KR20140123558A - Alk1 길항제 및 신세포 암종 치료에서의 그의 용도 - Google Patents

Alk1 길항제 및 신세포 암종 치료에서의 그의 용도 Download PDF

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KR20140123558A
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루팔 에스. 배트
라빈드라 쿠마
제임스 더블유. 마이어
로버트 피어설
매튜 셔먼
니콜라스 솔반
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악셀레론 파마 인코포레이티드
베스 이스라엘 데코니스 메디칼 센터
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Abstract

특정 측면에서, 본 개시내용은 액티빈-유사 키나제 I (ALK1) 폴리펩티드의 세포외 도메인의 리간드-결합 부분을 포함하는 폴리펩티드가 생체내 신세포 암종 (RCC)의 종양 성장을 억제하는데 사용될 수 있다는 통찰에 관한 것이다. 추가 측면에서, 본 개시내용은 ALK1의 세포외 도메인의 리간드-결합 부분을 포함하는 폴리펩티드가 생체내 RCC 종양 성장을 억제하기 위한 표준 치료 수용체 티로신 키나제 억제제의 능력을 급격히 증가시킨다는 통찰에 관한 것이다.

Description

ALK1 길항제 및 신세포 암종 치료에서의 그의 용도 {ALK1 ANTAGONISTS AND THEIR USES IN TREATING RENAL CELL CARCINOMA}
신세포 암종 (RCC)은 모든 악성 신장 종양의 최대 90%를 차지하고, 미국 남성 및 여성에서 상위 8번째로 흔히 진단되는 암이다. 미국 국립 암 연구소는 2012년에 미국에서 대략 65,000건의 신규 신암 사례가 진단될 것이며 신암으로 인해 대략 13,600건의 사망이 일어날 것이라고 추정한다. 전세계적으로 200,000건이 넘는 신규 사례가 진단되고 RCC로 인해 매년 100,000건이 넘는 사망이 일어난다고 추정된다. RCC의 발생률 및 사망률 모두가 전세계적으로 증가하고 있다.
RCC는 신장 또는 바로 옆 주위 조직에 여전히 국부화되어 있을 때 진단 및 치료되는 경우 종양 또는 신장의 외과적 제거를 통해 종종 치유될 수 있다. 그러나, 무질환 생존의 확률은 암이 혈관화되고 신체의 먼 부분으로 전이됨에 따라 유의하게 감소한다. RCC의 3분의 1은 5년 생존률이 10% 미만인 전이성 질환으로서 나타난다.
전이성 RCC (mRCC)는 병력적으로 화학요법 및 호르몬 요법에 대해 비감수성이었고, 매우 최근까지 전신 치료는 인터류킨 2 (IL-2) 또는 인터페론 알파 (IFN-α)를 이용한 비-특이적 면역-기반 시토카인 요법으로 제한되었다. 이러한 요법은 낮은 반응 비율 및 높은 독성 비율과 연관이 있다.
과거 십 년 동안의 연구는 RCC 종양발생 및 진행성 질환과 연관된 유전적 사례를 해명하는데 도움이 되었다. 특히, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 및 종양 세포 내 및 종양 세포와 주위 조직 (예를 들어, 존재하는 내피 세포 및 혈관주위세포) 사이 모두에서의 AKT/mTOR (라파마이신의 포유동물 표적) 신호전달 경로의 이상 신호전달은 RCC 혈관화, 세포 생존 및 종양 증식을 조종하는 영향력 있는 역할을 수행하는 것으로 확인되었다. RCC를 갖는 이들 경로에서 이상 신호전달의 회합은 차례로 VEGF, PDGF 및 mTOR 신호전달 경로의 중요 단계를 표적으로 하는 요법들의 개발로 이어졌다. 특히, 2005년 이후로, VEGF 및 PDGF 경로를 표적으로 하는 5종의 작용제 (즉, 소라페닙, 수니티닙, 베바시주맙, 파조파닙 및 악시티닙) 및 2종의 mTOR 경로-표적화 요법제 (즉, 템시롤리무스 및 에베롤리무스)가 진행성 RCC 적응증에 대해 FDA의 승인을 받았다.
베바시주맙 (VEGF에 결합하는 인간화 항체, 일반적으로 아바스틴(AVASTIN)®으로 공지됨)을 제외하고, VEGF 경로를 표적으로 하는 승인된 RCC 요법제는 소분자 ATP-모방 억제제 화합물이다. 이들 소분자 억제제는 수용체 티로신 키나제, 예컨대 VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3의 고도로 보존된 ATP-결합 촉매 부위에 결합하여 결합된 수용체의 세포내 신호전달을 차단함으로써 작용한다. 그러나, 부분적으로는 단백질 키나제 사이에 ATP-결합 촉매 부위의 고도로 보존된 구조로 인해, 대부분의 소분자 수용체 티로신 키나제 억제제는 또한 별개의 의도하지 않은 수용체 티로신 키나제 및 때로는 심지어 다른 키나제 패밀리의 구성원에 결합하여 그를 억제한다. 이러한 수용체 티로신 키나제 억제제의 "표적을 벗어난(off-target)" 작용은 치료 용도 및/또는 약물 효능을 제한하는 유해 사례 및 독성을 종종 유도한다.
수니티닙 (일반적으로 수텐트(SUTENT)®로 공지됨)은 처음에 c-Met 수용체 티로신 키나제의 소분자 억제제로서 개발된 다중표적 수용체 티로신 키나제 억제제이다. c-Met 이외에, 수니티닙은 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, PDGFRa, PDGFRb, flt-3, c-KIT (CD117), RET 및 CSF-1R 수용체 티로신 키나제의 활성을 경쟁적으로 억제한다. 수니티닙은, 수니티닙이 인터페론-알파와 비교하여 진행성 질환 환자의 전체 생존률을 거의 5개월 만큼 연장시킴 (26.4 개월 대 21.8 개월)을 입증하는 핵심 실험을 마친 후 진행성 RCC를 치료하는데 있어 제1선 요법제로서 승인을 받았다. 이러한 환자 생존률의 향상은 비록 대단하지는 않을지라도, 수니티닙을 치료 경험이 없는 진행성 RCC 환자에 대한 새로운 표준 치료제로 만들었다. 수니티닙 요법은 수니티닙과 연관된 유의한 독성을 관리하기 위해 RCC 환자의 50%에서 용량 감소를 필요로 한다고 입증된 바와 같이, 유의한 부작용과 연관된다.
최근 RCC 요법의 진보에도 불구하고, 충족되지 않은 유의한 필요성이 지속된다. 현재 이용가능한 요법은 환자에게 질환 진행 없는 1년 미만의 생존을 제공하고, 유의한 독성과 연관된다. 더욱이, 치료에 대한 종양의 적응은 치료의 중단 및 가속되는 종양 성장을 종종 유도한다.
개요
본 개시내용은 액티빈-유사 키나제 I (ALK1)-조절 시스템의 길항제 및 신세포 암종 (RCC)을 치료하기 위한 상기 길항제의 용도를 제공한다. 특정 측면에서, RCC는 투명 세포 신세포 암종이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM (종양/림프절/전이 분류) 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 다른 측면에서, RCC는 신동(renal sinus)을 침습하였다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
본원에 기재된 바와 같은 ALK1은 GDF(성장 분화 인자)6 및 GDF7을 포함하는 GDF5 군의 리간드, 및 BMP(골 형태발생 단백질)10을 포함하는 BMP9 군의 리간드에 대한 수용체이다. 본 개시내용은 ALK1 및 상기 기재된 리간드에 의해 매개되는 신호전달이 생체내 혈관신생에 관여하고, 이러한 조절 시스템의 억제가 강력한 항혈관신생 효과를 갖는다는 것을 입증한다.
본 개시내용은 또한 ALK1 조절 시스템 길항제, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질의 사용이 인간 RCC 이종이식편 동물 모델에서 종양 성장을 억제한다는 것을 입증한다. 본 개시내용은 또한 ALK1의 길항제인 ALK1-Fc 융합 단백질이 인간 RCC 이종이식편 동물 모델에서 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제인 수니티닙과 조합하여 투여될 때 수니티닙의 종양 성장 억제 활성을 유의하게 증진시킨다는 것을 입증한다. 따라서, 특정 측면에서, 본 개시내용은 신세포 암종을 치료하는데 사용하기 위한, ALK1 수용체 또는 하나 이상의 ALK1 리간드의 길항제를 포함한 ALK1 조절 시스템의 길항제를 제공한다. 특정 측면에서, ALK1 길항제는 ALK1-Fc 융합 단백질 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ALK1-Fc 융합 단백질)이다. 특정 측면에서, 본 개시내용은 신세포 암종을 치료하는데 사용하기 위한, ALK1 수용체 또는 하나 이상의 ALK1 리간드의 길항제를 포함한 ALK1 조절 시스템의 길항제를 제공한다. 특정 측면에서, 신세포 암종은 투명 세포 신세포 암종이다. 추가 측면에서, 치료되는 신세포 암종은 신동을 침습하였다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 다른 측면에서, RCC는 신동을 침습하였다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 혈관신생을 억제하는데 사용하기 위한 ALK1의 세포외 도메인의 리간드 결합 부분을 포함하는 폴리펩티드 ("ALK1 ECD 폴리펩티드")를 제공한다. 추가 측면에서, 본 개시내용은 RCC (예를 들어, 투명 세포 신세포 암종)를 치료하는데 사용하기 위한 ALK1 ECD 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 임의의 특정 작용 메카니즘에 매이기를 바라지 않지만, 이러한 폴리펩티드는 ALK1의 리간드에 결합하여 이들 리간드가 ALK1 뿐만 아니라 다른 수용체와 상호작용하는 능력을 억제함으로써 작용한다고 예상된다. 특정 실시양태에서, ALK1 ECD 폴리펩티드는 서열 1의 인간 ALK1 서열의 아미노산 22-118의 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, ALK1 ECD 폴리펩티드는 서열 1의 인간 ALK1 서열의 아미노산 22-120의 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. ALK1 ECD 폴리펩티드는 소형 단량체 단백질 또는 이량체화된 형태 (예를 들어, Fc 융합 단백질로 표현됨)로 사용될 수 있다. ALK1 ECD는 또한 개선되거나 바람직한 특성, 예컨대 개선된 리간드 결합 친화도, 증가된 반감기 또는 더 큰 생산 또는 정제 용이성을 제공하기 위해 제2 폴리펩티드 부분에 융합될 수 있다. 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 대한 융합 또는 폴리옥시에틸렌 모이어티 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)에 대한 연결은 전신 투여 (예를 들어, 정맥내, 동맥내 및 복막내 투여) 동안 ALK1 ECD 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는데 특히 유용하다.
본원에서 입증된 바와 같이, 전신 투여된 ALK1-Fc 융합 단백질은 인간 RCC 마우스 이종이식편 모델에서 단독으로 투여될 때 강력한 종양 성장 억제 효과를 갖고, 시험되는 인간 RCC 마우스 이종이식편 모델에서 수니티닙과 함께 전신 투여될 때 수니티닙 RCC 종양 성장 억제를 급격하게 증가시킨다. 특정 실시양태에서, ALK1-Fc 융합 단백질은 서열 1의 아미노산 22-118 또는 22-120의 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 이 폴리펩티드는 이뮤노글로불린의 Fc 부분에, 개재 링커와 함께 또는 개재 링커 없이 융합되고, 여기서 ALK1-Fc 융합 단백질은 GDF5 (예를 들어, 진뱅크(Genbank) 등록 번호 CAA56874에 인용된 서열을 가짐), GDF6 (예를 들어, 진뱅크 등록 번호 AAH43222에 인용된 서열을 가짐), GDF7 (예를 들어, 진뱅크 등록 번호 NP_878248에 인용된 서열을 가짐), BMP9 (예를 들어, 진뱅크 등록 번호 AF156891 AF188285 AK314956 BC069643 또는 BC074921에 인용된 서열을 가짐) 및 BMP10 (예를 들어, 진뱅크 등록 번호 095393에 인용된 서열을 가짐)로부터 선택되는 ALK1 리간드에 결합한다. 추가 측면에서, ALK1-Fc 융합 단백질은 1 x 10-7 M 미만의 KD로 GDF5, GDF7 및 BMP9로부터 선택되는 ALK1 리간드에 결합하고, 1 x 10-6 M 초과의 KD로 TGFβ-1에 결합한다. 치료되는 유기체에 적절하고 목적하는 약동학 및 약력학 특성을 나타내도록 Fc 융합 단백질의 Fc 부분이 선택된다. 임의로, Fc 부분은 인간 IgG1의 Fc 부분이다. 바람직한 실시양태에서, ALK1-Fc 융합 단백질은 서열 1의 아미노산 22-118 또는 22-120을 포함한다. 임의로, ALK1-Fc 융합 단백질은 서열 3의 아미노산 서열을 포함한다. 임의로, ALK1-Fc 융합 단백질은 서열 14의 아미노산 서열을 포함한다. 임의로, ALK1-Fc 융합 단백질은 포유동물 세포주, 특히 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주에서 서열 4의 핵산의 발현에 의해 생산된 단백질이다. ALK1-ECD 폴리펩티드는 실질적으로 발열원이 존재하지 않는 제약 제제와 같이 제제화된다. 제약 제제는 전신 전달 (예를 들어, 정맥내, 동맥내 또는 피하 전달) 또는 국부 전달을 위해 제조될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 치료 환경에서 사용하기 위한 ALK1-Fc 융합 단백질의 비교적 균질한 제제를 개발함에 있어서의 어려움을 다룬다. 본원에 기재된 바와 같은 ALK1-Fc 융합 단백질은 보다 고차의 다량체로 응집되는 경향이 있다. 본 개시내용은 이러한 어려움에 대한 해법을 제공하고, 이에 따라 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이량체 ALK1-Fc 융합 단백질로 구성된 ALK1-Fc 융합 단백질을 포함하는 제약 제제를 제공한다. 따라서, 특정 측면에서, 본 개시내용은 서열 1의 아미노산 22-118 또는 22-120의 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96% 또는 97% 동일한 아미노산 서열을 가지며 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 융합되는 폴리펩티드를 포함하고, GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로부터 선택되는 리간드에 결합하는 ALK1-Fc 융합 단백질을 함유하는 제약 제제를 제공한다. 추가 측면에서, ALK1-Fc 융합 단백질은 1 x 10-7 M 미만의 KD로 GDF5, GDF7 및 BMP9에 결합하고, 1 x 10-6 M 초과의 KD로 TGFβ-1에 결합하며, ALK1-Fc 융합 단백질의 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 이량체 형태로 존재한다.
ALK1-Fc 융합 단백질의 Fc 부분은 인간 IgG1 또는 또 다른 인간 이뮤노글로불린 하위부류, 예컨대 IgG2 또는 IgG3의 Fc 부분일 수 있다. 일부 측면에서, ALK1-Fc 융합 단백질은 서열 3의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 측면에서, ALK1-Fc 융합 단백질은 서열 14의 아미노산 서열을 포함한다. 추가 측면에서, ALK1-Fc 융합 단백질은 포유동물 세포주, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주에서 서열 4의 핵산의 발현에 의해 생산된다. 이러한 제약 제제는 공지된 기술 및 시약을 사용하여 ALK1-Fc 융합 단백질의 바람직한 특성을 최적화하는 목적으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 제약 제제는 혈관신생을 억제하고 RCC를 치료하는 것을 포함한, 본원에 기재된 다양한 치료 목적에 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 제약 제제는 투명 세포 신세포 암종을 치료하는데 사용된다. 추가 측면에서, 제약 제제는 이전에 RCC 치료제를 투여받은 포유동물에서 RCC를 치료하는데 사용된다. 또 다른 측면에서, 제약 제제는 RCC를 가지고 있으며 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받았거나 받을 준비중인 포유동물을 치료하는데 사용된다. 추가 측면에서, 본 발명의 제약 제제는 진행성 (전이성) RCC를 치료하는데 사용된다. 추가 측면에서, 본 발명의 제약 제제는 혈관신생을 억제하고/거나 혈관신생의 억제가 요망되는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, ALK1-Fc 제약 제제 및 ALK1에 관한 항체 또는 ALK1의 하나 이상의 리간드 (예를 들어, BMP9 및/또는 BMP10)를 포함하는 제제는 혈관신생을 억제하는 작용제와 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, ALK1-Fc 제약 제제 및 ALK1에 관한 항체 또는 ALK1의 하나 이상의 리간드 (예를 들어, BMP9 및/또는 BMP10)를 포함하는 제제는 VEGF 신호전달 경로 길항제 (예를 들어, VEGF에 결합하는 항체 (예를 들어, 아바스틴®), VEGF 수용체 (예를 들어, VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3) 및 VEGF 수용체 트랩(trap))와 함께 사용된다. 특정 측면에서, 제약 제제는 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제를 포함한다. 추가 측면에서, VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제는 수니티닙 (수텐트®), 소라페닙 (넥사바르(NEXAVAR)®), 파조파닙 (보트리엔트(VOTRIENT)®), 악시티닙 (인리타(INLYTA)®), 티보자닙 및 반데타닙으로부터 선택되는 작용제이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 신세포 암종 (RCC)을 갖는 포유동물에게 ALK1 ECD 폴리펩티드를 투여함으로써 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 추가 측면에서, 본 개시내용은 RCC를 갖는 포유동물에게 유효량의 액티빈-유사 키나제 I (ALK1)-Fc 융합 단백질 및 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 치료될 RCC는 투명 세포 신세포 암종이다. 또 다른 측면에서, 치료될 RCC는 신동을 침습하였다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
특정 측면에서, 본 발명의 방법에 따라 투여되는 ALK1-Fc 융합 단백질은 서열 1의 아미노산 22-118 또는 22-120의 서열에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가지며 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 융합되는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 ALK1-Fc 융합 단백질은 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로부터 선택되는 ALK-리간드에 결합한다. 추가 측면에서, ALK1-Fc 융합 단백질은 1 x 10-6 M 초과의 KD로 TGFβ-1에 결합한다. 임의로, ALK1-Fc 융합 단백질은 서열 3의 서열을 갖는다. 대안적인 측면에서, ALK1-Fc 융합 단백질은 서열 14의 서열을 갖는다. ALK1 ECD 폴리펩티드는 국부적으로 또는 전신적으로 (예를 들어, 정맥내로, 동맥내로 또는 피하로) 전달될 수 있다.
추가 측면에서, ALK1-Fc 융합 단백질과 함께 투여되는 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제는 수니티닙 (수텐트®), 소라페닙 (넥사바르®), 파조파닙 (보트리엔트®), 악시티닙 (인리타®), 티보자닙 및 반데타닙으로부터 선택되는 작용제이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 RCC를 갖는 포유동물에게 유효량의 액티빈-유사 키나제 I (ALK1)-Fc, VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제 및 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR) 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 추가 측면에서, ALK1-Fc 융합 단백질 및 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제는 mTOR-표적화 억제제인 에베롤리무스 또는 템시롤리무스와 함께 투여된다. 다른 측면에서, mTOR 억제제는 WYE354, YE132 (화이자(Pfizer)), PP30 및 PP242, AZD8055, OSI-027, 토린(Torin)1, BEZ235, XL765, GDC-0980, PF-04691502 및 PF-05212384로부터 선택되는 작용제이다.
한 측면에서, 치료될 RCC는 투명 세포 신세포 암종이다. 또 다른 측면에서, 치료될 RCC는 신동을 침습하였다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 이전에 신세포 암종 (RCC) 치료제를 투여받은 포유동물에게 유효량의 액티빈-유사 키나제 I (ALK1)-Fc 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 이전에 투여받은 치료제는 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제이다. 추가 측면에서, VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제는 수니티닙, 소라페닙, 파조파닙, 악시티닙, 티보자닙 및 반데타닙으로부터 선택되는 작용제이다. 또 다른 측면에서, 이전에 투여받은 치료제는 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR)-표적화 억제제이다. 추가 측면에서, mTOR-표적화 억제제는 에베롤리무스 및 템시롤리무스로부터 선택되는 작용제이다. 다른 측면에서, mTOR-표적화 억제제는 WYE354, YE132 (화이자), PP30 및 PP242, AZD8055, OSI-027, 토린1, BEZ235, XL765, GDC-0980, PF-04691502 및 PF-05212384로부터 선택되는 작용제이다. 추가 측면에서, 이전에 투여받은 치료제는 전신 시토카인 요법제이다. 추가 측면에서, 전신 시토카인 요법제는 인터페론 알파 (IFN-α) 또는 인터류킨-2 (IL-2)이다. 한 측면에 따르면, 치료되는 RCC는 투명 세포 신세포 암종이다. 또 다른 측면에서, 치료되는 RCC는 신동을 침습하였다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 이전에 신세포 암종 (RCC) 치료제를 투여받은 포유동물에게 유효량의 액티빈-유사 키나제 I (ALK1)-Fc 융합 단백질 및 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제는 수니티닙, 소라페닙, 파조파닙, 악시티닙, 티보자닙 및 반데타닙으로부터 선택되는 작용제이다. 또 다른 측면에서, 치료되는 RCC는 신동을 침습하였다. 한 측면에 따르면, RCC는 투명 세포 신세포 암종이다. 또 다른 측면에서, 치료되는 RCC는 신동을 침습하였다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 이전에 신세포 암종 (RCC) 치료제를 투여받은 포유동물에게 유효량의 액티빈-유사 키나제 I (ALK1)-Fc 융합 단백질 및 수용체 티로신 키나제에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 추가 측면에서, 항체는 VEGF, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, PDGFRa, PDGFRb, c-KIT, MET FAK, RET, 베타 FGF, Tie-1, Tie-2 및 EGFR로부터 선택되는 수용체 티로신 키나제에 결합한다. 추가 측면에서, 투여되는 항체는 베바시주맙이다. 한 측면에 따르면, RCC는 투명 세포 신세포 암종이다. 또 다른 측면에서, 치료되는 RCC는 신동을 침습하였다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 이전에 신세포 암종 (RCC) 치료제를 투여받은 포유동물에게 유효량의 액티빈-유사 키나제 I (ALK1)-Fc 융합 단백질 및 mTOR-표적화 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 추가 측면에서, mTOR-표적화 억제제는 에베롤리무스 및 템시롤리무스로부터 선택되는 작용제이다. 다른 측면에서, mTOR 억제제는 WYE354, YE132 (화이자), PP30 및 PP242, AZD8055, OSI-027, 토린1, BEZ235, XL765, GDC-0980, PF-04691502 및 PF-05212384로부터 선택되는 작용제이다. 한 측면에 따르면, RCC는 투명 세포 신세포 암종이다. 또 다른 측면에서, 치료되는 RCC는 신동을 침습하였다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 이전에 신세포 암종 (RCC) 치료제를 투여받은 포유동물에게 유효량의 액티빈-유사 키나제 I (ALK1)-Fc 융합 단백질 및 면역자극 시토카인을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 투여되는 면역자극 시토카인은 IFN-α 또는 IL-2이다. 또 다른 측면에 따르면, 치료되는 RCC는 투명 세포 신세포 암종이다. 또 다른 측면에서, 치료되는 RCC는 신동을 침습하였다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 RCC를 가지고 있으며 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받았거나 받을 준비중인 포유동물에게 유효량의 액티빈-유사 키나제 I (ALK1)-Fc 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 의료 절차는 네프론-보존술(nephron-sparing surgery), 부분 신절제술, 완전 신절제술 및 열 절제로부터 선택된다. 일부 측면에서, RCC는 투명 세포 신세포 암종이다. 추가 측면에서, RCC는 신동을 침습하였다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
한 측면에서, RCC를 가지고 있으며 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받았거나 받을 준비중인 포유동물에게 투여되는 ALK1-Fc 융합 단백질은 서열 1의 아미노산 22-118 또는 22-120의 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 ALK1-Fc 융합 단백질은 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로부터 선택되는 ALK1 리간드에 결합한다. 추가 측면에서, ALK1-Fc 융합 단백질의 Fc 부분은 인간 IgG1 이뮤노글로불린의 Fc 부분이다. 추가 측면에서, ALK1-Fc 융합 단백질은 서열 3 또는 서열 14의 아미노산 서열을 포함한다
추가 측면에서, 본 개시내용은 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받았거나 받을 준비중인 포유동물에게 유효량의 액티빈-유사 키나제 I (ALK1)-Fc 융합 단백질 및 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 한 측면에 따르면, VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제는 수니티닙, 소라페닙, 파조파닙, 악시티닙, 티보자닙 및 반데타닙으로부터 선택되는 작용제이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받았거나 받을 준비중인 포유동물에게 유효량의 ALK1-Fc 융합 단백질, VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제 및 mTOR-표적화 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, mTOR-표적화 억제제는 에베롤리무스 및 템시롤리무스로부터 선택되는 작용제이다. 또 다른 측면에서, mTOR 억제제는 WYE354, YE132 (화이자), PP30 및 PP242, AZD8055, OSI-027, 토린1, BEZ235, XL765, GDC-0980, PF-04691502 및 PF-05212384로부터 선택되는 작용제이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받았거나 받을 준비중인 포유동물에게 유효량의 ALK1-Fc 융합 단백질, VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제 및 면역자극 시토카인을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 투여되는 면역자극 시토카인은 IFN-알파 또는 IL-2이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받았거나 받을 준비중인 포유동물에게, ALK1 리간드에 결합하여 ALK1에 대한 ALK1 리간드의 결합을 억제하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 5 x 10-8 M 미만의 KD로 ALK1 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 ALK1 리간드에 의해 자극된 혈관신생을 억제한다. 특정 측면에서, 항체는 세포외 도메인인 서열 1의 아미노산 22-118 또는 22-120에서 ALK1에 결합하고, GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 ALK1 리간드에 대한 ALK1의 결합을 억제한다. ALK1에 대한 이들 리간드의 친화도에 기초하여, 항체는 5 x 10-8 M 미만, 임의로 5 x 10-8 M 내지 1 x 10-10 M의 KD로 결합할 수 있다. 상기 범위 내의 친화도를 갖는 항체는 GDF5, GDF6 및 GDF7 중 하나 이상에 의한 신호전달을 억제하는 한편, BMP9 및 BMP10에 의한 신호전달에는 더 적은 영향을 미치는 것으로 예상될 것이다. 이러한 항체는 바람직하게는 GDF5, GDF6 및 GDF7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 ALK1 리간드에 의해 자극된 혈관신생을 억제한다. 특정 메카니즘에 매이기를 바라지 않지만, 상기 항체는 ALK1 활성을 직접 억제함으로써 작용할 것으로 예상되고, 이는 ALK1 리간드의 활성을 억제하는 것으로 예상되는 ALK1-Fc 융합 단백질의 활성에 대조될 것이다. 항-ALK1 항체는 대안적 수용체 시스템, 예를 들어 BMPR1a, BMPR1b 및 BMPRII 복합체를 통해 신호전달하는 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 또는 BMP10의 능력을 저해하는 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 항-ALK1 항체는, ALK1 ECD가 저친화도 리간드에 결합하지 않거나 그를 억제하지 않을 수 있더라도 ALK1을 통해 신호전달하는 ALK1에 대한 저친화도 리간드 (예를 들어, 결합이 상대적으로 약하더라도 일반적으로 ALK-1을 통해 유의한 신호전달 사건을 촉발하는 것으로 인식되는 TGF-β)의 능력을 저해하는 것으로 예상된다. 일부 실시양태에서는, 1 x 10-10 M 미만의 KD로 ALK1 폴리펩티드에 결합한다. 상기 범위 내의 친화도를 갖는 항체는 BMP9 또는 BMP10에 의한 신호전달을 억제하는 것으로 예상될 것이다. 상기 항체는 바람직하게는 ALK1에 대한 BMP9 및 BMP10의 결합을 억제한다.
기능적 신호전달 복합체를 형성하기 위해, BMP9, BMP10, GDF5, GDF6 및 GDF7을 포함한 BMP/GDF 패밀리의 구성원은 유형 I 및 유형 II 수용체에 결합한다. 이러한 두가지 유형의 수용체에 대한 결합 부위는 상이하다. 따라서, 특정 실시양태에서, ALK1 리간드에 결합하여 ALK1에 대한 리간드를 억제하는 항체는 리간드의 유형 I 수용체 결합 부위에 또는 그 근처에 결합하는 항체이다.
특히, 본원에 개시된 데이터에 기초하여, ALK1에 상대적으로 약하게 결합하는 항체는 GDF5 또는 BMP9와 같은 보다 강한 결합 리간드를 억제하지 않으면서 ALK1에 대한 TGFβ 결합을 억제할 수 있다. 본원에 기재된 항체는 바람직하게는 재조합 항체이고, 이는 분자 생물학의 기술을 사용하여 구축된 핵산으로부터 발현된 항체, 예컨대 단일 쇄 항체로부터 개발된 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 의미한다. Fv, Fab 및 단일 쇄 항체가 또한 용어 "재조합 항체" 내에 포함된다. 항체는 또한 폴리클로날 또는 비-재조합 모노클로날 항체 (인간 또는 뮤린 형태, 및 트랜스제닉 마우스로부터 얻은 인간 항체 포함)일 수 있다. 항체 및 ALK1-ECD 폴리펩티드는 실질적으로 발열원이 존재하지 않는 제약 제제로서 용이하게 제제화될 수 있다. 제약 제제는 전신 전달 (예를 들어, 정맥내, 동맥내 또는 피하 전달) 또는 국부 전달을 위해 제조될 수 있다. 국제 출원 공개 번호 WO 2007/040912에 기재된 항체는 본원에 기재된 다양한 방법에 유용할 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 포유동물에게 본원에서 일반적으로 또는 구체적으로 기재된 ALK1 폴리펩티드에 결합하는 항체의 유효량을 투여함으로써 포유동물에서 신세포 암종을 치료하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 신세포 암종은 투명 세포 신세포 암종이다. 또 다른 측면에서, RCC는 신동을 침습하였다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
상기 목적에 유용한 항체는 ALK1의 세포외 도메인에 결합하거나 (예를 들어, 서열 1의 아미노산 22-118로 이루어진 폴리펩티드에 결합하거나) 또는 ALK1의 다른 부분에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 1의 아미노산 22-118로 이루어진 폴리펩티드에 결합하여, GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 ALK1 리간드의 결합을 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 5 x 10-8 M 미만, 임의로 5 x 10-8 M 내지 1 x 10-10 M의 KD로 ALK1 폴리펩티드에 결합한다. 추가 실시양태에서, 항체는 GDF5, GDF6 및 GDF7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 ALK1 리간드에 의해 자극된 혈관신생을 억제한다. 일부 실시양태에서, BMP9 또는 BMP10에 의한 신호전달에 비해 GDF5, GDF6 또는 GDF7에 의해 매개된 신호전달을 선택적으로 억제하는 항체는 GDF5, GDF6 또는 GDF7이 국부화되어 있는 조직, 즉, 주로 골 또는 관절에서 일어나는 혈관신생의 선택적인 억제제로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 항체는 1 x 10-10 M 미만의 KD로 ALK1 폴리펩티드에 결합한다. 추가 실시양태에서, 항체는 ALK1 리간드에 대한 ALK1의 결합을 억제하며, 여기서 ALK1 리간드는 BMP9 및 BMP10으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 항-ALK1 항체는 국부적으로 또는 전신적으로 (예를 들어, 정맥내로, 동맥내로 또는 피하로) 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 항-ALK1 항체를 투여함으로써 포유동물의 진행성 신세포 암종을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 항-ALK1 항체 및 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제를 투여함으로써 신세포 암종을 갖는 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 신세포 암종 (RCC)을 갖는 포유동물에게 항-ALK1 항체 및 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제를 투여함으로써 투명 세포 RCC를 갖는 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, RCC는 투명 세포 신세포 암종이다. 또 다른 측면에서, 치료될 RCC는 신동을 침습하였다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 ALK1 리간드에 결합하여 ALK1에 대한 ALK1 리간드의 결합을 억제하는 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제 및 항체를 함유하는 조성물을 제공하며, 여기서 ALK1 리간드는 BMP9 및 BMP10으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히, 본원에서 제시된 바와 같이, 중화 항-BMP9 항체는 생체내 혈관신생을 억제한다. 추가로, 본원에서 입증된 바와 같이, BMP-10은 혈관신생을 자극하며, BMP-10의 길항제는 혈관신생을 억제한다. 항체는 1 x 10-10 M 미만의 KD로 ALK1 리간드에 결합할 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는 재조합 항체이고, 실질적으로 발열원이 존재하지 않는 제약 제제로서 제제화될 수 있다. 제약 제제는 전신 전달 (예를 들어, 정맥내, 동맥내 또는 피하 전달) 또는 국부 전달을 위해 제조될 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 포유동물에게 ALK1 리간드에 결합하여 ALK1에 대한 ALK1 리간드의 결합을 억제하는 수용체 티로신 키나제 억제제 (RTKI) 및 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 신세포 암종을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 ALK1 리간드는 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 항체는 GDF5, GDF6 및 GDF7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 ALK1 리간드에 의해 자극된 혈관신생을 억제할 수 있다. 추가 측면에서, 치료되는 신세포 암종은 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, 치료되는 신세포 암종은 투명 세포 신세포 암종이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 신세포 암종 (RCC)을 갖는 포유동물에게, ALK1, GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 또는 BMP10의 생산을 감소시키는 핵산 (예를 들어, 안티센스 또는 RNAi 구축물)을 포함하는 (이에 제한되지 않음) ALK1 신호전달 시스템의 억제제 및 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제의 유효량을 투여함으로써, 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 치료될 RCC는 신동을 침습하였다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다. 상기 ALK1 신호전달의 억제제는 선택된 표적에 결합하도록 변형될 수 있는 친화도 결합 시약, 예컨대 압타머, 랜덤 펩티드 및 단백질 스캐폴드 (이러한 스캐폴드의 예는 안티칼린 및 FNIII 도메인을 포함함)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이들 결합 시약은 또한 ALK1-리간드 상호작용을 파괴하거나 결합 후 발생하는 신호전달을 억제함으로써 ALK1 조절 시스템을 파괴하는 친화도 결합 시약을 확인하고 선택하는데 사용될 수 있다. 한 측면에서, 상기 방법에 따라 치료되는 RCC는 투명 세포 신세포 암종이다. 또 다른 측면에서, 치료될 RCC는 신동을 침습하였다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
본 개시내용의 추가 측면에서, 신세포 암종 (RCC)을 갖는 포유동물에게 유효량의 BMP9 및/또는 BMP10의 길항제 및 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 길항제는 BMP9 및/또는 BMP10에 결합하는 항체이다. 항체는 폴리클로날, 모노클로날 및 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다. 길항제는 Fd, Fv, Fab, F(ab'), F(ab)2 또는 F(ab')2 단편, 단일 쇄 Fv (scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디 또는 펩티바디일 수 있다. 일부 실시양태에서, 길항제는 압타머 (펩티드 또는 핵산)이다. BMP9 및 BMP10의 길항제의 중복 효과를 고려해 볼 때, 본원에서 입증된 바와 같이, 본 개시내용은 BMP9 및 BMP10 둘 다의 길항제, 예컨대 두 단백질에 효과적으로 교차-반응하여 길항작용하는 항체 (예를 들어, BMP9 및 BMP10 둘 다에 대한 친화도가 10 nM 미만 또는 1 nM 미만임)를 제공한다. BMP9 및 BMP10 둘 다에 결합하는 ALK1 길항제의 또 다른 예는 BMP9 및 BMP10 둘 다에 결합하여 두 리간드의 활성을 억제하는 ALK1-Fc 융합 단백질이다. 본 발명의 추가 측면에서, 방법은 포유동물에게 유효량의 mTOR-표적화 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 측면에서, 길항제는 BMP9 및/또는 BMP10 발현을 억제한다. 일부 실시양태에서, 길항제는 BMP9 및/또는 BMP10 발현을 억제하는 핵산이다. 예를 들어, 한 측면에서, 핵산은 안티센스 또는 RNAi 핵산이다. 다른 측면에서, 길항제는 BMP9 및/또는 BMP10에 결합하는 항체와 다른 단백질이다. 한 측면에서, 길항제는 GDF 트랩 패밀리의 구성원이다. GDF 트랩 패밀리의 예는 폴리스타틴, FLRG, 노긴 및 그렘린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 길항제는 BMP9 및 BMP10에 결합하는 아미노산 서열을 검출하는 단계를 포함하는 방법에 의해 아미노산 서열의 라이브러리로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 포유동물에서 전이성 신세포 암종을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 방법은 전이성 신세포 암종을 갖는 포유동물에게, ALK1 ECD 단백질; ALK1 리간드에 결합하여 ALK1에 대한 ALK1 리간드의 결합을 억제하는 항체 (여기서, ALK1 리간드는 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로 이루어진 군으로부터 선택됨); 서열 1의 아미노산 22-118로 이루어진 ALK1 폴리펩티드에 결합하여 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 ALK1 리간드의 결합을 억제하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용제 및 RTKI의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
각각의 경우에, 본원에 기재된 작용제는 혈관신생을 억제하는 추가의 작용제와 함께 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 혈관신생의 억제를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 ALK1 신호전달 시스템의 억제제 (예를 들어, ALK1-Fc)를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 종양의 혈관신생을 억제하는 것이 바람직한 경우에, 작용제는 임의로 항암 효과를 갖는 제2 작용제, 예컨대 화학요법제 또는 생물학적 항암제와 함께 투여된다. 추가 측면에서, 작용제는 MTOR (라파마이신의 포유동물 표적) 억제제와 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 종양, 항-VEGF 요법에 내성이 있는 종양, 다발성 골수종, 및 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이된 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈관신생 관련 질환을 치료하는데 사용된다.
도 1은 인간 액티빈 유사 키나제 1 (ALK1)에 대한 아미노산 서열 (서열 1)을 도시한다. 단일 밑줄은 예측된 세포외 도메인을 나타낸다. 이중 밑줄은 세포내 도메인을 나타낸다. 신호 펩티드 및 막횡단 도메인은 밑줄치지 않았다.
도 2는 인간 ALK1 cDNA의 핵산 서열 (서열 2)을 도시한다. 코딩 서열을 밑줄로 표시하였다. 세포외 도메인을 코딩하는 부분은 이중 밑줄로 표시하였다.
도 3a 및 3b는 Fc 도메인에 대한 인간 ALK1의 세포외 도메인의 융합체의 예 (서열 3) 및 (서열 14)를 도시한다. hALK1-Fc 단백질은 C-말단에서 링커 (밑줄침) 및 IgG1 Fc 영역에 융합된 인간 ALK1 단백질의 아미노산 22-120을 포함한다.
도 4는 서열 3의 hALK1-Fc 폴리펩티드의 발현을 위한 핵산 서열을 도시한다. 코딩된 아미노산 서열을 또한 도시한다. 리더(leader) 서열은 분비된 단백질의 N-말단 아미노산이 Asp 22이도록 절단된다.
도 5는 내피 세포관 형성 검정에서 뮤린 ALK1-Fc ("RAP") 및 인간 ALK1-Fc ("ACE")의 항혈관신생 효과를 도시한다. 모든 농도의 RAP 및 ACE는 내피 세포 성장 보충제 (ECGF)에 반응하는 관 형성의 수준을 양성 대조군인 엔도스타틴(Endostatin)보다 더 큰 정도로 감소시켰다.
도 6은 병아리(chick) 융모요막 (CAM) 검정에서 GDF7의 혈관신생 효과를 도시한다. GDF7 효과는 VEGF의 효과에 필적한다.
도 7은 CAM 검정에서 인간 ALK1-Fc 융합체의 항혈관신생 효과를 도시한다. hALK1-Fc는 VEGF, FGF 및 GDF7에 의해 자극된 혈관신생을 억제한다.
도 8은 뮤린 ALK1-Fc (mALK1-Fc), hALK1-Fc, 상업적으로 입수가능한 항-ALK1 모노클로날 항체 (항-ALK1 mAb) 및 상업적으로 입수가능한 중화 항-VEGF 모노클로날 항체의 비교용 항혈관신생 효과를 도시한다. ALK1-Fc 구축물의 항혈관신생 효과는 항-VEGF 항체의 효과에 필적한다.
도 9는 생체내 hALK1-Fc 및 항-VEGF 항체의 항혈관신생 효과를 도시한다. hALK1-Fc 및 항-VEGF는 마우스 각막 미세낭(micropocket) 검정에 의해 측정시 눈에서의 혈관신생에 대해 필적할만한 효과를 가졌다.
도 10은 류마티스 관절염의 뮤린 콜라겐-유도된 관절염 (CIA) 모델에서 mALK1-Fc의 효과를 도시한다. 그래프는 콜라겐-유도된 수컷 DBA/1 관절염 마우스에서 42일 관찰 기간 동안 측정된 평균 군 관절염 점수를 도시한다. RAP-041은 mALK1-Fc이다. 아바스틴™은 항-VEGF 항체 베바시주맙이다.
도 11은 슈퍼로즈(Superose) 12 10/300 GL 크기 배제 칼럼 (아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에 의한 R&D 시스템즈(R&D Systems) (미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)로부터의 hALK1-Fc (서열 3) 및 hALK1-Fc 융합 단백질의 분해(resolution)를 도시한다. R&D 시스템즈 물질은 그래프의 좌측면 상의 피크에 의해 나타난 바와 같이 대략 13％의 응집 단백질 및 몇몇 더 낮은 분자량 종을 함유한다. 서열 3의 물질은 99％ 초과가 적절한 분자 크기의 이량체로 이루어져 있다.
도 12는 PBS (원형) 및 mALK1-Fc (사각형)로 처리된 마우스에서 루시페라제-발현 루이스(Lewis) 폐암 (LL/2-luc) 세포로부터의 형광 신호를 도시한다. 종양 세포를 꼬리 정맥에 주사하고, 세포 투여 당일에 처리 (PBS 또는 10 mg/kg mALK1-Fc IP, 주 2회)를 개시하였다. PBS-처리된 마우스를 22일째에 빈사 상태로 희생시켰다. 처리군 및 대조군은 각각 7마리의 동물 (n=7)로 이루어져 있었다.
도 13은 CAM 검정에서 VEGF-매개 혈관신생에 대한 재조합 인간 BMP9 ("rhB9") 및 상업적으로 입수가능한 항-BMP9 모노클로날 항체 ("mabB9")의 효과를 도시한다. 흥미롭게도, BMP9 및 항-BMP9 처리 둘 다는 VEGF-매개 혈관신생을 억제한다.
도 14는 ER- 유방암 세포로부터 유래된 세포주인 MDA-MB-231 세포주를 사용한 동소 이종이식편 모델에서 mALK1-Fc의 효과를 도시한다. 30 mg/kg의 용량에서, mALK1-Fc는 이종이식편 종양에 대해 유의한 성장 지연 효과를 갖는다.
도 15는 에스트로겐 수용체 양성 (ER+) 유방암 세포로부터 유래된 세포주인 MCF7 세포주를 사용한 동소 이종이식편 모델에서 hALK1-Fc의 효과를 도시한다. 10 또는 30 mg/kg의 용량에서, hALK1-Fc는 이종이식편 종양에 대해 유의한 성장 지연 효과를 갖는다.
도 16은 세포-기반 검정에서 BMP10에 의해 유도된 전사 리포터 활성을 80% 초과로 억제하는 hALK1-Fc의 능력을 도시한다.
도 17은 인간 BMP9 (서열 12) 및 BMP10 (서열 13) 단백질의 성숙 부분의 정렬을 도시한다. 동일성의 영역은 별표로 나타나 있다.
도 18은 786-O 인간 RCC 이종이식편 모델에서 수니티닙에 의한 종양 성장 억제를 증진시키는 hALK1-Fc의 능력을 도시한다. hALK1-Fc는 단일 작용제로서 종양 성장을 억제하는 경향을 추가로 나타냈다.
도 19는 A498 인간 RCC 이종이식편 모델에서 단일 작용제로서 종양 성장을 억제하는 hALK1-Fc의 능력을 도시한다.
도 20은 A498 인간 RCC 이종이식편 모델에서 수니티닙에 의한 종양 성장 억제를 증진시키는 hALK1-Fc의 능력을 도시한다.
상세한 설명
1. 개괄
신세포 암종
세계 보건 기구(World Health Organism)는 50가지가 넘는 상이한 유형의 신장암을 나열한다. 신세포 암종 (RCC)은 성인에서 가장 흔한 유형의 신장암이고, 암 세포가 신장의 세관 내벽에서 형성될 때 발생한다. RCC는 조기 경고 신호, 다양한 임상적 징후 및 화학요법 및 방사선에 대한 내성의 부족을 특징으로 한다. 50 내지 70세의 환자에서 존재하는 대부분의 RCC 종양은 남성에서 2 내지 3배 더 많다. 폰 히펠-린다우(von Hippel-Lindau, VHL) 증후군, 유전성 유두상 신장 암종, 버트-호그-두베(Birt-Hogg-Dube) 증후군과 연관된 가족성 신장 호산과립세포종(oncocytoma) 및 유전성 신장 암종을 포함한 특정 유전적 상태는 RCC의 발생률 증가와 연관이 있다. 환자의 30%는 전이성 또는 절제불가능한 질환을 갖는, RCC의 진행성 병기에 있고, 이 코호트의 2년 전체 생존률은 <10%이다 (문헌 [Reeves et al., Cancer Chemotherapy and Pharmacology 2009; 64(1):11-25]).
RCC의 5가지 주요 하위유형은 현재 투명 세포, 가장 흔한 RCC 하위유형인 유두상 (유형 I 및 유형 II), 혐색소성(chromophobe), 집합관 및 미분류 RCC를 포함하는 것으로 인식된다. 또한, 해부학적 기준은 전형적으로 RCC의 개별 병기를 구별하는데 사용되었다. 종양, 림프절 및 전이 (TNM) 분류 체계는 RCC의 병기를 구별하기 위해 종양의 주요 크기, 종양이 림프절로 퍼지는 정도 및 전이의 존재를 기준으로 한다. 종양 병기는 RCC에서 생존을 예측하는 가장 중요한 인자이다 (문헌 [Koul et al ., Am. J. Cancer Research 2011; 1(2):240-254]). 조기 병기 RCC를 갖는 환자의 50% 초과는 치유된다. 특정 상황 하에서, 근치적 신절제술(radical nephrectomy)은 또한 국부적으로 진행된 RCC 및 전이성 RCC를 치료하는 것으로 나타나 있다. 임상적으로 국부화된 질환을 갖는 환자의 23%는 신절제술 후에 전이성 질환을 발달시킨다 (문헌 [Koul et al ., Am. J. Cancer Research 2011; 1(2):240-254]). 그러나, 결과는 TNM 병기 III 및 병기 IV 질환에 대해 부족한데, 이들은 예를 들어 주요 정맥 또는 부신에서의 종양의 존재 또는 림프절 관여 (병기 III) 및 신장 밖의 질환의 존재 (병기 IV)를 특징으로 한다.
투명 세포 신세포 암종은 전형적으로 네프론의 근위곡세관(proximal convoluted tubule)의 상피 세포로부터 신장 피질 내에서 발생하고, 혈관 침습을 통해 퍼지는 경향이 있으며, 이때 악성 세포는 기관-국한된 종양의 18-29%에서 신내 정맥 내에서 발견된다 (문헌 [Delahunt et al ., Clin. Lab. Med. 2005; 25(2):231-46]; 및 [Bonsib et al ., Mod. Pathol. 2006; 19(5):746-53]). 120개 투명 세포 신세포 암종의 광범위한 병리학적 검사는 연구된 종양의 대략 절반에서 신동 침습을 나타냈다. RCC는 가장 흔히는 폐 (33-72%), 복부내 림프절 (3-35%), 골 (21-25%), 뇌 (7-13%) 및 간 (5-10%)으로 전이된다. 예를 들어, 문헌 [Klatte et al., Urol. Oncol. 2008; 26(6):604-9]을 참조한다.
신장으로 또는 신장 내에 국부화된 소형 종양은 부분 신절제술 (또한 "네프론-보존술"로도 공지됨)에 의해 종종 제거된다. 국부화된 종양을 위한 추가의 외과적 절차는 조직 절제 치료 (예를 들어, 냉동수술(cryosurgery) 및 고주파 절제 (RFA))를 포함한다. 암이 신장 내에 또는 신장 외에 크기 및/또는 분포로 진행되는 경우, 외과적 개입은 전형적으로 완전 신절제술 (즉, 근처 부신 및 신장 주위의 지방 조직과 함께 또는 이들 없이 전체 신장을 제거함)을 포함한다. 이러한 수술은 신장암에 대한 전형적인 표준 개입이다. 특정 상황 하에서, 근치적 신절제술은 또한 국부적으로 진행된 RCC 및 전이성 RCC를 치료하는 것으로 나타나 있다. 임상적으로 국부화된 질환을 갖는 환자의 23%는 신절제술 후에 전이성 질환을 발달시킨다 (문헌 [Koul et al ., Am J Cancer Research 2011; 1(2):240-254]).
면역자극 시토카인, 예컨대 인터류킨-2 (IL-2) 및 인터페론-α (IFN-α)를 이용한 면역요법은 RCC에 대한 주요 전신 요법이다. 고용량 정맥내 IL-2는 15-20% 반응률, 6-8% 완전 완화율 및 대략 5%의 치유율을 나타낸다고 보고되었다 (문헌 [Koul et al ., Am J Cancer Research 2011; 1(2):240-254]). 그러나, 그 요법은 매우 독성이다. IFN-α는 더 크지 않은 생존 이익을 나타내지만 더 바람직한 독성 프로파일을 갖는다.
ALK1
ALK1은 TGF-β 슈퍼패밀리의 리간드에 대한 유형 I 세포-표면 수용체이고, 또한 ACVRL1 및 ACVRLK1로 공지되어 있다. ALK1은 TGF-β1, TGF-β3 및 BMP-9에 대한 수용체로서 관련되었다 (문헌 [Marchuk et al ., 2003; Hum. Mol. Genet. 12:R97-R112] 및 [Brown et al ., 2005; J. Biol. Chem. 280(26):25111-8]).
마우스에서, ALK1의 기능 상실 돌연변이는 발생중인 혈관계에서 다양한 이상을 일으킨다 (문헌 [Oh et al ., 2000; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:2626-31] 및 [Urness et al ., 2000; Nat. Genet. 26:328-31]).
인간에서, ALK1의 기능 상실 돌연변이는 유전성 출혈성 모세혈관확장증 (HHT 또는 오슬러-랑뒤-웨버(Osler-Rendu-Weber) 증후군)과 연관되며, 여기서 환자는 개재되는 모세혈관 상(bed) 없이 동맥으로부터 정맥으로 직접 유동 (소통)을 생성시키는 동정맥 기형을 발달시킨다 (동정맥 단락(arteriovenous shunt)). HHT의 환자의 전형적인 증상은 재발성 코출혈, 위장 출혈, 피부 및 점막피부 모세혈관확장증, 및 폐, 대뇌 또는 간 혈관계에서의 동정맥 기형 (AVM)을 포함한다.
문헌 ([David et al ., Blood 2007; 109(5):1953-61] 및 [Scharpfenecker et al., J. Cell Sci. 2007 120(6):964-72])의 최근 간행물에서는 BMP9 및 BMP10이 내피 세포에서 ALK1을 활성화시키고, 이 활성화의 결과가 내피 세포 증식 및 이동을 억제하는 것으로 결론지었다. 이들 제안된 ALK1 활성화의 효과는 VEGF와 같은 혈관신생촉진 인자의 효과와 직접적으로 반대된다. 따라서, 상기 간행물에서는 BMP9 및 BMP10 자체가 항혈관신생 인자이고, 또한 ALK1 활성화가 항혈관신생 효과를 갖는 것으로 결론지었다. 이와 대조적으로, 본 개시내용은 BMP9 및 BMP10의 길항제 (효능제가 아니라)가 항혈관신생 효과를 갖는 것을 입증한다.
본 개시내용은 ALK1의 세포외 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드 ("ALK1 ECD 폴리펩티드")가 생체내 RCC 암 성장을 억제할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 보다 특히, 하기 논의된 바와 같이, 본 개시내용은 VEGF-독립적 혈관신생 및 VEGF, FGF 및 PDGF를 포함한 다수의 혈관신생 인자에 의해 매개되는 혈관신생 모두에 영향을 미침에 있어서 ALK1이 관여함을 입증하기 위해 ALK1 ECD 길항제의 용도를 기재한다. 본 개시내용은 또한 ALK1 ECD 길항제, 예컨대 ALK1-Fc가 생체내 인간 RCC 이종이식편 모델에서 RCC 종양 성장을 억제할 수 있고, 또한 인간 RCC 이종이식편 모델에서 수니티닙의 종양 억제 활성을 상당히 개선시킬 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다.
본 개시내용은 ALK1의 세포외 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드 ("ALK1 ECD 폴리펩티드")가 생체내에서 VEGF-독립적 혈관신생 및 VEGF, FGF 및 PDGF를 포함한 다수의 혈관신생 인자에 의해 매개되는 혈관신생 모두를 포함한 혈관신생을 억제하는데 사용될 수 있다는 발견에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 ALK1의 세포외 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드 ("ALK1 ECD 폴리펩티드")가 생체내에서 VEGF-독립적 혈관신생 및 VEGF, FGF 및 PDGF를 포함한 다수의 혈관신생 인자에 의해 매개되는 혈관신생을 포함한 혈관신생을 억제하는데 사용될 수 있다는 발견에 관한 것이다. 부분적으로, 본 개시내용은 ALK1에 대한 생리학적 고친화도 리간드의 정체(identity)를 제공하고, ALK1 ECD 폴리펩티드가 혈관신생을 억제한다는 것을 입증한다.
부분적으로, 본 개시내용은 ALK1에 대한 생리학적 고친화도 리간드의 정체를 제공하고, ALK1 ECD 폴리펩티드가 혈관신생을 억제한다는 것을 입증한다. 본원에 제시된 데이터는 ALK1 ECD 폴리펩티드가 TGF-β1에 대한 의미있는 결합을 나타내지 않는 경우에도 ALK1 ECD 폴리펩티드가 항혈관신생 효과를 발휘할 수 있다는 것을 입증한다. 또한, ALK1 ECD 폴리펩티드는 VEGF, FGF 및 GDF7을 포함한 많은 상이한 혈관신생촉진 인자에 의해 자극되는 혈관신생을 억제한다. 따라서, 본 개시내용은 ALK1 조절 시스템의 설명을 제공하며, 여기서 ALK1은 GDF6 및 GDF7을 포함하는 GDF5 군의 리간드에 대한 수용체이고, 또한 BMP10을 포함하는 BMP9 군의 리간드에 대한 수용체이며, 두 군의 리간드에 대해 상이한 친화도를 갖는다. 또한, 본 개시내용은 ALK1 및 상기 기재된 리간드에 의해 매개된 신호전달이 생체내에서 혈관신생촉진성이고, 상기 조절 시스템의 억제가 생체내에서 강력한 항혈관신생 효과를 갖는다는 것을 입증한다.
따라서, 특정 측면에서, 본 개시내용은 VEGF-의존성 혈관신생 및 VEGF-독립적 혈관신생 모두를 포함한 혈관신생을 억제하는데 사용하기 위한 ALK1 수용체 또는 하나 이상의 ALK1 리간드의 길항제를 포함한 ALK1 조절 시스템의 길항제를 제공한다. 그러나, ALK1 자체에 대한 항체는 ALK1 ECD 폴리펩티드와 상이한 효과를 갖는 것으로 예상됨을 주목하여야 한다. ALK1에 대한 범-중화 항체 (강한 및 약한 리간드 모두의 결합을 억제하는 것)는 ALK1을 통한 상기 리간드의 신호전달을 억제하는 것으로 예상되지만, 다른 수용체 (예를 들어, GDF5-7 및 BMP9-10의 경우에 BMPR1a, BMPR1b, BMPRII, 및 TGFβ의 경우에 TBRI 및 TBRII)를 통해 신호전달하는 상기 리간드의 능력을 억제하는 것으로 예상되지 않을 것이다. 반면에, ALK1 ECD 폴리펩티드는, 예를 들어 실시예에 나타낸 것과 같은 구축물, GDF5-7 및 BMP9-10을 포함하여 그가 강하게 결합하는 모든 리간드를 억제하는 것으로 예상되지만, TGF-β와 같이 그가 약하게 결합하는 리간드에는 영향을 미치지 않을 것이다. 따라서, ALK1에 대한 범-중화 항체는 ALK1을 통한 BMP9 및 TGF-β 신호전달을 차단하는 반면에, 또 다른 수용체를 통한 BMP9 및 TGF-β 신호전달을 차단하지는 않을 것이고, ALK1 ECD 폴리펩티드는 모든 수용체 (심지어 ALK1 이외의 수용체)를 통한 BMP9 신호전달을 억제할 수 있는 반면에, 임의의 수용체, 심지어 ALK1을 통한 TGF-β 신호전달을 억제하는 것으로는 예상되지 않을 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 일반적으로 본 개시내용의 문맥 내에서 및 각각의 용어가 사용되는 구체적인 문맥 내에서 당업계에서의 그의 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 본원에 개시된 조성물 및 방법과 그의 제조 및 사용 방법을 설명하는데 있어서 당업자에게 추가의 지침을 제공하기 위해 명세서에서 논의된다. 임의의 용어 사용의 범위 또는 의미는 용어가 사용되는 구체적인 문맥으로부터 분명할 것이다.
2. 가용성 ALK1 폴리펩티드
자연 발생 ALK1 단백질은 막횡단 단백질이고, 세포 외부에 위치하는 단백질의 부분 (세포외 부분) 및 세포 내부에 위치하는 단백질의 부분 (세포내 부분)을 갖는다. 본 개시내용의 측면은 ALK1의 세포외 도메인의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 "ALK1 ECD 폴리펩티드"를 제공한다. 용어 "ALK1 ECD 폴리펩티드"는 임의의 신호 서열 및 그 신호 서열에 대한 N-말단 서열을 포함하거나 배제하는 자연 발생 ALK1 폴리펩티드의 세포외 도메인의 아미노산 서열, 또는 자연 발생 ALK1 폴리펩티드의 세포외 도메인에 대해 적어도 33％ 동일하고, 임의로는 자연 발생 ALK1 폴리펩티드의 세포외 도메인의 서열에 대해 적어도 60％, 적어도 70％, 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 90％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 적어도 99％ 또는 100％ 동일한 아미노산 서열로 이루어지거나 그를 포함하는 폴리펩티드를 나타내도록 의도되고, 서열 1의 아미노산 34-95의 시스테인 노트(knot) 영역, 또는 시스테인 노트 + 세포외 도메인의 N- 및 C-말단에서의 추가의 아미노산, 예컨대 서열 1의 아미노산 22-118 또는 22-120으로 예시된다.
마찬가지로, ALK1 ECD 폴리펩티드는 서열 2의 뉴클레오티드 100-285 또는 그의 침묵 변이체, 또는 엄격한 혼성화 조건 (일반적으로, 이러한 조건은 당업계에 공지되어 있지만, 예를 들어 50％ v/v 포름아미드, 5 x SSC, 2％ w/v 차단제, 0.1％ N-라우로일사르코신, 0.3％ SDS 내에서 65℃에서 밤새 혼성화하고, 예를 들어 5 x SSC 내에서 약 65℃에서 세척할 수 있음) 하에 그의 상보체에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 추가로, ALK1 ECD 폴리펩티드는 서열 2의 뉴클레오티드 64-384 또는 그의 침묵 변이체, 또는 엄격한 혼성화 조건 (일반적으로, 이러한 조건은 당업계에 공지되어 있지만, 예를 들어 50％ v/v 포름아미드, 5 x SSC, 2％ w/v 차단제, 0.1％ N-라우로일사르코신, 0.3％ SDS 내에서 65℃에서 밤새 혼성화하고, 예를 들어 5 x SSC 내에서 약 65℃에서 세척할 수 있음) 하에 그의 상보체에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "ALK1 ECD 폴리펩티드"는 ALK1 폴리펩티드의 단리된 세포외 부분, 그의 변이체 (예를 들어, 서열 1의 아미노산 22-118 또는 22-120에 상응하는 서열에서 2, 3, 4, 5 또는 10개 이하의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 변이체를 포함하고, 서열 1의 아미노산 34-95에 상응하는 서열에서 2, 3, 4, 5 또는 10개 이하의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 변이체를 포함함), 그의 단편 및 임의의 상기한 것을 포함하는 융합 단백질을 포함하지만, 각각의 경우에 바람직하게는 임의의 상기 ALK1 ECD 폴리펩티드는 하나 이상의 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 또는 BMP10에 대한 실질적인 친화도를 보유할 것이다. 용어 "ALK1 ECD 폴리펩티드"는 명백하게 임의의 전장 자연 발생 ALK1 폴리펩티드를 배제하는 것으로 의도된다. 일반적으로, ALK1 ECD 폴리펩티드는 생물학상 관련 온도, pH 수준 및 오스몰농도에서 수용액에 가용성이도록 설계될 것이다.
상기한 바와 같이, 본 개시내용은 자연 발생 ALK1 폴리펩티드와 명시된 정도의 서열 동일성 또는 유사성을 공유하는 ALK1 ECD 폴리펩티드를 제공한다. 2개의 아미노산 서열의 ％ 동일성을 결정하기 위해, 서열을 최적 비교 목적으로 정렬시킨다 (예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭(gap)을 도입할 수 있고, 비교 목적으로 비-상동성 서열을 무시할 수 있음). 이어서, 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 잔기를 비교한다. 제1 서열 내의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기에 의해 점유되면, 분자들은 그 위치에서 동일하다 (본원에서 사용될 때, 아미노산 "동일성"은 아미노산 "상동성"과 동등함). 2개의 서열들 사이의 ％ 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다.
서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 ％ 동일성 및 유사성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성할 수 있다 (문헌 [Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; [Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987]; 및 [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]).
한 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열 사이의 ％ 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 내로 통합된 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 1970; (48):444-453]의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 특정 실시양태에서, 다음 파라미터가 GAP 프로그램에 사용된다: 블로섬(Blosum) 62 행렬 (matrix) 또는 PAM250 행렬, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치. 또 다른 실시양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 ％ 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램을 사용하여 결정된다 (문헌 [Devereux et al ., Nucleic Acids Res. 1984; 12(1):387]) (http://www.gcg.com에서 이용가능함). 예시적인 파라미터는 NWSgapdna.CMP 행렬 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하는 것을 포함한다. 달리 명시하지 않는 한, 2개의 아미노산 서열 사이의 ％ 동일성은 블로섬 62 행렬, 10의 갭 가중치 및 3의 길이 가중치를 사용하는 GAP 프로그램을 사용하여 결정되어야 하고, 상기 알고리즘이 목적하는 ％ 동일성을 계산할 수 없으면, 본원에 개시된 적합한 대안이 선택되어야 한다.
또 다른 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열 사이의 ％ 동일성은 PAM120 가중치 잔기 표(weight residue table), 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 통합된 문헌 [E. Myers and W. Miller, CABIOS, 1989; 4:11-17]의 알고리즘을 사용하여 결정된다.
2개의 아미노산 서열 사이에 최선의 전체 정렬을 결정하기 위한 또 다른 실시양태는 문헌 [Brutlag et al ., Comp. App. Biosci., 1990;6:237-245]의 알고리즘에 기반한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 정렬에서, 질의 및 대상 서열은 모두 아미노산 서열이다. 상기 전체적인 서열 정렬의 결과는 ％ 동일성으로 제시된다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열 동일성은 문헌 [Brutlag et al ., Comp. App. Biosci., 1990;6:237-245]의 알고리즘에 기반한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행된다. 특정 실시양태에서, 아미노산 정렬의 ％ 동일성 및 유사성을 계산하기 위해 사용된 파라미터는 행렬=PAM 150, k-터플(tuple)=2, 미스매치 페널티=1, 연결 페널티=20, 무작위화 군 길이=0, 컷오프 점수=1, 갭 페널티=5 및 갭 크기 페널티=0.05를 포함한다.
특정 실시양태에서, ALK1 ECD 폴리펩티드는 서열 1의 서열과 같은 자연 발생 ALK1 단백질의 세포외 부분, 및 바람직하게는 ALK1 세포외 도메인의 리간드 결합 부분을 포함한다. 실시양태에서, 가용성 ALK1 ECD 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 22-118 또는 22-120의 아미노산 서열에 대해 적어도 60％, 70％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 말단절단된 세포외 ALK1 폴리펩티드는 서열 1의 세포외 부분의 아미노산 서열의 적어도 30, 40 또는 50개의 연속 아미노산을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, ALK1 ECD 폴리펩티드는 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10 중 하나 이상과 결합한다. 임의로, ALK1 폴리펩티드는 TGF-β1 또는 TGF-β3에 대해 실질적인 결합을 보이지 않는다. 결합은 용액 내에 또는 표면 플라즈몬 공명 시스템, 예컨대 비아코어(Biacore)™ 시스템에서 정제된 단백질을 사용하여 평가할 수 있다. 바람직한 가용성 ALK1 폴리펩티드는 항혈관신생 활성을 나타낼 것이다. 혈관신생 억제 활성에 대한 생물검정은 병아리 융모요막 (CAM) 검정, 마우스 각막 미세낭 검정, 또는 이식된 종양에 단리 또는 합성된 단백질을 투여하는 효과를 측정하기 위한 당업계 공지의 검정을 포함한다. CAM 검정은 문헌 [O'Reilly, et al ., in "Angiogenic Regulation of Metastatic Growth" Cell, 1994;79 (2):315-328]에 기재되어 있다. 간단히 설명하면, 무손상 난황을 갖는 3일령 닭 배아를 계란으로부터 분리하고, 페트리 디쉬에 넣는다. 3일 인큐베이션 후, 시험될 단백질을 함유하는 메틸셀룰로스 디스크를 개별 배아의 CAM에 적용한다. 48시간 인큐베이션 후, 내피 성장이 억제되었는지를 결정하기 위해 배아 및 CAM을 관찰한다. 마우스 각막 미세낭 검정은 성장 인자-함유 펠릿을 의심되는 내피 성장 억제제를 함유하는 또 다른 펠릿과 함께 마우스의 각막에 이식하고, 각막 내에 정교해지는 모세관의 패턴을 관찰하는 것을 포함한다. 다른 검정은 실시예에 기재되어 있다.
ALK1 ECD 폴리펩티드는 ALK1 ECD 폴리펩티드의 세포질 테일(tail) 및 막횡단 영역을 제거함으로써 제조될 수 있다. 다르게는, 막횡단 도메인은 결실에 의해 또는 막횡단 도메인을 구성하는 통상 소수성인 아미노산 잔기를 친수성 잔기로 치환함으로써 불활성화될 수 있다. 어느 경우에나, 지질 친화도를 감소시키고 수 용해도를 개선시킬 실질적으로 친수성인 소수친수성(hydropathy) 프로파일이 생성된다. 막횡단 도메인의 결실이 친수성 아미노산 잔기로의 치환보다 바람직한데, 이는 잠재적 면역원성 에피토프의 도입을 피하기 때문이다.
ALK1 ECD 폴리펩티드는 추가로 N-말단에서 임의의 다양한 리더 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 펩티드가 발현되어 진핵계에서 분비 경로를 표적화하도록 할 것이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,082,783 (Ernst et al .)을 참조한다. 다르게는, 천연 ALK1 신호 서열은 세포로부터의 돌출을 수행하도록 사용될 수 있다. 가능한 리더 서열은 천연, tPa 및 꿀벌 멜리틴 리더 (각각 서열 7-9)을 포함한다. 신호 펩티드의 처리는 다른 변수 중 선택된 리더 서열, 사용된 세포 유형 및 배양 조건에 따라 변할 수 있고, 따라서 서열 5의 것을 포함한 성숙 ALK1 ECD 폴리펩티드에 대한 실제 N-말단 개시 부위는 N-말단 또는 C-말단 방향으로 1-5개 아미노산만큼 이동할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 폴리펩티드의 글리코실화를 변경하도록 ALK1 폴리펩티드의 특정 돌연변이를 고려한다. 상기 돌연변이는 하나 이상의 글리코실화 부위, 예컨대 O-연결된 또는 N-연결된 글리코실화 부위를 도입하거나 제거하도록 선택될 수 있다. 아스파라긴-연결된 글리코실화 인식 부위는 일반적으로 적절한 세포성 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-트레오닌 (또는 아스파라긴-X-세린) (여기서, "X"는 임의의 아미노산임)을 포함한다. 변경은 또한 야생형 ALK1 폴리펩티드의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 그에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위에 대해). 글리코실화 인식 부위의 제1 또는 제3 아미노산 위치 중 하나 또는 둘 모두에서 다양한 아미노산 치환 또는 결실 (및/또는 제2 위치에서 아미노산 결실)은 변형된 트리펩티드 서열에서 비-글리코실화를 일으킨다. ALK1 폴리펩티드 상에 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 다른 수단은 ALK1 폴리펩티드에 대한 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링에 의한 것이다. 사용된 커플링 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 유리 카르복실기; (c) 유리 술프히드릴기, 예컨대 시스테인의 것; (d) 유리 히드록실기, 예컨대 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 것; (e) 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것; 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 본원에 참조로 포함되는 WO 87/05330 (1987년 9월 11일 공개) 및 문헌 [Aplin and Wriston, (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306]에 기재되어 있다. ALK1 폴리펩티드 상에 존재하는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 및/또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는, 예를 들어 ALK1 폴리펩티드를 화합물 트리플루오로메탄술폰산 또는 동등한 화합물에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 처리는 아미노산 서열을 무손상 상태로 유지하면서 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 또는 모든 당을 절단시킨다. 화학적 탈글리코실화는 문헌 [Hakimuddin et al ., (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52] 및 [Edge et al ., Anal. Biochem. 1981; 118:131]에 추가로 기재되어 있다. ALK1 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al ., (1987) Meth. Enzymol. 138:350]에 기재된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 달성될 수 있다. ALK1 폴리펩티드의 서열은 적절한 경우에 사용된 발현 시스템의 유형에 따라 조정될 수 있고, 이는 포유동물, 효모, 곤충 및 식물 세포 모두가 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 상이한 글리코실화 패턴을 도입할 수 있기 때문이다. 일반적으로, 인간에서 사용하기 위한 ALK1 단백질은 적절한 글리코실화를 제공하는 포유동물 세포주, 예컨대 HEK293 또는 CHO 세포주에서 발현될 것이지만, 다른 포유동물 발현 세포주, 조작된 글리코실화 효소를 갖는 효모 세포주 및 곤충 세포도 또한 유용한 것으로 예상된다.
본 개시내용은 돌연변이체, 특히 ALK1 폴리펩티드의 조합 돌연변이체의 세트, 및 말단절단 돌연변이체를 생성하는 방법을 추가로 고려하는데, 조합 돌연변이체의 풀(pool)은 기능적 변이체 서열을 확인하는데 특히 유용하다. 상기 조합 라이브러리를 스크리닝하는 목적은, 예를 들어 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있거나 다르게는 신규한 활성을 함께 갖는 ALK1 폴리펩티드 변이체를 생성하기 위한 것일 수 있다. 다양한 스크리닝 검정을 하기에 제공하며, 이러한 검정은 변이체를 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, ALK1 폴리펩티드 변이체를, ALK1 리간드에 결합하거나, ALK1 폴리펩티드에 대한 ALK1 리간드의 결합을 방지하거나, ALK1 리간드에 의해 유발된 신호전달을 저해하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. ALK1 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 활성은 또한 세포 기반 또는 생체내 검정, 특히 실시예에 개시된 임의의 검정에서 시험될 수 있다.
자연 발생 ALK1 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 ALK1 ECD 폴리펩티드에 비해 선택적인 또는 일반적으로 증가된 효능을 갖는, 조합 방식으로-유도된 변이체가 생성될 수 있다. 마찬가지로, 돌연변이유발은, 혈청 반감기가 상응하는 야생형 ALK1 ECD 폴리펩티드와 크게 상이한 변이체를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 변경된 단백질은 단백질분해에 의한 분해, 또는 천연 ALK1 ECD 폴리펩티드의 파괴나 제거 또는 불활성화를 일으키는 다른 과정에 대해 더 안정하거나 덜 안정하게 될 수 있다. 상기 변이체 및 그를 코딩하는 유전자는 ALK1 폴리펩티드의 반감기를 조절함으로써 ALK1 ECD 폴리펩티드 수준을 변경하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 짧은 반감기는 보다 일시적인 생물학적 효과를 일으킬 수 있고, 환자 내에서 재조합 ALK1 ECD 폴리펩티드 수준을 보다 엄격하게 제어할 수 있다. Fc 융합 단백질에서, 단백질의 반감기를 변경하기 위해 링커 (존재하는 경우) 및/또는 Fc 부분에서 돌연변이가 이루어질 수 있다.
조합 라이브러리는 각각 적어도 잠재적 ALK1 폴리펩티드 서열의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리를 코딩하는 유전자의 축중성 라이브러리에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 잠재적 ALK1 폴리펩티드 뉴클레오티드 서열의 축중성 세트가 개별 폴리펩티드로서, 또는 다르게는 보다 큰 융합 단백질의 세트로서 (예를 들어, 파지 디스플레이에 대해) 발현가능하도록 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물이 효소 작용에 의해 유전자 서열 내로 라이게이션될 수 있다.
축중성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적 ALK1 ECD 변이체의 라이브러리를 생성할 수 있는 많은 방법이 존재한다. 축중성 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행될 수 있고, 이어서 합성 유전자가 발현을 위해 적절한 벡터 내로 라이게이션될 수 있다. 축중성 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Narang, SA Tetrahedron 1983;39:3]; [Itakura et al ., Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289]; [Itakura et al ., (1984) Annu. Rev. Biochem. 1981; 53:323]; [Itakura et al ., (1984) Science 1984;198:1056]; [Ike et al ., Nucleic Acid Res.1983:1983; 11:477] 참조). 상기 기술은 다른 단백질의 지정된 진화에 사용되었다 (예를 들어, 문헌 ([Scott et al ., Science 1990;249:386-390]; [Roberts et al ., (1992) PNAS USA 89:2429-2433]; [Devlin et al.,; Science 1990;249: 404-406]; [Cwirla et al ., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382]); 및 미국 특허 번호 5,223,409, 5,198,346 및 5,096,815 참조).
다르게는, 다른 형태의 돌연변이유발이 조합 라이브러리를 생성하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, ALK1 폴리펩티드 변이체가 생성되고, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 등을 사용하는 스크리닝에 의해 (문헌 [Ruf et al ., Biochemistry 1994; 33:1565-1572]; [Wang et al ., J. Biol. Chem. 1994; 269:3095-3099]; [Balint et al ., Gene 1993; 137:109-118]; [Grodberg et al ., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601]; [Nagashima et al ., J. Biol. Chem. 1993; 268:2888-2892]; [Lowman et al ., Biochemistry 1991;30:10832-10838]; 및 [Cunningham et al ., (1989) Science 244:1081-1085]), 링커 스캐닝 돌연변이유발에 의해 (문헌 [Gustin et al ., Virology 1993;193:653-660]; [Brown et al ., Mol. Cell Biol. 1992; 12:2644-2652]; [McKnight et al ., Science 1982; 232:316]); 포화 돌연변이유발에 의해 (문헌 [Meyers et al ., Science 1986; 232:613]); PCR 돌연변이유발에 의해 (문헌 [Leung et al ., Method Cell Mol. Biol., 1989;1:11-19]); 또는 화학적 돌연변이유발 등을 포함한 무작위 돌연변이유발에 의해 (문헌 [Miller et al ., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY]; 및 [Greener et al ., Strategies in Mol Biol 1994;7:32-34]) 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 링커 스캐닝 돌연변이유발은 특히 조합 세팅에서 말단절단된 (생활성) 형태의 ALK1 폴리펩티드를 확인하기 위한 매력적인 방법이다.
점 돌연변이 및 말단절단에 의해 제조된 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하기 위한 및 실제로 특정 특성을 갖는 유전자 생성물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 매우 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 기술은 일반적으로 ALK1 폴리펩티드의 조합 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝을 위해 채택가능할 것이다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위해 가장 널리 사용되는 기술은 대개 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 적절한 세포를 생성된 벡터의 라이브러리로 형질전환시키고, 목적하는 활성의 검출이 검출된 생성물의 유전자를 코딩하는 벡터의 비교적 용이한 단리를 가능하게 하는 조건 하에서 조합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 바람직한 검정은 ALK1 리간드 결합 검정 및 리간드-매개 세포 신호전달 검정을 포함한다.
특정 실시양태에서, ALK1 ECD 폴리펩티드는 ALK1 폴리펩티드 내에 자연적으로 존재하는 것 이외의 번역후 변형을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 변형은 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그 결과, 변형된 ALK1 ECD 폴리펩티드는 비-아미노산 요소, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 폴리사카라이드 또는 모노사카라이드 및 포스페이트를 함유할 수 있다. ALK1 ECD 폴리펩티드의 기능성에 대한 상기 비-아미노산 요소의 효과는 다른 ALK1 ECD 폴리펩티드 변이체에 대해 본원에 기재된 바와 같이 시험될 수 있다. ALK1 ECD 폴리펩티드가 신생 형태의 ALK1 폴리펩티드를 절단함으로써 세포 내에서 생산될 때, 단백질의 정확한 폴딩 및/또는 기능을 위해 번역후 처리가 또한 중요할 수 있다. 상이한 세포 (예컨대 CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 또는 HEK293)는 이러한 번역후 활성을 위한 특정 세포 기구 및 특징적인 메카니즘을 갖고, ALK1 폴리펩티드의 정확한 변형 및 처리를 보장하도록 선택될 수 있다.
특정 측면에서, ALK1 ECD 폴리펩티드의 기능적 변이체 또는 변형된 형태는 적어도 ALK1 ECD 폴리펩티드의 일부 및 하나 이상의 융합 도메인을 갖는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 융합 도메인의 널리 공지된 예는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 (Fc), 말토스 결합 단백질 (MBP) 또는 인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 융합 도메인은 요구되는 특성을 부여하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 융합 도메인은 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리에 특히 유용하다. 친화성 정제의 목적에서, 친화성 크로마토그래피를 위한 관련 매트릭스, 예컨대 글루타티온-, 아밀라제- 및 니켈- 또는 코발트-접합된 수지가 사용된다. 이러한 매트릭스 다수는 "키트" 형태, 예컨대 (HIS6) 융합 파트너로서 유용한 파마시아(Pharmacia) GST 정제 시스템 및 QIA익스프레스(QIAexpress)™ 시스템 (퀴아젠(Qiagen))으로 이용가능하다.
또 다른 예로서, 융합 도메인은 ALK1 ECD 폴리펩티드의 검출을 용이하게 하도록 선택될 수 있다. 이러한 검출 도메인의 예로는 각종 형광성 단백질 (예를 들어, GFP) 뿐만 아니라, 보통은 그에 대해 특이적인 항체가 이용가능한, 단쇄 펩티드 서열인 "에피토프 태그"를 포함한다. 그에 대한 특이적인 모노클로날 항체가 용이하게 이용가능한, 널리 공지된 에피토프 태그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에서, 융합 도메인은 인자 Xa 또는 트롬빈에 대한 것과 같은 프로테아제 절단 부위를 갖고, 이는 관련 프로테아제가 융합 단백질을 부분적으로 소화시켜 그로부터 재조합 단백질을 유리시키도록 한다. 이어서, 유리된 단백질은 후속적인 크로마토그래피 분리에 의해 융합 도메인으로부터 단리될 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, ALK1 ECD 폴리펩티드는 생체내에서 ALK1 폴리펩티드를 안정화시키는 도메인 ("안정화제" 도메인)에 융합된다. "안정화"라는 것은 파괴 감소 때문인지, 신장에 의한 제거 감소 때문인지, 또는 다른 약동학적 효과 때문인지와는 상관없이, 혈청 반감기를 증가시키는 것을 의미한다. 이뮤노글로불린의 Fc 부분과의 융합이 매우 다양한 단백질에 대해 바람직한 약동학적 특성을 부여하는 것으로 공지되어 있다. 마찬가지로, 인간 혈청 알부민에 대한 융합은 바람직한 특성을 부여할 수 있다. 선택될 수 있는 다른 유형의 융합 도메인은 다량체화 (예를 들어, 이량체화, 사량체화) 도메인 및 기능성 도메인을 포함한다.
특정 예로서, 본 개시내용은 Fc 도메인에 융합된 ALK1의 가용성 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다 (예를 들어, 서열 6).
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임의로, Fc 도메인은 Asp-265, 리신 322 및 Asn-434와 같은 잔기에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 특정 경우에, 하나 이상의 이들 돌연변이 (예를 들어, Asp-265 돌연변이)를 갖는 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 Fcγ 수용체에 결합하는 능력이 감소한다. 다른 경우에, 하나 이상의 이들 돌연변이 (예를 들어, Asn-434 돌연변이)를 갖는 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 MHC 부류 I-관련 Fc-수용체 (FcRN)에 결합하는 능력이 증가한다.
융합 단백질의 상이한 요소들은 목적하는 기능성과 일치하는 임의의 방식으로 배열될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, ALK1 ECD 폴리펩티드는 이종 도메인에 대해 C-말단에 위치할 수 있거나, 다르게는 이종 도메인이 ALK1 ECD 폴리펩티드에 대해 C-말단에 위치할 수 있다. ALK1 ECD 폴리펩티드 도메인 및 이종 도메인은 융합 단백질 내에서 인접할 필요가 없고, 추가의 도메인 또는 아미노산 서열이 어느 하나의 도메인에 대해 C- 또는 N-말단에, 또는 도메인들 사이에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이뮤노글로불린 Fc 영역" 또는 간단히 "Fc"는 이뮤노글로불린 쇄 불변 영역, 바람직하게는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 또는 그의 일부의 카르복실-말단 부분을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 이뮤노글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 또는 5) 2개 이상의 도메인 및 이뮤노글로불린 힌지 영역의 조합을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 Fc 영역은 적어도 이뮤노글로불린 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 바람직하게는 CH1 도메인이 결여되어 있다.
한 실시양태에서, 중쇄 불변 영역이 유래되는 이뮤노글로불린의 부류는 IgG (Igγ) (γ 하위부류 1, 2, 3 또는 4)이다. 다른 부류의 이뮤노글로불린, IgA (Igα), IgD (Igδ), IgE (Igε) 및 IgM (Igμ)이 사용될 수 있다. 적절한 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역의 선택은 미국 특허 번호 5,541,087 및 5,726,044에 상세히 논의되어 있다. 특정 결과를 달성하기 위해 특정 이뮤노글로불린 부류 및 하위부류로부터 특정 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 선택하는 것은 당업계의 기술 수준 내에 있는 것으로 간주된다. 이뮤노글로불린 Fc 영역을 코딩하는 DNA 구축물의 부분은 바람직하게는 힌지 도메인의 적어도 일부 및 바람직하게는 Fc 감마의 CH3 도메인의 적어도 일부 또는 임의의 IgA, IgD, IgE 또는 IgM 내의 상동성 도메인을 포함한다.
또한, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 실시에 있어서 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 내의 아미노산의 치환 또는 결실이 유용할 수 있는 것으로 고려된다. 한 예는 상부 CH2 영역에 아미노산 치환을 도입하여 Fc 수용체에 대한 친화도가 감소한 Fc 변이체를 생성하는 것일 것이다 (문헌 [Cole et al ., (1997) J. Immunol. 159:3613]).
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 다른 단백질 및/또는 다른 ALK1 ECD 폴리펩티드 종으로부터 단리되거나 이들이 실질적으로 없는 (예를 들어, 적어도 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％로 없는) ALK1 ECD 폴리펩티드의 단리된 및/또는 정제된 형태를 이용가능하게 한다. ALK1 ECD 폴리펩티드는 일반적으로 재조합 핵산으로부터의 발현에 의해 제조될 것이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 ALK1 단백질의 세포외 부분에 대한 코딩 서열을 포함하는 가용성 ALK1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 폴리펩티드는 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli), 곤충 세포 (예를 들어, 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용함), 효모 또는 포유동물 세포 내에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 본 개시내용의 일부 실시양태는 또한 ALK1 ECD 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 입증된 바와 같이, 서열 14에 제시되고 CHO 세포 내에서 발현된 ALK1-Fc 융합 단백질은 강력한 항혈관신생 활성을 갖는다.
3. ALK1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산
특정 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 단편, 기능적 변이체 및 융합 단백질을 포함한 임의의 ALK1 폴리펩티드 (예를 들어, ALK1 ECD 폴리펩티드)를 코딩하는 단리된 및/또는 재조합 핵산을 제공한다. 예를 들어, 서열 2는 자연 발생 인간 ALK1 전구체 폴리펩티드를 코딩하고, 서열 4는 IgG1 Fc 도메인에 융합된 ALK1 세포외 도메인의 전구체를 코딩한다. 대상 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이들 핵산은, 예를 들어 ALK1 폴리펩티드를 제조하는 방법에서 또는 직접적인 치료제로서 (예를 들어, 안티센스, RNAi 또는 유전자 요법 접근법에서) 사용될 수 있다.
특정 측면에서, ALK1 폴리펩티드를 코딩하는 대상 핵산은 서열 2 또는 4의 변이체인 핵산을 포함하는 것으로 더욱 이해된다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실에 의해 상이한 서열, 예컨대 대립유전자 변이체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 2 또는 4에 대해 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 동일한 단리된 또는 재조합 핵산 서열을 제공한다. 당업자는 서열 2 또는 4에 상보적인 핵산 서열, 및 서열 2 또는 4의 변이체가 또한 본 개시내용의 범위 내에 있음을 이해할 것이다. 추가의 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 서열은 단리되고/되거나, 재조합되고/되거나, 이종 뉴클레오티드 서열과 융합되거나, DNA 라이브러리 내에 존재할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산은 또한 고도로 엄격한 조건 하에서 서열 2 또는 4에 지정된 뉴클레오티드 서열, 서열 2 또는 4의 상보체 서열, 또는 이들의 단편에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 논의한 바와 같이, 당업자는 DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격도 조건이 변할 수 있음을 용이하게 이해할 것이다. 당업자는 DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격도 조건이 변할 수 있음을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들어, 6.0 x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC)로 약 45℃에서 혼성화를 수행한 후, 2.0 x SSC로 50℃에서 세척할 수 있다. 예를 들어, 세척 단계의 염 농도는 50℃에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격도로부터 50℃에서 약 0.2 x SSC의 높은 엄격도까지 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계의 온도는 실온인 약 22℃에서의 낮은 엄격도 조건으로부터 약 65℃에서의 높은 엄격도 조건까지 증가될 수 있다. 온도 및 염은 모두 변할 수 있거나, 다른 변수를 변화시키면서 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄격도 조건 하에 혼성화한 후, 실온에서 2 x SSC로 세척한 핵산을 제공한다.
유전자 코드의 축중성으로 인해 서열 2 또는 4에 제시된 핵산과 상이한 단리된 핵산이 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다. 예를 들어, 많은 아미노산은 하나 초과의 삼중체로 지정될 수 있다. 동일한 아미노산을 명시하는 코돈, 또는 동의코돈(synonym) (예를 들어, CAU 및 CAC는 히스티딘에 대한 동의코돈임)은 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 "침묵" 돌연변이를 일으킬 수 있다. 그러나, 대상 단백질의 아미노산 서열의 변화를 일으키는 DNA 서열 다형성(polymorphism)이 포유동물 세포 사이에 존재할 것으로 예상된다. 당업자는 특정 단백질을 코딩하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드 (뉴클레오티드의 약 3-5％까지)에서 이들 변이가 자연적 대립유전자 변이로 인해 주어진 종의 개체들 사이에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 임의의 및 모든 이러한 뉴클레오티드 변이 및 생성된 아미노산 다형성은 본 개시내용의 범위 내에 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 재조합 핵산은 발현 구축물 내에서 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 발현을 위해 사용된 숙주 세포에 적절할 것이다. 다양한 숙주 세포에 대한 다수 유형의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 상기 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성인자 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업계에 공지되어 있는 구성적 또는 유도성 프로모터가 본 개시내용에서 고려된다. 프로모터는 자연 발생 프로모터, 또는 하나 초과의 프로모터의 요소들을 조합한 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 구축물은 세포 내에 에피솜, 예컨대 플라스미드 상에 존재할 수 있거나, 발현 구축물은 염색체 내에 삽입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 가능케 하는 선택 마커 유전자를 함유한다. 선택 마커 유전자는 당업계에 널리 공지되어 있고, 사용된 숙주 세포에 따라 변할 것이다.
본원에 개시된 특정 측면에서, 대상 핵산은 ALK1 ECD 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 적어도 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 발현 벡터 내에 제공된다. 조절 서열은 당업계에 인식되어 있고, ALK1 폴리펩티드의 발현을 지시하도록 선택된다. 따라서, 용어 조절 서열은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소를 포함한다. 예시적인 조절 서열은 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology Methods: in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 작동가능하게 연결될 때 DNA 서열의 발현을 제어하는 임의의 매우 다양한 발현 제어 서열이 이들 벡터 내에서 ALK1 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 유용한 발현 제어 서열은, 예를 들어 SV40의 조기 및 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T7 프로모터 (그의 발현은 T7 RNA 폴리머라제에 의해 지시됨), 파지 람다의 주요 오퍼레이터(operator) 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질에 대한 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소에 대한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 예를 들어 Pho5, 효모 α-접합 인자의 프로모터, 바큘로바이러스 시스템의 폴리헤드론 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 그의 바이러스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 공지된 다른 서열, 및 이들의 다양한 조합을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환시킬 숙주 세포의 선택 및/또는 발현시키고자 하는 단백질의 유형과 같은 인자에 따를 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 벡터의 카피수, 벡터에 의해 코딩된 임의의 다른 단백질의 카피수 및 발현을 제어하는 능력, 예컨대 항생제 마커가 또한 고려되어야 한다.
본 개시내용에 포함된 재조합 핵산은 클로닝된 유전자 또는 그의 일부를 원핵 세포, 진핵 세포 (효모, 조류, 곤충 또는 포유동물), 또는 둘 모두에서 발현에 적합한 벡터 내로 라이게이션함으로써 생산될 수 있다. 재조합 ALK1 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 비히클은 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 예를 들어, 적합한 벡터는 이. 콜라이와 같은 원핵 세포에서의 발현을 위한 pBR322-유도된 플라스미드, pEMBL-유도된 플라스미드, pEX-유도된 플라스미드, pBTac-유도된 플라스미드 및 pUC-유도된 플라스미드 유형의 플라스미드를 포함한다.
일부 포유동물 발현 벡터는 박테리아에서 벡터의 증식을 용이하게 하는 원핵 서열, 및 진핵 세포 내에서 발현되는 하나 이상의 진핵 전사 단위를 모두 함유한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유도된 벡터는 진핵 세포의 형질감염에 적합한 포유동물 발현 벡터의 예이다. 이들 벡터 중 일부는 원핵 및 진핵 세포 모두에서 복제 및 약물 내성 선택을 용이하게 하도록 박테리아 플라스미드, 예컨대 pBR322로부터의 서열로 변형된다. 다르게는, 진핵 세포에서 단백질의 일시적인 발현을 위해 바이러스의 유도체, 예컨대 소 유두종 바이러스 (BPV-1), 또는 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 (pHEBo, pREP-유도 및 p205)가 사용될 수 있다. 다른 바이러스 (레트로바이러스 포함) 발현 시스템의 예는 하기 유전자 요법 전달 시스템의 기재에서 찾을 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에 사용되는 다양한 방법이 당업계에 널리 공지되어 있다. 원핵 및 진핵 세포 모두에 대한 다른 적합한 발현 시스템 및 일반적인 재조합 절차에 대해서는 문헌 [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)]을 참조한다. 일부 경우에서, 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용함으로써 재조합 폴리펩티드를 발현하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 바큘로바이러스 발현 시스템의 예는 pVL-유도된 벡터 (예컨대 pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유도된 벡터 (예컨대 pAcUW1), 및 pBlueBac-유도된 벡터 (예컨대 β-gal 함유 pBlueBac III)를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 벡터는 CHO 세포에서 대상 ALK1 폴리펩티드의 생산을 위해 설계될 것이고, 예컨대 Pcmv-Script 벡터 (스트라타진(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재), pcDNA4 벡터 (인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 및 pCI-neo 벡터 (프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 포함한다. 자명할 바와 같이, 대상 유전자 구축물은 정제를 위해, 예를 들어 융합 단백질 또는 변이체 단백질을 포함한 단백질을 생산하도록 배양물 내에 증식되는 세포에서 대상 ALK1 폴리펩티드의 발현을 일으키기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 또한 하나 이상의 대상 ALK1 ECD 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 (예를 들어, 서열 2 또는 4)을 포함하는 재조합 유전자로 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 ALK1 폴리펩티드는 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이, 곤충 세포 (예를 들어, 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용함), 효모 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다.
따라서, 본 개시내용은 또한 ALK1 ECD 폴리펩티드를 포함한 대상 ALK1 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, ALK1 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 ALK1 폴리펩티드의 발현이 일어나도록 하기에 적절한 조건 하에서 배양될 수 있다. ALK1 폴리펩티드는 ALK1 폴리펩티드를 함유하는 세포 및 배지의 혼합물로부터 분비되고 단리될 수 있다. 다르게는, ALK1 폴리펩티드는 세포질에 또는 막 분획에 보유될 수 있고, 세포는 수거, 용해될 수 있고, 단백질은 단리될 수 있다. 세포 배양물은 숙주 세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 세포 배양을 위한 적합한 배지는 당업계에 널리 공지되어 있다.
대상 ALK1 폴리펩티드는, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동, ALK1 폴리펩티드의 특정 에피토프에 특이적인 항체를 사용한 면역친화성 정제 및 ALK1 폴리펩티드에 융합된 도메인에 결합하는 작용제를 사용한 친화성 정제 (예를 들어, ALK1-Fc 융합체를 정제하기 위해 단백질 A 칼럼이 사용될 수 있음)를 포함한 단백질 정제를 위한 당업계에 공지된 기술을 사용하여 세포 배양 배지, 숙주 세포 또는 둘 모두로부터 단리될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, ALK1 폴리펩티드는 그의 정제를 용이하게 하는 도메인을 함유하는 융합 단백질이다. 바람직한 실시양태에서, 정제는, 예를 들어 다음 중 3개 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성된다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로스 크로마토그래피, 페닐세파로스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 완충제 교환으로 완료될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 ALK1 폴리펩티드의 목적하는 부분의 N-말단에서 폴리-(His)/엔테로키나제 절단 부위 서열과 같은 정제 리더 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni2 + 금속 수지를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 발현된 융합 단백질을 정제할 수 있다. 이어서, 정제 리더 서열은 엔테로키나제로 처리하여 후속적으로 제거되어, 정제된 ALK1 폴리펩티드를 제공할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177]; 및 [Janknecht et al., PNAS USA 88:8972] 참조).
융합 유전자를 제조하기 위한 기술은 널리 공지되어 있다. 본질적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편의 연결은 라이게이션을 위한 블런트-단부(blunt-ended) 또는 스태거-단부(stagger-ended) 말단, 적절한 말단을 제공하는 제한 효소 소화, 적절한 경우 점착성(cohesive) 단부의 충전(filling-in), 바람직하지 않은 연결을 피하기 위한 알칼리성 포스파타제 처리, 및 효소적 라이게이션을 이용하는 통상적인 기술에 따라 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 유전자는 자동 DNA 합성기를 포함하는 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 다르게는, 유전자 단편의 PCR 증폭은 2개의 연속 유전자 단편 사이에 상보적 오버행(overhang)을 일으키는 앵커(anchor) 프라이머를 사용하여 수행될 수 있고, 이는 후속적으로 어닐링되어 키메라(chimeric) 유전자 서열을 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al ., John Wiley & Sons: 1992] 참조).
ALK1, BMP9, BMP10, GDF5, GDF6 또는 GDF7의 길항제인 핵산 화합물의 카테고리의 예는 안티센스 핵산, RNAi 구축물 및 촉매적 핵산 구축물을 포함한다. 핵산 화합물은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥 화합물은 또한 오버행 또는 비-상보성의 영역을 포함할 수 있으며, 여기서 가닥 중 하나 또는 다른 하나는 단일 가닥이다. 단일 가닥 화합물은 자가-상보성의 영역을 포함할 수 있고, 이는 화합물이 이중 나선 구조의 영역과 소위 "헤어핀(hairpin)" 또는 "스템-루프(stem-loop)" 구조를 형성하는 것을 의미한다. 핵산 화합물은 전장 ALK1 핵산 서열 또는 리간드 핵산 서열의 1000개 이하, 500개 이하, 250개 이하, 100개 이하 또는 50, 35, 30, 25, 22, 20 또는 18개 이하의 뉴클레오티드로 이루어진 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상보성의 영역은 바람직하게는 적어도 8개 뉴클레오티드, 임의로 적어도 10개 또는 적어도 15개 뉴클레오티드, 임의로 15 내지 25개 뉴클레오티드일 것이다. 상보성의 영역은 표적 전사체의 인트론, 코딩 서열 또는 비코딩 서열, 예컨대 코딩 서열 부분 내에 속할 수 있다. 일반적으로, 핵산 화합물은 길이가 약 8 내지 약 500개 뉴클레오티드 또는 염기쌍 길이일 것이고, 임의로 길이는 약 14 내지 약 50개 뉴클레오티드일 것이다. 핵산은 DNA (특히 안티센스로서 사용하기 위한 것), RNA 또는 RNA:DNA 하이브리드일 수 있다. 임의의 하나의 가닥은 DNA 및 RNA의 혼합물, 및 DNA 또는 RNA로서 용이하게 분류될 수 없는 변형된 형태를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 이중 가닥 화합물은 DNA:DNA, DNA:RNA 또는 RNA:RNA일 수 있고, 임의의 하나의 가닥은 또한 DNA 및 RNA의 혼합물, 및 DNA 또는 RNA로서 용이하게 분류될 수 없는 변형된 형태를 포함할 수 있다. 핵산 화합물은 백본 (뉴클레오티드간 연결을 포함한 천연 핵산에서의 당-포스페이트 부분) 또는 염기 부분 (천연 핵산의 퓨린 또는 피리미딘 부분)에 대한 하나 이상의 변형을 포함한 임의의 다양한 변형을 포함할 수 있다. 안티센스 핵산 화합물은 바람직하게는 길이가 약 15 내지 약 30개 뉴클레오티드일 것이고, 종종 혈청 내에서, 세포 내에서, 또는 화합물이 전달될 것 같은 장소에서, 예컨대 경구 전달된 화합물의 경우 위에서, 및 흡입된 화합물의 경우 폐에서, 안정성과 같은 특징을 개선하기 위해 하나 이상의 변형을 함유할 것이다. RNAi 구축물의 경우에, 표적 전사체에 상보적인 가닥은 일반적으로 RNA 또는 그의 변형일 것이다. 다른 가닥은 RNA, DNA 또는 임의의 다른 변이일 수 있다. 이중 가닥 또는 단일 가닥의 "헤어핀" RNAi 구축물의 이중체 부분은 다이서(Dicer) 기질로서 역할을 하는 한, 바람직하게는 길이가 18 내지 40개 뉴클레오티드 길이 및 임의로 약 21 내지 23개 뉴클레오티드 길이일 것이다. 촉매적 또는 효소적 핵산은 리보자임 또는 DNA 효소일 수 있고 또한 변형된 형태를 함유할 수 있다. 핵산 화합물은 생리학적 조건 하에 및 넌센스 또는 센스 제어가 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 농도에서 세포와 접촉될 때 표적의 발현을 약 50％, 75％, 90％ 이상 억제할 수 있다. 핵산 화합물의 효과를 시험하기 위한 바람직한 농도는 1, 5 및 10 마이크로몰농도이다. 핵산 화합물은 또한, 예를 들어 혈관신생에 대한 효과에 대해 시험될 수 있다.
4. 항체
본 개시내용의 또 다른 측면은 ALK1 폴리펩티드의 세포외 부분과 반응성인 항체, 바람직하게는 ALK1 폴리펩티드와 특이적으로 반응성인 항체에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 또는 BMP10과 같은 리간드에 대한 ALK1 결합을 저해할 수 있고, ALK1의 리간드에 대한 항체는 관련 단백질의 성숙 처리 형태에 결합할 것임이 이해될 것이다. 본 개시내용은 또한 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및/또는 BMP10에 결합하여 이러한 리간드에 대한 ALK1 결합을 억제하는 항체를 제공한다. 바람직한 항체는 생물검정, 예컨대 CAM 검정 또는 각막 미세낭 검정 (상기 참조)에서 항혈관신생 활성을 나타낼 것이다. 바람직한 항-BMP9 항체는 하기 실시예 10에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, BMP9 및 BMP10 둘 다를 억제하는 항체가 바람직할 수 있는데; 이러한 항체는 ALK1 결합 검정, 혈관신생 검정 (예를 들어, HUVEC 튜브 형성 검정, CAM 검정, 매트리겔(Matrigel) 검정, 또는 기타 본원에 기재된 상기 검정)에서 두 리간드를 억제할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는, 예를 들어 임의의 이소형 (IgG, IgA, IgM, IgE 등)의 전체 항체를 포함하는 것으로 의도되고, 선택된 항원과 반응성인 이뮤노글로불린의 단편 또는 도메인을 포함한다. 항체는 통상적인 기술을 사용하여 단편화될 수 있고, 단편은 유용성 및/또는 관심있는 특정 에피토프와의 상호작용에 대해 스크리닝될 수 있다. 따라서, 상기 용어는 특정 단백질과 선택적으로 반응할 수 있는 항체 분자의 단백질분해에 의해 절단된 또는 재조합 방식으로 제조된 부분의 절편을 포함한다. 이러한 단백질분해 및/또는 재조합 단편의 비-제한적인 예는 Fab, F(ab')2, Fab', Fv, 및 펩티드 링커에 의해 연결된 V[L] 및/또는 V[H] 도메인을 함유하는 단일 쇄 항체 (scFv)를 포함한다. scFv는 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결되어 2개 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 형성할 수 있다. 용어 항체는 또한 폴리클로날, 모노클로날, 또는 항체 및 재조합 항체의 다른 정제된 제제를 포함한다. 용어 "재조합 항체"는 분자 생물학의 기술을 사용하여 구축된 핵산으로부터 발현된 항체 또는 이뮤노글로불린의 항원 결합 도메인, 예컨대 단일 쇄 항체로부터 개발된 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 의미한다. 단일 도메인 및 단일 쇄 항체는 또한 용어 "재조합 항체" 내에 포함된다.
항체는 동물에 대한 항원의 투여, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 동물에 대한 항원의 투여, 또는 항체 (종종 단일 쇄 항체 또는 항체 도메인)의 라이브러리에 대한 항원을 이용하는 스크리닝을 포함한, 당업계에 공지된 임의의 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 항원 결합 활성이 검출되면, 단백질의 관련 부분을 전장 IgG 프레임워크를 포함한 다른 항체 프레임워크에 그라프팅할 수 있다. 예를 들어, ALK1 폴리펩티드 또는 ALK1 리간드로부터 유래된 면역원 (예를 들어, BMP9 또는 BMP10, 또는 BMP9 및 BMP10 둘 다에 공통인 면역원)을 사용함으로써, 항-단백질/항-펩티드 항혈청 또는 모노클로날 항체를 표준 프로토콜에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)] 참조). 도 19에 도시된 바와 같이, BMP9 및 BMP10은 상당한 아미노산 동일성을 가지고 있고, 따라서 각 단백질은 BMP9 및 BMP10 둘 다와 교차반응할 수 있는 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 고도로 유사한 서열의 단편이 또한 면역원으로서 사용될 수 있다. 마우스, 햄스터 또는 토끼와 같은 포유동물은 면역원성 형태의 펩티드 (예를 들어, 항체 반응을 유발시킬 수 있는 ALK1 폴리펩티드 또는 항원 단편, 또는 융합 단백질)로 면역화될 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 면역원성을 부여하는 기술은 담체에 대한 접합 또는 당업계에 널리 공지된 다른 기술을 포함한다. ALK1 폴리펩티드의 면역원성 부분 (바람직하게는 세포외 부분) 또는 ALK1 리간드, 예컨대 BMP9 또는 BMP10은 아주반트(adjuvant)의 존재 하에 투여될 수 있다. 면역화의 진행은 혈장 또는 혈청 내에서 항체 역가의 검출에 의해 모니터링될 수 있다. 항체의 수준을 평가하기 위해 항원으로서의 면역원에 대해 표준 ELISA 또는 다른 면역검정이 사용될 수 있다.
ALK1 폴리펩티드 또는 리간드 폴리펩티드 (예를 들어, BMP9 또는 BMP10)의 항원 제제로 동물을 면역화한 후, 항-ALK1 또는 항-리간드 항혈청을 얻을 수 있고, 원하는 경우에, 혈청으로부터 폴리클로날 항체를 단리할 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위해, 항체-생산 세포 (림프구)를 면역화된 동물로부터 수거하고, 표준 체세포 융합 절차에 의해 불멸화 세포, 예컨대 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 얻을 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 하이브리도마 기술 (문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 1975;256: 495-497]에서 처음 개발됨), 인간 B 세포 하이브리도마 기술 (문헌 [Kozbar et al ., Immunology Today, (1983;4:72)], 및 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술 (문헌 [Cole et al ., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96])을 포함한다. 하이브리도마 세포는 본 개시내용의 포유동물 ALK1 폴리펩티드 또는 BMP9 또는 BMP10과 같은 리간드와 특이적으로 반응성인 항체의 생산에 대해 면역화학적으로 스크리닝될 수 있고, 모노클로날 항체를 상기 하이브리도마 세포를 포함하는 배양물로부터 단리할 수 있다. BMP9 및 BMP10 둘 다에 대한 특이성을 갖는 항체는 BMP9 또는 BMP10 단독으로 접종된 동물로부터 수득된 하이브리도마로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 용어 항체는 또한, 대상 ALK1 폴리펩티드 또는 ALK1 리간드 폴리펩티드 중 하나 또는 표적 항원의 조합 (예를 들어, BMP9 및 BMP10)과 특이적으로 반응성인 그의 단편을 포함하도록 의도된다. 항체는 통상적인 기술을 사용하여 단편화될 수 있고, 단편은 전체 항체에 대하여 상기한 바와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, F(ab)2 단편은 항체를 펩신으로 처리하여 생성될 수 있다. 생성된 F(ab)2 단편은 Fab 단편을 생산하기 위해 디술피드 가교를 환원시키도록 처리될 수 있다. 본 개시내용의 항체는 항체의 적어도 하나의 CDR 영역에 의해 부여된 ALK1 폴리펩티드에 대한 친화도를 갖는 이중특이적, 단일 쇄, 및 키메라 및 인간화 분자를 포함하는 것으로 추가로 의도된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 그에 부착된 표지를 추가로 포함하고 검출될 수 있다 (예를 들어, 표지는 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자일 수 있음).
특정 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 재조합 항체, 특히 인간화 모노클로날 항체 또는 완전 인간 재조합 항체이다.
항체에 관하여 사용될 때 형용사 "~와 특이적으로 반응성인"은 당업계에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, 항체가 최소한 특정 유형의 생물학적 샘플 내에서 관심 항원의 존재를 검출하는데 유용하도록, 항체가 관심 항원 (예를 들어 ALK1 폴리펩티드 또는 ALK1 리간드)과 관심없는 다른 항원 사이에서 충분히 선택적임을 의미하는 것으로 의도된다. 항체를 이용하는 특정 방법에서, 보다 높은 정도의 결합 특이성이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 관심없는 하나 이상의 매우 높은 풍부도 단백질의 존재 하에 관심있는 낮은 풍부도 단백질을 검출하는데 사용하기 위한 항체는 관심 항원과 다른 교차-반응물 사이에서 보다 높은 정도의 선택성을 갖는다면 더 잘 작용할 수 있다. 모노클로날 항체는 일반적으로 목적하는 항원과 교차-반응성 폴리펩티드 사이를 효과적으로 식별하는 경향이 더 크다 (폴리클로날 항체에 비해). 또한, 한 유형의 생물학적 샘플 (예를 들어 대변 샘플)에서 관심 항원을 선택적으로 확인하는데 효과적인 항체는 상이한 유형의 생물학적 샘플 (예를 들어 혈액 샘플)에서 동일한 항원을 선택적으로 확인하는 것만큼 효과적이지 않을 수 있다. 마찬가지로, 다른 생물학적 오염물이 없는 정제된 단백질 제제에서 관심 항원을 확인하는데 효과적인 항체는 조 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 또는 요 샘플에서 관심 항원을 확인하는 것만큼 효과적이지 않을 수 있다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 출원은 항체의 사용을 위해 선택된 샘플 유형일 수 있는 샘플 유형에서 관심 항원에 대한 특이성이 입증된 항체를 제공한다.
항체:항원 상호작용의 특이성에 영향을 미치는 하나의 특징은 항원에 대한 항체의 친화도이다. 목적하는 특이성은 다양한 친화도의 범위로 도달될 수 있지만, 일반적으로 바람직한 항체는 친화도 (해리 상수)가 약 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 이하일 것이다. ALK1에 대한 TGFβ의 명백하게 낮은 결합 친화도를 고려해 볼 때, 많은 항-ALK1 항체가 TGFβ 결합을 억제할 것으로 예상된다. 그러나, GDF5, 6, 7 군의 리간드는 대략 5 x 10-8 M의 KD로 결합하고, BMP9, 10 리간드는 대략 1 x 10-10 M의 KD로 결합한다. 따라서, 이들 리간드의 신호전달 활성을 저해하도록 적절한 친화도의 항체가 선택될 수 있다.
또한, 바람직한 항체를 확인하도록 항체를 스크리닝하기 위해 사용되는 기술은 얻어진 항체의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 특정 치료 목적에 사용될 항체는 바람직하게는 특정 세포 유형을 표적화할 수 있을 것이다. 따라서, 이러한 유형의 항체를 얻기 위해, 관심 항원을 발현하는 세포에 결합하는 항체에 대해 스크리닝하는 것이 바람직할 수 있다 (예를 들어 형광 활성화된 세포 분류에 의해). 마찬가지로, 항체가 용액에서 항원과 결합하도록 사용되어야 한다면, 용액 결합을 시험하는 것이 바람직할 수 있다. 특히 바람직한 항체를 확인하기 위해 항체:항원 상호작용을 시험하기 위한 다양한 상이한 기술이 이용가능하다. 이러한 기술은 ELISA, 표면 플라즈몬 공명 결합 검정 (예를 들어, 비아코어 결합 검정, 비아-코어 아베(Bia-core AB), 스웨덴 웁살라 소재), 샌드위치 검정 (예를 들어, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 아이젠 인터내셔날, 인크.(IGEN International, Inc.)의 상자성 비드 시스템), 웨스턴 블롯(western blot), 면역침전 검정 및 면역조직화학을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는 인간 BMP9의 성숙 부분에 결합하는 항체이며, 그의 아미노산 서열은 아래에 나타낸다:
Figure pct00002
(서열 12)
추가 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는 인간 BMP10의 성숙 부분에 결합하는 항체이며, 그의 아미노산 서열은 아래에 나타낸다:
Figure pct00003
(서열 13)
추가로, BMP9 또는 BMP10에 결합하는 비-항체 단백질은 라이브러리로부터의 선택에 의해 생성될 수 있다. 매우 다양한 기술이 특정 리간드에 결합하는 랜덤 펩티드 및 프레임워크 기반 단백질을 선택하기 위해 이용가능하다. 일반적으로, 유용한 비-항체 단백질을 확인하는 것에 대한 접근법은 BMP9 및/또는 BMP10에 결합하거나 BMP9 또는 BMP10 활성, 예컨대 수용체 (예를 들어, ALK1) 결합 또는 세포 신호전달 (예를 들어, SMAD 1/5 신호전달)을 억제하는 비-항체 단백질을 라이브러리로부터 스크리닝 또는 선택하는 것을 포함할 것이다.
5. 항체 및 Fc-융합 단백질에서의 변경
본 출원은 조작된 또는 변이체 Fc 영역을 함유하는 항체 및 ALK1-Fc 융합 단백질을 추가로 제공한다. 이러한 항체 및 Fc 융합 단백질은, 예를 들어 이펙터 기능, 예컨대 항원-의존성 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 조절하는데 유용할 수 있다. 추가로, 변형은 항체 및 Fc 융합 단백질의 안정성을 개선할 수 있다. 항체 및 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 DNA 내로 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변이체는, 예를 들어 본원에 개시된 항체 및 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 바람직한 특징을 갖는다는 조건 하에 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어져 최종 구축물에 도달된다. 아미노산 변화는 또한 항체 및 Fc 융합 단백질의 번역후 과정을 변경시킬 수 있으며, 예컨대 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체 및 Fc 융합 단백질은 WO 94/28027 및 WO 98/47531 (Bluestone et al.); 또한 문헌 [Xu et al ., 2000 Cell Immunol 200; 16-26]에 기재된 Ala-Ala 돌연변이를 포함하나 이에 제한되지 않는 변화를 아미노산 서열에 도입함으로써 생산될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, Ala-Ala 돌연변이를 포함하는 불변 영역 내의 돌연변이를 함유하는 본 개시내용의 항체 및 Fc 융합 단백질은 이펙터 기능을 감소 또는 폐지하기 위해 사용될 수 있다. 이들 실시양태에 따라, 항체 및 Fc 융합 단백질은 위치 234에서 알라닌에 대한 돌연변이 또는 위치 235에서 알라닌에 대한 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 또는 Fc 융합 단백질은 IgG4 프레임워크를 포함하고, 여기서 Ala-Ala 돌연변이는 위치 234에서 페닐알라닌으로부터 알라닌으로의 돌연변이(들) 및/또는 위치 235에서 류신으로부터 알라닌으로의 돌연변이를 설명할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 Fc 융합 단백질은 IgG1 프레임워크를 포함하고, 여기서 Ala-Ala 돌연변이는 위치 234에서 류신으로부터 알라닌으로의 돌연변이(들) 및/또는 위치 235에서 류신으로부터 알라닌으로의 돌연변이를 설명할 것이다. 항체 또는 Fc 융합 단백질은 다르게는 또는 추가로 CH2 도메인에서 점 돌연변이 K322A를 포함한 다른 돌연변이를 보유할 수 있다 (문헌 [Hezareh et al ., 2001; J. Virol. 75: 12161-8]).
특정 실시양태에서, 항체 또는 Fc 융합 단백질은 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 증진시키거나 억제하기 위해 변형된다. 조절된 CDC 활성은 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 도입함으로써 달성될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,194,551 참조). 대안적으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내에 도입하여, 이 영역 내에서의 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 개선되거나 감소된 내재화 능력 및/또는 증가되거나 감소된 보체-매개된 세포 치사성을 가질 것이다 (문헌 [Caron et al .; J. Exp Med. 1992; 176:1191-1195] 및 [Shopes, B. (1992); J. Immunol. 148:2918-2922], WO 99/51642, [Duncan & Winter Natureb, 1988; 322: 738-40]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351 참조).
6. 신세포 암종을 치료하고, 혈관신생을 조절하고, 다른 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물
본 개시내용은 포유동물에게 유효량의 ALK1 ECD 폴리펩티드, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질, 또는 본원에 개시된 바와 같은 항체, 예컨대 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9, BMP10 또는 ALK1의 ECD에 대한 항체, 또는 임의의 상기한 것의 핵산 길항제 (예를 들어, 안티센스 또는 siRNA) (이하에서 종합적으로 "치료제" 또는 "ALK1 길항제(들)"로서 칭함)를 투여함으로써, 포유동물에서 신세포 암종을 치료하는 방법을 제공한다. 이들 치료제는 단일 작용제로서, 또는 다른 RCC 치료제와 조합하여 신세포 암종을 치료하는데 유용하다.
특히, 본 개시내용의 폴리펩티드 치료제는 그들을 RCC 치료의 치료제로서 특히 매력적이게 하는 여러 특성을 갖는다. 예를 들어, 대부분의 생물학적 작용제와는 달리, ALK1 ECD 폴리펩티드는 종양 성장, 증식 및 종양 혈관신생을 촉진하고 지속시키는 다수의 인자를 조절함으로써 신세포 성장에 영향을 미친다. 이는 암과 고도로 관련되고, 여기서 암은 종종, 예를 들어 종양 성장, 증식, 혈관신생 및 전이를 유도하는 다수의 개개 신호전달 경로와 연관된 돌연변이를 가지게 될 것이다. 따라서, 본원에 개시된 치료제는 단일 혈관신생 인자를 표적으로 하는 약물 (예를 들어, VEGF를 표적으로 하는 베바시주맙)을 이용한 치료에 대해 내성인 종양, 예컨대 신세포 암종을 치료하는데 특히 효과적이며, 동시에 활성화된 내피 세포 상에 선택적으로 발현되고 종양 혈관신생 및 세포 증식을 유도하는 다수의 인자, 예컨대 BMP9, VEGF 및 FGF에 대한 상기 세포의 반응을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 하는 것처럼 보이는 ALK1의 활성에 대한 길항작용 잠재력을 제공한다.
본원에서 입증된 바와 같이, ALK1-Fc 융합 단백질은 인간 RCC 이종이식편 모델에서 생체내 종양의 종양 성장을 감소시키는데 효과적이다. 따라서, 본원에 개시된 ALK1 ECD 폴리펩티드, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질 및 다른 치료제는 신세포 암종을 치료하기 위한 독립형(stand-alone) (즉, 단일 작용제) 요법에 유용한 것으로 예상된다. 또한, 본원에 추가로 개시된 바와 같이, ALK1-Fc 융합 단백질은 시험된 각각의 인간 RCC 이종이식편 모델에서 진행성 RCC에 대한 현재 표준 치료제인 수니티닙의 종양 성장 억제 활성을 유의하게 증가시킨다. 따라서, 본원에 개시된 ALK1 ECD 폴리펩티드, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질 및 다른 치료제는 신세포 암종을 치료하기 위한 다른 작용제, 예컨대 수용체 티로신 키나제 억제제와의 조합 요법에 유용한 것으로 예상된다.
본원에 사용된 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 포유동물 (예를 들어, 인간), 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 외인성 치료제, 진단제 또는 조성물을 접촉시키거나 투여하는 것을 지칭하고, 예를 들어 치료, 약동학, 진단, 연구 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. "치료하는" 또는 "치료"는 증상, 합병증, 또는 질환, 상태 또는 장애의 생화학적 적응증의 개시를 방지 또는 지연시키거나, 증상을 완화하거나, 질환, 상태 또는 장애의 추가 발달을 정지 또는 억제하기 위해 ALK1 ECD 폴리펩티드, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질 또는 다른 ALK 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 치료는 예방적 (질환의 개시를 방지 또는 지연시키거나, 임상 또는 그의 준임상적 증상의 징후를 방지하는 것) 또는 질환, 상태 또는 장애의 징후 후 증상의 치료적 억제 또는 완화일 수 있다. 치료는 ALK1 ECD 폴리펩티드 (예를 들어, ALK1-Fc 융합 단백질) 또는 다른 ALK1 길항제 단독으로, 또는 하나 이상의 추가의 치료제와 조합하여 이루어질 수 있다. 본원에 사용된 용어 "포유동물" 또는 "대상체"는 포유류의 동물 (비-영장류, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 소, 개, 고양이, 래트 및 마우스를 포함하나 이에 제한되지 않음), 보다 구체적으로 영장류 (원숭이, 유인원 및 인간을 포함하나 이에 제한되지 않음) 및 보다 더 구체적으로 인간을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "유효한 양" 또는 "유효량" (예를 들어, 치료하기 위한 것 등)은, 치료된 대상체 또는 집단에서 목적하는 효과를 달성하기에, 예컨대 하나 이상의 질환 증상 또는 효과를 완화시키기에 (임의의 임상적으로 측정가능한 정도로 상기 증상(들) 또는 효과의 퇴행을 유도함에 의하던지 그의 진행을 억제함에 의하던지) 충분한 치료제, 예를 들어 ALK1-Fc 융합 단백질과 같은 ALK1 ECD 폴리펩티드의 양을 의미한다. 임의의 특정 질환 증상 또는 효과를 완화시키는데 유효한 치료제의 양 (또한 "치료 유효량"으로도 언급됨) 또는 특정 질환 증상 또는 효과를 예방하는데 유효한 치료제의 양 (또한 "예방 유효량"으로도 언급됨)은 환자의 질환 상태, 연령 및 체중, 및 환자에서 요구되는 반응을 유도하는 약물의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 질환 증상 또는 효과의 완화 여부는 그 증상 또는 효과의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 (예를 들어, 의료인 또는 임상의에 의해) 전형적으로 사용되는 임의의 임상 척도에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "두문자어 "RTKI"은 VEGFR1, VEGFR2 또는 VEGFR3에 결합하여 그의 신호전달을 억제하는 소분자 수용체 티로신 키나제 억제제를 의미한다. RTKI은 VEGFR, 예컨대 PDGFRa, PDGFRb, RET 및 c-Met 이외에 수용체 티로신 키나제에 결합하여 그를 억제할 수 있다. 마찬가지로, RTKI는 여러 부류의 키나제 및 세포 표면 수용체가 아닌 키나제, 예컨대 세린 키나제 B-raf 키나제 및 c-raf 키나제를 억제할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 신세포 암종 (RCC)을 갖는 포유동물에게 유효량의 RTKI 및 ALK1 ECD 폴리펩티드, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질 또는 본원에 개시된 다른 ALK 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, ALK 길항제는 (a) ALK1의 세포외 도메인의 리간드 결합 부분을 포함하는 ALK1 폴리펩티드; (b) 인간 ALK1의 세포외 도메인에 결합하는 항체; (c) 인간 BMP9에 결합하는 항체; 및 (d) 인간 BMP10에 결합하는 항체로부터 선택되는 작용제이다. 일부 측면에서, 상기 방법에 따라 사용된 ALK1 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 22-120의 서열에 대해 적어도 90％ 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 추가로 이뮤노글로불린의 불변 도메인을 포함한다. 추가 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 추가로 이뮤노글로불린의 Fc 부분을 포함하고, 추가 측면에서, Fc 부분은 인간 IgG1의 Fc 부분이다. 다른 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 서열 3 또는 서열 14의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 신세포 암종 (RCC)을 가지고 있으며 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받은 포유동물에서 신세포 암종을 치료하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 의료 절차는 네프론-보존술, 신절제술, 완전 신절제술 및 조직 절제로부터 선택된다. 추가 측면에서, 치료는 의료 절차 후 1, 2, 3, 4, 5, 6일 또는 1개월 이내에 포유동물에게 투여된다.
일부 측면에서, 항체는 서열 1의 아미노산 22-118의 서열 내 에피토프에 결합하여 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로부터 선택된 리간드의 결합을 억제한다. 추가 측면에서, 항체는 서열 12의 아미노산 1-111의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP9의 결합을 억제한다. 추가 측면에서, 항체는 서열 13의 아미노산 1-108의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP10의 결합을 억제한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 방법에 따라 사용된 RTKI는 수니티닙이다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 따라 사용된 RTKI는 수니티닙이 아니다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 방법에 따라 사용된 RTKI는 소라페닙이다. 추가 측면에서, RTKI는 파조파닙이다. 추가 측면에서, RTKI는 악시티닙이다. 또 다른 측면에서, RTKI는 티보자닙 또는 반데타닙이다. 추가 측면에서, 상기 방법에 따라 사용된 RTKI는 모테사닙 (AMG-706), 바탈라닙 (PTK787/ZK), 사막사닙 (SU5416), SU6668, AZD2171, XL184, XL880/GSK1363089, PF-2351066, MGCD265, ZD6474, AEE788, AG-013736, AG-013737, GW786034 및 ABT-869로부터 선택되는 작용제이다. 추가 측면에서, 제약 제제는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 또는 WO 98/13354에 개시된 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제 작용제를 포함한다. 추가 측면에서, 본 개시내용은 신세포 암종 (RCC)을 갖는 포유동물에게 유효량의 (1) RTKI; (2) ALK1 ECD 폴리펩티드, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질 또는 개시된 다른 ALK 길항제; 및 (3) 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR)-표적화 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "mTOR-표적화 억제제"는 AKT/mTOR 신호전달 경로에 결합하여 그의 신호전달을 억제하는 소분자 억제제를 의미한다. mTOR-표적화 억제제, 및 본 개시내용의 방법에 따라 사용될 수 있는 mTOR-표적화 억제제를 확인하기 위한 검정은 당업계에 공지되어 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 방법에 따라 사용되는 mTOR 억제제는 에베롤리무스이다. 다른 측면에서, mTOR 억제제는 템시롤리무스이다. 추가 측면에서, mTOR 억제제는 WYE354, YE132 (화이자), PP30 및 PP242, AZD8055, OSI-027, 토린1, BEZ235, XL765, GDC-0980, PF-04691502 및 PF-05212384로부터 선택되는 작용제이다.
추가 측면에서, 본 개시내용의 방법에 따라 치료된 신세포 암종 (RCC)은 투명 세포 신세포 암종이다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 다른 측면에서, RCC는 신동을 침습하였다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
따라서, 한 측면에 따르면, 본 개시내용은 전이성 신세포 암종 (RCC)을 갖는 포유동물에게 유효량의 RTKI 및 ALK1 ECD 폴리펩티드, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질 또는 본원에 개시된 다른 ALK 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 전이성 RCC를 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 개시내용은 신세포 암종 (RCC)을 가지고 있으며 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받은 포유동물에서 신세포 암종을 치료하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 의료 절차는 네프론-보존술, 신절제술, 완전 신절제술 및 조직 절제로부터 선택된다. 추가 측면에서, 치료는 의료 절차 후 1, 2, 3, 4, 5, 6일 또는 1개월 이내에 포유동물에게 투여된다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 RCC 치료제를 이용한 선행 치료를 받은 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 추가 측면에서, 본 개시내용은 이전에 RCC 치료제를 투여받은 포유동물에게 유효량의 (a) ALK1의 세포외 도메인의 리간드 결합 부분을 포함하는 ALK1 폴리펩티드; (b) 인간 ALK1의 세포외 도메인에 결합하는 항체; (c) 인간 BMP9에 결합하는 항체; 및 (d) 인간 BMP10에 결합하는 항체로부터 선택된 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 신세포 암종을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법에 따라 사용된 ALK1 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 22-120의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 추가로 이뮤노글로불린의 불변 도메인을 포함한다. 추가 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 추가로 이뮤노글로불린의 Fc 부분을 포함하고, 추가 측면에서, Fc 부분은 인간 IgG1의 Fc 부분이다. 다른 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 서열 3 또는 서열 14의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 방법에 따라 사용된 항체는 서열 1의 아미노산 22-118의 서열 내 에피토프에 결합하여 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로부터 선택된 리간드의 결합을 억제한다. 추가 측면에서, 항체는 서열 12의 아미노산 1-111의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP9의 결합을 억제한다. 추가 측면에서, 항체는 서열 13의 아미노산 1-108의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP10의 결합을 억제한다.
한 측면에서, 이전에 투여받은 RCC 치료제는 RTKI이다. 추가 측면에서, RTKI는 수니티닙, 소라페닙, 파조파닙, 악시티닙, 티보자닙 및 반데타닙으로부터 선택되는 작용제이다. 또 다른 측면에서, 이전에 투여받은 RCC 치료제는 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR)-표적화 억제제이다. 추가 측면에서, mTOR-표적화 억제제는 에베롤리무스 및 템시롤리무스로부터 선택되는 작용제이다. 다른 측면에서, mTOR 억제제는 WYE354, YE132 (화이자), PP30 및 PP242, AZD8055, OSI-027, 토린1, BEZ235, XL765, GDC-0980, PF-04691502 및 PF-05212384로부터 선택되는 작용제이다.
추가 측면에서, 이전에 투여받은 RCC 치료제는 전신 시토카인 요법제이다. 추가 측면에서, 이전에 투여받은 RCC 치료제는 인터페론 알파 (IFN-α) 또는 인터류킨-2 (IL-2)이다.
일부 측면에서, RCC 치료제를 이용한 선행 치료를 받은 포유동물을 치료하는 방법에 따라 사용된 RTKI는 수니티닙이다.
다른 실시양태에서, RCC 치료제를 이용한 선행 치료를 받은 포유동물을 치료하는 방법에 따라 사용된 RTKI는 수니티닙이 아니다.
일부 측면에서, RCC 치료제를 이용한 선행 치료를 받은 포유동물을 치료하는 방법에 따라 사용된 RTKI는 소라페닙이다. 추가 측면에서, RTKI는 파조파닙이다. 추가 측면에서, RTKI는 악시티닙이다. 또 다른 실시양태에서, RTKI는 티보자닙 또는 반데타닙이다. 추가 측면에서, 상기 방법에 따라 사용된 RTKI는 모테사닙 (AMG-706), 바탈라닙 (PTK787/ZK), 사막사닙 (SU5416), SU6668, AZD2171, XL184, XL880/GSK1363089, PF-2351066, MGCD265, ZD6474, AEE788, AG-013736, AG-013737, GW786034 및 ABT-869로부터 선택되는 작용제이다. 추가 측면에서, 제약 제제는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 또는 WO 98/13354에 개시된 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제 작용제를 포함한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 이전에 신세포 암종 (RCC) 치료제를 투여받은 포유동물에게 유효량의 (1) RTKI, (2) ALK1 ECD 폴리펩티드, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질 또는 개시된 다른 ALK 길항제, 및 (3) 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR)-표적화 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법에 관한 것이다. mTOR-표적화 억제제, 및 본 개시내용의 방법에 따라 사용될 수 있는 mTOR-표적화 억제제를 확인하기 위한 검정은 당업계에 공지되어 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 방법에 따라 사용된 mTOR 억제제는 에베롤리무스이다. 다른 측면에서, mTOR 억제제는 템시롤리무스이다. 다른 측면에서, mTOR 억제제는 WYE354, YE132 (화이자), PP30 및 PP242, AZD8055, OSI-027, 토린1, BEZ235, XL765, GDC-0980, PF-04691502 및 PF-05212384로부터 선택되는 작용제이다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 이전에 신세포 암종 (RCC) 치료제를 투여받은 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 본 개시내용의 방법에 따라 치료된 신세포 암종 (RCC)은 투명 세포 신세포 암종이다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 다른 측면에서, RCC는 신동을 침습하였다. 추가 측면에서, RCC는 전이성 신세포 암종이다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 RCC를 가지고 있으며 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받을 준비중인 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 개시내용은 RCC를 가지고 있으며 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받을 준비중인 포유동물에게 유효량의 (a) ALK1의 세포외 도메인의 리간드 결합 부분을 포함하는 ALK1 폴리펩티드; (b) 인간 ALK1의 세포외 도메인에 결합하는 항체; (c) 인간 BMP9에 결합하는 항체; 및 (d) 인간 BMP10에 결합하는 항체로부터 선택된 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 신세포 암종을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법에 따라 사용된 ALK1 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 22-120의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 추가로 이뮤노글로불린의 불변 도메인을 포함한다. 추가 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 추가로 이뮤노글로불린의 Fc 부분을 포함하고, 추가 측면에서, Fc 부분은 인간 IgG1의 Fc 부분이다. 다른 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 서열 3 또는 서열 14의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 작용제는 의료 절차의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 전에 투여된다. 또 다른 측면에서, 포유동물은 수술 전에 작용제를 이용하여 일련의 적어도 1, 2, 3 또는 4회의 치료를 받았다. 또 다른 측면에서, 작용제는 네프론-보존술, 신절제술, 완전 신절제술 및 조직 절제로부터 선택되는 의로 절차 전에 투여된다.
일부 실시양태에서, 항체는 RCC를 가지고 있으며 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받을 준비중인 포유동물을 치료하기 위해 투여된다. 추가 실시양태에서, 투여된 항체는 서열 1의 아미노산 22-118의 서열 내 에피토프에 결합하여 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로부터 선택된 리간드의 결합을 억제한다. 추가 측면에서, 항체는 서열 12의 아미노산 1-111의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP9의 결합을 억제한다. 추가 측면에서, 항체는 서열 13의 아미노산 1-108의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP10의 결합을 억제한다.
일부 측면에서, RTKI는 의료 절차를 받기 전에 포유동물을 치료하기 위해 본원에 개시된 ALK-1 길항제와 함께 투여된다. 일부 측면에서, RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받기 전에 포유동물을 치료하는 방법에 따라 사용된 RTKI는 수니티닙이다. 다른 실시양태에서, RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받기 전에 포유동물을 치료하는 방법에 따라 사용된 RTKI는 수니티닙이 아니다.
일부 측면에서, RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받기 전에 포유동물을 치료하는 방법에 따라 사용된 RTKI는 소라페닙이다. 추가 측면에서, RTKI는 파조파닙이다. 추가 측면에서, RTKI는 악시티닙이다. 또 다른 실시양태에서, RTKI는 티보자닙 또는 반데타닙이다. 추가 측면에서, 상기 방법에 따라 사용된 RTKI는 모테사닙 (AMG-706), 바탈라닙 (PTK787/ZK), 사막사닙 (SU5416), SU6668, AZD2171, XL184, XL880/GSK1363089, PF-2351066, MGCD265, ZD6474, AEE788, AG-013736, AG-013737, GW786034 및 ABT-869로부터 선택되는 작용제이다. 추가 측면에서, 작용제는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 또는 WO 98/13354에 개시된 RTKI를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 RCC를 가지고 있으며 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받을 준비중인 포유동물에게 유효량의 (1) RTKI, (2) ALK1 ECD 폴리펩티드, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질 또는 개시된 다른 ALK 길항제, 및 (3) 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR)-표적화 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명의 방법에 따라 사용된 mTOR 억제제는 에베롤리무스이다. 다른 측면에서, mTOR 억제제는 템시롤리무스이다. 다른 측면에서, mTOR 억제제는 WYE354, YE132 (화이자), PP30 및 PP242, AZD8055, OSI-027, 토린1, BEZ235, XL765, GDC-0980, PF-04691502 및 PF-05212384로부터 선택되는 작용제이다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 신세포 암종 (RCC)을 치료하기 위한 의료 절차를 받기 전에 RCC를 갖는 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 신세포 암종 (RCC)은 투명 세포 신세포 암종이다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 다른 측면에서, RCC는 신동을 침습하였다. 추가 측면에서, RCC는 전이성 신세포 암종이다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 RCC를 가지고 있으며 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받은 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 개시내용은 RCC를 가지고 있으며 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받은 포유동물에게 유효량의 (a) ALK1의 세포외 도메인의 리간드 결합 부분을 포함하는 ALK1 폴리펩티드; (b) 인간 ALK1의 세포외 도메인에 결합하는 항체; (c) 인간 BMP9에 결합하는 항체; 및 (d) 인간 BMP10에 결합하는 항체로부터 선택된 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 신세포 암종을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법에 따라 사용된 ALK1 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 22-120의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 추가로 이뮤노글로불린의 불변 도메인을 포함한다. 추가 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 추가로 이뮤노글로불린의 Fc 부분을 포함하고, 추가 측면에서, Fc 부분은 인간 IgG1의 Fc 부분이다. 다른 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 서열 3 또는 서열 14의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 작용제는 의료 절차 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일에 투여된다. 또 다른 측면에서, 작용제는 의료 절차의 1주, 1개월 또는 3개월 이내에 투여된다. 또 다른 측면에서, 작용제는 의료 절차 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일에 투여된다. 또 다른 측면에서, 포유동물은 수술 후에 작용제를 이용하여 일련의 적어도 1, 2, 3 또는 4회 치료를 받는다. 또 다른 측면에서, 작용제는 네프론-보존술, 신절제술, 완전 신절제술 및 조직 절제로부터 선택되는 의료 절차 후에 투여된다
일부 실시양태에서, 항체는 RCC를 가지고 있으며 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받은 포유동물을 치료하기 위해 투여된다. 일부 측면에서, 항체는 서열 1의 아미노산 22-118의 서열 내 에피토프에 결합하여 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로부터 선택된 리간드의 결합을 억제한다. 추가 측면에서, 항체는 서열 12의 아미노산 1-111의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP9의 결합을 억제한다. 추가 측면에서, 항체는 서열 13의 아미노산 1-108의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP10의 결합을 억제한다.
일부 측면에서, RTKI는 RCC를 가지고 있으며 RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받은 포유동물을 치료하기 위해 본원에 개시된 ALK-1 길항제와 함께 투여된다. 일부 측면에서, 의료 절차를 받은 후의 포유동물을 치료하는 방법에 따라 사용된 RTKI는 수니티닙이다. 다른 실시양태에서, RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받은 후의 포유동물을 치료하는 방법에 따라 사용된 RTKI는 수니티닙이 아니다. 일부 측면에서, RCC를 치료하기 위한 의료 절차를 받은 후의 포유동물을 치료하는 방법에 따라 사용된 RTKI는 소라페닙이다. 추가 측면에서, RTKI는 파조파닙이다. 추가 측면에서, RTKI는 악시티닙이다. 또 다른 실시양태에서, RTKI는 티보자닙 또는 반데타닙이다. 추가 측면에서, 상기 방법에 따라 사용된 RTKI는 모테사닙 (AMG-706), 바탈라닙 (PTK787/ZK), 사막사닙 (SU5416), SU6668, AZD2171, XL184, XL880/GSK1363089, PF-2351066, MGCD265, ZD6474, AEE788, AG-013736, AG-013737, GW786034 및 ABT-869로부터 선택되는 작용제이다. 추가 측면에서, 작용제는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 또는 WO 98/13354에 개시된 RTKI를 포함한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 신세포 암종 (RCC)을 치료하기 위한 의료 절차를 받은 후의 포유동물에게 유효량의 (1) RTKI, (2) ALK1 ECD 폴리펩티드, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질 또는 개시된 다른 ALK 길항제, 및 (3) 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR)-표적화 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명의 방법에 따라 사용된 mTOR 억제제는 에베롤리무스이다. 다른 측면에서, mTOR 억제제는 템시롤리무스이다. 다른 측면에서, mTOR 억제제는 WYE354, YE132 (화이자), PP30 및 PP242, AZD8055, OSI-027, 토린1, BEZ235, XL765, GDC-0980, PF-04691502 및 PF-05212384로부터 선택되는 작용제이다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 신세포 암종 (RCC)을 치료하기 위한 의료 절차를 받은 후의 RCC를 갖는 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 신세포 암종 (RCC)은 투명 세포 신세포 암종이다. 일부 측면에서, RCC는 TNM 병기 III 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 TNM 병기 IV 질환이다. 추가 측면에서, RCC는 신내 정맥 내에서 발견된다. 다른 측면에서, RCC는 신동을 침습하였다. 추가 측면에서, RCC는 전이성 신세포 암종이다. 추가 측면에서, RCC는 부신 또는 림프절로 전이되었다. 추가 측면에서, RCC는 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이되었다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 전이성 RCC를 갖는 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 개시내용은 전이성 RCC를 갖는 포유동물에게 유효량의 (a) ALK1의 세포외 도메인의 리간드 결합 부분을 포함하는 ALK1 폴리펩티드; (b) 인간 ALK1의 세포외 도메인에 결합하는 항체; (c) 인간 BMP9에 결합하는 항체; 및 (d) 인간 BMP10에 결합하는 항체로부터 선택된 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 전이성 RCC를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법에 따라 사용된 ALK1 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 22-120의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 추가로 이뮤노글로불린의 불변 도메인을 포함한다. 추가 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 추가로 이뮤노글로불린의 Fc 부분을 포함하고, 추가 측면에서, Fc 부분은 인간 IgG1의 Fc 부분이다. 다른 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 서열 3 또는 서열 14의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 전이성 RCC를 갖는 포유동물을 치료하기 위해 투여된다. 추가 실시양태에서, 투여된 항체는 서열 1의 아미노산 22-118의 서열 내 에피토프에 결합하여 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로부터 선택된 리간드의 결합을 억제한다. 추가 측면에서, 항체는 서열 12의 아미노산 1-111의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP9의 결합을 억제한다. 추가 측면에서, 항체는 서열 13의 아미노산 1-108의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP10의 결합을 억제한다.
한 측면에 따르면, 본 개시내용은 전이성 신세포 암종 (RCC)을 갖는 포유동물에게 유효량의 RTKI 및 ALK1 ECD 폴리펩티드, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질 또는 본원에 개시된 다른 ALK 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 전이성 신세포 암종 (RCC)을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, RTKI는 수니티닙이다. 다른 실시양태에서, RTKI는 수니티닙이 아니다. 일부 측면에서, RTKI는 소라페닙이다. 추가 측면에서, RTKI는 파조파닙이다. 추가 측면에서, RTKI는 악시티닙이다. 또 다른 실시양태에서, RTKI는 티보자닙 또는 반데타닙이다. 추가 측면에서, RTKI는 모테사닙 (AMG-706), 바탈라닙 (PTK787/ZK), 사막사닙 (SU5416), SU6668, AZD2171, XL184, XL880/GSK1363089, PF-2351066, MGCD265, ZD6474, AEE788, AG-013736, AG-013737, GW786034 및 ABT-869로부터 선택되는 작용제이다. 추가 측면에서, 작용제는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 또는 WO 98/13354에 개시된 RTKI를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 전이성 RCC를 갖는 포유동물에게 유효량의 (1) RTKI, (2) ALK1 ECD 폴리펩티드, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질 또는 개시된 다른 ALK 길항제, 및 (3) 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR)-표적화 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명의 방법에 따라 사용된 mTOR 억제제는 에베롤리무스이다. 다른 측면에서, mTOR 억제제는 템시롤리무스이다. 다른 측면에서, mTOR 억제제는 WYE354, YE132 (화이자), PP30 및 PP242, AZD8055, OSI-027, 토린1, BEZ235, XL765, GDC-0980, PF-04691502 및 PF-05212384로부터 선택되는 작용제이다.
본 개시내용은 또한 포유동물에게 유효량의 ALK1 ECD 폴리펩티드, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질, 또는 본원에 개시된 바와 같은 다른 "치료제" 또는 "ALK1 길항제"를 투여함으로써 포유동물에서 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 이들 치료제는 또한 골 및 관절에서 및 종양, 특히 골 및 관절과 연관된 종양에서 혈관신생을 억제하는데 유용할 것으로 예상된다.
혈관신생 연관 질환은 혈관신생-의존성 암, 예를 들어 고형 종양, 혈액 유래 종양, 예컨대 백혈병, 및 종양 전이; 양성 종양, 예를 들어 혈관종, 청신경종, 신경섬유종, 트라코마, 및 화농성 육아종; 류마티스 관절염; 건선; 피부홍조; 오슬러-웨버 증후군(Osler-Webber Syndrome); 심근 혈관신생; 플라크 신생혈관화; 모세혈관확장증; 혈우병 관절; 및 혈관섬유종을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특히, 본 개시내용의 폴리펩티드 치료제는 암 (종양) 및 특히 성장을 지지하기 위해 혈관신생 과정에 의존하는 것으로 공지된 암을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 대부분의 항혈관신생제와는 달리, ALK1 ECD 폴리펩티드는 다수 인자에 의해 자극된 혈관신생에 영향을 미친다. 이는 암에서 고도로 관련되고, 여기서 암은 종종 종양 혈관신생을 지지하는 다수 인자를 획득할 것이다. 따라서, 본원에 개시된 치료제는 단일 혈관신생 인자를 표적으로 하는 약물 (예를 들어, VEGF를 표적으로 하는 베바시주맙)을 이용한 치료에 내성인 종양을 치료하는데 특히 효과적일 것이다. 본원에서 입증된 바와 같이, ALK1-Fc 융합 단백질은 흑색종, 폐암 및 다발성 골수종의 병리학적 효과를 감소시키는데 효과적이다. 다발성 골수종은 상당한 혈관신생 성분을 포함하는 암으로서 널리 인식된다. 따라서, ALK1-Fc 융합 단백질 및 본원에 개시된 다른 치료제는 다발성 골수종 및 골과 연관된 다른 종양을 치료하는데 유용할 것으로 예상된다. 본원에서 입증된 바와 같이, 본원에 개시된 치료제는 다발성 골수종과 연관된 골 손상을 개선하기 위해 사용될 수 있고, 따라서 다른 종양, 예컨대 유방 또는 전립선 종양의 골 전이와 연관된 골 손상을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 나타낸 바와 같이, GDF5-7 리간드는 골에서 고도로 발현되고, 임의의 특정 메카니즘에 제한되기를 바라지 않지만, 이들 리간드를 저해하면 골에서 종양 발생에 요구되는 과정을 파괴할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 혈관신생 억제가 요망되는 상태를 갖는 포유동물에게 유효량의 (a) ALK1의 세포외 도메인의 리간드 결합 부분을 포함하는 ALK1 폴리펩티드; (b) 인간 ALK1의 세포외 도메인에 결합하는 항체; (c) 인간 BMP9에 결합하는 항체; 및 (d) 인간 BMP10에 결합하는 항체로부터 선택된 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 혈관신생을 억제하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 상기 방법에 따라 사용된 ALK1 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 22-120의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 추가로 이뮤노글로불린의 불변 도메인을 포함한다. 추가 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 추가로 이뮤노글로불린의 Fc 부분을 포함하고, 추가 측면에서, Fc 부분은 인간 IgG1의 Fc 부분이다. 다른 측면에서, ALK1 폴리펩티드는 서열 3 또는 서열 14의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 포유동물에서 혈관신생을 억제하기 위해 투여된다. 추가 실시양태에서, 투여된 항체는 서열 1의 아미노산 22-118의 서열 내 에피토프에 결합하여 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로부터 선택된 리간드의 결합을 억제한다. 추가 측면에서, 항체는 서열 12의 아미노산 1-111의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP9의 결합을 억제한다. 추가 측면에서, 항체는 서열 13의 아미노산 1-108의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP10의 결합을 억제한다.
일부 측면에서, RTKI는 포유동물에서 혈관신생을 억제하기 위해 본원에 개시된 ALK-1 길항제와 함께 투여된다. 일부 측면에서, RTKI는 수니티닙이다. 다른 실시양태에서, RTKI는 수니티닙이 아니다. 일부 측면에서, RTKI는 소라페닙이다. 추가 측면에서, RTKI는 파조파닙이다. 추가 측면에서, RTKI는 악시티닙이다. 또 다른 실시양태에서, RTKI는 티보자닙 또는 반데타닙이다. 추가 측면에서, RTKI는 모테사닙 (AMG-706), 바탈라닙 (PTK787/ZK), 사막사닙 (SU5416), SU6668, AZD2171, XL184, XL880/GSK1363089, PF-2351066, MGCD265, ZD6474, AEE788, AG-013736, AG-013737, GW786034 및 ABT-869로부터 선택된다. 추가 측면에서, RTKI는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 또는 WO 98/13354에 개시되어 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 포유동물에게 유효량의 (1) RTKI, (2) ALK1 ECD 폴리펩티드, 예컨대 ALK1-Fc 융합 단백질 또는 개시된 다른 ALK 길항제, 및 (3) 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR)-표적화 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생을 억제하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명의 방법에 따라 사용된 mTOR 억제제는 에베롤리무스이다. 다른 측면에서, mTOR 억제제는 템시롤리무스이다. 다른 측면에서, mTOR 억제제는 WYE354, YE132 (화이자), PP30 및 PP242, AZD8055, OSI-027, 토린1, BEZ235, XL765, GDC-0980, PF-04691502 및 PF-05212384로부터 선택되는 작용제이다.
본 개시내용에 따라, 본원에 기재된 항혈관신생제는 질환의 치료를 위한 다른 조성물 및 절차와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양은 통상적으로 ALK1 또는 ALK1 리간드 길항제와 조합한 수술, 방사선 또는 화학요법으로 치료될 수 있고, 이후 길항제가 미세전이의 휴면을 확장시키고 임의의 잔류 원발성 종양을 안정화하기 위해 환자에게 후속적으로 투여될 수 있다.
혈관신생-억제제는 또한 새로운 암 또는 재발성 암이 발생할 위험이 큰 것으로 공지된 개인에게 예방적으로 제공될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 측면은 대상체에게 유효량의 ALK1 또는 ALK1 리간드 길항제 및/또는 그의 유도체, 또는 본 개시내용의 또 다른 혈관신생-억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암의 예방적 방지를 위한 방법을 포함한다.
본원에서 입증된 바와 같이, ALK1-Fc는 류마티스 관절염의 뮤린 모델의 표현형을 감소시키는데 효과적이다. 따라서, 본원에 개시된 치료제는 류마티스 관절염 및 다른 유형의 골 또는 관절 염증의 치료를 위해 사용될 수 있다.
특정 정상 생리학적 과정, 예를 들어 배란, 월경 및 태반형성이 또한 혈관신생과 연관된다. 본 개시내용의 혈관신생 억제 단백질은 내피 세포의 과도하거나 비정상인 자극의 질환의 치료에서 유용하다. 이들 질환은 장 유착, 아테롬성동맥경화증, 경피증 및 비후성 반흔, 즉, 켈로이드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 또한 병리학적 결과로서 혈관신생이 있는 질환, 예컨대 고양이 긁힘병 (로셀 미날리아 퀸토사(Rochele minalia quintosa)) 및 궤양 (헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori))의 치료에서 유용하다.
일반적 혈관신생 억제 단백질은 배아 착상에 요구되는 자궁 혈관화를 감소 또는 방지함으로써 피임제로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 배아 착상을 방지하기에 충분한 양의 억제 단백질을 여성에게 투여할 때 효과적인 피임 방법을 제공한다. 피임 방법의 한 측면에서, 성교 및 수정이 일어나기 전 또는 후에 배아 착상을 차단하기에 충분한 양의 억제 단백질이 투여되어, 효과적인 피임 방법, 가능하게는 "사후(morning after)" 방법을 제공한다. 본 기재에 의해 매이기를 원하지 않지만, 자궁 내막의 혈관화의 억제는 배반포의 착상을 저해하는 것으로 생각된다. 자궁관의 점막의 혈관화의 유사한 억제는 배반포의 착상을 저해하여, 난관 임신의 발생을 방지한다. 본 개시내용의 혈관신생 억제제의 투여는 태반의 정상적인 향상된 혈관화, 및 또한 성공적으로 착상된 배반포 및 발생 중인 배아 및 태아 내에서의 혈관의 발생을 저해할 것으로 또한 생각된다.
투여 방법은 환제, 주사 (정맥내, 피하, 근육내), 좌제, 질 스폰지, 질 탐폰 및 피임 링을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 치료제가 함께 (동시에) 또는 상이한 시간에 (순차적으로) 투여될 수 있다. 또한 치료제는 암을 치료하거나 혈관신생을 억제하기 위한 또 다른 유형의 화합물과 함께 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 대상 방법은 단독으로 사용될 수 있다. 다르게는, 대상 방법은 증식성 장애 (예를 들어, 종양)의 치료 또는 예방에 지시된 다른 통상적인 항암 치료 접근법과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 예방적 암 방지, 수술 후 암 재발 및 전이의 방지에서 및 다른 통상적인 암 요법의 아주반트로서 사용될 수 있다. 본 개시내용은 통상적인 암 요법 (예를 들어, 화학요법, 방사선 요법, 광선요법, 면역요법 및 수술)의 유효성이 대상 폴리펩티드 치료제의 사용을 통해 증진될 수 있음을 인식한다.
넓은 범위의 통상적인 화합물이 항신생물성 활성을 갖는 것으로 나타났다. 이들 화합물은 고형 종양을 수축시키거나, 전이 및 추가의 성장을 방지하거나, 백혈병성 또는 골수 악성종양에서 악성 세포의 수를 감소시키기 위해 화학요법에서 약제로서 사용되었다. 화학요법이 다양한 유형의 악성종양을 치료하는데 효과적이었지만, 많은 항신생물성 화합물은 바람직하지 않은 부작용을 유발한다. 2가지 이상의 상이한 치료가 조합될 때, 치료는 상승적으로 작용하고 각각의 치료 투여량을 감소시켜, 보다 고투여량에서 각각의 화합물에 의해 나타나는 유해한 부작용을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 다른 경우에, 치료에 불응성인 악성종양은 2가지 이상의 상이한 치료의 조합 요법에 반응할 수 있다.
본원에 개시된 폴리펩티드 치료제가 다른 통상적인 항신생물제와 조합되어 동시에 또는 순차적으로 투여될 때, 상기 치료제는 항신생물제의 치료 효과를 증진시키거나, 이러한 항-신생물제에 대한 세포 내성을 극복할 수 있다. 이는 항신생물제의 투여량을 감소시켜, 바람직하지 않은 부작용을 감소시키거나 내성 세포에서 항신생물제의 유효성을 회복시킨다.
본 개시내용의 방법은 또한 눈의 상태를 치료하기 위해 사용되는 다른 의약과의 공-투여를 포함한다. 하나 초과의 작용제 또는 작용제와 의약의 조합물을 투여할 때, 투여는 시간상 동시에 또는 순차적으로 일어날 수 있다. 치료제 및/또는 의약은 상이한 투여 경로에 의해 또는 동일한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
7. 제제 및 유효 용량
본원에 개시된 치료제는 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은 하나 이상의 생리학상 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 통상적인 방식으로 제제화될 수 있다. 이러한 제제에는 일반적으로 대부분의 규제 요건에 따라 실질적으로 발열원이 존재하지 않을 것이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 치료 방법은 조성물을 전신으로, 또는 임플란트 또는 장치로서 국부로 투여하는 것을 포함한다. 투여될 때, 본 개시내용에서 사용하기 위한 치료 조성물은 발열원이 존재하지 않는 생리학상 허용되는 형태이다. 상기한 바와 같이 조성물 내에 또한 임의로 포함될 수 있는 ALK1 신호전달 길항제 이외의 치료상 유용한 작용제는 본원에 개시된 방법에서 대상 화합물 (예를 들어, ALK1 ECD 폴리펩티드 또는 임의의 본원에 개시된 항체)과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
전형적으로, 본원에 개시된 단백질 치료제는 비경구로, 특히 정맥내로 또는 피하로 투여될 것이다. 비경구 투여에 적합한 제약 조성물은 하나 이상의 ALK1 ECD 폴리펩티드 또는 다른 항체를 하나 이상의 제약상 허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 직전에 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합하여 포함할 수 있고, 이는 항산화제, 완충제, 정박테리아제, 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질, 또는 현탁화제 또는 증점제를 함유할 수 있다. 본 개시내용의 제약 조성물에 이용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에서는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
조성물 및 제제는 원하는 경우에 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 분배기 장치 내에 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터(blister) 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 분배기 장치에는 투여를 위한 지침서가 동반될 수 있다.
실시예 :
실시예 1: ALK1-Fc 융합 단백질의 발현
본 출원인은 사이에 최소 링커를 갖는, 인간 Fc에 융합된 인간 ALK1 또는 뮤린 Fc 도메인에 융합된 마우스 ALK1의 세포외 도메인을 갖는 가용성 ALK1 융합 단백질을 구축하였다. 구축물을 각각 hALK1-Fc 및 mALK1-Fc로 칭한다.
hALK1-Fc는 도 3b에 CHO 세포주로부터 정제된 것으로서 도시된다 (서열 14). 특히, 인간 ALK1 단백질의 세포외 도메인의 통상적인 C-말단은 서열 1의 아미노산 118이지만, 본 발명자들은 도메인이 글루타민 잔기로 끝나는 것을 방지하는 것이 바람직하다고 결정하였다. 따라서, 인간 ALK1로부터 유래한 서열 14의 부분은 Q118에 대해 C-말단인 2개의 잔기, 즉 류신 및 알라닌을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 ALK1 유래 서열의 C-말단이 Q118의 상류 1 내지 5개 아미노산 (서열 1에 대해 113-117) 또는 하류 (119-123)의 임의의 부위인 ALK1 ECD 폴리펩티드 (Fc 융합 단백질 포함)를 제공한다.
hALK1-Fc 및 mALK1-Fc 단백질을 CHO 세포주에서 발현시켰다. 3개의 상이한 리더 서열을 고려하였다:
(i) 꿀벌 멜리틴 (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열 7)
(ii) 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (서열 8)
(iii) 천연: MTLGSPRKGLLMLLMALVTQG (서열 9).
선택된 형태는 TPA 리더를 사용하고, 도 4에 도시된 비처리된 아미노산 서열을 갖는다 (서열 5).
상기 폴리펩티드는 도 4에 도시된 핵산 서열에 의해 코딩된다 (서열 4).
정제는, 예를 들어 하기 중 3개 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 이루어질 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로스 크로마토그래피, 페닐세파로스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 완충제 교환으로 완료될 수 있다. hALK1-Fc 단백질은 크기 배제 크로마토그래피로 측정시에 >98％, SDS PAGE로 측정시에 >95％의 순도로 정제되었다.
단백질 생산 및 정제의 과정에서, 본 발명자들은 hALK1-Fc가, 변성, 환원 조건 (예를 들어, 환원 SDS-PAGE) 하에서는 순수한 것으로 보이지만 환자에게 투여시에는 문제가 되는 이량체 및 보다 고차 구조의 응집체의 혼합물로 발현되는 경향이 있다는 것을 관찰하였다. 응집체는 면역원성이거나 또는 생체이용률이 불량할 수 있고, 이들 응집체는 그의 이종성으로 인해 약물 개발에 바람직한 수준으로 제약 제제를 특성화하는 것을 어렵게 한다. 따라서, 최종 제제 중에 응집체의 양을 감소시키는 다양한 접근법을 시험하였다.
한 접근법에서, 다수의 다양한 세포 배양 배지를 시험하였다. IS CHO-CD (카탈로그 번호 91119, 어바인 사이언티픽(Irvine Scientific), 미국 캘리포니아주 산타 아나 소재)는 응집 생성물의 생산의 주목할 만한 감소를 보인 반면, hALK1-Fc의 높은 생산 수준은 유지하였다. 추가로, pH 8.0에서의 소수성 상호작용 칼럼 (예를 들어, 페닐세파로스)으로부터의 물질의 용리는 응집 생성물을 추가로 분리시켰다. 생성된 물질은 99％ 초과의 이량체로 이루어져 있다. R&D 시스템즈에 의해 판매된 ALK1-Fc 융합 단백질 (카탈로그 번호 370-AL, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)과 비교하면, NSO 세포에서 생산된 상기 단백질은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 고분자량 종으로 나타난 나머지 단백질과 함께 84％ 이량체인 것으로 나타난다. 제제에 대한 사이징(sizing) 칼럼 프로파일의 비교를 도 11에 도시한다. 응집체 형성은 ALK1-Fc 생산에서 상당한 문제인 것으로 확인되었는 바, 추가 정제 단계를 수반하는 접근법 (그러나, 이러한 접근법은 정제된 단백질의 수율을 낮출 수 있음)을 포함한 다른 접근법이 개발될 수 있을 것으로 예상된다.
실시예 2: ALK1-Fc 리간드의 확인
ALK1은 TGFβ 패밀리의 리간드에 대한 유형 1 수용체이다. TGFβ 패밀리의 다수 구성원을 비아코어™ 시스템을 사용하여 인간 ALK1-Fc 융합 단백질에의 결합에 대해 시험하였다. TGFβ 자체, GDF8, GDF11, BMP2 및 BMP4는 모두 hALK1-Fc 단백질에 대한 실질적인 결합을 보이지 않았으며, BMP2 및 BMP4는 단지 제한된 결합을 보였다. 대조적으로, GDF5 및 GDF7은 두 경우 대략 5 x 10-8 M의 KD 값으로 유의한 결합을 나타냈다. GDF6에 대한 GDF5 및 GDF7의 구조적 유사성에 기초하여, GDF6은 유사한 친화도로 융합 단백질에 결합할 것으로 예상된다. hALK1-Fc에 대한 최고 결합 친화도는 BMP9의 경우 KD 값이 1 x 10-10 내지 2 x 10-9의 범위이고, BMP10의 경우 KD가 대략 3 x 10-9로 관찰되었다.
실시예 3: 내피 세포에 대한 ALK1-Fc 및 항-ALK1 항체 효과의 특성화
Smad1/5/8-매개 신호전달에 반응성인 4개의 순차적 컨센서스 SBE 부위의 제어 하의 루시페라제 리포터 구축물 (SBE4-luc)를 사용하여, 본 발명자들은 HMVEC 세포에서 hALK1-Fc 약물 또는 중화 ALK1 특이적 모노클로날 항체의 존재 및 부재 하에 BMP-9 매개 활성을 측정하였다. HMVEC 세포를 rhBMP-9 (50 ng/ml)로 자극하였고, 이는 본원에서 SBE4-luc 조절된 전사 상향조절의 증가에 의해 입증된, Smad1/5/8-매개 전사 활성화를 유도하였다. 첨가되었을 때, hALK1-Fc 화합물 (10 ㎍/ml) 또는 항체 (10 ㎍/ml)는 상기 전사 반응을 각각 거의 60％ 감소시켰으며, 이는 ALK1-Fc의 존재가 BMP9 신호전달을 유의하게 감소시키고, 또한 BMP9 신호전달이 ALK1 활성에 관련된다는 것을 나타낸다.
SMAD 인산화의 활성화는 상류 액티빈 수용체의 활성화를 검정하기 위해 일반적으로 사용된다. ALK1은 그의 리간드에 의한 활성화 시에 SMAD 단백질 1, 5 및 8의 인산화를 조절하는 것으로 공지되어 있다. 여기서, 본 발명자들은 HUVEC 세포 (선천적으로 ALK1 수용체를 발현하는 인간 내피 세포주)에서 SMAD 인산화를 개시하기 위해 rhBMP-9 (50 ng/ml)를 30분에 걸쳐 첨가하였다. SMAD 1/5/8의 인산화는 세포를 리간드로 처리한 지 5분 후에 보였고, 인산화는 30분 기간 전체 동안 유지되었다. 상대적으로 낮은 농도의 hALK1-Fc (250 ng/ml)의 존재 하에, SMAD 1/5/8 인산화는 감소하였고, 이는 상기 작용제가 내피 세포에서 Smad1/5/8 활성화를 억제함을 확인시켜 준다.
시험관내 시스템에서 ALK1-Fc의 혈관신생 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 매트리겔 기질 상에서 내피 세포의 관 형성을 감소시키는데 있어서 화합물의 유효성을 검정하였다. 상기 기술은 신생혈관화를 평가하기 위해 일반적으로 사용되어, 신속하고 고도로 재현가능한 결과를 제공한다. 내피 세포 성장 보충제 (ECGS)를 사용하여 매트리겔 상에서 내피 세포로부터 미세혈관 형성을 유도하고, 이어서 항혈관신생 화합물의 효능을 18시간에 걸쳐 약물 및 ECGS 모두의 존재 하에 코드(cord) 형성의 감소로서 측정하였다. 예상되는 바와 같이, ECGS (200 ng/ml)의 첨가는 매트리겔 기질 상에 생성된 기초 수준의 내피 세포 코드 형성을 나타내는 음성 대조군 (처리제를 첨가하지 않음)에 비해 유의한 코드 형성을 유도하였다 (도 5). hALK1-Fc (100 ng/ml) 또는 mALK1-Fc (100 ng/ml)의 첨가시에, 코드 형성은 뚜렷하게 감소하였다. 모든 샘플에서 혈관 길이의 최종 정량화로 모든 농도의 hALK1-fc 또는 mALK1-Fc가 신생혈관화를 기초 수준으로 감소시켰음이 밝혀졌다. 추가로, hALK1-Fc 및 mALK1-Fc는 강한 혈관신생촉진 인자 ECGS의 존재 하에 신생혈관화의 강한 억제를 유지하였고, 이는 음성 대조군 엔도스타틴 (100 ng/ml)보다 훨씬 더 강력한 항혈관신생 활성을 입증한다.
실시예 4: CAM 검정
VEGF 및 FGF는 혈관신생을 자극하는 것으로 널리 공지되어 있다. GDF7의 혈관신생 효과를 평가하기 위해 CAM (병아리 융모요막) 검정 시스템을 사용하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, GDF7은 VEGF와 유사한 효력으로 혈관신생을 자극한다. GDF5 및 GDF6에서도 유사한 결과가 관찰되었다.
ALK1-Fc 융합체를 CAM 검정에서 항혈관신생 활성에 대해 시험하였다. 이들 융합 단백질은 VEGF, FGF 및 GDF7에 의해 자극된 혈관신생에 대한 강력한 항혈관신생 효과를 보였다. 도 7을 참조한다. BMP9 및 PDGF는 상기 검정에서 상대적으로 불량한 혈관신생 유도 능력을 보였지만, 그럼에도 불구하고 이들 인자의 상기 혈관신생 효과는 ALK1에 의해 억제되었다.
ALK1-Fc 단백질 및 상업적으로 입수가능한 항혈관신생 항-VEGF 모노클로날 항체를 CAM 검정에서 비교하였다. ALK1-Fc 단백질은 항-VEGF와 비교시 유사한 효력을 가졌다. 항-VEGF 항체인 베바시주맙은 현재 인간에서 암 및 황반 변성의 치료에 사용되고 있다. 도 8을 참조한다.
흥미롭게도, 항-ALK1 항체 (R&D 시스템즈)는 상기 검정 시스템에서 혈관신생을 유의하게 억제하지 못하였다. 본 발명자들은 이것이 상이한 종에서 ALK1 서열의 차이를 반영할 수 있는 것으로 예상한다.
실시예 5: 마우스 각막 미세낭 검정
마우스 눈에서 혈관신생에 대한 ALK1-Fc의 효과를 평가하기 위해 마우스 각막 미세낭 검정을 사용하였다. 복강내 투여된 hALK1-Fc는 안구 혈관신생을 유의하게 억제하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, hALK1-Fc는 안구 혈관신생을 항-VEGF와 동일한 정도로 억제하였다. hALK1-Fc 및 항-VEGF를 동일한 중량/중량 투여량으로 사용하였다. VEGF를 포화시킨 매트리겔 플러그를 비-안구 위치에 이식했을 때 유사한 데이터를 얻었다.
이들 데이터는 ALK1에 대한 고친화도 리간드가 혈관신생을 촉진하고, ALK1-Fc 융합 단백질이 강력한 항혈관신생 활성을 가짐을 입증한다. ALK1에 대한 리간드는 2개의 카테고리에 속하는데, 여기서 GDF5, 6, 7 군은 ALK1에 대한 중간 친화도를 갖고, BMP9, 10 군은 ALK1에 대해 고 친화도를 갖는다.
GDF5, 6 및 7은 주로 골 및 관절에 국부화되어 있는 한편, BMP9는 혈액 내에서 순환한다. 따라서, ALK1, GDF5, 6 및 7을 포함하는 골 및 관절의 혈관신생촉진 시스템, 및 ALK1 및 BMP9 (및 가능하게는 BMP10)을 포함하는 전신 혈관신생 시스템이 있는 것으로 보인다.
실시예 6: 류마티스 관절염의 뮤린 모델
뮤린 콜라겐-유도된 관절염 모델은 류마티스 관절염의 널리 허용된 모델이다. 본 연구에서, 10마리의 마우스의 군들을 비히클, 항-VEGF (베바시주맙 - 베바시주맙은 뮤린 VEGF를 억제하지 않으므로 음성 대조군으로서 사용됨), 또는 1 mg/kg, 10 mg/kg 또는 25 mg/kg의 용량의 mALK1-Fc ("RAP-041")로 처리하였다. 제21일에 콜라겐 증가(boost) 후, 관절염 점수 (도 10 참조) 및 발 부기는 모든 군에서 꾸준히 증가하였고, 약 38일에 최고치에 도달하였다. mALK1-Fc ("RAP-041")로 처리된 마우스는 특히 최고 용량 (25 mg/kg)에서 2가지 특징 모두에 대해 감소된 점수를 보였지만, 이러한 감소는 통계학적으로 유의하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 용량-관련 경향은 명백하다.
제42일에 연구 종료시, 관절염의 발생률은 비히클 대조군 처리된 마우스에서 10/10, 베바시주맙 처리된 마우스에서 9/10, mALK1-Fc 1 mg/kg 처리군에서 8/10 및 mALK1-Fc 10 mg/kg 처리군에서 9/10에 달하였다. mALK1-Fc 25 mg/kg 처리군에서, 질환 발생률은 6/10으로 더 낮았다.
실시예 7: ALK1-Fc는 CAM 검정에서 종양 혈관신생을 감소시킨다
임의의 조직과 마찬가지로 종양은 기초 영양소 및 산소 요구량을 갖는다. 작은 종양은 주변 혈관으로부터의 확산을 통해 충분량을 얻을 수 있지만, 종양의 크기가 증가함에 따라 이들은 존재하는 모세혈관을 동원하고 유지시켜 영양소를 확보해야 한다. ALK1-Fc 단백질의 혈관 억제를 통한 종양 성장 제한 능력을 시험하기 위해서, 본 발명자들은 흑색종 체외이식편 CAM 검정에서 다양한 농도의 mALK1-Fc를 시험하였다. 상기 기재된 CAM 검정에서와 같이, 각 난(egg)의 표면에 작은 창을 만들고, 이를 통해 5 x 105개의 B16 흑색종 세포를 이식하였다. 이어서, 난을 1주일 동안 매일 0.02 mg/ml mALK1-Fc, 0.2 mg/ml mALK1-Fc로 처리하거나 또는 처리하지 않은 채로 방치하였다. 실험의 마지막에 종양을 조심스럽게 꺼내어, 칭량하고, 디지탈 영상을 캡쳐하였다. mALK1-Fc로 처리된 CAM으로부터 유래한 종양은 비처리된 CAM 종양에 비해 현저한 크기 감소를 나타내었다. 종양 중량의 정량화로, 매일 0.02 mg/ml 또는 0.2 mg/ml의 mALK1-Fc로 처리된 종양의 중량은 비처리된 CAM에 비해 65％ 및 85％의 감소를 나타낸다는 것이 입증되었다 (도 6E). 결론적으로, 신생혈관화 및 종양 성장은 ALK1-Fc의 첨가시 용량-반응적 방식으로 유의하게 저해되었고, 이는 ALK1-Fc가 강력한 항혈관신생제임을 나타낸다.
실시예 8: 폐암 실험 모델
종양 진행에 대한 ALK1-Fc의 효과를 추가로 확인하기 위해서, 폐암의 마우스 모델을 시험하였다. 형광 표지된 뮤린 루이스 폐암 세포 (LL/2-luc)를 알비노 흑색 마우스 6마리에 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 같은 날, 복강내 투여된 PBS 대조군 (n=7) 또는 10 mg/kg mALK1-Fc (n=7)로 마우스 처리를 시작하였다. 생애 형광 영상화는 대조군 마우스에서 폐에 국부화된 종양의 실질적인 발생을 나타내었고, 이식 22일 후에 마우스는 빈사 상태가 되어 희생시켜야 하였다. 대조적으로, ALK1-Fc 처리된 마우스는 폐 종양의 실질적으로 지연된 성장을 나타내었고, 22일 당시 100％ 생존을 나타내었다. 도 12를 참조한다.
이들 데이터는, ALK1-Fc가 폐암의 마우스 모델에서의 종양 성장에 대해 상당한 효과를 가지고, 생존 이익을 제공한다는 것을 입증한다.
실시예 9: BMP9 및 항-BMP9, 혈관신생에 대한 효과
CAM (병아리 융모요막) 검정 시스템을 사용하여 재조합 인간 BMP9 (rhB9) 및 항-BMP9 모노클로날 항체 (mabB9) (R&D 시스템즈, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재, 카탈로그 번호 MAB3209)의 혈관신생 효과를 평가하였다. 이 항체는 BMP9/ALK1 신호전달을 중화하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Scharpfenecker et al ., J Cell Sci . 2007 Mar 15;120(Pt 6):964-72]; [David et al ., (2007); Blood Mar 1;109(5):1953-61]; [David et al ., Circ . Res. 2008 Apr 25;102(8):914-22]을 참조한다.
BMP9 및 항-BMP9 모두 외인성 VEGF의 부재 하에서는 혈관신생에 대한 상당한 효과를 갖지 않았는데, 이는 아마도 외인성 VEGF의 부재 하에서의 혈관신생의 결핍이 검정의 감수성을 감소시키기 때문일 것이다. 도 13의 우측 칼럼을 참조한다. 외인성 VEGF의 부재 하에서, 두 단백질을 5일 주기로 1일 및 3일에 50 ng (1회 투여)/일로 사용하였다. 그러나, VEGF의 존재 하에서, BMP9 및 그의 항체 둘 다는 상당한 항혈관신생 효과를 가졌다. 도 13을 참조한다. 이들 데이터는, BMP9와 VEGF의 조합에 대하여 스카페네커 등(Scharpfenecker et al .)으로부터의 데이터와 일치하고, BMP9 그 자체의 항혈관신생 효과에 대하여 스카페네커 등 및 데이비드 등(David et al .)으로부터의 결론과 일치한다. 그러나, 항-BMP9 항체의 효과는 공개된 문헌과 현저한 대조를 이룬다. 이들 데이터를 기초로, 본 발명자들은 BMP9의 최적 또는 생리학적 수준이 적절한 혈관신생을 위해 필요할 수 있고 또한 BMP9의 과잉 또는 결핍이 혈관신생을 억제할 것이라고 가정한다.
흥미롭게도, 항-BMP9 항체의 효과는 ALK1-Fc (이는 대안적 BMP9 길항제임)가 또한 혈관신생을 억제하는 것을 보여주는 본원에 제시된 데이터와 일치한다. 따라서, 이들 데이터는 ALK1-Fc 및 항-BMP9가 각각 항혈관신생 효과를 가지고 있고, 항-BMP9 항체는 ALK1-Fc가 보여지는 것과 매우 동일한 방식으로, 혈관신생 장애, 예컨대 종양, 류마티스 관절염 및 안구 장애의 치료에 유용할 수 있음을 입증한다.
MAB3209의 항혈관신생 활성을 고려해 볼 때, 본 발명자들은 이러한 뮤린 모노클로날 항체가 인간에서 사용하기 위한 치료제를 제공하도록 인간화될 수 있었다는 것을 제안한다. 항체는 키메라화, CDR-그라프팅, 재표면화, 복귀 돌연변이, 초인간화(superhumanization), 인간 스트링 함량(string content) 최적화 및 경험적 방법, 예컨대 FR 라이브러리 생성 및 선택, FR 셔플링 및 인간공학을 포함한, 다양한 업계-인식된 기술에 의해 인간화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Frontiers in Biosciences, 13: 1619-1633, 2008]을 참조한다.
실시예 10: 유방암 종양 모델에서 ALK1-Fc 융합 단백질의 효과
mALK1-Fc는 에스트로겐 수용체 양성 (ER+) 및 에스트로겐 수용체 음성 (ER-) 종양 세포 둘 다로부터 유래된 유방암 종양 세포주의 성장을 지연시킴에 있어서 효과적이었다.
MDA-MB-231 유방암 세포주 (ER- 세포로부터 유래됨)를 루시페라제 유전자로 안정하게 형질감염시켜 종양 성장 및 잠재적 전이의 생체내 검출을 가능하게 하였다. 이 연구에서, 1 x 106개의 MDA-MB-231-Luc 세포를 무흉선 누드 마우스 (할란(Harlan))의 유방 지방 패드에 동소 이식하였다. 종양 진행 후, IVIS 스펙트럼 영상화 시스템 (캘리퍼 라이프 사이언시스(Caliper Life Sciences))을 사용하여 생물발광을 검출하였다. 발광 (검출된 광자 수)의 증가는 종양 부담의 증가에 상응한다.
30마리의 암컷 누드 마우스의 유방 지방 패드에 1 x 106개의 종양 세포를 주사하였다. 종양 이식 3일 후에 마우스를 주 2회 피하 (SC) 주사에 의해 비히클 대조군 또는 mALK1-Fc (30 mg/kg)로 처리하였다. 처리를 계속하였고, 종양 진행을 10주 동안 생물발광 영상화에 의해 모니터링하였다. 30 mg/kg의 mALK1-Fc 처리는 생물발광 검출에 의해 측정시 비히클 처리된 대조군과 비교하여 종양 진행을 늦추었다 (도 14). mALK1-Fc를 사용한 처리는 종양 성장을 지연시켰지만, 이 모델에서 종양 성장을 역전시키지는 않았다. 이는, 종양을 계속 성장시키도록 지지하기 위한 신규한 혈관 형성을 요구하기 전에 일정 크기로 생존시킬 수 있는 항혈관신생 화합물인 것으로 예상될 수 있다. 유사한 실험에서, hALK1-Fc는 3 mg/kg 정도의 적은 용량 수준에서 유사한 (약간 적은) 효과를 나타내었다.
에스트로겐-수용체-양성 (ER+)의 루시페라제 발현 세포주인 MCF-7을 또한 동소 이식 모델에서 시험하였다. 이 모델에서, 암컷 누드 마우스에 17β-에스트라디올의 60일 지연 방출 펠릿을 피하 이식하였다. 펠렛 이식 2일 후, 5 x 106개의 MCF-7 종양 세포를 유방 지방 패드에 이식하였다. 마우스를 주 2회 IP 경로에 의해 3, 10 및 30 mg/kg의 hALK1-Fc, 또는 비히클 대조군으로 처리하였다. 종양 진행 후, IVIS-스펙트럼 영상화기 (캘리퍼 라이프 사이언시스)를 사용하여 주 단위로 생물발광 영상화를 수행하였다. 비히클 처리된 마우스에서, 종양은 연구일 26일까지 빠르게 진행되었다 (도 15). 26일 후, 60일 (에스트라디올 펠릿이 고갈되는 시점)에 연구를 종결할 때까지 종양 발광의 변동이 있었다. 이러한 변동은, 빠른 종양 성장이 숙주 동물의 혈관신생 반응을 초과하여 종양 괴사를 유발하고 발광 신호의 감소를 수반할 수 있는 상기 모델의 공통 특징 때문이다. 나머지 세포는 성장을 계속하여 신호를 증가시킨다. 10 또는 30 mg/kg의 hALK1-Fc로 처리된 마우스는 비히클-처리된 대조군과 비교하여 연구 중에 일정한 수준으로 종양 크기를 유지시킬 수 있었고, 이는 종양 성장에 대한 상기 분자의 강력한 효과를 나타낸다.
실시예 11: 세포-기반 검정에서 hALK1-Fc에 의한 BMP10 신호전달의 억제
BMP10 신호전달에 대한 hALK-Fc의 효과를 세포-기반 검정에서 결정하였으며, 여기서 인간 교모세포종 T98G 세포를 다음 3개의 플라스미드로 형질감염시켰다: 1) 전장 ALK1을 코딩하는 발현 구축물; 2) Smad1/5/8-매개 신호전달에 반응하는 반딧불이-루시페라제 리포터 구축물 (실시예 3 참조); 및 3) 레닐라(Renilla)-루시페라제 구축물. 재조합 인간 BMP10 (1 ng/ml)에 의한 형질감염 세포의 처리는 레닐라 루시페라제 활성에 비해 반딧불이 루시페라제 활성을 강하게 자극하였다 (도 16). ALK1 발현 구축물의 생략은 BMP10-자극 활성을 대략 2/3로 감소시켰고 (데이터는 제시되지 않음), 따라서 ALK1을 BMP10 신호의 주요 매개자로서 시사한다. hALK1-Fc (65 ng/ml) 및 BMP10 (1 ng/ml)에 의한 완전 형질감염 세포의 처리는 BMP10 단독과 비교하여 전사 반응을 80% 초과로 감소시켰다 (도 16). 더불어, 이들 결과는 ALK1이 BMP10 신호전달의 주요 매개자이고, ALK1-Fc가 이러한 신호전달을 현저하게 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 13: ALK-Fc는 786-O 종양 이종이식편 모델에서 수니티닙의 활성을 증진시킨다
786-O 세포, 폰 히펠 린다우 (VHL)-결핍 인간 신세포 암종 (RCC) 세포주 (문헌 [Iliopoulos et al ., Nature Medicine 1995; 1:822-6])를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 획득하고, RPMI 1640 배지 (셀그로(Cellgro))에서 배양하였다. 배지를 2 mmol/L L-글루타민, 10% FCS 및 1% 스트렙토마이신 (50 μg/mL)으로 보충하고, 세포를 5% CO2 하에 37℃에서 배양하였다. 786-O 세포를 0.25% 트립신 및 0.02% EDTA에 대해 짧게 노출시켜 준-전면생장(subconfluent) 배양물로부터 수거하였다. 트립신처리를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 배지로 중지시키고, 세포를 혈청-무함유 배지에서 1회 세척하고, PBS에 재현탁시켰다. 단지 >90% 생존율을 갖는 단세포로 이루어진 현탁액만을 주사에 사용하였다.
인간 RCC 이종이식편을 확립하기 위해, 786-O 종양 세포 (1 x 107개의 세포)를 평균 체중 20 g인 6주령 내지 8주령의 암컷 무흉선 누드/베이지색 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories))의 옆구리 내로 피하 주사하였다. 종양은 마우스의 >80%에서 발생하였고, 대개 이식 몇일 내에 가시적이었다. 종양이 직경 12 mm로 성장하였을 때, 마우스를 비히클 + Fc, 수니티닙 + Fc, 비히클 + ALK-Fc, 또는 수니티닙 + ALK-Fc로 처리하였다. 수니티닙 (53.6 mg/kg; 화이자)을 위관영양 개시에 의해 주 당 7일 중 6일 투여하였다. ALK1-Fc (10 mg/kg)를 복강내로 주 당 3회 투여하였다. 종양을 마우스가 처리받는 동안 격일로 측정하였다.
도 18에 도시된 바와 같이, 수니티닙 + Fc에 의한 처리는 786-O 뮤린 인간 종양 이종이식편 모델에서 종양 성장을 늦추었다. 이러한 효과는 종양을 수니티닙 + ALK-Fc에 의해 처리하였을 때 더욱 증진되었는데, 이는 ALK-Fc가 투명 세포 신세포 암종에 대한 모델에서 수니티닙의 종양 성장 억제 활성을 증진시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 14: ALK-Fc는 A498 종양 이종이식편 모델에서 단일 작용제 활성을 갖는다
A498 세포, VHL-결핍 인간 RCC 세포주 (문헌 [Iliopoulos et al ., Nature Medicine 1995; 1:822-6] 참조)를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 획득하고, 이글(Eagle) 최소 필수 배지에서 배양하였다. 배지를 2 mmol/L L-글루타민, 10% FCS 및 1% 스트렙토마이신 (50 μg/mL)으로 보충하고, 세포를 5% CO2 하에 37℃에서 배양하였다. 786-O 세포를 0.25% 트립신 및 0.02% EDTA에 대해 짧게 노출시켜 준-전면생장 배양물로부터 수거하였다. 트립신처리를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 배지로 중지시키고, 세포를 혈청-무함유 배지에서 1회 세척하고, PBS에 재현탁시켰다. 단지 >90% 생존율을 갖는 단세포로 이루어진 현탁액만을 주사에 사용하였다.
인간 RCC 이종이식편을 확립하기 위해, A498 종양 세포 (1 x 107개의 세포)를 평균 체중 20 g인 6주령 내지 8주령의 암컷 무흉선 누드/베이지색 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈)의 옆구리 내로 피하 주사하였다. 종양은 마우스의 >80%에서 발생하였고, 대개 이식 몇일 내에 가시적이었다. 종양이 직경 12 mm로 성장하였을 때, 마우스를 Fc 또는 ALK-Fc로 처리하였다. ALK1-Fc (10 mg/kg)를 복강내로 주 당 3회 투여하였다. 종양을 마우스가 처리받는 동안 매일 측정하였다.
도 19에 도시된 바와 같이, ALK-Fc 단독으로 처리시 A498 뮤린 인간 종양 이종이식편 모델에서 종양 성장이 급속하게 늦추어졌는 바 ALK-Fc는 단일 작용제 활성을 갖는다.
실시예 15: ALK-Fc는 또한 A498 종양 이종이식편 모델에서 수니티닙의 활성을 증진시킨다
A498 세포 배양물 및 이종이식편 확립을 실시예 14에 기재된 바와 같이 수행하였다. 종양이 직경 12 mm로 성장하였을 때, 마우스를 비히클 + Fc, 수니티닙 + Fc, 비히클 + ALK-Fc, 또는 수니티닙 + ALK-Fc로 처리하였다. 수니티닙 (53.6 mg/kg; 화이자)을 위관영양 개시에 의해 주 당 7일 중 6일 투여하였다. ALK-Fc (10 mg/kg)를 복강내로 주 당 3회 투여하였다. 종양을 마우스가 처리받는 동안 매일 측정하였다.
도 20에 도시된 바와 같이, 수니티닙 + Fc 또는 비히클 + ALK-Fc에 의한 처리는 A498 종양 이종이식편 모델에서 종양 성장을 늦추었다. 그러나, 조합으로 투여하였을 때, ALK-Fc는 A498 종양 성장에 대한 수니티닙의 종양 성장 억제 활성을 실질적으로 증가시켰다.
참고문헌 포함
본원에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되는 것과 같이 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상충되는 경우에, 본원의 모든 정의를 포함한 본 명세서가 제어할 것이다.
등가물
본 발명의 특정 실시양태를 본원에서 명백하게 개시하지만, 상기 명세서의 내용은 예시적인 것이며, 제한적인 것이 아니다. 본 발명의 많은 변형은 본 명세서 및 하기 특허청구범위를 검토하는 경우 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 완전한 범위는 그의 등가물의 완전한 범위와 함께 특허청구범위 및 상기 변형과 함께 명세서를 참조로 결정되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Bhatt, Rupal S. Kumar, Ravindra Mier, James W. Pearsall, Robert Sherman, Matthew Solban, Nicolas <120> ALK1 Antagonists and Their Uses in Treating Renal Cell Carcinoma <130> 3174.001PC02/TJS/KKH <140> To be assigned <141> 2013-02-01 <150> US 61/593,864 <151> 2012-02-02 <150> US 61/597,124 <151> 2012-02-09 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 503 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Leu Gly Ser Pro Arg Lys Gly Leu Leu Met Leu Leu Met Ala 1 5 10 15 Leu Val Thr Gln Gly Asp Pro Val Lys Pro Ser Arg Gly Pro Leu Val 20 25 30 Thr Cys Thr Cys Glu Ser Pro His Cys Lys Gly Pro Thr Cys Arg Gly 35 40 45 Ala Trp Cys Thr Val Val Leu Val Arg Glu Glu Gly Arg His Pro Gln 50 55 60 Glu His Arg Gly Cys Gly Asn Leu His Arg Glu Leu Cys Arg Gly Arg 65 70 75 80 Pro Thr Glu Phe Val Asn His Tyr Cys Cys Asp Ser His Leu Cys Asn 85 90 95 His Asn Val Ser Leu Val Leu Glu Ala Thr Gln Pro Pro Ser Glu Gln 100 105 110 Pro Gly Thr Asp Gly Gln Leu Ala Leu Ile Leu Gly Pro Val Leu Ala 115 120 125 Leu Leu Ala Leu Val Ala Leu Gly Val Leu Gly Leu Trp His 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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 275 280 285 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 290 295 300 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 305 310 315 320 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 4 <211> 1075 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant DNA <400> 4 gctagcacca tggatgcaat gaagagaggg ctctgctgtg tgctgctgct gtgtggagca 60 gtcttcgttt cgcccggcgc cgaccctgtg aagccgtctc ggggcccgct ggtgacctgc 120 acgtgtgaga gcccacattg caaggggcct acctgccggg gggcctggtg cacagtagtg 180 ctggtgcggg aggaggggag gcacccccag gaacatcggg gctgcgggaa cttgcacagg 240 gagctctgca ggggccgccc caccgagttc gtcaaccact actgctgcga cagccacctc 300 tgcaaccaca acgtgtccct ggtgctggag gccacccaac ctccttcgga gcagccggga 360 acagatggcc agctggccac cggtggtgga actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 420 gaagccctgg gggcaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 480 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 540 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata 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Cys Gly Asn Leu His Arg Glu Leu Cys 65 70 75 80 Arg Gly Arg Pro Thr Glu Phe Val Asn His Tyr Cys Cys Asp Ser His 85 90 95 Leu Cys Asn His Asn Val Ser Leu Val Leu Glu Ala Thr Gln Pro Pro 100 105 110 Ser Glu Gln Pro Gly Thr Asp Gly Gln Leu Ala Thr Gly Gly Gly Thr 115 120 125 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser 130 135 140 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 145 150 155 160 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 165 170 175 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 180 185 190 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 195 200 205 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 210 215 220 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr 225 230 235 240 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 245 250 255 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 260 265 270 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 275 280 285 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 290 295 300 Ser Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 305 310 315 320 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 325 330 335 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 350 <210> 6 <211> 225 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> residue may optionally be mutated to alanine <220> <221> misc_feature <222> (100)..(100) <223> residue may optionally be mutated to alanine <220> <221> misc_feature <222> (212)..(212) <223> residue may optionally be mutated to alanine <400> 6 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 20 25 30 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 35 40 45 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 50 55 60 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 65 70 75 80 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 85 90 95 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys 100 105 110 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 115 120 125 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 145 150 155 160 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 165 170 175 Asp Ser Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 180 185 190 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 195 200 205 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 Lys 225 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant leader peptide <400> 7 Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile 1 5 10 15 Ser Tyr Ile Tyr Ala 20 <210> 8 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant leader peptide <400> 8 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro 20 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant leader peptide <400> 9 Met Thr Leu Gly Ser Pro Arg Lys Gly Leu Leu Met Leu Leu Met Ala 1 5 10 15 Leu Val Thr Gln Gly 20 <210> 10 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Leu Arg Val Leu Val Gly Ala Val Leu Pro Ala Met Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Pro Pro Pro Ile Asn Lys Leu Ala Leu Phe Pro Asp Lys Ser Ala 20 25 30 Trp Cys Glu Ala Lys Asn Ile Thr Gln Ile Val Gly His Ser Gly Cys 35 40 45 Glu Ala Lys Ser Ile Gln Asn Arg Ala Cys Leu Gly Gln Cys Phe Ser 50 55 60 Tyr Ser Val Pro Asn Thr Phe Pro Gln Ser Thr Glu Ser Leu Val His 65 70 75 80 Cys Asp Ser Cys Met Pro Ala Gln Ser Met Trp Glu Ile Val Thr Leu 85 90 95 Glu Cys Pro Gly His Glu Glu Val Pro Arg Val Asp Lys Leu Val Glu 100 105 110 Lys Ile Leu His Cys Ser Cys Gln Ala Cys Gly Lys Glu Pro Ser His 115 120 125 Glu Gly Leu Ser Val Tyr Val Gln Gly Glu Asp Gly Pro Gly Ser Gln 130 135 140 Pro Gly Thr His Pro His Pro His Pro His Pro His Pro Gly Gly Gln 145 150 155 160 Thr Pro Glu Pro Glu Asp Pro Pro Gly Ala Pro His Thr Glu Glu Glu 165 170 175 Gly Ala Glu Asp 180 <210> 11 <211> 2003 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gccgagcctc ctggggcgcc cgggcccgcg acccccgcac ccagctccgc aggaccggcg 60 ggcgcgcgcg ggctctggag gccacgggca tgatgcttcg ggtcctggtg ggggctgtcc 120 tccctgccat gctactggct gccccaccac ccatcaacaa gctggcactg ttcccagata 180 agagtgcctg gtgcgaagcc aagaacatca cccagatcgt gggccacagc ggctgtgagg 240 ccaagtccat ccagaacagg gcgtgcctag gacagtgctt cagctacagc gtccccaaca 300 ccttcccaca gtccacagag tccctggttc actgtgactc ctgcatgcca gcccagtcca 360 tgtgggagat tgtgacgctg gagtgcccgg gccacgagga ggtgcccagg gtggacaagc 420 tggtggagaa gatcctgcac tgtagctgcc aggcctgcgg caaggagcct agtcacgagg 480 ggctgagcgt ctatgtgcag ggcgaggacg ggccgggatc ccagcccggc acccaccctc 540 acccccatcc ccacccccat cctggcgggc agacccctga gcccgaggac ccccctgggg 600 ccccccacac agaggaagag ggggctgagg actgaggccc ccccaactct tcctcccctc 660 tcatccccct gtggaatgtt gggtctcact ctctggggaa gtcaggggag aagctgaagc 720 ccccctttgg cactggatgg acttggcttc agactcggac ttgaatgctg cccggttgcc 780 atggagatct gaaggggcgg ggttagagcc aagctgcaca atttaatata ttcaagagtg 840 gggggaggaa gcagaggtct tcagggctct ttttttgggg ggggggtggt ctcttcctgt 900 ctggcttcta gagatgtgcc tgtgggaggg ggaggaagtt ggctgagcca ttgagtgctg 960 ggggaggcca tccaagatgg catgaatcgg gctaaggtcc ctgggggtgc agatggtact 1020 gctgaggtcc cgggcttagt gtgagcatct tgccagcctc aggcttgagg gagggctggg 1080 ctagaaagac cactggcaga aacaggaggc tccggcccca caggtttccc caaggcctct 1140 caccccactt cccatctcca gggaagcgtc gccccagtgg cactgaagtg gccctccctc 1200 agcggagggg tttgggagtc aggcctgggc aggaccctgc tgactcgtgg cgcgggagct 1260 gggagccagg ctctccgggc ctttctctgg cttccttggc ttgcctggtg ggggaagggg 1320 aggaggggaa gaaggaaagg gaagagtctt ccaaggccag aaggaggggg acaacccccc 1380 aagaccatcc ctgaagacga gcatccccct cctctccctg ttagaaatgt tagtgccccg 1440 cactgtgccc caagttctag gccccccaga aagctgtcag agccggccgc cttctcccct 1500 ctcccaggga tgctctttgt aaatatcgga tgggtgtggg agtgaggggt tacctccctc 1560 gccccaaggt tccagaggcc ctaggcggga tgggctcgct gaacctcgag gaactccagg 1620 acgaggagga catgggactt gcgtggacag tcagggttca cttgggctct ctctagctcc 1680 ccaattctgc ctgcctcctc cctcccagct gcactttaac cctagaaggt ggggacctgg 1740 ggggagggac agggcaggcg ggcccatgaa gaaagcccct cgttgcccag cactgtctgc 1800 gtctgctctt ctgtgcccag ggtggctgcc agcccactgc ctcctgcctg gggtggcctg 1860 gccctcctgg ctgttgcgac gcgggcttct ggagcttgtc accattggac agtctccctg 1920 atggaccctc agtcttctca tgaataaatt ccttcaacgc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2003 <210> 12 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 12 Arg Ser Ala Gly Ala Gly Ser His Cys Gln Lys Thr Ser Leu Arg Val 1 5 10 15 Asn Phe Glu Asp Ile Gly Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Lys Glu 20 25 30 Tyr Glu Ala Tyr Glu Cys Lys Gly Gly Cys Phe Phe Pro Leu Ala Asp 35 40 45 Asp Val Thr 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Val Cys Asn Tyr Pro Leu Ala Glu His Leu Thr Pro Thr 100 105 110 Lys His Ala Ile Ile Gln Ala Leu 115 120 <210> 16 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Val His Leu Lys Phe Pro Thr Lys Val Gly Lys Ala Cys Cys Val Pro 1 5 10 15 Thr Lys Leu Ser Pro Ile Ser Val Leu Tyr Lys Asp Asp Met Gly Val 20 25 30 Pro Thr Leu Lys Tyr His Tyr Glu Gly Met Ser Val Ala Glu Cys Gly 35 40 45 Cys Arg Val His Leu Lys Asn Ser Gln Lys Ala Ser Lys Ala Cys Cys 50 55 60 Val Pro Thr Lys Leu Glu Pro Ile Ser Ile Leu Tyr Leu Asp Lys Gly 65 70 75 80 Val Val Thr Tyr Lys Phe Lys Tyr Glu Gly Met Ala Val Ser Glu Cys 85 90 95 Gly Cys Arg

Claims (45)

  1. 신세포 암종 (RCC)을 갖는 포유동물에게 유효량의 수용체 티로신 키나제 억제제 (RTKI) 및
    (a) ALK1의 세포외 도메인의 리간드 결합 부분을 포함하는 ALK1 폴리펩티드;
    (b) 인간 ALK1의 세포외 도메인에 결합하는 항체;
    (c) 인간 BMP9에 결합하는 항체; 및
    (d) 인간 BMP10에 결합하는 항체
    로부터 선택된 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, ALK1 폴리펩티드가 서열 1의 아미노산 22-118의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, ALK1 폴리펩티드가 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로부터 선택된 ALK1 리간드에 결합하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, ALK1 폴리펩티드가 서열 1의 아미노산 22-120의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, ALK1 폴리펩티드가 이뮤노글로불린의 불변 도메인을 추가로 포함하는 것인 방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, ALK1 폴리펩티드가 이뮤노글로불린의 Fc 부분을 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, Fc 부분이 인간 IgG1의 Fc 부분인 방법.
  7. 제1항에 있어서, ALK1 폴리펩티드가 서열 3 또는 서열 14의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, (b)의 항체가 서열 1의 아미노산 22-118의 서열 내 에피토프에 결합하여 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로부터 선택된 리간드의 결합을 억제하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, (c)의 항체가 서열 12의 아미노산 1-111의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP9의 결합을 억제하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, (d)의 항체가 서열 13의 아미노산 1-108의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP10의 결합을 억제하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, RTKI가 수니티닙인 방법.
  12. 제1항에 있어서, RTKI가 소라페닙인 방법.
  13. 제1항에 있어서, RTKI가 파조파닙인 방법.
  14. 제1항에 있어서, RTKI가 악시티닙인 방법.
  15. 제1항에 있어서, RTKI가 티보자닙 또는 반데타닙인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR)-표적화 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, mTOR-표적화 억제제가 에베롤리무스인 방법.
  18. 제16항에 있어서, mTOR-표적화 억제제가 템시롤리무스인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, RCC가 투명 세포 신세포 암종인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, RCC가 신동(renal sinus)을 침습한 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, RCC가 전이성 RCC인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, RCC가 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이된 것인 방법.
  23. 이전에 신세포 암종 (RCC) 치료제를 투여받은 포유동물에게 유효량의
    (a) ALK1의 세포외 도메인의 리간드 결합 부분을 포함하는 ALK1 폴리펩티드;
    (b) 인간 ALK1의 세포외 도메인에 결합하는 항체;
    (c) 인간 BMP9에 결합하는 항체; 및
    (d) 인간 BMP10에 결합하는 항체
    로부터 선택된 작용제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 RCC를 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, ALK1 폴리펩티드가 서열 1의 아미노산 22-118의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, ALK1 폴리펩티드가 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로부터 선택된 ALK1 리간드에 결합하는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, ALK1 폴리펩티드가 서열 1의 아미노산 22-120의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, ALK1 폴리펩티드가 이뮤노글로불린의 불변 도메인을 추가로 포함하는 것인 방법.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, ALK1 폴리펩티드가 이뮤노글로불린의 Fc 부분을 추가로 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, Fc 부분이 인간 IgG1의 Fc 부분인 방법.
  29. 제23항에 있어서, ALK1 폴리펩티드가 서열 3 또는 서열 14의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  30. 제23항에 있어서, (b)의 항체가 서열 1의 아미노산 22-118의 서열 내 에피토프에 결합하여 GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 및 BMP10으로부터 선택된 리간드의 결합을 억제하는 것인 방법.
  31. 제23항에 있어서, (c)의 항체가 서열 12의 아미노산 1-111의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP9의 결합을 억제하는 것인 방법.
  32. 제23항에 있어서, (d)의 항체가 서열 13의 아미노산 1-108의 서열 내 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 BMP10의 결합을 억제하는 것인 방법.
  33. 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 이전에 투여받은 RCC 치료제가 RTKI인 방법.
  34. 제33항에 있어서, RTKI가 수니티닙, 소라페닙, 파조파닙, 악시티닙, 티보자닙 및 반데타닙으로부터 선택되는 것인 방법.
  35. 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 이전에 투여받은 RCC 치료제가 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR)-표적화 억제제인 방법.
  36. 제35항에 있어서, mTOR-표적화 억제제가 에베롤리무스 및 템시롤리무스로부터 선택된 작용제인 방법.
  37. 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 이전에 투여받은 치료제가 인터페론 알파 (IFN-α) 또는 인터류킨-2 (IL-2)인 방법.
  38. 제23항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, RTKI를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, RTKI가 수니티닙, 소라페닙, 파조파닙, 악시티닙, 티보자닙 및 반데타닙으로부터 선택된 작용제인 방법.
  40. 제23항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, mTOR-표적화 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, mTOR-표적화 억제제가 에베롤리무스 및 템시롤리무스로부터 선택된 작용제인 방법.
  42. 제23항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, RCC가 투명 세포 신세포 암종인 방법.
  43. 제42항에 있어서, RCC가 신동을 침습한 것인 방법.
  44. 제23항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, RCC가 전이성 RCC인 방법.
  45. 제23항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, RCC가 폐, 복부내 림프절, 골, 뇌 또는 간으로 전이된 것인 방법.
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