引物。在琼脂糖凝胶上电泳扩增的序列，然后使用Macherey NagelPCR清理凝胶提取试剂盒(参考740609)进行纯化。为了产生突变体3，必须进行第三PCR。用于这些PCR的引物为M3a-F引物(5’-ACGGTGCTGTCCGCGGATGGATCTGTGCAGTCAG-3’)(SEQ ID NO:137)与M3b-R引物(5’-CCTGCTTTCTGGTCCTTGATATGAGCCAGGGTC-3’)(SEQ IDNO:138)。对于每个突变体产生两个或三个PCR产物，然后将它们连接进SELEXIS pSUREtech 192(HYGRO)载体，用限制性内切酶HindIII和XBaI进行消化，使用ClonTech InFusion系统(参考639644)，根据制造商的说明书。
测序后，使用Promega PureYieldTM质粒小量制备系统(参考A1222)，将包含突变的序列的载体制备为小量制备。然后根据制造商的说明书，使用OZBIOSCIENCES的HYPE-5TM转染试剂盒(参考HYR10003)，将载体用于CHOK1SV细胞转染。按1:8比率HYPE-5:DNA，使用300ng的DNA进行转染。
表D：具有靶向的氨基酸和用来产生突变体的引物序列的MICA*001突变体清单
并未示出抗体对未突变的野生型MICA的结合的任何损失，但是损失了对一个或多个突变体的结合，由此鉴定了若干表位。
抗体6E4具有对具有Q48A、W49S、E51S、D52A、V53S和L54A取代的突变体10和11的结合的损失，但是并未损失对任何其他突变体的结合。因此，6E4的主要表位包括残基Q48和W49中的一个或多个，和/或残基E51、D52、V53和L54中的一个或多个。这些残基在MICA的α1结构域内(表位可以进一步包括α2或α3结构域内的残基)。
图2A示出了MICA多肽的视图，包括处于黑暗阴影中的突变的氨基酸残基，这些突变的氨基酸残基导致(以不同组合)抗体结合的损失。NKG2D结合位点示于中等阴影的MICA多肽的顶部(并且还在结合至MICA的带状图(ribbon diagram)中)。可见，6E4在远离NKG2D结合表面的MICA侧面结合α1结构域，这与6E4并不阻断MICA-NKG2D相互作用的发现一致。
抗体9C10和12A10具有对具有N56A、K57S、T58A、R61A和R64A取代的突变体12和13的结合的损失，但是并未损失对任何其他突变体的结合。因此，9C10和12A10的主要表位包括残基N56和K57中的一个或多个，和/或残基T58、R61、和R64中的一个或多个。这些残基在MICA的α1结构域内(表位可以进一步包括α2或α3结构域内的残基)。
图2B示出了MICA多肽的视图，包括处于黑暗阴影中的突变的氨基酸残基，这些突变的氨基酸残基导致(以不同组合)9C10和12A10结合的损失。可见，9C10和12A10在接近NKG2D结合表面的MICA侧面结合α1结构域，具有可能的部分重叠，这与9C10和12A10阻断MICA-NKG2D相互作用的发现一致。
抗体20C6具有对具有K81A D82A Q83A K84A H109A Y111A D113A L116AS133A R134S T137A M140S N141A R143S N144A取代的突变体16、17、21、60、27和28中的每一个的结合的损失，但是并未损失对任何其他突变体的结合。因此，20C6的主要表位包括残基K81和D82中的一个或多个，残基Q83和K84中的一个或多个，残基H109、Y111和L116中的一个或多个，残基D113，残基S133、R134和T137总的一个或多个，和/或残基M140、N141、R143和N144中的一个或多个。这些残基在MICA的α1和α2结构域内(表位可以进一步包括α3结构域内的残基)。
抗体10A7具有与20C6的部分表位重叠。抗体20C6具有对具有K81A、D82A、Q83A、K84A、H109A、Y111A、D113A、L116A、Q131A、S132A、Q136S、M140S、N141A、R143S和N144A取代的突变体16、17、21、60、26和28中的每一个的结合的损失，但是并未损失对任何其他突变体的结合。因此，10A7的主要表位包括残基K81和D82中的一个或多个，残基Q83和K84中的一个或多个，残基H109、Y111和L116中的一个或多个，残基D113，残基Q131、S132和Q136中的一个或多个，和/或残基M140、N141、R143和N144中的一个或多个。这些残基在MICA的α1和α2结构域内(表位可以进一步包括α3结构域内的残基)。
图2C示出了MICA多肽的视图，包括处于黑暗阴影中的突变的氨基酸残基，这些突变的氨基酸残基导致(以不同组合)20C6结合的损失。图2D示出了MICA多肽的视图，包括处于黑暗阴影中的突变的氨基酸残基，这些突变的氨基酸残基导致(以不同组合)10A7结合的损失。可见，20C6和10A7在接近NKG2D结合表面的MICA侧面结合α1和α2结构域，具有可能的部分重叠。这与20C6阻断MICANKG2D相互作用的发现一致。
抗体19E9、18E8和10F3具有对具有E100A、D101S、N102A、S103A、T104S、R105A、N121A、E123S、T124A和E126A取代的突变体19、20、23和24中的结合的损失，但是并未损失对任何其他突变体的结合。因此，19E9、18E8和10F3的主要表位包括残基E100、D101和N102中的一个或多个，残基S103、T104、和R105中的一个或多个，残基N121、和E123中的一个或多个，和/或残基T124和E126中的一个或多个。这些残基在MICA的α2结构域内(表位可以进一步包括α1或α3结构域内的残基)。
图2E示出了MICA多肽的视图，包括处于黑暗阴影中的突变的氨基酸残基，这些突变的氨基酸残基导致(以不同组合)19E9、18E8和10F3结合的损失。可见，19E9、18E8和10F3在接近NKG2D结合表面的MICA侧面结合α2结构域，这与19E9、18E8和10F3阻断MICA-NKG2D相互作用的发现一致。
抗体15F9具有对具有R6A、N8A、E97A、H99A、E100A、D101S、N102A、S103A、T104S、R105A、E115A、L178A、R179S和R180A取代的突变体1、18、19、20、61和36中的结合的损失，但是并未损失对任何其他突变体的结合。因此，15F9的主要表位包括残基R6和N8中的一个或多个，残基E97和H99中的一个或多个，残基E100、D101和N102中的一个或多个，残基S103、T104和R105中的一个或多个，残基E115，和/或残基L178、R179和R180中的一个或多个。这些残基在MICA的α2结构域内(表位可以进一步包括α1或α3结构域内的残基)。
图2F示出了MICA多肽的视图，包括处于黑暗阴影中的突变的氨基酸残基，这些突变的氨基酸残基导致(以不同组合)15F9结合的损失。可见，15F9在NKG2D结合表面下方的MICA侧面结合α2结构域。15F9阻断sMICA-NKG2D相互作用。
抗体16A8具有对具有S224A、H225S、D226A、T227A、Q228S、Q229A、W230A和D232A取代的突变体45、46和47的结合的损失，但是并未损失对任何其他突变体的结合。因此，16A8的主要表位包括残基W230和/或D232中的一个或多个，残基T227、Q228和Q229中的一个或多个，残基S224、H225和D226中的一个或多个。16A8的表位主要在MICA的α3结构域内。
图2G示出了MICA多肽的视图，包括处于黑暗阴影中的突变的氨基酸残基，这些突变的氨基酸残基导致(以不同组合)16A8结合的损失。可见，16A8结合远离NKG2D结合表面的α3结构域。
抗体14B4具有对具有T227A、Q228S、和Q229A取代的突变体46的结合的损失，但是并未损失对任何其他突变体的结合。因此，14B4的主要表位包括残基T227、Q228和Q229中的一个或多个，并且具有与抗体16A8的部分重叠。14B4的表位主要在MICA的α3结构域内。可见，14B4结合远离NKG2D结合表面的α3结构域(然而，14B4是功能上的阻断抗体)。
实施例5-抗MICA抗体阻断NKG2D-MICA相互作用的能力
A.在抗MICA抗体存在下，用表面等离子共振评价MICA*001-His与NKG2D-Fc的结合
在25℃，在Biacore T100装置(Biacore GE Healthcare公司)上进行SPR测量。在所有Biacore实验中，HBS-EP+缓冲液(Biacore GE Healthcare公司)用作电泳缓冲液，10mM NaOH、500mM NaCl用作再生缓冲液，并且用Biaevaluation 4.1和Biacore T100评估软件分析传感图。
对于溶液竞争实验，将人NKG2D-Fc(R&D systems公司)重组蛋白共价固定到CM5传感片上。10μg/ml恒定浓度的可溶人MICA*01-BirA或人MICA*019-Fc(R&D systems公司)重组蛋白与5至10摩尔等价过量的抗体一起预温育，并且按10μl/min的流速，注射持续2分钟到NKG2D-Fc芯片上。在每个循环后，通过五次第二注射的适当再生缓冲液，使传感片再生。图3示出了结果的代表性实例，并且结果总结在表E中
B.抗MICA抗体阻断通过NK92NK细胞系的Raji-MICA*08转染子细胞的NKG2D依赖性溶解的能力。
评价了抗MICA抗体阻断NKG2D-MICA相互作用的能力。通过测量51Cr的靶细胞释放，测试了抗体减少或抑制MICA*008-转染的Raji的NKG2D+CD16-NK92细胞介导的杀灭的能力。通过本领域熟知的标准方法进行体外细胞毒性测定，例如，如在Coligan(科利根)等人编辑，Current Protocols in Immunology(免疫学实验指南)，Greene Publishing Assoc.(格林出版协会)和Wiley Interscience(威利国际科学)，N.Y.(纽约州)，(1992，1993)中所述。在添加NK细胞系之前用51Cr标记MICA表达靶细胞，然后杀灭被估计为与由于杀灭的结果的从细胞至培养基的51Cr的释放成比例。减少MICA和NKG2D之间的结合或阻断它们之间的相互作用的剂的添加导致防止了经由NKG2D的活化信号传递的引发和蔓延。因此，此类剂的添加导致靶细胞的NK介导的杀灭减少。可商购的阻断抗NKG2D抗体的F(ab’)2片段被用作NKG2D-MICA阻断的阳性对照，Rituximab(嵌合人IgG1抗-CD20)被用作阴性对照来确保并不通过ADCC介导溶解，并且使用处于在与抗MICA相同的条件下产生的无关嵌合人IgG1形式的额外的阴性对照。结果的实例示出在图4中并且总结在表E中。
CHG1-M-MIA-20C6、CHG1-M-MIA-10A7确实阻断重组非糖基化的MICA*001-BirA与二价NKG2D-Fc重组蛋白的相互作用，而它们并不阻断通过NK92的Raji-MICA*08的NKG2D介导的杀灭。第一假设是这两种抗MICA具有对重组MICA*001的最低一价亲和力，因此导致为了阻断细胞间细胞毒性测定中NKG2D-MICA相互作用需要比测试所用更高量的抗体。有趣地，这将意味着当在肿瘤治疗中体内使用时，抗体可能在高剂量具有一些阻断能力(即在ADCC/CDC是优势活性机制时，因为mAb浓度足以导致通过ADCC/CDC的MICA+细胞的充分消耗)，但是随着在给予(高)及剂量之后数天/数周中体内抗体浓度下降，抗体变成非阻断的，允许患者的内生NKG2D受体最佳地发挥功能。可选地，使用Biacore中的重组蛋白评价的阻断能力可以不是细胞膜上存在的天然充分糖基化蛋白的复杂度的预测。在测试期间，NKG2D-Fc和MICA重组蛋白都可以不处于它们的天然构象。最终，在会造成使用的两个实验程序之间观察到的阻断能力中的差异的四级结构方面，可能存在一些不连续的等位基因特异性。
此外，表位不是NKG2D-MICA阻断能力的预测，因为例如在使用并不直接在NKG2D结合位点上的表位的两个测定中，CHG1-M-MIA-19E9是阻断的抗MICA抗体(图2E)。当结合至测试的等位基因时，CHG1-M-MIA-14B4是阻断的NKG2D-MICA相互作用，虽然它的表位是在提示当CHG1-M-MIA-14B4结合时MICA构象改变的α3结构域上。用于CHG1-M-MIA-20C6的表位接近NKG2D结合位点但是并不重叠(图2C、2D和2F)，并且似乎并不在MICA*008上功能上阻断。
表E：通过表面等离子共振或通过功能细胞毒性测定，评价嵌合抗MICA抗体的NKG2D-MICA阻断能力的总结
实施例6-抗MICA抗体与人MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3的交叉反应
对于交叉结合研究，将人ULBP-1-Fc(R&D systems*公司)、MICB-Fc(*)、ULBP-2-Fc(*)和ULBP-3-Fc(*)重组蛋白分别共价固定在CM5传感片的流动池一至四上。按10μl/min的流速，经2分钟将抗MICA抗体(处于10μg/ml的恒定浓度)注射到并行的四个流动池上。在每个循环后，通过五次第二注射的适当再生缓冲液，使传感片再生。
图5A示出了与CHG1-M-MIA-20C6和CHG1-M-MIA-9C10的MICB和ULPB-1、-2及-3的交叉反应不存在。图5B示出CHG1-M-MIA-6E4和CHG1-M-MIA-19E9结合MICB但是不结合ULBP-1、-2和-3。图5C示出CHG1-M-MIA-16A8微弱但是明显地结合MICB但是不结合ULBP-1、-2和-3。预期并未测试的抗体具有类似属性，因为其他抗体共享相同表位区。
表F总结了使用所有的测试的抗MICA抗体的结果。
表F：通过表面等离子共振评价嵌合抗MICA抗体与MICB、ULBP-1、ILBP-2和ULBP-3的交叉反应。
实施例7-抗MICA抗体与食蟹猴MIC蛋白的交叉反应
获得自第一、第二和第三免疫系列(包括CHG1-M-MIA-19E9、CHG1-M-MIA-9C10、CHG1-M-MIA-6E4、CHG1-M-MIA-20C6、CHG1-M-MIA-16A8、CHG1-M-MIA-12A10、CHG1-M-MIA-18E8、CHG1-M-MIA-10F3、CHG1-M-MIA-15F9和CHG1-M-MIA-14B4)的抗体的结合，对它们结合食蟹猴(猕猴)MIC同系物蛋白进行测试。从包括MIC#9-1、MIC#9-2和MIC#2-7的食蟹猴cDNA成功克隆3个序列，并且在小鼠细胞系Baf/3中进行转染。通过流式细胞术分析结合，使用NKG2D-Fc重组蛋白作为对照来检测食蟹猴MIC蛋白的表面表达。
流式细胞术收获细胞，并且在4℃，使用剂量范围的抗MICA mAb或使用NKG2D-Fc重组蛋白(R&D systems公司)，在30分钟期间，在PBS 1X/BSA0,2％/EDTA 2mM缓冲液中对细胞进行染色。在染色缓冲液中洗涤两次后，在4℃，用小鼠抗人类IgG1-PE单克隆抗体(1/11)将与抗MICA抗体一起温育的细胞染色30min。在4℃，用山羊抗人类IgG多克隆抗体(1/200)将与NKG2D-Fc一起温育的细胞染色30min。洗涤两次后，在BD FACS Canto II上获得染色，并且使用BD FACSDiva软件进行分析。
CHG1-M-MIA-19E9、CHG1-M-MIA-9C10、CHG1-M-MIA-6E4、CHG1-M-MIA-20C6、CHG1-M-MIA-16A8、CHG1-M-MIA-12A10、CHG1-M-MIA-10F3、CHG1-M-MIA-15F9和CHG1-M-MIA-14B4抗体结合MIC#2-7食蟹猴蛋白。MIC#2-7分别呈现与MICA*019、MICA*044、MICA*001和MICB*002的99.6％、97.8％、95.6％和86.9％的蛋白同源。除了MIC#2-7，CHG1-M-MIA-6E4还结合MIC#9-1。在测试的实验条件下，CHG1-M-MIA-16A8结合MIC#9-2蛋白。结果示于图6中。
实施例8-MICA脱落的抑制
针对它阻断MICA脱落的能力，将抗α3结构域16A8抗体与可商购的BAM03进行比较(参见Salih(萨利赫)等人(2003)，同上)。在PBS 1X中洗涤C1R-MICA*01和C1R-MICA*04细胞的混合物，用来移除培养物中存在的可溶MICA，并且然后在剂量范围(0/1/3/10/30μg/ml)的16A8或BAM03存在或不存在下，将它在完全培养基中培养过夜。然后收获细胞培养物上清液，并且在ELISA中测试可溶MICA的存在。16A8和BAM03都不干扰用于ELISA的抗MICA抗体(数据未示出)。细胞与BAM03一起过夜温育导致上清液中可溶MICA浓度的下降，而16A8并不诱导可溶MICA的下降。结果示出在图7中，示出由BAM03而不是由16A8介导MICA脱落的抑制。
实施例9-抗MICA抗体对NKG2D下调的影响
报道还透露NK细胞上的NKG2D被sMICA下调(Groh(格罗)等人(2002)Nature(自然)；Arreygue-Garcia(阿莱伊格-加西亚)(2008)BMC；Jinushi(基纳施)等人(2005)J.Hepatol.(肝病学杂志))，导致更小反应性的NK细胞。为了模拟由可溶MICA诱导的下调，进行了以下实验。
在通过冷聚合的单核细胞的非特异性移除以后，在淋巴细胞中富集了来自四个健康供体的冻融的PBMC(Rubinstien(鲁宾斯坦)(1989)J.Clin.Lab.Immunol.(临床与实验免疫学杂志))。在增加浓度的可溶MICA*019-Fc(R&D systems公司)存在下，在抗MICA抗体(CHG1-M-MIA-9C10、CHG1-M-MIA-19E9、CHG1-M-MIA-20C6，处于10μg/mL)存在或不存在下，在4℃或37℃，在96孔板中温育细胞(每孔1.10e5个细胞)24h。由可溶MICA诱导了NKG2D下调，并且通过流式细胞术评价了它的通过抗MICA抗体的阻断。用以下人特异性小鼠抗体对细胞进行染色：抗CD14FITC、抗CD3太平洋蓝(Becton Dickinson公司)、抗CD56PE-Cy7(BioLegend公司)、抗NKG2D PE(Beckman Coulter公司)，并且分析门控的CD3-CD56+NK细胞上的NKG2D表达。
在这一实验设置中，在增加剂量的重组二价MICA*019*Fc蛋白(R&Dsystems公司)存在下，NKG2D下调了它的初始水平的30％至40％(图8)。在培养基中，在2至10μg/ml之间见到这一作用，在来自癌症患者的血清中观察到可溶MICA的很多上述水平(在恶性失调中范围是从30至1557pg/ml，n＝296，Holdenrieder(霍登瑞德)(2006)Int.J.Cancer(国际癌症杂志))。在这些实验条件下，使用一价MICA*01-His重组蛋白未观察到NKG2D下调(数据未示出)。在实施例5B的细胞毒性测定中阻断NKG2D-MICA相互作用的CHG1-M-MIA-9C10和CHG1-M-MIA-19E9抗MICA抗体(表E)正阻断NK细胞上表达的NKG2D与MICA*019-Fc的相互作用，因此反转了由MICA*019-Fc蛋白诱导的NKG2D下调(图8)。CHG1-M-MIA-20C6抗MICA并不反转MICA*019-Fc介导的NKG2D下调(图8)。虽然通过表面等离子共振这一抗体正阻断NKG2D-Fc/MICA*019-Fc结合(表E)，但是它并不增在阻断在实施例5B的细胞毒性测定中的NKG2D/MICA*08(表E)，并且它并不反转在原代细胞上的NKG2D下调，强调了以下事实：至少在测试的实验条件下，使用重组蛋白的NKG2D/MICA阻断实验可以并不是生物学功能的预测。
实施例10-抗MICA抗体能够介导经由CDC的MICA表达靶的杀灭
CHG1-M-MIA-9C10、CHG1-M-MIA-19E9、CHG1-M-MIA-6E4、CHG1-M-MIA-20C6和CHG1-M-MIA-16A8，测试了它们针对用编码MICA*001全蛋白的慢病毒转染的人类Raji肿瘤细胞介导CDC的能力。这些Raji-MICA*01细胞在它们的细胞表面上表达MICA*01。
简要地，在4℃，与表明剂量的抗MICA抗体一起温育100000个Raji-MICA*01细胞1h。然后将包含20％(终浓度)的人血清补体(Quidel公司)的培养基添加至细胞并且在37℃温育3小时。洗涤细胞并且与7-AAD一起温育来染色死细胞。BD FACS Canto II上通过流式细胞术获得细胞，并且使用BD FACSDiva软件进行分析。结果表示为在表明条件下的7-AAD阳性细胞的百分比。
结果示于图9中。这些结果示出了表明的Raji-MICA*01细胞在人类补体的存在下的生活力。这些结果示出CHG1-M-MIA-20C6、CHG1-M-MIA-9C10、CHG1-M-MIA-6E4、和CHG1-M-MIA-19E9导致死细胞的数目增加(分别具有0.97、2、1.01和2.35μg/ml的EC50值)(图9)。死细胞的最大百分比随着不同测试抗体而变化(图9)。显著地，CHG1-M-MIA-16A8并不介导补体细胞毒性。因为这5种抗MICA抗体具有相同数量级的染色C1R-MICA*01的EC50值(表C)，所以补体介导的细胞毒性似乎是表位依赖的(9C10>20C6＝6E4>19E9>>16A8)。
实施例11-抗体能够经由ADCC杀灭MICA表达靶
CHG1-M-MIA-19E9、CHG1-M-MIA-9C10、CHG1-M-MIA-6E4、CHG1-M-MIA-20C6、CHG1-M-MIA-16A8、CHG1-M-MIA-12A10、CHG1-M-MIA-18E8、CHG1-M-MIA-10F3、CHG1-M-MIA-15F9和CHG1-M-MIA-14B4，测试了它们针对用MICA*008(C1R-MICA*008)转染的C1R肿瘤细胞介导ADCC的能力。
简要地，在来自(Greiner公司)的96孔板V中，在经典4-h 31Cr释放测定中，评价了用人CD16(V同种型)转染的人NK细胞系KHYG-1的细胞溶解活性。简要地，按等于20的效应物/靶比率，在表明浓度的抗体和10μg/ml F(ab’)2ON-72存在下，用51Cr(100μCi(3.7MBq)/1x 106个细胞)标记C1R-MICA*008细胞，然后与用hCD16V转染的KHYG混合(以结合人IgG1)，用来阻断任何NKG2D介导的细胞毒性。在短暂离心和在37℃的4小时的温育后，50μL移除上清液没并且用TopCount NXTβ探测器(PerkinElmer Life Sciences公司，波士顿，马萨诸塞州)测量51Cr释放。一式三份分析素有实验组，并且按以下确定特异性溶解的百分比：100x(平均cpm实验释放-平均cpm自发释放)/(平均cpm总释放-平均cpm自发释放)。通过用2％Triton(曲通)X 100(Sigma公司)溶解靶细胞，获得总释放的百分比。
结果示于图10A中。与阴性对照(人类IgG1同种型对照抗体)相比，CHG1-M-MIA-9C10、CHG1-M-MIA-19E9、CHG1-M-MIA-6E4、CHG1-M-MIA-20C6和CHG1-M-MIA-16A8各自通过人类KHYG-1hCD16V NK细胞系诱导C1R-MICA*008细胞的特异性溶解，由此示出这些抗体针对MICA*008表达靶细胞诱导ADCC。靶细胞溶解的程度与结合细胞的抗体相关(图10B)。
实施例12-在RAJI-MICA*01高异种移植物的小鼠模型中，嵌合抗MICA 9C10、19E9、6E4、20C6和16A8示出抗肿瘤疗效
在其中RAJI细胞表达高水平的抗原MICA*01的小鼠长期RAJI-MICA*01肿瘤模型中测试抗体。Nod SCID小鼠静脉内移入15.106RAJI-MICA*01High(高)，并且按300μg/小鼠的剂量，从肿瘤细胞移植的那天开始，IP两次/周持续3周，用对照同种型对照抗体(IC)抑或嵌合抗体CHG1-M-MIA-9C10、CHG1-M-MIA-19E9、CHG1-M-MIA-6E4、CHG1-M-MIA-20C6、or CHG1-M-MIA-16A8进行处理。
在注射到小鼠中之前，在包含(补充有)10％的热灭活胎牛血清、1％L-谷氨酰胺、1％丙酮酸钠并且无抗体的完全RPMI 1640培养基中培养RAJI-MICA*01High(高)。
每周将小鼠称重两次。建立Kaplan(卡普兰)-Meier(迈耶)存活曲线来评价处理的小鼠的存活。
结果示于图11中。所有嵌合抗体示出抗肿瘤活性。接收同种型对照的动物具有27天的中位存活期，而用至少有效的嵌合抗体(16A8)处理的小鼠具有77天的中位存活期。对于所有其他抗体，多于50％的动物在第100天仍活着，阻止了中位存活期的计算，并且表明非常强的抗肿瘤效果。
在此使用的所有标题和副标题仅为了方便，并且不应以任何方式解释为限制本发明。除非在此另外表明或由上下文另外清晰地否定，处于其所有可能变化的上述元素的任何组合都由本发明涵盖。除非在此另外表明，在此的值的范围的详述仅旨在用作单独提及落在该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值并入本说明书，就像它在此单独列举一样。除非另外说明，在此提供的确切值都代表相应的近似值(例如相对于具体因子或测量值提供的所有确切示例性值都可以被认为是还提供了相应的近似测量值，在适当情况下由“约”修饰)。
除非在此另外表明或由上下文另外清晰地否定，可以按任何适合的顺序进行在此所述的方法。
在此提供的任何和所有实例、或示例性语言(例如“such as(例如)”)的使用都仅旨在更好地说明本发明并且不造成对本发明的范围的限制，除非另外指明。在本说明书中，没有语言应被解释为表明任何元素是实践本发明所必要的，除非同样被明确说明。
在此进行专利文件的引用和合并仅出于方便，并且并不反映此类专利文件的有效性、专利性和/或可执行性的任何观点，本发明的任何方面或实施例的在此的说明使用术语(例如参考一个或多个元素)旨在对“由……组成”、“基本上由……组成”或“基本上包括”该一个或多个具体元素的本发明的类似方面或实施例提供支持，除非另外表明或由上下文清晰地否定，(例如在此描述为包括具体元素的组合物应该被理解为还描述了由该元素组成的组合物，除非另外表明或由上下文清晰地否定)。
本发明包括至可适用法律允许的最大程度的在此呈现的方面或权利要求书中引用的主题的所有修改和等效物。
在本说明书中引用的所有出版物和专利申请都通过引用以其全文结合在此，就像各单独的出版物或专利申请确切并且独立地旨在通过引用而结合。
虽然出于理解清晰的目的已经通过说明和举例在一些细节描述了上述发明，但是鉴于本发明的教授内容，对于本领域普通技术人员容易清楚的是可以对此做出某些改变和修改而不偏离所附权利要求书的精神或范围。

Claims (47)

1.一种单克隆抗体，其结合至包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的MICA多肽、包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的MICA多肽、以及包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的MICA多肽。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体的特征在于通过流式细胞术确定的下述EC50：对于与在其表面表达包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的MICA多肽的细胞、在其表面表达包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的MICA多肽的细胞、以及在其表面表达包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的MICA多肽的细胞的结合而言，该EC50至多5μg/ml，任选地至多3μg/ml、至多2μg/ml、至多1μg/ml或至多0.5μg/ml。
3.如权利要求1-2所述的抗体，其中所述抗体进一步结合至包括SEQ IDNO:3的氨基酸序列的MICA多肽；任选地，其中所述抗体的特征在于对于与在其表面表达所述MICA多肽的细胞的结合而言至多5μg/ml，任选地至多3μg/ml、至多2μg/ml、至多1μg/ml或至多0.5μg/ml的EC50。
4.如权利要求1-3所述的抗体，其中所述抗体进一步结合至包括SEQ IDNO:6的氨基酸序列的MICB多肽；任选地，其中所述抗体的特征在于对于与在其表面表达所述MICB多肽的细胞的结合而言至多5μg/ml，任选地至多3μg/ml、至多2μg/ml、至多1μg/ml或至多0.5μg/ml的EC50。
5.如权利要求1-4所述的抗体，其中所述抗体结合至SEQ ID NO:1的MICA多肽的α1和/或α2结构域。
6.如权利要求1-5所述的抗体，其中所述抗体不抑制MICA在NKG2D表达细胞中诱导NKG2D活性的能力。
7.如权利要求1-5所述的抗体，其中所述抗体阻断MICA与NKG2D的相互作用。
8.如权利要求1-5或7所述的抗体，其中所述抗体抑制sMICA诱导的NKG2D在细胞的表面上的表达的下调。
9.如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合至表位，该表位包括选自下组的任何一个或多个氨基酸残基，该组由以下组成：SEQ ID NO:1的MICA多肽的R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230以及D232。
10.如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体具有至突变型MICA多肽的减少的结合，该突变型MICA多肽在以下各项处包括突变：
(a)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：Q48、W49、E51、D52、V53和L54；
(b)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：N56、K57、T58、R61和R64；
(c)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84、H109、Y111、D113、L116、S133、R134、T137、M140、N141、R143和N144；
(d)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84、H109、Y111、D113、L116、Q131、S132、Q136、M140、N141、R143和N144；
(e)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：E100、D101、N102、S103、T104、R105、N121、E123、T124和E126；
(f)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：R6、N8、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、E115、L178、R179和R180；或
(g)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230和D232，
在每种情况下相对于所述抗体与SEQ ID NO:1的野生型MICA多肽之间的结合。
11.如权利要求1-10中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合至SEQ ID NO:1的MICA多肽的α3结构域。
12.如权利要求1-10中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合至SEQ ID NO:1的MICA多肽的α1和/或α2结构域。
13.一种单克隆抗体，其结合SEQ ID NO:1的人类MICA多肽，其中所述抗体不阻断MICA与NKG2D的相互作用并且不阻断MICA自MICA-表达细胞脱落。
14.一种单克隆抗体，其结合SEQ ID NO:1的人类MICA多肽，其中所述抗体抑制sMICA诱导的NKG2D在免疫效应细胞的表面上的表达的下调而不阻断MICA自MICA表达细胞脱落。
15.一种单克隆抗体，其结合至SEQ ID NO:1的MICA多肽的α1和/或α2结构域，其中所述抗体不阻断MICA与NKG2D的相互作用和/或不抑制MICA在NKG2D表达细胞中诱导NKG2D活性的能力。
16.一种单克隆抗体，其结合至SEQ ID NO:1的MICA多肽的α3结构域，其中所述抗体阻断MICA与NKG2D的相互作用和/或抑制sMICA诱导的NKG2D在NKG2D表达细胞中的活性。
17.如权利要求16所述的抗体，其中所述抗体抑制sMICA诱导的NKG2D在细胞的表面上的表达的下调。
18.如权利要求13-17所述的抗体，其中所述抗体结合至包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的MICA多肽、包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的MICA多肽、包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的MICA多肽、以及包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列的MICA多肽。
19.如权利要求18所述的抗体，其中所述抗体结合至包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的MICB多肽和/或包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的MICA多肽。
20.如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合至包括O联和/或N联聚糖的MICA多肽，任选地其中所述抗体结合至由肿瘤细胞表达的糖基化MICA多肽。
21.如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体不阻断MICA自细胞脱落。
22.一种单克隆抗体，其结合SEQ ID NO:1的MICA多肽，其中所述抗体具有至突变型MICA多肽的减少的结合，该突变型MICA多肽在以下各项处包括突变：
(a)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：Q48、W49、E51、D52、V53和L54；
(b)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：N56、K57、T58、R61和R64；
(c)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84、H109、Y111、D113、L116、S133、R134、T137、M140、N141、R143和N144；
(d)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：K81、D82、Q83、K84、H109、Y111、D113、L116、Q131、S132、Q136、M140、N141、R143和N144；
(e)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：E100、D101、N102、S103、T104、R105、N121、E123、T124和E126；
(f)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：R6、N8、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、E115、L178、R179和R180；或
(g)选自下组的1、2、3、4个或更多个残基，该组由以下各项组成：S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230和D232，
在每种情况下相对于所述抗体与SEQ ID NO:1的野生型MICA多肽之间的结合。
23.一种单克隆抗体，其结合至表位，该表位包括选自下组的任何一个或多个氨基酸残基，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1的MICA多肽的R6、N8、Q48、W49、E51、D52、V53、L54、N56、K57、T58、R61、R64、K81、D82、Q83、K84、E97、H99、E100、D101、N102、S103、T104、R105、H109、Y111、D113、E115、L116、N121、E123、T124、E126、Q131、S132、S133、R134、Q136、T137、M140、N141、R143、N144、L178、R179、R180、S224、H225、D226、T227、Q228、Q229、W230以及D232。
24.如前面权利要求中任一项所述的抗体，其中对于与SEQ ID NO1的MICA多肽的结合，所述抗体与选自下组的抗体竞争，该组由以下各项组成：
(a)分别具有SEQ ID NO:7和8的VH和VL区的抗体(6E4)；
(b)分别具有SEQ ID NO:20和21的VH和VL区的抗体(20C6)；
(c)分别具有SEQ ID NO:33和34的VH和VL区的抗体(16A8)；
(d)分别具有SEQ ID NO:46和47的VH和VL区的抗体(19E9)；
(e)分别具有SEQ ID NO:57和58的VH和VL区的抗体(9C10)；
(f)分别具有SEQ ID NO:68和69的VH和VL区的抗体(12A10)；
(g)分别具有SEQ ID NO:79和80的VH和VL区的抗体(10A7)；
(h)分别具有SEQ ID NO:90和91的VH和VL区的抗体(18E8)；
(i)分别具有SEQ ID NO:101和102的VH和VL区的抗体(10F3)；
(j)分别具有SEQ ID NO:112和113的VH和VL区的抗体(15F9)；以及
(k)分别具有SEQ ID NO:123和124的VH和VL区的抗体(14B4)。
25.根据以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括轻链和重链，所述轻链包括：
a包括具有式VI的氨基酸序列(SEQ ID NO:266)的轻链CDR1(LCDR1)；
b包括具有式VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:267)的轻链CDR2(LCDR2)；和
c包括具有式VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:268)的轻链CDR3(LCDR3)；
所述重链包括：
d包括选自式I、II以及III的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:261、262以及263)的重链CDR1(HCDR1)；和/或
e包括具有式IV的氨基酸序列(SEQ ID NO:264)的重链CDR2(HCDR2)；和/或
f包括具有式V的氨基酸序列(SEQ ID NO:265)的重链CDR3(HCDR3)。
26.选自下组的单克隆抗体，该组由以下各项组成：
(a)单克隆抗体，其包括(i)包括SEQ ID NO:7的重链可变区的CDR1、2和3的重链以及(ii)包括SEQ ID NO:8的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链；
(b)单克隆抗体，其包括(i)包括SEQ ID NO:20的重链可变区的CDR1、2和3的重链以及(ii)包括SEQ ID NO:21的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链；
(c)单克隆抗体，其包括(i)包括SEQ ID NO:33的重链可变区的CDR1、2和3的重链以及(ii)包括SEQ ID NO:34的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链；
(d)单克隆抗体，其包括(i)包括SEQ ID NO:46的重链可变区的CDR1、2和3的重链以及(ii)包括SEQ ID NO:47的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链；
(e)单克隆抗体，其包括(i)包括SEQ ID NO:57的重链可变区的CDR1、2和3的重链以及(ii)包括SEQ ID NO:58的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链；
(f)单克隆抗体，其包括(i)包括SEQ ID NO:68的重链可变区的CDR1、2和3的重链以及(ii)包括SEQ ID NO:69的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链；
(g)单克隆抗体，其包括(i)包括SEQ ID NO:79的重链可变区的CDR1、2和3的重链以及(ii)包括SEQ ID NO:80的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链；
(h)单克隆抗体，其包括(i)包括SEQ ID NO:90的重链可变区的CDR1、2和3的重链以及(ii)包括SEQ ID NO:91的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链；
(i)单克隆抗体，其包括(i)包括SEQ ID NO:101的重链可变区的CDR1、2和3的重链以及(ii)包括SEQ ID NO:102的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链；
(j)单克隆抗体，其包括(i)包括SEQ ID NO:112的重链可变区的CDR1、2和3的重链以及(ii)包括SEQ ID NO:113的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链；以及
(k)单克隆抗体，其包括(i)包括SEQ ID NO:123的重链可变区的CDR1、2和3的重链以及(ii)包括SEQ ID NO:124的轻链可变区的CDR1、2和3的轻链。
27.如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括结合人类FcγIIIA受体的人类重链恒定区。
28.如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体对于结合至MICA多肽具有小于10-9M的二价Kd。
29.如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体、人类抗体或人源化抗体。
30.如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是四聚体抗体。
31.如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中该抗体是选自以下的抗体片段：Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、双抗体、单链抗体片段、或包括多个不同抗体片段的多特异性抗体。
32.如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体共轭或共价地结合至毒剂。
33.如以上权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体共轭或共价地结合至可检测部分。
34.一种抗体，其通过嵌合化或人源化如权利要求1至28所述的抗体而获得。
35.一种药物组合物，其包括根据以上权利要求中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载体。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述抗体以约25mg与500mg之间的量存在。
37.一种试剂盒，其包括如以上权利要求中任一项所述的抗体，任选地进一步包括特异性识别如以上权利要求中任一项所述的抗体的标记的第二抗体。
38.一种杂交瘤或重组宿主细胞，其产生如权利要求1至28所述的抗体。
39.一种用于治疗或预防对其有需要的患者的疾病的方法，所述方法包括向所述患者给予有效量的如权利要求1-34所述的抗体或如权利要求35-36所述的组合物。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述疾病是癌症。
41.一种用于在对象中鉴定MICA表达细胞的方法，所述方法包括从对象获得包括细胞的生物样品，使所述细胞与如权利要求1-34所述的抗体接触并且评价所述抗体是否结合至所述细胞。
42.一种用于在对象中鉴定MICA表达疾病相关细胞的方法，所述方法包括从对象获得包括疾病相关细胞的生物样品，使所述疾病相关细胞与如权利要求1-34所述的抗体接触并且评价所述抗体是否结合至疾病相关细胞，其中所述抗体结合至疾病相关细胞的发现指示所述对象罹患疾病、所述对象具有疾病相关细胞和/或所述疾病相关细胞表达MICA。
43.一种用于选择罹患对用如权利要求1-34所述的抗体的治疗应答的对象的方法，所述方法包括确定所述对象中的肿瘤细胞是否表达MICA多肽，任选地肿瘤细胞是否表达升高水平的MICA多肽，MICA多肽或升高水平的MICA多肽的所述表达是应答对象的指征。
44.如权利要求43所述的方法，进一步包括向应答对象给予如权利要求1-34所述的抗体。
45.如权利要求42-44所述的方法，其中所述疾病是癌症。
46.如权利要求42-45所述的方法，其中所述疾病相关细胞或肿瘤细胞表达糖基化MICA多肽，任选地是包括一个或多个核心2O-聚糖的MICA多肽。
47.如权利要求41-46所述的方法，其中所述方法在确定所述对象、所述疾病相关细胞或所述肿瘤细胞是否包括选自下组的MICA等位基因之前没有另外的步骤，该组由以下各项组成：MICA*001、MICA*004、MICA*007以及MICA*008。
CN201380017820.5A 2012-02-07 2013-02-07 Mica结合剂 Pending CN104244977A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261595902P 2012-02-07 2012-02-07
US61/595,902 2012-02-07
US201261625841P 2012-04-18 2012-04-18
US61/625,841 2012-04-18
PCT/EP2013/052439 WO2013117647A1 (en) 2012-02-07 2013-02-07 Mica binding agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104244977A true CN104244977A (zh) 2014-12-24

Family

ID=47714068

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380017820.5A Pending CN104244977A (zh) 2012-02-07 2013-02-07 Mica结合剂

Country Status (11)

Country Link
US (2) US10577416B2 (zh)
EP (1) EP2812027A1 (zh)
JP (1) JP6405242B2 (zh)
CN (1) CN104244977A (zh)
AU (1) AU2013218017B2 (zh)
BR (1) BR112014019611A2 (zh)
CA (1) CA2862101A1 (zh)
IL (1) IL233793B (zh)
RU (1) RU2656183C2 (zh)
SG (1) SG11201404177PA (zh)
WO (1) WO2013117647A1 (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107779433A (zh) * 2016-08-30 2018-03-09 天津市康婷生物工程有限公司 便捷的刺激nk细胞增殖和分化的饲养层制备方法
CN107964041A (zh) * 2016-10-20 2018-04-27 中国科学院广州生物医药与健康研究院 高稳定性和高亲和力的dmic及其制法
CN110088137A (zh) * 2016-10-19 2019-08-02 诺瓦罗技科斯生物科技有限公司 针对mica和micb蛋白的抗体
CN111465614A (zh) * 2017-07-10 2020-07-28 先天制药公司 使用人siglec-9抗体和人nkg2a抗体治疗癌症的组合疗法
CN111542539A (zh) * 2017-10-06 2020-08-14 先天制药公司 通过cd39/cd73轴恢复t细胞活性
CN111718416A (zh) * 2020-06-25 2020-09-29 菲鹏生物股份有限公司 抗硫氧还蛋白的抗体、其应用和诊断试剂盒
CN114369161A (zh) * 2021-12-28 2022-04-19 合肥天港免疫药物有限公司 Mica抗体及其应用
CN115611982A (zh) * 2021-07-14 2023-01-17 浙江大学 一种抗人MICA/Bα3区的单克隆抗体及其应用
WO2023124857A1 (zh) * 2021-12-28 2023-07-06 合肥天港免疫药物有限公司 抗体及其应用

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3628329B1 (en) 2011-09-30 2022-08-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Therapeutic peptides comprising antibodies binding to mhc class 1 polypeptide related sequence a (mica)
RU2656183C2 (ru) 2012-02-07 2018-05-31 Иннейт Фарма Связывающие mica агенты
EP2970490A4 (en) 2013-03-15 2017-04-26 Novelogics Biotechnology, Inc. Antibodies to mica and micb proteins
WO2014144791A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Therapeutic peptides
WO2015085210A1 (en) * 2013-12-06 2015-06-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Therapeutic peptides
EP3116903A2 (en) 2014-03-14 2017-01-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Vaccine compositions and methods for restoring nkg2d pathway function against cancers
PT3227311T (pt) * 2014-12-05 2022-02-23 Xyphos Biosciences Inc Fragmentos variáveis inseríveis de anticorpos e domínios a1-a2 modificados de ligandos de nkg2d
WO2016154585A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Charles Sentman Anti-mica antigen binding fragments, fusion molecules, cells which express and methods of using
EP3325967B1 (en) 2015-07-24 2019-12-04 Innate Pharma Methods for detecting tissue infiltrating nk cells
CR20230116A (es) 2015-12-04 2023-05-05 Dana Farber Cancer Inst Inc Composición de vacuna que comprende el dominio alfa 3 de mica/b (div. 2018-350)
WO2017147247A1 (en) * 2016-02-23 2017-08-31 Pires Eusebio S Anti-sas1b antibodies and methods of use
US20170267764A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Innate Pharma Anti-mica antibodies
CN110267678A (zh) * 2016-10-29 2019-09-20 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗mic抗体和使用方法
CN110366563A (zh) 2016-12-22 2019-10-22 西奈山伊坎医学院 抗lilrb3抗体及其使用方法
WO2018141959A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Innate Pharma Immunomodulatory antibody drug conjugates binding to a human mica polypeptide
WO2018217688A1 (en) 2017-05-22 2018-11-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for inhibition of mica/b shedding
TW202003565A (zh) * 2018-03-23 2020-01-16 美商必治妥美雅史谷比公司 抗mica及/或micb抗體及其用途
CN113056484A (zh) 2018-07-31 2021-06-29 库利南Mica公司 阻断mica/b脱落的抗mica/b抗体及其使用方法
WO2020035345A1 (en) 2018-08-14 2020-02-20 Innate Pharma Treatment of colorectal cancer by a combination of an anti-mica antibody and an anti-nkg2a antibody
AU2020336023A1 (en) * 2019-08-23 2022-03-03 Northwestern University Materials and methods for activating antigen-specific T cell responses
AU2020397189A1 (en) * 2019-12-05 2022-07-14 Vycellix, Inc. Modulators of the immune escape mechanism for universal cell therapy
CN111471099B (zh) * 2020-03-31 2022-04-12 长沙学院 MICA胞外区突变体及其筛选的方法、scFv-MICA融合抗体及其制备方法和应用
WO2022033975A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Innate Pharma Cell surface mica and micb detection using antibodies
CN112694532B (zh) * 2021-01-12 2023-04-18 倍而达药业（苏州）有限公司 抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段及应用

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
WO1996030511A1 (en) * 1995-03-29 1996-10-03 The Immunogenetics Research Foundation Incorporated Polymorphic and multicopy members of mhc gene families
CA2275141A1 (en) 1996-10-29 1998-05-07 Thomas Spies Cell stress regulated human mhc class i gene
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
DE69942021D1 (de) 1998-04-20 2010-04-01 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PL209392B1 (pl) 1999-01-15 2011-08-31 Genentech Inc Przeciwciało, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała oraz zastosowanie przeciwciała
EP2278003B2 (en) 1999-04-09 2020-08-05 Kyowa Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
CN100423777C (zh) 2001-10-25 2008-10-08 杰南技术公司 糖蛋白组合物
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
EP1578923A4 (en) * 2002-04-22 2009-01-21 Hutchinson Fred Cancer Res SOLUBLE MIC POLYPEPTIDE AS A MARKER FOR THE DIAGNOSIS, FORECAST AND TREATMENT OF CANCER AND AUTOIMMUNE DISEASES OR DISEASES
WO2004016750A2 (en) 2002-08-14 2004-02-26 Macrogenics, Inc. FcϜRIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
JP2008504002A (ja) 2003-11-12 2008-02-14 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合ポリペプチド改変体、ダイマーＦｃ結合タンパク質、およびそれらに関連する方法
KR101297146B1 (ko) 2004-05-10 2013-08-21 마크로제닉스, 인크. 인간화 ＦｃγＲＩＩＢ 특이적 항체 및 그의 사용 방법
EP1810035A4 (en) 2004-11-10 2010-03-17 Macrogenics Inc EFFECTOR FUNCTION OBTAINED BY CREATION BY BIOLOGICAL GENE OF FC ANTIBODY REGIONS
KR20080032065A (ko) 2005-06-03 2008-04-14 제넨테크, 인크. 푸코실화 수준이 조절된 항체의 생성 방법
LT2573114T (lt) 2005-08-10 2016-10-10 Macrogenics, Inc. Atpažinimas ir konstravimas antikūnų su variantinėmis fc sritimis ir jų panaudojimo būdai
WO2007055926A1 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Negative immunomodulation of immune responses by nkg2d-positive cd4+ cells
FR2894982A1 (fr) 2005-12-16 2007-06-22 Lab Francais Du Fractionnement Procede de preparation d'anticorps selectifs des recepteurs fc activateurs
ES2395842T3 (es) 2006-01-17 2013-02-15 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Composiciones y métodos para la humanización y optimización de N-glicanos en plantas
CA2644903A1 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant heavy chains and methods of using same
ES2489646T3 (es) 2006-05-26 2014-09-02 Macrogenics, Inc. Anticuerpos humanizados específicos a Fc gamma RIIB y sus métodos de uso
CA2656224C (en) 2006-06-26 2018-01-09 Macrogenics, Inc. Combination of fc.gamma.riib antibodies and cd20-specific antibodies and methods of use thereof
EP1878747A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 greenovation Biotech GmbH Glyco-engineered antibodies
EP2083857A4 (en) * 2006-09-22 2010-03-24 Dana Farber Cancer Res Inc METHOD FOR TREATING INTERFERENCE IN CONNECTION WITH MICA
CA3011859A1 (en) * 2007-04-23 2008-10-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center Negative immunomodulation of immune responses by erp5
EP1995309A1 (en) 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
US8802091B2 (en) 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
RS55906B1 (sr) 2010-12-23 2017-09-29 Janssen Biotech Inc Mutanti fc antitela koji su otporni na aktivnu proteazu
EP3628329B1 (en) * 2011-09-30 2022-08-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Therapeutic peptides comprising antibodies binding to mhc class 1 polypeptide related sequence a (mica)
RU2656183C2 (ru) 2012-02-07 2018-05-31 Иннейт Фарма Связывающие mica агенты
US20170267764A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Innate Pharma Anti-mica antibodies

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HELMUT RAINER SALIH,ET AL: "Functional expression and release of ligands for the activating immunoreceptor NKG2D in leukemia", 《BLOOD》 *
SUAREZ-ALVAREZ BEATRIZ ET AL.: "Identification of epitopes and immunodominant regions on the MICA protein defined by alloantibodies from kidney transplant patients", 《TRANSPLANTATION》 *
W.WONGSENA ET AL.: "Production and characterizqation of monoclonal antibodies against major histocompatibility complex class I chain-related gene A", 《TISSUE ANTIGENS》 *
YIZHOU ZOU ET AL.: "MICA is a target for complement dependent cytotoxicity with mouse monoclonal antibodies and human alloantibodies", 《HUMAN IMMUNOLOGY》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107779433A (zh) * 2016-08-30 2018-03-09 天津市康婷生物工程有限公司 便捷的刺激nk细胞增殖和分化的饲养层制备方法
CN110088137A (zh) * 2016-10-19 2019-08-02 诺瓦罗技科斯生物科技有限公司 针对mica和micb蛋白的抗体
CN107964041B (zh) * 2016-10-20 2023-08-01 中国科学院广州生物医药与健康研究院 高稳定性和高亲和力的dmic及其制法
CN107964041A (zh) * 2016-10-20 2018-04-27 中国科学院广州生物医药与健康研究院 高稳定性和高亲和力的dmic及其制法
CN109890837A (zh) * 2016-10-20 2019-06-14 中国科学院广州生物医药与健康研究院 高稳定性和高亲和力的dmic及其制法
CN109890837B (zh) * 2016-10-20 2023-09-08 中国科学院广州生物医药与健康研究院 高稳定性和高亲和力的dmic及其制法
CN111465614A (zh) * 2017-07-10 2020-07-28 先天制药公司 使用人siglec-9抗体和人nkg2a抗体治疗癌症的组合疗法
CN111542539A (zh) * 2017-10-06 2020-08-14 先天制药公司 通过cd39/cd73轴恢复t细胞活性
CN111542539B (zh) * 2017-10-06 2023-10-20 先天制药公司 通过cd39/cd73轴恢复t细胞活性
CN111718416A (zh) * 2020-06-25 2020-09-29 菲鹏生物股份有限公司 抗硫氧还蛋白的抗体、其应用和诊断试剂盒
CN115611982A (zh) * 2021-07-14 2023-01-17 浙江大学 一种抗人MICA/Bα3区的单克隆抗体及其应用
CN115611982B (zh) * 2021-07-14 2024-05-10 浙江大学 一种抗人MICA/Bα3区的单克隆抗体及其应用
WO2023124857A1 (zh) * 2021-12-28 2023-07-06 合肥天港免疫药物有限公司 抗体及其应用
CN114369161A (zh) * 2021-12-28 2022-04-19 合肥天港免疫药物有限公司 Mica抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201404177PA (en) 2014-08-28
JP6405242B2 (ja) 2018-10-17
US20150191542A1 (en) 2015-07-09
BR112014019611A2 (pt) 2017-06-27
RU2014131317A (ru) 2016-03-27
WO2013117647A1 (en) 2013-08-15
EP2812027A1 (en) 2014-12-17
IL233793B (en) 2020-04-30
RU2656183C2 (ru) 2018-05-31
JP2015508757A (ja) 2015-03-23
US10577416B2 (en) 2020-03-03
US20200299380A1 (en) 2020-09-24
IL233793A0 (en) 2014-09-30
AU2013218017A1 (en) 2014-09-11
AU2013218017A2 (en) 2014-10-16
CA2862101A1 (en) 2013-08-15
AU2013218017B2 (en) 2017-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200299380A1 (en) Mica binding agents
KR102585976B1 (ko) 항-tigit 항체, 항-pvrig 항체 및 이들의 조합
JP7235733B2 (ja) Ｐｄ－１に特異的に結合する抗体、及び使用方法
TWI718118B (zh) 針對ｒｏｒ１之特異性抗體及嵌合抗原受體
CN105473615B (zh) 抗-CD38抗体和与致弱干扰素α-2B的融合体
US20170267764A1 (en) Anti-mica antibodies
CN108430509A (zh) 特异性结合tim-3的抗体及其用途
CN109863170A (zh) 具有增强的激动作用和效应子功能的工程化抗体及其他含Fc结构域分子
CN109069622A (zh) 特异性结合人cd40的拮抗性抗体和使用方法
JP2022541332A (ja) カリクレイン関連ペプチダーゼ２抗原結合ドメインを含むタンパク質及びその使用
KR20230093010A (ko) 신규 항-lilrb2 항체 및 유도체 생성물
JP2023517660A (ja) シグレック３／ｃｄ３３に結合させるための材料及び方法
CN109689870A (zh) 用于治疗自身免疫疾病的抗体
CN116410326A (zh) 抗cd40×cldn18.2双特异性抗体及其用途
CN114773485A (zh) 抗人PD-L1抗体和TGFβRII的双功能融合蛋白分子
CN102329394A (zh) 重组人源化抗cd20单克隆抗体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20141224