JP2002233364A - 被検物質の毒性判定方法 - Google Patents
被検物質の毒性判定方法Info
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- JP2002233364A JP2002233364A JP2001033216A JP2001033216A JP2002233364A JP 2002233364 A JP2002233364 A JP 2002233364A JP 2001033216 A JP2001033216 A JP 2001033216A JP 2001033216 A JP2001033216 A JP 2001033216A JP 2002233364 A JP2002233364 A JP 2002233364A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 被検物質の毒性を包括的にかつ効率的に検定
し得る新規な手段を提供すること。 【解決手段】 被検物質の毒性を、被検物質により発現
量が変化した遺伝子の数を指標として判定する、被検物
質の毒性判定方法。
し得る新規な手段を提供すること。 【解決手段】 被検物質の毒性を、被検物質により発現
量が変化した遺伝子の数を指標として判定する、被検物
質の毒性判定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子発現解析を
利用した新規な毒性判定方法に関する。
利用した新規な毒性判定方法に関する。
【０００２】
【従来技術】同じ系統に属する主薬効が同等な医薬品で
あっても、それらの副作用の現れ方は必ずしも同等では
ない。副作用が主薬効とは無関係の機作により生じる場
合には、主薬効と副作用はそれぞれその医薬品の性質を
示す独立したパラメーターになりうる。例えば、合成キ
ノロン抗菌剤であるトロバフロキサシンは、他のキノロ
ン剤と比較して、肝臓に対して強い毒性を示す（Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．３０，４００−４０１，２０
００）。そのため、創薬研究においては、医薬品候補化
合物を探索するためのスクリーニングの初期段階からそ
れらの副作用に関わる情報を入手し、毒性を示しにくい
骨格の化合物を選択することが医薬品開発の効率上極め
て有益である。
あっても、それらの副作用の現れ方は必ずしも同等では
ない。副作用が主薬効とは無関係の機作により生じる場
合には、主薬効と副作用はそれぞれその医薬品の性質を
示す独立したパラメーターになりうる。例えば、合成キ
ノロン抗菌剤であるトロバフロキサシンは、他のキノロ
ン剤と比較して、肝臓に対して強い毒性を示す（Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．３０，４００−４０１，２０
００）。そのため、創薬研究においては、医薬品候補化
合物を探索するためのスクリーニングの初期段階からそ
れらの副作用に関わる情報を入手し、毒性を示しにくい
骨格の化合物を選択することが医薬品開発の効率上極め
て有益である。
【０００３】医薬品の副作用を評価するための手段とし
て、毒性試験が行われる。毒性試験とは、人体に健康障
害を引き起こすおそれのある化学物質、例えば医薬品、
食品添加物、工業廃棄物、生物産生物質などの安全性の
評価または許容量を判断するための試験であり、一般毒
性試験（急性、短期、長期毒性試験）、特殊毒性試験
（変異原性、局所刺激性、アレルギー性、発ガン性、催
奇形性、繁殖性、多世代試験）、体内滞留試験（吸収、
代謝、蓄積、排泄試験）や一般生物学的試験（薬理学
的、細胞毒性試験）などが行われている。化学物質の毒
性をヒトで試験することはできないため、代替として、
一般的に動物を用いての評価が行われている。しかしな
がら、ヒトと動物とでは化学物質の示す作用が異なる可
能性もあるので、ヒト由来の培養細胞を用いて毒性を評
価することは有用であると考えられる。
て、毒性試験が行われる。毒性試験とは、人体に健康障
害を引き起こすおそれのある化学物質、例えば医薬品、
食品添加物、工業廃棄物、生物産生物質などの安全性の
評価または許容量を判断するための試験であり、一般毒
性試験（急性、短期、長期毒性試験）、特殊毒性試験
（変異原性、局所刺激性、アレルギー性、発ガン性、催
奇形性、繁殖性、多世代試験）、体内滞留試験（吸収、
代謝、蓄積、排泄試験）や一般生物学的試験（薬理学
的、細胞毒性試験）などが行われている。化学物質の毒
性をヒトで試験することはできないため、代替として、
一般的に動物を用いての評価が行われている。しかしな
がら、ヒトと動物とでは化学物質の示す作用が異なる可
能性もあるので、ヒト由来の培養細胞を用いて毒性を評
価することは有用であると考えられる。
【０００４】最近、多数の遺伝子の発現変動や遺伝子の
一塩基変異（ＳＮＰ）などを包括的に捉え得る有用な方
法として、ＤＮＡチップを用いた遺伝子解析方法が注目
されている（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐ
ｐｌｉｍｅｎｔ ２１：３−６０，１９９９）（ＤＮＡ
ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌａ
ｐｐｒｏａｃｈ， Ｓｈｅｎａ，Ｍ．編：Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）。ＤＮ
ＡチップはＤＮＡマイクロアレイとも呼ばれ、基盤上に
固定された多数の異なったキャプチャーＤＮＡに対し
て、標識したＤＮＡまたはＲＮＡをハイブリダイゼーシ
ョンさせ、ハイブリダイゼーションしたＤＮＡまたはＲ
ＮＡの測定を標識の検出により行う技術である。現在知
られているＤＮＡチップは、基盤に固定されるキャプチ
ャーＤＮＡの種類、及びその作製法により２種類に分類
される。一つは、オリゴＤＮＡを基盤上で合成してゆく
オリゴヌクレオチドアレイであり、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉ
ｘ社から入手可能である（商品名：ＧｅｎｅＣｈｉ
ｐ）。他方は、ＤＮＡ、主にｃＤＮＡを基盤上にスポッ
ティングしてキャプチャーＤＮＡとして固定化するｃＤ
ＮＡアレイである。このようなＤＮＡチップ技術は、新
たな遺伝子発現調節単位の解明や遺伝子発現プロファイ
ルに基づく疾患の分類などに用いられている。
一塩基変異（ＳＮＰ）などを包括的に捉え得る有用な方
法として、ＤＮＡチップを用いた遺伝子解析方法が注目
されている（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐ
ｐｌｉｍｅｎｔ ２１：３−６０，１９９９）（ＤＮＡ
ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌａ
ｐｐｒｏａｃｈ， Ｓｈｅｎａ，Ｍ．編：Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）。ＤＮ
ＡチップはＤＮＡマイクロアレイとも呼ばれ、基盤上に
固定された多数の異なったキャプチャーＤＮＡに対し
て、標識したＤＮＡまたはＲＮＡをハイブリダイゼーシ
ョンさせ、ハイブリダイゼーションしたＤＮＡまたはＲ
ＮＡの測定を標識の検出により行う技術である。現在知
られているＤＮＡチップは、基盤に固定されるキャプチ
ャーＤＮＡの種類、及びその作製法により２種類に分類
される。一つは、オリゴＤＮＡを基盤上で合成してゆく
オリゴヌクレオチドアレイであり、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉ
ｘ社から入手可能である（商品名：ＧｅｎｅＣｈｉ
ｐ）。他方は、ＤＮＡ、主にｃＤＮＡを基盤上にスポッ
ティングしてキャプチャーＤＮＡとして固定化するｃＤ
ＮＡアレイである。このようなＤＮＡチップ技術は、新
たな遺伝子発現調節単位の解明や遺伝子発現プロファイ
ルに基づく疾患の分類などに用いられている。
【０００５】一方、薬剤などの化学物質がある特定の遺
伝子の発現に及ぼす作用は、良く知られているノーザン
ブロットやＰＣＲといった技術に加え、上記のＤＮＡチ
ップ技術を用いて解析することが可能である。しかしな
がら、例えば抗菌剤のように、本来、ヒト組織には作用
を及ぼさないことが期待される薬剤が、遺伝子発現にど
のような影響を与えるのかを解析し、解析結果から得ら
れた情報をその薬剤の副作用の判定に利用することを考
えた場合、特定の遺伝子に注目してその変化を検出する
だけでは不十分であり、遺伝子の変化を総合的に評価し
た上で判定することが望ましいと考えられる。ところ
が、これまでに、薬剤などの化学物質の遺伝子発現に及
ぼす作用を可能な限り多くの遺伝子に関し解析し、得ら
れた情報をもとに、薬剤の副作用の強さを判定する方法
はなかった。
伝子の発現に及ぼす作用は、良く知られているノーザン
ブロットやＰＣＲといった技術に加え、上記のＤＮＡチ
ップ技術を用いて解析することが可能である。しかしな
がら、例えば抗菌剤のように、本来、ヒト組織には作用
を及ぼさないことが期待される薬剤が、遺伝子発現にど
のような影響を与えるのかを解析し、解析結果から得ら
れた情報をその薬剤の副作用の判定に利用することを考
えた場合、特定の遺伝子に注目してその変化を検出する
だけでは不十分であり、遺伝子の変化を総合的に評価し
た上で判定することが望ましいと考えられる。ところ
が、これまでに、薬剤などの化学物質の遺伝子発現に及
ぼす作用を可能な限り多くの遺伝子に関し解析し、得ら
れた情報をもとに、薬剤の副作用の強さを判定する方法
はなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、被検
物質の毒性を検定する新規な毒性判定方法を提供するこ
とであり、さらに該判定方法に用いる毒性判定用キット
及び該判定方法を用いる新規生体適用物質のスクリーニ
ング方法を提供することである。
物質の毒性を検定する新規な毒性判定方法を提供するこ
とであり、さらに該判定方法に用いる毒性判定用キット
及び該判定方法を用いる新規生体適用物質のスクリーニ
ング方法を提供することである。
【０００７】
【課題解決のための手段】本発明者らは、課題解決のた
めに、被検物質による遺伝子発現の変化をＤＮＡチップ
を用いて包括的に検定し、その変化を分析することが毒
性判定方法として有用でありかつ効率的であることを確
認して本発明を完成した。
めに、被検物質による遺伝子発現の変化をＤＮＡチップ
を用いて包括的に検定し、その変化を分析することが毒
性判定方法として有用でありかつ効率的であることを確
認して本発明を完成した。
【０００８】すなわち本発明は、以下に列挙するもので
ある。 １）被検物質の毒性を、被検物質により発現量が変化し
た遺伝子の数を指標として判定する、被検物質の毒性判
定方法。 ２）被検物質の毒性を、生物学的評価系を用いて、被検
物質により発現量が変化した遺伝子の数を指標として判
定する、被検物質の毒性判定方法。 ３）生物学的評価系として、哺乳類由来の継代培養細胞
あるいは初代培養細胞を用いることを特徴とする、前記
２）の被検物質の毒性判定方法。 ４）生物学的評価系として、実験動物、実験動物の臓
器、実験動物の組織、実験動物の細胞あるいは実験動物
の血液を用いることを特徴とする、前記２）の被検物質
の毒性判定方法。 ５）遺伝子の発現量を測定する手段としてＤＮＡチップ
（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いることを特徴とする前
記１）から４）のいずれかの被検物質の毒性判定方法。 ６）被検物質により発現量が変化した遺伝子の数を、被
検物質と接触した生物学的評価系における遺伝子の発現
量と、被検物質と接触しなかった生物学的評価系におけ
る遺伝子の発現量とを比較解析し判定する、前記２）か
ら５）のいずれかの被検物質の毒性判定方法。 ７）被検物質と接触した生物学的評価系における遺伝子
の発現量と、被検物質と接触しなかった生物学的評価系
における遺伝子の発現量との比較解析において、ハウス
キーピング遺伝子の変化（増加または減少）より大きな
変化を示した遺伝子を発現量が変化した遺伝子と判定す
る、前記２）から６）のいずれかの被検物質の毒性判定
方法。 ８）発現量が変化した遺伝子の数が、５０以下であった
ときに被検物質の毒性が弱いとし、５００以上であった
ときに被検物質の毒性が強いとする判定基準により被検
物質の毒性を判定する、前記２）から７）のいずれかの
被検物質の毒性判定方法。 ９）組織に対する被検物質の毒性を判定する方法であっ
て、該組織由来の培養細胞を用い、該被検物質と接触さ
せた該培養細胞における遺伝子の発現量と該被検物質と
接触させなかった該培養細胞における遺伝子の発現量と
を比較解析し、遺伝子の発現量が変化した遺伝子の数を
指標として、培養細胞の由来となった組織に対する被検
物質の毒性を判定する方法。 １０）遺伝子の発現量を測定する手段としてＤＮＡチッ
プ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いることを特徴とする
前記９）の被検物質の毒性判定方法。 １１）組織に対する被検物質の毒性を判定する方法であ
って、該組織由来の培養細胞を用い、該被検物質と接触
させた該培養細胞における遺伝子の発現量と該被検物質
と接触させなかった該培養細胞における遺伝子の発現量
との比較解析において、ハウスキーピング遺伝子の変化
（増加または減少）より大きな変化を示した遺伝子を発
現量が変化した遺伝子と判定する、前記９）または１
０）の被検物質の毒性判定方法。 １２）発現量が変化した遺伝子の数が、５０以下であっ
た被検物質を前記培養細胞の由来となった組織に対する
毒性が弱い、５００以上であった被検物質を前記培養細
胞の由来となった組織に対する毒性が強いと判定する前
記９）から１１）のいずれかの被検物質の毒性判定方
法。 １３）組織がヒト肝臓で、培養細胞がＨｅｐＧ２であ
る、前記９）から１２）のいずれかの被検物質の毒性判
定方法。 １４）ヒト肝臓に対する被検物質の毒性を判定する方法
であって、該被検物質と接触させたＨｅｐＧ２細胞にお
ける遺伝子の発現量と該被検物質と接触させなかったＨ
ｅｐＧ２細胞における遺伝子の発現量をＤＮＡチップ
（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いて解析し、ハウスキー
ピング遺伝子の変化（増加または減少）より大きな変化
を示した遺伝子の数が、５０以下であった被検物質を肝
臓に対する毒性が弱い、５００以上であった被検物質を
肝臓に対する毒性が強いと判定する方法。 １５）被検物質が抗菌剤である前記１）から１４）のい
ずれかの被検物質の毒性判定方法。 １６）抗菌剤がキノロン剤である前記１５）の被検物質
の毒性判定方法。 １７）キノロン剤のヒト肝臓に対する毒性を判定する方
法であって、該キノロン剤と接触させたＨｅｐＧ２細胞
における遺伝子の発現量とキノロン剤と接触しなかった
ＨｅｐＧ２細胞における遺伝子の発現量とをＤＮＡチッ
プ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いて測定し、ハウスキ
ーピング遺伝子の変化（増加または減少）より大きな変
化を示した遺伝子の数が、５０以下であったキノロン剤
をヒト肝臓に対する毒性が弱い、５００以上であったキ
ノロン剤をヒト肝臓に対する毒性が強いと判定する方
法。 １８）前記１）から１７）のいずれかの被検物質の毒性
判定方法をスクリーニング工程として含む、新規生体適
用物質のスクリーニング方法。 １９）前記１）から１７）のいずれかの被検物質の毒性
判定方法、あるいは、前記１８）のスクリーニング方法
に使用する、試薬、容器、判定手段を含む毒性判定用キ
ット。
ある。 １）被検物質の毒性を、被検物質により発現量が変化し
た遺伝子の数を指標として判定する、被検物質の毒性判
定方法。 ２）被検物質の毒性を、生物学的評価系を用いて、被検
物質により発現量が変化した遺伝子の数を指標として判
定する、被検物質の毒性判定方法。 ３）生物学的評価系として、哺乳類由来の継代培養細胞
あるいは初代培養細胞を用いることを特徴とする、前記
２）の被検物質の毒性判定方法。 ４）生物学的評価系として、実験動物、実験動物の臓
器、実験動物の組織、実験動物の細胞あるいは実験動物
の血液を用いることを特徴とする、前記２）の被検物質
の毒性判定方法。 ５）遺伝子の発現量を測定する手段としてＤＮＡチップ
（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いることを特徴とする前
記１）から４）のいずれかの被検物質の毒性判定方法。 ６）被検物質により発現量が変化した遺伝子の数を、被
検物質と接触した生物学的評価系における遺伝子の発現
量と、被検物質と接触しなかった生物学的評価系におけ
る遺伝子の発現量とを比較解析し判定する、前記２）か
ら５）のいずれかの被検物質の毒性判定方法。 ７）被検物質と接触した生物学的評価系における遺伝子
の発現量と、被検物質と接触しなかった生物学的評価系
における遺伝子の発現量との比較解析において、ハウス
キーピング遺伝子の変化（増加または減少）より大きな
変化を示した遺伝子を発現量が変化した遺伝子と判定す
る、前記２）から６）のいずれかの被検物質の毒性判定
方法。 ８）発現量が変化した遺伝子の数が、５０以下であった
ときに被検物質の毒性が弱いとし、５００以上であった
ときに被検物質の毒性が強いとする判定基準により被検
物質の毒性を判定する、前記２）から７）のいずれかの
被検物質の毒性判定方法。 ９）組織に対する被検物質の毒性を判定する方法であっ
て、該組織由来の培養細胞を用い、該被検物質と接触さ
せた該培養細胞における遺伝子の発現量と該被検物質と
接触させなかった該培養細胞における遺伝子の発現量と
を比較解析し、遺伝子の発現量が変化した遺伝子の数を
指標として、培養細胞の由来となった組織に対する被検
物質の毒性を判定する方法。 １０）遺伝子の発現量を測定する手段としてＤＮＡチッ
プ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いることを特徴とする
前記９）の被検物質の毒性判定方法。 １１）組織に対する被検物質の毒性を判定する方法であ
って、該組織由来の培養細胞を用い、該被検物質と接触
させた該培養細胞における遺伝子の発現量と該被検物質
と接触させなかった該培養細胞における遺伝子の発現量
との比較解析において、ハウスキーピング遺伝子の変化
（増加または減少）より大きな変化を示した遺伝子を発
現量が変化した遺伝子と判定する、前記９）または１
０）の被検物質の毒性判定方法。 １２）発現量が変化した遺伝子の数が、５０以下であっ
た被検物質を前記培養細胞の由来となった組織に対する
毒性が弱い、５００以上であった被検物質を前記培養細
胞の由来となった組織に対する毒性が強いと判定する前
記９）から１１）のいずれかの被検物質の毒性判定方
法。 １３）組織がヒト肝臓で、培養細胞がＨｅｐＧ２であ
る、前記９）から１２）のいずれかの被検物質の毒性判
定方法。 １４）ヒト肝臓に対する被検物質の毒性を判定する方法
であって、該被検物質と接触させたＨｅｐＧ２細胞にお
ける遺伝子の発現量と該被検物質と接触させなかったＨ
ｅｐＧ２細胞における遺伝子の発現量をＤＮＡチップ
（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いて解析し、ハウスキー
ピング遺伝子の変化（増加または減少）より大きな変化
を示した遺伝子の数が、５０以下であった被検物質を肝
臓に対する毒性が弱い、５００以上であった被検物質を
肝臓に対する毒性が強いと判定する方法。 １５）被検物質が抗菌剤である前記１）から１４）のい
ずれかの被検物質の毒性判定方法。 １６）抗菌剤がキノロン剤である前記１５）の被検物質
の毒性判定方法。 １７）キノロン剤のヒト肝臓に対する毒性を判定する方
法であって、該キノロン剤と接触させたＨｅｐＧ２細胞
における遺伝子の発現量とキノロン剤と接触しなかった
ＨｅｐＧ２細胞における遺伝子の発現量とをＤＮＡチッ
プ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いて測定し、ハウスキ
ーピング遺伝子の変化（増加または減少）より大きな変
化を示した遺伝子の数が、５０以下であったキノロン剤
をヒト肝臓に対する毒性が弱い、５００以上であったキ
ノロン剤をヒト肝臓に対する毒性が強いと判定する方
法。 １８）前記１）から１７）のいずれかの被検物質の毒性
判定方法をスクリーニング工程として含む、新規生体適
用物質のスクリーニング方法。 １９）前記１）から１７）のいずれかの被検物質の毒性
判定方法、あるいは、前記１８）のスクリーニング方法
に使用する、試薬、容器、判定手段を含む毒性判定用キ
ット。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の被検物質の毒性判定方法
は、被検物質により発現量が変化した遺伝子の数を指標
として判定することを特徴とする。例えば、被検物質と
接触させた生物学的評価系における遺伝子の発現量と、
該被検物質と接触させなかった生物学的評価系における
遺伝子の発現量とを測定し、得られた結果を比較して、
発現量が変化した遺伝子の数により被検物質の毒性を判
定する。
は、被検物質により発現量が変化した遺伝子の数を指標
として判定することを特徴とする。例えば、被検物質と
接触させた生物学的評価系における遺伝子の発現量と、
該被検物質と接触させなかった生物学的評価系における
遺伝子の発現量とを測定し、得られた結果を比較して、
発現量が変化した遺伝子の数により被検物質の毒性を判
定する。
【００１０】本発明の被検物質の毒性判定方法におい
て、遺伝子の発現量を測定する方法は、遺伝子の発現を
包括的に定量しうる方法であればよい。例えば、ハイブ
リダイゼーションに基づくＲＮＡの検出方法として、高
密度フィルター（Ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｉｌｔ
ｅｒ）を用いる方法などの公知の方法を利用することが
できる。特に、少ないサンプル量で多量の遺伝子を一度
に包括的に測定し得ることから、ＤＮＡチップ（ＤＮＡ
マイクロアレイ）を用いてハイブリダイゼーションによ
り測定する方法が好ましい。後述する実施例においては
ＤＮＡチップとしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社から入手が
可能なオリゴヌクレオチドアレイ（商品名；ＧｅｎｅＣ
ｈｉｐ）を用いたが、これに限定されない。また、ＤＮ
Ａチップを用いた解析において、遺伝子の発現は、ポリ
（Ａ）ＲＮＡから存在比を変えず、相補的に標識物質を
取り込ませたＤＮＡあるいはＲＮＡを増幅し、これらを
キャプチャーＤＮＡにハイブリダイゼーションさせ、さ
らに標識物質に応じた公知の検出方法を用いることによ
り検出することができる。例えば、ＲＮＡの標識化にビ
オチンを用いたときは、ＲＮＡをＤＮＡチップにハイブ
リダイゼーションさせた後に、ビオチンに結合し得るス
トレプトアビジン−フィコエリスリン（ＰＥ）複合体で
染色を行い、ＰＥの蛍光強度のイメージデータを取得し
てコンピューター解析ソフトにより解析する。コンピュ
ーター解析ソフトとしては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製
のＧｅｎｅＣｈｉｐ ＳｕｉｔｅやＧｅｎｅＣｈｉｐ
ＬＩＭＳ／ＥＤＭＴが挙げられるが、これらに限定され
ない。これにより、得られたイメージデータは数値化さ
れる。
て、遺伝子の発現量を測定する方法は、遺伝子の発現を
包括的に定量しうる方法であればよい。例えば、ハイブ
リダイゼーションに基づくＲＮＡの検出方法として、高
密度フィルター（Ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｉｌｔ
ｅｒ）を用いる方法などの公知の方法を利用することが
できる。特に、少ないサンプル量で多量の遺伝子を一度
に包括的に測定し得ることから、ＤＮＡチップ（ＤＮＡ
マイクロアレイ）を用いてハイブリダイゼーションによ
り測定する方法が好ましい。後述する実施例においては
ＤＮＡチップとしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社から入手が
可能なオリゴヌクレオチドアレイ（商品名；ＧｅｎｅＣ
ｈｉｐ）を用いたが、これに限定されない。また、ＤＮ
Ａチップを用いた解析において、遺伝子の発現は、ポリ
（Ａ）ＲＮＡから存在比を変えず、相補的に標識物質を
取り込ませたＤＮＡあるいはＲＮＡを増幅し、これらを
キャプチャーＤＮＡにハイブリダイゼーションさせ、さ
らに標識物質に応じた公知の検出方法を用いることによ
り検出することができる。例えば、ＲＮＡの標識化にビ
オチンを用いたときは、ＲＮＡをＤＮＡチップにハイブ
リダイゼーションさせた後に、ビオチンに結合し得るス
トレプトアビジン−フィコエリスリン（ＰＥ）複合体で
染色を行い、ＰＥの蛍光強度のイメージデータを取得し
てコンピューター解析ソフトにより解析する。コンピュ
ーター解析ソフトとしては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製
のＧｅｎｅＣｈｉｐ ＳｕｉｔｅやＧｅｎｅＣｈｉｐ
ＬＩＭＳ／ＥＤＭＴが挙げられるが、これらに限定され
ない。これにより、得られたイメージデータは数値化さ
れる。
【００１１】被検物質の毒性は、上記の測定方法で得ら
れた遺伝子発現量が変化した遺伝子の数を指標に判定さ
れる。例えば、被検物質と接触させた生物学的評価系
（処理群）における遺伝子発現プロファイル、すなわち
多量の遺伝子発現情報を基に解析された包括的な遺伝子
発現パターンを、被検物質で処理しない対照群における
それと比較することにより、処理群において発現量が増
加あるいは減少している遺伝子を同定し、増加あるいは
減少した遺伝子の数を決定する。また、発現量が増加あ
るいは減少している遺伝子の同定は、例えばＧｅｎｅＣ
ｈｉｐ ＬＩＭＳ／ＥＤＭＴを用いて計算される、Ｆｏ
ｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値を用いて行うこともできる。Ｆｏ
ｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値は、対照群に対し処理群の各遺伝
子の発現量がどのように変化したかを示す値であり、例
えば、Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値が２以上である遺伝子
を有意な増加を示した遺伝子、また、−２以下である遺
伝子を有意な減少を示した遺伝子であるとして、これら
の要件を満たす遺伝子の数を決定することが可能であ
る。あるいは、ＤＮＡチップ上のハウスキーピング遺伝
子、例えばβ−アクチンやＧ３ＰＤＨなど、のＦｏｌｄ
Ｃｈａｎｇｅ値に基づいて、それより増加あるいは減
少している遺伝子を同定し、その数を決定することも可
能である。例えば、ハウスキーピング遺伝子のＦｏｌｄ
Ｃｈａｎｇｅ値が３及び−２である場合、４以上ある
いは−３以下のＦｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値を示した遺伝
子を有意な変動を示した遺伝子とし、発現量が増加ある
いは減少した遺伝子の数を決定することができる。
れた遺伝子発現量が変化した遺伝子の数を指標に判定さ
れる。例えば、被検物質と接触させた生物学的評価系
（処理群）における遺伝子発現プロファイル、すなわち
多量の遺伝子発現情報を基に解析された包括的な遺伝子
発現パターンを、被検物質で処理しない対照群における
それと比較することにより、処理群において発現量が増
加あるいは減少している遺伝子を同定し、増加あるいは
減少した遺伝子の数を決定する。また、発現量が増加あ
るいは減少している遺伝子の同定は、例えばＧｅｎｅＣ
ｈｉｐ ＬＩＭＳ／ＥＤＭＴを用いて計算される、Ｆｏ
ｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値を用いて行うこともできる。Ｆｏ
ｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値は、対照群に対し処理群の各遺伝
子の発現量がどのように変化したかを示す値であり、例
えば、Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値が２以上である遺伝子
を有意な増加を示した遺伝子、また、−２以下である遺
伝子を有意な減少を示した遺伝子であるとして、これら
の要件を満たす遺伝子の数を決定することが可能であ
る。あるいは、ＤＮＡチップ上のハウスキーピング遺伝
子、例えばβ−アクチンやＧ３ＰＤＨなど、のＦｏｌｄ
Ｃｈａｎｇｅ値に基づいて、それより増加あるいは減
少している遺伝子を同定し、その数を決定することも可
能である。例えば、ハウスキーピング遺伝子のＦｏｌｄ
Ｃｈａｎｇｅ値が３及び−２である場合、４以上ある
いは−３以下のＦｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ値を示した遺伝
子を有意な変動を示した遺伝子とし、発現量が増加ある
いは減少した遺伝子の数を決定することができる。
【００１２】被検物質の毒性の強さは、発現量が増加あ
るいは減少した遺伝子の数により評価する。例えば、毒
性の強さの判定基準として、発現量が増加あるいは減少
した遺伝子が５０以下、好ましくは４０以下、特に好ま
しくは３０以下であったとき被検物質の毒性が弱いと
し、５００以上、好ましくは６００以上、特に好ましく
は７００以上であったとき被検物質の毒性が強いとし
て、被検物質の毒性を判定してもよい。また、被検物質
の毒性の強さは、被検物質により発現量が増加あるいは
減少した遺伝子の数と、基準物質（対象とする組織の細
胞に対する毒性や副作用のないことが確認された物質及
び重篤な毒性などが確認された物質）のそれとを比較す
ることにより、判定することもできる。すなわち、毒性
や副作用がないまたは少ないと判断されている基準物質
で処理することにより発現量が増加あるいは減少した遺
伝子の数より、発現量が増加あるいは減少した遺伝子の
数が少ないときは、その被検物質は毒性を示さないと判
断できる。また、重篤な毒性が確認されている基準物質
で処理したときより多くの遺伝子で発現量が増加あるい
は減少が認められたときは、毒性が強いと判断すること
ができる。あるいは、被検物質を適宜希釈して、それぞ
れの濃度において、いくつの遺伝子が増減したかを計測
し、毒性を示さなくなる濃度を被検物質毎に決定し、こ
の値を比較することにより、複数の被検物質の毒性の強
さを比較判定することも可能である。さらには、増減し
た遺伝子の数について濃度依存性曲線を作製し、得られ
るその傾きを判定基準とすることもできる。
るいは減少した遺伝子の数により評価する。例えば、毒
性の強さの判定基準として、発現量が増加あるいは減少
した遺伝子が５０以下、好ましくは４０以下、特に好ま
しくは３０以下であったとき被検物質の毒性が弱いと
し、５００以上、好ましくは６００以上、特に好ましく
は７００以上であったとき被検物質の毒性が強いとし
て、被検物質の毒性を判定してもよい。また、被検物質
の毒性の強さは、被検物質により発現量が増加あるいは
減少した遺伝子の数と、基準物質（対象とする組織の細
胞に対する毒性や副作用のないことが確認された物質及
び重篤な毒性などが確認された物質）のそれとを比較す
ることにより、判定することもできる。すなわち、毒性
や副作用がないまたは少ないと判断されている基準物質
で処理することにより発現量が増加あるいは減少した遺
伝子の数より、発現量が増加あるいは減少した遺伝子の
数が少ないときは、その被検物質は毒性を示さないと判
断できる。また、重篤な毒性が確認されている基準物質
で処理したときより多くの遺伝子で発現量が増加あるい
は減少が認められたときは、毒性が強いと判断すること
ができる。あるいは、被検物質を適宜希釈して、それぞ
れの濃度において、いくつの遺伝子が増減したかを計測
し、毒性を示さなくなる濃度を被検物質毎に決定し、こ
の値を比較することにより、複数の被検物質の毒性の強
さを比較判定することも可能である。さらには、増減し
た遺伝子の数について濃度依存性曲線を作製し、得られ
るその傾きを判定基準とすることもできる。
【００１３】本発明において、上記発現量が増加あるい
は減少した遺伝子については、その遺伝子がハイブリダ
イゼーションしたキャプチャーＤＮＡのＤＮＡチップ上
での位置を同定し、該キャプチャーＤＮＡの情報から、
該遺伝子の情報、例えば塩基配列、コードする蛋白質、
及び関連する疾患などの情報、を得ることも可能であ
る。したがって、発現量が増加あるいは減少した遺伝子
のさらに詳細な解析も可能である。
は減少した遺伝子については、その遺伝子がハイブリダ
イゼーションしたキャプチャーＤＮＡのＤＮＡチップ上
での位置を同定し、該キャプチャーＤＮＡの情報から、
該遺伝子の情報、例えば塩基配列、コードする蛋白質、
及び関連する疾患などの情報、を得ることも可能であ
る。したがって、発現量が増加あるいは減少した遺伝子
のさらに詳細な解析も可能である。
【００１４】本発明において被検物質としては、医薬
品、食品、食品添加物、栄養補助食品など広く生体内に
摂取される物質、ならびに工業廃棄物や環境汚染物質な
どの生体に影響を及ぼし得る物質が対象とされる。実施
例においては、医薬品、特に抗菌剤を例示したが、対象
とする物質はこれに限定されない。
品、食品、食品添加物、栄養補助食品など広く生体内に
摂取される物質、ならびに工業廃棄物や環境汚染物質な
どの生体に影響を及ぼし得る物質が対象とされる。実施
例においては、医薬品、特に抗菌剤を例示したが、対象
とする物質はこれに限定されない。
【００１５】本発明において使用される生物学的評価系
とは、検定目的に応じて選定された生物由来、好ましく
は哺乳類由来の継代培養細胞または初代培養細胞、ある
いはラット、マウス、ウサギなどの実験動物を利用する
評価系を意味する。生物学的評価系として上記のような
培養細胞を用い、被検物質を接触させて上記毒性判定方
法を実施すれば、被検物質の培養細胞に対する毒性を包
括的に判定することができる。また、細胞に対する毒性
を判定することで、各細胞が由来した組織及び／または
臓器に対する毒性を評価することもできる。例えば、肝
臓由来の継代培養細胞株または初代培養細胞を使用すれ
ば、最も顕著に生体内において毒性が現れる肝臓に対す
る毒性を包括的に評価することが可能である。実験動物
を利用した場合には、生物学的評価系として、実験動物
から採取した生体試料を用いることもできる。実験動物
から採取した生体試料とは、臓器、組織、細胞、血液、
骨髄、受精卵、胚などを意味する。このとき、あらかじ
め被検物質を投与しておいた実験動物から生体試料を採
取してもよいし、採取した生体試料と被検物質とを直接
接触することも可能である。さらに、上記毒性判定方法
を利用すれば、医薬品を投与された、あるいは化学物質
に曝されたヒトに由来する生体試料、例えば血液などを
用いて、該医薬品の副作用や該化学物質の影響を検査す
ることもできる。上記毒性判定方法を実施するとき、用
いる生物学的評価系の数は１つに限らず、複数の生物学
的評価系について同時に判定を実施できる。例えば、２
種類以上の継代培養細胞株について一度に上記毒性判定
方法を実施できる。また、例えば２種類以上の組織及び
／または臓器に由来する、１種類もしくは２種類以上の
継代培養細胞株または初代培養細胞について、上記毒性
判定方法を一度に実施することにより、被検物質の生体
に対する影響を包括的に評価できる。
とは、検定目的に応じて選定された生物由来、好ましく
は哺乳類由来の継代培養細胞または初代培養細胞、ある
いはラット、マウス、ウサギなどの実験動物を利用する
評価系を意味する。生物学的評価系として上記のような
培養細胞を用い、被検物質を接触させて上記毒性判定方
法を実施すれば、被検物質の培養細胞に対する毒性を包
括的に判定することができる。また、細胞に対する毒性
を判定することで、各細胞が由来した組織及び／または
臓器に対する毒性を評価することもできる。例えば、肝
臓由来の継代培養細胞株または初代培養細胞を使用すれ
ば、最も顕著に生体内において毒性が現れる肝臓に対す
る毒性を包括的に評価することが可能である。実験動物
を利用した場合には、生物学的評価系として、実験動物
から採取した生体試料を用いることもできる。実験動物
から採取した生体試料とは、臓器、組織、細胞、血液、
骨髄、受精卵、胚などを意味する。このとき、あらかじ
め被検物質を投与しておいた実験動物から生体試料を採
取してもよいし、採取した生体試料と被検物質とを直接
接触することも可能である。さらに、上記毒性判定方法
を利用すれば、医薬品を投与された、あるいは化学物質
に曝されたヒトに由来する生体試料、例えば血液などを
用いて、該医薬品の副作用や該化学物質の影響を検査す
ることもできる。上記毒性判定方法を実施するとき、用
いる生物学的評価系の数は１つに限らず、複数の生物学
的評価系について同時に判定を実施できる。例えば、２
種類以上の継代培養細胞株について一度に上記毒性判定
方法を実施できる。また、例えば２種類以上の組織及び
／または臓器に由来する、１種類もしくは２種類以上の
継代培養細胞株または初代培養細胞について、上記毒性
判定方法を一度に実施することにより、被検物質の生体
に対する影響を包括的に評価できる。
【００１６】被検物質と生物学的評価系との接触とは、
例えば継代培養細胞株や初代培養細胞を生物学的評価系
として用いる場合、被検物質の存在下で細胞を培養し、
その後細胞を回収することを意味する。細胞の培養方法
及び培養条件は、用いる細胞に応じて自体公知の方法及
び条件から最適のものを選択する。このとき、用いる細
胞を公知の方法により、例えば培養時に血清を欠乏させ
る、または培養培地からイソロイシン、グルタミンなど
のアミノ酸を除くなどの方法によって、同調培養して使
用してもよい。培養期間は、被検物質の用途及び毒性や
副作用の発現時期に応じて所望の期間に調整され得る。
一般的には、被検物質との培養を５〜４８時間行う。実
験動物を生物学的評価系として用いるときは、被検物質
を、その予想される投与法または摂取法により、被検物
質の用途及び毒性や副作用の発現時期に応じて所望の期
間、実験動物に与える。その後、検定目的とされる組織
を採取する。例えば、被検物質を単回投与後、数時間か
ら２４時間後に検定目的とされる組織を採取する。ま
た、長期間摂取または投与されることが予想される被検
物質の場合は、該被検物質を実験動物に長期投与あるい
は反復投与後に採取した組織を用いてもよい。
例えば継代培養細胞株や初代培養細胞を生物学的評価系
として用いる場合、被検物質の存在下で細胞を培養し、
その後細胞を回収することを意味する。細胞の培養方法
及び培養条件は、用いる細胞に応じて自体公知の方法及
び条件から最適のものを選択する。このとき、用いる細
胞を公知の方法により、例えば培養時に血清を欠乏させ
る、または培養培地からイソロイシン、グルタミンなど
のアミノ酸を除くなどの方法によって、同調培養して使
用してもよい。培養期間は、被検物質の用途及び毒性や
副作用の発現時期に応じて所望の期間に調整され得る。
一般的には、被検物質との培養を５〜４８時間行う。実
験動物を生物学的評価系として用いるときは、被検物質
を、その予想される投与法または摂取法により、被検物
質の用途及び毒性や副作用の発現時期に応じて所望の期
間、実験動物に与える。その後、検定目的とされる組織
を採取する。例えば、被検物質を単回投与後、数時間か
ら２４時間後に検定目的とされる組織を採取する。ま
た、長期間摂取または投与されることが予想される被検
物質の場合は、該被検物質を実験動物に長期投与あるい
は反復投与後に採取した組織を用いてもよい。
【００１７】得られた細胞または組織から、ついでＲＮ
Ａを調製する。ＲＮＡの調製には、広く公知の手法が適
用される。例えば、ヒトＲＮＡを調製する場合、公知の
簡便なＲＮＡ抽出法であるＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａ
ｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｐｈｅｎ
ｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．１６２，１５６−１５９，１９８７）が使用で
きる。得られた総ＲＮＡは、さらに、通常使用されるオ
リゴ（ｄＴ）ビーズやカラムを用いた方法などによりポ
リ（Ａ）ＲＮＡに精製してもよい。また、組織あるいは
培養細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを直接、抽出、精製して
もよい。調製された総ＲＮＡあるいはポリ（Ａ）ＲＮＡ
から、リバーストランスクリプターゼやＴ７ポリメラー
ゼなどを用いて一段階あるいは多段階で相補鎖を合成
し、これを基盤状に合成あるいはスポットされたキャプ
チャーＤＮＡとハイブリダイゼーションさせる。相補鎖
を合成するとき、ビオチンなどの標識物質を取り込ませ
ておけば、標識物質を検出することにより、ハイブリダ
イズした核酸を検出することが可能である。さらに標識
されたＲＮＡあるいはＤＮＡは、ハイブリダイゼーショ
ンを効率的に行うために、断片化処理がなされる方が好
ましい場合もある。断片化の程度は、該断片化されたＲ
ＮＡあるいはＤＮＡとハイブリダイゼーションさせるキ
ャプチャーＤＮＡの長さにより、適した長さを選択する
ことができる。例えば、ハイブリダイゼーションを実施
例で用いたオリゴヌクレオチドアレイであるＧｅｎｅＣ
ｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて行うときに
は、ＲＮＡを約３５ｍｅｒ〜約２００ｍｅｒの長さに断
片化することが好ましい。
Ａを調製する。ＲＮＡの調製には、広く公知の手法が適
用される。例えば、ヒトＲＮＡを調製する場合、公知の
簡便なＲＮＡ抽出法であるＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａ
ｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｐｈｅｎ
ｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．１６２，１５６−１５９，１９８７）が使用で
きる。得られた総ＲＮＡは、さらに、通常使用されるオ
リゴ（ｄＴ）ビーズやカラムを用いた方法などによりポ
リ（Ａ）ＲＮＡに精製してもよい。また、組織あるいは
培養細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを直接、抽出、精製して
もよい。調製された総ＲＮＡあるいはポリ（Ａ）ＲＮＡ
から、リバーストランスクリプターゼやＴ７ポリメラー
ゼなどを用いて一段階あるいは多段階で相補鎖を合成
し、これを基盤状に合成あるいはスポットされたキャプ
チャーＤＮＡとハイブリダイゼーションさせる。相補鎖
を合成するとき、ビオチンなどの標識物質を取り込ませ
ておけば、標識物質を検出することにより、ハイブリダ
イズした核酸を検出することが可能である。さらに標識
されたＲＮＡあるいはＤＮＡは、ハイブリダイゼーショ
ンを効率的に行うために、断片化処理がなされる方が好
ましい場合もある。断片化の程度は、該断片化されたＲ
ＮＡあるいはＤＮＡとハイブリダイゼーションさせるキ
ャプチャーＤＮＡの長さにより、適した長さを選択する
ことができる。例えば、ハイブリダイゼーションを実施
例で用いたオリゴヌクレオチドアレイであるＧｅｎｅＣ
ｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて行うときに
は、ＲＮＡを約３５ｍｅｒ〜約２００ｍｅｒの長さに断
片化することが好ましい。
【００１８】上記本発明の毒性判定方法は、新規生体適
用物質のスクリーニングに利用することができる。生体
適用物質、例えば医薬品、の開発において、目的とする
作用や活性を有する候補物質を選別するためにスクリー
ニングを行う。このとき、該候補物質の毒性を指標とし
て、毒性の無いものまたは低いものをさらに選別するこ
とが一般的に行われている。スクリーニングにおける候
補物質の毒性の判定は、細胞毒性を指標に行われること
が多い。本発明の毒性判定方法を新規生体適用物質のス
クリーニングの一工程として含むスクリーニング方法
は、細胞毒性だけでなく遺伝子レベルでの作用に基づく
候補物質の差別化を行うことができるため、候補物質の
選別に有効な方法である。ここで、目的とする作用や活
性を有する候補物質を選別するためのスクリーニングに
用いる試験法は、従来実施されているいずれのものであ
ってもよい。
用物質のスクリーニングに利用することができる。生体
適用物質、例えば医薬品、の開発において、目的とする
作用や活性を有する候補物質を選別するためにスクリー
ニングを行う。このとき、該候補物質の毒性を指標とし
て、毒性の無いものまたは低いものをさらに選別するこ
とが一般的に行われている。スクリーニングにおける候
補物質の毒性の判定は、細胞毒性を指標に行われること
が多い。本発明の毒性判定方法を新規生体適用物質のス
クリーニングの一工程として含むスクリーニング方法
は、細胞毒性だけでなく遺伝子レベルでの作用に基づく
候補物質の差別化を行うことができるため、候補物質の
選別に有効な方法である。ここで、目的とする作用や活
性を有する候補物質を選別するためのスクリーニングに
用いる試験法は、従来実施されているいずれのものであ
ってもよい。
【００１９】本発明は、さらに上記毒性判定方法に用い
るための、毒性判定用キットを提供する。該毒性判定用
キットは、ＲＮＡの調製、精製、標識及び検出に用いる
試薬、器具、及び容器、ならびに測定結果を検定するた
めの手段、例えばコンピューターソフトなどを含むもの
である。
るための、毒性判定用キットを提供する。該毒性判定用
キットは、ＲＮＡの調製、精製、標識及び検出に用いる
試薬、器具、及び容器、ならびに測定結果を検定するた
めの手段、例えばコンピューターソフトなどを含むもの
である。
【００２０】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】被検物質として、シタフロキサシン、レボ
フロキサシン及びトロバフロキサシンの各キノロン系抗
菌剤を使用した。これらをそれぞれ添加して培養したヒ
ト肝芽腫由来の細胞株、ＨｅｐＧ２細胞、から得た総Ｒ
ＮＡをサンプルとして、ヒトプローブアレイであるＨｕ
Ｇｅｎｅ ＦＬを用いて、ＧｅｎｅＣｈｉｐシステム
（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）により遺伝子発現の解析を
行った。
フロキサシン及びトロバフロキサシンの各キノロン系抗
菌剤を使用した。これらをそれぞれ添加して培養したヒ
ト肝芽腫由来の細胞株、ＨｅｐＧ２細胞、から得た総Ｒ
ＮＡをサンプルとして、ヒトプローブアレイであるＨｕ
Ｇｅｎｅ ＦＬを用いて、ＧｅｎｅＣｈｉｐシステム
（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）により遺伝子発現の解析を
行った。
【００２１】（ＲＮＡの分取）ＨｅｐＧ２細胞は、１０
％牛胎児血清を含むＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ
社）中で維持し、その２×１０６個を７５ｃｍ２の培養
フラスコに加えて、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で一晩
インキュベーションした。ついで、上記各キノロン剤を
それぞれ１０．０μｇ／ｍｌの終濃度となるように添加
し、６時間または１６時間培養して細胞を回収した。各
キノロン剤は、０．１Ｎ ＮａＯＨで溶解したため、キ
ノロン剤の代わりに０．１Ｎ ＮａＯＨを加えて培養し
た細胞を対照とした。
％牛胎児血清を含むＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ
社）中で維持し、その２×１０６個を７５ｃｍ２の培養
フラスコに加えて、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で一晩
インキュベーションした。ついで、上記各キノロン剤を
それぞれ１０．０μｇ／ｍｌの終濃度となるように添加
し、６時間または１６時間培養して細胞を回収した。各
キノロン剤は、０．１Ｎ ＮａＯＨで溶解したため、キ
ノロン剤の代わりに０．１Ｎ ＮａＯＨを加えて培養し
た細胞を対照とした。
【００２２】キノロン剤で処理した細胞及び無処理の細
胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄
し、それぞれの総ＲＮＡをＡＧＰＣ法（Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９，１９８７）で抽
出した。得られた総ＲＮＡからビオチン標識化ｃＲＮＡ
を、ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現解析技術マニュアル（Ａｆｆ
ｙｍｅｔｒｉｘ社）にしたがって、下記のように調製し
た。
胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄
し、それぞれの総ＲＮＡをＡＧＰＣ法（Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９，１９８７）で抽
出した。得られた総ＲＮＡからビオチン標識化ｃＲＮＡ
を、ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現解析技術マニュアル（Ａｆｆ
ｙｍｅｔｒｉｘ社）にしたがって、下記のように調製し
た。
【００２３】まず、２本鎖ｃＤＮＡを作製するため、総
ＲＮＡを８μｇとＴ７−（ｄＴ）２４プライマー（１０
０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌとにＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏを加え
て９μｌとし、７０℃で１０分間インキュベーションし
た。これを遠心して氷上で冷却した後、５× １ｓｔ
ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ 緩衝液を４μｌ、０．１Ｍの
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を２μｌ、２．５ｍＭの
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄ
ＴＴＰの混合物）を４μｌ添加して４２℃で２分間イン
キュベーションし、２００Ｕ／μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒ
ｉｐｔ II ＲＴ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１μｌを更に加えて４２℃で
１時間インキュベーション後、氷上で冷却して遠心し、
１ｓｔｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。つぎに、２
ｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成するため、上記１
ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡに下記の組成の溶液を加
えて遠心し、１６℃で２時間インキュベーションした。 ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ ８２μｌ ５× ２ｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ 緩衝液 ３０μｌ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ １２μｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／μｌ） １μｌ ＤＮＡポリメラーゼ Ｉ（１０Ｕ／μｌ） ４μｌ ＲＮａｓｅ Ｈ（２Ｕ／μｌ） １μｌ ────────────────────────────── 合計 １５０μｌ その後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を２
μｌ加えて１６℃で５分間インキュベーションし、０．
５Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１０μｌを
加え、二本鎖ＤＮＡを合成した。得られた二本鎖ＤＮＡ
は、Ｐｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ Ｉ−ｌｉｇｈｔ
（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−５ Ｐｒｉｍｅ社）を使用し
て、使用説明書にしたがって精製した。
ＲＮＡを８μｇとＴ７−（ｄＴ）２４プライマー（１０
０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌとにＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏを加え
て９μｌとし、７０℃で１０分間インキュベーションし
た。これを遠心して氷上で冷却した後、５× １ｓｔ
ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ 緩衝液を４μｌ、０．１Ｍの
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を２μｌ、２．５ｍＭの
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄ
ＴＴＰの混合物）を４μｌ添加して４２℃で２分間イン
キュベーションし、２００Ｕ／μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒ
ｉｐｔ II ＲＴ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１μｌを更に加えて４２℃で
１時間インキュベーション後、氷上で冷却して遠心し、
１ｓｔｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。つぎに、２
ｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成するため、上記１
ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡに下記の組成の溶液を加
えて遠心し、１６℃で２時間インキュベーションした。 ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ ８２μｌ ５× ２ｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ 緩衝液 ３０μｌ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ １２μｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／μｌ） １μｌ ＤＮＡポリメラーゼ Ｉ（１０Ｕ／μｌ） ４μｌ ＲＮａｓｅ Ｈ（２Ｕ／μｌ） １μｌ ────────────────────────────── 合計 １５０μｌ その後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を２
μｌ加えて１６℃で５分間インキュベーションし、０．
５Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１０μｌを
加え、二本鎖ＤＮＡを合成した。得られた二本鎖ＤＮＡ
は、Ｐｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ Ｉ−ｌｉｇｈｔ
（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−５ Ｐｒｉｍｅ社）を使用し
て、使用説明書にしたがって精製した。
【００２４】ついで、得られた２本鎖ｃＤＮＡから、Ｂ
ｉｏＡｒｒａｙ ＨｉｇｈＹｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ
社）を用いて使用説明書に従い、ビオチン標識化ｃＲＮ
Ａを調製した。まず、下記の溶液を調製し、混合して遠
心後、３７℃で５時間インキュベーションした。 ｃＤＮＡ １０μｌ ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ １２μｌ １０× ＨＹ反応緩衝液 ４μｌ １０× ビオチン標識化リボヌクレオチド ４μｌ １０× ＤＴＴ ４μｌ １０× ＲＮａｓｅ阻害剤混合物 ４μｌ ２０× Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ２μｌ ─────────────────────────── 合計 ４０μｌ 得られたビオチン標識化ｃＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍ
ｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、使用説明書
にしたがって精製した。さらに、得られたビオチン標識
化ｃＲＮＡの約２０μｇを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロ
トコールに従い、４０ｍＭ トリス−酢酸、ｐＨ８．
１、１００ｍＭ ＫＯＡｃ、及び３０ｍＭＭｇＯＡｃの
溶液中で、９４℃で３５分間かけて断片化した。
ｉｏＡｒｒａｙ ＨｉｇｈＹｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ
社）を用いて使用説明書に従い、ビオチン標識化ｃＲＮ
Ａを調製した。まず、下記の溶液を調製し、混合して遠
心後、３７℃で５時間インキュベーションした。 ｃＤＮＡ １０μｌ ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ １２μｌ １０× ＨＹ反応緩衝液 ４μｌ １０× ビオチン標識化リボヌクレオチド ４μｌ １０× ＤＴＴ ４μｌ １０× ＲＮａｓｅ阻害剤混合物 ４μｌ ２０× Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ２μｌ ─────────────────────────── 合計 ４０μｌ 得られたビオチン標識化ｃＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍ
ｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、使用説明書
にしたがって精製した。さらに、得られたビオチン標識
化ｃＲＮＡの約２０μｇを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロ
トコールに従い、４０ｍＭ トリス−酢酸、ｐＨ８．
１、１００ｍＭ ＫＯＡｃ、及び３０ｍＭＭｇＯＡｃの
溶液中で、９４℃で３５分間かけて断片化した。
【００２５】（分析）上記ビオチン標識化ｃＲＮＡの品
質は、断片化したｃＲＮＡ（４μｇ／アレイ）をＡｆｆ
ｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｒｒａｙ（Ｔｅ
ｓｔ ２）とハイブリダイゼーションさせることにより
確認した。続いて、断片化したｃＲＮＡの１０μｇを、
ヒト遺伝子発現解析用のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎ
ｅＣｈｉｐ ＡｒｒａｙであるＨｕＧｅｎｅ ＦＬと、
使用説明書にしたがってハイブリダイゼーションさせ
た。ハイブリダイゼーションは、４５℃で１６時間、６
０ｒｐｍで回転させて混合しながら行った。終了後、Ｆ
ｌｕｉｄｉｃｓ ｓｔａｔｉｏｎで、アレイの洗浄及び
ストレプトアビジン−フィコエリスリン複合体（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）での染色を自動で行
った。さらにアレイを洗浄後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ用
ＧｅｎｅＣｈｉｐ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｆｏｃａｌ
ｓｃａｎｎｅｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋｅｒｄ社
製）を用い、蛍光強度のイメージデータを取得した。
質は、断片化したｃＲＮＡ（４μｇ／アレイ）をＡｆｆ
ｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｒｒａｙ（Ｔｅ
ｓｔ ２）とハイブリダイゼーションさせることにより
確認した。続いて、断片化したｃＲＮＡの１０μｇを、
ヒト遺伝子発現解析用のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎ
ｅＣｈｉｐ ＡｒｒａｙであるＨｕＧｅｎｅ ＦＬと、
使用説明書にしたがってハイブリダイゼーションさせ
た。ハイブリダイゼーションは、４５℃で１６時間、６
０ｒｐｍで回転させて混合しながら行った。終了後、Ｆ
ｌｕｉｄｉｃｓ ｓｔａｔｉｏｎで、アレイの洗浄及び
ストレプトアビジン−フィコエリスリン複合体（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）での染色を自動で行
った。さらにアレイを洗浄後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ用
ＧｅｎｅＣｈｉｐ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｆｏｃａｌ
ｓｃａｎｎｅｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋｅｒｄ社
製）を用い、蛍光強度のイメージデータを取得した。
【００２６】（データ解析）ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＬＩＭ
Ｓ／ＥＤＭＴソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社
製）により、取得したイメージデータを解析した。各サ
ンプルのイメージデータを数値化し、発現している遺伝
子を同定し、その数を計測した。さらに、この解析結果
を用い、キノロン剤処理細胞での遺伝子発現量の増加ま
たは減少を判定した。対照と比較して、２倍増加以上ま
たは３倍減少以下であるとき有意の変化とした。
Ｓ／ＥＤＭＴソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社
製）により、取得したイメージデータを解析した。各サ
ンプルのイメージデータを数値化し、発現している遺伝
子を同定し、その数を計測した。さらに、この解析結果
を用い、キノロン剤処理細胞での遺伝子発現量の増加ま
たは減少を判定した。対照と比較して、２倍増加以上ま
たは３倍減少以下であるとき有意の変化とした。
【００２７】（成績）ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｒｒａｙで
あるＨｕＧｅｎｅ ＦＬ上には、ヒトの５６００遺伝子
に対応する特異的プローブが固定化されている。この中
で、対照である０．１Ｎ ＮａＯＨで処理したＨｅｐＧ
２細胞で発現している遺伝子数は３３５９であり、レボ
フロキサシン、シタフロキサシン、及びトロバフロキサ
シン各１０μｇ／ｍｌで１６時間処理後に発現している
遺伝子数は、それぞれ、３３５０、３２８６、及び３０
６５であった。この結果により、各キノロン剤で処理し
た細胞において発現している遺伝子数には顕著な差は認
められないと考えられた。
あるＨｕＧｅｎｅ ＦＬ上には、ヒトの５６００遺伝子
に対応する特異的プローブが固定化されている。この中
で、対照である０．１Ｎ ＮａＯＨで処理したＨｅｐＧ
２細胞で発現している遺伝子数は３３５９であり、レボ
フロキサシン、シタフロキサシン、及びトロバフロキサ
シン各１０μｇ／ｍｌで１６時間処理後に発現している
遺伝子数は、それぞれ、３３５０、３２８６、及び３０
６５であった。この結果により、各キノロン剤で処理し
た細胞において発現している遺伝子数には顕著な差は認
められないと考えられた。
【００２８】上記各キノロン剤１０μｇ／ｍｌで１６時
間処理後に、細胞中で発現量が有意に増加または減少し
た遺伝子の数を、図１に示した。トロバフロキサシンで
処理した細胞においては、遺伝子の発現量が、１８９遺
伝子で増加し、３３２遺伝子で減少した。それに反して
レボフロキサシンで処理した細胞では、少数の遺伝子の
発現量が変化したのみであり、２５遺伝子で増加、３遺
伝子で減少が認められた。この結果、トロバフロキサシ
ンが、レボフロキサシンに比較して、ＨｅｐＧ２細胞の
遺伝子発現により大きな影響を与えることが判明した。
トロバフロキサシンは重篤な肝毒性を示すことが知られ
ており（Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．３０，４００
−４０１，２０００）、一方レボフロキサシンは安全な
キノロン剤であることが知られている（Ａｎｔｉｍｉｃ
ｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：３
０９−３１２，１９９１）。このことから、キノロン剤
で処理した細胞において発現量が増加したあるいは減少
した遺伝子の数と、それら薬剤の毒性との間には相関が
あることが示唆された。
間処理後に、細胞中で発現量が有意に増加または減少し
た遺伝子の数を、図１に示した。トロバフロキサシンで
処理した細胞においては、遺伝子の発現量が、１８９遺
伝子で増加し、３３２遺伝子で減少した。それに反して
レボフロキサシンで処理した細胞では、少数の遺伝子の
発現量が変化したのみであり、２５遺伝子で増加、３遺
伝子で減少が認められた。この結果、トロバフロキサシ
ンが、レボフロキサシンに比較して、ＨｅｐＧ２細胞の
遺伝子発現により大きな影響を与えることが判明した。
トロバフロキサシンは重篤な肝毒性を示すことが知られ
ており（Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．３０，４００
−４０１，２０００）、一方レボフロキサシンは安全な
キノロン剤であることが知られている（Ａｎｔｉｍｉｃ
ｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：３
０９−３１２，１９９１）。このことから、キノロン剤
で処理した細胞において発現量が増加したあるいは減少
した遺伝子の数と、それら薬剤の毒性との間には相関が
あることが示唆された。
【００２９】また、新規なキノロン剤のシタフロキサシ
ン処理では、３６遺伝子の発現量が増加し、１０遺伝子
の発現量が減少した。シタフロキサシン処理細胞におい
て発現量が増加したあるいは減少した遺伝子数の全体で
の変化はレボフロキサシンのそれに比較してわずかに大
きい。しかし、明らかにトロバフロキサシンで処理した
細胞の遺伝子発現量よりその変化は少ない。したがっ
て、ＨｅｐＧ２細胞に対するシタフロキサシンの影響
は、明らかにトロバフロキサシンのそれより弱いことが
示唆された。
ン処理では、３６遺伝子の発現量が増加し、１０遺伝子
の発現量が減少した。シタフロキサシン処理細胞におい
て発現量が増加したあるいは減少した遺伝子数の全体で
の変化はレボフロキサシンのそれに比較してわずかに大
きい。しかし、明らかにトロバフロキサシンで処理した
細胞の遺伝子発現量よりその変化は少ない。したがっ
て、ＨｅｐＧ２細胞に対するシタフロキサシンの影響
は、明らかにトロバフロキサシンのそれより弱いことが
示唆された。
【００３０】
【発明の効果】各種キノロン剤を作用させたＨｅｐＧ２
細胞由来の総ＲＮＡについて、ヒトプローブアレイを使
用して、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍにより遺伝子
発現の解析を行い、得られたデータの解析結果から、様
々なキノロン剤処理により発現している遺伝子の数には
差がないこと、キノロン剤の種類により、遺伝子の発現
量が増加あるいは減少した遺伝子の数はキノロン剤の種
類により違いのあること、さらにキノロン剤により発現
量が増加したあるいは減少した遺伝子の数とキノロン剤
の毒性との間には相関があることが確認された。本発明
の毒性判定方法は、短期間でデータが得られる簡便な方
法であり、さらに遺伝子レベルで被検物質の毒性を包括
的に評価することができる。以上のことから、本発明の
遺伝子発現プロファイルの変化、具体的には発現量が増
加あるいは減少した遺伝子の数を指標として行う被検物
質の毒性判定方法は、該被検物質のヒトにおける毒性や
副作用の発現予測方法として有用である。さらに、被検
物質に対する反応遺伝子の解析が可能であり、新規開発
品と既存品との反応遺伝子の違いによる差別化、及び発
現機序解析、摂取量や投与量などの検討にも展開でき
る。
細胞由来の総ＲＮＡについて、ヒトプローブアレイを使
用して、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍにより遺伝子
発現の解析を行い、得られたデータの解析結果から、様
々なキノロン剤処理により発現している遺伝子の数には
差がないこと、キノロン剤の種類により、遺伝子の発現
量が増加あるいは減少した遺伝子の数はキノロン剤の種
類により違いのあること、さらにキノロン剤により発現
量が増加したあるいは減少した遺伝子の数とキノロン剤
の毒性との間には相関があることが確認された。本発明
の毒性判定方法は、短期間でデータが得られる簡便な方
法であり、さらに遺伝子レベルで被検物質の毒性を包括
的に評価することができる。以上のことから、本発明の
遺伝子発現プロファイルの変化、具体的には発現量が増
加あるいは減少した遺伝子の数を指標として行う被検物
質の毒性判定方法は、該被検物質のヒトにおける毒性や
副作用の発現予測方法として有用である。さらに、被検
物質に対する反応遺伝子の解析が可能であり、新規開発
品と既存品との反応遺伝子の違いによる差別化、及び発
現機序解析、摂取量や投与量などの検討にも展開でき
る。
【図１】 キノロン剤処理によりヒト肝芽腫由来培養細
胞株ＨｅｐＧ２細胞において遺伝子発現量の変化が認め
られた遺伝子の数を示す図である。
胞株ＨｅｐＧ２細胞において遺伝子発現量の変化が認め
られた遺伝子の数を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 37/00 １０２ 37/00 １０２ (Ｃ１２Ｑ 1/02 //(Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ Ｆターム(参考） 2G045 BB01 BB10 BB14 BB20 BB24 BB46 BB50 BB51 CA25 CB01 DA13 DA14 FB02 FB12 GC14 4B024 AA11 CA04 CA09 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ20 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR40 QR56 QR62 QR84 QS24 QS25 QS34 QS39
Claims (19)
- 【請求項１】被検物質の毒性を、被検物質により発現量
が変化した遺伝子の数を指標として判定する、被検物質
の毒性判定方法。 - 【請求項２】被検物質の毒性を、生物学的評価系を用い
て、被検物質により発現量が変化した遺伝子の数を指標
として判定する、被検物質の毒性判定方法。 - 【請求項３】生物学的評価系として、哺乳類由来の継代
培養細胞あるいは初代培養細胞を用いることを特徴とす
る、請求項２に記載の被検物質の毒性判定方法。 - 【請求項４】生物学的評価系として、実験動物、実験動
物の臓器、実験動物の組織、実験動物の細胞あるいは実
験動物の血液を用いることを特徴とする、請求項２に記
載の被検物質の毒性判定方法。 - 【請求項５】遺伝子の発現量を測定する手段としてＤＮ
Ａチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いることを特徴
とする請求項１から４のいずれか１項に記載の被検物質
の毒性判定方法。 - 【請求項６】被検物質により発現量が変化した遺伝子の
数を、被検物質と接触した生物学的評価系における遺伝
子の発現量と、被検物質と接触しなかった生物学的評価
系における遺伝子の発現量とを比較解析し判定する、請
求項２から５のいずれか１項に記載の被検物質の毒性判
定方法。 - 【請求項７】被検物質と接触した生物学的評価系におけ
る遺伝子の発現量と、被検物質と接触しなかった生物学
的評価系における遺伝子の発現量との比較解析におい
て、ハウスキーピング遺伝子の変化（増加または減少）
より大きな変化を示した遺伝子を発現量が変化した遺伝
子と判定する、請求項２から６のいずれか１項に記載の
被検物質の毒性判定方法。 - 【請求項８】発現量が変化した遺伝子の数が、５０以下
であったときに被検物質の毒性が弱いとし、５００以上
であったときに被検物質の毒性が強いとする判定基準に
より被検物質の毒性を判定する、請求項２から７のいず
れか１項に記載の被検物質の毒性判定方法。 - 【請求項９】組織に対する被検物質の毒性を判定する方
法であって、該組織由来の培養細胞を用い、該被検物質
と接触させた該培養細胞における遺伝子の発現量と該被
検物質と接触させなかった該培養細胞における遺伝子の
発現量とを比較解析し、遺伝子の発現量が変化した遺伝
子の数を指標として、培養細胞の由来となった組織に対
する被検物質の毒性を判定する方法。 - 【請求項１０】遺伝子の発現量を測定する手段としてＤ
ＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いることを特
徴とする請求項９に記載の被検物質の毒性判定方法。 - 【請求項１１】組織に対する被検物質の毒性を判定する
方法であって、該組織由来の培養細胞を用い、該被検物
質と接触させた該培養細胞における遺伝子の発現量と該
被検物質と接触させなかった該培養細胞における遺伝子
の発現量との比較解析において、ハウスキーピング遺伝
子の変化（増加または減少）より大きな変化を示した遺
伝子を発現量が変化した遺伝子と判定する、請求項９ま
たは１０に記載の被検物質の毒性判定方法。 - 【請求項１２】発現量が変化した遺伝子の数が、５０以
下であった被検物質を前記培養細胞の由来となった組織
に対する毒性が弱い、５００以上であった被検物質を前
記培養細胞の由来となった組織に対する毒性が強いと判
定する請求項９から１１のいずれか１項に記載の被検物
質の毒性判定方法。 - 【請求項１３】組織がヒト肝臓で、培養細胞がＨｅｐＧ
２である、請求項９から１２のいずれか１項に記載の被
検物質の毒性判定方法。 - 【請求項１４】ヒト肝臓に対する被検物質の毒性を判定
する方法であって、該被検物質と接触させたＨｅｐＧ２
細胞における遺伝子の発現量と該被検物質と接触させな
かったＨｅｐＧ２細胞における遺伝子の発現量をＤＮＡ
チップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いて解析し、ハウ
スキーピング遺伝子の変化（増加または減少）より大き
な変化を示した遺伝子の数が、５０以下であった被検物
質を肝臓に対する毒性が弱い、５００以上であった被検
物質を肝臓に対する毒性が強いと判定する方法。 - 【請求項１５】被検物質が抗菌剤である請求項１から１
４のいずれか１項に記載の被検物質の毒性判定方法。 - 【請求項１６】抗菌剤がキノロン剤である請求項１５に
記載の被検物質の毒性判定方法。 - 【請求項１７】キノロン剤のヒト肝臓に対する毒性を判
定する方法であって、該キノロン剤と接触させたＨｅｐ
Ｇ２細胞における遺伝子の発現量とキノロン剤と接触し
なかったＨｅｐＧ２細胞における遺伝子の発現量とをＤ
ＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いて測定し、
ハウスキーピング遺伝子の変化（増加または減少）より
大きな変化を示した遺伝子の数が、５０以下であったキ
ノロン剤をヒト肝臓に対する毒性が弱い、５００以上で
あったキノロン剤をヒト肝臓に対する毒性が強いと判定
する方法。 - 【請求項１８】請求項１から１７のいずれか１項に記載
の被検物質の毒性判定方法をスクリーニング工程として
含む、新規生体適用物質のスクリーニング方法。 - 【請求項１９】請求項１から１７のいずれか１項に記載
の被検物質の毒性判定方法、あるいは、請求項１８に記
載のスクリーニング方法に使用する、試薬、容器、判定
手段を含む毒性判定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001033216A JP2002233364A (ja) | 2001-02-09 | 2001-02-09 | 被検物質の毒性判定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001033216A JP2002233364A (ja) | 2001-02-09 | 2001-02-09 | 被検物質の毒性判定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002233364A true JP2002233364A (ja) | 2002-08-20 |
Family
ID=18897001
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001033216A Withdrawn JP2002233364A (ja) | 2001-02-09 | 2001-02-09 | 被検物質の毒性判定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002233364A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007509733A (ja) * | 2003-05-21 | 2007-04-19 | コミツサリア タ レネルジー アトミーク | 試料中に存在するターゲットまたは対象物を結合／脱離させるためのデバイスおよび方法 |
| JP2007533370A (ja) * | 2004-03-02 | 2007-11-22 | ビルコ・ビーブイビーエイ | 臨床的カット−オフ値の推測 |
| JP2008520216A (ja) * | 2004-11-24 | 2008-06-19 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 遺伝毒性を判定するための方法 |
-
2001
- 2001-02-09 JP JP2001033216A patent/JP2002233364A/ja not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007509733A (ja) * | 2003-05-21 | 2007-04-19 | コミツサリア タ レネルジー アトミーク | 試料中に存在するターゲットまたは対象物を結合／脱離させるためのデバイスおよび方法 |
| JP4814098B2 (ja) * | 2003-05-21 | 2011-11-09 | コミッサリア ア レネルジー アトミーク エ オ ゼネルジ ザルタナテイヴ | 試料中に存在するターゲットまたは対象物を結合／脱離させるためのデバイスおよび方法 |
| JP2007533370A (ja) * | 2004-03-02 | 2007-11-22 | ビルコ・ビーブイビーエイ | 臨床的カット−オフ値の推測 |
| JP2008520216A (ja) * | 2004-11-24 | 2008-06-19 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 遺伝毒性を判定するための方法 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080513 |