PT2331136T - Agentes de ligação a frizzled e utilizações dos mesmos - Google Patents

Description

reparação tecidual pelas células estaminais (revisto em Reya e Clevers, 2005, Nature 434:843; Beachy et al. , 2004, Nature 432 :324) . A via de sinalização de Wnt foi inicialmente elucidada no mutante de desenvolvimento wingless (wg) de Drosophila e a partir do proto-oncogene int-1 de ratinho, agora Wntl (Nusse e Varmus, 1982, Cell 31:99-109; Van Ooyen e Nusse, 1984, Cell 39:233-40; Cabrera et al., 1987, Cell 50:659-63; Rijsewijk et al., 1987, Cell 50:649-57). Os genes Wnt codificam glicoproteínas modificadas por lípidos segregados das quais 19 foram identificadas em mamíferos. Estes ligandos segregados ativam um complexo de recetor consistindo num membro da família do recetor Frizzled (FZD) e da proteína 5 ou 6 (LPR5/6) relacionada com o recetor de lipoproteína de baixa densidade (LDL). Os recetores FZD são sete proteínas de domínio transmembrana da superfamília dos recetores acoplados a proteína G (GPCR) e contêm um domínio de ligação a ligando N-terminal extracelular grande com 10 cisternas conservadas, conhecido como um domínio rico em cisteína (CRD) ou domínio Fri. Existem dez recetores FZD humanos: FZD1-10. Diferentes CRDs de FZD têm diferentes afinidades de ligação para Wnts específicos (Wu e Nusse, 2002, J. Biol. Chem. 277:41762-9), e os recetores FZD foram agrupados nos que ativam a via canónica da β-catenina e nos que ativam vias não canónicas descritas abaixo (Miller et al. 1999, Oncogene 18:7860-72). Para formar o complexo de recetor que liga os ligandos FZD, os recetores FZD interatuam com LRP5/6, proteínas transmembrana de passagem única com quatro domínios de tipo EGF extracelulares separados por seis repetições de aminoácidos YWTD (Johnson et al. , 2004, J. Bone Mineral Res. 19:1749) . A via de sinalização de Wnt canónica ativada após a ligação ao recetor é mediada pela proteína citoplasmática Dishevelled (DSH) interatuando diretamente com o recetor FZD e resulta na estabilização citoplasmática e acumulação de β-catenina. Na ausência de um sinal de Wnt, a β-catenina é localizada a um complexo de destruição citoplasmãtica que inclui as proteínas supressoras de tumor polipose adenomatosa coli (APe) e Axina. Estas proteínas funcionam como estruturas críticas para permitir que a glicogénio sintase quinase (GSK)-3β ligue e fosforile a β-catenina, marcando a mesma para degradação através da via ubiquitina/proteossoma. A ativação de Dsh resulta na fosforilação da 0ΞΚ3β e na dissociação do complexo de destruição. A β-catenina citoplasmãtica acumulada é então transportada para o núcleo onde interatua com as proteínas de ligação a ADN da família Tcf/Lef para ativar a transcrição.

Para além da via de sinalização canónica, os ligandos Wnt também ativam vias independentes de β-catenina (Veeman et al., 2003, Dev. Cell 5:367-77). A sinalização de Wnt não canónica foi implicada em numerosos processos, mas de forma mais convincente nos movimentos de gastrulação através de um mecanismo semelhante à via de polaridade celular planar de Drosophila (PCP). Outros mecanismos potenciais de sinalização de Wnt não canónica incluem fluxo de cálcio, JNK, e proteínas G tanto pequenas como heterotriméricas. É frequentemente observado antagonismo entre as vias canónicas e não canónicas, e algumas evidências indicam que a sinalização não canónica pode suprimir a formação de cancro (Olson e Gibo, 1998, Exp Cell Res 241:134; Topol et al., 2003, J. Cell. Biol. 162:899-908). Consequentemente, em determinados contextos, os recetores FZD atuam como reguladores negativos da via de sinalização de Wnt canónica. Por exemplo, FZD6 reprime a sinalização canónica induzida por Wnt-3a quando co-expressa com FZD1 através da via TAK1-NLK (Golan et al. 2004, JBC 279:14879-88). De forma semelhante, FZD2 antagonizou a sinalização de Wnt canónica na presença de Wnt-5a através da cascata TAK1-NLK MAPK (Ishitani et al. 2003, Mol. Cell. Biol. 23:131-9) . A via de sinalização de Wnt canónica também desempenha um papel central na manutenção de populações de células estaminais no intestino delgado e cólon, e a ativação inadequada desta via desempenha um papel proeminente em casos de cancro colorretal (Reya e Clevers, 2005, Nature 434:843). 0 epitélio de absorção dos intestinos está organizado em vilosidades e criptas. As células estaminais residem nas criptas e dividem-se lentamente para produzir células de proliferação rápida que dão origem a todas as populações de células diferenciadas que se movem para fora das criptas para ocupar as vilosidades intestinais. A cascata de sinalização de Wnt desempenha um papel dominante no controlo do destino das células ao longo do eixo cripta-vilosidades e é essencial para a manutenção da população de células estaminais. A interrupção da sinalização de Wnt por perda genética de Tcf7/2 através de recombinação homóloga (Korinek et al. 1998, Na t. Genet. 19:379) ou por sobreexpressão de Dickkopf-1 (Dkkl), um potente antagonista de Wnt segregado (Pinto et al. 2003, Genes Dev. 17:1709-13; Kuhnert et al., 2004, Proc. Nat'l Acad. Sei. 101:266-71), resulta no esgotamento das populações de células estaminais intestinais. 0 cancro colorretal é mais comumente iniciado por mutações ativadoras na cascata de sinalização de Wnt. Aproximadamente 5-10% de todos os cancros colorretais são hereditários com uma das principais formas sendo a polipose adenomatosa familiar (PAF), uma doença dominante autossómica na qual cerca de 80% dos indivíduos afetados contêm uma mutação de linha germinal no gene da polipose adenomatosa coli (APe). Foram também identificadas mutações noutros componentes da via Wnt incluindo Axina e β-catenina. Os adenomas individuais são excrescências clonais de células epiteliais contendo um segundo alelo inativado, e o grande número de adenomas de PAF inevitavelmente resulta no desenvolvimento de adenocarcinomas através de mutações de adição em oncogenes e/ou genes supressores de tumor. Além disso, a ativação da via de sinalização de Wnt, incluindo mutações por aquisição de função em APC e β-catenina, podem induzir desenvolvimento hiperplásico e crescimento tumoral em modelos de ratinhos (Oshima et al. , 1997, Cancer Res 57:1644- 9; Harada et al. , 1999, EMBOJ 18 :5931-42) .

Foi inicialmente descoberto um papel para a sinalização de Wnt no cancro com a identificação de Wntl (originalmente intl) como um oncogene em tumores mamários transformados pela inserção nas proximidades de um vírus de ratinho (Nusse e Varmus, 1982, Cell 31:99-109). Tem sido desde então acumulada evidência adicional sobre o papel da via de sinalização de Wnt no cancro da mama. Por exemplo, a sobreexpressão transgênica de β-catenina nas glândulas mamárias resulta em hiperplasias e adenocarcinomas (Imbert et al. , 2001, J. Cell Biol 153:555-68; Michaelson e Leder, 2001, Oncogene 20:5093-9) enquanto a perda de sinalização de Wnt interrompe o desenvolvimento normal da glândula mamária (Tepera et al., 2003, J. Cell Sei. 116:1137-49; Hatsell et al. , 2003, J. Mamary Gland Biol. Neoplasia 8:145-58). Mais recentemente as células estaminais mamárias foram mostradas como sendo ativadas pela via de sinalização de Wnt (Liu et al. , 2004, Proc Nat'l Acad Sei. 101:4158). No cancro da mama humano, a acumulação de β-catenina implica sinalização de Wnt ativada em mais de 50% dos carcinomas, e apesar de não terem sido identificadas mutações específicas, foi observada regulação positiva da expressão do recetor Frizzled (Brennan e Brown, 2004, J. Mammary Gland Neoplasia 9:119-31; Malovanovic et al., 2004, Int. J. Oncol 25:1337-42) . FZD10, FZD8, FZD7, FZD4 e FZD5 são cinco de dez recetores Wnt humanos identificados. FZD10 é co-expresso com Wnt7b nos pulmões e os estudos de transfeção de células demonstraram que o co-recetor FZD10/LRP5 ativa a via de sinalização de Wnt canónica em resposta a Wnt7b (Wang et al. , 2005, Mol Cell Biol 25: 5022-30). 0 ARNm de FZD10 ARNm é regulado positivamente em numerosas linhas de células cancerígenas, incluindo linhas celulares do colo do útero, gástricas e de glioblastoma, e em cancros primários incluindo aproximadamente 40% dos cancros gástricos primários, cancros de cólon e sarcomas sinoviais (Saitoh et al. 2002, Int. J. Oncol 20:117-20; Terasaki et al., 2002, Jnt. J. Moí Med 9:107-12; Nagayama et al., 2005, Oncogene 1-12). FZD8 é regulado positivamente em várias linhas de células cancerígenas humanas, cancros gástricos primários e carcinomas renais (Saitoh et al., 2001, Int. J. Oncol. 18:991-96; Kirikoshi et al., 2001, Int. J. Oncol. 19:111-5; Janssens et al. , 2004, Tumor Biol. 25:161-71). FZD7 é expresso em todo o trato gastrointestinal e é regulada positivamente num de seis casos de cancro gástrico primário humano (Kirikoshi et al. 2001, Int. J. Oncol. 19:111-5). A expressão do ectodomínio de FZD7 por uma linha de células cancerígenas do cólon induziu alterações morfológicas e diminuiu o crescimento tumoral num modelo de xenoenxerto (Vincan et al. 2005, Differentiation 73:142-53). A sequência de FZD7 e FZD8 e parte da sequência de ligação a ligando é divulgada no documento US2008/194457. FZD5 desempenha um papel essencial na angiogénese do saco vitelino e placentário (Ishikawa et al. 2001, Dev. 128:25-33) e é regulada positivamente em carcinomas renais em associação com a ativação da sinalização de Wnt/beta-catenina (Janssens et al. 2004, Tumor Biology 25:161-71). FZD4 é altamente expresso em células epiteliais das criptas intestinais e é um dos vários fatores que exibem expressão diferencial em tecidos normais contra neoplásicos (Gregorieff et al. 2005, Gastroenterology 129:626-38). A identificação dos recetores FZD como marcadores de células estaminais cancerígenas torna consequentemente estas proteínas alvos ideais para a terapêutica do cancro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um aspeto da invenção proporciona um anticorpo monoclonal conforme estabelecido na reivindicação 1. A presente divulgação proporciona novos agentes que ligam a um ou mais recetores frizzled humanos (FZDs), incluindo, mas não limitados a, anticorpos ou outros agentes que ligam dois ou mais recetores frizzled humanos, e métodos para utilizar os agentes. A presente divulgação proporciona adicionalmente novos polipéptidos, tais como anticorpos que ligam a um ou mais recetores frizzled humanos, fragmentos de tais anticorpos, e outros polipéptidos relacionados com tais anticorpos. Em determinadas formas de realização, o agente, anticorpos, outros polipéptidos, ou agentes que ligam um FZD, ligam a uma região do FZD referida no presente documento como o Sítio de Ligação Biológica (BBS) que os inventores identificaram recentemente pela primeira vez como um alvo para inibir a sinalização de Wnt e/ou o crescimento tumoral. Também são proporcionados anticorpos e outros polipéptidos que compreendem um sítio de ligação a antigénio que liga mais de um FZD. São também proporcionados polinucleótidos compreendendo sequências de ácidos nucleicos codificando os polipéptidos, bem como vetores compreendendo os polinucleótidos. São adicionalmente proporcionadas células compreendendo os polipéptidos e/ou polinucleótidos da divulgação. Também são proporcionadas composições (por exemplo, composições farmacêuticas), compreendendo os novos agentes ou anticorpos de ligação a FZD. Adicionalmente, são também proporcionados métodos para produzir e utilizar os novos anticorpos ou agentes de ligação a FZD, tais como métodos para utilizar os novos anticorpos ou agentes de ligação a FZD para inibir o crescimento do tumor e/ou tratar o cancro.

Consequentemente, num aspeto, a divulgação proporciona um agente que liga especificamente a um recetor frizzled humano. Em determinadas formas de realização, o agente inibe a ligação de um ligando (por exemplo, um Wnt) a um Sítio de Ligação Biológica (BBS) do recetor frizzled humano. Em determinadas formas de realização, o agente liga a pelo menos uma parte do Sítio de Ligação Biológica (BBS) dentro do recetor frizzled humano. Em determinadas formas de realização, a ligação do agente ao BBS resulta numa inibição da sinalização de Wnt e/ou crescimento tumoral. Em determinadas formas de realização, o recetor frizzled humano é FZDS e o agente liga a pelo menos uma parte de: (a) um epítopo conformacional de FZD8 formado pelos aminoãcidos 72(F), 74-75(PL), 78(1), 92(Y), 121-122 (LM) e 129-132 (WPDR (SEQ ID NO: 70)), (b) uma região de FZD8 consistindo na sequência QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO: 67) , e/ou (c) uma região de FZD8 consistindo na sequência QYGFA (SEQ ID NO: 66) . Em determinadas formas de realização, o recetor frizzled humano é selecionado a partir do grupo consistindo em FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 ou FZD8, e o agente liga a pelo menos parte da sequência Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL (SEQ ID NO: 24) dentro do recetor frizzled humano. Por exemplo, em determinadas formas de realização, o recetor frizzled humano é FZD8 e o agente liga a pelo menos parte da sequência QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO: 67) dentro do FZD8. Em determinadas formas de realização, o agente liga a pelo menos parte da sequência GLEVHQ (SEQ ID NO: 25) . Em determinadas formas de realização, o recetor frizzled humano é FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD9 ou FZD10, e o agente liga a pelo menos parte de uma região do recetor frizzled humano correspondente à região de FZD8 consistindo em QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO: 67) . Em determinadas formas de realização, o agente liga a pelo menos parte de uma sequência (K/Q)(F/Y)GF(Q/A) (SEQ ID NO: 69) dentro de FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e/ou FZD8. Por exemplo, em determinadas formas de realização, o recetor frizzled humano é FZD8 e o agente liga a pelo menos parte de uma sequência QYGFA (SEQ ID NO: 66) dentro de FZD8. Em determinadas formas de realização alternativas, o recetor frizzled humano é FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD9 ou FZD10, e O agente liga a pelo menos parte de uma região do recetor frizzled humano correspondente à região de FZD8 consistindo em QYGFA (SEQ ID NO: 66) . Em determinadas formas de realização, o agente liga especificamente a dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais recetores frizzled humanos. Em determinadas formas de realização, o agente liga especificamente ao recetor frizzled humano compreendendo FZD5 e FZD8.

Noutro aspeto, a divulgação proporciona um agente que compete pela ligação específica a um recetor frizzled humano com um anticorpo (por exemplo, num ensaio de ligação competitiva in vitro), em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14. Em determinadas formas de realização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 14. Em determinadas formas de realização, o agente compete por ligação específica a dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais recetores frizzled humanos. Em determinadas formas de realização, o agente compete por ligação específica a FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 ou FZD8.

Noutro aspeto, a divulgação proporciona um agente que compete por ligação específica a um FZD5 e/ou FZD8 humano com um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 85 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 86.

Noutro aspeto, a divulgação proporciona um agente que liga especificamente a dois ou mais recetores frizzled humanos. Em determinadas formas de realização, os dois ou mais recetores frizzled compreendem: (a) FZD1 e um segundo recetor frizzled selecionado a partir do grupo consistindo em FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8, (b) FZD2 e um segundo recetor frizzled selecionado a partir do grupo consistindo em FZD5, FZD7 e FZD8, (c) FZD5 e FZD7, ou (d) FZD7 e FZD8 . Em determinadas formas de realização, o agente liga especif icamente a três ou mais (ou seja, 3, 4 ou 5) recetores frizzled humanos, em que os três ou mais recetores frizzled humanos compreendem FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e/ou FZD8. Em determinadas formas de realização, os três ou mais recetores humanos compreendem FZD5 e FZD8. Em determinadas formas de realização, os três ou mais recetores frizzled humanos compreendem adicionalmente FZD3, FZD4, FZD6, FZD9 e/ou FZD10.

Num aspeto adicional, a divulgação proporciona um polipéptido que liga especificamente a um recetor frizzled humano, em que o polipéptido compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: 1) ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (b) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VISGDGSYTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; e/ou (c) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO: 3), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos. Em determinadas formas de realização, o polipéptido liga especificamente a FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e/ou FZD8. Em certas formas de realização, o polipéptido liga especificamente os dois ou mais recetores frizzled humanos incluindo FZD5 e FZD8. Em determinadas formas de realização, as substituições de aminoácidos são substituições conservatives.

Em um aspeto adicional, a divulgação proporciona um polipéptido que liga especificamente a um recetor frizzled humano, em que o polipéptido compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo: (a) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO: 4) ou SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO: 7), ou uma variante da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 7 compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (b) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5) OU DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8), OU uma variante da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 8 compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos e/ou (c) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo SSFAGNSLE (SEQ ID NO: 6) ou QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9), ou uma variante da SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 9 compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos. Em determinadas formas de realização, o polipéptido liga especificamente a FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e/ou FZD8. Em certas formas de realização, o polipéptido liga especificamente os dois ou mais recetores frizzled humanos incluindo FZD5 e FZD8. Em determinadas formas de realização, as substituições de aminoácidos são substituições conservativas.

Noutro aspeto, a divulgação proporciona um polipéptido compreendendo: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: 1), uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VISGDGSYTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO: 3) ; e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO: 4) OU SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO: 7), uma CDR2 de cadeia leve compreendendo EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5) ou DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8), e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo SSFAGNSLE (SEQ ID NO: 6) ou QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9). Em determinadas formas de realização, o polipéptido liga especificamente a um recetor frizzled humano. Em determinadas formas de realização, o polipéptido liga especif icamente a dois ou mais (por exemplo, pelo menos FZD5 e FZD8) , três ou mais, ou quatro ou mais recetores frizzled humanos.

Num aspeto adicional, a divulgação proporciona um anticorpo que liga especificamente a um recetor frizzled humano selecionado a partir do grupo consistindo em FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: 1), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoãcidos, uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VISGDGSYTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2) , ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO: 3), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos,· e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO: 4), SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO: 7), ou uma variante da SEQ ID NO: 4 ou da SEQ ID NO: 7 compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácidos, uma CDR2 de cadeia leve compreendendo EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5), DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8), ou uma variante da SEQ ID NO: 5 ou da SEQ ID NO: 8 compreendendo 1, 2, 3, ou 4 substituições conservativas do aminoácido, e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo SSFAGNSLE (SEQ ID NO: 6) , QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9), ou uma variante da SEQ ID NO: 6 ou da SEQ ID NO: 9 compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas do aminoácido. Em determinadas formas de realização, o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: 1), uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VISGDGSYTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO: 3) ,* e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO: 4) ou SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO: 7), uma CDR2 de cadeia leve compreendendo EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5) ou DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8), e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo SSFAGNSLE (SEQ ID NO: 6) ou QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9) . Em determinadas formas de realização, o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: 1), uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VISGDGSYTYYADSVKG {SEQ ID NO: 2), e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO: 3) e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO: 7), uma CDR2 de cadeia leve compreendendo DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8), e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9).

Noutro aspeto, a divulgação proporciona um polipéptido compreendendo (a) um polipéptido tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou (b) um polipéptido tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14. Em determinadas formas de realização, a divulgação proporciona um polipéptido compreendendo (a) um polipéptido tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou (b) um polipéptido tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. Em determinadas formas de realização, o polipéptido liga especificamente a um recetor frizzled humano. Em certas formas de realização, o polipéptido liga especif icamente a dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais recetores frizzled humanos. Em algumas formas de realização, o(s) recetor(es) frizzled humano(s) são selecionados a partir do grupo consistindo em FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8.

Ainda noutro aspeto, a divulgação proporciona um agente tal como um anticorpo que liga especificamente a FZD5 e/ou FZD8 humano, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSSYYIT (SEQ ID NO: 77), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições conservatives de aminoãcidos, uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo TISYSSSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 78), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições conservatives de aminoãcidos e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo SIVFDY (SEQ ID NO: 79), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoãcidos e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo S GDALGNR YVY (SEQ ID NO: 80), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoãcidos, uma CDR2 de cadeia leve compreendendo SG (SEQ ID NO: 81), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoãcidos; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo GSWDTRPYPKY (SEQ ID NO: 82), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoãcidos. Em determinadas formas de realização, o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSSYYIT (SEQ ID NO: 77), uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo TISYSSSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 78) , e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo SIVFDY (SEQ ID NO: 79), e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo S GDALGNR YVY (SEQ ID NO: 80), uma CDR2 de cadeia leve compreendendo SG (SEQ ID NO: 81), e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo GSWDTRPYPKY (SEQ ID NO: 82).

Num aspeto adicional, a divulgação proporciona um polipéptido que liga especificamente a FZD5 e/ou FZD8, em que o dito polipéptido compreende: (a) um polipéptido tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 85; e/ou (b) um polipéptido tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com a SEQ ID NO: 86.

Nm aspeto adicional, a divulgação proporciona um agente que compete por ligação específica a FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e/ou FZD8 humanos com qualquer um dos anticorpos IgG seguintes: 18R8, 18R5, 18R4605 e 18R4805.

Ainda num aspeto adicional, a divulgação proporciona um agente que compete para a ligação específica a FZD5 e/ou FZD8 humano com o anticorpo anti-IgG FZD 44R24.

Em determinadas formas de realização de cada um dos aspetos mencionados acima, bem como outros aspetos descritos no presente documento, o agente ou o polipéptido é um anticorpo. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente não é um anticorpo.

Em determinadas formas de realização de cada um dos aspetos mencionados acima, bem como outros aspetos descritos no presente documento, o agente ou polipéptido ou o anticorpo liga especificamente ao domínio extracelular (ECD) do recetor ou recetores frizzled humanos aos quais o mesmo liga. Em determinadas formas de realização de cada um dos aspetos mencionados acima, bem como outros aspetos descritos no presente documento, o agente ou polipéptido ou anticorpo liga especificamente ao domínio Fri (Fri) do recetor ou recetores frizzled humanos aos quais o mesmo liga.

Em determinadas formas de realização de cada um dos aspetos mencionados acima, bem como outros aspetos descritos noutro ponto do presente documento, um sítio de ligação a antigénio individual do anticorpo ou outro polipéptido liga especificamente (ou é capaz de ligar) a mais de um recetor frizzled humano.

Em determinadas formas de realização de cada um dos aspetos mencionados acima, bem como outros aspetos descritos no presente documento, o agente ou polipéptido ou anticorpo inibe a ligação de um ligando ao(s) recetor(es) frizzled humano(s). Em determinadas formas de realização, o ligando é um Wnt.

Em determinadas formas de realização de cada um dos aspetos mencionados acima, bem como outros aspetos descritos no presente documento, o agente ou polipéptido ou anticorpo que liga ao (s) FZD(s) é um antagonista do (s) FZD(s) .

Em determinadas formas de realização de cada um dos aspetos mencionados acima, bem como outros aspetos descritos no presente documento, o agente ou polipéptido ou anticorpo inibe a sinalização de Wnt. Em determinadas formas de realização, a sinalização de Wnt que é inibida é sinalização de Wnt canónica. Nalgumas formas de realização, a sinalização de Wnt que é inibida pelo agente de ligação a FZD é sinalização de Wnt não canónica. Em determinadas formas de realização, a sinalização de Wnt é sinalização de Wnt não canónica.

Em determinadas formas de realização de cada um dos aspetos mencionados acima, bem como outros aspetos descritos no presente documento, o anticorpo ou polipéptido ou agente de ligação a FZD inibe o crescimento tumoral. A divulgação proporciona adicionalmente os anticorpos 18R8, 18R5, 18R46Q5, 44R24 e 18R4805, bem como fragmentos dos mesmos. A divulgação proporciona adicionalmente composições, tais como composições farmacêuticas, compreendendo um anticorpo ou agente de ligação a FZD. São proporcionados métodos para inibição da sinalização de Wnt (por exemplo, sinalização de Wnt canónica) e/ou inibição do crescimento tumoral num indivíduo, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou polipéptido ou agente de ligação a FZDs. São também proporcionados métodos para reduzir a tumorigenicidade de um tumor compreendendo células estaminais cancerígenas. Em determinadas formas de realização, os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou polipéptido ou agente de ligação a FZD a um indivíduo compreendendo o tumor. Em determinadas formas de realização, a frequência de células estaminais cancerígenas num tumor é reduzida pela administração do anticorpo. Em determinadas formas de realização, a administração do agente de ligação a FZD resulta na diferenciação de células tumorigénicas no tumor a um estado não tumorigénico.

Também são proporcionados métodos para induzir a diferenciação de células de um tumor num indivíduo, os ditos métodos compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo ou polipéptido ou agente de ligação a FZD ao indivíduo. São adicionalmente proporcionados métodos para tratamento do cancro num indivíduo, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou polipéptido ou agente de ligação a FZD ao indivíduo.

Adicionalmente, também são proporcionados métodos para reduzir a ativação de miofibroblastos no estroma de um tumor sólido, compreendendo contactar o estroma com uma quantidade eficaz do anticorpo ou polipéptido ou agente de ligação a FZD.

Em determinadas formas de realização, os métodos compreendendo a administração do anticorpo ou polipéptido ou agente de ligação a FZD compreendem adicionalmente administrar um segundo agente anti cancro (por exemplo, um agente quimioterapêutico) ao indivíduo. Em determinadas formas de realização, o segundo agente é gemcitabina, irinotecano ou paclitaxel. Em determinadas formas de realização, o segundo agente é um inibidor de angiogénese e/ou um inibidor de sinalização Notch.

Noutro aspeto, a divulgação proporciona um polipéptido compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 10-15. São também proporcionados polipéptidos compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 85-86. São também proporcionados polinucleótidos compreendendo as sequências de ácido nucleico codificando tais polipéptidos.

Num aspeto adicional, a divulgação proporciona um polinucleótido compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 17-22. São adicionalmente proporcionados polinucleótidos compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 87-90, 92 e 94-95.

Ainda num aspeto adicional, a divulgação proporciona um polinucleótido que compreende um polinucleótido que híbrida com um polinucleótido selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs : 17, 19, 21, 87-90, 92 e 94-95, ou um polinucleótido que codifica um polipéptido selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 12, 14 e 85-86 sob condições de elevada restringência. Em determinadas formas de realização, a divulgação compreende um polinucleótido que híbrida com um polinucleótido que consiste numa das sequências das SEQ ID NOs: 17, 19 ou 21, ou um polinucleótido que codifica as SEQ ID NOs: 10, 12 ou 14 sob condições de elevada restringência.

Em determinadas formas de realização de cada um dos aspetos mencionados acima, bem como outros aspetos descritos no presente documento, o agente ou polipéptido ou anticorpo ou polinucleótido está isolado. Em determinadas formas de realização, o agente ou polipéptido ou anticorpo ou polinucleótido é substancialmente puro. A presente divulgação proporciona adicionalmente uma assinatura de gene Wnt útil para a identificação de tumores e/ou pacientes com probabilidade de responder ao tratamento com um agente de ligação a FZD (por exemplo, um antagonista de um recetor frizzled humano e/ou um inibidor de Sinalização de Wnt) ou outros inibidores da sinalização de Wnt. São também proporcionados métodos para utilizar a assinatura de gene Wnt para selecionar pacientes para tratamento com um agente de ligação a FZD ou outro inibidor da via de sinalização de Wnt. Em determinadas formas de realização, os métodos envolvem a avaliação do nível de um ou mais genes na assinatura de gene Wnt. Também são proporcionados métodos de rastreio de candidatos a fármaco contra tumores identificados utilizando a assinatura de gene Wnt. Também são proporcionados arranjos, kits, e outras composições úteis nos métodos. A presente divulgação proporciona também métodos para rastreio de candidatos a fármacos potenciais ou outros agentes. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, métodos compreendendo comparação dos níveis de um ou mais marcadores de diferenciação num primeiro tumor sólido que tenha sido exposto ao agente em relação aos níveis de um ou mais marcadores de diferenciação num segundo tumor sólido que não tenha sido exposto ao agente. Em determinadas formas de realização, estes métodos compreendem (a) expor um primeiro tumor sólido, mas não um segundo tumor sólido ao agente, (b) avaliar os níveis de um ou mais marcadores de diferenciação nos primeiro e segundo tumores sólidos, e (c) comparar os níveis de um ou mais marcadores de diferenciação nos primeiro e segundo tumores sólidos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. 18R8 liga a múltiplos recetores frizzled humanos. A análise por FACS demonstrou que 18R8 liga as sequências de FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8 em células HEK293 transfetadas de forma transiente. São mostrados gráficos de FACS para a ligação de 18R8 a células HEK293 transfetadas com vetores de expressão codificando o FZD indicado e um vetor de expressão para GFP. A ligação de 18R8 é indicada por colorações elevadas dentro da população de células co-transfetadas (GFP positivo). Os gráficos de FACS para FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8 estão dentro de caixas com linha grossa para destacar os FZDs mostrando a ligação a 18R8.

Figura 2. 18R5 de anticorpo anti-FZD liga vários recetores frizzled humanos nas células. A análise por FACS demonstrou que 18R5, como 18R8, liga às sequências de FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8 em células. Os anticorpos 18R8 e 18R5 foram incubados num intervalo de concentrações com as células HEK293 sobreexpressando o FZD indicado e a ligação do anticorpo foi avaliada por citometria de fluxo. Embora tanto 18R8 quanto 18R5 liguem ao FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8, 18R5 liga com maior afinidade.

Figura 3. Foram realizados ensaios do repórter de luciferase em células STF293 que expressam estavelmente elemento promotor 8xTCF ligado a luciferase. As células foram tratadas com meio condicionado contendo Wnt3A, bem como um intervalo de concentrações de 18R8 e 18R5 e posteriormente ensaiadas 18 horas mais tarde utilizando o sistema de ensaio de repórter de luciferase Dual-Glo (Promega). Os resultados demonstram que tanto 18R8 como 18R5 inibe a sinalização de Wnt e que 18R5 liga com maior afinidade do que 18R8.

Figura 4. 18R8 bloqueia a sinalização de TCF por múltiplas Wnts. Foram realizados ensaios de repórter de luciferase em células STF293 que expressam estavelmente o elemento promotor 8xTCF ligado a luciferase. Foram geradas várias células sobreexpressando Wnt através de transfeção de células HEK293 (ATCC) com vetores de expressão codificando proteínas Wnt indicadas utilizando Fugene 6 (Roche). As células STF293 foram tratadas com 18R8 e foram adicionadas às mesmas células HEK293 sobreexpressando Wnts e ensaiadas 18 horas mais tarde utilizando o sistema de ensaio de repórter de luciferase Dual-Glo.

Figura 5. 18R8 inibe diretamente a ligação Wnt para FZD. Foram realizados ensaios de repórter de luciferase em células STF293 que expressam estavelmente o elemento promotor 8xTCF. Foi co-incubada uma mistura contendo meio condicionado com Wnt3A, FZDS-Fc purificado, e/ou 18R8 conforme indicado durante 2 horas a 4 °C com/sem microesferas de proteína A sefarose. Após a incubação, as microesferas de proteína A sefarose foram removidas e adicionadas a células STF293. As células STF293 tratadas foram ensaiadas 18 horas mais tarde utilizando o sistema de ensaio de repórter de luciferase Dual-Glo. Esta experiência mostra que, na ausência de 18R8, FZD8-FC é capaz de inibir a capacidade de Wnt3A de estimular a sinalização, mas que 18R8 é capaz de bloquear a capacidade de FZD8 de ligar a Wnt3A, conforme evidenciado pela restauração da sinalização quando as microesferas de sefarose A são utilizadas para remover o FZD8-Fc (e 18R8) a partir da co-incubação.

Figura 6. Análise FACS da ligação de 18R8 ao mutante de FZD8 em comparação com FZD8 de tipo selvagem. Para avaliar o epítopo de 18R8 em FZD, foram realizados estudos de mapeamento de epítopos. Foi utilizada uma construção de expressão que permitiu a expressão do domínio Fri de FZD8 humano com uma etiqueta FLAG N-terminal, e um domínio transmembrana e domínio intracelular CD4 C-terminal em estudos de transfeção transitória com um vetor de expressão codificando GFP. Foram também preparadas variantes deste vetor de expressão que continham substituições de aminoácidos selecionadas dentro da sequência de FZD8 para codificar os aminoácidos na posição correspondente dentro do domínio Fri de outros FZDs particulares não ligados por 18R8. Foi então avaliada a capacidade de 18R8 de ligar a estas sequências de FZD8 variantes através de citometria de fluxo. Determinadas posições incluindo os aminoácidos 66-71 e 126-127 do FZD8 foram consideradas como sendo necessárias para a ligação de 18R8 conforme indicado pela coloração reduzida dentro da população de células co-transfetadas (GFP positivo). A região do gráfico de FACS mostrando ligação de 18R8 à população de células co-transfetadas é destacada por uma caixa e a caixa é mostrada em linhas grossas para as substituições de aminoácidos mostrando acentuadamente ligação de 18R8 reduzida.

Figura 7. 18R5 e 18R8 mostraram ter um epítopo de ligação semelhante em FZD8 humano. A capacidade de 18R5 para ligar a um epítopo semelhante como 18R8 foi avaliada por citometria de fluxo utilizando uma série de variantes de aminoácidos mostrados anteriormente como interrompendo a ligação de 18R8. As posições incluindo os aminoácidos 66-71 e 126127 de FZD8 foram consideradas como sendo necessárias para tanto 18R8 como 18R5 conforme indicado pela coloração reduzida dentro da população de células co-transfetadas (GFP positivo). A região do gráfico de FACS mostrando a ligação de 18R8 para a população de células co-transfetadas é destacada por uma caixa e a caixa é mostrada em linhas grossas para aquelas substituições de aminoácidos que mostrando ligação de 18R8 e 18R5 acentuadamente reduzida.

Figura 8. Comparação das sequências de aminoácidos de porções das sequências de domínio Fri dos recetores frizzled humanos. Os sítios com resíduos conservados são sombreados em preto; os sítios com resíduos de aminoácidos semelhantes são sombreados em cinzento. 0 epítopo FZD de 18R8 e 18R5 contém as regiões denotadas por sublinhado e etiquetadas como "limite superior" e "limite inferior". Os termos "limite superior" e "limite inferior" refletem o reconhecimento, com base no exame da estrutura cristalina do domínio Fri, de que estas regiões flanqueiam um sulco na superfície da proteína FZD. Este sulco contém vários resíduos altamente conservados. Os aminoácidos que compõem este sulco são destacados por símbolos de cenoura por cima de cada posição correspondente dentro do alinhamento. Não foi previamente atribuída função específica a esta região. A descoberta de anticorpos que ligam a esta região e a descoberta de que estes anticorpos inibem a ligação de Wnt e a sinalização de Wnt, bem como o reconhecimento dos inventores da natureza conservada deste sulco permitiu aos inventores identificar esta região como um aspeto funcional chave das proteínas FZD.

Figura 9. Sítio de Ligação Biológica (BBS) de FZD. São mostradas imagens da estrutura de um domínio Fri de FZD. As imagens são baseadas na análise da estrutura cristalina anteriormente relatada de FZD8 de ratinho (Dann CE et al. , Nature 412 (6842) 86-90, 2001) e a análise realizada utilizando o programa de software PyMOL. É mostrada na imagem superior esquerda uma vista superficial do domínio Fri de FZD com a região da proteína FZD compreendendo o sítio de ligação biológica (BBS) que os inventores descobriram (rodeado por uma oval branca). Esta é a região delimitada pelos anticorpos 18R8 e 18R5. Esta região contém elementos estruturais denominados pelos inventores o "limite superior", o "limite inferior" e o "sulco". Cada um destes é destacado em coloração mais escura da superfície em imagens separadas na parte inferior do painel. A imagem superior direita destaca na superfície mais escura os resíduos que são conservados em nove ou dez dos dez membros da família de FZD humano e destaca o reconhecimento de que um grupo distinto desses resíduos ocorre dentro do centro da região de "sulco" flanqueada pelo epítopo que liga a anticorpos que inibem a função de FZD.

Figura 10. Prevenção do crescimento tumoral dependente de Wnt por mAb anti-FZD. Ratinhos NOD/SCID injetados com 50.000 células derivadas a partir de tumor MMTV WNT1 e o crescimento tumoral foi monitorizado semanalmente até ser detetado crescimento, posteriormente o crescimento tumoral foi medido duas vezes por semana. Dez ratinhos com tumores estabelecidos foram tratados com 18R8 ou com um anticorpo de controlo como um controlo. O crescimento tumoral nos animais tratados com 18R8 foi praticamente eliminado em comparação com o observado nos animais tratados com anticorpo de controlo.

Figura 11. Redução do crescimento do tumor de xenoenxerto OMP-C28 através de tratamento de combinação de 18R5 e irinotecano. Os ratinhos NOD/SCID foram injetados com 10.000 células de tumor do cólon OMP-C28, e no dia 24, os ratinhos com tumores do volume médio de 12 9 mm3 foram aleatorizados e os tratamentos indicados foram iniciados. 0 crescimento tumoral foi monitorizado semanalmente. 0 crescimento tumoral nos animais tratados com 18R5 foi significativamente reduzido. Além disso, a combinação de 18R5 e irinotecano foi significativamente reduzida durante o tratamento com qualquer dos agentes por si só. Figura 12. Redução do crescimento tumoral de xenoenxerto 0MP-Pn4 através de tratamento de combinação de 18R5 e gemeitabina. Ratinhos NOD/SCID injetados com 50.000 células de tumor pancreático 0MP-Pn4 e no dia 38, os ratinhos com tumores de volume médio de cerca de 120 mm3 foram aleatorizados, e os tratamentos indicados foram iniciados dois dias depois. 0 crescimento tumoral nos animais tratados com a combinação de 18R5 e gemeitabina foi significativamente reduzido durante o tratamento com gemeitabina por si só.

Figura 13. Sequências de aminoácidos de cadeia pesada e de cadeia leve para 18R8 el8R5, incluindo sequências VH e VL.

Figura 14. Sequências de nucleótidos codificando as sequências de cadeia pesada e VH de 18R8 e 18R5.

Figura 15. Sequências de nucleótidos codificando as sequências de cadeia leve e VL del8R8 e 18R5.

Figura 16. Sequência de aminoácidos da proteína FZD7 ECD Fc e sequência de nucleótidos codificando a mesma.

Figura 17. Sequências de aminoácidos de FZD1 humano (SEQ ID NO: 26), o domínio extracelular (ECD) de FZD1 (SEQ ID

NO: 27, mostrado como os aminoácidos sublinhados 1-321 da SEQ ID NO: 26), e O domínio Fri do FZD1 (SEQ ID NO: 28). Figura 18. Sequências de aminoácidos de FZD2 humano (SEQ ID NO: 30) , o domínio extracelular (ECD) de FZD2 (SEQ ID NO: 31, mostrado como os aminoácidos sublinhados 1-250 da SEQ ID NO: 30), e o domínio Fri de FZD2 (SEQ ID NO: 32). Figura 19. Sequência de nucleõtidos codificando FZD1 humano.

Figura 20. Sequência de nucleõtidos codificando FZD2 humano.

Figura 21. Sequências de aminoácidos de FZD3 humano (SEQ ID NO: 34) , o domínio extracelular (ECD) de FZD3 (SEQ ID NO: 35, mostrado como os aminoácidos sublinhados 1-204 da SEQ ID NO: 34), e O domínio Fri de FZD3 (SEQ ID NO: 36). Figura 22. Sequências de aminoácidos de FZD4 humano (SEQ ID NO: 38) , o domínio extracelular (ECD) de FZD4 (SEQ ID NO: 39, mostrado como os aminoácidos sublinhados 1-224 da SEQ ID NO: 38), e O domínio Fri de FZD4 (SEQ ID NO: 40). Figura 23. Sequência de nucleõtidos codificando FZD3 humana.

Figura 24. Sequência de nucleõtidos codificando FZD4 humana.

Figura 25. Sequências de aminoácidos de FZD5 humano (SEQ ID NO: 42) , o domínio extracelular (ECD) de FZD5 (SEQ ID NO: 43, mostrado como os aminoácidos sublinhados 1-233 da SEQ ID NO: 42), e o domínio Fri da FZD5 (SEQ ID NO: 44). Figura 26. Sequências de aminoácidos de FZD6 humano (SEQ ID NO: 46) , o domínio extracelular (ECD) de FZD6 (SEQ ID NO: 47, mostrado como os aminoácidos sublinhados 1-207 da SEQ ID NO: 46), e o domínio Fri da FZD6 (SEQ ID NO: 48). Figura 27. Sequência de nucleõtidos codificando FZD 5humano.

Figura 28. Sequência de nucleõtidos codificando FZD6 humano.

Figura 29. Sequências de aminoácidos de FZD7 humano (SEQ ID NO: 50) , o domínio extracelular (ECD) de FZD7 (SEQ ID NO: 51, mostrado como os aminoácidos sublinhados 1-255 da SEQ ID NO: 50), e o domínio Fri de FZD7 (SEQ ID NO: 52). Figura 30. Sequências de aminoácidos de FZD8 humano (SEQ ID NO: 54) , o domínio extracelular (ECD) de FZD8 (SEQ ID NO: 55, mostrado como os aminoácidos sublinhados 1-277 da SEQ ID NO: 54), e O domínio Fri de FZD8 (SEQ ID NO: 56). Figura 31. Sequência de nucleótidos codificando FZD7 humano.

Figura 32. Sequência de nucleótidos codificando FZDS humano.

Figura 33. Sequências de aminoácidos de FZD9 humano (SEQ ID NO: 58) , o domínio extracelular (ECD) de FZD9 (SEQ ID NO: 59, mostrado como os aminoácidos sublinhados 1-230 da SEQ ID NO: 58), e o domínio Fri de FZD9 (SEQ ID NO: 60). Figura 34. Sequências de aminoácidos de FZD10 humano (SEQ ID NO: 62), o domínio extracelular (ECD) de FZD10 (SEQ ID NO: 63, mostrado como os aminoácidos sublinhados 1-227 da SEQ ID NO: 62), e o domínio Fri de FZD10 (SEQ ID No.64). Figura 35. Sequência de nucleótidos codificando FZD9 humano,

Figura 36. Sequência de nucleótidos codificando FZD10 humano.

Figura 37. Redução do crescimento do tumor da mama PE-13 com tratamento de combinação com anticorpo 18R5 e paclitaxel. Os ratinhos NOD/SCID foram injetados com 10.000 células de tumor de mama PE-13 e no dia 22, os ratinhos com tumores de volume médio de cerca de 120 mm3 foram aleatorizados. Os ratinhos foram então tratados com um controlo de anticorpo ("Ab Controlo"), anticorpo 18R5 ("Anti-FZD"), paclitaxel ("Taxol"), ou uma combinação de anticorpo 18R5 com paclitaxel ("Anti-FZD + Taxol"). O tratamento com anticorpo 18R5 em combinação com paclitaxel resultou em atividade anti tumoral.

Figura 38. Crescimento do tumor de mama em animais individuais tratados com a combinação de anticorpo 18R5 mais paclitaxel. O tratamento com anticorpo 18R5 em combinação com paclitaxel resultou na regressão dos tumores de mama estabelecidos.

Figura 39. Análise de citometria de fluxo de células de tumor colorretal após tratamento com anticorpo de controlo, anticorpo 18R5, irinotecano, ou anticorpo 18R5 e irinotecano.

Figura 40. Crescimento tumoral em ratinhos após a implantação de 30, 90, 270, ou 810 células tumorais obtidas a partir de ratinhos que foram tratados durante 41 dias com um anticorpo de controlo ("Controlo"), anticorpo 18R5 ("Anti-FZD"), gemcitabina ("gemcitabina"), ou a combinação de 18R5 mais gemcitabina ("Combinação"). Figura 41. Frequência de células estaminais cancerígenas (CTC) em tumores pancreáticos PN-4 após tratamento com o anticorpo de controlo ("Ab Controlo"), o anticorpo 18R5 por si só ("Anti-FZD"), a gemcitabina por si só ("gemcitabina"), ou a combinação de anticorpo 18R5 e gemcitabina ("combinação"), conforme determinado por análise de diluição limitante.

Figura 42. Cromatograma de expressão génica em células de tumor pancreático que foram tratadas com anticorpo de controlo ("LZ-1"), anticorpo 18R5 por si só ("18R5"), gemcitabina por si só ("Gem") , ou uma combinação de gemcitabina e 18R5 ("Combo").

Figura 43. 0 tratamento com anticorpo anti-FZD 18R5 promove a diferenciação de células tumorais em células mucinosas não proliferativas. Os ratinhos NOD/SCID foram injetados com 50.000 células tumorais pancreático OMP-PN13 e no dia 23, os ratinhos com tumores de volume médio de cerca de 107 mm3 foram aleatorizados, e foi iniciado tratamento com o anticorpo de controlo ou 18R5 quatro dias depois. Após 20 dias os tumores foram recolhidos e cortados. Os cortes de tumores a partir de ratinhos tratados com 18R5 ou ratinhos tratados com anticorpo de controlo foram corados com corante azul de alciano para revelar células mucinosas e por imunohistoquímica com anticorpo para ki67 para revelar células proliferativas.

As células mucinosas e células proliferativas exemplares são destacadas por setas.

Figura 44. 0 anticorpo anti-FZD 18R5, tanto por si só como em combinação com Taxol® (paclitaxel), inibe o crescimento do tumor de xenoenxerto 0MP-LU24. Ratinhos portadores de tumores de pulmão humano OMP-LU24 foram tratados com anticorpo de controlo ("Ab Controlo"), anti-FZD 18R5 ("18R5"), Taxol® ("Taxol") ou a combinação de 18R5 mais Taxol® ("18R5 +Taxol").

Figura 45. 0 anticorpo anti-FZD 18R5, tanto por si só como em combinação com Avastin® (bevacizumab), inibe o crescimento do tumor de xenoenxerto OMP-LU33. Ratinhos portadores de tumores de pulmão humano OMP-LU33 foram tratados com anticorpo de controlo (quadrados), Avastin® (triângulos apontando para cima), anti-FZD 18R5 (triângulos apontando para baixo), ou a combinação de 18R5 mais Avastin® (círculos).

Figura 46. A combinação de anticorpos 18R5 anti-FZD com Herceptin® (Trastuzumab) inibe o crescimento do tumor de xenoenxerto T3. Ratinhos portando tumores de mama humanos T3 foram tratados com anticorpo de controlo (quadrados) , 18R5 anti-FZD (triângulos), Herceptin® (círculos preenchidos), ou a combinação de 18R5 mais Herceptin® (círculos abertos).

Figura 47. Perfis de ligação 18R5 e 44R24 FZD. Curva de resposta à dose representando a ligação de cada mAb a FZD1, 2, 5, 7 e 8.

Figura 48. Inibição da atividade repórter induzida por Wnt3a em células STF por 18R5 e 44R24 (curvas de resposta à dose) .

Figura 49. Inibição do nível basal de expressão genica de axin2 por 18R5 e 44R24.

Figura 50. Deteção IHC de Muc 16 em tumores 0MP-PN13 tratados com 44R24 e 18R5.

Figura 51. Inibição da actina do músculo liso em tumor pancreático tratado com 18R5. A. Níveis de expressão génica de ACTA2 conforme detetado por microarranjo. B. Deteção SMA em mAb de controlo (painel superior) e 18R5 (painel inferior) - tumores tratados com 0MP-Pn4.

Figura 52. Testagem da tumorigenicidade de células Muc 16+ 0MP-PN13 induzidas por 18R5. A. Gráfico de FACS de células tumorais 0MP-PN13 esgotadas por lin coradas com Muc 16. As 2 populações classificadas estão rodeadas por um círculo. B. Fotos representativas de tumores resultantes da injeção de células Muc 16- (painel superior) e Muc 16+ (painel inferior) . C. Curvas de crescimento tumoral.

Figura 53. Inibição da recorrência de tumores por mAb anti-FZD 18R5 no xenoenxerto de tumor de mama PE13.

Figura 54. Redução da frequência de células estaminais de cancro de mama por mAb anti-FZD 18R5.

Figura 55. Inibição da recorrência de tumores por mAb anti-FZD 18R5 em xenoenxerto de tumor pancreático PN4. Figura 56. Inibição do crescimento tumoral por mAb anti-FZD 44R24 em associação com gemcitabina em xenoenxerto de tumor pancreático PN4.

Figura 57. Análise FACS de ligação do mAb anti-FZD 44R24 a FZD8 mutante em relação a FZD8 de tipo selvagem. A região do gráfico de FACS mostrando ligação de 44R24 à população de células co-transfetadas é destacada por uma caixa. A caixa para as substituições de aminoãcidos mostrando ligação de 44R24 acentuadamente reduzida é marcada com uma seta.

Figura 58. Atividade antitumoral de anticorpos anti-FZD 44R24 e 18R5 em xenoenxertos de tumor do cólon C28.

Figura 59. Indução da expressão de citoqueratina 7 em xenoenxertos de tumor do cólon C28 tratados com anticorpos anti-FZD 44R24 ou 18R5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA DIVULGAÇÃO A presente divulgação proporciona novos agentes, incluindo mas não limitados a polipéptidos tais como anticorpos, que ligam a um ou mais recetores frizzled humanos (FZDs). São também proporcionados polipéptidos e polinucleótidos relacionados, composições compreendendo os agentes de ligação a FZD, e métodos para preparar os agentes de ligação a FZD. Também são proporcionados métodos para utilizar os novos agentes de ligação a FZDs, tais como métodos para inibir o crescimento tumoral e/ou tratar o cancro. A divulgação é baseada, em parte, na identificação de uma região dentro dos recetores frizzled humanos que é um alvo adequado para agentes anti cancro de ligação a FZD. Dois anticorpos anti-FZD, 18R8 e 18R5, foram constatados como ligando especificamente a FZD7, mas como tendo também reatividade cruzada com FZD1, FZD2, FZD5 e FZD8 (Exemplos 1 e 2, abaixo). Experiências in vitro com o anticorpo 18R8 indicaram que o anticorpo é capaz de inibir a sinalização de Wnt (Exemplo 3, abaixo) e inibir a ligação de ligandos Wnt a FZD8 (Exemplo 4, abaixo). 0 anticorpo 18R5 foi também demonstrado como sendo capaz de inibir a sinalização de Wnt em ensaios baseados em células (Exemplos 3 e 20, abaixo). Experiências in vivo com o anticorpo 18R5 demonstraram que o anticorpo é capaz de inibir o crescimento ou recorrência de tumores (Exemplos 7, 17 e 23, abaixo) . Os inventores mostraram também que o anticorpo anti-FZD 18R5 é capaz de reduzir a frequência de células estaminais cancerígenas em tumores (Exemplos, 8 e 23, abaixo) e induzir a diferenciação e/ou reduzir a tumorigenicidade de células tumorais (Exemplos 16, 21, 22 e 25, abaixo). Experiências de mapeamento de epítopos com estes anticorpos 18R8 e 18R5 ativos indicaram que ambos os anticorpos ligam a pelo menos parte da sequência GLEVHQ (SEQ ID NO: 25) e a pelo menos parte da sequência YGFA (SEQ ID NO: 74) dentro de FZD8 (Exemplo 5, abaixo), À luz da atividade biológica demonstrada destes dois anticorpos, a estrutura cristalina de Frizzled 8 de ratinho (Dann et al. , Nature, 411: 8690 (2001)) foi analisada e foi identificada pela primeira vez uma região extracelular de proteínas frizzled compreendendo estas sequências à qual não foi previamente atribuída qualquer função específica como desempenhando um importante papel funcional na biologia de FZD e sinalização de Wnt (Exemplo 6) . Esta região de recetores frizzled humanos, denominada Sítio de Ligação Biológica (BBS), é um alvo adequado para as terapêuticas anti cancro.

Adicionalmente, um terceiro anticorpo, 44R24, foi constatado como ligando especificamente a FZD5 e FZD8 humanos (Exemplo 19, abaixo). Este anticorpo foi também mostrado como sendo capaz de inibir a sinalização de Wnt em ensaios baseados em células (Exemplo 20, abaixo) e de eficácia antitumoral in vivo (Exemplos 23 e 25, abaixo). Como o tratamento com os anticorpos anti- FZD 18R8 e 18R5, o tratamento de um tumor com 44R24 resultou em níveis aumentados de um marcador de diferenciação no tumor (Exemplo 25, abaixo). 0 mapeamento de epítopos também mostrou que o epítopo do anticorpo anti-FZD 44R24 está sobreposto com o dos anticorpos anti-FZD 18R8 e 18R5. Mais especificamente, 44R24 fi mostrado como ligando a pelo menos parte da região YGFA (SEQ ID NO: 74) no BBS (exemplo 24, abaixo). I. Definições

Para facilitar a compreensão da presente divulgação, são definidos abaixo uma série de termos e frases. 0 termo "anticorpo" significa uma molécula de imunoglobulina que reconhece e liga especificamente a um alvo, tal como uma proteína, polipéptido, péptido, hidrato de carbono, polinucleótido, lípido ou combinações dos anteriores através de pelo menos um sítio de reconhecimento de antigénio dentro da região variável da molécula de imunoglobulina. Conforme utilizado no presente documento, o termo "anticorpo" abrange anticorpos policlonais intactos, anticorpos monoclonais intactos, fragmentos de anticorpos (tais como fragmentos Fab, Fab' , F (ab' ) 2 , e Fv) , mutantes Fv de cadeia simples (scFv), anticorpos multiespecíficos tais como anticorpos biespecíficos gerados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, proteínas de fusão compreendendo uma porção de determinação de antigénio de um anticorpo, e qualquer outra molécula de imunoglobulina modificada compreendendo um sítio de reconhecimento de antigénio contanto que os anticorpos exibam a atividade biológica desejada. Um anticorpo pode ser de qualquer das cinco principais classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, ou subclasses (isotipos) das mesmas (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2), com base na identidade dos seus domínios constantes de cadeia pesada referidos como alfa, delta, épsilon, gama e mu, respetivamente. As diferentes classes de imunoglobulinas têm estruturas de subunidades e configurações tridimensionais diferentes e bem conhecidas. Os anticorpos podem ser nus ou conjugados com outras moléculas, tais como toxinas, radioisótopos, etc. 0 termo "fragmento de anticorpo" refere-se a uma porção de um anticorpo intacto e refere-se às regiões variáveis de determinação antigénica de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia simples e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

Um "anticorpo monoclonal" refere-se a uma população de anticorpos homogénea envolvida no reconhecimento e ligação altamente específicos de um determinante antigénico único, ou epítopo. Isto está em contraste com os anticorpos policlonais que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes antigénicos. 0 termo "anticorpo monoclonal" abrange tanto anticorpos monoclonais intactos como de comprimento completo, bem como fragmentos de anticorpos (tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fv) , mutantes Fv de cadeia simples (scFv), proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo, e qualquer outra molécula de imunoglobulina modificada compreendendo um sítio de reconhecimento de antigénio. Além disso, "anticorpo monoclonal" refere-se a tais anticorpos formados por qualquer número de formas, incluindo mas não limitadas a, através de hibridoma, seleção de fago, expressão recombinante e animais transgénicos, 0 termo "anticorpo humanizado" refere-se a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, de ratinho) que são cadeias de imunoglobulina específicas, imunoglobulinas quiméricas, ou fragmentos das mesmas que contêm sequências não humanas mínimas (por exemplo, de ratinho). Tipicamente, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas nas quais os resíduos da região de determinação de complementaridade (CDR) são substituídos por resíduos a partir da CDR de uma espécie não humana (por exemplo, ratinho, rato, coelho, hámster) que têm a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al. , 1988, Science, 239:1534-1536.). Nalguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) de Fv de uma imunog1obu1ina humana são substituídos com os resíduos correspondentes num anticorpo a partir de uma espécie não humana que tem a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. 0 anticorpo humanizado pode ser adicionalmente modificado pela substituição de resíduos adicionais quer na região estrutural de Fv e/ou dentro dos resíduos não humanos substituídos para refinar e otimizar a especificidade, afinidade e/ou capacidade do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois ou três, domínios variáveis contendo todas ou substancialmente todas as regiões de CDR que correspondem às imunoglobulinas não humanas enquanto todas ou substancialmente todas as regiões de FR são aquelas de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de um domínio (Fc) ou região constante da imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. São descritos exemplos de métodos utilizados para gerar anticorpos humanizados na Patente U.S. 5.225.539. 0 termo "anticorpo humano" significa um anticorpo produzido por um ser humano ou um anticorpo tendo uma sequência de aminoácidos correspondentes a um anticorpo produzido por um ser humano fabricado utilizando qualquer técnica conhecida na técnica. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos intactos ou de comprimento completo, fragmentos dos mesmos e/ou anticorpos compreendendo pelo menos um polipéptido de cadeia pesada e/ou leve humana tal como, por exemplo, um anticorpo compreendendo polipéptidos de cadeia leve de ratinho e de cadeia pesada de humano. 0 termo "anticorpos quiméricos" refere-se a anticorpos em que a sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina é derivada a partir de duas ou mais espécies. Tipicamente, a região variável das cadeias leve e pesada corresponde à região variável de anticorpos derivados a partir de uma espécie de mamíferos (por exemplo, ratinho, rato, coelho, etc.) com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas enquanto as regiões constantes são homólogas às sequências nos anticorpos derivados a partir de outra (habitualmente humana), para evitar desencadear uma resposta imune nessa espécie. 0 termo "epítopo" ou "determinante antigénico" é utilizado no presente documento indistintamente e refere-se àquela porção de um antigénio capaz de ser reconhecida e especificamente ligada por um anticorpo particular. Quando o antigénio é um polipéptido, podem ser formados epítopos tanto a partir de aminoácidos contíguos como de aminoácidos não contíguos justapostos por dobramento terciário de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são geralmente retidos após a desnaturação de proteína, enquanto os epítopos formados por dobramento terciário são geralmente perdidos após a desnaturação de proteínas. Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, e mais habitualmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos numa única conformação espacial. 0 fato de que um anticorpo "ligue especificamente" a um epítopo ou proteína significa que o anticorpo reage ou se associa mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração, com maior afinidade, ou com alguma combinação das opções acima a um epítopo ou proteína do que com substâncias alternativas, incluindo proteínas não relacionadas. Em determinadas formas de realização, "liga especificamente" significa, por exemplo, que um anticorpo liga a uma proteína com um KD de cerca de 0,1 mM ou inferior, mas mais habitualmente inferior a cerca de 1 μΜ. Em determinadas formas de realização, "liga especificamente" significa que um anticorpo liga a uma proteína algumas vezes com um KD de pelo menos cerca de 0,1 μΜ ou inferior, e outras vezes pelo menos cerca de 0,01 μΜ ou inferior. Devido à identidade de sequência entre proteínas homólogas em espécies diferentes, a ligação específica pode incluir um anticorpo que reconhece uma proteína particular tal como um recetor frizzled em mais de uma espécie. Igualmente, devido à homologia entre recetores FZD diferentes (por exemplo, FZD5 e FZD8) em determinadas regiões das sequências de polipéptidos dos recetores, a ligação específica pode incluir um anticorpo (ou outro polipéptido ou agente) que reconhece mais de um recetor frizzled. É entendido que um anticorpo ou fração de ligação que liga especificamente a um primeiro alvo pode ou não ligar especificamente a um segundo alvo. Como tal, "ligação específica" não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva, isto é, ligação a um único alvo. Consequentemente, um anticorpo pode, em determinadas formas de realização, ligar especificamente a mais de um alvo (por exemplo, FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e/ou FZD8 humano). Em determinadas formas de realização, os alvos múltiplos podem ser ligados pelo mesmo sítio de ligação a antigénio do anticorpo. Por exemplo, um anticorpo pode, em determinados casos, compreender dois sítios de ligação a antigénio idênticos, cada um dos quais liga especificamente dois ou mais recetores frizzled humanos (por exemplo, FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e/ou FZD8 humanos). Em determinadas formas de realização alternativas, um anticorpo pode ser biespecífico e compreender pelo menos dois sítios de ligação a antigénio com diferentes especificidades. Por meio de exemplo não limitante, um anticorpo biespecífico pode compreender um sítio de ligação a antigénio que reconhece um epítopo num recetor frizzled, tal como FZD5 humano, e compreende adicionalmente um segundo sítio de ligação a antigénio diferente que reconhece um epítopo diferente num segundo recetor frizzled, tal como FZD8 humano. Geralmente, mas não necessariamente, a referência a ligação significa ligação específica.

Um polipéptido, anticorpo, polinucleótido, vetor, célula ou composição, que é "isolado" é um polipéptido, anticorpo, polinucleótido, vetor, célula ou composição que se encontra numa forma não encontrada na natureza. Os polipéptidos, anticorpos, polinucleõtidos, vetores, células ou composições isolados incluem aqueles que foram purificados a um grau em que já não se encontram na forma na qual são encontrados na natureza. Nalgumas formas de realização, um anticorpo, polinucleótido, vetor ou célula ou composição que é isolada é substancialmente pura.

Conforme utilizado no presente documento, "substancialmente puro" refere-se a material que é pelo menos 50% puro (isto é, isento de contaminantes) , mais preferentemente pelo menos 90% puro, mais preferentemente pelo menos 95% puro, mais preferentemente pelo menos 98% puro, mais preferentemente pelo menos 99% puro.

Os termos "cancro" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos na qual uma população de células é caracterizada por crescimento celular não regulado. Exemplos de cancro incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Mais exemplos particulares de tais cancros incluem carcinoma de células escamosas, cancro de pulmão de células pequenas, cancro de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, cancro do peritoneu, cancro hepatocelular, cancro gastrointestinal, cancro pancreãtico, glioblastoma, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, cancro do cólon, cancro colorretal, carcinoma do endométrio ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, cancro renal, cancro do fígado, cancro da próstata, cancro vulvar, cancro da tiroide, carcinoma hepático e vários tipos de cancros da cabeça e pescoço. "Tumor" e "neoplasia" referem-se a qualquer massa de tecido que resulta a partir de crescimento ou proliferação celular excessiva, quer benignos (não cancerosos) ou malignos (cancerosos), incluindo lesões pré-cancerosas.

Os termos "células estaminais cancerígenas", "células estaminais tumorais", ou "células estaminais de tumores sólidos" são utilizados indistintamente no presente documento e referem-se a uma população de células a partir de um tumor sólido que: (1) têm capacidade proliferativa extensa; 2) são capazes de divisão celular assimétrica para gerar um ou mais tipos de progénie diferenciada com potencial de desenvolvimento ou proliferativo reduzido, e (3) são capazes de divisões celulares simétricas para autorrenovação ou auto-manutenção. Essas propriedades de "células estaminais cancerígenas", "células estaminais tumorais", ou "células estaminais de tumores sólidos" confere a essas células estaminais cancerígenas a capacidade de formar tumores palpáveis após transplante em série num ratinho imunologicamente comprometido em comparação com a maioria de células tumorais que não formam tumores. As células estaminais cancerosas são submetidas a autorrenovação contra diferenciação de uma forma caótica para formar tumores com tipos celulares anormais que podem sofrer alterações ao longo do tempo à medida que ocorrem mutações.

Os termos "célula cancerosa", "célula tumoral," e equivalentes gramaticais referem-se à população total de células derivadas a partir de um tumor ou de uma lesão pré-cancerosa, incluindo células não-tumorigénicas, que compreendem a maior parte da população de células tumorais, e células tumorigénicas (células estaminais cancerígenas). Conforme utilizado no presente documento, o termo "célula tumoral" será modificado pelo termo "não tumorigénica" quando referindo somente células tumorais carecendo da capacidade de renovação e diferenciação para distinguir estas células tumorais das células estaminais cancerígenas. 0 termo "tumorigénico" refere-se às características funcionais de uma célula estaminal de tumor sólido incluindo as propriedades de autorrenovação (dando origem a células estaminais cancerígenas tumorigénicas adicionais) e proliferação para gerar todas as outras células tumorais (dando origem a células tumorais diferenciadas e consequentemente não tumorigénicas) que permitem que as células estaminais de tumores sólidos formem um tumor. Estas propriedades de autorrenovação e proliferação para gerar todas as outras células tumorais conferem às células estaminais cancerígenas a capacidade de formar tumores palpáveis após transplante em série num ratinho imunologicamente comprometido em comparação com as células tumorais não tumorigénicas, que são incapazes de formar tumores após transplante em série. Foi observado que as células tumorais não tumorigénicas podem formar um tumor após transplante primário num ratinho imunologicamente comprometido após obtenção das células tumorais a partir de um tumor sólido, mas estas células tumorais não-tumorigénicas não dão origem a um tumor após transplante em série. 0 termo "indivíduo" refere-se a qualquer animal (por exemplo, um mamífero), incluindo mas não limitado a seres humanos, primatas não humanos, roedores e semelhantes, que se destina a ser o recetor de um tratamento particular. Tipicamente, os termos " indivíduo" e "paciente" são utilizados indistintamente no presente documento em referência a um indivíduo humano. "Sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal de um composto que é farmaceuticamente aceitável e que possui a atividade farmacológica desejada do composto parental. "Excipiente, portador ou adjuvante farmaceuticamente aceitável" refere-se a um excipiente, portador ou adjuvante que pode ser administrado a um indivíduo, juntamente com pelo menos um anticorpo da presente divulgação, e que não destrói a atividade farmacológica do mesmo e é não tóxico quando administrado em doses suficientes para distribuir uma quantidade terapêutica do composto. "Veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, ou portador com o qual pelo menos um anticorpo da presente divulgação é administrado. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz " refere-se a uma quantidade de um anticorpo, polipéptido, polinucleótido, molécula orgânica pequena, ou outro fãrmaco eficaz para "tratar" uma doença ou distúrbio num indivíduo ou um mamífero. No caso do cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células de cancro; reduzir o tamanho do tumor; inibir ou deter a infiltração de células cancerígenas em órgãos periféricos incluindo, por exemplo, a disseminação do cancro em tecidos moles e osso; inibir e deter a metástase tumoral; inibir e parar o crescimento tumoral; aliviar em determinada medida um ou mais dos sintomas associados com o cancro; reduzir a morbilidade e a mortalidade; melhorar a qualidade de vida; diminuir a tumorigenicidade, a frequência tumorigénica, ou a capacidade tumorigénica de um tumor; reduzir o número ou a frequência de células estaminais cancerosas num tumor; diferenciar células tumorigénicas a um estado não tumorigénico, ou uma combinação de tais efeitos. Na medida em que o fãrmaco impede o crescimento e/ou mata as células cancerígenas, pode ser referido como citostático e/ou citotóxico.

Termos tais como "tratando" ou "tratamento" ou "tratar" ou "aliviando" ou "aliviar' referem-se a 1) medidas terapêuticas de cura, atraso, diminuição dos sintomas de, e/ou interrupção da progressão de uma condição ou distúrbio patológico diagnosticado e 2) medidas profiláticas ou preventivas que impedem e/ou atrasam o desenvolvimento de uma condição ou distúrbio patológico alvo. Consequentemente, aqueles com necessidade de tratamento incluem aqueles jã com o distúrbio; aqueles propensos a ter o distúrbio,· e aqueles nos quais o distúrbio se destina a ser prevenido. Em determinadas formas de realização, um indivíduo é "tratado" com êxito de cancro de acordo com os métodos da presente divulgação se o paciente mostrar uma ou mais dos seguintes: uma redução do número de células cancerígenas ou ausência completa de células cancerígenas; uma redução do tamanho tumoral; inibição ou ausência de infiltração de células cancerígenas em órgãos periféricos, incluindo, por exemplo, a disseminação do cancro em tecidos moles e ossos; inibição de ou ausência de metástase tumoral; inibição ou ausência de crescimento tumoral; alívio de um ou mais sintomas associados com o cancro específico; morbilidade e mortalidade reduzida; melhoria da qualidade de vida; redução da tumorigenicidade, frequência tumorigénica, ou capacidade tumorigénica, de um tumor; redução do número ou frequência de células estaminais cancerígenas num tumor, diferenciação de células tumorais a um estado não tumorigénico, ou alguma combinação de efeitos. "Polinucleótido", ou "ácido nucléico", conforme utilizado indistintamente no presente documento, refere-se a polímeros de nucleótidos de qualquer comprimento, e incluem ADN e ARN. Os nucleótidos podem ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos ou bases modificados, e/ou os seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado num polímero por ADN ou ARN polimerase. Um polinucleótido pode compreender nucleótidos modificados, tais como nucleótidos metilados e os seus análogos. Se presente, a modificação da estrutura de nucleótidos pode ser transmitida antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleótidos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleótido pode ser adicionalmente modificado após a polimerização, tal como por conjugação com um componente de etiquetagem. Outros tipos de alterações incluem, por exemplo, "capas", substituição de um ou mais dos nucleótidos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotídicas tais como, por exemplo, aquelas com ligações sem carga (por exemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações com carga (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas contendo frações pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos sinal, ply-L-lisina, etc.), aquelas com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquelas contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidantes, etc.), aquelas contendo alquiladores, aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucléicos alfa anoméricos, etc.), bem como formas não modificadas do (s) polinucleótido(s) . Além disso, qualquer dos grupos hidroxilo normalmente presentes nos açúcares podem ser substituídos, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos de proteção padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais a nucleótidos adicionais, ou podem ser conjugados com suportes sólidos. 0 terminal OH 51 e 3' pode ser fosforilado ou substituído com aminas ou frações de grupo de capeamento orgânico de desde 1 até 20 átomos de carbono. Também podem ser derivatizados outros hidroxilos a grupos de proteção padrão. Os polinucleótidos também podem conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-, '-O-alil, fluoro-2'-ou 2-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclicos, açúcares alfa-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeos abásicos tais como ribosídeo de metilo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados a, formas de realização em que o fosfato é substituído por P (O) S ("tioato"), P (S) S ("ditioato") , "(O) NR2 ("amidato"), P (O) R, P (O) ou, CO ou CH2 ("formacetal") , nos quais cada R ou R ' é independentemente H ou alquilo (1-20 C) substituído ou não substituído contendo opcionalmente uma ligação éter (--O--) de ligação, arilo, alquenilo, cicloalquenilo, cicloalquilo ou araldilo. Nem todas as ligações num polinucleõtido necessitam ser idênticas. A descrição acima é aplicada a todos os polinucleótidos referidos no presente documento, incluindo ADN e ARN.

Uma "região variável de um anticorpo refere-se à região variável de cadeia leve do anticorpo ou à região variável de cadeia pesada do anticorpo, quer por si só ou em combinação. As regiões variáveis da cadeia pesada e leve consistem cada um em quatro regiões estruturais (FR) unidas por três regiões de determinação da complementaridade (CDRs), também conhecidas como regiões hipervariáveis. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as CDRs a partir da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antigénio dos anticorpos. Existem na pelo menos duas técnicas para a determinação de CDRs: (1) uma abordagem baseada na variabilidade da sequência de espécies cruzadas (isto é, Rabat et al Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5 a ed, 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)) e (2) uma abordagem baseada em estudos cristalográficos dos complexos antigénio-anticorpo (Al-lazikani et al (1997) J. Biol Molec 273:927-948.)) Adicionalmente, são algumas vezes utilizada na técnica combinações destas duas abordagens para determinar CDRs. 0 termo "vetor" significa uma construção, que é capaz de proporcionar, e preferentemente expressar, um ou mais gene(s) ou sequência(s) de interesse numa célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores virais, vetores de expressão de ADN ou ARN nu, plasmídeo, vetores de cosmídeo ou fago, vetores de expressão de ADN ou ARN associado a agentes de condensação catiónicos, vetores de expressão de ADN ou ARN encapsulados em lipossomas, e determinadas células eucariôticas, tais como células produtoras.

Os termos "polipéptido", "pêptido", e "proteínas" são utilizados indistintamente para referir no presente documento polímeros de aminoácidos de qualquer tamanho. 0 polímero pode ser linear ou ramificado, podem compreender aminoácidos modificados, e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção, por exemplo, formação de pontes dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com uma componente de etiquetagem. Também estão incluídos na definição, por exemplo, polipéptidos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc), bem como outras modificações conhecidas na técnica. É entendido que, dado que os polipéptidos desta divulgação são baseados em anticorpos, em determinadas formas de realização, os polipéptidos podem ocorrer como cadeias simples ou cadeias associadas.

Os termos "idêntico" ou percentagem de "identidade", no contexto de dois ou mais ácidos nucléicos ou polipéptidos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma percentagem especificada de resíduos de nucleótidos ou aminoácidos que são os mesmos, quando comparadas e alinhadas (introduzindo lacunas, se necessário) para correspondência máxima, não considerando quaisquer substituições conservatives de aminoácidos como parte da identidade da sequência. A percentagem de identidade pode ser medida utilizando software ou algoritmos de comparação de sequência ou por inspeção visual. São conhecidos vários algoritmos e software na técnica que podem ser utilizados para obter alinhamentos de sequências de aminoácidos ou nucleótidos. Um tal exemplo não limitante de um algoritmo de alinhamento é o algoritmo descrito em Karlin et al, 1990, Proc. Natl.

Acad. SCL, 87:2264-2268, conforme modificado em Karlin et al. 1993, Proc. Natl. Acad. SCL, 90:5873-5877, e incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (Altschul et al. 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). Em determinadas formas de realização, pode ser utilizado Gapped BLAST conforme descrito em Altschul et al. 1997, dos Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al. 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, Califórnia) ou Megalign (ADNSTAR) são programas de software publicamente disponíveis adicionais que podem ser utilizados para alinhar sequências. Em determinadas formas de realização, a percentagem de identidade entre duas sequências de nucleótidos é determinada utilizando o programa GAP em software GCG (por exemplo, utilizando uma matriz NWSgapADN.CMP e um peso de lacuna de 40, 50, 60, 70 ou 90 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) . Em determinadas formas de realização alternativas, pode ser utilizado o programa GAP no pacote de software GCG, que incorpora o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Moi. Biol. (48):444-453 (1970)) para determinar a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos (por exemplo, utilizando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento del, 2, 3, 4, 5). Alternativamente, em determinadas formas de realização, a percentagem de identidade entre nucleótidos ou aminoácidos é determinada utilizando o algoritmo de Myers e Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por exemplo, a percentagem de identidade pode ser determinada utilizando o programa ALIGN (versão 2.0) e utilizando um ΡΑΜΙ20 com mesa de resíduos, uma penalização de comprimento de lacuna de 12 e uma pena de lacuna de 4. Os parâmetros adequados para o alinhamento máximo através de software de alinhamento particular podem ser determinados por um perito na especialidade. Em determinadas formas de realização, são utilizados os parâmetros predefinidos do software de alinhamento. Em determinadas formas de realização, a percentagem de identidade "X" de uma primeira sequência de aminoácidos para uma segunda sequência de aminoácidos é calculada como 100 x (Y/Z) , onde Y é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como correspondências idênticas no alinhamento da primeira e segunda sequências de (conforme alinhados por inspeção visual ou um programa de alinhamento de sequência particular) e Z é o número total de resíduos na segunda sequência. Se o comprimento de uma primeira sequência é maior do que a segunda sequência, a percentagem de identidade da primeira sequência para a segunda sequência será maior do que a percentagem de identidade da segunda sequência para a primeira sequência.

Como um exemplo não limitante, é possível, em determinadas formas de realização, determinar se algum polinucleótido particular tem uma determinada percentagem de identidade de sequência (por exemplo, é pelo menos 80% idêntico, pelo menos 85% idêntico, pelo menos 90% idêntico e nalgumas formas de realização, pelo menos 95 %, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico) a uma sequência de referência utilizando o programa BestFit (Wisconsin Sequence Analysis Package, versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University ResearchPark, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BestFit utiliza o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981), para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Ao utilizar BestFit ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências para determinar se uma sequência em particular é, por exemplo, 95% idêntica à sequência de referência de acordo com a presente divulgação, os parâmetros são definidos tal que a percentagem de identidade seja calculada ao longo do comprimento completo da sequência de nucleótidos de referência e que sejam permitidas lacunas em homologia de até 5% do número total de nucleõtidos na sequência de referência.

Nalgumas formas de realização, dois ácidos nucléicos ou polipéptidos da divulgação são substancialmente idênticos, o que significa que têm pelo menos 70%, pelo menos 75%, de preferência pelo menos 80%, mais preferentemente pelo menos 85%, mais preferentemente pelo menos 90 % e nalgumas formas de realização pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de resíduos de nucleótidos ou aminoácidos, quando comparados e alinhados para correspondência máxima, conforme medido através de um algoritmo de comparação de sequência ou por inspeção visual. Preferentemente, existe identidade numa região das sequências que seja de pelo menos cerca de 10, preferentemente cerca de 20, mais preferentemente cerca de 40-60 resíduos de comprimento ou de qualquer valor inteiro entre os mesmos, preferentemente numa região mais longa do que 60-80 resíduos, preferentemente pelo menos cerca de 90-100 resíduos, e mais preferentemente as sequências são substancialmente idênticas ao longo do comprimento completo das sequências a ser comparadas, tais como a região de codificação de uma sequência de nucleótidos, por exemplo.

Uma "substituição conservative de aminoácidos" é uma na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral semelhante. Foram definidas na técnica famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais semelhantes, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apoiares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) , cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por exemplo, a substituição de uma fenilalanina por uma tirosina é uma substituição conservativa. Preferentemente, as substituições conservatives nas sequências dos polipéptidos e anticorpos da divulgação não anulam a ligação do anticorpo ou polipéptido contendo a sequência de aminoácidos, ao (s) antigénio (s) , isto é, o um ou mais recetores frizzled humanos ao(s) qual(is) liga o polipéptido ou anticorpo. São bem conhecidos na técnica métodos de identificação de substituições conservativas de nucleótidos e aminoácidos que não eliminam a ligação ao antigénio (veja-se, por exemplo, Brummell et al, Biochem 32: 1180-1 187 (1993), Kobayashi et al Protein Eng.. 12 (10) : 879-884 (1999) e Burks et al Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:.412-417 (1997)).

Conforme utilizado na presente divulgação e reivindicações, as formas singulares "um", "uma", e "a" incluem formas plurais a menos que o contexto claramente indique o contrário. É entendido que sempre que forem descritas formas de realização no presente documento com a linguagem "compreendendo", são também proporcionadas formas de realização de outra forma análogas descritas em termos de "consistindo em" e/ou" "consistindo essencialmente em". 0 termo "e/ou" conforme utilizado numa frase como "A e/ou B" no presente documento pretende abranger tanto "A e B", "A ou B", "A" e "B". Igualmente, a expressão "e/ou" conforme utilizada numa frase tal como "A, B e/ou C" destina-se a abranger cada uma das seguintes formas de realização: A, B e C, A, B ou C; A ou C, A ou B, B ou C, A e C, A e B, B e C, A (por si só), B (por si só) e C (por si só) . "Condições de restringência elevada," podem ser identificadas por aquelas que: (1) empregam baixa força iónica e temperatura elevada para lavagem, por exemplo cloreto de sódio 0,015 M/citrato de sódio 0,0015 M/dodecil sulfato de sódio 0,1% a 50 °C; (2) empregam durante a hibridação um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, formamida 50% (v/v) com albumina sérica bovina 0,1% /Ficoll 0,1% /polivinilpirrolidona 0,1%/tampão fosfato de sódio 50 mM a pH 6,5, com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42 °C; ou (3) empregam formamida 50%, 5xSSC (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1%, solução de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml) , SDS 0,1% e sulfato de dextrano 10% a 42 °C, com lavagens a 42 °C em 0,2xSSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida 50% a 55 °C, seguido por um lavagem de elevada restringência consistindo em 0,lxSSC contendo EDTA a 55 °C.

II, Agentes de ligação a FZD A presente divulgação proporciona agentes que ligam especificamente um ou mais recetores frizzled humanos (FZDs). Estes agentes são referidos no presente documento como "agentes de ligação a FZD." Em determinadas formas de realização, os agentes ligam especificamente dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez recetores frizzled. 0 recetor ou recetores frizzled humanos ligados pelo agente podem ser selecionados a partir do grupo consistindo em FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9 e FZD10. Em determinadas formas de realização, o um ou mais recetores frizzled humanos compreendem FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e/ou FZD8. Em determinadas formas de realização, o um ou mais recetores frizzled humanos compreendem FZD7. Em determinadas formas de realização, o um ou mais recetores frizzled humanos compreendem FZD5 e/ou FZD8. Em determinadas formas de realização, o agente liga especificamente a FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8. As sequências de aminoãcidos (aa) e nucleótidos (nt) de comprimento completo para FZD1-10 são conhecidas na técnica e também proporcionadas no presente documento como SEQ ID NO: 26 (aa FZD1) , SEQ ID NO: 30 (aa FZD2) , SEQ ID NO: 34 (aa FZD3) , SEQ ID NO: 38 (aa FZD4) , SEQ ID NO: 42 (aa FZD5) , SEQ ID NO: 46 (aa FZD6) , SEQ ID NO: 50 (aa FZD7) , SEQ ID NO: 54 (aa FZD8) , SEQ ID NO: 58 (aa FZD9) , SEQ ID NO: 62 (aa FZD10) , SEQ ID NO: 29 (nt FZD1), SEQ ID NO: 33 (nt FZD2) , SEQ ID NO: 37 (nt FZD3) , SEQ ID NO: 41 (nt FZD4) , SEQ ID NO: 45 (nt FZD5) , SEQ ID NO: 49 (nt FZD6) ,

SEQ ID NO: 53 (nt FZD7) , SEQ ID NO: 57 (nt FZD8) , SEQ ID NO: 61 (nt FZD9), e SEQ ID NO: 65 (nt FZD10).

Em determinadas formas de realização, o anticorpo ou outro polipéptido ou agente descrito no presente documento liga especificamente a FZD7. Em determinadas formas de realização, esse anticorpo, polipéptido ou agente pode adicionalmente ligar especificamente ou ter reatividade cruzada com um ou mais recetores humanos frizzled adicionais.

Em determinadas formas de realização, o anticorpo ou outro polipéptido ou agente descrito no presente documento liga especificamente a FZD5. Em determinadas formas de realização, esse anticorpo, polipéptido ou agente pode adicionalmente ligar especificamente ou ter reatividade cruzada com um ou mais recetores humanos frizzled adicionais.

Em determinadas formas de realização, o agente liga especificamente a dois ou mais recetores frizzled humanos. Em determinadas formas de realização, os dois ou mais recetores frizzled humanos são selecionados a partir do grupo consistindo em FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8. Em determinadas formas de realização, os dois ou mais recetores frizzled compreendem FZD1 e um segundo recetor frizzled selecionado a partir do grupo consistindo em FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8. Em determinadas formas de realização, os dois ou mais recetores frizzled compreendem FZD2 e um segundo recetor frizzled selecionado a partir do grupo consistindo em FZD1, FZD5, FZD7 e FZD8. Em determinadas formas de realização, os dois ou mais recetores frizzled compreendem FZD5 e um segundo recetor frizzled selecionado a partir do grupo consistindo em FZD1, FZD2, FZD7 e FZD8. Em determinadas formas de realização, os dois ou mais recetores frizzled incluem FZD5 e FZD8. Em determinadas formas de realização, os dois ou mais recetores frizzled compreendem FZD7 e um segundo recetor frizzled selecionado a partir do grupo consistindo em FZD1, FZD2, FZD5 e FZD8.

Em determinadas formas de realização, o agente liga especificamente a três ou mais recetores frizzled humanos. Em determinadas formas de realização, os três ou mais recetores frizzled humanos compreendem três ou mais recetores frizzled selecionados a partir do grupo consistindo em FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, e FZD8. Em determinadas formas de realização, o agente adicionalmente liga especificamente a um ou mais recetores humanos frizzled adicionais.

Em determinadas formas de realização, o agente ou o anticorpo liga especificamente ao domínio extracelular (ECD) dentro do um ou mais recetores frizzled humanos ao(s) qual(is) liga. São conhecidas na técnica sequências do domínio extracelular de cada um dos recetores frizzled humanos e são também proporcionadas como SEQ ID NO: 27 (ECD FZD1), SEQ ID NO: 31 (ECD FZD2), SEQ ID NO: 35 (ECD FZD3), SEQ ID NO: 39 (ECD FZD4), SEQ ID NO: 43 (ECD FZD5), SEQ ID NO: 47 (ECD FZD6), SEQ ID NO: 51 (ECD FZD7), SEQ ID NO: 55 (ECD FZD8) , SEQ ID NO: 59 (ECD FZD9) , e SEQ ID NO: 63 (ECD FZD10).

Em determinadas formas de realização, o agente ou anticorpo liga especificamente ao domínio Fri (FRI) (também conhecido como o domínio rico em cisteína (CRD)) dentro do recetor(es) frizzled humano(s) ao(s) qual(is) liga. São conhecidas na técnica sequências do domínio Fri de cada um dos recetores frizzled humanos e são também proporcionadas como SEQ ID NO: 28 (FRI FZD1), SEQ ID NO: 32 (FRI FZD2) , SEQ ID NO: 36 (FRI FZD3), SEQ ID NO: 40 (FRI FZD4), SEQ ID NO: 44 (FRI FZD5), SEQ ID NO: 48 (FRI FZD6), SEQ ID NO: 52 (FRI FZD7) , SEQ ID NO: 56 (FRI FZD8) , SEQ ID NO: 60 (FRI FZD9), e SEQ ID NO: 64 (FRI FZD10).

Em determinadas formas de realização, um sítio de ligação a antigénio individual de um anticorpo ou polipéptido de ligação a FZD descrito no presente documento é capaz de ligar (ou liga) o um, dois, três, quatro, ou cinco (ou mais) recetores frizzled humanos. Em determinadas formas de realização, um sítio de ligação ao antigénio individual do anticorpo ou polipéptido de ligação ao FZD ê capaz de ligar especificamente a um, dois, três, quatro ou cinco recetores frizzled humanos selecionados a partir do grupo consistindo em FZD1, FZD2, FZD5, FZD7, e FZD8. Em determinadas formas de realização, um sítio de ligação individual do anticorpo ou polipéptido liga especificamente a pelo menos FZD5 e FZD8.

Em determinadas formas de realização, o agente ou anticorpo de ligação a FZD liga a um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais) recetores frizzled humanos, com uma constante de dissociação (KD) de cerca de ΙμΜ ou menos, cerca de 100 nM ou menos, cerca de 40 nM ou menos, cerca de 20 nM ou menos, ou cerca de 10 nM ou menos. Por exemplo, em determinadas formas de realização, um anticorpo ou agente de ligação a FZD descrito no presente documento que liga a mais de um FZD, liga a aqueles FZDs com uma KD de cerca de 100 nM ou menos, cerca de 20 nM ou menos, ou cerca de 10 nM ou menos. Em determinadas formas de realização, o anticorpo ou agente de ligação a FZD liga a cada um de um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5) dos seguintes FZDs com uma constante de dissociação de cerca de 40 nM ou menos: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8. Em determinadas formas de realização, o anticorpo ou agente de ligação a FZD liga a cada um de urn ou mais dos seguintes FZDs com uma constante de dissociação de cerca de 10 nm ou menos: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8. Em determinadas formas de realização, o anticorpo ou agente de ligação a FZD liga a cada um ou mais dos seguintes FZDs com uma constante de dissociação de cerca de 10 nM ou menos: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8. Em determinadas formas de realização, a constante de dissociação do agente ou anticorpo para um FZD particular é a constante de dissociação determinada utilizando uma proteína de fusão FZD-Fc compreendendo o domínio extracelular FZD ou domínio Fri imobilizado num chip Biacore.

Em determinadas formas de realização, o anticorpo ou agente de ligação a FZD liga a um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais) recetores frizzled humanos com uma ECS0 de cerca de 1 μΜ ou menos, cerca de 100 nM ou menos, cerca de 40 nM ou menos, cerca de 2 0 nM ou menos, cerca de 10 nM ou menos, ou cerca de 1 nM ou menos. Por exemplo, em determinadas formas de realização, um anticorpo ou agente de ligação a FZD descrito no presente documento que liga a mais de um FZD tem uma EC5o de cerca de 40 nM ou menos, cerca de 20 nM ou menos, ou cerca de 10 nM ou menos, em relação a esses FZDs. Em determinadas formas de realização, o agente ou anticorpo de ligação a FZD tem uma EC50 de cerca de 20 nM ou menos em relação a um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5) dos seguintes FZDs: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8. Em determinadas formas de realização, o agente ou anticorpo de ligação a FZD tem uma EC5o de cerca de 10 nM ou menos em relação a um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5) dos seguintes FZDs: FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8. Em determinadas formas de realização, o agente ou anticorpo de ligação a FZD tem uma EC5o de cerca de 40 nM ou menos ou 20 nM ou menos em relação à ligação de FZD5 e/ou FZD8.

Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD (por exemplo, anticorpo) liga ao mesmo epítopo ou liga a um epítopo que está sobreposto com o epítopo de um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 10 e um região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 (por exemplo, o anticorpo IgG 18R5 ou 18R8). Em determinadas formas de realização, o anticorpo ou agente de ligação a FZD liga ao mesmo epítopo ou liga a um epítopo que está sobreposto com o epítopo de um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 11 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD liga ao mesmo epítopo ou liga a um epítopo que está sobreposto com o epítopo de um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 85 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 86 (por exemplo, o anticorpo IgG 44R24).

Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD compete por ligação específica a um recetor frizzled humano com um anticorpo num ensaio de ligação competitiva, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 10 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD compete por ligação específica a um recetor frizzled humano com um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 11 e uma cadeia leve compreendendo a

sequência de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15. Em determinadas formas de realização, os anticorpos com os quais o agente compete por ligação específica ao recetor frizzled humano é um anticorpo IgG 18R5. Em determinadas formas de realização alternativas, o anticorpo é uma IgG 18R8 .

Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD compete por ligação específica a um recetor frizzled humano com um anticorpo num ensaio de ligação competitiva, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO: 85 e uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 86 .

Em determinadas formas de realização, o anticorpo ou agente de ligação a FZD liga a pelo menos parte de uma região de um recetor frizzled humano designada pelos inventores como o Sítio de Ligação Biológica (BBS) (Figura 9, Exemplo 6) . Em FZD8 humano (SEQ ID NO: 54), o BBS consiste no seguinte: (a) um epítopo conformacional consistindo nos aminoácidos 72(F), 74-75(PL), 78(1) , 92 (Y), 121-122 (LM) e 129-132 (WPDR (SEQ ID NO: 70)) (o "sulco" do BBS mostrada nas Figuras 8 e 9) , (b) uma região de FZD8 consistindo na sequência GLEVHQ (SEQ ID NO: 25) ("limite superior" do BBS mostrado nas Figuras 8 e 9) e (c) uma região de FZD8 consistindo na sequência YGFA (SEQ ID NO: 74) ("limite inferior" do BBS mostrado nas Figuras 8 e 9).

Os resíduos correspondentes do BBS em FZD 1-7, FZD9 e FZD10 são identificados no Quadro 1, abaixo, e na Figura 8. Em determinadas formas de realização, um agente que bloqueia a ligação de um ligando (por exemplo, um Wnt) a FZD inibe a ligação do ligando ao BBS. É entendido que em determinadas formas de realização, os agentes que ligam a pelo menos parte do BBS também podem ligar a uma ou mais regiões noutro lugar (isto é, fora do BBS) no recetor frizzled humano. Por outras palavras, em de te rminadas formas de realização, o epítopo ao qual o anticorpo ou agente de ligação a FDZ liga é uma região dentro do domínio extracelular do recetor FZD que está sobreposta com o BBS, mas não está inteiramente contida dentro do BBS. Em determinadas formas de realização alternativas, o epítopo ao qual o anticorpo ou agente de ligação a FZD liga está totalmente contido dentro do BBS (isto é, o BBS compreende o epítopo inteiro ao qual o anticorpo ou outro agente de ligação a FZD liga).

Quadro 1. Sítios de Ligação Biológica (BBS) de Recetores FZD

Sem estar ligado a teoria, é acreditado que o BBS compreenda um possível sítio de ligação a ligando, tal como um sítio de ligação para Wnt. Em FZD8, este possível sítio de ligação a ligando compreende o epítopo conformacional formado pelos aminoãcidos 72(F), 74-75(PL), 78(1), 92(Y), 121- 122 (LM) e 129-132 (WPDR (SEQ ID NO: 70)) ("sulco" do BBS mostrado nas Figuras 8 e 9). Os resíduos correspondentes do possível sítio de ligação a ligando em FZD1-7, FZD9 e FZD10 são mostrados no alinhamento das sequências na Figura 8. Em determinadas formas de realização, um agente que bloqueia a ligação de um ligando (por exemplo, um Wnt) ao BBS inibe a ligação do ligando a este epítopo conformacional. É entendido que em determinadas formas de realização, os agentes que ligam a pelo menos uma parte deste sítio de ligação ao ligando podem também ligar a uma região noutro lugar (por exemplo, fora do BBS) no recetor frizzled humano. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente não liga a qualquer porção de FZD fora do epítopo conformacional.

Em determinadas formas de realização, o agente liga a pelo menos parte da sequência QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO: 67) dentro do recetor frizzled humano se o recetor frizzled humano é FZD8, ou à sequência correspondente se o recetor frizzled humano é FZD 1-7, FZD9 ou FZD10. Esta região dos FZDs compreende o "limite superior" do BBS identificado nas Figuras 8 e 9. As sequências correspondentes ao epítopo QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO: 67) de FZD8 em vários recetores frizzled são identificadas na Quadro 2, abaixo, e também são aparentes a partir do alinhamento na Figura 8. Em determinadas formas de realização, o agente liga especificamente a um recetor frizzled humano selecionado a partir do grupo consistindo em FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8, e o agente liga a pelo menos parte da sequência Q(DE/ED) AGLEVHQF(Y/W)PL (SEQ ID NO: 24) dentro O recetor frizzled humano. Em determinadas formas de realização, o agente liga especificamente a pelo menos parte da sequência AGLEVHQF (SEQ ID NO: 68) dentro do(s) recetor(es) frizzled humano(s) FZD1, FZD2 , FZD5, FZD7 e/ou FZD8. Em determinadas formas de realização, o agente liga a pelo menos parte de uma sequência em FZD3, FZD4, FZD6, FZD9 e/ou FZD10 que corresponde à sequência AGLEVHQF (SEQ ID NO: 68) em FZD8. Em determinadas formas de realização, o agente liga especificamente a pelo menos parte da sequência GLEVHQ (SEQ ID NO: 25) dentro do(s) recetor(es) frizzled humano(s) FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e/ou FZD8. Esta sequência é o "limite superior" do BBS mostrado na Figura 9. Em determinadas formas de realização, o agente liga a pelo menos parte da sequência em FZD3, FZD4, FZD6, FZD9 e/ou FZD10 que corresponde à sequência GLEVHQ (SEQ ID NO: 25) em FZD8. As sequências que correspondem à sequência GLEVHQ (SEQ ID NO: 25) de FZD8 estão sublinhadas na segunda e terceira colunas da Quadro 2 abaixo e são aparentes a partir do alinhamento de sequências na Figura 8. Em determinadas formas de realização, um agente que liga a pelo menos parte da SEQ ID NO: 67 ou 68 em FZD8, ou a um epítopo correspondente noutro FZD, inibe a ligação de um ligando (por exemplo, um Wnt) ao FZD (por exemplo, ao BBS de FZD) . Em determinadas formas de realização, os agentes que ligam às regiões indicadas acima podem também ligar a outras regiões noutro lugar (isto é, fora das regiões especificadas acima) no recetor frizzled humano.

Quadro 2. Regiões Correspondentes em Recetores Frizzled Humanos

Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD liga a pelo menos parte de uma região consistindo na sequência QYGFA (SEQ ID NO: 66) se o recetor frizzled humano é FZD8, que compreende o "limite inferior" do BBS, ou na sequência correspondente se o recetor frizzled humano é FZD 1-7, FZD9 ou FZD10. As sequências correspondentes à região QYGFA (SEQ ID NO: 66) nos vários recetores frizzled estão identificadas na Figura 8 e Quadro 2 acima. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD liga a pelo menos parte de uma região consistindo na sequência YGFA (SEQ ID NO: 74) , o "limite inferior" do BBS, se o recetor frizzled humano é FZD8, ou na sequência correspondente, se o recetor frizzled humano é FZD 1-7, FZD9 ou FZD10. As sequências correspondentes à região YGFA (SEQ ID NO: 74) nos vários recetores frizzled são identificadas na Figura 8 e sublinhadas na quarta coluna da Quadro 2 acima. Em determinadas formas de realização, um agente que liga a pelo menos parte da SEQ ID NO: 6 6 ou SEQ ID NO: 74 em FZD8, ou à sua sequência correspondente noutro FZD, inibe a ligação de um ligando (por exemplo, um Wnt) a FZD (por exemplo, o BBS da FZD). Em determinadas formas de realização, os agentes que ligam a esta região também podem ligar a um ou mais resíduos de aminoácidos noutro lugar (isto é, fora desta região) no recetor frizzled humano.

Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD liga a pelo menos parte da região que forma o "limite superior" do BBS, bem como pelo menos uma parte da região que forma o "limite inferior" do BBS. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD que liga a pelo menos parte de Q (DE/ED) AGLEVHQF (Y/W) PL (SEQ ID NO: 24) dentro de FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e/ou FZD8, QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO: 67) dentro de FZD8, AGLEVHQF (SEQ ID NO: 68) dentro de FZD8 e/ou GLEVHQ (SEQ ID NO: 25) dentro de FZD8, e/ou uma sequência correspondente a qualquer destas sequência num recetor frizzled humano diferente {conforme definido no Quadro 2, acima) liga adicionalmente a pelo menos parte de QYGFA (SEQ ID NO: 66) dentro de FZD8 ou YGFA (SEQ ID NO: 74) dentro de FZD8 e/ou uma sequência correspondente a uma destas sequências dentro de FZD1-7, FZD9 ou FZD10 (conforme definido no Quadro 2, acima). Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FDZ liga a pelo menos parte da sequência GLEVHQ (SEQ ID NO: 25) dentro de FZD8, bem como pelo menos parte da sequência YGFA (SEQ ID NO: 74) dentro de FZD8. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD liga a pelo menos parte de uma região de FZD 1-7, FZD9 ou FZD10 corresponde à sequência GLEVHQ (SEQ ID NO: 25) em FZD8, bem como pelo menos parte de uma região de FZD1-7, FZD9 ou FZD10 correspondendo à sequência YGFA (SEQ ID NO: 74) em FZD8. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD que liga às sequências indicadas também liga a uma ou mais sequências noutro ponto dentro do (s) recetor(es) frizzled humano (s) ao (s) qual(is) liga. Por outras palavras, em determinadas formas de realização, o epítopo ao qual o anticorpo ou agente de ligação a FDZ liga é uma região dentro do domínio extracelular de FZD que está sobreposto somente parcialmente com as sequências indicadas acima. Em determinadas formas de realização alternativas, o epítopo inteiro ao qual o anticorpo ou agente de ligação a FDZ liga está totalmente contido dentro das sequências indicadas acima.

Em determinadas formas de realização, o agente é um polipéptido. Em determinadas formas de realização, o agente ou polipéptido é um anticorpo. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo IgGl ou um anticorpo IgG2. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado. Em determinadas formas de realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo.

Os anticorpos ou outros agentes da presente divulgação podem ser ensaiados para ligação específica através de qualquer método conhecido na técnica. Os imunoensaios que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, sistemas de ensaio competitivo e não competitivo utilizando técnicas tais como BIAcore, análise FACS, imunofluorescência, imunocitoquímica. Western blots, radioimunoensaios, ELISA, imunoensaios de "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitação, reações de precipitina por difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes e imunoensaios de proteína A. Tais ensaios são rotineiros e bem conhecidos na técnica (veja-se, por exemplo, Ausubel et al. , eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1. John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque).

Por exemplo, a ligação específica de um anticorpo a um recetor frizzled humano pode ser determinada utilizando ELISA. Um ensaio ELISA compreende preparação do antigénio, revestimento de poços de uma placa de microtitulação de 96 poços com o antigénio, adição do anticorpo de ligação a FZD ou outros agentes de ligação a FZD conjugados a um composto detetável tal como um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina) ao poço, incubação durante um período de tempo e deteção da presença do antigénio. Nalgumas formas de realização, o agente ou anticorpo de ligação a FDZ não é conjugado a um composto detetável, mas em vez disso é adicionado ao poço a um segundo anticorpo conjugado que reconhece o agente ou anticorpo de ligação a FDZ. Nalgumas formas de realização, em vez do revestimento do poço com o antigénio, o agente ou anticorpo de ligação a FDZ pode ser revestido no poço e pode ser adicionado um segundo anticorpo conjugado com um composto detetável após a adição do antigénio ao poço revestido. Um perito na especialidade seria conhecedor dos parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detetado, bem como outras variações de ELISA conhecidas na técnica (veja-se, por exemplo Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1., John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque em 11.2.1). A afinidade de ligação de um anticorpo ou outro agente a um recetor frizzled humano e a taxa de separação de uma interação antigénio-anticorpo pode ser determinada por ensaios de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação do antigénio etiquetado (por exemplo, 3H ou 125I) , ou fragmento ou variante do me smo, com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de antigénio não etiquetado seguido pela deteção do anticorpo ligado ao antigénio etiquetado. A afinidade do anticorpo contra um recetor frizzled e as taxas de separação da ligação podem ser determinadas a partir dos dados por análise de gráficos de Scatchard. Nalgumas formas de realização, é utilizada análise cinética de BIAcore para determinar as taxas de união e de separação da ligação de anticorpos ou de agentes que ligam um ou mais recetores frizzled humanos. A análise cinética de BIAcore compreende análise da ligação e dissociação dos anticorpos a partir de chips com antigénios FZD imobilizados na sua superfície.

Em determinadas formas de realização, o agente (por exemplo, anticorpo) é um antagonista de pelo menos um recetor frizzled humano (isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 FZDs) ligado pelo agente, Em determinadas formas de realização, o agente inibe pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 90%, ou cerca de 100 % de uma ou mais atividades do recetor frizzled humano ligado.

Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD inibe a ligação de um ligando a pelo menos um recetor frizzled humano. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD inibe a ligação de um ligando ao Sítio de Ligação Biológico (BBS) do recetor frizzled humano. Em determinadas formas de realização, o ligando é uma proteína Wnt humana. Foram identificadas dezanove proteínas Wnt humanas: WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A (anteriormente WNT14), WNT9B (anteriormente WNT15), WNT10A, WNT10B, WNT11 e WNT16. Em determinadas formas de realização, o agente inibe a ligação de WNT3A a FZD8. Em determinadas formas de realização, a inibição da ligação de um ligando específico a uma proteína frizzled humana específica proporcionada pelo agente de ligação a FZD é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%. Em determinadas formas de realização, um agente que inibe a ligação de um ligando tal como um Wnt a um FZD, inibe adicionalmente a sinalização de Wnt (por exemplo, inibe a sinalização de Wnt canónica).

Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD inibe a sinalização de Wnt. É entendido que um agente de ligação a FZD que inibe a sinalização de Wnt pode, em determinadas formas de realização, inibir a sinalização por um ou mais Wnts, mas não necessariamente por todas as Wnts. Em determinadas formas de realização alternativas, a sinalização por todas as Wnts humanas pode ser inibida. Em determinadas formas de realização, a sinalização por uma ou mais Wnts selecionadas a partir do grupo consistindo em WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A (anteriormente WNT14), WNT9B (anteriormente WNT15), WNT10A, WNT10B, WNT11 e WNT16 é inibida. Em determinadas formas de realização, a sinalização de Wnt que é inibida é sinalização por WNT1, WNT2, WNT3, WNT3A, WNT7a, WNT7b e/ou WNT10B. Em determinadas formas de realização, o agente inibe a sinalização por (pelo menos) WNT1, WNT3A, WNT7b e WNT10B. Em formas de realização particulares, o agente inibe a sinalização por (pelo menos) WNT3A. Em determinadas formas de realização, a inibição da sinalização por uma Wnt proporcionada pelo agente de ligação a FZD é uma redução do nível de sinalização por Wnt de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%. Em determinadas formas de realização, a sinalização de Wnt que é inibida é sinalização de Wnt canónica. São conhecidos na técnica ensaios in vivo e in vitro para determinar se um agente de ligação a FZD (ou agente de ligação a FZD candidato) inibe a sinalização de Wnt. Por exemplo, podem ser utilizados ensaios de luciferase repórter baseados em células utilizando um vetor repórter TCF/Luc contendo várias cópias do domínio de ligação a TCF a montante de um gene repórter de luciferase de pirilampo para medir os níveis de sinalização de Wnt canónica in vitro (Gazit et al. 1999, Oncogene 18; 5959-66). 0 nível da sinalização de Wnt na presença de uma ou mais Wnts (por exemplo, Wnt(s) expressa(s) por células transfetadas ou proporcionada(s) por meio condicionado com Wnt) com o presente agente de ligação a FZD é comparado com o nível de sinalização sem o agente de ligação a FZD presente. São proporcionados exemplos não-limitantes específicos da utilização de tal ensaio de luciferase repórter para avaliar a inibição da sinalização de Wnt canónica nos Exemplos 3 e 11, abaixo. Para além do ensaio de TCF/repórter luc, o efeito de um agente de ligação a FZD (ou agente candidato) sobre a sinalização de Wnt canónica pode ser medido in vitro ou in vivo medindo o efeito do agente sobre o nível de expressão de genes regulados por beta-catenina, tais como c-myc (He et al., Science, 281:1509-12 (1998)), ciclina Dl (Tetsu et al. Nature, 398:422-6 (1999)) e/ou fibronectina (Gradl et al. Mol. Cell Biol., 19:5576-87 (1999)). Em determinadas formas de realização, o efeito de um agente sobre a sinalização de Wnt também pode ser avaliado através da medição do efeito do agente sobre o estado de fosforilação de Dishevelled-1, Dishevelled-2, Dishevelled-3, LRP5, LRP6 e/ou β-catenina. Em formas de realização ainda adicionais, o efeito de um agente de ligação a FZD sobre a sinalização de Wnt é determinado pela avaliação do impacto do agente de ligação a FZD sobre o nível de expressão de um ou mais genes numa assinatura Wnt.

Em determinadas formas de realização, os agentes de ligação a FZD têm um ou mais dos seguintes efeitos: inibir a proliferação de células tumorais; reduzir a tumorigenicidade de um tumor, reduzindo a frequência de células estaminais cancerígenas no tumor; inibir o crescimento tumoral, aumentar a sobrevivência, desencadear a morte celular de células tumorais, diferenciar células tumorigénicas a um estado de não-tumorigénicas, ou prevenir a metãstase de células tumorais.

Em determinadas formas de realização, anticorpos ou outros agentes que ligam especificamente um ou mais recetores frizzled humanos desencadeiam a morte celular por meio de uma toxina conjugada, agente quimioterapêutico, radioisótopo, ou qualquer outro agente. Por exemplo, em determinadas formas de realização, um anticorpo para um anticorpo frizzled humano é conjugado a uma toxina que é ativada nas células tumorais expressando FZD através de internaiização de proteínas. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente ou anticorpo não é conjugado a uma toxina, agente quimioterapêutico, ou radioisótopo.

Em determinadas formas de realização, os agentes de ligação a FZD são capazes de inibir o crescimento tumoral. Em determinadas formas de realização, os agentes de ligação a FZD são capazes de inibir o crescimento tumoral in vivo (por exemplo, num modelo de ratinho de xenoenxerto e/ou num ser humano tendo cancro).

Em determinadas formas de realização, os agentes de ligação a FZD são capazes de reduzir a tumorigenicidade de um tumor. Em determinadas formas de realização, o agente ou anticorpo é capaz de reduzir a tumorigenicidade de um tumor compreendendo células estaminais cancerígenas num modelo animal, tal como um modelo de xenoenxerto de ratinho. Em determinadas formas de realização, o número ou a frequência de células estaminais cancerígenas num tumor é reduzido em pelo menos cerca de duas vezes, cerca de três vezes, cerca de cinco vezes, cerca de dez vezes, cerca de 50 vezes, cerca de 100 vezes ou cerca de 1000 vezes. Em determinadas formas de realização, a redução do número ou frequência de células estaminais cancerígenas é determinada através de ensaio de diluição limitante utilizando um modelo animal. É proporcionado um exemplo de um ensaio de diluição limitante utilizado para testar a eficácia de um anticorpo anti-FZD no Exemplo 8, abaixo. Podem ser encontrados exemplos e orientações adicionais sobre a utilização de ensaios de diluição limitante para determinar uma redução do número ou frequência de células estaminais cancerígenas num tumor, por exemplo, na publicação internacional Número WO 2008/042236, Publicação de Pedido de Patente U.S. N.0 2008/0064049 e Publicação de Pedido de Patente U.S. N.° 2008/0178305.

Em determinadas formas de realização, os anticorpos para os recetores frizzled humanos medeiam a morte celular de uma célula expressando a proteína FZD por meio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). A ADCC envolve lise celular por células efetoras que reconhecem a porção Fc de um anticorpo. Vários linfócitos, monócitos, macrófagos teciduais, granulócitos e eosinõfilos, por exemplo, têm recetores Fc e podem mediar a citólise (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497).

Em determinadas formas de realização, os anticorpos para um ou mais FZDs desencadeiam a morte celular de uma célula expressando a (s) proteína(s) FZD por ativação de citotoxicidade dependente de complemento (CDC). A CDC envolve a ligação de complemento sérico a porção Fc de um anticorpo e a ativação subsequente da cascata de proteínas de complemento, resultando em dano da membrana celular e eventual morte celular. A atividade biológica de anticorpos é conhecida como sendo determinada, em grande medida, pelos domínios constantes ou região Fc da molécula de anticorpo (Uananue e Benacerraf, Textbook of Immunology, 2 edição, Williams e Wilkins, p. 218 (1984)). Os anticorpos de diferentes classes e subclasses diferem neste respeito, bem como os anticorpos da mesma subclasse mas de diferentes espécies. Dos anticorpos humanos, IgM é a classe mais eficaz de anticorpos para ligar ao complemento, seguido por IgGl, IgG3, e IgG2 enquanto IgG4 parece bastante deficiente na ativação da cascata de complemento (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:14 97; Jefferis et al. 1998, Immunol. Rev. 153:59-76). De acordo com a divulgação, são preparados anticorpos das classes tendo a atividade biológica desej ada. A capacidade de qualquer anticorpo específico contra uma ou mais FZDs de mediar a lise da célula-alvo por ativação do complemento e/ou ADCC pode ser ensaiada. As células de interesse são cultivadas e etiquetadas in vitro; o anticorpo é adicionado à cultura celular, em combinação com complemento de soro ou células imunes que podem ser ativadas pelos complexos antigénio-anticorpo. A citólise das células-alvo é detetada, por exemplo, pela libertação de marcador a partir das células lisadas. De facto, os anticorpos podem ser rastreados utilizando o soro do próprio paciente como uma fonte de complemento e/ou de células imunes. 0 anticorpo que é capaz de ativar o complemento ou mediar ADCC no teste in vitro pode então ser utilizado terapeuticamente nesse paciente em particular. A divulgação proporciona polipéptidos, incluindo mas não limitados a, anticorpos que ligam especificamente a um ou mais recetores frizzled humanos, que compreendem um, dois, três, quatro, cinco e/ou seis das CDRs de 18R5 e/ou 18R8 (veja-se o Quadro 4 do Exemplo 1 abaixo) , com até quatro (isto é, 0, 1, 2, 3 ou 4) substituições de aminoãcidos conservatives por CDR. Consequentemente, a divulgação proporciona polipéptidos, incluindo mas não limitado a, anticorpos que ligam-se especificamente a um ou mais recetores frizzled humanos compreendendo um, dois, três, quatro, cinco e/ou seis das CDRs de 18R5 e/ou 18R8. Em determinadas formas de realização, os polipéptidos compreendem a CDR3 de cadeia pesada de 18R8 e/ou a CDR3 de cadeia leve de 18R5 oul8R8. Em determinadas formas de realização, a (s) CDR(s) de cadeia pesada estão contidas dentro de uma região variável de cadeia pesada e/ou as CDR(s) de cadeia leve estão contidas dentro de uma região variável de cadeia leve.

Por exemplo, a divulgação proporciona um polipéptido (por exemplo, um anticorpo) que liga especif icamente a um recetor frizzled humano, em que o polipéptido compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID NO:1), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos, (b) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VISGDGSYTYYADSVKG (SEQ ID NO:2), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácido, e/ou (c) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO:3), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos. Em determinadas formas de realização, o polipéptido compreende adicionalmente uma região variável de cadeia leve compreendendo: (a) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO:4) ou SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO:7), ou uma variante da SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO: 7 compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (b) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo EKDNRPSG (SEQ ID NO:5) ou DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8), ou uma variante da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 8 compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos e/ou (c) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo SSFAGNSLE (SEQ ID NO:6) ou QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9), ou uma variante da SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 9 compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos. Em determinadas formas de realização, as substituições de aminoácidos são substituições conservativas.

Consequentemente, a divulgação proporciona polipéptidos ou anticorpos que compreendem uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID NO:1), uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VISGDGSYTYYADSVKG (SEQ ID NO:2), e/ou uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO:3). Em determinadas formas de realização, a(s) CDR(s) cadeias leves estão contidas dentro de uma região variável de uma cadeia pesada de anticorpo. Em determinadas formas de realização, o polipéptido ou anticorpo compreendendo uma ou mais das CDRs de cadeia pesada liga especificamente a um ou mais recetores frizzled humanos. Em determinadas formas de realização, a (s) CDR(s) foram modificadas com 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácidos. Em determinadas formas de realização, cada uma da(s) CDR(s) de cadeia pesada foram modificadas por não mais de 1-2 substituições conservativas de aminoácidos. A divulgação proporciona também um anticorpo que liga especificamente a um recetor frizzled humano, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada, compreendendo: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID NO:1), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (b) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VISGDGSYTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; e (c) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO:3), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos. Em determinadas formas de realização, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variável de cadeia leve compreendendo: (a) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO:4) ou SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO: 7) , ou uma variante da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 7 compreendendo 1,2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (b) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5) ou DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8) , ou uma variante da SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:8 compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; e (c) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo SSFAGNSLE (SEQ ID NO:6) ou QSYANTLSL (SEQ ID NO:9), ou uma variante da SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO: 9 compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos. Nalgumas formas de realização alternativas, o anticorpo compreende adicionalmente em vez disso uma região variável de cadeia leve compreendendo: (a) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO:4) ou SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO: 7) ; (b) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo EKDNRPSG (SEQ ID NO:5) ou DKSNRPSG (SEQ ID NO:8) e (c) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo SSFAGNSLE (SEQ ID NO: 6) ou QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9) . Em determinadas formas de realização, o anticorpo liga especificamente a FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e/ou FZD8. Em determinadas formas de realização, o anticorpo liga especificamente a dois ou mais recetores frizzled humanos incluindo FZD5 e FZD8. Em determinadas formas de realização, as substituições de aminoácidos são substituições conservativas. A divulgação proporciona adicionalmente um polipéptido (por exemplo, um anticorpo) que liga especificamente a um recetor frizzled humano, em que o polipéptido compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo: (a) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO:4) ou SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO: 7) , ou uma variante da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 7 compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos; (b) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo EKDNRPSG (SEQ ID NO:5) ou DKSNRPSG (SEQ ID NO:8), ou uma variante da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 8 compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos e/ou (c) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo SSFAGNSLE (SEQ ID NO: 6) ou QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9), OU uma variante da SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 9 compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos. Em determinadas formas de realização, as substituições de aminoácidos são substituições conservativas.

Também são proporcionados polipéptidos ou anticorpos que compreendem (a) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência SGD (K/N)(L/I)G(K/S)(K/F)Y(A/V)(S/H) (SEQ ID NO:71) ou a sequência de SEQ ID NO: 71 com até quatro (isto é, 0, 1, 2, 3 ou 4) substituições conservativas de aminoácidos, (b) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência (E/D)K(D/S)NRPSG (SEQ ID NO:72) ou a sequência de SEQ ID NO:72 com até quatro substituições de aminoácidos conservativas, e/ou (c) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência (S/Q)S(F/Y)A(G/N)(N/T)(sem aa/L)SL(E/sem aa) (onde "sem aa/L" indica L ou sem aminoácido e "E/sem aa" indica E ou sem aminoácido; SEQ NO: 73) ou a sequência de SEQ ID NO: 73 com até quatro substituições conservativas de aminoácidos.

A divulgação também proporciona polipéptidos ou anticorpos que compreendem uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO:4) ou SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO:7), uma CDR2 de cadeia leve compreendendo EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5) OU DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8) , e/ou uma CDR3 de cadeia leve compreendendo SSFAGNSLE (SEQ ID NO:6) ou QSYANTLSL (SEQ ID NO :9). Em determinadas formas de realização, o polipéptido ou anticorpo compreende uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO:7), uma CDR2 de cadeia leve compreendendo DKSNRPSG (SEQ ID NO:8), e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QSYANTLSL (SEQ ID NO:9). Em determinadas formas de realização alternativas, o polipéptido ou anticorpo compreende uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO:4), uma CDR2 de cadeia leve compreendendo EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5), e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo SSFAGNSLE (SEQ ID NO:6). Em determinadas formas de realização, a (s) CDR(s) de cadeia leve estão contidas dentro de uma região variável de uma cadeia leve de anticorpo. Em determinadas formas de realização, o polipéptido ou o anticorpo liga especificamente a um ou mais recetores frizzled humanos. Em determinadas formas de realização, o polipéptido ou anticorpo compreendendo uma ou mais das cadeias leves CDRs liga especificamente a um ou mais recetores frizzled humanos. Em determinadas formas de realização, a(s) CDR(s) foram modificadas com 1, 2, 3 ou 4 modificações conservatives. Em determinadas formas de realização, cada uma da(s) CDR(s) cadeias leves foram modificadas por não mais de 1-2 substituições conservatives de aminoácidos.

Em determinadas formas de realização, o anticorpo compreende (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID NO:1), uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VISGDGSYTYYADSVKG (SEQ ID NO:2), e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO:3) e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO: 4) ou SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO: 7) , uma CDR2 de cadeia leve compreendendo EKDNRPSG (SEQ ID NO:5) ou DKSNRPSG (SEQ ID NO:8), e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo SSFAGNSLE (SEQ ID NO: 6) ou QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9) . Em determinadas formas de realização, o anticorpo compreende (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID N0:1), uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VISGDGSYTYYADSVKG (SEQ ID NO:2), e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO: 3) ; e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO:4), uma CDR2 de cadeia leve compreendendo EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5), e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo SSFAGNSLE (SEQ ID NO:6). Em determinadas formas de realização, o anticorpo compreende (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID NO:1), uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VISGDGSYTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2) , e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO:3) e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO:7), uma CDR2 de cadeia leve compreendendo DKSNRPSG (SEQ ID NO:8), e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9) . Em determinadas formas de realização, a(s) CDR(s) foram modificadas com 1, 2, 3 ou 4 substituições conservatives de aminoácidos. Em determinadas formas de realização, cada uma da(s) CDR(s) foram modificadas por não mais de 1-2 substituições conservatives de aminoácidos. A divulgação proporciona adicionalmente polipéptidos, incluindo, mas não limitados a, anticorpos que ligam especificamente a um ou mais recetores frizzled humanos, que compreendem um, dois, três, quatro, cinco e/ou seis das CDRs dos anticorpos anti-FZD 44R24 (veja-se o Quadro 7 do Exemplo 18 abaixo) com até quatro (isto é, 0, 1, 2, 3 ou 4) substituições conservativas de aminoácidos por CDR. Consequentemente, a divulgação proporciona polipéptidos, incluindo, mas não limitados a, anticorpos que ligam especificamente a um ou mais recetores frizzled humanos que compreendem um, dois, três, quatro, cinco e/ou seis das CDRs de 44R24. Em determinadas formas de realização, os polipéptidos compreendem a CDR3 de cadeia pesada de 44R24 e./ou a CDR3 de cadeia leve de 44R24. Em determinadas formas de realização, a (s) CDR(s) de cadeia pesada estão contidas dentro de uma região variável de cadeia pesada e/ou a(s) CDR(s) de cadeia leve estão contidas dentro de uma região variável de cadeia leve. A divulgação proporciona adicionalmente um polipéptido (por exemplo, um anticorpo) que liga especificamente a FZD5 e/ou FZD8 humano, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSSYYIT (SEQ ID NO:77), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições conservatives de aminoácidos, uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo TISYSSSNTYYADSVKG (SEQ ID NO:78), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácidos; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo SIVFDY (SEQ ID NO:79), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácidos; e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDALGNRYVY (SEQ ID NO:80), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácidos; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo SG (SEQ ID NO: 81), ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácidos; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo GSWDTRPYPKY (SEQ ID NO: 82) , ou uma variante da mesma compreendendo 1, 2, 3 ou 4 substituições conservativas de aminoácidos. Em determinadas formas de realização, o anticorpo (ou outro polipéptido de ligação a FZD) compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSSYYIT (SEQ ID NO:77), uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo TISYSSSNTYYADSVKG (SEQ ID NO:78), e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo SIVFDY (SEQ ID NO:79), e/ou (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDALGNRYVY (SEQ ID NO:80), uma CDR2 de cadeia leve compreendendo SG (SEQ ID NO:81), e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo GSWDTRPYPKY (SEQ ID NO :82) . São também proporcionados polipéptidos compreendendo uma das cadeias leves individuais ou cadeias pesadas descritas no presente documento, bem como polipéptidos (por exemplo, anticorpos), compreendendo tanto uma cadeia leve como uma cadeia pesada.

Também são proporcionados polipéptidos que compreendem: (a) um polipéptido tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 10; e/ou (b) um polipéptido tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO:12 ou SEQ ID NO:14. Em determinadas formas de realização, o polipéptido compreende um polipéptido tendo pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com SEQ ID NOs: 10, 12 ou 14. Consequentemente, em determinadas formas de realização, o polipéptido compreende (a) um polipéptido tendo, pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 10 e/ou (b) um polipéptido tendo, pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:12 ou 14. Em determinadas formas de realização, o polipéptido compreende (a) um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e/ou (b) um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO :14. Em determinadas formas de realização, o polipéptido compreende (a) um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11; e/ou (b) um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO :15. Em determinadas formas de realização, o polipéptido é um anticorpo e/ou o polipéptido liga especificamente a um ou mais recetores frizzled humanos (por exemplo, FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e/ou FZD8). Por exemplo, a divulgação proporciona um anticorpo que liga especificamente a um recetor frizzled humano que compreende (a) um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10; e (b) um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Em determinadas formas de realização o polipéptido compreendendo a SEQ ID NO:10 é uma região variável de cadeia pesada. Em determinadas formas de realização, o polipéptido compreendendo a SEQ ID NO:12 ou 14 é uma região variável de cadeia leve. Em determinadas formas de realização, o polipéptido tendo uma determinada percentagem de identidade de sequência com SEQ ID NO:10, 12 ou 14 difere da SEQ ID NO: 10, 12 ou 14 somente por substituições conservatives de aminoácidos.

Em determinadas formas de realização o polipéptido ou anticorpo compreende: (a) SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12; (b)

SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 14; (c) SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO :13, OU (d) SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:15. A divulgação proporciona adicionalmente um anticorpo ou outro polipéptido que liga especificamente a FZD5 e/ou FZD8 e compreende: (a) um polipéptido tendo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade com SEQ ID NO:8 5; e/ou (b) um polipéptido tendo pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade com SEQ ID NO: 86. Em determinadas formas de realização alternativas, o polipéptido ou anticorpo compreende SEQ ID NO:85 e/ou SEQ ID NO:86.

Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD compreende, consiste essencialmente em, ou consiste num anticorpo anti-FZD selecionado a partir do grupo consistindo em anticorpos IgG 18R8, 18R5, 18R4605, 18R4805 e 44R24.

Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD compreende as cadeias pesadas e as cadeias leves do anticorpo IgG2 18R8 (com ou sem a sequência líder). Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD é o anticorpo IgG2 18R8. Foi depositado ADN codificando cadeias pesadas e cadeias leves do anticorpo

IgG2 18R8 na American Type Culture Collection (ATCC), 10.801 University Boulevard, Manassas, VA, EUA, sob as condições do Tratado de Budapeste a 29 de setembro de 2008, e foi-lhe atribuído o número de designação de depósito ATCC PTA-9540. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD compreende as cadeias pesadas e as cadeias leves do anticorpo IgG2 18R5 (com ou sem a sequência líder). Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD é o anticorpo IgG2 18R5. Foi depositado ADN codificando cadeias pesadas e de cadeias leves do anticorpo IgG2 18R5 na ATCC, sob as condições do Tratado de Budapeste a 29 de setembro de 2008, e foi-lhe atribuído o número de designação de depósito ATCC PTA-9541.

Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD é um anticorpo IgG codificado pelo plasmídeo depositado na ATCC a 26 de agosto de 2009, e foi-lhe atribuído o número de designação de depósito ATCC PTA-10307, PTA-10309 ou PTA-10311.

Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD é um agente que compete por ligação específica a FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e/ou FZD8 com um anticorpo codificado pelo plasmídeo tendo número de designação de depósito ATCC PTA-9540, PTA-9541, PTA-10307, ou PTA-10309 (por exemplo, num ensaio de ligação competitiva). Em determinadas formas de realização alternativas, o agente de ligação a FZD é um agente que compete por ligação específica a FZD5 e/ou FZD8 com um anticorpo codificado pelo plasmídeo tendo número de designação de depósito ATCC PTA-10311.

Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD tem uma semivida circulante em ratos, macacos cinomolgos ou seres humanos, de pelo menos cerca de 10 horas, pelo menos cerca de 24 horas, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 1 semana, ou pelo menos cerca de 2 semanas. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD é um anticorpo IgG (por exemplo, IgGl ou IgG2), que tem uma semivida circulante em ratos, macacos cinomolgos ou seres humanos, de pelo menos cerca de 10 horas, pelo menos cerca de 24 horas, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 1 semana, ou pelo menos cerca de 2 semanas. São conhecidos no estado da técnica métodos para aumentar a semivida de agentes tais como polipéptidos e anticorpos. Por exemplo, os métodos conhecidos para aumentar a semivida circulante dos anticorpos IgG incluem a introdução de mutações na região Fc que aumentam a ligação dependente de pH do anticorpo ao recetor Fc neonatal (FcRn) a pH 6.0 (veja-se, por exemplo, Pub. de Pat. U.S. N.°s 2005/0276799, 2007/0148164 e 2007/0122403). Os métodos conhecidos para aumentar a semivida circulante de fragmentos de anticorpos carecendo da região Fc incluem técnicas tais como peguilação.

Os anticorpos policlonais podem ser preparados através de qualquer método conhecido. Os anticorpos policlonais são originados por meio da imunização de um animal (por exemplo, um coelho, rato, ratinho, burro, etc) por múltiplas injeções por via subcutânea ou intraperitoneal do antigénio relevante (um fragmento de péptido purificado, proteína recombinante de comprimento completo, proteína de fusão, etc), opcionalmente conjugado a hemocianina de lapa (KLH), albumina sérica, etc diluído em solução salina estéril e combinado com um adjuvante (por exemplo, Adjuvante de Freund completo ou incompleto) para formar uma emulsão estável. 0 anticorpo policlonal é então recuperado a partir do sangue, ascite e semelhantes, de um animal imunizado como tal. 0 sangue recolhido é coagulado e o soro decantado, clarificado por centrifugação, e ensaiado para a titulação de anticorpos. Os anticorpos policlonais podem ser purificados a partir de soro ou ascite de acordo com métodos padrão na técnica incluindo cromatografia de afinidade, cromatografia de permuta iónica, eletroforese, diãlise, etc.

Os anticorpos monoclonals podem ser preparados através de métodos de hibridoma, tais como aqueles descritos por Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495. Utilizando o método de hibridoma, um ratinho, um hámster, ou outro animal hospedeiro adequado, é imunizado conforme descrito acima para desencadear a produção de anticorpos por parte dos linfócitos dos anticorpos que ligarão especificamente a um antigénio imunizante. Os linfócitos também podem ser imunizados in vitro. Após a imunização, os linfócitos são isolados e fusionados com uma linha celular de mieloma adequada utilizando, por exemplo, polietilenoglicol, para formar células de hibridoma que podem ser então selecionadas a partir de linfócitos e células de mieloma não fusionados. Os hibridomas que produzem anticorpos monoclonais especificamente direcionados contra um antigénio eleito conforme determinado por imunoprecipitação, imunoblotting, ou por um ensaio de ligação in vitro (por exemplo, radioimunoensaio (RIA); ensaio imunosorvente ligado a enzima (ELISA)) podem então ser propagados em cultura in vitro utilizando métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) ou in vivo como tumores de ascite num animal. Os anticorpos monoclonais podem ser então purificados a partir do meio de cultura ou fluido ascítico conforme descrito acima para os anticorpos policlonais.

Alternativamente também podem ser fabricados anticorpos monoclonais utilizando métodos de ADN recombinante, conforme descrito na Patente US 4.816.567. Os polinucleótidos codificando um anticorpo monoclonal são isolados a partir de células B maduras ou célula de hibridoma, tal como por RT-PCR utilizando iniciadores de oligonucleótidos que amplificam especificamente os genes codificando as cadeias leves e pesadas do anticorpo, e a sua sequência é determinada utilizando procedimentos convencionais. Os polinucleótidos isolados codificando as cadeias pesadas e leves são então clonados em vetores de expressão adequados, que quando transfetados em células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outra forma não produzem proteína imunoglobulina, os anticorpos monoclonais são gerados pelas células hospedeiras. Além disso, os anticorpos monoclonais recombinantes ou fragmentos dos mesmos das espécies desejadas podem ser isolados a partir de bibliotecas de exibição de fago expressando CDRs das espécies desejadas, conforme descrito (McCafferty et al, 1990, Nature, 348 :552-554;.. Clackson et al, 1991, Nature, 352:624-628; . e Marks et al, 1991, J. Biol Moí, 222:581-597). 0 (s) polinucleótido(s) codificando um anticorpo monoclonal podem adicionalmente ser modificado(s) de uma série de maneiras diferentes utilizando tecnologia de ADN recombinante para gerar anticorpos alternativos. Nalgumas formas de realização, os domínios constantes das cadeias leves e pesadas, por exemplo, um anticorpo monoclonal de ratinho podem ser substituídos 1) por aquelas regiões de, por exemplo, um anticorpo humano para gerar um anticorpo monoclonal quimérico ou 2) por um polipéptido não imunog1obu1ina para gerar um anticorpo de fusão. Nalgumas formas de realização, as regiões constantes são truncadas ou removidas para gerar os fragmentos de anticorpos desej ados de um anticorpo monoclonal. Pode ser utilizada mutagénese direcionada ao local ou de alta densidade da região variável para otimizar a especificidade, afinidade, etc de um anticorpo monoclonal.

Nalgumas formas de realização, o anticorpo monoclonal contra o (s) recetor(es) frizzled humano(s) é um anticorpo humanizado. Em determinadas formas de realização, tais anticorpos são utilizados terapeuticamente para reduzir a antigenicidade e as respostas de HAMA (anticorpos anti ratinho humanos) quando administrados a um indivíduo humano. Os anticorpos humanizados podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na técnica. Em determinadas formas de realização alternativas, o anticorpo para o recetor frizzled humano(s) é um anticorpo humano.

Os anticorpos humanos podem ser diretamente preparados utilizando várias técnicas conhecidas na técnica. Podem ser gerados linfócitos B humanos imortalizados imunizados in vitro ou isolados a partir de um indivíduo imunizado que produzem um anticorpo direcionado contra um antigénio alvo (veja-se, por exemplo. Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) ,- Boemer et al, 1991, J. Immunol, 147 (1) :86-95,- e Patente US 5.750.373). Igualmente, o anticorpo humano pode ser selecionado a partir de uma biblioteca de fago, onde essa biblioteca de fago expressa os anticorpos humanos, conforme descrito, por exemplo, em Vaughan et al. 1996, Nat. Biotech., 14 :309-314, Roupa et al. 1998, Proc. Nat'1. Acad. Sei . , 95:6157-6162, Hoogenboom e Winter, 1991, J. Moi . Biol., 227:381, e Marks et al., 1991, J. Moi. Biol, 222:581) . São também descritas técnicas para geração e utilização de bibliotecas de fago de anticorpos nas Patentes US N.°s 5969108, 6172197, 5885793, 6521404, 6544731, 6555313, 6582915, 6593081, 6300064, 6653068, 6706484 e 7264963, e Rothe et al, 2007, J. Moi. Bio, doi: . 10.1016/j.jmb.2007.12.018. São conhecidas na técnica estratégias de maturação de afinidade e estratégias de permuta de cadeia (Marks et al. 1992, Bio/Technology 10:779-783) e podem ser empregues para gerar anticorpos humanos de afinidade elevada.

Também podem ser fabricados anticorpos humanizados em ratinhos transgénicos contendo loci de i munog1obu1ina humana que são capazes após imunização de produzir o repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Esta abordagem é descrita nas Patentes US 5.545.807; 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425 e 5.661.016.

Esta divulgação também abrange anticorpos biespecíficos que reconhecem especificamente um recetor frizzled humano. Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que são capazes de reconhecer especificamente e ligar pelo menos dois epítopos diferentes. Os epítopos diferentes podem estar dentro da mesma molécula (por exemplo, o mesmo recetor humano frizzled) ou em moléculas diferentes tal que ambos, por exemplo, os anticorpos possam especificamente reconhecer e ligar um recetor frizzled humano bem como, por exemplo, 1) uma molécula efetora num leucócito tal como um recetor de células T (por exemplo CD3) ou recetor Fc (por exemplo, CD64, CD32 ou CD 16) ou 2) um agente citotóxico conforme descrito em detalhe abaixo. Em determinadas formas de realização, o anticorpo biespecífico liga especificamente a pelo menos um recetor frizzled humano, bem como VEGF, um ligando Notch, tal como um ligando de tipo delta (por exemplo, DLL4) ou jagged, ou pelo menos um recetor Notch selecionado a partir do grupo consistindo em Notch 1, Notch 2, Notch 3 e Notch 4. Os anticorpos biespecíficos podem ser anticorpos intactos ou fragmentos de anticorpos.

Os anticorpos biespecíficos exemplares podem ligar a dois epítopos diferentes, pelo menos um dos quais é originado num polipéptido da divulgação. Alternativamente, um braço anti antigénico de uma molécula de imunog1obu1ina pode ser combinado com um braço que liga a uma molécula de acionamento num leucócito tal como uma molécula recetora de células T (por exemplo, CD2, CD3, CD28 ou B7), ou recetores Fc para IgG de modo a visar os mecanismos de defesa celulares para células expressando um antigénio particular. Os anticorpos biespecíficos também podem ser utilizados para direcionar os agentes citotóxicos a células que expressam um antigénio específico. Estes anticorpos possuem um braço de ligação a antigénio e um braço que liga um agente citotóxico ou um quelante de radionuclídeo, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, ou TETA. As técnicas para produção de anticorpos biespecíficos são comuns na técnica (Millstein et al, 1983, Nature 305:537-539;. Brennan et al, 1985, Science 229:81;. Suresh et al, 1986, Methods in Enzymoll21:120.; Traunecker et al, 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al, 1992, Exp Med J. 175:217-225;. Kostelny et al, 1992, J. Immunol 148:1547-1553;.. Gruber et al, 1994, J. Immunol 152:5368 e Patente US 5.731.168). São também contemplados anticorpos com mais de duas valências. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecíficos (Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991)). Consequentemente, em determinadas formas de realização os anticorpos para o(s) recetor(es) frizzled humano(s) são multiespecíficos.

Alternativamente, em determinadas formas de realização alternativas, os agentes de ligação a FZD da divulgação não são anticorpos biespecíficos.

Em determinadas formas de realização, os anticorpos (ou outros polipéptidos) descritos no presente documento podem ser monoespecíficos. Por exemplo, em determinadas formas de realização, cada um de um ou mais sítios de ligação a antigénio que um anticorpo contém é capaz de ligar (ou liga) o mesmo de um ou mais recetores FZD humanos (por exemplo, FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 ou FZD8, ou um epítopo homólogo em alguma combinação das FZDs). Em determinadas formas de realização, um sítio de ligação a antigénio de um anticorpo monoespecífico descrito no presente documento é capaz de ligar (ou liga) , um, dois, três, quatro, ou cinco (ou mais) dos recetores frizzled humanos.

Em determinadas formas de realização são proporcionados um fragmento de anticorpo para, por exemplo, aumentar a penetração do tumor. São conhecidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos.

Tradicionalmente, estes fragmentos são obtidos através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (por exemplo, Morimoto et al, 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117;. Brennan et al, 1985, Science, 229:81). Em determinadas formas de realização, os fragmentos de anticorpos são produzidos recombinantemente. Os fragmentos de anticorpos Fab, FV e scFv podem ser todos expressos e segregados a partir de E. coli ou outras células hospedeiras, permitindo consequentemente a produção de grandes quantidades destes fragmentos. Tais fragmentos de anticorpos podem também ser isolados a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. 0 fragmento de anticorpo também pode ser anticorpos lineares conforme descrito na Patente US 5.641.870, por exemplo, e podem ser monoespecíficos ou biespecíficos. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão aparentes para o perito na especialidade.

De acordo com a presente divulgação, as técnicas podem ser adaptadas para a produção de anticorpos de cadeia simples específicos para um ou mais recetores frizzled humanos (veja-se a Pat. US N° 4946778). Adicionalmente, os métodos podem ser adaptados para a construção de bibliotecas de expressão de Fab (Huse, et al. Science 246:1275-1281 (1989)) para permitir a identificação rápida e eficaz dos fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada para um recetor FZD, ou derivados, fragmentos, análogos ou homólogos dos mesmos. Podem ser produzidos fragmentos de anticorpos através das técnicas na técnica incluindo, mas não limitadas a: (a) um fragmento F(ab')2 produzido por digestão com pepsina de uma molécula de anticorpo, (b) um fragmento Fab gerado por redução das pontes dissulfeto de um fragmento F(ab')2, (c) um fragmento Fab gerado pelo tratamento da molécula de anticorpo com papaína e um agente redutor, e (d) fragmentos Fv.

Pode adicionalmente ser desejável, especialmente no caso de fragmentos de anticorpos, modificar um anticorpo de modo a aumentar a sua semivida sérica. Isto pode ser conseguido, por exemplo, pela incorporação de um epítopo de ligação de recetores de resgate no fragmento de anticorpo através de mutação da região adequada no fragmento de anticorpo ou incorporando o epítopo numa etiqueta de péptido que é então fusionada ao fragmento de anticorpo em cada extremidade ou no meio (por exemplo, por síntese de ADN ou péptidos).

Os anticorpos heteroconjugados também estão dentro do âmbito da presente divulgação. Os anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos unidos covalentemente. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos como direcionando células imunes a células indesejadas (Pat US N° 4676980) . É contemplado que os anticorpos possam ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos na química de proteínas sintéticas, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, podem ser construídas imunotoxinas utilizando uma reação de permuta de dissulfeto ou por formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.

Para os propósitos da presente divulgação, deve ser apreciado que os anticorpos modificados podem compreender qualquer tipo de região variável que proporciona a associação do anticorpo com os polipéptidos de um recetor FZD humano. Neste sentido, a região variável pode incluir, ou ser derivada a partir de qualquer tipo de mamífero que possa ser induzido a montar uma resposta humoral e gerar imunoglobulinas contra o antigénio associado ao tumor desejado. Como tal, a região variável dos anticorpos modificados pode ser, por exemplo, de origem humana, de ratinho, de primata não-humano (por exemplo, macacos cinomolgos, macacos rhesus, etc) ou de lupino. Em algumas formas de realização tanto a região variável como constante das imunoglobulinas modificadas são humanas. Noutras formas de realização as regiões variáveis dos anticorpos compatíveis (habitualmente derivados a partir de uma fonte não humana) podem ser manipuladas ou especificamente concebidas para melhorar as propriedades de ligação ou reduzir a imunogenicidade da molécula. A este respeito, as regiões variáveis úteis na presente divulgação podem ser humanizadas ou de outra forma alteradas através da inclusão de sequências de aminoãcidos importadas.

Em determinadas formas de realização, os domínios variáveis nas cadeias pesada e leve são alterados por pelo menos substituição parcial de um ou mais CDRs e, se necessário, por substituição parcial da região estrutural e alteração de sequência. Embora as CDRs possam ser derivadas a partir de um anticorpo da mesma classe ou inclusive subclasse que o anticorpo a partir do qual as regiões estruturais são derivadas, é visado que as CDRs sejam derivadas a partir de um anticorpo de classe diferente e preferentemente de um anticorpo de espécie diferente. Pode não ser necessária a substituição de todas as CDRs pelas CDRs completas da região variável dadora para transferir a capacidade de ligação do antigénio de um domínio variável para outro. Pelo contrário, pode somente ser necessário transferir aqueles resíduos que são necessários para manter a atividade do sítio de ligação do antigénio. Dadas as explicações estabelecidas nas Patentes US N.°s 5585089, 5593761 e 5693762, estará bem dentro da competência dos peritos na especialidade, quer levando a cabo experimentação de rotina quer através de teste por tentativas para obter um anticorpo funcional com imunogenicidade reduzida. Não obstante alterações da região variável, os peritos na especialidade apreciarão que os anticorpos modificados desta divulgação compreenderão anticorpos (por exemplo, anticorpos de comprimento completo ou fragmentos imunorreativos dos mesmos), nos quais pelo menos uma fração de um ou mais dos domínios de região constante foram eliminados ou de outra forma alterados de modo a proporcionar características bioquímicas desejadas tais como localização do tumor aumentada ou semivida sérica reduzida quando comparados com um anticorpo de aproximadamente a mesma imunogenicidade compreendendo uma região nativa ou constante inalterada. Nalgumas formas de realização, a região constante dos anticorpos modificados compreenderá uma região constante humana. Modificações na região constante compatíveis com esta divulgação compreendem adições, eliminações ou substituições de um ou mais aminoãcidos num ou mais domínios. Isto é, os anticorpos modificados divulgados no presente documento podem incluir alterações ou modificações de um ou mais dos três domínios constantes da cadeia pesada (CHI, CH2 ou CH3) e/ou no domínio constante de cadeia leve (CL) . Nalgumas formas de realização, são contempladas regiões constantes modificadas onde um ou mais domínios são total ou parcialmente eliminados. Nalgumas formas de realização, os anticorpos modificados irão compreender construções ou variantes de domínio eliminados em que o domínio CH2 completo foi retirado (construções ACH2). Nalgumas formas de realização, o domínio da região constante omitido será substituído por um espaçador de aminoãcidos curto (por exemplo, 10 resíduos), que proporciona alguma da flexibilidade molecular tipicamente transmitida pela região constante ausente.

Para além da sua configuração, é sabido na técnica que a região constante medeia várias funções efetoras. Por exemplo, a ligação do componente Cl do complemento a anticorpos ativa o sistema de complemento. A ativação do complemento é importante na opsonização e lise dos agentes patogénicos celulares. A ativação do complemento também estimula a resposta inflamatória e também pode estar envolvida na hipersensibilidade autoimune. Adicionalmente, os anticorpos ligam às células por meio da região Fc, com um sítio recetor Fc na região Fc do anticorpo ligando a um recetor Fc (FcR) numa célula. Existem uma série de recetores Fc que são específicos para diferentes classes de anticorpos, incluindo anticorpos IgG (recetores gama), IgE (recetores eta), IgA (recetores alfa) e IgM (recetores mu). A ligação do anticorpo aos recetores Fc na superfície celular desencadeia uma série de importantes e diversas respostas biológicas, incluindo englobamento e destruição de partículas revestidas por anticorpos, eliminação de imunocomplexos, lise de células alvo revestidas por anticorpo por parte de células killer (denominada citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo, ou ADCC), libertação de mediadores inflamatórios, transferência placentãria e controlo da produção da imunoglobulina.

Em determinadas formas de realização, os anticorpos de ligação a FZD proporcionam funções efetoras alteradas que, por sua vez, afetam o perfil biológico do anticorpo administrado. Por exemplo, a eliminação ou inativação (por meio de mutações pontuais ou outros meios) de um domínio de região constante pode reduzir a ligação do recetor Fc do anticorpo modificado circulante, aumentando como tal a localização do tumor. Noutros casos, pode ocorrer que as modificações da região constante, consistentes com esta divulgação, moderem a ligação ao complemento e consequentemente reduzam a semivida sérica e a associação não específica de uma citotoxina conjugada. Podem ser utilizadas ainda outras modificações da região constante para eliminar ligações dissulfeto ou frações de oligossacarídeos que permitem localização melhorada devido a especificidade do antigénio ou flexibilidade de anticorpos aumentadas. De forma semelhante, podem ser facilmente realizadas modificações da região constante de acordo com esta divulgação utilizando técnicas de bioquímicas ou de engenharia molecular bem conhecidas dentro da competência do perito na especialidade.

Em determinadas formas de realização, um agente de ligação a FZD que é um anticorpo não tem uma ou mais funções efetoras. Por exemplo, nalgumas formas de realização, o anticorpo não tem atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e/ou nenhuma atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Em determinadas formas de realização, o anticorpo não liga a um recetor Fc e/ou fatores de complemento. Em de t e rmi nada s formas de realização, o anticorpo não tem função efetora.

Será notado que, em determinadas formas de realização, os anticorpos modificados podem ser manipulados para fusionar o domínio CH3 diretamente com a região de dobradiça dos respetivos anticorpos modificados. Noutras construções pode ser conveniente proporcionar um espaçador de péptidos entre a região de dobradiça e os domínios CH2 e/ou CH3 modificados. Por exemplo, poderiam ser expressas construções compatíveis em que o domínio CH2 foi eliminado e o domínio CH3 restante (modificado ou não) é unido à região de dobradiça com um espaçador de 5 a 20 aminoácidos. Tal espaçador pode ser adicionado, por exemplo, para garantir que os elementos reguladores do domínio constante permaneçam livres e acessíveis ou que a região de dobradiça permaneça flexível. No entanto, deve ser notado que os espaçadores de aminoãcido podem, nalguns casos, provar ser imunogénicos e desencadear uma resposta imune indesej ada contra a construção. Consequentemente, em determinadas formas de realização, qualquer espaçador adicionado à construção será relativamente não imunogénico, ou inclusive omitido por completo, de modo a manter as qualidades bioquímicas desejadas dos anticorpos modificados.

Para além da eliminação de todos os domínios da região constante, será apreciado que os anticorpos da presente divulgação possam ser proporcionados por eliminação ou substituição parcial de alguns ou inclusive um único aminoácido. Por exemplo, a mutação de um único aminoãcido em áreas selecionadas do domínio CH2 pode ser suficiente para reduzir substancialmente a ligação de Fc e desta forma aumentar a localização do tumor. De forma semelhante, pode ser desejável simplesmente eliminar aquela parte de um ou mais domínios da região constante que controlam a função efetora (por exemplo, ligação de CLQ ao complemento) a ser modulada. Tais eliminações parciais das regiões constantes podem melhorar as características selecionadas de anticorpo (semivida sérica) enquanto deixando outras funções desejáveis associadas ao domínio da região constante do indivíduo intactas. Além disso, conforme mencionado anteriormente, as regiões constantes dos anticorpos divulgados podem ser modificadas através da mutação ou substituição de um ou mais aminoácidos que potência o perfil da construção resultante. A este respeito pode ser possível interromper a atividade proporcionada por um sítio de ligação conservado (por exemplo, ligação a Fc) , enquanto substancialmente mantendo a configuração e perfil imunogénico do anticorpo modificado. Determinadas formas de realização podem compreender a adição de um ou mais aminoácidos à região constante para melhorar características desejáveis tais como diminuição ou aumento da função efetora ou proporcionar maior união de citotoxina ou hidratos de carbono. Em tais formas de realização pode ser desej ável inserir ou replicar sequências específicas derivadas a partir de domínios de região constante selecionados. A presente divulgação abrange adicionalmente variantes e equivalentes que são substancialmente homólogos aos anticorpos quiméricos, humanizados e humanos, ou fragmentos de anticorpos dos mesmos, estabelecidos no presente documento. Estes podem conter, por exemplo, mutações de substituição conservative, isto é, a substituição de um ou mais aminoácidos por aminoácidos semelhantes. Por exemplo, substituição conservative refere-se à substituição de um aminoácido por outro dentro da mesma classe geral, tal como, por exemplo, um aminoácido ácido com outro aminoácido ácido, um aminoácido básico com outro aminoácido básico ou um aminoácido neutro por outro aminoácido neutro. 0 que é pretendido por uma substituição de aminoácido conservative é bem conhecido na técnica. A divulgação também se refere a imunoconjugados compreendendo um anticorpo conjugado a um agente citotóxico. Os agentes citotóxicos incluem agentes quimioterapêuticos, agentes inibidores do crescimento, toxinas (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, vegetal, fúngica ou animal, ou fragmentos da mesma), isótopos radioativos (isto é, um radioconjugado), etc. Agentes quimioterapêuticos úteis na geração de imunoconjugados incluem, por exemplo, metotrexato, adriamicina, doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes. Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas que podem ser utilizados incluem a cadeia A da difteria, fragmentos ativos não ligantes da toxina da difteria, cadeia A da exotoxina, cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor da Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Estão disponíveis uma variedade de radionuclídeos para produção de anticorpos radioconj ugados incluindo 212Bi, 1311 1311η, 90Y e 186Re. São fabricados conjugados do anticorpo e agente citotóxico utilizando uma variedade de agentes de acoplamento a proteína bifuncionais, tais como N-succinimidil-3-(2-piridiiditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (TI), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidilo), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (tais como bis(p-diazóniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolieno), e compostos de flúor bis-ativo (como 1,5-difluoro-2,4 -dinitrobenzeno). Também podem ser utilizados conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, tais como uma caliqueamicina, maitansinoides, um tricoteno e CC1065, e os derivados destas toxinas que têm atividade de toxina. Os anticorpos conjugados são compostos por dois anticorpos unidos covalentemente. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos como direcionando células imunes para células indesejadas (Pat US N° 4676980) . É contemplado que os anticorpos possam ser preparados in vitro, utilizando métodos conhecidos na química de proteínas sintéticas, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, podem ser construídas imunotoxinas utilizando uma reação de permuta de dissulfeto ou através de formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este propósito incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.

Independentemente de como são obtidas quantidades úteis, os anticorpos da presente divulgação podem ser utilizados em qualquer uma de uma série de formas conjugadas (isto é, um imunoconjugado) ou não conjugadas. Alternativamente, os anticorpos da presente divulgação podem ser utilizados numa forma não conjugada ou "nua". Em determinadas formas de realização, os anticorpos são utilizados de forma não conjugada para aproveitar os mecanismos de defesa naturais do indivíduo incluindo a citotoxidade dependente de complemento (CDC) e a toxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) para eliminar as células malignas. Nalgumas formas de realização, os anticorpos podem ser conjugados com radioisótopos, tais ____ 90v 12 5 x 131T 123 x 111τ_ ΙΟδτ,ν, 153,^ 67«, 67«„ 166TT^ como Y, I, I, X, In, Rn, Sm, Cu, Ga, Ho, 177Lu, 186Re e 188Re utilizando qualquer um de uma série de quelantes conhecidos ou etiquetagem direta. Noutras formas de realização, as composições divulgadas podem incluir anticorpos acoplados a fármacos, profãrmacos ou modificadores da resposta biológica tais como metotrexato, adriamicina, e linfocinas tais como interferão. Ainda outras formas de realização da presente divulgação compreendem a utilização de anticorpos conjugados com biotoxinas específicas, tais como ricina ou toxina da difteria. Ainda noutras formas de realização os anticorpos modificados podem ser complexados com outros ligandos imunologicamente ativos (por exemplo, anticorpos ou fragmentos dos mesmos) em que a molécula resultante liga tanto à célula neoplásica como a uma célula efetora tal como uma célula T. A seleção de que anticorpo conjugado ou não conjugado modificado utilizar irá depender do tipo e estádio do cancro, utilização de tratamento adjunto (por exemplo, quimioterapia ou radiação externa) e condição do paciente. Será apreciado que um perito na especialidade poderia facilmente realizar uma tal seleção em vista dos ensinamentos no presente documento.

Os polipéptidos da presente divulgação podem ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturais ou polipéptidos sintéticos compreendendo um anticorpo ou fragmento do mesmo, contra um recetor FZD humano. Será reconhecido na técnica que algumas sequências de aminoácidos da divulgação podem ser modificadas sem efeito significativo sobre a estrutura ou função da proteína. Consequentemente, a divulgação inclui adicionalmente variações dos polipéptidos que mostram atividade substancial ou que incluem regiões de um anticorpo ou fragmento do mesmo, contra uma proteína de recetor FZD humano. Tais mutantes incluem eliminações, inserções, inversões, repetições e substituições de tipo.

Os polipéptidos e análogos podem adicionalmente ser modificados para conter frações químicas adicionais que não fazem normalmente parte da proteína. Estas frações derivatizadas podem melhorar a solubilidade, a semivida biológica ou absorção da proteína. As frações podem também reduzir ou eliminar quaisquer efeitos secundários desejáveis das proteínas e semelhantes. Pode ser encontrada uma visão geral para essas frações em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20 ed. Mack Publishing Co., Easton, PA (2000) .

Os polipéptidos isolados descritos no presente documento podem ser produzidos através de qualquer método adequado conhecido na técnica. Tais métodos variam de métodos de síntese de proteínas diretos para construir uma sequência de ADN isolada codificando sequências polipeptídicas isoladas e expressando essas sequências num hospedeiro transformado adequado. Nalgumas formas de realização, uma sequência de ADN é construída utilizando tecnologia recombinante através de isolamento ou síntese de uma sequência de ADN codificando uma proteína de tipo selvagem de interesse. Opcionalmente, a sequência pode ser mutagenizada por mutagénese específica de sítio para proporcionar análogos funcionais dos mesmos. Veja-se, por exemplo, Zoeller et al. Proc. Nat’1. Acad. Sei. USA 81:5662-5066 (1984) e Pat. US N.°. 4588585.

Nalgumas formas de realização uma sequência de ADN codificando um polipéptido de interesse seria construída através de síntese química utilizando um sintetizador de oligonucleótidos. Tais oligonucleõtidos podem ser desenhados com base na sequência de aminoácidos do polipéptido desejado e seleção daqueles codões que são favorecidos na célula hospedeira na qual o polipéptido recombinante de interesse será produzido. Podem ser aplicados métodos padrão para sintetizar uma sequência de polinucleótidos isolados codificando um polipéptido isolado de interesse. Por exemplo, pode ser utilizada uma sequência de aminoácidos completa para construir um gene novamente traduzido. Adicionalmente, pode ser sintetizado um oligómero de ADN contendo uma sequência de nucleótidos codificando o polipéptido isolado particular. Por exemplo, podem ser sintetizados vários pequenos oligonucleótidos de codificação para porções do polipéptido desejado e posteriormente ligados. Os oligonucleótidos individuais contêm tipicamente saliências 5' ou 3' para montagem complementar.

Após ser montada (por síntese, mutagénese direcionada ao local ou outro método), as sequências de polinucleõtido codificando um polipéptido isolado particular de interesse serão inseridas num vetor de expressão e operativamente ligadas a uma sequência de controlo de expressão adequada para a expressão da proteína num hospedeiro desejado. A montagem correta pode ser confirmada através de sequenciamento de nucleótidos, mapeamento de restrição e expressão de um polipéptido biologicamente ativo num hospedeiro adequado. Conforme é conhecido na técnica, de modo a obter níveis elevados de expressão de um gene transfetado num hospedeiro, o gene deve ser operativamente ligado às sequências de controlo de expressão transcricional e traducional que são funcionais no hospedeiro de expressão eleito.

Em determinadas formas de realização, os vetores de expressão recombinantes são utilizados para amplificar e expressar anticorpos de codificação de ADN, ou fragmentos dos mesmos, contra recetores frizzled humanos. Os vetores de expressão recombinantes são construções de ADN replicáveis que têm fragmentos de ADN sintéticos ou derivados de ADNc codificando uma cadeia polipeptídica de um anticorpo anti-FZD, ou fragmento do mesmo, operativamente ligado a elementos reguladores transcricionais ou traducionais adequados derivados a partir de genes de mamíferos, microbianos, virais ou de insetos. Uma unidade de transcrição geralmente compreende uma montagem de (1) um elemento ou elementos genético(s) tendo um papel regulador na expressão génica, por exemplo, promotores ou potenciadores de transcrição, (2) uma sequência estrutural ou de codificação que é transcrita em ARNm e traduzida em proteína, e (3) sequências de iniciação e terminação de transcrição e tradução adequadas, conforme descrito em detalhe abaixo. Tais elementos reguladores podem incluir uma sequência de operador para controlar a transcrição. Podem ser incorporadas a capacidade de replicar num hospedeiro, normalmente atribuída por uma origem de replicação, e um gene de seleção para facilitar o reconhecimento dos transformantes. As regiões de ADN são operativamente ligadas quando estão funcionalmente relacionadas entre si. Por exemplo, o ADN para um péptido de sinal (líder secretor) é operativamente ligado ao ADN para um polipéptido se este for expresso como um precursor que participa na secreção do polipéptido; um promotor é operativamente ligado a uma sequência de codificação se controlar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossoma é operativamente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de forma a permitir a tradução. Os elementos estruturais destinados para utilização em sistemas de expressão de levedura incluem uma sequência líder permitindo a secreção extracelular das proteínas traduzidas por uma célula hospedeira. Alternativamente, onde a proteína recombinante é expressa sem uma sequência líder ou de transporte, pode incluir um resíduo de metionina N-terminal. Este resíduo pode opcionalmente ser subsequentemente clivado a partir da proteína recombinante expressa para proporcionar um produto final. A eleição da sequência de controlo de expressão e vetor de expressão irá depender da eleição do hospedeiro. Pode ser empregue uma ampla variedade de combinações de hospedeiro/vetor de expressão. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos incluem, por exemplo, vetores compreendendo sequências de controlo de expressão a partir do SV40, vírus do papiloma bovino, adenovirus e citomegalovírus. Vetores de expressão úteis para hospedeiros bacterianos incluem plasmídeos bacterianos conhecidos, tais como plasmídeos de Escherichia coli, incluindo pCR 1, pBR322, pMB9 e os seus derivados, plasmídeos de gama de hospedeiros mais ampla, tais como M 13 e fagos de ADN de cadeia simples filamentosos. Células hospedeiras adequadas para a expressão de um polipéptido de ligação a FZD ou anticorpo (ou uma proteína FZD para utilização como um antigénio) incluem procariotas, leveduras, insetos ou células eucariotas superiores sob o controlo de promotores adequados. Os procariontes incluem organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo E. coli ou bacilos. Células eucarióticas superiores incluem linhas celulares estabelecidas de origem mamífera conforme descrito abaixo. Também poderiam ser empregues sistemas de tradução isentos de células. São descritos vetores de clonagem e de expressão adequados para utilização com hospedeiros celulares bacterianos, de leveduras, fúngicos e mamíferos por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, NY, 1985.

Pode ser encontrada informação adicional a respeito de métodos de produção de proteínas, incluindo produção de anticorpos, por exemplo, na Publicação de Patente US N.° 2008/0187954, Patentes US N.°s 6413746 e 6660501, e Publicação Internacional de Patente N.° W004009823.

Também são vantajosamente empregues vários sistemas de culturas celulares de mamíferos ou insetos para expressar uma proteína recombinante. A expressão das proteínas recombinantes em células de mamíferos pode ser realizada dado que essas proteínas são geralmente dobradas corretamente, modificadas adequadamente e completamente funcionais. Exemplos de linhas celulares de hospedeiros mamíferos adequados incluem as linhas COS-7 de células de rim de macaco, descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981), e outras linhas celulares capazes de expressar um vetor adequado, incluindo, por exemplo, células L, linhas C127, 3T3, ovário de hamster chinês (CHO), HeLa e BHK. Os vetores de expressão de mamíferos podem incluir elementos não transcritos tais como uma origem de replicação, um promotor adequado e potenciador ligados ao gene a ser expresso, e outras sequências flanqueantes não transcritas a 5 'ou 3' e sequências não traduzidas a 5 'ou 3', tais como sítios de ligação a ribossoma necessários, um sítio de poliadenilação, sítios de doador e aceitador de excisão-união, e sequências de terminação transcricionais. São revistos sistemas de Baculovírus para produção de proteínas heterólogas em células de inseto por Luckow and Summers, Bio/Technology 06:47 (1988).

As proteínas produzidas por um hospedeiro transformado podem ser purificadas de acordo com qualquer método adequado. Tais métodos padrão incluem cromatografia padrão (por exemplo, permuta iónica, cromatografia de coluna de afinidade e tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial, ou através de qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Podem ser unidas etiquetas de afinidade tais como hexahistidina, domínio de ligação de maltose, sequência de revestimento de influenza e glutationa-S-transferase à proteína para permitir purificação fácil através de passagem sobre uma coluna de afinidade adequada. As proteínas isoladas também podem ser caracterizadas fisicamente através de técnicas tais como proteólise, ressonância magnética nuclear e cristalografia de raios X.

Por exemplo, os sobrenadantes a partir de sistemas que segregam proteínas recombinantes em meio de cultura podem ser primeiramente concentrados utilizando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pel1icon. Após a etapa de concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação adequada. Alternativamente, pode ser empregue uma resina de permuta iónica, por exemplo, uma matriz ou substrato tendo grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos comumente empregues na purificação de proteínas. Alternativamente, pode ser empregue uma etapa de permuta catiónica. Permutas catiónicas adequadas incluem várias matrizes insolúveis compreendendo grupos sulfoproprilo ou carboximetilcelulose. Finalmente, pode ser empregue uma ou mais etapas de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (HPLC-RP) empregando meios de RP-HPLC hidrofóbicos, por exemplo, gel de sílica tendo grupos metilo ou outros grupos alifáticos pendentes para purificar um agente de ligação a FZD. Podem também ser empregues algumas ou todas as etapas de purificação anteriores, em várias combinações, para proporcionar uma proteína recombinante homogénea. A proteína recombinante produzida em cultura de bactérias pode ser isolada, por exemplo, por extração inicial a partir de sedimentos de células, seguido por uma ou mais etapas de concentração, dessalinização, permuta iónica aquosa ou cromatografia de exclusão de tamanho. Pode ser empregue cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para as etapas finais de purificação. As células microbianas empregues na expressão de uma proteína recombinante podem ser interrompidas por qualquer método conveniente, incluindo ciclo de congelamento e descongelamento, sonicação, rutura mecânica, ou utilização de agente de lise celular. Métodos conhecidos na técnica para purificação de anticorpos e outras proteínas também incluem, por exemplo, aqueles descritos nas publicações de pedidos de patente U.S. N.° s. 2008/0312425, 2008/0177048, e 2009/0187005.

Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD é um polipéptido que não é um anticorpo. É conhecida na técnica uma variedade de métodos para identificar e produzir polipéptidos que não são anticorpos que ligam com afinidade elevada a uma proteína alvo. Veja-se, por exemplo, Skerra, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304 (2007), Hosse et al., Protein Science, 15:14-27 (2006), Gill et al. Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658 (2006), Nygren, FEBS J., 275:2668-76 (2008), e Skerra, FEBS J., 275:2677-83 (2008). Em determinadas formas de realização, foi utilizada tecnologia de exibição de fagos para identificar e produzir o polipéptido de ligação a FZD. Em determinadas formas de realização, o polipéptido compreende uma estrutura proteica de um tipo selecionado a partir do grupo consistindo em proteína A, uma lipocalina, um domínio fibronectina, um domínio de repetição consenso de anquirina, e tiorredoxina.

Nalgumas formas de realização, o agente é uma molécula não proteica. Em determinadas formas de realização, o agente é uma molécula pequena. São conhecidas bibliotecas de química combinatória e técnicas úteis na identificação de agentes de ligação a FZD não proteicos pelos peritos na especialidade. Veja-se, por exemplo, Kennedy et al. J. Comb. Chem, 10:345-354 (2008), Dolle et al. , J. Comb. Chem., 9:855-902 (2007) e Bhattacharyya, Curr. Med. Chem., 8:1383-404 (2001). Em determinadas formas de realização adicionais, o agente é um hidrato de carbono, um glicosaminoglicano, uma glicoproteína ou um proteoglicano.

Em determinadas formas de realização, o agente é um aptâmero de ácidos nucleicos. Os aptâmeros são moléculas de polinucleõtidos que foram selecionadas (por exemplo, de agrupamentos aleatórios ou mutagenizados) com base na sua capacidade de ligar a outra molécula. Nalgumas formas de realização, o aptâmero compreende um polinucleótido de ADN. Em determinadas formas de realização alternativas, o aptâmero compreende um polinucleótido de ARN. Em determinadas formas de realização, o aptâmero compreende um ou mais resíduos de ácido nucleico modificados. São bem conhecidos na técnica métodos de geração e rastreio de aptâmeros de ácidos nucleicos para ligação a proteínas. Veja-se, por exemplo, Patente U.S. N.°. 5.270.163, Patente U.S. N.°. 5.683.867, Patente U.S. N.°. 5.763.595, Patente U.S. N.0. 6.344.321, Patente U.S. N.°. 7.368.236, Patente U.S. N.0. 5.582.981, Patente U.S. N. 0 . 5.756.291, Patente U.S. N. 0 . 5.840.867, Patente U.S. N.°. 7.312.325, Patente U.S. N. 0 . 7.32 9.742, Publicação Internacional de Patente N.° WO 02/077262, Publicação Internacional de Patente N.0 WO 03/070984, Publicação de Pedido de Patente U.S. N. ° . 2005/0239134, Publicação Pedido de Patente U.S. N.°. 2005/0124565, e publicação de pedidos de patente U.S. N. °s 2008/0227735. A presente divulgação proporciona adicionalmente métodos de rastreio de agentes para eficácia na inibição da sinalização de Wnt, para eficácia anti tumoral, e/ou eficácia contra células estaminais cancerígenas. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, métodos compreendendo a comparação dos níveis de um ou mais marcadores de diferenciação num primeiro tumor sólido que tenha sido exposto ao agente em relação aos níveis de um ou mais marcadores de diferenciação num segundo tumor sólido que não tenha sido exposto ao agente. Em determinadas formas de realização, estes métodos incluem: (a) expor um primeiro tumor sólido, mas não um segundo tumor sólido ao agente, (b) avaliar os níveis de um ou mais marcadores de diferenciação nos primeiro e segundo tumores sólidos, e (c) comparar os níveis de um ou mais marcadores de diferenciação nos primeiro e segundo tumores sólidos. Em determinadas formas de realização, o agente é um inibidor da via de sinalização de Wnt canónica, e/ou inibe a ligação de uma ou mais proteínas Wnt humanas a um ou mais recetores frizzled humanos. Em determinadas formas de realização, o agente é um anticorpo que liga especificamente a um ou mais recetores frizzled humanos. Em determinadas formas de realização, os níveis aumentados de um ou mais marcadores de diferenciação no primeiro tumor sólido em relação ao segundo tumor sólido indicam eficácia contra células estaminais de tumores sólidos. Em determinadas formas de realização alternativas, os níveis diminuídos de um ou mais marcadores de diferenciação (isto é, marcadores negativos para diferenciação) no primeiro tumor sólido em relação ao segundo tumor sólido indicam eficácia contra células estaminais de tumores sólidos. Em determinadas formas de realização, o tumor sólido é um tumor pancreático. Em determinadas formas de realização, o tumor sólido é um tumor pancreático e o um ou mais marcadores de diferenciação podem compreender uma ou mais mucinas (por exemplo, Muc6) e/ou cromogranina A (CHGA). Em determinadas formas de realização alternativas, o tumor sólido é um tumor do cólon. Nalgumas formas de realização, o tumor sólido é um tumor do cólon e o um ou mais marcadores de diferenciação compreendem citoqueratina 7. São conhecidos outros potenciais marcadores de diferenciação para pâncreas e cólon, bem como outros tipos de tumor pelos peritos na especialidade. A utilidade de potenciais marcadores de diferenciação num método de rastreio pode ser facilmente avaliada por um perito na especialidade através de tratamento do tipo de tumor desejado com um ou mais dos anticorpos anti-FZD divulgados no presente documento tais como 18R5 e/ou 44R24 e posteriormente através de avaliação de alterações da expressão do marcador pelo tumor tratado em relação ao controlo. Podem, por exemplo, ser encontrados exemplos não limitantes de tais métodos nos Exemplos específicos abaixo. III. Polinucleótidos

Em determinadas formas de realização, a divulgação abrange polinucleótidos compreendendo polinucleótidos que codificam um polipéptido que liga especificamente a um recetor FZD humano ou um fragmento de um tal polipéptido. Por exemplo, a divulgação proporciona um polinucleótido compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um anticorpo para um recetor frizzled humano ou codifica um fragmento de tal anticorpo. Os polinucleótidos da divulgação podem estar na forma de ARN ou na forma de ADN. 0 ADN inclui ADNc, ADN genómico e ADN sintético, e pode ser de cadeia dupla ou de cadeia simples, e se for de cadeia simples, pode ser a cadeia codificante ou a cadeia não codificante (anti sentido).

Em determinadas formas de realização, os polinucleótidos são isolados. Em determinadas formas de realização, os polinucleótidos são substancialmente puros. A divulgação proporciona um polinucleótido compreendendo um polinucleótido codificando um polipéptido compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 10, 12, 14. A divulgação proporciona adicionalmente um polinucleótido compreendendo um polinucleótido codificando um polipéptido compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 85-86. É também proporcionado um polinucleótido compreendendo polinucleótidos codificando um polipéptido compreendendo as SEQ ID NOs: 11, 13 ou 15. A divulgação proporciona adicionalmente um polinucleótido compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 17, 19 e 21.

Alternativamente, em determinadas formas de realização, o polinucleótido pode incluir uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 87-90, 92 e 94-95. Também são proporcionadas sequências de polinucleótidos compreendendo as SEQ ID NO: 18, 20 ou 22.

Também é proporcionado um polinucleótido compreendendo um polinucleótido que hibrida com um polinucleótido tendo uma sequência de SEQ ID NO: 17, 19 ou 21 e/ou com um polinucleótido codificando um polipéptido tendo a sequência de SEQ ID NO: 10, 12 ou 14. Também é proporcionado um polinucleótido compreendendo um polinucleótido que hibrida com um polinucleótido tendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 87-90, 92 e 94-95 e/ou com um polinucleótido codificando um polipéptido tendo a sequência de SEQ ID NO: 85 ou 86. Em determinadas formas de realização, a hibridação é em condições de elevada restringência.

Em determinadas formas de realização os polinucleótidos compreendem a sequência de codificação para o polipéptido maduro fusionado no mesmo quadro de leitura a um polinucleótido que auxilia, por exemplo, na expressão e secreção de um polipéptido a partir de uma célula hospedeira (por exemplo, uma sequência líder que funciona como uma sequência de secreção para controlar o transporte de um polipéptido a partir da célula). 0 polipéptido tendo uma sequência líder é uma pré-proteína e pode ter a sequência líder clivada pela célula hospedeira para formar a forma madura do polipéptido. Os polinucleótidos também podem codificar uma pró-proteína que é a proteína madura mais resíduos de aminoácidos a 5' adicionais. A proteína madura tendo uma pró - sequencia é uma pró-proteína e é uma forma inativa da proteína. Após a pró-sequência ser clivada, permanece uma proteína madura ativa.

Em determinadas formas de realização os polinucleótidos compreendem a sequência de codificação para o polipéptido maduro fundido no mesmo quadro de leitura a uma sequência de marcador que permite, por exemplo, a purificação do polipéptido codificado. Por exemplo, a sequência de marcador pode ser uma etiqueta de hexahistidina proporcionada por um vetor pQE-9 para proporcionar a purificação do polipéptido maduro fusionado ao marcador no caso de um hospedeiro bacteriano, ou a sequência de marcador pode ser uma etiqueta de hemaglutinina (HA) derivada a partir da proteína hemaglutinina da gripe quando é utilizado um hospedeiro mamífero (por exemplo, células COS-7). A presente divulgação também diz respeito a variantes dos polinucleótidos descritos acima codificando, por exemplo, fragmentos, análogos e derivados.

Em determinadas formas de realização, a presente divulgação proporciona polinucleótidos isolados compreendendo polinucleótidos tendo uma sequência de nucleótidos pelo menos 80% idêntica, pelo menos 85% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 95% idêntica e. Em algumas formas de realização, pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a um polinucleótido codificando um polipéptido compreendendo um anticorpo ou fragmento do mesmo a um recetor FZD humano descrito no presente documento.

Por um polinucleótido tendo uma sequência de nucleótidos pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma sequência de nucleótidos de referência é entendido que a sequência de nucleótidos do polinucleótido é idêntica à sequência de referência exceto que a sequência de polinucleótido pode incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleótidos da sequência de nucleótidos de referência. Por outras palavras, para obter um polinucleótido tendo uma sequência de nucleótidos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleótidos de referência, até 5% dos nucleótidos na sequência de referência podem ser excluídos ou substituídos por outro nucleótido, ou podem ser inseridos na sequência de referência uma série de nucleótidos até 5% do total de nucleótidos na sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições amino-ou carboxi-terminal da sequência de nucleótidos de referência ou em qualquer lugar entre as essas posições terminais, intercaladas quer individualmente entre os nucleótidos na sequência de referência ou num ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

As variantes de polinucleótidos podem conter alterações nas regiões codificantes, nas regiões não codificantes, ou em ambas. Nalgumas formas de realização, as variantes de polinucleótidos contém alterações que produzem substituições, adições ou eliminações silenciosas, mas não alteram as propriedades ou atividades do polipéptido codificado. Nalgumas formas de realização, as variantes de nucleótidos são produzidas por substituições silenciosas devido à degeneração do código genético. As variantes de polinucleótido podem ser produzidas por uma variedade de razões, por exemplo, para otimizar a expressão do codão para um hospedeiro particular (alteração de codões no ARNm humano para aqueles preferidos por uma série de bactérias tais como E. coli). São também proporcionados vetores e células compreendendo os polinucleótidos descritos no presente documento. IV. Métodos de Utilização e Composições Farmacêuticas

Os agentes de ligação a FZD (incluindo polipéptidos e anticorpos) da divulgação são úteis numa variedade de aplicações incluindo, mas não limitadas a, métodos de tratamento terapêutico, tais como tratamento de cancro. Em determinadas formas de realização, os agentes são úteis para inibir a sinalização de Wnt (por exemplo, sinalização de Wnt canónica), inibir o crescimento tumoral, induzir diferenciação, reduzir o volume tumoral, e/ou reduzir a tumorigenicidade de um tumor. Os métodos de utilização podem ser métodos in vitro, ex vivo, ou in vivo, Em determinadas formas de realização, o anticorpo ou polipéptido ou agente de ligação a FZD é um antagonista de um ou mais recetores frizzled humanos aos quais liga. Em determinadas formas de realização, os agentes ou antagonistas de ligação a FZD são utilizados no tratamento de uma doença associada com a ativação da sinalização de Wnt. Em formas de realização particulares, a doença é uma doença dependente da sinalização de Wnt. Em determinadas formas de realização, a via de sinalização de Wnt é sinalização de Wnt canónica. Em determinadas formas de realização, os agentes ou antagonistas de ligação a FZD são utilizados no tratamento de distúrbios caracterizados por níveis aumentados de células estaminais e/ou células progenitoras.

Em determinadas formas de realização, a doença tratada com o agente ou antagonista de ligação a FZD (por exemplo, um anticorpo anti-FZD) é um cancro. Em determinadas formas de realização, o cancro é caracterizado por tumores dependentes de Wnt. Em determinadas formas de realização, o cancro é caracterizado por tumores expressando um ou mais recetores frizzled aos quais o agente de ligação a FZD (por exemplo, anticorpo) liga. Em determinadas formas de realização, o cancro é caracterizado por tumores expressando um ou mais genes numa assinatura de gene Wnt.

Em determinadas formas de realização, a doença tratada com o agente ou antagonista de ligação a FZD não é um cancro. Por exemplo, a doença pode ser um distúrbio metabólico, tal como obesidade ou diabetes (por exemplo, diabetes de tipo II) (Jin T., Diabetologia, 2008 Out, 51 (10):1771-80). Alternativamente, a doença pode ser um distúrbio ósseo tal como osteoporose, osteoartrite ou artrite reumatoide (Corr M. , Nat Clin Pract Rheumatol, outubro de 2008, 4 (10):550-6,- Day et al. , Bone Joint Surg

Am, Fev 2 008; 90 Suppl 1:19-24) . A doença pode também ser um distúrbio renal, tal como uma doença de rim poliquístico (Harris et ai,, Annu Rev Med, 23 de outubro de 2008; Schmidt-Ott et al. , Kidney Int, Out 2008, 74 (8):1004 - 8,-Benzing et al., J Am Soc Nephrol, maio de 2007, 18 (5) :1389-98) . Alternativamente, podem ser tratados distúrbios oculares, incluindo mas não limitados a, degeneração macular e vitreorretinopatia exsudativa familiar (Lad et al., Stem Cells Dev, 08 de agosto de 2008). Também podem ser tratados distúrbios cardiovasculares, incluindo infarto do miocárdio, aterosclerose e doenças das válvulas, (Al-aiy Z . , Transi Res, Maio de 2008, 151 (5) : 233 - 9 ; Kobayashi et al. , Nat Cell Biol, janeiro de 2009; 11(1):46-55,- Gijn van et al. , Cardiovasc Res, julho de 2002; 55 (1):16-24,-Christman et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol, junho de 2008; 294 (6) :H2864-70) . Nalgumas formas de realização, a doença é um distúrbio pulmonar, tal como hipertensão arterial pulmonar idiopãtica ou fibrose pulmonar (Laumanns et al. , Am J Respir Cell Biol Mol, 21 de novembro de 2008,·. Kônigshof f et al. , PLoS ONE, maio de 2008. 14,-3(5): e2142) . Nalgumas formas de realização, a doença tratada com o agente de ligação a FZD é uma doença do fígado, tal como cirrose ou fibrose hepática (Cheng et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, janeiro de 2008,- 294 (1):G39-49) . A presente divulgação proporciona métodos de tratamento do cancro compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação a FZD a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo com necessidade de tratamento). Em determinadas formas de realização, o cancro é um cancro selecionado a partir do grupo consistindo em cancro colorretal, cancro pancreático, cancro de pulmão, cancro do ovário, cancro do fígado, cancro da mama, cancro renal, cancro da próstata, cancro do trato gastrointestinal, melanoma, cancro do colo do útero, cancro da bexiga, glioblastoma e cancro da cabeça e pescoço. Em determinadas formas de realização, o cancro é um cancro pancreãtico. Em determinadas formas de realização, o cancro é cancro colorretal. Em determinadas formas de realização, o indivíduo é um ser humano. A presente divulgação proporciona adicionalmente métodos para inibir o crescimento tumoral utilizando os anticorpos ou outros agentes descritos no presente documento. Em determinadas formas de realização, o método para inibir o crescimento tumoral compreende contactar a célula com um agente de ligação a FZD (por exemplo, anticorpo) in vitro. Por exemplo, uma linha celular imortalizada ou uma linha celular de cancro que expressa o(s) FZD(s) alvo(s) é cultivada em meio ao qual é adicionado o anticorpo ou outro agente para inibir o crescimento tumoral. Nalgumas formas de realização, as células tumorais são isoladas a partir de uma amostra do paciente tal como, por exemplo, uma biópsia de tecido, efusão pleural ou amostra de sangue e cultivadas em meio ao qual é adicionado um agente de ligação a FZD para inibir o crescimento tumoral.

Nalgumas formas de realização, o método para inibir o crescimento tumoral compreende contactar as células tumorais ou o tumor com o agente de ligação a FZD (por exemplo, anticorpo) in vivo. Em determinadas formas de realização, o contacto de uma célula de tumor ou tumor com um agente de ligação a FZD é realizado num modelo animal. Por exemplo, podem ser administrados agentes de ligação a FZD a xenoenxertos expressando um ou mais FZDs que foram cultivados em ratinhos imunocomprometidos (por exemplo, ratinhos NOD/SCID) para inibir o crescimento tumoral. Nalgumas formas de realização, são isoladas células estaminais cancerígenas a partir de uma amostra do paciente tal como, por exemplo, uma biópsia de tecido, efusão pleural ou amostra de sangue e injetadas em ratinhos i munoc omp rome tidos que são então administrados com um agente de ligação a FZD para inibir o crescimento de células tumorais. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a FZD é administrado ao mesmo tempo ou pouco depois da introdução de células tumorigénicas no animal para prevenir o crescimento tumoral. Nalgumas formas de realização, o agente de ligação a FZD é administrado como um produto terapêutico após as células tumorigénicas terem crescido até um tamanho especificado.

Em determinadas formas de realização, o método para inibir o crescimento tumoral compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação a FZD. Em determinadas formas de realização, o indivíduo é um ser humano. Em determinadas formas de realização, o indivíduo tem um tumor ou teve um tumor removido.

Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor no qual a sinalização de Wnt está ativa. Em determinada forma de realização, a sinalização de Wnt que está ativa é a sinalização de Wnt canónica. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor dependente de Wnt. Por exemplo, nalgumas formas de realização, o tumor é sensível a sobreexpressão de axina. Em determinadas formas de realização, o tumor não compreende uma mutação de inativação (por exemplo, uma mutação de truncamento) no gene supressor de tumor de polipose adenomatosa coli (APe) ou uma mutação ativadora no gene da beta-catenina. Em determinadas formas de realização, o tumor expressa um ou mais genes numa assinatura de gene Wnt. Em determinadas formas de realização, o cancro para o qual um indivíduo está a ser tratado envolve um tal tumor. Em determinadas formas de realização, o tumor expressa o um ou mais recetores frizzled humanos aos quais o agente ou anticorpo de ligação a FZD liga. Em determinadas formas de realização, o tumor sobreexpressa o(s) recetor(es) frizzled humano(s).

Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor selecionado a partir do grupo consistindo em tumor colorretal, tumor pancreático, tumor de pulmão, tumor do ovário, tumor do fígado, tumor da mama, tumor renal, tumor da próstata, tumor gastrointestinal, melanoma, tumor do colo do útero, tumor da bexiga, glioblastoma e tumor da cabeça e pescoço. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor colorretal. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor pancreático. A divulgação também proporciona um método para inibição da sinalização de Wnt numa célula compreendendo contactar a célula com uma quantidade eficaz de um agente de ligação a FZD. Em determinadas formas de realização, a célula é uma célula tumoral. Em determinadas formas de realização, o método é um método in vivo em que a etapa de contactar a célula com o agente compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente ao indivíduo. Nalgumas formas de realização alternativas, o método é um método in vitro ou ex vivo. Em determinadas formas de realização, a sinalização de Wnt que é inibida é a sinalização de Wnt canónica. Em determinadas formas de realização, a sinalização de Wnt é sinalização por WNT1, WNT2, WNT3, WNT3A, Wnt7a, WNT7b e/ou WNT10B. Em determinadas formas de realização, a sinalização de Wnt é sinalização por WNT1, WNT3A, WNT7b e/ou WNT10B. Além disso, a divulgação proporciona um método para reduzir a tumorigenicidade de um tumor num indivíduo, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação a FZD ao indivíduo, Em determinadas formas de realização, o tumor compreende células estaminais cancerígenas. Em determinadas formas de realização, a frequência de células estaminais cancerígenas no tumor é reduzida pela administração do agente.

Consequentemente, a divulgação também proporciona um método para reduzir a frequência de células estaminais cancerígenas num tumor, compreendendo contactar o tumor com uma quantidade eficaz de um agente de ligação a FZD (por exemplo, um anticorpo anti-FZD). A divulgação proporciona adicionalmente métodos de diferenciação das células tumorigénicas em células não tumorigénicas compreendendo contactar as células tumorigénicas com um agente de ligação a FZD (por exemplo, por administração do agente de ligação a FZD a um indivíduo que tem um tumor compreendendo as células tumorigénicas ou aquele que tenha tido um tal tumor removido. Em determinadas formas de realização, as células tumorigénicas são células tumorais pancreáticas. Em determinadas formas de realização alternativas, as células tumorigénicas são células tumorais do cólon.

Também é proporcionada a utilização dos agentes de ligação a FZD, polipéptidos, ou anticorpos descritos no presente documento para induzir a diferenciação de células, incluindo mas não limitadas a células tumorais. Por exemplo, são visados métodos para induzir a diferenciação de células compreendendo contactar as células com uma quantidade eficaz de um agente de ligação a FZD (por exemplo, um anticorpo anti-FZD) descritos no presente documento. São também proporcionados métodos para induzir a diferenciação de células de um tumor num indivíduo compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, polipéptido ou agente de ligação a FZD ao indivíduo. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor pancreático. Em determinadas formas de realização, o tumor é um tumor do cólon. São adicionalmente proporcionados métodos para tratar uma doença ou distúrbio num indivíduo, em que a doença ou distúrbio está associado com a ativação da sinalização de Wnt e/ou é caracterizado por um nível aumentado de células estaminais e/ou células progenitoras. Nalgumas formas de realização, os métodos de tratamento incluem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou polipéptido ou agente de ligação a FZD ao indivíduo. Em determinadas formas de realização, a sinalização de Wnt é sinalização de Wnt canónica. A presente divulgação proporciona adicionalmente métodos para reduzir a ativação de miofibroblastos no estroma de um tumor sólido, compreendendo contactar o estroma com uma quantidade eficaz do agente de ligação a FZD, polipéptido ou anticorpo. A presente divulgação proporciona adicionalmente composições farmacêuticas compreendendo um ou mais dos agentes de ligação a FZD descritos no presente documento. Em determinadas formas de realização, as composições farmacêuticas compreendem adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Estas composições farmacêuticas encontram utilidade na inibição do crescimento tumoral e no tratamento do cancro em pacientes humanos.

Em determinadas formas de realização, são preparadas formulações para armazenamento e utilização através da combinação de um anticorpo ou agente purificado da presente divulgação com um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, portador, excipiente) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edição Mack Publishing, 2000) . Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a, tampões não tóxicos, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos,· sais tais como cloreto de sódio; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (por exemplo, cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametõnio, cloreto de benzalcónio; cloreto de benzetónio, álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol ,-ciclohexanol,· 3-pentanol,-e m-cresol) ; polipéptidos de baixa massa molecular (por exemplo, menos do que cerca de 10 resíduos de aminoácidos), proteínas tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; hidratos de carbono tais como monossacarídeos, dissacarídeos, glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraiões formadores de sais tais como sódio,· complexos metálicos (por exemplo, complexos Zn-proteína) e tensioativos não iónicos tais como TWEEN ou polietilenoglicol (PEG).

As composições farmacêuticas da presente divulgação podem ser administradas de uma série de maneiras para o tratamento local ou sistémico. A administração pode ser tópica (tal como nas membranas mucosas, incluindo administração vaginal e retal), tais como adesivos transdérmicos, pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós; pulmonar (por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica); oral; ou parentérica, incluindo injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; ou administração intracraniana (por exemplo, intratecal ou intraventricular). A formulação terapêutica pode ser em forma farmacêutica unitária. Tais formulações incluem comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões em água ou não aquoso, ou supositórios para administração oral, parentérica ou retal, ou para administração por inalação. Em composições sólidas tais como comprimidos o ingrediente ativo principal é misturado com um portador farmacêutico. Os ingredientes de comprimidos convencionais incluem amido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, ácido esteárico, talco, estearato de magnésio, fosfato dicálcico ou gomas e outros diluentes (por exemplo, água) para formar uma composição de pré-formulação sólida contendo uma mistura homogénea de um composto da presente divulgação, ou um sal farmaceuticamente aceitável não tóxico do mesmo. A composição de pré-formulação sólida é então subdividida em formas farmacêuticas unitárias do tipo descrito acima. Os comprimidos, pílulas, etc. das novas composições podem ser revestidos ou de outro modo compostos para proporcionar uma forma farmacêutica oferecendo a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, o comprimido ou pílula pode compreender uma composição interna revestida por um componente externo. Além disso, os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração e permite que o componente interno passe intacto através do estômago ou tenha libertação retardada. Pode ser utilizada uma variedade de materiais para tais revestimentos ou camadas entéricas, tais materiais incluindo uma série de ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com materiais tais como goma-laca, álcool cetílico e acetato de celulose.

Os anticorpos ou agentes também podem ser capturados em microcápsulas. Tais microcápsulas são preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato) , respetivamente, em sistemas de distribuição de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões conforme descrito em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 2 0a Ed. Mack Publishing (2000) .

Em determinadas formas de realização, as formulações farmacêuticas incluem anticorpos ou outros agentes da presente divulgação complexados com lipossomas (Epstein et al. , 1985, Proc. Acad. Natl Sci EUA 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc. Acad. Natl. Sci EUA 77:4030; e Patentes U.S. 4.485.045 e 4.544.545). São divulgados lipossomas com tempo de circulação potenciado na Patente U.S. 5.013.556. Alguns lipossomas podem ser gerados pela evaporação em fase reversa com uma composição lipídica compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada por PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrudados através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomas com o diâmetro desejado.

Adicionalmente podem ser preparadas preparações de libertação prolongada. Exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados (por exemplo, películas ou microcápsulas). Exemplos de matrizes de libertação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis tais como poli (2-hidroxietil metacrilato) ou poli(álcool vinílico), poliláctidos (Patente U.S. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e 7 etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo não degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis tais como LUPRON DEPOT TM (microsferas injetáveis compostas por copolímeros de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprólido), isobutirato de acetato de sacarose, e ácido poli-D-(-)3-hidroxibutírico.

Em determinadas formas de realização, para além de administrar o agente de ligação a FZD, o método ou tratamento compreende adicionalmente a administração de um segundo agente anti cancro (antes de, concomitantemente com e/ou subsequentemente à administração do agente de ligação a FZD). São também proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo o agente de ligação a FZD e o segundo agente anti cancro.

Será apreciado que a combinação de um agente de ligação a FZD e um segundo agente anti cancro pode ser administrada em qualquer ordem ou concomitantemente. Em formas de realização selecionadas, os agentes de ligação a FZD serão administrados a pacientes que tenham previamente sido submetidos a tratamento com o segundo agente anti cancro. Em determinadas outras formas de realização, o agente de ligação a FZD e o segundo agente anti cancro serão administrados substancialmente simultaneamente ou concomitantemente. Por exemplo, pode ser administrado a um indivíduo o agente de ligação a FZD enquanto sendo submetido a um curso de tratamento com o segundo agente anti cancro (por exemplo, quimioterapia). Em determinadas formas de realização, o agente de ligação a FZD será administrado no prazo de 1 ano após o tratamento com o segundo agente anti cancro. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente de ligação a FZD será administrado no praz de 10, 8, 6, 4 ou 2 meses após o tratamento com o segundo agente anti cancro. Em determinadas outras formas de realização, o agente de ligação a FZD será administrado no prazo de 4, 3, 2 ou 1 semana após qualquer tratamento com o segundo agente anti cancro. Em algumas formas de realização, o agente de ligação a FZD será administrado no prazo de 5, 4, 3, 2 ou 1 dia após qualquer tratamento com o segundo agente anti cancro. Será adicionalmente apreciado que os dois agentes ou o tratamento podem ser administrados ao indivíduo no prazo de horas ou minutos (isto é, substancialmente simultaneamente).

As classes úteis de agentes anti cancro incluem, por exemplo, agentes anti tubulina, auristatinas, ligandos de ADN de sulco menor, inibidores de replicação do ADN, agentes alquilantes (por exemplo, complexos de platina tais como complexos de cisplatina, mono(platina), bis(platina) e platina tri-nuclear e carboplatina), antraciclinas, antibióticos antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etopósidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureias, platinóis, compostos de desempenho, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizadores de radiação, esteroides, taxanos, inibidores de topoisomerase, alcaloides de vinca ou semelhantes. Em determinadas formas de realização, o segundo agente anti cancro é um antimetabolito, um anti mitótico, um inibidor de topoisomerase ou um inibidor de angiogénese.

Os agentes anti cancro que podem ser administrados em combinação com os agentes de ligação a FZD incluem agentes quimioterapêuticos. Consequentemente, nalgumas formas de realização, o método ou tratamento envolve a administração combinada de um anticorpo ou agente da presente divulgação e um agente quimioterapêutico ou cocktail de múltiplos agentes quimioterapêuticos diferentes. 0 tratamento com um anticorpo pode ocorrer antes de, concomitantemente com, ou subsequentemente à administração de quimioterapias. As quimioterapias contempladas pela divulgação incluem substâncias químicas ou fármacos que são conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente, tais como Gemcitabina, Irinotecano, Doxorrubicina, 5-Fluorouracilo, arabinósido de Citosina ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, Bussulfano, Citoxina, TAXOL, Metotrexato, Cisplatina, Melfalano, Vimblastina e Carboplatina. A administração combinada pode incluir a coadministração, quer numa formulação farmacêutica única ou utilizando formulações separadas, ou administração consecutiva em qualquer ordem mas geralmente dentro de um período de tempo tal que todos os agentes ativos possam exercer as suas atividades biológicas simultaneamente. Podem ser utilizados esquemas de preparação e dosagem para tais agentes quimioterapêuticos de acordo com as instruções dos fabricantes ou conforme determinado empiricamente pelo profissional médico. São também descritos esquemas de preparação e dosagem para tal quimioterapia em Chemotherapy Service Ed. M. C. Perry, Williams e Wilkins, Baltimore, Md (1992) .

Os agentes quimioterapêuticos úteis na presente divulgação também incluem, mas não estão limitados a, agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN); sulfonatos de alquilo, tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina, mostardas de azoto tais como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembicina, fenesterina, trofosfamida, prednimustina, mostarda de uracilo; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tais como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, c romomi c i na s, dactinomicina, daunorrubi c ina detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato, análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos da pirimidina tais como ancitabina azacitidina, β-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU, androgénios tais como calusterona, propionato de dromo s t a1onona, epitiostanol mepitiostano, testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetímida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fõlico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida, ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato,· defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio, etoglúcido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lent inano; lonidamina; mitoguazona,· mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK; razoxano; sizofurano; espirogermânio, ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2', 2" -triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa,-taxoides, por exemplo paclitaxel (TAXOL, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.) e doxetaxel (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucilo; gemeitabina; 6 -tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina,· vimblastina; platina; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona, vincristina; vinorelbina; navelbina; tenipósido; novantrona; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ,- ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um acima. Os agentes quimioterapêuticos incluem também agentes anti hormonais que atuam para regular ou inibir a ação hormonal sobre tumores tais como anti estrogénios, incluindo por exemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazóis de inibição de aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston) ; e anti androgénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprólido, goserelina; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um acima.

Em determinadas formas de realização, o agente quimioterapêutico é um inibidor de topoisomerase. Os inibidores de topoisomerase são agentes quimioterapêuticos, que interferem com a ação de uma enzima topoisomerase (por exemplo, topoisomerase I ou II) . Os inibidores da topoisomerase incluem, mas não estão limitados a, doxorrubicina HC1, citrato de daunorubicina, mitoxantrona HCL, actinomicina D, etopósido, Topotecan HCL, tenipósido (VM-26) e irinotecano. Em determinadas formas de realização, o segundo agente anti cancro é irinotecano. Em determinadas formas de realização, o tumor a ser tratado é um tumor colorretal e o segundo agente anti cancro é um inibidor de topoisomerase, tal como irinotecano.

Em determinadas formas de realização, o agente quimioterapêutico é um antimetabolito. Um antimetabolito é um composto químico com uma estrutura semelhante a um metabolito, necessário para reações bioquímicas normais, mas suficientemente diferente para interferir com uma ou mais funções normais das células, tais como a divisão celular. Os antimetabolitos incluem, mas não estão limitados a, gemcitabina, fluorouracilo, capecitabina, metotrexato de sódio, ralitrexed, Pemetrexed, tegafur, arabinósido de citosina, TIOGUANINA (G1axoSmithKline), 5-azacitidina, 6-mercaptopurina, azatioprina, 6 -tioguanina, pentostatina, fosfato de fludarabina e cladribina, bem como sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos mesmos. Em determinadas formas de realização, o segundo agente anti cancro é gemcitabina. Em determinadas formas de realização, o tumor a ser tratado é um tumor pancreático e o segundo agente anti cancro é um antimetabolito (por exemplo, gemcitabina).

Em de t e rmi nada s formas de realização, o agente quimioterapêutico é um agente anti mitótico, incluindo mas não limitado a, agentes que ligam a tubulina. Por meio de exemplo não limitante, o agente compreende um taxano. Em determinadas formas de realização, o agente compreende paditaxei ou docetaxel, ou um sal farmaceuticamente aceitável, ácido, ou derivado de paclitaxel ou docetaxel. Em determinadas formas de realização, o agente é paclitaxel (TAXOL), docetaxel (TAXOTERE), paclitaxel ligado a albumina (por exemplo, ABRAXANE), DHA-paclitaxei ou PG-paclitaxel. Em determinadas formas de realização alternativas, o agente anti mitótico compreende um alcaloide de vinca, tal como vincristina, vimblastina, vinorelbina ou vindesina, ou sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados dos mesmos. Nalgumas formas de realização, o agente anti mitótico é um inibidor de quinesina Eg5 ou um inibidor de uma quinase mitótica tal como Aurora A ou Plkl. Em determinadas formas de realização onde o agente quimioterapêutico administrado em combinação com o anticorpo ou polipéptido ou agente de ligação a FZD compreende um agente anti mitótico, o cancro ou tumor a ser tratado é cancro da mama ou um tumor de mama.

Em determinadas formas de realização, o tratamento envolve a administração combinada de um anticorpo (ou outro agente) da presente divulgação e radioterapêutica. 0 tratamento com o anticorpo (ou agente) pode ocorrer antes de, simultaneamente com, ou subsequentemente à administração de radioterapêutica. Quaisquer esquemas de dosagem para tal radioterapêutica podem ser utilizados conforme determinado pelo profissional médico.

Nalgumas formas de realização, o segundo agente anti cancro compreende um anticorpo. Consequentemente, o tratamento pode envolver a administração combinada de anticorpos (ou outros agentes) da presente divulgação com outros anticorpos contra antigénios associados a tumor adicionais incluindo, mas não limitados a, anticorpos que ligam a EGFR, ErbB2, HER2, DLL4, Notch e/ου VEGF. São descritos anticorpos anti-DLL4 exemplares, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente N.°. 2008/0187532. Em determinadas formas de realização, o segundo agente anti cancro é um anticorpo que é um inibidor de angiogénese (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF). São descritos anticorpos anti-DLL4 adicionais, por exemplo, nas Publicações Internacionais de Patente N.°s. WO 2008/091222 e WO 2008/0793326, e nas publicações de pedidos de patente U.S. N.°s. US 2008/0014196, US 2008/0175847, US 2008/0181899, e US 2008/0107648. São descritos anticorpos anti-Notch exemplares, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente U.S. N.°. US 2008/0131434. Em determinadas formas de realização, o segundo agente anti cancro é um anticorpo que é um inibidor de angiogénese (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF). Em determinadas formas de realização, o segundo agente anti cancro é um inibidor da sinalização de Notch. Em determinadas formas de realização, o segundo agente anti cancro é AVASTIN (Bevacizumab), Herceptin (Trastuzumab), VECTIBIX (Panitumumab), ou Erbitux (Cetuximab). A administração combinada pode incluir coadministração, quer numa formulação farmacêutica única ou utilizando formulações separadas, ou administração consecutiva em qualquer ordem mas geralmente dentro de um período de tempo tal que todos os agentes ativos possam exercer as suas atividades biológicas simultaneamente.

Além disso, o tratamento pode incluir a administração de uma ou mais citocinas (por exemplo, linfocinas, interleucinas, fatores de necrose tumoral, e/ou fatores de crescimento) ou pode ser acompanhado pela remoção cirúrgica das células de cancro ou qualquer outra terapêutica considerada necessária por um profissional clínico.

Para o tratamento da doença, a dosagem adequada de um anticorpo ou agente da presente divulgação depende do tipo de doença a ser tratada, da gravidade e do curso da doença, da capacidade de resposta da doença, de se o anticorpo ou agente é administrado para propósitos terapêuticos ou preventivos, terapêutica prévia, história clínica do paciente, e assim por diante ao critério do profissional clínico. 0 anticorpo ou agente pode ser administrado uma vez ou durante uma série de tratamentos durando desde vários dias até vários meses, ou até ser efetuada uma cura ou ser atingida uma diminuição do estado de doença (por exemplo: redução do tamanho do tumor). Podem ser calculados esquemas de dosagem ótimos a partir de medições de acumulação do fármaco no corpo do paciente e variarão de acordo com a potência relativa de um anticorpo ou agente individual. 0 profissional clínico responsável pela administração pode facilmente determinar dosagens ótimas, metodologias de dosagem e taxas de repetição. Em determinadas formas de realização, a dosagem é de 0,01 pg a 100 mg por kg de peso corporal, e pode ser administrada uma ou mais vezes diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente. Em determinadas formas de realização, o anticorpo ou outro agente de ligação a FZD é administrado uma vez cada duas semanas ou uma vez cada três semanas. Em determinadas formas de realização, a dosagem do anticorpo ou outro agente de ligação a FZD é desde cerca de 0,1 mg até 20 mg por kg de peso corporal. 0 profissional clínico pode estimar taxas de repetição para dosagem com base nos tempos de residência medidos e nas concentrações do fármaco em fluidos corporais ou tecidos. V. Assinatura de gene Wnt e utilizações da mesma A presente divulgação proporciona adicionalmente uma assinatura de gene Wnt, uma assinatura de gene indicativa de atividade de sinalização de Wnt em tumores, que pode ser utilizada na seleção de tumores, pacientes e/ou terapêuticas. A assinatura de gene Wnt compreende a expressão diferencial de um conjunto de genes em tumores nos quais a sinalização de Wnt está ativada (e/ou que são dependentes de sinalização de Wnt), em relação aos tumores nos quais a sinalização de Wnt não está ativada. Em determinadas formas de realização, a sinalização de Wnt é sinalização de Wnt canónica. A assinatura de gene Wnt é útil para a identificação de tumores e/ou pacientes com probabilidade de responder a tratamento com um inibidor da via de sinalização de Wnt (por exemplo, um agente de ligação a FZD que é um antagonista de pelo menos um recetor frizzled humano e/ou um inibidor da sinalização de Wnt).

Em determinadas formas de realização, a assinatura de gene Wnt compreende um ou mais genes (isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 genes) listados no Quadro 3, abaixo. Os números de "ID do Conjunto de Sonda" são os números ID do conjunto de sonda para GeneChipe® Human Genome U133 Plus 2.0 Array ("HG_U133_Plus_2"; Affymetrix, Santa Clara, CA) . Nos tumores nos quais a sinalização de Wnt está ativa (isto é, tumores que são positivos para uma assinatura de gene Wnt) , o(s) nível(is) de expressão do(s) gene(s) no Quadro 3 que compreende (m) a assinatura de gene Wnt são elevados em relação aos tumores nos quais a sinalização de Wnt não está ativa. Nalgumas formas de realização, a assinatura de gene Wnt compreende dois ou mais genes relacionados no Quadro 3, abaixo. Nalgumas formas de realização, a assinatura de gene Wnt compreende três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, onze ou mais, doze ou mais, treze ou mais, catorze ou mais, quinze ou mais, dezasseis ou mais, dezassete ou mais, dezoito ou mais, ou dezanove dos genes listados no Quadro 3, abaixo. Em determinadas formas de realização, o tumor a ser avaliado para níveis de expressão de um ou mais genes no Quadro 3 é um tumor colorretal. Em determinadas formas de realização, a assinatura de gene Wnt compreende AXIN2 e/ou F0XQ1. Em determinadas formas de realização, o tumor ê um tumor colorretal e a assinatura de gene Wnt compreende AXIN2, LGR5 e/ou F0XQ1.

Quadro 3. Genes de assinatura de qenes Wnt exemplares

São também proporcionados métodos para utilizar a assinatura de gene Wnt para selecionar pacientes (ou para identificar um paciente) adequado para tratamento com um inibidor da via de Wnt ou para avaliar a eficácia de uma terapêutica particular. Em determinadas formas de realização, o inibidor da sinalização de Wnt é Um agente de ligação a FZD, tal como um anticorpo FZD antagonístico. Por exemplo, um paciente pode ser identificado como sendo adequado para o tratamento com um agente de ligação a FZD (ou agentes de ligação a FZD) pela determinação de se um tumor no paciente ou que tenha sido removido a partir do paciente exibe uma assinatura de gene Wnt. Em determinadas formas de realização, a deteção da assinatura de gene Wnt compreende avaliar o nível de expressão de um ou mais genes no Quadro 3 no tumor. Se os níveis de expressão do um ou mais genes na Quadro 3 que compreendem a assinatura de gene Wnt são elevados no tumor consequentemente indicando que a sinalização de Wnt está ativa no tumor), o paciente é identificado como sendo adequado para tratamento com um agente de ligação a FZD, tal como um anticorpo anti-FZD que inibe a sinalização de Wnt. São da mesma forma proporcionados métodos para utilizar a assinatura de gene Wnt para selecionar uma terapêutica adequada para um paciente em particular. A divulgação proporciona um método de tratamento do cancro num paciente tendo um tumor ou a partir do qual foi retirado um tumor, compreendendo (a) proporcionar o nível de expressão de um ou mais genes no Quadro 3 no tumor (b) selecionar o paciente para iniciar ou continuar o tratamento com um agente de ligação a FZD com base no nível de expressão de um ou mais genes, e (c) administrar o agente de ligação a FZD ao paciente. Em determinadas formas de realização, o método compreende a medição do nível de expressão de um ou mais genes no tumor. Em determinadas formas de realização, o nível de expressão de um ou mais genes é comparado com um nível de controlo ou de referência. São também proporcionados métodos de identificação de tumores que podem ser sensíveis ao tratamento com um inibidor da sinalização de Wnt. Em determinadas formas de realização, o inibidor da via de sinalização de Wnt é um agente de ligação a FZD. Em determinadas formas de realização, os métodos compreendem testar o tumor para uma assinatura de gene Wnt. Em determinadas formas de realização, os métodos compreendem a avaliação do nível de expressão de um ou mais genes no Quadro 3 no tumor. São também proporcionados métodos de rastreio de candidatos a fármaco contra tumores identificados como exibindo a assinatura de gene Wnt. Em determinadas formas de realização, os candidatos a fármaco são inibidores da sinalização de Wnt. Tais candidatos a fármaco são preferentemente testados para eficácia naqueles tumores nos quais a sinalização de Wnt está ativa e/ou que são dependentes de sinalização de Wnt. A presente divulgação também proporciona um método de rastreio de um candidato a fármaco compreendendo a avaliação do nível de expressão de um ou mais genes no Quadro 3 num tumor (b) seleção do tumor para testagem com o candidato a fármaco com base (pelo menos em parte) no nível de expressão de um ou mais genes, e (c) testagem do efeito do candidato a fármaco sobre o tumor.

Além disso, em determinadas formas de realização, o efeito de um fármaco sobre a assinatura de gene Wnt pode ser determinado e utilizado para avaliar a eficácia do tratamento de um tumor no qual a sinalização de Wnt está ativa. Em determinadas formas de realização, isto proporciona um método de monitorização do tratamento de um paciente. Nalgumas formas de realização alternativas, isto proporciona um método de avaliação da eficácia de um candidato a fármaco. Em determinadas formas de realização, uma diminuição dos níveis de expressão de um ou mais genes no Quadro 3 (isto é, uma redução ou eliminação da assinatura de gene Wnt) indica a eficácia do tratamento.

Em determinadas formas de realização, a avaliação do nível de um ou mais genes numa assinatura de um gene Wnt compreende a determinação dos níveis de expressão dos polinucleótidos de um ou mais genes. Em determinadas formas de realização, a deteção de uma assinatura de gene Wnt compreende detetar a expressão de ARNm de polinucleótidos do um ou mais genes que compreendem a assinatura. Nalgumas formas de realização, a deteção da expressão de ARNm é através de Northern blot. Em algumas formas de realização, a deteção da expressão de ARNm é através de RT-PCR, PCR em tempo real ou PCR quantitativa utilizando conjuntos de iniciadores que amplificam os polinucleótidos compreendendo a assinatura de células estaminais cancerígenas. Em determinadas formas de realização, a deteção de ARNm compreende a exposição de uma amostra a sondas de ácido nucléico complementares a polinucleótidos compreendendo uma assinatura de gene de células estaminais cancerígenas. Nalgumas formas de realização, o ARNm da amostra é convertido em ADNc antes da deteção. Nalgumas formas de realização, a deteção de ARNm é através de microarranjos que compreendem polinucleótidos que hibridam com um ou mais genes na assinatura de gene Wnt.

Em determinadas formas de realização, a avaliação do nível de um ou mais genes numa assinatura de gene Wnt compreende a deteção de polipéptidos codificados por um ou mais genes. Nalgumas formas de realização, a avaliação dos níveis dos produtos de expressão do polipéptido do um ou mais genes compreende a exposição de uma amostra a anticorpos específicos para os polipéptidos e a deteção da ligação de anticorpos aos polipéptidos através de, por exemplo, imunofluorescência quantitativa ou ELISA. São conhecidos outros meios de deteção por um perito na especialidade, veja-se por exemplo a Patente U.S. N.°. 6.057.105. É também proporcionado um arranjo compreendendo polinucleótidos que hibridam em condições de restringência com um ou mais genes no Quadro 3. Também é proporcionado um kit compreendendo o arranjo.

Também são proporcionados kits compreendendo os anticorpos que ligam ao produto de expressão de um ou mais genes no Quadro 3.

VI. Kits compreendendo agentes de ligação a FZD A presente divulgação proporciona kits que compreendem os anticorpos ou outros agentes descritos no presente documento e que podem ser utilizados para realizar os métodos descritos no presente documento. Em determinadas formas de realização, um kit compreende pelo menos um anticorpo purificado contro um ou mais recetores frizzled humanos num ou mais recipientes. Nalgumas formas de realização, os kits contêm todos os componentes necessários e/ou suficientes para realizar um ensaio de deteção, incluindo todos os controlos, instruções para a realização de ensaios, e qualquer software necessário para análise e apresentação de resultados. Um perito na especialidade reconhecerá facilmente que os anticorpos ou agentes divulgados da presente divulgação podem ser prontamente incorporados num dos formatos de kit estabelecidos que são bem conhecidos na técnica. São adicionalmente proporcionados kits compreendendo um agente de ligação a FZD (por exemplo, um anticorpo de ligação a FZD) bem como um segundo agente anti cancro. Em determinadas formas de realização, o segundo agente anti cancro é um agente quimioterapêutico (por exemplo, gemcitabina ou irinotecano). Em determinadas formas de realização, o segundo agente anti cancro é um inibidor da angiogénese. Em determinadas formas de realização, o segundo agente anti cancro é um inibidor da sinalização de Notch (por exemplo, um anti-DLL4 ou anticorpo anti Notch).

Também são proporcionados kits compreendendo um agente de ligação a FZD e um reagente ou reagentes para avaliar a expressão de um ou mais genes no Quadro 3, acima ("Genes de assinatura de gene Wnt exemplares ").

As formas de realização da presente divulgação podem ser adicionalmente definidas por referência aos seguintes exemplos não limitantes, que descrevem em detalhe a preparação de determinados anticorpos da presente divulgação e métodos para utilizar os anticorpos da presente divulgação. Será aparente para os peritos na especialidade podem ser praticadas que muitas modificações, tanto para materiais como para os métodos, sem se afastar do âmbito da presente divulgação.

EXEMPLOS É entendido que os exemplos e formas de realização descritos no presente documento são somente para fins ilustrativos e que serão sugeridas várias modificações ou alterações à luz das mesmas aos peritos na especialidade e destinam-se a ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido.

Exemplo 1

Identificação/geração de anticorpos anti-FZD

Os anticorpos humanos que reconhecem especificamente um ou mais recetores frizzled humanos podem ser isolados utilizando exibição de fagos. Por exemplo, uma biblioteca de anticorpos sintéticos contendo domínios variáveis de anticorpos humanos pode ser ampliada para reconhecimento específico e de alta afinidade do domínio extracelular do recetor FZD7 humano. Após ter sido identificado um Fab específico com as características desejadas, as regiões variáveis humanas do Fab são então clonadas num vetor de expressão de Ig contendo cadeia pesada e cadeia leve (capa ou lambda) de IgG2 humana para expressão de anticorpos humanos em células CHO.

Foi utilizada exibição de fagos para identificar um Fab específico, 18R8, que liga ao domínio extracelular de FZD7. Foram incubadas 2 x 1013 partículas de fago exibindo Fab a partir de uma biblioteca de fagos Fab humanos com proteína FZD7 ECD Fc recombinante imobilizada passivamente. Os fagos não específicos foram lavados e posteriormente os fagos específicos foram eluídos com DTT. 0 produto eluído foi utilizado para infetar bactérias TGI F+, resgatado com fago auxiliar. A exibição de Fab foi então induzida com IPTG (0,25 mM) . O resultado deste primeiro ciclo resgatado serviu como o ponto de partida para ciclos adicionais de seleção. As seleções foram continuadas até ao 3 ciclo, e posteriormente o produto foi rastreado em ELISA para Fabs específicos para a proteína recombinante FZD7 ECD Fc. Foi identificado um Fab que ligou especificamente a FZD7 humano.

Foram obtidas as sequências das regiões variáveis do Fab identificados. Foi removido um sítio de glicosilação N-ligado a partir da sequência parental por meio de mutagénese direcionada ao local. O sítio de glicosilação N-ligado, Asn, na CDR1 de cadeia pesada foi alterado para

His. Esta mutação foi realizada para evitar glicosilação durante a expressão em sistemas de mamíferos. 0 Fab resultante foi designado 18R8. As sequências de CDR de cadeia pesada e de cadeia leve 18R8 são mostradas no Quadro 4, abaixo. As sequências de VH e VL de 18R8 são proporcionadas nas SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12, respetivamente.

Quadro 4. CDRs de anticorpos humanos IS RS e 18R5

Foi gerado Anti-FZD Fab 18R5 através de associação das cadeias de VH-CH1 de 18R8 Fab com uma variedade de cadeias de VL-CL a partir da biblioteca de fago Fab original a partir da qual 18R8 foi identificado. 18R5 foi isolado a partir da biblioteca após três ciclos de ampliação com a proteína recombinante FZD7 ECD Fc imobilizada. As sequências das CDRs de 18R5 são apresentadas no Quadro 4, acima. A VL do anticorpo 18R5 tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 14. As CDRs de cadeia pesada e a VH do anticorpo 18R5 são idênticos às do anticorpo 18R8.

As regiões variáveis humanas dos Fabs 18R8 e 18R5 foram clonadas em vetor de expressão Ig contendo cadeia pesada IgG2 e cadeia leve (lambda) humanas do anticorpo IgG 18R8 para expressão em células CHO. A sequência de aminoãcidos de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo IgG 18R8 (incluindo sequências sinal) são proporcionadas na SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 13, respetivamente. A sequência sinal no terminal N da sequência de aminoãcidos de cada uma das cadeias é clivada após a secreção. As sequências de ácido nucléico codificando as cadeias pesada e leve do anticorpo IgG 18R8 são proporcionadas nas SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20, respetivamente. A sequência de aminoãcidos de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo IgG 18R5 são proporcionadas nas SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 15, respetivamente. (Novamente, a sequência sinal N-terminal da sequência de aminoãcidos de cada uma das cadeias é clivada após a secreção.) Os ácidos nucléicos codificando as cadeias pesada e leve do anticorpo IgG 18R5 são proporcionados nas SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 22, respetivamente. Foi utilizada purificação da proteína A para purificar os anticorpos.

As KDs dos anticorpos 18R8 e 18R5 foram determinadas utilizando o sistema Biacore 2000 da Biacore Lifescience (GE Healthcare). Especificamente, foram diluídos em série anticorpos anti-FZD7 purificados em incrementos de 2 vezes a partir de 100 a 0,78 nM em HBS-P (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, Tensioativo P20 0,005% v/v). Cada diluição foi testada contra proteínas FZD Fc recombinantes imobilizadas num chip Biacore CM5. As taxas de associação e dissociação foram medidas e os valores de KD foram determinados utilizando o programa Biaevaluation (Quadro 5, abaixo). Quadro 5. Afinidade de anticorpos IgG 18R5 e 18R8 18R8 18R5 FZD KD (Nm) Kr, (Nm) 1 15,6 4,6 2 6,2 3,3 5 4,2 1,9 7 5,2 1,8 8 29,3 5,8

Exemplo 2 A análise FACS de anticorpos anti-FZD demonstra ligação a múltiplos FZDs humanos de superfície celular

Foi utilizada análise de citometria de fluxo para determinar a capacidade dos anticorpos de ligar a proteínas FZD expressas na superfície celular.

Para possibilitar a expressão robusta de superfície celular de proteínas FZDs selecionadas, foram gerados plasmídeos de expressão de mamífero compreendendo um promotor CMV a montante dos polinucleótidos codificando o FZD utilizando tecnologia de ADN recombinante padrão (tais construções foram denominadas "FL sem FLAG"). Foram gerados plasmídeos de expressão semelhantes para cada uma das dez proteínas frizzled humanas. Foram também preparadas versões alternativas dos vetores de expressão FZD nas quais foram também gerados polinucleótidos codificando uma sequência sinal N-terminal-etiqueta de epítopo FLAG fusionada ao terminal N da proteína FZD madura por tecnologia recombinante padrão (tais construções foram denominadas "FL flag"). Adicionalmente, foram desenhados plasmídeos de expressão que codificaram proteínas quiméricas compostas pelo domínio CRD (também referido como o domínio "fri") de FZD ou do domínio extracelular N-terminal de toda a proteína FZD fundida a um sequência sinal N-terminal-epítopo FLAG (denominados "fri flag" e " ECD flag", respetivamente), bem como uma secção C-terminal codificando o domínio transmembrana e citoplasmático da proteína CD4 humana.

Para medir a ligação do anticorpo a FZD por citometria de fluxo foram co-transfetadas células HEK293 com vetores de expressão FZD e o marcador de transfeção GFP. Vinte e quatro a quarenta e oito horas após a transfeção, as células foram recolhidas em suspensão e incubadas em gelo com anticorpos anti-FZD (10 pg/ml a menos que indicado de outro modo) ou IgG controlo para deteção da ligação de anticorpos de fundo. As células foram lavadas e foram detetados anticorpos primários com anticorpos secundários específicos de domínio Fc conjugados a um cromóforo fluorescente (por exemplo, anti-IgG humana conjugada com ficoeritrina). As células etiquetadas foram então analisadas por citometria de fluxo para identificar anticorpos anti-FZD que reconhecem especificamente a expressão de superfície celular da proteína FZD. Os anticorpos monoclonais 18R5 e 18R8 reconheceram FZD nas células transfetadas. Conforme mostrado na Figura 1 e Figura 2, tanto 18R8 como 18R5 ligam a múltiplos FZDs incluindo FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8. Para examinar a capacidade relativa de 18R8 e 18R5 de ligar a cada proteína FZD, foi realizada análise de titulação na qual a quantidade de anticorpos na reação de ligação foi variada (Figura 2) . Esta análise demonstrou que 18R5 exibiu potência de ligação mais elevada para cada um dos recetores FZD (FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8) do que 18R8.

Exemplo 3

Inibição da Sinalização de Wnt por 18R8 e 18R5 A capacidade dos anticorpos IgG anti-FZD 18R8 e 18R5 de bloquear a ativação da via de sinalização de Wnt foi determinada in vitro utilizando ensaios de repórter de luciferase.

Foram cultivadas células STF293 em DMEM suplementado com antibióticos e FCS 10%. As células STF293 são 293 células nas quais foram integrados de forma estável os seguintes: (1) um vetor repórter 8xTCF Luc contendo sete cópias do sítio de ligação a TCF ligado a um promotor a montante de um gene repórter de luciferase de pirilampo para medir os níveis de sinalização de Wnt canónica (Gazit et al., 1999, Oncogene 18:5959-66) e (2) um repórter de luciferase Renilla (PromegaMadison, WI) como um controlo interno para a eficácia de transfeção. As células foram adicionadas a placas de culturas. Os anticorpos de FZD a serem testados (ou sem anticorpos) foram adicionados. As células foram então incubadas na presença ou ausência de um meio condicionado com Wnt3A que foi preparado a partir de células L que expressam Wnt3a de forma estável (ATCC CRL-2647) ou meio condicionado de controlo a partir de células L não sobreexpressando Wnt3A (linha celular ATCC CRL-2648). Após incubação durante a noite, os níveis de luciferase foram medidos utilizando um kit de ensaio duplo de luciferase (Promega, Madison, WI), com atividade luciferase de pirilampo normalizada para a atividade luciferase Renilla. A capacidade dos anticorpos 18R8 e 18R5 de inibir a ativação da via induzida por Wnt foi consequentemente determinada. As células STF293 foram tratadas com diferentes concentrações de anticorpos IgG 18R8 e 18R5 e foi adicionado meio condicionado com Wnt 3A. As células foram analisadas 18 horas mais tarde utilizando o kit de ensaio duplo de luciferase. Os resultados são mostrados na Figura 3. Foi observada maior inibição da sinalização de TCF da via de Wnt3a com o anticorpo 18R5 anti-FZD.

Em experiências adicionais, foi determinada a capacidade do anticorpo 18R8 de antagonizar a sinalização por diferentes ligandos de Wnt. Foram transfetadas células HEK 293 com Wntl, Wnt2, Wnt2b2, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt9b e WntlOb durante quarenta e oito horas através de Fugene 6 (Roche) . Foi utilizado meio condicionado com Wnt3A ("WNT3ACM") como um controlo positivo de ativação. Foram cultivadas células STF293 em DMEM suplementado com antibióticos e FCS 10% e tratadas com anticorpos 18R8 a 20 pg/ml ou sem anticorpo. Foram então adicionadas células HEK293 sobreexpressando Wnt. Dezoito horas após o tratamento, os níveis de luciferase foram medidos utilizando um kit de ensaio duplo de luciferase. Os resultados são mostrados na Figura 4. 0 anticorpo anti-FZD 18R8 foi mostrado como inibindo a sinalização de uma variedade de Wnts, incluindo inibição de Wntl, Wnt2, Wnt3, Wnt7a, Wnt7B, e WntlOB, para além de Wnt3A.

Exemplo 4 18R8 bloqueia a ligação de FZD a Wnt

Para avaliar a capacidade de 18R8 de bloquear a ligação de FZD a Wnt, foram adicionados 2 μΐ de FZD8-FC solúvel a 1,32 pg/pl contendo o domínio Fri (aminoácidos 1-157 de FZD8 ligadas em estrutura a IgGl Fc humana) ao meio de cultura para ligar Wnt3A (adicionado como 20 μΐ de meio condicionado com Wnt3A) , por si sós ou na presença de anticorpos IgG 18R8 (adicionados como 4μ1 de 3,71 pg/pl) . As misturas foram incubadas por si sós ou na presença de microesferas de sefarose de proteína A (produtos GE Healthcare; 20 μΐ de solução a 50% em PBS) durante duas horas a 4 °C. Após a incubação, as esferas de proteína A (e quaisquer proteínas complexadas às esferas de proteína A) em cada amostra foram removidas por centrifugação e o sobrenadante foi ensaiado para a capacidade de induzir a atividade da luciferase 8xTCF. 0 sobrenadante foi adicionado a células STF293, que expressam 8xTCF de forma estável (oito cópias do domínio de ligação a TCF a montante de um gene repórter de luciferase de pirilampo) para medir os níveis de sinalização de Wnt canónica e que foram cultivados em DMEM suplementado com antibióticos e FCS 10%. Dezoito horas após o tratamento das células STF293, os níveis de luciferase foram medidos utilizando um kit de ensaio duplo de luciferase (Promega, Madison, WI).

Conforme observado na Figura 5, Wnt3A mais proteína A induz uma forte ativação do gene repórter conforme medido por unidades de luciferase (RLU) (Figura 5, coluna 1) . A adição de Fzd8-fc induz um complexo entre Wnt 3A-Fzd8 e a proteína de fusão Fc com as microesferas de sefarose de proteína A, e após o complexo proteína A-Wnt3A-FZD8 ter sido removido por centrifugação, o sobrenadante resultante já não é capaz de ativar o gene repórter (Figura 5, coluna 2). Após a adição de 18R8, este complexo é presumivelmente interrompido pelo bloqueio do anticorpo sobre o domínio de interação com Wnt3 de FZD8, dado que embora o complexo proteína A-Fzd8-fc seja removido juntamente com 18R8 que pode interatuar facilmente com a proteína A através da sua própria porção Fc, pode ser facilmente observada atividade repórter, sugerindo níveis suficientes de Wnt 3A não complexado (Figura 5, coluna 3) . 18R8 também funciona nos Fzds endógenos presentes nas células STF293, porque a falha na remoção de 18R8 por parte da proteína A não mostra o retorno da ativação de Wnt 3A (Figura 5, coluna 6).

Os dados da Figura 5 mostram que a presença do anticorpo IgG 18R8 na reação de incubação resultou na retenção da atividade de Wnt3A dentro do sobrenadante em relação à atividade observada com FZD8-Fc por si só. Estes resultados indicam que 18R8 bloqueou a capacidade de FZD8 de ligar a Wnt3A e indicam que a ligação do anticorpo ao epítopo reconhecido por 18R8 é capaz de bloquear interações Wnt-FZD.

Exemplo 5

Mapeamento de epítopos de 18R8 e 18R5

Para identificar o epítopo FZD reconhecido pelo anticorpo IgG 18R8, foi realizado mapeamento de epítopos. Foi utilizada análise de citometria de fluxo de FZD expresso na superfície celular para medir a ligação do anticorpo. Foram gerados vetores de plasmídeos de expressão de mamífero compreendendo um promotor CMV a montante de polinucleótidos que codificam uma etiqueta de epítopo FLAG de sequência sinal N-terminal fusionada ao terminal N do domínio Fri de FZD8, por sua vez fusionado ao domínio transmembrana e ao domínio intracelular de proteína CD4 por tecnologia recombinante padrão. Esta construção de expressão permite a expressão do domínio FZD8 Fri na superfície celular, bem como expressão de uma etiqueta de epítopo FLAG para monitorizar a expressão. Foi então utilizada mutagénese direcionada ao local para modificar aminoácidos selecionados dentro do domínio extracelular de FZD. Foram co-transfetadas células HEK293 com vetores de expressão codificando FZD e o marcador GFP de transfeção. Quarenta e oito horas após a transfeção, as células foram recolhidas em suspensão e incubadas em gelo com anticorpo IgG anti-FZD ou IgG de controlo para deteção de ligação de anticorpos de fundo. As células foram lavadas e os anticorpos primários detetados com anticorpos secundários anti anticorpos conjugados a um cromõforo fluorescente. As células etiquetadas foram então analisadas por citometria de fluxo para medir a ligação do anticorpo anti-FZD a FZD de superfície celular.

Desta forma, os aminoácidos específicos dentro do domínio extracelular de FZD que foram importantes para a ligação de anticorpos anti-FZD foram identificados. Quando os resíduos de aminoácidos 82-83 de FZD8 foram mutados de PD a SQ, a ligação de FZD8 por 18R8 foi pouco afetada (Figura 6) . De forma semelhante, quando o aminoãcido 109S foi alterado a 109Q, não foi observado qualquer efeito significativo na ligação. Por outro lado, quando os resíduos 70-71 de FZD8 foram mudados de HQ a AE, a ligação de FZD8 nas células por 18R8 foi visivelmente diminuída (Figura 6 e Figura 7} . Quando os aminoácidos 66-67 foram mutados de GL a AA, ou quando os aminoácidos 6 8-69 foram mutados de EV a QL, ou quando os aminoácidos 126-127 foram mutados de FG a NV, a ligação do anticorpo 18R8 a FZD8 nas células foi de forma semelhante perdida. A perda da ligação a FZD quando determinados aminoácidos foram substituídos o domínio extracelular de FZD revelou sítios de reconhecimento específico do anticorpo. Consequentemente, o anticorpo 18R8 foi determinado como ligando a um epítopo compreendendo os aminoácidos 66-71 GLEVHQ (SEQ ID NO: 25) de FZD8 e os aminoácidos 124-128 GF de FZD8 humano. Esta região de epítopo é bem conservada entre os recetores frizzled humanos aos quais FZD8 liga (isto é, FZD1, FZD2, FZD5, FZD7 e FZD8), e não altamente conservada naqueles recetores frizzled humanos aos quais FZD8 não liga (isto é, FZD3, FZD4, FZD6, FZD9 ou FZD10).

Foram também realizadas experiências FACS comparando a ligação de IgG 18R5 e IgG 18R8 a FZD8 mutante e de tipo selvagem em células. Estas experiências demonstraram que o anticorpo 18R8 e o anticorpo 18R5 ligam a um epítopo semelhante em FZD8 (Figura 7).

Exemplo 6

Identificação do Sítio de Ligação Biológica (BBS dos recetores FZD) A verificação de anticorpos que inibem a sinalização de Wnt e a descoberta do epítopo dentro da proteína FZD ligada por estes anticorpos permitiu agora a análise de que regiões da estrutura da proteína FZD são importantes para a sinalização de Wnt. Para examinar isto, foi examinada a estrutura cristalina do domínio Fri de FZD 8 de ratinho.

Foi identificado o epítopo de ligação de 18R8 e 18R5 como encontrando-se dentro de uma região da estrutura de FZD para a qual não havia sido previamente apreciado um papel funcional específico. Além disso, o epítopo continha dois elementos de superfície separados de Fzd (que foram denominados "limite superior" e "limite inferior"), separados por um sulco. Também foi descoberto após comparação dos dez recetores frizzled humanos que ocorreu conservação marcada da identidade de aminoácidos que estavam alinhados na parte inferior deste sulco. A região compreendendo este sulco, bem como o "limite superior" e "limite inferior" ao qual 18R8 e 18R5 ligam foi designada Sítio de Ligação Biológica (BBS) de FZD. São mostradas na Figura 9 imagens da estrutura de um domínio Fri de Fzd com base na análise da estrutura cristalina anteriormente relatada de FZD8 de ratinho (Dann CE et al. Nature (6842) 86-90, 2001) e análise realizada utilizando o programa de software Pymol. É mostrada na imagem superior esquerda uma vista de superfície do domínio FZD Fri com a região da proteína FZD compreendendo o sítio de ligação biológica (BBS) indicada por um círculo branco. As regiões designadas como "limite superior", "limite inferior" e "sulco" do BBS estão destacadas cada uma numa coloração mais escura da superfície em imagens separadas na parte inferior do painel. A imagem superior direita da Figura 9 destaca numa superfície mais escura os resíduos que são conservados em 9 ou 10 dos dez membros da família de Fzd humano.

Exemplo 7

Inibição do crescimento tumoral in vivo por 18R5 Prevenção do crescimento tumoral dependente de Wnt por 18R5 Ratinhos NOD/SCID fêmea com 5-7 semanas de idade foram injetados com 50.000 células derivadas de vírus de tumor mamário de ratinho (MMTV)-tumor WNT1 no corpo adiposo mamário superior direito. Os ratinhos (MMTV)-Wnt-1 transgénicos exibem etapas discretas de tumorigénese mamária, incluindo hiperplasia, carcinoma dutal invasivo e metãstases distantes, e consequentemente este modelo de ratinho de cancro da mama proporciona uma ferramenta útil para analisar o papel dos Wnts na formação e crescimento tumorais (Nusse e Varmus Cell (1982) 31:99-109). Foram dissociados tumores a partir destes ratinhos e estas células tumorais dissociadas utilizadas para propósitos de propagação do tumor. Os ratinhos com células tumorais implantadas no corpo adiposo mamário foram monitorizados duas vezes por semana. Após os tumores serem palpáveis, os tumores foram medidos duas vezes por semana e o volume tumoral foi determinado utilizando a fórmula XÁ (a x b2) ; onde a = comprimento, e b = largura. Os dados estão expressos como média e média ± E.P.M. As médias dos grupos foram comparadas utilizando o teste t de Student não emparelhado bicaudal. Os valores de probabilidade (p) de < 0,05 foram interpretados como significativamente diferentes. No dia 19, os ratinhos com volume tumoral médio de 44 mm3 foram aleatorizados em 2 grupos de 10 animais cada um. Os animais foram injetados com anticorpo de controlo ou anticorpo IgG 18R5 (10mg/kg). A administração dos anticorpos foi realizada através de injeção na cavidade intraperitoneal, duas vezes por semana. 0 tratamento com o anticorpo 18R5 aboliu completamente o crescimento tumoral em comparação com os tumores tratados com anticorpo de controlo (Figura 10, p = 0,002).

Redução do crescimento tumoral de xenoenxerto OMP-C28 por tratamento de combinação de 18R5 e irinotecano

Noutra forma de realização os anticorpos anti-FZD foram analisados para a sua capacidade de reduzir o crescimento dos xenoenxertos de tumor de cólon OMP-C28. Foram injetadas células OMP-C28 humanas dissociadas (10.000 por animal) por via subcutânea em ratinhos NOD/SCID do sexo masculino de 6-8 semanas de idade. 0 crescimento tumoral foi monitorizado semanalmente e as medições do tumor foram iniciadas após os tumores se tornarem palpáveis. No dia 24 os ratinhos com tumor de volume médio de 12 9 mm3 foram aleatorizados em 4 grupos de 10 animais cada. Os animais foram injetados com anticorpo de controlo, ou anticorpo IgG 18R5 de (10 mg/kg) , ou irinotecano (7,5 mg/kg) ou combinação de 18R5 e irinotecano. A administração dos anticorpos e irinotecano foi realizada por meio de injeção na cavidade intraperitoneal, duas vezes por semana. Os tumores foram medidos duas vezes por semana e o volume do tumor foi determinado através da fórmula %(a x b2) , onde a = comprimento, e b = largura. Os dados estão expressos como média e média ± E.P.M. As médias dos grupos foram comparadas utilizando teste t de Student não emparelhado bicaudal. Os valores de probabilidade (p) de < 0,05 foram interpretados como significativamente diferentes. 0 tratamento com 18R5 resultou numa redução de 40% do crescimento tumoral, conforme mostrado na Figura 11 (p = 0,02) . Além disso, o tratamento com irinotecano 18R5 e resultou numa redução de 53% do crescimento tumoral em relação ao tratamento com irinotecano por si só (p = 0,0002 contra irinotecano por si só) (Figura 11) . Consequentemente, 18R5 demonstrou atividade de anti crescimento tumoral num modelo de tumor de cólon C28 OMP como um agente único bem como em associação com irinotecano.

Redução do crescimento tumoral de xenoenxerto OMP-Pn4 através de tratamento de combinação de 1SR5 e gemcitabina

Noutra forma de realização, os anticorpos anti-FZD foram analisados para a sua capacidade de reduzir o crescimento dos xenoenxertos de tumor pancreático 0MP-Pn4. Os ratinhos NOD/SCID foram adquiridos da Harlan (Indianápolis, Indiana) e deixados aclimatar durante vários dias antes dos estudos. 0 estabelecimento e a caracterização de cancro em modelos de xenoenxerto de pâncreas direcionados por células estaminais in vivo foram descritos anteriormente (Li et al. Cancer Res., 67:1030-7, 2007). Para estudos de eficácia, as células de tumor pancreático humano OMP-Pn4 foram dissociadas em suspensões de células únicas, ressuspensas em mistura 1:1 (v/v) de tampão FACS (solução salina equilibrada de Hank [HBSS] suplementada com soro fetal bovino inativado por calor a 2% e Hepes 20 mM) e Matrigel (BD Bioscience, San Jose, CA) e implantado por via subcutânea na região do flanco direito de ratinhos NOD/SCID do sexo masculino de 6-7 semanas de idade com uma agulha de calibre 25, contendo 50.000 células/ΙΟΟμΙ. 0 crescimento tumoral foi monitorizado semanalmente e as medições do tumor foram iniciadas após os tumores se tornarem palpáveis. No dia 36, os volumes tumorais médios atingiram cerca de 120 mm3 e os animais portadores de tumor foram aleatorizados (4 grupos de 9 por grupo). 0 tratamento foi iniciado dois dias mais tarde. Os animais foram injetados com anticorpo de controlo, com anticorpos IgG 18R5 (10 mg/kg), com gemcitabina (40 mg/kg), ou com uma combinação de anticorpos IgG 18R5 e gemcitabina. A administração dos anticorpos e/ou gemcitabina foi realizada através de injeção na cavidade intraperitoneal, uma vez por semana. 0 crescimento tumoral foi medido por um calibrador eletrónico (Costa Tools Company, San Leandro, CA). Os tumores foram medidos uma vez por semana e o volume tumoral foi determinado através da fórmula 1A{a x b2) , em que a = comprimento (eixo mais longo do tumor) , e b = largura (eixo mais curto do tumor). Os animais foram pesados a cada dia se mostrassem mais de 15% de perda de peso corporal e sacrificados se mostrassem 20% do peso corporal. Os dados são expressos como média ± E.P.M. As diferenças nos valores médios entre os grupos foram analisadas através de teste t não-paramétrico. As comparações múltiplas utilizaram teste ANOVA unidirecional com comparação de teste t post hoc. As diferenças de p < 0,05 são consideradas significativamente diferentes. 0 software para análise estatística foi GraphPad Prism4 (GraphPad Software Inc,, San Diego, CA). No final do estudo, os ratinhos foram sacrificados utilizando uma câmara de C02 seguido por deslocamento cervical. Os tumores foram recolhidos para análise de ARN e histológica. Os tumores restantes foram transferidos para meio frio 199 para processamento em suspensões de célula única para análise da frequência de células estaminais cancerígenas.

Os resultados do estudo de xenoenxerto 0MP-Pn4 são mostrados na Figura 12. 0 tratamento com o anticorpo 18R5 como monoterapêutica não resultou numa redução significativa do crescimento tumoral nesta experiência. No entanto, o tratamento com gemcitabina e 18R5 resultou numa redução do crescimento tumoral de 42% durante o tratamento com gemcitabina (Figura 12, p = < 0,001 contra gemcitabina por si só) . Consequentemente, 18R5 demonstrou atividade anti crescimento tumoral sinérgico num modelo de tumor pancreãtico 0MP-Pn4, em combinação com gemcitabina, um agente de quimioterapia de cuidados de saúde padrão aprovado.

Redução do crescimento tumoral de mama PE-13 através de tratamento de combinação de 18R5 e paclitaxel

Foram implantadas 10.000 células tumorais de mama humano PE-13 (negativas para HER2) em ratinhos NOD-SCID e deixadas crescer por 22 dias até alcançarem um volume médio de aproximadamente 120 mm3. Os animais foram aleatorizados em 4 grupos de 10 animais cada e doseados com um anticorpo de controlo, anti-FZD 18R5, paclitaxel (Taxol®), ou 18R5 mais paclitaxel. A Figura 37 mostra os volumes médios de tumor dos ratinhos doseados com anticorpo de controlo, anti-FZD 18R5, paclitaxel ou 18R5 e paclitaxel. Os anticorpos foram administrados em doses de 10 mg/kg, I.P., duas vezes por semana. Foi administrado paclitaxel em doses de 10 mg/kg, I.P., uma vez por semana. Os tumores foram medidos nos dias indicados na Figura 37. A Figura 38 mostra o crescimento tumoral dos animais individuais no grupo de 18R5 e paclitaxel. 0 tratamento com 18R5 e paclitaxel foi mostrado como resultando em atividade antitumoral e regressão dos tumores de mama estabelecidos.

Exemplo 8

Ensaios para determinar o efeito sobre a frequência de células estaminais cancerígenas

Podem ser utilizados ensaios de diluição limitante (LDAs) para avaliar o efeito de um agente ou anticorpo de ligação a FZD sobre células estaminais cancerígenas de tumor sólido e sobre a tumorigenicidade de um tumor compreendendo células estaminais cancerígenas. Os ensaios podem ser utilizados para determinar a frequência de células estaminais cancerígenas em tumores a partir de animais tratados com o anticorpo de ligação a FZD ou outro agente e comparar a frequência com a frequência de células estaminais cancerígenas em tumores a partir de animais do grupo de controlo.

Efeito do tratamento de combinação de 18R5 e irinotecano em células estaminais cancerígenas em tumores 0MP-C28

Foram colhidos tumores de controlo e tratados a partir do estudo de xenoenxerto de OMP-C28 descrito acima (Exemplo 7) no final do estudo (dia 48) . Os tumores foram processados e dissociados em células únicas. As células tumorais foram então incubadas com anticorpos de ratinho biotinilados (diluição 1:200 de a-CD45 de ratinho -biotina e diluição 1:100 de a-H2Kd de ratinho-biotina de rato, BioLegend, San Diego, CA) em gelo durante 30 min seguido por adição de microesferas magnéticas etiquetadas com estreptavidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) para remover as células de ratinho com a ajuda de um íman.

Para LDA, as células humanas na suspensão foram colhidas, contadas, e foram misturadas doses adequadas de células (5, 25 e 125 células) em tampão FACS numa mistura 1:1 com Matrigel e injetadas por via subcutânea em ratinhos NOD/SCID (10 ratinhos por dose de células por grupo de tratamento). Os tumores são deixados crescer durante até 4 meses. No ponto de tempo desejado, é determinada a percentagem de ratinhos com tumores detetáveis em todos os grupos injetados com células tumorais tratadas com anticorpo anti-FZD e comparada com a percentagem de ratinhos com tumores detetáveis nos controlos. Por exemplo, o número de ratinhos injetados com 125 células tumorais tratadas com controlo que têm tumores detetáveis é determinado e comparado com o número de ratinhos injetados com 125 células tumorais tratadas com anticorpos de FZD que têm tumores detetáveis. É então calculada a frequência de células estaminais cancerígenas utilizando o software L-CalcTM (StemCell Technologies Inc.). Brevemente, com base em estatísticas de Poisson, existe exatamente uma célula estaminal do cancro entre o número conhecido de células injetadas, se 37% dos animais não desenvolverem tumores.

Para a análise de marcadores de superfície celular, a suspensão de célula tumoral única foi corada com anticorpos anti-ESA (Biomeda) e anticorpos anti-CD44 (BD Biosciences) que foram diretamente conjugados com fluorocromos. As células mortas foram excluídas utilizando o corante DAPI de viabilidade. Foi realizada citometria de fluxo utilizando um FACS Aria (Becton Dickinson). Os perfis de dispersão lateral e de dispersão frontal foram utilizados para eliminar os aglomerados celulares. A análise dos tumores tratados com anticorpo de controlo revelou que 64% da população tumoral em massa expressa tanto ESA como CD44 em níveis elevados (Figura 39). A população dupla positiva não foi significativamente afetada pelo tratamento com irinotecano por si só (55%), conforme mostrado na Figura 39, mas o tratamento com o 18R5 ou com a combinação de 18R5 com irinotecan reduziu a população dupla positiva (40% e 32% respetivamente).

Efeito do tratamento de combinação de 18R5 e gemcitabina em células estaminais cancerígenas em tumores 0MP-Pn4

Os tumores tratados e de controlo do estudo de xenoenxerto com 0MP-Pn4 descrito acima (Exemplo 7) foram recolhidos ao fim de 41 dias de tratamento. Os tumores foram processados e dissociados em células únicas. As células tumorais foram então incubadas com anticorpos de ratinho biotinilado (diluição 1:200 de oí-CD4 5 de ratinho-biotina e diluição 1:100 de a-H2Kd de ratinho-biotina de rato, BioLegend, San Diego, CA) em gelo durante 3 0 min seguido por adição de microesferas magnéticas etiquetadas com estreptavidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) para remover as células de ratinho. As células humanas restantes na suspensão foram recolhidas, contadas e diluídas a doses de células adequadas (30, 90, 270 e 810 células), misturadas na mistura de tampão FACS e Matrigel 1:1 (v/v) e injetadas por via subcutânea em ratinhos SCID/NOD (10 ratinhos por dose de células por grupo de tratamento). Os tumores foram deixados crescer durante 75 dias, conforme mostrado na Figura 40. Cada ponto na figura 40 representa o volume do tumor de um ratinho individual. A percentagem de ratinhos com tumores detetáveis foi determinada em todos os grupos injetados com células tumorais tratadas anticorpos anti-FZD e comparada com a percentagem de ratinhos com tumores detetáveis nos controlos. Por exemplo, o número de ratinhos injetados com 810 células tumorais tratados com o controlo que têm tumores detetáveis foi determinado e comparado com o número de ratinhos injetados com 810 células tumorais tratados com anticorpos de FZD que têm tumores detetáveis. A frequência de crescimento tumoral foi utilizada para calcular a frequência de células estaminais cancerígenas utilizando software L-CalcTM. As frequências de células estaminais cancerígenas calculadas para cada um dos grupos de tratamento são mostradas na Figura 41. 0 tratamento com 18R5 por si só e tratamento com 18R5 em combinação com gemcitabina reduziu a frequência das células estaminais cancerígenas, enquanto o tratamento com gemcitabina por si só não teve efeito.

Exemplo 9

Produção de anticorpos de FZD Produção de Antigénios São gerados fragmentos de polipéptidos recombinantes do domínio extracelular (ECD) ou do domínio Fri (Fri) dos recetores FZD humanos (FZDs) como antigénios para a produção de anticorpos. É utilizada tecnologia de ADN recombinante padrão para isolar polinucleótidos codificando os aminoácidos destes domínios do recetor ou recetores frizzled humanos desejado(s). Estes polinucleótidos são ligados em estrutura em posição N-terminal a uma etiqueta Fc humana ou etiqueta de histidina e clonados num vetor de plasmídeo de transferência para expressão mediada por baculovirus em células de inseto. São utilizados protocolos de transfeção, infeção e cultura celular padrão para produzir células de inseto recombinantes expressando os polipéptidos FZD correspondentes (0'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)) . É purificada proteína de antigénio a partir de meio condicionado de células de inseto utilizando cromatografia de afinidade a proteína A e quelato de Ni++. A proteína de antigénio purificada é dialisada contra PBS (pH = 7), concentrada a cerca de 1 mg/ml e filtrada de forma estéril na preparação para a imunização.

Imunização São imunizados ratinhos com proteína de antigénio FZD purificada utilizando técnicas padrão. 0 sangue de ratinhos individuais é rastreado cerca de 70 dias após a imunização inicial para reconhecimento do antigénio utilizando análise de ELISA e FACS (descrito em detalhe abaixo) . Os dois animais com os títulos mais altos de anticorpos são selecionados para reforço do antigénio final após o qual são isoladas células do baço para a produção de hibridomas. As células de hibridoma são colocadas em placas a 1 célula por poço em placas de 96 poços, e o sobrenadante a partir de cada poço é rastreado por análise de ELISA e FACS contra a proteína de antigénio. São selecionados vários hibridomas com titulações elevadas de anticorpos e ampliados em cultura em balão estático. Os anticorpos são purificados a partir do sobrenadante de hibridoma utilizando cromatografia de agarose de proteína A ou proteína G. Os anticorpos monoclonais purificados são novamente testados por FACS e são isotipados para selecionar anticorpos IgG e IgM.

Mapeamento de Epítopos

Para identificar os anticorpos que reconhecem regiões específicas do domínio extracelular FZD incluindo o domínio rico em cisteína, é realizado mapeamento de epítopos. São gerados vetores de plasmídeo para expressão em mamíferos compreendendo um promotor CMV a montante dos polinucleótidos codificando os fragmentos do domínio FZD extracelular utilizando tecnologia de ADN recombinante padrão. As proteínas recombinantes são posteriormente expressas em células de mamíferos cultivadas através de transfeção transitória. Vinte e quatro a 48 horas após a transfeção, as células são recolhidas e a proteína do lisado celular é separada em géis de acrilamida SDS-PAGE para Western blot utilizando anticorpos de ratinhos imunizados com antigénio FZD. Os anticorpos que reconhecem o domínio de ligando de FZD podem ser analisados para ligação competitiva com proteínas Wnt por ELISA.

Para identificar epítopos específicos dentro dos domínios extracelulares reconhecidos por um anticorpo contra FZD é utilizado o sistema SPOTs (Sigma Genosys, The Woodlands, TX) . Uma série de péptidos lineares de 10 resíduos sobrepostos por um aminoácido e cobrindo todo o domínio FZD extracelular são sintetizados e ligados covalent emente a uma membrana de celulose por meio da técnica de síntese SPOT. A membrana é previamente incubada durante 8 horas à temperatura ambiente com tampão de bloqueio e hibridada com anticorpos durante a noite em 4°C. A membrana é então lavada, incubada com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) , novamente lavada e visualizada com solução de desenvolvimento de sinal contendo 3-amino-9-etilcarbazol. Os epítopos específicos reconhecidos por um anticorpo são consequentemente determinados.

Análise FACS

Para selecionar anticorpos monoclonais produzidos por clones de hibridomas que reconhecem a proteína FZD nativa da superfície celular, é utilizada análise FACs. São transfetadas células HEK293 com um vetor de expressão codificando um clone de ADNc de comprimento completo de FZD correspondente por si só ou co-transfetado com um vetor expressando GFP. Pode ser introduzida Uma etiqueta de epítopo FLAG no terminal amino, que permite a verificação da expressão dos recetores FZD etiquetados na superfície celular. Vinte e quatro a 48 horas após a transfeção, as células são recolhidas em suspensão e incubadas em gelo com anticorpos anti-FZD, anticorpos FLAG, soro imune (para células expressando FZD5), ou controlo IgG para deteção de ligação de anticorpos de fundo. As células são lavadas e os anticorpos primários detetados com anticorpos secundários anti ratinho conjugados com um cromóforo fluorescente. As células etiquetadas são então classificadas por FACS para identificar anticorpos anti-FZD que reconhecem especificamente a expressão na superfície celular do recetor FZD correspondente. São identificados anticorpos que reconhecem o(s) recetor(es) frizzled humano(s) desejados.

Anticorpos Quiméricos

Após os anticorpos monoclonais que reconhecem especificamente um recetor FZD serem identificados, estes anticorpos são modificados para superar a resposta imune do anticorpo anti ratinho humano (HAMA) quando são utilizados anticorpos de roedores como agentes terapêuticos. As regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo monoclonal selecionado são isoladas por RT-PCR a partir de células de hibridoma e ligadas em estrutura a regiões constantes de cadeia pesada de IgGl e cadeia leve capa humanas, respetivamente, em vetores de expressão de mamíferos. Alternativamente é utilizado um vetor de expressão de Ig humana tal como TCAE 5.3 que contém os genes da região constante de cadeia pesada de IgGl e cadeia leve capa humanas no mesmo plasmídeo (Preston et al. 1998, Infection e Immunity 66:4137-42) . Os vetores de expressão codificando cadeias pesadas e leves quiméricas são então co-transfetados em células de ovário de hamster chinês (CHO) para a produção de anticorpos quiméricos. A imunorreatividade e afinidade dos anticorpos quiméricos são comparadas com os anticorpos de ratinho parentais por ELISA e FACS.

Anticorpos humanizados

Dado que as terapêuticas de anticorpos quiméricos são ainda frequentemente antigénicas, ao produzir uma resposta imune de anticorpo anti quimérico humano (HACA), os anticorpos quiméricos contra um recetor FZD podem ser submetidos a humanização adicional. Para gerar anticorpos humanizados, os aspetos chave dos motivos de determinação da especificidade do anticorpo, potencialmente incluindo elementos das três sequências hipervariáveis curtas, ou regiões determinantes complementares (CDRs), e/ou as regiões estruturais necessárias para posicionar corretamente as regiões CDR dos anticorpos dos domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve acima descritos são manipulados utilizando tecnologia de ADN recombinante nas sequências de ADN de linha germinativa humana de genes de cadeia leve e de cadeia pesada humanas do anticorpo, respetivamente e posteriormente clonadas num vetor de expressão de mamífero para expressão em células CHO. A imunorreatividade e afinidade dos anticorpos humanizados são comparadas com os anticorpos quiméricos parentais por ELISA e FACS. Adicionalmente, pode ser utilizada mutagénese direcionada ao local ou de alta densidade da região variável para otimizar especificidade, afinidade, etc., do anticorpo humanizado.

Anticorpos humanos

Nalgumas formas de realização, os anticorpos humanos que reconhecem especificamente o domínio extracelular de um recetor FZD são isolados utilizando tecnologia de exibição de fagos. É rastreada uma biblioteca de anticorpos de exibição de fagos contendo domínios variáveis de anticorpos humanos exibidos como Fv de cadeia simples ou como domínios fab para reconhecimento específico e de alta afinidade de um antigénio do recetor FZD descrito acima. As sequências de anticorpos de domínio variáveis identificadas são então reformatadas num vetor de expressão de Ig contendo cadeia pesada IgGl e cadeia leve capa humanas para expressão de anticorpos humanos em células CHO.

Exemplo 10

Produção de anticorpos que reconhecem epítopos específicos Anticorpos monoclonals a partir de hibridomas

Em determinadas formas de realização, são gerados anticorpos que reconhecem epítopos funcionais de recetores FZD através de imunização de ratinhos com um ou mais dos antigénios do recetor FZD. Os ratinhos são imunizados com a proteína de antigénio FDZ purificada utilizando técnicas padrão. Em determinadas formas de realização os ratinhos são imunizados sequencialmente com antigénios de recetores FZD distintos. É rastreado sangue a partir de ratinhos individuais cerca de 70 dias após a imunização inicial. Os animais com as titulações de anticorpos elevadas para o antigénio FZD são selecionados para reforçar o antigénio final após o qual são isoladas células do baço para a produção de hibridomas. As células de hibridoma são colocadas em placas a 1 célula por poço em placas de 96 poços, e os sobrenadantes de cada poço são rastreados por ELISA e análise de citometria de fluxo. Para identificar anticorpos monoclonais que reconhecem epítopos específicos, incluindo epítopos dentro ou em sobreposição com o Sítio de Ligação Biológica (BBS), o hibridoma do sobrenadante é rastreado tanto para a ligação do anticorpo ao(s) FZD(s) desejado (s) como para falha na ligação a FZD que têm substituições de aminoácidos específicas dentro do epítopo específico desejado (por exemplo, o BBS).

Anticorpos humanos

Pode ser utilizada uma biblioteca de exibição de fagos para identificar anticorpos que reconhecem os epítopos desejados dos recetores FZD (por exemplo, epítopos comuns a FZD múltiplos e/ou epítopos dentro de ou sobrepostos com o BBS ou uma porção do mesmo). Por exemplo, o domínio Fri de um FZD selecionado é expresso como proteína recombinante e revestido sobre uma superfície adequada a 10 pg/ml. É então ampliada uma biblioteca de fagos humana através de dois ou mais ciclos de enriquecimento (Veja-se, por exemplo, Griffiths et ai. EMBO J. 12:715-34). Opcionalmente, podem ser realizados ciclos subsequentes de ampliação utilizando proteínas FZD distintas. Opcionalmente, cada ciclo da ampliação pode ser realizado na presença de proteína FZD solúvel de chamariz contendo substituições específicas de aminoácidos na região do epítopo alvo desejado (por exemplo, incluindo os epítopos no sítio de ligação biológica (BBS)). São então rastreados clones individuais do produto das seleções de ampliação para a capacidade de ligar a(s) proteína(s) FZD desejada(s) por ELISA ou análise de citometria de fluxo e a ligação a um epítopo desejado é avaliada pela ausência de ligação à proteína FZD contendo substituições de aminoácidos específicas dentro do epítopo alvo desejado. São então recuperados genes codificando o domínio de ligação ao antigénio a partir do fago e utilizados para construir uma molécula de anticorpo humano completa através de união do domínio de ligação ao antigénio com regiões constantes para expressão numa linha celular hospedeira adequada. Os anticorpos são identificados e testados para a capacidade de impedir o crescimento de células tumorais conforme descrito noutro ponto do presente documento.

Exemplo 11

Ensaios adicionais in vitro para avaliar os anticorpos contra um recetor FZD

Este exemplo descreve ensaios in vitro representativos para testar a atividade de anticorpos gerados contra um recetor FZD sobre a proliferação celular, ativação de vias e citotoxicidade.

Ensaio de Proliferação A expressão de um recetor FZD por diferentes linhas celulares cancerígenas é quantificada utilizando análise Taqman. As linhas celulares identificadas expressando um recetor FZD são colocadas em placas a uma densidade de 104 células por poço em microplacas de cultura de tecido de 96 poços, e deixadas disseminar durante 24 horas. Subsequentemente as células são cultivadas durante 12 horas adicionais em DMEM fresco com FCS 2%, em cujo ponto são adicionados anticorpos anti-FZD contra os anticorpos de controlo ao meio de cultura na presença de BrdU 10 pmol/l. Após etiquetagem com BrdU, o meio de cultura é removido, e as células fixas à temperatura ambiente durante 30 minutos em etanol e reagidas durante 90 minutos com anticorpo anti-BrdU monoclonal conjugado com peroxidase (clone BMG 6H8, fragmentos Fab) . 0 substrato é desenvolvido numa solução contendo tetrametilbenzidina e interrompido após 15 minutos com 25 μΐ de H2S04 1 mol/1. A reação de coloração é medida com um leitor automático de placas ELISA utilizando um filtro de 450 nm (UV Microplate Reader; Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Todas as experiências são realizadas por triplicado. É determinada a capacidade dos anticorpos anti-FZD de inibir a proliferação celular em comparação com os anticorpos de controlo.

Ensaio de Ativação de Via

Em determinadas formas de realização, a capacidade de anticorpos contra um recetor FZD de bloquear a ativação da via de sinalização de Wnt é determinada in vitro. Por exemplo, células HEK 293 cultivadas em DMEM suplementado com antibióticos e FCS 10% são co- transfetadas com 1) vetores de expressão Wnt7B e FZD10 para ativar a via da sinalização de Wnt; 2) um vetor repórter TCF/Luc mutante ou de tipo selvagem contendo três ou oito cópias do domínio de ligação a TCF a montante de um gene repórter de luciferase de pirilampo para medir os níveis de sinalização de Wnt canónica (Gazit et al, 1999, Oncogene 18:5959-66.); e 3) um repórter luciferase de Renilla (Promega, Madison, WI) como um controlo interno para eficácia de transfeção. São adicionados anticorpos anti-FZDIO e anticorpos de controlo ao meio de cultura de células. Quarenta e oito horas após a transfeção, os níveis de luciferase são medidos através de um kit de ensaio de luciferase duplo (Promega, Madison, WI) , com atividade de luciferase de pirilampo normalizada para atividade de luciferase de Renilla. São realizadas três experiências independentes por triplicado. A capacidade dos anticorpos de FZD de inibir a ativação da via Wnt é consequentemente determinada.

Ensaio de Citotoxicidade Dependente de Complemento

Em determinadas formas de realização, são utilizadas linhas celulares cancerígenas expressando um recetor FZD ou células estaminais cancerígenas isoladas a partir de uma amostra de paciente passada como um xenoenxerto em ratinhos imunocomprometidos para medir a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) mediada por um anticorpo contra um recetor FZD. As células são suspensas em 200 μΐ de meio de cultura RPMI 1640 suplementado com antibióticos e FBS 5% a 106 células/ml. As células suspensas são então misturadas com 200 ml de soro ou soro inativado por calor com anticorpo contra um recetor FZD ou anticorpos de controlo por triplicado. As misturas de células são incubadas durante 1 a 4 horas a 37° C em C02 a 5%. As células tratadas são então recolhidas, ressuspensas em 100 μΐ de anexina V etiquetada com FITC diluída em meio de cultura e incubadas à temperatura ambiente por 10 minutos. São adicionados cem microlitros de uma solução de iodeto de propídio (25 pg/ml) diluída em HBSS e incubados durante 5 minutos à temperatura ambiente. As células são recolhidas, ressuspensas em meio de cultura e analisadas através de citometria de fluxo. A citometria de fluxo de células etiquetadas com FITC proporciona contagem de células totais, e a captação de iodeto de propídio por células mortas como uma percentagem do número total de células é utilizada para medir a morte celular na presença de soro e anticorpos contra um FZD em comparação com soro inativado por calor e anticorpos de controlo. A capacidade dos anticorpos anti-FZD de mediar a citotoxicidade dependente de complemento é consequentemente determinada.

Ensaio de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo

Podem ser utilizadas linhas celulares cancerígenas expressando um recetor FZD ou células estaminais cancerígenas isoladas a partir de uma amostra de um paciente passadas como um xenoenxerto em ratinhos imunocomprometidos para medir a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) mediada por um anticorpo contra um recetor FZD. As células são suspensas em 200 μΐ de meio de cultura RPMI 1640 isento de vermelho de fenol suplementado com antibióticos e FBS 5% a 106 células/ml. São isoladas células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) a partir de sangue periférico heparinizado por centrifugação por gradiente de densidade de Ficoll-Paque para utilização como células efetoras. As células-alvo (T) são então misturadas com células efetoras PBMC (E) em razões de E/T de 25:1, 10:1 e 5:1 em placas de 96 poços na presença de pelo menos um anticorpo de recetor FZD ou um anticorpo de controlo. Os controlos incluem a incubação de células-alvo por si só e células efetoras por si só na presença de anticorpo. As misturas de células são incubadas durante 1 a 6 horas a 37° C em C02 a 5%. É então medida a lactato desidrogenase (LDH) libertada, uma enzima citosólica estável libertada durante a lise celular através de um ensaio colorimétrico (Ensaio de Citotoxicidade Não Radioativa CytoTox96; Promega, Madison, WI) . Os dados de absorvância a 490 nm são recolhidos com um leitor de placas de 96 poços padrão e o fundo corrigido. A percentagem de citotoxicidade específica é calculada segundo a fórmula: citotoxicidade % = 100 x (libertação de LDH experimental -libertação de LDH espontânea efetora - libertação de LDH espontânea alvo)/(libertação de LDH máxima alvo libertação de LDH espontânea alvo). A capacidade de anticorpos contra um recetor FZD de mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo é consequentemente determinada.

Exemplo 12

Prevenção do crescimento tumoral in vivo utilizando anticorpos anti recetores FZD

Este exemplo descreve a utilização de anticorpos anti-recetores FZD para prevenir o crescimento tumoral num modelo de xenoenxerto. Em determinadas formas de realização, as células tumorais a partir de uma amostra de paciente (biópsia de tumores sólidos ou efusão pleural) que tenham sido passadas como um xenoenxerto em ratinhos são preparadas para nova passagem em animais experimentais. 0 tecido tumoral é removido sob condições estéreis, cortado em pedaços pequenos, picado completamente utilizando lâminas estéreis, e são obtidas suspensões de células únicas através de digestão enzimãtica e rutura mecânica. Especificamente, as células de derrame pleural ou os pedaços do tumor resultantes são misturados com colagenase III ultra pura em meio de cultura (200-250 unidades de colagenase por ml) e incubadas a 37°C durante 3-4 horas com pipetagem para cima e para baixo através de uma pipeta de 10 ml cada 15-20 minutos. As células digeridas são filtradas através de uma malha de nylon de 45 μΜ, lavadas com RPMI/FBS 20%, e lavadas duas vezes com HBSS. As células tumorais dissociadas são então injetadas no tecido adiposo mamário de ratinhos NOD/SCID para desencadear crescimento tumoral.

Em determinadas formas de realização, as células tumorais dissociadas são primeiro classificadas em células tumorigénicas e não tumorigénicas com base em marcadores de superfície celular antes de injeção em animais experimentais. Especificamente, as células tumorais dissociadas conforme descritas acima são lavadas duas vezes com solução salina tamponada com Hepes (HBSS) contendo de soro bovino inativado por calor (HICS) 2% e ressuspensas a 10° células por 100 μΐ. São adicionados anticorpos e as células são incubadas durante 20 minutos em gelo seguido por duas lavagens com HBSS/HICS 2%. Os anticorpos incluem anti-ESA (Biomeda, Foster City, CA), anti-CD44, anti-CD24 e marcadores Lineage anti CD2, CD3, CD10, CD16, CD18, CD31, CD64 e CD140b (coletivamente referidos como Lin; PharMingen, San Jose, CA) . Os anticorpos são diretamente conjugados com fluorocromos para selecionar positivamente ou negativamente células expressando estes marcadores. As células de ratinhos são eliminadas através de seleção contra células H2Kd+, e as células mortas são eliminadas utilizando o corante de viabilidade 7AAD. É realizada citometria de fluxo num FACSVantage (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . São utilizados perfis de dispersão lateral e dispersão frontal para eliminar aglomerados celulares. São então injetadas células tumorigénicas ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin- isoladas por via subcutânea em ratinhos NOD/SCID para desencadear o crescimento tumoral.

Por meio de exemplo, os anticorpos anti-FZD são analisados para a sua capacidade de reduzir o crescimento das células tumorais. São injetadas células tumorais dissociadas (10.000 por animal) por via subcutânea na região do flanco de ratinhos NOD/SCID de 6-8 semanas de idade. Dois dias após a injeção de células tumorais, os animais são injetados por via intraperitoneal (i.p.) com anticorpos anti-FZD a 10 mg/kg duas vezes por semana. 0 crescimento tumoral é monitorizado semanalmente até ser detetado crescimento, após cujo ponto o crescimento tumoral é medido duas vezes por semana durante um total de 8 semanas. Os anticorpos de ligação a FZD que reduzem significativamente o crescimento tumoral conforme comparado com controlos injetados PBS são consequentemente identificados.

Exemplo 13

Tratamento de tumores in vivo utilizando anticorpos anti -recetores FZD.

Este exemplo descreve uma utilização de anticorpos anti-recetores FZD para tratar o cancro num modelo de xenoenxerto. Em determinadas formas de realização, as células tumorais a partir de uma amostra de paciente (biópsia de tumores sólidos ou efusão pleural) que tenham sido passadas como um xenoenxerto em ratinhos são preparadas para nova passagem em animais experimentais. O tecido tumoral é removido, cortado em pedaços pequenos, picado c ompletamente utilizando lâminas estéreis, e são obtidas suspensões de células únicas através de digestão enzimática e rutura mecânica. As células tumorais dissociadas são então injetadas por via subcutânea no tecido adiposo mamário, para tumores de mama, ou no flanco, para tumores não de mama, de ratinhos NOD/SCID para desencadear o crescimento tumoral. Alternativamente são isoladas células tumorais tumorigénicas ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin- conforme descrito acima e injetadas.

Após a injeção de células tumorais, os animais são monitorizados para o crescimento tumoral. Após os tumores alcançarem um tamanho médio de cerca de 150 a 200 mm, o tratamento com anticorpo começa. Cada animal recebe 100 pg de recetor FZD ou anticorpos de controlo i.p., 2 a 5 vezes por semana durante um total de 6 semanas. 0 tamanho do tumor é avaliado duas vezes por semana durante estas seis semanas. A capacidade dos anticorpos de recetor FZD de prevenir crescimento tumoral adicional ou de reduzir o tamanho tumoral em comparação com os anticorpos de controlo é consequentemente determinada.

No ponto final do tratamento com anticorpos, os tumores são recolhidos para análises adicionais. Nalgumas formas de realização uma porção do tumor é analisada através de imunofluorescência para avaliar a penetração dos anticorpos no tumor e a resposta tumoral. Uma porção de cada tumor recolhido a partir de ratinhos tratados com anticorpos anti-recetores FZD e de ratinhos tratados com anticorpos de controlo é imediatamente congelada em azoto líquido, incorporada em O.C.T., e cortada num criostato em cortes de 10 pm em lâminas de vidro. Nalgumas formas de realização, uma porção de cada tumor é fixada em formalina, incorporada em parafina e cortada num micrótomo em corte de 10 pm em lâminas de vidro. Os cortes são pós-fixos e incubados com anticorpos marcados com cromóforos que reconhecem especificamente anticorpos injetados para detetar anticorpos anti recetor FZD ou anticorpos de controlo presentes na biópsia do tumor. Além disso, podem ser utilizados anticorpos que detetam diferentes tipos de células tumorais e células recrutadas por tumor tais como, por exemplo, anticorpos de caderina anti-VE (CD 144) ou anti-PECAM-1 (CD31) para detetar células endoteliais vasculares, anticorpos anti-alfa-actina do músculo liso para detetar células vasculares do músculo liso, anticorpos anti-Ki67 para detetar células proliterativas, ensaios TUNEL para detetar células mortas, anticorpos anti β-catenina para detetar a sinalização de Wnt, e anticorpos anti fragmento Notch de domínio intracelular (ICD) para detetar a sinalização Notch para avaliar os efeitos do tratamento com anticorpos, por exemplo angiogénese, crescimento tumoral e morfologia do tumor.

Em determinadas formas de realização, também é avaliado o efeito do tratamento com anticorpo anti-recetor FZD sobre a expressão génica de células tumorais. É extraído ARN total a partir de uma porção de cada tumor recolhido a partir de ratinhos tratados com anticorpo FZD e tratados com anticorpo de controlo e utilizado para RT-PCR quantitativo. São analisados os níveis de expressão de recetores FZD, componentes da via de sinalização de Wnt, incluindo, por exemplo, Wntl e β-catenina, bem como marcadores de células estaminais cancerígenas adicionais previamente identificados (por exemplo, CD44) em relação ao gene de manutenção GAPDH como um controlo interno. As alterações da expressão génica de células tumorais após tratamento com anticorpo de recetor FZD são consequentemente determinadas.

Adicionalmente, é avaliado o efeito do tratamento com anticorpos anti-recetor FZD sobre a frequência de células estaminais cancerígenas num tumor. Amostras tumorais a partir de ratinhos tratados com anticorpo FZD contra anticorpo de controlo são cortadas em pedaços pequenos, picadas completamente utilizando lâminas estéreis e são obtidas suspensões de células únicas por digestão enzimática e rutura mecânica. As células tumorais dissociadas são então analisadas por análise FACS para a presença de células estaminais cancerígenas tumorigénicas com base na expressão dos marcadores celulares de superfície ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin- conforme descrito em detalhe acima. A tumorigenicidade de células isoladas com base na expressão de ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin- após o tratamento com anticorpo anti-FZD pode então ser avaliada. São novamente injetadas células estaminais cancerígenas ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin- isoladas a partir de ratinhos tratados com anticorpo FZD contra ratinhos tratados com anticorpo de controlo por via subcutânea nos tecidos adiposos mamários de ratinhos NOD/SCID. A tumorigenicidade de células estaminais cancerígenas com base no número de células injetadas necessárias para a formação de tumor consistente é então determinada.

Exemplo 14

Identificação de uma assinatura de gene Wnt

Foram levadas a cabo experiências para identificar um grupo de genes cuja expressão é específica para a ativação da via de sinalização de Wnt em tumores do cólon humano. Anulamento do crescimento tumoral por sobreexpressâo de axina A axina é um regulador importante da via de Wnt canónica. Forma parte do complexo multiproteina que desencadeia a degradação da β-catenina, mantendo consequentemente a via silenciosa na ausência de Wnt. Este efeito é revertido por Wnt, que remove a axina a partir do complexo de destruição, permitindo a translocação de β-catenina e a ativação mediada por TCF de genes de alvo específico. Tanto a sobreexpressâo de axina exógena como a expressão de uma forma dominante negativa truncada de TCF (DNTCF4) representam meios bem caracterizados para bloquear a via de sinalização de Wnt.

Foi mostrado que a sobreexpressâo de axina mediada por lentivírus anulou completamente o crescimento dos tumores da mama UM-PE13 e UM-T3, bem como o crescimento dos tumores do cólon 0MP-C11 e 0MP-C17 em ratinhos NOD/SCID. A expressão estável de DNTCF4 em células tumorais UM-T3 teve o mesmo efeito. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que o bloqueio de Wnt intracelular pode afetar negativamente o desenvolvimento de diferentes tipos de tumores, suportando a via de Wnt como um alvo relevante para o tratamento dos cancros de mama e cólon. A via de sinalização de Wnt é constitutivamente ativada em muitos tipos de tumores. Na maioria dos tumores do cólon esta ativação é devido à mutação truncada do APC ou mutações ativadoras de β-catenina. Tais mutações não foram relatadas para outros tecidos, nos quais a via de sinalização de Wnt podia ser ativada através de outro conjunto de mutações ou por um mecanismo autócrino. Naqueles tumores onde a via de sinalização de Wnt permanece responsiva a estímulos autócrinos, o bloqueio da via através de meios extracelulares tais como anticorpos ou outros inibidores de proteína solúveis deveria ser viável e impactar o desenvolvimento tumoral. A identificação de tais tumores dependentes de Wnt seria útil no desenvolvimento de agentes anti-Wnt e definiria os tipos de tumores a visar na clínica.

Os dados imunohistoquímicos mostraram que a maioria das células tumorais 0MP-C11 expressam níveis elevados de β-catenina citoplásmica/nuclear, sugerindo que a via de sinalização de Wnt é ativada constitutivamente neste tipo de tumor. Isto foi confirmado pela deteção de níveis elevados de β-catenina em 0MP-C11 através de Western blot. A combinação da ativação da via de Wnt e da sensibilidade à sobreexpressão de axina faz de 0MP-C11 um bom tumor no qual estudar a regulação da expressão génica em resposta a Wnt e ao bloqueio de Wnt e a partir do qual derivar uma assinatura de gene de Wnt.

Análise de Microarranjo da expressão diferencial de genes em resposta a sobreexpressão de axina.

Foi determinada a expressão diferencial de genes após tratamento de células de tumor de cólon 0MP-C11 com axina através de análise de microarranjos.

Foram utilizados tumores de cólon humano 0MP-C11 recém-removidos a partir de ratinhos NOD/SCID (Modelo de tumor de xenoenxerto) como uma fonte para as células de tumor do cólon. Foram gerados dois vetores lentivirais para a administração de uma cassete de expressão axina-IRES-GFP constitutiva e uma cassete de expressão IRES-GFP de controlo que foram denominadas L0M91 e LOM92, respetivamente.

Os tumores 0MP-C11 foram processados para uma suspensão de células únicas e esgotados a partir das células da linha de ratinho. As células esgotadas de lin foram infetadas com vetores lentivirais L0M91 (axina) ou 92 (controlo) utilizando uma multiplicidade de infeção de 2,5, mantidas em cultura durante 3-4 dias e classificadas para a expressão de GFP. Foi extraído ARN total a partir de cada amostra de células classificadas. Os ARNs foram analisados no microarranjo GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, California). A experiência foi repetida duas vezes.

Foi gerada uma assinatura de gene contendo um conjunto básico de genes regulados pela via Wnt por análise dos genes que são diferencialmente expressos após tratamento com axina e que também exibem correlação com a expressão de axin2 ao longo de um painel de amostras de tumor do cólon maligno e normal. Foram identificados genes a partir da experiência de microarranjo de axina (acima), que mostrou regulação negativa em resposta a sobreexpressão de axina. O ponto de corte para esta seleção foi a regulação negativa de 50% ou mais em amostras sobreexpressando Axinl em comparação com amostras de controlo (a taxa Iog2 de amostras sobreexpressando Axinl sobre amostras de controlo deve ser -1 ou inferior), com valor p de teste T inferior a 0,1. Dado que Axinl é um inibidor conhecido da via Wnt, os genes regulados negativamente pela sobreexpressão de Axinl irão ser alvos da via Wnt direta ou indireta. Esta seleção foi então adicionalmente refinada pela identificação dos genes que mostraram alta correlação (valor de correlação > 0,3) com axin2 entre um conjunto de amostras de tumor maligno do cólon/intestino/outros tecidos digestivos (232 amostras) . Dado que Axin2 é um alvo conhecido de Wnt, os genes mostrando padrão de expressão semelhante a Axin2 serão também provavelmente alvo de Wnt. Esta análise produziu uma assinatura de gene para a atividade da via Wnt (Quadro β) . Os níveis de expressão dos genes nesta assinatura podem ser utilizados para avaliar se as amostras de tumor individual ou diferentes tipos de tumores mostram evidências de via de sinalização de Wnt alterada.

Quadro 6. Lista de assinaturas de gene Wnt provenientes a __partir de tumores do cólon_

Exemplo 15

Tratamento do cancro humano utilizando anticorpos de recetores anti-FZD

Este exemplo descreve métodos para tratamento de cancro utilizando anticorpos contra um recetor FZD para visar tumores compreendendo células estaminais cancerígenas e/ou células tumorais nas quais foi detetada expressão do recetor FZD e/ou células tumorais tendo uma assinatura de gene Wnt indicando que são responsivas à inibição da sinalização de Wnt (por exemplo, a assinatura de gene Wnt do Exemplo 14). A presença de marcador de células estaminais cancerosas ou de recetor FZD ou a expressão de um ou mais genes numa assinatura de gene Wnt pode ser primeiro determinada através de uma biópsia de tumor. São removidas células tumorais a partir de uma biópsia de um paciente diagnosticado com cancro sob condições estéreis. Nalgumas formas de realização, a biópsia de tecido é imediatamente congelada em azoto líquido, embebida em O.T.C. e cortada num criostato como cortes de 10 μιη em lâminas de vidro. Nalgumas formas de realização, a biópsia de tecido é fixa em formalina, embebida em parafina e cortada num micrótomo como cortes de 10 pm em lâminas de vidro.

Os cortes são incubados com anticorpos contra um recetor FZD para detetar a expressão da proteína FZD. Alternativamente, os cortes podem ser analisados para a presença de um ou mais genes na assinatura de gene Wnt conforme descrito no Exemplo 14.

Também pode ser determinada a presença de células estaminais cancerígenas. São cortadas amostras de biópsia de tecido em pedaços pequenos, picadas completamente utilizando lâminas estéreis, e as células são submetidas a digestão enzimãtica e rutura mecânica para obter uma suspensão de célula única. As células tumorais dissociadas são então incubadas com anticorpos anti ESA, CD44, CD24, Lin e FZD para detetar células estaminais cancerígenas, e a presença de células estaminais tumorais ESA +, CD44 +, CD24-/low, Lin-, FZD+ é determinada através de citometria de fluxo, conforme descrito em detalhe acima.

Os pacientes com cancro cujos tumores são diagnosticados como expressando um recetor FZD e/ou um ou mais genes 11a assinatura de gene Wnt são tratados com anticorpos anti-recetores FZD. Em determinadas formas de realização, são purificados anticorpos anti-recetores FZD monoclonais humanizados ou humanos gerados como descritos acima e formulados com um veículo farmacêutico adequado para injeção. Nalgumas formas de realização, os pacientes são tratados com os anticorpos de FZD pelo menos uma vez por mês durante pelo menos 10 semanas. Nalgumas formas de realização, os pacientes são tratados com os anticorpos de FZD pelo menos uma vez uma por semana durante pelo menos cerca de 14 semanas. Cada administração do anticorpo deve ser uma dose farmaceuticamente eficaz. Nalgumas formas de realização, são administrados entre cerca de 2 a cerca de 100 mg/ml de um anticorpo anti-FZD. Nalgumas formas de realização, são administrados entre cerca de 5 a cerca de 40 mg/ml de um anticorpo anti-FZD. 0 anticorpo pode ser administrado antes de, concomitantemente com, ou após regimes de radioterapia ou regimes de quimioterapia padrão utilizando um ou mais agentes quimioterapêuticos, tais como oxaliplatina, fluorouracilo, leucovorina ou estreptozocina. Os pacientes são monitorizados para determinar se tal tratamento resultou numa resposta antitumoral, por exemplo, com base na regressão do tumor, redução das incidências de novos tumores, menor expressão de antigénio tumoral, diminuição do número de células estaminais cancerígenas, ou outros meios de avaliação do prognóstico da doença.

Exemplo 16

Diferenciação de células tumorais pancreãticas após tratamento com gemcitabina e 18R5

Análise da expressão génica de células tumorais pancreãticas tratadas através de PCR quantitativa (Q-PCR)

Foram analisados tumores de xenoenxerto PN4 tratados com controlo de Ab, anticorpo IgG 18R5, gemcitabina, ou a combinação de gemcitabina e anticorpo IgG 18R5 conforme descrito acima (Exemplo 7) para expressão de cromogranina A (CHGA) por análise de PCR quantitativo. CHGA é bem conhecido como sendo um marcador para diferenciação neuroendócrina de vários tumores incluindo tumores da mama, cólon, pulmão e pancreático e a expressão elevada de CHGA em tumores pancreáticos foi constatada como estando associada a sobrevivência melhorada (Tezel et al. 2000. Cancer 89, 2230-6) .

Foi preparado ARM total a partir de 5 tumores de cada grupo do estudo de xenoenxerto PN4 e foi avaliado por transcrição reversa de uma etapa (RT)-PCR utilizando sondas inventariadas Applied Biosystems TaqMan® de acordo com protocolos padrão. O conjunto de iniciador-sonda (Hs00154441_ ml) utilizado para análise de CHGA incluiu uma sonda marcada com corante FAM e o seguinte iniciador:5'-CGCTCTCCAAGGCGCCAAGGAGAGG-3 ' (SEQ ID NO: 75) . Gus B foi utilizado como controlo interno. Brevemente, a RT foi realizada a 48 °C durante 30 min, desnaturação inicial a 95 °C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 15 segundos e extensão a 60 °C durante 1 min e a ampli f icação/incorporação de sondas fluorescentes foi observada em tempo real. O marcador de células beta de ilhota CHGA foi elevado significativamente comente em amostras a partir de ratinhos tratados com gemcitabina e 18R5. Os tumores dos grupos de Ab de controlo, 18R5 e gemcitabina por si sós expressaram níveis similares de ARN de CHGA enquanto os tumores do grupo de combinação mostraram um claro aumento da expressão de CHGA. Os níveis de CHGA foram elevados 10 vezes e 7 vezes em duas experiências em tumores tratados com 18R5 e gemcitabina. Os resultados de uma experiência representativa são mostrados na Figura 42.

Análise da expressão génica de células tumorais pancreáticas tratadas através de imunohistoquímica A expressão aumentada de CHGA também foi observada ao nível de proteínas por imunohistoquímica em cortes histológicos preparados a partir de tumores tratados (dados não mostrados) . Os tumores tratados com Ab de controlo mostraram coloração intensa de um pequeno subconjunto de células dispersas ao longo dos tumores. Os tumores tratados com 18R5 por si só ou gemcitabina por si só expressaram CHGA a níveis semelhantes aos dos controlos. Em contraste, os tumores tratados com a combinação de 18R5 e gemcitabina mostraram um aumento do número de células positivas para CHGA, consistente com a expressão de ARN aumentada detetada por Q-PCR.

Coloração com azul de alcian e anticorpos para ki67

Outra característica das células endócrinas, secretoras ou dutais é a produção de mucina e estas células podem ser detetadas através de coloração de azul de alcian (van Es et al. 2005. Nature 435 959-63) . Foi observado durante a recolha e processamento de tumores que os tumores tratados com 18R5 eram muito mais mucinosos do que os tumores tratados com controlo. Como tal, os cortes de tumores PN4 a partir de ratinhos tratados com anticorpo de controlo, gemcitabina por si só, 18R5 por si só, ou 18R5 mais gemcitabina foram coradas com azul de alcian. Os tumores tratados com 18R5 mostraram um claro aumento da coloração do azul de alcian, tanto em 18R5 por si só como nos grupos tratados com 18R5 mais gemcitabina em relação aos controlos e grupos tratados com gemcitabina por si só (dados não mostrados).

Também foram observado aumento das células mucinosas numa segunda linha de tumor pancreático PN 13, após tratamento com 18R5 ou anticorpo de controlo (Figura 43) . Nesta experiência os ratinhos portando tumores PN13 foram tratados conforme descrito acima (Exemplo 7) . Os cortes de tumores foram corados com azul de alcian para revelar células mucinosas e também corados por imunohistoquímica com um anticorpo para ki67 para revelar células sofrendo proliferação. Os resultados mostram que o tratamento com 18R5 resultou em números aumentados de células mucinosas positivas para azul de alcian. Adicionalmente, a frequência de células positivas para ki67 foi reduzida pelo tratamento com 18R5. De forma interessante, não ocorreu uma sobreposição entre as células mucinosas e células que foram positivas para ki67, sugerindo que as células mucinosas não são proliferativas. Isto proporciona evidência de que o tratamento com 18R5 está a promover a diferenciação de células tumorais em progénie não proliferativa.

Em resumo, a expressão de CEGA aumentada, a produção aumentada de mucinas conforme evidenciado pela coloração de azul de alcian, e a produção de progénie não proliferativa conforme evidenciado pela coloração com anticorpo Ki67 são consistentes com um modelo no qual a inibição da sinalização de Wnt-FZD com tratamento 18R5 promove a diferenciação de células tumorais pancreáticas a vários tipos de células distintas com características típicas de células diferenciadas não-proliferativas.

Exemplo 17

Estudos adicionais da eficácia in vivo com 18R5 por si só e/ou em combinação com outros agentes anti cancro

Efeito sobre o crescimento tumoral de xenoenxerto 0MP-LU24

Foi avaliada a eficácia do anticorpo 18R5 anti-FZD, tanto por si só como em combinação com Taxol® (paclitaxel), na inibição do crescimento dos tumores de pulmão humanos OMP-LU24 in vivo.

Foram injetadas 50.000 células tumorais de pulmão humano 0MP-LU24 por via subcutânea em ratinhos NOD-SCID. Os tumores foram deixados crescer durante 27 dias até alcançarem um volume médio de 143 mm·'. Os animais foram aleatorizados em 4 grupos (n = 9 por grupo) e tratados com anticorpo de controlo ("Ab Controlo"), anti-FZD 18R5 (" 18R5") , Taxol® ("Taxol") ou a combinação de 18R5 mais Taxol® ("18R5+Taxol"). Foram realizadas medições dos tumores nos dias indicados na Figura 44. Os anticorpos foram doseados a 10 mg/kg por via intraperitoneal (I.P.), uma vez por semana e foi doseado Taxol® a 15 mg/kg, I.P., uma vez por semana.

Os resultados são mostrados na Figura 44. 0 tratamento anti-FZD foi observado como reduzindo o crescimento tumoral, e o tratamento de combinação mostrou atividade antitumoral potenciada em relação a TaxoIa por si só.

Efeito sobre o crescimento tumoral de xenoenxerto OMP-LU33

Também foi testada a eficácia do anticorpo 18R5 anti-FZD, tanto por si só como em combinação com Avast in® (bevacizumab), na inibição do crescimento dos tumores de pulmão humano OMP-LU33 in vivo.

Foram injetadas 10.000 células tumorais de pulmão humano OMP-LU33 por via subcutânea em ratinhos NOD-SCID. Os tumores foram deixados crescer durante 30 dias até alcançarem um volume médio de 124 mm3. Os animais foram aleatorizados em 4 grupos (n = 10 por grupo) e tratados com anticorpo de controlo (quadrados), Avastin (triângulos apontando para baixo), 18R5 anti-FZD (triângulos apontando para cima) , ou a combinação de 18R5 e Avastin® (círculos) . Foram realizadas medições dos tumores nos dias indicados na Figura 45. Os anticorpos foram doseados a 10 mg/kg, I.P., duas vezes por semana.

Os resultados são mostrados na Figura 45. 0 tratamento anti-FZD foi observado como reduzindo o crescimento tumoral, e o tratamento de combinação mostrou atividade antitumoral potenciada em relação a Avast in’' por si só. Efeito sobre o crescimento tumoral de xenoenxerto T3

Foi também avaliada a eficácia do anticorpo 18R5 anti-FZD, tanto por si só como em combinação com Herceptin® (trastuzumab), na inibição do crescimento de tumores da mama humana T3 positivos para HER2 in vivo.

Foram injetadas 50.000 células de tumor de mama T3 humano por via subcutânea em ratinhos NOD-SCID. Os tumores foram deixados crescer durante 32 dias até alcançarem a um volume médio de 125 mm3. Os animais foram aleatorizados em 4 grupos (n = 10 por grupo) e tratados com anticorpo de controlo (quadrados), 18R5 anti-FZD (triângulos),

Herceptin® (pequenos círculos preenchidos), ou a combinação de 185 e Herceptin® (círculos abertos). Foram realizadas medições dos tumores nos dias indicados na Figura 46. Os anticorpos foram doseados a 10 mg/kg, I.P., duas vezes por semana.

Os resultados são mostrados na Figura 46. 0 tratamento de combinação com 18R5 e Herceptin® apresentou atividade antitumoral potenciada em relação a Herceptin® por si só. EXEMPLO 18

Sequências de anticorpos anti-FZD São proporcionadas CDRs de cadeia pesada e de cadeia leve dos anticorpos anti-FZD nas Quadros 7 e 8, abaixo, respetivamente. As regiões variáveis da cadeia pesada (VH) e as regiões variáveis da cadeia leve (VL) dos anticorpos anti-FZD e as suas sequências de codificação são identificadas no Quadro 9, abaixo. Os aminoácidos e sequências de polinucleótido da VH e VL listados no Quadro 9 são proporcionados nas Figuras 13-15 ou Quadros 10 e 11, abaixo. As sequências codificando a cadeia pesada ou a cadeia leve de anticorpos anti-FZD são proporcionadas nas Figuras 14-15 e Quadro 12, abaixo.

Quadro 7. CDRs de cadeia pesada de anticorpos humanos anti-

FZD

Quadro 8. CDRs de cadeia leve de anticorpos humanos anti-

Quadro 9. VH e VL de anticorpos humanos anti-FZD

Quadro 10. Sequências de aminoãcidos VH e VL anti-FZD adicionais

Quadro 11. Sequências de nucleótidos codificando VH e VL de _anticorpos anti-FZD adicionais_

Quadro 12. Sequências de nucleótidos codificando cadeias pesadas (HC) ou cadeias leves (LC) de anticorpos IgG anti-FZD IgG adicionais (incluindo sequências sinal)

Os plasmídeos isolados a partir de E. coli codificando os anticorpos anti-FZD IgG 18R4605 (Depósito ATCC N.° PTA-10307), 18R4805 (Depósito ATCC N.° PTA-10309) e 44R24 (Depósito ATCC N. ° . PTA-10311) foram depositados na

American Type Culture Collection (ATCC), 10801 Universidade Boulevard, Manassas, VA, EUA, sob as condições do Tratado de Budapeste a 26 de agosto de 2009. EXEMPLO 19

Perfis de ligação de anticorpos anti-FZD

Foi utilizada análise FACS para caracterizar os perfis de ligação a FZD1, 2, 5, 7 e 8 dos anticorpos monoclonais (mAbs) anti-FZD.

Foram co-transfetadas células HEK293 com um ADN de plasmídeo expressando FZD1, 2, 5, 7 ou 8 de comprimento completo juntamente com outro plasmídeo expressando o gene repórter GFP utilizado como um marcador de transfeção. Foi utilizado Fugene 6 (Roche) como reagente de transfeção de acordo com as instruções do fabricante. As células transfetadas foram incubadas vinte e quatro a quarenta e oito horas a 37 °C e C02 a 5%. Os mAbs anti-FZD foram diluídos num volume final de 50 μΐ iniciando com uma concentração de 20 pg/ml e diluídos em série de 4 vezes até um total de 8 diluições. Cada agrupamento de FZD/GFP293 transfetado de forma transitória foi recolhido em suspensão e foram incubadas 100.000 células transfetadas em gelo 30-60 minutos com o mAb anti-FZD diluído a ser testado. As células foram lavadas e os anticorpos anti-FZD ligados foram detetados com um anticorpo secundário anti-humano conjugado a um cromóforo fluorescente. As células etiquetadas foram detetadas e contadas através de FACS. Os dados gerados por FACS foram expressos em unidades de Intensidade de Fluorescência Média (MFI). Foi utilizado o software GraphPad Prism para representar graficamente e analisar os dados. As MFIs foram representadas graficamente como uma função da concentração de Ab para estabelecer curvas de resposta à dose. Foi aplicada uma regressão não-linear para ajustar os números à curva e calcular as EC50s.

Os perfis de ligação para os mAbs 18R5 e 44R24 foram determinados e comparados. A curva de resposta à dose representando a ligação de cada um dos 18R5 e 44R24 para Fzdl, 2, 5, 7 e 8 é mostrada na Figura 47. As EC50s (nM) calculadas para os dois mAbs são mostradas no Quadro 13. 44R24 ligou a Fzd5 e Fzd8 com boa afinidade. Mão pôde ser estabelecida uma curva de resposta à dose sigmoide para os outros três recetores Fzd, sugerindo que 44R24 não liga a Fzdl, 2 e 7. Foi confirmada afinidade de ligação elevada de Fzdl, 2, 5 e 7 para 18R5.

Quadro 13. EC50s (nM) para os mAbs 18R5 e 44R24

EXEMPLO 20

Avaliação da atividade anti-Wnt de mAbs anti-FZD em ensaios baseados em células A capacidade de 18R5 e 44R24 de inibir a sinalização de Wnt em células STF-293 foi avaliada e comparada. As células STF são Células Renais Embrionárias Humanas (HEK)-293 transfetadas estavelmente com a cassete repórter Super Top Flash (STF) em que a expressão do gene repórter de luciferase (Luc) é regulada por múltiplas cópias do sítio de ligação a TCF a montante de um promotor mínimo. Uma expressão basal baixa de Luc pode ser induzida por 30-60 vezes em resposta a Wnt3a, proporcionando uma grande janela para avaliar a atividade inibitória do anti-FZD Abs.

Para avaliar os mAbs, foram cultivadas células STF-293 em DMEM-FBS a 10%. No dia 1, foram semeadas 10.000 células por poço em placas Optical Bottom White de 96 poços (Nunc η.0 165306). As células foram incubadas O.N. a 37 °C e de C02 a 5%. No dia 2, os Abs a serem testados foram diluídos até uma concentração final de 40 pg/pl, utilizando meio de cultura. Foram realizadas sete diluições em série de 5 vezes. 0 meio de cultura de células STF-293 foi substituído por uma mistura contendo 50 μΐ de diluição de Ab, 25 μΐ de meio condicionado com Wnt3a a partir de células L estáveis para Wnt3a e 25 μΐ de DMEM-FBS a 10%. Para cada Ab, as concentrações finais testadas foram 20, 4, 0,8, 0,16, 0,03, 0,006, 0,0013, 0,0003 pg/ml. Cada concentração de Ab foi

testada por triplicado. Foi utilizado um Ab humano anti hapteno, LZ1, como controlo negativo de Ab. Foi utilizado um meio não condicionado com Wnt3a a partir de células L parentais como indutor de controlo negativo. As placas foram novamente colocadas na incubadora. A atividade luciferase foi medida no dia 3, utilizando o kit Promega Steady Glo (VWR n.° PAE2550-A) de acordo com as especificações do fabricante. Os resultados foram expressos em fotões por segundo. Foi utilizado o software GraphPad Prism para representar graficamente e analisar os dados. As atividades de luciferase foram representadas graficamente como uma função da concentração de Ab para estabelecer curvas de resposta à dose. Foi aplicada uma regressão não-linear aos números para ajustar a curva e calcular IC50s.

Foi igualmente determinada e comparada a capacidade de 44R24 e 18R5 de inibir a sinalização de Wnt em células STF como descrito acima. Os resultados são mostrados na Figura 48 e Quadro 14. A atividade de 44R24 somente foi detetada a concentrações mais elevadas de Ab, refletindo a baixa atividade do anticorpo no ensaio. 0 IC50 de 44R24 foi calculado como sendo 13 vezes inferior ao de 18R5.

Quadro 14. IC50s para a inibição da sinalização de Wnt em células ST-293 por 18R5 e44R24

A capacidade de 18R5 e 44R24 de inibir a sinalização de Wnt em células A54 9 também foi determinada. As células A549 são células de carcinoma de pulmão humano nas quais o gene Axin2 é altamente expresso, traduzindo a atividade endógena da via de sinalização de Wnt. Axin2 é um gene alvo de Wnt bem conhecido que responde à ativação da via através de regulação positiva da sua transcrição e eventualmente regulação negativa da sinalização de Wnt através de um mecanismo de retroalimentação. Este sistema foi utilizado para testar o impacto dos Abs anti-Fzd sobre os níveis de ARNm de Axin2 através de qPCR.

Foram semeadas placas de 12 poços com 30.000 células A54 9 por poço e cultivadas durante 3 dias em DMEM + FBS a 10%. Foram adicionados anticorpos a concentrações variáveis (5, 1, 0,2, 0,04, 0,008 pg/ml) durante 24 horas e foi extraído ARN total a partir das células. Foi utilizado LZ1, um anticorpo não ligante, como controlo negativo somente à concentração mais alta.

Foram semeadas 30.000 células A549 em placas de 12 poços e cultivadas durante 3 dias em DMEM + FBS a 10%. Foram adicionados anticorpos 18R5 anti-FZD ou 44R24 a concentrações variáveis (5, 1, 0,2, 0,04, 0,008 ug/ml), e foi utilizado LZ1, um anticorpo não ligante, como controlo negativo, somente à concentração mais alta. Foi fabricado ARN 24 horas após o tratamento e posteriormente tratado com ADNase.

Axin2 é conhecido como sendo um gene alvo robusto na sinalização de Wnt e o seu nível de expressão foi examinado realizando um ensaio de expressão relativa de Taqman (ΔΔΤΟ utilizando uma máquina Applied Biosystems 7900 HT. Foram utilizados 50 ng de ARN por ponto por triplicado e foi utilizada uma sonda GUSB para o controlo endógeno. Todos os resultados foram normalizados com os níveis de Axin2 na amostra de controlo de LZ1. A curva de resposta à dose mostrando a inibição do nível basal da expressão do gene axin2 por 18R5 e 44R24 e os valores de EC50 calculados para estes anticorpos são mostrados na Figura 49. 18R5 e 44R24 inibem os níveis basais de Axin2 em relação ao controlo de LZ1 com eficácias comparáveis. EXEMPLO 21

Avaliação da atividade antitumoral de mAbs anti-FZD em modelos de xenoenxerto pancreático Tumores pancreáticos OMP-PN13:

Foram obtidas células tumorais 0MP-PN13 que foram passadas duas vezes em ratinhos a partir do banco de tumores OncoMed. Foram descongeladas e injetadas por via subcutânea, no flanco esquerdo de ratinhos NOD/SCID imediatamente após o descongelamento. Foram injetadas ~25.000 células viáveis por animal. Os ratinhos foram monitorizados semanalmente para crescimento tumoral. Após o seu início, o tamanho dos tumores foi medido uma vez por semana através de calibre. Os ratinhos portadores de tumor com 200-300 mm3 foram atribuídos a grupos de tratamento que continham cada um 5 animais. 0 tamanho médio dos tumores foi comparável em cada grupo. Foi iniciado tratamento com Ab no dia após a aleatorização. Foi utilizado LZ1 como o controlo negativo de Ab. Foram administradas 3 doses de Ab a 10 mg/kg através de injeção intraperitoneal durante um período de 12 dias. Os ratinhos foram sacrificados 24 horas após a última injeção. 0 tumor, duodeno e fígado foram recolhidos.

Os tecidos tumorais foram fixos em formalina para inclusão em parafina e corte. Foi realizada deteção de Mucl6 através de imunohistoquímica (IHQ) para monitorizar o aparecimento de células produtoras de mucina. As mucinas são específicas para um subtipo de células diferenciadas no pâncreas, e como tal são utilizadas como marcadores de diferenciação no modelo de tumor.

Os cortes fixos em formalina e embebidos em parafina (FFPE) foram desparafinizados. As lâminas foram inicialmente desparafinizadas através de tratamento sequencial com xileno duas vezes durante 5 minutos cada uma. O tecido foi então novamente hidratado através de imersão numa série de etanol a 100% duas vezes durante 3 minutos cada uma, 90% uma vez durante um minuto, 80% uma vez durante um minuto e 70% após 1 minuto em água. 0 tecido foi lavado com fluxo de água destilada durante 1 minuto.

Foi utilizado anticorpo Mucin 16 (X325 clone da AbCAM, catálogo abl0033) para deteção IHC de células expressando mucina 16 em cortes do tecido FFPE. Foi realizada recuperação antigénica induzida por calor com tampão citrato 10 mM pH 6,0 num autoclave. As lâminas foram então mantidas à temperatura ambiente e as proteínas deixadas recuperar lentamente a antigenicidade (aproximadamente 2 horas).

Os cortes de tecido foram bloqueados com solução de peróxido de hidrogénio a 3% na água, lavados e posteriormente bloqueados novamente utilizando solução de Bloqueio de soro de Cavalo Normal (para 50 ml; PBS (38,5 ml), NHS a 10% (5 ml), BSA a 1% (5 ml), gelatina a 0,1% (500 μΐ) , 0,1% Tx-100 (500 μΐ) , NaN3 a 0,05% (500 μΐ) ) durante 1 hora à temperatura ambiente. Os cortes foram então corados com diluição 1:200 de anticorpo primário Mucl6 em diluente Verde de Da Vinci pH 7,3 (PD 900, Biocare Medicai) durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por três lavagens utilizando solução salina tamponada com fosfato contendo triton X-100 a 0,1%. Os cortes foram então corados com 3 gotas de conjugado IgG anti ratinho HRP ImmPress (catálogo 101098-260, VWR) durante 30 minutos à temperatura ambiente seguido por três lavagens com solução salina tamponada com fosfato contendo triton X-100 a 0,1%. As lâminas foram colocadas em placas de Petri e desenvolvidas utilizando o kit Vector NovaRed (SK4800, Vector labs) durante 1-2 minutos. A reação foi interrompida através da adição de água destilada. As lâminas foram enxaguadas minuciosamente sob fluxo de água destilada. Os cortes de tecido foram então contrastados utilizando hematoxilina (Catálogo H3401, fórmula de Vector Labs Gill) durante 1 minuto, lavados, e posteriormente neutralizados com solução de azulamento durante 30 segundos. As lâminas foram deixadas secar durante a noite e montadas utilizando VectaMount (Vector Labs).

Os campos representativos de tumores tratados com Ab de controlo (LZ1), 18R5 ou 44R24 são mostrados na Figura 50. Enquanto LZ1 foi associado com baixa intensidade de coloração, foram detetados níveis mais elevados de coloração com o anticorpo Muclô nos tumores tratados com 18R5. Isto sugere que foi induzida diferenciação das células tumorais para a linha celular produtora de mucina por 18R5. Os níveis da coloração de Muclô nos tumores tratados com 44R24 foram mais moderados do que nos tumores tratados com 18R5, mas pareceram ainda ser um pouco mais elevados do que nos tumores tratados com LZ1 nesta experiência.

Também foram extraídos ARNs totais a parti do tumor, duodeno, fígado para análises de expressão génica de Wnt alvo utilizando qPCR.

Os tecidos foram imediatamente transferidos para RNAlater (QIAGEN) no momento da recolha. 0 ARN foi extraído utilizando mini kit QIAGEN RNeasy para tecido fibroso de acordo com as instruções do fabricante. Foram submetidos 50 ng de ARN total a análises de expressão génica utilizando protocolo ABI de RT-PCR de uma etapa e reagentes. Foi utilizada expressão génica de GusB como controlo endógeno. Foram configurados triplicados para cada amostra. Foram analisados os 5 tumores de cada grupo de tratamento. Foi utilizada a máquina ABI 7900 TaqMan para executar as experiências. Foi utilizado o software ABI SDS 2.2.1 para analisar os dados e calcular valores de DeltaCt que foram convertidos em quantidades relativas. Foram calculados os valores por triplicado dos cinco tumores para cada grupo de tratamento. Foram calculados os fatores de magnitude de inibição em relação ao anticorpo de controlo (LZ1) .

Os resultados são mostrados no Quadro 15. Os genes Wnt alvo foram variavelmente afetados pelos Abs anti-FZD. 18R5 induziu inibição de 2,3x e 8x no tumor e no fígado, enquanto permanecendo inalterado no duodeno. As alterações induzidas por 44R24 foram mais moderadas.

Quadro 15, Análise qPCR da expressão génica de genes Wnt alvo em tecidos tratados com 18R5 e 44R24.

Tumores pancreáticos 0MP-Pn4:

Foi também investigado o impacto de 18R5 no estroma tumoral no modelo de xenoenxerto de tumor pancreático OMP-Pn4. Foram identificados vários genes através de microarranjo cujos níveis de expressão foram alterados pelo tratamento. Entre os mesmos, ACTA2, que codifica a proteína actina do músculo liso (SMA), é de particular interesse. A SMA foi mostrada como estando associada com estroma tumoral ativado. A sua regulação negativa pode como tal ser vista como um sinal de fenótipo tumorigénico diminuído.

Conforme descrito no Exemplo 7, foram tratados ratinhos NOD/SCID portadores de tumor 0MP-Pn4 com o controlo Ab (LZ-1), 18R5, gemcitabina, ou a combinação de 18R5 e gemcitabina uma vez por semana durante 6 semanas. Os anticorpos foram administrados a uma concentração de 10 mg/kg. Após terem sido recolhidos, os tumores a partir dessa experiência foram analisados para a expressão de genes Wnt alvo aos níveis tanto de ARN como de proteínas, utilizando microarranjo e IHC, respetivamente.

Foi extraído ARN total a partir dos tumores, amplificado, e submetido a análise por microarranjo. Os ARNs totais foram amplificados utilizando Ovation RNA Amplification System V2 (NuGEN, San Carlos, CA) . 0 ADNcss de sentido reverso amplificado resultante foi fragmentado e biotinilado utilizando FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 (NuGEN) para utilização em chips Affymetrix. Foram utilizados HG-U133 Affymetrix mais microarranj os de oligonucleótido 2 ou MG 430 2,0 nestas experiências (realizados em Almac Diagnostics, Durham, NC) . Após a hibridação, os Chips de Gene foram lavados, corados e rastreados de acordo com as instruções do fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA) . A qualidade do ADNc e do ADNc fragmentado foi avaliada através de espectrofotometria e Bioanalizador antes da hibridação do arranjo. Os dados do chip rastreados foram quantificados e escalonados utilizando o pacote de software GCOS (Affymetrix) e submetidos a uma avaliação global do Controlo de Qualidade de Chips de Gene de recomendados pela Affymetrix para detetar quaisquer defeitos de chips e corpos estranhos, que foram excluídos da análise de dados subsequente.

Foram realizados ajuste de fundo do arranjo e normalização da intensidade do sinal com o algoritmo GCRMA no software Bioconductor open-source (www.bioconductor.org). Foram identificados genes expressos diferencialmente entre dois grupos ou pontos de tempo com o teste t Bayesiano (Cyber-T), que combina o teste t de Student com uma estimativa Bayesiana da variância intra-grupo obtida a partir da variação observada de conjuntos de sonda a níveis de expressão semelhantes (Baldi P, Long AD. A Bayesian framework for the analysis of microarray expression data: regularized t-test and statistical inferences of gene changes. Bioinformatics. 2001,-17(6) :509-19) .

Para a análise de chips de genes tumorais humanos, foram ensaiadas amostras em chips humanos e de ratinho para avaliar os efeitos do tratamento em tumores humanos em massa e em estroma do ratinho de forma independente. Estes conjuntos de sonda Affymetrix que não foram específicos para a espécie foram omissos da análise.

Na preparação para imunofluoresceneia da alfa actina do músculo liso (SMAa), o tecido tumoral foi congelado utilizando OCT, foram obtidos cortes de 4 micra e armazenados sob congelamento a -80 °C. Para coloração de SMAa, o tecido foi fixo utilizando acetona gelada a -20 °C durante 15 minutos e posteriormente deixado secar e alcançar a temperatura ambiente e posteriormente marcado utilizando uma caneta hidrofóbica PAP. As lâminas foram lavadas utilizando solução salina tamponada com fosfato (PBS). 0 tecido foi bloqueado utilizando soro de cavalo normal R.T.U. (Vector Labs) durante 2 horas à temperatura ambiente. Foi realizada coloração do anticorpo primário com diluição 1:10.000 de anticorpo de alfa actina de músculo liso conjugado com FITC (1A4 Cline, n.° F3777, SIGMA) durante 1 hora. Os cortes foram lavados 3 vezes utilizando PBS contendo triton X-100 a 0,1%. As lâminas foram então secas ao ar e então montadas utilizando meio de montagem Hard set contendo DAPI (vectashied H-500). A Figura 51 mostra os níveis de expressão do gene ACTA2 detetados através de microarranjo. Os tumores tratados com o anticorpo 18R5 anti-FZD mostraram diminuição dos níveis de expressão de ACTA2. A Figura 51 B mostra os resultados da imunofluorescência de alfa actina de músculo liso (SMAa) em tumores 0MP-PN4 tratados com mAb de controlo (painel superior) e 18R5 (painel inferior). Foram detetadas quantidades reduzidas de SMAa nos tumores tratados com 18R5. A expressão de ACTA2 e a quantidade de SMA foram dramaticamente reduzidas no estroma tumoral em resposta à 18R5, sugerindo que o bloqueio Wnt (i) impacta este compartimento do tumor e (ii) fã-lo reduzindo um marcador de tumorigenicidade bem estabelecido. Estes resultados sugerem que a redução da ativação de miofibroblastos podem ser um dos mecanismos da ação anti tumoral de 18R5. EXEMPLO 22

Avaliação do potencial tumorigénico de células 0MP-PN13 positivas para Mucl6

Conforme descrito acima, o tratamento com 18R5 induziu expressão génica e alterações de fenótipos celulares em tumores pancreáticos, incluindo expressão aumentada de mucina. Em particular, IHC realizada em tumores tratados com PN-13 revelou um aumento do número de células positivas para Mucl6. Os níveis de expressão de gene Mucl6 também foram mais elevados nos tumores tratados do que nos tumores de controlo. A tumorigenicidade das células positivas para Mucl6 induzidas por 18R5 foi avaliada para testar a hipótese de que as células positivas para Mucl6 induzidas por 18R5 são representativas de uma subpopulação de células tumorais diferenciadas.

Foram tratados ratinhos portadores de 0MP-PN13 com 18R5 acordo com o protocolo descrito no Exemplo 21. Os ratinhos foram sacrificados 12 dias após o início do tratamento com Ab. Os tumores foram recolhidos e processados para obter uma suspensão celular única com colagenase III para digerir os tecidos. As células do estroma dos ratinhos foram marcadas com um anticorpo anti-H - 2Kd biotinilado e um anticorpo anti-CD4 5 biotinilado. Foram então incubadas com microesferas magnéticas conjugadas a estreptavidina (Thermo MagnaBind) e esgotadas utilizando um íman Dynal. As células tumorais esgotadas de lin resultantes foram marcadas com um mAb anti-Mucl6 detetado com um Ab secundário conjugado com PE. As células positivas para Mucl6 e negativas para Mucl6 foram classificadas utilizando uma máquina ARIA FACS executada pelo software DIVA. Veja-se Figura 52A. As células foram novamente injetadas por via subcutânea no flanco esquerdo de ratinhos NOD/SCID para comparação das suas potencialidades tumorigénicas. Cada tipo de célula foi injetada em 10 ratinhos. Cada ratinho recebeu 75 células. São mostradas imagens representativas de tumores resultando a partir da injeção de células Mucl6- (painel superior) e Mucl6 + (painel inferior) na Figura 52B. As curvas de crescimento para os tumores Mucl6- e Muc 16+ após injeção nos ratinhos são mostradas na Figura 52C. Não cresceram tumores após a injeção das células Muc 16+, enquanto 7 dos 10 ratinhos injetados com as células Mucl6- desenvolveram tumores. Os dados sugerem que as células Muc 16+ induzidas por 18R5 não são tumorigénicas, suportando a indução de diferenciação como mecanismo subjacente da atividade antitumoral de 18R5. EXEMPLO 23

Estudos adicionais in vivo com anticorpos anti-FZD

Estudo de recorrência de tumor de mama PE 13 com mAb 18R5: Foram injetadas células de tumor de mama PE13 em ratinhos Nod-Scid e deixadas crescer até os tumores alcançarem aproximadamente 100 mm3. Os animais foram aleatorizados em dois grupos (n = 10) e foi-lhes administrado taxol (15 mg/kg, duas vezes por semana) + Anticorpo de controlo (quadrados pretos) ou a mesma dose de taxol + Anti-FZD 18R5 (círculos cinzentos abertos). Os anticorpos foram doseados a 20 mg/kg uma vez por semana. Os tratamentos com Taxol foram interrompidos em 70 dias e os tratamentos com anticorpos continuaram. Os resultados são mostrados na Figura 53. 18R5 foi observado como potenciando a taxa de regressão do tumor e retardando a recorrência de tumores após a interrupção do tratamento com taxol.

Estudo de ensaio de diluição limitante (LDA) de tumor de mama PE13 com mAb 18R5: Foram tratados animais portadores de tumores de mama PE13 com anticorpo de controlo (círculos cinzentos), 18R5 (triângulos abertos), taxol (círculos pretos), ou a combinação de taxol e 18R5 (quadrados abertos). 0 taxol foi administrado a doses de 15 mg/kg, duas vezes por semana e os anticorpos foram administrados a doses de 20 mg/kg uma vez por semana. Os tumores foram recolhidos e as células tumorais humanas foram purificadas através de esgotamento de lin. Foram injetadas 50, 150 ou 500 células tumorais numa nova coorte de ratinhos (n = 10 por dose de células). Os resultados são mostrados na Figura 54. A frequência de crescimento tumoral foi monitorizada após 59 dias e utilizada para calcular a frequência CSC (L-calc).

Estudo de recorrência de tumores pancreáticos PN4 com mAb 18R5: Foram injetadas células de tumor pancreático PN4 em ratinhos NOD-SCID e deixadas crescer até os tumores alcançarem aproximadamente 250 mm3. Os animais receberam gemeitabina (75 mg/kg, uma vez por semana) durante 5 semanas até que os tumores terem regredido. Os animais foram aleatorizados em dois grupos e foi-lhes administrado anticorpo de controlo (quadrados pretos) ou 18R5 anti-FZD (círculos abertos cinzentos). Os anticorpos foram doseados a 10 mg/kg uma vez por semana. Os resultados são mostrados na Figura 55. 18R5 foi observado como retardando a recorrência do tumor após o tratamento com gemeitabina.

Estudo do crescimento de tumores pancreáticos PN4 com mAb 44R24: Foram injetados tumores pancreáticos PN4 em ratinhos Nod-Scid. Os tumores foram deixados crescer até terem alcançado um volume de aproximadamente 150 mm3. Os animais foram aleatorizados em 4 grupos (n = 10 por grupo) e foi-lhes administrado anticorpo de controlo (quadrados pretos), 44R24 anti-FZD5/8 (triângulos abertos cinzentos), gemeitabina (triângulos cheios), ou uma combinação de 44R24 mais gemeitabina (círculos cinzentos abertos). Foi doseada gemeitabina a 15 mg/kg uma vez por semana e os anticorpos foram doseados a 20 mg/kg duas vezes por semana. Os resultados são mostrados na Figura 56. 44R24 foi observado como reduzindo o crescimento tumoral em combinação com gemeitabina em relação a gemeitabina por si só. EXEMPLO 24

Mapeamento de epítopos do anticorpo 44R24 anti-FZD

Foi realizado mapeamento de epítopos para o anticorpo anti-FZD 44R24 de uma forma semelhante à descrita acima no Exemplo 5 para os anticorpos 18R8 e 18R5. Foi avaliada a capacidade de 44R24 de ligar a um epítopo semelhante a 18R8 através de citometria de fluxo utilizando uma série de variantes de aminoácidos de FZD8 previamente mostradas como rompendo a ligação de 18R8 (veja-se Exemplo 5 e Figuras 6 e 7) . Os aminoácidos 126-127 de FZD8 foram considerados como sendo requeridos para a ligação de 44R24 conforme indicado por coloração reduzida dentro da população de células co-transfetadas (positivas para GFP) . Os resultados das experiências FACS são mostrados na Figura 57. Estes resultados mostram que 44R24 liga a um epítopo que está sobreposto com o epítopo de 18R8 e compreende os aminoácidos 126-127compartilhados. EXEMPLO 25

Estudo do crescimento de tumores do cólon C28 com anticorpos anti-FZD 18R5, 18R8 e 44R24

Foram injetadas células tumorais C28 por via subcutânea em ratinhos Nod-Scid. Os tumores foram deixados crescer até alcançarem um volume médio de 126 mm3. Os animais portadores do tumor foram aleatorizados em quatro grupos (n = 10 ratinhos por grupo) e tratados com Ab de Controlo (quadrados pretos), 18R8 (triângulos cinzentos), 44R24 (círculos pretos abertos) ou 18R5 (círculos cinzentos) (Figura 58) . Os anticorpos foram doseados por via intraperitoneal a 15 mg/kg, duas vezes por semana. São indicados os volumes tumorais. O tratamento com anticorpos 44R24 e 18R5 reduziu o crescimento em relação ao grupo de controlo, enquanto 18R8 não teve efeito (Figura 58).

Após o tratamento dos animais na experiência mostrada na Figura 58, os tumores foram recolhidos, fixos em formalina, embebidos em parafina e cortados em cortes de 5 micra. Os cortes de tumor foram analisados para a expressão de Citoqueratina 7, um marcador de diferenciação das células do cólon, através de imunohistoquímica (kit Vectastain, Vector Labs). A expressão da Citoqueratina 7 foi observada como sendo elevada após o tratamento com 44R24 ou 18R5 (Figura 59),

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> oncomed Pharmaceuticals, Inc. Gurney, Austin L. Sato, Aaron Ken Axelrod, Fumiko Takada satyal, Sanjeev H. <120> Agentes de Ligação a Frizzled e Utilizações dos Mesmos <130> 2293.051PC04 <140> PCT/US0 9/5863 5 <141> 28-09-2009 <150> 61/176.741 <151> 08-05-2009 <150> 61/144.248 <151> 13-01-2009 <150> 61/144.058 <151> 12-01-2009 <150> 61/100.639 <151> 26-09-2008 <160> 97 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> CDR1 de cadeia pesada <400> 1

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<210> 12 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> região variável de cadeia leve (VL) de 18R8 <400> 12

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Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 <210> 16

<211> 485 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> proteína de fusão EDC FC de Fzd7 <400> 16

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Leu Ser Pro Gly lvs 485

<210> 17 <211> 354 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223>região variável de cadeia pesada (VH) de 18R5/18R8 <400> 17 gaagtgcaac tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac ctggcggcag cctgagactg 60 agctgcgctg cctccggatt taccttttct cattatactc tgtcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgtt' atctctggtg atggtagcta tacctattat 180 gctgatagcg tgaaaggcag atttaccatt tcaagtgata attccaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaagat acagccgtgt attattgcgc tagaaatttt 300 attaagtatg tttttgctaa ttggggccaa ggcaccctgg tgacagttag ctca 354 <210> 18 <211> 1389

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> cadeia pesada (IgG2) de 18R5/18R8 <400> 18 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtccgaa 60 gtgcaactgg tggaaagcgg cggcggcctg gtgcaacctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgctgcct ccggatttac cttttctcat tatactctgt cttgggtgcg ccaagcccct 180 gggaagggtc tcgagtgggt gagcgttatc tctggtgatg gtagctatac ctattatgct 240 gatagcgtga aaggcagatt taccatttca agtgataatt ccaaaaacac cctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc tgaagataca gccgtgtatt attgcgctag aaattttatt 360 aagtatgttt ttgctaattg gggccaaggc accctggtga cagttagctc agccagcaca 420 aagggcccta gcgtcttccc tctggctccc tgcagcagga gcaccagcga gagcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720 gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaa 1389 <210> 19 <211> 324

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> região variável de cadeia leve (VL) de 18R8 <400> 19 gatatcgaac tgacccagcc tccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgctagaatc 60 tcttgtagcg gcgataagct gggtaagaag tatgcttctt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggctccag ttctggtgat ttatgagaag gataatagac cctcaggcat ccctgaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgct accctgacca ttagcggcac tcaggctgaa 240 gacgaagccg attattattg ctcttctttt gctggtaatt ctctggaggt gtttggcggc 300 ggcaccaagt taaccgtcct gggt 324 <210> 20 <211> 696

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> cadeia leve (lambda) de 18R8 <400> 20 atggcctggg ctctgctgct cctcaccctc ctcactcagg gcacaggatc ctgggctgat 60 atcgaactga cccagcctcc ttcagtgagc gttgcaccag gtcagaccgc tagaatctct 120 tgtagcggcg ataagctggg taagaagtat gcttcttggt accagcagaa acccgggcag 180 gctccagttc tggtgattta tgagaaggat aatagaccct caggcatccc tgaacgcttt 240 agcggatcca acagcggcaa caccgctacc ctgaccatta gcggcactca ggctgaagac 300 gaagccgatt attattgctc ttcttttgct ggtaattctc tggaggtgtt tggcggcggc 360 accaagttaa ccgtcctggg tcagcccaag gctgccccca gcgtcactct gttccctccc 420 tcctctgagg agctgcaagc caacaaggcc acactggtgt gtctcataag tgacttctac 480 cctggagccg tgacagtggc ctggaaggca gatagcagcc ccgtcaaggc tggagtggag 540 accaccacac cctccaaaca aagcaacaac aagtacgctg ccagcagcta tctgagcctg 600 acacctgagc agtggaagtc ccacagaagc tacagctgcc aggtcacaca tgaagggagc 660 accgtggaga agacagtggc ccctacagaa tgttca 696 <210> 21 <211> 324

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> região variável de cadeia leve de 18R5 <400> 21 gatatcgagc tgactcagcc tccatccgtg agtgtggccc ctggtcagac agcacgcatc 60 agctgctccg gggacaatat cggatctttc tacgtgcact ggtateagca gaagcctggt 120 caggctccag ttctcgttat ctatgataag agtaatcgcc cctctgggat tccagagcgc 180 ttcagcggaa gcaacagcgg aaatactgca actctcacaa tttccggtac tcaggctgag 240 gacgaagccg actattactg ccaaagctac gcaaacaccc tgtccctcgt cttcggaggc 300 ggaaccaagt taaccgtcct gggt 324 <210> 22 <211> 696

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> cadeia leve (lambda) de 18R5 <400> 22 atggcatggg cactgctgct gctcactctg ctgacacaag gtactggctc ttgggccgat 60 atcgagctga ctcagcctcc atccgtgagt gtggcccctg gtcagacagc acgcatcagc 120 tgctccgggg acaatatcgg atctttctac gtgcactggt atcagcagaa gcctggtcag 180 gctccagttc tcgttatcta tgataagagt aatcgcccct ctgggattcc agagcgcttc 240 agcggaagca acagcggaaa tactgcaact ctcacaattt ccggtactca ggctgaggac 300 gaagccgact attactgcca aagctacgca aacaccctgt ccctcgtctt cggaggcgga 360 accaagttaa ccgtcctggg tcagcccaag gctgccccca gcgtcactct gttccctccc 420 tcctctgagg agctgcaagc caacaaggcc acactggtgt gtctcataag tgacttctac 480 cctggagccg tgacagtggc ctggaaggca gatagcagcc ccgtcaaggc tggagtggag 540 accaccacac cctccaaaca aagcaacaac aagtacgctg ccagcagcta tctgagcctg 600 acacctgagc agtggaagtc ccacagaagc tacagctgcc aggtcacaca tgaagggagc 660 accgtggaga agacagtggc ccctacagaa tgttca 696

<210> 23 <211> 1455 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> proteína de fusão EDC FC de Fzd7 <400> 23 atgcgggacc ccggcgcggc cgctccgctt tcgtccctgg gcctctgtgc cctggtgctg 60 gcgctgctgg gcgcactgtc cgcgggcgcc ggggcgcagc cgtaccacgg agagaagggc 120 atctccgtgc cggaccacgg cttctgccag cccatctcca tcccgctgtg cacggacatc 180 gcctacaacc agaccatcct gcccaacctg ctgggccaca cgaaccaaga ggacgcgggc 240 ctcgaggtgc accagtteta cccgctggtg aaggtgcagt gttctcccga actccgcttt 300 ttcttatgct ccatgtatgc gcccgtgtgc· accgtgctcg atcaggccat cccgccgtgt 360 cgttctctgt gcgagcgcgc ccgccagggc tgcgaggcgc tcatgaacaa gttcggcttc 420 cagtggcccg agcggctgcg ctgcgagaac ttcccggtgc acggtgcggg cgagatctgc 480 gtgggccaga acacgtcgga cggctccggg ggcccaggcg gcggccccac tgcctaccct 540 accgcgccct acctgccgga cctgcccttc accgcgctgc ccccgggggc ctcagatggc 600 agggggcgtc ccgccttccc cttctcatgc ccccgtcagc tcaaggtgcc cccgtacctg 660 ggctaccgct tcctgggtga gcgcgattgt ggcgccccgt gcgaaccggg ccgtgccaac 720 ggcctgatgt actttaagga ggaggagagg cgcttcgccc gcctcgggcg cgccgacaaa 780 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 840 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 900 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 960 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 1020 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1080 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1140 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1200 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1260 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgaeggc 1320 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1380 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1440 ctgtctccgg gtaaa 1455

< 210 > 24 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> fragmento de recetor frizzled Humano <400> 24

Gin Asp Glu Glu Asp Ala Gly Leu Glu Vai His Gin Phe Tyr Trp Pro 15 10 15

Leu

<210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> fragmento de recetor frizzled Humano <400> 25

Gly Leu Glu Val His Gin 1 5

<210> 26 <211> 647 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> recetor frizzled Humano FZD1 <400> 26

Met Ala Glu Glu Glu Ala Pro Lys Lys Ser Arg Ala Ala Gly Gly Gly 15 10 15

Ala Ser Trp Glu Leu cys Ala Gly Ala Leu Ser Ala Arg Leu Ala Glu 20 25 30

Glu Gly Ser Gly Asp Ala Gly Gly Arg Arg Arg pro pro val Asp Pro 35 40 45

Arg Arg Leu Ala Arg Gin Leu Leu Leu Leu Leu Trp Leu Leu Glu Ala 50 55 60

Pro Leu Leu Leu Gly Val Arg Ala Gin Ala Ala Gly Gin Gly Pro Gly 65 70 75 80

Gin Gly Pro Gly Pro Gly Gin Gin Pro Pro Pro Pro Pro Gin Gin Gin 85 90 95

Gin Ser Gly Gin Gin Tyr Asn Gly Glu Arg Gly lie Ser Val Pro Asp 100 105 110

His Gly Tyr cys Gin Pro lie Ser lie Pro Leu cys Thr Asp lie Ala 115 120 125

Tyr Asn Gin Thr lie Met Pro Asn Leu Leu Gly His Thr Asn Gin Glu 130 135 140

Leu Glu val His Gin Rhe Tyr pro Leu val Lys val Gin

Ala G y 150 15S 160 2.4!> ru_ 4la Glu Leu Lys Rhe Rhe Leu Cys ser Met Tyr Ala Pro val tys ser 165 170 175 rve Tur Vai Leu Glu Gin Ala Leu Pro Pro cys Arg Ser Leu Cys Glu cys Tor va« igQ 185 190

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Mig Aia wy ^ 200 205

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Glv His Ara Gly Gly Phe Pro Gly Gly Ala Gly Ala Ser Glu Arg Gly 260 265 270

Lys Phe ser cys Pro Arg Ala Leu Lys val pro Ser Tyr Leu Asn Tyr 275 280 285

His phe Leu Gly Glu Lys Asp Cys Gly Ala pro Cys Glu Pro Thr Lys 290 295 300

Val Tyr Glv Leu Met Tyr Phe Gly Pro Glu Glu Leu Arg Phe Ser Arg 305 310 315 320

Thr Trp He Gly lie Trp ser val Leu cys cys Ala Ser Thr Leu Phe 325 330 335

Thr val Leu Thr Tyr Leu val Asp Met Arg Arg Phe Ser Tyr pro Glu 340 345 350

Arg Pro He lie Phe Leu ser Gly Cys Tyr Thr Ala val Ala val Ala 355 360 365

Tyr He Ala Gly Phe Leu Leu Glu Asp Arg val val cys Asn Asp Lys 370 375 380

Phe Ala Glu Asp Gly Ala Arg Thr val Ala Gin Gly Thr Lys Lys Glu 385 390 395 400

Gly cys Thr lie Leu Phe Met Met Leu Tyr Phe Phe Ser Met Ala ser 405 410 415

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Met Lys Trp Gly h1s Glu Ala lie Glu Ala Asn ser Gin Tyr Phe His 435 440 445

Leu Ala Ala Trp Ala val Pro Ala lie Lys Thr lie Thr lie Leu Ala 450 455 460

Leu Gly Gin val Asp Gly Asp val Leu Ser Gly val Cys Phe Val Gly 465 470 475 480

Leu Asn Asn Val Asp Ala Leu Arg Gly Phe val Leu Ala pro Leu Phe 485 490 495

Val Tyr Leu Phe lie Gly Thr Ser Phe Leu Leu Ala Gly Phe Val Ser 500 505 510

Leu Phe Arg lie Arg Thr lie Met Lys His Asp Gly Thr Lys Thr Glu 515 520 525

Lys Leu Glu Lys Leu Met Val Arg lie Gly val Phe ser val Leu Tyr 530 535 540

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Phe Arg Asp Gin Trp Glu Arg Ser Trp Val Ala Gin Ser Cys Lys Ser 565 570 575

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His pro pro Met ser Pro Asp Phe Thr val Phe Met lie Lys Tyr Leu 595 600 605

Met Thr Leu lie val Gly lie Thr ser Gly Phe Trp lie Trp ser Gly 610 615 620

Lys Thr Leu Asn ser Trp Arg Lys Phe Tyr Thr Arg Leu Thr Asn Ser 625 630 635 640

Lys Gin Gly Glu Thr Thr val 645 <210> 27

<211> 321 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> domínio extracelular (ECD) de FZD1 <400> 27

Met Ala Glu Glu Glu Ala Pro Lys Lys Ser Arg Ala Ala Gly Gly Gly 15 10 15

Ala Ser Trp Glu Leu Cys Ala Gly Ala Leu Ser Ala Arg Leu Ala Glu 20 25 30

Glu Gly Ser Gly Asp Ala Gly Gly Arg Arg Arg Pro Pro Val Asp Pro 35 40 45

Arg Arg Leu Ala Arg Gin Leu Leu Leu Leu Leu Trp Leu Leu Glu Ala 50 55 60

Pro Leu Leu Leu Gly Val Arg Ala Gin Ala Ala Gly Gin Gly Pro Gly 65 70 75 80

Gin Gly Pro Gly Pro Gly Gin Gin Pro Pro Pro Pro Pro Gin Gin Gin 85 90 95

Gin Ser Gly Gin Gin Tyr Asn Gly Glu Arg Gly lie Ser val Pro Asp 100 105 110

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Cys Thr val Leu Glu Gin Ala Leu Pro Pro Cys Arg Ser Leu Cys Glu 180 185 190

Arg Ala Arg Gin Gly Cys Glu Ala Leu Met Asn Lys Phe Gly Phe Gin 195 200 205

Trp pro Asp Thr Leu Lys cys Glu Lys Phe Pro val His Gly Ala Gly 210 215 220

Glu Leu Cys Val Gly Gin Asn Thr ser Asp Lys Gly Thr Pro Thr Pro 225 230 235 240

Ser Leu Leu Pro Glu Phe Trp Thr Ser Asn Pro Gin His Gly Gly Gly 245 250 255

Gly His Arg Gly Gly Phe Pro Gly Gly Ala Gly Ala Ser Glu Arg Gly 260 265 270

Lys Phe Ser Cys Pro Arg Ala Leu Lys Val Pro Ser Tyr Leu Asn Tyr 275 280 285

His Phe Leu Gly Glu Lys Asp Cys Gly Ala pro Cys Glu pro Thr Lys 290 295 300

Val Tyr Gly Leu Met Tyr Phe Gly Pro Glu Glu Leu Arg Phe Ser Arg 305 310 315 320

Thr

<210> 28 <211> 151 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> domínio Fri de FZD1 Humano <400> 28

Gin Gin pro Pro Pro Pro Pro Gin Gin Gin Gin Ser Gly Gin Gin Tyr 15 10 15

Asn Gly Glu Arg Gly lie Ser val Pro Asp His Gly Tyr cys Gin Pro 20 25 30 lie ser lie pro Leu cys Thr Asp lie Ala Tyr Asn Gin Thr lie Met 35 40 45

Pro Asn Leu Leu Gly His Thr Asn Gin Glu Asp Ala Gly Leu Glu val 50 55 60

His Gin Phe Tyr Pro Leu Val Lys Val Gin Cys Ser Ala Glu Leu Lys 65 70 75 80

Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Ala Pro Val Cys Thr val Leu Glu Gin 85 90 95

Ala Leu Pro Pro cys Arg Ser Leu Cys Glu Arg Ala Arg Gin Gly Cys 100 105 110

Glu Ala Leu Met Asn Lys Phe Gly Phe Gin Trp Pro Asp Thr Leu Lys 115 120 125

Cys Glu Lys Phe Pro val His Gly Ala Gly Glu Leu Cys Val Gly Gin 130 135 140

Asn Thr Ser Asp Lys Gly Thr 145 150

<210> 29 <211> 1944 < 212 > ADN <213> Sequência artificial <220> <223> FZD1 Humano <400> 29 atggctgagg aggaggcgcc taagaagtcc cgggccgccg gcggtggcgc gagctgggaa 60 ctttgtgccg gggcgctctc ggcccggctg gcggaggagg gcagcgggga cgccggtggc 120 cgccgccgcc cgccagttga cccccggcga ttggcgcgcc agctgctgct gctgctttgg 180 ctgctggagg ctccgctgct gctgggggtc cgggcccagg cggcgggcca ggggccaggc 240 caggggcccg ggccggggca gcaaccgccg ccgccgcctc agcagcaaca gagcgggcag 300 cagtacaacg gcgagcgggg catctccgtc ccggaccacg gctattgcca gcccatctcc 360 atcccgctgt gcacggacat cgcgtacaac cagaccatca tgcccaacct gctgggccac 420 acgaaccagg aggacgcggg cctggaggtg caccagttct accctctagt gaaagtgcag 480 tgttccgctg agctcaagtt cttcctgtgc tccatgtacg cgcccgtgtg caccgtgcta 540 gagcaggcgc tgccgccctg ccgctccctg tgcgagcgcg cgcgccaggg ctgcgaggcg 600 ctcatgaaca agttcggctt ccagtggcca gacacgctca agtgtgagaa gttcccggtg 660 cacggcgccg gcgagctgtg cgtgggccag aacacgtccg acaagggcac cccgacgccc 720 tcgctgcttc cagagttctg gaccagcaac cctcagcacg gcggcggagg gcaccgtggc 780 ggcttcccgg ggggcgccgg cgcgtcggag cgaggcaagt tctcctgccc gcgcgccctc 840 aaggtgccct cctacctcaa ctaccacttc ctgggggaga aggactgcgg cgcaccttgt 900 gagccgacca aggtgtatgg gctcatgtac ttcgggcccg aggagctgcg cttctcgcgc 960 acctggattg gcatttggtc agtgctgtgc'tgcgcctcca cgctcttcac ggtgcttacg 1020 tacctggtgg acatgcggcg cttcagctac ccggagcggc ccatcatctt cttgtccggc 1080 tgttacacgg ccgtggccgt ggcctacatc gccggcttcc tcctggaaga ccgagtggtg 1140 tgtaatgaca agttcgccga ggacggggca cgcactgtgg cgcagggcac caagaaggag 1200 ggctgcacca tcctcttcat gatgctctac ttcttcagca tggccagctc catctggtgg 1260 gtgatcctgt cgctcacctg gttcctggcg gctggcatga agtggggcca cgaggccatc 1320 gaagccaact cacagtattt tcacctggcc gcctgggctg tgccggccat caagaccatc 1380 accatcctgg cgctgggcca ggtggacggc gatgtgctga gcggagtgtg cttcgtgggg 1440 cttaacaacg tggacgcgct gcgtggcttc gtgctggcgc ccctcttcgt gtacctgttt 1500 atcggcacgt cctttctgct ggccggcttt gtgtcgctct tccgcatccg caccatcatg 1560 aagcacgatg gcaccaagac cgagaagctg gagaagctca tggtgcgcat tggcgtcttc 1620 agcgtgctgt acactgtgcc agccaccatc gtcatcgcct gctacttcta cgagcaggcc 1680 ttccgggacc agtgggaacg cagctgggtg gcccagagct gcaagagcta cgctatcccc 1740 tgccctcacc tccaggcggg cggaggcgcc ccgccgcacc cgcccatgag cccggacttc 1800 acggtcttca tgattaagta ccttatgacg ctgatcgtgg gcatcacgtc gggcttctgg I860 atctggtccg gcaagaccct caactcctgg aggaagttct acacgaggct caccaacagc 1920 aaacaagggg agactacagt ctga 1944 <210> 30 <211> 565

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> FZD2 Humano <400> 30

Met Arg Pro Arg ser Ala Leu Pro Arg Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu IS 10 15

Leu pro Ala Ala Gly pro Ala Gin Phe His Gly Glu Lys Gly lie ser 20 25 30 lie Pro Asp His Gly Phe Cys Gin Pro lie Ser lie Pro Leu cys Thr 35 40 45

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Asn Gin Glu Asp Ala Gly Leu Glu val His Gin Phe Tyr Pro Leu val 65 70 75 80 n . ΔΓη Php phe Leu cys ser Met Tyr

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Gly Phe Gin Trp Pro Glu Arg Leu Arg Cys 61» »Jg <*« *-« 130 135 , , , , n . , Mis ser Glu Asp Gly Ala

Gly Ala Glu Gin lie Cys val Gly Gin Asn W χβο 145 150 pro Ala Leu Leu Thr Thr Ala Pro Pro Pro Gly Leu Pr0 χ·^ A^a 165 170

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Met val ser val Ala Tyr lie Ala Gly Phe Val Leu Gin Glu Arg Val 290 300 val Cys Asn Glu Ar9 Ser Glu Asp Gly Tyr Arg Thr Val Val Gin 305 310 315 320

Gly Thr Lys Lys Glu Gly cys Thr lie Leu Phe Met Met Leu Tyr Phe 325 330 335

Phe ser Met Ala ser ser He Trp Trp val lie Leu ser Leu Thr Trp 340 345 350

Phe Leu Ala Ala Gly Met Lys Trp Gly His Glu Ala lie Glu Ala Asn 355 360 365

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Leu Ala Pro Leu Phe val Tyr Leu Phe lie Gly Thr Ser Phe Leu Leu 420 425 430

Ala Gly Phe val ser Leu Phe Arg lie Arg Thr lie Met Lys His Asp 435 440 445

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Gin His Cys Lys Ser Leu Ala lie Pro Cys Pro Ala His Tyr Thr Pro 500 505 510

Arg Met Ser Pro Asp Phe Thr Val Tyr Met lie Lys Tyr Leu Met Thr 515 520 525

Leu He Val Gly lie Thr ser Gly Phe Trp lie Trp ser Gly Lys Thr 530 535 540

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Gly Glu Thr Thr val 565

< 210 > 31 <211> 250 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> domínio extracelular (ECD) de FZD2 <400> 31

Al, . Λ11 &amp;ra Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu

Met Arg pro Arg ser Ala Leu Pro Ary ^ 15 l 5 - .,, _η_ phe His Gly Glu Lys Gly lie Ser

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<210> 43 <211> 233 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> domínio extracelular (ECD) de FZD5 <400> 43

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Ala Ala Gly Lys Lys Trp Gly His Glu Ala lie Glu Ala Asn Ser Ser 340 345 350

Tyr Phe His Leu Ala Ala Trp Ala lie Pro Ala val Lys Thr lie Leu 355 360 __ 365 lie Leu val Met Arg Arg val Ala Gly Asp Glu Leu Thr Gly val Cys 370 375 380

Tvr val Gly Ser Met Asp val Asn Ala Leu Thr Gly Phe val Leu lie 385 390 395 400

Pro Leu Ala cys Tyr Leu Val lie Gly Thr ser Phe lie Leu ser Gly 405 410 415

Phe Val Ala Leu Phe His lie Arg Arg val Met Lys Thr Gly Gly Glu 420 425 430

Asn Thr Asp Lys Leu Glu Lys Leu Met val Arg lie Gly Leu Phe ser 435 440 445 val Leu Tyr Thr val Pro Ala Thr cys val lie Ala cys Tyr Phe Tyr 450 455 460

Glu Arg Leu Asn wet Asp Tyr Trp Lys lie Leu Ala Ala Gin His Lys 455 470 475 480

Cvs Lvs Met Asn Asn Gin Thr Lys Thr Leu Asp Cys Leu Met Ala Ala 485 490 495

Ser ile pro Ala val Glu lie Phe Met val Lys lie Phe Met Leu Leu 500 505 510 val val Gly lie Thr ser Gly Met Trp lie Trp Thr Ser Lys Thr Leu 515 520 525

Gin ser Trp Gin Gin val cys Ser Arg Arg Leu Lys Lys Lys ser Arg 530 535 540

Arg Lys Pro Ala ser val Ile Thr ser Gly Gly lie Tyr Lys Lys Ala 545 550 555 560

Gin His Pro Gin Lys Thr His His Gly Lys Tyr Glu lie pro Ala Gin 565 570 575

Ser Pro Thr cys val 580

<210> 63 <211> 227 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> domínio extracelular (ECD) de FZD10 <400> 63

Met Gin Arg Pro Gly Pro Arg Leu Trp Leu val Leu Gin val Met Gly 15 10 15 ser cys Ala Ala lie ser ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp Gly 20 25 50

Lys Cys Gin Pro lie Glu lie Pro Met Cys Lys Asp lie Gly Tyr Asn 35 40 45

Met Thr Arg Met Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gin Arg Glu Ala SO 55 60

Ala lie Gin Leu His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly cys His 65 70 75 80

Gly His Leu Arg phe Phe Leu cys ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys Thr 85 90 95

Glu Gin val Ser Thr Pro lie Pro Ala cys Arg val Met Cys Glu Gin 100 105 110

Ala Arg Leu Lys cys Ser Pro lie Met Glu Gin Phe Asn Phe Lys Trp 115 120 125 pro Asp Ser Leu Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp Pro Asn 130 135 140

Tyr Leu Cys Met Glu Ala Pro Asn Asn Gly Ser Asp Glu Pro Thr Arg 145 150 155

Gly Ser Gly Leu Phe pro Pro Leu Phe Arg Pro Gin Arg Pr° Ser 165 170

Ala Gin Glu His Pro Leu Lys Asp Gly Gly Pro Gly Arg G^ Cys 180 185

Asp Asn Pro Gly Lys Phe His His val Glu Lys ser Ajt| Ser c^s A^a 195 200 20>

Pro Leu Cys Thr pro Gly Val Asp val Tyr Trp ser ΑΓ9 G^u AS^ 210 215 220

Arg Phe Ala 225 <210> 64

<211> 134 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> domínio Fri de FZD10 Humano <400> 64 lie ser ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp Gly Lys Cys Gin Pro 15 10 15 rle Glu lie Pro Met Cys Lys Asp lie Gly Tyr Asn Met Thr Arg Met 20 25 30

Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gin Arg Glu Ala Ala lie Gin Leu 35 40 45

His Glu Phe Ala Pro Leu val Glu Tyr Gly Cys His Gly His Leu Arq 50 55 60

Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys Thr Glu Gin Val ser 65 70 75 80

Thr pro lie Pro Ala Cys Arg Val Met Cys Glu Gin Ala Arg Leu Lys 85 90 g5

Cys Ser pro lie Met Glu Gin Phe Asn Phe Lys Trp Pro asd Ser Leu 100 105 Uq

Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp Pro Asn Tyr Leu Cvs Met US 120 12 $

Glu Ala Pro Asn Asn Gly 130

<210> 65 <211> 1746 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> FZD10 Humano <400> 65 atgcagcgcc cgggcccccg cctgtggctg gtcctgcagg tgatgggctc gtgcgccgcc 60 atcagctcca tggacatgga gcgcccgggc gacggcaaat gccagcccat cgagatcccg 120 atgtgcaagg acatcggcta caacatgact cgtatgccca acctgatggg ccacgagaac 180 cagcgcgagg cagccatcca gttgcacgag ttcgcgccgc "tggtggagta cggctgccac 240 ggccacctcc gcttcttcct gtgctcgctg tacgcgccga tgtgcaccga gcaggtctct 300 acccccatcc ccgcctgccg ggtcatgtgc gagcaggccc ggctcaagtg ctccccgatt 360 atggagcagt tcaacttcaa gtggcccgac tccctggact gccggaaact ccccaacaag 420 aacgacccca actacctgtg catggaggcg cccaacaacg gctcggacga gcccacccgg 480 ggctcgggcc tgttcccgcc gctgttccgg ccgcagcggc cccacagcgc gcaggagcac 540 ccgctgaagg acgggggccc cgggcgcggc ggctgcgaca acccgggcaa gttccaccac 600 gtggàgaaga gcgcgtcgtg cgcgccgctc tgcacgcccg gcgtggacgt gtactggagc 660 cgcgaggaca agcgcttcgc agtggtctgg ctggccatct gggcggtgct gtgcttcttc 720 tccagcgcct tcaccgtgct caccttcctc atcgacccgg cccgcttccg ctaccccgag 780 cgccccatca tcttcctctc catgtgctac tgcgtctact ccgtgggcta cctcatccgc 840 ctcttcgccg gcgccgagag catcgcctgc gaccgggaca gcggccagct ctatgtcatc 900 caggagggac tggagagcac cggctgcacg ctggtcttcc tggtcctcta ctacttcggc 960 atggccagct cgctgtggtg ggtggtcctc acgctcacct ggttcctggc cgccggcaag 1020 aagtggggcc acgaggccat cgaagccaac agcagccact tccacctggc agcctgggcc 1080 atcccggcgg tgaagaccat cctgatcctg gtcatgcgca gggtggcggg ggacgagctc 1140 accggggtct gctacgtggg cagcatggac gtcaacgcgc tcaccggctt cgtgctcatt 1200 cccctggcct gctacctggt catcggcacg tccttcatcc tctcgggctt cgtggccctg 1260 ttccacatcc ggagggtgat gaagacgggc ggcgagaaca cggacaagct ggagaagctc 1320 atggtgcgta tcgggctctt ctctgtgctg tacaccgtgc cggccacctg tgtgatcgcc 1380 tgctactttt acgaacgcct caacatggat tactggaaga tcctggcggc gcagcacaag 1440 tgcaaaatga acaaccagac taaaacgctg gactgcctga tggccgcctc catccccgcc 1500 gtggagatct tcatggtgaa gatctttatg ctgctggtgg tggggatcac cagcgggatg 1560 tggatttgga cctccaagac tctgcagtcc tggcagcagg tgtgcagccg taggttaaag 1620 aagaagagcc ggagaaaaco ggccagcgtg atcaccagcg gtgggattta caaaaaagcc 1680 cagcatcccc agaaaactca ccacgggaaa tatgagatcc ctgcccagtc gcccacctgc 1740 gtgtga 1746

< 210 > 6 6 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> fragmento sintético de recetor frizzled humano <400> 66

Gin Tyr Gly Phe Ala 1 5

<210> 67 < 211> 14 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> fragmento sintético de recetor frizzled humano <400> 67

Gin Asp Glu Ala Gly Leu Glu Vai His Gin phe Trp Pro Leu 15 10

<210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> fragmento sintético de recetor frizzled humano <400> 68

Ala Gly Leu Glu Val His Gin Phe 1 5

<210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> fragmento sintético de recetor frizzled humano <400> 6 9

Lys Gin Phe Tyr Gly Phe Gin Ala 1 5

<210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> epítopo conformacional de FZD8 <400> 70

Phe pro Leu lie Tyr Leu Met Trp pro Asp Arg 1 5 10

<210> 71 < 211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR1 de cadeia leve <400> 71

Ser Gly Asp Lys Asn Leu lie Gly Lys Ser Lys Phe Tyr Ala Vai Ser 15 10 15

His

<210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> uma CDR2 de cadeia leve <400> 72

Glu Asp Lys Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly 15 10

<210> 73 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 de cadeia leve <400> 73

Ser Gin Ser Phe Tyr Ala Gly Asn Asn Thr Leu Ser Leu Glu 1 5 10 <210> 74

< 211 > 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> fragmento de FZD8 <400> 74 xyr Gly Phe Ala 1

<210> 75 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> iniciador sintético <400> 75 cgctctccaa ggcgccaagg agagg 25

<210> 76 <211> 696 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> cadeia leve de 18R5 de anticorpos IgG anti-FZD <400> 7 6 atggcctggg ccctgctgct gctgaccctg ctgacacagg gcaccggctc ttgggccgac 60 atcgagctga cccagcctcc ctccgtgtcc gtggcccctg gccagaccgc ccggatctcc 120 tgctccggcg acaacatcgg cagcttctac gtgcactggt atcagcagaa acctggacag 180 gcccctgtgc tggtgatcta cgacaagtcc aaccggcctt ccggcatccc tgagcggttc 240 tccggctcca actccggcaa caccgccacc ctgaccatct ccggcaccca ggccgaggac 300 gaggccgaet actactgcca gtcctacgcc aacaccctgt ccctggtgtt tggcggcgga 360 acaaagctga ccgtgctggg ccagcctaag gccgctcctt ccgtgaccct gttccctcct 420 tcctccgagg agctgcaggc caacaaggcc accctggtgt gcctgatctc cgacttctac 480 cctggcgctg tgactgtggc ttggaaggcc gactcctccc ctgtgaaggc cggcgtggag 540 acaaccaccc cttccaagca gtccaacaac aagtacgccg cctcctccta cctgtccctg 600 acccctgagc agtggaagtc ccaccggtcc tactcttgcc aggtgaccca cgagggctcc 660 accgtggaaa agacagtggc acccaccgag tgctcc 696 <210> 77 <211> 10

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR1 de cadeia pesada <400> 77

Gly Phe Thr Phe ser ser Tyr Tyr lie Thr 15 10

<210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR2 de cadeia pesada <400> 78

Thr lie Ser Tyr Ser Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

< 210 > 7 9 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 de cadeia pesada <400> 79

Ser lie Val Phe Asp Tyr 1 5

< 210 > 80 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR1 de cadeia leve <400> 80

Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asn Arg Tyr Val Tyr 1 5 10

<210> 81 < 211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> CDR2 de cadeia leve <400> 81

Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asn Arg Tyr Vai Tyr 1 5 10

<210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 de cadeia leve <400> 82

Gly Ser Trp Asp Thr Arg Pro Tyr Pro Lys Tyr ' 15 10

<210> 83 <211> 696 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> cadeia leve de 18R4605 de anticorpos anti-FZD <400> 83 atggcatggg cattattgct acttactcta ttgacgcaag gaacgggttc atgggcagac 60 atagaactaa ctcagccacc ctctgttagc gttgcaccgg gacagacggc acgtatatcg 120 tgctcgggag acaatatagg aagtttctat gtacattggt atcaacagaa acctggtcaa 180 gcacctgtat tagtaatcta tgacaaaagt aaccgacctt ccggaatacc tgagcgtttc 240 agtggttcga actccggcaa cactgcaact ttaactatat ctggaactca ggcggaggat 300 gaggctgact actactgcca gagttacgca aacactctgt ccctggtgtt tggcggcgga 360 acaaagttaa ccgtgctggg ccagcctaag gccgcacctt cggtgaccct attccctcct 420 tcatccgagg agctacaggc caacaaggcc accttagtgt gcctaatctc cgacttctat 480 cctggtgctg taacggtagc gtggaaggcc gactcatcgc cggtgaaggc cggtgtggag 540 acaacgactc cttccaagca gtccaacaac aaatacgccg cgtcctccta cctgtcccta 600 acccctgagc agtggaagtc ccaccgttca tactcgtgcc aggtgacgca cgagggttca 660 acggtcgaaa agacagtagc acctactgaa tgctca 696

<210> 84 <211> 696 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> cadeia leve de 18R4805 de anticorpos anti-FZD <400> 84 atggcatggg cattattact acttactcta cttacgcaag gaacgggttc atgggcagac 60 atagaactaa ctcagccgcc gtctgttagc gttgcaccgg gacagacggc acgtatatcg 120 tgctcgggag acaatattgg ttctttctat gtacattggt atcaacagaa acctggtcaa 180 gcacctgtat tagtaatata tgacaaaagt aaccgtcctt cgggaatacc tgagcgtttc 240 agtggttcga actcgggcaa cactgcaact ttaactatat ctggaacgca ggcggaggat 300 gaggcggact actattgcca aagttacgca aacactctat ccttagtgtt tggtggagga 360 acaaagttaa ccgtgctagg ccagcctaag gccgcacctt cggtgaccct attccctcct 420 tcatccgagg agctacaggc gaacaaagcc accttagtgt gcctaatctc agacttttat 480 cctggtgctg taacggtagc gtggaaggcg gactcatcgc ~cggtgaaggc cggtgtggag 540 acaacgactc cttccaagca gtccaacaac aaatacgcag cgagtagtta cctgtcccta 600 acccctgagc agtggaagtc gcaccgttca tactcgtgcc aggttacgca cgagggttca 660 acggtcgaaa agacagtagc acctacggaa tgctca 696

<210> 85 <211> 115 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> cadeia pesada de 44R24 de anticorpos anti-FZD <400> 85

Glu val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Ser ser Tyr 20 25 30

Tyr lie Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45

Ser Thr lie Ser Tyr Ser Ser ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser val 50 55 60 iys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg ser lie val Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 val Ser Ser 115

<210> 86 <211> 104 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> cadeia leve de 44R24 de anticorpos anti-FZD <400> 86

Asp IIe Glu Leu Thr Gin Pro pro Ser val ser val Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg lie Ser cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asn Arg Tyr val 20 25 aU

Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro val Leu val He Pro 35 40

Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala 50 55 60

Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 65 70 75 80

Cys Gly ser Trp Asp Thr Arg Pro Tyr Pro Lys Tyr Val Phe Gly Gly 85 90 95

Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100

<210> 87 <211> 3 54 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> cadeia pesada de 18R5/18R8 de anticorpos anti-FZD <400> 87 gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc cactacaccc tgtcctgggt gcgccaggca 120 ccagggaagg gactggagtg ggtctccgtg atctccggcg acggctccta cacctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcctccgaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actctctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggaacttc 300 atcaagtacg tgttcgccaa ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc ctcc 354

<210> 88 <211> 324 < 212 > ADN <213> Sequência artificial <220> <223> cadeia leve de 18R8 de anticorpos anti-FZD <400> 88 gacatcgagc tgacccagcc tccctccgtg tctgtggctc ctggccagac cgcccggatc 60 tcctgctccg gcgacaagct gggcaagaag tacgcctcct ggtatcagca gaagcctgga 120 eaggcccctg tgctggtcat ctacgagaag gacaaccggc ctagcggcat ccctgagcgg 180 ttctccggct ccaactccgg caacaccgcc accctgacca tctccggcac ccaggccgag 240 gacgaggccg actactactg ctcctccttc gccggcaact ccctggaagt gttcggcgga 300 ggcaccaagc tgaccgtgct gggc 324

<210> 89 <211> 324 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> cadeia leve de 18R5 de anticorpos anti-FZD <400> 89 gacatcgagc tgacccagcc tccctccgtg tccgtggccc ctggccagac cgcccggatc 60 tcctgctccg gcgacaacat cggcagcttc tacgtgcact ggtatcagca gaaacctgga 120 caggcccctg tgctggtgat ctacgacaag tccaaccggc cttccggcat ccctgagcgg 180 ttctccggct ccaactccgg caacaccgcc accctgacca tctccggcac ccaggccgag 240 gacgaggccg actactactg ccagtcctac gccaacaccc tgtccctggt gtttggcggc 300 ggaacaaagc tgaccgtgct gggc 324

<210> 90 <211> 324 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> anticorpos anti-FZD de 18R4605 <400> 90 gacatagaac taactcagcc accctctgtt agcgttgcac cgggacagac ggcacgtata 60 tcgtgctcgg gagacaatat aggaagtttc tatgtacatt ggtatcaaca gaaacctggt 120 caagcacctg tattagtaat ctatgacaaa agtaaccgac cttccggaat acctgagcgt 180 ttcagtggtt cgaactccgg caacactgca actttaacta tatctggaac tcaggcggag 240 gatgaggctg actactactg ccagagttac gcaaacactc tgtccctggt gtttggcggc 300 ggaacaaagt taaccgtgct gggc 324

<210> 91 <211> 1365 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> cadeia pesada de 44R24 de anticorpos anti-FZD <400> 91 atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgctc ctagatgggt gctgtccgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg cggaggactg gtgcagcctg gcggctccct gagactgtct 120 tgcgccgcct ccggcttcac cttctcctct tactacatca cctgggtgcg ccaggctcct 180 ggcaagggac tggaatgggt gtccaccatc tcctactcct ccagcaacac ctactacgcc 240 gactccgtga agggccggtt caceatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 300 cagatgaact ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gtccatcgtg 360 ttcgactact ggggccaggg caccctggtg accgtgtcct cttccgtgtt ccctctggcc 420 ccttgctccc ggtccacctc tgagtctacc gccgctctgg gctgcctggt gaaggactac 480 ttccctgagc ctgtgaccgt gtcctggaac tctggcgccc tgacctctgg cgtgcacacc 540 ttccctgccg tgctgcagtc ctccggcctg tactccctgt cctccgtggt gaccgtgcct 600 tcctccaact tcggcaccca gacctacacc tgcaacgtgg accacaagcc ttccaacacc 660 aaggtggaca agaccgtgga gcggaagtgc tgcgtggagt gccctccttg tcctgctcct 720 cctgtggctg gcccttctgt gttcctgttc cctcctaagc ctaaggacac cctgatgatc 780 tcccggaccc ctgaagtgac ctgcgtggtg gtggacgtgt cccacgagga ccctgaggtg 840 cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaacg ccaagaccaa gcctcgggag 900 gaacagttca actccacctt ccgggtggtg tctgtgctga ccgtggtgca ccaggactgg 960 ctgaacggca aagaatacaa gtgcaaggtg tccaacaagg gcctgcctgc ccctatcgaa 1020 aagaccatct ctaagaccaa gggccagcct cgcgagcctc aggtctacae cctgcctcct 1080 agccgggagg aaatgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gtctggtgaa gggcttctac 1140 ccttccgata tcgccgtgga gtgggagtct aacggccagc ctgagaacaa ctacaagacc 1200 acccctccta tgctggactc cgacggctcc ttcttcctgt actccaagct gacagtggac 1260 aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc tcctgctccg tgatgcacga ggccctgcac 1320 aaccactaca cccagaagtc cctgtccctg tctcctggca agtga 1365

<210> 92 <211> 324 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> anticorpos anti-FZD de 18R4805 <400> 92 gacatagaac taactcagcc gccgtctgtt agcgttgcac cgggacagac ggcacgtata 60 tcgtgctcgg gagacaatat tggttctttc tatgtacatt ggtatcaaca gaaacctggt 120 caagcacctg tattagtaat atatgacaaa agtaaccgtc cttcgggaat acctgagcgt 180 ttcagtggtt cgaactcggg caacactgca actttaacta tatctggaac gcaggcggag 240 gatgaggcgg actactattg ccaaagttac gcaaacactc tatccttagt gtttggtgga 300 ggaacaaagt taaccgtgct aggc ' 324

<210> 93 <211> 672 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> cadeia leve de 44R24 de anticorpos anti-FZD <400> 93 atggcttggg ctctgctgct gctgaccctg ctgacacagg gcaccggctc ttgggccgac 60 atcgagctga cccagcctcc ctctgtgtct gtggcccctg gccagaccgc caggatctct 120 tgctctggcg acgccctggg caacagatac gtgtactggt atcagcagaa gccaggccag 180 gcccctgtgc tggtgatccc ttccggcatc cctgagcggt tctccggctc caactccggc 240 aacaccgcca ccctgaccat ctctggcacc caggccgagg acgaggccga ctactactgc 300 ggctcctggg acacccggcc ttaccctaag tacgtgttcg gcggaggcac caagctgacc 360 gtgctgggcc cttccgtgac cctgttccct ccatcctccg aggaactgca ggccaacaag 420 gccaccctgg tgtgcctgat ctccgacttc taccctggcg ccgtgaccgt ggcttggaag 480 gccgactcta gccctgtgaa ggccggcgtg gagacaacca ccccttccaa gcagtccaac 540 aacaagtacg ccgcctcctc ctacctgtcc ctgacccctg agcagtggaa gtcccaccgg 600 tcctactctt gccaggtgac ccacgagggc tccaccgtgg aaaagaccgt ggcccctacc 660 gagtgctcct ag 672

<210> 94 <211> 345 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> cadeia pesada de 44R24 de anticorpos anti-FZD <400> 94 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc tcttactaca tcacctgggt gcgccaggct 120 cctggcaagg gactggaatg ggtgtccacc atctcctact cctccagcaa cacctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggtccatc 300 gtgttcgact actggggcca gggcaccctg gtgaccgtgt cctct 345

<210> 95 <211> 312 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> cadeia leve de 44R24 de anticorpos anti-FZD <400> 95 gacatcgagc tgacccagcc tccctctgtg tctgtggccc ctggccagac cgccaggatc 60 tcttgctctg gcgacgccct gggcaacaga tacgtgtact ggtatcagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtgat cccttceggc atccctgagc ggttctccgg ctccaactcc 180 ggcaacaccg ccaccctgac catctctggc acccaggccg aggacgaggc cgactactac 240 tgcggctcct gggacacccg gccttaccct aagtacgtgt tcggcggagg caccaagctg 300 accgtgctgg gc 312

<210> 96 <211> 1389 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> cadeia pesada IgG2 de 18R5/18R8/18R4605/18R4805 IgG2 de anticorpos anti-FZD <400> 96 atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtcgccgctc ctagatgggt gctgtccgag 60 gtgcagctgg tcgagtctgg cggcggactg gtgcagcctg gcggctccct gagactgtcc 120 tgcgccgcct ccggcttcac cttctcccac tacaccctgt cctgggtgcg ccaggcacca 180 gggaagggac tggagtgggt ctccgtgatc tccggcgacg gctcctacac ctactacgcc 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc tccgacaact ccaagaacac cctgtacctg 300 cagatgaact ctctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gaacttcatc 360 aagtacgtgt tcgccaactg gggccagggc accctggtga ccgtgtcctc cgcctccacc 420 aagggccctt ccgtgttccc tctggcccct tgctcccggt ccacctccga gtccaccgcc 480 gctctgggct gcctggtgaa ggactacttc cctgagcctg tgacagtgtc ctggaactct 540 ggcgccctga cctccggcgt gcacaccttc cctgccgtgc tgcagtcctc cggcctgtac 600 tccctgtcct ccgtggtgac agtgccttcc tccaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660 aacgtggacc acaagccttc caacaccaag gtggacaaga ccgtggagcg gaagtgctgc 720 gtggagtgcc ctccttgccc tgcccctcct gtggctggtc ctagcgtgtt cctgttccct 780 cctaagccta aggacaccct gatgatctcc cggacccctg aggtgacctg cgtggtggtg 840 gacgtgtccc acgaggatcc tgaagtccag ttcaattggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 cacaacgcca agaccaagcc tcgggaggag cagttcaact ccaccttccg ggtggtgtcc 960 gtgctgaccg tggtgcacca ggactggctg aacggcaaag aatacaagtg caaagtctcc 1020 aacaagggcc tgcctgcccc tatcgaaaag accatcagca agaccaaggg ccagcctcgc 1080 gagcctcagg tgtacaccct gcctccctct cgcgaagaga tgaccaagaa ccaggtgtcc 1140 t ctgacctgtc tggtgaaggg cttctaccct tccgatatcg ccgtggagtg ggagtccaac 1200 ggccagcctg agaacaacta caagaccacc cctcctatgc tggactccga cggctctttc 1260 ttcctgtact ccaagctgac agtggacaag tcccggtggc agcagggcaa cgtgttctcc 1320 tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaat cactacaccc agaagtccct gtccctgtct 1380 cctggcaag 1389

<210> 97 <211> 696 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> cadeia elevada lambda de 1848 de anticorpos anti-

FZD <400> 97 atggcctggg ccctgctgct gctgaccctg ctgacacagg gcaccggctc ttgggccgac 60 atcgagctga cccagcctcc ctccgtgtct gtggctcctg gccagaccgc ccggatctcc 120 tgctccggcg acaagctggg caagaagtac gcctcctggt atcagcagaa gcctggacag 180 gcccctgtgc tggtcatcta cgagaaggac aaccggccta gcggcatccc tgagcggttc 240 tccggctcca actccggcaa caccgccacc ctgaccatct ccggcaccca ggccgaggac 300 gaggccgact actactgctc ctccttcgcc ggcaactccc tggaagtgtt cggcggaggc 360 accaagctga ccgtgctggg ccagcctaag gccgctcctt ccgtgaccct gttccctcct 420 tcctccgagg aactgcaggc caacaaggcc accctggtct gcctgatctc cgacttctac 480 cctggcgccg tgaccgtggc ctggaaggcc gactcctccc ctgtgaaggc cggcgtggag 540 acaaccaccc cttccaagca gtccaacaac aagtacgccg cctcctccta cctgtccctg 600 acccctgagc agtggaagtc ccaccggtcc tactcttgcc aggtcaccca cgagggctcc 660 accgtggaaa agacagtggc ccccaccgag tgctcc 696

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 2008194457 A [0009] • US 5225539 A [0052] • WO 2008042236 A [0111] • US 20080064049 A [0111] • US 20080178305 A [0111] • US 20050276799 A [0132] • US 20070148164 A [0132] • US 20070122403 A [0132] • US 4816567 A [0135] • US 5750373 A [0138] • US 5969108 A [0138] • US 6172197 B [0138] • US 5885793 A [0138] • US 6521404 B [0138] • US 6544731 B [0138] • US 6555313 B [0138] • US 6582915 B [0138] • US 6593081 B [0138] • US 6300064 B [0138] • US 6653068 B [0138] • US 6706484 B [0138] • US 7264963 B [0138] • US 5545807 A [0139] • US 5545806 A [0139] • US 5569825 A [0139] • US 5625126 A [0139] • US 5633425 A [0139] • US 5661016 A [0139] • US 5731168 A [0141] • US 5641870 A [0144] • US 4946778 A [0145] • US 4676980 A [0147] [0157] • US 5585089 A [0149] • US 5693761 A [0149] • US 5693762 A [0149] • US 4588585 A [0161] • US 20080187954 A [0167] • US 6413746 B [0167] • US 6660501 B [0167] • WO 04009823 A [0167] • US 20080312425 A [0172] • US 20080177048 A [0172] • US 20090187005 A [0172] • US 5270163 A [0175] • US 5683867 A [0175] • US 5763595 A [0175] • US 6344321 B [0175] • US 7368236 B [0175] • US 5582981 A [0175] • US 5756291 A [0175] • US 5840867 A [0175] • US 7312325 B [0175] • US 7329742 B [0175] • WO 02077262 A [0175] • WO 03070984 A [0175] • US 20050239134 A [0175] • US 20050124565 A [0175] • US 20080227735 A [0175] • US 4485045 A [0207] • US 4544545 A [0207] • US 5013556 A [0207] • US 3773919 A [0208] • WO 2008091222 A [0218] • WO 20080793326 A [0218] • US 20080014196 A [0218] • US 20080175847 A [0218] • US 20080181899 A [0218] • US 20080107648 A [0218] • US 20080131434 A [0218] • US 6057105 A [0230] • US 0958635 W [0363] • US 61176741 B [0363] • US 61144248 B [0363] • US 61144058 B [0363] • US 61100639 B [0363]

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REIVINDICACIONES 1. Um anticorpo monoclonal que liga especificamente a um recetor frizzled humano selecionado a partir do grupo consistindo em FZD8, FZD5, FZD1, FZD2 e FZD7, e inibe a ligação de Wnt ao recetor frizzled humano, em que o anticorpo: (a) liga à sequência (K/Q) (F/Y) GF (Q/A) (SEQ ID NO: 69) e/ou à sequência Q (DE/ED) AGLEVHQF (Y/W) PL (SEQ ID NO: 24) dentro do recetor frizzled humano; (b) compete por ligação específica a FZD8, FZD5, FZD1, FZD2 ou FZD7 humano num ensaio de ligação competitiva com um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 10 e a região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 12 ; e/ou (c) compreende uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: 1); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VISGDGSYTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2) ; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO: 3) ; e uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO: 7) ; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9). 2. 0 anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, que liga especif icamente a mais de um recetor frizzled humano selecionado a partir do grupo consistindo em FZD8, FZD5, FZD1, FZD2 e FZD7. 3. 0 anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2, em que os recetores frizzled humanos aos quais o anticorpo liga compreendem FZD8 e FZD5. 4. 0 anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação

Claims (9)

1. 3, que liga especificamente a FZD8, FZD5, FZD1, FZD2, e FZD7, 5. 0 anticorpo monoclonal de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é um antagonista do(s) recetor(es) recetor frizzled humano(s). 6. 0 anticorpo monoclonal de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, que liga especificamente a FZD8 humano, em que o anticorpo: (a) liga à sequência QYGFA (SEQ ID NO:66); e/ou (b) liga à sequência QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO:67). 7. 0 anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 6, que liga especificamente a FZD8 humano, em que o anticorpo: (a) liga à sequência QYGFA (SEQ ID NO:66) dentro de FZD8; e/ou (b) liga à sequência GLEVHQ (SEQ ID NO: 25) dentro de FZD8 . 8. 0 anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que é um fragmento de anticorpo. 9. 0 anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID NO:1); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VISGDGSYTYYADSVKG (SEQ ID NO:2); uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO:3); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO: 7) OU SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO: 4) ; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo DKSNRPSG (SEQ ID NO:8) ou EKDNRPSG (SEQ ID NO:5); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QSYANTLSL (SEQ ID NO:9) ou SSFAGNSLE (SEQ ID NO:6)
2. 10. O anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 9 em que o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID NO:1); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VISGDGSYTYYADSVKG (SEQ ID NO:2); uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO:3); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO: 7) ou SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO: 4); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo DKSNRPSG (SEQ ID NO:8) e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QSYANTLSL (SEQ ID NO:9).
3. 11. O anticorpo monoclonal de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o anticorpo compreende: (a) um polipéptido tendo pelo menos cerca de 80S de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; e/ou (b) um polipéptido tendo pelo menos cerca de 800 de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 12 .
4. 12. O anticorpo monoclonal de acordo com as reivindicações 1 a 3, em que o anticorpo liga especificamente a FZD5 e/ou FZD8 humano, e compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSSYYIT (SEQ ID NO:77); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo TISYSSSNTYYADSVKG (SEQ ID NO :78) ; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo SIVFDY (SEQ ID NO:79); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDALGNRYVY (SEQ ID NO: 80); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo SG (SEQ ID NO:81); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo GSWDTRPYPKY (SEQ ID NO :82) .
5. 13. O anticorpo monoclonal de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 ou reivindicação 12, em que o anticorpo liga especificamente a FZD8 e/ou FZD5, e compreende: (a) um polipéptido tendo pelo menos cerca de 800 de identidade com a SEQ ID NO:85; e/ou (b) um polipéptido tendo pelo menos cerca de 800 de identidade com a SEQ ID NO: 86.
6. 14. O anticorpo monoclonal de acordo com as reivindicações 1 a 3, 12 ou 13, em que o anticorpo compete por ligação específica FZD8 e/ou FZD5 humano num ensaio de ligação competitiva com um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 86.
7. 15. Uma composição farmacêutica compreendendo a anticorpo monoclonal e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que 0 anticorpo inibe a ligação de wnt a um recetor frizzled humano, e (i) o anticorpo compreende: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo GFTFSHYTLS (SEQ ID NO:1); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo VIS- GDGSYTYYADSVKG (SEQ ID NO:2); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo NFIKYVFAN (SEQ ID NO:3); e (b) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo SGDNIGSFYVH (SEQ ID NO: 7) ; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo DKSN- RPSG (SEQ ID NO: 8) ; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo QSYANTLSL (SEQ ID NO:9), or (ii) o anticorpo é codificado pela sequência de um plasmídeo depositado com o número de acesso ATCC como PTA-9541. 16. 0 anticorpo monoclonal de acordo com as reivindicações 1 a 11 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, em que o anticorpo compreende a região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 10; e a região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 14.
8. 17. Um anticorpo monoclonal ou composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações anteriores para utilização num método de tratamento do organismo humano ou animal.
9. 18. Um anticorpo monoclonal ou composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 16, para utilização num método de: (i) inibir o crescimento tumoral num indivíduo, (ii) tratar o cancro num indivíduo, (iii) tratar um distúrbio num indivíduo, em que o distúrbio é caracterizado por um nível aumentado de células estaminais e/ou células progenitoras, (iv) tratar uma doença num indivíduo, em que a doença está associada com a ativação da sinalização de Wnt (v) induzir a diferenciação das células num tumor num indivíduo, ou (vi) reduzir a tumorigenicidade de um tumor que compreende célula estaminais cancerígenas num indivíduo; 0 método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou composição farmacêutica ao indivíduo. 19. 0 anticorpo monoclonal ou composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 16, para utilização num método de acordo com a reivindicação 18, em que o método compreende adicionalmente administrar um segundo agente terapêutico. 20. 0 anticorpo monoclonal ou composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 16, para utilização num método de acordo com a reivindicação 19, em que o método compreende tratar o cancro num indivíduo e em que o segundo agente terapêutico é um agente quimioterapêutico. 21. 0 anticorpo monoclonal ou composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 16, para utilização num método de acordo com a reivindicação 20, em que o método compreende tratar cancro da mama num indivíduo através da administração de paclitaxel e a quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou composição farmacêutica ao indivíduo.