JP5727226B2 - Frizzled1、Frizzled2又はFrizzled7細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質を含有する骨疾患治療用医薬組成物 - Google Patents
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Description
本発明に関わるFrizzled受容体は、哺乳動物由来のFrizzled1、Frizzled2又はFrizzled7である。これらの受容体は、リガンドがWntである10種類のFrizzled受容体のうち特に細胞外システインリッチドメイン(以下、「CRD」とも称する)の同一性が高い。これらの受容体のCRDのN末端側の第1システイン残基からC末端側の第10システイン残基までのアミノ酸配列の同一性は、ヒト及びマウスの場合、Frizzled7のCRDとFrizzled2のCRDとの間で93%の同一性、Frizzled7のCRDとFrizzled1のCRDとの間で91%の同一性である。この領域のアミノ酸配列はヒトとマウスで同一であり、種間で保存性が高い。ちなみに、その他のFrizzled3〜6、8〜10のCRDとFrizzled7のCRDとの間の同一性は42〜56%と低い。
QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYPTAPYL
マウスFrizzled7の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列(配列番号20):
QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGAGGSPTAYPTAPYL
下線の部分は、N末端側の第1システイン残基からC末端側の第10システイン残基までの配列であり、CRDの最小領域である(配列番号21)。
CQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEIC
Frizzled1(FZD1とも称される)は、ヒト、マウス、ラット、セキショクヤケイ、アフリカツメガエル等から単離され、配列情報が公開されている。本発明においては、Frizzled1蛋白質又はこれをコードする核酸は、その由来に限定されるものではないが、哺乳動物、例えばヒトを含む霊長類、マウスを含むげっ歯類等の由来であることが好ましい。ヒト又はマウス由来Frizzled1の配列情報は、例えばヒトFrizzled1はアクセッション番号NM_003505.1、NP_003496.1等として、マウスFZD1はアクセッション番号NM_021457.1、NP_067432.1、NM_021457.2、NP_067432.2、NM_021457.3等として、GenBankに登録されている。
QAAGQGPGQGPGPGQQPPPPPQQQQSGQQYNGERGISVPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGTPTPSLLPEFWTSNPQH
マウスFrizzled1の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列(配列番号23):
QAAGQVSGPGQQAPPPPQPQQSGQQYNGERGISIPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGTPTPSLLPEFWTSNPQH
下線の部分は、N末端側の第1システイン残基からC末端側の第10システイン残基までの配列であり、CRDの最小領域である(配列番号24)。この領域は、ヒトとマウスとで同一のアミノ酸配列を示す。
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELC
Frizzled2(FZD2とも称される)は、ヒト、マウス、ラット、アフリカツメガエル等から単離され、配列情報が公開されている。本発明においては、Frizzled2蛋白質又はこれをコードする核酸は、その由来に限定されるものではないが、哺乳動物、例えばヒトを含む霊長類、マウスを含むげっ歯類等の由来であることが好ましい。ヒト又はマウス由来Frizzled2の配列情報は、例えばヒトFrizzled2はアクセッション番号NM_001466.1、NM_001466.2、NP_001457.1等として、マウスFZD2はアクセッション番号NM_020510.1、NM_020510.2、NP_065256.1等として、GenBankに登録されている。
QFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDGAPAL
下線の部分は、N末端側の第1システイン残基からC末端側の第10システイン残基までの配列であり、CRDの最小領域である(配列番号26)。
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQIC
本発明において、「細胞外システインリッチドメイン」は、哺乳動物由来のFrizzled1、Frizzled2及びFrizzled7からなる群から選択されるFrizzled受容体の細胞外領域蛋白質のN末端側の第1システイン残基から第10システイン残基までのアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、哺乳動物において骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する能力を有する蛋白質である。ここで、「少なくとも含み」とは、細胞外システインリッチドメインが、Frizzled受容体の細胞外領域蛋白質のN末端側の第1システイン残基から第10システイン残基までの最小CRD配列からなっていてもよいし、又は、該最小CRD配列のN末端側及び/又はC末端側に、骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する能力を有するかぎり、任意の外来配列が付加していてもよいことを表わす。また、ここで、「外来配列」は、Frizzled受容体の細胞外領域蛋白質と無関係の任意の異種蛋白質由来の配列もしくは人工配列、異種Frizzled受容体の細胞外領域蛋白質の最小CRD配列以外の部分に由来する配列、等を含むことができる。
本発明の細胞外システインリッチドメインには、上記<Frizzled受容体の細胞外システインリッチドメイン>の節で記載した細胞外システインリッチドメインの変異体も包含される。このような変異体は、天然の突然変異体及び人工変異体のいずれも含まれ、上記細胞外システインリッチドメインのアミノ酸配列において、1もしくは複数(好ましくは1もしくは数個)のアミノ酸の置換、欠失又は付加を含むか、或いは、該アミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、例えば93%以上、95%以上、97%以上、98%以上又は99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する能力を有するものである。
上で説明したように、本発明の医薬組成物の有効成分のひとつは、哺乳動物由来のFrizzled1、Frizzled2及びFrizzled7からなる群から選択されるFrizzled受容体由来の骨量、骨密度及び/又は骨強度増加作用をもつ細胞外システインリッチドメイン、又は該ドメインのアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有しかつ骨量、骨密度及び/又は骨強度増加作用をもつその変異体、を含む蛋白質である。
QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYPTAPYLAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号28(配列番号20+配列番号4):
QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGAGGSPTAYPTAPYLAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号29(配列番号22+配列番号4):
QAAGQGPGQGPGPGQQPPPPPQQQQSGQQYNGERGISVPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGTPTPSLLPEFWTSNPQHAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号30(配列番号23+配列番号4):
QAAGQVSGPGQQAPPPPQPQQSGQQYNGERGISIPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGTPTPSLLPEFWTSNPQHAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号31(配列番号25+配列番号4):
QFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDGAPALAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
上記配列番号27〜31のアミノ酸配列中の細胞外システインリッチドメインは、Frizzled7、Frizzled1又はFrizzled2受容体の細胞外領域蛋白質に由来するが、このドメインのアミノ酸配列は、骨量、骨密度及び/又は骨強度を増加する能力を有するかぎり、上記<細胞外システインリッチドメインの変異体>の節に記載したような変異を含んでもよい。
本発明の組成物の有効成分として、上記細胞外システインリッチドメイン又はその変異体を含む蛋白質をコードする核酸を含むベクターも含まれる。
ATGCGGGGCCCCGGCACGGCGGCGTCGCACTCGCCCCTGGGCCTCTGCGCCCTGGTGCTTGCTCTTCTGTGCGCGCTGCCCACGGACACCCGGGCTCAGCCATATCACGGCGAGAAAGGCATCTCGGTACCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGTTGTGCACGGATATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTAAAGGTGCAGTGTTCTCCTGAGCTACGCTTCTTCTTATGCTCTATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTCGACCAAGCCATTCCTCCGTGCCGTTCCTTGTGCGAGCGCGCCCGACAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGAGCGGTTGCGCTGCGAGAACTTCCCAGTGCACGGTGCCGGCGAGATCTGCGTGGGGCAGAACACGTCCGACGGCTCCGGGGGCGCGGGCGGCAGTCCCACCGCCTACCCTACTGCTCCCTACCTG
ヒトFrizzled7細胞外領域蛋白質をコードするDNA(配列番号33):
ATGCGGGACCCCGGCGCGGCCGCTCCGCTTTCGTCCCTGGGCCTCTGTGCCCTGGTGCTGGCGCTGCTGGGCGCACTGTCCGCGGGCGCCGGGGCGCAGCCGTACCACGGAGAGAAGGGCATCTCCGTGCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCCCGAACTCCGCTTTTTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCCATCCCGCCGTGTCGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCCGAGCGGCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGCGTGGGCCAGAACACGTCGGACGGCTCCGGGGGCCCAGGCGGCGGCCCCACTGCCTACCCTACCGCGCCCTACCTG
マウスFrizzled1細胞外領域蛋白質をコードするDNA(配列番号34):
ATGGCTGAGGAGGCGGCGCCTAGCGAGTCCCGGGCCGCCGGCCGGCTGAGCTTGGAACTTTGTGCCGAAGCACTCCCGGGCCGGCGGGAGGAGGTGGGGCACGAGGACACGGCCAGCCACCGCCGCCCCCGGGCTGATCCCCGGCGTTGGGCTAGCGGGCTGCTGCTGCTGCTTTGGTTGCTGGAGGCTCCTCTGCTTTTGGGGGTCCGAGCGCAGGCGGCGGGCCAGGTATCCGGGCCGGGCCAGCAAGCCCCGCCGCCGCCCCAGCCCCAGCAGAGCGGGCAGCAGTACAACGGCGAACGGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTACTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCGTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAATCAGGAGGACGCCGGTCTGGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCCGCCGAGCTCAAGTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCTGTGTGCACCGTACTGGAGCAGGCGCTACCGCCCTGCCGCTCCCTGTGCGAGCGCGCACGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGACACACTCAAGTGCGAGAAGTTCCCGGTGCACGGCGCAGGAGAGCTGTGCGTGGGCCAGAACACGTCCGACAAAGGCACCCCAACTCCCTCCTTGCTACCAGAGTTCTGGACCAGTAATCCGCAGCAC
ヒトFrizzled1細胞外領域蛋白質をコードするDNA(配列番号35):
ATGGCTGAGGAGGAGGCGCCTAAGAAGTCCCGGGCCGCCGGCGGTGGCGCGAGCTGGGAACTTTGTGCCGGGGCGCTCTCGGCCCGGCTGGCGGAGGAGGGCAGCGGGGACGCCGGTGGCCGCCGCCGCCCGCCAGTTGACCCCCGGCGATTGGCGCGCCAGCTGCTGCTGCTGCTTTGGCTGCTGGAGGCTCCGCTGCTGCTGGGGGTCCGGGCCCAGGCGGCGGGCCAGGGGCCAGGCCAGGGGCCCGGGCCGGGGCAGCAACCGCCGCCGCCGCCTCAGCAGCAACAGAGCGGGCAGCAGTACAACGGCGAGCGGGGCATCTCCGTCCCGGACCACGGCTATTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCGTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCGGGCCTGGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTAGTGAAAGTGCAGTGTTCCGCTGAGCTCAAGTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCCGTGTGCACCGTGCTAGAGCAGGCGCTGCCGCCCTGCCGCTCCCTGTGCGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGACACGCTCAAGTGTGAGAAGTTCCCGGTGCACGGCGCCGGCGAGCTGTGCGTGGGCCAGAACACGTCCGACAAGGGCACCCCGACGCCCTCGCTGCTTCCAGAGTTCTGGACCAGCAACCCTCAGCAC
マウスFrizzled2細胞外領域蛋白質をコードするDNA(配列番号36):
ATGCGGGCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCACTGCTGCTGCTGCCGGCCGCCGGACCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTTGGCCACACGAACCAGGAAGACGCGGGCCTGGAGGTGCATCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAGCTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCGGTGTGCACAGTGCTGGAGCAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCCATCTGCGAGCGCGCGCGCCAAGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAATGGCCCGAGCGCCTCCGCTGCGAGCATTTCCCGCGTCACGGCGCGGAGCAGATCTGCGTGGGCCAGAACCACTCGGAGGACGGAGCTCCTGCGCTA
ヒトFrizzled2細胞外領域蛋白質をコードするDNA(配列番号37):
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTA
本発明における核酸は、Frizzled受容体の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質又はその変異体と、上記定義の異種蛋白質との融合蛋白質をコードする核酸も含まれる。異種蛋白質として好ましい例は、哺乳動物由来の免疫グロブリンFc蛋白質であり、特にヒトFc蛋白質が好ましいが、その生物活性(特にADCC及びCDC)を低下又は喪失させるように変異を導入することが望ましい。例えば、変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質をコードするヌクレオチド配列を配列番号3に示す。さらにまた、この変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質(下線部)と、マウス又はヒト由来Frizzled7、1又は2受容体の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質(非下線部)との融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列を、以下に例示する。
CAGCCATATCACGGCGAGAAAGGCATCTCGGTACCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGTTGTGCACGGATATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTAAAGGTGCAGTGTTCTCCTGAGCTACGCTTCTTCTTATGCTCTATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTCGACCAAGCCATTCCTCCGTGCCGTTCCTTGTGCGAGCGCGCCCGACAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGAGCGGTTGCGCTGCGAGAACTTCCCAGTGCACGGTGCCGGCGAGATCTGCGTGGGGCAGAACACGTCCGACGGCTCCGGGGGCGCGGGCGGCAGTCCCACCGCCTACCCTACTGCTCCCTACCTGGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
ヒトFrizzled7細胞外領域蛋白質+変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質の融合蛋白質をコードするDNA(配列番号39):
CAGCCGTACCACGGAGAGAAGGGCATCTCCGTGCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCCCGAACTCCGCTTTTTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCCATCCCGCCGTGTCGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCCGAGCGGCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGCGTGGGCCAGAACACGTCGGACGGCTCCGGGGGCCCAGGCGGCGGCCCCACTGCCTACCCTACCGCGCCCTACCTGGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
マウスFrizzled1細胞外領域蛋白質+変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質の融合蛋白質をコードするDNA(配列番号40):
CAGGCGGCGGGCCAGGTATCCGGGCCGGGCCAGCAAGCCCCGCCGCCGCCCCAGCCCCAGCAGAGCGGGCAGCAGTACAACGGCGAACGGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTACTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCGTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAATCAGGAGGACGCCGGTCTGGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCCGCCGAGCTCAAGTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCTGTGTGCACCGTACTGGAGCAGGCGCTACCGCCCTGCCGCTCCCTGTGCGAGCGCGCACGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGACACACTCAAGTGCGAGAAGTTCCCGGTGCACGGCGCAGGAGAGCTGTGCGTGGGCCAGAACACGTCCGACAAAGGCACCCCAACTCCCTCCTTGCTACCAGAGTTCTGGACCAGTAATCCGCAGCACGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
ヒトFrizzled1細胞外領域蛋白質+変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質の融合蛋白質をコードするDNA(配列番号41):
CAGGCGGCGGGCCAGGGGCCAGGCCAGGGGCCCGGGCCGGGGCAGCAACCGCCGCCGCCGCCTCAGCAGCAACAGAGCGGGCAGCAGTACAACGGCGAGCGGGGCATCTCCGTCCCGGACCACGGCTATTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCGTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCGGGCCTGGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTAGTGAAAGTGCAGTGTTCCGCTGAGCTCAAGTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCCGTGTGCACCGTGCTAGAGCAGGCGCTGCCGCCCTGCCGCTCCCTGTGCGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGACACGCTCAAGTGTGAGAAGTTCCCGGTGCACGGCGCCGGCGAGCTGTGCGTGGGCCAGAACACGTCCGACAAGGGCACCCCGACGCCCTCGCTGCTTCCAGAGTTCTGGACCAGCAACCCTCAGCACGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
マウスFrizzled2細胞外領域蛋白質+変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質の融合蛋白質をコードするDNA(配列番号42):
CAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTTGGCCACACGAACCAGGAAGACGCGGGCCTGGAGGTGCATCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAGCTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCGGTGTGCACAGTGCTGGAGCAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCCATCTGCGAGCGCGCGCGCCAAGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAATGGCCCGAGCGCCTCCGCTGCGAGCATTTCCCGCGTCACGGCGCGGAGCAGATCTGCGTGGGCCAGAACCACTCGGAGGACGGAGCTCCTGCGCTAGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
ヒトFrizzled2細胞外領域蛋白質+変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質の融合蛋白質をコードするDNA(配列番号43):
CAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTAGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
また、マウス及びヒト由来のFrizzled7、Frizzled1及びFrizzled2の細胞外領域蛋白質のN末端側の第1システイン残基から第10システイン残基までのシステインリッチドメイン(CRD)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を以下に例示する。
TGCCAGCCCATCTCCATCCCGTTGTGCACGGATATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTAAAGGTGCAGTGTTCTCCTGAGCTACGCTTCTTCTTATGCTCTATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTCGACCAAGCCATTCCTCCGTGCCGTTCCTTGTGCGAGCGCGCCCGACAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGAGCGGTTGCGCTGCGAGAACTTCCCAGTGCACGGTGCCGGCGAGATCTGC
配列番号45:Frizzled7 ヒト CRD
TGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCCCGAACTCCGCTTTTTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCCATCCCGCCGTGTCGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCCGAGCGGCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGC
配列番号46:Frizzled1 マウス CRD
TGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCGTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAATCAGGAGGACGCCGGTCTGGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCCGCCGAGCTCAAGTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCTGTGTGCACCGTACTGGAGCAGGCGCTACCGCCCTGCCGCTCCCTGTGCGAGCGCGCACGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGACACACTCAAGTGCGAGAAGTTCCCGGTGCACGGCGCAGGAGAGCTGTGC
配列番号47:Frizzled1 ヒト CRD
TGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCGTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCGGGCCTGGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTAGTGAAAGTGCAGTGTTCCGCTGAGCTCAAGTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCCGTGTGCACCGTGCTAGAGCAGGCGCTGCCGCCCTGCCGCTCCCTGTGCGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGACACGCTCAAGTGTGAGAAGTTCCCGGTGCACGGCGCCGGCGAGCTGTGC
配列番号48:Frizzled2 マウス CRD
TGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTTGGCCACACGAACCAGGAAGACGCGGGCCTGGAGGTGCATCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAGCTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCGGTGTGCACAGTGCTGGAGCAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCCATCTGCGAGCGCGCGCGCCAAGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAATGGCCCGAGCGCCTCCGCTGCGAGCATTTCCCGCGTCACGGCGCGGAGCAGATCTGC
配列番号49:Frizzled2 ヒト CRD
TGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGC
上記融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。シグナル配列の例は、ヒト蛋白質由来のシグナル配列、例えばヒトFrizzled1、2及び7由来のシグナル配列、ヒトCD33由来のシグナル配列、ヒト血清アルブミン由来のシグナル配列、ヒトプレプロトリプシン由来のシグナル配列等である。
本発明は更に、上で説明したFrizzled1、Frizzled2又はFrizzled7受容体の細胞外システインリッチドメイン又はその変異体を含む蛋白質、或いは、該蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分とする骨疾患治療用組成物を提供する。
本発明は、Frizzled7、Frizzled1、又はFrizzled2受容体の細胞外システインリッチドメインの生体内機能を解析するためのB細胞特異的発現ノックインキメラマウス及びその作製法を通して見出されたものである。
び胸骨の海綿骨の増加が観察された。また、後述の実施例5及び16においては、Frizzled1細胞外システインリッチドメインノックインキメラマウス特異的な表現型として、実施例5(5-1)より大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の硬化、肋骨の硬化が、実施例5(5-2)より脛骨のX線写真撮影から、脛骨の骨密度増加が、実施例5(5-4)よりH&E染色された病理切片の観察から、大腿骨の骨幹壁厚の肥厚と海綿骨増加及び胸骨の海綿骨の増加が、実施例16(16-2-2)より脛骨の単位骨量の増加が、実施例16(16-2-4)より脛骨の石灰化速度・石灰化面・骨形成速度の増加が、実施例16(16-3)より大腿骨の最大荷重増加が、実施例16(16-4)より大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域における単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下が観察された。さらに、後述の実施例10及び19においては、Frizzled2細胞外システインリッチドメインノックインキメラマウス特異的な表現型として、実施例10(10-1)より大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の硬化、肋骨の硬化が、実施例10(10-2)よりH&E染色された病理切片の観察から、大腿骨の骨幹壁厚の肥厚が、実施例19(19-4-2)より脛骨の単位骨量の増加が、実施例19(19-4-4)より脛骨の石灰化速度・石灰化面・骨形成速度の増加が、実施例19-4-5より破骨細胞数・破骨細胞面の低下が、実施例19(19-5)より大腿骨の最大荷重増加が、実施例19(19-6)より大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域における単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下、骨梁中心間距離低下が観察された。
国際公開第WO2006/78072号パンフレットの実施例記載の方法に従い、マウスFZD7-cDNA(開始コドンから終止コドンを含む1719bp、配列番号1)及びヒトIgG1Fc変異体-cDNA(FZD7の細胞外システインリッチドメインと結合させるため挿入したリンカー配列から終止コドンを含む702bp、配列番号3)より、pUSmFZD7crd-hFcm KIベクターを作製した。
以下に、ヒトIgG1 由来Fc変異体(hFcm)のcDNA配列及びアミノ酸配列を配列番号3及び4に示す。公知の情報(Tawara, T., et al., J. Immunology, 180, 2294-2298(2008);Gross, J. A., et al., Immunity, 15, 289-302(2001);国際公開第WO02/094852号パンフレット)を基に本来のヒトIgG1 由来Fc領域配列の中で、ADCC活性低下型に変えるため変異させたcDNA及びアミノ酸配列部分(N末端側より変異前と変異後のアミノ酸を記す。L→A、L→E、G→A)を二重下線で、CDC活性低下型に変えるため変異させたcDNA及びアミノ酸配列部分(変異前と変異後のアミノ酸配列を記す。K→A、P→S)を囲み線で、FZD7の細胞外システインリッチドメインのC末端アミノ酸と結合させるため本来のヒトIgG1由来Fc配列の5’末端に付加したリンカー配列(SfoI認識配列を含む)を下線で示す。公知の情報[Gross, J. A., et al., Immunity, 15, 289-302(2001)]から、上記方法以外にCDC活性低下型に変えるため、配列番号4記載のN末端より116番目のAをSに変異させることも可能である。
以下に、pUSmFZD7crd-hFcm KIベクター発現ユニットの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列[配列番号5:マウスFZD7シグナル配列を、イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列(下線部分)に置換し、その下流にマウスFZD7crd-hFcm配列を含む1462bpより構成される。囲み線の部分はマウスFrizzled7細胞外システインリッチドメイン、二重線の部分はhFcmを示す]、及び該cDNAがコードするアミノ酸配列(配列番号6:406アミノ酸。下線部分はマウスIgκシグナル配列、囲み線の部分はマウスFrizzled7細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す)を示す。イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列情報はGenBankより取得したMUSIGKVR1(アクセッション番号K02159)を基に、その上流のゲノム配列をUCSCマウスゲノムデータベースより取得した。
配列番号6:
pUSmFZD7crd-hFcm KIベクターを用い、国際公開第WO2006/78072号のパンフレットの実施例記載の方法に従いB細胞特異的にマウスFrizzled7細胞外システインリッチドメインとヒトFcmとの融合体を発現するUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスは作製された。
2-1.剖検所見
上記実施例1で作製されたキメラマウスを用い、16週齢において剖検を実施し、脾臓、肝臓、腎臓、副腎、胃、小腸、盲腸、大腸、膵臓、腸間膜リンパ節、雌雄生殖器、胸腺、肺、心臓、脳、筋肉、皮膚、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、椎骨、肋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の白色化と硬化、肋骨の硬化が認められた。また、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスの約半数の個体で脾臓の肥大が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
剖検を実施したUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス20個体中全ての個体においてコントロール29個体に比べ白色化が観察された。
剖検を実施したUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス20個体中全ての個体においてコントロール29個体に比べ白色化が観察された。
剖検を実施したUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス20個体中、コントロール29個体に比べ白色化は16個体、硬化は18個体認められた。
剖検を実施したUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス20個体中、コントロール29個体に比べ白色化は1個体、硬化は10個体認められた。
剖検を実施したUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス20個体中、コントロール29個体に比べ硬化は7個体認められた。
剖検を実施したUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス20個体中、コントロールに比べ11個体で肥大傾向が認められた。但し同様の変化はコントロール個体においても29個体中、4個体で認められた。
16週齢のコントロールキメラマウス7個体及びUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス20個体から由来する肝臓、腎臓、心臓、肺、脾臓、胸腺、腸間膜リンパ節、膵臓、脳、副腎、精巣(雄性の場合)、卵巣(雌性の場合)、大腿骨、胸骨、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、脊髄、大動脈、骨格筋、皮膚のH&E染色病理切片を用いた観察から、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスの全例において大腿骨の海綿骨増加及び胸骨の海綿骨の増加が観察された(図1、2)。コントロール個体においては1個体においてのみ上記同様の変化を示す個体が観察された。骨以外の臓器・組織においては、コントロールに比べ顕著な変化は観察されなかった。
16週齢のコントロールキメラマウス(雌5個体、雄4個体)及びUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雌7個体、雄6個体)由来脛骨を用いてX線写真(μFX-1000、FUJIFILM社製)を撮影した(図3、4)。
8週齢のUSmFZD7crd-hFcm KIキメラ雌マウス14個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体から、8週齢のコントロール雌マウス15個体、コントロール雄マウス9個体から、15週齢のUSmFZD7crd-hFcm KIキメラ雌マウス14個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体から、15週齢のコントロール雌マウス14個体、コントロール雄マウス11個体からエーテル麻酔状態下、ガラスキャピラリーを用いて眼窩採血を行い、ADVIA120(バイエルメディカル株式会社)を用いて血球成分(赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、MCH、MCHC、網状赤血球数、白血球数、血小板数、リンパ球数、好中球数、単球数、好酸球数、好塩基球数)分析を実施した。その結果、8週齢15週齢共に、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
16週齢のUSmFZD7crd-hFcm KIキメラ雌マウス14個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体、コントロール雌マウス16個体、コントロール雄マウス14個体よりエーテル麻酔下で全採血し、血清を調製した。日立7180(株式会社日立サイエンスシステムズ)を用い血清生化学(LDH活性、GOT活性、GPT活性、CK活性、ALP活性、AMY活性、LAP活性、LIP活性、T-CHO濃度、F-CHO濃度、LDL-CHO濃度、HDL-CHO濃度、TG濃度、PL濃度、GLU濃度、GA%、UA濃度、BUN濃度、CREA濃度、T-BIL濃度、D-BIL濃度、TP濃度、ALB濃度、A/G比、IP濃度、Ca濃度、Mg濃度、Na濃度、K濃度、Cl濃度、Fe濃度、UIBC濃度、TIBC濃度)分析を実施した。その結果、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
2-6-1.USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス由来血清を用いたマウスFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体のELISA測定
16週齢USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雌14個体、雄6個体)血清中に存在するマウスFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体をELISA法によって検出した。
ヒトIgG認識ウサギポリクローナル抗体を用いた、16週齢USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス及びコントロールキメラマウス由来血清のウエスタン解析を行った。ウエスタン解析に用いたサンプルとして、予め血清50μLをプロテインGカラム(GEヘルスケア、レジン体積約100μL)にアプライし、非特異的吸着物を除いた後、血清1.25μL及び2.5μL相当のレジンを解析用サンプルとして用いた。その結果、還元条件下で60kDa付近にUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス特有のメインバンドが検出された(図5)。本解析で得られた分子量は本来アミノ酸配列でのみ予測される分子量(還元条件下:42.8kDa)より大きな分子量を示したが、本融合体はN-link、O-link糖鎖付加予測サイトをそれぞれ3箇所含み、糖鎖付加による分子量の増加が示唆された。
実施例1記載の方法に従い、ヒトFZD7-cDNA(配列番号7)及びヒトIgG1Fc変異体-cDNA(配列番号3)より、pUShFZD7crd-hFcm KIベクターを作製した。
以下に、pUShFZD7crd-hFcm KIベクター発現ユニットの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列[配列番号9:ヒトFZD7シグナル配列を、イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列(下線部分)に置換し、その下流にヒトFZD7crd-hFcm配列を含む1462bpより構成される。囲み線の部分はヒトFrizzled7細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す]、及び該cDNAがコードするアミノ酸配列(配列番号10:406アミノ酸。下線部分はマウスIgκシグナル配列、囲み線の部分はヒトFrizzled7細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す)を示す。イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列情報はGenBankより取得したMUSIGKVR1(アクセッション番号K02159)を基に、その上流のゲノム配列をUCSCマウスゲノムデータベースより取得した。
配列番号10:
pUShFZD7crd-hFcm KIベクターを用い、国際公開第WO2006/78072号のパンフレットの実施例記載の方法に従いB細胞特異的にヒトFrizzled7細胞外システインリッチドメインとヒトFcmとの融合体を発現するUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスは作製される。
実施例1記載の方法に従い、マウスFZD1-cDNA(開始コドンから終止コドンを含む1929bp 配列番号11)及びヒトIgG1Fc変異体-cDNA(配列番号3)より、pUSmFZD1crd-hFcm KIベクターを作製した。
以下に、pUSmFZD1crd-hFcm KIベクター発現ユニットの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列[配列番号13:マウスFZD1シグナル配列を、イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列(下線部分)に置換し、その下流にマウスFZD1crd-hFcm配列を含む1534bpより構成される。囲み線の部分はマウスFrizzled1細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す]、及び該cDNAがコードするアミノ酸配列(配列番号14:430アミノ酸、下線部分はマウスIgκシグナル配列、囲み線の部分はマウスFrizzled1細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す)を示す。イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列情報はGenBankより取得したMUSIGKVR1(アクセッション番号K02159)を基に、その上流のゲノム配列をUCSCマウスゲノムデータベースより取得した。
配列番号14:
pUSmFZD1crd-hFcm KIベクターを用い、国際公開第WO2006/78072号のパンフレットの実施例記載の方法に従いB細胞特異的にマウスFrizzled1細胞外システインリッチドメインとヒトFcmとの融合体を発現するUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスは作製される。
5-1.剖検所見
上記実施例4で作製されたキメラマウスを用い、16週齢において剖検を実施し、脾臓、肝臓、腎臓、副腎、胃、小腸、盲腸、大腸、膵臓、腸間膜リンパ節、雌雄生殖器、胸腺、肺、心臓、脳、筋肉、皮膚、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、椎骨、肋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の硬化、肋骨の硬化が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
剖検を実施したUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中10個体においてコントロール10個体に比べ白色化が観察された。
剖検を実施したUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中18個体においてコントロール10個体に比べ白色化が観察された。
剖検を実施したUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中、コントロール10個体に比べ白色化は19個体、硬化は13個体認められた。
剖検を実施したUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中、コントロール10個体に比べ硬化は10個体認められた。
剖検を実施したUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中、コントロール10個体に比べ硬化は7個体認められた。
16週齢のコントロールキメラマウス(雌9個体、雄7個体)及びUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(雌8個体、雄3個体)由来脛骨を用いてX線写真(μFX-1000、FUJIFILM社製)を撮影した(図6、7)。
8週齢のUSmFZD1crd-hFcm KIキメラ雌マウス17個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラ雄マウス3個体から、8週齢のコントロール雌マウス21個体、コントロール雄マウス4個体から、15週齢のUSmFZD1crd-hFcm KIキメラ雌マウス17個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラ雄マウス3個体から、15週齢のコントロール雌マウス17個体、コントロール雄マウス4個体からエーテル麻酔状態下、ガラスキャピラリーを用いて眼窩採血を行い、ADVIA120(バイエルメディカル株式会社)を用いて血球成分(赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、MCH、MCHC、網状赤血球数、白血球数、血小板数、リンパ球数、好中球数、単球数、好酸球数、好塩基球数)分析を実施した。その結果、8週齢15週齢共に、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
16週齢のコントロールキメラマウス9個体及びUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体から由来する肝臓、腎臓、心臓、肺、脾臓、胸腺、腸間膜リンパ節、膵臓、脳、副腎、精巣(雄性の場合)、卵巣(雌性の場合)、大腿骨、胸骨、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、脊髄、大動脈、骨格筋、皮膚のH&E染色病理切片を用い観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の骨幹壁厚の肥厚(図8、9、表1)と海綿骨の増加(図10)及び胸骨の海綿骨の増加(図11)が認められた。それぞれの変化が観察された個体数を以下に記す。
剖検を実施したコントロール9個体に比べUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中11個体において骨幹壁厚の肥厚が、またUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中15個体において海綿骨の増加が観察された。更に、大腿骨の3地点(近位端より30%、50%及び80%)の横断切片について、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス7個体、コントロールマウス2個体由来のサンプルを用いて骨幹壁厚を計測した結果、近位端より50%地点の最大壁厚値でコントロールよりも高値を示した(図9、表1)。また、80%地点での海綿骨増加の所見が7個体中5個体で認められた(表1)。
剖検を実施したUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス20個体中14個体においてコントロール9個体に比べ海綿骨の増加が観察された。
16週齢USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(雌17個体、雄3個体)血清中に存在するマウスFZD1細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体をELISA法によって検出した。
実施例1記載の方法に従い、ヒトFZD1-cDNA(配列番号15)及びヒトIgG1Fc変異体-cDNA(配列番号3)より、pUShFZD7crd-hFcm KIベクターを作製した。
以下に、pUShFZD1crd-hFcm KIベクター発現ユニットの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列[配列番号17:ヒトFZD1シグナル配列を、イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列(下線部分)に置換し、その下流にヒトFZD1crd-hFcm配列を含む1546bpより構成される。囲み線の部分はヒトFrizzled1細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す]、及び該cDNAがコードするアミノ酸配列(配列番号18:434アミノ酸。下線部分はマウスIgκシグナル配列、囲み線の部分はヒトFrizzled1細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す)を示す。イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列情報はGenBankより取得したMUSIGKVR1(アクセッション番号K02159)を基に、その上流のゲノム配列をUCSCマウスゲノムデータベースより取得した。
配列番号18:
pUShFZD1crd-hFcm KIベクターを用い、国際公開第WO2006/78072号のパンフレットの実施例記載の方法に従いB細胞特異的にヒトFrizzled1細胞外システインリッチドメインとヒトFcmとの融合体を発現するUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスは作製される。
7-1.mFZD7crd-hFcm組換え体発現ベクターの構築
7-1-1.pLN1V5ベクターの構築
5’末端にBamHI・NheI・SalIサイトを3’末端にXhoIサイトを持つ(V5タグ+Stop codon)センスオリゴDNA(V5S)及びそれに対するアンチセンスオリゴDNA(V5AS)を合成した。
V5AS:TCGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCGTCGACGCTAGCG(配列番号51)
上記合成オリゴDNAを、掛田らの報告[Gene Ther., 12, 852-856(2005)]に記載されたpLN1ベクター上のBamHI-XhoIサイトに導入し、pLN1V5ベクターを構築した。
088Fc_BHIkozakFw:TAAAGGATCCCGGCCACCATGCGGGGCCCCGGCACGGCGG
(配列番号52)
088Fc_mFZD7G1SA_3primer:GTCTGAAGACCTAGGCTCGGCCAGGTAGGGAGCAGTAGGG
(配列番号53)
G1SA_5primer:GCCGAGCCTAGGTCTTCAGAC
(配列番号54)
SalIG1SARev:TAAAGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGG
(配列番号55)
Prime STAR HS DNA Polymerase(日本国タカラバイオ株式会社)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中に配列番号52及び53のプライマー各10pmol、鋳型としマウスFZD7 cDNA(配列番号1)を添加し、98℃1分保温した後、98℃10秒、57℃5秒、及び72℃2分を1サイクルとして20サイクル増幅し、得られた594bpの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって増幅断片(BamHI mFZD7crd hFcm)を回収した。
実施例7-1-2で回収されたPCR増幅断片をBamHI及びSalI(日本国ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)で酵素消化し、0.8%アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。得られた酵素処理断片を実施例7-1-1で作製されたpLN1V5ベクターのBamHI・SalIサイトに導入し、mFZD7crd-hFcm組換え体発現ベクター(図12)を構築した。
ATGCGGGGCCCCGGCACGGCGGCGTCGCACTCGCCCCTGGGCCTCTGCGCCCTGGTGCTTGCTCTTCTGTGCGCGCTGCCCACGGACACCCGGGCTCAGCCATATCACGGCGAGAAAGGCATCTCGGTACCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGTTGTGCACGGATATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTAAAGGTGCAGTGTTCTCCTGAGCTACGCTTCTTCTTATGCTCTATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTCGACCAAGCCATTCCTCCGTGCCGTTCCTTGTGCGAGCGCGCCCGACAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGAGCGGTTGCGCTGCGAGAACTTCCCAGTGCACGGTGCCGGCGAGATCTGCGTGGGGCAGAACACGTCCGACGGCTCCGGGGGCGCGGGCGGCAGTCCCACCGCCTACCCTACTGCTCCCTACCTGGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号57:
MRGPGTAASHSPLGLCALVLALLCALPTDTRAQPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGAGGSPTAYPTAPYLAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
7-2.mFZD7crd-hFcm組換え体発現ベクターを用いたmFZD7crd-hFcmの一過的発現
7-2-1.遺伝子導入用発現ベクター調製
実施例7-1-3で取得されたmFZD7crd-hFcm組換え体発現ベクターを大腸菌DH5αに導入し、得られた形質転換体よりDNAをプラスミド精製キット(Qiagen plasmid Maxi kit、日本国株式会社キアゲン)を用い調製した。
Free style 293F細胞(日本国インビトロジェン株式会社)をFree style 293 Expression Medium(日本国インビトロジェン株式会社)を用い、37℃、5%CO2、125rpm条件下、細胞密度が2×105から3×106cells/mLの範囲内で培養する。培地1Lを用いて培養した場合、発現ベクター1mgに35mLのOpti-MEM I Reduced Serum Medium(日本国インビトロジェン株式会社)を加えた溶液、及び1.3mLの293 fectin Transfection Reagent(日本国インビトロジェン株式会社)に33.7mLのOpti-MEM I Reduced Serum Mediumを加えた溶液をそれぞれ調製し、5分間室温でインキュベートした。インキュベート後この2液を混合し、更に約30分間室温でインキュベートした。その後、1x109cells/LのFree style 293F細胞を含む培地に前記方法で処理された発現ベクターを添加し、3日間培養した。
7-3-1.培養上清前処理
実施例7-2-2で得られた培養液の上清を回収し、0.22μmフィルター(0.22μm GP Express Membrane 500mL、日本国日本ミリポア株式会社)で濾過処理を行った後4℃で冷却した。
用いた酸性bufferの組成はクエン酸一水和物(日本国ナカライテスク株式会社)3.895g、クエン酸三ナトリウム(日本国和光純薬工業株式会社)0.38g、塩化ナトリウム(日本国純正化学株式会社)2.92gを水に溶かし、1Lとしたものである。用いた中和bufferの組成はリン酸二水素ナトリウム・二水和物(日本国関東化学株式会社)13.1gとリン酸水素二ナトリウム・12水和物(日本国和光純薬工業株式会社)41.5gを水に溶かし、1Lとしたものである。
実施例7-3-2で得られた精製標品中のbufferを限外濾過膜VIVASPIN20 10,000 MW COPES(日本国ザルトリウス・ステディム・ジャパン株式会社)を用いてサンプルを濃縮した。その後、NAP-25Columns(日本国GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)を用いてPBSに置換した。濃縮置換操作終了後0.22μmフィルター(Millex GV、日本国日本ミリポア株式会社)により濾過処理を行った。
8-1.マウスへの投与
mFZD7crd-hFcm組換え体による骨組織に対する生理作用を評価する目的で、マウスへの投与実験を行った。
剖検において、右大腿骨及び胸骨等の組織を採取し、10%中性緩衝ホルマリン液(日本国和光純薬株式会社)に浸漬して固定の後、脱灰操作を行い、H&E標本を作製し、大腿骨における近位端より50%地点の最大骨幹壁厚を測定した。
上記実施例8-2にて剖検を実施した、mFZD7crd-hFcm組換え体投与マウス4個体の大腿骨、胸骨、頭蓋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてmFZD7crd-hFcm組換え体投与マウスにおいて大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化、胸骨の白色化、節が太くなる傾向が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
剖検を実施したmFZD7crd-hFcm組換え体投与マウス4個体中3個体において白色化が観察された。
剖検を実施したmFZD7crd-hFcm組換え体投与マウス4個体中2個体において白色化が観測された。
剖検を実施したmFZD7crd-hFcm組換え体投与マウス4個体中1個体において白色化、2個体において節が太くなる傾向が観察された。
剖検において、脛骨の組織を採取し、脛骨の非脱灰薄切標本を作製しトルイジンブルー染色を行った。なお、薄切標本を作製するため予め脛骨サンプルはGMA(Glycolmethacrylate)樹脂で包埋処理した。得られた非脱灰薄切標本の骨幹端部二次海綿骨部分について構造パラメーターである単位骨量BV/TVを測定した。
実施例1記載の方法に従い、マウスFZD2-cDNA(開始コドンから終止コドンを含む1713bp、配列番号58)及びヒトIgG1Fc変異体-cDNA(配列番号3)より、pUSmFZD2crd-hFcm KIベクターを作製した。
以下に、pUSmFZD2crd-hFcm KIベクター発現ユニットの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列[配列番号60:マウスFZD2シグナル配列を、イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列(下線部分)に置換し、その下流にマウスFZD2crd-hFcm配列を含む1423bpより構成される。囲み線の部分はマウスFrizzled2細胞外システインリッチドメイン、二重線の部分はhFcmを示す]、及び該cDNAがコードするアミノ酸配列(配列番号61:393アミノ酸。下線部分はマウスIgκシグナル配列、囲み線の部分はマウスFrizzled2細胞外システインリッチドメイン、二重下線の部分はhFcmを示す)を示す。イントロン領域を含んだマウスIgκシグナル配列情報はGenBankより取得したMUSIGKVR1(アクセッション番号K02159)を基に、その上流のゲノム配列をUCSCマウスゲノムデータベースより取得した。
配列番号61:
pUSmFZD2crd-hFcm KIベクターを用い、国際公開第WO2006/78072号パンフレットの実施例に従いB細胞特異的にマウスFZD2細胞外システインリッチドメインとヒトFcmとの融合体を発現するUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスは作製される。
10-1.剖検所見
上記実施例9で作製されたキメラマウスを用い、16週齢において剖検を実施し、脾臓、肝臓、腎臓、副腎、胃、小腸、盲腸、大腸、膵臓、腸間膜リンパ節、雌雄生殖器、胸腺、肺、心臓、脳、筋肉、皮膚、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、椎骨、肋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨の硬化、肋骨の硬化が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
剖検を実施したUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス12個体中7個体においてコントロール6個体に比べ白色化が観察された。
剖検を実施したUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス12個体中9個体においてコントロール6個体に比べ白色化が観察された。
剖検を実施したUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、コントロール6個体に比べ白色化は6個体、硬化は4個体認められた。
剖検を実施したUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、コントロール6個体に比べ硬化は2個体認められた。
剖検を実施したUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、コントロール6個体に比べ硬化は2個体認められた。
実施例8-2に記載の方法に従い、大腿骨における近位端より30%、50%及び80%の各地点の最大骨幹壁厚を測定した。
11-1.mFZD1crd-hFcm組換え体発現ベクターの構築
実施例7-1記載の方法に従い、配列番号54、55、62、63のPCRプライマー、及び鋳型としてマウスFzd1 cDNA(配列番号11)、hFcm cDNA(配列番号3)を用いて、mFZD1crd-hFcm組換え体発現ベクターを構築した(図13)。
(配列番号62)
103Fc_mFZD1G1SA_3primer:GTCTGAAGACCTAGGCTCGGC GTGCTGCGGATTACTGGTCC
(配列番号63)
以下にmFZD1crd-hFcm組換え体 cDNAの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列(1446bp、配列番号64)、及び該cDNAがコードするmFZD1-hFcmのシグナル配列を含んだアミノ酸配列(481アミノ酸、配列番号65)を示す。配列番号64及び65において、下線部はマウスFZD1のシグナル配列部分を示す。
ATGGCTGAGGAGGCGGCGCCTAGCGAGTCCCGGGCCGCCGGCCGGCTGAGCTTGGAACTTTGTGCCGAAGCACTCCCGGGCCGGCGGGAGGAGGTGGGGCACGAGGACACGGCCAGCCACCGCCGCCCCCGGGCTGATCCCCGGCGTTGGGCTAGCGGGCTGCTGCTGCTGCTTTGGTTGCTGGAGGCTCCTCTGCTTTTGGGGGTCCGAGCGCAGGCGGCGGGCCAGGTATCCGGGCCGGGCCAGCAAGCCCCGCCGCCGCCCCAGCCCCAGCAGAGCGGGCAGCAGTACAACGGCGAACGGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTACTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCGTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAATCAGGAGGACGCCGGTCTGGAGGTGCACCAGTTCTACCCTCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCCGCCGAGCTCAAGTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCTGTGTGCACCGTACTGGAGCAGGCGCTACCGCCCTGCCGCTCCCTGTGCGAGCGCGCACGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCAGACACACTCAAGTGCGAGAAGTTCCCGGTGCACGGCGCAGGAGAGCTGTGCGTGGGCCAGAACACGTCCGACAAAGGCACCCCAACTCCCTCCTTGCTACCAGAGTTCTGGACCAGTAATCCGCAGCACGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号65:
MAEEAAPSESRAAGRLSLELCAEALPGRREEVGHEDTASHRRPRADPRRWASGLLLLLWLLEAPLLLGVRAQAAGQVSGPGQQAPPPPQPQQSGQQYNGERGISIPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGTPTPSLLPEFWTSNPQHAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
11-2.mFZD1crd-hFcm組換え体発現ベクターを用いたmFZD1crd-hFcm組換え体の一過的発現
11-2-1.遺伝子導入用発現ベクター調製
実施例11-1で取得されたmFZD1crd-hFcm組換え体発現ベクターを大腸菌DH5αに導入し、得られた形質転換体よりDNAをプラスミド精製キット(Qiagen plasmid Maxi kit; 日本国株式会社キアゲン)を用い調製した。
Free style 293F細胞(日本国インビトロジェン株式会社)をFree style 293 Expression Medium (日本国インビトロジェン株式会社)を用い、37℃、5%CO2、125 rpm条件下、細胞密度が2×105から3×106cells/mLの範囲内で培養する。培地1Lを用いて培養した場合、発現ベクター1mgに20mLのOpti PRO SFM(日本国インビトロジェン株式会社)を加え、2.5mLのPEI(Polyethylenimine) に17.5mLのOpti PRO SFMを加えた。その後すぐにこの2液を混合し、10分間室温でインキュベートした。その後、1×109cells/LのFree style 293F細胞を含む培地に前記方法で処理された発現ベクターを添加し、3日間培養した。
11-3-1.培養上清前処理
実施例11-2-2で得られた培養液の上清を回収し、0.22μmフィルター(0.22μm GP Express Membrane 500mL;日本国日本ミリポア株式会社)で濾過処理を行った後4℃(低温室)で冷却した。
用いた酸性bufferの組成はクエン酸一水和物(ナカライテスク株式会社、MW:210.14)を3.895g、クエン酸三ナトリウム(和光純薬工業株式会社、MW:258.07)を0.38g、塩化ナトリウム(純正化学株式会社、MW:58.44)2.92gをミリQ水に溶かし、1Lとしたものである。用いた中和bufferの組成はリン酸二水素ナトリウム・二水和物(関東化学株式会社、MW:156.01)を13.1gとリン酸水素二ナトリウム・12水(和光純薬工業株式会社、MW:358.14)を41.5g、塩化ナトリウム(純正化学株式会社、MW:58.44)8.77gをミリQ水に溶かし、1Lとしたものである。
実施例11-3-2で得られた精製標品中のbufferを限外濾過膜VIVASPIN20 10,000 MWCO PES(日本国ザルトリウス・ステディム・ジャパン株式会社)を用いてサンプルを濃縮した。その後、NAP-25Columns(日本国GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)を用いてPBSに置換した。濃縮置換操作終了後0.22μmフィルター(Millex GV; 日本国日本ミリポア株式会社)により濾過処理を行った。
12-1.マウスへの投与
mFZD1crd-hFcm組換え体による骨組織に対する生理作用を評価する目的で、実施例8-1記載の方法に従い、実施例11-3で得られたmFZD1crd-hFcm組換え体のマウスへの投与実験を行った。
剖検を実施し、mFZD1crd-hFcm組換え体投与マウス5個体の大腿骨、胸骨、頭蓋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてmFZD1crd-hFcm組換え体投与マウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の白色化と骨端肥大、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨の硬化が認められた。それぞれの変化が観察された個体数を以下に記す。
剖検を実施したmFZD1crd-hFcm組換え体投与マウス5個体中4個体で白色化、1個体でやや白色化が、更に1個体で骨端肥大が観察され、コントロール5個体中1個体でやや白色化が観察された。
剖検を実施したmFZD1crd-hFcm組換え体投与マウス5個体中4個体で白色化、1個体でやや白色化が、コントロール5個体中1個体でやや白色化が観察された。
剖検を実施したmFZD1crd-hFcm組換え体投与マウス5個体中4個体で白色化と硬化、1個体でやや白色化とやや硬化が認められたが、コントロール5個体全てにおいてに変化は認められなかった。
剖検を実施したmFZD1crd-hFcm組換え体投与マウス5個体中1個体で硬化が認められたが、コントロール5個体全てにおいて変化は認められなかった。
実施例1記載の方法に従い作製された4週齢USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雌6個体)、4週齢コントロールマウス(雌6個体)、8週齢USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雌6個体)、8週齢コントロールマウス(雌6個体)、16週齢USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雌6個体、雄6個体)、16週齢コントロールマウス(雌6個体、雄5個体)それぞれの血清中に存在するマウスFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体の濃度を実施例2記載の方法に従ってELISA法によって検出した。マウスは温湿度及び、照明時間を一定(温度:22℃、湿度:55%、明暗各12時間)にした条件下で、飼料(CE-2、日本国日本クレア社)を自由摂取出来る環境で飼育した。
13-2-1.骨形態計測
剖検を行う前に、石灰化速度・石灰化面・骨形成速度の各データーを得るため、炭酸水素ナトリウム(日本国関東化学株式会社、商品番号:37116-00)の2%水溶液にカルセイン(日本国同仁化学株式会社、商品番号:340-00433)を溶解させ調製したカルセイン溶液(カルシウムキレート剤)を16mg/kgの投与量で皮下投与した。4週齢剖検の場合、剖検3日前及び1日前にカルセインを投与し、8、16週齢剖検の場合、剖検6日前及び1日前にカルセインを投与した。4、8、16週齢個体の剖検において、脛骨を採取し、脛骨の非脱灰薄切標本を作製後、トルイジンブルー染色(TB染色)、アルカリフォスファターゼ染色(ALP染色)、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP染色)を行った。なお、薄切標本を作製するため予め脛骨サンプルはGMA(Glycolmethacrylate)樹脂で包埋処理した。得られた非脱灰薄切標本の骨幹端部二次海綿骨部分について骨構造に関するパラメーターである単位骨量(BV/TV)、骨形成に関するパラメーターである骨芽細胞数(Ob.N/B.Pm)、骨芽細胞面(Ob.S/BS)、類骨量(OV/BV)、石灰化速度(MAR)、石灰化面(MS/BS)、骨形成速度(BFR/BS)、骨吸収に関するパラメーターである破骨細胞数(Oc.N/B.Pm)、破骨細胞面(Oc.S/BS)をそれぞれ測定した。
4、8、16週齢(雌個体)それぞれにおいて剖検を実施したコントロール6個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨サンプルを用いて単位骨量を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス個体群の単位骨量が4、8、16週齢それぞれで増加していることから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の単位骨量増加はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
4、8、16週齢(雌個体)それぞれにおいて剖検を実施したコントロール6個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨サンプルを用いて骨芽細胞数・骨芽細胞面・類骨量を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス個体群の骨芽細胞数・類骨量が4、8週齢それぞれ減少傾向を示すことから、若週齢において脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の骨芽細胞数・類骨量はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現の影響をほとんど受けないか、やや抑制された可能性が示された。骨芽細胞面では4、8、16週齢全てコントロールとの差はほとんど観察されなかった。
4、8、16週齢(雌個体)それぞれにおいて剖検を実施したコントロール6個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨を用いて石灰化速度・石灰化面・骨形成速度を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス個体群の石灰化速度が16週齢のみで増加を示し、石灰化面は4、8週齢で増加を示し、骨形成速度は4、8、16週齢で増加を示したことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の石灰化はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現によって促進された可能性が示された。
4、8、16週齢(雌個体)それぞれにおいて剖検を実施したコントロール6個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体由来の脛骨を用いて破骨細胞数・破骨細胞面を測定した結果、コントロール個体群に比べ全ての週齢で変化を示さなかったことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の破骨細胞数・破骨細胞面はマウスFZD7細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現の影響をほとんど受けない可能性が示された。
剖検において、大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った。試験実施において支点間距離は6mm、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
剖検において、左脛骨を採取し、高分解能マイクロフォーカスX線CTスキャナー(マイクロCT、Scan Xmate-L090、日本国コムスキャンテクノ社)、使用解析ソフト(TRY 3D-BON、日本国ラトックシステムエンジニアリング社)を用いて脛骨近位骨幹端部の海綿骨領域の内部構造を非破壊的に観察し、単位骨量(BV/TV)、骨梁幅(Tb. Th)、骨梁数(Tb. N)、骨梁間隔(Tb. Sp)、骨梁中心間距離(Tb. Spac)を測定した。
実施例3記載の方法に従い作製された8週齢UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雌6個体)、8週齢コントロールマウス(雌6個体)、8週齢UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雄6個体)、8週齢コントロールマウス(雄6個体)、12週齢UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス(雄6個体)、12週齢コントロールマウス(雄6個体)それぞれの血清中に存在するヒトFZD7細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体を実施例2記載の方法に従ってELISA法によって検出した。マウスは温湿度及び、照明時間を一定(温度:22℃、湿度:55%、明暗各12時間)にした条件下で、飼料(日本国日本クレア社、CE-2)を自由摂取出来る環境で飼育した。
上記実施例3で作製されたキメラマウスを用い、8週齢において剖検(雌6個体、雄6個体)を実施し、脾臓、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、椎骨、肋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウス(雌6個体、雄6個体)に比べ大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨のやや硬化が認められた。また、UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスで脾臓の肥大傾向が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、10個体で白色化が、2個体でやや白色化がコントロール群(12個体)に比べ観察された。
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、10個体で白色化が、2個体でやや白色化がコントロール群(12個体)に比べ観察された。
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、コントロール群(12個体)に比べ白色化は10個体、やや白色化は2個体、硬化は1個体、やや硬化は9個体認められた。
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス12個体中5個体においてコントロール群(12個体)に比べやや硬化が認められた。
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、コントロール群(12個体)に比べ6個体で肥大傾向が認められた。
剖検において、大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った。試験実施において支点間距離は6mm、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
剖検において、大腿骨を採取し、高分解能マイクロフォーカスX線CTスキャナー(マイクロCT、Scan Xmate-L090、コムスキャンテクノ社)、使用解析ソフト(TRY 3D-BON、ラトックシステムエンジニアリング社)を用いて大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域の内部構造を非破壊的に観察し、単位骨量(BV/TV)、骨梁幅(Tb. Th)、骨梁数(Tb. N)、骨梁間隔(Tb. Sp)、骨梁中心間距離(Tb. Spac)を測定した。
上記実施例3で作製されたキメラマウスを用い、12週齢において剖検(雄6個体)を実施し、脾臓、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、椎骨、肋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウス(雄6個体)に比べ大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、椎骨のやや硬化が認められた。また、UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスで脾臓のやや肥大が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体中、1個体で白色化が、4個体でやや白色化がコントロール群(6個体)に比べ観察された。
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体中、1個体で白色化が、1個体でやや白色化がコントロール群(6個体)に比べ観察された。
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体中、コントロール群(6個体)に比べ白色化は2個体、やや白色化は3個体、硬化は1個体、やや硬化は1個体認められた。
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体中1個体においてコントロール群(6個体)に比べやや硬化が認められた。
剖検を実施したUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体中、コントロール群(6個体)に比べ1個体で肥大が認められた。
12週齢のコントロールキメラマウス6個体及びUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体から由来する大腿骨、胸骨のH&E染色病理切片を用いた観察から、UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の骨幹壁厚の肥厚(図14、15、表13)と海綿骨の増加(図16)及び胸骨の海綿骨の増加(図17)が認められた。それぞれの変化が観察された個体数を以下に記す。
剖検を実施したコントロール6個体に比べUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体中6個体において海綿骨の増加が観察された(図16)。更に、大腿骨の3地点(近位端より30%、50%及び80%)の横断切片について骨幹壁厚を計測した結果、近位端より30%地点の最小壁厚値と50%地点の最大壁厚値でそれぞれの平均値はコントロールよりも高値を示した(図14、15、表13)。
剖検を実施したコントロール6個体に比べUShFZD7crd-hFcm KIキメラマウス6個体中5個体において海綿骨の増加が観察された(図17)。
12週齢のUShFZD7crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体、コントロール雄マウス6個体よりエーテル麻酔下で全採血し、血清を調製した。日立7180(日本国株式会社日立サイエンスシステムズ)を用い血清生化学(LDH活性、GOT活性、GPT活性、CK活性、ALP活性、AMY活性、LAP活性、LIP活性、T-CHO濃度、F-CHO濃度、LDL-CHO濃度、HDL-CHO濃度、TG濃度、PL濃度、GLU濃度、GA%、UA濃度、BUN濃度、CREA濃度、T-BIL濃度、D-BIL濃度、TP濃度、ALB濃度、A/G比、IP濃度、Ca濃度、Mg濃度、Na濃度、K濃度、Cl濃度、Fe濃度、UIBC濃度、TIBC濃度)分析を実施した。その結果、UShFZD7crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
mFZD7crd-hFcm組換え体の骨粗鬆症治療薬としての薬効評価を行う目的で、卵巣摘出(OVX)モデルマウスを作製した。mFZD7crd-hFcm組換え体はヒト抗体Fc領域を含む蛋白であることから、投与により生体内で中和抗体が産生された場合にmFZD7crd-hFcm組換え体の活性が抑制される可能性が考えられた。このため、投与実験には中和抗体産生の危険性を低減させる目的で、機能的なBリンパ球が欠損し抗体が産生されない免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスをMCH(ICR)(日本国日本クレア社)系統への戻し交配により得られたホモ接合体(97KDマウス、日本国日本クレア株式会社、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722-7, 2000)をOVXモデルマウス作製に用いた。10週齢の97KDマウスに対し麻酔下で背部を切開し両卵巣を摘出あるいは、卵巣摘出を行わず切開のみ実施する偽手術を施した後に背部を縫合した。
15-2-1.OVXモデルマウスへの投与
上記実施例15-1で作製されたOVXモデルマウスに対し、術後1週間経過した後にmFZD7crd-hFcm組換え体の骨粗鬆症への薬効を評価する目的で投与を行った。被験物質としてmFZD7crd-hFcm組換え体の他に、比較対象としてビスフォスファネート製剤であるリセドロネート(日本国和光純薬株式会社、商品番号:572-27451)を用い、さらにmFZD7crd-hFcm組換え体とリセドロネートの両者を投与する併用群を設定した。投与開始日をDay0とし、剖検はDay69とDay70に実施した。この間、mFZD7crd-hFcm組換え体を1mg/doseの用量で10日に1回の頻度で計7回、尾静脈内(IV)投与した。また、リセドロネートは5μg/kgの用量で1週間に3回の頻度で計30回、皮下(SC)投与した。群設定は、偽手術/非被験物質投与(Sham/non-treatment)群、OVX/リセドロネート投与(OVX/risedronate)群、偽手術/リセドロネート投与(Sham/risedronate)群、OVX/ mFZD7crd-hFcm組換え体投与(OVX/mFZD7crd-hFcm)群、偽手術/mFZD7crd-hFcm組換え体投与(Sham/mFZD7crd-hFcm)群、OVX/mFZD7crd-hFcm組換え体/リセドロネート投与(OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate)群、OVX/非被験物質投与(OVX/non-treatment)群の各群を設定し投与を行った。
上記実施例15-2で記載されたマウスを、Day69及びDay70に剖検し、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、肋骨、椎骨、脾臓、子宮について観察を行った。その結果、Sham/non-treatment群と比べSham/risedronate群、OVX/mFZD7crd-hFcm群、Sham/mFZD7crd-hFcm群、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群で大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨の硬化、椎骨の硬化(Sham/risedronate群は除く)が特徴的な変化として認められた。Sham/mFZD7crd-hFcm群で脾臓のやや黒色化を示す個体数が増加した。OVX/risedronate群、OVX/mFZD7crd-hFcm群、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群、OVX/non-treatment群で子宮の退縮が認められた。上記の臓器において、変化が観察された個体数を以下に示す。
Sham/non-treatment群10個体中1個体でやや白色化が認められたのに対して、OVX/risedronate群10個体中、1個体で白色化、Sham/risedronate群10個体中、2個体で白色化、4個体でやや白色化、OVX/mFZD7crd-hFcm群10個体中、5個体で白色化、4個体でやや白色化、Sham/mFZD7crd-hFcm群10個体中、8個体で白色化、2個体でやや白色化、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群10個体中、7個体で白色化、3個体でやや白色化、OVX/non-treatment群10個体中、1個体でやや白色化が認められた。
Sham/non-treatment群10個体中1個体でやや白色化が認められたのに対して、OVX/risedronate群10個体中、2個体でやや白色化、Sham/risedronate群10個体中、4個体で白色化、3個体でやや白色化、OVX/mFZD7crd-hFcm群10個体中、4個体で白色化、3個体でやや白色化、Sham/mFZD7crd-hFcm群10個体中、8個体で白色化、1個体でやや白色化、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群10個体中、8個体で白色化、1個体でやや白色化、OVX/non-treatment群10個体中、1個体でやや白色化、1個体で濃色化が認められた。
Sham/non-treatment群10個体中1個体でやや白色化が認められたのに対して、OVX/risedronate群10個体中、3個体でやや白色化、1個体でやや硬化、Sham/risedronate群10個体中、2個体で白色化、6個体でやや白色化、2個体でやや硬化、OVX/mFZD7crd-hFcm群10個体中、4個体で白色化、3個体でやや白色化、2個体で硬化、3個体でやや硬化、Sham/mFZD7crd-hFcm群10個体中、7個体で白色化、1個体でやや白色化、5個体で硬化、4個体でやや硬化、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群10個体中、5個体で白色化、2個体でやや白色化、2個体で硬化、4個体でやや硬化、OVX/non-treatment群10個体中、1個体でやや白色化、2個体で部分的軟化が認められた。
Sham/non-treatment群(10個体)と比べ、OVX/risedronate群10個体中、1個体で硬化、Sham/risedronate群10個体中、2個体で硬化、1個体でやや硬化、OVX/mFZD7crd-hFcm群10個体中、2個体で硬化、2個体でやや硬化、Sham/mFZD7crd-hFcm群10個体中、3個体で硬化、2個体でやや硬化、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群10個体中、2個体で硬化、2個体でやや硬化、OVX/non-treatment群10個体中、2個体で部分的軟化が認められた。
Sham/non-treatment群(10個体)と比べ、OVX/mFZD7crd-hFcm群10個体中、1個体で硬化、1個体でやや硬化、Sham/mFZD7crd-hFcm群10個体中、4個体で硬化、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群10個体中、2個体で硬化、1個体でやや硬化が認められた。
Sham/non-treatment群(10個体)と比べ、OVX/risedronate群10個体中、1個体で肥大、1個体で黒色化、Sham/risedronate群10個体中、1個体で肥大傾向、1個体でやや黒色化、OVX/mFZD7crd-hFcm群10個体中、1個体で肥大傾向、2個体でやや黒色化、Sham/mFZD7crd-hFcm群10個体中、1個体で肥大、6個体でやや黒色化、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群9個体中、1個体で肥大傾向、2個体でやや黒色化、OVX/non-treatment群10個体中、1個体でやや黒色化が認められた。
Sham/non-treatment群(10個体)と比べ、OVX/risedronate群10個体中、3個体で退縮、OVX/mFZD7crd-hFcm群10個体中、4個体で退縮、2個体で退縮傾向、OVX/mFZD7crd-hFcm/risedronate群9個体中、6個体で退縮、OVX/non-treatment群10個体中、3個体で退縮、2個体で退縮傾向が認められた。
実施例15-2-2で行われた剖検において、各個体より右大腿骨を採取し、10%中性緩衝ホルマリン液(日本国和光純薬株式会社)に浸漬して固定の後、近位端より30%地点及び50%地点の位置で輪切りし、末端部分は縦切りしたサンプルのH&E標本を作製した。末端部分の海綿骨の変化を観察し、更に近位端より30%地点の最大骨幹壁厚、50%地点の最大・最小骨幹壁厚を測定した。
実施例15-2-2で行われた剖検において、各個体より右大腿骨を採取し、近位端より50%の地点の2DマイクロCT撮影(図18)を行い、近位端より50%地点の皮質骨断面積を測定した(測定個体数は各群10個体)。
実施例15-2-2で行われた剖検において、各個体より右大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った(測定個体数は各群10個体である)。試験実施において支点間距離は6mm、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
16-1.血清生化学解析
上記実施例4で作製された16週齢のUSmFZD1crd-hFcm KIキメラ雌マウス14個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体、コントロール雌マウス16個体、コントロール雄マウス14個体よりエーテル麻酔下で全採血し、血清を調製した。日立7180(日本国株式会社日立サイエンスシステムズ)を用い血清生化学(LDH活性、GOT活性、GPT活性、CK活性、ALP活性、AMY活性、LAP活性、LIP活性、T-CHO濃度、F-CHO濃度、LDL-CHO濃度、HDL-CHO濃度、TG濃度、PL濃度、GLU濃度、GA%、UA濃度、BUN濃度、CREA濃度、T-BIL濃度、D-BIL濃度、TP濃度、ALB濃度、A/G比、IP濃度、Ca濃度、Mg濃度、Na濃度、K濃度、Cl濃度、Fe濃度、UIBC濃度、TIBC濃度)分析を実施した。その結果、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
16-2-1.骨形態計測方法
剖検を行う前に、石灰化速度・石灰化面・骨形成速度の各データーを得るため、炭酸水素ナトリウム(日本国関東化学株式会社、商品番号:37116-00)の2%水溶液にカルセイン(日本国同仁化学株式会社、商品番号:340-00433)を溶解させ調製したカルセイン溶液(カルシウムキレート剤)を16mg/kgの投与量で皮下投与した。投与は剖検6日前及び1日前実施した。剖検において、脛骨を採取し、脛骨の非脱灰薄切標本を作製後、トルイジンブルー染色(TB染色)、アルカリフォスファターゼ染色(ALP染色)、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP染色)を行った。なお、薄切標本を作製するため予め脛骨サンプルはGMA(Glycolmethacrylate)樹脂で包埋処理した。得られた非脱灰薄切標本の骨幹端部二次海綿骨部分について骨構造に関するパラメーターである単位骨量(BV/TV)、骨形成に関するパラメーターである骨芽細胞数(Ob.N/B.Pm)、骨芽細胞面(Ob.S/BS)、類骨量(OV/BV)、石灰化速度(MAR)、石灰化面(MS/BS)、骨形成速度(BFR/BS)、骨吸収に関するパラメーターである破骨細胞数(Oc.N/B.Pm)、破骨細胞面(Oc.S/BS)をそれぞれ測定した。実施例16のコントロールデーター取得には全て16週齢個体が用いられた。
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス雌6個体由来の脛骨サンプルを用いて単位骨量を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス個体群の単位骨量が増加したことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の単位骨量増加はマウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス雌6個体由来の脛骨を用いて骨芽細胞数・骨芽細胞面・類骨量を測定した結果、全てコントロールとの差はほとんど観察されなかった。
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス雌6個体由来の脛骨を用いて石灰化速度・石灰化面・骨形成速度を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス個体群の石灰化速度、石灰化面、骨形成速度が全て増加傾向を示したことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の石灰化はマウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現によって促進された可能性が示された。
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD1crd-hFcm KIキメラマウス雌6個体由来の脛骨を用いて破骨細胞数・破骨細胞面を測定した結果、コントロール個体群とほぼ等しい値が得られたことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の破骨細胞数・破骨細胞面はマウスFZD1細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現の影響をほとんど受けない可能性が示された。
剖検において、大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った。試験実施において支点間距離は6mm、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
剖検において、大腿骨を採取し、高分解能マイクロフォーカスX線CTスキャナー(マイクロCT、Scan Xmate-L090、日本国コムスキャンテクノ社)、使用解析ソフト(TRY 3D-BON、日本国ラトックシステムエンジニアリング社)を用いて大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域の内部構造を非破壊的に観察し、単位骨量(BV/TV)、骨梁幅(Tb. Th)、骨梁数(Tb. N)、骨梁間隔(Tb. Sp)、骨梁中心間距離(Tb. Spac)を測定した。
実施例6記載の方法に従い作製された8週齢UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(雌6個体、雄6個体)、8週齢コントロールマウス(雌6個体、雄6個体)、12週齢UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス(雄6個体)、12週齢コントロールマウス(雄6個体)それぞれの血清中に存在するヒトFZD1細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体を実施例2記載の方法に従ってELISA法によって検出した。マウスは温湿度及び、照明時間を一定(温度:22℃、湿度:55%、明暗各12時間)にした条件下で、飼料(日本国日本クレア社、CE-2)を自由摂取出来る環境で飼育した。
上記実施例6で作製されたキメラマウスを用い、8週齢において剖検(雌6個体、雄6個体)を実施し、脾臓、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、椎骨、肋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨の硬化が認められた。また、UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスで脾臓のやや肥大が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、5個体で白色化が、6個体でやや白色化がコントロール群(雌6個体、雄6個体)に比べ観察された。
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス12個体中11個体においてコントロール群(雌6個体、雄6個体)に比べ白色化が観察された。
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、コントロール群(雌6個体、雄6個体)に比べ白色化は9個体、やや白色化は3個体、硬化は2個体、やや硬化は5個体認められた。
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス12個体中5個体においてコントロール群(雌6個体、雄6個体)に比べやや硬化が認められた。
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス12個体中、コントロール群(雌6個体、雄6個体)に比べ7個体で肥大傾向が、8個体でやや黒色化が認められた。
剖検において、大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った。試験実施において支点間距離は6mm、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
剖検において、大腿骨を採取し、高分解能マイクロフォーカスX線CTスキャナー(マイクロCT、Scan Xmate-L090、日本国コムスキャンテクノ社)、使用解析ソフト(TRY 3D-BON、日本国ラトックシステムエンジニアリング社)を用いて大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域の内部構造を非破壊的に観察し、単位骨量(BV/TV)、骨梁幅(Tb. Th)、骨梁数(Tb. N)、骨梁間隔(Tb. Sp)、骨梁中心間距離(Tb. Spac)を測定した。
上記実施例6で作製されたキメラマウスを用い、12週齢において剖検(雄6個体)を実施し、脾臓、大腿骨、胸骨、頭蓋骨、椎骨、肋骨について観察を行った。その結果、特徴的な変化としてUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウス(雄6個体)に比べ大腿骨の白色化、胸骨の白色化、頭蓋骨の白色化と硬化、肋骨のやや硬化が認められた。それぞれ変化が観察された個体数を以下に記す。
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体中、5個体でやや白色化がコントロール群(6個体)に比べ観察された。
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体中、3個体で白色化が、3個体でやや白色化がコントロール群(6個体)に比べ観察された。
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体中、コントロール群(6個体)に比べ白色化は1個体、やや白色化は4個体、硬化は1個体、やや硬化は2個体認められた。
剖検を実施したUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体中2個体においてコントロール群(6個体)に比べやや硬化が認められた。
12週齢のコントロールキメラマウス6個体及びUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体から由来する大腿骨、胸骨のH&E染色病理切片を用いた観察から、UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスにおいてコントロールマウスに比べ大腿骨の骨幹壁厚の肥厚(図19、20、表24)と海綿骨の増加(図21)及び、胸骨の海綿骨の増加(図22)が認められた。それぞれの変化が観察された個体数を以下に記す。
剖検を実施したコントロール6個体に比べUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体中6個体において海綿骨の増加が観察された。更に、大腿骨の3地点(近位端より30%地点、50%地点及び80%地点)の横断切片について骨幹壁厚を計測した結果、近位端より30%地点の最小壁厚値と50%地点の最大壁厚値でそれぞれの平均値コントロールよりも高値を示した(図19、20、表24)。
剖検を実施したコントロール6個体に比べUShFZD1crd-hFcm KIキメラマウス6個体中6個体において海綿骨の増加が観察された(図22)。
12週齢のUShFZD1crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体、コントロール雄マウス6個体よりエーテル麻酔下で全採血し、血清を調製した。日立7180(日本国株式会社日立サイエンスシステムズ)を用い血清生化学(LDH活性、GOT活性、GPT活性、CK活性、ALP活性、AMY活性、LAP活性、LIP活性、T-CHO濃度、F-CHO濃度、LDL-CHO濃度、HDL-CHO濃度、TG濃度、PL濃度、GLU濃度、GA%、UA濃度、BUN濃度、CREA濃度、T-BIL濃度、D-BIL濃度、TP濃度、ALB濃度、A/G比、IP濃度、Ca濃度、Mg濃度、Na濃度、K濃度、Cl濃度、Fe濃度、UIBC濃度、TIBC濃度)分析を実施した。その結果、UShFZD1crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
頭蓋骨のトルイジンブルー染色標本を作製し、矢状縫合線から左右に0.6mmを除外し、頭頂側頭縫合線(鱗縁)までの蓋骨外面における頭蓋冠厚(μm)を測定した。
剖検において、大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った。試験実施において支点間距離は6mm、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
19-1.血球解析
8週齢のUSmFZD2crd-hFcm KIキメラ雌マウス6個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体、8週齢のコントロール雌マウス11個体、コントロール雄マウス11個体、15週齢のUSmFZD2crd-hFcm KIキメラ雌マウス6個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体、15週齢のコントロール雌マウス11個体、コントロール雄マウス11個体からエーテル麻酔状態下、ガラスキャピラリーを用いて眼窩採血を行い、ADVIA120(日本国バイエルメディカル株式会社)を用いて血球成分(赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、MCH、MCHC、網状赤血球数、白血球数、血小板数、リンパ球数、好中球数、単球数、好酸球数、好塩基球数)分析を実施した。その結果、8週齢15週齢共に、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
16週齢のUSmFZD2crd-hFcm KIキメラ雌マウス6個体、USmFZD7crd-hFcm KIキメラ雄マウス6個体、コントロール雌マウス9個体、コントロール雄マウス9個体よりエーテル麻酔下で全採血し、血清を調製した。日立7180(日本国株式会社日立サイエンスシステムズ)を用い血清生化学(LDH活性、GOT活性、GPT活性、CK活性、ALP活性、AMY活性、LAP活性、LIP活性、T-CHO濃度、F-CHO濃度、LDL-CHO濃度、HDL-CHO濃度、TG濃度、PL濃度、GLU濃度、GA%、UA濃度、BUN濃度、CREA濃度、T-BIL濃度、D-BIL濃度、TP濃度、ALB濃度、A/G比、IP濃度、Ca濃度、Mg濃度、Na濃度、K濃度、Cl濃度、Fe濃度、UIBC濃度、TIBC濃度)分析を実施した。その結果、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウスで得られた値はコントロールに比べ顕著な変化を示さなかった。
実施例2記載の方法に従い、16週齢USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス(雌6個体、雄6個体)血清中に存在するマウスFZD2細胞外システインリッチドメインとヒトFc変異体との融合体の濃度をELISA法によって検出した。マウスは温湿度及び、照明時間を一定(温度:22℃、湿度:55%、明暗各12時間)にした条件下で、飼料(CE-2、日本国日本クレア社)を自由摂取出来る環境で飼育した。
19-4-1.骨形態計測方法
剖検を行う前に、石灰化速度・石灰化面・骨形成速度の各データーを得るため、炭酸水素ナトリウム(日本国関東化学株式会社、商品番号:37116-00)の2%水溶液にカルセイン(日本国同仁化学株式会社、商品番号:340-00433)を溶解させ調製したカルセイン溶液(カルシウムキレート剤)を16mg/kgの投与量で皮下投与した。投与は剖検6日前及び1日前実施した。剖検において、脛骨を採取し、脛骨の非脱灰薄切標本を作製後、トルイジンブルー染色(TB染色)、アルカリフォスファターゼ染色(ALP染色)、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP染色)を行った。なお、薄切標本を作製するため予め脛骨サンプルはGMA(Glycolmethacrylate)樹脂で包埋処理した。得られた非脱灰薄切標本の骨幹端部二次海綿骨部分について骨構造に関するパラメーターである単位骨量(BV/TV)、骨形成に関するパラメーターである骨芽細胞数(Ob.N/B.Pm)、骨芽細胞面(Ob.S/BS)、類骨量(OV/BV)、石灰化速度(MAR)、石灰化面(MS/BS)、骨形成速度(BFR/BS)、骨吸収に関するパラメーターである破骨細胞数(Oc.N/B.Pm)、破骨細胞面(Oc.S/BS)をそれぞれ測定した。実施例19において実施例19-2以降のコントロールデーター取得には全て16週齢個体が用いられた。
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス雌3個体由来の脛骨サンプルを用いて単位骨量を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス個体群の単位骨量が増加したことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の単位骨量増加はマウスFZD2細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体の過剰発現によって引き起こされた可能性が示された。
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス雌3個体由来の脛骨を用いて骨芽細胞数・骨芽細胞面・類骨量を測定した結果、全てコントロールとの差はほとんど観察されなかった。
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス雌3個体由来の脛骨を用いて石灰化速度・石灰化面・骨形成速度を測定した結果、コントロール個体群に比べUSmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス個体群の石灰化速度、石灰化面、骨形成速度が全て増加を示したことから、頸骨骨幹端部二次海綿骨部分の石灰化はマウスFZD2細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現によって促進された可能性が示された。
剖検を実施したコントロール雌6個体、USmFZD2crd-hFcm KIキメラマウス雌3個体由来の脛骨を用いて破骨細胞数・破骨細胞面を測定した結果、両パラメーターともにコントロール個体群に比べ低下傾向を示すことから、脛骨骨幹端部二次海綿骨部分の破骨細胞数・破骨細胞面はマウスFZD2細胞外システインリッチドメイン-ヒトFc変異体過剰発現によって抑制された可能性が示された。
剖検において、大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った。試験実施において支点間距離は6mm、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
剖検において、大腿骨を採取し、高分解能マイクロフォーカスX線CTスキャナー(マイクロCT、Scan Xmate-L090、日本国コムスキャンテクノ社)、使用解析ソフト(TRY 3D-BON、日本国ラトックシステムエンジニアリング社)を用いて大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域の内部構造を非破壊的に観察し、単位骨量(BV/TV)、骨梁幅(Tb. Th)、骨梁数(Tb. N)、骨梁間隔(Tb. Sp)、骨梁中心間距離(Tb. Spac)を測定した。
20-1.mFZD2crd-hFcm組換え体発現ベクターの構築
実施例7-1記載の方法に従い、配列番号54、66、67、68のPCRプライマー、及び鋳型としてマウスFZD2 cDNA(配列番号58)、hFcm cDNA(配列番号3)を用いて、mFZD2crd-hFcm組換え体発現ベクターを構築した(図23)。
5’末端にBamHI・NheI・SalI サイトを3’末端にXhoIサイトを持つ(V5タグ+Stop codon)センスオリゴDNA(V5S)及びそれに対するアンチセンスオリゴDNA(V5AS)を合成した。
(配列番号50)
V5AS:TCGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCGTCGACGCTAGCG
(配列番号51)
上記合成オリゴDNAを、掛田らの報告[Gene Ther., 12, 852-856(2005)]に記載されたpLN1ベクター上のBamHI-XhoIサイトに導入し、pLN1V5ベクターを構築した。
155Fc_BHIkozakFw:TAAAGGATCCCGGCCACCATGCGGGCCCGCAGCGCCCTGC
(配列番号66)
155Fc_mFZD2G1SA_3primer:GTCTGAAGACCTAGGCTCGGCTAGCGCAGGAGCTCCGTCC
(配列番号67)
G1SA_5primer:GCCGAGCCTAGGTCTTCAGAC
(配列番号54)
hFc-NotI-Rv:ATAGTTTAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGG
(配列番号68)
Prime STAR HS DNA Polymerase(日本国タカラバイオ株式会社)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中に配列番号66及び67のプライマー各10pmol、鋳型としマウスFZD2 cDNA(配列番号58)を添加し、98℃1分保温した後、98℃10秒、62℃5秒、及び72℃40秒を1サイクルとして30サイクル増幅し、得られた543bpの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって増幅断片(BamHI mFZD2crd hFcm)を回収した。
実施例20-1-2で回収されたPCR増幅断片をBamHI及びNotI(日本国ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)で酵素消化し、0.8%アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。実施例20-1-1で作製されたpLN1V5ベクターにNotI siteを付加したvectorを用意し、上で得られた酵素処理断片をBamHI・NotIサイトに導入し、mFZD2crd-hFcm組換え体発現ベクター(図23)を構築した。
ATGCGGGCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCACTGCTGCTGCTGCCGGCCGCCGGACCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTTGGCCACACGAACCAGGAAGACGCGGGCCTGGAGGTGCATCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAGCTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCGCCGGTGTGCACAGTGCTGGAGCAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCCATCTGCGAGCGCGCGCGCCAAGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAATGGCCCGAGCGCCTCCGCTGCGAGCATTTCCCGCGTCACGGCGCGGAGCAGATCTGCGTGGGCCAGAACCACTCGGAGGACGGAGCTCCTGCGCTAGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号70:
MRARSALPRSALPRLLLPLLLLPAAGPAQFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDGAPALAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
20-2.mFZD2crd-hFcm組換え体発現ベクターを用いたmFZD2crd-hFcm組換え体の一過的発現
20-2-1.遺伝子導入用発現ベクター調製
実施例20-1-3で取得されたmFZD2crd-hFcm組換え体発現ベクターを大腸菌DH5αに導入し、得られた形質転換体よりDNAをプラスミド精製キット(Qiagen plasmid Maxi kit、日本国株式会社キアゲン)を用い調製した。
FreeStyle CHO-S Cells(日本国インビトロジェン株式会社)をFreeStyle CHO Expression Medium(日本国インビトロジェン株式会社)を用い、37℃、5%CO2、125rpm条件下、細胞密度が1×105から4×106cells/mLの範囲内で培養する。培地1Lを用いて培養した場合、発現ベクター1mgに20mLのOpti PRO SFM(日本国インビトロジェン株式会社)を加え、7.5mLのポリエチレンイミン(PEI)に12.5mLのOpti PRO SFM(日本国インビトロジェン株式会社)を加えた。その後すぐにこの2液を混合し、10分間室温でインキュベートした。その後、2×109 cells/LのFreeStyle CHO-S細胞を含む培地に前記方法で処理された発現ベクターを添加し、3日間培養した。
20-3-1.培養上清前処理
培養後、上清を回収し0.22μmフィルター(TCフィルターユニットPES、ナルゲン社)で濾過処理を行った後4℃(低温室)で冷却した。凍結保存した場合には融解後、再度0.22μmフィルターで濾過した。
用いた酸性bufferの組成はくえん酸一水和物(ナカライテスク株式会社、MW:210.14)を3.43g、くえん酸三ナトリウム(和光純薬工業株式会社、MW:258.07)を0.90g、塩化ナトリウム(純正化学株式会社、MW:58.44)8.77gをミリQ水に溶かし、1Lとしたものである。用いた中和bufferの組成はりん酸二水素ナトリウム・二水和物(関東化学株式会社、MW:156.01)を13.1gとりん酸水素二ナトリウム・12水(和光純薬工業株式会社、MW:358.14)を41.5g、塩化ナトリウム(純正化学株式会社、MW:58.44)8.77gをミリQ水に溶かし、1Lとしたものである。
実施例20-3-2で得られた精製標品中のbufferを限外濾過膜VIVASPIN20 10,000 MWCO PES(日本国ザルトリウス・ステディム・ジャパン株式会社)を用いてサンプルを濃縮した。その後、NAP-25Columns(日本国GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)を用いてPBSに置換した。濃縮置換操作終了後0.22μmフィルター(Millex GV、日本国日本ミリポア株式会社)により濾過処理を行った。濃縮操作は可能な限りクリーンベンチ内で行った。実施例20-3で行われた全ての工程はクリーンベンチでの作業以外、低温室(+4℃)ないしは氷上で実施した。蛋白質濃度はA280nmを測定し、比吸光係数(E1%,1cm=9.7)より算出した。
21-1.mFZD7c10-hFcm組換え体発現ベクターの構築
実施例7-1記載の方法に従い、配列番号55、71のPCRプライマー、及び鋳型としてマウスFZD7 cDNA(配列番号1)、hFcm cDNA(配列番号3)を用いて、mFZD7c10-hFcm組換え体発現ベクターを構築した(図24)。
5’末端にBamHI・NheI・SalI サイトを3’末端にXhoIサイトを持つ(V5タグ+Stop codon)センスオリゴDNA(V5S)及びそれに対するアンチセンスオリゴDNA(V5AS)を合成した。
(配列番号50)
V5AS:TCGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCGTCGACGCTAGCG
(配列番号51)
上記合成オリゴDNAを、掛田らの報告[Gene Ther., 12, 852-856(2005)]に記載されたpLN1ベクター上のBamHI-XhoIサイトに導入し、pLN1V5ベクターを構築した。
pLN1V5-BHIkozakFw:TAAAGGATCCCGGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTG
(配列番号71)
SalIG1SARv:TAAAGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGG
(配列番号55)
Prime STAR HS DNA Polymerase(日本国タカラバイオ株式会社)を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、50μl反応液中に配列番号71及び55のプライマー各10pmol、鋳型として、実施例1に記載の方法を基に作製した、マウスIgkシグナル配列、Frizzled7マウスCRD、及び変異型ヒトIgG1由来Fc蛋白質の融合蛋白質をコードするDNAを融合した配列を用い、98℃10秒保温した後、98℃10秒、57℃5秒、及び72℃2分を1サイクルとして20サイクル増幅し、得られた1367bpの増幅断片を0.8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって増幅断片(BamHI mFZD7c10hFcm SalI)を回収した。
実施例21-1-2で回収されたPCR増幅断片をBamHI及びSalI(日本国ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)で酵素消化し、0.8%アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからQIAquick Gel Extraction Extraction Kit(日本国株式会社キアゲン)を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。得られた酵素処理断片を実施例21-1-1で作製されたpLN1V5ベクターのBamHI・SalIサイトに導入し、mFZD7c10-hFcm組換え体発現ベクター(図24)を構築した。
配列番号73:
21-2.mFZD7c10-hFcm組換え体発現ベクターを用いたmFZD7c10-hFcm組換え体の一過的発現
21-2-1.遺伝子導入用発現ベクター調製
実施例21-1-3.で取得されたmFZD7c10-hFcm組換え体発現ベクターを大腸菌DH5αに導入し、得られた形質転換体よりDNAをプラスミド精製キット(Qiagen plasmid Maxi kit、日本国株式会社キアゲン)を用い調製した。
Free style 293F細胞(日本国インビトロジェン株式会社)をFree style 293 Expression Medium(日本国インビトロジェン株式会社)を用い、37℃、5%CO2、125rpm条件下、細胞密度が2×105から3×106cells/mLの範囲内で培養する。培地1Lを用いて培養した場合、発現ベクター1mgに35mLのOpti-MEM I Reduced Serum Medium(日本国インビトロジェン株式会社)を加え、1.3mLの293 fectin Transfection Reagent(日本国インビトロジェン株式会社)に33.7mLのOpti-MEM I Reduced Serum Medium(日本国インビトロジェン株式会社)を加え、5分間室温でインキュベートした。インキュベート後この2液を混合し、更に20〜30分間室温でインキュベートした。その後、1×109cells/LのFree style 293F細胞を含む培地に前記方法で処理された発現ベクターを添加し、3日間培養した。
21-3-1.培養上清前処理
培養後、上清を回収し0.22μmフィルター(TCフィルターユニットPES、ナルゲン社)で濾過処理を行った後4℃(低温室)で冷却した。凍結保存した場合には融解後、再度0.22μmフィルターで濾過した。
用いた酸性bufferの組成はくえん酸一水和物(ナカライテスク株式会社、MW:210.14)を3.895g、クエン酸三ナトリウム(和光純薬工業株式会社、MW:258.07)を0.38g、塩化ナトリウム(純正化学株式会社、MW:58.44)8.77gをミリQ水に溶かし、1Lとしたものである。用いた中和bufferの組成はリン酸二水素ナトリウム・二水和物(関東化学株式会社、MW:156.01)を13.1gとリン酸水素二ナトリウム・12水(和光純薬工業株式会社、MW:358.14)を41.5g、塩化ナトリウム(純正化学株式会社、MW:58.44)8.77gをミリQ水に溶かし、1Lとしたものである。
実施例21-3-2で得られた精製標品中のbufferを限外濾過膜VIVASPIN20 10,000 MWCO PES(日本国ザルトリウス・ステディム・ジャパン株式会社)を用いてPBSに置換後、サンプルを濃縮した。濃縮置換操作終了後0.22μmフィルター(Millex GV、日本国日本ミリポア株式会社)により濾過処理を行った。濃縮操作は可能な限りクリーンベンチ内で行った。実施例21-3で行われた全ての工程はクリーンベンチでの作業以外、低温室(+4℃)ないしは氷上で実施した。最終精製品のSDS-PAGE(CBB染色)より、還元条件下では単量体が検出された。蛋白質濃度はA280nmを測定し、比吸光係数(E1%,1cm=10.5)より算出した。
22-1.mFZD7c10-hFcm組換え体の投与
mFZD7c10-hFcm組換え体の薬効評価を行う目的で、マウスへの投与実験を行った。mFZD7c10-hFcm組換え体はヒト抗体Fc領域を含む蛋白であることから、投与により生体内で中和抗体が産生された場合にmFZD7c10-hFcm組換え体の活性が抑制される可能性が考えられた。このため、投与実験には中和抗体産生の危険性を低減させる目的で、機能的なBリンパ球が欠損し抗体が産生されない免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスをMCH(ICR)(日本国日本クレア社)系統への戻し交配により得られたホモ接合体(97KDマウス、日本国日本クレア株式会社、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722-7, 2000)を用いた。投与期間中、97KDマウスは温湿度及び、照明時間を一定(温度:22℃、湿度:55%、明暗各12時間)にした条件下で、飼料(CE-2、日本国日本クレア社)を自由摂取出来る環境で飼育した。6週齢時点の投与開始日前日(Day-1)の体重を元に、1群5匹ずつ計4群に群分けを実施した。mFZD7c10-hFcm組換え体投与群には、mFZD7c10-hFcm組換え体を蛋白濃度5mg/mLとなるようにPBSで調製して凍結保存しておいた投与液を用時に融解し、各個体に200μLずつ1mg/doseの用量で10日に1回の頻度で計7回(q10d7)、尾静脈内に投与した。コントロール群として、無処置コントロール群を設定した。初回投与日をDay0とし、Day60まで10日おきに計7回の尾静脈投与を実施した後、Day70に全ての群の動物を剖検に供した。
剖検において、右大腿骨を採取し、3点曲げ試験を行った。試験実施において支点間距離は6mmとし、その中点に荷重し最大荷重(N)を測定した。
剖検において、左脛骨を採取し、高分解能マイクロフォーカスX線CTスキャナー(マイクロCT、Scan Xmate-L090、日本国コムスキャンテクノ社)、使用解析ソフト(TRY 3D-BON、ラトックシステムエンジニアリング社)を用いて脛骨近位骨幹端部 海綿骨領域の内部構造を非破壊的に観察し、単位骨量(BV/TV)、骨梁幅(Tb. Th)、骨梁数(Tb. N)、骨梁間隔(Tb. Sp)、骨梁中心間距離(Tb. Spac)を測定した(図25)。
配列番号5:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号6:融合蛋白質
配列番号9:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号10:融合蛋白質
配列番号13:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号14:融合蛋白質
配列番号17:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号18:融合蛋白質
配列番号27〜31:融合蛋白質
配列番号38〜43:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号50及び51:センスオリゴDNA
配列番号52〜55:プライマー
配列番号56:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号57:融合蛋白質
配列番号62及び63:プライマー
配列番号64:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号65:融合蛋白質
配列番号66〜68:プライマー
配列番号69:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号70:融合蛋白質
配列番号71:プライマー
配列番号72:融合蛋白質をコードするDNA
配列番号73:融合蛋白質
Claims (15)
- 哺乳動物由来のFrizzled1、Frizzled2及びFrizzled7からなる群から選択されるFrizzled受容体由来の骨量、骨密度及び/又は骨強度増加作用をもつ、細胞外領域蛋白質又はその細胞外システインリッチドメインを含む断片と、哺乳動物由来免疫グロブリンFc蛋白質又はその変異体との融合蛋白質、或いは、該融合蛋白質をコードする核酸を含むベクター、を有効成分として含有する骨疾患治療用医薬組成物。
- 上記融合蛋白質が化学修飾されている、請求項1記載の組成物。
- 上記化学修飾が、1又は複数のポリエチレングリコール分子の結合である、請求項2記載の組成物。
- 上記化学修飾が、糖鎖の結合である、請求項2記載の組成物。
- 上記融合蛋白質が、組換え蛋白質である、請求項1〜4のいずれか1項記載の組成物。
- 上記細胞外領域蛋白質又はその細胞外システインリッチドメインを含む断片が、上記Frizzled受容体の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列において、そのN末端側の第1番目のシステイン残基からC末端側の第10番目のシステイン残基までのアミノ酸配列を少なくとも含む、請求項1〜5のいずれか1項記載の組成物。
- 上記細胞外領域蛋白質が、配列番号19、20、22、23又は25のアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の組成物。
- 上記細胞外領域蛋白質又はその細胞外システインリッチドメインを含む断片が、配列番号21、配列番号24、又は配列番号26のN末端側の第1番目のシステイン残基からC末端側の第10番目のシステイン残基までのアミノ酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか1項記載の組成物。
- 上記細胞外領域蛋白質又はその細胞外システインリッチドメインを含む断片をコードする核酸が、配列番号44〜49のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項1〜8のいずれか1項記載の組成物。
- 上記Fc蛋白質の変異体が、配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の組成物。
- 上記Fc蛋白質の変異体をコードする核酸が、配列番号3のヌクレオチド配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の組成物。
- 上記融合蛋白質が、配列番号27〜31のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の組成物。
- 上記融合蛋白質をコードする核酸が、配列番号38〜43のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の組成物。
- 上記哺乳動物がヒトである、請求項1〜13のいずれか1項記載の組成物。
- 上記骨疾患が、骨量、骨密度及び/又は骨強度の低下を伴う疾患である、請求項1〜14のいずれか1項記載の組成物。
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