CN104321070A - Alk1拮抗剂及其在治疗肾细胞癌中的用途 - Google Patents

Alk1拮抗剂及其在治疗肾细胞癌中的用途 Download PDF

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Abstract

在某些方面，本公开涉及如下认识：包含激活素样激酶I(ALK1)多肽的胞外结构域的配体结合部分的多肽可以用来在体内抑制肾细胞癌(RCC)的肿瘤生长。在其他方面，本公开涉及如下认识：包含激活素样激酶I(ALK1)多肽的胞外结构域的配体结合部分的多肽显著地增加护理受体酪氨酸激酶抑制剂的标准物在体内抑制RCC肿瘤生长的能力。

Description

ALK1拮抗剂及其在治疗肾细胞癌中的用途
背景
肾细胞癌(RCC)占全部恶性肾肿瘤的高达90％并且是美国男性和女性中第八位最常诊断的癌症。美国国家癌症研究所估计2012年在美国将确诊大约65,000个新肾癌病例并且大约13,600例死亡将因肾癌所致。世界范围内估计每年超过200,000个新病例确诊并且多于100,000例死于RCC。RCC的发生率和死亡率在世界范围均正在增长。
如果确诊，RCC可以经常通过手术摘除肿瘤或肾治愈并且当依旧局限于肾或紧邻周围组织时可以治疗。然而随着癌症血管化并转移至身体远端部分，无疾病存活的概率显著地下降。三分之一的RCC作为转移性疾病存在，5年存活率小于10％。
转移性RCC(mRCC)历史上对化疗和激素疗法不敏感并且直至最近以来，全身性治疗尚限于基于非特异性免疫的白介素2(IL-2)或干扰素α(IFN-α)细胞因子疗法。这些疗法与低反应速率和高毒性率相关。
过去十年期间的研究有助于阐明与RCC肿瘤形成和晚期疾病相关的遗传事件。特别地，已经确定在肿瘤细胞内部以及在肿瘤细胞和周围组织(例如，常驻性内皮细胞和周皮细胞)之间的血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和AKT/mTOR(雷帕霉素哺乳动物靶)信号传导途径的异常信号传导在驱动RCC血管化、细胞存活和肿瘤增生中发挥支配作用。这些途径中的异常与RCC的关联已经转而导致开发一系列靶向VEGF，PDGF和mTOR信号传导途径中关键步骤的疗法。特别地，自从2005年来，靶向VEGF和PDGF途径的5种药物(即，索拉非尼、舒尼替尼、贝伐珠单抗、帕唑帕尼和阿昔替尼)和两种mTOR途径靶向治疗药(即，坦罗莫司和依维莫司)已经由FDA批准用于晚期RCC适应症。
除了贝伐珠单抗(一种结合VEGF的人源化抗体，通称为)之外，靶向VEGF途径的已批准的RCC治疗药是小分子ATP模拟物抑制化合物。这些小分子抑制剂通过如下方式发挥作用：结合受体酪氨酸激酶如VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的高度保守的ATP结合催化位点并且因而阻断结合的受体的胞内信号传导。但是，部分归因于蛋白激酶之间ATP结合催化位点的高度保守结构，大多数小分子受体酪氨酸激酶抑制剂还结合并抑制不同的非预期受体酪氨酸激酶，并且有时甚至结合并抑制其他激酶家族的成员。受体酪氨酸激酶抑制剂的这种“脱靶”作用经常导致限制药物的治疗性应用和/或功效的不良事件和毒性。
舒尼替尼(通称为)是一种起初作为c-Met受体酪氨酸激酶的小分子抑制剂而开发的多靶受体酪氨酸激酶抑制剂。除c-Met之外，舒尼替尼还竞争性抑制VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、PDGFRa、PDGFRb、flt-3、c-KIT(CD117)、RET和CSF-1R受体酪氨酸激酶的活性。在总结关键试验后，舒尼替尼经批准作为治疗晚期RCC的一线治疗药，所述关键试验显示与干扰素-α相比，舒尼替尼在患有晚期疾病的患者中延长总生存期几乎5个月(与21.8个月相比，26.4个月)。虽然适中，但是这种在患者存活方面的改善已经使舒尼替尼成为护理治疗未用过药的晚期RCC患者的新标准。舒尼替尼治疗与明显的副作用相关，如50％RCC患者中要求降低剂量以管理与舒尼替尼相关的明显毒性所展示。
尽管RCC疗法中存在最近进展，但是持续存在明显未满足的需求。目前可用疗法为患者提供小于1年的无病情进展存活并且与明显毒性相关。另外，肿瘤对治疗的适应经常导致治疗中止和肿瘤生长加速。
概述
本公开提供激活素样激酶I(ALK1)调节系统的拮抗剂和这类拮抗剂治疗细胞癌(RCC)的用途。在特定方面，RCC是透明细胞肾细胞癌。在其他方面，RCC是TNM(Tumor/Mode/Metastasis，肿瘤/模式/转移分级)III期疾病。在另外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经侵入肾窦。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
如本文所述，ALK1是GDF5(生长分化因子5)组配体的受体，所述GDF5组包括GDF6和GDF7，并且还是BMP9(骨形态发生蛋白5)组配体的受体，所述BMP9组包括BMP10。本公开表明，由ALK1和上述配体介导的信号传导参与体内血管生成，并且抑制这个调节系统具有强力抗血管生成作用。
本公开还展示ALK1调节系统拮抗剂如ALK1-Fc融合蛋白在人RCC异体移植动物模型中抑制肿瘤生长的用途。本公开进一步表明，与舒尼替尼组合施用时，ALK1的ALK1-Fc融合蛋白拮抗剂在人RCC异体移植动物模型中显著地增强舒尼替尼(一种VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂)的肿瘤生长抑制活性。因此，在某些方面，本公开提供用于治疗肾细胞癌的ALK1调节系统拮抗剂，包括ALK1受体或一种或多种ALK1配体的拮抗剂。在特定方面，ALK1拮抗剂是ALK1-Fc融合蛋白(例如，如本文所述的ALK1-Fc融合蛋白)。在某些方面，本公开提供用于治疗肾细胞癌的ALK1调节系统拮抗剂，包括ALK1受体或一种或多种ALK1配体的拮抗剂。在特定方面，肾细胞癌是透明细胞肾细胞癌。在额外的方面，治疗过的肾细胞癌已经侵入肾窦。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经侵入肾窦。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
在某些方面，本公开提供用于抑制血管生成的包含ALK1胞外结构域的配体结合部分的多肽(“ALK1 ECD多肽”)。在额外的方面，本公开提供用于治疗RCC(例如，透明细胞肾细胞癌)的包含ALK1 ECD多肽的多肽。尽管不希望受任何特定作用机制约束，预期这类多肽通过与ALK1的配体结合并抑制这些配体与ALK1以及其他受体相互作用的能力发挥作用。在某些实施方案中，ALK1 ECD多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的人ALK1序列的氨基酸22-118的序列至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在某些实施方案中，ALK1 ECD多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的人ALK1序列的氨基酸22-120的序列至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。ALK1 ECD多肽可以作为单体小蛋白或以二聚化形式(例如，表达为Fc融合蛋白)使用。ALK1 ECD也可以与第二多肽部分融合以提供改善的或所需的特性，如改善的配体结合亲和力、增加的半寿期或更易于生产或纯化。融合于免疫球蛋白的Fc部分或连接至聚氧乙烯部分(例如，聚乙二醇)特别可用于全身性施用(例如，静脉内、动脉内和腹膜内施用)期间增加ALK1 ECD多肽的血清半寿期。
如本文中展示，在人RCC小鼠异体移植模型中单独施用时，全身施用的ALK1-Fc融合蛋白具有强力肿瘤生长抑制作用，并且在测试的人RCC小鼠异体移植模型中与舒尼替尼一起全身性施用时，大幅度增加舒尼替尼的RCC肿瘤生长抑制作用。在某些实施方案中，ALK1–Fc融合蛋白包含具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸22-118或22-120的序列至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，所述多肽在具有或没有间插性接头的情况下与免疫球蛋白的Fc部分融合，并且其中ALK1-Fc融合蛋白与选自以下的ALK1配体结合：GDF5(例如，具有GenBank登录号CAA56874中列举的序列)、GDF6(例如，具有GenBank登录号AAH43222)中列举的序列，GDF7(例如，具有GenBank登录号NP_878248中所述的序列)、BMP9(例如，具有GenBank登录号AF156891、AF188285、AK314956、BC069643或BC074921中列举的序列)和BMP10(例如，具有GenBank登录号095393中列举的序列)。在其他方面，ALK1-Fc融合蛋白与选自GDF5、GDF7和BMP9的ALK1配体以小于1×10-7M的KD结合并且与TGFβ-1以大于1×10-6M的KD结合。如此选择Fc融合蛋白的Fc部分，从而适于正在治疗的生物并显示出所需的药物代谢动力学特性和药效动力学特性。任选地，Fc部分是人IgG1的Fc部分。在一个优选实施方案中，ALK1-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-118或22-120。任选地，ALK1-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。任选地，ALK1-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。任选地，ALK1-Fc融合蛋白是通过在哺乳动物细胞系、特别中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中表达SEQ ID NO:4的核酸所产生的蛋白质。将ALK1-ECD多肽配制为基本上无热原的药物制品。可以制备该药物制品用于全身性递送(例如，静脉内、动脉内或皮下递送)或局部递送。
在某些方面，本公开解决了在开发治疗性环境下使用的相对均匀的ALK1-Fc融合蛋白制备物中的难题。如本文所述，ALK1-Fc融合蛋白倾向于聚集成高阶多聚体。本公开提供了这些难题的解决方案并且因此提供包含ALK1-Fc融合蛋白的药物制品，其中这类制品包含至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的二聚体ALK1-Fc融合蛋白。因此，在某些方面，本公开提供含有ALK1-Fc融合蛋白的药物制品，所述ALK1-Fc融合蛋白包含具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸22-118或22-120的序列至少90％、95％、96％或97％相同，所述肽与免疫球蛋白的Fc部分融合，并且其中ALK1-Fc融合蛋白与选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的配体结合。在其他方面，ALK1-Fc融合蛋白以小于1×10-7M的KD结合GDF5、GDF7和BMP9并且与TGFβ-1以大于1×10-6M的KD结合并且其中至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的ALK1-Fc融合蛋白以二聚体形式存在。
ALK1-Fc融合蛋白的Fc部分可以是人IgG1或另一个人免疫球蛋白亚类(如IgG2或IgG3)的Fc部分。在一些方面，ALK1-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在其他方面，ALK1-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在其他方面，通过在哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中表达SEQ ID NO:4的核酸产生ALK1-Fc融合蛋白。可以配制这类药物制品，旨在使用已知技术和试剂优化ALK1-Fc融合蛋白的所需特性。
本发明的药物制品可以出于本文所述的多种治疗目的使用，包括抑制血管生成和治疗RCC。在一个特定方面，药物制品用来治疗透明细胞肾细胞癌。在又一个方面，药物制品用来在先前已经接受过RCC治疗药的哺乳动物中治疗RCC。在另一个方面，药物制品用来治疗患有RCC和已经接受或准备接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物。在又一个方面中，本发明的药物制品用来治疗晚期(转移性)RCC。在额外的方面，本发明的药物制品用来抑制血管生成和/或用来治疗其中需要抑制血管生成的疾病或病症。
在一些实施方案中，包含针对ALK1的抗体或一种或多种ALK1配体(例如，BMP9和/或BMP10)的ALK1-Fc药物制品和制备物与抑制血管生成的药物联合使用。在一些实施方案中，包含针对ALK1的抗体或一种或多种ALK1配体(例如，BMP9和/或BMP10)的ALK1-Fc药物制品和制备物与VEGF信号传导途径拮抗剂(例如，结合VEGF(例如，)、VEGF受体(例如，VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)和VEGF受体阱的抗体)联合使用。在特定方面，药物制品包含VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂。在其他方面，VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂是选自舒尼替尼()、索拉非尼()、帕唑帕尼()、阿昔替尼()、替沃扎尼和凡德他尼的药物。
在某些方面，本公开提供了通过向患有RCC的哺乳动物施用ALK1 ECD多肽治疗哺乳动物中肾细胞癌的方法。在又一个方面，本公开提供一种治疗哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，包括向患有RCC的哺乳动物施用有效量的激活素样激酶I(ALK1)-Fc融合蛋白和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂。在一个方面，待治疗的RCC是透明细胞肾细胞癌。在另一个方面，待治疗的RCC已经侵入肾窦。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
在某些方面，根据本发明方法施用的ALK1-Fc融合蛋白包含具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸22-118或22-120的序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，所述肽与免疫球蛋白的Fc部分融合，并且其中ALK1-Fc融合蛋白与选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的ALK-配体结合。在其他方面，ALK1-Fc融合蛋白以大于1×10-6M的KD结合TGFβ-1。任选地，ALK1-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO:3的序列。在替代性选项中，ALK1-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO:14的序列。可以局部或全身性(例如，静脉内、动脉内或皮下)递送ALK1ECD多肽。
在又一个方面，与ALK1-Fc融合蛋白一起施用的VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂是选自舒尼替尼()、索拉非尼()、帕唑帕尼()、阿昔替尼()、替沃扎尼和凡德他尼的药物。
在另一个方面，本公开提供一种治疗哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，包括向患有RCC的哺乳动物施用有效量的激活素样激酶I(ALK1)-Fc、VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂和哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)抑制剂。在又一个方面，将ALK1-Fc融合蛋白和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂与靶向mTOR的抑制剂依维莫司或坦罗莫司一起施用。在其他方面，mTOR抑制剂是选自以下的药物：WYE354、YE132(Pfizer)、PP30和PP242、AZD8055、OSI-027、Torin1、BEZ235、XL765、GDC-0980、PF-04691502和PF-05212384。
在一个方面，待治疗的RCC是透明细胞肾细胞癌。在另一个方面，待治疗的RCC已经侵入肾窦。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
在另一个方面，本公开提供一种治疗先前已经接受过RCC治疗药的哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的激活素样激酶I(ALK1)-Fc融合蛋白。在一个方面，先前接受的治疗药是VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂。在又一个方面，VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂是选自以下的药物：舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、阿昔替尼、替沃扎尼和凡德他尼。在另一个方面，先前接受的治疗药是哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)抑制剂。在又一个方面，靶向mTOR的抑制剂是选自依维莫司和坦罗莫司的药物。在其他方面，靶向mTOR的抑制剂是选自以下的药物：WYE354、YE132(Pfizer)、PP30和PP242、AZD8055、OSI-027、Torin1、BEZ235、XL765、GDC-0980、PF-04691502和PF-05212384。在一个额外的方面，先前接受的治疗药是全身性细胞因子治疗药。在又一个方面，全身性细胞因子治疗药是干扰素α(IFN-α)或白介素-2(IL-2)。根据一个方面，治疗的RCC是透明细胞肾细胞癌。在另一个方面，治疗的RCC已经侵入肾窦。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
在额外的方面，本公开提供一种治疗先前已经接受过RCC治疗药的哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的激活素样激酶I(ALK1)-Fc融合蛋白和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂。在又一个实施方案中，VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂是选自以下的药物：舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、阿昔替尼、替沃扎尼和凡德他尼。在另一个方面，治疗的RCC已经侵入肾窦。根据一个方面，RCC是透明细胞肾细胞癌。在另一个方面，治疗的RCC已经侵入肾窦。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
在额外的方面，本公开提供一种治疗先前已经接受过RCC治疗药的哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的激活素样激酶I(ALK1)-Fc融合蛋白和that结合受体酪氨酸激酶的抗体。在又一个方面，抗体结合选自以下的受体酪氨酸激酶：VEGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、PDGFRa、PDGFRb、C-kit、MET FAK、RET、βFGF、TiE-1、Tie-2和EGFR。在一个额外的方面，施用的抗体是贝伐珠单抗。根据一个方面，RCC是透明细胞肾细胞癌。在另一个方面，治疗的RCC已经侵入肾窦。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
在额外的方面，本公开提供一种治疗先前已经接受过RCC治疗药的哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的激活素样激酶I(ALK1)-Fc融合蛋白和靶向mTOR的抑制剂。在又一个方面，靶向mTOR的抑制剂是选自依维莫司和坦罗莫司的药物。在其他方面，mTOR抑制剂是选自以下的药物：WYE354、YE132(Pfizer)、PP30和PP242、AZD8055、OSI-027、Torin1、BEZ235、XL765、GDC-0980、PF-04691502和PF-05212384。根据一个方面，RCC是透明细胞肾细胞癌。在另一个方面，治疗的RCC已经侵入肾窦。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
在额外的方面，本公开提供一种治疗先前已经接受过RCC治疗药的哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的激活素样激酶I(ALK1)-Fc融合蛋白和免疫刺激性细胞因子。在又一个实施方案中，施用的免疫刺激性细胞因子是IFN-α或IL-2。根据另一个方面，治疗的RCC是透明细胞肾细胞癌。在另一个方面，治疗的RCC已经侵入肾窦。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
在一个额外的方面，本公开提供一种治疗哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，所述方法包括向患有RCC和已经接受或准备接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物施用有效量的激活素样激酶I(ALK1)-Fc融合蛋白。在一个方面，医疗操作选自肾单位保留手术、部分肾切除术、全肾切除术和热消融术。在一些方面，RCC是透明细胞肾细胞癌。在额外的方面，RCC已经侵入肾窦。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
在一个方面，向患有RCC和已经接受或准备接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物施用的ALK1-Fc融合蛋白包含具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸22-118或22-120的序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，并且其中ALK1-Fc融合蛋白与选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的ALK1配体结合。在一个额外的方面，ALK1-Fc融合蛋白的Fc部分是人IgG1免疫球蛋白的Fc部分。在又一个方面，ALK1-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在又一个方面，本公开提供一种在患有RCC和已经接受或准备接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物中治疗RCC的方法，其中所述方法包括向该哺乳动物施用有效量的激活素样激酶I(ALK1)-Fc融合蛋白和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂。根据一个方面，VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂是选自以下的药物：舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、阿昔替尼、替沃扎尼和凡德他尼。
在另一个方面，本公开提供一种在患有RCC和已经接受或准备接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物中治疗RCC的方法，其中所述方法包括向该哺乳动物施用有效量的ALK1-Fc融合蛋白、VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂和靶向mTOR的抑制剂。在一个方面，靶向mTOR的抑制剂是选自依维莫司和坦罗莫司的药物。在另一个方面，mTOR抑制剂是选自以下的药物：WYE354、YE132(Pfizer)、PP30和PP242、AZD8055、OSI-027、Torin1、BEZ235、XL765、GDC-0980、PF-04691502和PF-05212384。
在另一个方面，本公开提供一种在患有RCC和已经接受或准备接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物中治疗RCC的方法，其中所述方法包括向该哺乳动物施用有效量的ALK1-Fc融合蛋白、VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂和免疫刺激性细胞因子。在一个方面，施用的免疫刺激性细胞因子是IFN-α或IL-2。
在某些方面，本公开提供一种在患有RCC和已经接受或准备接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物中治疗RCC的方法，其中所述方法包括向该哺乳动物施用与ALK1配体结合并抑制ALK1配体与ALK1结合的抗体。在一些实施方案中，该抗体与ALK1配体以小于5×10-8M的KD结合。在一些实施方案中，该抗体抑制受ALK1配体刺激的血管生成。在某些方面，该抗体与ALK1在胞外结构域(SEQ IDNO:1的氨基酸22-118或22-120)中结合并且抑制ALK1与选自以下的至少一种ALK1配体结合：GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10。基于这些配体对ALK1的亲和力，抗体可以按小于5×10-8M和任选地5×10-8M和1×10-10M之间的KD结合。将期望具有处于这个范围的亲和力的抗体抑制借助GDF5、GFD6和GFD7中一者或多者的信号传导，同时对借助BMP9和BMP10的信号传导具有较少影响。这种抗体优选地抑制受选自以下的至少一种ALK1配体刺激的血管生成：GDF5、GDF6和GDF7。尽管不希望受特定机制约束，预期这类抗体将通过直接抑制ALK1活性发挥作用，这应当与ALK1-Fc融合蛋白的活性相反，其中期望所述ALK1-Fc融合蛋白抑制ALK1配体的活性。不期望抗-ALK1抗体通过替代性受体系统(如BMPR1a、BMPR1b和BMPRII复合物)干扰GDF5、GDF6、GDF7、BMP9或BMP10进行信号传导的能力。但是，期望抗-ALK1抗体通过ALK1干扰ALK1的低亲和力配体(例如，TGF-β，总体上认为它通过ALK1触发明显的信号传导事件，尽管结合作用相对弱)进行信号传导的能力，即便ALK1 ECD可能不结合至或抑制这类低亲和力配体。在一些实施方案中，该抗体与ALK1多肽以小于1×10-10M的KD结合。将期望具有处于这个范围的亲和力的抗体抑制借助BMP9或BMP10的信号传导。这种抗体优选地抑制BMP9和BMP10与ALK1的结合。
为了形成有功能的信号传导复合体，BMP/GDF家族成员，包括BMP9、BMP10、GDF5、GDF6和GDF7，与I型和II型受体结合。这两种类型受体的结合位点是不同的。因此，在某些实施方案中，与ALK1配体结合并抑制该配体与ALK1结合的抗体是在该配体的I型受体结合位点处或其附近结合的抗体。
值得注意地，基于本文中公开的数据，相对差地与ALK1结合的抗体可以抑制TGFβ与ALK1结合，同时不抑制更紧密结合的配体如GDF5或BMP9。本文所述的抗体优选地是重组抗体，意指从已经使用分子生物学技术构建的核酸中表达的抗体，如从单链抗体形成的人源化抗体或全人抗体。Fv抗体、Fab抗体和单链抗体还涵盖于术语“重组抗体”内。抗体也可以是多克隆抗体或非重组单克隆抗体(包括人形式或鼠形式，以及从转基因小鼠获得的人抗体)。可以将抗体和ALK1-ECD多肽容易地配制为基本上无热原的药物制品。可以制备该药物制品用于全身性递送(例如，静脉内、动脉内或皮下递送)或局部递送。国际申请公开号WO2007/040912中描述的抗体可以用于本文所述的多种方法。
在某些方面，本公开提供了本文中总体或专门描述的通过向哺乳动物施用有效量与ALK1多肽结合的抗体治疗哺乳动物中肾细胞癌的方法。在一个方面，肾细胞癌是透明细胞肾细胞癌。在另一个方面，RCC已经侵入肾窦。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
可用于这种目的抗体与ALK1胞外结构域(例如，结合由SEQ IDNO:1的氨基酸22-118组成的多肽)或ALK1的另一个部分结合。在一个实施方案中，该抗体结合由SEQ ID NO:1的氨基酸22-118组成的多肽并抑制选自以下的至少一种ALK1配体的结合作用：GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10。在另一个实施方案中，抗体以小于5×10-8M和任选地5×10-8M和1×10-10M之间的KD结合ALK1多肽。在一个额外的实施方案中，该抗体抑制受选自以下的至少一种ALK1配体刺激的血管生成：GDF5、GDF6和GDF7。在一些实施方案中，使用相对于由BMP9或BMP10介导的信号传导而选择性抑制由GDF5、GDF6或GDF7介导的信号传导的抗体作为组织中出现的血管生成的选择性抑制剂，在所述组织中定位有GDF5、GDF6或GDF7，主要是骨或关节。在一些实施方案中，该抗体与ALK1多肽以小于1×10-10M的KD结合。在额外的实施方案中，该抗体抑制ALK1与ALK1配体的结合，其中ALK1配体选自：BMP9和BMP10。可以局部或全身性(例如，静脉内、动脉内或皮下)递送抗-ALK1抗体。在一个特定实施方案中，本公开提供一种通过施用抗-ALK1抗体治疗哺乳动物晚期肾细胞癌的方法。
在另一个具体实施方案中，本公开提供一种通过施用如本文所述的抗-ALK1抗体和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，治疗患有肾细胞癌的哺乳动物的方法。在一个特定实施方案中，本公开提供一种通过向患有RCC的哺乳动物施用如本文所述的抗-ALK1抗体和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，治疗患有透明细胞肾细胞癌的哺乳动物的方法。在一个方面，RCC是透明细胞肾细胞癌。在另一个方面，待治疗的RCC已经侵入肾窦。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
在某些方面，本公开提供了含有VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂和与ALK1配体结合并抑制该ALK1配体与ALK1结合的抗体的组合物，其中ALK1配体选自BMP9和BMP10。值得注意地，如本文中显示，中和性抗-BMP9抗体在体内抑制血管生成。另外，如本文中展示，BMP-10刺激血管生成，而BMP-10的拮抗剂抑制血管生成。该抗体可以与ALK1配体以小于1×10-10M的KD结合。这类抗体优选地是重组抗体，并且可以配制为基本上无热原的药物制品。可以制备该药物制品用于全身性递送(例如，静脉内、动脉内或皮下递送)或局部递送。
在某些方面，本公开提供用于治疗哺乳动物中肾细胞癌的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)和与ALK1配体结合并抑制ALK1配体与ALK1结合的抗体，其中ALK1配体选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10。该抗体可以抑制受选自以下的至少一种ALK1配体刺激的血管生成：GDF5、GDF6和GDF7。在其他方面，治疗的肾细胞癌已经转移至淋巴结。在额外的方面，治疗的肾细胞癌是透明细胞肾细胞癌。
在某些方面，本公开提供了通过以下方式治疗哺乳动物中肾细胞癌的方法：向患有RCC的哺乳动物施用有效量的VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂和ALK1信号传导系统抑制剂，包括但不限于，减少ALK1、GDF5、GDF6、GDF7、BMP9或BMP10产生的核酸(例如，反义或RNAi构建体)。在另一个方面，待治疗的RCC已经侵入肾窦。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNMIV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。这类ALK1信号传导抑制剂包括但不限于可以经修饰以允许与选择的靶结合的亲和结合试剂，如适配体、随机肽和蛋白质支架(这类支架的例子包括抗运载蛋白和FNIII结构域)。这些结合试剂可以用来鉴定并选择通过破坏ALK1-配体相互作用或通过抑制结合后发生的信号传导来破坏ALK1调节系统的亲和结合试剂。在一个方面，根据这种方法治疗的RCC是透明细胞肾细胞癌。在另一个方面，待治疗的RCC已经侵入肾窦。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
在本公开的又一个方面，提供一种治疗哺乳动物中肾细胞癌在的方法，所述方法包括向患有RCC的哺乳动物施用有效量的BMP9和/或BMP10的拮抗剂以及VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，拮抗剂是与BMP9和/或BMP10结合的抗体。该抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体和嵌合抗体或人源化抗体。拮抗剂可以是Fd、Fv、Fab、F(ab')、F(ab)2或F(ab')2片段、单链Fv(scFv)、双体抗体、三体抗体、四体抗体、迷你抗体或肽体。在一些实施方案中，拮抗剂是适配体(肽或核酸)。鉴于BMP9和BMP10的拮抗剂的交叠效应，如本文中展示，本公开提供BMP9和BMP10二者的拮抗剂，如发生交叉反应并且因此有效拮抗两种蛋白质(例如，对于BMP9和BMP10二者的亲和力小于10nM或小于1nM)的抗体。结合BMP9和BMP10二者的ALK1拮抗剂的另一个例子是与BMP9和BMP10二者结合并抑制两种配体的活性的ALK1-Fc融合蛋白。在本发明的又一个方面，该方法还包括向哺乳动物施用有效量的靶向mTOR的抑制剂。在其他方面，该拮抗剂抑制BMP9和/或BMP10表达。在一些实施方案中，该拮抗剂是抑制BMP9和/或BMP10表达的核酸。例如，在一个方面，核酸是反义核酸或RNAi核酸。在其他方面，该拮抗剂是除抗体之外的与BMP9和/或BMP10结合的蛋白质。在一个方面，该拮抗剂是GDF Trap家族的成员。GDF Trap家族的例子包括但不限于卵泡抑素、FLRG、头蛋白和gremlin。在一些实施方案中，拮抗剂是一种多肽，所述多肽包含通过下述方法从氨基酸序列文库选择的氨基酸序列，所述方法包括检测与BMP9和BMP10结合的氨基酸序列的步骤。
在某些方面，本公开提供一种用于治疗哺乳动物中转移性肾细胞癌的方法。例如，这种方法可以包含向患有转移性肾细胞癌的哺乳动物施用有效量RTKI和选自以下的药物：ALK1 ECD蛋白；与ALK1配体结合并抑制ALK1配体与ALK1结合的抗体，其中ALK1配体选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10；与ALK1多肽结合的抗体由SEQ ID NO:1的氨基酸22-118组成并抑制选自以下的至少一种ALK1配体的结合作用：GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10。
在每种情况下，本文所述的药物可以与抑制血管生成的其他药物一起施用。
在一些实施方案中，本发明提供用于抑制哺乳动物中血管生成的方法，所述方法包括向有需求的哺乳动物施用有效量的ALK1信号传导系统抑制剂(例如，ALK1-Fc)。在需要抑制肿瘤的血管生成的情况下，该药物任选地与具有抗癌作用的第二种药物如化疗药或生物抗癌药一起施用。在其他方面，该药物与mTOR(mammalian target ofrapamycin，哺乳动物雷帕霉素靶)抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本发明的方法用来治疗血管生成相关疾病，所述血管生成相关疾病选自肿瘤、抵抗抗VEGF疗法的肿瘤、多发性骨髓瘤肿瘤和已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝的肿瘤。
附图说明
图1显示人激活素样激酶1的氨基酸序列，ALK1(SEQ ID NO:1)。单下划线显示预测的胞外结构域。双下划线显示胞内结构域。信号肽和跨膜结构域不加下划线。
图2显示人ALK1 cDNA的核酸序列(SEQ ID NO:2)。将编码序列加下划线。将编码胞外结构域的部分加双下划线。
图3A和图3B显示人ALK1的胞外结构域与Fc结构域的融合物的例子(SEQ ID NO:3)和(SEQ ID NO:14)。hALK1-Fc蛋白包含人ALK1蛋白的在C端与接头(加下划线)和IgG1 Fc区融合的氨基酸22-120。
图4显示用于表达SEQ ID NO:3的hALK1-Fc多肽的核酸序列。还显示编码的氨基酸序列。如此切割前导序列，从而Asp22是分泌型蛋白的N端氨基酸。
图5显示鼠ALK1-Fc(“RAP”)和人ALK1-Fc(“ACE”)在内皮细胞管形成测定法中的抗血管生成作用。RAP和ACE的全部浓度均比阳性对照-内皮抑制素更大程度地降低响应于内皮细胞生长补充物(ECGF)的管形成水平。
图6显示GDF7在鸡绒毛尿囊膜(CAM)测定法中的血管生成作用。GDF7的作用类似于VEGF的作用。
图7显示人ALK1-Fc融合物在CAM测定法中的抗血管生成作用。hALK1-Fc抑制受VEGF、FGF和GDF7刺激的血管生成。
图8显示鼠ALK1-Fc(mALK1-Fc)、hALK1-Fc、市售抗ALK1单克隆抗体(抗-ALK1 mAb)和市售中和性抗VEGF单克隆抗体的对比性抗血管生成作用。ALK1-Fc构建体的抗血管生成作用类似于抗VEGF抗体的作用。
图9显示hALK1-Fc和抗VEGF抗体的体内抗血管生成作用。hALK1-Fc和抗-VEGF对眼中的血管生成具有类似的影响，如通过小鼠角膜微囊袋测定法所测量。
图10显示mALK1-Fc在类风湿性关节炎的鼠胶原蛋白诱导型关节炎(CIA)模型中的作用。曲线显示在胶原诱导的雄性DBA/1关节炎小鼠中42日观察期期间确定的平均群组关节炎评分。RAP-041是mALK1-Fc。AvastinTM是抗VEGF抗体贝伐珠单抗。
图11显示通过Superose 1210/300 GL大小排阻柱(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)对hALK1-Fc(SEQ ID NO:3)和来自R&D Systems(Minneapolis，MN)的hALK1-Fc融合蛋白的解析。R&DSystems物质含有大约13％聚集的蛋白质，如该图左手侧上的峰所显示，以及一些低分子量种类。超过99％的SEQ ID NO:3的物质由适宜分子大小的二聚体组成。
图12显示用PBS(圆圈)和mALK1-Fc(方块)处理的小鼠中来自表达萤光素酶的Lewis肺癌(LL/2-luc)细胞的荧光信号。将肿瘤细胞注入尾静脉并且在细胞施用当日开始处理(PBS或10mg/kg mALK1-Fc腹膜内，每周二次)。PBS处理的小鼠在第22日因濒死而处死。处理组和对照组各自由7只动物组成(n＝7)。
图13显示重组人BMP9(“rhB9”)和市售抗-BMP9单克隆抗体(“mabB9”)在CAM测定法中对VEGF介导的血管生成的影响。令人好奇地，BMP9和抗-BMP9治疗药均抑制VEGF介导的血管生成。
图14显示mALK1-Fc对使用MDA-MB-231细胞系(一个源自ER-乳腺癌细胞的细胞系)的原位异体移植模型的影响。在剂量30mg/kg时，mALK1-Fc对异体移植肿瘤具有显著的生长延迟作用。
图15显示hALK1-Fc对使用MCF7细胞系(一个源自雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌细胞的细胞系)的原位异体移植模型的影响。在剂量10mg/kg或30mg/kg时，hALK1-Fc对异体移植肿瘤具有显著的生长延迟作用。
图16显示hALK1-Fc在基于细胞的测定法中抑制超过80％由BMP10诱导的转录性报道分子活性的能力。
图17显示人BMP9(SEQ ID NO:12)蛋白和BMP10(SEQ IDNO:13)蛋白的成熟部分的比对结果。同一性区域以星号显示。
图18显示hALK1-Fc在786-O人RCC异体移植模型中增强舒尼替尼的肿瘤生长抑制作用的能力。hALK1-Fc作为单一药剂还趋向抑制肿瘤生长。
图19显示hALK1-Fc作为单一药剂在A498人RCC异体移植模型中抑制肿瘤生长的能力。
图20显示hALK1-Fc在A498人RCC异体移植模型中增强舒尼替尼的肿瘤生长抑制作用的能力。
发明详述
1.概述
肾细胞癌
世界卫生组织列出超过50种不同类型的肾癌。肾细胞癌(RCC)是在成年人中最常见类型的肾癌并且当癌细胞在肾脏的肾小管衬层形成时产生。RCC以缺少早期警告体征、临床表现多样和抵抗化疗和放疗为特征。大部分RCC肿瘤存在于年龄在50岁和70岁之间的患者中并且本病的发病率在男性中高2至3倍。某些遗传疾病与增加的RCC发病率相关，包括Hippel-Lindau(VHL)综合征、遗传性乳头状肾癌、与Birt-Hogg-Dubé综合征相关的家族性肾嗜酸细胞瘤和遗传性肾癌。30％的患者表现RCC进展期，患有转移性或不可切除的疾病，并且这个队列的2年总生存期是<10％。Reeves等人，CancerChemotherapy and Pharmacology 2009；64(1):11-25。
目前确认RCC的5个主要亚型，包括透明细胞RCC(最常见RCC亚型)、乳头状(I型和II型)RCC、嫌色性RCC、集合管RCC和未分类的RCC。另外，解剖标准传统上用来区分RCC的不同分期。肿瘤、淋巴结和转移(TMN)分类系统基于肿瘤原始尺寸、肿瘤扩散至淋巴结的程度和区分RCC分期的转移的存在。肿瘤分期是RCC中预示存活的最重要因素。Koul等人，Am.J.Cancer Research 2011；1(2):240-254。超过50％的早期RCC患者治愈。在某些情况下，还指示根治性肾切除术治疗局部晚期RCC和转移性RCC。23％具有临床局限性病情的患者在肾切除术后形成转移性疾病。Koul等人，Am.J.Cancer Research 2011；1(2):240-254。但是，TNM III期疾病和IV期疾病的转归不良，这两类疾病以例如肿瘤在主静脉或肾上腺中存在或累及淋巴结(III期)和肾外部存在疾病(IV)为特征。
透明细胞肾细胞癌一般在肾皮质内部从肾单位近曲小管的上皮细胞产生并且趋向于通过侵入血管扩散，在18-29％的器官局限肿瘤中的肾内静脉内部发现恶性细胞。Delahunt等人，Clin.Lab.Med.2005；25(2):231-46；和Bonsib等人，Mod.Pathol.2006；19(5):746-53。对120例透明细胞肾细胞癌的充分病理学检验已经在研究的大约一半肿瘤中指出肾窦侵入。RCC最常见地转移至肺(33-72％)、腹内淋巴结(3-35％)、骨(21-25％)、脑(7-13％)和肝(5-10％)。见，例如，Klatte等人，Urol.Oncol.2008；26(6):604-9。
经常通过部分肾切除术(也称作“肾单位保留手术”)摘除局限至肾或其内部的小肿瘤。用于局限化肿瘤的其他外科手术包括组织消融治疗(例如，低温手术和射频消融术(RFA)。在其中癌症在大小方面和/或分布方面在肾内部或之外属晚期的那些情况下，手术介入一般涉及全肾切除术(即，摘除整个肾连同或不连同附近的肾上腺和肾周围的脂肪组织)。这种手术是肾癌的传统标准介入疗法。在某些情况下，还指示根治性肾切除术治疗局部晚期RCC和转移性RCC。23％具有临床局限性病情的患者在肾切除术后形成转移性疾病。Koul等人，Am JCancer Research 2011；1(2):240-254。
采用免疫刺激性细胞因子如白介素-2(IL-2)和干扰素-α(IFN-α)的免疫疗法是RCC的主流全身性疗法。已经报道高剂量静脉内的IL-2产生15-20％缓解率、6-8％完全缓解率和大约5％治愈率。Koul等人，Am J Cancer Research 2011；1(2):240-254。然而，这种方案是相当有毒的。IFN-α产生更适中的生存期益处，但是具有更有利的毒性谱。
ALK1
ALK1是配体TGF-β超家族的I型细胞表面受体并且又称作ACVRL1和ACVRLK1。ALK1已经作为TGF-β1、TGF-β3和BMP-9的受体涉及(Marchuk等人，2003；Hum.Mol.Genet.12:R97-R112和Brown等人，2005；J.Biol.Chem.280(26):25111-8)。
在小鼠中，ALK1中的功能丧失型突变导致正在发育的血管系统的多种异常(Oh等人，2000；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:2626–31和Urness等人，2000；Nat.Genet.26:328–31)。
在人类中，ALK1中的功能丧失型突变与遗传出血性毛细血管扩张症(HHT或Osler–Rendu–Weber综合征)相关，其中患者形成导致在无居间毛细血管床的情况下从动脉直接流(连同)至静脉(动静脉短路)的动静脉畸形。HHT患者的常见症状包括复发性鼻衄、胃肠道出血、皮肤及粘膜皮肤毛细管扩张和肺、脑或肝血管系统中动静脉畸形(AVM)。
来自David等人(Blood 2007；109(5):1953-61)和Scharpfenecker等人(J.Cell Sci.2007120(6):964-72)等人的最新发表论文得出结论：BMP9和BMP10激活内皮细胞中的ALK1并且这种激活的结果是抑制内皮细胞增殖和移行。这些提出的ALK1激活效应直接对抗促血管生成因子如VEGF的那些效应。因此，这些发表论文得出结论：BMP9和BMP10本身是抗血管生成性因子，并且进一步得出结论：ALK1激活具有抗血管生成作用。相反，本公开表明BMP9和BMP10的拮抗剂而非激动剂具有抗血管生成作用。
本公开涉及以下发现：包含ALK1胞外结构域的一部分的多肽(“ALK1 ECD多肽”)可以在体内抑制RCC癌生长。更具体地，如下文讨论，本公开描述了ALK1 ECD拮抗剂展示ALK1参与影响VEGF非依赖性血管生成和多种血管生成性因子(包括VEGF、FGF和PDGF)介导的血管生成的用途。本公开还涉及以下出乎意料的发现：ALK1ECD拮抗剂如ALK1-Fc能够在人RCC异体移植模型中在体内抑制RCC肿瘤生长并且还能够在人RCC异体移植模型中大幅度改善舒尼替尼的肿瘤抑制活性。
本公开另外涉及以下发现：包含ALK1胞外结构域的一部分的多肽(“ALK1 ECD多肽”)可以用来在体内抑制RCC癌生长，包括VEGF非依赖性血管生成和多种血管生成性因子(包括VEGF、FGF和PDGF)介导的血管生成。
本公开还涉及以下发现：包含ALK1胞外结构域的一部分的多肽(“ALK1 ECD多肽”)可以用来在体内抑制RCC癌生长，包括VEGF非依赖性血管生成和多种血管生成性因子(包括VEGF、FGF和PDGF)介导的血管生成。部分地，本公开提供ALK1的生理学高亲和力配体的特性并且展示ALK1 ECD多肽抑制血管生成。
部分地，本公开提供ALK1的生理学高亲和力配体的特性并且展示ALK1 ECD多肽抑制血管生成。本文中展示的数据显示ALK1 ECD多肽可以产生抗血管生成作用，甚至在其中ALK1 ECD多肽不显示与TGF-β1有意义结合的情况下也是如此。另外，ALK1 ECD多肽抑制受许多不同促血管生成因子(包括VEGF、FGF和GDF7)刺激的血管生成。因此，本公开提供对一种ALK1调节系统的描述，其中ALK1是GDF5组配体的受体，所述GDF5组包括GDF6和GDF7，并且还是BMP9组配体的受体，所述BMP9组包括BMP10，对两个组的配体具有不同亲和力。另外，本公开表明，由ALK1和上述配体介导的信号传导在体内促血管生成，并且抑制这个调节系统具有强力的体内抗血管生成作用。
因此，在某些方面，本公开提供用于治疗肾细胞癌的ALK1调节系统拮抗剂，包括ALK1受体或一种或多种ALK1配体的拮抗剂，用于抑制血管生成，包括VEGF依赖性血管生成和VEGF非依赖性血管生成。但是，应当指出针对ALK1本身的抗体期望具有不同于ALK1ECD多肽的作用。一种针对ALK1的泛中和抗体(抑制全部强配体和弱配体结合的抗体)将预计抑制这类配体经过ALK1进行的信号传导，但是将预计不抑制这类配体经过其他受体进行信号传导的能力(例如，BMPR1a、BMPR1b、在GDF5-7的情况下BMPRII以及在TGFβ的情况下BMP9-10和TBRI及TBRII)。在另一方面，ALK1 ECD多肽将预计抑制与它紧密结合的全部配体，例如包括，构建体如实施例中所示的那种、GDF5-7和BMP9-10，但是将不影响与它微弱结合的配体，如TGF-β。因而，尽管针对ALK1的泛中和抗体将阻断经过ALK1的BMP9和TGF-β信号传导，但是抗体将不阻断BMP9和TGF-β经过另一种受体的信号传导，并且尽管ALK1 ECD多肽可以抑制BMP9经过全部受体的信号传导(甚至除ALK1之外的受体)，但是将预计它不抑制TGF-β经过任何受体、甚至经ALK1的信号传导。
在本公开的上下文范围内和在使用每个术语的具体上下文中，本说明书中所用的术语通常具有本领域的普通意思。某些术语在本说明书中讨论，以为实施者在描述本文所公开的组合物和方法和如何制得并使用它们方面提供额外指导。某个术语的任何用途的范围或含义将从使用该术语的具体上下文中显而易见。
2.可溶性ALK1多肽
天然存在的ALK1蛋白是跨膜蛋白，该蛋白质的一部分位于细胞外部(胞外部分)并且该蛋白质的一部分位于细胞内部(胞内部分)。本公开的多个方面涵盖包含ALK1胞外结构域的一部分的多肽。
在某些实施方案中，本公开提供“ALK1 ECD多肽”。术语“ALK1ECD多肽”意指一种多肽，所述多肽由天然存在的ALK1多肽的胞外结构域的氨基酸序列组成或包含该氨基酸序列，包括或不包括任何信号序列和该信号序列N末端的序列，或由下述氨基酸序列组成或包含该氨基酸序列，所述氨基酸序列与天然存在的ALK1多肽的胞外结构域至少33％相同，并且任选地与天然存在的ALK1多肽的胞外结构域的序列至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，如通过SEQ ID NO:1的氨基酸34-95的半胱氨酸结区域或在该胞外结构域的N末端和C末端处的半胱氨酸结外加额外氨基酸(如SEQ IDNO.1的氨基酸22-118或22-120)所例举。
同样地，ALK1 ECD多肽可以包含多肽，所述多肽由SEQ IDNO:2的核苷酸100-285或其沉默变体或与其互补物在严格杂交条件下杂交(通常，这类条件是本领域已知的，但是可以例如涉及在50％v/v甲酰胺、5xSSC、2％w/v封闭剂、0.1％N-月桂酰肌氨酸、0.3％SDS中于65℃杂交过夜并在例如5xSSC中于约65℃洗涤)的核酸编码。另外，ALK1 ECD多肽可以包含多肽，所述多肽由SEQ ID NO:2的核苷酸64-384或其沉默变体或与其互补物在严格杂交条件下杂交(通常，这类条件是本领域已知的，但是可以例如涉及在50％v/v甲酰胺、5xSSC、2％w/v封闭剂、0.1％N-月桂酰肌氨酸、0.3％SDS中于65℃杂交过夜并在例如5xSSC中于约65℃洗涤)的核酸编码。术语“ALK1ECD多肽”因此涵盖ALK1多肽、其变体(包括例如在序列中包含与SEQ ID NO:1的氨基酸22-118或22-120相对应的不多于2、3、4、5或10个氨基酸置换、添加或缺失的变体并且包括在序列中包含与SEQID NO:1的氨基酸34-95相对应的不多于2、3、4、5或10个氨基酸置换、添加或缺失的变体)、其片段和包含前述任一者的融合蛋白的分离的胞外部分，但是在每种情况下优选地，任一前述ALK1 ECD多肽均将保留针对GDF5、GDF6、GDF7、BMP9或BMP10中一者或多者的大部分亲和力。术语“ALK1 ECD多肽”明确地意在排除任何全长、天然存在的ALK1多肽。通常，ALK1 ECD多肽将设计成在有生物学意义的温度、pH水平和克分子渗透压浓度可溶于水溶液中。
如上文所述的，本公开提供与天然存在的ALK1多肽共享指定的序列同一性程度或相似性的ALK1 ECD多肽。为确定两个氨基酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。随后比较相应氨基酸位置处的氨基酸残基。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基占据时，则该分子在这个位置处是相同的(如本文所用，氨基酸“同一性”等同于氨基酸“同源性”)。考虑到为最佳比对这两个序列而需要引入的空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分数随所述序列共有的相同位置变化而变化。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性和相似性百分数的计算。(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编著,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informaticsand Genome Projects,Smith,D.W.编著,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著,Humana Press,New Jersey,1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编著,MStockton Press,New York,1991)。
在一个实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分数可以使用已经集成至GCG软件包的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)中的Needlema和Wunsch(J.Mol.Biol.1970；(48):444-453)算法来确定。在一个具体实施方案中，以下参数用于GAP程序中：Blosum 62矩阵或PAM250矩阵，和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6。在又一个实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(Devereux等人，Nucleic Acids Res.1984；12(1):387)(在http://www.gcg.com可获得)，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。示例性参数包括使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6。除非另外说明，使用Blosum 62矩阵、空位权重10和长度权重3，利用GAP程序确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数，并且如果这类算法不能计算所需的同一性百分数，则应当选择本文中公开的合适替代方法。
在另一个实施方案中，可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Myers和W.Miller算法(CABIOS,1989；4:11-17)确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。
可以使用基于Brutlag等人算法的FASTDB计算机程序(Comp.App.Biosci.,1990；6:237-245)确定用于确定两个氨基酸序列之间最佳总体比对的另一个实施方案。在序列比对中，查询序列和主题序列均是氨基酸序列。所述总体序列比对的结果以同一性百分数展示。在一个实施方案中，基于Brutlag等人算法的FASTDB计算机程序(Comp.App.Biosci.,1990；6:237-245)确定氨基酸序列同一性。在一个具体实施方案中，用来计算同一性百分数和氨基酸比对结果的相似性的参数包括：矩阵＝PAM150，K-tuple＝2，错配罚分＝1，接合罚分＝20，随机化分组长度＝0，临界评分＝1，空位罚分＝5和空位大小罚分＝0.05。
在某些实施方案中，ALK1 ECD多肽包含天然存在ALK1蛋白的胞外部分，如SEQ ID NO:1的序列，和优选地ALK1胞外结构域的配体结合部分。在实施方案中，可溶性ALK1 ECD多肽包含与SEQ IDNO:1的氨基酸22-118或22-120的氨基酸序列至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，截短的胞外ALK1多肽包含SEQ ID NO:1的胞外部分的氨基酸序列的至少30、40或50个连续氨基酸。
在优选的实施方案中，ALK1 ECD多肽与GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的一者或多者结合。任选地，该ALK1多肽不显示与TGF-β1或TGF-β3实质结合。可以使用纯化的蛋白质在溶液中或在表面等离子体共振系统，如BiacoreTM系统中评估结合作用。优选的可溶性ALK1多肽将显示抗血管生成活性。用于血管生成抑制剂活性的生物测定法包括鸡绒毛尿囊膜(CAM)测定法、小鼠角膜微囊袋测定法或本领域已知用于测量施用分离的或合成的蛋白质对所植入肿瘤的作用的测定法。CAM测定法由O'Reilly等人在"AngiogenicRegulation of Metastatic Growth(转移性生长的血管生成调节)"Cell,1994；79(2):315-328中描述。简而言之，将具有完整卵黄的3日龄鸡从卵中取出并置于皮式培养皿中。在3日温育后，将含有待测试蛋白质的甲基纤维素圆片施加单个胚胎的CAM。在48小时温育后，观察胚胎和CAM以确定内皮生长是否已被抑制。小鼠角膜微囊袋测定法涉及在小鼠的角膜中植入含有生长因子的丸粒，连同另一个丸粒含有疑似内皮生长抑制剂，并且观察在角膜中精致布局的毛细血管的样式。在实施例中描述其他测定法。
可以通过移除ALK1 ECD多肽的胞质尾和跨膜区产生ALK1ECD多肽。可选地，可以通过缺失或通过用亲水氨基酸残基置换构成跨膜结构域的通常疏水的氨基酸残基，使跨膜结构域失活。在任何一种情况下，产生基本上亲水的亲水性图，这将降低脂质亲和力并改善水溶解性。相对于用亲水氨基酸残基置换，优选缺失跨膜结构域，因为这避免引入可能有免疫原性的表位。
ALK1 ECD多肽可以另外在N末端包含多种前导序列中的任一种。这种序列将允许肽表达和靶向至真核系统中的分泌途径。见，例如，Ernst等人，美国专利号5,082,783。可选地，天然ALK1信号序列可以用来实现从细胞排出。可能的前导序列包括天然tPa前导序列和蜜蜂蜂毒肽前导序列(分别是SEQ ID Nos.7-9)。信号肽的加工可以根据选择的前导序列、使用的细胞类型和培养条件连同其他变量变动，并且因此，成熟ALK1 ECD多肽的实际N末端起始位点，包括SEQ IDNO:5的实际N末端起始位点，可以按N端或C端方向移动1-5个氨基酸。
在某些实施方案中，本公开构思ALK1多肽的特定突变，从而改变该多肽的糖基化。可以如此选择这类突变，从而引入或消除一个或多个糖基化位点，如O联或N联糖基化位点。天冬酰胺联糖基化识别位点通常上包含由适宜的细胞性糖基化酶特异性识别的三肽序列：天冬酰胺-X-苏氨酸(或天冬酰胺-X-丝氨酸)(其中X是任何氨基酸)。也可以通过对野生型ALK1多肽的序列添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基，产生这种变异(对O-联糖基化位点而言)。在糖基化识别位点的第一或第三氨基酸位置中一个位置或两个位置处的多个氨基酸置换或缺失(和/或在第二位置处的氨基酸缺失)导致在修饰的三肽序列处的非糖基化。在ALK1多肽上增加糖部分数目的另一种手段是通过糖苷与ALK1多肽的化学偶联或酶促偶联。取决于使用的偶联模式，糖)可以连接至(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离硫氢基，如半胱氨酸的那些；(d)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些；(e)芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法在1987年9月11日公开的WO 87/05330以及在中的Aplin和Wriston，(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页中描述，所述文献通过引用的方式并入本文。可以化学地和/或酶促地实现移除存在于ALK1多肽上的一个或多个糖部分。化学去糖基化可以例如涉及ALK1多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物。这种处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖裂解，同时留下完整氨基酸序列。化学去糖基化由Hakimuddin等人，(1987)Arch.Biochem.Biophys.259:52和Edge等人，Anal.Biochem.1981；118:131进一步描述。可以通过使用多种内切和外切糖苷酶实现ALK1多肽上糖部分的酶促裂解，如Thotakura等人，(1987)Meth.Enzymol.138:350所描述。如果适宜，可以根据所用表达系统的类型调整ALK1多肽的序列，如哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞均可以引入可能受肽的氨基酸序列影响的差异性糖基化模式。通常而言，用于人类中的ALK1蛋白将在提供正确糖基化的哺乳动物细胞系(如HEK293或CHO细胞系)中表达，不过预期其他哺乳动物表达细胞系、具有工程化糖基化酶的酵母细胞系和昆虫细胞也有用。
本公开还构思了的一种产生突变体、尤其ALK1多肽组合突变体集合以及截短突变体的方法；组合突变体集合特别可用于鉴定功能性变体序列。筛选这类组合文库的目的可以是产生例如可以充当激动剂或拮抗剂或可选地总体拥有新活性的ALK1多肽变体。下文提供多种筛选分析法，并且此类测定法可以用来评价变体。例如，可以对一种ALK1多肽变体筛选与结合ALK1配体的能力、防止ALK1配体与ALK1多肽结合的能力或干扰由ALK1配体引起的信号传导的能力。ALK1多肽或其变体的活性也可以在基于细胞或体内的测定法、特别在实施例中公开的任一种测定法中测试。
可以生成组合方式衍生的变体，相对于包含天然存在ALK1多肽的胞外结构域的ALK1 ECD多肽，所述变体具有选择性或总体上增加的效力。同样地，诱变可以产生具有与相应野生型ALK1 ECD多肽明显不同的血清半寿期大的变体。例如，可以使得改变的蛋白质对蛋白酶解性降解或导致天然ALK1 ECD多肽破坏或否则其消除或失活的其他处理更稳定或更不稳定。这类变体和编码它们的基因可以用来通过调节ALK1多肽的半寿期，改变ALK1 ECD多肽水平。例如，短半寿期可以产生更短暂的生物学效果并且可以允许更紧密控制患者内部的重组ALK1 ECD多肽水平。在Fc融合蛋白中，可以在接头(如果有的话)和/或Fc部分中产生突变以改变蛋白质的半寿期。
可以通过编码多肽文库的基因的简并文库产生组合文库，其中所述肽各自包含潜在ALK1多肽序列的至少一部分。例如，合成性寡核苷酸的混合物可以如此酶促连接入基因序列中，从而潜在ALK1多肽核苷酸序列的简并集合可表达为单个多肽，或可选地，表述为一组较大融合蛋白(例如，对于噬菌体展示而言)。
存在可以借此从简并寡核苷酸序列生成潜在ALK1 ECD变体的文库的许多方式。可以在自动DNA合成仪上实施简并基因序列的化学合成，并且合成性基因随后可以连接入用于表达的适宜载体中。简并寡核苷酸的合成是本领域熟知的(见例如Narang,SA Tetrahedron1983；39:3；Itakura等人，Recombinant DNA,Proc.3rd ClevelandSympos.Macromolecules,ed.AG Walton,Amsterdam:Elsevierpp273-289；Itakura等人，(1984)Annu.Rev.Biochem.1981；53:323；Itakura等人，(1984)Science 1984；198:1056；Ike等人，Nucleic AcidRes.1983:1983；11:477)。这类技术已经用于其他蛋白质的定向进化(见，例如，Scott等人，Science 1990；249:386-390；Roberts等人，(1992)PNAS USA 89:2429-2433；Devlin等人，Science 1990；249:404-406；Cwirla等人，(1990)PNAS USA 87:6378-6382；以及美国专利号5,223,409、5,198,346和5,096,815)。
可选地，其他形式的诱变可以用来生成组合文库。例如，可以通过使用例如丙氨酸扫描法诱变等(Ruf等人，Biochemistry 1994；33:1565-1572；Wang等人，J.Biol.Chem.1994；269:3095-3099；Balint等人，Gene 1993；137:109-118；Grodberg等人，(1993)Eur.J.Biochem.218:597-601；Nagashima等人，J.Biol.Chem.1993；268:2888-2892；Lowman等人，Biochemistry 1991；30:10832-10838；和Cunningham等人，(1989)Science 244:1081-1085)、通过接头扫描诱变(Gustin等人，Virology 1993；193:653-660；Brown等人，Mol.Cell Biol.1992；12:2644-2652；McKnight等人，Science 1982；232:316)；通过饱和诱变(Meyers等人，Science 1986；232:613)；通过PCR诱变(Leung等人，Method Cell Mol.Biol.,1989；1:11-19)；或通过随机诱变，包括化学诱变等(Miller等人，(1992)A Short Course in Bacterial Genetics,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY；和Greener等人，Strategies inMol Biol 1994；7:32-34)筛选，从文库生成并分离ALK1多肽变体。接头扫描诱变，特别地在组合环境下，是一种于鉴定截短(生物活性)形式ALK1多肽的诱人方法。
本领域已知广泛类型的技术用于筛选通过点突变和截短产生的组合文库的基因产物，并且因此，用于对cDNA文库筛选具有某种特性的基因产物。这类技术将总体上适应于快速筛选通过组合诱变ALK1多肽产生的基因文库。最广泛使用的用于筛选大型基因文库的技术一般包括将基因文库克隆至复制型表达载体中，用所产生的载体文库转化适宜的细胞并在如下条件下表达组合基因，在所述条件下，检测所需的活性促进相对容易地分离编码检出其产物的基因的载体。优选的测定法包括ALK1配体结合测定法和配体介导的细胞信号传导测定法。
在某些实施方案中，ALK1 ECD多肽还可以包含相对于ALK1多肽中天然存在的任何修饰为额外的翻译后修饰。这类修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰化。因此，修饰的ALK1ECD多肽可以含有非氨基酸组分，如聚乙二醇、脂质、聚糖或单糖和磷酸酯。可以如本文对其他ALK1 ECD多肽变体所述那样检验这类非氨基酸组分对ALK1 ECD多肽的官能团的影响。当ALK1 ECD多肽在细胞中通过切割新生形式的ALK1多肽产生时，翻译后加工也可能对蛋白质的正确折叠和/或功能重要。不同细胞(如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)具有用于这类翻译后活性的特定细胞装置和特征性机制并且可以如此选择以确保ALK1多肽的正确修饰和加工。
在某些方面，ALK1 ECD多肽的功能性变体或修饰形式包括具有ALK1 ECD多肽的至少一部分和一个或多个融合物结构域的融合蛋白。这类融合结构域的熟知例子包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可以如此选择融合结构域，从而赋予所需的特性。例如，一些融合结构域特别可用于通过亲和层析分离融合蛋白。出于亲和纯化的目的，使用用于亲和层析的相关基质，如谷胱甘肽缀合的淀粉酶缀合的和镍缀合的或钴缀合的树脂。这类基质中许多以“试剂盒”形式可获得，如可随(HIS6)融合配偶物使用的Pharmacia GST纯化系统和QIAexpressTM系统(Qiagen)。
作为另一个例子，可以如此选择融合结构域，从而促进ALK1ECD多肽的检测。这类检测结构域的例子包括多种荧光蛋白(例如，GFP)以及“表位标签”，所述表位标签通常是可获得其特异性抗体的短肽序列。容易可获得其特异性单克隆抗体的熟知表位标签包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，融合结构域具有蛋白酶切割位点，如因子Xa或凝血酶的切割位点，这允许相关蛋白酶部分地消化该融合蛋白并因而从中释放重组蛋白。释放的蛋白质随后可以通过后续色谱层析与融合结构域分离。在某些优选的实施方案中，ALK1 ECD多肽与在体内稳定ALK1多肽(“稳定”结构域)的结构域融合。“稳定”意指增加血清半寿期的任何事物，无论这种增加是否因破坏减少、肾清除作用减少或其他药物代谢动力学效应所致。已知与免疫球蛋白的Fc部分融合向广泛类型的蛋白质赋予合乎需要的药物代谢动力学特性。同样地，与人血清白蛋白融合可以赋予合乎需要的特性。可以选择的其他类型的融合结构域包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)结构域和功能性结构域。
作为一个具体例子，本公开提供一种包含与一种Fc结构域(例如，SEQ ID NO:6)融合的可溶性ALK1胞外结构域的融合蛋白。
THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK*
任选地，该Fc结构域在多个残基如Asp-265、赖氨酸322和Asn-434处具有一个或多个突变。在某些情况下，相对于野生型Fc结构域，具有这些突变中一个或多个(例如，Asp-265突变)的突变Fc结构域具有降低的与Fcγ受体结合的能力。在其他情况下，相对于野生型Fc结构域，具有这些突变中一个或多个(例如，Asn-434突变)的突变Fc结构域具有增加的与MHC I类相关性Fc-受体(FcRN)结合的能力。
可以理解，融合蛋白的不同组件可以按照与所需官能团一致的任何方式布置。例如，ALK1 ECD多肽可以置于异源结构域的C末端，或，可选地，异源结构域可以置于ALK1 ECD多肽的C末端。ALK1ECD多肽结构域和异源结构域不必要在融合蛋白中是相邻的，并且可以在结构域的C-或N末端或在结构域之间包含额外的结构域或氨基酸序列。
如本文所用，术语“免疫球蛋白Fc区”或简单地“Fc”理解为意指免疫球蛋白链恒定区的羧基端部分，优选地免疫球蛋白重链恒定区的羧基端部分，或其部分。例如，免疫球蛋白Fc区可以包含1)CH1域、CH2域和CH3域，2)CH1域和CH2域，3)CH1域和CH3域，4)CH2域和CH3域，或5)两个或更多个结构域和免疫球蛋白铰链区的组合。在一个优选实施方案中，免疫球蛋白Fc区至少包含免疫球蛋白铰链区CH2域和CH3域，并且优选地缺少CH1域。
在一个实施方案中，从中衍生重链恒定区的免疫球蛋白的类别是IgG(Igγ)(γ亚类1、2、3或4)。可以使用其他类别的免疫球蛋白：IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)和IgM(Igμ)。对适宜免疫球蛋白重链恒定区的选择在美国专利号5,541,087和5,726,044中详细讨论。认为从某些免疫球蛋白类别和亚类选择特定免疫球蛋白重链恒定区序列以实现特定结果处于本领域技术能力范围内。编码免疫球蛋白Fc区的DNA构建体的部分优选地包含铰链结构域的至少一部分，和优选地Fcγ的CH3域或IgA、IgD、IgE或IgM的任一者中同源结构域的至少一部分。
另外，构思了置换或缺失免疫球蛋白重链恒定区内部的氨基酸可以用于设施本文中公开的方法和组合物。一个例子将是在上CH2区域中引入氨基酸置换以产生对Fc受体具有降低的亲和力的Fc变体(Cole等人，(1997)J.Immunol.159:3613)。
在某些实施方案中，本公开使分离和/或纯化形式的ALK1 ECD多肽可获得，所述分离和/或纯化形式的ALK1 ECD多肽与其他蛋白质和/或其他ALK1 ECD多肽种类分离或否则基本上不含(例如，至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％不含)后者。ALK1 ECD多肽将通常通过从重组核酸中表达来产生。
在某些实施方案中，本公开包括编码可溶性ALK1多肽的核酸，所述核酸包含ALK1蛋白的胞外部分的编码序列。在其他实施方案中，本公开还涉及包含这类核酸的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本公开的多肽可以在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞中表达。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。因此，本公开的一些实施方案还涉及产生ALK1 ECD多肽的方法。如本文中所展示，在SEQID NO:14中所述和在CHO细胞中表达的ALK1-Fc融合蛋白具有强力抗血管生成活性。
3.编码ALK1多肽的核酸
在某些方面，本公开提供分离和/或重组的编码任一种ALK1多肽(例如，ALK1 ECD多肽)(包括本文中公开的片段、功能性变体和融合蛋白)的核酸。例如，SEQ ID NO:2编码天然存在的人ALK1前体多肽，而SEQ ID NO:4编码与IgG1 Fc结构域融合的ALK1胞外结构域的前体。主题核酸可以是单链或双链的。这类核酸可以是DNA分子或RNA分子。这些核酸可以例如用于产生ALK1多肽的方法中或作为直接治疗药使用(例如，在反义、RNAi或基因治疗方案中)。
在某些方面，ALK1多肽的主题核酸编码还理解为包括作为SEQID NO:2或4的变体的核酸。变异核苷酸序列包括相差一个或多个核苷酸替换、添加或缺失的序列，如等位变体。
在某些实施方案中，本公开提供与SEQ ID NO:2或4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的分离或重组的核酸序列。本领域普通技术人员将理解与SEQ ID NO:2或4互补的核酸序列和SEQ ID NO:2或4的变体也处于本公开的范围内。在其他实施方案中，本公开的核酸序列可以是分离的、重组的和/或与异源核苷酸序列融合或在DNA文库中。
在其他实施方案中，本公开的核酸还包括在高严格性条件下与以SEQ ID NO:2或4命名的核苷酸序列、SEQ ID NO:2或4的互补序列或其片段杂交的核苷酸序列。如上文讨论，本领域普通技术人员将容易地理解，促进DNA杂交适宜的严格性条件可以变动。本领域普通技术人员将容易地理解，促进DNA杂交适宜的严格性条件可以变动。例如，可以进行在约45℃以6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)杂交，随后在50℃进行2.0 x SSC洗涤。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自约2.0x SSC在50℃的低严格性至约0.2x SSC在50℃的高严格性。此外，在洗涤步骤中的温度可以从低严格性条件在室温(约22℃)增加至高严格性条件在约65℃。温度和盐均可以变动，或温度或盐浓度可以保持恒定，而改变另一个变量。在一个实施方案中，本公开提供在6x SSC在室温随后2x SSC在室温洗涤的低严格性条件下杂交的核酸。
与如SEQ ID NO:2或4中所述的核酸而遗传密码字简并性而不同的分离的核酸也处于本公开的范围内。例如，众多氨基酸由多于一种三联体命名。规定相同氨基酸或同义词(例如，CAU和CAC对组氨酸同义)的密码子可以导致不影响蛋白质的氨基酸序列的“沉默突变”。但是，预期导致主题蛋白质的氨基酸序列变化的DNA序列多态性将存在于哺乳动物细胞之间。本领域技术人员将理解，在编码特定蛋白质的核酸的一个或多个核苷酸(直至约3-5％的核苷酸)中的这些变异可以因天然等位变异而存在于给定物种的个体之间。任何和全部这类核苷酸变异和所产生的氨基酸多态性均处于本公开的范围内。
在某些实施方案中，本公开的重组核酸可以在表达构建体中与一个或多个调节性核苷酸序列有效连接。调节性核苷酸序列将通常适合为表达所用的宿主细胞。本领域已知用于多种宿主细胞的众多类型的适宜表达载体和合适调节序列。一般，所述一种或多种调节性核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始序列和终止序列、翻译起始序列和终止序列和增强子或激活蛋白序列。本公开构思了如本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子或组合多于一种启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可以存在于细胞中在附加体如质粒上，或可以将表达构建体插入染色体中。在一个优选实施方案中，表达载体含有选择标记基因以允许选择转化的宿主细胞。选择标记基因是本领域熟知的并且将随所用的宿主细胞变动。
在本文中公开的某些方面，主题核酸在表达载体中提供，所述表达载体包含编码ALK1 ECD多肽并与至少一个调节序列有效连接的核苷酸序列。调节序列是本领域认可的并经选择以指导ALK1多肽的表达。因此，术语“调节序列”包括启动子、增强子及其他表达控制元件。示例性调节序列在Goeddel；Gene Expression Technology:Methodsin Enzymology,Academic Press,San Diego,CA(1990)中描述。例如，与DNA序列有效连接时控制其表达的广泛类型的表达控制序列的任一种可以用于这些载体中以表达编码ALK1多肽的DNA序列。这类有用的表达控制序列例如包括SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、RSV启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、其表达受T7 RNA聚合酶指导的T7启动子、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子(例如，Pho5)、酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多角体启动子和已知控制原核细胞或真核细胞或其病毒的基因表达的其他序列和它们的各种组合。应当理解，表达载体的设计可能取决于此类因素如待转化的宿主细胞的选择和/或需要表达的蛋白质的类型等。另外，还应当考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数和由载体编码的任何其他蛋白质的表达的能力，如抗生素标记。
可以通过将克隆的基因或其部分连接至适于原核细胞、真核细胞(酵母、鸟类、昆虫或哺乳动物)或二者中表达的载体中，产生本公开中包括的重组核酸。用于产生重组ALK1多肽的表达载具包括质粒和其他载体。例如，合适载体包括多种类型的质粒：用于原核细胞如大肠杆菌中表达的pBR322衍生型质粒、pEMBL衍生型质粒、pEX衍生型质粒、pBTac衍生型质粒和pUC衍生型质粒。
一些哺乳动物表达载体含有促进载体在细菌中增殖的原核序列和在真核细胞中表达的一个或多个真核转录单位。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生型载体是适于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的例子。这些载体的一些用来自细菌质粒(如pBR322)的序列修饰以促进在原核细胞和真核细胞中的复制和耐药选择。可选地，病毒如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或Epstein-Barr病毒的衍生物(pHEBo、pREP-衍生物和p205)可以用于真核细胞中瞬时表达蛋白质。其他病毒(包括逆转录病毒)表达系统的例子可以在对基因治疗递送系统的描述中找到。在制备质粒和在转化宿主生物中使用的多种方法是本领域熟知的。对于原核细胞和真核细胞的其他合适表达系统以及一般重组程序，见Molecular Cloning,A LaboratoryManual，第3版。Sambrook、Fritsch和Maniatis编辑(Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001)。在一些情况下，可能想要通过使用杆状病毒表达系统表达重组多肽。这类杆状病毒表达系统的例子包括pVL衍生型载体(如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生型载体(如pAcUW1)和pBlueBac衍生型载体(如含有β-gal的pBlueBacIII)。
在一个优选实施方案中，载体将设计在CHO细胞中产生主题ALK1多肽，如Pcmv-Script载体(Stratagene,La Jolla,Calif.)、pcDNA4载体(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)和pCI-neo载体(Promega,Madison,Wisc.)。如将显而易见，主题基因构建体可以用来引起主题ALK1多肽在培养方式增殖的细胞中表达，例如，以产生用于纯化的蛋白质，包括融合蛋白或变体蛋白。
本公开还涉及用包含一种或多种主题ALK1 ACD多肽的编码序列(例如，SEQ ID NO:2或4)的重组基因转染的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本文中公开的ALK1多肽可以在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞中表达。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
因此，本公开还涉及产生主题ALK1多肽(包括ALK1 ECD多肽)的方法。例如，可以在允许ALK1多肽表达发生的适宜条件下培养用编码ALK1多肽的表达载体转染的宿主细胞。ALK1多肽可以被分泌并从含有ALK1多肽的细胞和培养基的混合物分离。可选地，ALK1多肽可以留在胞质中或留在膜级分中，并且将细胞收获、裂解和并分离蛋白质分。细胞培养物包含宿主细胞、培养基和其他副产物。用于细胞培养物的合适培养基是本领域熟知的。
主体ALK1多肽可以使用纯化蛋白质的本领域已知技术，从细胞培养基、宿主细胞或二者分离，所述技术包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、电泳、采用对ALK1多肽特定表位特异的抗体的免疫亲和纯化和采用下述试剂的亲和纯化，所述试剂结合与ALK1多肽融合的结构域(例如，蛋白A柱可以用来纯化ALK1-Fc融合物)。在一个优选实施方案中，ALK1多肽是含有促进其纯化的结构域的融合蛋白。在一个优选实施方案中，通过一系列柱层析步骤实现纯化，例如以任何顺序包括三个或更多个以下步骤：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、大小排阻层析和阳离子交换层析。可以采用病毒过滤和缓冲液交换完成纯化。
在另一个实施方案中，编码纯化用前导序列(如在重组ALK1多肽的所需部分的N末端处多(His)/肠激酶切割位点序列)的融合基因可以允许使用Ni2+金属树脂，通过亲和层析纯化表达的融合蛋白。纯化用前导序列随后可以接着通过用肠激酶处理移除，以提供纯化的ALK1多肽(例如，见Hochuli等人，(1987)J.Chromatography 411:177；和Janknecht等人，PNAS USA 88:8972)。
用于产生融合基因的技术是熟知的。基本上，根据常规技术，使用平末端化或交错末端化的末端用于连接、限制性酶消化以提供适宜末端、补平粘末端(如适合)、碱性磷酸酶处理以避免不想要的接合和酶促连接，进行编码不同多肽序列的多个DNA片段的接合。在另一个实施方案中，融合基因可以通过常规技术包括(自动DNA合成仪)合成。可选地，可以使用在两个连续基因片段之间产生互补突出端的锚定引物实施基因片段的PCR扩增，其中所述互补突出端以随后复性以生成嵌合基因序列(见，例如，"Current Protocols in MolecularBiology"，Ausubel等人(编著),John Wiley&Sons,(1992))。
作为ALK1、BMP9、BMP10、GDF5、GDF6或GDF7的拮抗剂的核酸化合物类别的例子包括反义核酸、RNAi构建体和催化性核酸构建体。核酸化合物可以是单链或双链的。双链化合物可以还包括具有突出端或非互补性的区域，其中所述链的一条或另一条是单链的。单链化合物可以包括具有自我互补性的区域，意指该化合物与双螺旋结构的区域形成所谓“发夹”或“茎-环”结构。核酸化合物可以包含与下述区域互补的核苷酸序列，所述区域由全长ALK1核酸序列或配体核酸序列的不多于1000个、不多于500个、不多于250个、不多于100个或不多于50个、35个、30个、25个、22个、20个或18个核苷酸组成。互补性区域将优选地具有至少8个核苷酸，并且任选地至少10个或至少15个核苷酸，和任选地15个至25个之间的核苷酸。互补性区域可以落入内含子、靶转录物的编码序列或非编码序列如编码序列部分范围内。通常，核酸化合物将具有约8个至约500个核苷酸或碱基对长度，并且任选地，该长度将是约14个至约50个核苷酸。核酸可以是DNA(特别地用作反义)、RNA或RNA:DNA杂交分子。任一条链可以包括DNA和RNA的混合物，以及不能轻易地划归为DNA或RNA的修饰形式。同样，双链化合物可以是DNA:DNA、DNA:RNA或RNA:RNA，并且任一个链也可以包括DNA和RNA的混合物，以及不能容易地划归为DNA或RNA的修饰形式。核酸化合物可以包括多种修饰的任一种，包括对主链(天然核酸中的糖-磷酸酯部分，包括核苷酸间键)或碱基部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分)的修饰之一。反义核酸化合物将优选地具有约15个至约30个核苷酸长度并将经常含有一个或多个修饰以改善特征，如在血清中、细胞中或在其中可能递送该化合物的位置如在口服递送的化合物情况下胃和对于吸入型化合物而言肺内的稳定性。在RNAi构建体的情况下，与靶转录物互补的链将通常是RNA或其修饰物。另一条链可以是RNA、DNA或任何其他变型。双链或单链“发夹”RNAi构建体的双链体部分将优选地具有18个至40个核苷酸长度和任选地约21个至23个核苷酸长度，只要它充当Dicer底物即可。催化性或酶活性核酸可以是核酶或DNA酶并且也可以含有修饰形式。与细胞在生理条件下并以其中无义或有义对照具有微小作用或无作用的浓度接触时，核酸化合物可以抑制靶的表达约50％、75％、90％或更多。用于检验核酸化合物的作用的优选浓度是1、5和10微摩尔。也可以测试核酸化合物对例如血管生成的作用。
4.抗体
本公开的另一个方面涉及与ALK1多肽的胞外部分反应的抗体，优选地与ALK1多肽特异性反应的抗体。在一个优选实施方案中，这类抗体可以干扰ALK1与配体如GDF5、GDF6、GDF7BMP-9或BMP-10结合–应当理解针对ALK1的配体的抗体应当与成熟的加工形式的有关蛋白质结合。本公开还提供与GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和/或BMP10结合并抑制ALK1与这类配体结合的抗体。优选的抗体将在生物测定法如CAM测定法或角膜微囊袋测定法(见上文)中显示抗血管生成活性。在下文实施例10中描述优选的抗BMP9抗体。在某些实施方案中，可能需要同时抑制BMP9和BMP10的抗体；这种抗体可以在ALK1结合测定法中、在血管生成测定法中(例如，HUVEC管形成测定法、CAM测定法、基质胶测定法或本文所述的其他此类测定法)抑制两种配体。
如本文所用的术语“抗体”意在包括完整抗体，例如，任何同种型(IgG、IgA、IgM、IgE等)的完整抗体，并且包括与选择的抗原反应的免疫球蛋白的片段或结构域。可以使用常规技术使抗体片段化并且可以对片段筛选用途和/或与特定目的表位的相互作用。因此，该术语包括蛋白酶解切割的或重组制备的抗体分子部分的区段，所述区段能够选择性地与某种蛋白质反应。这类蛋白酶解性片段和/或重组片段的非限制性例子包括Fab、F(ab')2、Fab'、Fv和含有由肽接头连接的V[L]和/或V[H]结构域的单链抗体(scFv)。scFv's可以是共价地或非共价地连接以形成具有两个或更多个结合位点的抗体。术语“抗体”还包括多克隆抗体、单克隆抗体或其他纯化的制抗体和重组抗体备物。术语“重组抗体”意指从已经使用分子生物学技术构建的核酸中表达的抗体或免疫球蛋白的抗原结合结构域，如从单链抗体形成的人源化抗体或全人抗体。单结构域和单链抗体还涵盖于术语“重组抗体”。
抗体可以通过本领域已知的各种方法的任一种方法产生，所述方法包括向动物施用抗原、向携带人免疫球蛋白基因的动物施用抗原，或用抗原针对抗体文库(经常是单链抗体或抗体结构域)筛选。一旦检测到抗原结合活性，则可以将蛋白质的有关部分移植入其他抗体框架(包括全长IgG框架)中。例如，通过使用衍生自ALK1多肽或ALK1配体的免疫原(例如，BMP9或BMP10，或BMP9和BMP10二者共同的免疫原)，可以通过标准方案产生抗蛋白质/抗肽抗血清或单克隆抗体(见，例如，Antibodies:A Laboratory Manual编者Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press:1988))。如图19中所示，BMP9和BMP10具有可观的氨基酸同一性，并且因此，可以使用每种蛋白质作为免疫原以产生可以与BMP9和BMP10二者交叉反应的抗体。也可以使用序列高度相似的片段作为免疫原。哺乳动物，如小鼠、仓鼠或兔可以用肽的免疫原形式免疫(例如，ALK1多肽；或能够激发抗体反应的抗原性片段或融合蛋白)。用于向蛋白质或肽赋予免疫原性的技术包括与载体缀合或本领域熟知的其他技术。ALK1多肽或ALK1配体如BMP9或BMP10的免疫原性部分(优选地胞外部分)可以在佐剂存在的情况下施用。可以通过检测在血浆或血清中的抗体滴度监测免疫的进程。以免疫原作为抗原，标准ELISA或其他免疫测定法可以用来评估抗体的水平。
在用ALK1多肽或配体多肽(例如，BMP9或BMP10)的抗原性制备物免疫of an动物后，可以获得抗ALK1或抗配体抗血清，并且，如果需要，多克隆抗体可以从该血清分离。为了产生单克隆抗体，抗体产生细胞(淋巴细胞)可以从免疫的动物收获并且通过标准体细胞融合流程与永生化细胞如骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞。这类技术是本领域熟知的并且例如包括杂交瘤技术(最初由Kohler和Milstein开发，Nature,1975；256:495-497)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbar等人,Immunology Today,(1983；4:72)和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等人,(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.第77-96页)。可以按免疫化学方式对杂交瘤细胞筛选与本公开的哺乳动物ALK1多肽或配体如BMP9或BMP10特异性反应的抗体的产生，并且从包含这类杂交瘤细胞的培养物分离单克隆抗体。对BMP9和BMP10同时具有特异性的抗体可以选自从用BMP9或BMP10单独接种的动物获得的杂交瘤。
如本文所用的术语“抗体”意在包括其还与主题ALK1多肽或ALK1配体多肽或靶抗原的组合(例如，BMP9和BMP10)之一特异性反应的片段。可以使用常规技术使抗体片段化并且可以对片段按照如上文对完整抗体所述的相同方式筛选用途。例如，可以通过用胃蛋白酶处理抗体产生F(ab)2片段。可以处理所产生的F(ab)2片段以减少二硫键以产生Fab片段。本公开的抗体还意在包括对ALK1多肽具有亲和力的由抗体的至少一个CDR区赋予的双特异性、单链和嵌合和人源化分子。在优选的实施方案中，该抗体还包含与之连接的标记物并且是能够检测到的(例如，标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。
在某些优选的实施方案中，本公开的抗体是重组抗体，特别地人源化单克隆抗体或全人重组抗体。
如本领域中通常理解，如用来指称抗体的形容词“与…特异性反应的”意指该抗体在目的抗原(例如，ALK1多肽或ALK1配体)和其他抗原之间具有足够选择性，其中所述其他抗原不是该抗原可使用的目标，至少检测在特定类型的生物样品中目的抗原的存在。在使用抗体的某些方法中，可能需要更高程度的结合特异性。例如，用于在一种或多种并非目的的极高丰度蛋白质存在下检测低丰度目的蛋白的抗体可以表现得更好，如果该抗体在目的抗原和其他交叉反应物之间具有更高程度的选择性。单克隆抗体通常具有在目的抗原和交叉反应多肽之间有效区分的更大倾向性(与多克隆抗体相比)。此外，有效在一个类型的生物样品(例如，粪便样品)中选择性鉴定目的抗原的抗体可能不如在不同类型的生物样品(例如，血液样品)中选择性鉴定相同抗原同样有效。同样地，有效在缺少其他生物杂质的纯化蛋白质制备物中鉴定目的抗原的抗体可能不如在粗制生物样品如血样或尿样中选择性鉴定目的抗原同样有效。因此，在优选的实施方案中，本申请了提供已经对样品类型中目的抗原展示特异性的抗体，其中所述样品类型可能是使用该抗体所选择的样品类型。
影响抗体:抗原相互作用的特异性的一个特征是抗体对该抗原的亲和力。虽然所需的特异性可以以一系列不同的亲和力达到，但是通常优选的抗体将具有约10-6、10-7、10-8、10-9或更小的亲和力(解离常数)。鉴于TGFβ对ALK1的结合亲和力明显低，预期许多抗ALK1抗体将抑制TGFβ结合。但是，GDF 5、6、7组配体以大约5×10-8M的KD结合并且BMP 9、BMP 10配体以大约1×10-10M的KD结合。因此，可以选择亲和力适宜的抗体以干扰这些配体的信号传导活性。
此外，用来筛选抗体以鉴定目的抗体的技术可以影响获得的抗体的特性。例如，待用于某些治疗目的的抗体将优选地能够靶向特定细胞类型。因此，为了获得这种类型的抗体，可能需要筛选与表达目的抗原的细胞结合的抗体(例如，通过荧光激活细胞分选)。同样地，如果抗体待用于结合在溶液中的抗原，可能需要检验溶液结合作用。多种不同技术可用于检验抗体:抗原相互作用以鉴定特别合乎需要的抗体。这类技术包括ELISA、表面等离子体共振结合测定法(例如，Biacore结合测定法，Bia-core AB，Uppsala，瑞典)、夹心测定法(例如，IGEN International,Inc.的顺磁珠系统，Gaithersburg，Maryland)、蛋白质印迹法、免疫沉淀测定法和免疫组织化学。
在一个优选实施方案中，本文中公开的抗体是与人BMP9的成熟部分结合的抗体，以下显示所述成熟部分的氨基酸序列：
RS AGAGSHCQKT SLRVNFEDIG WDSWIIAPKEYEAYECKGGC FFPLADDVTP TKHAIVQTLV HLKFPTKVGKACCVPTKLSP ISVLYKDDMG VPTLKYHYEG MSVAECGCR(SEQ ID NO:12)
在一个额外的实施方案中，本文中公开的抗体是与人BMP10的成熟部分结合的抗体，以下显示所述成熟部分的氨基酸序列：
NAKG NYCKRTPLYI DFKEIGWDSW IIAPPGYEAYECRGVCNYPL AEHLTPTKHA IIQALVHLKN SQKASKACCVPTKLEPISIL YLDKGVVTYK FKYEGMAVSE CGCR(SEQ ID NO:13)。
另外，与BMP9或BMP10结合的非抗体蛋白质可以通过从文库选择来生成。广泛类型的技术可用于选择与特定配体结合的随机肽以及基于框架的蛋白质。通常而言，鉴定有用非抗体蛋白质的方案将涉及从文库筛选或选择与BMP9和/或BMP10结合或抑制BMP9或BMP10活性如受体(例如，ALK1)结合作用或细胞信号传导(例如，SMAD 1/5信号传导)的那些蛋白质。
5.抗体和Fc-融合蛋白中的改变
本申请还提供含有工程化Fc区或变异Fc区的抗体和ALK1-Fc融合蛋白。这类抗体和Fc融合蛋白可以例如用于调节效应子功能如抗原依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)。另外，修饰可以改善抗体和Fc融合蛋白的稳定性。通过将适宜的核苷酸变化导入DNA中或通过肽合成，制备抗体和Fc融合蛋白的氨基酸序列变体。这类变体包括例如，从本文中公开的抗体和Fc融合蛋白的氨基酸序列内部缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列和/或置换所述氨基酸序列内部的残基。产生缺失、插入和置换的任意组合以实现最终构建体，只要所述最终构建体拥有想要的特征。氨基酸变化也可以改变抗抗体和Fc融合蛋白的翻译后过程，如改变糖基化位点的数目或位置。
可以通过在氨基酸序列中引入变化，产生具有减少的效应子功能的抗体和Fc融合蛋白，所述变化包括但是不是限于由Bluestone等人描述的Ala-Ala突变(见WO 94/28027和WO 98/47531；还见Xu等人，2000 Cell Immunol 200；16-26)。因此在某些实施方案中，在恒定区内部含有突变(包括Ala-Ala突变)的本公开抗体和Fc融合蛋白可以用来减少或消除效应子功能。根据这些实施方案，抗体和Fc融合蛋白可以在第234位置包含变成丙氨酸的突变或在第235位置包含变成丙氨酸的突变或其组合。在一个实施方案中，抗体或Fc融合蛋白包含IgG4框架，其中Ala-Ala突变将描述在第234位置处从苯丙氨酸至丙氨酸的突变和/或在第235位置处从亮氨酸至丙氨酸的突变。在另一个实施方案中，抗体或Fc融合蛋白包含IgG1框架，其中Ala-Ala突变将描述在第234位置处从亮氨酸至丙氨酸的突变和/或在第235位置处从亮氨酸至丙氨酸的突变。抗体或Fc融合蛋白可以备选或另外地携带其他突变，包括CH2域中的点突变K322A(Hezareh等人，2001；J.Virol.75:12161-8)。
在具体的实施方案中，修饰抗体或Fc融合蛋白以增强或抑制补体依赖的细胞毒性(CDC)。可以通过在Fc区中引入一个或多个氨基酸置换、插入或缺失，实现调节的CDC活性(见，例如，美国专利号6,194,551)。备选或另外，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，因而允许在该区域内形成链间二硫键。如此生成的同型二聚体抗体可以具有改善的或降低的内化能力和/或增加或减少的补体介导的细胞杀伤作用。见Caron等人，J.Exp Med.1992；176:1191-1195和Shopes,B.(1992)；J.Immunol.148:2918-2922、WO 99/51642、Duncan和WinterNatureb,1988；322:738-40；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
6.用于治疗肾细胞癌、调节血管生成和治疗其他病症的方法和组合物
本公开提供通过以下方式治疗哺乳动物中肾细胞癌的方法：向哺乳动物施用有效量的ALK1 ECD多肽，如ALK1-Fc融合蛋白，或本文中公开的抗体，如针对GDF5、GDF6、GDF7、BMP9、BMP10或ALK1 ECD的抗体或前述任一者的核酸拮抗剂(例如，反义或siRNA)，此后统称为“治疗药”或“ALK1“拮抗剂。预期这些治疗药作为单一药剂或与其他RCC治疗药组合可用于治疗肾细胞癌。
具体而言，本公开的多肽治疗药具有使其作为治疗RCC的治疗药特别有吸引力的几种特性。例如，不同于大多数生物药剂，ALK1ECD多肽通过调节促进并支持肿瘤生长、增殖和肿瘤血管生成的多个因子影响肾细胞生长。这在以下癌中是高度有意义的，其中癌将经常具有与驱动例如肿瘤生长、增殖、血管生成和转移的多条不同信号传导途径相关的突变。因此，本文中公开的治疗药在如下方面特别有效：治疗抵抗靶向单一血管生成性因子的药物(例如，贝伐珠单抗，其靶向VEGF)的肿瘤如肾细胞癌，同时提供拮抗ALK1活性的潜力，所述ALK1在活化的内皮细胞上选择性表达和似乎在调节这些细胞对驱动肿瘤血管生成和细胞增殖的多种因子如BMP9、VEGF和FGF的反应方面发挥重要作用。
如本文中展示，ALK1-Fc融合蛋白有效在人RCC异体移植模型中减少肿瘤的体内肿瘤生长。因此，预期本文中公开的ALK1 ECD多肽如ALK1-Fc融合蛋白和其他治疗药可用于单独(即，单一药剂)疗法中以治疗肾细胞癌。另外，如本文中进一步公开，ALK1-Fc融合蛋白显著地在测试的每种人RCC异体移植模型中增加舒尼替尼(晚期RCC的当前护理标准药)的肿瘤生长抑制活性。因此，预期本文中公开的ALK1 ECD多肽如ALK1-Fc融合蛋白和其他治疗药可用于采用与其他药物(如受体酪氨酸激酶抑制剂)的联合疗法中以治疗肾细胞癌。
如本文所用，术语“治疗”或“处理”指将外源治疗药、诊断剂或组合物接触于或施用至哺乳动物(例如，人类受试者)、细胞、组织、器官或生物流体，并且可以例如指治疗方法、药物代谢动力学方法、诊断方法、研究方法和实验性方法。“治疗”或“疗法”包括施用ALK1ECD多肽如ALK1-Fc融合蛋白或其他ALK拮抗剂以阻止或延迟疾病、病状或病症的症状、并发症或生物化学指标的发作、减轻症状或停滞或抑制疾病、病状或病症的进一步发展。治疗可以是预防性的(以阻止或延迟疾病的发作，或以阻止其临床或亚临床症状表现)或治疗性的(在疾病、病状或病症表现后抑制或减轻症状)。治疗可以是采用单独的ALK1 ECD多肽(例如，ALK1-Fc融合蛋白)或其他ALK1拮抗剂或与一种或多种额外治疗药组合。如本文所用、术语“哺乳动物”或“受试者”指哺乳动物(包括但不限于非灵长类如奶牛、猪、马、羊、奶牛、犬、猫、大鼠和小鼠)、更具体地指灵长类(包括但不限于猴、猿和人)并且甚至更具体地指人。
如本文所用，术语“有效的量”或“有效量”(例如，治疗等)指治疗药(例如，ALK1 ECD多肽如ALK1-Fc融合蛋白)的量，所述量足以实现所需的效果，如，足以在治疗的受试者或群体中减轻一种或多种疾病症状或影响，无论是否通过引起这类症状或影响的消退或抑制这类症状或影响的进展达临床上可度量的任何程度。治疗药的有效减轻任何具体疾病症状或影响(也称作“治疗有效量”)或预防具体疾病症状或影响(也称作“预防有效量”)的量可以根据多种因素变动，如患者的疾病状态、年龄和重量以及药物在患者中激发所需反应的能力。是否已经减轻疾病症状或影响可以通过常用来评估该疾病症状或影响的严重性或进展状态的任何临床测量(例如，由医疗服务提供者或实验室临床医生)来评估。
如本文所用，术语首字母缩略词“RTKI”指与VEGFR1、VEGFR2或VEGFR3结合并抑制其信号传导的小分子受体酪氨酸激酶抑制剂。RTKI可以结合并抑制除VEGFR之外的受体酪氨酸激酶，如PDGFRa、PDGFRb、RET和c-Met。同样地，RTKI可以抑制不同类别的激酶和不是细胞表面受体的激酶，如丝氨酸激酶B-raf激酶和c-raf激酶。
因此，在一个方面，本公开涉及一种治疗哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，包括向患有RCC的哺乳动物施用有效量的RTKI和ALK1 ECD多肽，如本文中公开的ALK1-Fc融合蛋白或其他ALK拮抗剂。在一个方面，ALK拮抗剂是选自以下的药物：(a)包含ALK1胞外结构域的配体结合部分的ALK1多肽；(b)与人ALK1的胞外结构域结合的抗体；(c)与人BMP9结合的抗体；和(d)与人BMP10结合的抗体。在一些方面，根据该方法使用的ALK1多肽包含具有下述氨基酸的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸22-120的序列至少90％相同。在其他方面，ALK1多肽还包含免疫球蛋白的恒定域。在其他方面，ALK1多肽还包含免疫球蛋白的Fc部分并且在额外的方面，Fc部分是人IgG1的Fc部分。在其他方面，ALK1多肽包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:14的序列至少90％相同的氨基酸序列。
在一个额外的方面，本公开涵盖一种在患有RCC并且已经接受以治疗RCC的哺乳动物中治疗肾细胞癌的方法。在具体的实施方案中，医疗操作选自肾单位保留手术、肾切除术、全肾切除术和组织消融术。在其他方面，将治疗药在医疗操作后1、2、3、4、5、6或1个月内施用至哺乳动物。
在一些方面，根据本公开方法使用的抗体结合SEQ ID NO:1的氨基酸22-118的序列内部的表位并且抑制选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的配体的结合作用。在额外的方面，该抗体与SEQ IDNO:12的氨基酸1-111的序列内部的表位结合并且抑制BMP9与受体的结合。在其他方面，该抗体与SEQ ID NO:13的氨基酸1-108的序列内部的表位结合并且抑制BMP10与受体的结合。
在一些方面，根据本发明方法使用的RTKI是舒尼替尼。
在其他实施方案中，根据本发明方法使用的RTKI不是舒尼替尼。
在一些方面，根据本发明方法使用的RTKI是索拉非尼。在额外的方面，RTKI是帕唑帕尼。在额外的方面，RTKI是阿昔替尼。在另一个方面，RTKI是替沃扎尼或凡德他尼。在额外的方面，根据该方法使用的RTKI是选自以下的药物：莫特塞尼(AMG-706)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK)、samaxanib(SU5416)、SU6668、AZD2171、XL184、XL880/GSK1363089、PF-2351066、MGCD265、ZD6474、AEE788、AG-013736、AG-013737、GW786034和ABT-869。在其他方面，该药物制品包含在国际专利申请公开号WO 97/22596、WO97/30035、WO 97/32856或WO 98/13354中公开的VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂。在额外的方面，本公开涉及一种治疗哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，包括向患有RCC(1)的哺乳动物施用有效量的(1)RTKI、(2)ALK1 ECD多肽，如公开的ALK1-Fc融合蛋白或其他ALK拮抗剂和(3)靶向哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)的抑制剂。如本文所用，术语“靶向mTOR的抑制剂”指结合至并抑制AKT/mTOR信号传导途径的信号传导的小分子抑制剂。可以根据本公开方法使用的靶向mTOR的抑制剂和用于鉴定靶向mTOR的抑制剂的测定法是本领域已知的。在一些方面，根据本发明方法使用的mTOR抑制剂是依维莫司。在其他方面，mTOR抑制剂是坦罗莫司。在额外的方面，mTOR抑制剂是选自以下的药物：WYE354、YE132(Pfizer)、PP30和PP242、AZD8055、OSI-027、Torin1、BEZ235、XL765、GDC-0980、PF-04691502和PF-05212384。
在额外的方面，根据本公开方法治疗的肾细胞癌(RCC)是透明细胞肾细胞癌。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经侵入肾窦。在其他方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
因此，根据一个方面，本公开涉及一种治疗哺乳动物中转移性肾细胞癌(RCC)的方法，包括向患有转移性RCC的哺乳动物施用有效量的RTKI和ALK1 ECD多肽，如本文中公开的ALK1-Fc融合蛋白或其他ALK拮抗剂。在一个方面，本公开涵盖一种在患有RCC并且已经接受以治疗RCC的哺乳动物中治疗肾细胞癌的方法。在具体的实施方案中，医疗操作选自肾单位保留手术、肾切除术、全肾切除术和组织消融术。在其他方面，将治疗药在医疗操作后1、2、3、4、5、6或1个月内施用至哺乳动物。
在其他方面，本公开涉及治疗已经接受采用RCC治疗药的现有疗法的哺乳动物的方法。在又一个方面，本公开涵盖一种治疗先前已经接受过RCC治疗药的哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的选自以下的药物：(a)包含ALK1胞外结构域的配体结合部分的ALK1多肽；(b)与人ALK1的胞外结构域结合的抗体；(c)与人BMP9结合的抗体；和(d)与人BMP10结合的抗体。在一些方面，根据该方法使用的ALK1多肽包含具有下述氨基酸的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸22-120的序列至少90％相同。在其他方面，ALK1多肽还包含免疫球蛋白的恒定域。在其他方面，ALK1多肽还包含免疫球蛋白的Fc部分并且在额外的方面，Fc部分是人IgG1的Fc部分。在其他方面，ALK1多肽包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:14的序列至少90％相同的氨基酸序列。
在一些方面，根据本公开方法使用的抗体结合至SEQ ID NO:1的氨基酸22-118的序列内部的表位并且抑制选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的配体的结合作用。在额外的方面，该抗体与SEQ IDNO:12的氨基酸1-111的序列内部的表位结合并且抑制BMP9与受体的结合。在其他方面，该抗体与SEQ ID NO:13的氨基酸1-108的序列内部的表位结合并且抑制BMP10与受体的结合。
在一个方面，先前接受的RCC治疗药是RTKI。在又一个方面，该RTKI是选自以下的药物：舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、阿昔替尼、替沃扎尼和凡德他尼。在另一个方面，先前接受的RCC治疗药是靶向哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)的抑制剂。在又一个方面，靶向mTOR的抑制剂是选自依维莫司和坦罗莫司的药物。在其他方面，mTOR抑制剂是选自以下的药物：WYE354、YE132(Pfizer)、PP30和PP242、AZD8055、OSI-027、Torin1、BEZ235、XL765、GDC-0980、PF-04691502和PF-05212384。
在一个额外的方面，先前接受的RCC治疗药是全身性细胞因子治疗药。在又一个方面，先前接受的RCC治疗药是干扰素α(IFN-α)或白介素-2(IL-2)。
在一些方面，根据治疗已经接受采用RCC治疗药的哺乳动物的方法所使用的RTKI是舒尼替尼。
在其他实施方案中，根据治疗已经接受采用RCC治疗药的哺乳动物的方法所使用的RTKI不是舒尼替尼。
在一些方面，根据治疗已经接受采用RCC治疗药的哺乳动物的方法所使用的RTKI是索拉非尼。在额外的方面，RTKI是帕唑帕尼。在额外的方面，RTKI是阿昔替尼。在另一个实施方案中，RTKI是替沃扎尼或凡德他尼。在额外的方面，根据该方法使用的RTKI是选自以下的药物：莫特塞尼(AMG-706)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK)、samaxanib(SU5416)、SU6668、AZD2171、XL184、XL880/GSK1363089、PF-2351066、MGCD265、ZD6474、AEE788、AG-013736、AG-013737、GW786034和ABT-869。在其他方面，该药物制品包含在国际专利申请公开号WO 97/22596、WO97/30035、WO 97/32856或WO 98/13354中公开的VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂。
在额外的方面，本公开涉及一种治疗先前已经接受过RCC治疗药的哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，包括向该哺乳动物施用有效量的(1)RTKI、(2)ALK1 ECD多肽，如公开的ALK1-Fc融合蛋白或其他ALK拮抗剂和(3)靶向哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)的抑制剂。可以根据本公开方法使用的靶向mTOR的抑制剂和用于鉴定靶向mTOR的抑制剂的测定法是本领域已知的。在一些方面，根据本发明方法使用的mTOR抑制剂是依维莫司。在其他方面，mTOR抑制剂是坦罗莫司。在其他方面，mTOR抑制剂是选自以下的药物：WYE354、YE132(Pfizer)、PP30和PP242、AZD8055、OSI-027、Torin1、BEZ235、XL765、GDC-0980、PF-04691502和PF-05212384。
在额外的方面，本公开涉及治疗先前已经接受过RCC治疗药的哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，其中根据本公开方法治疗的肾细胞癌(RCC)是透明细胞肾细胞癌。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经侵入肾窦。在其他方面，RCC是转移性肾细胞癌。在额外的方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
在其他方面，本公开涉及治疗患有RCC并正在准备接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物的方法。在一个方面，本公开涵盖一种治疗患有RCC并正在准备接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的选自以下的药物：(a)包含ALK1胞外结构域的配体结合部分的ALK1多肽；(b)与人ALK1的胞外结构域结合的抗体；(c)与人BMP9结合的抗体；和(d)与人BMP10结合的抗体。在一些方面，根据该方法使用的ALK1多肽包含具有下述氨基酸的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸22-120的序列至少90％相同。在其他方面，ALK1多肽还包含免疫球蛋白的恒定域。在其他方面，ALK1多肽还包含免疫球蛋白的Fc部分并且在额外的方面，Fc部分是人IgG1的Fc部分。在其他方面，ALK1多肽包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:14的序列至少90％相同的氨基酸序列。在一个方面，将药剂在医疗操作前至少1、2、3、4、5、6或7日施用。在另一个方面，哺乳动物在手术前已经接受一系列至少1、2、3或4次用该治疗药治疗。在另一个方面，将该药剂在选自肾单位保留手术、肾切除术、全肾切除术和组织消融术的医疗操作之前施用。
在一些实施方案中，施用抗体以治疗患有RCC并正在准备接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物。在其他实施方案中，施用的抗体与SEQ ID NO:1的氨基酸22-118的序列内部的表位结合并且抑制选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的配体的结合作用。在额外的方面，该抗体与SEQ ID NO:12的氨基酸1-111的序列内部的表位结合并且抑制BMP9与受体的结合。在其他方面，该抗体与SEQID NO:13的氨基酸1-108的序列内部的表位结合并且抑制BMP10与受体的结合。
在一些方面，将RTKI随本文中公开的ALK-1拮抗剂一起施用以治疗接受医疗操作之前的哺乳动物。在一些方面，根据治疗在接受医疗操作以治疗RCC之前的哺乳动物的方法使用的RTKI是舒尼替尼。在其他实施方案中，根据治疗在接受医疗操作以治疗RCC之前的哺乳动物的方法使用的RTKI不是舒尼替尼。
在一些方面，根据治疗在接受医疗操作以治疗RCC之前的哺乳动物的方法使用的RTKI是索拉非尼。在额外的方面，RTKI是帕唑帕尼。在额外的方面，RTKI是阿昔替尼。在另一个实施方案中，RTKI是替沃扎尼或凡德他尼。在额外的方面，根据该方法使用的RTKI是选自以下的药物：莫特塞尼(AMG-706)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK)、samaxanib(SU5416)、SU6668、AZD2171、XL184、XL880/GSK1363089、PF-2351066、MGCD265、ZD6474、AEE788、AG-013736、AG-013737、GW786034和ABT-869。在其他方面，该药物包含在国际专利申请公开号WO 97/22596、WO97/30035、WO 97/32856或WO 98/13354中公开的RTKI。
在一些方面，本公开涉及治疗患有RCC并正在准备接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物的方法，其中所述方法包括向该哺乳动物施用有效量的(1)RTKI、(2)ALK1 ECD多肽，如公开的ALK1-Fc融合蛋白或其他ALK拮抗剂和(3)靶向哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)的抑制剂。在一些方面，根据本发明方法使用的mTOR抑制剂是依维莫司。在其他方面，mTOR抑制剂是坦罗莫司。在其他方面，mTOR抑制剂是选自以下的药物：WYE354、YE132(Pfizer)、PP30和PP242、AZD8055、OSI-027、Torin1、BEZ235、XL765、GDC-0980、PF-04691502和PF-05212384。
在额外的方面，本公开涉及一种治疗在接受医疗操作以治疗RCC之前的患有RCC的哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，其中肾细胞癌(RCC)是透明细胞肾细胞癌。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经侵入肾窦。在其他方面，RCC是转移性肾细胞癌。在额外的方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
在又一个方面，本公开涉及治疗患有RCC并已经接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物的方法。在一个方面，本公开涵盖一种治疗患有RCC并且已经接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的选自以下的药物：(a)包含ALK1胞外结构域的配体结合部分的ALK1多肽；(b)与人ALK1的胞外结构域结合的抗体；(c)与人BMP9结合的抗体；和(d)与人BMP10结合的抗体。在一些方面，根据该方法使用的ALK1多肽包含具有下述氨基酸的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸22-120的序列至少90％相同。在其他方面，ALK1多肽还包含免疫球蛋白的恒定域。在其他方面，ALK1多肽还包含免疫球蛋白的Fc部分并且在额外的方面，Fc部分是人IgG1的Fc部分。在其他方面，ALK1多肽包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:14的序列至少90％相同的氨基酸序列。在一个方面，将药剂在医疗操作后至少1、2、3、4、5、6或7日施用。在另一个方面，将药剂在医疗操作1周、1个月或3个月以内施用。在另一个方面，将该药剂在手术后至少1、2、3、4、5、6或7日施用。在另一个方面，哺乳动物在手术后接受一系列至少1、2、3或4次用该治疗药治疗。在另一个方面，将该药剂在选自肾单位保留手术、肾切除术、全肾切除术和组织消融术的医疗操作之后施用。
在一些实施方案中，施用抗体以治疗患有RCC并已经接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物。在一些方面，该抗体结合至SEQ IDNO:1的氨基酸22-118的序列内部的表位并且抑制选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的配体的结合作用。在额外的方面，该抗体与SEQ ID NO:12的氨基酸1-111的序列内部的表位结合并且抑制BMP9与受体的结合。在其他方面，该抗体与SEQ ID NO:13的氨基酸1-108的序列内部的表位结合并且抑制BMP10与受体的结合。
在一些方面，将RTKI随本文中公开的ALK-1拮抗剂一起施用以治疗患有RCC并且已经接受医疗操作以治疗RCC的哺乳动物。在一些方面，根据治疗在接受医疗操作之后的哺乳动物的方法使用的RTKI是舒尼替尼。在其他实施方案中，根据治疗在接受医疗操作以治疗RCC之后的哺乳动物的方法使用的RTKI不是舒尼替尼。在一些方面，根据治疗在接受医疗操作以治疗RCC之后的哺乳动物的方法使用的RTKI是索拉非尼。在额外的方面，RTKI是帕唑帕尼。在额外的方面，RTKI是阿昔替尼。在另一个实施方案中，RTKI是替沃扎尼或凡德他尼。在额外的方面，根据该方法使用的RTKI是选自以下的药物：莫特塞尼(AMG-706)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK)、samaxanib(SU5416)、SU6668、AZD2171、XL184、XL880/GSK1363089、PF-2351066、MGCD265、ZD6474、AEE788、AG-013736、AG-013737、GW786034和ABT-869。在其他方面，该药物包含在国际专利申请公开号WO 97/22596、WO 97/30035、WO97/32856或WO 98/13354中公开的RTKI。
在额外的方面，本公开涉及一种治疗在接受医疗操作以治疗RCC后的哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，其中所述方法包括向该哺乳动物施用有效量的(1)RTKI、(2)ALK1 ECD多肽，如公开的ALK1-Fc融合蛋白或其他ALK拮抗剂和(3)靶向哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)的抑制剂。在一些方面，根据本发明方法使用的mTOR抑制剂是依维莫司。在其他方面，mTOR抑制剂是坦罗莫司。在其他方面，mTOR抑制剂是选自以下的药物：WYE354、YE132(Pfizer)、PP30和PP242、AZD8055、OSI-027、Torin1、BEZ235、XL765、GDC-0980、PF-04691502和PF-05212384。
在额外的方面，本公开涉及一种治疗在接受医疗操作以治疗RCC之后的患有RCC的哺乳动物中RCC的方法，其中肾细胞癌(RCC)是透明细胞肾细胞癌。在额外的方面，RCC是TNM III期疾病。在额外的方面，RCC是TNM IV期疾病。在额外的方面，RCC存在于肾内静脉内部。在其他方面，RCC已经侵入肾窦。在其他方面，RCC是转移性肾细胞癌。在额外的方面，RCC已经转移至肾上腺或转移至淋巴结。在其他方面，RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
在其他方面，本公开涉及治疗患有转移性RCC的哺乳动物的方法。在一个方面，本公开涵盖一种治疗转移性RCC的方法，其中所述方法包括向哺乳动物施用有效量的选自以下的药物：(a)包含ALK1胞外结构域的配体结合部分的ALK1多肽；(b)与人ALK1的胞外结构域结合的抗体；(c)与人BMP9结合的抗体；和(d)与人BMP10结合的抗体。在一些方面，根据该方法使用的ALK1多肽包含具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸22-120的序列至少90％相同。在其他方面，ALK1多肽还包含免疫球蛋白的恒定域。在其他方面，ALK1多肽还包含免疫球蛋白的Fc部分并且在额外的方面，Fc部分是人IgG1的Fc部分。在其他方面，ALK1多肽包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:14的序列至少90％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，施用抗体以治疗患有转移性RCC的哺乳动物。在其他实施方案中，施用的抗体与SEQ ID NO:1的氨基酸22-118的序列内部的表位结合并且抑制选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的配体的结合作用。在额外的方面，该抗体与SEQ ID NO:12的氨基酸1-111的序列内部的表位结合并且抑制BMP9与受体的结合。在其他方面，该抗体与SEQ ID NO:13的氨基酸1-108的序列内部的表位结合并且抑制BMP10与受体的结合。
根据一个方面，本公开涉及一种治疗哺乳动物中转移性肾细胞癌(RCC)的方法，包括向患有转移性RCC的哺乳动物施用有效量的RTKI和ALK1 ECD多肽，如本文中公开的ALK1-Fc融合蛋白或其他ALK拮抗剂。在一些方面，RTKI是舒尼替尼。在其他实施方案中，RTKI不是舒尼替尼。在一些方面，RTKI是索拉非尼。在额外的方面，RTKI是帕唑帕尼。在额外的方面，RTKI是阿昔替尼。在另一个实施方案中，RTKI是替沃扎尼或凡德他尼。在额外的方面，RTKI是选自以下的药物：莫特塞尼(AMG-706)、瓦他拉尼(PTK787/ZK)、samaxanib(SU5416)、SU6668、AZD2171、XL184、XL880/GSK1363089、PF-2351066、MGCD265、ZD6474、AEE788、AG-013736、AG-013737、GW786034和ABT-869。在其他方面，该药物包含在国际专利申请公开号WO 97/22596、WO 97/30035、WO97/32856或WO 98/13354中公开的RTKI。
在一些方面，本公开涉及治疗患有转移性RCC的哺乳动物的方法，其中所述方法包括向该哺乳动物施用有效量的(1)RTKI、(2)ALK1ECD多肽，如公开的ALK1-Fc融合蛋白或其他ALK拮抗剂和(3)靶向哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)的抑制剂。在一些方面，根据本发明方法使用的mTOR抑制剂是依维莫司。在其他方面，mTOR抑制剂是坦罗莫司。在其他方面，mTOR抑制剂是选自以下的药物：WYE354、YE132(Pfizer)、PP30和PP242、AZD8055、OSI-027、Torin1、BEZ235、XL765、GDC-0980、PF-04691502和PF-05212384。
本公开还提供通过向哺乳动物施用有效量的如本文中公开的ALK1 ECD多肽(如ALK1-Fc融合蛋白)或其他“治疗药”或“ALK1“拮抗剂”，抑制哺乳动物中血管生成的方法。预期这些治疗药也将可用于抑制骨和关节中和肿瘤、尤其与骨及关节相关的肿瘤中的血管生成。
血管生成相关性疾病包括但不限于血管生成依赖性癌症，例如包括，实体瘤、血源肿瘤如白血病和肿瘤转移；良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和化脓性肉芽肿；类风湿性关节炎；银屑病；虹膜红变；Osler-Webber综合征；心肌血管生成；斑块血管新生；毛细血管扩张症；血友病性关节；和纤维血管瘤。
具体而言，本公开的多肽治疗药可用于治疗或预防癌症(肿瘤)，并且特别地如已知依赖于血管生成过程以支持生长的这类癌症。不同于大多数抗血管生成剂，ALK1 ECD多肽影响受多种因子刺激的血管生成。这在以下癌中是高度有意义的，其中癌将经常获得支持肿瘤血管生成的多种因子。因此，本文中公开的治疗药将在如下方面特别有效：治疗抵抗靶向单一血管生成性因子的药物(例如，贝伐珠单抗，其靶向VEGF)的肿瘤。如本文中展示，ALK1-Fc融合蛋白有效减少黑色素瘤、肺癌和多发性骨髓瘤的病理学效应。广泛地认为多发性骨髓瘤是包括明显血管生成性组分的癌。因此，预期本文中公开的ALK1-Fc融合蛋白和其他治疗药将可用于治疗多发性骨髓瘤和与骨相关的其他肿瘤。如本文中展示，本文中公开的治疗药可以用来改善与多发性骨髓瘤相关的骨损伤，并且因此可以用来改善与其他肿瘤(如乳腺或前列腺肿瘤)的骨转移关的骨损伤。如本文指出，GDF5-7配体在骨中高度表达，并且尽管不希望受限于任何具体机制，干扰这些配体可能破坏骨中肿瘤形成所需要的过程。
在一些方面，本公开涵盖抑制患有需要抑制管生成的病状的哺乳动物中血管生成的方法，其中所述方法包括向哺乳动物施用有效量的选自以下的药物：(a)包含ALK1胞外结构域的配体结合部分的ALK1多肽；(b)与人ALK1的胞外结构域结合的抗体；(c)与人BMP9结合的抗体；和(d)与人BMP10结合的抗体。在一些方面，根据该方法使用的ALK1多肽包含具有下述氨基酸的多肽，所述氨基酸序列与SEQID NO:1的氨基酸22-120的序列至少90％相同。在其他方面，ALK1多肽还包含免疫球蛋白的恒定域。在其他方面，ALK1多肽还包含免疫球蛋白的Fc部分并且在额外的方面，Fc部分是人IgG1的Fc部分。在其他方面，ALK1多肽包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:14的序列至少90％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，施用抗体以抑制哺乳动物中的血管生成。在其他实施方案中，施用的抗体与SEQ ID NO:1的氨基酸22-118的序列内部的表位结合并且抑制选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的配体的结合作用。在额外的方面，该抗体与SEQ ID NO:12的氨基酸1-111的序列内部的表位结合并且抑制BMP9与受体的结合。在其他方面，该抗体与SEQ ID NO:13的氨基酸1-108的序列内部的表位结合并且抑制BMP10与受体的结合。
在一些方面，将RTKI随本文中公开的ALK-1拮抗剂一起施用以抑制哺乳动物中的血管生成。在一些方面，RTKI是舒尼替尼。在其他实施方案中，RTKI不是舒尼替尼。在一些方面，RTKI是索拉非尼。在额外的方面，RTKI是帕唑帕尼。在额外的方面，RTKI是阿昔替尼。在另一个实施方案中，RTKI是替沃扎尼或凡德他尼。在额外的方面，RTKI选自：莫特塞尼(AMG-706)、瓦他拉尼(PTK787/ZK)、samaxanib(SU5416)、SU6668、AZD2171、XL184、XL880/GSK1363089、PF-2351066、MGCD265、ZD6474、AEE788、AG-013736、AG-013737、GW786034和ABT-869。在其他方面，RTKI在国际专利申请公开号WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856或WO 98/13354中公开。
在一些方面，本公开涉及抑制血管生成的方法，其中所述方法包括向该哺乳动物施用有效量的(1)RTKI、(2)ALK1 ECD多肽，如公开的ALK1-Fc融合蛋白或其他ALK拮抗剂和(3)靶向哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)的抑制剂。在一些方面，根据本发明方法使用的mTOR抑制剂是依维莫司。在其他方面，mTOR抑制剂是坦罗莫司。在其他方面，mTOR抑制剂是选自以下的药物：WYE354、YE132(Pfizer)、PP30和PP242、AZD8055、OSI-027、Torin1、BEZ235、XL765、GDC-0980、PF-04691502和PF-05212384。
根据本公开，本文所述的抗血管生成剂可以与用于治疗疾病的其他组合物和手术组合使用。例如，肿瘤可以用与ALK1或ALK1配体拮抗剂组合的手术、放疗或化疗常规地治疗，并且随后，可以将拮抗剂接着施用至患者以扩展微转移灶的蛰伏和以稳定任何残余原发性肿瘤。
也可以向已知处于形成新癌症或复发性癌症的高风险的个体预防性给予血管生成抑制剂。因此，本公开的一个方面涵盖用于预防性阻止受试者中癌症的方法，包括向受试者施用有效量的ALK1或ALK1配体拮抗剂和/或其衍生物，或本公开的另一种血管生成抑制剂。
如本文中展示，ALK1-Fc有效减弱类风湿性关节炎鼠模型的表型。因此，本文中公开的治疗药可以用于治疗类风湿性关节炎和其他类型的骨或关节炎症。
某些正常生理过程也与血管生成相关，例如，排卵、月经和胎盘形成。本公开的血管生成抑制蛋白可用于治疗过度或异常刺激内皮细胞的疾病。这些疾病包括但不限于肠黏连、动脉粥样硬化、硬皮病和肥厚性疤痕，即，瘢痕瘤。它们还可用于治疗以血管生成作为病理学后果的疾病如猫抓病(Rochele minalia quintosa)和溃疡(幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))。
由于减少或防止胚胎植入所需要的子宫血管化，可以使用通用血管生成抑制蛋白作为生殖控制剂。因此，本公开提供一种将量足以防止胚胎植入的抑制性蛋白质施用至雌性时有效的生殖控制方法。在生殖控制方法的一个方面，将量足以阻断胚胎植入的抑制性蛋白质在交配和受精已经发生之前或之后施用，因此提供有效的生殖控制方法，可能是“清晨后”法。尽管不想受这种声明约束，但是认为抑制子宫内膜的血管化干扰胚泡着床。对输卵管粘膜血管化的相似抑制干扰胚泡着床，阻止输卵管妊娠的发生。还认为施用本公开的血管生成抑制剂将干扰正常的增强胎盘血管化，并且还干扰成功着床的胚泡以及和正在发育的胚胎和胎儿内部的血管发育。
施用方法可以包括但不限于丸剂、注射(静脉内、皮下、肌内)、栓剂、阴道海绵、阴道塞和子宫内装置。在某些实施方案中，可以将一种或多种治疗药同时或在不同时间(依次)施用。此外，治疗药可以与另一个类型用于治疗癌症或用于抑制血管生成的化合物一起施用。在某些实施方案中，可以单独使用本公开的主题方法。可选地，主题方法可以与涉及治疗或预防增殖性病症(例如，肿瘤)的其他常规抗癌症治疗方案组合使用。例如，这类方法可以用于预防性癌症预防、预防癌症复发和术后转移，并且作为其他常规癌疗法的辅助方法使用。本公开确认，可以通过使用主题多肽治疗药增强常规癌疗法(例如，化疗、放射疗法、光疗法、免疫疗法和手术)的有效性。
已经显示广泛系列的常规化合物具有抗肿瘤活性。已经使用这些化合物作为化疗中的药剂(pharmaceutical agent)以缩减实体瘤、防止转移和进一步生长，或在白血病肿瘤或骨髓恶性肿瘤中减少恶性细胞的数目。虽然化疗已经有效治疗各种类型的恶性肿瘤，但是许多抗肿瘤化合物引起不利副作用。已经显示当两种或更多种不同治疗组合时，这些治疗可以协同地发挥作用并允许减少每种治疗的剂量，因而减少由每种化合物在更高剂量时产生的有害副作用。在其他情况下，抵抗治疗的恶性肿瘤可能响应于两种或更多种不同治疗的联合疗法。
当本文中公开的多肽治疗药与另一中常规抗肿瘤药同时或依次组合施用时，这类治疗药可以增强抗肿瘤药的治疗效果或克服这类抗肿瘤药的细胞耐药性。这允许减少抗肿瘤药的剂量，因而减少不利副作用，或恢复抗肿瘤药在耐药性细胞中的有效性。
本公开的方法还包括与治疗眼病的其他药物共施用。当施用多于一种药物或药剂和药品的组合时，施用可以在时间上同时或依次进行。治疗药和/或药品可以通过不同的施用途径或通过相同的施用途径施用。
7.剂型和有效剂量
可以将本文所述的治疗药配制成药物组合物。根据本公开使用的药物组合物可以按常规方式使用一种或多种生理可接受载体或赋形剂配制。根据大多数法规要求，这类制剂通常将是基本上无热原的。
在某些实施方案中，本公开的治疗方法包括全身性施用组合物或作为植入物或装置局部地施用。当施用时，用于本公开中的治疗性组合物处于无热原、生理可接受形式。除ALK1信号传导拮抗剂之外还可以任选地在如上文所述的组合物中包含的治疗上有用的药物可以在本文所公开的方法中与主题化合物(例如，本文中公开的ALK1 ECD多肽或任一种抗体)可同时或依次施用。
一般，本文中公开的蛋白质治疗药将以肠胃外方式并且特别以静脉内或皮下方式施用。适于肠胃外施用的药物组合物可以包含与一种或多种可药用无菌等渗水溶液或非水溶液、分散体、悬液或乳液或者无菌粉剂组合的一种或多种ALK1 ECD多肽或其他抗体，其中所述的无菌粉剂可以仅在使用之前才复水成无菌注射溶液剂或分散剂，可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、使制剂与目的接受者的血液等渗的溶质或助悬剂或增稠剂。可以在本公开的药物组合物中使用的合适水质和非水质载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。可以例如通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持要求的粒度和通过使用表面活性剂，维持适宜的流动性。
如果需要的话，组合物和制剂可以存在于含有一个或多个单位剂量形式的包装或分配器装置中，所述单位剂量形式包含活性成分。该包装可以例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。该包装或分配器装置可以伴有施用说明书。
实施例：
实施例1：ALK1-Fc融合蛋白的表达
申请人构建一种可溶性ALK1融合蛋白，其具有与人Fc融合的人ALK1胞外结构域或与鼠Fc结构域融合的小鼠ALK1胞外结构域，二者之间存在一个最小接头。这些构建体分别称作hALK1-Fc和mALK1-Fc。
在图3B中显示如从CHO细胞系纯化的hALK1-Fc(SEQ ID NO:14)。值得注意地，尽管人ALK1蛋白的胞外结构域的常规C末端是SEQ ID NO:1的氨基酸118，我们已经确定，期望的是避免具有以谷氨酰胺残基结尾的结构域。因此，从人ALK1衍生的SEQ ID NO:14的部分相对于Q118的C末端并入两个残基：亮氨酸和丙氨酸。本公开因此提供具有ALK1衍生序列的C末端的ALK1 ECD多肽(包括Fc融合蛋白)，所述C末端在距Q118的上游(相对于SEQ ID NO:1而言113-117)或下游(119-123)1至5个氨基酸任何一点。
在CHO细胞系中表达hALK1-Fc蛋白和mALK1-Fc蛋白。考虑三种不同的前导序列：
(i)蜜蜂蜂毒肽(HBML)：MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(SEQID NO:7)
(ii)组织纤溶酶原激活物(TPA)：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID NO:8)
(iii)天然：MTLGSPRKGLLMLLMALVTQG(SEQ ID NO:9)。
所选择的形式利用TPA前导序列并具有图4中显示的未加工的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
这种多肽由图4中显示的核酸序列(SEQ ID NO:4)编码。
可以通过一系列柱层析步骤实现纯化，例如以任何顺序包括三个或更多个以下步骤：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、大小排阻层析和阳离子交换层析。可以采用病毒过滤和缓冲液交换完成纯化。将hALK1-Fc蛋白纯化到纯度>98％，如通过大小排阻层析所测定，和>95％，如通过SDS PAGE所测定。
在蛋白质产生和纯化的过程中，我们观察到hALK1-Fc倾向于以二聚体和更高阶聚集物的混合物形式表达，其中所述更高阶聚集物尽管在变性、还原条件(例如，还原性SDS-PAGE)下显得是纯的，但对施用至患者而言带来问题。聚集物可以是有免疫原性或生物利用不良，并且因它们的异质性，这些聚集物致使难以按药物开发所要求的水平表征药物制品。因此，检验了减少最终制备物中聚集物的量的各种方案。
在一个方案中，检验了许多不同的细胞培养基。IS CHO-CD(目录号91119,Irvine Scientific,Santa Ana,CA)显示聚集产物的产生明显减少，同时维持高水平的hALK1-Fc产生。另外，在pH 8.0从疏水相互作用柱(例如，苯基琼脂糖)对物质的洗脱导致进一步解析聚集产物。所得到的物质由大于99％的二聚体组成。与R&D Systems出售的ALK1-Fc融合蛋白(目录号370-AL，Minneapolis，MN)比较显示，在NSO细胞中产生的这种蛋白质的84％是二聚体，而剩余蛋白质因大小排阻层析而作为高分子量种类出现。图11中显示制备物的分级柱曲线的比较。已经确定聚集物形成作为ALK1-Fc生产中的突出问题，预期可以开发其他方案，包括涉及额外纯化步骤的方案(虽然这类方案可能导致较低产量的纯化蛋白质)。
实施例2：ALK1-Fc配体的鉴定
ALK1是一种TGFβ家族配体的1型受体。使用BiacoreTM系统，对TGFβ家族的多个成员测试与人ALK1-Fc融合蛋白的结合。TGFβ本身、GDF8、GDF11、BMP2和BMP4均不能显示与hALK1-Fc蛋白明显结合，而BMP2和BMP4仅显示有限结合。与之相反，GDF5和GDF7在两种情况下均显示以大约5×10-8M的KD值明显结合。基于GDF5和GDF7与GDF6的结构相似性，预期GDF6将以相似的亲和力与融合蛋白结合。观察到BMP9对hALK1-Fc的最高结合亲和力，KD值是从1×10-10至2×10-9，以及BMP10对hALK1-Fc的最高结合亲和力，KD为大约3×10-9。
实施例3：ALK1-Fc和抗ALK1抗体对内皮细胞影响的表征
使用在4个依次共有SBE位点(SBE4-luc)(其响应于Smad1/5/8-介导的信号传导)控制下的萤光素酶报道分子构建体，我们在HMVEC细胞中在hALK1-Fc药物或中和性ALK1特异性单克隆抗体存在和不存在下测量BMP-9介导的活性。将HMVEC细胞用rhBMP-9(50 ng/ml)刺激，这引起Smad1/5/8介导的转录激活，由SBE4-luc调节的转录性上调增加所佐证。当添加时，hALK1-Fc化合物(10μg/ml)或抗体(10μg/ml)削弱这种转录性反应，各自达几乎60％，这表明ALK1-Fc的存在显著减少BMP9信号传导，并且进一步表明BMP9信号传导与ALK1活性相关。
常使用SMAD磷酸化的激活来分析上游激活素受体的激活。已知ALK1被其配体激活时调节SMAD蛋白1、5和8的磷酸化。这里，我们添加rhBMP-9(50ng/ml)以启动HUVEC细胞(一个内在表达ALK1受体的人内皮细胞系)中的SMAD磷酸化持续30分钟时程。用配体处理细胞后5分钟见到SMAD1/5/8的磷酸化，并且磷酸化维持整个30分钟时间。在相对低浓度的hALK1-Fc(250ng/ml)存在下，SMAD1/5/8磷酸化减少，证实这种物质抑制内皮细胞中的Smad1/5/8激活。
为了体外系统中评价ALK1-Fc的血管生成作用，我们测定该化合物在减少基质胶基质上内皮细胞的管形成方面的有效性。这项技术常用来评估血管新生，产生既快又高度可重复的结果。将内皮细胞生长补充物(ECGS)用来诱导微血管系统从基质胶上的内皮细胞中形成，并且将抗血管生成化合物的功效随后度量为18小时时程范围内在药物和ECGS存在下索状物(cord)形成的减少。如预期，与显示基质胶基质上产生的内皮细胞索状物形成的基础水平的阴性对照(未添加处理)相比，添加ECGS(200ng/ml)引起显著的索状物形成(图5)。当添加hALK1-Fc(100ng/ml)或mALK1-Fc(100ng/ml)时，索状物形成明显减少。全部样品中血管长度的最终定量揭示，每种浓度的hALK1-fc或mALK1-Fc均减少血管新生至基础水平。另外，在强烈促血管生成的因子ECGS存在下，hALK1-Fc和mALK1-Fc维持对血管新生的强烈抑制，显示比阴性对照内皮抑制素(100ng/ml)甚至更强力的抗血管生成活性。
实施例4：CAM测定法
熟知VEGF和FGF刺激血管生成。CAM(鸡绒毛尿囊膜)测定法系统用来评估GDF7的血管生成作用。如图6中所示，GDF7以类似于VEGF的效力刺激血管生成。对GDF5和GDF6观察到相似的结果。
在CAM测定法中对ALK1-Fc融合物测试抗血管生成活性。这些融合蛋白对受VEGF、FGF和GDF7刺激的血管生成显示强力的抗血管生成作用。见图7。BMP9和PDGF在这个测定法中显示相对差的诱导血管生成能力，然而这类因子的这种血管生成作用被ALK1抑制。
在CAM测定法中比较ALK1-Fc蛋白和一种市售抗血管生成性抗VEGF单克隆抗体。与抗VEGF相比，ALK1-Fc蛋白具有相似的效力。抗VEGF抗体贝伐珠单抗目前用于治疗人类中的癌症和黄斑变性。见图8。
有趣地，抗-ALK1抗体(R&D Systems)没有在这个分析系统中显著地抑制血管生成。我们预计这可能反映不同物种中ALK1序列的差异。
实施例5：小鼠角膜微囊袋测定法
小鼠角膜微囊袋测定法用来评估ALK1-Fc对小鼠眼中血管生成的影响。腹膜内施用的hALK1-Fc显著抑制眼血管生成。如图9中所示，hALK1-Fc按照与抗-VEGF相同的程度抑制眼血管生成。hALK1-Fc和抗-VEGF以相同的重量/重量剂量使用。用VEGF浸渍的基质胶塞植入非眼位置中之时，获得了相似的数据。
这些数据显示ALK1的高亲和力配体促进血管生成并且显示ALK1-Fc融合蛋白具有强力抗血管生成活性。ALK1的配体落入两个类别，GDF5、6、7分组具有针对ALK1的中等亲和力并且BMP9、10分组具有针对ALK1的高亲和力。
GDF5、6和7主要定位于骨和关节，而BMP9在血液中循环。因此，似乎存在包括ALK1、GDF5、6和7的骨和关节促血管生成系统和包括ALK1和BMP9(和可能BMP10)的全身性血管生成系统。
实施例6：类风湿性关节炎的小鼠模型
小鼠胶原蛋白诱导的关节炎模型是充分接受的类风湿性关节炎模型。在这项研究中，将具有10只小鼠的组用载体、抗VEGF(贝伐珠单抗–作为阴性对照，因为贝伐珠单抗不抑制鼠VEGF)或多个剂量的mALK1-Fc(“RAP-041”)按1mg/kg、10mg/kg或25mg/kg处理。在第21日用胶原蛋白强化后，全部组中的关节炎评分(见图10)和爪肿胀稳定增长，在第38日附近达到峰值。用mALK1-Fc(“RAP-041”)处理的小鼠显示两种特征的评分减少，特别地在最高剂量(25mg/kg)时，不过这种减少未达到统计显著性。然而，剂量相关的趋势是明显的。
截止第42日研究终止，关节炎发生率在载体对照处理的小鼠中已经达到10/10，在贝伐珠单抗处理的小鼠中已经达到9/10，在mALK1-Fc以1mg/kg处理的组中已经达到8/10并且在mALK1-Fc以10mg/kg处理的组中已经达到9/10。在mALK1-Fc 25mg/kg处理组中，发病率较低，处于6/10。
实施例7：ALK1-Fc在CAM测定法中减少肿瘤血管生成
与任何组织一样，肿瘤具有基本的营养要求和氧要求。虽然小肿瘤能够通过从邻近血管扩散而获得足够的量，但是随着肿瘤尺寸增加，它必须通过征用和维持现有毛细血管攫取养分。为检验ALK1-Fc蛋白通过血管抑制作用限制肿瘤生长的能力，我们在黑色素瘤外植体CAM测定法中测试不同浓度的mALK1-Fc。与上文描述的CAM测定法一样，在每只卵上开设小窗，经所述小窗植入5×105个B16黑色素瘤细胞。随后将卵每日用0.02mg/mL mALK1-Fc、0.2mg/mL mALK1-Fc处理，或不作处理，持续1周时间。在实验结束时，将肿瘤小心地取出，称重并捕获数字图像。与未处理的CAM肿瘤相比，源自用mALK1-Fc处理的CAM的肿瘤显示尺寸显著减少。对肿瘤重量的定量表明，与未处理的CAM相比，每日用0.02mg/ml或0.2mg/mlmALK1-Fc处理的肿瘤的重量显示减少65％和85％(图6E)。总之，当添加ALK1-Fc时，以剂量-反应方式显著抑制血管新生和肿瘤生长，这表明ALK1-Fc是强有力的抗血管生成剂。
实施例8：肺癌实验模型
为了进一步证实ALK1-Fc对肿瘤进展的影响，测试肺癌小鼠模型。将荧光标记的鼠Lewis肺癌细胞(LL/2-luc)经尾静脉施用至白化黑6小鼠。在相同日，小鼠开始用腹膜内施用的PBS对照(n＝7)或10mg/kg mALK1-Fc(n＝7)处理。活体荧光成像显示对照小鼠中定位至肺的肿瘤明显发展，达到如此程度，以至于小鼠濒死并且截止植入后第22日不得不处死。相反，ALK1-Fc处理的小鼠显示明显延迟的肺肿瘤生长并截止第22日显示100％存活。见图12。
这些数据显示ALK1-Fc在肺癌小鼠模型中对肿瘤生长具有明显影响并提供生存期益处。
实施例9.BMP9和抗BMP9，对血管生成的作用
CAM(鸡绒毛尿囊膜)测定法系统用来评重组人BMP9(rhB9)和抗BMP9单克隆抗体(mabB9)(R&D Systems，Minneapolis，MN，目录号MAB3209)的血管生成作用。已知这种抗体使BMP9/ALK1信号传导无效。见，例如，Scharpfenecker等人，J Cell Sci.2007 Mar 15；120(Pt6):964-72；David等人，(2007)；Blood Mar 1；109(5):1953-61；David等人，Circ.Res.2008 Apr 25；102(8):914-22。
在外源VEGF不存在的情况下，BMP9和抗BMP9均不明显影响血管生成，可能因为血管生成在外源VEGF不存在的情况下的缺少降低分析灵敏度。见图13，右侧列。在VEGF不存在的情况下，两种蛋白质均按5日循环在第1日和第3日以50ng剂量1x/日使用。然而，在VEGF存在的情况下，BMP9及其抗体均具有明显的抗血管生成作用。见图13。就组合的BMP9和VEGF而言，这些数据与来自Scharpfenecker等人的数据一致，并且就BMP9自身的抗血管生成作用而言，还与Scharpfenecker等人和David等人的结论一致。然而，抗BMP9抗体的作用与发表的文献明显抵触。基于这些数据，我们假设BMP9的最佳或生理水平可能是适宜的血管生成需要的，并且BMP9过多或匮乏将抑制血管生成。
令人好奇地，抗BMP9抗体的作用与本文展示的数据一致，这表明ALK1-Fc(其是另一种BMP9拮抗剂)也抑制血管生成。因此，这些数据显示ALK1-Fc和抗BMP9各自具有抗血管生成作用，并且抗BMP9抗体可能按照与ALK1-Fc经证实如此极其相同的方式用于治疗血管生成病，如肿瘤、类风湿性关节炎和眼病。
鉴于MAB3209的抗血管生成活性，我们提出这种鼠单克隆抗体可以经人源化以提供用于人类中的治疗药。抗体可以通过本领域认可的多种技术人源化，包括嵌合化、CDR移植、表面重塑、回复突变，超人源化、人系内容优化(human string content optimization)和经验方法，如FR文库生成和选择，FR改组和人工程化(humaneering)。见，例如，Almagro和Fransson,Frontiers in Biosciences,13:1619-1633,2008。
实施例10.ALK1-Fc融合蛋白对乳腺癌肿瘤模型的效果
mALK1-Fc有效延迟源自雌激素受体阳性(ER+)和雌激素受体阴性肿瘤细胞(ER-)的乳腺癌肿瘤细胞系的生长。
MDA-MB-231乳腺癌细胞系(源自ER-细胞)用萤光素酶基因稳定转染以允许体内检测肿瘤生长和潜在转移。在这项研究中，将1×106个MDA-MB-231-Luc细胞原位植入无胸腺裸鼠(Harlan)的乳房脂肪垫中。使用IVIS光谱成像系统(Caliper Life Sciences)，通过生物发光检测法追踪肿瘤进展。发光(检测到的光子数目)的增加对应于肿瘤负荷的增加。
将1×106个肿瘤细胞注射30只雌性裸鼠的乳房脂肪垫中。在肿瘤植入后三日，通过皮下(SC)注射，将小鼠用载体对照或mALK1-Fc(30mg/kg)治疗，每周2次。继续治疗并且通过生物发光成像监测肿瘤进展10周。与载体处理的对照相比时，按30mg/kg的mALK1-Fc治疗延缓肿瘤进展，如通过生物发光检测所确定(图14)。在这个模型中，采用mALK1-Fc的治疗延迟但是不逆转肿瘤生长。这可能对抗血管生成化合物预期如此，在于肿瘤可能在需要新血管形成以支持持续生长之前能够存活达到某个尺寸。在相似实验中，hALK1-Fc以低至3mg/kg的剂量水平产生相似的但略微较小的效果。
还在原位植入法模型中测试雌激素受体阳性(ER+)、表达萤光素酶的细胞系MCF-7。在这个模型中，对雌性裸鼠皮下植入用17β-雌二醇60日缓释丸粒。在丸粒植入后2日，将5×106个MCF-7肿瘤细胞植入乳房脂肪垫中。将小鼠每周2次用3、10和30 mg/kg的hALK1-Fc或载体对照通过IP途径治疗。以每周为基础，用IVIS-Spectrum成像仪(Caliper Life Sciences)，通过生物发光检测法追踪肿瘤进展。在载体治疗的小鼠中，肿瘤快速进展直至第26研究日(图15)。在第26日后，肿瘤发光存在波动直至第60日研究结束(此时雌二醇丸粒耗尽)。这些波动归因于这个模型的共同特征，即快速肿瘤生长可以超过宿主动物的血管生成响应，导致肿瘤坏死和同时发光信号下降。剩余的细胞继续生长，导致信号增加。与载体治疗的对照相比，用10或30mg/kghALK1-Fc治疗的小鼠能够在研究期间维持肿瘤尺寸处于恒定水平，显示这种分子对肿瘤生长的强力影响。
实施例11.基于细胞的测定法中hALK1-Fc抑制BMP10信号传导
在基于细胞的测定法确定hALK-Fc对BMP10信号传导的作用，其中将人胶质母细胞瘤T98G细胞用如下三种质粒转染：1)编码全长ALK1的表达构建体；2)响应于Smad1/5/8-介导的信号传导的萤火虫-萤光素酶报道分子构建体(见实施例3)，和3)Renilla萤光素酶对照构建体。相对于Renilla萤光素酶活性，用重组人BMP10(1ng/mL)处理转染的细胞强烈刺激萤火虫萤光素酶活性(图16)。ALK1表达构建体的省略减少BMP10刺激的活性大约三分之二(数据未显示)，因此提示ALK1作为BMP10信号的主要介体。与单独的BMP10相比，用hALK1-Fc(65ng/mL)和BMP10(1ng/mL)处理充分转染的细胞减少转录反应超过80％(图16)。总之，这些结果表明ALK1是BMP10信号传导的主要介体并且ALK1-Fc可以明显地抑制这种信号传导。
实施例13.ALK-Fc在786-O肿瘤异体移植物模型中增强舒尼替尼的活性
786-O细胞，von Hippel Lindau(VHL)缺陷型人肾细胞癌(RCC)细胞系(见Iliopoulos等人，Nature Medicine 1995；1:822-6)，从美国典型培养物保藏中心获得并且在RPMI 1640培养基(Cellgro)中培养。将培养基用2mmol/L L-谷氨酰胺、10％FCS和1％链霉素(50μg/ml)补充，并且将细胞在37℃伴随5％CO2培养。通过短暂暴露于0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA从分会合培养物收获786-O细胞。用含有10％胎牛血清的培养基终止胰蛋白酶消化并且将细胞在无血清培养基中洗涤1次并重悬于PBS中。仅由活力>90％的单个细胞组成的悬液用于注射。
为建立人RCC异体移植物，将786-O肿瘤细胞皮下注射(1×107个细胞)入平均体重20g的6周龄至8周龄雌性无胸腺裸鼠/米色鼠(Charles River Laboratories)的腹侧。肿瘤在>80％的小鼠中形成并且通常在置入数日内可见。当肿瘤已经生长至直径12mm时，将小鼠用载体外加Fc、舒尼替尼外加Fc、载体外加ALK-Fc或舒尼替尼外加ALK-Fc治疗。通过管饲开始，每周7日中6日施用舒尼替尼(53.6mg/kg；Pfizer)。将ALK1-Fc(10mg/kg)每周腹膜内施用3次。每两日测量肿瘤，同时治疗小鼠。
如图18中所示，用舒尼替尼外加Fc治疗在786-O鼠人肿瘤异体移植物模型中延缓肿瘤生长。当肿瘤用舒尼替尼外加ALK-Fc治疗时，这种作用进一步增强，表明ALK-FC在透明细胞肾细胞癌的模型中增强舒尼替尼的肿瘤生长抑制活性。
实施例14.ALK-Fc在A498肿瘤异体移植物模型中具有单一药剂活性
A498细胞，VHL缺陷型人RCC细胞系(见Iliopoulos等人，NatureMedicine 1995；1:822-6)，从美国典型培养物保藏中心获得并且在Eagle极限基本培养基中培养。将培养基用2mmol/L L-谷氨酰胺、10％FCS和1％链霉素(50μg/ml)补充，并且将细胞在37℃伴随5％CO2培养。通过短暂暴露于0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA从分会合培养物收获786-O细胞。用含有10％胎牛血清的培养基终止胰蛋白酶消化并且将细胞在无血清培养基中洗涤1次并重悬于PBS中。仅由活力>90％的单个细胞组成的悬液用于注射。
为建立人RCC异体移植物，将A498肿瘤细胞皮下注射(1×107个细胞)入平均体重20g的6周龄至8周龄雌性无胸腺裸鼠/beige小鼠(CCharles River Laboratories)的腹侧。肿瘤在>80％的小鼠中形成并且通常在置入数日内可见。当肿瘤已经生长至直径12mm时，将小鼠用Fc或ALK-Fc治疗。将ALK-Fc(10mg/kg)每周腹膜内施用3次。在小鼠进行治疗的同时，每日测量肿瘤。
如图19中所示，ALK-FC具有单一药剂活性，因为用单独的ALK-Fc治疗在A498鼠人肿瘤异体移植物模型中大幅度延缓肿瘤生长。
实施例15.ALK-Fc还在A498肿瘤异体移植物模型中增强舒尼替尼的活性
A498细胞培养物和异体移植物如实施例14中所述那样建立。当肿瘤已经生长至直径12mm时，将小鼠用载体外加Fc、舒尼替尼外加Fc、载体外加ALK-Fc或舒尼替尼外加ALK-Fc治疗。通过管饲开始，每周7日中6日施用舒尼替尼(53.6mg/kg；Pfizer)。将ALK1-Fc(10mg/kg)每周腹膜内施用3次。在小鼠进行治疗的同时，每日测量肿瘤。
如图20中所示，用舒尼替尼外加Fc或载体外加ALK-Fc治疗在A498鼠人肿瘤异体移植物模型中延缓肿瘤生长。但是，当组合施用时，ALK-FC大幅度增加舒尼替尼对A498肿瘤生长的肿瘤生长抑制活性。
通过引用方式并入
本文中提到的全部出版物及专利通过引用的方式完整并入本文，如同通过引用方式专门且独自地并入每份单独的出版物或专利。在矛盾的情况下，本申请，包括其中的任何定义，将居主导。
等同物
尽管本文中明确地公开本发明的具体实施方案，但是以上说明书起说明性作用并且不起限制作用。对于本领域技术人员而言，一旦浏览本说明书及下文的权利要求书，则本发明的许多变型将变得明显。本发明的完整范围应当通过参考权利要求、连同其等同物的完整范围和本说明书连同这类变型来确定。

Claims (45)

1.一种治疗哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，包括向患有RCC的哺乳动物施用有效量的受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)和选自以下的药剂：
(a)包含ALK1胞外结构域的配体结合部分的ALK1多肽；
(b)与人ALK1的胞外结构域结合的抗体；
(c)与人BMP9结合的抗体；和
(d)与人BMP10结合的抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中ALK1多肽包含具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸22-118的序列至少90％相同，并且其中ALK1多肽与选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的ALK1配体结合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中ALK1多肽包含具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸22-120的序列至少90％相同。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中ALK1多肽还包含免疫球蛋白的恒定域。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其中ALK1多肽还包含免疫球蛋白的Fc部分。
6.根据权利要求5所述的方法，其中Fc部分是人IgG1的Fc部分。
7.根据权利要求1所述的方法，其中ALK1多肽包含与SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:14的序列至少90％相同的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的方法，其中(b)的抗体与SEQ ID NO:1的氨基酸22-118的序列内部的表位结合并且抑制选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的配体的结合作用。
9.根据权利要求1所述的方法，其中(c)的抗体与SEQ ID NO:12的氨基酸1-111的序列内部的表位结合并且抑制BMP9与受体的结合。
10.根据权利要求1所述的方法，其中(d)的抗体与SEQ ID NO:13的氨基酸1-108的序列内部的表位结合并且抑制BMP10与受体的结合。
11.根据权利要求1所述的方法，其中RTKI是舒尼替尼。
12.根据权利要求1所述的方法，其中RTKI是索拉非尼。
13.根据权利要求1所述的方法，其中RTKI是帕唑帕尼。
14.根据权利要求1所述的方法，其中RTKI是阿昔替尼。
15.根据权利要求1所述的方法，其中RTKI是替沃扎尼或凡德他尼。
16.根据权利要求1所述的方法，还包括施用靶向哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)的抑制剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中靶向mTOR的抑制剂是依维莫司。
18.根据权利要求16所述的方法，其中靶向mTOR的抑制剂是坦罗莫司。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中RCC是透明细胞肾细胞癌。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中RCC已经侵入肾窦。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中RCC是转移性RCC。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
23.一种治疗先前已经接受过RCC治疗药的哺乳动物中肾细胞癌(RCC)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的选自以下的药剂：
(a)包含ALK1胞外结构域的配体结合部分的ALK1多肽；
(b)与人ALK1的胞外结构域结合的抗体；
(c)与人BMP9结合的抗体；和
(d)与人BMP10结合的抗体。
24.根据权利要求23所述的方法，其中ALK1多肽包含具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸22-118的序列至少90％相同，并且其中ALK1多肽与选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的ALK1配体结合。
25.根据权利要求23所述的方法，其中ALK1多肽包含具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸22-120的序列至少90％相同。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中ALK1多肽还包含免疫球蛋白的恒定域。
27.根据权利要求24或25所述的方法，其中ALK1多肽还包含免疫球蛋白的Fc部分。
28.根据权利要求27所述的方法，其中Fc部分是人IgG1的Fc部分。
29.根据权利要求23所述的方法，其中ALK1多肽包含与SEQID NO:3或SEQ ID NO:14的序列至少90％相同的氨基酸序列。
30.根据权利要求23所述的方法，其中(b)的抗体与SEQ ID NO:1的氨基酸22-118的序列内部的表位结合并且抑制选自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的配体的结合作用。
31.根据权利要求23所述的方法，其中(c)的抗体与SEQ ID NO:12的氨基酸1-111的序列内部的表位结合并且抑制BMP9与受体的结合。
32.根据权利要求23所述的方法，其中(d)的抗体与SEQ ID NO:13的氨基酸1-108的序列内部的表位结合并且抑制BMP10与受体的结合。
33.根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中先前接受的RCC治疗药是RTKI。
34.根据权利要求33所述的方法，其中RTKI选自：舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、阿昔替尼、替沃扎尼和凡德他尼。
35.根据权利要求23-34中任一项所述的方法，其中先前接受的RCC治疗药是靶向哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)的抑制剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中靶向mTOR的抑制剂是选自依维莫司和坦罗莫司的药剂。
37.根据权利要求23-34中任一项所述的方法，其中先前接受的RCC治疗药是干扰素α(IFN-α)或白介素-2(IL-2)。
38.根据权利要求23-37中任一项所述的方法，还包括施用RTKI。
39.根据权利要求38所述的方法，其中RTKI是选自舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、阿昔替尼、替沃扎尼和凡德他尼的药剂。
40.根据权利要求23-37中任一项所述的方法，还包括施用靶向mTOR的抑制剂。
41.根据权利要求40所述的方法，其中靶向mTOR的抑制剂是选自依维莫司和坦罗莫司的药剂。
42.根据权利要求23-41中任一项所述的方法，其中RCC是透明细胞肾细胞癌。
43.根据权利要求42所述的方法，其中RCC已经侵入肾窦。
44.根据权利要求23-43中任一项所述的方法，其中RCC是转移性RCC。
45.根据权利要求23-44中任一项所述的方法，其中RCC已经转移至肺、腹内淋巴结、骨、脑或肝。
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