KR20090039756A

KR20090039756A - 당조작 항체

Info

Publication number: KR20090039756A
Application number: KR1020097002684A
Authority: KR
Inventors: 만프레드 슈스터; 랄프 키르하이스; 안드레아스 네한스키; 볼프강 요스트; 길버트 고르
Original assignee: 그리노파티온 바이오테크 게엠베하
Priority date: 2006-07-11
Filing date: 2007-07-11
Publication date: 2009-04-22
Also published as: EP1878747A1; PL2368913T3; EP2044121A2; DK2044121T3; US20090291078A1; US10253098B2; CN101495514A; PL2044121T3; WO2008006554A3; EP2044121B1; CA2657605C; EP2368913A2; WO2008006554A2; ES2428875T3; JP5424878B2; IL196022A; IL196022A0; DK2368913T3; WO2008006554A8; PT2368913E

Abstract

본 발명은 항원에 특이적인, 동물의 변형된 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 단편을 포함하는, 항체 제조물로써, 상기 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 단편은 푸코오스와 크실로오스가 없는 N-글리칸 구조를 포함하며, 상기 변형된 항체, 유도체 또는 이의 단편의 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이상이 C-말단 리신 잔기가 결여되어 있는 것을 특징으로 하는 항체 제조물과 관련이 있다.

Description

당조작 항체{GLYCOENGINEERED ANTIBODIES}

본 발명은 변형된 항체, 또는 이의 유도체 또는 이의 단편 분야와 관련이 있다.

약제 산업은 생물의약품(biopharmaceuticals)의 비용 효율적 대안적 대규모 생산 시스템에 대한 요구를 직면하고 있다. 한편, 식물-기반 발현 시스템은 동물 세포 공장에 대한 적합한 대안책으로서 이들의 유용성이 입증되었다. 특히, 사람 병원균의 부재로 인한 최소화된 오염 위험을 통한 탁월한 안정성과 조합된 이들의 낮은 생산 비용[Raskin, I. et al., Trends Biotechnol 20, 522-531 (2002); Fischer, R. et al., Curr Opin Plant Biol 7, 152-158 (2004)]이 가장 중요하다. 식물은 대부분의 고등 진핵성 번역후 변형(modifications)을 수행할 수 있다[Gomord, V. & Faye, L., Curr Opin Plant Biol 7, 171-181 (2004)]. 이러한 변형은 복잡한 당화, 단백질 가공 및 폴딩을 비롯한 복합 다량체(multimeric) 단백질의 조립을 포함하며, 상기 변형들은 활성 치료 항체의 생활성 및 약동학에 기여하는 특징들이다. 그러므로, 사람 항체를 포함하는, 다양한 재조합 단백질은 식물 숙주 발현 시스템내에서 성공적으로 발현되었다[Hiatt, A. et al., Nature 342, 76-78 (1989); Ma, J. K. et al., Nat Rev Genet 4, 794-805 (2003)].

그럼에도 불구하고, 식물 유래 N-연결 올리고당류는 사람에서 발견되는 올리고당류와는 상당히 차이가 있다. 식물에서 α1,6-푸코실 잔기의 일반적 부재 외에, 당화와 같은, 번역후 변형에서의 차이가 식물-유래 단백질의 특성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다[Daniell et al., 전게서; Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109; Mann et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:255-261]. 식물에서, N-연결 글리칸은 글리칸 코어의 N-연결된 만노오스에 부착된 항원성[Faye et al. (1993) AnA1. Biochem. 109:104-108] 및/또는 알레르겐성(allergenic)[van Ree et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:11451-11458] β(1,2)-크실로오스(Xyl) 잔기 및 포유류 글리칸에 존재하지 않는 근위(proximal) GlcNAc에 부착된 α(1,3)-푸코오스(Fuc) 잔기를 함유할 수 있다. 대조적으로, 시알산 잔기는 일반적으로 식물 N-글리칸에 부착되어 있지 않다. 그러나, 식물 항체는 성공적인 국소 수동 면역화(passive immunization)를 위해 이러한 잔기를 필요로 하지 아니한다(Ma et al., 전게서).

소포체(ER)에서 당화 가공은 거의 모든 종들 간에 보존되어 있고 올리고-만노오스(Man_5-9GlcNAc₂) 타입 N-글리칸에 제한되어 있는 반면, 하이브리드 및 복합체 타입 글리칸에 대한 골지-발생(golgi-generated) 가공은 매우 다양하다[Helenius et al. (2001) Science 291:2364-2369]. 유전자도입(Transgenic) 식물에서 발현 단백질의 ER 체류는 일반적으로 생산 수준을 개선시킨다[Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 101-109; Sharp et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 73:338- 346]. 그러나, 글리칸 가공이 항체의 안정성에 영향을 미칠 수 있기 때문에[Rudd et al. (2001) Science 291:2370-2376], 변형된 글리칸 구조를 지닌 식물 발현 시스템에서 유래된 항체가 활성을 나타내며 전신성 노출후 효과적인 예방(prophylaxis)을 제공할 수 있을지 여부는 불분명하다.

함유된 현탁 배양물 중의 재조합 단백질을 위한 대규모 호환성 생산 플랫폼으로서 강건한 이끼(robust moss) 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens)는 표적화된 유전자의 효율적인 녹아웃(knock-out)을 가능케하는 엄청나게 높은 속도의 상동성 핵(nuclear) DNA 재조합 - 육상(land) 식물에서의 재조합만이 아님 - 과 몇 가지 이로운 속성을 결합시킴으로써 동물 구성성분이 완전 결여된, 차세대 생산 기술을 제공한다[Gorr, G. & Wagner, S., Modern Biopharmaceuticals 3, 919-929 (2005); Girke, T. et al., Plant J 15, 39-48 (1998); Schaefer, D. G. & Zyrd, J. P; Plant J 11, 1195-1206 (1997)]. N-연결 올리고당류 구조를 "인간화(humanize)"하기 위한 시도로써, β1,2-크실로실트랜스퍼라아제 및 α1,3-푸코실트랜스퍼라아제 유전자(Δxyl-t/Δfuc-t)에 관한 이중 녹아웃 변이체(variants)가 WO 04/057002호에 따라서 최근 생산되었다. 이러한 이끼 변이체는 2개의 식물-특이적 당 잔기가 완전히 결여된 전체 당단백질을 합성하였으나, 상기 변이체는 형태, 성장, 발달 및 재조합 당단백질을 분비하는 능력에 이상은 없었다[Koprivova, A. et al.; Plant Biotechnol J 2, 517-523 (2004); Huether, CM. et al. Plant Biol 7, 292-299 (2005)]. 이끼로부터의 N-글리칸에 대한 말단의 사람-유사 1,4-연결 갈락토오스의 성공적인 부착이 또한 보고되었다[Huether, CM. et al. Plant Biol 7, 292-299 (2005); Gorr and Jost Bioprocess J 4, 26-30 (2005)]. ADCC(항체-의존성 세포-매개 세포독성) 및 CDC(보체-의존성 세포독성) 활성과 같은 항체의 기능적 특성은 이들 문헌에 개시된바 없다.

식물 발현 시스템에 의해 항체를 생산하려는 시도가 있었지만, 변형된 당화 패턴으로 인한 항체 안정성 및 이펙터 기능에 대한 부정적인 영향 및 이러한 항체들의 Fc 영역과 Fc 수용체 사이의 상호작용이 보고되었다. 면역글로불린의 Fc-부분에 의해 매개되는 기능은 이들의 N-연결 올리고당류 구조와 강하게 관련되어 있는 것으로 보고되었다[Jefferis, R. et al., Immunol Rev 163, 59-76 (1998)].

특히, 핵 푸코실화된 올리고당류는 이펙터 세포상에 발현된 FcγRIIIa 수용체(CD16)에 대하여 더 약화된 결합을 나타내었으며 그 결과 용해 능력(lytic potential)의 감소가 초래되었다[Shields, R. L. et al., J Biol Chem 277, 26733-26740 (2002); Shinkawa, T. et al., J Biol Chem 278, 3466-3473 (2003)]. 대조적으로, N-글리칸 패턴내 코어 푸코오스가 결여된 효모에서 생산된 항체는 B-세포 감소(depletion) 검정에서 약한 능력을 나타내었다. 고 농도의 항체만이 건강한 공여자로부터의 B-세포의 감소를 초래하였다. ADCC와 CDC 활성과 같은 항체의 특성은 이들 문헌에 개시된 바 없다.

그러나, 생체내 조건에서 항체 생산후, 이 연구에서 제시된 대부분의 N-글리칸 구조는 최종 N-글리칸 패턴을 획득하기 위해 시험관내 조건에서 특이 효소를 사용한 추가 단계에서 가공되었다[Li et al., Nat Biotechnol, doi: 10.1038/nbtll78 (2006)].

US 6,602,684호는 GnTIII에 의해 변형된 이등분된(bisected) N-연결 글리칸 구조와 같은, 복잡한 글리칸 구조를 변형시킴으로써 항체의 이펙터 기능을 증가시키는 방법을 기술하고 있다.

광견병에 대한 모노클로날 항체가 WO 2005/000225 A2호에 기재되어 있다. 이러한 항체는 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 부류의 항체이고, 알파-1,3-푸코오스 잔기를 지니는 N-글리칸 구조가 결여된 식물에서 생산되며, 덜 알레르겐성인 식물 에피토프를 지닌다.

WO 2004/050838 A2호는 푸코오스 잔기가 없지만 크실로오스를 포함할 수 있는 식물에서 생산된 단순 포진 바이러스에 대한 면역글로불린에 대해 기재하고 있다.

WO 01/31045 A1호의 개시 내용은 식물내에서 포유동물-유사 당구조를 지닌 단백질을 생산하는 방법과 관련되어 있다. 바람직하게는, 상기 식물은 활성 푸코실트랜스퍼라아제 또는 크실로실트랜스퍼라아제(xylosyltransferase)를 갖지 않는다.

US 2006/0034829 A1호는 화학식 Man₃GlcNAc₂의 N-글리칸 구조를 지니는 면역글로빈에 대해 기재하고 있다.

US 2006/0029604 A1호는 화학식 GlcNac₂Man₃GlcNac₂의 N-글리칸 구조를 지니는 면역글로빈에 대해 기재하고 있다. 이러한 구조는 β-갈락토시다아제 처리로 생산된다.

WO 01/55434 A1호는 식물내 탄수화물 변형 효소, 특히 GBSS와 GnTI의 억제와 관련이 있다.

항체 개발에 관한 장기간의 심도 깊은 연구에도 불구하고, 이펙터 기능의 증가와 같은 개선된 특성을 지닌 항체에 대한 높은 요구가 여전히 존재한다.

본 발명의 목적은 개선된 특성을 지닌 항체를 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 이 목적은 특허청구범위의 발명 주제에 의해 달성된다.

본 발명은 항원에 특이적인, 동물, 바람직하게는 포유동물의 변형된 항체, 또는 이의 유도체 또는 이의 단편을 포함하는 항체 제조물을 제공하는데, 상기 항체 제조물은 하기를 특징으로 한다:

· 상기 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 단편은 푸코오스와 크실로오스가 결여된 N-글리칸 구조를 포함하며,

· 상기 제조물의 ADCC 활성은 동일 항원에 특이적인 상기 동물의 비변형된 항체 제조물보다 상기 동물의 비특이적 항체를 포함하는 10% 이상의 혈청 용액(100% 용액은 비희석된 혈청임) 중에서 적어도 10% 적게 억제되고/거나, 상기 변형된 항체, 이의 유도체 또는 이의 단편의 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이상은 C-말단 리신 잔기가 결여되어 있다.

치료 항체의 이펙터 기능은 체액에서 정상적으로 발견되는 정상 항체 백그라운드에 의해 일반적으로 억제된다는 것이 확인되었다. 천연 혈청에서, 고 농도의 치료 IgG(예를 들어, 사람 IgG1 또는 IgG3, 또는 뮤린 Ig-G2a) 항체는 과량의 내생 성(endogenous) 면역글로불린 G에 의한 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)의 억제를 보상하기 위해 요구된다. 사람 혈청은 대략 11.7㎎/㎖의 평균 항체 농도를 지니는데, 여기서 IgG1 및 IgG3가 대부분을 차지한다(모두 합하여 7.7㎎/㎖). 정상적인 혈청 IgG 수준은 NK 세포에 존재하는 저 친화력 IgG 수용체(F_CγRIIIa, CD16)에 대한 치료학적 IgG 항체의 결합을 차단한다. CD64와 함께, 이러한 2개의 F_Cγ 수용체는 ADCC를 매개하는 주요한 세포(cellular) 수용체이다. ADCC 용해는 상이한 당화 구조를 통해 증가될 수 있다(예를 들어, WO 2006/005367호). 그러나, 이러한 항체는 여전히 비특이적 혈청 항체에 의해 억제될 수 있다[Preitner et al., Mol. Immunol. 43, 1183-1193(2003)]. 현재 놀랍게도 푸코오스와 크실로오스가 결여된, 특히 C-말단 리신이 결여된, 바람직하게는 갈락토오스도 결여된, N-글리칸 구조를 갖는 항체 제조물이 상당한 정도로 이러한 억제에 대한 증가된 내성(resistance)을 나타낸다는 것이 확인되었다.

동일 항원에 특이적인, 동물, 특히 포유동물의 비변형 항체 제조물이라 함은 본 발명에 따른 항체와 관련하여, 상기 항체의 C-말단 부분의 이펙터 기능이 변형된 것으로 이해되어야 한다. 물론, 용해 활성(ADCC)은 항체 표적에 대한 해당 항체의 친화력에 좌우되는데, 항체로부터의 Fc 부분에 의해 매개된 용해 이펙터 기능은 독립적인 것으로 간주되어야 한다. 비변형된 항체는 정상적으로 갈락토오스, 푸코오스(특히, α1,3-푸코오스) 및/또는 크실로오스(특히 β1,2-크실로오스)을 지닌 N-글리칸 구조를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 변형된 항체 및 비변형 된(즉, 모) 항체 둘 모두는 모노클로날 항체이고 더 바람직하게는 세포 발현 시스템, 예를 들어, 식물 세포에서 재조합적으로 발현(또는 재조합 발현을 위해 디자인됨)된다.

대조(Comparative) 혈청 용액(예를 들어, 대략 10% 혈청으로 희석될 수 있음)의 대안으로, 비특이적 항체의 항체 조성물이 사용될 수 있다. 이와 같은 대조 항체 조성물은 동물의 생리학적 항체를 지닐 수 있거나 본 발명의(변형된) 항체의 모(비변형된) 항체 제조물일 수 있다. 대조 항체는 혈청 항체와 유사한 농도, 예를 들어, 0.5㎎/㎖ 내지 15㎎/㎖, 바람직하게는 1㎎/㎖ 내지 5㎎/㎖, 더 바람직하게는 3㎎/㎖로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 비교 항체는 IgG1과 IgG3이다. 7.7㎎/㎖의 혈청 중의 대략적인 혈청 IgG1과 IgG3 수준을 고려하면, 10% 혈청은 0.77㎎/㎖에 달할 것이고 40% 혈청은 3.08㎎/㎖의 IgG1과 IgG3에 달할 것이다.

이러한 내성을 지니는 신규한 항체를 비롯하여 이의 유도체, 단편 또는 제조물은 β1,2-크실로실트랜스퍼라아제와 α1,3-푸코실트랜스퍼라아제가 부족한(deficient), 재조합 세포, 바람직하게는 식물 세포에서 생산될 수 있다.

바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 단편의 N-글리칸 구조는 갈락토오스도 결여되어 있다. 갈락토오스의 결여는 특이 식물 세포 발현 시스템과 같은, 적절한 발현 시스템에서의 발현에 의해서, 또는 갈락토시다아제 처리에 의해서 또는 1,4-갈락토실트랜스퍼라아제 활성이 결여된, 세포, 예를 들어, 동물 세포내에서 발현에 의해 달성될 수 있다.

바람직하게는, 비변형된 항체 제조물은 변형된 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 단편의 제조물과 동일한 항원 친화력을 지닌다.

제조물에서, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 변형된 항체, 이의 유도체 또는 이의 단편은 C-말단 리신 잔기, 특히 전체(sum) 중쇄(정상적으로 리신을 포함할 수 있음)에 대해 결정된 C-말단 리신 잔기가 결여되어 있다. 항체가 잠재적으로 C-말단 리신을 포함하는 더 많은 쇄(chains)을 지닐 수 있기 때문에, 리신 결여에 관한 정량적 백분율은 모든 쇄가 잠재적으로 C-말단 리신을 지닌다는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 모노클로날 항체가 C-말단 리신의 존재에 있어서 이질적(heterogeneous)임이 밝혀졌다[Lazar et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry (18), 3, 239-244, 2004]. 놀랍게도 C-말단 리신이 정량적으로 감소된 (또는 발현되지 아니한) 항체는 다른 항체보다 상당히 유익한 이펙터 기능을 지닌다는 것이 확인되었다. 본원에서 ADCC가 생리학적으로 존재하는 항체에 의해 혈청 희석액 중에서 억제될 수 있다는 것이 드러났다. 이러한 억제 효과는 C-말단 리신이 결여된 본 구체예의 발명 항체에는 존재하지 않았다(또는 상당히 감소되었다).

더욱이, 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 단편의 N-글리칸 구조는 바람직하게는 GlcNAc₂Man₃, GlcNAc₂Man₃GlcNAc 또는 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 중에서 선택된다. 바람직하게는 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 구조가 항체, 또는 이의 단편 또는 이의 유도체의 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 또는 가장 바람직하게는 90% 이상을 구성한다. 다른 구체예들에서, 바람직한 구조는 GlcNAc₂Man₃ 및/또는 GlcNAc₂- Man₃GlcNAc인데, 특히 여기서 상기 GlcNAc₂Man₃와 GlcNAc₂Man₃GlcNAc 구조가 변형된 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 단편의 N-글리칸 구조의 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더 바람직하게는 70% 이상으로 존재한다.

항체 제조물의 특별한 구체예들에서, 항체, 또는 이의 유도체 또는 이의 단편의 50% 미만, 바람직하게는 30% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만이 N-글리칸 구조가 결여되어 있다. 사람 IgG 항체에서 Asn297에 결합되어 있는, N-글리칸 구조는 바람직하게는 대부분의 항체 제조물내에 존재한다.

변형된 항체(뿐만 아니라, 이의 단편 및 유도체)가 유래되는 동물은 바람직하게는 포유동물(특별한 구체예들에서, 사람 또는 마우스), 또는 파충류(특별한 구체예들에서, 크로코다일(crocodile)이다 - 항체가 식물 세포와 같은 다른 개체내에서 재조합적으로 발현될 수 있다.

바람직하게는, 상기 제조물의 ADCC 활성은 동일 항원에 특이적인 동물의 비변형된 항체 제조물보다 동물의 비특이적 항체를 포함하는 10% 이상, 바람직하게는 40% 이상의 혈청 용액 중에서, 적어도 10% 더 적게 억제되며, 특히 바람직하게는 적어도 15%, 20%, 25% 또는 심지어 30% 더 적게 억제된다. 신규한 항체는 동물의 체액(예를 들어, 혈청)에서 발견되는 다른 항체의 효과를 차폐(masking)하는데 있어 이러한 예외적인 내성을 지닌다. 바람직하게는 상기 제조물의 ADCC 활성은 비특이적 항체 용액 중에서 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30% 더 적게 억제된다.

항체의 바람직한 형태 중에는 키메라, 인간화 또는 사람 항체, 바람직하게는 IgG 항체가 있다.

본 발명의 특별한 구체예에서, 항체 제조물의 바람직한 특징은 CDC 활성이 동일 항원에 특이적인 비변형된 항체 제조물과 비교하여 10% 이상 감소된다는 것이다. 또 다른 구체예에서, 제조물은 동일 항원에 특이적인 동물의 비변형된 항체 제조물와 비교하여 10배 이상 증가된 ADCC 활성을 지닌다.

바람직한 구체예에서, CD16₁₅₈ _F/F에 대한 변형된 항체, 이의 유도체 또는 이의 단편의 결합은 동일 항원에 특이적인 동물의 비변형된 항체 제조물 보다 동물의 비특이적 항체를 포함하는 10% 이상, 바람직하게는 40% 이상의 혈청 용액 중에서 적어도 10% 더 적게 억제된다.

바람직하게는 CDl6₁₅₈ 유전자형 중 어느 한 유전자형의 이펙터 세포에 의해 매개된 변형된 항체, 또는 이의 유도체 또는 이의 단편의 표적 세포 용해는 동일 항원에 특이적인 동물의 비변형된 항체 제조물보다 동물의 비특이적 항체를 포함하는 10% 이상, 바람직하게는 40% 이상의 혈청 용액 중에서 적어도 10% 더 적게 억제된다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 β1,2-크실로실트랜스퍼라아제 및 α1,3-푸코실트랜스퍼라아제 활성이 부족한, 세포, 바람직하게는 식물 세포내에서 항체, 또는 이의 단편 또는 이의 유도체를 엔코딩하는 핵산(들)의 발현을 통해 획득가능한 항체 제조물을 제공한다. 이와 같은 항체 제조물은 바람직하게는 상기 기재된 기능적 및 구조적 이점에 의해 추가로 특징지워진다. 항체, 또는 이의 단편 또는 이의 유도체는 하나 이상의 아미노산 쇄로 구성될 수 있으며 발현을 위해 하나 이상의 핵산(예를 들어, 각 사슬에 대한 핵산)이 필요할 것임이 이해된다. 물론 하나 이상의 쇄가 예를 들어, 한 벡터 상의 한 핵산에 의해 엔코딩될 수 있다.

바람직하게는, 항체 제조물은 갈락토실트랜스퍼라아제도 부족한 세포에서 획득될 수 있으며, 바람직하게는 상기 세포는 갈락토오스-1-포스페이트-우리딜-트랜스퍼라아제 또는 임의의 갈락토실트랜스퍼라아제가 완전히 결여되어 있다.

특별한 구체예에서, 항체 제조물은 N-글리칸의 말단 GlcNAc 잔기에 1,4-결합으로 갈락토오스 잔기를 부착시킬 수 있는 발현 시스템에서 획득가능하다. 이와 같은 발현 시스템은 천연 갈락토실트랜스퍼라아제 활성을 포함하거나 특이 갈락토실트랜스퍼라아제 활성을 획득하기 위해 유전자적으로 조작될 수 있다.

바람직하게는, 항체 제조물은 특히 US 6,602,684호 또는 WO99/54342호에 개시된 것과 같이, GnTIII 활성을 지니는 세포에서 발현된다. GnTIII 활성은 추가로 개선된 용해 이펙터 기능을 가져온다(예를 들어, 이등분 구조의 도입). 세포는 예를 들어, GnTIII 유전자로 트랜스펙션되는데, 결과적으로, 트랜스펙션되지 아니하거나 비변형된 세포와 비교할 때, GnTIII 발현의 증가가 초래된다.

본 발명은 또 다른 양상에서 변형된 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 단편을 제공하는데, 상기 항체의 글리칸 구조는 푸코오스와 크실로오스가 없으며, 바람직하게는 갈락토오스도 없고, 상기 N-글리칸 구조는 GlcNAc₂Man₃, 또는 GlcNAc₂Man₃GlcNAc 또는 GlcNAc₂-Man₃GlcNAc₂ 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다. N-글리칸 구조는 바람직하게는 화학식 -β-1,4-GlcNAc-β-1,4-GlcNAc-(β-1,4-Man)(α-1,6-Man(α-1,3-Man)을 따르는데, 여기서 α-만노오스 잔기 중 어느 하나 (또는 둘 모두)는 추가 β-1,4-GlcNAc와 결합할 수 있다(도 4). 코어 당화는 IgG 항체의 Asn297에서 일반적으로 발견된다.

특정 양상에서, 본 발명은 루이스(Lewis) Y 항원을 인지하며 갈락토오스, 푸코오스 또는 크실로오스를 포함하는 모 모노클로날 항체(즉, 비변형된 항체)로부터 유래되며, 루이스 Y 항원을 인지하는 모노클로날 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 단편과 관련이 있는데, 여기서 상기 모노클로날 항체의 글리칸 구조는 푸코오스와 크실로오스가 없으며, 바람직하게는 갈락토오스도 없고, ADCC 이펙터 기능은 10배 이상 증가되며 상기 항체의 항원 결합 특이성 및 친화력은 비변형된 모 항체와 동일 또는 유사하다. 이 구체예의 경우, 루이스-Y를 인지하는 임의의 항체가 모 항체로서 사용될 수 있다.

바람직한 모 모노클로날 항체는 인간화된 경쇄 가변 영역, 사람 경쇄 불변 영역, 인간화된 중쇄 가변 영역 및 사람 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체인데, 여기서 상기 인간화된 경쇄 가변 영역은 적어도 도 1에 도시된 것과 같은 아미노산 서열의 일부를 지닐 수 있고, 상기 인간화된 중쇄 가변 영역은 적제도 도 2에 도시된 것과 같은 아미노산 서열의 일부를 지닐 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체의 아미노산 서열은 모 항체와 동일하다. 예를 들어, 항체 유도체는 EP 0 528 767호에 따른 키메라 항체일 수 있다. 특별한 구체예에서, 항체 유도체는 단일 쇄 항체(single chain antibody; SCA)이다. SCA는 예를 들어, US 4,946,778호 에 소개되어 있다. 동일한 DNA에 의해 엔코딩되지만, 동물, 예를 들어, 포유류 숙주내에서 발현되는 비변형된 모 항체와 비교하여, 본 발명에 따른 항체는 동일 또는 유사한 조립, 폴딩, 특이성 및 이가(bivalence)를 나타낼 수 있고, 바람직하게는 더 높은 분해도(degradation) 또는 응집도(aggregation)를 나타내지 아니한다.

항체 유도체는 단일 쇄 항체를 포함하는, 재조합 또는 인공, 항체(특히, 동물로부터 유래한 인간화된 항체)의 그룹에서 선택될 수 있다. 특히, 사람에서 최소 항원성을 나타내는, 카멜(camel) 또는 크로코다일과 같은 파충류에서 유래한 항체가 바람직하다. 항체 단편은 항체의 불변 및/또는 가변 부분을 포함하거나 이 부분에서 선택될 수 있는데, 특히 Fc, 유사Fc(Fc-like), Fv, Fab, F(ab)₂, Fab', F(ab')₂, scFv, scfc, V_HH 중에서 선택될 수 있다. 가장 바람직한 항체 단편은 본 발명의 당화 구조를 지니는 유사Fc 단편 또는 Fc 단편이다.

모 항체의 임상적 효능은 사람 IgG1 분자의 Fc 부분의 생물학적 활성과 관련이 있는데, 이 활성은 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)를 유도시의 이의 효능에 의해 결정된다. ADCC 기능은 과립구 및 단핵구 상의 FcγRIII와 상호작용하는, Fc 부분의 당화에 좌우된다[Lifely et al., 1995, Glycobiology, 5(8), 813-822].

본 발명에 따른 항체 및/또는 제조물의 ADCC 이펙터 기능은 모 항체의 ADCC 활성, 즉, 동일 항원에 특이적인 비변형된 항체 제조물과 비교하여, 5배 이상, 바람직하게는 10배 이상, 더 바람직하게는 20배 이상 또는 심지어 30배 이상, 훨씬 더 바람직하게는 40배 이상, 가장 바람직하게는 50배 이상 증가된다. ADCC 이펙터 기능은 항체가 유도되는 항원을 발현하는 세포의 세포 용해로 가장 잘 측정된다(용해의 EC₅₀-값). 항원은 항체가 일반적으로 유도될 수 있는 화합물인 것으로 이해되어 있다(예를 들어, 임의의 단백질, 당단백질, 핵산 등). 항원은 한개의 에피토프 또는 달리 한개 이상의 에피토프를 지닐 수 있다. 바람직하게는, 항체는 모노클로날 항체내의 에피토프와 동일한 에피토프에 대해 유도된다.

본 발명의 항체의 ADCC 용해 활성은 세포 용해 검정시 표적 항원을 지니는 세포를 이용하여 모 항체와 대비하여 측정될 수 있다. 루이스-Y 항원에 대해 유도된 항체의 경우, 루이스-Y 포지티브 표적 암 세포주, 예를 들어, SKBR5, SKBR3, LoVo, MCF7, OVCAR3 및 Kato III가 표적으로서 사용될 수 있다.

이펙터 세포 매개 종양 세포 용해는 면역글로불린 Fc 도메인과 이펙터 세포 상의 Fc 수용체 간의 상호작용에 강하게 좌우될 수 있다. NK 세포 상에 발현된 CD16 수용체는, 이의 표현형에 따라서, 상이한 친화력으로 IgG에 결합하는 것으로 보고되었다[Niwa et al., Cancer Res 64, 2127-2133]. 그에 따라 PBMC 공여체(donors)의 CD16 유전자형이 분석되었고 약 50%(10개 중 5개)만이 고 친화력 표현형(CD16_158v/v)을 발현시켰다는 것이 확인되었다. 이와 같은 PBMC 공여체를 이용하여 수행된 ADCC 검정은, 저 친화력 수용체(CD16_158F/F)를 발현하는 NK 세포와 비교할 때, 모 항체 제조물 및 본 발명에 따른 항체가 강하게 증강된 용해 활성을 지님을 보여주었다. Ovcar-3 세포 상에서의 병렬 비교는, 선택된 CD16 표현형과 독립적으로, 본 발명에 따른 항체의 용해 능력이 대략 40배(factor) 증강되었음을 보여주었 다.

본 발명에 따른 항체는 뮤린, 키메라, 사람 또는 인간화 항체일 수 있으며, 바람직하게는 항체는 인간화 항체이다. 바람직한 구체예에서, 항체는 IgG 또는 이의 단편 또는 이의 유도체이고, 바람직하게는 IgG1 또는 이의 단편 또는 이의 유도체이다. 추가 구체예에서, 본 발명의 항체는 사람 IgG의 Fc 영역과 동등한 영역을 포함하는 융합 단백질이다.

따라서, 일 양상에서, 본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 중에 본 발명에 따른 항체를 함유한 약제 제조물과 관련이 있다.

더욱이, 본 발명은 약제(pharmaceuticals)로서 이 항체의 용도와 관련이 있다.

약제는 환자내, 종양 세포 성장을, 각각, 감소 또는 억제시키기 위한, 특히 고형암의 치료(대표적인 예로서, 상피 기원의 전이(metastasized) 종양 또는 파종(disseminated) 종양 세포의 치료)를 위한, 예방적 및/또는 치료적 치료를 위한 약제(medicament)로서 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 항체는 극소 잔류 질병(minimal residual disease)의 치료를 위해 사용될 수 있다.

주어진 농도의 본 발명에 따른 항체는 보다 넓은 범위의 항원 밀도를 지닌 표적 세포를 용해시킬 수 있었다. 이러한 현상은 표적 항원 밀도가 상피 종양에서 일정하다고 생각될 수 없고 원발성(primary) 종양 및 유래성(derived) 전이종양 둘 모두에서 달라질 수 있기 때문에 종양 요법에서 특히 적절할 수 있다. 요약하면, 당-최적화(Glyco-optimized) 생산 종(예컨대, 이끼-생산 항체 IGN314)에 의해 발현 된 활성 치료 항체는 증강된 용해 활성을 실제로 나타내며 치료 용량을 감소시키거나, 주어진 농도에서, 상이한 항원 밀도를 지닌 더 넓은 범위의 종양 세포를 용해시킬 수 있다. 특히, 표준 치료 항체를 회피할 수 있는, 낮은 항원 밀도를 지니는 세포가, 이와 같은 당-조작된 항체에 의해 표적화되고 파괴될 수 있다. 이에 더하여, 당-최적화 항체는 조사된 모든 세포주에서 그리고 CD16₁₅₈ 두 표현형에서 더 낮은 EC₅₀ 값을 나타내었는데, 상기 값은 두 표현형, CD16_158F/F, CDl6_158v/v에 대하여 더 높은 친화력에 대한 지표이다. 이러한 더 강한 상호작용은 두 표현형과 관련한 EC₅₀ 농도를 감소시키고 표적 세포 용해를 개시시키는데 필요한 최저유효농도(threshold concentration)를 감소시킬 수 있다. 이러한 현상은 저 친화력 표현형을 지니는 환자에 대해 특히 치료학적 이점을 가져올 수 있으며, 이와는 달리, 기존의 항체 제조물로 치료할 경우 동일한 치료 효과를 위해 더 높은 항체 농도가 요구될 것이다.

본 발명의 추가 양상에서, 항체 또는 항체 혼합물의 제조 방법이 제공되는데, 여기서 상기 항체는, β1,2-크실로크실로실트랜스퍼라아제 및 α1,3-푸코실트랜스퍼라아제 활성이 부족한, 바람직하게는 β1,2-크실로실트랜스퍼라아제 및 α1,3-푸코실트랜스퍼라아제 활성이 완전히 결여된, 세포, 바람직하게는 식물 세포내에서 발현될 뿐만 아니라, 상기 항체는 이 발현에 의해 획득가능하다. 예를 들어, 항체 쇄를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 적어도 한개의 벡터를 세포 또는 식물 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있으며, 상기 세포는 차례로 변형된 항체를 생산하 기 위해서 증식 및 사용될 수 있다.

바람직하게는 세포는 또한 1,4-갈락토실트랜스퍼라아제 활성도 부족하다.

바람직한 구체예에서, 항체, 또는 단편 또는 유도체를 엔코딩하는 DNA는 C-말단 리신에 관한 코돈이 결여된 항체, 단편 또는 유도체를 발현시키는데 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 항체, 단편 또는 유도체의 C-말단 리신은 제거되는데, 바람직하게는, 카르복시 펩티다아제(carboxy peptidase), 예를 들어, 카르복시펩티다아제 B, 또는 생체내조건에서 적절한 세포 배양 조건의 선별에 의해, 바람직하게는 동물 세포 발현 시스템의 선별에 의해 제거될 수 있다. 발현은 바람직하게는 BY2 세포, 당근(carrot) 세포, 효모(예를 들어, 피치아(pichia) 또는 사카로미세스(saccharomyces)), 섬모충, 조류(algae) 또는 곤충 세포내에서 이루어진다.

도 1: 모노클로날 항체 IGN314를 표적으로 삼는 루이스 Y의 인간화 경쇄 가변 영역의 서열.

도 2: 모노클로날 항체 IGN314를 표적으로 삼는 루이스 Y의 인간화 중쇄 가변 영역의 서열. 서열 1 또는 2가 사용될 수 있다.

도 3: 정제된 항체 IGN314의 특성결정

(a) 모 항체 IGN311과 비교한 정제된 IG-N314의 은-염색 SDS-폴리아크릴아미드 겔. IGN311은 인간화 모노클로날 IgG 항-루이스 Y 항체이다. 비-환원 조건하에서(좌측 패널), 두 샘플은 올바르게 조립된, 온전한(intact) IgG의 예상된 분자 량에 상응하는 대략 150 kDa 범위에서 정확하게 동일한 단백질 밴드로 나타났다. (-) 동시에 정제된 배양물 상청액의 목-형질전환(mock-transformations). 환원 조건하에서(우측 패널), 대략 50 및 25kDa의 단독의 단백질 밴드가 검출될 수 있었는데, 이들 밴드는 각각 IgG 중쇄와 경쇄에 해당한다.

(b) IGN314에 대한 크기 배제 HPLC 분석. 발현 생성물은 온전한 IgG에 대하여 특성결정된 체류 시간 8.6분에서 날카로운 피크로 용리되었다. 덜 풍부한 생성물(10% 미만)이, 더 짧은 체류 시간 7.4분과 7.9분에서 완전히 분별(resolution)되지 않은 피크로 나타났는데, 이러한 생성물은 아마도 IgG 다량체와 같이 소량의 응집된(aggregated) 항체 구조물에 해당할 것으로 추정된다. (c) 항-이디오타입(anti-idiotypic) 샌드위치 ELISA로 항원에 결합하는 IGN314의 활성을 시험함으로써 IGN314 특이성에 대한 검증[연(Runs) 검정]. IG-N311과 비교한 희석 곡선이 그래프로 도시되어 있다. 곡선을 4가지 파라미터의 시그모이드 적합(fit)을 이용하여 적합화시켰다(적합도: R² > 0.99).

도 4: IGN311 및 IGN314의 N-당화

각각의 질량 스펙트럼으로부터 추론된 글리칸 구조에 관한 표가 제시되어 있다. 항체 IGN311(모) 및 IGN314(당-변형)의 중쇄에 관한 SDS-폴리아크릴아미드 겔 밴드로부터 얻은 트립신으로 분해시킨 펩티드를 HPLC로 분리하고 전자분무 이온화 질량 분석기로 분석하였다. 서열 TKPREEQYN²⁹⁷STYR(한 개의 비사용 트립신 절단 부위를 지님) 또는 EEQYN²⁹⁷STYR의 글리코펩티드에 관한 검출 질량에 대하여 글리칸 질량을 계산하였다. 글리칸 구조를 각각의 질량 증분(increment)으로부터 추론하였다. GlcNAc = N-아세틸글루코사민, Man = 만노오스, Fuc = 1,6-연결된 푸코오스, 및 Gal = 1,4-연결된 갈락토오스 잔기. GlcNAc 잔기는 2개의 안테나(antennae) 중 어느 하나에 결합될 수 있다. Gal 잔기는 2개의 안테나 중 어느 하나에 결합될 수 있다. Fuc 잔기는 근위(proximal) GlcNAc 잔기에 결합될 수 있다.

도 5: 사람 IgG1-Fc의 구조 및 FcγRIII(CD16)와의 상호작용. 패널 A: IgG 항체의 일반적인 구조. 뮤린 IgG2a 항체를 해리스 등의 문헌[Harris et al 20](브룩하벤(Brookhaven) 단백질 데이터뱅크 코드 1IGT)에 의거하여 결정화시켰다. 2개의 중쇄는 각각 검은색 및 밝은 청색으로 보여진다. 2개의 경쇄는 각각 녹색과 노란색으로 나타났다. 적색으로, 중쇄의 Asn297에 결합된 탄수화물 부분이 나타났다. 패널 B: FcγRIII(CD16)와 사람 IgG1-Fc의 상호작용. 복합체를 결정화시키고 브룩하벤 단백질 데이타뱅크 코드: 1T89로 공개하였다. 인간 Fc(CHl과 CH2로 구성됨)의 리본 모델은 2개의 중쇄 성분은 각각 밝은 청색과 보라색으로 보여진다. 세포 표면(회색 박스)에 결합된, CD16의 세포외 영역은 녹색으로 보여진다. 파선은 CD16 중 어느 하나가 신호전달 성분 분자로서 또는 GPI-연결(비신호전달 성분) 분자로서 존재한다는 것을 제시한다. 당-조작된 IGN311 변이체내에 존재하지 아니하는 푸코오스 잔기의 위치는 원으로 표시되어 있다(오렌지색) .

도 6: 모 항체 IGN311(회색 선) 및 이끼-유래 데-푸코실화된 변이체 IGN314(검은색 선)에 의해 매개된 사람 PBMC에 의한 종양 세포의 ADCC 매개 용해의 비교: 상이한 혈청 기질내에서 항체 매개 세포 용해(ADCC)에 관한 사람 혈청의 영향. 샘플을 일정한 기질(각각, 10% FCS 또는 40% NHS) 중에서 RPMI 1640로 희석하고 사람 PBMC에 의한 SK-BR-3 종양 세포의 ADCC 매개 용해를 3회 반복하여 측정하였다. 데이타를 4가지 파라미터 시그모이드 적합을 이용하여 적합화시켰다(전체 케이스에서 적합도, R² > 0.92). 용해 능력을 EC₅₀으로 평가하였다: 10% FCS 중의, 모 IGN311 야생형 및 당-변형된 IGN314 각각의 경우, 0.301㎍/㎖(95% CI: 0.169-0.537) 및 0.052㎍/㎖(95% CI: 0.028-0.094)이었으며, 40% NHS 중의, 모 IGN311 및 당-변형 IG-N314 각각의 경우, 1.558㎍/㎖(95% CI: 0.989 - 2.457) 및 0.126㎍/㎖(95% CI: 0.065 - 0.244)이었음.

도 7: (A) IGN311, IGN314, 및 사람 폴리클로날 IgG의 C-말단 항체 펩티드 SLSLSPG에 대한 C18-크로마토그래프. (B) IGN311의 C-말단 항체 펩티드 SLSLSPGK에 대한 C18-크로마토그래프; SLSLSPGK는 샘플 IGN314 및 사람 폴리클로날 IgG에서 검출되지 않았음.

본원에 사용된 용어들은 일반적으로 당업계에서 사용되는 용어로서, 달리 정의하지 않는한, 다음과 같이 정의된다.

용어 항체는 항체 또는 항체 유도체 또는 이의 단편을 의미하며 항체에 대한 설명은 또한 본 발명의 항체 제조물에에도 적용된다. 항체 단편들 중에서, 항체의 기능적 등가체 또는 상동체는 면역글로불린 결합 도메인, 또는 Fc 영역, 또는 이 Fc 영역 또는 이의 적어도 일부분에 대한 상동성 영역과 함께 상기 결합 도메인을 모방하는 펩티드를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 면역글로불린 결합 도메인, 또는 또 다른 폴리펩티드에 융합된, 등가물를 포함하는 키메라 분자가 포함된다.

대표적인 항체 분자는 온전한 면역글로불린 분자와 파라토프(paratope)를 함유하는 면역글로불린 분자의 그러한 부분인데, 항체 분자는 Fab, Fab', F(ab')₂ ,Fc 및 F(v)를 비롯한 N-글리칸 구조로 공지된 그러한 부분을 포함한다.

놀랍게도, 본 발명의 일 구체예에서 본 발명에 따른 항체는 개선된 약동학을 지닐 수 있음이 밝혀졌다. 항체 분자상의 말단 갈락토오스 잔기의 결여는 소포체 시스템(reticular endothelial system)의 세포(간(liver)내 쿠퍼(Kupffer) 세포)에 의한 상기 항체 분자의 비바람직한 흡수(uptake) 및 간 세포내 아시알로글리코수용체(asialoglycoreceptors)를 통한 흡수를 감소시킬 수 있다. 이것은 결과적으로 더 적은 원치 않는 부작용 및 개선된 약동학을 비롯한 항체의 증가된 반감기를 초래하며, 결과적으로 항원(예를 들어, 루이스 Y, CD20, Ep-CAM, HER-2, Erbl 수용체, Erb2 수용체) 발현 표적 세포로 향하는 순환 항체의 지연된 효율 농도 및 더 긴 이펙터 기능을 가져온다.

본원에 사용된, 본 발명에 따른 항체는 항체를 발현하도록 변형될 수 있는 모든 종류의 세포 시스템을 포괄하는 숙주 세포내에서 발현될 수 있다. 본 발명의 영역내에서, 용어 "세포"는 배양된 개별 세포, 조직, 기관, 곤충 세포, 조류(avian) 세포, 파충류 세포, 포유류 세포, 하이브리도마 세포, 일차(primary) 세포, 연속 세포주, 줄기 세포 및/또는 유전자적으로 조작된 세포, 예컨대 본 발명에 따른 글리코실화된 항체를 발현하는 재조합 세포를 의미한다.

본 발명에 따른 항체의 재조합 발현을 위해 사용되는 세포 시스템은 임의의 세포, 조직, 동물계로부터의 개체, 예를 들어, 유전자도입 염소, CHO 세포, 곤충 세포, 사람 세포주일 수 있다.

바람직하게는, 세포는 동물 세포, 예를 들어, BSC-1 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, CHO 세포, COS 세포, 뮤린 세포, 사람 세포, HeLa 세포, 293 세포, VERO 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, MDOK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, TCMK 세포, LLC-PK 세포, PK15 세포, WI-38 세포, MRC-5 세포, T-FLY 세포, BHK 세포, SP2/0, NSO 세포 또는 이의 유도체이다.

대안적으로, 세포, 조직, 개체는 또한 진균계 또는 효모, 담배, 벼, 알팔파 또는 옥수수와 같은 식물계로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 선태식물(bryophyte) 세포는 예를 들어, 피스코미트렐라(Physcomitrella), 푸나리아(Funaria), 스파그넘(Sphagnum), 세라토돈(Ceratodon), 마르찬티아(Marchantia) 및 스패로카르포스(Sphaerocarpos) 속의 종들로부터 선택될 수 있다. 대표적인, 선태식물 세포는 WO 04/057002호에 사용된 것과 같은 피스코미트렐라 파텐스( Physcomitrella patens)이다.

대안적으로, 기능부전 푸코실트랜스퍼라아제를 지니거나 코어 푸코실트랜스퍼라아제를 지니지 아니하고/거나 기능부전 크실로실트랜스퍼라아제를 지니거나 이를 지니지 아니하고/거나 기능부전 1,4-갈락토실트랜스퍼라아제를 지니거나 이를 지니지 아니하는 발현 시스템이 사용될 수 있다.

갈락토오스, 푸코오스 및/또는 크실로오스는 대안적으로 잔기를 제거시키는 효소로 처리함으로써 본 발명에 따른 항체로부터 제거될 수 있다. 당업계에 공지된 N-글리칸으로부터의 갈락토오스, 푸코오스 및/또는 크실로오스 잔기의 방출을 초래하는 임의의 효소, 예를 들어, 알파-갈락토시다아제, 베타-크실로시다아제, 알파-푸코시다아제가 사용될 수 있다.

대안적으로, 1,3-푸코실트랜스퍼라아제 및/또는 1,2-크실로실트랜스퍼라아제, 및/또는 1,4-갈락토실트랜스퍼라아제에 의해 기질로서 사용될 수 없는 변형된 N-글리칸을 합성하는 발현 시스템이 사용될 수 있다.

대안적으로, 개선된 절단율을 가져오는 C-말단 리신 잔기의 절단에 관여하는 염기성 카르복시펩티다아제를 동시발현시키는 발현 시스템이 사용될 수 있다.

대안적으로, C-말단 리신 잔기의 개선된 절단을 달성하기 위한 최적 국부화(localization)를 겨냥한 염기성 카르복시펩티다아제를 포함하는 발현 시스템이 사용된다.

C-말단 리신 잔기의 제거는 대안적으로 중쇄를 엔코딩하는 핵산 상의 C-말단 리신에 대한 코돈이 결여된 벡터 작제물을 사용함으로써 달성될 수 있다.

대안적으로, C-말단 리신 잔기는 바람직한 염기성 카르복시펩티다아제 활성을 보유한 효소를 사용하여 시험관내에서 가공됨으로써 제거될 수 있다.

본 발명에 따라서, C-말단 리신 잔기의 절단은 C-말단의 바람직한 절단과 관련하여 세포, 조직 또는 개체를 배양하기 위한 조건을 최적화함으로써 개선될 수 있다.

본원에 사용된 용어 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)은 이펙터 세포, 예컨대 살해 세포, 자연 살해 세포, 활성화된 대식세포 또는 기타 이와 유사한 세포의 표면상에 존재하는 Fc 수용체에 항체의 Fc 영역의 결합을 통해 이펙터 세포를 활성화시킴으로써 종양 세포 또는 기타 이와 유사한 세포를 손상시키는 임의의 활성을 의미한다.

증가된 ADCC 활성을 지니는 항체는 통상의 기술자에게 알려진 임의의 적당한 방법에 의해 결정될 수 있다. 한가지 용인된 검정법은 실시예에 기술되어 있다.

증가된 ADCC는 감소된 EC50 항체 농도로서 측정된 증가된 용해 능력으로 측정될 수 있는데, 상기 EC50 항체 농도는 표적 세포 양의 최대 절반을 특이적으로 용해시키는데 필요한 항체 농도를 의미한다.

용어 보체 의존성 세포독성(CDC)은 보체에 대한 결합 및 이의 활성화에 의한 직접적인 세포 독성으로서 정의된다. 항체는 예를 들어, 종양 세포의 세포 표면에서 이의 표적에 결합하며 "보체 캐스케이드"로도 알려진, 보체 시스템을 개시시키는데, 이는 결과적으로 세포 막 내부에 완전히 구멍을 만드는 막 공격 복합체를 초래하여, 세포 용해 및 사멸을 일으킨다.

감소된 CDC 활성을 지니는 항체는 통상의 기술자에게 알려진 임의의 적당한 방법에 의해 결정될 수 있다. 한가지 용인된 검정법은 실시예에 기술된다.

감소된 CDC 활성은 표적 세포 양의 최대-절반을 용해시킬 수 있는 증가된 EC50 항체 농도로서 정의된다. 본 발명에 따른 항체의 CDC 활성은 최대 10% 까지, 달리 최대 20%까지, 달리 최대 30%까지 감소될 수 있다. 다른 구체예에서, CDC 활성은 비변형된다.

표적 항원, 예를 들어, 루이스 Y 항원, CD20, Ep-CAM 또는 Her-2에 대한 본 발명의 항체의 결합 활성은 모 항체와 비교하여 80% 이상, 바람직하게는 모 항체와 비교하여 90% 이상, 더 바람직하게는 모 항체와 비교하여 100% 이상이다.

가능한 처리 목적은 종양 세포, 즉 종양 조직 또는 전이종양 또는, 특히, 파종 종양세포에 대한 효과적인 결합 및 이의 감소이다. 혈액, 골수 또는 장기내에서 각각 검출가능한 종양 세포, 또는 미세전이종양(micrometastases)의 갯수는 상당히 감소될 것이다. 전이종양의 형성은 지연되며, 이들의 성장은 적어도 느려지게 된다. 따라서, 환자의 무재발(relapse-free) 수명 및 이에 따른 총 생존 시간은 특이적으로 표적화된 면역요법에 의해 신장될 수 있다.

본 발명에 따른 사용 범위 이내에서, 특히 암 환자에서 종양 세포의 성장을 각각 감소, 또는 억제시키기 위한 치료 범위에서, 혈액투석이 또한 가능하다.

본 발명에 따라, 약제학적 담체 또는 희석제 중에 본 발명에 따른 항체를 함유한 약제 제조물이 포함된다. 제조물은 환자에서 종양 세포의 성장을, 각각 감소 또는 억제시키기 위한 예방적 및/또는 치료적 치료를 위한 약제 제조를 위해 사용될 수 있다. 종양 세포 성장의 감소는 동일 항원에 특이적인 비변형된 항체의 사용과 비교하여 5% 이상 증가될 수 있다.

본 발명에 따른 항체를 함유한 제조물은 또한 고형암, 바람직하게는 상피 기원의 고형암 또는 극소 잔류 질병의 치료를 위한 약제 제조에 유용하다.

본 발명의 항체는 수동 면역요법에 사용될 수 있다.

피검체, 바람직하게는 사람의 샘플을 제공하는 단계, 및 상기 샘플내 항원에 대한 항체의 결합 사건을 검출하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법(바람직하게는 생체내)을 위한 본 발명의 항체 또는 이들의 제조물의 용도가 제공된다. 유사하게, 피검체(예를 들어, 사람)의 샘플을 제공하는 단계, 상기 샘플과 항체를 접촉시키는 단계 및 결합 사건을 검출하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이 제공된다. 본 방법에 따라서, 본 발명의 항체로 처리될 수 있는 피검체는 식별될 수 있다. 또한 특정 질병 또는 피검체의 처리를 위한 최적 항체/제조물이 식별될 수 있다. 피검체(질병을 앓고 있을 수 있음)의 샘플을 제공하는 단계, 상기 샘플을 질병을 특징지우는 항원에 특이적인 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계, 샘플내의 항원과 항체의 결합 사건을 검출하는 단계 및 결합 사건이 검출되는 경우 질병을 진단하는 단계를 포함하는 특정 질병을 진단하는 방법이 또한 제공된다.

종양 세포의 모든 특이화된 수용체(변형된 항체/제조물의 항원)를 결합시키기 위해, 일반적으로 환자당 1㎎/용량(dose) 이상, 바람직하게는 10㎎/용량 이상, 가장 바람직하게는 50㎎/용량 이상의 용량이 투여된다. 최대 용량은 가장 잘 견뎌지는, 항체, 인간화 항체, 및 사람 항체, 각각의 내약성(tolerability)에 좌우될 것이다. 환자 및 처치당 최대 1g 또는 일부 경우에서 최대 2g의 용량이 매우 유익할 수 있다.

놀랍게도, 증가된 ADCC 활성으로 인해, 치료적 및/또는 예방적 목적을 위해 적용되는 항체의 양은 감소될 수 있으나, 심지어 감소된 용량에서조차 여전히 긍정적인 치료 효과를 가져온다는 것이 본 발명에서 밝혀졌다. 증가된 ADCC 이펙터 기능으로 인해, 적용된 항체의 양은 모 항체에 관한 투여량과 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 더 바람직하게는 30% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 40% 이상, 가장 바람직하게는 50% 이상 감소될 수 있다.

처치는 바람직하게는 사용된 항체의 반감기에 따라서, 특정 시간 간격으로 반복되는데, 이 간격은 일반적으로 3일에서 30일의 범위이내이다. 항체를 특별히 유도체화함으로써, 반감기를 최대 수개월까지 증가시키고 이에 따라 처치 간격을 결과적으로 신장시키는 것이 가능하다.

본 발명에 따라 사용된 약제는 바람직하게는 적당한 제형으로 제공된다. 약제학적으로 허용되는 담체를 지니는 그러한 제형이 바람직하다. 전자는, 예를 들어, 보조제, 완충액, 염 및 보존제를 포함한다. 바람직하게는, 즉시 사용 수액(infusion solution)이 제공된다. 항체가 비교적 안정하기 때문에, 항체 또는 이들의 유도체에 기초한 약제는 이들이 저장이 안정한 용액으로서 또는 즉시 사용 형태의 제형으로서 출시될 수 있다는 상당한 이점을 갖는다. 전자는 바람직하게는 냉장 온도에서 최대 실온까지에서 저장에 안정한 제형이다. 그러나, 본 발명에 따라 사용되는 약제는 또한 필요시 해동하거나 재구성될 수 있는 냉동 또는 동결건조된 형태로 제공될 수 있다.

약제의 활성 물질의 농도는 이의 내약성에 좌우될 것이다. 인간화 항체에 기초한 특별히 잘 견딜수 있는 제조물은 직접적으로 추가 희석 없이 고 농도로 환자에게 투여될 수 있다. 0.1% 내지 10%, 바람직하게는 1% 내지 5%의 범위내의 바람직한 농도에 의해, 낮은 투여 부피 및 상응하는 주입 시간을 유지하는 것이 가능해진다.

일반적으로, 약제는 정맥내(i.v.)로 투여될 것이다. 그러나, 유사하게, 또다른 비경구 또는 점막 모드 투여가 또한 선택될 수 있는데, 이는 활성 물질을 종양 또는 전이 부위에 전신적 또는 국소적 적용을 야기시킨다.

하기 실시예들은 본 발명을 보다 상세하게 설명할 것이나, 본 발명이 이러한 실시예들로만 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 및 방법

포유류 세포주 및 이끼 생산종

종양 세포주 TF-I[Kitamura, T. et al., J Cell Physiol 140, 323-334 (1989)), Ovcar-3(Hamilton, T. C. et al., Cancer Res 43, 5379-5389 (1983)], SK-BR-3[Trempe, G. L., Recent Results Cancer Res 57, 33-41 (1976)]를 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection)(Manassas, CA)로부터 구매하였다. 1ng/㎖에서부터 100㎍/㎖까지의 연속 희석액 중의 인간화된 루이스 Y 특이적 항체 IGN311를 이용하여 FACS 분석에 의해 표적 항원 밀도(루이스 Y)를 측정하였다. 10㎍/㎖에서 측정된 평균 형광 강도(Mean fluorescence intensity, MFI) 값을 추가 분석을 위해 기록하였다.

피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens)(Hedw.) B. S. G. Δxyl-t/Δ fuc-t 이중 녹아웃주를 코크리보바 등의 문헌[Koprivova, A. et al., Plant Biotechnol J2, 517-523 (2004)]에 따라 사용하였다. 이끼 원형질체(protoplasts)이 생산을 위해, 선택된 Δxyl-t/Δfuc-t 이중 녹아웃주를 이전에 기술된 것과 같이 광생물반응기에서 배양하였다[Hohe, A. & Reski, R., Plant Sci 163, 69-74 (2002)].

재조합 항체의 생산

임상 등급 IGN311 대조 항체를 FCS를 함유한 중공 섬유 생산 공정 및 단백질 A 포획 단계를 포함하는 고전적인 다운 스트림 공정을 이용하여 SP 2.0 세포내에서 발현시켰다.

Δxyl-t/Δfuc-t 이중 녹아웃 이끼에서 발현된, 당-조작된 IGN311 변이체를 IGN314로 명명하였다. IGN311 중쇄 및 경쇄의 코딩 영역 - 이들 각각의 시그날 펩티드가 배제됨 - 을 PCR-증폭시키고(pfu 중합효소) 식물 시그날 펩티드의 사용에 의해 상응하는 유전자 생성물을 분비하도록 디자인된 이끼 발현 벡터 p127[Gorr, G. & Jost, W., Bioprocessing J 4, 26-30 (2005); Weise et al. Appl Microbiol Biotechnol 70, 337-345] 내로 블런트-클로닝(blunt-cloning)시켰다. 그 결과 얻어진 작제물(각각, p127-IGN-HC 및 p127-IGN-LC)을 제한효소 절단 및 시퀀싱으로 확증하였다. 이끼 원형질체의 형질전환을 각각 45㎍의 두 작제물을 동시에 사용하고 하기와 같이 변형하여 조스트 등의 문헌[Jost et al. Curr Genet 47, 111-120 (2005)]에 기재된 대로 수행하였다: 3배의 원형질체의 갯수 및 6배의 PEG-용액의 양(원형질체/DNA 혼합물에 첨가하고 난 다음, 뒤이어 12분 인큐베이션)을 표준 배 지와 함께 사용하였다[3M; 480mOsm; Jost, W. et al. Curr Genet 47, 111-120 (2005)]. 표준 배지내 IgG 타이터(titers)가 비교적 낮은 것으로 판명되었기 때문에, 이끼의 경우 서로 다른 8가지 일자에 최적화된 배지 조건하에서 총 167개의 형질변형체의 생산을 수행하였다[표준 배지와 W5 배지의 1:1 혼합물, Baur, A. et al., J Biotechnol 119, 332-342 (2005)]. 모든 배지에 0.01%(w/v) BSA를 보충하였다. 형질전환 절차를 거친후, 세포를 400㎕의 배지에 유지하였고, 후속하여 300㎕의 배양물 상청액을 신선한, 동일한 배지로 주단위로 교체하였다. 목-형질전환을 (무정제 및 동시-정제) 음성 대조군으로 설정하였다. 매주 어느 한 날에 수행된 모든 형질전환의 상청액을 수집하고 평형화시킨 1㎖ HiTrap 단백질 A 컬럼(Amersham)에 직접 로딩하여 정제하였다. 미정제 배양물 상청액을 비롯한 정제된 항체를 항-이디오타입 샌드위치 ELISA와 은-염색 SDS-PAGE로 분석하였다.

안정적으로 형질전환된 식물의 생산을 위해, PEG-매개 직접 DNA-전달을 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다[Jost et al. Curr Genet 47, 111-120 (2005)]. DNA를 제한 효소 XhoI, HindIII 및 ScaI을 이용한 p127-IGN-HC와 p127-IGN-LC의 절단으로 생산하였다. DNA 밴드는 XhoI/HindIII 분해와 관련이 있으며 - 발현 촉진 서열을 포함하는, 식물 시그날 펩티드 및 종결 시그날에 융합된 경쇄 및 중쇄에 대한 코딩 서열 - 상기 밴드는 겔-전기영동에 의해 분리되고, 절제되고, 겔-매트릭스에서 용리되었다. 원형질체를 Δxyl-t/Δfuc-t 이중 녹아웃주로부터 분리하고 각각 5㎍의 선형화되고 용리된 DNA 작제물을 동시-형질전환(co-transformation)시켰다. 형질전환 절차 및 후속 희석 및 세척 단계를 거친 후, 원형질체를 밤새 5μ mol m-2s-1로 재생 배지(6% 글루코오스와 3.6% 만닛(mannit)을 함유하는 Knop 배지, pH 5.6, ~ 580 mOsm)에서 인큐베이션한 후 뒤이어 7-10일 동안 40-50μmol m-2s-1로 광 인큐베이션하였다.

두 작제물을 함유하며 조립된 IGN 314를 생산하는 유전자도입주를 항-이디오타입 샌드위치 ELISA를 이용하여 항체 생산을 스크리닝함으로써 동정하였다. 확인된 유전자도입 주를 추가로 Knop 배지에서 배양하였다.

N-연결된 올리고당류 프로파일의 결정

샘플 IGN311과 IGN314의 중쇄를 문헌[Kolarich, D. & A1tmann, AnA1 Biochem 285, 64-75 (2000)]에 기술된 대로 환원(reducing) SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 쿠마시 염색 밴드를 문헌[Kolarich, D., 전개서]에 기술된 대로 잘라내고, 탈염색시키고, 카르브아미도메틸화시키고, 트립신으로 분해시키고, 겔 조각으로부터 추출해내었다. 추출물을 Speed Vac 농축기(concentrator)로 건조시키고 0.1% 포름산을 함유한 물로 재구성시켰다. 질량 분광 분석을 표준 전자분사 유닛, Cap-1C 시스템(Waters Micromass) 및 10-포트 용매 교환 모듈(Rheodyne)이 구비된 Q-TOF Ultima G1obA1(Waters Micromass)에서 수행하였다. 샘플을 제일 먼저 용매로 물을 이용하여 Aquasil C18 precolumn(30 x 0.32 mm, Thermo Electron)으로 포획하였다. 상기 분석용 컬럼을 용매 교체 이전에 5% 아세토니트릴에 놓아 두었고 이후 5에서 50%의 아세토티트릴의 선형 구배를 2㎕/분의 유속으로 적용하였다. 모든 용리액은 0.1% 포름산을 함유하였다. [G1u1]-피브리노펩티드 B를 재차 사용하여 탠덤 MS 모드로 TOF 분석기의 질량 튜닝을 실행하였다. 샘플을 MS 모드로 분석하였다. MS와 탠덤 MS 모드 사이의 전환이 이루어지지 아니하였기 때문에, 신호 손실, 특히 글리코펩티드의 분석을 위한 신호 손실은 발생하지 아니하였다. 데이터 분석을 MassLynx 4.0 SP4 소프트웨어(Waters Micromass)를 이용하여 수행하였다.

분석 방법

정제된 발현 생성물의 온전성(integrity), 분자량 및 잠재 분해 생성물을 제조업자의 사용설명서에 따라 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔 상에서 Novex 전기영동 시스템(Invitrogen)을 이용하여 SDS-PAGE로 분석하였다. 겔을 은-염색하였다(SilverQuest/Invitrogen). 크기 배제 HPLC를 수행하여 순도, 무결성 및 잠재 분해성의 측면에서 항체를 분석하였다. 샘플을 Dionex HPLC 시스템내 ZORBAX G-250(Agilent-technologies) 컬럼을 이용하여 분석하였다. 잠재적인 응집체(aggregates)를 분해시키고 잠재적인 침전을 억제시키기 위해, 10% 아세토니트릴 (CH₃CN)과 함께 220 mM NaH₂PO₄(pH=7.0)를 러닝 버퍼(유속 1㎖/분)로 사용하였다. 용리물을 214nm 및 280nm에서 온라인으로 모니터링하였다. 생성물 농도를 피크 통합으로 폴리클로날 사람 IgG(PentaG1obin^®, Biotest)에 대해 표준화시켜 계산하였다.

내독소(Endotoxin) 농도를 제조업자의 사용설명서에 따라 시중에서 구매가능한 LAL 검출 키트(Charles River Laboratories)를 이용하여 결정하였다.

유세포분석 데이터를 FACS-CALIBUR 장비(Becton Dickinson)로 수집하였다. 조사된 세포주 상의 항원 발현을 농도 범위 100㎍/㎖ 내지 1.6ng/ml의 사람 루이스 -Y 특이 항체 IGN311을 이용하여 정량하였다. 평가를 10㎎/㎖에서 수행하였다.

결합 특이성의 결정

발현 생성물의 결합 활성을 연속 희석액 중의 항체 샘플(100pg 내지 1㎍/㎖)을 모노클로날 항-이디오타입 항체 MMA383[Perkins, M. et al., Pharm Res 17, 1110-1117 (2000)]로 코팅된 마이크로타이터 웰에서 인큐베이션함으로써 특이적 샌드위치 ELISA로 분석하였다. 5% FCS로 블록킹 및 세척 실시 후, 결합된 발현 생성물을 사람 IgG, IgM 및 IgA(Zymed, CA)에 특이적인 염소-면역글로불린-퍼옥시다아제 컨주게이트와의 반응으로 결정하고 o-페닐렌디아민/과산화수소로 염색하였다. 최적 밀도(492nm)를 항체 농도의 로그에 대하여 플로팅시키고 GraphPad Prism 4 소프트웨어를 사용하면서 시그모이드 4가지 파라미터 적합을 이용하여 적합화시켰다. EC50 값을 계산하고 정량화에 사용하였다.

보체 의존성 세포독성(CDC)의 결정

보체 매개 세포 용해 활성을 표적으로서 루이스 Y-포지티브 SK-BR-3 유방암 세포주를 이용하여 ⁵¹Cr-방출 검정으로 3회 반복 시험하였다. 표적 세포를 100μCi의 ⁵¹Cr과 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 배지로 2회 세척하고, 분석되어야 할 연속 희석 샘플(72ng 내지 75㎍/㎖) 및 자원한 공여자로부터의 보체-활성 혈청을 함께 웰 당 20 x 10³개의 세포 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 상기 플레이트를 C0₂-인큐베이터에서 1시간 동안 37℃로 인큐베이션하였다. 상청액을 수집 하고 방출된 ⁵¹Cr("Cs")를 계수하였다. 자발적 방출("Sr") 및 최대 방출("Mr")에 관한 값을 각각 단독의 배지 및 계면활성제(SDS)와 함께 대표 샘플을 인큐베이션한 후 측정하였다. 보제 매개 세포독성을 수식 100 x (Cs-Sr) / (Mr- Sr)에 의해 세포 용액의 백분율로서 계산하였고 항체 농도(ng/ml)에 대한 로그로 플로팅하고 GraphPad Prism 4 소프트웨어를 사용하면서 시그모이드 4가지 파라미터 적합을 이용하여 적합화시켰다. EC₅₀ 값을 계산하고 이를 정량화에 사용하였다. 네거티브 용해를 수반한 샘플을 0%로 설정하였다.

항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)의 결정

ADCC를 표적 세포(SK-BR-3, TF-I, Kato-III 및 Ovcar 3)로서 다양한 루이스 Y-포지티브 암 세포주를 이용하여 ⁵¹Cr-방출 검정으로 3회 반복하여 시험하였다. 표적 세포를 100μCi의 ⁵¹Cr와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 웰 당 20 x 10³개의 세포 밀도로 96-웰 마이크로플레이트에 플레이팅하였다. 이펙터 세포(자원한 건강한 공여자로부터의 PBMC)를 즉석에서 제조하고 분석되어야 할 항체 샘플의 연속 희석액(100pg 내지 10㎍/㎖)과 함께 40:1의 E:T 비율에 도달되도록 표적 세포에 첨가하였다. C0₂-인큐베이터에서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 세포 상청액을 수집하고 방출된 ⁵¹Cr("Cs")를 계수하였다. 자발적 방출("Sr") 및 최대 방출("Mr")에 관한 값을 각각 단독의 배지 및 계면활성제(SDS)와 함께 대 표 샘플을 인큐베이션한 후 측정하였다. 세포독성을 수식 100 x (Cs-Sr) / (Mr- Sr)에 의해 세포 용해의 백분율로서 계산하였다. 세포 독성 백분율을 항체 농도(ng/ml)의 로그에 대해 플로팅하고 GraphPad Prism 4 소프트웨어를 사용하면서 시그모이드 4가지 파라미터 적합을 이용하여 적합화시켰다. EC₅₀ 값을 계산하고 이를 정량화에 사용하였다.

PBMC 공여체의 CD16 유전자형결정(genotyping)

CD16(FcγRIIIa)-158_V/F 다형성(polymorphism)을 문헌[Koene, H. R. et al., Blood 90, 1109-1114 (1997)]에 기술된 것과 같은 방법을 조금 변형시킨 PCR-기반 대립유전자-특이적 제한효소 분석 검정으로 분석하였다.

결과: IGN314의 발현 및 특성결정

이끼 Δxyl-t/Δfuc-t 원형질체를 일시적으로 중쇄 및 경쇄 발현 작제물(pl27-IGN-HC, pl27-IGN-LC)로 형질전환시키고 배양물 상청액 수집물 중의 IgG1 타이터를 항-이디오타입 샌드위치 효소-연관 면역흡수 검정(ELISA)에 의해 주단위로 평가하였다. 표준 배양 조건하에서, IgG1 타이터는 상대적으로 낮은 것으로 확인되었다(0.1-0.5㎍/㎖). 그러나, IGN314 분비는 최적화된 배지 조건하에서 3개월 이상의 기간 동안 유의하게 증가되었다. 전체적으로, 이것은, 샘플 수확 5주 후에 이미 획득한 2.0mg과 함께, 14주이내에 모두 167가지 형질전환에 대하여 3.8mg의 IGN314의 획득을 초래하였다(전체 평균: 6.1㎍/㎖). 미정제 배양물 상청액의 은-염색 소디움 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 - 이끼 배양물내 오염 단 백질의 일반적인 낮은 백그라운드는 제외함 - 은 단백질가수분해적으로 가공되거나 손상된 중쇄 또는 경쇄 또는 더 작은 항체 단편에 해당하는 보조적인 밴드를 나타내지 아니하였으며 완전한 IgG1의 조립율이 높다는 것이 판명되었다. 배양물 상청액을 취합하고, 단백질-A 정제를 거치게 하고, 정제된 IGN314를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), 크기 배제 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 비롯한 항-이디오타입 샌드위치 ELISA로 분석하여 상기 IGN314의 항원-결합 특이성을 시험하였다. 결과는 도 3에 제시되어 있으며 IgG1 조립, 순도, 및 표적 항원 친화력과 관련하여 IGN314의 온전성을 입증한다. 더욱이, 중쇄 및 경쇄의 펩티드 맵핑을 수행하였으며, 두 경우에 있어서 식물 시그날-펩티드를 비롯한 IGN311와 IGN314의 동일한 1차 아미노산 서열 - 두 중쇄내 C-말단 리신의 제거를 포함함 -의 정확한 절단이 증명되었다.

액체 크로마토그래피 질량 분광(LC-MS) 분석은 IGN311과 IGN314 중쇄, 각각에 대한 상이한 N-당화 패턴을 밝혀냈다(도 4). 가장 주목할 점은 샘플이 코어-푸코실화, 말단 갈락토실화 및 전반적인 당화의 정도와 관련하여 상이하였다는 것이다. IGN311은 거의 완전히 푸코실화되었으며 상당한 정도의 말단 갈락토실화를 포함하였는데, 이는 포유류 숙주 세포내에서 발현된 IgG 분자에 대해 예상될 수 있는 것이다. 본 연구에 사용된 당-조작된 이끼 종에 의해 생산된 IGN314의 경우, 갈락토오스- 또는 푸코오스-함유 글리칸 구조를 검출할 수 없었으며 만노오스로 종결된 IGN314 N-글리칸의 양은 미미하였다. IGN311과는 대조적으로, IGN314는 또한 비당화된 중쇄를 상당량 함유한 반면, IGN311은 완전히 당화되었다. 상기 2개의 샘플 중 어느 것도 크실로오스 잔기를 내포하지 아니하였다.

이펙터 기능

IGN311 중 하나와 당-조작된 IGN314의 용해 능력을 비교하였으며 이것은 암 면역요법으로 부각될 수 있는 생물학적 다양성 측면을 다루기 위해 시도되었다. 이 다양성은 표적 및 이펙터 세포 둘 모두와 관계가 있는데, 이것은 개개 종양 표적 세포에서 발현된 표적 항원 밀도가 상이하고 환자들이 아미노산 위치 158(CD16_158V/F)에 영향을 미치는 유전적 다형성으로 인한, 자연 살해(NK) 이펙터 세포에서 발현된 CD16 수용체의 상이한 대립유전자와 관련된 IgG 친화력 변이를 나타내기 때문이다. 따라서, 본 발명자들은 다른 한편으로 상이한 밀도로 막성 루이스 Y 항원을 발현하는 3가지 상이한 종양 세포주(Ovcar-3, SK-BR-3 및 TF-1)를 분석하였다. 이들 표적 세포주를 ADCC 실험에 앞서 형광 보조 세포 분류(FACS)로 이들의 루이스 Y 밀도에 관해 분석하였다. Ovcar-3는 가장 높은 항원 밀도를 나타내었으며 SK-BR-3와 TF-1 순이었다(평균 형광 밀도 값에 대해서는 표 1을 참조하라). 다른 한편으로, 규정된 이펙터 세포 제조물로 사용하기 위해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 공여체의 CD16₁₅₈ 다형성을 분석하였고 약 50%(10 중 5)가 고 친화력 CD16_158v/v표현형을 발현시켰음을 확인하였다(미제시). 모든 ADCC 검정을 위해 두 표현형, 즉 l58_V/V와 158_F/F의 공여체로부터의 PBMC 제조물을 제조하였다. 모든 샘플내 내독소의 부재를 측정전에 확인하였다. 동시에 정제된 목-형질전환물의 배양물 상청액을 또한 조사하였으며 백그라운드와 상이한 임의의 용해 활성은 나타나지 아 니하였다. ADCC 실험 결과(계산된 50% 유효 농도(EC₅₀) 값)을 표 1에 요약하였다. IGN314에 대해 측정한 EC₅₀ 값은 IGN311 중 하나와 대비할 때 상당히 더 낮았는데, 이는 IGN314가 모 항체 IGN311와 비교하여 세포성 세포독성에 의해 매개된, 7 내지 40배 증강된 용해 능력을 지님을 의미한다. 더욱이, 표적 세포 상의 루이스 Y 밀도와 EC₅₀ 농도 사이의 역 상관관계(inverse correlation)가 두 항체에서 관찰되었다. 낮은 루이스 Y 표적 항원 밀도(TF-I)를 지닌 세포주와 비교할 때, 상승된 표적 항원 밀도를 지니는 세포주(Ovcar-3)는 동일한 용해를 유도시키는데 훨씬 더 낮은 항체 농도를 필요로 하였다. EC₅₀ 값을 적절한 항원 밀도를 지닌 세포주(SK-BR-3)에 관해 측정하였는데, 예상한대로, 상기 값은 높은 항원 밀도와 낮은 항원 밀도의 세포주에 관하여 계산된 값들 사이에 존재하였다.

CD16 표현형 수준에서, 고 친화력 수용체 공여자(158_V/V)로부터 제조된 이펙터 세포는, IgG에 대한 이의 친화력이 더 낮은 것으로 보고된[Shields, R. L. et al. J Biol Chem 277, 26733-26740 (2002); Niwa, R. et al. Clin Cancer Res 10, 6248- 6255 (2004)], 158_F/F 공여자로부터 수득한 세포 보다 더 높은 용해 활성을 나타내었다. CD16_158v/v 공여자로부터 유래된 PBMC를 이용한 용해 실험에서 Ovcar-3 표적 세포 상에서 두 항체에 관하여 계산된 EC₅₀ 값은 CD16_158F/F 공여자로부터의 PBMC를 이용하여 동일한 설정에 의해 획득된 값보다 3배 더 낮았다. 요약하면, 최대 40배의 IGN314 농도의 감소는 IGN311과 비교할 때(Ovcar-3, 표 1을 비교바람), 동일한 ADCC 용해 효과(EC₅₀)를 가져왔으며 이러한 감소는 이펙터 세포 CD16 표현형(158_V/V 또는 158_F/F)과는 관련이 없다.

표 1: 두가지 CD16₁₅₈ 표현형의 이펙터 세포(NK)를 이용한 상이한 루이스 Y 표적 밀도를 지니는 세포주에서 IGN311과 IGN314의 용해 능력의 비교(MFI: 평균 형광 밀도; EC₅₀: 50% 유효 농도).

SK-BR-3 표적 세포를 이용한 용해 실험의 두 번째 세트에서, 보체(CDC)를 활성화시키기 위한 IGN314의 용해 능력을 IGN311과 탈당화된(deglycosylated) IGN311 중 어느 하나와 비교하였다. IG-N311은 예상된 용해 곡선을 나타내었으며(EC₅₀ 값 19.6 ± 1.5㎍/㎖), 한편 IGN314의 보체-매개 용해 활성은 최고 값을 비롯한 EC₅₀ 농도를 고려할 때 어마어마하게 감소되었다. 탈당화된 IGN311은 임의의 용해 활성을 전혀 나타내지 아니하였다.

혈청 효과

천연 혈청에서, 고 농도의 치료 IgG1 항체는 과도한 내생성 면역글로불린 G에 의한 항체-의존성 세포성 세포독성의 억제를 보상시키는데 요구된다. 정상 혈청IgG 수준은 NK 세포에 존재하는 저 친화력 IgG 수용체(CD16)에 대한 치료 IgG1 항체의 결합을 블록킹시킨다. CD64와 더불어, 이들 두 Fcγ 수용체는 ADCC를 매개하는 주요 세포성 수용체이다. 혈청 IgG의 억제 효과를 극복하기 위한 한가지 가능성은 많은 양의 치료 항체의 적용이다. 그러나, 이러한 접근법은 비용 부담이 크며 정상 조직과의 증강된 교차 반응성, 증강된 보체 활성화, 극심한 최초-투여량 부작용, 사람 항-사람 항체(HAHA) 반응의 유도 또는 면역 복합체의 생성으로 초래되는 투여량 연관 부작용과 관련될 수 있다. 또 다른 접근법은 Fcγ 수용체에 대하여 개선된 친화력을 위해 조작된 치료 항체의 사용이다. FcγR에 대한 항체의 결합을 위해, 항체 중쇄의 CH2-영역내 보존된 Asn297 잔기에 공유적으로 결합된 올리고당류의 존재가 필수적이며(도 5, 패널 A), 이것은 탄수화물 구조가 결합을 용이하게 하는 형태를 안정화시킨다는 것을 시사한다. 도 5, 패널 B에 도시된 바와 같이, Asn297은 수용체 결합 부위 바로 옆에 위치하고 있다; 그러나, 탄수화물 부분(moieties)은 경계면(interface)으로부터 멀리 떨어지게 배향(orientation)되어 수용체와의 특이적 접촉을 형성하지 않는다는 것이 드러났다.

당-변형 접근법과 관련하여, 항체의 ADCC 활성은 이들의 당화를 푸코실화된 전형적인 복합체 타입의 코어로부터 이러한 코어 푸코실화가 결여된 구조까지 변화시킴으로써 증강될 수 있다. 이와 같은 탈-푸코오스화된(de-fucosylated) 항체는 당화 기구에 영향을 미치는 유전자의 코-트랜스펙션(co-transfection)으로 또는 특이 당화 효소가 결여된 생산 숙주내에서 발현으로 또는 각각의 효소의 발현을 변형시킴으로써 생산될 수 있다.

이전에, 코어 푸코오스 잔기가 결여된, 루이스-Y 특이적 인간화 항체 IGN311의 당-조작-변이체가, 특징적인 코어 푸코실화 N-연결 올리고당 패턴을 지니는 야생형 항체와 비교할 때, 루이스-Y 포지티브 SK-BR-5 종양 세포에서 29배 증가된 ADCC 반응성을 나타내는 것으로 드러났다(WO2004/062556). IGN312로 명명된, 데-푸코실화된 IGN311은 아세틸-글리코사미닐트랜스퍼라아제-III 유전자 및 IGN311 중쇄와 경쇄를 사람 배아 신장-EBV 핵 항원 세포내로 일시적으로 코-트랜스펙션시킴으로써 항체-생산 숙주의 당화 기구의 유전적 조작으로 생성되었다. 본 발명에 따르면, 대안적 당-최적화 식물 발현 시스템, 즉, β1,2-크실로실트랜스퍼라아제 및 α1,3-푸코실트랜스퍼라아제 녹아웃 이끼 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens)에서 중쇄 및 경쇄에 대한 IGN311 유전자를 발현시킴으로써 최대 40배의 ADCC 활성 증가가 나타났다. 요약하면, 두가지 접근법 - 푸코실-부족 포유류 및 식물 발현 시스템 - 을 이용할 때, 요구되는 치료 투여량의 최소화를 가능케하는 인간화 모노클로날 치료 항체 IGN314의 ADCC 능력에서의 유의한 증가가 입증되었다. 당-조작된 항체의 개선된 ADCC 활성은 적어도 부분적으로 이펙터 세포, 즉 치료 항체로 확인된 ADCC 활성에 관한 주요 활동체(players)인 NK 세포 상의 Fcγ- RIII 수용체에 대한 Fc 부분의 증가된 결합에 기인한다.

데-푸코실화된 IGN314에 의해 매개된 증가된 친화력은, 내생성 IgG와 비교할 때, 이펙터 세포 상의 Fcγ-RIII 수용체에 대한 결합과 관련한 유리한 열역학적 행동으로 설명될 수 있다. 사람 정상 혈청(NHS)이 IGN311 및 데-푸코실화된 IGN314, 각각의 활성에 영향을 미침으로써 ADCC를 나타내는지 여부를 조사하였다. 제일 처음, 본 발명자들은 10% 또는 40%의 정상 사람 혈정(NHS) 중에 희석된 IGN311가 10% 우태아 혈청(FCS) 중에서 보다 유의하게 낮은 ADCC 활성을 나타내었음을 확인하였는데, 이는 NHS가 유의하게 IGN311의 이펙터 기능을 감소시켰음을 시사한다(도 6, 회색 선). 반대로, 데-푸코실화된 변이체는 NHS에 의해 영향받지 아니하였으며(도 6, 검은색 선) 추가적으로 FCS 뿐만 아니라 NHS 중의 야생형 IGN311와 비교하였을 때, 유리한 EC₅₀ 값을 지녔다. 또한, 데이터는 치료 항체의 당-조작이 생체내에서 항체-의존성 세포성 세포독성의 내생성 IgG 매개 억제를 보상할 수 있다는 것을 제시한다.

용해 능력을 EC₅₀으로 평가하였다: 10% FCS 중의 야생형 모 IGN311 및 당-변형 IGN314, 각각의 경우 0.301㎍/㎖(95% CI: 0.169 - 0.537)와 0.052㎍/㎖(95% CI: 0.028 - 0.094)으로 평가되었고, 40% NHS 중의 모 IGN311과 당-변형 IGN314, 각각의 경우 1.558㎍/㎖(95% CI: 0.989 - 2.457)과 0.126㎍/㎖(95% CI: 0.065 - 0.244)으로 평가되었다. EC₅₀ 값을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.

또한, 고전적인 항체-기반 요법은 이펙터 세포 상의 Fcγ-RIII 수용체의 기능적 다형성으로 인한 제약이 있다. 사람 개체군에서 더 낮은 빈도로 존재하는, FcγRIII-158v 이소형(isoform)은 천연 및 당-조작 항체 둘 모두에 대해 높은 친화 력을 나타내는 반면, 전우성(predominant) 이소형 FcγRIII-158F은 당-조작 항체에만 높은 친화력을 갖는다. 따라서, 당-조작은 사람 혈청내 증가된 용해 이펙터 기능에 기반한 수동 항체 요법에 대한 임상 반응자(responders)의 수를 어마어마하게 증가시킨다. 이들 데이터는 치료 항체의 당-변형이 사람내에서 우세한 ADCC 활성을 변경시킬 것임을 강하게 시사한다.

C-말단 리신

혈청에서 유래된 것 뿐만 아니라, 재조합적으로 생산된, IgG1 분자는 이들의 C-말단 Lys-잔기의 출현과 관련하여 미세-이질성(micro-heterogeneity)을 나타내었다. 보존된 C-말단 Lys-잔기의 (부분) 절단은 번역후 사건인데, 세포내의 염기성 카르복시펩티다아제의 작용으로 촉매된다[Lazar et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry (18), 3, 239-244, 2004].

2개의 C-말단 트립신 펩티드 변이체("SLSLSPGK" 및 "SLSLSPG-")와 관련하여 사람 폴리클로날 IgG의 분석은 가공된 변이체("SLSLSPG-")만이 샘플내에 존재함을 제시하였다. 유사하게, Lys-결여 변이체는 전적으로 rAb IGN314(이끼-세포에서 발현됨)에 존재하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과와는 대조적으로, 두 펩티드 변이체들은 샘플 IGN311내에서 검출되었다(도 7) .

SEQUENCE LISTING <110> Greenovation Biotech GmbH <120> Glyco-engineered antibodies <130> r50531 <150> EP06450095.2 <151> 2006-07-11 <160> 7 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant antibody variable region <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant antibody variable region <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Ser Ser His Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Met Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant antibody variable region <400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Ser Ser His Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Met Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> glycopeptide <400> 4 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> glycopeptide <400> 5 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C-terminus of recombinant antibody <400> 6 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C-terminus of recombinant antibody <400> 7 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1 5

Claims

항원에 특이적인, 동물의 변형된 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 단편을 포함하는, 항체 제조물(preparation)로서,

상기 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 단편은 푸코오스와 크실로오스가 결여된 N-글리칸 구조를 포함하며,

상기 변형된 항체, 이의 유도체 또는 이의 단편의 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이상이 C-말단 리신 잔기가 결여되어 있는 것을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 단편의 N-글리칸 구조에는 갈락토오스도 결여되어 있음을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 비변형된 항체 제조물이 상기 변형된 항체 또는 또는 이의 유도체 또는 이의 단편의 제조물과 상기 항원에 동일한 친화력을 지님을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조물의 ADCC 활성이 상기 동일 항원에 특이적인 상기 동물의 비변형된 항체 제조물보다, 동물, 바람직하게는 포유동물의 비특이적 항체를 포함하는 10% 이상의 혈청 용액 중에서 적어도 10% 더 적게 억제됨을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-글리칸 구조가 GlcNAc₂Man₃, GlcNAc₂Man₃GlcNAc 또는 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ 중에서 선택됨을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADCC 이펙터 기능이 상기 동물의 비변형된 항체 제조물, 바람직하게는 상기 동일 항원에 특이적인 항체 제조물과 비교하여, 5배 이상, 바람직하게는 10배 이상, 특히 바람직하게는 20배 이상, 더 바람직하게는 30배 이상, 심지어 더 바람직하게는 40배 이상, 가장 바람직하게는 50배 이상 증가됨을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 유도체 또는 이의 단편의 50% 미만, 바람직하게는 30% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만이 N-글리칸 구조가 결여되어 있음을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물이 포유동물, 바람직하게는 사람, 또는 카멜(camel) 또는 마우스인 것을 특징으로 하는 항제 제조물.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조물의 ADCC 활성이 상기 동일 항원에 특이적인 상기 동물의 비변형된 항체 제조물보다 상기 동물의 비특이적 항체를 포함하는 10% 이상, 바람직하게는 40% 이상의 혈청 용액 중에서, 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20% 더 적게 억제됨을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조물의 ADCC 활성이 상기 비특이적 항체 용액 중에서 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30% 더 적게 억제됨을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물의 변형된 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 단편이 키메라, 인간화 또는 사람 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, CDC 활성이 상기 동일 항원에 특이적인 비변형된 항체 제조물과 비교하여 10% 이상 감소됨을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조물이 IgG 항체 또는 이의 단편 또는 이의 유도체인 것을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조물이 모노클로날 항체, 이의 단편 또는 이의 유도체인 것을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, CD16_158F/F에 대한 상기 변형된 항체, 또는 이의 유도체 또는 이의 단편의 결합이 상기 동일 항원에 특이적인 상기 동물의 비변형된 항체 제조물보다, 상기 동물의 비특이적 항체를 포함하는 10% 이상, 바람직하게는 40% 이상의 혈청 용액 중에서 적어도 10% 더 적게 억제됨을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, CD16₁₅₈ 유전자형 중 어느 한 유전자형의 이펙터 세포에 의해 매개된 상기 변형된 항체, 또는 이의 유도체 또는 이의 단편의 표적 세포 용해가 상기 동일 항원에 특이적인 동물의 비변형된 항체 제조물보다, 상기 동물의 비특이적 항체를 포함하는 10% 이상, 바람직하게는 40% 이상의 혈청 용액 중에서 적어도 10% 더 적게 억제됨을 특징으로 하는 항체 제조물.
β-1,2-크실로실트랜스퍼라아제(xylosyltransferase)와 α-1,3-푸코실트랜스퍼라아제(fucosyltransferase) 활성이 부족한(deficient) 세포, 바람직하게는 식물 세포내에서 항체, 또는 이의 단편 또는 이의 유도체를 엔코딩하는 핵산(들)의 발현 을 통해 획득가능한 항체 제조물.
제 17항에 있어서, 상기 세포에는 갈락토실트랜스퍼라아제(galctosyltransferase)가 부족함을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 17항 또는 제 18항에 있어서, 상기 세포가 GnTIII 활성을 지니도록 변형된 것을 특징으로 하는 항체 제조물.
제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조물의 변형된 항체, 또는 이의 유도체 또는 이의 단편이 파충류, 바람직하게는 크로코다일(crocodile)에서 유래된 것임을 특징으로 하는 항체 제조물.
약제학적 담체 또는 희석제 중의 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 항체 제조물을 함유한 약제 제조물.
환자, 바람직하게는, 사람 또는 포유동물에서, 각각, 종양 세포 성장의 감소 또는 억제를 위한 예방학적 및/또는 치료학적 치료를 위한 약제 제조를 위한 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 항체에 기초한 제조물의 용도.
제 22항에 있어서, 상기 종양 세포 성장의 감소가, 동일 항원에 특이적인 비 변형된 항체의 용도와 비교하여, 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 더 바람직하게는 20% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 30% 이상, 가장 바람직하게는 50% 이상 증가됨을 특징으로 하는, 용도.
고형암의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 제조물의 용도.
제 24항에 있어서, 상피 기원의 고형암 치료를 위한 용도.
극소 잔류 질병(Minimal residual disease)을 치료하기 위한 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 제조물의 용도.
제 22항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 수동 면역요법(passive immunotherapy)을 위한 용도.
제 22항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 혼합물이 1㎎/용량 이상의 투여량, 바람직하게는 10㎎/용량 이상의 투여량, 더 바람직하게는 50㎎/용량 이상의 투여량으로 사용됨을 특징으로 하는 용도.
피검체, 바람직하게는 사람의 샘플을 제공하는 단계, 및 상기 샘플내 항원에 대한 항체의 결합 사건을 검출하는 단계를 포함하는, 시험관내 스크리닝 방법을 위한 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 항체에 기초한 제조물의 용도.
제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 항체 제조물의 제조 방법으로서, 상기 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체가 β1,2-크실로실트랜스퍼라아제 활성 및 α1,3-푸코실트랜스퍼라아제 활성이 부족한, 세포, 바람직하게는, 식물 세포내에서 발현됨을 특징으로 하는, 항체 제조물의 제조 방법.
제 30항에 있어서, 상기 세포에는 1,4-갈락토실트랜스퍼라아제 활성이 부족함을 특징으로 하는 항체 제조물의 제조 방법.
제 30항 또는 제 31항에 있어서, 상기 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체를 발현시키는데 사용된 상기 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체를 엔코딩하는 DNA에는 C-말단 리신에 관한 코돈이 없음을 특징으로 하는 항체 제조물의 제조 방법.
제 30항 또는 제 31항에 있어서, 상기 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체의 C-말단 리신이 바람직하게는 카르복시펩티다아제에 의해 제거되거나, 생체내조건에서 적절한 세포 배양 조건의 선별에 의해, 바람직하게는, 동물 세포 발현 시스템의 선별에 의해 제거됨을 특징으로 하는 항체 제조물의 제조 방법.