ES2350231T3 - Método para determinar la genotoxicidad. - Google Patents

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ES2350231T3 ES05804099T ES05804099T ES2350231T3 ES 2350231 T3 ES2350231 T3 ES 2350231T3 ES 05804099 T ES05804099 T ES 05804099T ES 05804099 T ES05804099 T ES 05804099T ES 2350231 T3 ES2350231 T3 ES 2350231T3
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Abstract

Un método in-vitro para determinar la genotoxicidad de un compuesto prueba, dicho método comprende: (a) contactar una célula de prueba viable con dicho compuesto prueba; (b) determinar el cambio en el nivel de expresión de un gen indicador en el que dicho gen indicador es 4833427G06 Rik (cDNA RIKEN); en el que un aumento en la expresión de al menos 1,5 veces, indica que dicho compuesto prueba presenta genotoxicidad.

Description

La presente invención está relacionada con las áreas de la molecular biología y la toxicología. Más específica- mente, la presente invención está relacionada con los métodos para determinar la genotoxicidad de los compuestos y células de ensayo, animales transgénicos no humanos, equipos y reactivos de los mismos.
La respuesta celular de los mamíferos al daño geno- tóxico se analiza a menudo utilizando una batería de pruebas, que suelen incluir pruebas de aberraciones cromosómicas in vitro o de formación de micronúcleos. Ambas pruebas visualizan el daño en el DNA en las células tras la exposición a agentes potencialmente genotóxicos al analizar aberraciones en los cromosomas recogidos (S.M. Galloway, Environ Mol Mutagen (2000) 35:191-201) o al examinar los micronúcleos formados en las células cuyo DNA se ha dañado (W. von der Hude et al., Mutation Res (2000) 468:137-63). Sin embargo, existen problemas significativos con la interpretación de los resultados de las pruebas de genotoxicidad in vitro utilizadas actualmente. Los resultados falsos positivos no son extraños en estas pruebas y el subsiguiente análisis, que involucra pruebas en animales in vivo, pueden ser costosos tanto económicamente como en su duración. Son necesarios ensayos que mejor pueden predecir el potencial genotóxico de un compuesto (véase, por ejemplo, R.K. Newton
et al., Environ Health Persp (2004) 112:420-22). En respuesta al estrés genotóxico, las células en división que se someten a una diferenciación celular se detienen en etapas concretas del ciclo celular (véase, por ejemplo, T. Weinert et al., Nature Gen (1999) 21:151-52; T. Weinert, Cell (1998) 94: 555-58). Se cree que esta parada para la diferenciación resulta de la activación de quinasas reguladoras clave y otros componentes de respuesta al daño en el DNA en los puntos de control críticos del ciclo celular (T. Weinert (1998) supra; B.S. Zhou-Bin et al., Nature Rev Cancer (2004) 4:216-25).
P.L. Puri et al., Nature Gen (2002) 32:585-93 investigó la capacidad de cuatro agentes genotóxicos conocidos (sulfonato de metilmetano, cisplatino, etoposido, y radiación ionizante) de inhibir la diferenciación de células mioblastos C2C12 en miotubos. Los efectos de los agentes también se examinaron analizando la expresión de las proteínas específicas de músculo (miogenina, cadena pesada de la miosina, MyoD), y utilizando un gen marcador de la luciferasa acoplado al promotor de la quinasa de la creatinina muscular.
El gen DDA3 murino se secuenció para su estudio debido a su regulación por p53 (P-K. Lo et al., Oncogene (1999) 18:7765-74). P-K Lo et al. también descubrieron que DDA3 estaba regulado positivamente en las células NIH3T3 expuestas a agentes que causan daño en el DNA como la adriamicina y la mitomicina C. P-K Lo et al. descubrieron que DDA3 estaba altamente expresado en cerebro, bazo y pulmón (con
una expresión moderada en riñón), no se encontró expresión
o tenía una expresión mínima en corazón, hígado, músculo esquelético o testículos. La secuencia de genómico en 5’ (incluyendo la región reguladora corriente arriba) ha sido secuenciada y descrita por S.-C. Hsieh et al., Oncogene (2002) 21:3050-57, que identificaron el elemento de unión a p53 y determinaron que su expresión también estaba inducida por p73. P.-K. Lo & F.-F. Wang, Biochim Biophys Acta (2002) 1579:214-18 publicaron la identificación y la secuenciación de un homólogo de DDA3 humano, y también encontraron que se expresa en casi cada tejido excepto en músculo esquelético de adulto. P.-K. Lo & F.-F. Wang, Arch Biochem Biophys (2004) 425:221-32 publicaron que el DDA3 murino se transcribe o edita en una serie de formas diferentes. Sohn et al., Carcinogenesis, volumen 23, número 6, págs. 949 - 957, describe como gen indicador las secuencias reguladoras del gen supresor de tumores p53. Este gen se utiliza como gen marcador en las células cancerosas humanas transfectadas. A continuación se prueban una batería de agentes quimioterapéuticos y potencialmente genotóxicos in vitro. De los agentes quimioterapéuticos/ genotóxicos probados, la mayoría inducen la construcción marcadora de p53 en al menos un factor de 2.
Tugendreich et al., WO 2004/037200, describen la medida de las respuestas genómicas de las células de hígado de rata a la hidroxiurea, citarabina, doxorubicina, ifosfamida, tioguanina, azatioprina, etoposido y albendazol, todos ellos administrados in vivo. Las respuestas genómicas se
utilizaron entonces para generar una "firma de respuesta al fármaco" que correlaciona la regulación transcripcional de dos genes (aminolevulinato sintasa 2 delta, Genbank NM 013197; y periferina 1, Genbank NM 012633) con la tendencia de cada compuesto a causar la depleción de reticulocitos.
Se ha determinado que varios genes se activan en las células eucariotas capaces de una posterior diferenciación cuando dichas células se exponen a agentes que dañan el DNA (genotóxicos) tras la inducción de la diferenciación.
Un aspecto de la invención comprende un método para determinar la genotoxicidad de un compuesto prueba, al poner en contacto una célula capaz de diferenciarse con el compuesto prueba, inducir la diferenciación, y determinar el nivel de expresión de uno o más genes indicadores. Por lo tanto, la presente solicitud proporciona un método para determinar la genotoxicidad de un compuesto prueba, dicho método comprende:
(a)
poner en contacto una célula de prueba viable con dicho compuesto prueba;
(b)
determinar el cambio en el nivel de expresión de un gen indicador en el que dicho gen indicador se selecciona de entre el grupo que consiste en Prelp (Repetición rica en leucina con extremo rico en prolina-arginina); Sesn2 (Sestrina 2); 4833427G06 Rik (cDNA RIKEN); Dda3 (Presentación diferencial activado por p53); Usp30 (Proteasa 30 específica de Ubiquitina); 0610013D04 Rik (cDNA RIKEN); Slc19a2 (familia 19 de transportadores de solutos (trans
portador de tiamina), miembro 2); Trp53inp1 (Proteína relacionada con la transformación 53, proteína nuclear inducible 1); D4Ertd421e (segmento de DNA, Chr 4, ERATO Doi 421, expressado); Shcbp1 (dominio Shc 1 de unión a proteína SH2); Mki67 (antígeno identificado mediante el MAb Ki67); Phex (endopeptidasa neutral reguladora de fosfato (cromosoma X)); Tk1 (quinasa de timidina 1); Mmhead (clon de cDNA de cabeza de embrión de 15 días Mus musculus); Osbpl6 (proteína 6 similar a la proteína de unión a oxisterol); Mphosph1 (fosfoproteína de fase M); Ephx1 (hidrolasa de epóxido 1 (hidrolasa xenobiótica microsomal); Top2a (Topoisomerasa (DNA) II alfa); Ccng1 (Ciclina G1); Plf (Proliferina); Np95 (proteína nuclear 95); Rad51ap1 (proteína 1 asociada a RAD51); Nos3 (sintasa 3 de óxido nítrico, célula endotelial); 2610005B21 Rik (cDNA RIKEN); Brca1 (Cáncer de mama 1); Stk18 (quinasa de serina/treonina 18); Calmbp1 (proteína de unión a calmodulina 1); Lek1 (proteína 1 de la familia de leucina, ácido glutámico, lisina); Smc211 (proteína 1 similar a SMC2 de mantenimiento estructural de cromosomas 2); E2f7 (factor transcripción E2F 7); Hmmr (receptor de motilidad mediado por hialuronano (RHAMM)); Nusap1 (proteína 1 nucleolar y asociada al huso); Fbxo5 (proteína 31 de f-box); Slc19a2 (familia 19 transportadora de solutos (transportador de tiamina), miembro 2); 9030617003 Rik (cDNA RIKEN); Ly6e (complejo del antígeno 6 de linfocitos, locus E); 6530401L14 Rik (cDNA RIKEN); Mad3 (proteína de dimerización Max 3); Hmgb2 (caja del grupo de alta movilidad 2); Kif11 (Quinesina 11); Mad211 (proteína 1 similar a
MAD2 (deficiente en parada mitótica, homólogo) (levadura)); Asf1b (función anti-silenciadora de ASF1 1 homólogo B (Saccharomyces)); Mcm3 (deficiente en el mantenimiento de minicromosomas 3 (Saccharomyces)); MGC: 32192 (clon de cDNA MGC:32192 IMAGE:5006129 de Mus musculus); Foxm1 (caja forkhead M1); Anxa8 (Anexina A8); S1c35a5 (familia 35 de transportadores de solutos, miembro A5); E030024M05 Rik (cDNA RIKEN); Cks2 (subunidad 2 reguladora de la proteína quinasa CDC28); Cilp (proteína de la capa intermedia de cartílago); Tacc3 (proteína 3 que contiene sobreenrrollamiento, acídica, transformante); Prc1 (Proteína reguladora de citoquinas 1); 2610509G12 Rik (cDNA RIKEN); 2810417H13 Rik (cDNA RIKEN); Pbk (quinasa de unión a PDZ); Capn6 (calpaína 6); Gmnn (geminina); Mcmd4 (deficiente en el mantenimiento de minicromosomas 4 homólogo); Ccna2 (ciclina A2); Pola1 (polimerasa de DNA alfa 1, 180 kDa); Hmgb3 (caja del grupo de alta movilidad 3); Tagln (Transgelina (proteína 22 del músculo liso)); 1600013K19 Rik (cDNA RIKEN); Serpine1 (inhibidor de proteínasa de Ser (o Cys), clase E, miembro 1); Wig1 (gen inducido por p53 tipo salvaje 1); Hgf (factor de crecimiento de hepatocito (factor de dispersión)); Gnpi (deaminasa de glucosamina-6-fosfato); Birc5 (proteína 5 que contiene repetición IAP baculoviral); Prim1 (primasa de DNA, subunidad p49); Rbl1 (proteína 1 similar a retinoblastoma (p107)); Pcna (antígeno nuclear de proliferación celular); E130315B21 Rik (cDNA RIKEN); 2610019I03 RIK (cDNA RIKEN); en el que un aumento en la expresión de al menos 1,5 veces, indica que dicho compuesto prueba presenta geno
toxicidad. Preferiblemente, el gen indicador se selecciona de entre el grupo que consiste en 4833427G06Rik y Dda3.
La célula de prueba comprende preferiblemente una célula mioblástica. Preferiblemente, la célula de prueba son células blásticas derivadas de ratón, rata, pez cebra, humano, chimpancé o pollo. Las células de prueba pueden modificarse para expresar una marca detectable además del gen indicador o para expresar un marcaje en lugar del gen indicador.
El cambio del nivel de expresión puede determinarse preferiblemente midiendo la cantidad de mRNA producido utilizando RT-PCR. Otro método preferible para determinar el cambio del nivel de expresión comprende medir el aumento de la señal producida por el aumento de la expresión de un marcaje.
También se describe un equipo para determinar la geno- toxicidad de un compuesto prueba, que comprende una célula adecuada capaz de diferenciarse, y reactivos para cuantificar los niveles de expresión de los genes indicadores seleccionados.
También se describe un polinucleótido capaz de hibridar específicamente con un polinucleótido con la secuencia de Id. de Sec. Nº: 5, 7, 9, 11, 13, 15, o 17, o la complementaria de la misma. Otro aspecto de la invención comprende un conjunto de polinucleótidos capaces de hibridar específicamente con una serie de genes indicadores seleccionados.
Otro aspecto de la solicitud es un microchip que comprende un conjunto de polinucleótidos capaces de hibridar específicamente con una serie de genes indicadores seleccionados.
Otro aspecto de la solicitud comprende un polipéptido con la secuencia de Id. de Sec. Nº:6, 8, 10, 12, 14, 16, o
18.
También se describe un anticuerpo capaz de unir específicamente a un polipéptido con la secuencia de Id. de Sec. Nº: 6, 8, 10, 12, 14, 16, o 18,
así como un mamífero transgénico no humano en el que el gen marcador está unido de forma operativa a un gen indicador.
Definiciones:
A no ser que se indique de otra manera, los siguientes términos utilizados en esta Solicitud, incluyendo la especificación y las reivindicaciones, poseen las definiciones dadas a continuación. Debe resaltarse que, tal como se utilizan en la especificación y las reivindicaciones anexadas, las formas singulares "un", "una," y "el", "la" incluyen las referencias en plural a no ser que el contexto claramente dicte lo contrario.
El término "célula de prueba" se refiere a una célula como una célula blástica que es capaz de una posterior diferenciación, por ejemplo hasta un estado terminalmente diferenciado como un miotúbulo, adipocito, eritrocito o similares. Las células de prueba derivan preferiblemente de vertebrados como, por ejemplo, el pez cebra (Danio rerio),
pollo (Gallus gallus), ratón (Mus musculus), rata (Rattus norvegicus), chimpancé (Pan troglodytes), humano (Homo sapiens) y similares. Las "células de prueba" incluyen tanto las muestras de células primarias como las líneas celulares establecidas, ya sean de tipo recombinante o salvajes. Ejemplos de células de prueba incluyen, sin limitación, las células C2C12 de ratón, células L6E9 de rata, preadipocitos, células 3T3-L1, osteoblastos y similares. Las células de prueba pueden modificarse para expresar un marcaje detectable además o en lugar del gen indicador. Por ejemplo, la célula de prueba puede estar transfectada de forma estable con una construcción que comprende las secuencias reguladoras derivadas de un gen indicador, unido de forma operativa a un gen marcador detectable como una luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP), β-galactosidasa (βGal), peroxidasa de rábano picante (HRP) o similares.
El término "muestra de prueba" se refiere a una sustancia, mezcla o condición de prueba con la que la célula de prueba puede ponerse en contacto o tratarse, con el propósito de evaluar la genotoxicidad de la misma. El método de la invención es útil para evaluar el efecto genotóxico de sustancias diferentes de compuestos y soluciones puras, y así pueden utilizarse para analizar, por ejemplo, la radiación; muestras ambientales (por ejemplo de aire, agua o suelo contaminado); virus u otros microorganismos; proteínas, polinucleótidos, polímeros y otras macromoléculas, y similares. Las células de prueba pueden "ponerse en contacto" con condiciones como la radiación exponiendo la célula
a dichas condiciones de forma que se permita reaccionar a la célula.
El término "gen indicador" se refiere a un gen en el que la modulación del nivel de expresión se correlaciona con la genotoxicidad (daño del DNA). Los genes indicadores dentro del alcance de esta invención incluyen el DDA3 (Id. de Sec. Nº:1, Id. de Sec. Nº:3), 4833427G06Rik (Id. de Sec. Nº:5, 7, 9, 11, 13, 15, o 17) y los genes listados en la Tabla 2 más adelante.
Los términos "promotor" y "región reguladora" se utilizan de forma intercambiable en este documento para referirse a secuencias de polinucleótido que se unen a factores de transcripción y transcriptasas, que regulan la expresión de un gen indicador. Los promotores se encuentran adyacentes (en cis) y (normalmente) corriente arriba de las regiones codificantes o genes estructurales.
El término "gen marcador" tal como se utiliza en este documento se refiere a un gen que codifica un producto detectable. Un "gen marcador" es un gen que, tras su expresión, confiere un fenotipo a una célula que expresa el gen marcador de forma que la célula puede identificarse bajo condiciones apropiadas. En el presente caso, el gen marcador está unido de forma operativa a un promotor o secuencia reguladora, de forma que la expresión del gen marcador indica la activación del promotor o secuencia reguladora. Un "gen marcador heterólogo" es un gen marcador que está unido de forma operativa a un promotor o región reguladora diferente del promotor o región reguladora al que normalmente
está unido. Por ejemplo, el gen marcador puede producir un producto polipeptídico que puede detectarse fácilmente o medirse en un ensayo rutinario. Los genes marcadores adecuados conocidos en la materia que confieren esta característica incluyen aquellos que codifican la cloramfenicol acetil transferasa (actividad CAT), β-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, hormona de crecimiento humana, proteínas fluorescentes, como la proteína verde fluorescente (GFP) y otras. De hecho, cualquier gen que codifique una proteína o enzima que pueda medirse fácilmente, por ejemplo, mediante un inmunoensayo como un ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA) o mediante la conversión enzimática de un sustrato en un producto detectable, y que casi no se exprese en las células huésped (expresión específica sin ruido de fondo) puede utilizarse como gen marcador para analizar la actividad del promotor. Otros genes marcadores que pueden utilizarse en el presente documento incluyen los genes que permiten la selección de las células en base a su capacidad de prosperar en presencia o ausencia de un agente químico u otro agente que inhiba una función esencial de una célula. Los marcadores adecuados, por lo tanto, incluyen los genes que codifican proteínas que confieren resistencia a fármacos o sensibilidad a los mismos, o que cambiar las características antigénicas de las células que expresan el gen marcador cuando las células crecen en un medio selectivo apropiado. Por ejemplo, los genes marcadores incluyen: marcadores citotóxicos y de resistencia a fármacos, en los que las células se seleccionan por su capacidad
de crecer en medios que contienen una o más de las cito- toxinas o fármacos; marcadores auxotróficos mediante los que las células se seleccionan por su capacidad de crecer sobre medios definidos con o sin nutrientes concretos o suplementos; y marcadores metabólicos mediante los que las células se seleccionan, por ejemplo, por su capacidad de crecer sobre un medio definido que contiene el azúcar apropiado como única fuente de carbono. Estos y otros genes marcadores son bien conocidos en la materia.
Un "cambio en el nivel del producto del gen marcador" se detecta comparando los niveles de expresión del producto del gen marcador en una célula expuesta a un compuesto candidato en relación a los niveles del producto del gen marcador expresado en una célula que no está expuesta al compuesto de prueba y/o a una célula que está expuesta al compuesto control. El cambio en el nivel puede determinarse cuantitativamente por ejemplo, mediante su medida utilizando un espectrofotómetro, espectrofluorómetro, luminómetro y similares, y generalmente representará un aumento o descenso estadísticamente significativo en el nivel respecto al ruido de fondo. Sin embargo, un cambio tal también puede detectarse sin una medida cuantitativa simplemente, por ejemplo, mediante la visualización, como cuando el gen marcador confiere la capacidad a las células de formar colonias coloreadas sobre sustratos cromogénicos.
El término "ligado operativamente" indica una relación funcional entre un promotor o una región reguladora y un gen estructural regulado, de forma que la activación del
promotor o región reguladora da lugar a un aumento de la trascripción del gen estructural.
El término "Dda3" o "DDA3" se refiere a el polinucleótido con la secuencia de Id. de Sec. Nº:1 (murina) o Id. de Sec. Nº:3 (humana). Los "homólogos" de DDA3 son polinucleótidos (por ejemplo, RNA, cDNA o DNA genómico) que se derivan de otras especies y que poseen una secuencia similar al Dda3 murino y/o humano (cadena directa o reversa), con una identidad de secuencia de al menos un 60%. Los homólogos de la proteína DDA3 murina y/o humana son polipéptidos derivados de otras especies con al menos un 60% de identidad de secuencia con la proteína DDA3 murina o humana (Id. de Sec. Nº:2 o Id. de Sec. Nº:4, respectivamente).
El término "4833427G06Rik" se refiere al polinucleótido con la secuencia de Id. de Sec. Nº:5 (murina), Id. de Sec. Nº:7 (humana), Id. de Sec. Nº:9 (rata), Id. de Sec. Nº:11 (pez cebra), Id. de Sec. Nº:13 (el segundo homólogo de pez cebra), Id. de Sec. Nº:15 (pollo) o Id. de Sec. Nº:17 (chimpancé). Los "homólogos" de 4833427G06Rik son polinucleótidos (por ejemplo, RNA, cDNA o DNA genómico) que se derivan de otras especies y que poseen una secuencia similar al 4833427G06Rik murino y/o humano (cadena directa o reversa), con una identidad de secuencia de al menos un 60%. Los homólogos de la proteína 4833427G06Rik murina y/o humana son polipéptidos derivados de otras especies con al menos un 60% de identidad de secuencia con la proteína 4833427G06Rik murina o humana (Id. de Sec. Nº:6 o Id. de
Sec. Nº:8, respectivamente).
El término "hibridación específica" tal y como se utiliza en este documento se refiere a la unión de cadenas complementarias de ácido nucleico entre ellas mediante puentes de hidrógeno. Los niveles de astringencia utilizados para hibridar una sonda dada con un DNA diana pueden variarse fácilmente por los expertos en la materia. La frase "hibridación astringente" se utiliza aquí para referirse a las condiciones bajo las que las moléculas de polinucleótido de doble cadena son estables sólo cuando la complementariedad es muy elevada, con pocos desemparejamientos de bases, como se ve reflejado en la temperatura de fusión (Tm) de los polinucleótidos de doble cadena ("ds"). En general, la estabilidad de un polinucleótido ds es una función de la concentración de ion sodio y de la temperatura. Típicamente, una reacción de hibridación se realiza bajo condiciones de baja astringencia, seguida de lavados de astringencia creciente. La referencia a la astringencia de la hibridación está relacionada con tales condiciones de lavado.
Como se utiliza aquí, la frase "hibridación moderadamente astringente" se refiere a unas condiciones que permiten que el DNA diana se una al ácido nucleico complementario que posee alrededor del 60% de identidad, preferiblemente alrededor del 75% de identidad, más preferiblemente alrededor del 85% de identidad con el DNA diana; siendo especialmente preferible una identidad con el DNA diana superior al 90%. Preferiblemente, las condiciones moderadamente astringentes son condiciones equivalentes a una hibridación
en formamida al 50%, solución de Denhart 5x, SSPE 5x, SDS al 0,2% a 42°C, seguido de un lavado en SSPE 0,2x, SDS 0,2% a 65°C. La frase "hibridación de elevada astringencia" se refiere a las condiciones que permiten sólo la hibridación de aquellas secuencias de ácido nucleico que forman híbridos estables en NaCl 0,018 M a 65°C (es decir, si un híbrido no es estable en NaCl 0,018 M a 65°C, no será estable bajo condiciones de elevada astringencia, como se contempla aquí). Pueden proporcionarse condiciones de elevada astringencia, por ejemplo, mediante una hibridación en formamida al 50%, solución de Denhart 5x, SSPE 5x, SDS al 0,2% a 42°C, seguido de lavados en SSPE 0,1x y SDS al 0,1% a 65°C. La frase "hibridación de baja astringencia" se refiere a las condiciones equivalentes a una hibridación en formamida al 10%, solución de Denhart 5x, SSPE 6x, SDS al 0,2% a 42°C, seguido de lavados en SSPE 1x y SDS al 0,2% a 50°C (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) que son bien conocidas para los expertos en la materia así como otros tampones de hibridación adecuados.
El término "unión específica" entre dos entidades significa una afinidad de al menos 107 M-1 .
El término "identidad sustancial" significa que dos polinucleótidos o secuencias de polipéptido, cuando se alinean de forma óptima, como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando la introducción de huecos por defecto, comparten al menos un 65% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 80% o 90% de identidad de secuencia,
más preferiblemente al menos 95% secuencia identidad o más (por ejemplo, un 99% de identidad de secuencia o más). En el caso de los polipéptidos, las posiciones de los residuos que no son idénticas preferiblemente difieren por substituciones de aminoácido conservativas. Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de referencia y de prueba en un ordenador, y se indican las coordenadas de subsecuencia (si es necesario), y los parámetros del programa con algoritmos de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencia de la(s) secuencia (s) de prueba en relación con la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa indicados. Un alineamiento de secuencias óptimo para su comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante un algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482, mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch,
J. Mol. Biol. (1970) 48:443, mediante el método de búsqueda por similitud de Pearson y Lipman, Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85:2444, mediante las mejoras computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual. Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de
secuencia es el algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10. El programa para realizar análisis BLAST está disponible para el público a través del National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Normalmente, se utilizan los parámetros del programa por defecto para realizar la comparación de secuencias, aunque también pueden utilizarse parámetros personalizados. Para las secuencias de aminoácido, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de valoración BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 89:10915).
Con el propósito de clasificar las sustituciones de aminoácido como conservativas o no conservativas, se agrupan los aminoácidos como sigue: cadenas laterales hidrofóbicas: norleucina, met, ala, val, leu, ile; cadenas laterales hidrófilas neutras: cys, ser, thr; cadenas laterales acídicas: asp, glu; cadenas laterales básicas: asn, gln, his, lys, arg; residuos que afectan la orientación de las cadenas: gly, pro; y cadenas laterales aromáticas: trp, tyr, phe. Las sustituciones conservativas involucran sustituciones entre aminoácidos del mismo tipo. Las sustituciones no conservativas constituyen un intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra.
El término "anticuerpo" o "inmunoglobulina" se utiliza para incluir anticuerpos intactos y fragmentos de unión de los mismos. Normalmente, los fragmentos compiten con el anticuerpo intacto a partir del que se han derivado por la
unión específica a un fragmento de antígeno e incluyen distintas cadenas pesadas, cadenas ligeras Fab, Fab’ F(ab’)2, Fabc y Fv. Los fragmentos se producen mediante técnicas de DNA recombinante, o mediante la separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. El término "anticuerpo" también incluye una o más cadenas de inmunoglobulina conjugadas químicamente o que se expresen como proteínas de fusión con otras proteínas. El término "anticuerpo" también incluye los anticuerpos biespecíficos. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial con dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes y dos lugares de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos que incluyen la fusión de hibridomas o ligado de fragmentos Fab’. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. (1990) 79:315-21; Kostelny et al., J. Immunol. (1992) 148:1547-53. Un "antígeno" es una entidad a la que un anticuerpo se une específicamente.
El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un lugar sobre un antígeno al que las células B y/o T responden. Los epítopos de las Células B pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se retienen tras la exposición a solventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario normalmente se pierden tras el tratamiento con solventes desnaturalizantes. Un
epítopo normalmente incluye al menos 3 y más habitualmente, al menos 5 o 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos de determinación de conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana. Las células T reconocen epítopos continuos de alrededor de nueve aminoácidos en el caso de las células CD8 o alrededor de 13-15 aminoácidos en el caso de las células CD4. Las células T que reconocen el epítopo pueden identificarse mediante ensayos in vitro que miden la proliferación dependiente de antígeno, como la determinación mediante la incorporación de timidina tritiada en células T cebadas en respuesta a un epítopo (Burke et al., J. Inf. Dis. (1994) 170:1110-19), mediante muerte dependiente de antígeno (ensayo de linfocitos T citotóxicos, Tigges et al., J. Immunol. (1996) 156:3901-10) o mediante la secreción de citoquinas.
Un "agente inmunogénico" o "inmunógeno" es capaz de inducir una respuesta inmunológica frente a sí mismo tras su administración a un mamífero, opcionalmente junto con un adyuvante. El término "adyuvante" se refiere a un compuesto que cuando se administra junto con un antígeno aumenta la respuesta inmune al antígeno, pero cuando se administra so
lo no genera una respuesta inmune al antígeno. Los adyuvantes pueden aumentar una respuesta inmune a través de varios mecanismos, lo que incluye el reclutamiento de linfocitos, estimulación de células B y/o T y estimulación de macrófagos.
La competición entre anticuerpos se determina mediante un ensayo en el que la inmunoglobulina a prueba inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecta en fase sólida (RIA), inmunoensayo enzimático directo
o indirecto en fase sólida (EIA), ensayo de competición en sándwich (véase Stahli et al., Meth Enzymol (1983) 9:24253); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (véase Kirkland et al., J. Immunol. (1986) 137:3614-19); ensayo con marcaje directo en fase sólida, ensayo directo de sándwich con marcaje en fase sólida (véase Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA con marcaje directo en fase sólida utilizando un marcaje de 125I (véase Morel et al., Mol. Immunol. (1988) 25(1):7-15); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung et al., Virology (1990) 176:546-52); y RIA directo con marcaje (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. (1990) 32:77-82). Normalmente, tal ensayo involucra la utilización de antígeno purificado unido a una superficie sólida o a células que muestran una inmunoglobulina no marcada de prueba o bien una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de
marcaje unido a la superficie sólida o a las células en presencia de la inmunoglobulina de prueba. Normalmente la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Los anticuerpos identificados mediante un ensayo de competición (anticuerpos de competición) incluyen los anticuerpos de unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y los anticuerpos de unión a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo unido al anticuerpo de referencia para que aparezca un impedimento estérico. Normalmente, cuando un anticuerpo de competición está presente en exceso, se inhibe la unión especifica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos un 50 o 75%.
"Tratar" o "tratamiento" de una enfermedad incluye:
(1) evitar la enfermedad, es decir, evitar que los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen en un mamífero que puede estar expuesto o predispuesto a la enfermedad pero que no está experimentando o mostrando los síntomas de la enfermedad; (2) inhibir la enfermedad, es decir, detener
o reducir el desarrollo de la enfermedad o sus síntomas clínicos; o (3) aliviar la enfermedad, es decir, causar una regresión de la enfermedad o de sus síntomas clínicos.
"Una cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad de un compuesto que, cuando se administra a un mamífero para tratar una enfermedad, es suficiente para constituir el tratamiento de tal enfermedad. La "cantidad terapéuticamente efectiva" variará dependiendo del compuesto, la enfermedad y su gravedad, y de la edad, peso, etc. del
mamífero a tratar.
"Modulador" significa una molécula que interacciona con una diana. Las interacciones incluyen, pero no se limitan a agonismo, antagonismo y similares, como se definen aquí.
"Opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrita a continuación puede pero no es necesario que ocurra y que la descripción incluye ejemplos en los que el evento o circunstancia aparece y ejemplos en los que no.
"Estado de enfermedad" significa cualquier enfermedad, condición, síntoma o indicación.
"Sujeto" significa mamíferos y no mamíferos. Mamíferos significa cualquier miembro de la clase mammalia, lo que incluye, pero no se limita a los humanos, los primates no humanos como los chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja como vacas, caballos, ovejas, cabras y cerdos; animales domésticos como conejos, perros y gatos; animales de laboratorio, lo que incluye roedores, como ratas, ratones y conejillos de indias, y similares. Ejemplos de no mamíferos incluyen, pero no se limitan a, pájaros y similares. El término "sujeto" no indica una edad
o sexo en particular.
El término "animal transgénico" o "animal knock-out" se refiere a un animal no humano diseñado con una disfunción de la expresión de un gen o genes diana, o con la expresión de un gen heterólogo.
Método general
La invención proporciona un método para detectar la genotoxicidad de un compuesto. Esencialmente, se proporcionan células de prueba que son capaces de una posterior diferenciación. Las células de prueba se ponen en contacto con un compuesto de prueba o muestra de prueba, y se incuban durante un periodo de tiempo suficiente para que el compuesto de prueba o muestra de prueba interaccionen con la célula de prueba. A continuación, la célula de prueba se induce a diferenciarse y se determina si existe un cambio en el nivel de expresión de uno o más genes indicadores.
En primer lugar se selecciona una célula de prueba adecuada. En general, la célula de prueba utilizada será capaz de diferenciarse posteriormente hasta una forma intermediaria o finalmente diferenciada, y puede comprender una línea celular, muestra de tejido, aislamiento o explante, y similares. La célula de prueba puede estar presente como parte de la población de células en una muestra o aislamiento. Alternativamente, la respuesta celular puede estudiarse in situ, administrando los compuestos de prueba a un animal, particularmente a un animal transgénico no humano. Preferiblemente, se utiliza una línea celular permanente como C2C12.
La célula adecuada puede modificarse al incorporar una construcción indicadora, por ejemplo al reemplazar el gen estructural DDA3 o la región codificante de 4833427G06Rik con un gen marcador, por ejemplo, mediante recombinación homóloga, o mediante la transformación de una célula con una construcción con la región reguladora de un gen indica
dor unido de forma operativa a un gen marcador. Se puede utilizar cualquiera de los genes listados en la Tabla 2 o combinaciones de los mismos. Adicionalmente, se puede utilizar un panel de dos o más células de prueba diferentes, mientras cada célula de prueba comprenda una construcción marcadora que responda a la región reguladora de uno o más genes indicadores. Cuando la construcción marcadora proporciona un marcaje visualizable, como la proteína verde fluorescente (GFP), β-galactosidasa (βGal) o similares, cada célula de prueba preferiblemente comprende no más de dos construcciones marcadoras, más preferiblemente no más de una construcción marcadora. Cuando la construcción marcadora proporciona un marcaje de trascripción (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido distintiva), la célula puede contener múltiples construcciones marcadoras. En ambos casos, pueden obtenerse un panel de células de prueba con diferentes tipos de célula de prueba (por ejemplo, mioblastos y osteoblastos), y/o células de prueba derivadas de diferentes especies (por ejemplo, células de ratón y humanas).
Los genes indicadores particulares a analizar se seleccionan preferiblemente en base a su selectividad, es decir, deben mostrar una potente respuesta a la exposición a compuestos o condiciones genotóxicas, y poca o ninguna respuesta a compuestos o condiciones que no sean genotóxicas. La "respuesta potente" puede ser una regulación positiva o negativa, y se evalúa generalmente mediante la comparación con el grado de variación de la señal en ausencia de un compuesto o condición genotóxico (por ejemplo, comparando
con el “ruido de fondo” del gen). Preferiblemente, los genes indicadores utilizados comprenden DDA3 y 4833427G06Rik.
Los compuestos a analizar pueden derivarse de cualquier fuente, y pueden proporcionarse como compuestos o soluciones puras, mezclas, fármacos formulados, muestras ambientales complejas (por ejemplo, una muestra de agua o suelo de la que se sospecha que contiene agentes genotóxicos) y similares. En el caso de los compuestos puros, como por ejemplo los candidatos a fármacos, preferiblemente se preparan una serie de diluciones, generalmente limitadas por la menor concentración a la que se observa un efecto (o la menor concentración que probablemente se va a utilizar) y la máxima concentración que las células seleccionadas tolerarán (o una dosis que es los suficientemente elevada para ser tóxica). En el caso de muestras desconocidas, preferiblemente se prepararán una serie de diluciones como, por ejemplo 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, etc., para determinar la potencia de cualquier agente genotóxico que pueda estar incluido. En el caso de las muestras ambientales, en lugar de esto, se puede establecer en primer lugar una nivel basal "aceptable", y cribar las muestras a esta dilución para determinar si las muestras contienen o no una cantidad menor al nivel "aceptable" de agentes genotóxicos. Las muestras ambientales opcionalmente pueden esterilizarse previamente a su análisis, para evitar los posibles efectos de virus, bacterias y hongos que pueden estar presentes en la muestra.
Las células seleccionadas se ponen en contacto con compuestos o muestras mientras se mantienen en la fase de reposo (G0) del ciclo mitótico, y se incuban durante un periodo de tiempo suficiente para que aparezca cualquier interacción posible. En general, este tiempo de incubación será al menos de alrededor de 5 minutos, más preferiblemente al menos de alrededor de 20 minutos, aún más preferiblemente al menos de alrededor de 1 hora y aún más preferiblemente al menos de alrededor de 4 horas. El tiempo de incubación preferiblemente será inferior a alrededor de 48 horas, más preferiblemente inferior a alrededor de 36 horas y más preferiblemente entre alrededor de 12 y 24 horas.
Tras la incubación con los compuestos o muestras, las células se lavan opcionalmente para eliminar cualquier resto de compuesto, después se exponen a condiciones que puedan inducir a las células a diferenciarse (las células pueden detenerse o no, y en realidad no se diferencian). El método para inducir la diferenciación dependerá generalmente de las células empleadas en particular, pero normalmente implica añadir factores de crecimiento adecuados, a menudo en forma de suero. Se permite a las células diferenciarse durante un periodo de tiempo suficiente para que ocurra un cambio detectable en los niveles de expresión génica del indicador. En general, este tiempo de diferenciación será de al menos de alrededor de 5 minutos, preferiblemente al menos de alrededor de 20 minutos, aún más preferiblemente al menos de alrededor de 1 hora, y aún más preferiblemente al menos de alrededor de 4 horas. El tiempo de diferencia
ción será generalmente inferior a alrededor de 48 horas, más preferiblemente inferior a alrededor de 36 horas, más preferiblemente entre 12 y 24 horas.
Tras la exposición a las condiciones de diferenciación, se determina el nivel de expresión de uno o más genes indicadores. El nivel de expresión puede detectarse midiendo directamente el mRNA transcrito del gen indicador (por ejemplo, utilizando RT-PCR o PCR cuantitativa o semi- cuantitativa u otro método de amplificación de dianas), midiendo el producto de proteína, midiendo un marcaje detectable expresado bajo el control del promotor del gen indicador, o utilizando otros métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, N. Kruse et al., J Immunol Meth (1997) 210:195-203. El producto de proteína puede medirse mediante una serie de métodos conocidos en la técnica, incluyendo la medición directa de la proteína mediante la unión a un anticuerpo selectivo (tras la traducción de mRNA in vivo o in vitro), midiendo la proteína mediante su actividad enzimática o la actividad de una proteína de fusión combinando el producto de gen indicador con un marcaje detectable (por ejemplo luciferina, proteína verde fluorescente, peroxidasa de rábano picante), y similares.
Cuando los polinucleótidos se detectan directamente, las secuencias utilizadas serán generalmente subgrupos de secuencias (y sus complementarios) establecidos en el Listado de Secuencias adjunto. La selección de la secuencia dependerá de las especies de células utilizadas, y los detalles de cualquier construcción utilizada y forma de am
plificación utilizada. Ejemplos de secuencias para RT-PCR incluye, sin limitación, Id. de Sec. Nº:19, Id. de Sec. Nº:20, Id. de Sec. Nº:22, y Id. de Sec. Nº:23.
El cambio en el nivel de expresión se determina normalmente mediante la comparación con un nivel de expresión control, que puede ser un valor medio histórico ya establecido, o preferiblemente el nivel de expresión de una célula prueba no tratada con un compuesto genotóxico (por ejemplo, tratado con vehículo solo) pero de otra manera tratado idénticamente con las otras células prueba. En general, un aumento o descenso en el nivel de expresión en un factor de 1,5 o superior, preferiblemente un factor de 2,0 o superior, en la expresión de un gen indicador significa que el compuesto prueba presenta genotoxicidad.
Se desconocía previamente si el gen 4833427G06Rik y su producto de proteína presentaban cualquier actividad: nuestra invención demuestra que están involucrados en la regulación del ciclo celular y en la diferenciación.
La presente invención también proporciona vectores de expresión y de clonaje recombinantes que contienen DNA, así como células huésped que contienen los vectores recombinantes. Los vectores de expresión que comprenden DNA pueden utilizarse para preparar los polipéptidos o fragmentos de la invención codificados por el DNA. Un método para producir polipéptidos comprende el cultivo de células huésped transformadas con un vector de expresión recombinante que codifica el polipéptido, bajo condiciones que promueven la expresión del polipéptido, recuperando después los polipép
tidos expresados del cultivo. El experto en la materia reconocerá que el procedimiento para purificar los polipéptidos expresados variarán de acuerdo con dichos factores como el tipo de células huésped empleadas, y si el polipéptido está unido a membrana o en forma soluble que se secreta de la célula huésped. Cualquier sistema de expresión adecuado puede emplearse. Los vectores incluyen un DNA que codifica un polipéptido o fragmento de la invención, unido de forma operativa a secuencias de nucleótidos reguladoras adecuadas transcripcionales o traduccionales, como las derivadas de un gen de mamífero, microbio, virus, o insecto. Ejemplos de secuencias reguladoras incluye promotores transcripcionales, operadores, o potenciadores, un sitio de unión a mRNA ribosomal, y secuencias apropiadas que controlan la transcripción y el inicio y fin de la traducción. Las secuencias de nucleótidos están unidas de forma operativa cuando la secuencia reguladora está relacionada funcionalmente a la secuencia de DNA. Así, una secuencia de nucleótidos de un promotor está unida de forma operativa a una secuencia de DNA si la secuencia de nucleótidos de un promotor controla la transcripción de la secuencia de DNA. Un origen de replicación que confiere la capacidad de replicar en las células huésped deseadas, y un gen de selección mediante el que se identifican los transformantes, se incorporan generalmente en el vector de expresión.
Además, una secuencia que codifica un péptido señal apropiado (nativo o heterólogo) puede incorporarse en los vectores de expresión. Una secuencia de DNA para un péptido
señal (líder de secreción) puede fusionarse en marco de lectura con la secuencia de polinucleótido de la invención para que el DNA se transcriba inicialmente, y el mRNA se traduzca, en una proteína de fusión que comprende el péptido señal. Un péptido señal que es funcional en las células huésped promueve la secreción extracelular del polipéptido. El péptido señal se escinde del polipéptido tras la secreción del polipéptido de la célula.
El experto en la materia también reconocerá que la(s) posición (es) en la que el péptido señal se escinde puede diferir de la predicha por el programa de ordenador, y puede variar de acuerdo con varios factores como el tipo de células huésped empleadas en la expresión de un polipéptido recombinante. Una preparación de proteína puede incluir una mezcla de moléculas de proteína con diferentes aminoácidos N-terminal, que resultan en la escisión del péptido señal en más de un sitio.
Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos incluye células procariotas, de levadura o eucariotas superiores. Las células de mamíferos o insecto se prefieren generalmente para su uso como células huésped. Los vectores de expresión y clonación apropiados para utilizar con células huésped de bacterias, hongos, levaduras, y mamíferos se describen, por ejemplo, en Pouwels et al., "Cloning Vectors: A Laboratory Manual" (Elsevier, New York, 1985). Se describen aquí los sistemas de traducción libres de células que pueden también emplearse para producir poli
péptidos utilizando RNA derivado de construcciones de DNA.
Los procariotas incluye organismos gram negativos o gram positivos. Las células huésped procariotas adecuadas para la transformación incluye, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y otras especies dentro del género de Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus. En una célula huésped procariota, como E. coli, un polipéptido puede incluir un residuo de metionina N- terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula huésped procariota. La Met N-terminal puede escindirse del polipéptido recombinante expresado.
Los vectores de expresión para utilizar en células huésped procariotas generalmente comprenden uno o más genes marcadores de selección fenotípica. Un gen marcador de selección fenotípica es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere una resistencia a antibiótico o que proporciona un requerimiento autotrófico. Ejemplos de vectores de expresión útiles para células huésped procariotas incluye aquellos derivados de los plásmidos comercialmente disponibles como el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). pBR322 contiene genes para la resistencia a ampicilina y tetraciclina, y proporciona así métodos simples para identificar células transformadas. Un promotor apropiado y una secuencia de DNA se insertan en el vector pBR322. Otros vectores comercialmente disponibles incluye, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, Wis., EE.UU.).
Las secuencias promotoras utilizadas comúnmente para
los vectores de expresión para células huésped procariotas
recombinantes incluye β-lactamasa (penicilinasa), sistema de promotor de lactosa (Chang et al., Nature (1978) 275:615; y Goeddel et al., Nature (1979) 281:544), sistema de promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nuc Acids Res. (1980) 8:4057; y EP036776) y promotor tac (Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresión para células huésped procariotas particularmente útiles utiliza un promotor de fago λPL y una secuencia represora termosensible cI857ts. Los vectores plasmídicos disponibles del American Type Culture Collection que incorpora derivados del promotor λPL incluye el plásmido pHUB2 (residente en la cepa de E. coli JMB9, ATCC 37092) y pPLc28 (residente en E. coli RR1, ATCC 53082).
Alternativamente, los polipéptidos pueden expresarse en células huésped de levaduras, preferiblemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). Otro género de levaduras, como Pichia o Kluyveromyces, pueden también utilizarse. Los vectores de levaduras a menudo contienen una secuencia de origen de replicación a partir de un plásmido de levadura 2P, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias de poliadenilación, secuencias para el fin de la transcripción, y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para los vectores de levadura incluye, entre otros, promotores para la metalotioneína, 3- fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. (1980) 255:2073) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. (1968)
7:149; y Holland et al., Biochem. (1978) 17:4900), como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa- 6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfo-glucosa isomerasa, y glucoquinasa. Otros vectores adecuados y promotores para utilizar en la expresión en levaduras se describen en profundidad en Hitzeman, PE073.657. Otra alternativa es el promotor ADH2 reprimible por glucosa descrito en Russell et al., J. Biol. Chem. (1982) 258: 2674 y Beier et al., Nature (1982) 300:724. Los vectores lanzadera replicables en ambas levadura y E. coli pueden construirse al insertar secuencias de DNA de pBR322 para la selección y replicación en E. coli (gen Ampr y origen de replicación) en los vectores de levadura descritos anteriormente.
La secuencia líder del factor α de levadura puede utilizarse para dirigir la secreción del polipéptido. La secuencia líder del factor α se inserta a menudo entre la secuencia promotor y la secuencia del gen estructural. Véase, por ejemplo, Kurjan et al., Cell (1982) 30:933, y Bitter et al., Proc Natl Acad Sci USA (1984) 81:5330. Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de los polipéptidos recombinantes de los huéspedes de levadura son conocidas por los expertos en la materia. Una secuencia líder puede modificarse cerca de su extremo 3’ para alojar uno o más sitios de restricción. Esto puede facilitar la fusión de la secuencia líder con el gen estructural.
Los protocolos de transformación de levaduras son co
nocidos por los expertos en la materia. Uno de dichos protocolos se describe en Hinnen et al., Proc Natl Acad Sci USA (1978) 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen et al. selecciona los transformantes Trp+ en un medio selectivo, en el que el medio selectivo consiste en una base nitrogenada de levadura 0,67%, casaminoácidos 0,5%, glucosa 2%, adenina 10 mg/ml y uracilo 20 mg/ml.
Las células huésped de levadura transformadas con vectores que contienen una secuencia promotora de ADH2 puede cultivarse para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de medio rico es uno que consiste en extracto de levadura 1%, peptona 2%, y glucosa 1% suplementado con adenina 80 mg/ml uracilo y 80 mg/ml. La ausencia de represión del promotor ADH2 ocurre cuando la glucosa se agota del medio.
Los sistemas de cultivo de células huésped de mamíferos o insectos también pueden utilizarse para expresar polipéptidos recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto se revisa en Luckow y Summers, Bio/Technology (1988)
6:47. También pueden utilizarse las líneas celulares establecidas de mamífero. Ejemplos de líneas celulares huésped adecuadas de mamífero incluye la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell (1981)
23: 175), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular de riñón de mo
no verde africano CV1 (ATCC CCL 70) como se describe en McMahan et al. (EMBO J. (1991) 10:2821).
Los métodos establecidos para introducir DNA en células de mamífero se ha descrito en (Kaufman, R.J., "Large Scale Mammmal cell Culture", 1990, pp. 15-69). Pueden utilizarse otros protocolos que utilizan reactivos comercialmente disponibles, como el reactivo de lípidos Lipofectamina (Gibco/BRL) o reactivo de lípidos Lipofectamina-Plus, para transfectar células (Felgner et al., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:7413-17). Además, pueden utilizarse electroporación para transfectar células de mamífero utilizando los procesos convencionales, como los descritos en Sambrook et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). La selección de transformantes estables puede realizarse utilizando métodos conocidos en la materia, como por ejemplo, resistencia a fármacos citotóxicos. Kaufman et al., Meth Enzymol (1990) 185:487-511, describe varios esquemas de selección, como la resistencia a la dihidrofolato reductasa (DHFR). Una cepa huésped adecuada para la selección de DHFR puede ser una cepa DX-B11 de CHO, que es deficiente en DHFR (Urlaub y Chasin, Proc Natl Acad Sci USA (1980) 77:421620). Un plásmido que expresa el cDNA de DHFR puede introducirse en la cepa DX-B11, y sólo las células que contienen el plásmido pueden crecer en el medio selectivo apropiado. Otros ejemplos de marcadores seleccionables que pueden incorporarse en un vector de expresión incluye los cDNA que confieren resistencia a antibióticos, como G418 y higromi
cina B. Las células portadoras del vector pueden seleccionarse según la resistencia a estos compuestos.
Las secuencias de control transcripcional y traduccional para los vectores de expresión de células huésped de mamífero pueden escindirse de los genomas virales. Las secuencias promotoras y potenciadoras comúnmente utilizadas derivan del virus de polioma, adenovirus 2, virus de simio40 (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de DNA derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, origen de SV40, promotor temprano y tardío, potenciador, sitios de corte y empalme, y de poliadenilación pueden utilizarse para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia de gen estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores tempranos y tardíos virales son particularmente útiles debido a que ambos se pueden obtener fácilmente de un genoma viral como un fragmento, que también puede contener un origen viral de replicación (Fiers et al., Nature (1978) 273:113; Kaufman, Meth. Enzymol (1990). También pueden utilizarse fragmentos de SV40 más grandes o más pequeños, siempre que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl I localizado en el origen de replicación viral SV40.
Las secuencias control adicionales mostraron mejorar la expresión de genes heterólogos a partir de los vectores de expresión de mamíferos incluyen elementos como el elemento de secuencia que aumentan la expresión (EASE) derivado de las células CHO (Morris et al., WO 97/25420) y el lí
der tripartito (TPL) y los RNA del gen VA de Adenovirus 2 (Gingeras et al., J. Biol. Chem. (1982) 257:13475-91). Las secuencias sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) de origen viral permite a los mRNA dicistrónicos traducirse eficientemente (Oh y Sarnow, Cur Op Gen Dev (1993) 3:295300; Ramesh et al., Polinuc Res (1996) 24: 2697-700). La expresión de un cDNA heterólogo como parte de un mRNA dicistrónico seguido del gen para un marcador seleccionable (por ejemplo DHFR) ha demostrado mejorar la capacidad de transfección del huésped y la expresión del cDNA heterólogo (Kaufman, Meth Enzymol, 1990). Ejemplos de vectores de expresión que utilizan mRNA dicistrónicos son pTR-DC/GFP descritos por Mosser et al., Biotechniques (1997) 22:150-61, y p2A5I descrito por Morris et al., "Animal Cell Technology", 1997, pp. 529-34.
Un vector de expresión alta útil, pCAVNOT, se ha descrito por Mosley et al., Cell (1989) 59:335-48. Otros vectores de expresión para utilizar en células huésped de mamífero pueden construirse como se describe en Okayama y Berg, Mol. Cell. Biol. (1983) 3:280. Un sistema útil para un nivel alto de expresión estable de cDNA de mamífero en células epiteliales mamarias murinas C127 pueden construirse sustancialmente como se describe en Cosman et al., Mol. Immunol. (1986) 23:935. Un vector de expresión alta útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al., Nature (1984) 312:768, se ha depositado como ATCC 39890. Otros vectores de expresión útiles de mamífero se describen en PE0367566, y en WO91/18982. En otra alternativa, los vectores pueden
derivarse de retrovirus.
Pueden utilizarse otros vectores de expresión útiles, pFLAG.RTM. La tecnología de FLAG.RTM. se centra en la fusión de un péptido marcador FLAG.RTM. de peso molecular bajo (1 kD), hidrofílico, al extremo N terminal de la proteína recombinante expresada por los vectores de expresión pFLAG.RTM.
Respecto a los péptidos señal que pueden utilizarse, el péptido señal nativo puede sustituirse por un péptido señal heterólogo o secuencia líder, si se desea. La elección del péptido señal o líder puede depender de factores como el tipo de células huésped en que se produce el polipéptido recombinante. Para ilustrar, ejemplos de péptidos señal heterólogos que son funcionales en células huésped de mamífero incluye la secuencia señal de interleuquina-7 (IL7) descrita en US 4.965.195; la secuencia señal del receptor de interleuquina-2 descrito en Cosman et al., Nature (1984) 312:768; el péptido señal del receptor de interleuquina-4 descrito en PE 367.566; el péptido señal del receptor de tipo I de interleuquina-1 descrito en US 4.968.607; y el péptido señal del receptor de tipo II de interleuquina-I descrito en PE 460.846.
Los polipéptidos "aislados" o fragmentos de los mismos abarcados por esta solicitud son polipéptidos o fragmentos que no están en un ambiente idéntico a un ambiente en el que pueden encontrarse en la naturaleza. Los polipéptidos "purificados" o fragmentos de los mismos están esencialmente libres de asociación con otras proteínas o polipéptidos,
por ejemplo, como producto de purificación de sistemas de expresión recombinantes como los descritos anteriormente o como producto purificado de una fuente no recombinante como las células y/o tejidos que aparecen de forma natural.
Respecto a cualquier tipo de célula huésped, como se conoce por el experto en la materia, los procedimientos para purificar un polipéptido recombinante o fragmento variará de acuerdo con dichos factores como el tipo de células huésped empleadas y si el polipéptido recombinante o fragmento está secretado o no en el medio de cultivo.
En general, el polipéptido recombinante o fragmento puede aislarse de las células huésped si no se secreta, o del medio o sobrenadante si es soluble y se secreta, seguido de uno o más pasos de concentración, desalinización, intercambio de iones, interacción hidrofóbica, purificación de afinidad o cromatografía de exclusión por tamaño. Formas específicas para lograr estos pasos, el medio de cultivo primero puede concentrarse utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Tras el paso de concentración, el concentrado puede aplicarse sobre una matriz de purificación como un medio de filtración en gel. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio de aniones, por ejemplo, una matriz o sustrato con grupos colgantes de dietilaminoetilo (DEAE). Las matrices pueden ser de acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros formas de purificación de proteínas utilizadas normalmente. Alternativamente, se puede utilizar un
paso de intercambio de cationes. Los intercambiadores de cationes adecuados incluye varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Además, puede emplearse un paso de cromatoenfoque. Alternativamente, se puede utilizar un paso de cromatografía de interacción hidrofóbica. Matrices adecuadas pueden ser porciones de fenilo o octilo unidas a resinas. Además, puede utilizarse la cromatografía de afinidad con una matriz que se une de forma selectiva a la proteína recombinante. Ejemplos de tales resinas utilizadas son columnas de lectina, columnas de colorante, y columnas de quelantes de metales. Finalmente, pueden utilizarse una o más pasos de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase reversa (RP-HPLC) utilizando medio RP-HPLC hidrofóbico, (por ejemplo, gel de sílice o resina de polímero con grupos metilo, octilo, octildecilo u otros grupos alifáticos colgantes) para purificar los polipéptidos. Alguno o todos los pasos de purificación anteriores, en varias combinaciones, son bien conocidos y pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante aislada y purificada.
También es posible utilizar una columna de afinidad que comprende un proteína de unión a polipéptido de la invención, como un anticuerpo monoclonal generado frente a polipéptidos de la solicitud para purificar por afinidad los polipéptidos expresados. Estos polipéptidos pueden eliminarse de una columna de afinidad utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, en un tampón de elución de alta concentración de sal y después dializarse en un tampón de
elución de baja concentración de sal para utilizar o cambiar el pH u otros componentes que dependen de la matriz de afinidad utilizada, o eliminarse competitivamente utilizando el sustrato natural de la porción de afinidad, como un polipéptido derivado de la descripción.
En este aspecto de la solicitud las proteínas de unión a polipéptidos, como los anticuerpos anti-polipéptido u otras proteínas que pueden interaccionar con el polipéptido pueden unirse a un soporte de fase sólida como una matriz de cromatografía en columna o un sustrato similar adecuado para identificar, separar, o purificar células que expresan polipéptidos de la solicitud en la superficie de un sólido. La adherencia de proteínas de unión a polipéptido de la solicitud a una superficie de contacto de fase sólida puede lograrse mediante cualquier forma. Por ejemplo, las microesferas magnéticas pueden recubrirse con estas proteínas de unión a polipéptido y mantenerse en el recipiente de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de mezclas de células se ponen en contacto con la fase sólida que poseen dichas proteínas de unión a polipéptidos en ellas. Las células con los polipéptidos de la solicitud en su superficie se unen a la proteína de unión fijada al polipéptido y las células no unidas se eliminan por el lavado. Este método de unión por afinidad es útil para purificar, cribar, o separar dichas células que expresan polipéptidos de la solución. Los métodos para liberar positivamente las células seleccionadas de la fase sólida son conocidas en la materia y abarcan, por ejemplo, el uso de enzi
mas. Dichas enzimas son preferiblemente no tóxicas y no dañinas para las células y se dirigen preferiblemente para escindir la pareja de unión a la superficie celular.
Alternativamente, las mezclas de células sospechosas de contener células que expresan polipéptidos de la solicitud primero se incuban con una proteína de unión a polipéptido biotinilada. Los periodos de incubación son normalmente al menos de una hora de duración para asegurar una unión suficiente a los polipéptidos de la solicitud. La mezcla resultante se pasa a través de una columna empaquetada con cuentas recubiertas de avidina, en la que la alta afinidad de la biotina por la avidina proporciona la unión de las células de unión a polipéptido a las cuentas. El uso de cuentas recubiertas de avidina es conocido en la materia. Véase Berenson, et al. J. Cell. Biochem (1986) 10D:239. El lavado de material no unido y la liberación de las células unidas se realiza utilizando métodos convencionales.
El grado de pureza deseado depende del uso que se pretenda de la proteína. Un grado relativamente alto de pureza es deseable cuando el polipéptido debe administrarse in vivo, por ejemplo. En tal caso, los polipéptidos se purifican de forma que no se detectan bandas de proteína que corresponden con otras proteínas tras el análisis mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Un experto en la materia reconocerá que las bandas múltiples correspondientes con el polipéptido pueden visualizarse mediante SDS-PAGE, debido a la glicosilación diferencial, procesamiento post-traduccional diferencial y similares.
Más preferiblemente, el polipéptido de la invención se purifica hasta una homogeneidad sustancial, como se indica mediante una única banda de proteína tras el análisis mediante SDS-PAGE. La banda de proteína puede visualizarse mediante tinción de plata, tinción con azul de Coomassie, o (si la proteína está radiomarcada) mediante autoradiografía.
Los polipéptidos purificados de la solicitud (incluyendo proteínas, polipéptidos, fragmentos, variantes, oligómeros, y otras formas) pueden analizarse por su capacidad de unión a la pareja de unión en cualquier ensayo adecuado, como un ensayo de unión convencional. El polipéptido puede marcarse con un reactivo detectable (por ejemplo, un radio- núcleo, cromóforo, una enzima que cataliza una reacción colorimétrica o fluorométrica, y similares). El polipéptido marcado se pone en contacto con las células que expresan la pareja de unión. Las células se lavan entonces para eliminar el polipéptido marcado no unido, y la presencia marcaje unido a la célula se determina mediante una técnica adecuada, escogida de acuerdo con la naturaleza del marcaje.
Otro tipo de ensayo de unión competitivo utiliza una pareja de unión radiomarcada soluble, como una proteína de fusión soluble 4833427G06Rik /Fc, y células intactas que expresan un anticuerpo específico. Los resultados cualitativos pueden obtenerse mediante ensayos de unión en placa autoradiográficos competitivos, mientras que las representaciones Scatchard (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. (1949) 51:660) pueden utilizarse para generar resultados cuantita
tivos. Dichos ensayos de unión pueden ser útiles para evaluar la actividad biológica de una variante de polipéptido mediante el análisis de la capacidad de la variante para competir con la proteína nativa para unirse a la pareja de unión.
El polipéptido 4833427G06Rik de la presente solicitud puede también utilizarse en un ensayo de cribado para compuestos y moléculas pequeñas que inhiben la activación (antagonizan) mediante el polipéptido 4833427G06Rik de la presente invención. Así, los polipéptidos de la invención pueden utilizarse para identificar antagonistas de, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas, y mezclas de productos naturales. Los antagonistas pueden ser naturales o sustratos modificados, ligandos, enzimas, o receptores del polipéptido 4833427G06Rik, o pueden ser imitadores estructurales o funcionales del polipéptido 4833427G06Rik. Los antagonistas pueden ser moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos y oligonucleótidos antisentido.
Una realización de un método para identificar compuestos que antagonizan el polipéptido 4833427G06Rik es poner en contacto un compuesto candidato con células que responden al polipéptido 4833427G06Rik y observar la unión de 4833427G06Rik a las células, o la estimulación o inhibición de una respuesta funcional. La actividad de las células que se ponen en contacto con el compuesto candidato puede entonces compararse con las células idénticas que no se pusieron en contacto para la actividad del polipéptido
4833427G06Rik y pueden identificarse agonistas y antagonistas del polipéptido 4833427G06Rik. Otra realización de la presente invención proporciona un método para identificar compuestos que inhiben la síntesis o secreción de 4833427G06Rik mediante la puesta en contacto del compuesto candidato con células que expresan el polipéptido 4833427G06Rik y medir la producción de 4833427G06Rik. La medición de la producción de 4833427G06Rik puede realizarse mediante un número de métodos bien conocidos como la medición de la cantidad de proteína presente (por ejemplo, mediante ELISA) o de la actividad de la proteína.
Los polipéptidos purificados de acuerdo con la solicitud facilitarán el descubrimiento de inhibidores (o antagonistas) y/o agonistas de dichos polipéptidos. El uso de un polipéptido purificado de la invención en el cribado de inhibidores potenciales y/o agonistas de los mismos es importante y puede eliminar o reducir la posibilidad de reacciones de interferencia con contaminantes.
Además, los polipéptidos de la solicitud pueden utilizarse para el diseño basado en la estructura de inhibidores y/o agonistas del polipéptido. Dicho diseño basado en la estructura también se conoce como "diseño racional de fármacos". Los polipéptidos pueden analizarse de forma tridimensional mediante, por ejemplo, cristalografía por rayos X, resonancia magnética nuclear o modelado por homología, todas ellos son métodos bien conocidos. El uso de la información estructural del polipéptido en los sistemas de programas de modelado molecular para ayudar en el diseño de
inhibidores e interacción inhibidor-polipéptido también está abarcado por la solicitud. Dicho modelado asistido por computadora y diseño de fármacos puede utilizar información como el análisis químico conformacional, potencial electroestático de las moléculas, plegamiento de proteínas, etc. Por ejemplo, la mayoría del diseño de inhibidores específicos de clase de las metaloproteasas se ha centrado en los intentos de quelar o unir el átomo de zinc catalítico. Los inhibidores sintéticos se diseñan normalmente para contener una porción negativamente cargada a la que se une una serie de otros grupos diseñadas para ajustar los bolsillos de especificidad de la proteasa particular. Un método particular de la solicitud comprende el análisis de estructura tridimensional de polipéptidos descritos para la unión probable de sitios de unión de sustratos, sintetizar una nueva molécula que incorpora un sitio reactivo predictivo, y analizar la nueva molécula como se ha descrito anteriormente.
Los métodos de cribado específicos son conocidos en la materia y junto con los sistemas robóticos integrados y colecciones de compuestos químicos/ productos naturales se incorporan extensivamente en un cribado de alto rendimiento de forma que pueden analizarse un gran número de compuestos prueba para la actividad antagonista o agonista en un periodo corto de tiempo. Estos métodos incluyen formatos de ensayo homogéneos como transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, polarización de la fluorescencia, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia con resolución temporal, ensayos de proximidad de cente
lleo, ensayos de marcadores de genes, sustrato enzimático con la fluorescencia bloqueada, sustrato enzimático cromogénico y electroquimioluminescencia, así como formatos de ensayo heterogéneos más tradicionales como los ensayos inmunosorbentes asociados a enzima (ELISA) o radioinmunoensayos. Los ensayos homogéneos son preferibles. También se comprenden aquí los ensayos basados en células, por ejemplo aquellos que utilizan marcadores de genes, así como ensayos funcionales que analizan el efecto de un antagonista o agonista sobre la(s) función(es) biológica(s) o actividad(es) de 4833427G06Rik.
De acuerdo con esto, en un aspecto de la invención, se proporciona un método para buscar un compuesto prueba para determinar si el compuesto prueba afecta (o modula) una actividad biológica de un polipéptido 4833427G06Rik, el método comprende poner en contacto el compuesto prueba y el polipéptido 4833427G06Rik con células capaces de presentar la actividad biológica cuando se pone en contacto con 4833427G06Rik, y analizar las células para la aparición de actividad biológica, en la que si la actividad biológica observada en la presencia del compuesto prueba difiere de la actividad biológica observada cuando el compuesto prueba está ausente, el compuesto prueba afecta a la actividad biológica de 4833427G06Rik. Las células pueden ponerse en contacto in vitro o in vivo.
La modulación mediada por 4833427G06Rik de las rutas de señalización, a menudo implican una cascada de cambios moleculares, por ejemplo como se ha discutido anteriormente
cuando un receptor propaga una señal ligada a ligando-receptor mediante la activación específica de quinasas intracelulares que fosforilan los sustratos diana (que también pueden ser quinasas que se activan tras la fosforilación, o moléculas adaptadoras que facilitan la señalización corriente abajo a través de la interacción proteína-proteína tras la fosforilación), lo que resulta en la activación de otros factores (por ejemplo, NFκB). Cuando los métodos de cribado de la presente invención incluyen el análisis de la modulación inducida por 4833427G06Rik de las rutas de señalización, las rutas de señalización que pueden analizarse incluyen aquellas que implican la activación de NFκB. El análisis de la activación de las cascadas de señalización incluye además la detección de la fosforilación de moléculas que sucede durante la cascada de señalización, como en la fosforilación de IκB (que incluye los ensayos de degradación de IκB, y los ensayos de IκB libre), quinasa MAP p38, y la proteína quinasa activada por estrés (SAPK/JNK).
Además, los expertos en la materia entienden que la(s) actividad(es) biológica(s) es/son a menudo inducida(s) por la unión de un ligando (por ejemplo, 4833427G06Rik) a un receptor (porción de unión) presente en una célula; en consecuencia, tal como se ha descrito anteriormente, pueden utilizarse los polipéptidos 4833427G06Rik (que incluye los fragmentos de polipéptido 4833427G06Rik) en los estudios de unión para identificar células que expresan el receptor. Dichos estudios de unión también proporcionan ensayos úti
les en los métodos de la invención. Los polipéptidos 4833427G06Rik pueden también utilizarse para clonar receptores (u otras moléculas que se unen a 4833427G06Rik) y para buscar moléculas que bloquean las interacciones receptor/ligando. Los expertos en la materia entenderán que las actividades biológicas incluyen la proliferación celular, muerte celular, y cambios en la morfología celular y/o función (por ejemplo, activación, maduración); los ensayos que evalúan los efectos de 4833427G06Rik son conocidos en la materia, y también serán útiles en los métodos de la invención. Además, los modelos animales de los síndromes y/o enfermedades, como las descritas aquí, son útiles para el cribado de compuestos con actividad biológica, que incluye el cribado de antagonistas (o agonistas) de 4833427G06Rik.
Los métodos de la invención abarcan además realizar más de un ensayo para descubrir y/o analizar agonistas o antagonistas de la actividad de 4833427G06Rik (es decir, métodos de combinación). En general, dichos métodos comprenden la selección de compuestos prueba que afectan a una propiedad de 4833427G06Rik (es decir, la capacidad de unión de 4833427G06Rik a una porción de unión de 4833427G06Rik), después se analizan los compuestos seleccionados para un efecto sobre otra propiedad de 4833427G06Rik (es decir, poner en contacto los compuestos prueba seleccionados y un polipéptido 4833427G06Rik con células capaces de presentar una actividad biológica cuando entra en contacto con 4833427G06Rik, y determinar si los compuestos afectan a la actividad biológica). Por ejemplo, los métodos de la inven
ción pueden comprender un primer ensayo para determinar si una molécula candidata interacciona con (se une a) 4833427G06Rik. En una realización, el primer ensayo es en un formato de alto rendimiento, numerosas formas del mismo son conocidas en la materia y se describen aquí. Dicho ensayo comprenderá generalmente los pasos de: poner en contacto los compuestos de prueba y un polipéptido 4833427G06Rik con una porción de unión de 4833427G06Rik; determinando si los compuestos prueba afectan a la capacidad de unión de 4833427G06Rik a la porción de unión; y seleccionar uno o más compuestos prueba que afectan a la capacidad de unión de 4833427G06Rik a la porción de unión. Los métodos de combinación de la invención comprenden además evaluar los compuestos seleccionados en un segundo ensayo, para un efecto agonista o antagonista sobre la actividad biológica utilizando uno o más de los ensayos anteriormente mencionados.
De forma alternativa, los métodos de combinación de la invención pueden comprender un primer ensayo para determinar si una molécula candidata modula una actividad biológica de 4833427G06Rik, como se describe en este documento utilizando un ensayo in vitro o un ensayo in vivo (por ejemplo, un modelo animal). De acuerdo con dichos métodos de combinación, las moléculas que modulan una actividad biológica de 4833427G06Rik de esta manera se seleccionan utilizando uno o más de los ensayos mencionados anteriormente por su actividad biológica, y se analizan para determinar si la(s) molécula(s) candidata(s) se une(n) a
4833427G06Rik. Las moléculas seleccionadas pueden analizarse para definir además la región o regiones exactas de 4833427G06Rik a las que se une la molécula prueba (por ejemplo, mapeo de epítopos para anticuerpos).
Tal como se ha descrito anteriormente, los tipos de ensayo para actividades biológicas de 4833427G06Rik que pueden utilizarse en los métodos de combinación de la invención incluye ensayos para la expresión de citoquinas, ensayos para la expresión de moléculas de superficie celular, ensayos para detectar la activación de moléculas de señalización, ensayos para detectar la inducción de mRNA, y ensayos que evalúan la proliferación celular o muerte celular (y combinaciones de las mismas), como se ha descrito aquí. Las moléculas que se unen y que poseen un efecto agonista o antagonista sobre la actividad biológica serán útiles para tratar o prevenir enfermedades o condiciones en las que está(n) implicado(s) el/los polipéptido(s).
Los expertos en la materia entienden que cuando la actividad biológica observada en presencia del compuesto prueba es superior a la observada cuando el compuesto prueba está ausente, el compuesto prueba es un agonista de 4833427G06Rik, mientras que cuando la actividad biológica observada en presencia del compuesto prueba es inferior a la observada cuando el compuesto prueba está ausente, el compuesto prueba es un antagonista (o inhibidor) de 4833427G06Rik. En general, un antagonista disminuirá o inhibirá, una actividad en al menos un 30%; más preferiblemente, los antagonistas inhibirán la actividad en al menos
un 50%, más preferiblemente en al menos un 90%. De forma similar, un agonista aumentará, o potenciará, una actividad en al menos un 20%; más preferiblemente, los agonistas potenciarán la actividad en al menos un 30%, más preferiblemente en al menos un 50%. Los expertos en la materia también reconocerán que los agonistas y/o antagonistas con diferentes niveles de agonismo o antagonismo respectivamente serán útiles para diferentes aplicaciones (es decir, para el tratamiento de diferentes enfermedades).
Los ensayos homogéneos son ensayos del tipo mezclar y leer que son muy adecuados para su robotización, mientras que los ensayos heterogéneos requieren la separación de libre de analito unido mediante operaciones más complejas como filtración, centrifugación o lavado. Estos ensayos se utilizan para detectar una amplia variedad de interacciones biomoleculares específicas (que incluye proteína-proteína, receptor-ligando, enzima-sustrato, y otras), y la inhibición de los mismos mediante moléculas orgánicas pequeñas. Estos métodos de ensayo y las técnicas son bien conocidas en la materia (véase, por ejemplo, "High Throughput Screening: The Discovery of Bioactive Substances", John P. Devlin (ed.), Marcel Dekker, New York, 1997 ISBN: 0-8247-00678). Los ensayos de cribado de la presente invención son adecuados para el cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas y son adecuados para la identificación de fármacos candidatos de pequeñas moléculas, anticuerpos, péptidos, y otros antagonistas y/o agonistas, naturales o sintéticos. Varios ensayos útiles se describen en US 2003
0165985.
Los métodos de la invención pueden utilizarse para identificar antagonistas (también referidos como inhibido- res) y agonistas de la actividad 4833427G06Rik de las células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas, bibliotecas de cDNA, bibliotecas de anticuerpos recombinantes (o bibliotecas que comprenden subunidades de anticuerpos) y mezclas de productos naturales. Los antagonistas y agonistas pueden ser sustratos naturales o modificados, ligandos, enzimas, receptores, etc. de los polipéptidos de la presente invención, o pueden ser miméticos estructurales o funcionales de 4833427G06Rik o de su pareja/porción de unión. Los antagonistas potenciales de la presente invención incluye moléculas pequeñas, péptidos y anticuerpos que se unen y ocupan un sitio de unión de los polipéptidos de la invención o una pareja de unión de los mismos, provocando que no estén disponibles para unirse a sus parejas de unión naturales y previniendo así la actividad biológica normal. Los antagonistas también incluyen sustancias químicas (incluyendo moléculas pequeñas y péptidos) que interfieren con las rutas de señalización utilizadas por 4833427G06Rik (por ejemplo, inhibiendo la interacción de las subunidades del receptor, o inhibiendo la interacción de los componentes intracelulares de la cascada de señalización). Los agonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas, péptidos y anticuerpos que se unen a los polipéptidos de la invención o parejas de unión de las mismas, y obtener los mismos efectos biológicos o potenciados que los
provocados por la unión de los polipéptidos de la presente invención. Además, las sustancias que activan (o potencian) las rutas de señalización utilizadas por 4833427G06Rik también están incluidas dentro del alcance de los agonistas de 4833427G06Rik.
Los agonistas y los antagonistas de moléculas pequeñas poseen normalmente un peso molecular inferior a 10K y pueden poseer ciertas propiedades fisicoquímicas y farmacológicas que aumentan la penetración celular, resistencia a la degradación y prolongación de sus vidas medias fisiológicas. Los anticuerpos, que incluyen moléculas intactas así como fragmentos como los Fab y los F(ab’)2, así como moléculas recombinantes derivadas de las mismas (incluyendo anticuerpos expresados en fagos, intracuerpos, anticuerpos de cadena única como scFv y otras moléculas derivadas de inmunoglobulinas conocidas en la materia), pueden utilizarse para unirse e inhibir los polipéptidos de la presente solicitud al bloquear la propagación de la cascada de señalización. Es preferible que los anticuerpos sean humanizados, y más preferible que los anticuerpos sean humanos. Los anticuerpos de la presente solicitud pueden prepararse mediante cualquier variedad de métodos bien conocidos, como los que se describen aquí.
Otros ejemplos de moléculas candidatas, también denominadas aquí "moléculas prueba" o "compuestos prueba" para analizar su capacidad de modular la actividad de 4833427G06Rik incluye, pero no se limita a, carbohidratos, moléculas pequeñas (normalmente moléculas orgánicas o pép
tidos), proteínas, y moléculas de ácido nucleico (incluyendo fragmentos de oligonucleótido que consisten normalmente en 8 a 30 residuos de ácido nucleico). Los péptidos a analizar normalmente consistes en 5 a 25 residuos de aminoácido. También, las moléculas candidatas de ácido nucleico pueden ser secuencias de ácido nucleico antisentido, y/o pueden poseer actividad ribozima.
Los métodos de la solicitud pueden utilizarse para buscar moléculas antisentido que inhiben la expresión funcional de una o más moléculas de mRNA que codifican una o más proteínas que median una respuesta celular dependiente de 4833427G06Rik. Una molécula de ácido nucleico antisentido es una secuencia de DNA que es capaz hibridar con la molécula de mRNA diana a través de un emparejamiento de bases de Watson-Crick, e inhibir la traducción de la misma. Alternativamente, el DNA puede invertirse en relación a su orientación normal para la transcripción y expresar así un transcrito de RNA que es complementario a la molécula de mRNA diana (es decir, el transcrito de RNA de la molécula de ácido nucleico antisentido puede hibridar con la molécula de mRNA diana a través de un emparejamiento de tipo Watson-Crick). Una molécula de ácido nucleico antisentido puede construirse de diferentes maneras para que sea capaz de interferir con la expresión de una proteína diana. Los oligonucleótidos antisentido típicos para cribar preferiblemente poseen 30-40 nucleótidos de longitud. La molécula de ácido nucleico antisentido generalmente será sustancialmente idéntica (aunque en la orientación antisentido) al gen
diana. La identidad mínima será típicamente mayor que el 80%, pero una mayor identidad ejercerá una represión más efectiva de la expresión de las secuencias endógenas. Es preferible una identidad sustancialmente superior de más del 90%, aunque alrededor del 95% de identidad absoluta será lo más preferible.
Las moléculas candidato de ácido nucleico pueden poseer actividad ribozima. Así, los métodos de la solicitud pueden utilizarse para cribar moléculas de ribozima que inhiben la expresión funcional de una o más moléculas de mRNA que codifican una o más proteínas que median una respuesta celular dependiente de IL-1 eta. Las ribozimas son moléculas de RNA catalíticas que pueden escindir moléculas de ácido nucleico con una secuencia que es completamente o parcialmente homóloga a la secuencia de ribozima. Es posible diseñar transgenes de ribozima que codifican ribozimas de RNA que se emparejan específicamente con un RNA diana y escinden el esqueleto fosfodiéster en una localización específica, inactivando de esta manera funcionalmente el RNA diana. Para llevar a cabo esta escisión, no se altera la ribozima en sí, y así es capaz de reciclar y escindir a otras moléculas. La inclusión de secuencias de ribozima dentro de los RNA antisentido les confiere actividad escisora de RNA, aumentando así la actividad de las construcciones antisentido.
El diseño y el uso de ribozimas diana específicas de RNA se describe en Haseloff et al., Nature (1988) 334:585, y US 5.646.023. Tabler et al., Gen (1991) 108:175 han sim
plificado enormemente la construcción de RNA catalíticos al combinar las ventajas de los RNA antisentido y las tecnologías de ribozima en una única construcción. Las regiones de homología más pequeñas son necesarias para la catálisis de ribozima, por lo que esto puede promover la represión de diferentes miembros de una gran familia de genes si se conservan los sitios de escisión.
Entre los usos de los polinucleótidos de la invención está el uso de fragmentos como sondas o cebadores. Dichos fragmentos generalmente comprenden al menos alrededor de 17 nucleótidos contiguos de una secuencia de DNA. En otras realizaciones, un fragmento de DNA comprende al menos 30, o al menos 60, nucleótidos contiguos de una secuencia de DNA.
Debido a que los homólogos de 4833427G06Rik de otras especies de mamíferos están contemplados aquí, las sondas basadas en la secuencia del DNA de ratón de 4833427G06Rik puede utilizarse para cribar las bibliotecas de cDNA derivadas de otras especies de mamíferos, utilizando técnicas de hibridación entre especies convencionales. Utilizando el conocimiento del código genético en combinación con las secuencias de aminoácido establecidas anteriormente, pueden prepararse grupos de oligonucleótidos degenerados. Dichos oligonucleótidos son útiles como cebadores, por ejemplo, en las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), en las que los fragmentos de DNA se aíslan y amplifican. El DNA de la presente solicitud puede utilizarse para desarrollar tratamientos para cualquier trastorno mediado (directa o indirectamente) por cantidades defectuosas, o insuficientes de
los correspondientes genes de los polinucleótidos de la solicitud. La presente descripción de las secuencias de nucleótidos nativos permite la detección de genes defectivos, y la sustitución de los mismos con genes normales. Los genes defectivos pueden detectarse en ensayos diagnósticos in vitro, y mediante la comparación de una secuencia de nucleótidos nativa se describen aquí con los derivados de un gen de una persona sospechosa de ser portadora de una copia defectuosa de este gen.
Otros fragmentos útiles de los polinucleótidos de esta solicitud incluye los oligonucleótidos sentido o antisentido que comprenden una secuencia de polinucleótido de cadena sencilla (de RNA o DNA) capaz de unirse a una secuencia de mRNA diana (sentido) o DNA (antisentido). Los oligonucleótidos antisentido o sentido de acuerdo con la presente solicitud comprenden un fragmento de DNA (Id. de Sec. Nº:5). Dicho fragmento generalmente comprende al menos alrededor de 14 nucleótidos, preferiblemente entre alrededor de 14 y alrededor de 30 nucleótidos. La capacidad de derivar un oligonucleótido antisentido o sentido, en base a una secuencia de cDNA que codifica una proteína determinada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen, Cancer Res. (1988) 48:2659 y van der Krol et al., Biotechniques (1988) 6:958.
La unión de oligonucleótidos antisentido o sentido a secuencias polinucleótido diana resulta en la formación de dobletes que bloquean o inhiben la expresión de proteína mediante una de varias formas, que incluye aumento de la degradación del mRNA mediante RNAsaH, inhibición del corte
y empalme, terminación prematura de la transcripción o traducción, o mediante otros medios. Los oligonucleótidos antisentido pueden utilizarse de esta manera para bloquear la expresión de proteínas. LOS oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden además oligonucleótidos que poseen esqueletos modificados de azúcar-fosfodiéster (u otros enlaces de azúcar, como los descritos en W091/06629) y en los que dichos enlaces de azúcar son resistentes a las nucleasas endógenas. Dichos oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia que es capaz de unirse a secuencias de nucleótido diana.
Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o antisentido incluye aquellos oligonucleótidos que están covalentemente unidos a porciones orgánicas, como las descritas en WO 90/10448, y otras porciones que aumentan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia de polinucleótido diana, como una poli-(L-lisina). Aún más, los agentes intercalantes, como la elipticina, y los agentes alquilantes o complejos metálicos pueden unirse a oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido antisentido o sentido para la secuencia de nucleótido diana.
Los oligonucleótidos antisentido o sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de polinucleótido diana mediante cualquier método de transferencia génica, incluyendo, por ejemplo, lipofección, transfección
de DNA mediada por CaPO4, electroporación, o utilizando vectores de transferencia génica como el virus Epstein-Barr.
Los oligonucleótidos sentido o antisentido también pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de nucleótido diana mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión a ligando, tal como se describe en WO 91/04753. Las moléculas de unión a ligando adecuadas incluyen, pero no se limitan a, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a los receptores de superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de unión a ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de unión de la molécula a un ligando para unirse a su correspondiente molécula o receptor, o bloquear la entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula.
Alternativamente, un oligonucleótido sentido o antisentido puede introducirse en una célula que contiene la secuencia de polinucleótido diana mediante la formación de un complejo lípido oligonucleótido, tal como se describe en WO 90/10448. El complejo de oligonucleótido sentido o antisentido-lípido se disocia preferiblemente en la célula mediante una lipasa endógena.
Los polipéptidos de la presente solicitud se utilizan como un reactivo de purificación de proteínas. Los polipéptidos pueden unirse a un material de soporte sólido y utilizarse para purificar las parejas de unión a la proteína mediante cromatografía de afinidad. En realizaciones parti
culares, un polipéptido (en cualquier forma descrita aquí que es capaz de unirse a la pareja de unión) está unida a un soporte sólido mediante los procesos convencionales. Como ejemplo, las columnas de cromatografía que contienen grupos funcionales que reaccionarán con los grupos funcionales sobre las cadenas laterales de aminoácido de las proteínas están disponibles (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, N.J.). Como alternativa, un polipéptido/ proteína Fc (tal como se ha discutido anteriormente) se une a las columnas de cromatografía que contienen Proteína A o Proteína G a través de la interacción con la porción Fc.
El polipéptido también se utiliza para purificar o identificar células que expresan la pareja de unión en la superficie celular. Los polipéptidos se unen a una fase sólida como una matriz de cromatografía en columna o un sus- trato adecuado similar. Por ejemplo, las microesferas magnéticas pueden recubrirse con los polipéptidos y mantenerse en un recipiente de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de las mezclas celulares que contienen las células que expresan la pareja de unión se ponen en contacto con la fase sólida que posee los polipéptidos. Las células que expresan la pareja de unión en la superficie celular se unen a los polipéptidos fijados, y las células no unidas se eliminan mediante lavados. Alternativamente, los polipéptidos pueden conjugarse con una porción detectable, después se incuban con las células a analizar para ver si expresan las parejas de unión. Tras la incubación, el material marcado no unido se elimina y se determina la pre
sencia o ausencia de la porción detectable en las células.
En otra alternativa, las mezclas de las células que se sospecha que contienen células que expresan la pareja de unión se incuban con polipéptidos biotinilados. Los periodos de incubación son normalmente al menos de una hora de duración para asegurar una unión suficiente. La mezcla resultante se pasa entonces a través de una columna empaquetada con cuentas recubiertas de avidina, por lo que la alta afinidad de la biotina por la avidina proporciona la unión de las células deseadas por las cuentas. Los procedimientos para utilizar las cuentas recubiertas de avidina son conocidas (véase Berenson, et al. J célula Biochem. (1986) 10D:239). Los lavados para eliminar el material no unido, y la liberación de las células unidas, se realiza utilizando los métodos convencionales.
Los polipéptidos también se utilizan para medir la actividad biológica de la proteína de la pareja de unión en términos de su afinidad de unión. Los polipéptidos así pueden utilizarse por los que realizan estudios de "control de calidad", por ejemplo, para monitorizar la vida útil y la estabilidad de la proteína bajo diferentes condiciones. Por ejemplo, los polipéptidos pueden utilizarse en un estudio de afinidad de unión para medir la actividad biológica de una proteína de pareja de unión que ha sido almacenada a diferentes temperaturas, o producida en diferentes tipos de células. Las proteínas también pueden utilizarse para determinar si la actividad biológica se retiene tras la modificación de una proteína de pareja de unión (por ejemplo,
modificación química, truncamientos, mutación, etc.). La afinidad de unión de la proteína modificada de la pareja de unión se compara con la de una proteína no modificada de pareja de unión para detectar cualquier impacto adverso de las modificaciones en la actividad biológica de la pareja de unión. La actividad biológica de una proteína de pareja de unión así por ejemplo, se puede determinar antes de ser utilizada en un estudio de investigación.
Los agentes detectables (diagnóstico) y terapéuticos que pueden unirse a un polipéptido incluye, pero no se limita a, toxinas, otros agentes citotóxicos, fármacos, radionúcleos, cromóforos, enzimas que catalizan una reacción calorímétrica o fluorométrica, y similares, con el agente particular a escoger de acuerdo con la aplicación deseada. Entre las toxinas está la ricina, abrina, toxina difteria, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, proteínas inactiva- doras del ribosoma, micotoxinas como tricotecenas, y derivados y fragmentos (por ejemplo, cadenas sencillas) de los mismos. Los radionúcleos adecuados para su uso diagnóstico incluye, pero no se limita a, 123I, 131I, 99mTc, 111In, y 76Br. Ejemplos de radionúcleos adecuados para su uso terapéutico son 131I, 211At, 77Br, 186Re, 188Re, 212Pb, 212Bi, 109Pd, 64Cu, y 67Cu.
Tales agentes pueden unirse al polipéptido mediante cualquier procedimiento adecuado convencional. El polipéptido comprende grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos que pueden hacerse reaccionar con grupos funcionales en un agente deseado para formar por ejemplo
enlaces covalentes. Alternativamente, la proteína o agente puede derivarse para generar o unir un grupo funcional re- activo deseado. La derivación puede implicar la unión de un reactivo de acoplamiento bifuncional disponible para unir varias moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.). Se conocen varias técnicas para marcar radiactivamente a proteínas. Los radionúcleos de metales pueden unirse a polipéptidos utilizando por ejemplo un agente quelante bifuncional adecuado.
Los conjugados que comprenden los polipéptidos y un agente diagnóstico o terapéutico adecuado (preferiblemente covalentemente unido) se preparan así. Los conjugados se administran o se utilizan de otra manera en una cantidad apropiada para la aplicación particular.
Los polipéptidos de la solicitud pueden utilizarse para desarrollar tratamientos para cualquier trastorno mediado (directa o indirectamente) por cantidades defectuosas, o insuficientes de polipéptidos. Además, los polipéptidos pueden utilizarse para desarrollar tratamientos para cualquier trastorno que resulte (directa o indirectamente) por el exceso de polipéptido. Los polipéptidos de la presente solicitud pueden administrarse a un mamífero afectado por estos trastornos.
Los polipéptidos pueden emplearse también en la inhibición de la actividad biológica de la pareja de unión, en procedimientos in vitro o in vivo. Por ejemplo, puede utilizarse un polipéptido 4833427G06Rik purificado para inhibir la unión de 4833427G06Rik endógeno a su receptor ce
lular.
Los polipéptidos de la solicitud pueden administrarse para tratar a un mamífero de un trastorno mediado por una pareja de unión. Dichos trastornos mediados por una pareja de unión incluye las condiciones provocadas (directa o indirectamente) o agudizadas por la pareja de unión.
Las composiciones de la presente solicitud pueden contener un polipéptido en cualquier forma descrita aquí, como proteínas nativas, variantes, derivados, oligómeros, y fragmentos biológicamente activos. En realizaciones particulares, la composición comprenden un polipéptido soluble o un oligómero que comprende polipéptidos solubles de la solicitud.
Las composiciones que comprenden una cantidad efectiva de un polipéptido de la presente solicitud, en combinación con otros componentes como un diluyente fisiológicamente aceptable, transportador, o excipiente, se proporciona aquí. Los polipéptidos pueden formularse de acuerdo con los métodos conocidos utilizados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Pueden combinarse en una mezcla, como el material activo solo o con otros materiales activos conocidos adecuados para una determinada indicación, con diluyentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, solución salina, Tris-HCl, acetato, y soluciones tamponadas con fosfato), conservantes (por ejemplo, timerosal, bencil alcohol, parabenos), emulsificantes, solubilizantes, adyuvantes y/o transportadores. Las formulaciones adecuadas para las composiciones farmacéuticas incluye aquellas descritas
en "Remington’s Pharmaceutical Sciences", 16ª ed. 1980, Mack Publishing Company, Easton, PA.
Además, dichas composiciones pueden formar complejos con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o incorporarse en compuestos poliméricos como el ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, dextrano, y similares, o incorporarse en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, fantasmas de eritrocitos o esferoblastos. Dichas composiciones influirán en el estado físico, solubilidad, estabilidad, tasa de liberación in vivo y tasa de eliminación in vivo, y se escogen de acuerdo con la aplicación deseada.
Las composiciones de la solicitud pueden administrarse de cualquier forma adecuada, por ejemplo, por vía tópica, parenteral, o por inhalación. El término "parenteral" incluye inyección, por ejemplo, mediante vía subcutánea, intravenosa, o intramuscular, también incluye la administración localizada, por ejemplo, en el lugar de la enfermedad
o daño. Los expertos en la materia reconocen que son adecuados otros tipos de administración localizada (por ejemplo, intraarticular, intracapsular, intracarpal, intracelial, intracerebroventricular, intrasinovial, intraespinal, intraligamentosa, intrameníngea, intraocular, epidural, transepitelial, y/o administración mediante una o más de estas rutas en un lugar cerca o adyacente a un lugar de la enfermedad o daño) para utilizar en la administración de las composiciones de la presente solicitud. La liberación
sostenida a partir de implantes también se contempla.
Un experto en la materia reconocerá que las dosificaciones adecuados variarán, dependiendo de dichos factores como la naturaleza del trastorno a tratar, el peso del paciente, edad, y condición general, y la ruta de administración. Las dosis preliminares pueden determinarse de acuerdo con ensayos en animales, y el escalado de las dosis para la administración en humanos se realiza de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica.
Las composiciones que comprenden polinucleótidos en las formulaciones fisiológicamente aceptables también se contemplan. El DNA pede formularse por ejemplo para inyección. Además, puesto que los expertos en la materia saben que las composiciones de ácido nucleico (incluyendo DNA) son captadas por las células y resultan en la expresión de la proteína en o cerca del área en la que la composición de ácido nucleico se ha administrado, las composiciones de ácido nucleico de la invención serán útiles para la administración localizada de los polipéptidos codificados en ellas.
Otro uso del polipéptido de la presente solicitud es una herramienta de investigación para estudiar los efectos biológicos que resultan de las interacciones de 4833427G06Rik con su pareja de unión, o de inhibir estas interacciones, sobre diferentes tipos celulares. Los polipéptidos también pueden utilizarse en ensayos in vitro para detectar 4833427G06Rik, la pareja de unión o la interacción de los mismos. Los polipéptidos de la invención también serán útiles en elucidar las rutas de señalización de los
miembros de la familia p53, y en identificar moléculas que modulan varios aspectos de dichas rutas de señalización. Los moduladores identificador mediante estudios que utilizan los polipéptidos de la invención poseen utilidad en el tratamiento o mejora de una amplia variedad de enfermedades y síndromes en los que juega un papel la regulación del ciclo celular o la apoptosis.
Se proporcionan en el presente documento los anticuerpos que son inmunoreactivos a los polipéptidos de la solicitud. Dichos anticuerpos se unen específicamente a los polipéptidos mediante los sitios de unión a antígeno del anticuerpo (en oposición a la unión no específica). Así, los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión, etc., según lo establecido anteriormente pueden utilizarse como "inmunógenos" para producir anticuerpos inmunoreactivos a éstos. Más específicamente, los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión, etc. contienen determinantes antigénicos o epítopos para obtener la formación de anticuerpos.
Estos determinantes antigénicos o epítopos pueden ser lineales o conformacionales (discontinuos). Los epítopos lineales están compuestos de una sección única de aminoácidos del polipéptido, mientras que los epítopos conformacionales o discontinuos están compuestos de secciones de aminoácidos de diferentes regiones de la cadena de polipéptido que quedan situados con gran proximidad tras el plegamiento de la proteína (C. A. Janeway et al., "Immuno Biology" (1996) 3:9 (Garland Publishing Inc., 2ª ed.)). Debido a que
las proteínas plegadas poseen superficies complejas, el número de epítopos disponibles es bastante numeroso; no obstante, debido a la conformación de la proteína y los impedimentos estéricos, el número de anticuerpos que actualmente se unen a los epítopos es inferior al número de epítopos disponibles (C. A. Janeway et al., "Immuno Biology" 2:14 (Garland Publishing Inc., 2ª ed. 1996)). Los epítopos pueden identificarse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la materia.
Así, un aspecto de la presente solicitud está relacionado con los epítopos antigénicos de los polipéptidos de la solicitud. Tales epítopos son útiles para descubrir anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, tal como se describe en más detalle más adelante. Adicionalmente, los epítopos de los polipéptidos de la solicitud pueden utilizarse como reactivos de investigación, en ensayos, y para purificar la unión específica de anticuerpos a partir de sustancias como el suero policlonal o los sobrenadantes de los hibridomas cultivados. Tales epítopos o variantes de los mismos pueden producirse utilizando técnicas bien conocidas en la materia como la síntesis en fase sólida, escisión química o enzimática de un polipéptido, o utilizando tecnología de DNA recombinante.
En cuanto a los anticuerpos que pueden obtenerse mediante los epítopos de los polipéptidos de la solicitud, si los epítopos se han aislado o son parte de los polipéptidos, ambos anticuerpos policlonal y monoclonal pueden prepararse mediante técnicas convencionales. Véase, por ejem
plo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biologic Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).
Las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos de la solicitud también se contemplan aquí. Tales hibridomas pueden producirse e identificarse mediante técnicas convencionales. Un método para producir dicha línea celular de hibridoma comprende la inmunización de un animal con un polipéptido; recogiendo células del bazo del animal inmunizado; fusionando dichas células del bazo en una línea celular de mieloma, generando así células de hibridoma; e identificar una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une al polipéptido. Los anticuerpos monoclonales pueden recuperarse mediante técnicas convencionales.
Los anticuerpos monoclonales de la presente solicitud incluye anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Dichos anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante técnicas conocidas y ofrecen la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo murino (o tan sólo el sitio de unión a antígeno de los mismos) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Alternati
vamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de la región variable (que carece del sitio de unión a antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procesos para la producción de anticuerpos quiméricos y otros anticuerpos monoclonales modificados incluye los descritos en Riechmann et al., Nature (1988) 332:323, Liu et al. (Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:3439, Larrick et al., Bio/Technology (1989) 7:934, y Winter y Harris (TIPS 14:139, May, 1993). Los procesos para generar anticuerpos transgénicos puede encontrarse en GB 2.272.440, US 5.569.825 y US 5.545.806 y patentes relacionadas que reivindican la prioridad de la misma.
Los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, que pueden producirse mediante técnicas convencionales, también están abarcados por la presente solicitud. Ejemplos de dichos fragmentos incluye, pero no se limita a, fragmentos Fab y F(ab’)2. También se proporcionan fragmentos de anticuerpo y derivados producidos mediante técnicas de ingeniería genética.
En una realización, los anticuerpos son específicos para los polipéptidos de la presente solicitud y no reaccionan de forma cruzada con otras proteínas. Los procesos de cribado mediante los que se identifican los anticuerpos son bien conocidos, y pueden implicar, por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad.
Los anticuerpos de la solicitud pueden utilizarse en
ensayos para detectar la presencia de los polipéptidos o
fragmentos, tanto in vitro como in vivo. Los anticuerpos también pueden utilizarse en la purificación de polipéptidos o fragmentos de la solicitud mediante cromatografía de inmunoafinidad.
Aquellos anticuerpos que adicionalmente pueden bloquear la unión de los polipéptidos de la solicitud a la pareja de unión pueden utilizarse para inhibir una actividad biológica que resulta de dicha unión. Dichos anticuerpos de bloqueo pueden identificarse utilizando cualquier proceso de ensayo adecuado, como el análisis de anticuerpos por la capacidad de inhibir la unión de 4833427G06Rik a ciertas células que expresan los receptores de 4833427G06Rik. Alternativamente, los anticuerpos de bloqueo pueden identificarse en ensayos por su capacidad de inhibir un efecto biológico que resulta de los polipéptidos de la invención que se unen a sus parejas de unión para identificar células. Los anticuerpos pueden analizarse por su capacidad de inhibir 4833427G06Rik, o por ejemplo, la lisis celular mediada por la pareja de unión.
Dichos anticuerpos pueden utilizarse en un procedimiento in vitro, o administrarse in vivo para inhibir una actividad biológica mediada por la entidad que generó el anticuerpo. Los trastornos provocados o agudizados (directa
o indirectamente) por la interacción de los polipéptidos de la solicitud con la pareja de unión, pueden tratarse de esta manera. Un método terapéutico involucra la administración in vivo de un anticuerpo de bloqueo a un mamífero en una cantidad efectiva para inhibir la actividad biológica
mediada por la pareja de unión. Los anticuerpos monoclonales son preferibles generalmente para su uso en dichos métodos terapéuticos. En una realización, se emplea un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno.
Los anticuerpos pueden analizarse por sus propiedades agonistas (es decir, por imitación del ligando). Tales anticuerpos, tras la unión al receptor de superficie celular, induce los efectos biológicos (por ejemplo, transducción de señales biológicas) similares a los efectos biológicos inducidos cuando la IL-1 de une a los receptores de superficie celular de IL-1. Los anticuerpos agonistas pueden utilizarse para activar las células vasculares endoteliales y linfocitos, inducir destrucción de tejido local y fiebre (Janeway et al., 1996, supra), estimular a los macrófagos y a las células vasculares endoteliales para producir IL-6, y regular positivamente las moléculas en la superficie de las células vasculares endoteliales.
Las composiciones que comprenden un anticuerpo que está dirigido contra polipéptidos de la solicitud, y un diluyente fisiológicamente aceptable, excipiente, o transportador, se proporcionan en este documento. Los componentes adecuados de dichas composiciones son como se ha descrito anteriormente para las composiciones que contienen polipéptidos de la solicitud.
También se proporcionan aquí los conjugados que comprenden un agente detectable (por ejemplo, para diagnóstico) o agente terapéutico, unido al anticuerpo. Ejemplos de tales agentes se han presentado anteriormente. Los conjuga
dos se utilizan en procesos in vitro o in vivo.
La presente solicitud también abarca a animales transgénicos no humanos con indicador de actividad génica alterado. Los clones recombinantes derivados de las secuencias genómicas, por ejemplo, que contienen intrones, serán útiles para los estudios de transgénicos y de knock-out, incluyendo células transgénicas, organismos, y animales knock-out, y para terapia génica. (Véase, por ejemplo, Goodnow (1992) "Animales transgénicos" en Roitt (ed.) Enciclopedia de Inmunología, Academic Press, San Diego, Calif., pp. 1502-1504; Travis, Science (1992) 254:707-10; Capecchi, Science (1989) 244:1288-92; Robertson (ed.) (1987) "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach", IRL Press, Oxford; Rosenberg, J. Clinical Oncology (1992) 10:180-99; Hogan, et al. (eds.) (1994) "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, NY; Wei, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. (1997) 37:119-41; y Rajewsky, et al., J. Clin. Inves. (1996) 98:551-S53.)
Ejemplos de estas técnicas incluye: 1) Inserción de genes marcadores operativamente unidos a las regiones pro- motoras de un gen indicador mediante microinyección, infección retroviral, u otros medios conocidos por los expertos en la materia, en embriones fertilizados de forma adecuada para producir un animal transgénico no humano (véase, por ejemplo, Hogan, supra); y 2) recombinación homóloga (véase, por ejemplo, Capecchi, supra; y Zimmer y Gruss, Nature (1989) 338:150-53) en células madre embrionarias permitien
do la introducción de versiones mutantes o normales, humanas o animales de genes en la línea germinal de un animal. Los animales resultantes knock-out pueden expresar el gen marcador en respuesta a un estímulo que de otra manera induciría la transcripción del gen indicador, por ejemplo, la administración de un compuesto genotóxico.
La técnica de la recombinación homóloga ya se conoce en la materia. Introduce un gen sustituto del gen nativo en el genoma animal, y así es útil para producir un animal que no puede expresar el gen original nativo pero expresa, por ejemplo, un receptor mutante insertado, o una forma alternativa del receptor o ningún receptor. En la presente solicitud, esta técnica resulta en un animal que produce un producto de gen marcador en respuesta a estímulos con un compuesto genotóxico, en lugar de los productos génicos del indicador nativo.
Con respecto a la creación de animales transgénicos no humanos, la microinyección añade genes al genoma, pero no los elimina, y así es útil para producir un animal que expresa sus proteínas propias y proteínas añadidas. Un medio disponible para producir un animal transgénico no humano, por ejemplo un ratón, es de la siguiente manera: Se aparea una hembra de ratón, y los óvulos fertilizados resultantes se separan de los oviductos. Los óvulos se guardan en un medio apropiado como medio M2 (véase, por ejemplo, Hogan, supra). El DNA o cDNA que codifican una región reguladora de un gen indicador o promotor unido de forma operativa a un gen marcador se purifica de un vector apropiado mediante
los métodos conocidos en la materia. Pueden fusionarse promotores adicionales inducibles con la región codificante del DNA para proporcionar un método experimental para regular la expresión del transgén. Alternativamente, o adicionalmente, los elementos reguladores adicionales específicos de tejido pueden fusionarse con la región codificante para permitir la expresión específica de tejido del transgén. El DNA, en una solución tamponada de forma apropiada, se inserta en una aguja de microinyección, y el óvulo a inyectar se introduce en un portaobjetos. La aguja se inserta en el pronúcleo del óvulo, y se inyecta la solución de DNA. El óvulo inyectado se transfiere entonces en el oviducto de un ratón pseudogestante (un ratón estimulado mediante las hormonas adecuadas para mantener el embarazo, pero que no está de hecho en gestación), donde va a parar al útero, se implanta, y se lleva a término. Tal como se ha indicado anteriormente, la microinyección no es sólo un método para insertar DNA en el óvulo, y se utiliza aquí sólo a modo de ejemplo. Los animales transgénicos no humanos de la solicitud pueden utilizarse para cribar o analizar compuestos por su genotoxicidad, con la ventaja añadida que se puede examinar simultáneamente el efecto de cualquier metabolito del compuesto que se presenten.
Los métodos y reactivos de la invención son útiles para determinar el potencial de un compuesto para provocar genotoxicdad tras su administración a un animal. Los métodos de la invención pueden utilizarse, por ejemplo, utilizando la tecnología de microchip disponible en la actuali
dad, o mediante la inserción de genes marcadores unidos de forma operativa a las secuencias promotoras heterólogas o endógenas que corresponden a o que derivan de los genes indicadores. Al administrar compuestos prueba a células prueba in vitro, se puede eliminar los fármacos candidatos que presentan una genotoxicidad inaceptable sin necesitar ensayos caros y largos in vivo.
Habiendo descrito la invención de forma general, se entenderá mejor la misma haciendo referencia a ejemplos específicos, que se incluyen aquí a modo de ilustración y que no pretende limitar a menos que se especifique de otra manera, junto con la siguiente figura:
Figuras:
Figura 1: muestra un diagrama de la regulación negativa mediada por el siRNA de mRNA Dog. La regulación negativa mediada por el siRNA de mRNA Dog permite a las células miogénicas diferenciarse incluso después de recibir daño en el DNA. Las células C2C12 se transfectaron con 20 nM del siRNA específico de Dog1 indicado (D1-1; D1-2), siRNA control (C)
o sólo lípido (M) durante 28 horas. Se trataron entonces con MMS 75 µM o vehículo durante 24 horas, antes de lavar y cultivar en medio de diferenciación durante 72 horas.
A) Veintiocho horas tras la transfección, los siRNA específicos de Dog1 disminuyeron el mRNA de Dog1 en un 8096% en células C2C12. Los siRNA control no disminuyeron de forma significativa el nivel de mRNA de Dog1.
B) Las células C2C12 transfectadas con siRNA control o
vector control no se diferenciaron en miotubos tras la ex
posición al mutágeno. No obstante, las células C2C12 tratadas con mutágenos que fueron transfectadas con siRNA específico de Dog1 se diferenciaron en miotubos.
EJEMPLOS
Las siguientes preparaciones y ejemplos se proporcionan para permitir a los expertos en la materia entender más claramente y practicar la presente invención. No deben considerarse como limitantes del alcance de la invención, sino como ejemplos ilustrativos y representativos de la misma.
Ejemplo 1: Ensayo fenotípico
Formulación de fármacos. Todos los compuestos se compraron a Sigma-Aldrich Fine Chemicals. Los fármacos se disolvieron en DMSO, excepto el pireno que se disolvió en MeOH. La concentración de cada fármaco utilizado para el ensayo de genotoxicidad se basó en la concentración conocida para inducir la formación de micronúcleos in vitro. Cuando no se conoce esta concentración, se utiliza un amplio rango de concentraciones de fármaco que va de 1 nM a 5 mM. Para ambos agentes genotóxicos y no genotóxicos, la concentración más alta analizada se determinó mediante toxicidad celular o solubilidad del compuesto (Tabla 1).
Ensayo de genotoxicidad. Las células C2C12 (ATCC) se cultivaron en DMEM con FBS 20%, piruvato sódico, glutamina pen-strep, manteniendo el estado de subconfluencia. El ensayo de diferenciación se realizó de acuerdo con el método descrito por P.L. Puri et al., Nature Gen (2002) 32:585-93, en medio e crecimiento que contiene además 1% de DMSO o compuesto en 1% de DMSO final (véase Tabla I para los com
puestos y concentraciones). Las células se incubaron durante 24 horas, se lavaron con PBS y se colocaron en medio de diferenciación (DMEM, suero de caballo 2%, piruvato sódico y glutamina pen-strep), sin fármaco o vehículo. Las células se analizaron visualmente por su diferenciación a las 48 y 72 horas: las células diferenciadas forman miotubos, mientras que las células bloqueadas o retrasadas mantienen una monocapa con muy pocos miotubos. Si el bloqueo es extremo, las células empiezan a morir tras 3 días en medio de diferenciación (por ejemplo, tratamiento con etoposido o cisplatino). Los fármacos se analizaron por su citotoxicidad evaluando el contaje de células a las 24 horas de exposición con el compuesto, en relación con el vehículo.
Tabla I
Compuesto
ref. ChemAbs Rango de dosis (imagen1 g/ml) Dosis efectiva inferior (imagen1 g/ml)
DMSO
67-68-5 NA NA
Famotidina
76824-35-6 0,5-316(s) NA
Pilocarpina HCl
54-71-7 1,6-100(s) NA
Cefoperazona (sal Na)
62893-20-3 0,2-200(s) NA
Clozapina
5786-21-0 0,1-250(s) NA
Clofibrato
637-07-0 0,5-180(t) NA
Bencilacetato
140-11-4 0,5-50(t) NA
Metilurea
598-50-5 0,4-40(t) NA
diéster de ácido ftálico
117-87-7 0,1-100(s) NA
Metanol
67-56-1 1-12,206(t) NA
Compuesto
ref. ChemAbs Rango de dosis (imagen1 g/ml) Dosis efectiva inferior (imagen1 g/ml)
Propafenona HCl
54063-53-5 0,1-100(t) NA
Mesalamina
89-57-6 0,1-74(s) NA
Maleato de timolol
26921-17-5 0,5-100(s) NA
Tetraciclina HCl
64-75-5 0,1-50(s) NA
Levamisol HCl
16595-80-5 0,5-250(s) NA
Terazosina HCl
63590-64-7 0,5-500(t) NA
Prostaglandina I2 (sal de Na)
61849-14-7 0,5-55(t) NA
Tricloroetileno
79-01-6 0,7-254(s) NA
Uretano
51-79-6 0,03-35(t) NA
Pireno
129-00-0 0,1-55(t) NA
Metanosulfonato metil éster (MMS)
62-27-3 0,0020,016(t) 0,002
Metanosulfonato etil éster (EMS)
62-50-0 100-800(t) 100
5-fluorouracilo
51-21-8 0,00080,0032(t) 0,0008
2-nitrofluoreno
602-57-8 1,5-100(s) 5,2
4-nitroquinolina N-óxido
56-57-5 0,05-0,8(t) 0,05
1-metil-3-nitronitrosoguanidina (MNNG)
70-25-7 0,1-0,8(t) 0,1
Dietilstilbestrol (DES)
56-53-1 1,8-7,4(t) 1,8
sulfato de Bleomi
9041-93-4 1-8(t) 1
Compuesto
ref. ChemAbs Rango de dosis (imagen1 g/ml) Dosis efectiva inferior (imagen1 g/ml)
cina
Mitomicina C
50-07-7 0,15-0,6(t) 0,15
Actinomicina D
50-76-0 0,000750,003(t) 0,00075
Doxorubicina HCl
25316-40-9 0,005-0,02(t) 0,005
Etoposido
33419-42-0 0,25-2(t) 0,5
Cisplatino
15663-27-1 0,15-0,8(t) 0,15
sulfato de Vincristina
206878-2 0,0020,012(t) 0,002
sulfato de Vinblastina
143-67-9 0,00060,003(t) 0,0006
Amsacrina HCl
54301-15-4 0,0010,004(t) 0,001
Griseofulvina
126-07-8 2-79(t) 14
Paclitaxel
33069-62-4 0,002-1,4(t) 0,002
(s)
rango limitado por la solubilidad del compuesto
(t)
rango limitado por la toxicidad del compuesto
Los compuestos genotóxicos y no genotóxicos se clasifican de acuerdo con los resultados publicados utilizando el ensayo de formación de micronúcleos in vitro (W. von der Hude et al., Mut Res (2000) 468:137-63) o el ensayo de aberración cromosómica (S. Kalweit et al., Mut Res (1999) 439:183-90; B. Miller et al., Mut Res (1998) 410:81-116; B. Miller et al., Mut Res (1997) 392:45-59). Los compuestos no genotóxicos analizados cubren un amplio rango de estructuras químicas y usos terapéuticos, incluyendo un agente an
tipsicótico (clozapina), un agente antihiperlipoproteinémico (clofibrato), y un agente anestésico (uretano) (Tabla 1). Los 19 agentes no genotóxicos, aún cuando se analizan en un amplio rango de concentraciones, fracasaron en el bloqueo de la diferenciación miogénica. Por contra, los 18 fármacos genotóxicos bloquearon la diferenciación de células C2C12 en miotubos en todas las concentraciones analizadas. Estos compuestos bloquearon la diferenciación en concentraciones que no provocan una citotoxicidad celular detectable. Los compuestos genotóxicos actúan a través de una serie de mecanismos diferentes, que incluyen la inducción de roturas en el DNA de doble cadena (sulfato de bleomicina y etoposido), alquilación de DNA (MMS y EMS), formación de aductos (cisplatino y DES), intercalación de DNA (5-FU) y inhibidores de la formación del huso mitótico (Vincristina, Vinblastina y Paclitaxel). Los resultados de este panel de compuestos demuestra que el sistema de diferenciación de miocitos puede utilizarse para identificar compuestos geno- tóxicos.
Ejemplo 2: Ensayo genómico
Análisis de la expresión génica. Tras el tratamiento con vehículo (DMSO) o compuesto (MMS – 0,008 µg/ml; MNNG -4 µg/ml; cisplatino -0.6 µg/ml; etoposido -0.5 µg/ml; bleomicina - 0.5 µg/ml; sulfato de vincristina - 0.6 µg/ml) durante 24 horas, las células C2C12 se lavaron para eliminar el fármaco, se cambiaron a un medio de diferenciación para inducir la diferenciación, y se recogieron a las 6, 18
o 24 horas tras la inducción. Se generaron tres réplicas
independientes para cada fármaco y punto temporal. El procesamiento de muestras se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos descritos en el Manual técnico de análisis de la expresión de Affymetrix. En breve, el RNA total se aísla de las células mediante el método de extracción tiocianato de ácido de guanidinio -fenol-cloroformo (Trizol®, Invitrogen, Carlsbad, CA). El RNA poli(A+) purificado dos veces se aisló y se transcribió de forma reversa utilizando un cebador oligo(dT) acoplado al promotor T7, seguido de la transcripción in vitro. Las muestras marcadas se aplicaron al equipo de Affymetrix Murine Genome MOE430 y se hibridaron durante la noche a 45°C/60 rpm, se lavaron utilizando una estación FS450 Fluidics, y se escanearon en un escáner GS3000. Los archivos de imagen resultantes se analizaron utilizando el programa de Affymetrix (Microarray Analysis Suite versión 5.0).
Para medir el efecto del tratamiento del fármaco sobre la expresión génica celular, los datos de las réplicas obtenidos de cada fármaco y puntos temporales se compararon con las réplicas de los controles emparejados con vehículo utilizando el test t de Student. Los niveles de expresión génica se transformaron logarítmicamente antes de aplicarse al test t de Student. El cambio del nivel medio de expresión entre las células control y las tratadas con fármaco también se calculó. Un cambio en la expresión génica tras el tratamiento con fármaco se consideró significativo si se cumplieron todas las siguientes condiciones para al menos un gen y un punto temporal: primero, el gen debe expresarse
tanto en células tratadas con fármaco como células tratadas con vehículo. Un gen debe considerarse expresado si el programa de Affymetrix determina que el gen estaba "presente" en dos de las tres réplicas. Esto asegura que se identifican los verdaderos cambios en la expresión, y pueden distinguirse de la variabilidad de fondo. Segundo, el cambio de expresión calculado para cada uno de los cinco fármacos analizados fue de al menos 2 veces, y el valor p calculado para el cambio de expresión utilizando el test t de Student fue inferior a 0,01.
Para validar este sistema experimental, y para examinar el mecanismo mediante el que estos agentes genotóxicos inhiben la diferenciación miogénica, se utilizaron microchips de oligonucleótido para identificar los genes cuya expresión está alterada en respuesta al tratamiento con fármacos genotóxicos. Se sabe que cinco de los fármacos descritos provocan daño en el DNA celular. El sulfato de vincristina provoca genotoxicidad mediante un mecanismo indirecto: inhibe la formación del huso mitótico al bloquear la polimerización de la tubulina. Consistente con tener un mecanismo de acción diferente, la vincristina induce un patrón distinto de cambios en la expresión génica en relación a los otros cinco fármacos analizados. Los alcaloides vinca inducen distintamente diferentes cambios en la expresión génica que los que realizan el resto de fármacos analizados (véase también U. Scherf et al., Nature Gen (2000) 24:23644). Debido a esto, se analizaron los cambios en la expresión génica que se inducen normalmente tras la exposición a
los cinco fármacos genotóxicos que actúan de forma directa. El análisis de los datos de la expresión génica reveló que los 86 genes poseen un cambio significativo en el nivel de expresión de mRNA tras el tratamiento con los cinco fármacos genotóxicos que actúan de forma directa (no se utilizaron los resultados de la vincristina para los genes seleccionados) (véase Tabla 2). Cada gen seleccionado presentó al menos un cambio de 1,5 veces en los niveles de expresión tras el tratamiento con cada uno de los cinco fármacos, y el valor p calculado para cada cambio la expresión inducido por el fármaco fue inferior a 0,01. La expresión de 28 genes se reguló positivamente tras el tratamiento con el fármaco, mientras que los otros 58 genes estaban regulados negativamente.
Tabla 2: Cambio en la expresión en respuesta a compuestos genotóxicos
Símbolo
Descripción BLEO CIS ETOP MMS MNNG VINC
Prelp
Repetición rica en leucina, extremo rico en prolinaarginina 0,23 0,12 0,34 0,19 0,11 0,58
Sesn2
Sestrina 2 4,20 3,80 4,20 5,30 5,80 2,38
4833427G06 Rik
cDNA RIKEN 5,40 3,70 11,30 3,70 4,00 0,98
Dda3pending
Presentación diferencial activado por p53 5,00 3,30 4,50 3,70 3,80 2,00
Símbolo
Descripción BLEO CIS ETOP MMS MNNG VINC
Usp30
Proteasa 30 específica de ubiquitina 2,50 2,70 3,70 2,60 2,00
0610013D04 Rik
cDNA RIKEN 2,80 2,60 2,60 2,50 2,00
Slc19a2
Familia 19 de transportadores de solutos (transportador de tiamina), miembro 2 3,10 2,30 5,50 2,70 3,30 1,40
Trp53inp1
Proteína relacionada con la transformación 53, proteína nuclear inducible 1 3,30 2,30 5,30 2,90 3,00 1,60
D4Ertd421e
Segmento de DNA, Cr 4, ERATO Doi 421, expresado 0,24 0,34 0,44 0,40 0,64
Shcbp1
Dominio Shc 1 de unión a proteína SH2 0,28 0,38 0,25 0,37 0,44 0,52
Mki67
Antígeno identificado mediante el MAb Ki67 0,27 0,44 0,29 0,31 0,34 0,43
Phex
Endopeptidasa neutral reguladora de fosfato (cromosoma 2,40 2,50 2,20 2,20 0,67
Símbolo
Descripción BLEO CIS ETOP MMS MNNG VINC
X)
Tk1
Quinasa de timidina 1 0,24 0,32 0,17 0,46 0,46 0,62
Mmhead
Clon de cDNA de cabeza de embrión de 15 días de Mus musculus 2,50 2,10 3,00 2,50 0,95
Osbpl6
Proteína 6 similar a la proteína de unión a oxisterol 2,10 2,10 2,20 2,10 1,10
Mphosph1
Fosfoproteína de fase M 0,23 0,50 0,47 0,27 0,38 0,37
Ephx1
Hidrolasa de epóxido 1 (hidrolasa xenobiótica microsomal) 2,70 2,00 4,20 2,10 2,10 1,10
Top2a
Topoisomerasa (DNA) II alfa 0,29 0,50 0,39 0,37 0,47 0,52
Ccng1
Ciclina G1 2,60 2,00 3,20 2,40 3,10 1,80
Plf
Proliferina 2,40 2,30 2,60 2,00 1,10
Np95
Proteína nuclear 95 0,31 0,47 0,41 0,51 0,71
Rad51ap1
Proteína 1 asociada a RAD51 0,32 0,50 0,36 0,45 0,52 0,59
Nos3
Sintasa 3 de óxido nítrico, célula endotelial 2,60 2,00 5,20 1,90 2,10 1,30
Símbolo
Descripción BLEO CIS ETOP MMS MNNG VINC
2610005B21 Rik
cDNA RIKEN 0,25 0,39 0,53 0,47 0,81
Brca1
Cáncer de mama 1 0,37 0,50 0,53 0,47 0,53 0,51
Stk18
Quinasa de serina/ treonina 18 0,45 0,52 0,45 0,49 0,53 0,63
Calmbp1
Proteína 1 de unión a calmodulina 0,28 0,54 0,43 0,30 0,41 0,40
Lek1
Proteína 1 de la familia leucina, ácido glutámico, lisina 0,30 0,54 0,46 0,36 0,36 0,45
Smc211
Proteína 1 similar a SMC2 de mantenimiento estructural de cromosomas 2 0,37 0,48 0,31 0,49 0,54 0,75
E2f7
Factor de trascripción E2F 7 0,34 0,35 0,24 0,55 0,53 0,63
Hmmr
Receptor de motilidad mediado por hialuronano (RHAMM) 0,26 0,55 0,53 0,36 0,47 0,52
Nusap1
Proteína 1 nucleolar y asociada al huso 0,32 0,51 0,40 0,48 0,55 0,56
Fbxo5
Proteína 31 de fbox 0,40 0,55 0,32 0,42 0,51 0,54
Símbolo
Descripción BLEO CIS ETOP MMS MNNG VINC
Slc19a2
Familia 19 transportadora de solutos (transportador de tiamina), miembro 2 2,50 1,80 4,30 2,30 2,20 1,10
9030617003 Rik
cDNA RIKEN 2,20 1,80 3,80 2,40 2,20 1,20
Ly6e
Complejo del antígeno 6 de linfocitos, locus E 2,60 2,00 2,50 1,80 2,30 1,30
6530401L14 Rik
cDNA RIKEN 0,29 0,53 0,50 0,39 0,56 0,53
Mad3
Proteína de dimerización Max 3 0,30 0,38 0,52 0,56 0,89
Hmgb2
Caja del grupo de alta movilidad 2 0,31 0,46 0,56 0,45 0,57
Kif11
Quinesina 11 0,30 0,57 0,31 0,43 0,53 0,46
Mad211
Proteína 1 similar a MAD2 (deficiente en parada mitótica, homólogo) (levadura) 0,30 0,57 0,40 0,43 0,55 0,64
Asflb
Función antisilenciadora de ASF1 1 homólogo B (Saccharomyces) 0,34 0,47 0,34 0,47 0,57 0,71
Mcm3
Deficiente en el 0,41 0,48 0,40 0,56 0,57 0,69
Símbolo
Descripción BLEO CIS ETOP MMS MNNG VINC
mantenimiento de minicromosomas 3 (Saccharomyces)
MGC: 32192
Clon de cDNA MGC: 32192 IMAGEN: 5006129 de Mus musculus 0,27 0,40 0,32 0,46 0,58 0,71
Foxm1
Caja forkhead M1 0,35 0,53 0,41 0,41 0,58 0,68
Anxa8
Anexina A8 2,60 1,70 5,60 2,50 2,80 1,80
Slc35a5
Familia 35 transportadora de solutos, miembro A5 1,70 2,90 2,60 2,50 1,30
E030024M05 Rik
cDNA RIKEN 2,10 1,70 2,70 2,00 2,00 1,20
Cks2
Subunidad 2 reguladora de la proteína quinasa CDC28 0,34 0,41 0,59 0,57 0,78
Cilp
Proteína de la capa intermedia de cartílago 0,59 0,38 0,57 0,49 0,77
Tacc3
Proteína 3 que contiene sobreenrrollamiento, acídica, transforman-te 0,43 0,42 0,48 0,59 0,73
Prc1
Proteína regulado 0,45 0,58 0,42 0,44 0,59 0,63
Símbolo
Descripción BLEO CIS ETOP MMS MNNG VINC
ra de citoquinas 1
2610509G12 Rik
cDNA RIKEN 0,49 0,50 0,46 0,55 0,59 0,55
2810417H13 Rik
cDNA RIKEN 0,25 0,36 0,48 0,60 0,96
Pbk
Quinasa de unión a PDZ 0,27 0,45 0,26 0,46 0,60 0,62
Capn6
Calpaína 6 0,57 0,56 0,36 0,60 0,60 0,83
Gmnn
Geminina 0,47 0,52 0,60 0,54 0,58 0,65
Mcmd4
Deficiente en el mantenimiento de minicromosomas 4 homólogo 0,60 0,59 0,47 0,57 0,57 0,64
Ccna2
Ciclina A2 0,33 0,51 0,35 0,46 0,61 0,82
Polal
Polimerasa de DNA alfa 1, 180 kDa 0,46 0,61 0,55 0,37 0,36 0,51
Hmgb3
Caja del grupo de alta movilidad 3 0,51 0,61 0,38 0,45 0,46 0,67
Tagln
Transgelina (proteína 22 de músculo liso) 0,51 0,61 0,47 0,55 0,84
1600013K19 Rik
cDNA RIKEN 0,48 0,60 0,62 0,62 0,98
Serpine1
Inhibidor de proteínasa de Ser (o Cys), clase E, miembro 1 0,54 0,54 0,58 0,62 1,00
Símbolo
Descripción BLEO CIS ETOP MMS MNNG VINC
Wig1
Gen inducido por p53 tipo salvaje 1 2,70 1,60 3,50 2,40 1,90 1,20
Hgf
Factor de crecimiento de hepatocito (factor de dispersión) 1,60 1,60 2,20 2,20 3,20 2,00
Gnpi
Deaminasa de glucosamina-6-fosfato 1,70 1,70 1,60 1,90 1,60
Birc5
Proteína 5 que contiene repetición IAP baculoviral 0,28 0,42 0,51 0,63 0,87
Prim1
Primasa de DNA, subunidad p49 0,45 0,63 0,44 0,51 0,51 0,54
Rbl1
Proteína 1 similar a retinoblastoma (p107) 0,48 0,58 0,38 0,59 0,64 0,67
Pcna
Antígeno nuclear de proliferación celular 0,57 0,62 0,47 0,60 0,64 0,70
E130315B21 Rik
cDNA RIKEN 0,58 0,56 0,55 0,64 0,60 0,70
2610019I03 RIK
cDNA RIKEN 0,46 0,41 0,43 0,65 0,76
Sesenta de los 86 genes expresados diferencialmente poseen una función conocida anotada en el índice de ontolo
gía de genes (www.geneontology.org/). Las funciones anotadas de estos genes indican que los fármacos genotóxicos afectan las rutas relevantes a la transformación celular y de respuesta al daño de DNA. De interés, p53 o c-Myc se conocen por regular la transcripción de 26 (58%) de estos ge
nes.
Los genes regulados por p53 (2610509G12Rik, Birc5,
Brca1,
Calmbp1, Ccna2, Ccng1, Dda3, Hmgb2, Hmmr, Mcm3,
Mcm4,
Mki67, Nos3, Np95, Nusap1, Pcna, Polal, Prc1,
Rad51ap1,
Slc19a2, Smc2l1, Tk1, Top2a, Trp53inp1, Wig1,
Cks2, Lmnb1, Pbk) se han identificado en la bibliografía publicada. Los genes regulados por c-Myc (Brca1, Ccna2, Ccng1, Cks2, Ephx1, Fabp5, Foxm1, Hmmr, Lmnb1, Mad2l1, Mcm3, Mcm4, Mcm5, Mki67, Pcna, Rad51ap1, Serpine1, Tk1, Ugt1a1) se han identificado utilizando la base de datos de genes diana de Myc (http://www.myccancergene.org/index. asp). Además, 32 de los 53 genes afectados con la anotación funcional de un proceso biológico específico son conocidos por estar involucrados en la respuesta al daño de DNA. En particular, 14 (26%) de estos genes están anotados por estar involucrados en el metabolismo del DNA y 21 (40%) en el control del ciclo celular. Por comparación, sólo el 3% y el 5% de todos los genes de ratón anotados están involucrados en el metabolismo del DNA o en el control del ciclo celular.
Los datos demuestran que ocurre un único patrón de alteración de la expresión génica cuando las células que no están terminalmente diferenciadas se exponen a agentes que dañan directamente el DNA. Este patrón de expresión (y sub
grupos de patrones) son por loo tanto útiles para clasificar otros compuestos e identificar compuestos que probablemente provocan el daño directo del DNA.
Ejemplo 3: Ensayo RT-PCR
Un cambio de expresión en un subgrupo de genes en este sistema de diferenciación in vitro puede proporcionar un indicador universal de daño en el DNA. Por lo tanto, se desarrollaron ensayos de RT-PCR para dos genes cuya expresión se vio aumentada notablemente tras la exposición a todos los agentes genotóxicos que actúan directamente. Uno es un gen nuevo de función desconocida, 4833427G06Rik. El otro es Dda3, un gen cuya expresión se ha visto que responde a p53 y p73 (P.K. Lo et al., Oncogene (1999) 18:7765-74), y que suprime el crecimiento celular cuando se sobreexpresa (S.C. Hsieh et al., Oncogene (2002) 21:3050-57). Los ensayos de RT-PCR se utilizan para analizar el mRNA preparado de células C2C12 tras la exposición a 12 genotóxicos (Actinomicina D (ACTD), dietilstilbestrol (DES), doxorubicina HCl (DOX), metanosulfonato de etilo (EMS), sulfato de bleomicina (BLEO), cisplatino (CIS), etoposido (ETOP), metanosulfonato de metilo (MMS), 1-metil-3-nitro-nitrosoguanidina (MNG), sulfato de vincristina (VINC), sulfato de vinblastina (VINB), y paclitaxel (PACL)) y 9 compuestos no genotóxicos (dimetil sulfóxido (DMSO), cefoperazona sódica (CER), famotidina (FAM), pilocarpina HCl (PILO), maleato de timolol (TIM), benzilacetato (BA), clofibrato (CLOF), mesalamina (MES), metilurea (MU), y diéster de ácido ftálico (PTD)). Tras exponer las células a cada fármaco durante 24 horas,
se indujeron para diferenciarlas durante 18 horas antes de preparar el RNA.
El RNA total se trató con Dnasa l y se convirtió en cDNA utilizando la transcriptasa inversa Multiscribe (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). El ensayo de PCR cuantitativo en tiempo real cDNA SYBR green se realizó utilizando el cDNA como molde, y se analizó utilizando un detector de secuencias ABI PRISM 7900. Los posteriores ceba- dores y sondas se diseñaron para Dda3 y el nuevo clon Riken utilizando el programa Primer Express V. 2.0 (Applied Biosystems Inc. Foster City, CA):
Dda3-139F 5’ -GATCGGGTGCCTTGAGCTT-3’ (Id. de Sec. Nº:19);
Dda3-213R 5’-ACCTCTGCCCCTCTCTTCTTCT-3’ (Id. de Sec. Nº:20);
Dda-P-167T 5’-CAACCCCACCCTACCCTGCCCTG-3’ (Id. de Sec. Nº:21)
Rik-93F 5’-CAAATCAAAGGAAGTTTTATCAGAGTCA-3’ (Id. de Sec. Nº:22);
Rik-182R 5’-GTCGATACCATATGTCAATCAAATCAT-3’ (Id. de Sec. Nº:23);
Rik-P-126T 5’-CCAAGGCTTTGACTTCTTCTTGGTCCCTT-3’ (Id. de Sec. Nº:24).
La expresión de estos dos genes se aumentó significativamente tras la exposición a cada uno de los 12 agentes genotóxicos, pero no tras la exposición a cualquiera de los 9 fármacos no genotóxicos. La expresión relativa de 4833427G06Rik mRNA se vio aumentada entre 2,3 y 13,9 veces
tras la exposición a estos agentes genotóxicos, y Dda3 se vio aumentada entre 1,6 y 12,7 veces. El valor p calculado para el cambio en la expresión del mRNA de 4833427G06Rik tras la exposición a cada fármaco en relación al vehículo control fue inferior a 0,001; y los valores p para el cambio de expresión del mRNA de Dda3 estuvo en el rango de 0,04 (Paclitaxel) a 0,0001 (vinblastina). También fue importante para determinar si el cambio en la expresión de estos dos genes fue relativamente constante durante el periodo tras la exposición al compuesto genotóxico. Para hacer esto, se analizó el periodo de tiempo durante el que la expresión de estos dos genes fue elevada en las células C2C12 que se diferencian tras la exposición a compuestos genotóxicos. Los ensayos RT-PCR se realizaron en muestras de RNA obtenidas 6, 18 y 24 horas tras la inducción de la diferenciación celular tras la exposición al compuesto. La expresión de ambos genes fue consistentemente elevada durante el periodo de 6 a 24 horas de la inducción de la diferenciación tras la exposición a la genotoxina. Fue sorprendente encontrar que la vinblastina provocara un incremento mucho mayor en la expresión de estos genes indicado- res de lo que hizo la vincristina. aunque la vincristina y la vinblastina son estructuralmente similares los alcaloides Vinca, y ambos actúan a través de la inhibición de la formación de microtúbulos, poseen un espectro de actividad clínica diferente (B.A. Chabner et al., "Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics" (J.G. Hardman y L.E. Limbard, Eds., McGraw-Hill, NH, 2001) capí
tulo 52). La vincristina se utiliza en el tratamiento pediátrico de la leucemia y tumores sólidos, y se utiliza frecuentemente en el tratamiento de linfomas en adultos. La vinblastina se utiliza principalmente para tratar carcinomas testiculares y linfomas, y como segunda línea de terapia de varios tumores sólidos.
Para identificar los términos de ontología génica (OG) que fueron significativamente enriquecidos entre el grupo d genes cuya expresión se vio afectada por los fármacos geno- tóxicos, recogimos todos los términos OG anotados para cada gen. Para cada término utilizado en la anotación OG, se contó el número de genes diferencialmente expresados anotados con dicho término, o cualquier término subsidiario. La proporción de genes diferencialmente expresados con cada anotación OG se comparó con la proporción del número total de genes de ratón anotados con dicho término OG. Este proceso permitió identificar los términos OG que estaban enriquecidos entre los genes diferencialmente expresados. Entre los 53 genes con la anotación de ontología génica para los procesos biológicos, 32 estaban involucrados en la respuesta celular al daño de DNA o regulación del ciclo celular.
Ejemplo 4: experimentos de RNAi.
Los siguientes siRNA frente a Dog1 (4833427G06RIK) se diseñaron utilizando SMARTPOOL (Dharmacon);
Dog1-2 es un conjunto de las siguientes secuencias:
Dog1-4; GAAAGGAUCUCGAAAGAACUU (Id. de Sec. Nº: 25);
Dog1-5;GAAGAGAGAGCAAAGUAUCUU (Id. de Sec. Nº: 26);
Dog1-6; GCGGAACUCUAAAGUCGUUUU (Id. de Sec. Nº: 27);
Dog1-7; CAAAGGAAGUUUUAUCAGAUU (Id. de Sec. Nº: 28); o algoritmos STEALTH (Invitrogen):
Dog1-1;
GGAUGCCAAUUUGGCUAAGCAGUUU (Id. de Sec. Nº:
29);
Dog1-3;
CCUUUGAUCAGGACAAGGAUGCAAU (Id. de Sec. Nº:
30).
Los siRNA control se obtuvieron de Dharmacon: Control-1; CCCUAUUCUCCUUCUUCGCTT (control de lucifera
sa de luciérnaga) (Id. de Sec. Nº:31);
Control-2; secuencia patentada libre de RISC
Los cuatro oligos SMARTPOOL se utilizaron como conjunto (Dog1-2). Los siRNA control, incluyendo el RNAsi CONTROL libre de RISC con una secuencia patentada y el control de luciferasa de luciérnaga se obtuvieron de Dharmacon. Las células C2C12 se transfectaron en solución (M. Amarzguioui, Biotechniques (2004) 36: 766-768) con medio optimem (Invitrogen) que contiene el siRNA a concentraciones en el rango de 10 a 80 nM durante 5 horas y Lipofectamina 2000 (Invitrogen) a 2 ul lípido/ pocillo (placa de 12 pocillos). El medio de cultivo se cambió entonces a medio de crecimiento sin antibióticos. A las 28 horas tras la transfección, el medio de cultivo se cambió a un medio de crecimiento con antibióticos y vehículo o MMS 75 µM. Tras otras 24 horas de incubación, las células se lavaron, y el medio se cambió a medio de diferenciación. La formación de miotubos se observó en las siguientes 72 horas. El nivel de regulación negativa del gen se cuantificó mediante análisis por RT-PCR a
las 28 horas tras la transfección.
Se analizó el efecto de la regulación negativa mediada por el RNAi del mRNA de Dog1 sobre la diferenciación de C2C12 tras el daño de DNA inducido por mutágeno. Para asegurar que el efecto biológico fue específicamente provocado por un descenso en el gen diana, se utilizaron 3 diferentes siRNA específicos de Dog1s en estos experimentos. Además, estos siRNA se diseñaron utilizando dos algoritmos diferentes y se obtuvieron de dos empresas diferentes. El análisis del mRNA Dog1 en estas células, 28 horas tras la transfección reveló que cada siRNA específico de Dog1 redujo la cantidad de mRNA de Dog1 entre un 80 a un 96% en relación al control (Figura 1A). Por contra, los siRNA control no disminuyeron significativamente el mRNA de Dog1. La diferenciación celular de C2C12 en miotubos se inhibió completamente tras la exposición a genotoxia (Figura 1B). Ni la transfección con vector control ni la transfección con los dos controles de siRNA diferentes a una concentración de 80 nM pudo superar el bloqueo de la diferenciación de C2C12 en miotubos inducido por el mutágeno (Figura 1B). Por el contrario, la transfección con cada uno de los tres siRNA específicos de Dog1 a 20 nM permitieron la diferenciación de miocitos para proceder tras la exposición a mutágeno (Figura 1B). Por lo tanto, una reducción específica en el mRNA de Dog1 permitió a las células C2Cl2 someterse a una diferenciación miogénica en presencia de DNA dañado.
Mientras que la presente invención ha sido descrita en referencia a realizaciones específicas de la misma, debe entenderse por los expertos en la materia que pueden reali
zarse varios cambios y pueden sustituirse equivalentes sin alejarse del verdadero espíritu y alcance de la invención. Además, pueden realizarse muchas modificaciones para adaptar una situación particular, material, composición de materia, proceso, paso o pasos del proceso, al objetivo y alcance de la presente invención. Todas dichas modificaciones pretenden estar dentro del alcance de las reivindicaciones anexadas.
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<210> 1
<211> 1676
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (116)..(1105)
<400> 1
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<210> 2
<211> 329
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
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<210> 3
<211> 1572
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (76)..(1008)
<400> 3
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<210> 4
<211> 310
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
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<210> 5
<211> 808
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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<210> 7
<211> 691
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
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<210> 9
<211> 336
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<400> 9
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<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 10
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<210> 11
<211> 361
<212> DNA
<213> Danio rerio
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 11
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<210> 12
<211> 120
<212> PRT
<213> Danio rerio
<400> 12
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<210> 13
<211> 361
<212> DNA
<213> Danio rerio
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 13
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<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> Danio rerio
<400> 14
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<210> 15
<211> 735
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<220>
<221> CDS
<222> (290)..(733)
<400> 15
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<210> 16
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<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 16
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<211> 504
<212> DNA
<213> Pan troglodytes
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(501)
<400> 17
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<210> 18
<211> 167
<212> PRT
<213> Pan troglodytes
<400> 18
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<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 19 gatcgggtgc cttgagctt 19
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 20 acctctgccc ctctcttctt ct 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 21 caaccccacc ctaccctgcc ctg 23
<210> 22
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<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 22 caaatcaaag gaagttttat cagagtca 28
<210> 23
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<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 23 gtcgatacca tatgtcaatc aaatcat 27
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 24 ccaaggcttt gacttcttct tggtccctt 29
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> Mus musculus
<400> 25 gaaaggaucu cgaaagaacu u 21
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> Mus musculus
<400> 26 gaagagagag caaaguaucu u 21
<210> 27
<211> 21
<212> RNA
<213> Mus musculus
<400> 27 gcggaacucu aaagucguuu u 21
<210> 28
<211> 21
<212> RNA
<213> Mus musculus
<400> 28 caaaggaagu uuuaucagau u 21
<210> 29
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<212> RNA
<213> Mus musculus
<400> 29 ggaugccaau uuggcuaagc aguuu 25
<210> 30
<211> 25
<212> RNA
<213> Mus musculus
<400> 30 ccuuugauca ggacaaggau gcaau 25
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 31 cccuauucuc cuucuucgct t 21

Claims (6)

  1. Reivindicaciones
    1. Un método in-vitro para determinar la genotoxicidad de un compuesto prueba, dicho método comprende:
    (a)
    contactar una célula de prueba viable con dicho compuesto prueba;
    (b)
    determinar el cambio en el nivel de expresión de un gen indicador en el que dicho gen indicador es 4833427G06 Rik (cDNA RIKEN); en el que un aumento en la expresión de al menos 1,5 veces, indica que dicho compuesto prueba presenta genotoxicidad.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en el que dicho gen indicador es 4833427G06Rik y Dda3.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha célula de prueba comprende una célula mioblástica.
  4. 4.
    El método de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha célula de prueba se selecciona de células blásticas de ratón, rata, pez cebra, humano, chimpancé, y pollo.
  5. 5.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que determinar el cambio en el nivel de expresión comprende medir la cantidad de mRNA producido utilizando RT-PCR.
  6. 6.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que determinar el cambio en el nivel de expresión comprende medir el aumento en la señal producida por el aumento de expresión de un marcaje.
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