KR20080080531A - 유전자 발현 프로파일 및 사용 방법 - Google Patents

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이안 테일러
더글라스 빅우드
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지멘스 헬쓰케어 다이아그노스틱스 인크.
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Abstract

본 발명은 유전자 발현 프로파일, 유전자 발현 프로파일을 나타내는 핵산 서열을 포함하는 마이크로어레이, 및 유전자 프로파일과 마이크로어레이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암을 검출하기 위한 진단 검정용 방법 및 조성물 및 암을 치료하기 위한 치료 방법 및 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 암 치료제를 설계하고, 확인하고, 최적화하기 위한 방법을 제공한다.

Description

유전자 발현 프로파일 및 사용 방법 {GENE EXPRESSION PROFILES AND METHODS OF USE}
본 발명은 유전자 발현 프로파일, 유전자 발현 프로파일을 나타내는 핵산 서열을 포함하는 마이크로어레이, 및 유전자 발현 프로파일과 마이크로어레이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
다수의 질병 상태는 유전자 DNA의 카피(copy) 수의 변화 또는 특정 유전자의 전사 수준의 변화에 의한 (예를 들어, 개시 제어, RNA 전구체의 제공, RNA 프로세싱 등에 의한) 다양한 유전자의 발현 수준의 차이를 특징으로 한다. 예를 들어, 유전 물질의 손실 및 획득은 악성 전환 (malignant transformation) 및 진행에서 중요한 역할을 한다. 이러한 획득 및 손실은 적어도 2 종류의 유전자, 즉, 종양유전자 및 종양 억제제 유전자에 의해 "구동되는(driven)" 것으로 생각된다. 종양유전자는 종양발생의 포지티브 조절인자이며, 종양 억제제 유전자는 종양발생의 네거티브 조절인자이다 (Marshall, Cell 64:313-326, 1991; Weinberg, Science 254:1138-1146, 1991). 따라서, 조절되지 않은 성장을 활성화시키는 한 가지 메커니즘은 (예를 들어, 세포 또는 환경 변화에 반응하여) 종양유전자 단백질을 코딩하는 유전자의 수를 증가시키거나 이러한 종양 유전자의 발현 수준을 증가시키는 것 이고, 또 다른 메커니즘은 유전 물질을 손실시키거나 종양 억제제를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 감소시키는 것이다. 이러한 모델은 신경아교종 진행과 관련된 유전 물질의 손실 및 획득에 의해 뒷받침된다 (Mikkelson, et al., J. Cellular Biochem. 46:3-8, 1991). 따라서, 특정 유전자 (예를 들어, 종양유전자 또는 종양 억제제)의 발현 (전사) 수준의 변화는 다양한 암의 존재 및 진행에 대한 길잡이 역할을 한다.
이러한 다양한 질병 (예를 들어, 암)을 치료하기 위한 치료제로서 사용되는 화합물은 아마도 상기 유전자 발현 변화의 일부 또는 전부를 반전시킨다. 따라서, 이러한 유전자의 일부 또는 전부의 발현 변화는 그러한 치료제의 효능을 모니터하거나 예측하는 방법으로서 사용될 수 있다. 발현 변화의 분석은 관심있는 표적 조직 (예를 들어, 종양) 또는 몇몇 대용적 세포 집단 (예를 들어, 말초혈 백혈구)에서 수행될 수 있다. 후자의 경우, 유전자 발현 변화와 효능 (예를 들어, 종양 수축 또는 무성장(non-growth))의 상관관계는 효능에 대한 마커로서 사용하려는 발현 변화 패턴에 대해 특히 강력해야 한다.
마이크로어레이 또는 다른 방법을 통한 유전자 발현 분석을 사용하여 인간 종양을 분자 수준에서 분류하는 데에 있어서 다수의 실험실로부터 성공 사례가 보고되어 왔다 (Bittner et al., Nature 406:536-540, 2000; Alon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:6745-6750, 1999; Alizadeh et al., Nature 403:503-511 , 2000; Golub et al., Science 286:531-537, 1999; Perou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96:9212-9217, 1999; Kahn et al., American Journal of Pathology 156:1887-1900, 2000). 이러한 방식으로 개별적으로 또는 서브셋(subset)으로서 확인된 유전자는 치료 화합물(들)의 효능과 상호관련되는 변화에 대해 추적될 수 있는 마커로서 사용되거나 어떠한 환자들이 특정 치료제로부터 혜택을 받을 수 있는 지를 예측하기 위해 사용될 수 있다. 유사하게는, 실험실에서는 질병 관련되거나 (예를 들어, 암) 치료에 대한 민감성을 예측해주는 유전자 발현 패턴을 확인하기 위해 동결된 전혈 또는 말초혈 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리된 RNA의 유전자 발현 프로파일링(profiling)이 사용되어 왔다 (DePrimo et al, BMC Cancer 3:3, 2003; Kaneta et al, Jpn. J. Cancer Res. 93:849-856, 2002; Hofmann et al, The Lancet 359:481-486, 2002; Whitney et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 100:1896-1901, 2003.). 이와 관련하여, 혈액 세포는 질병 상태 또는 치료에 대한 반응을 확인하기 위한 대용적 시스템 또는 순환성(circulating) 바이오센서로서 여겨질 수 있다.
전체 RNA는 소라페닙(sorafenib)에 대한 임상 실험에 등록된 간세포암종을 지닌 환자로부터 채취한 전혈 샘플로부터 단리되었다. RNA는 애피메트릭스(Affymetrix) 기술에 의해 각각의 샘플로부터 분석되었고, 환자 반응을 에측하는데 사용될 수 있는 유전자의 서브셋을 확인하기 위해 RECIST 또는 WHO 기준에 의해 규정된 소라페닙에 대한 환자의 반응과 비교되었다.
발명의 개요
본 발명은 유전자 발현 프로파일, 상기 유전자 발현 프로파일을 나타내는 핵산 서열을 포함하는 마이크로어레이, 및 상기 유전자 발현 프로파일과 마이크로어 레이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 유전자 발현 프로파일은 약물에 노출된 후 변경된 발현을 나타내는 하나 이상의 유전자 (예를 들어, 서열확인번호 1 내지 18)를 포함하는 발현 프로파일이다. 예를 들어, 발현 프로파일은 멀티-키나아제 (multi-kinase) 억제제 (예를 들어, 소라페닙)에 노출된 후 변경된 발현을 나타내는 하나 이상의 유전자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 발현 프로파일은 약물에 노출된 후 변경된 발현을 나타내는 유전자 (예를 들어, 서열확인번호 1 내지 18)를 엔코딩하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 발현 프로파일이다. 예를 들어, 발현 프로파일은 멀티-키나아제 억제제 (예를 들어, 소라페닙)에 노출된 후 변경된 발현을 나타내는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.
또한, 본 발명의 범위에는 멀티-키나아제 억제제 (예를 들어, 소라페닙)에 노출된 후 변경된 발현을 나타내는 하나 이상의 유전자를 포함하는 마이크로어레이가 포함된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 마이크로어레이는 표 1에 기재된 유전자 (서열확인번호 1 내지 18)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 마이크로어레이일 수 있다. 추가의 구체예에서, 마이크로어레이는 표 1에 기재된 유전자 (서열확인번호 1 내지 18)를 포함하는 군으로부터 단리된 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 마이크로어레이일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 일면은 암을 예측, 진단, 예후 및 치료하기 위한 방법 및 시약을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로어레이를 사용하는 방법에 관한 것인데, 이러한 방법은 비제한적으로 조직 또는 세포 샘플에 대한 약물 또는 치료제 (예를 들어, 멀티-키나아제 억제제)의 효과를 스크리닝하고, 조직 또는 세포 샘플에 대한 독성 효과를 스크리닝하고, 조직 또는 세포 샘플에서 질병 상태를 확인하고, 환자 진단을 제공하고, 치료에 대한 환자의 반응을 예측하고, 대조 샘플 및 약물 처리된 샘플을 구별하고, 정상 샘플 및 종양 샘플을 구별하고, 신규 약물을 발견하고, 조직 또는 세포 샘플에서 유전자 발현의 수준을 측정하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 하나 이상의 유전자 (예를 들어, 서열확인번호 1 내지 18) 및/또는 유전자 생성물의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하여 조직 또는 세포 샘플에 대한 약물 (예를 들어, 멀티-키나아제 억제제)의 효과를 스크리닝하는 방법이며, 여기서 조직 또는 세포 샘플 중의 유전자 발현 및/또는 유전자 생성물 수준은 약물에 노출되기 전 및 후에 분석되고, 유전자 및/또는 유전자 생성물의 발현 수준의 변화는 약물의 효과를 나타내거나, 환자 진단을 제공하거나, 치료에 대한 환자의 반응을 예측해준다.
본 발명의 또 다른 일면은 하나 이상의 유전자 및/또는 유전자 생성물의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하여 신규 약물을 발견하는 방법이며, 여기서 세포의 유전자 발현 및/또는 유전자 생성물 수준은 약물에 노출되기 전 및 후에 분석되고, 유전자 및/또는 유전자 생성물의 발현 수준의 변화는 약물 효능을 나타낸다.
또한, 본 발명은 암에 걸린 피검체에게 시험 화합물을 투여하고, 폴리펩티드의 활성을 측정하는 것을 포함하여 암 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 제 공하며, 여기서 폴리펩티드의 활성 변화는 시험 화합물이 암 치료에 유용한 화합물임을 나타낸다.
이에 따라, 본 발명은 예를 들어 효능제 및 길항제, 부분 효능제, 인버스(inverse) 효능제, 활성제, 보조-활성제(co-activator) 및 억제제와 같은 조절인자 또는 조정제로서 작용할 수 있는 화합물을 확인하는 데에 사용될 수 있는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 암과 관련된 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 조절하기 위한 시약 및 방법을 제공한다. 발현, 안정성, 또는 폴리누클레오티드의 양 또는 폴리펩티드의 활성을 조정하는 시약은 단백질, 펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 핵산, 핵산 유사체 (펩티드 핵산, 잠금 핵산(locked nucleic acid)) 또는 소분자 (small molecule)일 수 있다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 유전자 및/또는 유전자 생성물의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하여 환자 진단을 제공하는 방법을 제공하며, 여기서 정상 샘플 및 환자 샘플의 유전자 발현 및/또는 유전자 생성물 수준이 분석되고, 환자 샘플 중의 유전자 및/또는 유전자 생성물의 발현 수준의 변화가 질병을 진단한다. 환자 샘플은 비제한적으로 혈액, 양수, 혈장, 정액, 골수 및 조직 생검물을 포함한다.
또한, 본 발명은 암에 걸린 것으로 의심되는 피검체에서 폴리펩티드의 활성을 측정하는 것을 포함하여 피검체에서 암을 진단하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 폴리펩티드의 활성이 암에 걸린 것으로 의심되지 않는 피검체 중의 폴리펩티드의 활성에 비해 차이가 있는 경우, 상기 피검체는 암에 걸린 것으로 진단된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 환자 샘플에서 암을 검출하는 방법을 제공하며, 여기서 단백질에 대한 항체가 환자 샘플 중의 단백질과 반응하도록 사용된다.
본 발명의 또 다른 일면은 하나 이상의 유전자 및/또는 유전자 생성물의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하여 정상 상태 및 질병 상태를 구별하는 방법이며, 여기서 정상 조직 및 질병 조직의 유전자 발현 및/또는 유전자 생성물 수준이 분석되고, 유전자 및/또는 유전자 생성물의 발현 수준의 변화가 질병 상태를 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 정상 세포에 대한 하나 이상의 유전자의 차별적 발현을 검출하는 것을 포함하여 세포의 표현형을 결정하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 유전자는 정상 세포와 비교하여 차별적으로 발현된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 정상 세포에 대한 하나 이상의 폴리펩티드의 차별적 발현을 검출하는 것을 포함하여 세포의 표현형을 결정하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 단백질은 정상 세포와 비교하여 차별적으로 발현된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 25개 이상 또는 약 40개 이상의 연속 누클레오티드를 지닌 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산 프로브를 제공하고, 환자로부터 세포 샘플을 수득하고, 임의로 실질적으로 세포 전부가 비암성인 제 2 세포 샘플을 제공하고, 상기 핵산 프로브를 엄격한 조건하에서 상기 제 1 및 제 2 세포 샘플 각각의 mRNA와 접촉시키고, (a) 상기 프로브와 제 1 세포 샘플의 mRNA의 하이브리드화 량을 (b) 상기 프로브와 제 2 세포 샘플의 mRNA의 하이브리드화 량과 비교함으로써 환자로부터의 세포의 표현형을 결정하는 방법에 관한 것이며, 여기서 제 2 세포 샘플의 mRNA와의 하이브리드화 량과 비교되는 제 1 세포 샘플의 mRNA와의 하이브리드화 량의 차이가 제 1 세포 샘플 중의 세포의 표현형을 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 환자로부터 단리된 세포 샘플에서 핵산 수준을 측정하기 위한 프로브/프라이머를 포함하는, 암성 세포 또는 조직의 존재를 확인하기 위한 시험 키트를 제공한다. 특정 구체예에서, 키트는 키트의 사용 설명서, 세포를 현탁시키거나 고정시키기 위한 용액, 검출가능한 태그 또는 표지, 핵산이 하이브리드화에 민감해지게 하기 위한 용액, 세포를 용해시키기 위한 용액 또는 핵산의 정제를 위한 용액을 추가로 포함할 수 있다.
한 가지 구체예에서, 본 발명은 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함하는, 암 세포 또는 조직의 존재를 확인하기 위한 시험 키트를 제공한다. 특정 구체예에서, 키트는 키트의 사용 설명서를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 키트는 세포를 현탁시키거나 고정시키기 위한 용액, 검출가능한 태그 또는 표지, 폴리펩티드가 항체의 결합에 대해 민감해지게 하는 용액, 세포를 용해시키기 위한 용액 또는 폴리펩티드의 정제를 위한 용액을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 환자로부터 단리된 세포 샘플에서 핵산의 수준을 측정하기 위한 프로브/프라이머를 포함하는, 암성 세포 또는 조직에서 화합물 또는 치료제의 효능을 모니터하기 위한 시험 키트를 제공한다. 특정 구체예에서, 키트는 키트의 사용 설명서, 세포를 현탁시키거나 고정시키기 위한 용액, 검출가능한 태그 또는 표지, 핵산이 하이브리드화에 민감해지게 하기 위한 용액, 세포를 용 해시키기 위한 용액 또는 핵산의 정제를 위한 용액을 추가로 포함할 수 있다.
한 가지 구체예에서, 본 발명은 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함하는, 암 세포 또는 조직에서 화합물 또는 치료제의 효능을 모니터하기 위한 시험 키트를 제공한다. 특정 구체예에서, 키트는 키트의 사용 설명서를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 키트는 세포를 현탁시키거나 고정시키기 위한 용액, 검출가능한 태그 또는 표지, 폴리펩티드가 항체의 결합에 민감해지게 하기 위한 용액, 세포를 용해시키기 위한 용액 또는 폴리펩티드의 정제를 위한 용액을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 질병 또는 약물 치료를 나타내는 유전자 발현 프로파일로부터 바이오마터 유전자 세트를 선택하는 단계를 포함하여 바이오마커를 확인하는 방법에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 구조물 및 시약에 제한되지 않으며, 그 자체로 가변적일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 것이며, 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구의 범위에 사용된 단수 형태는 명백히 달리 지시되어 있지 않는 한 복수 형태를 포함하는 것으로 인식되어야 한다. 따라서, 예를 들어 "유전자"라 함은 하나 이상의 유전자를 나타내고, 당업자에게 공지된 이들의 등가물 등 을 포함한다.
달리 규정되어 있지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 지닌다. 본원에 기재된 방법, 장치 및 재료와 유사한 임의의 방법, 장치 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료가 이제 기재된다.
본원에 언급된 모든 간행물 및 특허는 예를 들어 이제 기재되는 발명과 관련하여 사용될 수 있는 간행물에 기재된 구조물 및 방법을 설명하고 기술할 목적으로 참조로 본원에 포함된다. 상기 논의되고 본 명세서 전반에 걸쳐 논의된 간행물은 본원의 출원일 전에 개시되었다는 것을 위해서만 제공된다. 본원에 언급된 어떠한 간행물도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 그러한 개시에 앞설 자격이 없다는 것을 시인하는 것으로 해석되지 않아야 한다
정의
편의상, 명세서, 실시예 및 청구의 범위에서 사용된 특정 용어 및 어구의 의미가 하기 제공된다.
질병 세포의 "상응하는 정상 세포" 또는 질병 세포에 "상응하는 정상 세포" 또는 질병 세포의 "정상 대응 세포"라는 어구는 질병 세포의 유형과 동일한 유형의 정상 세포를 의미한다.
어레이 (예를 들어, 마이크로어레이)상의 "어드레스(address)"는 엘리먼트, 예를 들어 올리고누클레오티드가 어레이의 고형 표면에 부착되어 있는 위치를 의미 한다.
본원에 사용된 "효능제"라는 용어는 단백질의 생체활성을 의태(mimic)하거나 상향조절 (예를 들어, 증강 또는 보충)하는 작용제를 의미한다. 효능제는 야생형 단백질 또는 야생형 단백질의 하나 이상의 생체활성을 지닌 이의 유도체일 수 있다. 또한, 효능제는 유전자의 발현을 상향조절하거나 단백질의 하나 이상의 생체활성을 증가시키는 화합물일 수 있다. 또한, 효능제는 폴리펩티드와 또 다른 분자, 예를 들어 표적 펩티드 또는 핵산의 상호작용을 증가시키는 화합물일 수 있다.
본원에 사용된 "증폭"이란 용어는 핵산 서열의 추가의 카피의 생성에 관한 것이다. 예를 들어, 증폭은 당 분야에 널리 공지된 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술을 이용하여 수행될 수 있다 (참조: Dieffenbach, C. W. and G. S. Dveksler (1995) PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.).
본원에 사용된 "길항제"라는 용어는 단백질의 하나 이상의 생체활성을 하향조절 (예를 들어, 제지 또는 억제)하는 작용제를 의미한다. 길항제는 단백질과 또 다른 분자, 예를 들어 표적 펩티드 또는 효소 기질 간의 상호작용을 억제하거나 감소시키는 화합물일 수 있다. 또한, 길항제는 유전자의 발현을 하향조절하거나 존재하는 발현된 단백질의 양을 감소시키는 화합물일 수 있다. 예를 들어, 멀티-키나아제 억제제는 이러한 길항제의 예이다.
본원에 사용된 "항체"란 용어는 전항체(whole antibody), 예를 들어 임의의 이소타입 (IgG, IgA, IgM, IgE 등)의 전항체를 포함하는 것으로 의도되며, 척추동 물 (예를 들어, 포유동물) 단백질과 또한 특이적으로 반응하는 상기 전항체의 단편을 포함한다. 항체는 통상적인 기술을 이용하여 단편화될 수 있고, 단편은 전항체에 대해 상기 설명된 방식과 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 따라서, 상기 용어는 특정 단백질과 선택적으로 반응할 수 있는 단백분해적으로 절단되거나 재조합적으로 제조된 항체 분자의 부분의 분절을 포함한다. 이러한 단백분해 및/또는 재조합 단편의 비제한적 예는 Fab, F(ab')2, Fab', Fv, 및 펩티드 링커에 의해 결합된 V[L] 및/또는 V[H] 도메인을 함유하는 단일 사슬 항체 (scFv)를 포함한다. scFv는 2개 이상의 결합 부위를 형성하도록 공유 결합되거나 비공유 결합될 수 있다. 본 발명은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항체의 그 밖의 정제된 제조물 및 재조합 항체를 포함한다.
"어레이" 또는 "매트릭스"라는 용어는 장치상의 어드레스로 불러낼 수 있는 위치 또는 "어드레스"의 배열을 의미한다. 위치는 2차원 어레이, 3차원 어레이 또는 그 밖의 매트릭스 포맷으로 배열될 수 있다. 위치의 갯수는 수 개 내지 수 백 또는 수 천 개 이상일 수 있다. 가장 중요하게는, 각각의 위치는 완전히 독립적인 반응 부위를 나타낸다. "핵산 어레이"는 핵산 프로브, 예를 들어 유전자의 올리고누클레오티드 또는 보다 큰 부분을 함유하는 어레이를 의미한다. 어레이상의 핵산은 단일 가닥일 수 있다. 프로브가 올리고누클레오티드인 어레이는 "올리고누클레오티드 어레이" 또는 "올리고누클레오티드 칩"으로서 일컬어진다. 본원에서 또한 "바이오칩" 또는 "생물학적 칩"으로서 일컬어지는 "마이크로어레이"는 약 100/cm2 이상 또는 약 1000/cm2 이상의 분리된 영역의 밀도를 지닌 영역들의 어레이이다. 마이크로어레이내의 영역은 전형적인 치수, 예를 들어 약 10 내지 250 μm의 직경을 지니며, 어레이내의 다른 영역과 거의 동일한 거리 만큼 떨어져 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "생물학적 활성," "생체활성," "활성" 또는 "생물학적 기능"이란 폴리펩티드 (이의 천연 형태이든 변성된 형태이든) 또는 이의 임의의 서브시퀀스(subsequence)에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 발휘되는 이펙터 또는 항원 기능을 의미한다. 생물학적 활성은 폴리펩티드에 결합하는 것, 다른 단백질 또는 분자에 결합하는 것, DNA 결합 단백질로서의 활성, 전사 조절인자로서의 활성, 손상된 DNA에 결합하는 능력 등을 포함한다. 생체활성은 해당 폴리펩티드에 직접적으로 영향을 미침으로써 조정될 수 있다. 대안적으로, 생체활성은 폴리펩티드의 수준을 조정함으로써, 예를 들어 상응하는 유전자의 발현을 조정함으로써 변경될 수 있다.
본원에 사용된 "생물학적 샘플"이란 용어는 생물체로부터 수득된 샘플 또는 생물체의 성분 (예를 들어, 세포)로부터 수득된 샘플을 의미한다. 샘플은 임의의 생물학적 조직 또는 유체일 수 있다. 샘플은 환자로부터 유래된 샘플인 "임상 샘플"일 수 있다. 이러한 샘플은 비제한적으로 타액, 혈액, 혈액 세포 (예를 들어, 백혈구), 조직 또는 미세침 (fine needle) 생검 샘플, 소변, 복막액, 및 흉막액, 또는 이로부터의 세포를 포함한다. 생물학적 샘플은 또한 조직의 절편, 예를 들어 조직학용으로 취해진 동결된 절편을 포함할 수 있다.
"바이오마커" 또는 "마커"는 광범위한 세포내 및 세포외 사건 뿐만 아니라 생물체 전반에 걸친 생리학적 변화를 포함한다. 바이오마커는 본질적으로 세포 기능의 임의의 일면을 나타낼 수 있는데, 이러한 일면은 예를 들어 비제한적으로 신호전달 분자, 전사 인자, 대사산물, 유전자 전사체의 생성 수준 또는 생성률 뿐만 아니라 번역후 수식이다. 바이오마커는 전사체 수준의 전체 게놈 분석 또는 단백질 수준 및/또는 변형의 전체 프로테오솜 분석을 포함할 수 있다.
바이오마커는 또한 처리되지 않은 질병 세포와 비교하여 질병에 걸린 피검체의 화합물 처리된 질병 세포에서 상향조절되거나 하향조절되는 유전자 또는 유전자 생성물을 의미할 수 있다. 즉, 유전자 또는 유전자 생성물은 이것이 소분자의 효능을 확인하거나, 예측하거나, 검출하기 위해 임의로 다른 유전자 또는 유전자 생성물과 함께 사용될 수 있도록 처리된 세포에 대해 충분히 특이적이다. 따라서, 바이오마커는 질병 세포에서의 화합물의 효능 또는 화합물에 의한 처리에 대한 이러한 질병 세포의 반응의 특징이 되는 유전자 또는 유전자 생성물이다.
누클레오티드 서열은 2개의 서열의 염기 각각이 매칭되는 경우, 즉, 왓슨-크릭 염기쌍을 형성할 수 있는 경우에 또 다른 누클레오티드 서열에 "상보적"이다. "상보적 가닥"이라는 용어는 "상보체"라는 용어와 상호교환적으로 사용된다. 핵산 가닥의 상보체는 코딩 가닥의 상보체 또는 비코딩 가닥의 상보체일 수 있다.
"유전자의 검출 작용제"란 유전자 또는 이와 관련된 그 밖의 생물학적 분자, 예를 들어 유전자로부터 전사되는 RNA 또는 유전자에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드를 특이적으로 검출하는 데에 사용될 수 있는 작용제를 의미한다. 예시적인 검출 작용제는 유전자에 상응하는 핵산에 하이브리드화하는 핵산 프로브 및 항체이다.
예를 들어 정상 세포와 질병 세포 간의 "차별적 유전자 발현 패턴"은 정상 세포와 질병 세포 간의 유전자 발현의 차이를 반영하는 패턴을 의미한다. 또한, 차별적 유전자 발현 패턴은 하나의 시점에서의 세포 및 또 다른 시점에서의 세포 사이에서 수득될 수 있거나, 화합물과 인큐베이션되거나 접촉되는 세포 및 화합물과 인큐베이션되거나 접촉된 바 없는 세포 사이에서 수득될 수 있다.
"암"이란 용어는 비제한적으로 고형 종양, 예를 들어 유방암, 호흡기암, 뇌암, 생식기암, 소화관암, 요로암, 안암 (eye cancer), 간암, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 이들의 원격 전이를 포함한다. 이러한 용어는 또한 림프종, 육종 및 백혈병을 포함한다.
유방암의 예는 비제한적으로 침윤성 관암종, 침윤성 소엽성 암종, 원위치(in situ) 관암종 및 원위치 소엽성 암종을 포함한다.
호흡기암의 예는 비제한적으로 소세포 및 비소세포 폐 암종 뿐만 아니라 기관지 선종 및 흉막폐 모세포종을 포함한다.
뇌암의 예는 비제한적으로 뇌간 및 히포프탈믹(hypophtalmic) 신경아교종, 소뇌 및 대뇌 성상세포종, 수모세포종, 상의세포종 뿐만 아니라 신경외배엽 및 송과체(pineal) 종양을 포함한다.
남성 생식기의 종양은 비제한적으로 전립선암 및 고환암을 포함한다. 여성 생식기의 종양은 비제한적으로 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 질암 및 외음부암 뿐만 아니라 자궁 육종을 포함한다.
소화관 종양은 비제한적으로 항문암, 결장암, 결장직장암, 식도암, 담낭암, 위암, 췌장암, 직장암, 소장암 및 침샘암을 포함한다.
요로 종양은 비제한적으로 방광암, 음경암, 신장암, 신우암, 요관암 및 요도암을 포함한다.
안암은 비제한적으로 안내 흑색종 (intraocular melanoma) 및 망막모세포종을 포함한다.
간암의 예는 비제한적으로 간세포암종 (섬유층판형 변이를 지니거나 지니지 않는 간세포 암종), 담관암종 (간내 담관 암종) 및 혼합형 간세포 담관암종을 포함한다.
피부암은 비제한적으로 편평세포 암종, 카포시 육종, 악성 흑색종, 메르켈(Merkel) 세포 피부암 및 비-흑색종 피부암을 포함한다.
두경부암은 비제한적으로 후두암/ 하인두암/ 코인두암/ 입인두암, 및 입술 및 구강 암을 포함한다.
림프종은 비제한적으로 AIDS 관련된 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨 병 및 중추신경계 림프종을 포함한다.
육종은 비제한적으로 연질 조직 육종, 골육종, 악성 섬유성 조직구종, 림프육종 및 횡문근육종을 포함한다.
백혈병은 비제한적으로 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수원성 백혈병 및 털세포 백혈병을 포함한다.
"암 질병 세포"란 암에 걸린 피검체에 존재하는 세포를 의미한다. 즉, 이는 정상 세포의 변형된 형태이고 암에 걸리지 않은 피검체에 존재하지 않는 세포, 또는 암에 걸리지 않은 피검체에 비해 암에 걸린 피검체에 현저하게 많거나 적은 수로 존재하는 세포이다.
"등가의(equivalent)"란 용어는 기능적으로 등가의 폴리펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 것으로 이해된다. 등가의 누클레오티드 서열은 하나 이상의 누클레오티드 치환, 첨가 또는 결실에 의해 달라지는 서열, 예를 들어 대립형질 변이체를 포함할 수 있으며, 따라서 유전 코드의 축중(degeneracy)으로 인해 표 1에 언급된 핵산의 누클레오티드 서열과 달라지는 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 세포의 "유전자 발현 프로파일" 및 "핑거프린트(fingerprint)"와 상호교환적으로 사용되는 "발현 프로파일"이란 용어는 세포에서 하나 이상의 유전자의 mRNA 수준을 나타내는 값들의 세트를 의미한다. 발현 프로파일은 예를 들어 적어도 약 2개의 유전자, 적어도 약 5개의 유전자, 적어도 약 10개의 유전자, 또는 약 50개, 100개, 200개 이상의 유전자의 발현 수준을 나타내는 값을 포함할 수 있다. 또한, 발현 프로파일은 다수의 세포 및 조건에서 유사한 수준으로 발현되는 유전자 (예를 들어, GAPDH와 같은 하우스킵핑(housekeeping) 유전자)의 mRNA 수준을 포함할 수 있다.
"유전자"라는 용어는 폴리펩티드 또는 전구체의 생성을 위해 필요한 제어 및 코딩 서열을 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 폴리펩티드는 전장 코딩 서열 또는 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 엔코딩될 수 있다. 유전자는 전체적으로 또는 부분적으로 식물, 진균, 동물, 세균 게놈 또는 에피솜, 진핵, 핵 또는 플라스미드 DNA, cDNA, 바이러스 DNA 또는 화학 합성된 DNA를 포함하는 당 분야에 공지된 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 유전자는 발현 생성물의 생물학적 활성 또는 화학 구조, 발현율, 또는 발현 제어 방식에 영향을 미칠 수 있는 코딩 또는 비번역 영역에서 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 이러한 변형은 비제한적으로 하나 이상의 누클레오티드의 돌연변이, 삽입, 결실 및 치환를 포함한다. 이러한 유전자는 간섭되지 않은 코딩 서열을 구성할 수 있거나 적절한 스플라이스 접점 (splice junction)에 의해 결합된 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다.
"하이브리드화"는 핵산 가닥이 염기쌍형성을 통해 상보적 가닥과 결합하게 하는 임의의 방법을 의미한다. 예를 들어, 2개의 단일 가닥 핵산은 이들이 이중 가닥 이중체(duplex)를 형성하는 경우 "하이브리드화"한다. 이중 가닥의 영역은 단일 가닥 핵산 둘 모두 또는 이 중 하나의 전장, 또는 하나의 단일 가닥 핵산의 전부 및 나머지 단일 가닥 핵산의 서브시퀀스(subsequence)를 포함할 수 있거나, 이중 가닥의 영역은 각각의 핵산의 서브시퀀스를 포함할 수 있다. 또한, 하이브리드화는 특정 미스매치를 함유하는 이중체의 형성을 포함하는데, 단, 2개의 가닥은 여전히 이중 가닥 나선을 형성하고 있다. "엄격한 하이브리드화 조건"은 본질적으로 특이적인 하이브리드화를 일으키는 하이브리드화 조건을 의미한다.
DNA 또는 RNA와 같은 핵산과 관련하여 본원에 사용된 "단리된"이란 용어는 각각 천연 거대분자원에 존재하는 그 밖의 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 의미한다. 본원에 사용된 "단리된"이란 용어는 또한 재조합 DNA 기술에 의해 생성되는 경우 실질적으로 세포성 물질, 바이러스 물질, 배지가 없는 핵산 또는 펩티드를 의 미하며, 화학 합성되는 경우 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 핵산 또는 펩티드를 의미한다. 더욱이, "단리된 핵산"은 단편으로서 자연 발생되지 않고 천연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함할 수 있다. 또한, "단리된"이란 용어는 본원에서 폴리펩티드와 관련하여 사용되며, 이는 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "표지" 및 "검출가능한 표지"는 비제한적으로 방사성 동위원소, 형광단, 화학발광 부분, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 염료, 금속 이온, 리간드 (예를 들어, 비오틴 또는 합텐) 등을 포함하는 검출될 수 있는 분자를 의미한다. "플루오레서(fluorescer)"라는 용어는 검출가능한 범위에서 형광을 나타낼 수 있는 물질 또는 이의 부분을 의미한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표지의 특정 예는 플루오레세인, 로다민, 단실(dansyl), 움벨리페론(umbelliferone), 텍사스 레드 (Texas red), 루미놀, NADPH, 알파 - 베타 -갈락토시다아제, 및 양고추냉이 퍼옥시다아제를 포함한다.
"발현 수준"이란 어구는 세포에서 유전자에 의해 엔코딩된 mRNA 뿐만 아니라 pre-mRNA 신생 전사체(들), 전사체 프로세싱(processing) 중간체, 성숙 mRNA(들) 및 분해 생성물의 수준을 의미한다. 또한, "발현 수준"이란 어구는 세포내의 단백질 또는 폴리펩티드의 수준을 의미한다.
본원에 사용된 "핵산"이란 용어는 폴리누클레오티드, 예를 들어 데옥시리보핵산 (DNA)을 의미하며, 적절한 경우 리보핵산 (RNA)을 의미한다. 이러한 용어는 또한 등가물로서 핵산 유사체로부터 생성된 RNA 또는 DNA의 유사체를 포함하며, 기 재되는 구체예에 적용가능한 경우 단일 가닥 (센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리누클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 염색체, cDNA, mRNA, rRNA 및 EST가 핵산으로서 언급될 수 있는 분자의 대표적인 예이다.
"유전자에 상응하는 핵산"이란 어구는 상기 유전자를 검출하기 위해 사용될 수 있는 핵산, 예를 들어 상기 유전자에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 핵산을 의미한다.
"RNA로부터 유래된 핵산 샘플"이란 어구는 RNA로부터 합성될 수 있는 하나 이상의 핵산 분자 (예를 들어, RNA 또는 DNA)를 의미하며, PCR (예를 들어, RT-PCR)을 이용하는 방법으로부터 생성된 DNA를 포함한다.
본원에 사용된 "올리누클레오티드"란 용어는 예를 들어 약 10개 내지 약 1000개의 누클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에 사용된 올리고누클레오티드는 길이가 약 15개 내지 약 150개인 누클레오티드이거나 길이가 약 150개 내지 약 1000개인 누클레오티드일 수 있다. 이러한 올리고누클레오티드는 천연 올리고누클레오티드 또는 합성 올리고누클레오티드일 수 있다. 올리고누클레오티드는 포스포르아미디트 방법 (Beaucage and Carruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-62, 1981), 또는 트리에스테르 방법 (Matteucci, et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185, 1981), 또는 당 분야에 공지된 다른 화학적 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에 사용된 "환자" 또는 "피검체"라는 용어는 포유동물 (예를 들어, 인간 및 동물)을 포함한다.
"동일성 퍼센트"라는 용어는 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 누클레오티드 서열 간의 서열 동일성을 의미한다. 예를 들어, 2개의 서열 간의 동일성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각각의 서열 중의 특정 위치를 비교함으로써 측정될 수 있다. 비교된 서열 중의 등가의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유되어 있는 경우, 분자들은 그 위치에서 동일하다. 등가의 위치가 동일하거나 유사한 아미노산 잔기 (예를 들어, 입체적 및/또는 전자적 성질에서 유사함)에 의해 점유되어 있는 경우, 분자들은 그 위치에서 상동 (유사)인 것으로 언급될 수 있다. 상동성, 유사성 또는 동일성 퍼센트로서 표현하는 것은 비교된 서열에 의해 공유되는 위치에서 동일하거나 유사한 아미노산 갯수에 따름을 의미한다. 예를 들어 FASTA, BLAST, 또는 ENTREZ를 포함하는 다양한 정렬 알고리듬 및/또는 프로그램이 이용될 수 있다. FASTA 및 BLAST는 GCG 서열 분석 패키지 (University of Wisconsin, Madison, Wis.)의 일부로서 이용가능하고, 예를 들어 디폴트 셋팅과 함께 이용될 수 있다. ENTREZ는 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD)을 통해 이용가능하다. 한 가지 구체예에서, 2개의 서열의 동일성 퍼센트는 1의 갭 중량을 사용하는 GCG 프로그램에 의해 측정될 수 있다 (예를 들어, 각각의 아미노산 갭은 이것이 2개의 서열 간에 하나의 아미노산 또는 누클레오티드 미스매치가 있는 것처럼 가중됨). 정렬을 위한 다른 기술은 메쏘즈 인 엔자이몰로지 [Methods in Enzymology] (vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA)에 설명되어 있다. 서열에서 갭을 허용하는 정렬 프로그램이 서열을 정렬하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 스미쓰-워터맨 (Smith-Waterman)이 서열 정렬에서 갭을 허용하는 한 가지 알고리듬 유형이다 (참조: Meth. MoI. Biol. 70:173-187, 1997). 또한, 니들맨(Needleman) 및 운쉬(Wunsch) 정렬 방법을 이용하는 GAP 프로그램이 서열을 정렬하기 위해 이용될 수 있다. 또 다른 검색 방법은 MPSRCH 소프트웨어를 사용하는 것이며, 이는 MASPAR 컴퓨터로 실행된다. MPSRCH는 대규모 병렬 컴퓨터상에 서열을 기록하기 위해 스미쓰-워터맨 알고리듬을 사용한다. 이러한 방법은 멀리 떨어져 있는 관련 매치를 검출하는 능력을 개선시키고, 특히 작은 갭 및 누클레오티드 서열 오류를 묵인한다. 핵산 엔코딩된 아미노산 서열은 단백질 및 DNA 데이터베이스 둘 모두를 검색하기 위해 사용될 수 있다. 개개의 서열을 함유하는 데이터베이스는 메쏘즈 인 엔자이몰로지 (ed. Doolittle, 상기 참조)에 설명되어 있다. 데이터베이스는 예를 들어 Genbank, EMBL, 및 일본의 DNA 데이터베이스 (DDBJ)를 포함한다.
본원에 사용된 어레이에 부착된 핵산 또는 다른 분자는 "프로브" 또는 "포획 프로브 (capture probe)"로서 일컬어진다. 어레이가 하나의 유전자에 상응하는 수 개의 프로브를 함유하는 경우, 이들 프로브는 "유전자-프로브 세트 (gene-probe set)"로서 일컬어진다. 유전자-프로브 세트는 예를 들어 약 2개 내지 약 20개의 프로브, 약 2개 내지 약 10개의 프로브, 또는 약 5개의 프로브로 구성될 수 있다.
세포의 생물학적 상태의 "프로파일"은 약물 처리에 반응하여 변화하는 것으 로 알려져 있는 세포의 다양한 구성요소의 수준 및 세포의 생물학적 상태의 그 밖의 변동을 의미한다. 세포의 구성요소는 예를 들어 RNA의 수준, 단백질 존재 수준, 또는 단백질 활성 수준을 포함한다.
"단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"라는 용어는 유전자 생성물을 일컫는 경우에 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
2개의 프로파일에서의 유전자의 발현 수준이 충분히 유사하여 그러한 유사성이 공통적인 특성, 예를 들어 동일한 세포 유형을 나타내는 경우, 하나의 세포에서의 발현 프로파일은 또 다른 세포에서의 발현 프로파일과 "유사"하다.
본원에 사용된 "소분자"는 약 5 kD 미만 또는 약 4 kD 미만의 분자량을 지닌 물질을 의미한다. 소분자는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티도미메틱, 탄수화물, 지질, 또는 그 밖의 유기 또는 무기 분자일 수 있다. 다수의 제약 회사가 생체활성을 조정하는 화합물을 확인하기 위해 본 발명의 검정 중 어느 하나를 이용하여 스크리닝될 수 있는 화학 및/또는 생물학적 혼합물, 종종 진균, 세균 또는 조류(algal) 추출물의 광범위한 라이브러리를 보유하고 있다.
주형 핵산의 표적 부위에 대한 프로브의 "특이적 하이브리드화"라는 용어는 하이브리드화 신호가 명료하게 해석될 수 있게 하도록 프로브가 현저하게 표적에 하이브리드화하는 것을 의미한다. 본원에 추가로 설명되는 바와 같이, 특이적 하이브리드화를 일으키는 조건은 상동성 영역의 길이, 그러한 영역의 GC 함량 및 하이브리드의 융점 ("Tm")에 따라 달라진다. 따라서, 하이브리드화 조건은 하이브리드화 용액 및 세척액의 염 함량, 산도 및 온도면에서 달라질 수 있다.
폴리펩티드의 "변이체"란 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경된 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 변이체는 "보존적" 변화를 지닐 수 있으며, 여기서 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 지닌다 (예를 들어, 류신이 이소류신으로 대체됨). 또한, 변이체는 "비보존적" 변화를 지닐 수 있다 (예를 들어, 글리신이 트립토판으로 대체됨). 유사한 중요치 않은 변화는 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 어느 아미노산 잔기가 생물학적 또는 면역학적 활성을 파괴하지 않고 치환되거나, 삽입되거나, 결실될 수 있는 지를 결정하는 것에 대한 지침은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 LASERGENE 소프트웨어 (DNASTAR)를 사용하여 확인될 수 있다.
"변이체"라는 용어는 폴리누클레오티드 서열과 관련하여 사용된 경우에 특정 유전자 또는 이의 코딩 서열의 변이체와 관련된 폴리누클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 정의는 예를 들어 "대립형질", "스플라이스", "종" 또는 "다형성(polymorphic)" 변이체를 포함할 수 있다. 스플라이스 변이체는 기준 부자에 대해 현저한 동일성을 지닐 수 있지만, mRNA 프로세싱 동안 엑손의 교호적 스플라이싱으로 인해 일반적으로 보다 많거나 적은 수의 폴리누클레오티드를 지닐 것이다. 상응하는 폴리펩티드는 추가의 기능적 도메인을 지니거나 도메인을 지니지 않을 수 있다. 종 변이체는 종 마다 달라지는 폴리누클레오티드 서열이다. 생성된 폴리펩티드는 일반적으로 서로에 대해 현저한 아미노산 동일성을 지닐 것이다. 다형성 변이체는 주어진 종의 개체들 간의 특정 유전자의 폴리누클레오티드 서열이 변이된 것이다. 또한, 다형성 변이체는 폴리누클레오티드 서열이 하나의 염기 만 큼 달라지는 "단일 누클레오티드 다형성" (SNP)를 포함할 수 있다. SNP의 존재는 예를 들어 특정 집단, 질병 상태 또는 질병 상태에 대한 경향을 나타낼 수 있다.
유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 마이크로어레이
일반적으로, 마이크로어레이를 사용하여 발현 프로파일을 측정하는 것은 하기 단계를 포함한다: (a) 피검체로부터 mRNA 샘플을 수득하고, 이로부터 표지된 핵산 ("표적 핵산" 또는 "표적")을 제조하는 단계; (b) 표적 핵산이 예를 들어 하이브리드화 또는 특이적 결합에 의해 어레이상의 상응하는 프로브에 결합하게 하기에 충분한 조건하에서 표적 핵산을 어레이와 접촉시키는 단계; (c) 임의로, 어레이로부터 결합되지 않은 표적을 제거하는 단계; (d) 결합된 표적을 검출하는 단계; 및 (e) 예를 들어 컴퓨터 기반 분석 방법을 이용하여 결과를 분석하는 단계. 본원에 사용된 "핵산 프로브" 또는 "프로브"는 어레이에 부착된 핵산이며, "표적 핵산"은 어레이에 하이브리드화되는 핵산이다. 이들 단계 각각은 하기 보다 상세히 설명된다.
핵산 표본은 "침윤성" 또는 "비침윤성" 샘플채취 수단을 사용하여 시험하려는 개체로부터 수득될 수 있다. 샘플채취 수단은 이것이 동물 (뮤린, 인간, 양과, 말과, 소과, 돼지, 개과 또는 고양이과 동물을 포함함)의 피부 또는 장기내에서 이로부터 핵산을 수집하는 것을 포함하는 경우 "침윤성"인 것으로 여겨진다. 침윤성 방법의 예는 혈액 수집, 정액 수집, 침(needle) 생검, 흉막 흡인, 탯줄 생검 등을 포함한다. 이들 방법의 예는 김(Kim) 등의 문헌 [J. Virol. 66:3879-3882, 1992]; 비스바스(Biswas) 등의 문헌 [Ann. NY Acad. Sd. 590:582-583, 1990]; 및 비스바 스(Biswas) 등의 문헌 [J. Clin. Microbiol. 29:2228-2233, 1991]에 논의되어 있다.
대조적으로, "비침윤성" 샘플채취 수단은 핵산 분자가 동물의 내부 또는 외부 표면으로부터 회수되는 수단이다. 이러한 "비침윤성" 샘플채취 수단의 예는 예를 들어 "면봉법(swabbing)", 눈물, 타액, 소변, 대변 물질, 땀, 모발 등의 수집을 포함한다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 시험하려는 피검체로부터의 하나 이상의 세포가 수득되고, RNA가 세포로부터 단리된다. 한 가지 구체예에서, 말초혈 백혈구 (PBL) 세포의 샘플이 피검체로부터 수득된다. 또한, 피검체로부터 세포 샘플을 수득한 후, 요망되는 세포 유형에 대해 샘플을 농축시키는 것이 가능하다. 예를 들어, 세포는 다양한 기술, 예를 들어 요망되는 세포 유형의 세포 표면상의 에피토프에 결합하는 항체를 사용한 단리를 이용하여 다른 세포로부터 단리될 수 있다. 요망되는 세포가 고형 조직에 존재하는 경우, 특정 세포가 예를 들어 미세절개 또는 레이저 포획 미세절개 (LCM)에 의해 절개될 수 있다 (참조: Bonner, et al., Science 278:1481, 1997; Emmert-Buck, et al., Science 274:998, 1996; Fend, et al., Am. J. Path. 154:61, 1999; and Murakami, et al., Kidney Int. 58:1346, 2000).
RNA는 다양한 방법, 예를 들어 구아니듐 티오시아네이트 용해에 이은 CsCl 원심분리 (Chirgwin, et al., Biochemistry 18:5294-5299, 1979)에 의해 조직 또는 세포 샘플로부터 추출될 수 있다. 단일 세포로부터의 RNA는 단일 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제조하기 위한 방법에 설명된 바와 같이 수득될 수 있다 (참조: Dulac, Curr. Top. Dev. Biol. 36:245, 1998; Jena, et al., J. Immunol. Methods 190:199, 1996).
RNA 샘플은 특정 종에 대해 추가로 농축될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 예를 들어 poly(A)+ RNA는 RNA 샘플로부터 단리될 수 있다. 특히, poly-T 올리고누클레오티드는 mRNA에 대한 친화성 리간드로서 기능하도록 고체 지지체상에 고정될 수 있다. 이를 위한 키트는 시판되는데, 예를 들어 메시지메이커 키트(MessageMaker kit) (Life Technologies, Grand Island, NY)가 있다.
한 가지 구체예에서, RNA 집단은 관심있는 서열, 예를 들어 표 1에 기재된 유전자 (예를 들어, 서열확인번호 1 내지 18)에 대해 농축될 수 있다. 농축은 예를 들어 프라이머 특이적 cDNA 합성, 또는 cDNA 합성 및 주형 유도된 시험관내 전사를 기반으로 한 다수의 선형 증폭 라운드(round)에 의해 달성될 수 있다 (참조: Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9717, 1989; Dulac, et al., 상기 언급되어 있음; Jena, et al., 상기 언급되어 있음).
특정 종 또는 서열이 농축되거나 농축되지 않은 RNA의 집단은 추가로 증폭될 수 있다. 이러한 증폭은 하나의 세포 또는 수 개의 세포로부터의 RNA를 사용하는 경우 특히 중요하다. 다양한 증폭 방법이 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한데, 이러한 방법은 예를 들어 PCR; 리가아제 연쇄 반응 (LCR) (참조: Wu and Wallace, Genomics 4:560, 1989; Landegren, et al., Science 241:1077, 1988); 자체-유지 (self-sustained) 서열 복제 (SSR) (참조: Guatelli, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874, 1990); 핵산 기반 서열 증폭 (NASBA) 및 전사 증폭 (참조: Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173, 1989)을 포함한다. PCR 기술을 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (참조: PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, N.Y., N.Y., 1992); 문헌 [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications] (eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); (Mattila, et al., Nucleic Acids Res. 19:4967, 1991); 엑케르트(Eckert) 등의 문헌 [PCR Methods and Applications 1:17, 1991]; PCR (eds. McPherson, et al., IRL Press, Oxford); 및 미국 특허 번호 4,683,202). 증폭 방법은 예를 들어 오야마(Ohyama) 등의 문헌 [BioTechniques 29:530, 2000]; 루오(Luo) 등의 문헌 [Nat. Med. 5:117, 1999]; 헤지(Hegde) 등의 문헌 [BioTechniques 29:548, 2000]; 카챠르미나(Kacharmina) 등의 문헌 [Meth. Enzymol. 303:3, 1999]; 리베세이(Livesey) 등의 문헌 [Curr. Biol. 10:301, 2000]; 스피린(Spirin) 등의 문헌 [Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 40:3108, 1999]; 및 사카이(Sakai) 등의 문헌 [Anal. Biochem. 287:32, 2000]에 기재되어 있다. 또한, RNA 증폭 및 cDNA 합성은 원위치에서 세포에서 수행될 수 있다 (참조: Eberwine, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3010, 1992).
일반적으로, 표적 분자는 표적 분자가 마이크로어레이에 하이브리드화하는 것을 검출할 수 있도록 표지된다. 즉, 프로브는 신호 생성 시스템의 일원을 포함할 수 있으며, 이로써 직접 검출될 수 있거나 신호 생성 시스템의 하나 이상의 추 가 일원과의 병합적 작용을 통해 검출될 수 있다. 직접 검출될 수 있는 표지의 예는 일반적으로 공유 결합에 의해 프로브의 부분, 예를 들어 누클레오티드 단량체 단위 (예를 들어, 프라이머의 dNMP)내로, 또는 프로브 분자의 기능적 부분에 결합될 수 있는 검출가능한 표지의 광활성 또는 화학적 활성 유도체내로 혼입되는 동위원소 및 형광 부분을 포함한다.
핵산은 RNA의 농축 및/또는 증폭 동안 또는 후에 표지될 수 있다. 예를 들어, 역전사는 검출가능한 표지에 컨쥬게이션된 dNTP, 예를 들어 형광 표지된 dNTP의 존재하에서 수행될 수 있다. 또 다른 구체예에서, cDNA 또는 RNA 프로브는 검출가능한 표지의 부재하에서 합성될 수 있고, 후속하여 비오티닐화된 dNTP 또는 rNTP의 혼입 또는 다소 유사한 수단 (예를 들어, 비오틴의 소랄렌 유도체를 RNA에 광가교시키는 것)에 이은 표지된 스트렙타비딘 (예를 들어, 피코에리트린-컨쥬게이션된 스트렙타빈) 또는 등가물의 첨가에 의해 표지될 수 있다.
관심있는 형광 부분 또는 표지는 쿠마린 및 이의 유도체 (예를 들어, 7-아미노-4-메틸쿠마린, 아미노쿠마린); 보디피(bodipy) 염료, 예를 들어 보디피 FL 및 케스케이드 블루 (cascade blue); 플루오레세인 및 이의 유도체 (예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 오레곤 그린 (Oregon green)); 로다민 염료 (예를 들어, 텍사스 레드, 테트라메틸로다민); 에오신 및 에리트로신; 시아닌 염료 (예를 들어, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7); 플루오르엑스(FluorX), 란탄족 이온의 마크로시클릭 킬레이트 (예를 들어, 퀀텀 다이 (quantum dye™)); 형광 에너지 전달 염료, 예를 들어 티아졸 오렌지-에티듐 이종이량체, TOTAB, 단실 등을 포함한 다. 본 발명의 장치 또는 검정에서 바람직하게 검출되는 엘리먼트에 결합하기 위한 작용기를 지니거나 이러한 작용기를 혼입하도록 변형될 수 있는 개개의 형광 화합물이 또한 이용될 수 있다 (참조: Kricka, 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press San Diego, Calif.).
화학발광 표지는 루시페린 및 2,3-디히드로프탈라진디온, 예를 들어 루미놀을 포함한다.
또한, 표지는 검출가능한 신호를 제공하도록 동일한 시스템의 하나 이상의 추가 일원과 협력하여 작용하는 신호 생성 시스템의 일원일 수 있다. 이러한 표지의 예로는 특정 결합 쌍의 일원, 예를 들어 비오틴, 플루오레세인, 디곡시게닌, 항원, 다가 양이온, 킬레이터 그룹 등과 같은 리간드이다. 일원은 신호 생성 시스템의 추가의 일원에 특이적으로 결합할 수 있고, 추가의 일원은 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 제공할 수 있는데, 이의 예로는 기질을 색원체성 생성물로 전환시킬 수 있는 효소 부분 또는 형광 부분에 컨쥬게이션된 항체 (예를 들어, 알칼리 포스파타아제 컨쥬게이트 항체 등)가 있다.
관심있는 추가의 표지는 이것과 결합되는 프로브가 표적 분자에 특이적으로 결합된 경우에만 신호를 제공하는 표지를 포함한다. 이러한 표지는 티아기(Tyagi) 및 크라머(Kramer)의 문헌 [Nature Biotech. 14:303, 1996] 및 EP 0 070 685 B1에 기재된 "분자 비콘 (molecular beacons)"을 포함한다. 관심있는 그 밖의 표지는 미국 특허 번호 5,563,037, WO 97/17471 및 WO 97/17076에 기재된 것들을 포함한다.
다른 구체예에서, 표적 핵산은 표지되지 않을 수 있다. 이러한 경우, 하이브리드화는 예를 들어 플라스몬 공명에 의해 측정될 수 있다 (참조: Thiel, et al. Anal. Chem. 69:4948, 1997).
한 가지 구체에에서, 표적 핵산의 다수 (예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상)의 세트가 표지되고, 하나의 하이브리드화 반응에서 사용된다 ("멀티플렉스(multiplex)" 분석). 예를 들어, 핵산의 하나의 세트는 하나의 세포로부터의 RNA에 상응하고, 핵산의 또 다른 세트는 또 다른 세포로부터의 RNA에 상응할 수 있다. 핵산의 다수의 세트가 상이한 표지, 예를 들어 구별될 수 있도록 독특한 방출 스펙트럼을 지니는 상이한 형광 표지 (예를 들어, 플루오레세인 및 로다민)로 표지될 수 있다. 그 후, 상기 세트는 혼합되고, 하나의 마이크로어레이에 동시에 하이브리드화될 수 있다 (참조: Shena, et al., Science 270:467-470, 1995).
다수의 표적 핵산을 하나의 어레이에 하이브리드화시키는 경우 사용되는 구별가능한 표지의 예는 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 2개 이상의 상이한 방출 파장 형광 염료, 예를 들어 Cy3 및 Cy5; 형광 단백질과 염료의 배합물, 예를 들어 피코에리트린과 Cy5; 상이한 방출 에너지를 지닌 2개 이상의 동위원소, 예를 들어 32P 및 33P; 상이한 산란 스펙트럼을 지닌 금 또는 은 입자; 온도, pH, 추가 화학 작용제에 의한 처리 등과 같은 상이한 처리 조건하에서 신호를 생성시키거나, 처리 후 다양한 시점에서 신호를 생성시키는 표지를 포함한다. 신호 생성을 위해 하나 이상의 효소가 사용되면 효소의 상이한 기질 특이성을 기초로 하여 더욱 광범위한 구별가능한 표지를 사용할 수 있게 해준다 (예를 들어, 알칼리 포스파타아제/퍼옥시다아제).
표지된 핵산의 특성은 어레이에 하이브리드화시키기 전에 평가될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 이를 위해 애피메트릭스(Affymetrix) (Santa Clara, CA)로부터의 진칩® 테스트3 어레이 (GeneChip® Test3 Array)가 사용될 수 있다. 이러한 어레이는 포유동물을 포함하는 수 가지 생물체로부터의 특징화된 유전자의 서브셋을 대표하는 프로브를 함유한다. 따라서, 표지된 핵산 샘플의 특성은 샘플의 분획을 어레이에 하이브리드화시킴으로써 측정될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 마이크로어레이는 소분자 효능의 특징이 되는 유전자의 하나 이상의 프로브를 포함한다. 한 가지 구체에에서, 마이크로어레이는 암에서 상향조절되는 유전자 및 암에서 하향조절되는 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에 상응하는 프로브를 포함한다. 마이크로어레이는 예를 들어 적어도 2가지, 적어도 5가지, 적어도 10가지, 적어도 100가지 또는 그 이상의 소분자 효능의 특징에 상응하는 프로브를 포함할 수 있다. 마이크로어레이는 표 1에 기재된 각각의 유전자 또는 유전자 생성물에 상응하는 프로브를 포함할 수 있다.
마이크로어레이상의 각각의 유전자에 상응하는 하나 또는 그 이상의 프로브가 존재할 수 있다. 예를 들어, 마이크로어레이는 하나의 유전자에 상응하는 2개 내지 20개의 프로브 또는 약 5개 내지 10개의 프로브를 함유할 수 있다. 프로브는 소분자 효능의 특징이 되는 유전자의 전장 RNA 서열 또는 이의 상보서열에 상응할 수 있거나, 프로브는 특이적 하이브리드화를 가능하게 하기에 충분한 길이를 지닌 상기 서열의 부분에 상응할 수 있다. 이러한 프로브는 약 50개 내지 약 100개, 200개, 500개 또는 1000개의 누클레오티드를 포함하거나 1000개가 넘는 누클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 추가로 설명되는 바와 같이, 마이크로어레이는 약 10개 내지 50개의 누클레오티드, 약 15개 내지 30개의 누클레오티드, 또는 약 20개 내지 25개의 누클레오티드로 구성된 올리고누클레오티드 프로브를 함유할 수 있다. 프로브는 단일 가닥일 수 있고, 요망되는 수준의 서열 특이적 하이브리드화를 제공하기 위해 이의 표적에 대해 충분한 상보성을 지닐 것이다.
전형적으로, 본 발명에 사용되는 어레이는 cm2 당 100개 이상의 상이한 프로브의 부위 밀도 (site density)를 지닌다. 어레이는 예를 들어, 500/cm2 이상, 약 1000/cm2 이상, 또는 약 10,000/cm2 이상의 부위 밀도를 지닐 수 있다. 어레이는 예를 들어 하나의 기판상에 100개 이상의 상이한 프로브, 약 1000개 이상의 상이한 프로브, 약 10,000개 이상의 상이한 프로브, 또는 100,000개 이상의 상이한 프로브를 지닐 수 있다.
다수의 상이한 마이크로어레이 구성 및 이의 제조방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 미국 특허 번호 5,242,974; 5,384,261; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,445,934; 5,556,752; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,472,672; 5,527,681; 5,529,756; 5,545,531; 5,554,501; 5,561,071; 5,571,639; 5,593,839; 5,624,711; 5,700,637; 5,744,305; 5,770,456; 5,770,722; 5,837,832; 5,856,101; 5,874,219; 5,885,837; 5,919,523; 6,022,963; 6,077,674; 및 6,156,501; 쉐나(Shena) 등의 문헌 [Tibtech 16:301, 1998]; 듀간(Duggan) 등의 문헌 [Nat. Genet. 21 :10, 1999]; 보우텔(Bowtell) 등의 문헌 [Nat. Genet. 21:25, 1999]; 립슈츠(Lipshutz) 등의 문헌 [21 Nature Genet. 20-24, 1999]; 블랜챠드(Blanchard) 등의 문헌 [11 Biosensors and Bioelectronics, 687-90, 1996]; 마스코스(Maskos) 등의 문헌 [21 Nucleic Acids Res. 4663-69, 1993]; 휴이스(Hughes) 등의 문헌 [Nat. Biotechol. 19:342, 2001]에 기재되어 있는데, 이들 문헌에 기재된 내용은 본원에 참조로 포함된다. 다양한 적용분야에서 어레이를 사용하는 방법을 기술하는 특허는 미국 특허 번호 5,143,854; 5,288,644; 5,324,633; 5,432,049; 5,470,710; 5,492,806; 5,503,980; 5,510,270; 5,525,464; 5,547,839; 5,580,732; 5,661,028; 5,848,659; 및 5,874,219를 포함하며, 이들 특허에 기재된 내용은 본원에 참조로 포함된다.
또한, 어레이는 대조 및 기준 핵산을 포함할 수 있다. 대조 핵산은 예를 들어 원핵 유전자, 예를 들어 bioB, bioC 및 bioD, P1 박테리오파지로부터의 cre 또는 polyA 대조표준, 예를 들어 dap, lys, phe, thr 및 trp을 포함한다. 기준 핵산은 하나의 실험에서 또 다른 실험으로의 결과의 표준화 및 정량 수준에 대한 다수의 실험의 비교를 가능하게 한다. 예시적 기준 핵산은 공지된 발현 수준을 지닌 하우스킵핑 유전자, 예를 들어 GAPDH, 헥소키나아제 및 액틴을 포함한다.
한 가지 구체에에서, 올리고누클레오티드의 어레이는 고체 지지체상에서 합성될 수 있다. 예시적인 고체 지지체는 유리, 플라스틱, 중합체, 금속, 메탈로이 드, 세라믹, 유기물 등을 포함한다. 칩 마스킹 기술 및 광보호 화학을 이용하여, 핵산 프로브의 정돈된 어레이를 생성시키는 것이 가능하다. 예를 들어 "DNA 칩" 또는 매우 거대한 규모의 고정된 중합체 어레이 ("VLSIPS™" 어레이)로서 알려져 있는 이러한 어레이는 약 1 cm2 내지 수 cm2의 면적을 지닌 기판상에 수 백만개의 규정된 프로브 영역을 포함함으로써, 수 개 내지 수 백만개의 프로브를 혼입할 수 있다 (참조: 미국 특허 번호 5,631,734).
핵산 프로브는 적어도 예를 들어 약 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 50개, 100개 이상의 누클레오티드일 수 있고, 전장 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로브는 표 1에 기재된 유전자에 특이적으로 하이브리드화하는 것일 수 있다.
핵산 프로브는 예를 들어 게놈, cDNA (예를 들어, RT-PCR) 또는 클로닝된 서열로부터의 유전자 절편의 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. cDNA 프로브는 당 분야에 공지되어 있고 본원에 추가로 설명된 방법에 따라 제조될 수 있는데, 예를 들어 서열 특이적 프라이머를 사용하여 RNA의 역전사 PCR (RT-PCR)에 의해 제조될 수 있다. 프로브가 생성되는 유전자 또는 cDNA의 서열은 예를 들어 젠뱅크(GenBank), 그 밖의 공개 데이터베이스, 또는 간행물로부터 수득될 수 있다.
또한, 올리고누클레오티드 프로브는 당 분야에 공지된 표준 방법, 예를 들어 자동 DNA 합성기 또는 임의의 다른 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드는 스테인(Stein) 등의 문헌 [Nucl. Acids Res. 16:3209, 1988]에 기재된 방법에 의해 합성될 수 있고, 메틸포스포네이트 올 리고누클레오티드는 제어된 포어 글래스(pore glass) 중합체 지지체에 의해 제조될 수 있다 (참조: Sarin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451, 1988). 또 다른 구체예에서, 올리고누클레오티드는 2'-)-메틸리보누클레오티드 (Inoue, et al., Nucl. Acids Res. 15:6131-6148, 1987) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체 (Inoue, et al., FEBS Lett. 215:327-330, 1987)일 수 있다.
핵산 프로브는 천연 핵산 또는 화학적으로 변형된 핵산 (예를 들어, 누클레오티드 유사체로 구성됨)일 수 있지만, 프로브는 결합 화학과 상용가능한 활성화된 히드록실기를 지녀야 한다. 보호기는 광불안정할 수 있거나, 보호기는 특정한 화학 조건 (예를 들어, 산)하에서 불안정할 수 있다. 고체 지지체의 표면은 광에 노출시에 산을 발생시키는 조성물을 함유할 수 있다. 따라서, 기판의 영역이 광에 노출된 경우 노출된 영역에서 보호기를 제거하는 산이 그 영역에서 발생된다. 또한, 합성 방법은 3'-보호된 5'-0-포스포르아미디트-활성화된 데옥시누클레오시드를 사용할 수 있다. 이러한 경우, 올리고누클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 합성되어, 유리 5' 단부를 생성시킨다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 어레이의 올리고누클레오티드는 수 천개의 올리고누클레오티드를 생성할 수 있는 96-웰 자동 멀티플렉스 올리고누클레오티드 합성기 (A.M.O.S.)를 사용하여 합성될 수 있다 (참조: Lashkari, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7912, 1995).
발현 수준을 비교하기 위해, 표지된 핵산은 어레이상에서 표적 핵산과 프로브 간에 결합이 일어나게 하기에 충분한 조건하에서 어레이와 접촉될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 하이브리드화 조건은 요망되는 하이브리드화 특이성 수준을 제공하도록 선택될 수 있는데, 즉, 이는 마이크로어레이상에서 표지된 핵산과 프로브 간에 하이브리드화가 일어나게 하기에 충분한 조건이다.
하이브리드화는 본질적으로 특이적인 하이브리드화를 가능하게 하는 조건하에서 수행될 수 있다. 핵산의 길이 및 GC 함량은 열융점을 결정해주며, 이로써 프로브가 표적 핵산에 특이적으로 하이브리드화하는 데에 필요한 하이브리드화 조건을 결정해준다. 이러한 인자는 당업자에게 잘 알려져 있고, 또한 검정에서 시험될 수 있다. 핵산 하이브리드화에 대한 포괄적인 지침은 티즈센(Tijssen) 등의 문헌 [Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y., (1993)]에서 발견될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 농도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열융점 (Tm) 보다 약 5℃ 낮게 되도록 선택될 수 있다. Tm은 표적 서열의 50%가 (규정된 이온 농도 및 pH하에서) 완전히 매칭되는(matched) 프로브에 하이브리드화하는 온도이다. 매우 엄격한 조건은 특정 프로브에 대한 Tm 점과 동일하게 되도록 선택될 수 있다. 때때로 "해리 온도" (Td)라는 용어가 프로브의 적어도 절반이 완전히 매칭되는 표적 핵산으로부터 해리되는 온도를 규정하기 위해 사용된다. 어느 경우이든지, Tm 또는 Td를 평가하기 위한 다양하 기술이 이용가능하고, 일반적으로 상기 티즈센의 문헌에 기재되어 있다. 전형적으로, 듀플렉스 중의 G-C 염기쌍은 Tm에 약 3℃를 기여하는 것으로 평가되고, A-T 염기쌍은 약 2℃에서 약 80 내지 100℃까지의 이론적 최대치를 기여하는 것으로 평가된 다. 그러나, G-C 스택킹(stacking) 상호작용, 용매 효과, 요망되는 검정 온도 등이 고려된 더욱 정교한 Tm 및 Td 모델이 이용가능하다.
한 가지 구체예에서, 비특이적 결합 또는 백그라운드(background) 신호는 세정제 (예를 들어, C-TAB) 또는 차단 시약 (예를 들어, 정자(sperm) DNA, cot-1 DNA 등)을 사용함으로써 감소될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 하이브리드화는 약 0.5 mg/ml DNA (예를 들어, 청어 정자 DNA)의 존재하에 수행될 수 있다. 하이브리드화에서 차단제를 사용하는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다 (참조: 상기 언급된 티즈센(Tijssen)의 문헌).
표적 서열이 동일한 표지를 사용하여 검출되는 경우, 상이한 어레이가 각각의 생리학적 공급원에 대해 사용될 수 있거나, 동일한 어레이가 반복적으로 스크리닝될 수 있다. 상기 방법은 다양한 표적 집단 (예를 들어, 다양한 생리학적 공급원)에 대해 상이하고 구별가능한 표지를 사용함으로써 멀티플렉스 분석을 제공하도록 변화될 수 있다. 이러한 멀티플렉스 방법에 따르면, 동일한 어레이가 다양한 표적 집단 각각에 대해 동시에 사용될 수 있다.
상기 기재된 방법은 어레이 표면상에서 표지된 표적 핵산의 하이브리드화 패턴을 생성시킨다. 표지된 핵산의 생성된 하이브리드화 패턴은 다양한 방식으로 가시화되거나 검출될 수 있는데, 특정 검출 방식은 표적 핵산의 특정 표지를 기초로 하여 선택된다. 대표적인 검출 수단은 신틸레이션 계수, 자동방사선사진법, 형광 측정, 비색 측정, 발광 측정, 광 산란 등을 포함한다.
이러한 한 가지 검출 방법은 시판되는 어레이 스캐너 (array scanner) (Affymetrix, Santa Clara, CA), 예를 들어 417™ 어레이어(Arrayer), 418™ 어레이 스캐너, 또는 애질런트 진어레이™ (Agilent GeneArray™) 스캐너를 이용한다. 이러한 스캐너는 인터페이스 및 사용하기 쉬운 소프트웨어 도구를 이용하여 시스템 컴퓨터로부터 제어된다. 출력은 직접 불러지거나 다양한 소프트웨어 적용에 의해 직접 판독될 수 있다. 스캐닝 장치는 예를 들어 미국 특허 번호 5,143,854 및 5,424,186에 기재되어 있다.
형광 표지된 프로브의 경우, 전사체 어레이의 각각의 부위에서의 형광 방출이 주사 공초점 레이저 현미경법에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 레이저가 사용될 수 있는데, 이는 2개의 형광단에 대해 특이적인 파장에서 동시 표본 조명을 가능하게 하고, 2개의 형광단으로부터의 방출이 동시에 분석될 수 있게 한다 (참조: Shalon, et al., Genome Res. 6:639-645, 1996). 예를 들어, 어레이는 컴퓨터 제어되는 X-Y 스테이지 및 현미경 대물렌즈를 지닌 레이저 형광 스캐너로 스캐닝될 수 있다. 형광 레이저 스캐닝 장치는 상기 언급된 샬론 등의 문헌에 기재되어 있다.
데이터 수집 작업 후, 데이터는 전형적으로 데이터 분석 작업으로 보고된다. 샘플 분석 작업을 촉진하기 위해, 장치로부터 판독기에 의해 수득된 데이터는 디지털 컴퓨터를 사용하여 분석될 수 있다. 전형적으로, 컴퓨터는 장치로부터의 데이터의 수용 및 저장 뿐만 아니라 수집된 데이터의 분석 및 보고, 예를 들어, 백그라운드의 공제, 다중컬러 이미지의 디컨볼루션(deconvolution), 인공물(artifact)의 감소 또는 제거, 대조표준이 적절하게 기능을 발휘하였음을 입증하는 것, 신호를 표준화하는 것, 형광 데이터를 해석하여 하이브리드화된 표적의 양을 측정하는 것, 백그라운드의 표준화 및 단일 염기 미스매치 하이브리드화 등을 위해 적절하게 프로그래밍되어 있다.
한 가지 구체예에서, 시스템은 특정 패턴, 예를 들어 피검체에서 암 세포의 발현 프로프일과 대응 정상 세포의 발현 프로파일 간의 차별적 유전자 발현에 관한 패턴에 대해 검색할 수 있게 해주는 검색 기능을 포함한다. 예를 들어, 시스템은 2개 이상의 샘플 간의 유전자 발현의 패턴을 검색할 수 있게 해준다.
수행하려는 비교의 유형과 같은 유전자 발현 프로파일 데이터를 분석하기 위한 다양한 알고리듬이 이용가능하다. 특정 구체예에서, 동시 조절되는 유전자를 그룹으로 묶는 것이 바람직할 수 있다. 이는 다수의 프로파일의 비교를 가능하게 한다. 이러한 유전자 그룹을 확인하기 위한 한 가지 구체예는 군집화(clustering) 알고리듬을 포함한다 (군집화 알고리듬에 대해서는, 하기 문헌이 참조됨: Fukunaga, 1990, Statistical Pattern Recognition, 2nd Ed., Academic Press, San Diego; Everitt, 1974, Cluster Analysis, London: Heinemann Educ. Books; Hartigan, 1975, Clustering Algorithms, New York: Wiley; Sneath and Sokal, 1973, Numerical Taxonomy, Freeman; Anderberg, 1973, Cluster Analysis for Applications, Academic Press: New York).
군집화는 유전자의 다른 특성, 예를 들어 이들의 발현 수준 (참조: 미국 특허 번호 6,203,987)을 기초로 할 수 있거나 시간 곡선의 군집화를 가능하게 할 수 있다 (참조: 미국 특허 번호 6,263,287). 군집화 알고리듬의 예는 K-평균 군집화 및 계층적 군집화를 포함한다. 군집화는 또한 데이터의 그래프식 표현을 사용한 유전자 발현 데이터의 가시적 조사에 의해 달성될 수 있다 (예를 들어, "히트 맵 (heat map)"). 군집화 알고리듬 및 유전자 발현 데이터를 그래프식으로 표현하기 위한 수단을 함유하는 소프트웨어의 예는 스포트파이어 디씨젼사이트 (Spotfire DecisionSite) (Spotfire, Inc., Somerville, Massachusetts and Goeteborg, Sweden)이다.
소분자 효능의 특징이 되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 기준 발현 수준, 예를 들어 암 질병 세포 또는 정상적인 대응 세포에서의 발현 수준과 비교하는 것은 컴퓨터 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 발현 수준은 2개의 세포로부터 수득될 수 있고, 발현 수준의 이러한 2개의 세트는 비교를 위해 컴퓨터 시스템내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 수준의 하나의 세트는 컴퓨터 시스템에 이미 존재하는 값들과의 비교를 위해 컴퓨터 시스템내로 입력되거나, 컴퓨터 판독가능한 형태로 존재한 후 컴퓨터 시스템내로 입력된다.
한 가지 구체예에서, 컴퓨터 시스템은 또한 소분자 효능의 특징이 되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 나타내는 값을 포함하는 데이터베이스를 함유할 수 있다. 이러한 데이터베이스는 다양한 세포에서 소분자 효능의 특징이 되는 유전자의 하나 이상의 발현 프로파일을 함유할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 유전자 발현 프로파일 데이터의 컴퓨터 판독가능한 형태, 또는 질병 세포에서 암의 특징이 되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준에 상응하는 값의 컴퓨터 판독가능한 형태를 제공한다. 상기 값은 마이크로어레 이 분석과 같은 실험으로부터 수득된 mRNA 발현 수준일 수 있다. 또한, 상기 값은 다수의 조건하에서 다수의 세포에서 발현이 일정한 기준 유전자에 대해 표준화된 mRNA 수준일 수 있다 (예를 들어, GAPDH). 다른 구체예에서, 컴퓨터내의 값은 다양한 샘플 중의 표준화되거나 비표준화된 mRNA 수준의 비 또는 이러한 mRNA 수준 간의 차이일 수 있다.
한 가지 구체예에서, 발현 프로파일은 생체내 또는 시험관내에서 약물, 예를 들어 멀티-키나아제 억제제로 처리된 하나 이상의 피검체의 암세포로부터의 발현 프로파일이다. 시험관내 또는 생체내에서 약물로 처리된 피검체의 세포의 발현 데이터는 컴퓨터내로 입력되고, 컴퓨터에는 인풋(input)된 데이터를 컴퓨터내의 데이터와 비교하도록 하는 지시가 내려져서, 컴퓨터내로 입력된 발현 데이터가 약물에 대해 반응성인 피검체의 세포의 발현 데이터와 더 유사한 지 또는 약물에 대해 반응성이지 않은 피검체의 세포의 발현 데이터와 더 유사한 지를 나타내는 결과를 제공한다. 따라서, 결과는 피검체가 약물에 의한 처리에 반응할 것으로 여겨지는 지 또는 그렇지 않은 지를 나타내준다.
또한, 본 발명은 (i) 질의 세포 (query cell)에서 소분자 효능의 특징이 되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준에 상응하는 다수의 값을 하나 이상의 기준 세포의 기준 발현 또는 발현 프로파일 데이터 및 세포 유형의 주석(annotation)을 포함하는 기록을 포함하는 데이터와 비교하는 단계; 및 (ii) 발현 프로파일의 유사성을 기초로 하여 질의 세포가 어느 세포에 가장 유사한 지를 나타내는 단계를 수행하기 위한 프로그램 설명서를 포함하는 기계 판독가능하거나 컴퓨터 판독가능한 매 체를 제공한다. 기준 세포는 암의 다양한 시기에서 피검체로부터의 세포일 수 있다. 기준 세포는 또한 특정 약물 처리에 대해 반응하거나 반응하지 않는 피검체로부터의 세포로서, 임의로 약물과 함께 시험관내 또는 생체내에서 인큐베이션된 세포일 수 있다.
또한, 기준 세포는 수 개의 상이한 처리에 대해 반응하거나 반응하지 않는 피검체로부터의 세포일 수 있고, 컴퓨터 시스템은 피검체에 대한 바람직한 처리를 나타낸다. 따라서, 본 발명은 (i) 환자의 질병 세포에서 소분자 효능의 특징이 되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 제공하는 단계; (ii) 피검체 발현 프로파일 및 각각의 기준 프로파일이 다수의 값을 지니며 각각의 값은 암의 특징이 되는 유전자의 발현 수준을 나타내는, 각각 치료와 관련된 다수의 기준 프로파일을 제공하는 단계; (iii) 피검체 발현 프로파일과 가장 유사한 기준 프로파일을 선택함으로써 상기 환자에 대한 치료법을 선택하는 단계를 포함하여, 암에 걸린 환자를 위한 치료법을 선택하는 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 단계 (iii)는 컴퓨터에 의해 수행될 수 있다. 가장 유사한 기준 프로파일은 상응하는 발현 데이터와 관련된 중량 값을 사용하여 다수 값 중의 비교값을 칭량함으로써 선택될 수 있다.
2개의 생물학적 샘플 중의 mRNA의 상대적 존재비는 측정된 변동(perturbation) 및 이의 크기로서 기록되거나 (즉, 시험된 2개의 mRNA원에서 존재비가 상이함), 변동되지 않은 것으로 기록될 수 있다 (즉, 상대적 존재비가 동일함). 다양한 구체예에서, 2개의 RNA원 간의 차이는 변동으로서 기록된다. 변동은 계산 및 발현 비교를 위해 컴퓨터에 의해 이용될 수 있다.
마이크로어레이를 이용한 약물 설계
또한, 본 발명은 암에 대한 약물, 예를 들어 본원에 설명된 바와 같이 확인된 약물을 설계하고 최적화하는 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 화합물은 암 질병 세포 또는 유사한 세포를 시험 화합물과 인큐베이션한 후 소분자 효능의 특징이 되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 비교함으로써 스크리닝될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 유전자의 발현 수준은 마이크로어레이를 사용하여 시험 화합물에 반응하는 세포의 유전자 발현 프로파일을 암 질병 세포에 상응하는 정상 세포의 유전자 발현 프로파일 ("기준 프로파일")과 비교함으로써 측정될 수 있다. 추가의 구체예에서, 발현 프로파일은 또한 암 질병 세포의 발현 프로파일과 비교될 수 있다. 비교는 적절한 알고리듬을 이용하여 약물로 처리된 세포의 유전자 발현 프로파일 데이터를 컴퓨터 판독가능한 형태로 저장되어 있는 기준 유전자 발현 프로파일을 포함하는 컴퓨터 시스템내로 도입시킴으로써 수행될 수 있다. 시험 화합물은 소분자 효능의 특징이 되는 유전자의 발현 수준을 변경시키는 화합물에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 화합물, 즉, 소분자 효능의 특징이 되는 본질적으로 모든 유전자의 발현을 표준화할 수 있는 화합물이 후보 치료제이다.
그 후, 화합물의 효능은 추가의 시험관내 및 생체내 검정에서, 그리고 동물 모델 (예를 들어, 이종이식 모델)에서 시험될 수 있다. 시험 화합물은 시험 동물에 투여될 수 있고, 질병의 하나 이상의 증상이 동물의 질환의 개선에 대해 모니터될 수 있다. 소분자 효능의 특징이 되는 하나 이상의 유전자의 발현은 또한 시험 화합물을 동물에게 투여하기 전 및 후에 측정될 수 있다. 이들 유전자 중 하나 이 상의 발현의 표준화는 동물에서 암을 치료하기 위한 화합물의 효율을 나타내준다.
임상 환경에서, 암을 나타내는 조직의 인간 유래된 샘플을 수득하는 것은 금지되지 않은 경우 어려울 수 있다. 따라서, 치료 화합물의 효능을 나타내는 유전자 발현 변화의 확인은 더욱 용이하게 이용할 수 있는 대용 세포 집단, 예를 들어 말초혈 백혈구 (PBL)에서 측정될 수 있다. 이러한 방법은 인간 또는 동물 모델 시스템에서 수행될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 시험 화합물은 시험 동물 (정상 또는 암에 걸린 동물)에게 그러한 동물 모델에서 암을 치료하는 데에 효능이 있는 것으로 관찰된 투여량과 동일한 투여량으로 투여될 수 있다. 혈액은 다양한 시점 (예를 들어, 최초 투여 후 1시간, 4시간, 7시간 및 24시간, 중간점 및 수 일 투여 방법의 마지막 날)에서 동물로부터 채취될 수 있다. 비히클이 투여된 동물은 대조표준으로서 사용될 수 있다. RNA는 PBL로부터 단리될 수 있고, 마이크로어레이로의 하이브리드화를 위한 프로브를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 그 후, 하이브리드화 결과는 상기 설명된 바와 같이 컴퓨터 프로그램 및 데이터베이스를 이용하여 분석될 수 있다. 생성된 발현 프로파일은 유사성에 대해 처리된 암 조직으로부터의 유사한 프로파일과 직접 비교되거나, 동물 모델에서 단순히 효능과 상호관련될 수 있다 (예를 들어, 투여량 및 시점 측면에서).
또 다른 구체예에서, 인간 혈액은 동물 모델에서 치료적 투여량과 일치하는 투여량으로 또는 동물 모델에서 치료적 투여량의 공지된 혈장 수준과 일치하는 투여량으로 치료 화합물로 생체외에서 처리될 수 있다. 혈액은 치료 화합물로 즉시 처리되거나, 혈액 채취 후 유전자 발현이 다시 평형을 이루도록 얼마 간의 인큐베 이션 시간 (예를 들어, 24시간) 후에 처리될 수 있다 (예를 들어, 처리는 37℃에서 진동(rocking)시키는 것임). 또한, 혈액은 다양한 시점 (예를 들어, 4시간 및 24시간)에 대해 치료 화합물로 처리된 후, PBL RNA가 단리되어 마이크로어레이로의 하이브리드화를 위한 프로브를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 화합물 가용화제 (예를 들어, DMSO)가 대조표준으로서 사용될 수 있다. 생성된 발현 프로파일은 유사성에 대해 처리된 암 조직으로부터의 유사한 프로파일과 직접 비교되거나, 동물 모델에서 단순히 효능과 상호관련될 수 있다 (예를 들어, 투여량 및 시점 측면에서).
후보 치료 화합물의 독성은 화합물이 독성 반응과 관련된 것으로 공지된 유전자의 발현을 유도하는 지를 결정함으로써 평가될 수 있다. 이러한 독성 관련된 유전자의 발현은 다양한 세포 유형, 예를 들어 그러한 유전자를 발현하는 것으로 공지된 세포 유형에서 결정될 수 있다. 실제로, 유전자 발현의 변경은 정례적인 전임상 안전성 실험 보다 인간 독성의 더욱 민감한 마커로서 기능할 수 있다. 마이크로어레이는 독성 반응과 관련된 것으로 공지된 유전자의 발현 변화를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 발현 수준의 변화가 정례적인 전임상 안정성 시험에 의해 확인되지 않는 독성 사고를 예측할 수 있음을 나타내는 개념 실험의 증명을 수행하는 것이 가능할 수 있다 (참조: Huang, et al., Toxicol. Sci. 63:196-207, 2001; Waring, et al., Toxicol. Appl. Pharamacol. 175:28-42, 2001).
약물 스크리닝은 시험 화합물을 세포의 샘플에 첨가하고, 효과를 모니터함으로써 수행될 수 있다. 시험 화합물이 첨가되지 않은 대등한 샘플이 또한 대조표준 으로서 모니터될 수 있다. 그 후, 처리된 세포 및 비처리된 세포는 비제한적으로 현미경 분석, 생존성 시험, 복제 능력, 조직학적 검사, 세포와 관련된 특정 RNA 또는 폴리펩티드의 수준, 세포 또는 세포 용해물에 의해 나타나는 효소 활성의 수준, 및 다른 세포 또는 화합물과 상호작용하는 세포의 능력을 포함하는 임의의 안정한 표현형 기준에 의해 비교된다. 처리된 세포 및 비처리된 세포 간의 차이는 시험 화합물에 기인할 수 있는 효과를 나타낸다.
시험 화합물의 바람직한 효과는 암 관련 마커 핵산 서열에 의해 부여되는 임의의 표현형에 대한 효과를 포함한다. 예는 mRNA의 과다존재를 제한하거나, 엔코딩되는 단백질의 생성을 제한하거나, 단백질의 기능적 효과를 제한하는 시험 화합물을 포함한다. 시험 화합물의 효과는 처리된 세포 및 비처리된 세포 간의 결과를 비교하는 경우 명백하다.
진단 및 예후 검정
본 발명은 암에서 차별적으로 조절되는 핵산 서열 및 이러한 서열을 확인하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 피검체로부터 수득된 RNA에 상응하는 핵산 샘플을 정체(identity)가 알려져 있는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 핵산 샘플에 하이브리드화시키는 단계; 및 핵산 샘플이 정체가 알려져 있는 하나 이상의 핵산 분자에 하이브리드화하는 것을 측정하는 단계를 포함하여, 암에 걸린 피검체에서 차별적으로 조절되는 누클레오티드 서열을 확인하는 방법으로서, 암에 걸리지 않은 피검체로부터 수득된 핵산 샘플과 비교되는 정체가 알려져 있는 하나 이상의 핵산 샘플로의 핵산 샘플의 하이브리드화의 차이가 암에 걸린 피검체에서의 핵산 서열의 차별적 발현을 나타내는 것인 방법을 제공한다.
일반적으로, 본 발명은 피검체로부터 메신저 RNA를 단리하고, mRNA 샘플로부터 cRNA를 생성시키고, cRNA를 어레이상의 분리된 위치와 안정하게 결합된 다수의 핵산 분자를 포함하는 마이크로어레이에 하이브리드화시키고, cRNA가 어레이에 하이브리드화되는 패턴을 확인하는 것을 포함하여, 암에 걸린 피검체에서 차별적으로 조절되는 핵산 서열을 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 어레이상의 주어진 위치에 하이브리드화하는 핵산 분자는 하이브리드화 신호가 예를 들어 암에 걸리지 않은 피검체로부터 수득된 핵산 샘플과 하이브리드화되는 동일한 어레이상의 동일한 위치에서의 하이브리드화 신호 보다 높거나 낮은 경우에 차별적으로 조절되는 것으로 여겨진다.
발현 패턴은 환자에서 약물 처리의 효능을 예측하기 위해 사용될 수 있는 일단의 바이오마커를 유도해내기 위해 사용될 수 있다. 바이오마커는 생물학적 샘플로부터 단리된 RNA, 종양 생검물의 동결된 샘플로부터 단리된 RNA, 또는 혈청 중의 질량 분석법 유래된 단백질 덩어리에 대한 마이크로어레이 실험으로부터의 유전자 발현 수준으로 구성될 수 있다.
데이터 분석을 위한 정확한 메커니즘은 데이터의 정확한 특성에 좌우되지만, 일단의 바이오마커를 개발하기 위한 전형적인 절차는 다음과 같다. 데이터 (유전자 발현 수준 또는 질량 스펙트럼)는 처리 전에 각각의 환자에 대해 수집된다. 실험이 진행됨에 따라, 환자는 약물 처리에 대한 이들의 반응에 따라 효능적이거나 비효능적인 것으로 분류된다. 다수의 효능 수준이 데이터 모델에서 제공될 수 있 지만, 이원적 비교가 최적인 것으로 간주되는데, 이는 환자 집단이 수 백명 미만인 경우에 특히 그러하다. 각각의 부류에서의 환자의 적절한 수를 가정하여, 단백질 및/또는 유전자 발현 데이터가 당 분야에 공지된 다수의 기술에 의해 분석될 수 있다. 많은 기술은 기계 학습 분야로부터 통상적인 통계학으로부터 또한 유래된다. 이러한 기술은 두 가지 목적을 충족시킨다:
1. 데이터의 차원을 감소시킴 - 질량 스펙트럼 또는 유전자 발현 마이크로어레이의 경우, 데이터는 수 천개의 개개의 데이터 지점에서 예를 들어 약 3개 내지 10개로 감소된다. 감소는 세트로서 취해진 경우 데이터 지점의 예측 검정력 (predictive power)을 기초로 한다.
2. 훈련 - 그 후, 이러한 3개 내지 10개의 데이터 지점을 사용하여 다수의 기계 학습 알고리듬을 훈련시키고, 이는 이러한 경우 효능적 약물 처리를 비효능적 처리와 구별하는 단백질 덩어리 또는 유전자 발현의 패턴을 인식하도록 "학습"한다. 모든 환자 샘플은 알고리듬을 훈련시키기 위해 사용될 수 있다.
그 후, 생성된 훈련된 알고리듬은 이들의 예측 검정력을 측정하기 위해 시험된다. 전형적으로, 수 백개 미만의 훈련 예가 이용가능한 경우, 특정 형태의 교차확인(cross-validation)이 수행된다. 예시를 위해, 10배 교차확인이 고려된다. 이러한 경우, 환자 샘플은 10개의 통(bin) 중 하나에 무작위적으로 할당된다. 첫 번째 확인 라운드에서, 통 중 9개의 샘플이 훈련을 위해 사용되고, 10번째 통내의 남아있는 샘플이 알고리듬을 시험하기 위해 사용된다. 이를 추가 9회 반복하는데, 매번 상이한 통내의 샘플을 시험을 위해 남겨둔다. 모든 10번의 라운드로부터의 결과 (올바른 예측 및 오류)가 합쳐진 후, 예측 검정력이 평가된다. 다양한 알고리듬 뿐만 아니라 다양한 패널이 이러한 실험을 위해 이러한 방식으로 비교될 수 있다. 그 후, "최상"의 알고리듬/패널 조합이 선택된다. 그 후, 이러한 "스마트(smart)" 알고리듬은 처리에 반응할 것이 거의 확실한 환자를 선택하기 위해 장래 실험에서 사용될 수 있다.
다수의 알고리듬은 환자에 대해 취해진 추가의 정보로부터 이익을 얻는다. 예를 들어, 성별 또는 연령은 예측 검정력을 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 표준화 및 평탄화(smoothing)과 같은 데이터 변환은 노이즈(noise)를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 이로 인해, 다수의 알고리듬이 결과를 최적화시키기 위해 다수의 상이한 파라미터를 사용하여 훈련될 수 있다. 예측 패턴이 데이터에 존재하는 경우, 최적 또는 준최적 "스마트" 알고리듬이 개발될 수 있는 것으로 여겨진다. 더 많은 환자 샘플이 이용가능한 경우, 알고리듬은 새로운 데이터를 이용하기 위해 재훈련될 수 있다.
질량 분석법을 이용하는 예로서, 혈장이 소수성 SELDI-표적에 적용되고, 물로 철저히 세척되고, SELDI-Tof 질량 분석기에 의해 분석될 수 있다. 이는 100개 이상의 환자 샘플상에서 반복될 수 있다. 각각의 샘플에서 약 16,000 m/z 값의 세기로부터 생성된 단백질 프로파일이 약물 효능을 예측해주는 특정 m/z 값의 세트를 확인하기 위해 통계적으로 분석된다. 그 밖의 SELDI-표적, 예를 들어 이온교환 또는 IMAC 표면을 사용하는 동일한 실험이 또한 수행될 수 있다. 이들 실험은 혈장에 존재하는 단백질의 상이한 서브셋을 포획한다. 또한, 혈장은 SELDI 표적상으로 적용되기 전에 변성되고 사전분획화(prefractionation)될 수 있다.
본 발명은 피검체가 바이오마커, 즉, 암에 대한 핵산 및/또는 폴리펩티드 마커를 검출함으로써 원하지 않는 세포 증식을 특징으로 하는 질병 또는 질환을 발생시킬 위험이 있는 지의 여부를 결정하기 위한 방법을 제공한다.
임상 적용에서, 인간 조직 샘플은 본원에서 확인된 바이오마커의 존재 및/또는 부재에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 샘플은 침 생검 코어, 외과적 절제 샘플, 림프절 조직, 또는 혈청으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 생검물을 수득하는 것을 포함하며, 이러한 생검물은 종양 세포를 전체 세포 집단의 약 80%까지 농축시키기 위해 동결절편기 절개 (cryostat sectioning)에 의해 임의로 분획화된다. 특정 구체예에서, 이러한 샘플로부터 추출된 핵산은 당 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 증폭될 수 있다. 검출되는 선택된 마커의 수준은 전이성, 비전이성 악성, 양성 또는 정상 조직 샘플의 통계적으로 유효한 그룹과 비교된다.
한 가지 구체예에서, 본 발명의 진단 방법은 피검체가 바이오마커의 비정상적 mRNA 및/또는 단백질 수준을 지니는 지의 여부를, 예를 들어 노던 블롯 분석, 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR), 인 시튜 하이브리드화, 면역침전, 웨스턴 블롯 하이브리드화 또는 면역조직화학에 의해 결정하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 따르면, 세포는 피검체로부터 수득될 수 있고, 바이오마커인 단백질 또는 mRNA 수준이 측정되어, 건강한 피검체 중의 이러한 마커의 수준과 비교된다. 바이이오마커인 폴리펩티드 또는 mRNA 수준의 비정상적 수준은 암을 나타내는 것으로 여겨진다.
한 가지 구체예에서, 본 발명의 벙법은 환자로부터의 조직에 암 세포가 존재하는 지의 여부를 측정하기 위해 핵산 프로브를 사용하는 것을 포함한다. 구체적으로, 상기 방법은,
1. 누클레오티드 서열, 예를 들어 적어도 10개, 15개, 25개 또는 40개인 누클레오티드 및 핵산 서열의 코딩 서열의 일부에 상보적이며 종양 세포에서 차별적으로 발현되는 코딩 서열의 일부 또는 전부 또는 거의 전부를 포함하는 핵산 프로브를 제공하고;
2. 잠재적으로 암세포를 포함하는 환자로부터 조직 샘플을 수득하고;
3. 실질적으로 전부가 비암성인 세포를 함유하는 제 2 조직 샘플을 제공하고;
4. 핵산 프로브를 엄격한 조건하에서 상기 제 1 조직 샘플 및 제 2 조직 샘플 각각의 RNA와 접촉시키고 (예를 들어, 노던 블롯 또는 인 시튜 하이브리드화 검정에서);
5. 프로브가 제 1 조직 샘플의 RNA와 하이브리드화되는 량 (a) 을 프로브가 제 2 조직 샘플의 RNA와 하이브리드화되는 량 (b)과 비교하는 것을 포함하며, 여기서 제 2 조직 샘플의 RNA와 하이브리드화되는 량과 비교하여 제 1 조직 샘플의 RNA와 하이브리드화되는 량에서 통계적으로 유의할 만한 차이가 있는 경우 제 1 조직 샘플에 암성 세포가 존재함을 나타낸다.
한 가지 일면에서, 본 발명의 방법은 주어진 마커 핵산 서열로부터 유래된 프로브와 인 시튜 하이브리드화시키는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 표지된 하이브리드화 프로브를 암성 또는 전암성 세포 뿐만 아니라 정상 세포도 잠재적으로 함유하는 주어진 조직 유형의 샘플과 접촉시키고, 프로브가 이것이 동일한 조직 유형의 다른 세포를 표지하는 정도 보다 현저하게 상이한 정도로 주어진 조직 유형의 일부 세포를 표지하는 지의 여부를 측정하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명에는 시험 세포의 mRNA를 핵산 프로브, 예를 들어 적어도 약 10개, 15개, 25개 또는 40개 누클레오티드 및 핵산 서열의 코딩 서열의 일부에 상보적이며 주어진 조직 유형의 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 차별적으로 발현되는 서열의 일부 또는 전부 또는 거의 전부와 접촉시키고, 프로브가 mRNA에 하이브리드화되는 근사량를 측정함으로써 주어진 인간 조직으로부터 시험 세포의 표현형, 예를 들어 세포가 (a) 정상인지 (b) 암성 또는 전암성인 지의 여부를 결정하는 방법이 포함되며, 여기서 하이브리화되는 량이 조직 유형의 정상 세포의 mRNA와 관련하여 나타나는 하이브리드화 량 보다 많거나 적은 경우 시험 세포가 암성 또는 전암성임을 나타낸다.
대안적으로, 상기 진단 방법은 마커 핵산 서열에 의해 엔코딩되는 단백질 생성물을 검출하기 위해 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 한 가지 구체예에서, 본 발명의 검정은 시험 세포의 단백질을 핵산의 유전자 생성물에 대해 특이적인 항체와 접촉시키고, 항체와 시험 세포의 단백질에 의해 형성되는 면역복합체의 근사량을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 마커 핵산은 시험 세포와 동일한 조직 유형의 정상 세포에서 주어진 대조 수준으로 발현되는 핵산이고, 동일한 조직 유형의 정상 세포와 비교하여 시험 세포의 단백질에 의해 형성된 면역복합체의 양에서 통계적으로 유의할 만한 차이가 있는 경우 시험 세포가 암성 또는 전암성임을 나타낸다.
본 발명에서 유용한 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 및/또는 모노클로날 항체를 생성시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Dymecki, et al., (J. Biol. Chem. 267:4815, 1992)]; [Boersma & Van Leeuwen, (J. Neurosci. Methods 51:317, 1994)]; [Green, et al., (Cell 28:477, 1982)]; 및 [Arnheiter, et al., (Nature 294:278, 1981)]에서 발견될 수 있다.
또 다른 이러한 방법은 마커 핵산 서열의 유전자 생성물에 대해 특이적인 항체를 제공하는 단계로서, 상기 유전자 생성물이 주어진 조직 유형의 암성 조직에서 동일한 조직 유형의 비암성 조직내의 유전자 생성물의 수준 보다 높거나 낮은 수준으로 존재하는 것인 단계; 주어진 조직 유형의 조직의 제 1 샘플을 환자로부터 수득하는 단계로서, 이러한 샘플이 잠재적으로 암성 세포를 포함하는 것인 단계; 동일한 조직 유형의 조직의 제 2 샘플 (이는 동일한 환자 또는 정상 대조표준, 예를 들어 또 다른 개체 또는 배양된 세포로부터 유래될 수 있음)을 제공하는 단계로서, 이러한 제 2 샘플이 정상 세포를 함유하며 본질적으로 암성 세포를 함유하지 않는 것인 단계; 항체와 샘플에 존재하는 마커 핵산 서열 생성물 사이에 면역복합체가 형성되게 하는 조건하에서 항체를 제 1 샘플 및 제 2 샘플의 단백질 (용해되지만 분획화되지 않은 세포에서 정제되거나 원위치 정제될 수 있음)과 접촉시키는 단계; 및 제 1 샘플에서 면역복합체가 형성되는 양 (a)을 제 2 샘플에서 면역복합체가 형 성되는 양 (b)과 비교하는 단계로서, 제 2 샘플에서 면역복합체가 형성되는 양과 비교하여 제 1 샘플에서 면역복합체가 형성되는 양에서 통계적으로 유의할 만한 차이가 있는 경우 조직의 제 1 샘플에 암성 세포가 존재함을 나타내는 것인 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 (a) 피검체로부터 세포 샘플을 수득하고, (b) 이렇게 수득된 샘플에서 마커 폴리펩티드의 양을 정량적으로 측정하고, (c) 이렇게 측정된 마커 폴리펩티드의 양을 공지된 표준과 비교함으로써 피검체로부터 수득된 세포 샘플이 비정상적인 양의 마커 폴리펩티드를 지니는 지의 여부를 결정하는 것을 포함하여, 피검체로부터 수득된 세포 샘플이 비정상적인 양의 마커 폴리펩티드를 지니는 지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 이러한 마커 폴리펩티드는 면역조직화학 검정, 도트-블롯 (dot-blot) 검정, ELISA 등에 의해 검출될 수 있다.
세포 샘플내의 단백질 수준을 정량하기 위해 면역검정이 통상적으로 사용되며, 많은 그 밖의 면역검정 기술이 당 분야에 공지되어 있다. 본 발명은 특정 검정 절차에 제한되지 않으며, 따라서 동질적(homogeneous) 절차 및 이질적(heterogeneous) 절차 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명에 따라 수행될 수 있는 예시적 면역검정은 형광 편광 면역검정 (FPIA), 형광 면역검정 (FIA), 효소 면역검정 (EIA), 혼탁(nephelometric) 억제 면역검정 (NIA), 효소-결합 면역흡수 검정 (ELISA) 및 방사면역검정 (RIA)을 포함한다. 지표(indicator) 부분 또는 표지 그룹이 해당 항체에 부착될 수 있고, 검정 장비 및 상용가능한 면역검정 절차의 이용가능성에 의해 종종 지시되는 방법을 다양하게 사용할 필요성을 충족시키도록 선택된다. 상기 언급된 다양한 면역검정을 수행하는 데에 사용되는 일반적 기술은 당업자에게 공지되어 있다.
또 다른 구체예에서, 환자의 생물학적 유체 (예를 들어, 혈액 또는 뇨)내의 엔코딩된 생성물의 수준 또는 대안적으로 폴리펩티드의 수준은 그러한 환자의 세포에서 마커 핵산 서열의 발현 수준을 모니터하는 방법으로서 측정될 수 있다. 이러한 방법은 환자로부터 생물학적 유체의 샘플을 수득하는 단계, 샘플 (또는 샘플로부터의 단백질)을 엔코딩된 마커 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체와 접촉시키는 단계, 및 항체에 의해 형성된 면역 복합체의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 면역 복합체가 형성된 양은 샘플내의 엔코딩된 마커 생성물의 수준을 나타낸다. 이러한 측정치는 정상 개체로부터 채취된 대조 샘플 또는 동일한 사람으로부터 미리 수득되거나 후속하여 수득된 샘플내의 동일한 항체에 의해 형성된 면역 복합체의 양과 비교되는 경우 특히 유익하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 세포에 존재하는 마커 폴리펩티드의 양을 측정하기 위해 사용될 수 있으며, 이러한 측정치는 과증식성 장애의 진행과 상호관련될 수 있다. 마커 폴리펩티드의 수준은 세포의 샘플이 형질전환된 세포이거나 형질전환된 세포가 되도록 하는 소인을 지닌 세포를 함유하는 지의 여부를 평가하기 위해 예측적으로 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 방법은 형질전환되는 것으로 공지된 세포의 표현형을 평가하기 위해 사용될 수 있는데, 표현형검사 결과는 특정 치료법을 계획하는 데에 있어서 유용하다. 예를 들어, 샘플 세포내의 매우 높은 수준의 마커 폴리펩티드는 암에 대한 강력한 진단적이고 예후적인 마커이 다. 마커 폴리펩티드 수준의 결과는 예를 들어 보다 적극적인 치료를 사용할 것인 지에 관해 결정하는 데에 이용될 수 있다.
상기 제시된 바와 같이, 본 발명의 한 가지 일면은 환자로부터 단리된 세포와 관련하여 마커 폴리펩티드의 수준이 샘플 세포에서 현저하게 감소되는 지를 측정하기 위한 진단 검정에 관한 것이다. "현저하게 감소된"이란 용어는 세포가 조직 기원이 유사한 정상 세포에 비해 감소된 세포내 마커 폴리펩티드의 양을 지니는 세포 표현형을 의미한다. 검정은 시험 세포내의 마커 폴리펩티드의 수준을 평가하고, 측정된 수준을 하나 이상의 대조 세포, 예를 들어 정상 세포 및/또는 표현형이 공지된 형질전환된 세포에서 검출된 마커 폴리펩티드와 비교할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은 정상적 또는 비정상적 마커 폴리펩티드 수준과 관련된 세포의 수에 의해 측정되는 마커 폴리펩티드의 수준을 정량하는 능력이다. 그 후, 특정 마커 폴리펩티드 표현형을 지닌 세포의 수는 환자 예후와 상호관련될 수 있다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 병변의 마커 폴리펩티드 표현형은 마커 폴리펩티드의 비정상적으로 높거나/낮은 수준을 지니는 것으로 밝혀진 생검물내의 세포의 비율로서 측정된다. 이러한 발현은 면역조직화학 검정, 도트-블롯 검정, ELISA 등에 의해 검출될 수 있다.
조직 샘플이 사용되는 경우, 마커 폴리펩티드 표현형을 지닌 세포의 수를 측정하기 위해 면역조직화학적 염색이 이용될 수 있다. 이러한 염색의 경우, 조직의 멀티블록(multiblock)이 생검물 또는 다른 조직 샘플로부터 취해져서, 프로테아제 K 또는 펩신과 같은 물질을 사용하여 단백분해성 가수분해될 수 있다. 특정 구체 예에서, 샘플 세포로부터 핵 분획을 단리하고, 핵 분획내의 마커 폴리펩티드의 수준을 검출하는 것이 바람직할 수 있다.
조직 샘플은 포르말린, 글루타르알데히드, 메탄올 등과 같은 시약에 의한 처리에 의해 고정된다. 그 후, 샘플은 마커 폴리펩티드에 대해 결합 특이성을 지닌 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)와 함께 인큐베이션된다. 이러한 항체는 결합의 후속 검출을 위해 표지에 컨쥬게이션될 수 있다. 샘플은 면역복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션된다. 그 후, 항체의 결합은 이러한 항체에 컨쥬게이션된 표지에 의해 검출된다. 항체가 표지되지 않은 경우, 예를 들어 항-마커 폴리펩티드 항체의 이소타입에 대해 특이적인 제 2의 표지된 항체가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 예는 방사성핵종, 플루오레서, 화학발광물질, 효소 등을 포함한다.
효소가 사용되는 경우, 효소에 대한 기질이 샘플에 첨가되어 착색 생성물 또는 형광 생성물을 제공할 수 있다. 컨쥬게이트에서 사용되는 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 말레이트 데히드로게나아제 등을 포함한다. 시판되지 않는 경우, 이러한 항체-효소 컨쥬게이트는 당업자에게 공지된 기술에 의해 용이하게 생성된다.
한 가지 구체예에서, 검정은 도트 블롯 검정으로서 수행된다. 도트 블롯 검정은 이것이 소정의 세포 갯수로부터 생성된 세포 비함유 추출물내의 마커 폴리펩티드의 양을 상호관련시킴으로써 단일 세포와 관련된 마커 폴리펩티드의 평균량을 측정할 수 있게 하므로 조직 샘플이 사용되는 경우 특히 적용된다.
동일한 유형의 종양 세포 (예를 들어 폐 및/또는 결장 종양 세포)가 균일하게 증가된 개개의 종양유전자의 발현 또는 균일하게 감소된 개개의 종양 서프레서 유전자의 발현을 나타내지 않을 수 있다는 것이 암 관련 문헌에서 잘 정립되어 있다. 또한, 주어진 암 유형의 세포 간에서도 주어진 마커 유전자의 발현 수준이 또한 달라질 수 있는데, 이는 하나의 시험이 아닌 일련의 시험에 의존할 필요성을 추가로 강조하는 것이다. 따라서, 한 가지 일면에서, 본 발명은 진단 시험의 신뢰도 및/또는 정확도를 개선시키기 위해 본 발명의 다수의 프로브를 사용하는 일련의 시험을 제공한다.
한 가지 구체예에서, 본 발명은 핵산 프로브가 조직화된(organized) 어레이에서 DNA 칩상에 고정되는 방법을 제공한다. 올리고누클레오티드는 리토그래피를 포함하는 다양한 공정에 의해 고체 지지체에 결합될 수 있다. 예를 들어, 칩은 250,000개 이하의 올리고누클레오티드를 보유할 수 있다. 이러한 핵산 프로브는 누클레오티드, 예를 들어 길이가 약 12개, 15개, 25개 또는 40개인 누클레오티드 및 마커 핵산 서열의 코딩 서열의 부분에 상보적이고 종양 세포에서 차별적으로 발현되는 서열의 일부 또는 전부 또는 거의 전부를 포함한다. 본 발명은 다양한 암에 대해 이용가능한 시험에 비해 현저한 이점을 제공하는데, 이는 본 발명이 단일 칩상에 핵산 마커의 어레이를 제공함으로써 시험의 신뢰도를 증가시키기 때문이다.
본 발명의 방법은 종양 세포를 농축시키기 위해 동결절편기 절개 (cryostat sectioning)에 의해 임의로 분획화된 생검물을 수득하는 것을 포함한다. 그 후, DNA 또는 RNA가 추출되고, 증폭되고, DNA 칩으로 분석되어, 마커 핵산 서열의 존재 여부가 결정된다.
한 가지 구체예에서, 핵산 프로브는 2차원 매트릭스 또는 어레이에서 기판상으로 스폿팅(spotting)된다. 핵산의 샘플은 표지된 후, 프로브에 하이브리드화된다. 샘플의 결합되지 않은 부분이 세척된 경우, 핵산을 프로빙하기 위해 결합된 표지된 샘플 핵산을 포함하는 이중가닥 핵산이 검출될 수 있다.
프로브 핵산은 유리, 니트로셀룰로오스 등을 포함하는 기판상에 스폿팅될 수 있다. 프로브는 공유 결합 또는 비특이적 상호작용, 예를 들어 소수성 상호작용에 의해 기판에 결합될 수 있다. 샘플 핵산은 방사성 표지, 형광단, 발색단 등을 사용하여 표지될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 마커 폴리펩티드에 대해 생성된 일단의 항체를 사용하는 것을 고려한다. 이러한 일단의 항체는 암에 대한 신뢰할 만한 진단 프로브로서 사용될 수 있다. 본 발명의 검정은 세포, 예를 들어 폐 세포를 함유하는 생검 샘플을 엔코딩된 생성물 중 하나 이상에 대한 일단의 항체와 접촉시켜서 마커 폴리펩티드의 존재 여부를 결정하는 것을 포함한다.
본 발명의 진단 방법은 또한 처리에 대한 추적검사(follow-up)로서 사용될 수 있는데, 예를 들어 마커 폴리펩티드의 수준을 정량하는 것은 현재 사용되거나 이전에 사용된 암 치료법의 유효성 뿐만 아니라 환자 예후에 대한 이러한 치료법의 효과를 나타내줄 수 있다.
또한, 마커 핵산 또는 마커 폴리펩티드는 최초 검출, 추적조사 스크리닝, 재발의 검출, 및 화학요법 또는 외과적 처리에 대한 처리후 모니터링을 위한 진단 패 널의 일부로서 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 예를 들어 세포의 종양원성 형질전환으로부터 발생하는 증식성 장애의 진단 및 표현형검사를 보조하기 위해 세포로부터 마커 폴리펩티드의 획득 및/또는 손실을 검출하기 위한 진단 검정 및 시약을 이용할 수 있게 한다.
상기 설명된 진단 검정은 또한 예후 검정으로서 사용되도록 적합될 수 있다. 이러한 응용은 종양 진행의 특징적 시기에서 일어나는 사건에 대한 본 발명의 검정의 민감도를 이용한다. 예를 들어, 주어진 마커 유전자는 매우 초기에, 아마도 세포가 악성종양으로 발달되도록 비가역적으로 수임(committed)되기 전에 상향조절도거나 하향조절되며, 또 다른 마커 유전자는 훨씬 후기에서만 특징적으로 상향조절되거나 하향조절될 수 있다. 이러한 방법은 시험 세포의 mRNA를 종양 진행의 다양한 시기에서 암성 또는 전암성 세포에서 다양한 특징적 수준으로 발현되는 주어진 마커 핵산으로부터 유래되는 핵산 프로브와 접촉시키는 단계 및 프로브가 세포의 mRNA에 하이브리드화되는 근사량을 측정하는 단계를 포함할 수 있는데, 이러한 양은 세포내에서의 유전자의 발현 수준을 나타내고, 이로써 세포의 종양 진행의 시기를 나타내며; 대안적으로, 검정은 시험 세포의 단백질과 접촉되는 주어진 마커 핵산의 유전자 생성물에 대해 특이적인 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 일련의 이러한 시험은 종양의 존재 및 위치를 밝혀낼 뿐만 아니라 임상의로 하여금 종양에 대해 가장 적합한 치료 방식을 선택하게 하여 그러한 치료의 성공 가능성을 예측할 수 있게 한다.
또한, 본 발명의 방법은 종양의 임상적 경과를 추적하기 위해 사용될 수 있 다. 예를 들어, 본 발명의 검정은 환자로부터의 조직 샘플에 적용될 수 있고, 암에 관해 환자를 치료한 후에 또 다른 조직 샘플이 취해지고, 시험이 반복된다. 성공적인 치료는 암성 또는 전암성 세포의 특징이 되는 차별적 발현을 나타내는 모든 세포의 제거를 일으키거나, 아마도 정상 수준에 근접하거나 정상 수준을 초과하는 그러한 세포에서의 유전자의 발현을 상당히 증가시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 피검체가 폴리펩티드의 비정상적 활성과 관련된 질병을 발생시킬 위험, 예를 들어 암을 발생시킬 소인이 있는 지의 여부를 결정하는 방법을 제공하며, 여기서 폴리펩티드의 비정상적 활성은 (a) 마커 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자의 완전성(integrity)에 영향을 미치는 변화 또는 (b) 엔코딩 핵산의 발현이상(mis-expression) 중 하나 이상을 특징으로 하는 유전자 병변의 존재 여부를 검출함으로써 특성화된다. 예시를 위해, 이러한 유전자 병변은 (i) 핵산 서열으로부터의 하나 이상의 누클레오티드의 결실, (ii) 핵산 서열로의 하나 이상의 누클레오티드의 첨가, (iii) 핵산 서열의 하나 이상의 누클레오티드의 치환, (iv) 핵산 서열의 총체적 염색 재배열, (v) 핵산 서열의 메신저 RNA 전사체의 수준의 총체적 변화, (vi) 게놈 DNA의 메틸화 패턴과 같은 핵산 서열의 비정상적 변형, (vii) 유전자의 메신저 RNA 전사체의 비-야생형 스플라이싱 패턴의 존재, (viii) 마커 폴리펩티드의 비-야생형 수준, (ix) 유전자의 대립형질 손실, 및/또는 (x) 마커 폴리펩티드의 부적절한 번역후 변형 중 하나 이상의 존재를 확인함으로써 검출될 수 있다.
본 발명은 엔코딩 핵산 서열에서 병변을 검출하기 위한 검정 기술을 제공한 다. 이러한 방법은 비제한적으로 서열 분석, 서던 블롯 하이브리드화, 제한 효소 부위 맵핑을 포함하는 방법, 및 분석하려는 핵산 및 프로브 간의 누클레오티드 쌍형성의 부재를 검출하는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
특정 질병 또는 장애, 예를 들어 유전적 질병 또는 장애는 돌연변이된 단백질을 반드시 엔코딩하는 것은 아닌 특정 유전자의 다형성 영역의 특정 대립형질 변이체와 관련된다. 따라서, 피검체에서 유전자의 다형성 영역의 특정 대립형질 변이체의 존재는 피검체가 특정 질병 또는 장애를 발생시키기 쉽게 할 수 있다. 유전자에서 다형성 영역은 개체군에서 유전자의 누클레오티드 서열을 결정함으로써 확인될 수 있다. 다형성 영역이 확인된 경우, 특정 개체군, 예를 들어 암과 같은 특정 질병을 발생시킨 개체를 연구함으로써 특정 질병과의 연관성이 결정될 수 있다. 다형성 영역은 유전자의 임의의 영역, 예를 들어 엑손, 엑손의 코딩 또는 비코딩 영역내, 인트론 및 프로모터 영역에 위치할 수 있다.
예시적 구체예에서, 유전자 또는 이의 천연 돌연변이체의 센스 또는 안티센스 서열, 또는 당해 유전자 또는 이의 천연 돌연변이체와 천연적으로 관련된 5' 또는 3' 플랭킹 서열 또는 인트론 서열에 하이브리드화할 수 있는 누클레오티드 서열의 영역을 포함하는 핵산 프로브를 포함하는 핵산 조성물이 제공된다. 세포의 핵산은 하이브리드화될 수 있게 되고, 프로브는 샘플의 핵산과 접촉되고, 프로브가 샘플 핵산에 하이브리드화하는 것이 검출된다. 이러한 기술은 결실, 치환 등을 포함하는 게놈 또는 mRNA 수준에서의 병변 또는 대립형질 변이체를 검출하는 데에 사용될 뿐만 아니라 mRNA 전사체 수준을 측정하는 데에도 사용될 수 있다.
검출 방법의 예는 돌연변이 또는 다형성 부위를 오버랩핑(overlapping)하며 돌연변이 또는 다형성 영역 주변의 약 5개, 10개, 20개, 25개 또는 30개 누클레오티드를 지닌 프로브를 사용하는 대립형질 특이적 하이브리드화이다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 대립형질 변이체에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 다수의 프로브가 고체상 지지체, 예를 들어 "칩"에 부착된다. "DNA 프로브 어레이"로도 일컬어지는 올리고누클레오티드를 포함하는 이러한 칩을 사용하는 돌연변이 검출 분석은 예를 들어 문헌 [Cronin, et al., (Human Mutation 7:244, 1996)]에 기재되어 있다. 한 가지 구체예에서, 칩은 유전자의 하나 이상의 다형성 영역의 모든 대립형질 변이체를 포함할 수 있다. 그 후, 고체상 지지체는 시험 핵산과 접촉되고, 특정 프로브에 하이브리드화되는 지가 검출된다. 따라서, 하나 이상의 유전자의 다수의 대립형질 변이체의 정체는 단순한 하이브리드화 실험으로 확인될 수 있다.
특정 구체예에서, 병변의 검출은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (참조: 미국 특허 번호 4,683,195 및 5 4,683,202), 예를 들어 앵커(anchor) PCR 또는 RACE PCR, 또는 대안적으로 리가아제 연쇄 반응 (LCR) (참조: Landegran, et al., Science 241:1077-1080, 1988; Nakazaw, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364, 1994)에서 프로브/프라이머를 사용하는 것을 포함하며, 후자가 유전자에서 점 돌연변이를 검출하는 데에 있어서 특히 유용할 수 있다 (참조: Abravaya, et al., Nuc. Acid Res. 23:675- 682, 1995). 예시적 구체예에서, 본 발명의 방법은 (i) 환자로부터 세포의 샘플을 수집하는 단계, (ii) 샘플의 세포로부터 핵산 (예를 들어, 게놈, mRNA 또는 둘 모두)를 단리하는 단계, (iii) 핵산 샘플을 핵산 (존재하는 경 우)의 하이브리드화 및 증폭이 일어나게 하는 조건하에서 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 하나 이상의 프라이머와 접촉시키는 단계, 및 (iv) 증폭 생성물의 존재 여부를 검출하거나, 증폭 생성물의 크기를 검출하고 길이를 대조 샘플과 비교하는 단계를 포함한다. PCR 및/또는 LCR은 본원에 기재된 돌연변이를 검출하기 위해 사용되는 기술 중 어느 하나와 함께 예비 증폭 단계로서 사용하는 것이 바람직할 수 있는 것으로 예상된다.
따라서, 또한 본 발명은 마커 핵산 mRNA가 배양된 세포에서 검출가능한 세포 또는 조직을 작용제에 노출시켜서 작용제가 mRNA의 생성을 억제하거나 향상시킬 수 있는 지의 여부를 결정하고; 노출된 세포 또는 조직에서 mRNA의 수준을 측정하는 것을 포함하여, 시험관내에서 핵산 마커의 발현을 억제하거나 향상시키는 작용제를 스크리닝하는 방법을 포함하며, 여기서 세포주를 작용제에 노출시킨 후 mRNA의 수준이 감소한 것은 마커 핵산 mRNA 생성의 억제를 나타내고, mRNA 수준이 증가한 것은 마커 mRNA 생성의 향상을 나타낸다.
대안적으로, 스크리닝 방법은 마커 단백질이 배양된 세포에서 검출가능한 세포 또는 조직를 마커 단백질의 생성을 억제하거나 향상시킬 것으로 추정되는 작용제에 대해 시험관내 스크리닝하고, 세포 또는 조직에서 마커 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 세포 또는 조직을 작용제에 노출시킨 후 마커 단백질의 수준이 감소한 것은 마커 단백질 생성의 억제를 나타내고, 마커 단백질의 수준이 증가한 것은 마커 단백질 생성의 향상을 나타낸다.
또한, 본 발명은 마커 mRNA 또는 단백질이 검출가능한 종양 세포를 지닌 피 검체를 3마커 mRNA 또는 단백질의 생성을 억제하거나 향상시킬 것으로 추정되는 작용제에 노출시키고, 노출된 포유동물의 종양 세포에서 마커 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함하여, 마커 핵산의 발현을 억제하거나 향상시키는 작용제를 스크리닝하는 생체내 방법을 포함한다. 피검체를 작용제에 노출시킨 후 마커 mRNA 또는 단백질의 수준이 감소한 것은 마커 핵산 발현의 억제를 나타내고, 마커 mRNA 또는 단백질의 수준이 증가한 것은 마커 핵산 발현의 향상을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 마커 핵산을 발현하는 세포를 시험 화합물과 함께 인큐베이션시키고, mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 세포 집단에서 마커 핵산의 발현 수준을 정량적으로 측정하는 방법, 및 작용제가 세포 집단에서 마커 핵산의 발현 수준을 증가시키거나 감소시킬 수 있는 지의 여부를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 작용제가 세포 집단에서 마커 핵산의 발현 수준을 증가시키거나 감소시킬 수 있는 지의 여부를 측정하는 방법은 (a) 대조표준 및 작용제 처리된 세포 집단으로부터의 세포 추출물을 준비하는 단계, (b) 세포 추출물로부터 마커 폴리펩티드를 단리하는 단계, 및 (c) 마커 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체 사이에 형성된 면역복합체의 양을 정량 (예를 들어, 병행적으로)하는 단계를 포함한다. 본 발명의 마커 폴리펩티드는 또한 이의 생체활성에 대해 검정함으로써 정량될 수 있다. 마커 핵산 발현의 증가를 유도하는 작용제는 대조 세포에서 형성된 면역복합체의 양과 비교하여 처리된 세포에서 형성된 면역복합체의 양을 증가시키는 이의 능력에 의해 확인될 수 있다. 유사한 방식으로, 마커 핵산의 발현을 감소시키는 작용제는 대조 세포와 비교하여 처리된 세포 추출물에서 형성된 면역복합체의 양을 감소시키는 이의 능력에 의해 확인될 수 있다.
예측 검정
주어진 항암제로부터의 임상적 이익을 예측할 수 있는 실험실 기반 검정은 암 환자의 임상적 관리를 크게 향상시킨다. 이러한 효과를 평가하기 위해, 항암제와 관련된 바이오마커가 처리 전, 처리 동안 및 처리 후에 생물학적 샘플 (예를 들어, 종양 샘플, 혈장)에서 분석될 수 있다.
처리를 모니터하기 위한 또 다른 방법은 혈청 프로테오믹(proteomic) 스펙트럼을 평가하는 것이다. 상세하게는, 혈장 샘플이 질량 분석법 (예를 들어, 표면 향상된 레이저 탈착 및 이온화)에 적용되고, 프로테오믹 스펙트럼이 각각의 환자에 대해 생성될 수 있다. 처리 전 및 처리 동안 환자로부터의 혈장의 분석으로부터 유도된 스펙트럼의 세트는 처리된 샘플을 비처리된 샘플과 완벽하게 구별하는 프로테오믹 패턴을 확인할 수 있는 반복 검색 알고리듬에 의해 분석될 수 있다. 그 후, 생성된 패턴은 처리 후 임상적 이익을 예측하는 데에 사용될 수 있다.
생물학적 샘플 (예를 들어, 종양 생검 샘플, 혈액 샘플)의 전세계적 유전자 발현 프로파일링 및 생물정보학에 의한 패턴 확인이 항암제에 대한 내성의 발생 뿐만 아니라 임상적 이익 및 민감도를 예측하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 처리 전 및 처리 동안 환자로부터의 전혈로부터 유래된 세포로부터 단리된 RNA가 애피메트리스 진칩 (Affymetrix GeneChip) 기술 및 알고리듬을 이용한 혈액 세포 유전자 발현 프로파일을 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 그 후, 이러한 유전자 발현 프로파일은 특정 항암제에 의한 처리로부터의 임상적 이익을 예측할 수 있다.
또한, 1D 1H-NMR (핵 자기 공명)에 의한 소변의 생화학적 조성의 분석이 예측 검정으로서 이용될 수 있다. 패턴 인식 기술은 항암제에 의한 처리에 대한 대사 반응을 평가하고, 이러한 반응을 임상적 종점과 상호관련시키기 위해 사용될 수 있다. 소변으로 배출되는 생화학적 또는 내인성 대사물질은 정상 피검체에 대한 양성자 NMR에 의해 잘 특성화되어 있다 (Zuppi, et al., Clin Chim Acta 265:85-97, 1997). 이러한 대사물질 (약 30 내지 40개)는 주요 대사 경로, 예를 들어 시트르산 및 우레아 사이클의 부산물을 나타낸다. 약물-자극, 질병-자극 및 유전자-자극은 자극에 대한 대사 반응의 타임라인(timeline) 및 크기를 나타내는 기선 소변 프로파일의 대사-특이적 변화를 생성시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 분석은 다변수성(multi-variant)이므로, 데이터 해석을 개선시키기 위해 패턴 인식 기술을 이용한다. 소변 대사 프로파일은 임상적 이익을 결정하기 위해 임상적 종점과 상호관련될 수 있다.
키트
본 발명은 소분자 효능의 특징이 되는 유전자의 발현 수준을 결정하기 위한 키트를 추가로 제공한다. 본 발명의 키트는 암을 발생시킬 소인이 있거나 암에 걸린 피검체를 확인하는 데에 유용할 뿐만 아니라 암 치료제를 확인하고 유효성을 검사하는 데에 유용할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 키트는 암 질병 세포의 하나 이상의 유전자 발현 프로파일 또는 적어도 질병 세포에서 소분자 효능의 특징이 되 는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 나타내는 값이 저장된 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함한다. 또한, 컴퓨터 판독가능한 매체는 대응 정상 세포, 약물로 처리된 질병 세포의 유전자 발현 프로파일, 및 본원에 기재된 임의의 다른 유전자 발현 프로파일을 포함할 수 있다. 키트는 컴퓨터 시스템의 메모리내로 로딩될 수 있는 발현 프로파일 분석 소프트웨어를 포함할 수 있다.
키트는 소분자 효능의 특징이 되는 유전자의 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 포함할 수 있다. 키트는 소분자 효능의 특징이 되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 검출하기 위한 하나 이상의 프로브 또는 프라이머 및/또는 프로브가 부착되어 있고 샘플에서 소분자 효능의 특징이 되는 하나 이상의 유전자의 발현을 검출하기 위해 사용될 수 있는 고체 지지체를 포함할 수 있다. 키트는 핵산 대조표준, 완충제 및 사용 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
그 밖의 키트는 암을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 예를 들어, 키트는 또한 소분자 효능의 특징이 되는 하나 이상의 유전자에 상응하는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다 (예를 들어, 암 환자를 치료하기 위해 사용됨). 핵산은 플라스미드 또는 벡터 (예를 들어, 바이러스 벡터)에 포함될 수 있다. 그 밖의 키트는 암의 특징이 되는 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 항체를 포함한다. 그 밖의 키트는 소분자 효능의 특징이 되는 유전자의 효능제 또는 길항제로서 본원에서 확인된 화합물을 포함한다. 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제 조성물일 수 있다.
실시예
본원에 기재된 실시예 및 구체예가 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니라 예시하기 위한 것이고, 다른 실시예가 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 사용될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 1. 유전자 발현 프로파일링 프로토콜
A. 혈액원
인간 혈액을 처리 전에 약물 소라페닙으로 처리된 환자들로부터 수득하였다. 환자들을 두 그룹, 즉, WHO 기준에 의해 결정하여 진행성 질병의 최상의 반응을 나타낸 환자들 ("진행성환자(progressor)") 및 안정한 질병의 최상의 반응 또는 우수한 반응을 나타낸 환자들 ("비진행성환자(non-progressor))"로 나누었다.
B. 인간 전혈로부터의 전체 RNA 단리
이러한 방법은 키아겐 QIAamp RNA 혈액 미니 키트 (Qiagen QIAamp RNA Blood Mini kit): Version 01/99: "QIAamp RNA Mini Protocol for Isolation of Total Cellular RNA from Whole Human Blood" (http://www.qiagen.com/literature/Handbooks/PDF/DNA RNA_isolation clinical/INT/QA_ RNA Blood Mini/qarnab blood.pdf)를 이용한다.
프로토콜
1. -80℃ 냉동장치로부터 전혈의 튜브를 꺼내고; 튜브를 얼음에 넣는다.
2. 얼음상에서 혈액을 부분적으로 해동시킨다.
■ 튜브를 얼음에 튜브 캡까지 잠기게 한다.
■ 튜브를 뒤집은 경우 혈액이 자유롭게 이동하는 얼음같은 슬러리가 될 때까지 해동시킨다.
3. 1부피의 전혈을 3부피의 빙냉 완충액 EL에 첨가한다 (프로토콜의 변형된 단계 1)
■ 2부피의 완충액 EL을 지닌 얼음상에 50ml 원뿔형 튜브를 놓는다
■ 부분적으로 해동된 전혈을 빙냉 완충액 EL을 함유하는 50ml 원뿔형 튜브내로 붓는다.
■ 남아있는 1부피의 빙냉 완충액 EL을 사용하여 제 1 튜브로부터의 잔류 혈액을 세정한다.
4. 50ml 원뿔형 튜브를 천천히 수 회에 걸쳐 뒤집고; 튜브를 얼음에 되돌려 놓는다.
5. 튜브를 얼음상에서 10분간 인큐베이션시키며, 인큐베이션 동안 튜브를 천천히 수 회에 걸쳐 뒤집는다.
6. 튜브를 4℃에서 테이블용 원심분리기에서 10' 동안 1000 RPM으로 회전시킨다.
7. 상층액을 생물학적위험 폐기물에 천천히 따라내고; 50ml 원뿔형 튜브를 얼음상에 놓았다.
8. 1부피의 빙냉 완충액 EL을 원뿔형 튜브의 아래쪽에 천천히 피펫팅(pipet)한다.
9. 튜브를 천천히 소용돌이치게 하여 림프구 세포 펠레트를 재현탁시키고; 얼음상에 놓여져 있었던 15ml 원뿔형 튜브내로 부었다.
10. 추가의 0.5부피의 빙냉 완충액 EL을 사용하여 50ml 원뿔형 튜브를 세정하고; 15ml 원뿔형 튜브내의 제 1 세척물과 합친다.
11. 튜브를 4℃에서 테이블용 원심분리기에서 5' 동안 1000 RPM으로 회전시킨다.
12. 세포 펠레트를 어지럽히지 않도록 주의하며 좁은 피펫 팁 및 진공원을 사용하여 상층액을 조심스럽게 분리한다.
13.580 ul의 완충액 RLT (B-ME를 함유함)을 세포 펠레트에 첨가하고; 격렬하게 볼텍싱하여 세포 펠레트를 가용화시킨다.
14. (a) 세포 용해물을 -80℃에서 동결시키거나 (b) 키아겐 프로토콜의 단계 7을 계속한다.
15. 키아겐 RNase 비함유 DNase 세트 (Qiagen RNase-Free DNase Set)를 이용하는 임의적 온-컬럼(on-column) DNase 분해 단계를 포함시키고; 실온에서 30분간 DNase 분해시킨다.
16. DNase 분해 전 및 후 둘 모두의 시점에서 컬럼을 세척하기 위해 500 ul (350 ul 대신) 완충액 RW1을 사용함으로써 DNase 분해 프로토콜을 변형시킨다.
17. 옵션(option) 12a를 포함시킨다.
18. 제공된 RNase 비함유 물로 RNA를 용리시키고; 44 ul를 직접 필터상으로 첨가하고, 1분간 정치시킨 후, 10,000rpm 이상에서 1분간 원심분리한다. 용리는 반복하지 않는다.
19. 용리된 혈액 RNA의 튜브를 -80℃에서 저장한다.
C. 애피메트릭스 진칩 마이크로어레이 방법
제 1 및 제 2 가닥 cDNA 합성을 애피메트릭스 프로토콜에 의해 기재된 바와 같이 수퍼스크립트 초이스 시스템 (Superscript Choice System) (Invirogen; Carlsbad, CA)을 이용하여 500 ng 내지 5 ug RNA를 사용하여 수행하였다. 요약하면, 100pmol T7 d(T)24 프라이머 (Invitrogen, CA)를 RNA에 첨가하고, 70℃에서 10분간 인큐베이션시키고, 얼음상에서 켄칭시켰다. 그 후, 혼합물을 제 1 가닥 cDNA 완충액, 10 mM DTT 및 1mM dNTP 내에서 42℃에서 2분간 인큐베이션시켰다. 그 후, 200U SSII 역전사효소를 첨가하고, 42℃에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 그 후, 제 2 가닥 완충액, 0.2 mM dNTP, 10U 이. 콜라이 DNA 리가아제, 4OU DNA 중합효소 I, 및 2U RNase H를 첨가한 후 각각의 튜브를 16℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 2시간 후, 10U T4 DNA 중합효소를 첨가하고, 반응물을 16℃에서 추가 5분간 인큐베이션시켰다. 0.5 M EDTA를 첨가하여 반응을 중지시키고, cDNA를 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 추출에 이어서 7.5 M NH4OAc에 의한 에탄올 침전을 사용하여 정제하였다. 펠레트를 DEPC H2O에 재현탁시켰다.
어레이 분석을 위한 cDNA는 제조업자에 의해 설명된 바와 같이 바이오어레이 하이일드 트랜스크립션 키트 (BioArray HighYield Transcription Kit) (Enzo Diagnostics, NY)를 사용하여 cDNA의 시험관내 전사에 의해 생성시켰다. 요약하면, 주형 cDNA를 HY 완충액, 비오틴(Biotin) NTP, DTT, RNase 억제제 및 T7 RNA 중합효소와 혼합하였다. 튜브를 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션시켰다. cRNA를 RNeasy 클린-업(clean-up) 절차를 이용하여 정제하고, UV 분광법에 의해 측정하였다. 15 μg 이하의 cRNA를 .2M 트리스-아세테이트, 0.5M KOAc 및 0.15M KOAc 중에서 94℃에서 35분간 단편화시켰다. 어레이 하이브리드화를 위해, 단편화된 cRNA, 50 pM 대조 올리고 B2, 애피메트릭스로부터의 대조 cRNA 스파이크(spike), 30 μg 청어 정자 DNA, 150 μg BSA 및 Hyb 완충액 (10OmM MES, 1M Na+, 2OmM EDTA, .01% Tween20)으로부터 칵테일(cocktail)을 제조하였다.
애피메트릭스로부터의 HG-U133 플러스(Plus) 2.0 어레이 (약 50,000개의 RNA 전사체를 나타내는 60,000개 이상의 프로브 세트를 함유함)를 진칩 하이브리드화 오븐 640에서 60rmp으로 회전시키며 45℃에서 10분간 하이브리드화 완충액과 사전 하이브리드화시킨 후, 샘플 하이브리드화 칵테일의 부분과 밤새 하이브리드화시켰다.
그 후, 칩을 6X SSPE, .01% 트윈 20, 0.005% 안티포움(Antifoam), 및 100mM MES로 연속 세척하였다. 이러한 칩을 100mM MES 및 1.2mg BSA 중의 6ug 피코에리트린-스트렙타비딘 (Molecular Probes, CA)으로 염색하였다. 칩을 488nm에서 진칩 스캐너 (GeneChip Scanner) 3000 (GCS3000)에 의해 스캐닝하고, 애피메트릭스로부터의 마이크로어레이 슈트 (MicroArray Suite) 5.0 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 상기 소프트웨어는 어레이에 의해 생성된 광의 세기를 유전자 발현의 수준을 나타내는 수치로 디지털 변환시킨다.
D. 데이터 분석
목적은 진행성환자와 비진행성환자를 구별하기 위한 마커의 세트를 생성시키는 것이다. 마커 세트 원 (Marker Set One) (표 1)은 서포트 벡터 머신 (support vector machine)를 사용하여 환자가 진행성환자인지 비진행성환자인지의 여부를 예측하기 위한 최적의 세트인 프로브 세트 중의 하나의 세트이다. 최적의 세트는 최대의 예측 정확성 뿐만 아니라 비교적 소수의 유전자를 나타내는 세트인 것으로 결정된다. 이러한 마커 세트는 하기 방법을 이용하여 유도되었다:
1. 데이터를 스폿파이어(Spotfire)내로 임포트(import)시켰다.
2. 진행성환자와 비진행성환자 간의 처리 비교를 수행하였다.
3. 하기 기준을 이용하여 프로브 세트를 선택하였다:
a. 데이터는 각각의 그룹의 환자의 85% 이상에 대해 애피메트릭스 (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) 마이크로어레이 슈트 소프트웨어 v. 5.0에 의해 측정하여 프로브 세트가 모두 "앱센트(Absent)"는 아님을 나타냈다.
b. 이러한 기준을 만족시키지 않는 모든 프로브 세트를 추가의 분석으로부터 제외시켰다.
4. 남아있는 데이터를 WEKA (참조: Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Ian H. Witten, Eibe Frank. Morgan Kaufmann, October 1999. ISBN 1- 55860-552-5) 소프트웨어 패키지 및 서포트 벡터 머신 (Support Vector Machine)으로 일컬어지는 알고리듬을 이용하는 선택 과정에서 사용하였다. 상기 소프트웨어는 프로브 세트를 환자에서의 최상의 반응을 예측하기 위한 이의 관련성에 대해 등급을 매겼다.
5. 환자가 진행성환자인지 비진행성환자인 지의 여부를 예측하는 경우 교차-유효성검사(cross-validation)에 의해 측정하여 100%의 추정 정확도를 나타내는 작은 서브셋을 결정하기 위해 최상위 등급이 매겨진 프로브 세트를 사용하여 다수의 모델을 생성하였다.
6. 상기 기준을 충족하는 최상의 모델을 생성시키는 프로브 세트는 주해 (참조: Affymetrix web site address (file dated 16Sep2005) http://www.affymetrix.com/support/technical/byproduct.affx?product=hg-u133-plus)와 함께 표 1에 기재되어 있다.
표 1
Figure 112008041690765-PCT00001

Claims (20)

  1. (a) 항암제로 치료하기 전에 환자로부터 채취한 제 1의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 항암제로 치료한 후에 환자로부터 채취한 적어도 제 2의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 제 2의 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 유전자(들) 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 제 1의 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 유전자(들) 또는 유전자 생성물의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하여 항암제를 투여함으로써 암 치료중인 환자의 반응을 모니터하는 방법으로서, 제 1의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준과 비교하여 제 2의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 변화된 경우 항암제에 의한 치료 효능을 나타내는, 항암제를 투여함으로써 암 치료중인 환자의 반응을 모니터하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 항암제가 멀티-키나아제 (multi-kinase) 억제제인 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 하나 이상의 유전자가 서열 확인 번호 1 내지 18로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 멀티-키나아제 억제제가 소라페닙(sorafenib)인 방법.
  5. (a) 항암제로 치료하기 전에 환자로부터 채취한 제 1의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 환자로부터 채취한 적어도 제 2의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 제 2의 생물학적 샘플은 항암제에 노출된 것인 단계; 및
    (c) 제 2의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 유전자(들) 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 제 1의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 유전자(들) 또는 유전자 생성물의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하여 항암제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법으로서, 제 1의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준과 비교하여 제 2의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 변화된 경우 항암제에 대한 환자의 반응이 예측되는, 항암제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 항암제가 멀티-키나아제 억제제인 방법.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 하나 이상의 유전자가 서열 확인 번호 1 내지 18로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 멀티-키나아제 억제제가 소라페닙인 방법.
  9. (a) 화합물로 처리하기 전에 세포 또는 조직 샘플에서 하나 이상의 유전자 및/또는 유전자 생성물의 발현 수준을 분석하는 단계;
    (b) 화합물로 처리한 후에 세포 또는 조직 샘플에서 하나 이상의 유전자 및/또는 유전자 생성물의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하여 암 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법으로서, 유전자 및/또는 유전자 생성물의 발현 수준이 변화된 경우 약물 효능을 나타내는, 암 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 화합물이 멀티-키나아제 억제제인 방법.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 하나 이상의 유전자가 서열 확인 번호 1 내지 18로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 멀티-키나아제 억제제가 소라페닙인 방법.
  13. (a) 환자로부터 채취한 제 1의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 정상 환자 샘플로부터 채취한 적어도 제 2의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 제 1의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 제 2의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하여 환자를 암에 대해 진단하는 방법으로서, 제 2의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준과 비교하여 제 1의 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 변화된 경우 상기 질병으로 진단되는, 환자를 암에 대해 진단하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 하나 이상의 유전자가 서열 확인 번호 1 내지 18로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 서열 확인 번호 1 내지 18로 구성된 군으로부터 선택된 2개 이상의 유전자에 상응하는 2개 이상의 프로브를 포함하는 어레이.
  16. 서열 확인 번호 1 내지 18로부터 선택되는 핵산의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머 또는 프로브를 포함하는 시험 키트.
  17. 제 16항에 있어서, 조직 또는 세포 샘플을 현탁시키거나 고정시키기 위한 용액, 세포를 용해시키기 위한 용액, 하이브리드화 용액, 핵산 단리를 위한 용액, 대조 샘플 및 키트의 사용 설명서로부터 선택되는 하나 이상의 구성요소를 추가로 포 함하는 시험 키트.
  18. 서열 확인 번호 1 내지 18로부터 선택되는 유전자에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체를 포함하는 시험 키트.
  19. 제 18항에 있어서, 항체가 표지된 것인 시험 키트.
  20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 조직 또는 세포 샘플을 현탁시키거나 고정시키기 위한 용액, 세포를 용해시키기 위한 용액, 기질, 완충 시약, 차단제(blocker) 시약, 블롯팅(blotting) 시약, 대조 샘플 및 키트의 사용 설명서로부터 선택되는 하나 이상의 구성요소를 추가로 포함하는 시험 키트.
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