JP6121902B2 - Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質、および該蛋白質を含有する骨疾患治療用医薬組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、公知のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質に比べ、生産細胞における分泌性（以下、生産性ともいう）が高く、および／または骨量の増加活性を有する新規Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質、および該蛋白質を含有する骨疾患治療用医薬組成物に関する。
本発明はまた、公知のＦｒｉｚｚｌｅ２の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質に比べ、生産細胞における分泌性が高く、および／または骨量の増加活性を有する新規Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質、および該蛋白質を含有する骨疾患治療用医薬組成物の製造方法に関する。
本発明はさらに、公知のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質に比べ、生産細胞における分泌性が高く、および／または骨量の増加活性を有する新規Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質、および該蛋白質を含有する骨疾患治療用医薬組成物を用いた骨疾患の治療方法に関する。
この知見は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質の生産細胞の作製、および該蛋白質を投与したマウスの特性解析から見出された。
超高齢化社会を迎え骨粗鬆症人口は増加し、それに起因する骨折が社会的に大きな問題となっている。特に大腿骨頚部骨折および椎体骨折は、寝たきり状態を招くことにより、クオリティーオブライフを大幅に低下させ、介護または入院治療等による社会的および医療経済的負担の増加を招いている（非特許文献１、２）。
また骨粗鬆症は、高齢期における死亡率に大きな関連性のあることが近年明らかにされてきた（非特許文献３、４）。このような背景から骨粗鬆症の予防および治療は克服すべき重大な課題となっている。
骨粗鬆症（骨基質量と石灰化量との比率が保たれたままで骨量が減少した状態）には原発性骨粗鬆症と続発性（二次性）骨粗鬆症がある。前者は従来、閉経後骨粗鬆症または老人性骨粗鬆症といわれた病態を指す。後者は他の疾患によって骨代謝に変化を来し骨粗鬆症の病態を呈したものを指し、原因別に内分泌性、栄養性／代謝性、炎症性、不動性、薬物性、血液疾患、先天性、その他の疾患によるものに分類される。
上記分類において、内分泌性には、副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症、性腺機能低下症、クッシング症候群、成長ホルモン欠乏症、糖尿病、アジソン病またはカルシトニン欠損症等がある。
栄養性／代謝性には、慢性消耗性疾患、るいそう、重症肝疾患（特に原発性胆汁性肝硬変）、胃切除、壊血病、吸収不良症候群（セリアック病を含む）、低リン血症、慢性腎疾患、特発性高Ｃａ尿症、ヘモクロマトーシス、アミロイドーシス、肥胖細胞腫、ナトリウム過剰摂取、カルシウム摂取不足またはビタミンＤ，Ａ過剰症等がある。炎症性には、関節リウマチ、傍関節性（炎症性サイトカインによる骨吸収亢進）またはサルコイドーシス等がある。
また、不動性には、全身性、臥床安静、麻痺、局所性または骨折後等がある。薬物性には、ステロイド（免疫抑制薬として炎症性疾患に広く用いられている。ステロイドで治療する疾患には、膠原病、喘息、炎症性腸疾患または臓器移植等がある。骨喪失はこの療法の重篤な副作用である）、メトトレキセート、ヘパリン、ワーファリン、抗ケイレン薬、リチウムまたはタモキシフェン等がある。
血液疾患には、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、血友病または慢性溶血性疾患等がある。先天性には、骨形成不全症、マルファン症候群、クラインフェルター症候群、先天性骨髄性ポルフィリアまたは嚢胞性線維症等がある。
その他の疾患によるものには、慢性閉塞性肺疾患、肝疾患、腎疾患、関節リウマチ、妊娠、高酸素血症またはＨＩＶ感染症等が続発性骨粗鬆症の原因疾患として挙げられている（非特許文献５）。
上記疾患の中でも原発性骨粗鬆症に加え社会的に大きな影響のある骨疾患として、変形性関節症、関節リウマチ、悪性腫瘍または腎疾患に伴う骨疾患等が挙げられている。変形性関節症は運動器領域で最も多い疾患であり、日本の罹患者は１，０００万人ともいわれ、高齢化に伴い患者数は増加し続けることが予想されている。重度の関節障害は人工関節置換手術による治療が行われているが、疾病レベルが中等度以下の症状に対する根本的な治療方法は報告されていないのが現状である（非特許文献６）。
関節リウマチは多発性関節炎を主体とする慢性かつ進行性の炎症性疾患であり、関節滑膜の増殖から次第に周囲の軟骨または骨が侵され、関節の破壊と変形に至ることの多い疾患である。抗リウマチ薬（メトトレキサート）による治療では関節破壊の進行を十分に抑制できないことが報告されており、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αを標的とした生物学的製剤は関節破壊抑制効果が有意に表れることから画期的な薬剤と考えられている。しかしながらその使用にあたって日和見感染、結核（肺外結核）またはニューモシスチス肺炎等の発症率が増加することが副作用として懸念されている（非特許文献７）。
悪性腫瘍に伴う骨疾患として、主に悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症と骨転移が挙げられる。高カルシウム血症は食欲不振と利尿をきたし、脱水症状とそれによる腎機能不全を伴う。骨転移は特に乳がん、前立腺がんおよび肺がん患者に多く認められる。骨転移自体が致命的となることは少ないが、骨痛、病的骨折または神経麻痺等を引きおこす原因となるため患者のＱＯＬを著しく低下させることが多く、骨転移のコントロールは臨床上の重要な課題となっている（非特許文献８）。これら悪性腫瘍に伴う骨疾患の治療にはビスフォスフォネート製剤が用いられているが副作用による問題点が指摘されている。
腎疾患に伴う骨疾患のうち、腎臓組織障害が原因となって骨が障害される病態を腎性骨異栄養症と呼ぶ。腎透析患者における骨疾患は、主に二次性副甲状腺機能亢進症に起因する。副甲状腺機能亢進を原因とするＰＴＨ濃度増加と、例えば、骨形成蛋白質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）７の不十分な産生により、腎性骨異栄養症が進行する。透析患者において骨の副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＰＴＨ）に対する反応性が低下する場合が多く、ＰＴＨ濃度が慢性的かつ顕著に増加すると、線維性骨炎（高い骨回転）が発症するが、ＰＴＨ濃度が基準範囲に維持されると無形成骨症（低い骨回転）となる。
線維性骨炎が重症化するとコラーゲン線維が不規則に形成され、非結晶性燐酸カルシウムとして石灰化し、粗線維骨（ｗｏｖｅｎ ｂｏｎｅ）が形成されることにより、骨形成は亢進するものの骨は折れやすくなる。線維性骨炎治療の基本は副甲状腺ホルモンの分泌抑制であり、カルシウム摂取と活性型ビタミンＤの投与が中心となる。
但し慢性腎臓病（ＣＫＤ）、特に透析患者の場合には食物または水分の制限等様々なコントロールが必要であり、また二次性副甲状腺機能亢進症が進行すると逆に高カルシウム血症も問題となる。また活性型ビタミンＤもその処方にあたっては、常に腎機能（血清クレアチニン値）と血清カルシウム値をモニターする等の細心の注意が必要とされている。
活性型ビタミンＤ製剤の長期連用と過剰投与に伴うもの、または副甲状腺摘出術（ＰＴＸ）後の副甲状腺ホルモンの抑制によっても無形成骨症は発症する。無形成骨症は線維性骨炎よりも骨折率が高く、高カルシウム血症、血管または他の軟部組織の石灰化を誘導することから適切な治療法が求められているが、無形成骨の病態として、骨吸収も骨形成も抑制された低回転骨の状態であり、確立された治療法がないのが現状である（非特許文献９）。
骨のリン若しくはカルシウムの取り込み能の低下（低代謝回転骨）または貯蔵能力の低下（高代謝回転骨）によって引き起こされる高リン血症あるいは高カルシウム血症は異所性（血管）石灰化の原因の一つとして考えられている。慢性腎不全患者、特に透析患者では、死因の４０％以上が心血管系合併症によるものであり、血管石灰化を伴う動脈硬化が重要な病態として注目されている。慢性腎不全患者における高度の進展した石灰化病変に対する治療はいまだ困難で予後不良である（非特許文献１０）。
よって、原発性骨粗鬆症に加え、変形性関節症、関節リウマチ、悪性腫瘍、腎疾患に伴う骨疾患または骨疾患に伴う血管石灰化に対してさらに有効に作用し、副作用の少ない薬剤の開発が望まれている。
骨代謝は骨芽細胞と破骨細胞の働きのバランスによってコントロールされていると考えられており、骨を壊す作用が骨を作る作用を上回った時に、骨粗鬆症が生じる（非特許文献１１）。特に閉経後の女性は、骨を保護する役割を担う女性ホルモンの分泌が低下し、その結果として、骨芽細胞の骨形成能の低下と破骨細胞の骨吸収活性の亢進が認められ、骨粗鬆症の症状を呈する可能性が高い（非特許文献１２、１３）。
そのためエストロゲン製剤が用いられているが、その使用によって血栓症および乳がんの危険性が増すことが明らかとなり適応は制限されつつある。また、選択的エストロゲン受容体モジュレーターの使用においては深部静脈血栓症の危険性が増大することが報告されている（非特許文献１４）。
現在、破骨細胞の骨吸収活性を抑制する薬剤としてカルシトニンまたはビスフォスフォネート等が使用されている。カルシトニンは破骨細胞表面に発現するカルシトニン受容体と結合することによって破骨細胞の不活性化を誘導することが知られており、骨粗鬆症のみではなく高カルシウム血症または骨Ｐａｇｅｔ病等にも臨床応用されている。
しかしながら骨折抑制効果に対する有効性は明らかではなく、カルシトニン投与によってその受容体発現がダウンレギュレーションされることが報告されている（非特許文献１４、１５）。ビスフォスフォネートは強力な骨吸収抑制作用を示し、日本においてもアンドロネートまたはリセドロネート等のアミノ基含有ビスフォスフォネートは骨粗鬆症治療薬の主流である。これらビスフォスファネート製剤はファルネシル二燐酸合成酵素を阻害することによって脂質蛋白質のプレニル化を阻害し、骨吸収機能の抑制と破骨細胞のアポトーシスを誘導する（非特許文献１６）。
しかしながらビスフォネート製剤の問題点として、２００８年ＦＤＡから重度の骨格・関節・筋肉の疼痛発生の警告が発令された。また、歯科治療後に長期間（２〜３年以上）使用したとき顎骨壊死が発生する等の副作用が報告されている（非特許文献１７）。
上記以外の新しい骨吸収抑制剤として抗ＲＡＮＫＬ抗体が期待されている。抗ＲＡＮＫＬ抗体は更に関節リュウマチの関節破壊抑制剤または多発性骨髄腫治療剤としての適応も期待され臨床開発が進められている。
しかしながら、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ経路は、樹状細胞の生存と維持に重要との報告（非特許文献１８）またはＲＡＮＫおよびＲＡＮＫＬ欠損マウスではリンパ節の形成不全が引き起こされるとの報告（非特許文献１９、２０）から、抗ＲＡＮＫＬ抗体製剤の免疫系への影響が懸念される。
２００８年ＡＭＧＥＮ社より抗ＲＡＮＫＬ抗体製剤（デノスマブ）の臨床試験において一部感染症発症率の増加が報告された。また２００９年の抗ＲＡＮＫＬ抗体製剤の臨床試験結果から、ビスフォスフォネート製剤と同様、顎骨壊死の発生が副作用として報告された。
骨芽細胞を活性化する骨形成促進剤として唯一ＰＴＨを用いた間歇投与治療が行われているが（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社、テリパラチド）、海綿骨骨量増加活性に比べ皮質骨骨厚増加活性が余り高くない点ではビスフォスフォネート製剤等他の治療剤と変わらないため、骨折予防効果はあまり高くないと考えられる。
更にＰＴＨに関して、旭化成ファーマ社（日本）より、動悸、頻脈若しくは血圧降下等の副作用またはラット長期投与試験で骨肉種が認められた等の問題点が報告され、欧米においても１．５〜２年以上の継続的使用は認められておらず、癌患者への適応は禁止されているため癌骨転移抑制または癌によって引き起こされる高カルシウム血症（腫瘍細胞が産生する副甲状腺ホルモン関連ペプチドが原因となる腫瘍随伴体液性高カルシウム血症または局所性骨溶解性高カルシウム血症）の治療等にＰＴＨを用いることは不可能である。
よって、閉経後の女性を含む骨芽細胞の骨形成能の低下または破骨細胞の骨吸収活性の亢進が原因によって生じる骨粗鬆症、高カルシウム血症、骨Ｐａｇｅｔ病、骨転移抑制、関節リュウマチの関節破壊抑制または多発性骨髄腫に対してさらに有効に作用し、副作用の少ない薬剤の開発が望まれている。
この他、骨粗鬆症とは異なり石灰化のプロセスのみが阻害されることによって引き起こされる骨疾患として骨軟化症およびクル病が知られている。骨は、コラーゲン等よりなる基質層が、ハイドロキシアパタイトの沈着により石灰化されることによって形成されるが、該石灰化が障害され、類骨が増加した状態が骨軟化症であり、小児期に発症した場合は、クル病と呼ばれる。
症状としては、手足の痛み、関節痛、腰痛若しくは背中の痛み等、骨または関節の痛みが起き、歩行障害に至り、骨折しやすい状態に陥る。小児の場合、発育障害、Ｏ脚等手足の変形または鳩胸等が認められる。一般的な治療方法として、食事療法に加え、ビタミンＤ、カルシウム剤またはリン製剤が用いられるが変形による機能障害が強い場合、手術が唯一の対処療法である。よって、骨軟化症またはクル病に対して更に有効な薬剤の開発が望まれている
先に述べたように骨は常に骨芽細胞と破骨細胞の働きのバランスによってコントロールされリモデリングが行われている組織であるため、折れにくい丈夫な骨を作るには単に骨量が増加すればよいとは限らない。
例えば、大理石骨病（非特許文献２１）、骨ページェット病（非特許文献２２）またはカムラチ・エンゲルマン病（ＣＥＤ）（非特許文献２３、２４）等の遺伝性疾患ではそれぞれ異なる原因から骨形成と骨吸収のバランスが異常となり、骨量の増加が観察されながらも骨強度は却って低下することが知られている。
材料力学的に骨強度を決める因子には更に骨密度に代表される量的因子の他に、海綿骨の連結性、皮質骨の厚み若しくは多孔率、または断面モーメント等の形状因子、あるいは石灰化若しくは骨疲労等の質的因子が挙げられる（非特許文献２５）。それ故、骨量を増加させるばかりではなく、骨強度向上に役立つ有効な薬剤の開発が原発性骨粗鬆症または続発性（二次性）骨粗鬆症の治療において望まれている。
近年、骨形成促進薬の創薬標的として、Ｗｎｔ／ＬＲＰシグナル制御機構に関与する因子が注目されている。Ｗｎｔは分子量が約４万のパルミチン酸による脂質修飾を受けた分泌性糖タンパクであり、哺乳類では１９種類が存在すると考えられている。Ｗｎｔの受容体としては７回膜貫通型受体であるＦｒｉｚｚｌｅｄが１０種類、１回膜貫通型受容体であるＬＲＰ５／６の２種類が報告されている（非特許文献２６）。
Ｗｎｔが結合すると考えられているＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリー分子の細胞外領域には保存された１０個のシステインを含むシステインリッチドメイン［ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ（ＣＲＤ）］と呼ばれる領域が存在する。これら１０個のシステインのうち最もＮ末端側に位置するシステインと最もＣ末端側に位置するシステインに挟まれた領域のみをＣＲＤとする場合（非特許文献２７）またはその前後の配列も含んでＣＲＤとする場合（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）がある。マウスＦｒｉｚｚｌｅｄ８のＣＲＤを用いた結晶構造解析においてＣＲＤはホモダイマー構造を取ることが報告された（非特許文献２８）。
Ｗｎｔシグナルは、ｃａｎｏｎｉｃａｌ−Ｗｎｔシグナル経路、ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｗｎｔシグナル経路としてＳｍａｌｌ Ｇ結合タンパクを介するＰＣＰ（Ｐｌａｎａｒ Ｃｅｌｌ Ｐｏｌａｒｉｔｙ）経路、３量体Ｇタンパクを介するＣａ２＋経路の少なくとも３種類が存在すると考えられているが、骨代謝と関連した研究はｃａｎｏｎｉｃａｌ−Ｗｎｔシグナル経路が最も進んでおり、Ｗｎｔは骨形成に対し促進的に作用すると考えられている（非特許文献２９）。そのため、近年、本シグナル経路を阻害する内在性因子の働きをコントロールすることによって骨疾患治療に応用する試みがなされている。
Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎは，当初ＢＭＰのアンタゴニストと考えられていたが、その後の研究でＬＲＰ５／６に直接結合することによってシグナル経路を阻害する因子であることが報告された（非特許文献３０）。Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎをノックアウトしたマウスにおいて顕著な骨密度増加が示され（非特許文献３１）、現在欧米でＳｃｌｅｒｏｓｔｉｎ中和抗体のＰｈａｓｅＩＩ試験が行われており（ＡＭＧ７８５、Ａｍｇｅｎ＆ＵＣＢ）、今後の展開が注目されている。
別のｃａｎｏｎｉｃａｌ−Ｗｎｔシグナル阻害因子として知られているＤＫＫ１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１）の中和抗体も作製され、多発性骨髄腫細胞（ＭＭ）移植ＳＣＩＤマウスにおける骨密度低下阻害が見出され（非特許文献３２）、中和抗体（ＢＨＱ８８０、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を用いた臨床試験が行われている。
また、ＷｎｔのＤｅｃｏｙ受容体と考えられＦｒｉｚｚｌｅｄの細胞外ドメインとアミノ酸配列相同性の高いｓＦＲＰ（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、Ｗｎｔシグナルを負に制御していると考えられており（非特許文献３３）、ｓＦＲＰ１のノックアウトマウス大腿骨においては海綿骨量の増加が報告されている（非特許文献３４）。このような状況からｓＦＲＰ１阻害剤の研究開発（Ｗｙｅｔｈ社）も進められている。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７はＷｎｔリガンドと結合し、そのシグナルを伝達する受容体の一つとして同定されており（非特許文献３５、３６）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７細胞外システインリッチドメイン（保存された１０個のシステインのうち最もＮ末端側に位置するシステインと最もＣ末端側に位置するシステインに挟まれた領域のみをＣＲＤとした場合）のアミノ酸配列はマウスとヒトで種差はなく１００％一致している。本分子の作用として個体の発生分化への関与（非特許文献３７）および肝臓細胞増殖への関与（非特許文献３８）が報告されている。
また、本分子の発現様式として、マウス小腸または大腸におけるクリプト基底部に限局された発現パターン（非特許文献３９）、各種がん細胞における発現向上（非特許文献４０）、成体マウス由来組織における発現解析より脾臓を除く各組織（脳、眼球、心臓、腎臓、肝臓、肺、精巣）における発現が報告されている（非特許文献３５）。また、胎児ヒト由来組織における発現解析より、脳と肝臓を除く組織（肺、腎臓）における発現が、成人ヒト由来組織における発現解析より、強い発現が骨格筋でやや強い発現が心臓で、弱い発現が脳、胎盤と腎臓で、発現が検出されなかった組織として肺、肝臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸、大腸が報告されている（非特許文献４１）。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の可溶化受容体である細胞外システインリッチドメインは、Ｗｎｔと結合しその作用を阻害すると考えられており、インビトロ実験系においてＦｒｉｚｚｌｅｄ７細胞外システインリッチドメイン（保存された１０個のシステインのうち最もＮ末端側に位置するシステインと最もＣ末端側に位置するシステインに挟まれた領域およびその前後の配列を含む）とＦｃとの融合体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）がＷｎｔ３ａによる細胞質β−ｃａｔｅｎｉｎ安定化を阻害することが報告されている（非特許文献４２）。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７はがん細胞において発現向上が認められることから腫瘍治療のターゲット分子として注目されている（特許文献２、非特許文献４３）。例えばＦｒｉｚｚｌｅｄ７の細胞外ドメインを発現するベクターが導入された大腸がん細胞はコントロールベクター導入大腸がん細胞に比べＸｅｎｏｇｒａｆｔ腫瘍細胞移植系において増殖阻害が観察され（非特許文献４４）、腫瘍治療の創薬標的としての可能性が示唆された。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄは上記のように１０種類のファミリー分子が報告されているがＦｒｉｚｚｌｅｄ７と細胞外システインリッチドメインの一次配列相同性がとりわけ高い分子としてＦｒｉｚｚｌｅｄ１とＦｒｉｚｚｌｅｄ２が報告されている（保存された１０個のシステインのうち最もＮ末端側に位置するシステインと最もＣ末端側に位置するシステインに挟まれた領域のみをＣＲＤとした場合、非特許文献２２）。
これら分子のシステインリッチドメイン（保存された１０個のシステインのうち最もＮ末端側に位置するシステインと最もＣ末端側に位置するシステインに挟まれた領域のみをＣＲＤとした場合）におけるＦｒｉｚｚｌｅｄ７とのアミノ酸相同性は、ヒト・マウスどちらにおいても、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２に対してそれぞれ９１％、９３％と極めて相同性が高い。
またＦｒｉｚｚｌｅｄ７と同様Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ２は共にシステインリッチドメイン（保存された１０個のシステインのうち最もＮ末端側に位置するシステインと最もＣ末端側に位置するシステインに挟まれた領域のみをＣＲＤとした場合）のマウスとヒト由来アミノ酸配列に種差はなく１００％一致している。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１とＦｒｉｚｚｌｅｄ２も共にＦｒｉｚｚｌｅｄ７と同様、Ｗｎｔと相互作用することが報告されており、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１においてはＷｎｔ３ａと相互作用することでアミロイドベーターペプチドによって引き起こされる海馬ニューロンの破壊を保護することが報告されている（非特許文献４５）。
またＦｒｉｚｚｌｅｄ１の発現様式として成人ヒト由来組織における発現解析より、強い発現が心臓、胎盤、肺、腎臓、すい臓、前立腺、卵巣で報告されている。また、胎児由来組織における発現解析より、強い発現が肺と腎臓で報告されている（非特許文献４１）。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１とＦｒｉｚｚｌｅｄ２は共に大腸がんまたは乳がんで発現レベルが向上することから、癌化との関連が示唆されており、腫瘍治療のターゲット分子として注目されている（特許文献１、非特許文献４６、４７）。更に、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１においてはその遺伝子破壊マウスのフェノタイプに何ら変化が認められないことが報告された（非特許文献４８）。
超高齢化社会を迎え、骨粗鬆症、変形性関節症、関節リウマチおよび悪性腫瘍に伴う骨疾患並びにそれらに関連する骨疾患の治療が社会的にも益々重要な課題となり、骨疾患治療剤の開発研究が広く精力的に行われている。
柿谷らは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２またはＦｒｉｚｚｌｅｄ７由来の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質が骨量増加および骨強度増加に促進的かつ特異的に作用することを見出した（特許文献３）。しかし、さらなる生産細胞における分泌性（生産性）および活性向上が課題として残っている。
国際公開第２００８／０６１０１３号 国際公開第２００８／０３１００９号 国際公開第２０１０／０３８７５６号
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本発明は上記観点からなされたものであり、生産細胞における高い分泌性を有し、および／または骨量の増加活性に優れたＦｒｉｚｚｌｅｄ２由来の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質、および該蛋白質を含む医薬組成物を提供することを主な課題とする。
驚くべきことに、本発明者らは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質を含む蛋白質に関し、該細胞外領域蛋白質として配列番号１０２で表されるシステインリッチドメインの最小領域配列を含み、且つ全長が１４１から１７５アミノ酸である該細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質（以下、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質ともいう）を用いると、生産細胞における分泌性が飛躍的に向上することを見出した。
特に、本発明者らは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質として、該細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合蛋白質を用いることにより、該融合蛋白質の生産細胞における分泌性が飛躍的に向上することを見出した。
さらに、本発明者らは、上記のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質が、特許文献３に記載のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質と比べ、少なくとも同等またはそれ以上の骨量の増加活性を有することを初めて見出した。
このような知見に基づいて、前記のＦｒｉｚｚｌｅｄ２細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質、および該蛋白質を含有する骨疾患治療用医薬組成物を効率的に取得できることが示された。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
１．配列番号１０２で表されるシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）の最小領域配列を含み、且つ全長が１４１から１７５アミノ酸である蛋白質。
２．配列番号１０２で表されるシステインリッチドメインの最小領域配列のＣ末端に１４から４８個のアミノ酸が付加された前項１に記載の蛋白質。
３．配列番号１０２で表されるシステインリッチドメインの最小領域配列のＣ末端に２６から４８個のアミノ酸が付加された前項２に記載の蛋白質。
４．配列番号１０２で表されるシステインリッチドメインの最小領域配列のＣ末端に３２、３８、４４、または４８個のアミノ酸が付加された前項３に記載の蛋白質。
５．配列番号１０２で表されるシステインリッチドメインの最小領域配列のＣ末端に少なくとも配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２８番目のＶから１４１番目のＬまでのアミノ酸を含むアミノ酸が付加された前項１から４のいずれか１に記載の蛋白質。
６．配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４１番目のＬの後に、さらに配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４２番目のＴから１７５番目のＰまでのアミノ酸から選ばれる任意の長さのアミノ酸が付加された前項５に記載の蛋白質。
７．配列番号１０２で表されるシステインリッチドメインの最小領域配列のＮ末端に１から１５個のアミノ酸が付加された前項１から６のいずれか１に記載の蛋白質。
８．配列番号１０２で表されるシステインリッチドメインの最小領域配列のＮ末端に付加されるアミノ酸が配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目のＱから１５番目のＦまでのアミノ酸から選ばれる任意の長さのアミノ酸である、前項７に記載の蛋白質。
９．配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから、１５３番目のＡ、１５４番目のＧ、１５５番目のＧ、１５６番目のＴ、１５７番目のＰ、１５８番目のＧ、１５９番目のＧ、１６０番目のＰ、１６１番目のＧ、１６２番目のＧ、１６３番目のＧ、１６４番目のＧ、１６５番目のＡ、１６６番目のＰ、１６７番目のＰ、１６８番目のＲ、１６９番目のＹ、１７０番目のＡ、１７１番目のＴ、１７２番目のＬ、１７３番目のＥ、１７４番目のＨ、または１７５番目のＰのいずれか１のアミノ酸までのアミノ酸を含む蛋白質。
１０．化学修飾されている、前項１から９のいずれか１に記載の蛋白質。
１１．前記化学修飾が、１または複数のポリエチレングリコール分子の結合である、前項１０に記載の蛋白質。
１２．前記化学修飾が、糖鎖の結合である、前項１０に記載の蛋白質。
１３．組換え蛋白質である、前項１から１２のいずれか１に記載の蛋白質。
１４．前項１から１３のいずれか１に記載の蛋白質と哺乳動物由来免疫グロブリンＦｃ蛋白質またはその変異体との融合蛋白質。
１５．哺乳動物由来免疫グロブリンFc蛋白質が配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる、前項１４に記載の融合蛋白質。
１６．配列番号７２から９４のいずれか１で表されるアミノ酸配列からなる融合蛋白質。
１７．前項１４から１６のいずれか１に記載の融合蛋白質を含有する骨疾患治療用医薬組成物。
１８．前項１から１３のいずれか１に記載の蛋白質または前項１４から１６のいずれか１に記載の融合蛋白質をコードするＤＮＡ。
１９．哺乳動物由来免疫グロブリンＦｃ蛋白質をコードするヌクレオチド配列が配列番号４で表されるヌクレオチド配列である、前項１８に記載のＤＮＡ。
２０．配列番号４２から６４のいずれか１で表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
２１．前項１８から２０のいずれか１に記載のＤＮＡを含有する、骨疾患治療用医薬組成物。
２２．上記骨疾患が、骨量、骨密度および骨強度から選ばれる少なくとも１の低下を伴う疾患である、前項１７または２１に記載の骨疾患治療用医薬組成物。
２３．前項１７、２１または２２に記載の骨疾患治療用医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、骨疾患を治療する方法。
２４．前記哺乳動物がヒトである、前項２３の方法。
２５．前記骨疾患が、骨量、骨密度および骨強度から選ばれる少なくとも１の低下を伴う疾患である、前項２３または２４に記載の方法。
２６．前記骨疾患治療用医薬組成物が、他の骨疾患治療剤と組み合わせて同時にまたは連続的に投与される、前項２３から２５のいずれか１に記載の方法。
本発明のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質は生産細胞における分泌性が高い。また、本発明のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質は、特許文献３に記載のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のシステインリッチドメインを含む蛋白質と同等またはそれ以上の骨量増加活性を有する。
よって、本発明により、生産細胞における分泌性が向上し、および／または骨量増加活性を有するＦｒｉｚｚｌｅｄ２由来の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質を効率的に取得することができる。さらに、該蛋白質を用いて、骨量、骨密度および／または骨強度の低下を伴う疾患、例えば骨粗鬆症、変形性関節症、関節リウマチ、悪性腫瘍等に起因する骨疾患、およびそれらに関連する様々な骨疾患または障害を、副作用を引き起こすことなく、治療することが可能となる。
図１はｈＦＺＤ２（１４０）−ｈＦｃｍ組換え体発現ベクターを示す。＊は、制限酵素のユニークサイトを示す。 図２はｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍ組換え体発現ベクターを示す。Ｘは１５３−１７５、１７８、１８４、１９０、１９７、２１０、２１６および２２２のいずれか１である。＊は、制限酵素のユニークサイトを示す。 図３はｈＦＺＤ２（１４０）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１５３）−ｈＦｃｍからｈＦＺＤ２（１７５）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１７８）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１８４）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１９０）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１９７）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（２１０）−ｈＦｃｍ、およびｈＦＺＤ２（２１６）−ｈＦｃｍの培養上清中の濃度を示す。縦軸は培養上清中の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。横軸はｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍの種類をＸの値で示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
配列表を除いた本明細書におけるアミノ酸配列中の２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。すなわち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
本発明は、上記のとおり、哺乳動物由来のＦｒｉｚｚｌｅｄ２受容体由来の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質、および該蛋白質をコードするＤＮＡを含むベクターを有効成分として含有する骨疾患治療用医薬組成物を提供する。
＜Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質＞
本発明のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体は、哺乳動物由来のＦｒｉｚｚｌｅｄ２である。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体は細胞外領域蛋白質を有し、かつ該細胞外領域蛋白質は細胞外システインリッチドメインを有する。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体はリガンドがＷｎｔである１０種類のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体のうち特に細胞外システインリッチドメイン（以下、「ＣＲＤ」とも称する）の同一性が高い。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体のＣＲＤのＮ末端側の第１システイン残基からＣ末端側の第１０システイン残基までのアミノ酸配列の同一性は、ヒトおよびマウスの場合、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７のＣＲＤとＦｒｉｚｚｌｅｄ２のＣＲＤとの間で９３％の同一性である。当該領域のアミノ酸配列はヒトとマウスで同一であり、種間で保存性が高い。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のアミノ酸およびヌクレオチド配列の情報は、ＮＣＢＩ（米国）にアクセスすることによって入手可能である。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２（ＦＺＤ２とも称される）は、ヒト、マウス、ラットまたはアフリカツメガエル等から単離され、配列情報が公開されている。本発明においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２蛋白質または該蛋白質をコードするＤＮＡは、その由来に限定されるものではないが、哺乳動物、例えば、ヒトを含む霊長類、またはマウスを含むげっ歯類等の由来であることが好ましい。
ヒトまたはマウス由来Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の配列情報は、例えば、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ２はアクセッション番号ＮＭ＿００１４６６．１、ＮＭ＿００１４６６．２若しくはＮＰ＿００１４５７．１等として、またはマウスＦＺＤ２はアクセッション番号ＮＭ＿０２０５１０．１、ＮＭ＿０２０５１０．２若しくはＮＰ＿０６５２５６．１等として、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列は以下のとおりである。
ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１）：
QFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDGAPALLTTAPPPGLQPGAGGTPGGPGGGGAPPRYATLEHPFHCPRVLKVPSYLSYKFLGERDCAAPCEPARPDGSMFFSQEETRFAR
Ｎ末端より１６番目のアミノ酸であるＣから１２７番目のアミノ酸Ｃの部分は、Ｎ末端側の第１システイン残基からＣ末端側の第１０システイン残基までの配列であり、細胞外システインリッチドメイン（以下、ＣＲＤとも表される）の最小領域配列である（配列番号１０２）。なお、少なくともＣＲＤの最小領域配列についてはヒトもマウスも同じ配列である。
配列番号１０２：
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQIC
本発明において、「細胞外システインリッチドメイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ；ＣＲＤ）」は、哺乳動物由来のＦｒｉｚｚｌｅｄ２からなる群から選択されるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質のＮ末端側の第１システイン残基から第１０システイン残基までのアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、哺乳動物において骨量を増加する能力を有する蛋白質である。
ここで、「少なくとも含み」とは、細胞外システインリッチドメインが、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質のＮ末端側の第１システイン残基から第１０システイン残基までのシステインリッチドメインの最小領域配列（最小ＣＲＤ配列）からなっていてもよいし、または、該最小ＣＲＤ配列のＮ末端側および／またはＣ末端側に、骨量を増加する能力を有するかぎり、任意の外来配列が付加していてもよいことを表わす。
なお、システインリッチドメインの最小領域配列（最小ＣＲＤ配列）としては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２については配列番号１０２で表されるアミノ酸配列が挙げられる。また、ここで、「外来配列」は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質と無関係の任意の異種蛋白質由来の配列若しくは人工配列、または異種Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質の最小ＣＲＤ配列以外の部分に由来する配列等を含むことができる。
あるいは、本発明における細胞外システインリッチドメインは、哺乳動物由来のＦｒｉｚｚｌｅｄ２からなる群から選択されるＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列において、そのＮ末端側の第１システイン残基から第１０システイン残基までのアミノ酸配列（システインリッチドメインの最小領域配列、または最小ＣＲＤ配列）を少なくとも含み、かつ、哺乳動物において骨量、骨密度および／または骨強度を増加する能力を有する蛋白質である。
ここで、「少なくとも含む」とは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質のＮ末端側の第１システイン残基から第１０システイン残基までのアミノ酸配列を最小配列とし、該最小配列のＮ末端側および／またはＣ末端側に同種Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質由来の配列を適宜延長して含むことができることを表わす。
従って、細胞外システインリッチドメインは、上記最小ＣＲＤ配列から、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質の最大ＣＲＤ配列までの任意のアミノ酸配列を含むことができる。
＜Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質のトランケート体＞
本発明において「Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質のトランケート体」とは、哺乳動物由来のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のＮ末端側の第１システイン残基から第１０システイン残基までのアミノ酸配列（システインリッチドメインの最小領域配列）を少なくとも含み、かつ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質の一部のアミノ酸を有するものである。
本発明において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とは、配列番号１０２で表されるシステインリッチドメインの最小領域配列を含み、且つ全長が１４１から１７５アミノ酸である蛋白質である。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体の全長のアミノ酸数は、１４１から１７５個であり、１５３から１７５個であることが好ましい。
より好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とは、配列番号１０２で表されるシステインリッチドメインの最小領域配列のＣ末端にアミノ酸が好ましくは１４から４８個、より好ましくは２６から４８個付加された蛋白質である。
より好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とは、前記のいずれか１の蛋白質であって、配列番号１０２で表されるシステインリッチドメインの最小領域配列のＣ末端に３２、３８、４４、または４８個のアミノ酸が付加された蛋白質である。
さらに好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体としては、前記のいずれか１の蛋白質であって、配列番号１０２で表されるシステインリッチドメインの最小領域配列のＣ末端に少なくとも配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２８番目のＶから１４１番目のＬまでのアミノ酸を少なくとも含むアミノ酸が付加された蛋白質である。
さらに好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体としては、前記のいずれか１の蛋白質であって、配列番号１０２で表されるシステインリッチドメインの最小領域配列のＣ末端に、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４１番目のＬの後にさらに配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４２番目のＴから１７５番目のＰまでのアミノ酸から選ばれる任意の長さのアミノ酸が付加された蛋白質である。
ここで、「配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４２番目のＴから１７５番目のＰまでのアミノ酸から選ばれる任意の長さのアミノ酸が付加される」とは、具体的には、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４２番目のＴから１７５番目のＰまでのアミノ酸から選ばれる任意の連続するアミノ酸が付加されることをいう。
さらに好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とは、前記のいずれか１の蛋白質であって、さらに配列番号１０２で表されるシステインリッチドメインの最小領域配列のＮ末端に１から１５のアミノ酸が付加された蛋白質である。
さらに好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とは、前記のいずれか１の蛋白質であって、さらに配列番号１０２で表されるシステインリッチドメインの最小領域配列のＮ末端に配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目のＱから１５番目のＦまでのアミノ酸から選ばれる任意の長さのアミノ酸が付加された蛋白質である。
ここで、「配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目のＱから１５番目のＦまでのアミノ酸から選ばれる任意の長さのアミノ酸が付加される」とは、具体的には、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目のＱから１５番目のＦまでのアミノ酸から選ばれる任意の連続するアミノ酸が付加されることをいう。
さらに好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから、１５３番目のＡ、１５４番目のＧ、１５５番目のＧ、１５６番目のＴ、１５７番目のＰ、１５８番目のＧ、１５９番目のＧ、１６０番目のＰ、１６１番目のＧ、１６２番目のＧ、１６３番目のＧ、１６４番目のＧ、１６５番目のＡ、１６６番目のＰ、１６７番目のＰ、１６８番目のＲ、１６９番目のＹ、１７０番目のＡ、１７１番目のＴ、１７２番目のＬ、１７３番目のＥ、１７４番目のＨ、または１７５番目のＰのいずれか１のアミノ酸までのアミノ酸を含む蛋白質である。
さらに好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから、１５８番目のＧ、１５９番目のＧ、１６０番目のＰ、１６１番目のＧ、１６２番目のＧ、１６３番目のＧ、１６４番目のＧ、１６５番目のＡ、１６７番目のＰ、１６８番目のＲ、１６９番目のＹ、１７０番目のＡ、１７１番目のＴ、１７２番目のＬ、１７３番目のＥ、または１７４番目のＨのいずれか１のアミノ酸までのアミノ酸を含む蛋白質である。
より好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから、１５８番目のＧ、１６０番目のＰ、１６１番目のＧ、１６２番目のＧ、１６３番目のＧ、１６４番目のＧ、１６７番目のＰ、１６８番目のＲ、１６９番目のＹ、１７０番目のＡ、１７１番目のＴ、または１７２番目のＬのいずれか１のアミノ酸までのアミノ酸を含む蛋白質である。
最も好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから１６８番目のＲまでのアミノ酸を含む蛋白質である。
驚くべきことに、上述のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質は、公知のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質［例えば、国際公開第２０１０／０３８７５６号（特許文献３）に記載のもの］に比べ生産細胞における分泌性が向上しまたは同等の活性を有し、かつ少なくとも同等若しくはそれ以上の骨量の増加活性を有する。
特にＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体として配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから１５３番目のＡ、１５４番目のＧ、１５５番目のＧ、１５６番目のＴ、１５７番目のＰ、１５８番目のＧ、１５９番目のＧ、１６０番目のＰ、１６１番目のＧ、１６２番目のＧ、１６３番目のＧ、１６４番目のＧ、１６５番目のＡ、１６６番目のＰ、１６７番目のＰ、１６８番目のＲ、１６９番目のＹ、１７０番目のＡ、１７１番目のＴ、１７２番目のＬ、１７３番目のＥ、１７４番目のＨ、または１７５番目のＰのいずれか１のアミノ酸までのアミノ酸を含む蛋白質を用いた場合、これらのいずれか１のトランケート体を含む蛋白質は、公知のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外システインリッチドメインを含む融合蛋白質［例えば、国際公開第２０１０／０３８７５６号（特許文献３）に記載のもの］に比べ、生産細胞における分泌性が飛躍的に向上し、および／または骨量の増加活性も同等以上であることがわかった。
さらにＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体として、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから１５８番目のＧ、１５９番目のＧ、１６０番目のＰ、１６１番目のＧ、１６２番目のＧ、１６３番目のＧ、１６４番目のＧ、１６５番目のＡ、１６７番目のＰ、１６８番目のＲ、１６９番目のＹ、１７０番目のＡ、１７１番目のＴ、１７２番目のＬ、１７３番目のＥ、または１７４番目のＨのいずれか１のアミノ酸までのアミノ酸を含む蛋白質を用いた場合、生産細胞における分泌性の飛躍的向上、および／または骨量の増加活性の点で好ましい。
さらに、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体として、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから１５８番目のＧ、１６０番目のＰ、１６１番目のＧ、１６２番目のＧ、１６３番目のＧ、１６４番目のＧ、１６７番目のＰ、１６８番目のＲ、１６９番目のＹ、１７０番目のＡ、１７１番目のＴ、または１７２番目のＬのいずれか１のアミノ酸までのアミノ酸を含む蛋白質を用いた場合、これらのいずれかのトランケート体を含む蛋白質は、公知のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質［例えば、国際公開第２０１０／０３８７５６号（特許文献３）に記載のもの］に比べ、生産細胞における分泌性がさらに飛躍的に向上し、および／または骨量の増加活性も同等以上であることがわかった。
最も好ましくは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体として、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから１６８番目のＲのアミノ酸までのアミノ酸を含む含む蛋白質を用いる場合である。
なお、本発明において「生産細胞」とは、非限定的に、大腸菌等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス等のバチルス属若しくはシュードモナス・プチダ等のシュードモナス属等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ若しくはシゾサッカロミセス・ポンベ等のサッカロミセス属、カンジダ属若しくはピキア属等の酵母、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３若しくはＮＳ０等の動物細胞、Ｓｆ９若しくはＳｆ２１等の昆虫細胞、または植物細胞等が挙げられるが、本発明の蛋白質を分泌または生産できるものであればいずれの細胞も用いることができる。
本発明において「分泌性の向上」とは、少なくとも生産細胞における発現量が国際公開第２０１０／０３８７５６号（特許文献３）に記載の公知のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質に比べ高いことを意味する。
また本発明において、「骨量の増加」は、少なくとも単位骨量の増加を伴うことを意味する。ここで単位骨量とは、組織全体の体積に占める骨梁全体の体積をいい、単位骨量の増加とは骨密度増加をいう。
また、「骨量の増加」は単位骨量の増加のみならず骨梁幅の増加、骨梁数の増加、および／または骨梁間隔の低下を伴ってもよい。ここで骨梁幅とは骨梁の幅の平均、骨梁数とは単位長当りの骨梁数、骨梁間隔とは隣接した骨梁の距離をいう。
本発明において、哺乳動物は、以下のものに限定されないが、霊長類、家畜動物、げっ歯類、有蹄類またはペット動物等を含む。好ましい哺乳動物は、ヒトおよびマウスである。マウスは、細胞外システインリッチドメイン（ＣＲＤ）のアミノ酸配列、特にＮ末端側の第１システイン残基からＣ末端側の第１０システイン残基までの最小ＣＲＤ配列がヒト由来の配列と同一であるという点で重要である。さらに好ましい哺乳動物はヒトである。
＜細胞外領域蛋白質のトランケート体の変異体＞
本発明の細胞外領域蛋白質のトランケート体の変異体には、天然の突然変異体および人工変異体のいずれも含まれ、上記細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは複数（好ましくは１若しくは数個）のアミノ酸の置換、欠失または付加を含むか、あるいは、該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、例えば９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、生産細胞における分泌性が向上し、かつ、骨量を増加する能力を有するものである。
例えば、前記変異体は、配列番号１０２、または配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数（好ましくは１若しくは数個）のアミノ酸の置換、欠失または付加を含むか、あるいは、該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、例えば９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、生産細胞における分泌性が向上し、かつ、骨量を増加する能力を有するものである。
本明細書で使用される「数個」なる用語は、通常、２から１０までの任意の整数を指す。好ましくは、それは２〜５の任意の整数である。
本明細書で使用される「同一性」なる用語は、２つのアミノ酸配列（またはヌクレオチド配列）のアラインメントにおいて、同一のアミノ酸残基数（またはヌクレオチド数）が最大となるように該２つの配列を整列させたときの配列間の一致度を意味し、具体的には、総アミノ酸残基数（または総ヌクレオチド数）に対する同一アミノ酸残基数（または同一ヌクレオチド数）のパーセンテージ（％）で表わされる。ＦＡＳＴＡのようにギャップを導入する場合、ギャップの数も総アミノ酸残基数（または総ヌクレオチド数）に加算する。
８０％以上、好ましくは８５％以上の配列同一性を有する蛋白質は、例えばＮＣＢＩ（米国）、ＥＭＢＬ（欧州）等の配列データベースにアクセスし、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の配列相同性検索プログラムを利用して検索することが可能である［Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４０３−４１０；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．とＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８等］。
ＢＬＡＳＴは、配列を固定長のワードに区切り、ワード単位で類似する断片を検索し、これらを類似度が最大になるまで両方向に伸ばして局所的なアラインメントを行い、最後にこれらを結合して最終的なアラインメントを行う方法である。
また、ＦＡＳＴＡは、連続して一致する配列の断片を高速に検索し、それらの断片の中で類似度の高いものに着目して局所的なアラインメントを行い、最後にギャップを考慮した上でこれらを結合しアラインメントを行う方法である。
本発明の細胞外システインリッチドメインに変異を導入する場合、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質のＮ末端側の第１システイン残基からＣ末端側の第１０システイン残基までの配列（最小ＣＲＤ配列）内の１０個のシステイン残基以外のアミノ酸残基に対してのみ、置換、欠失または付加からなる変異を行い、および、天然のジスルフィド結合を破壊せず、かつ天然のコンホメーションを実質的に保持することが好ましい。
これは、もし細胞外システインリッチドメイン内の天然のジスルフィド結合を破壊し本来のコンホメーションを変化させると、該ドメイン蛋白質が骨量、骨密度および／または骨強度を増加する能力を喪失するかまたは該能力を大きく低減するおそれがあるからである。
変異導入法としては、細胞外システインリッチドメインの配列が公知であれば、その配列に基づいて合成した（相補的変異配列を含む）プライマーを使用するＰＣＲ法を利用した部位特異的突然変異誘発法が好ましい（Ｋｕｎｋｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２：４８８−４９２；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ等）。変異導入用キット（例えば、宝酒造製）も市販されているので、指示書に従って変異を導入することもできる。
簡単に説明すると、Ｋｕｎｋｅｌの方法は、細胞外システインリッチドメインをコードするＤＮＡを含むプラスミドを鋳型にし、Ｔ４ ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼで予め５’末端をリン酸化したプライマー（相補的変異配列を含む）を該鋳型にアニーリングし、ＤＮＡ合成を行ったのち、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで末端同士を連結して、目的の変異を含むＤＮＡを精製することを含む。
本発明において、変異は、置換、欠失、付加、挿入、またはそれの組み合わせを含む。置換は、保存的置換または非保存的置換のいずれでもよいが、細胞外システインリッチドメイン蛋白質のコンホメーションを実質的に変化させないためには保存的置換が好ましい。保存的置換は、構造的（例えば、分岐状または芳香族性等）、電気的（例えば、酸性または塩基性等）、極性または疎水性、等の化学的・物理的性質の類似したアミノ酸間での置換をいう。
分岐状アミノ酸には、バリン、ロイシン、イソロイシンが含まれる。芳香族アミノ酸には、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよびヒスチジンが含まれる。酸性アミノ酸には、グルタミン酸およびアスパラギン酸が含まれる。
塩基性アミノ酸には、リシン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれる。極性アミノ酸には、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、システイン、グリシンおよびプロリン等が含まれる。疎水性アミノ酸には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニン等が含まれる。
欠失は、１若しくは複数のアミノ酸残基を失うことである。付加は、１若しくは複数のアミノ酸残基を蛋白質のＮ末端またはＣ末端に結合することである。挿入は、蛋白質の内部に１若しくは複数のアミノ酸残基を結合することである。
このうち、欠失と挿入は、細胞外システインリッチドメイン蛋白質のコンホメーションを実質的に変化させないことを前提として行うことができる。そのために、好ましくは約１〜５個程度のアミノ酸残基の欠失または挿入に制限される。
＜細胞外領域蛋白質のトランケート体またはその変異体を含む蛋白質＞
上で説明したように、本発明の医薬組成物の有効成分のひとつは、哺乳動物由来のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体であって、生産細胞における分泌性が向上し、かつ骨量の増加活性を持つもの、または該トランケート体のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、生産細胞における分泌性が向上し、かつ骨量増加活性をもつその変異体、を含む蛋白質である。
ここで、本発明の「哺乳動物由来のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体」とは、上記記載のすべての細胞外領域蛋白質のトランケート体を意味する。
本発明の「含む」なる表現は、上記細胞外領域蛋白質のトランケート体またはその変異体に、異種ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質を、該ドメインまたはその変異体のＮ末端またはＣ末端側に、必要であれば適当なペプチドリンカー（例えば、アミノ酸数１〜２０）を介して、結合または融合してもよいことを意味する。例えば、そのような異種蛋白質として好ましい例は、哺乳動物由来免疫グロブリンＦｃ蛋白質またはその変異体等が挙げられる。
しかし、このような異種蛋白質が生体内に投与されると、拒絶反応を引き起こす可能性があるため、それをできる限り回避するためにも、投与する哺乳動物が本来もつ蛋白質を該異種蛋白質として使用することが好ましい。
好ましいＦｃ蛋白質は、ヒトへの使用を考慮すると、ヒト免疫グロブリンのＦｃ蛋白質である。また、免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスは、以下のものに制限されないが、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２等のいずれでもよいが、ヒトに使用するのであれば、ヒト免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスを使用することが好ましい。
Ｆｃ蛋白質は、細胞外システインリッチドメインまたはその変異体の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での安定性を向上させることができる。ただし、この場合、Ｆｃ蛋白質は、その生物活性による生体内に及ぼす影響を避けるために、例えば抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）活性等の生物活性を予め低下させることが好ましく、そのために、前記のような生物活性を抑制、低下または喪失させるための変異を導入することが好ましい。
そのような変異は、哺乳動物由来のＦｃ蛋白質のアミノ酸配列において、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸残基のアミノ酸置換であって、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を低下させるような任意のアミノ酸置換であり、具体的には、後述の実施例１に例示されるような置換を含むことができる。
Ｆｃ蛋白質の好適例は、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ変異体である。Ｆｃ蛋白質の結合位置は、細胞外システインリッチドメインまたはその変異体のＮ末端側、Ｃ末端側のいずれでもよいが、Ｃ末端側が好ましい。
本発明において好ましい蛋白質は、前記記載のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合蛋白質である。
本発明において好ましい蛋白質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合体を含む蛋白質であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから、１５３番目のＡ、１５４番目のＧ、１５５番目のＧ、１５６番目のＴ、１５７番目のＰ、１５８番目のＧ、１５９番目のＧ、１６０番目のＰ、１６１番目のＧ、１６２番目のＧ、１６３番目のＧ、１６４番目のＧ、１６５番目のＡ、１６６番目のＰ、１６７番目のＰ、１６８番目のＲ、１６９番目のＹ、１７０番目のＡ、１７１番目のＴ、１７２番目のＬ、１７３番目のＥ、１７４番目のＨ、または１７５番目のＰのいずれか１のアミノ酸までのアミノ酸を含むＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合蛋白質である。
さらに好ましい蛋白質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合体を含む蛋白質であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから、１５８番目のＧ、１５９番目のＧ、１６０番目のＰ、１６１番目のＧ、１６２番目のＧ、１６３番目のＧ、１６４番目のＧ、１６５番目のＡ、１６７番目のＰ、１６８番目のＲ、１６９番目のＹ、１７０番目のＡ、１７１番目のＴ、１７２番目のＬ、１７３番目のＥ、または１７４番目のＨのいずれか１のアミノ酸までのアミノ酸を含むＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合蛋白質である。
より好ましい蛋白質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合体を含む蛋白質であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから、１５８番目のＧ、１６０番目のＰ、１６１番目のＧ、１６２番目のＧ、１６３番目のＧ、１６４番目のＧ、１６７番目のＰ、１６８番目のＲ、１６９番目のＹ、１７０番目のＡ、１７１番目のＴ、または１７２番目のＬのいずれか１のアミノ酸までのアミノ酸を含むＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合蛋白質である。
最も好ましい蛋白質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合体を含む蛋白質であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから１６８番目のＲのアミノ酸までのアミノ酸を含むＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合蛋白質である。
さらに具体的には、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合蛋白質としては配列番号７２から９４のいずれか１で表されるアミノ酸配列を含む融合蛋白質である。
より好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合蛋白質としては配列番号７７から８４および８６から９３のいずれか１で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質である。
より好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合蛋白質としては配列番号７７、７９から８３および８６から９１のいずれか１で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質である。最も好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合蛋白質としては配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質である。
配列番号７２から９４のいずれか１で表されるアミノ酸配列を含む融合蛋白質中の細胞外領域蛋白質のトランケート体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質に由来するが、該トランケート体のアミノ酸配列は、骨量を増加する能力を有する限り、上記＜細胞外領域蛋白質のトランケート体の変異体＞の節に記載したような変異を含んでもよい。
驚くべきことに、上述のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む融合蛋白質は、公知のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外システインリッチドメインを含む融合蛋白質［例えば、国際公開第２０１０／０３８７５６号（特許文献３）に記載のもの］に比べ生産細胞における分泌性が向上しまたは同等の分泌性を有し、かつ少なくとも同等若しくはそれ以上の骨量増加活性を有する。
特にＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外蛋白質のトランケート体を含む融合蛋白質については、そのＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体として配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから、１５３番目のＡ、１５４番目のＧ、１５５番目のＧ、１５６番目のＴ、１５７番目のＰ、１５８番目のＧ、１５９番目のＧ、１６０番目のＰ、１６１番目のＧ、１６２番目のＧ、１６３番目のＧ、１６４番目のＧ、１６５番目のＡ、１６６番目のＰ、１６７番目のＰ、１６８番目のＲ、１６９番目のＹ、１７０番目のＡ、１７１番目のＴ、１７２番目のＬ、１７３番目のＥ、１７４番目のＨ、または１７５番目のＰのいずれか１のアミノ酸までのアミノ酸を含む蛋白質を用いた場合、これらのいずれか１のトランケート体を含む融合蛋白質は、公知のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外システインリッチドメインを含む融合蛋白質［例えば、国際公開第２０１０／０３８７５６号（特許文献３）に記載のもの］に比べ、生産細胞における分泌性が飛躍的に向上し、および／または骨量の増加活性も同等以上であることがわかった。
さらに前記融合蛋白質については、そのＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体として、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから、１５８番目のＧ、１５９番目のＧ、１６０番目のＰ、１６１番目のＧ、１６２番目のＧ、１６３番目のＧ、１６４番目のＧ、１６５番目のＡ、１６７番目のＰ、１６８番目のＲ、１６９番目のＹ、１７０番目のＡ、１７１番目のＴ、１７２番目のＬ、１７３番目のＥ、または１７４番目のＨのいずれか１のアミノ酸までのアミノ酸を含む蛋白質を有するものを用いた場合、生産細胞における分泌性の飛躍的向上、および／または骨量の増加活性の点で好ましい。
さらに、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから、１５８番目のＧ、１６０番目のＰ、１６１番目のＧ、１６２番目のＧ、１６３番目のＧ、１６４番目のＧ、１６７番目のＰ、１６８番目のＲ、１６９番目のＹ、１７０番目のＡ、１７１番目のＴ、または１７２番目のＬのいずれか１のアミノ酸までのアミノ酸を含む蛋白質を前記融合蛋白質に用いた場合、これらのいずれかのトランケート体を含む融合蛋白質は、公知のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外システインリッチドメインを含む融合蛋白質［例えば、国際公開第２０１０／０３８７５６号（特許文献３）に記載のもの］に比べ、生産細胞における分泌性がさらに飛躍的に向上し、および／または骨量の増加活性も同等以上であることがわかった。
最も好ましい融合蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから１６８番目のＲのアミノ酸までのアミノ酸を含むＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合蛋白質である。
また、実施例に示されるように、配列番号７２から９４のいずれか１で表されるアミノ酸配列を含む融合蛋白質も上記記載の驚くべき効果を有することがわかった。
より好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合蛋白質としては配列番号７７から８４および８６から９３のいずれかの１で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質である。
より好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合蛋白質としては配列番号７７、７９から８３および８６から９１で表されるアミノ酸配列のいずれか１のアミノ酸配列を含む蛋白質である。最も好ましいＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＦｃ蛋白質との融合蛋白質としては配列番号８７で表されるアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
なお、本発明において「生産細胞」とは、非限定的に、大腸菌等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス等のバチルス属、シュードモナス・プチダ等のシュードモナス属等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ若しくはシゾサッカロミセス・ポンベ等のサッカロミセス属、カンジダ属若しくはピキア属等の酵母、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３若しくはＮＳ０等の動物細胞、Ｓｆ９若しくはＳｆ２１等の昆虫細胞、または植物細胞等が挙げられるが、本願発明の蛋白質を分泌または生産できるものであればいずれの細胞も用いることができる。
本発明において「分泌性の向上」とは、すくなくとも生産細胞における発現量が国際公開第２０１０／０３８７５６号（特許文献３）に記載の公知のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外システインリッチドメインを含む融合蛋白質に比べ高いことを意味する。
また本発明において、「骨量の増加」は、少なくとも単位骨量の増加を伴う。
本発明においては、上記細胞外領域蛋白質のトランケート体またはその変異体を含む蛋白質は、必ずしも異種ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質と結合または融合する必要はない。すなわち、本発明における上記蛋白質は、上記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２受容体の細胞外領域蛋白質の断片であって、前記細胞外領域蛋白質を含む断片であってもよい。このような断片は、骨量、骨密度および／または骨強度を増加する能力を有するかぎり、上記＜細胞外領域蛋白質のトランケート体の変異体＞の節に記載したような変異を含んでもよい。
本発明の上記細胞外領域蛋白質のトランケート体またはその変異体を含む蛋白質は、当該技術分野で慣用の遺伝子組換え技術によって作製しうる。簡単に説明すると、該蛋白質の作製は、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを用意し、このＤＮＡを含む発現ベクターを構築し、該ベクターで原核または真核細胞を形質転換またはトランスフェクションし、得られた細胞の培養から目的の組換え蛋白質を回収することを含む。
蛋白質の精製は、蛋白質の慣用の精製法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、有機溶媒沈殿、透析、電気泳動、クロマトフォーカシング、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたはＨＰＬＣ等を適宜組み合わせることによって実施可能である。
上記ＤＮＡまたはベクターに関しては、後述の＜核酸およびベクター＞の節、実施例等に記載しているので、それらを参照することができる。また、遺伝子組換え技術は、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ等に記載されており、本発明のために利用できる。
本発明における上記Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体またはその変異体を含む蛋白質は、化学修飾されていてもよい。
化学修飾には、非限定的に、例えば、グリコシル化、ペグ（ＰＥＧ）化、アセチル化、アミド化またはリン酸化等が含まれる。特に好ましく利用できる化学修飾は、グリコシル化およびペグ化である。
ペグ化は、例えば、蛋白質のＮ末端アミノ基、リシン（Ｌｙｓ）のεアミノ基等のアミノ酸残基に１または複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を結合させることである。一般的には、アミノ酸の遊離アミノ基にＰＥＧ分子が結合される。
ＰＥＧの平均分子量は、以下に限定されないが、約３，０００〜約５０，０００の範囲で使用可能である。ＰＥＧを蛋白質に結合させるには、ＰＥＧの末端部分に、例えば、カルボキシル基、ホルミル（アルデヒド）基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基、チオール基またはマレイイミド基等の活性基を導入し、蛋白質のアミノ基、カルボキシル基、チオール基またはヒドロキシル基等の基と反応させることができる。
グリコシル化（糖鎖の結合）は、蛋白質のアスパラギン、セリンまたはトレオニン残基に炭水化物鎖（即ち、糖鎖）が結合することである。一般に、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（ここで、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸残基である。）の配列を認識して糖鎖の結合が起こる。このような配列をもつように該蛋白質のアミノ酸配列を改変するときは、天然型と異なる位置に糖鎖を導入することもできる。
通常、遺伝子組換え技術によって、組換え蛋白質をコードするＤＮＡを、真核細胞（酵母細胞、動物細胞、植物細胞等）中で発現することによって、組換え蛋白質のグリコシル化を起こすことができる。本発明では、糖鎖の構造は特に制限されないものとし、発現のために選択された細胞の種類によって糖鎖構造が異なると考えられる。ヒトにおける使用の場合、ヒト由来細胞、ヒト糖鎖を合成可能な酵母細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等を利用しうる。
アセチル化またはアミド化は、主に、蛋白質のＮ末端またはＣ末端で行うことが好ましい。これらの反応は、例えば、脂肪族アルコール若しくは脂肪酸等のアルコール類またはカルボン酸類を用いて行うことができる。アルキル部分の炭素数は、例えば、約１〜２０程度であるが、水溶性を損なわない、無毒性である等の条件を満たす必要がある。
＜核酸およびベクター＞
本発明の組成物の有効成分として、上記細胞外領域蛋白質のトランケート体またはその変異体を含む蛋白質をコードする核酸を含むベクターも含まれる。
本明細書で使用する「核酸」なる用語には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むものとし、ＤＮＡにはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含み、ＲＮＡにはｍＲＮＡを含む。
細胞外領域蛋白質のトランケート体、その変異体およびそれらを含む蛋白質については、Ｆｃ蛋白質との融合蛋白質を含めて、上記＜Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質のトランケート体＞、＜細胞外領域蛋白質のトランケート体の変異体＞および＜細胞外領域蛋白質のトランケート体またはその変異体を含む蛋白質＞の各節で説明したとおりであり、それらの節で説明した全ての記載をここでも引用する。したがって、本発明における核酸は、上で説明し具体的に例示した、細胞外領域蛋白質のトランケート体またはその変異体を含む蛋白質をコードするＤＮＡを包含する。
具体的には、該ＤＮＡはヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質（配列番号１）のアミノ酸配列において、少なくとも、Ｎ末端側の第１システイン残基からＣ末端側の第１０システイン残基までのアミノ酸配列からなるＣＲＤ最小配列（配列番号１０２）を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを包含する。
真核細胞での該ＤＮＡの発現および発現産物の細胞外への分泌を考慮するならば、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含むとよい。シグナル配列の例は、各Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体蛋白質由来のシグナル配列、ヒトＣＤ３３由来のシグナル配列、ヒト血清アルブミン由来のシグナル配列、ヒトプレプロトリプシン由来のシグナル配列等である。
より具体的には、本発明のＤＮＡは、以下に記載のものが挙げられる。
ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ２細胞外領域蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号２）：CAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGCTGGAGCACCCCTTCCACTGCCCGCGCGTCCTCAAGGTGCCATCCTATCTCAGCTACAAGTTTCTGGGCGAGCGTGATTGTGCTGCGCCCTGCGAACCTGCGCGGCCCGATGGTTCCATGTTCTTCTCACAGGAGGAGACGCGTTTCGCGCGC
本発明におけるＤＮＡは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質またはその変異体と、上記定義の異種蛋白質との融合蛋白質をコードするＤＮＡも含まれる。異種蛋白質として好ましい例は、哺乳動物由来の免疫グロブリンＦｃ蛋白質であり、特にヒトＦｃ蛋白質が好ましいが、その生物活性（特にＡＤＣＣおよびＣＤＣ）を低下または喪失させるように変異を導入することが好ましい。
例えば、変異型ヒトＩｇＧ１由来Ｆｃ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を配列番号４に示す。さらにまた、この変異型ヒトＩｇＧ１由来Ｆｃ蛋白質とヒト由来Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２受容体の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質との融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列として好ましい配列を、配列番号４２から６４に示す 。
また、ヒト由来のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のＮ末端側の第１システイン残基から第１０システイン残基までのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）のアミノ酸配列（ＣＲＤの最小領域配列）をコードするヌクレオチド配列を以下に例示する。
配列番号１０３（ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ２ＣＲＤの最小領域配列）：
TGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGC
上記融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。シグナル配列としては、ヒト蛋白質由来のシグナル配列、例えば、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ２由来のシグナル配列、ヒトＣＤ３３由来のシグナル配列、ヒト血清アルブミン由来のシグナル配列、またはヒトプレプロトリプシン由来のシグナル配列等が挙げられる。
上記蛋白質類をコードするＤＮＡホモログは、ヒト由来のＦｒｉｚｚｌｅｄ２の遺伝子をコードするｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡに基づいて作製したプライマーまたはプローブを使用する周知の技術によって、ヒト以外の他の哺乳動物由来の、該遺伝子を発現することが公知の細胞または組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから取得することができる。そのような技術としては、例えば、ＰＣＲ法またはハイブリダイゼーション法（例えば、サザン法またはノーザン法等）等が挙げられる。
ＰＣＲ法は、ポリメラーゼ連鎖反応であり、これは、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に解離するための変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）工程（約９４〜９６℃、約３０秒〜１分）、プライマーを鋳型の一本鎖ＤＮＡに結合するためのアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）工程（約５５〜６８℃、約３０秒〜１分）、ＤＮＡ鎖を伸長するための伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）工程（約７２℃、約３０秒〜１分）からなるサイクルを１サイクルとして約２５〜４０サイクルを実施する。
また、変性工程の前に、約９４〜９５℃で約５〜１２分の前加熱処理を行い、伸長工程の最終サイクル後に、さらに７２℃で約７〜１５分の伸長反応を実施することができる。ＰＣＲは、市販のサーマルサイクラーにて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ［例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等］、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）等を含有するＰＣＲバッファー中で、センスおよびアンチセンスプライマー（サイズ：約１７〜３０ｂ、好ましくは２０〜２５ｂ）と鋳型ＤＮＡの存在下で行う。増幅されたＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動で分離・精製（臭化エチジウム染色）することができる。
ハイブリダイゼーションは、約２０〜１００ｂまたはそれ以上の長さの標識プローブと二本鎖を形成して目的核酸を検出する技法である。選択性を高めるために、一般にストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うことができる。
ストリンジェントな条件は、例えば約１〜５×ＳＳＣ、室温〜約４０℃でのハイブリダイゼーション、およびその後の、約０．１〜１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、約４５〜６５℃での洗浄からなる。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｎａ−クエン酸、ｐＨ７．０の溶液を指す。このような条件は、配列同一性が約８０％以上、好ましくは８５％以上の核酸を検出することを可能にするであろう。
上記ＤＮＡはベクターに挿入され、本発明の医薬組成物の有効成分である蛋白質の製造のために使用されるか、あるいは、ベクター自体を製剤化して医薬組成物として使用される。
ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージまたはウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、非限定的に、大腸菌由来プラスミド（例えば、ｐＲＳＥＴ、ｐＴＺ１９Ｒ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９等）、枯草菌由来プラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０またはｐＴＰ５等）、酵母由来プラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４またはＹＣｐ５０等）またはＴｉプラスミド等が挙げられる。
ファージとしては、例えば、λファージ等が挙げられる。さらに、ウイルスベクターとしては、例えば、、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス若しくはアデノ随伴ウイルス等の動物ウイルスベクター、またはバキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等が挙げられる。
ベクターは、目的ＤＮＡを組み込むためのポリリンカーまたはマルチクローニングサイトを含んでもよく、また、該ＤＮＡを発現するためにいくつかの制御エレメントを含むことができる。制御エレメントとしては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、複製開始点、選択マーカー、リボソーム結合配列またはターミネーター等が挙げられる。
選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子またはピューロマイシン耐性遺伝子等）または栄養要求性相補遺伝子［例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子またはＵＲＡ３遺伝子等］等が挙げられる。
プロモーターは、宿主細胞に応じて異なる場合がある。宿主細胞としては、例えば、非限定的に、大腸菌等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス等のバチルス属、シュードモナス・プチダ等のシュードモナス属等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ若しくはシゾサッカロミセス・ポンベ等のサッカロミセス属、カンジダ属若しくはピキア属等の酵母、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３若しくはＮＳ０等の動物細胞、Ｓｆ９若しくはＳｆ２１等の昆虫細胞、または植物細胞等が挙げられる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合、プロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬまたはＰＲプロモーター等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合、プロモーターとしては、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターまたはＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合、プロモーターとしては、例えば、、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ヒトＣＭＶ初期遺伝子プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、メタロチオネインプロモーターまたは多角体プロモーター等が挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合、プロモーターとしては、例えば、ＣａＭＶプロモーターまたはＴＭＶプロモーター等が挙げられる。
形質転換またはトランスフェクションとしては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、アグロバクテリウム法、ウイルス感染法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法またはリポフェクション法等が挙げられる。
形質転換宿主は、細菌、酵母、動物細胞、植物細胞の種類に応じた培養条件で培養され、細胞内または培養液から目的蛋白質を回収する。
微生物の培養では、微生物が資化しうる炭素源、窒素源または無機塩類等を含有する培地を使用する。炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース若しくはデンプン等の炭水化物、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、またはエタノール若しくはプロパノール等のアルコール類が挙げられる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム若しくはリン酸アンモニウム等の無機酸あるいは有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキスまたはコーンスティープリカー等が挙げられる。
無機物としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸 第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅または炭酸カルシウム等が挙げられる。
動物細胞の培養では、例えば、ＤＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ１６４０培地等が基本培地として用いられ、該基本培地に牛胎児血清（ＦＣＳ）等を添加した培地が用いられる。
目的蛋白質の回収は、上で説明したとおり、蛋白質精製のための慣用手法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、有機溶媒沈殿、透析、電気泳動、クロマトフォーカシング、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたはＨＰＬＣ等にて実施しうる。
ベクターを治療用に使用する場合には、被験体のゲノムに組み込まれないベクターであって、細胞に感染するが複製が不能にされたウイルスベクターまたは非ウイルスベクター等が好ましい。このようなベクターとしては、例えば、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター等が挙げられる。これらのベクターは、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化部位、選択マーカーまたはレポーター遺伝子等を含みうる。
ウイルスベクターとしては、例えば、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１（１９９３），Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１７−７２９（１９９４），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−５８（１９９４），Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）若しくはＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５−１６９（１９９４）等に記載されているベクター、またはそれらの改良ベクターである。
更に、非ウイルスベクターの例は、ヒト人工染色体ベクターであり、これは、ヒト染色体由来のセントロメアおよびテロメアを含む染色体断片から構成されるベクターである。ヒト染色体断片は特に制限されないが、例えば、ヒト１４番染色体断片またはヒト２１番染色体断片等が含まれる（日本国再表２００４／０３１３８５号公報、日本国特開２００７−２９５８６０号公報等）。
上記ベクターに、上記定義のＤＮＡを挿入し、被験体の骨部に投与するか、あるいは、被験体から採取した骨部組織若しくは細胞にベクターを導入したのち該被験体の骨部に戻す方法等により、ベクターを被験体に投与することができる。
＜Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を有する蛋白質の製造方法＞
本発明により、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質の製造方法を提供する。具体的には、上記記載のＤＮＡ、ベクター、選択マーカー、プロモーター、宿主細胞、形質転換細胞、微生物の培養（動物細胞の培養を含む）、および目的蛋白質の回収等並びに公知の方法を用いて、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体を含む蛋白質を製造することが出来る。
＜医薬組成物＞
本発明は更に、上で説明したＦｒｉｚｚｌｅｄ２の受容体の細胞外領域蛋白質のトランケート体またはその変異体を含む蛋白質、または該蛋白質をコードするＤＮＡを含むベクターを有効成分とする骨疾患治療用組成物を提供する。
本発明はまた、前記骨疾患治療用組成物を哺乳動物に投与することを含む、骨疾患を治療する方法を提供する。
本発明において、骨疾患は、骨量、骨密度および／または骨強度の低下を伴う疾患であり、例えば、骨粗鬆症、変形性関節症、関節リウマチ、悪性腫瘍、高カルシウム血症、骨ページェット病、大理石骨病、カムラチ・エンゲルマン病、関節症、原発性甲状腺機能亢進症、骨減少症、骨多孔症、骨軟化症、クル病、外傷性骨折または疲労骨折等に起因する骨疾患、およびそれらに関連する様々な骨疾患または障害が挙げられる。
悪性腫瘍としては、例えば、破骨細胞腫、骨肉腫または多発性骨髄腫が挙げられる。多発性骨髄腫による骨の痛みは脊髄と肋骨にみられることが多く、運動することにより悪化することがある。同じ部分が持続的に痛む場合は、病的骨折を来している可能性がある。脊椎に病変がある場合は、脊髄圧迫を引き起こす場合がある。
多発性骨髄腫では、増殖した腫瘍細胞によってＩＬ−６が放出される。ＩＬ−６は破骨細胞を活性化する因子（ＯＡＦ：ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）としても知られ、ＩＬ−６によって活性化された破骨細胞が骨を吸収・破壊するため、多発性骨髄腫に侵された骨をレントゲン撮影すると、骨に穴が開いているように見える（打ち抜き像：“ｐｕｎｃｈｅｄ−ｏｕｔ” ｒｅｓｏｒｐｔｉｖｅ ｌｅｓｉｏｎｓ）。また、骨の破壊によって血中カルシウム濃度が高まり、高カルシウム血症またはそれに起因する様々な症状が発生する。
骨粗鬆症には原発性骨粗鬆症と続発性（二次性）骨粗鬆症が含まれる。原発性骨粗鬆症としては、例えば、閉経後骨粗鬆症または老人性骨粗鬆症が挙げられる。続発性（二次性）骨粗鬆症の原因疾患としては、例えば、内分泌性（例えば、副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症、性腺機能低下症、クッシング症候群、成長ホルモン欠乏症、糖尿病、アジソン病またはカルシトニン欠損症等）、栄養性／代謝性［例えば、慢性消耗性疾患、るいそう、重症肝疾患（特に原発性胆汁性肝硬変）、胃切除、壊血病、吸収不良症候群（セリアック病を含む）、低リン血症、慢性腎疾患、特発性高Ｃａ尿症、ヘモクロマトーシス、アミロイドーシス、肥胖細胞腫、ナトリウム過剰摂取、カルシウム摂取不足またはビタミンＤ，Ａ過剰症等］、炎症性［例えば、関節リウマチ、傍関節性（炎症性サイトカインによる骨吸収亢進）またはサルコイドーシス等］、不動性（例えば、全身性、臥床安静、麻痺、局所性または骨折後等）、薬物性［例えば、ステロイド（免疫抑制薬として炎症性疾患に広く用いられている。ステロイドで治療する疾患としては、例えば、膠原病、喘息、炎症性腸疾患、臓器移植等が挙げられる。骨喪失はこの療法の重篤な副作用である）、メトトレキセート、ヘパリン・ワーファリン、抗ケイレン薬、リチウムまたはタモキシフェン等］、血液疾患［例えば、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、血友病または慢性溶血性疾患等］、先天性（例えば、骨形成不全症、マルファン症候群、クラインフェルター症候群、先天性骨髄性ポルフィリアまたは嚢胞性線維症等）、その他の疾患によるもの［例えば、慢性閉塞性肺疾患、肝疾患、腎疾患、関節リウマチ、妊娠、高酸素血症またはＨＩＶ感染症等］が挙げられる。
また、本発明において、骨疾患には石灰化のプロセスのみが阻害されることによって引き起こされる骨疾患も含まれ、例えば、クル病等が挙げられる。
本発明の骨疾患治療用組成物は、骨疾患をもつ哺乳動物、好ましくは骨量、骨密度および／または骨強度の低下を伴う疾患をもつ哺乳動物に投与するとき、骨部に特異的に作用して骨量、骨密度および／または骨強度を増加させ、これによって、少なくとも海綿骨の増加、骨幹の肥厚および増殖等を可能にする。本発明の骨疾患治療用組成物は、骨部に特異的であるゆえに、その他の組織に副作用をほとんどまたはまったく引き起こさないという驚くべき利点を有している。
［実施例１］
１−１．ｈＦＺＤ２−ｈＦｃｍの作製
ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ２細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＩｇＧ１Ｆｃの変異体との融合蛋白質（以下、ｈＦＺＤ２−ｈＦｃｍ）について、それぞれの細胞外領域蛋白質のアミノ酸長を変えたトランケート体とヒトＩｇＧ１Ｆｃの変異体との融合蛋白質を作製した。
具体的には、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ２細胞外領域蛋白質のトランケート体に関して、配列番号１で表されるＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のＮ末の１位のアミノ酸から１４０，１５３，１５４，１５５，１５６，１５７，１５８，１５９，１６０，１６１，１６２，１６３，１６４，１６５，１６６，１６７，１６８，１６９，１７０，１７１，１７２，１７３，１７４，１７５，１７８，１８４，１９０，１９７，２１０，２１６または２２２番目のいずれかのアミノ酸までを有する計３１種のＦｒｉｚｚｌｅｄ２細胞外領域蛋白質のトランケート体を作成した。
以降各アミノ酸長のヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のトランケート体とヒトＩｇＧ１Ｆｃの変異体の融合蛋白質について、ｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍと表記し、（ ）内にアミノ酸長を数字で記載することとする。
配列番号１（ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質のアミノ酸配列）：QFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDGAPALLTTAPPPGLQPGAGGTPGGPGGGGAPPRYATLEHPFHCPRVLKVPSYLSYKFLGERDCAAPCEPARPDGSMFFSQEETRFAR
配列番号２（ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ２の細胞外領域蛋白質をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列）：CAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGCTGGAGCACCCCTTCCACTGCCCGCGCGTCCTCAAGGTGCCATCCTATCTCAGCTACAAGTTTCTGGGCGAGCGTGATTGTGCTGCGCCCTGCGAACCTGCGCGGCCCGATGGTTCCATGTTCTTCTCACAGGAGGAGACGCGTTTCGCGCGC
配列番号３（ヒトＩｇＧ１Ｆｃの変異体のアミノ酸配列）：AEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号４（ヒトＩｇＧ１Ｆｃの変異体をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列）：GCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
１−１−１．ｐＬＮ１Ｖ５ベクターの構築
５’末端にＢａｍＨＩ・ＮｈｅＩ・ＳａｌＩサイトを３’末端にＸｈｏＩサイトを持つ（Ｖ５タグ＋Ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）センスオリゴＤＮＡ（Ｖ５Ｓ）およびそれに対するアンチセンスオリゴＤＮＡ（Ｖ５ＡＳ）を合成した。
Ｖ５Ｓ：GATCCGCTAGCGTCGACGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGTGAC(配列番号５)
Ｖ５ＡＳ：TCGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCGTCGACGCTAGCG(配列番号６)
上記合成オリゴＤＮＡを、掛田らの報告［Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１２，８５２−８５６（２００５）］に記載されたｐＬＮ１ベクター上のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに導入し、ｐＬＮ１Ｖ５ベクターを構築した。
１−１−２．ｈＦＺＤ２（１４０）−ｈＦｃｍ ＤＮＡ断片の合成
BHI-kozak-hFZD2-F: CGGGATCCACC ATGCGGCCCCGCAGCGCCC(配列番号７)
hFc-NotI-Rv：ATAGTTTAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGG(配列番号８)
Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（日本国タカラバイオ株式会社）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中に配列番号７および８のプライマー各１０ｐｍｏｌ加え、鋳型としてｈＦＺＤ２（１４０）−ｈＦｃｍ（配列番号９）を用い９８℃１分保温した後、９８℃１０秒、６２℃５秒、および７２℃１分を１サイクルとして３０サイクル増幅し、得られた１２１８ｂｐの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（日本国株式会社キアゲン）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。
１−１−３．ｈＦＺＤ２（１４０）−ｈＦｃｍ 組換え体発現ベクターの構築
実施例１−１−２で回収されたＰＣＲ増幅断片をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（日本国株式会社キアゲン）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。実施例１−１−１で作製されたｐＬＮ１Ｖ５ベクターにＮｏｔＩ ｓｉｔｅを付加したｖｅｃｔｏｒを用意し、得られた酵素処理断片をそのＢａｍＨＩ・ＮｏｔＩサイトに導入し、ｈＦＺＤ２（１４０）−ｈＦｃｍ組換え体発現ベクター（図１）を構築した。
以下にｈＦＺＤ２（１４０）−ｈＦｃｍ組換え体のｃＤＮＡの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列（１１９１ｂｐ、配列番号９）および該ｃＤＮＡがコードするｈＦＺＤ２−ｈＦｃｍのシグナル配列を含んだアミノ酸配列（３９６アミノ酸、配列番号１０）を示す。
配列番号９：ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTAGCCGAGCCTAGGTCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCCGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号１０： MRPRSALPRLLLPLLLLPAAGPAQFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDGAPALAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
１−１−４．ｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍ（Ｘ＝１５３−１７５，１７８，１８４，１９０，１９７，２１０，２１６，２２２）ＤＮＡ断片の合成
ｈＦＺＤ２−ｔ（１５３）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGCCACCCGGGGTGCCC (配列番号１１)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１５４）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCCCCGGCACCCGGCTGC (配列番号１２)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１５５）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGCCCCCGGCACCCGGC (配列番号１３)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１５６）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGGTGCCCCCGGCACCC (配列番号１４)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１５７）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCCGGGGTGCCCCCGGCA (配列番号１５)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１５８）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCACCCGGGGTGCCCCCG (配列番号１６)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１５９）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGCCACCCGGGGTGCCC (配列番号１７)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１６０）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCCGGGCCACCCGGGGTG (配列番号１８)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１６１）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGCCCGGGCCACCCGGG (配列番号１９)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１６２）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGCCGCCCGGGCCACCC (配列番号２０)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１６３）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGCCGCCGCCCGGGCCA (配列番号２１)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１６４）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGCCGCCGCCGCCCGGG (配列番号２２)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１６５）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCAGCGCCGCCGCCGCCC (配列番号２３)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１６６）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGGGAGCGCCGCCGCCG (配列番号２４)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１６７）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCCGGGGGAGCGCCGCCG (配列番号２５)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１６８）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGCGCGGGGGAGCGCCG (配列番号２６)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１６９）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGTAGCGCGGGGGAGCG (配列番号２７)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１７０）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGGCGTAGCGCGGGGGA (配列番号２８)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１７１）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCCGTGGCGTAGCGCGGG (配列番号２９)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１７２）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCCAGCGTGGCGTAGCGC (配列番号３０)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１７３）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCCTCCAGCGTGGCGTAG (配列番号３１)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１７４）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGTGCTCCAGCGTGGCG (配列番号３２)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１７５）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGGGGTGCTCCAGCGTG (配列番号３３)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１７８）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGCAGTGGAAGGGGTGC (配列番号３４)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１８４）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCCACCTTGAGGACGCGC (配列番号３５)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１９０）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGTAGCTGAGATAGGAT (配列番号３６)
ｈＦＺＤ２−ｔ（１９７）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCATCACGCTCGCCCAGA (配列番号３７)
ｈＦＺＤ２−ｔ（２１０）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGGAACCATCGGGCCGC (配列番号３８)
ｈＦＺＤ２−ｔ（２１６）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCCTCCTGTGAGAAGAAC (配列番号３９)
ｈＦＺＤ２−ｔ（２２２）−ＡｖｒＩＩ−Ｒ：CGCCTAGGCTCGGCGCGCGCGAAACGCGTC (配列番号４０)
Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（日本国タカラバイオ株式会社）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中にＦｗ ｐｒｉｍｅｒとして配列番号７のプライマーを、Ｒｖ ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１１から４０のプライマー各１０ｐｍｏｌを、および鋳型としｈＦＺＤ２（配列番号４１）を添加し、９８℃１分保温した後、９８℃１０秒、６２℃５秒、および７２℃１分を１サイクルとして３０サイクル増幅した。得られた５５３−７６０ｂｐの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（日本国株式会社キアゲン）を用い添付文書にしたがって増幅断片（ｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍ）を回収した。
配列番号４１：ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGCTGGAGCACCCCTTCCACTGCCCGCGCGTCCTCAAGGTGCCATCCTATCTCAGCTACAAGTTTCTGGGCGAGCGTGATTGTGCTGCGCCCTGCGAACCTGCGCGGCCCGATGGTTCCATGTTCTTCTCACAGGAGGAGACGCGTTTCGCGCGCCTCTGGATCCTCACCTGGTCGGTGCTGTGCTGCGCTTCCACCTTCTTCACTGTCACCACGTACTTGGTAGACATGCAGCGCTTCCGCTACCCAGAGCGGCCTATCATTTTTCTGTCGGGCTGCTACACCATGGTGTCGGTGGCCTACATCGCGGGCTTCGTGCTCCAGGAGCGCGTGGTGTGCAACGAGCGCTTCTCCGAGGACGGTTACCGCACGGTGGTGCAGGGCACCAAGAAGGAGGGCTGCACCATCCTCTTCATGATGCTCTACTTCTTCAGCATGGCCAGCTCCATCTGGTGGGTCATCCTGTCGCTCACCTGGTTCCTGGCAGCCGGCATGAAGTGGGGCCACGAGGCCATCGAGGCCAACTCTCAGTACTTCCACCTGGCCGCCTGGGCCGTGCCGGCCGTCAAGACCATCACCATCCTGGCCATGGGCCAGATCGACGGCGACCTGCTGAGCGGCGTGTGCTTCGTAGGCCTCAACAGCCTGGACCCGCTGCGGGGCTTCGTGCTAGCGCCGCTCTTCGTGTACCTGTTCATCGGCACGTCCTTCCTCCTGGCCGGCTTCGTGTCGCTCTTCCGCATCCGCACCATCATGAAGCACGACGGCACCAAGACCGAAAAGCTGGAGCGGCTCATGGTGCGCATCGGCGTCTTCTCCGTGCTCTACACAGTGCCCGCCACCATCGTCATCGCTTGCTACTTCTACGAGCAGGCCTTCCGCGAGCACTGGGAGCGCTCGTGGGTGAGCCAGCACTGCAAGAGCCTGGCCATCCCGTGCCCGGCGCACTACACGCCGCGCATGTCGCCCGACTTCACGGTCTACATGATCAAATACCTCATGACGCTCATCGTGGGCATCACGTCGGGCTTCTGGATCTGGTCGGGCAAGACGCTGCACTCGTGGAGGAAGTTCTACACTCGCCTCACCAACAGCCGACACGGTGAGACCACCGTGTGA
1−１−５．ｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍ，（Ｘ＝１５３−１７５，１７８，１８４，１９０，１９７，２１０，２１６，２２２）組換え体発現ベクターの構築
実施例１−１−４で回収された各ＰＣＲ増幅断片をＢａｍＨＩおよびＡｖｒＩＩ（日本国ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で酵素消化し、０．８％アガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（日本国株式会社キアゲン）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。１−１−３で作製されたｈＦＺＤ２（１４０）−ｈＦｃｍ組換え体発現ベクターをＢａｍＨＩおよびＡｖｒＩＩにて制限酵素処理して得られるベクターを用意し、上記酵素処理断片をそのＢａｍＨＩ・ＡｖｒＩＩサイトに導入し、組換え体発現ベクター（図２）を構築した。
以下にｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍ組換え体のｃＤＮＡの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列（１２３０ｂｐ−１４３７ｂｐ、配列番号４２−７１）および該ｃＤＮＡがコードするｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍのシグナル配列を含んだアミノ酸配列（４０９アミノ酸−４７８アミノ酸、配列番号７２−１０１）を示す。
尚、ポリヌクレオチド配列中で、Ｎ末端より６９塩基まではシグナル配列部分を、大文字はｈＦＺＤ２細胞外領域のトランケート体を、小文字はヒトＩｇＧ１Ｆｃ変異体部分を表す。またアミノ酸配列中で、Ｃ末より２３３アミノ酸までがヒトＩｇＧ１Ｆｃ変異体部分を、それよりＮ末側はｈＦＺＤ２細胞外領域蛋白質のトランケート体を表す。なお、アミノ酸配列中にはシグナル配列は記載していない。
配列番号４２［ｈＦＺＤ２（１５３）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号４３［ｈＦＺＤ２（１５４）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号４４［ｈＦＺＤ２（１５５）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号４５［ｈＦＺＤ２（１５６）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号４６［ｈＦＺＤ２（１５７）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号４７［ｈＦＺＤ２（１５８）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号４８［ｈＦＺＤ２（１５９）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号４９［ｈＦＺＤ２（１６０）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号５０［ｈＦＺＤ２（１６１）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号５１［ｈＦＺＤ２（１６２）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号５２［ｈＦＺＤ２（１６３）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号５３［ｈＦＺＤ２（１６４）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号５４［ｈＦＺＤ２（１６５）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号５５［ｈＦＺＤ２（１６６）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号５６［ｈＦＺＤ２（１６７）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号５７［ｈＦＺＤ２（１６８）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号５８［ｈＦＺＤ２（１６９）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号５９［ｈＦＺＤ２（１７０）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号６０［ｈＦＺＤ２（１７１）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号６１［ｈＦＺＤ２（１７２）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGCTGgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号６２［ｈＦＺＤ２（１７３）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGCTGGAGgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号６３［ｈＦＺＤ２（１７４）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGCTGGAGCACgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号６４［ｈＦＺＤ２（１７５）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGCTGGAGCACCCCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号６５［ｈＦＺＤ２（１７８）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGCTGGAGCACCCCTTCCACTGCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号６６［ｈＦＺＤ２（１８４）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGCTGGAGCACCCCTTCCACTGCCCGCGCGTCCTCAAGGTGgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号６７［ｈＦＺＤ２（１９０）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGCTGGAGCACCCCTTCCACTGCCCGCGCGTCCTCAAGGTGCCATCCTATCTCAGCTACgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号６８［ｈＦＺＤ２（１９７）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGCTGGAGCACCCCTTCCACTGCCCGCGCGTCCTCAAGGTGCCATCCTATCTCAGCTACAAGTTTCTGGGCGAGCGTGATgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号６９［ｈＦＺＤ２（２１０）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGCTGGAGCACCCCTTCCACTGCCCGCGCGTCCTCAAGGTGCCATCCTATCTCAGCTACAAGTTTCTGGGCGAGCGTGATTGTGCTGCGCCCTGCGAACCTGCGCGGCCCGATGGTTCCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号７０［ｈＦＺＤ２（２１６）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGCTGGAGCACCCCTTCCACTGCCCGCGCGTCCTCAAGGTGCCATCCTATCTCAGCTACAAGTTTCTGGGCGAGCGTGATTGTGCTGCGCCCTGCGAACCTGCGCGGCCCGATGGTTCCATGTTCTTCTCACAGGAGgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号７１［ｈＦＺＤ２（２２２）−ｈＦｃｍのポリヌクレオチド配列］：
ATGCGGCCCCGCAGCGCCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCCCGCCGCCGGGCCGGCCCAGTTCCACGGGGAGAAGGGCATCTCCATCCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCATGCCCAACCTTCTGGGCCACACGAACCAGGAGGACGCAGGCCTAGAGGTGCACCAGTTCTATCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGCTCGCCCGAACTGCGCTTCTTCCTGTGCTCCATGTACGCACCCGTGTGCACCGTGCTGGAACAGGCCATCCCGCCGTGCCGCTCTATCTGTGAGCGCGCGCGCCAGGGCTGCGAAGCCCTCATGAACAAGTTCGGTTTTCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGCACTTCCCGCGCCACGGCGCCGAGCAGATCTGCGTCGGCCAGAACCACTCCGAGGACGGAGCTCCCGCGCTACTCACCACCGCGCCGCCGCCGGGACTGCAGCCGGGTGCCGGGGGCACCCCGGGTGGCCCGGGCGGCGGCGGCGCTCCCCCGCGCTACGCCACGCTGGAGCACCCCTTCCACTGCCCGCGCGTCCTCAAGGTGCCATCCTATCTCAGCTACAAGTTTCTGGGCGAGCGTGATTGTGCTGCGCCCTGCGAACCTGCGCGGCCCGATGGTTCCATGTTCTTCTCACAGGAGGAGACGCGTTTCGCGCGCgccgagcctaggtcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgagggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcgccgtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
配列番号７２［ｈＦＺＤ２（１５３）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：QFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDGAPALLTTAPPPGLQPGAAEPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号７３［ｈＦＺＤ２（１５４）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号７４［ｈＦＺＤ２（１５５）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号７５［ｈＦＺＤ２（１５６）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号７６［ｈＦＺＤ２（１５７）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号７７［ｈＦＺＤ２（１５８）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号７８［ｈＦＺＤ２（１５９）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号７９［ｈＦＺＤ２（１６０）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号８０［ｈＦＺＤ２（１６１）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号８１［ｈＦＺＤ２（１６２）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号８２［ｈＦＺＤ２（１６３）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号８３［ｈＦＺＤ２（１６４）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号８４［ｈＦＺＤ２（１６５）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号８５［ｈＦＺＤ２（１６６）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号８６［ｈＦＺＤ２（１６７）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号８７［ｈＦＺＤ２（１６８）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号８８［ｈＦＺＤ２（１６９）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号８９［ｈＦＺＤ２（１７０）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号９０［ｈＦＺＤ２（１７１）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号９１［ｈＦＺＤ２（１７２）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号９２［ｈＦＺＤ２（１７３）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号９３［ｈＦＺＤ２（１７４）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号９４［ｈＦＺＤ２（１７５）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号９５［ｈＦＺＤ２（１７８）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号９６［ｈＦＺＤ２（１８４）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号９７［ｈＦＺＤ２（１９０）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号９８［ｈＦＺＤ２（１９７）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号９９［ｈＦＺＤ２（２１０）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号１００［ｈＦＺＤ２（２１６）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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配列番号１０１［ｈＦＺＤ２（２２２）−ｈＦｃｍのアミノ酸配列］：
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［実施例２］
２−１．ｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍ組換え体発現ベクターを用いた配列番号７２−１０１のｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍの一過的発現（Ｘ＝１４０，１５３−１７５，１７８，１８４，１９０，１９７，２１０，２１６，２２２）
２−１−１．遺伝子導入用発現ベクター調製
実施例１−１−３および１−１−５で取得されたｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍ組換え体発現ベクターを大腸菌ＤＨ５αに導入し、得られた形質転換体よりＤＮＡをプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ ｋｉｔ、日本国株式会社キアゲン）を用い調製した。
２−１−２．培養細胞へのベクター導入と分泌発現
Ｆｒｅｅ ｓｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（日本国インビトロジェン株式会社）をＦｒｅｅ ｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（日本国インビトロジェン株式会社）を用い、３７℃、５％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ条件下、細胞密度が２×１０５から３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの範囲内で培養した。培地１Ｌを用いて培養した場合、発現ベクター１ｍｇに３５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（日本国インビトロジェン株式会社）を加えた溶液、および１．３ｍＬの２９３ ｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（日本国インビトロジェン株式会社）に３３．７ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍを加えた溶液をそれぞれ調製し、５分間室温でインキュベートした。インキュベート後この２液を混合し、更に約２５分間室温でインキュベートした。その後、１ｘ１０９ｃｅｌｌｓ／ＬのＦｒｅｅ ｓｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞を含む培地に前記方法で処理された発現ベクターを添加し、３日間培養した。
２−１−３．培養上清の分泌解析
ｈＦＺＤ２細胞外領域蛋白質のトランケート体とｈＦｃ変異体との融合蛋白質の濃度をＥＬＩＳＡ法によって測定するため、実施例２−１−２で得られた２日目の培養液の上清を一部回収した。Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（γ−Ｃｈａｉｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ＳＩＧＭＡ社、商品番号：Ｉ３３８２）を固定化した９６ｗｅｌｌプレート（コーニング社、Ｍａｘｉ Ｓｏａｐ）に評価サンプルないしは標準液［社内精製ｈＦＺＤ２（１４０）−ｈＦｃｍ組換え体］を加え、室温１時間インキュベートを行った後に、Ｔ−ＰＢＳ（−）で３回洗浄操作を行い、ペルオキシダーゼ標識抗体Ａｎｔ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ）Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ Ｇｏａｔ（ＳＩＧＭＡ社、商品番号：Ａ０１７０）を添加し室温で１時間インキュベートを行った。
その後、Ｔ−ＰＢＳ（−）で４回洗浄操作を行った後、スミロン ペルオキシダーゼ発色キット（住友ベークライト株式会社、商品番号：ＭＬ−１１２０Ｔ）を用いて発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定することで培養上清中濃度の測定を行った。
その結果、ｈＦＺＤ２（１４０）−ｈＦｃｍの培養上清中濃度は４６７．３±３．１ｎｇ／ｍＬであった。これに対し、ｈＦＺＤ２（１５３）−ｈＦｃｍからｈＦＺＤ２（１７５）−ｈＦｃｍの培養上清中濃度は、それぞれ１２０７．４±１３．８、１１５３．７±１７．３、１１６６．５±４３．９、１１５３．７±０．０、１１９４．５±１０８．７、１５６７．９±４６．６、１４４９．２±８３．１、１７０７．５±１５０．７、１６６４．５±１３０．７、１７１９．３±１６７．４、１９２１．５±１３５．３、１７２７．８±２０６．８、１４７３．５±４８．７、１０７６．７±７２．６、１９１９．１±８１．１、２３２４．０±２０６．４、１６９８．４±２３１．１、１７６８．４±１６６．８、１７７１．６±１２７．５、１９８７．１±１４２．５、１４３３．０±９３．４、１３６９．４±９８．５、９１５．３±４８．５ｎｇ／ｍＬであり、また、ｈＦＺＤ２（１７８）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１８４）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１９０）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１９７）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（２１０）−ｈＦｃｍおよびｈＦＺＤ２（２１６）−ｈＦｃｍの培養上清中濃度は、それぞれ１３７０．１±４４．６、２５８．１±５８．６、７５．３±５．３、１１５．６±４５．２、８０．２±５．２、９３．２±４．８ｎｇ／ｍＬと、ｈＦＺＤ２（１５３）−ｈＦｃｍからｈＦＺＤ２（１７５）−ｈＦｃｍは培養上清中に高濃度であった。
図３に、ｈＦＺＤ２（１４０）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１５３）−ｈＦｃｍからｈＦＺＤ２（１７５）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１７８）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１８４）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１９０）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１９７）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（２１０）−ｈＦｃｍ、およびｈＦＺＤ２（２１６）−ｈＦｃｍの培養上清中における濃度のグラフを示す。
図３に示すように、ｈＦＺＤ２−ｈＦｃｍ組換え体は細胞外領域蛋白質のアミノ酸長を１５３に伸ばすことで分泌が向上し、分泌向上は１７５まで維持されることが示唆された。
２−２．ｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍ組換え体の精製・調製
２−２−１．培養上清前処理
実施例２−１−２で得られた培養液の上清を回収し、０．２２μｍフィルター（０．２２μｍ ＧＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ５００ｍＬ、日本国日本ミリポア株式会社）で濾過処理を行った後４℃で冷却した。
２−２−２．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙクロマトグラフィー
用いた酸性ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ２．７）の組成はホウ酸（ナカライテスク株式会社、ＭＷ：６１．８３）を１．２４ｇ、リン酸水素二ナトリウム・１２水（和光純薬工業株式会社、ＭＷ：３５８．１４）を７．１６ｇ、クエン酸一水和物（ナカライテスク株式会社、ＭＷ：２１０．１４）を４．２０ｇ、塩化ナトリウム（ナカライテスク株式会社、ＭＷ：５８．４４）８．７７ｇをミリＱ水に溶かし、１Ｎ塩酸（和光純薬工業株式会社の１２Ｎ塩酸をミリＱ水で１２倍希釈した溶液）を１５．５５ｍＬ添加し、ミリＱ水で１Ｌとしたものである。
用いた中性ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）の組成はホウ酸（ナカライテスク株式会社、ＭＷ：６１．８３）を１．２４ｇ、リン酸水素二ナトリウム・１２水（和光純薬工業株式会社、ＭＷ：３５８．１４）を７．１６ｇ、クエン酸一水和物（ナカライテスク株式会社、ＭＷ：２１０．１４）を４．２０ｇ、塩化ナトリウム（ナカライテスク株式会社、ＭＷ：５８．４４）８．７７ｇをミリＱ水に溶かし、５Ｍ水酸化ナトリウム溶液（和光純薬工業株式会社の水酸化ナトリウム ＭＷ：４０．００を１０ｇ、ミリＱ水で溶かし、５０ｍｌにした溶液）を１１．７ｍｌ添加し、ミリＱ水で１Ｌとしたものである。
中和ｂｕｆｆｅｒの組成はリン酸二水素ナトリウム・二水和物（関東化学株式会社、ＭＷ：１５６．０１）を１３．１ｇとリン酸水素二ナトリウム・１２水（和光純薬工業株式会社、ＭＷ：３５８．１４）４１．５ｇ、塩化ナトリウム（ナカライテスク株式会社、ＭＷ：５８．４４）８．７７ｇをミリＱ水に溶かし、１Ｌとしたものである。
前処理された培養上清を中性ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）で平衡化されたＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（Ｈｉ Ｔｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰ ５ｍｌ；日本国ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）にアプライした。その後、中性ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）２５ｍｌ以上でカラムを洗浄し、次にＤ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク株式会社）にＮａＣｌを添加しＮａＣｌ濃度を１．８５Ｍ に調製した緩衝液で２５ｍＬ以上洗浄し、再度２５ｍｌ中性ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３）でカラムを洗浄した。
その後、５５％酸性ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ２．７）でカラムを１０ｍｌ洗浄した。洗浄操作終了後、カラムに酸性ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ２．７）を５５％から９５％のグラジエントで７０ｍｌ添加し目的蛋白質を回収した。上記分離精製操作にはＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１０ｓまたはＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（日本国ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）を用いた。使用前にエンドトキシン除去処理を行った。
２−２−３．精製標品調製
実施例２−２−２で得られた精製標品中のｂｕｆｆｅｒを限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０ １０，０００ ＭＷ ＣＯＰＥＳ（日本国ザルトリウス・ステディム・ジャパン株式会社）を用いてサンプルを濃縮した。その後、ＮＡＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ（日本国ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社）を用いてＤ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク株式会社）に置換した。濃縮置換操作終了後０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ、日本国日本ミリポア株式会社）により濾過処理を行った。
蛋白質濃度はＡ２８０ｎｍを測定し、比吸光係数より算出した。比吸光係数は次のとおりである。ｈＦＺＤ２（１４０）−ｈＦｃｍはＥ１％１ｃｍ＝９．７、ｈＦＺＤ２（１５９）−ｈＦｃｍはＥ１％１ｃｍ＝９．４、ｈＦＺＤ２（１６５）−ｈＦｃｍはＥ１％１ｃｍ＝９．３、ｈＦＺＤ２（１７１）−ｈＦｃｍはＥ１％１ｃｍ＝９．４、ｈＦＺＤ２（１７５）−ｈＦｃｍはＥ１％１ｃｍ＝９．５
２−３．ｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍ組換え体投与マウスの解析（Ｘ＝１４０，１５９，１６５，１７１，１７５）
２−３−１．マウスへの投与
ｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍ組換え体による骨組織に対する生理作用を評価する目的で、マウスへの投与実験を行った。ｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍ組換え体は、マウス（Ｃ５７Ｂ６）（日本チャールス・リバー）に投与した。ｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍ組換え体投与群には、ｈＦＺＤ２（Ｘ）−ｈＦｃｍ組換え体を蛋白濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで調製し、各個体に１０ｍＬ／ｋｇずつ、１０日に１回の頻度で計３回、尾静脈内に投与した。
また、骨組織変化を比較するコントロール群として、ＰＢＳを投与する群を設定した。初回投与日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ２０まで１０日おきに計３回の尾静脈投与を実施した後、Ｄａｙ３０にマウスを剖検に供した。
２−３−２．骨構造解析（３次元マイクロフォーカスＸ線ＣＴ）
剖検において、左大腿骨を採取し、高分解能マイクロフォーカスＸ線ＣＴスキャナー（マイクロＣＴ、Ｓｃａｎ Ｘｍａｔｅ−Ｌ０９０、日本国コムスキャンテクノ社）、使用解析ソフト（ＴＲＹ ３Ｄ−ＢＯＮ、日本国ラトックシステムエンジニアリング社）を用いて大腿骨遠位骨幹端部の海綿骨領域の内部構造を非破壊的に観察し、単位骨量（ＢＶ／ＴＶ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ）を測定した。その結果を表１に示す。
Figure 0006121902
表１に示すように、マイクロＣＴにより、大腿骨遠位骨幹端部海綿骨内部構造を観察した結果、ｈＦＺＤ２（１４０）−ｈＦｃｍ組換え体投与群の単位骨量（ＢＶ／ＴＶ）は、２０．２±１．３％であった。これに対し、ｈＦＺＤ２（１５９）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１６５）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１７１）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１７５）−ｈＦｃｍ組換え体投与群の単位骨量はそれぞれ、２４．０±２．７、２２．４±２．５、２０．８±２．９、２１．３±２．６％と増加していた。また、ｈＦＺＤ２（１５９）−ｈＦｃｍ、ｈＦＺＤ２（１６５）−ｈＦｃｍ組換え体投与群では、骨梁幅および骨梁数が増加、骨梁間隔が低下していた。
これらのことから、大腿骨遠位骨幹端部二次海綿骨部分の単位骨量増加、骨梁幅増加、骨梁数増加、骨梁間隔低下はｈＦＺＤ２（１４０）−ｈＦｃｍ組換え体の細胞外領域蛋白質のアミノ酸長を延長することによって引き起こされた可能性が示された（表１）。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１１年６月２１日付けで出願された日本国出願（特願２０１１−１３７２７９）に基づいており、その全体が引用により援用される。
本発明により、生産細胞における分泌性が向上し、かつ骨量増加活性を有するFrizzled2の細胞外領域蛋白質のトランケート体を有する蛋白質を作成できる。また当該蛋白質またはＤＮＡを用いて、効率的に骨疾患に対する医薬組成物を製造することが可能となる。さらに、その医薬組成物を用いた骨疾患に対する治療方法を提供することができる。
配列番号３：ヒトＩｇＧ１Ｆｃ変異体のアミノ酸配列
配列番号４：ヒトＩｇＧ１Ｆｃ変異体をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号５および６：センスオリゴＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号７および８：プライマーのヌクレオチド配列
配列番号９：融合蛋白質をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号１０：融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号１１〜４０：プライマーのヌクレオチド配列
配列番号４２〜７１：融合蛋白質をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号７２〜１０１：融合蛋白質のアミノ酸配列

Claims (15)

  1. 配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末の１位のアミノ酸であるＱから、１５３番目のＡ、１５４番目のＧ、１５５番目のＧ、１５６番目のＴ、１５７番目のＰ、１５８番目のＧ、１５９番目のＧ、１６０番目のＰ、１６１番目のＧ、１６２番目のＧ、１６３番目のＧ、１６４番目のＧ、１６５番目のＡ、１６６番目のＰ、１６７番目のＰ、１６８番目のＲ、１６９番目のＹ、１７０番目のＡ、１７１番目のＴ、１７２番目のＬ、１７３番目のＥ、１７４番目のＨ、または１７５番目のＰのいずれか１のアミノ酸までのアミノ酸と哺乳動物由来免疫グロブリンＦｃ蛋白質またはその変異体との融合蛋白質。
  2. 前記Ｆｃ蛋白質の変異体が生物活性を抑制、低下または喪失させるための変異を導入したＦｃ変異体である、請求項１に記載の融合蛋白質。
  3. 前記Ｆｃ蛋白質の変異体が抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を抑制、低下または喪失させるための変異を導入したＦｃ変異体である、請求項１に記載の融合蛋白質。
  4. 化学修飾されている、請求項１から３のいずれか１項に記載の融合蛋白質。
  5. 前記化学修飾が、１または複数のポリエチレングリコール分子の結合である、請求項４に記載の融合蛋白質。
  6. 前記化学修飾が、糖鎖の結合である、請求項４に記載の融合蛋白質。
  7. 組換え蛋白質である、請求項１から６のいずれか１項に記載の融合蛋白質。
  8. 哺乳動物由来免疫グロブリンＦｃ蛋白質が配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１から７のいずれか１項に記載の融合蛋白質。
  9. 配列番号７２から９４のいずれか１で表されるアミノ酸配列からなる融合蛋白質。
  10. 請求項１から９のいずれか１項に記載の融合蛋白質を含有する骨疾患治療用医薬組成物。
  11. 請求項１から９のいずれか１項に記載の融合蛋白質をコードするＤＮＡ。
  12. 哺乳動物由来免疫グロブリンＦｃ蛋白質をコードするヌクレオチド配列が配列番号４で表されるヌクレオチド配列である、請求項１１に記載のＤＮＡ。
  13. 配列番号４２から６４のいずれか１で表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
  14. 請求項１１から１３のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する、骨疾患治療用医薬組成物。
  15. 上記骨疾患が、骨量、骨密度および骨強度から選ばれる少なくとも１の低下を伴う疾患である、請求項１０または１４に記載の骨疾患治療用医薬組成物。
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