PL219013B1

PL219013B1 - Białko fuzyjne TACI-immunoglobulina, kodująca je cząsteczka kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania białka fuzyjnego TACI-immunoglobulina, zastosowanie białka fuzyjnego TACI-immunoglobulina i kompozycja farmaceutyczna zawierająca te białko fuzyjne

Info

Publication number: PL219013B1
Application number: PL366760A
Authority: PL
Inventors: Mark W. Rixon; Jane A. Gross
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2001-05-24
Filing date: 2002-05-20
Publication date: 2015-02-27
Also published as: CA2448123C; BRPI0209933B1; CN101628111A; CN1612750B; KR100976743B1; US7635767B2; US7964711B2; JP5149245B2; HK1076603A1; PT2116259E; US9346878B2; WO2002094852A2; BR0209933A; IL158920A0; PL403488A1; US7862814B2; EP1436003B3; CN101628111B; EA200301146A3; EP1436003B1

Description

Opis wynalazku

Dziedzina techniki

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest białko fuzyjne TACI-immunoglobulina/kodująca je cząsteczka kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania białka fuzyjnego TACI-immunoglobulina oraz zastosowanie białka fuzyjnego TACI-immunoglobulina i kompozycja farmaceutyczna zawierająca te białko fuzyjne.

Stan techniki

Cytokiny są rozpuszczalnymi drobnymi białkami uczestniczącymi w wywieraniu wielu efektów biologicznych, takich jak regulacja wzrostu i różnicowania wielu typów komórek (zob. np. Arai i wsp., Annu. Rev. Biochem. 53:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol 3:311 (1991); Paul i Seder, Cell 76:241 (1994)). Do białek z grupy cytokin należą: interleukiny, interferony, czynniki pobudzające wzrost kolonii, czynniki martwicy nowotworu i inne cząsteczki regulacyjne. Na przykład ludzka interleukina-17 jest cytokiną stymulującą ekspresję interleukiny-6, wewnątrzkomórkowej cząsteczki adhezyjnej 1, interleukiny-8, czynnika stymulującego kolonie makrofagów i granulocytów oraz prostaglandyny E2; odgrywa ona również rolę w preferencyjnym dojrzewaniu prekursorów hematopoetycznych CD34+ do neutrofili (Yao i wsp., J. Immunol. 155:5483 (1995); Fossiez i wsp., J. Exp. Med. 133:2593 (1996)).

Receptory wiążące cytokiny typowo składają się z jednego lub kilku integralnych białek błonowych wiążących się z cytokiną z dużym powinowactwem i przekazujących ten efekt wiązania na komórkę za pośrednictwem części cytoplazmatycznej pewnych podjednostek receptorowych. Receptory cytokin podzielono na kilka klas na podstawie podobieństwa ich domen wiążących ligandy zewnątrzkomórkowe. Na przykład łańcuchy receptorowe odpowiedzialne za wiązanie i/lub transdukowanie efektu interferonów należą do rodziny receptorów cytokin typu II na podstawie charakterystycznej domeny zewnątrzkomórkowej złożonej z 200 reszt.

Interakcje komórkowe zachodzące w czasie reakcji immunologicznej regulowane są przez receptory należące do kilku rodzin receptorów powierzchni komórkowej, do których należy rodzina receptorów czynnika martwicy nowotworów (TNFR). Rodzina TNFR obejmuje kilka receptorów glikoproteinowych stanowiących integralną część błony komórkowej, z których wiele w połączeniu z odpowiednimi ligandami reguluje interakcje między różnymi liniami komórek hematopoetycznych (zob. np. Cosman, Stem Cells 12:440 (1994); Wajant i wsp., Cytokine Growth Factor Rev. 10:15 (1999); Yeh i wsp., Immunol. Rev. 169:283 (1999); Idriss i Naismith, Microsc. Res. Tech. 50:184 (2000)).

Jednym z takich receptorów jest TACI, aktywator przezbłonowy i interaktor CAML (von B^ow i Bram, Science 228:138 (1997); Bram i von B^ow, Patent Stanów Zjednoczonych nr 5.969.102 (1999)). TACI jest receptorem związanym z błoną komórkową, zawierającym domenę pozakomórkową, w skład której wchodzą dwa bogate w cysteinę pseudopowtórzenia, domenę przezbłonową i domenę cytoplazmatyczną, wchodzącą w interakcję z CAML (modulator wapnia i ligand cytofiliny) integralnym białkiem błonowym znajdującym się w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych, który jest koinduktorem aktywacji NF-AT przy nadmiernej ekspresji w komórkach Jurkat. TACI jest związane z limfocytami B i z podgrupą limfocytów T. Sekwencje nukleotydowe kodujące TACI i odpowiednie sekwencje aminokwasów podano w niniejszym opisie jako SEQ ID o numerach, odpowiednio, 1 i 2.

Receptor TACI wiąże się z dwiema substancjami należącymi do rodziny ligandów czynnika martwicy nowotworów (TNF). Jeden z ligandów oznaczony jest różnie jako ZTNF4, „BAFF, „neutrokina-α, „BLyS, „TALL-1 i „THANK (Yu i wsp., międzynarodowa publikacja nr WO 98/18921 (1998), Moore i wsp., Science 255:269 (1999); Mukhopadhyay i wsp., J. Biol. Chem. 274:15978 (1999); Schneider i wsp., J. Exp. Med. 189:1747 (1999); Shu i wsp., J. Leukoc. Biol. 65:680 (1999)). Sekwencję aminokwasową ZTNF4 podano jako SEQ ID nr 3. Drugi ligand oznacza się jako „ZTNF2, „APRIL i „ligand-1 śmierci TNRF (Hahne i wsp., J. Exp. Med. 188:1185 (1998); Kelly i wsp., Cancer Res. 60:1021 (2000)). Sekwencję aminokwasową ZTNF2 podano jako SEQ ID nr 4. Oba ligandy ulegają również wiązaniu przez receptor dojrzewania limfocytów-B (BCMA) (Gross i wsp., Nature 404:995 (2000)). Sekwencję nukleotydową i aminokwasową BCMA podano odpowiednio jako SEQ ID nr 26 i nr 27.

Udowodniona aktywność in vivo receptorów czynnika martwicy nowotworu ilustruje potencjał kliniczny rozpuszczalnych postaci receptora. Rozpuszczalne postacie receptora TACI wytwarza się w postaci białek fuzyjnych immunoglobuliny. Początkowe wersje pozwoliły uzyskać ulegające małej ekspresji heterogenne białko. Heterogenność obserwowano na końcu aminokwasowym TACI, na

PL 219 013 B1 końcu karboksylowym FC i w regionie szypułowym (stalk region) TACI. Istnieje zatem potrzeba opracowania farmaceutycznie użytecznych kompozycji receptora TACI.

Krótki opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest białko fuzyjne aktywatora przezbłonowego i modulatora wapnia i interaktora ligandu cyklofiliny (TACI)-immunoglobulina, charakteryzujące się tym, że białko TACI-immunoglobulina zawiera:

(a) cząsteczkę receptora aktywatora przezbłonowego i modulatora wapnia i interaktora ligandu cyklofiliny (TACI) przy czym receptor TACI składa się z sekwencji aminokwasowej wybranej z:

(i) reszt aminokwasowych 34 do 104 w SEQ ID nr 2;

(ii) reszt aminokwasowych 30 do 110 w SEQ ID nr 2; lub (iii) reszt aminokwasowych 30 do 154 w SEQ ID nr 2; przy czym cząstka receptora TACI wiąże co najmniej jeden z ZTNF2 lub ZTNF4; i (b) cząstkę immunoglobuliny. Korzystnie według wynalazku cząstka immunoglobuliny zawiera region stały domeny immunoglobuliny.

W następnej, innej korzystnej postaci wynalazku w białku fuzyjnym cząstka receptora TACI składa się z reszt aminokwasowych 34 do 104 w SEQ ID nr 2, przy czym to białko fuzyjne zawiera ponadto segment szypułowy składający się z ciągłych serii następujących po sobie 2 do 50 reszt aminokwasowych rozpoczynających się od reszty aminokwasowej 105 w SEQ ID nr 2.

W bardziej korzystnej postaci wynalazku cząstka immunoglobuliny zawiera domenę regionu stałego łańcucha ciężkiego, a jeszcze bardziej korzystnie cząstka immunoglobuliny zawiera domenę regionu stałego ludzkiego łańcucha ciężkiego.

W kolejnej korzystnej postaci wynalazku białko fuzyjne charakteryzuje się tym, że region stały łańcucha ciężkiego jest domeną regionu stałego łańcucha ciężkiego IgG1.

W kolejnej korzystnej postaci wynalazku białko fuzyjne charakteryzuje się tym, że cząstka immunoglobuliny jest fragmentem Fc IgG1, który zawiera domeny CH2 i CH3, a bardziej korzystnie cząstka immunoglobuliny jest fragmentem Fc IgG1 zawierającym sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 33.

Białko fuzyjne według wynalazku korzystnie posiada sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 54.

Białko fuzyjne TACI-immunoglobulina według wynalazku korzystnie jest dimerem.

Białko fuzyjne według wynalazku składa się lub zawiera wydzielaną postać którejkolwiek z SEQ ID nr 50, 52, 54 lub 56.

Korzystnie biało fuzyjne według wynalazku składa się lub zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 50, 52, 54 lub 56, gdzie sekwencja liderowa (tPA) optymalizowana (otPA) (SEQ ID nr 25) została usunięta.

Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje białko fuzyjne aktywatora przezbłonowego i modulatora wapnia i interaktora ligandu cyklofiliny (TACI)-immunoglobulina, przy czym białko TACI-immunoglobulina zawiera:

(i) reszt aminokwasowych 34 do 104 w SEQ ID nr 2;

(ii) reszt aminokwasowych 30 do 110 w SEQ ID nr 2; lub (iii) reszt aminokwasowych 30 do 154 w SEQ ID nr 2; przy czym cząstka receptora TACI wiąże co najmniej jeden z ZTNF2 lub ZTNF4; i (b) cząstkę immunoglobuliny; które to białko fuzyjne TACI-immunoglobulina korzystnie składa się lub zawiera wydzielaną postać którejkolwiek z SEQ ID nr 50, 52, 54 lub 56; i gdzie sekwencja liderowa (tPA) optymalizowana (otPA) (SEQ ID nr 25) została usunięta.

Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje białko fuzyjne jak zdefiniowano powyżej przy czym cząstka immunoglobuliny zawiera region stały domeny immunoglobuliny. W tym wykonaniu wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego ma sekwencję nukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydową SEQ ID nr 53.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania białka fuzyjnego aktywatora przezbłonowego i modulatora wapnia i interaktora ligandu cyklofiliny (TACI)-immunoglobulina, polegający na tym, że sposób ten obejmuje ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego zawierającą sekwencje nukleotydową, która koduje wspomniane białko fuzyjne, przy czym to białko fuzyjne zawiera:

(a) cząsteczkę receptora aktywatora przezbłonowego i modulator wapnia i interaktora ligandu cyklofiliny (TACI), przy czym receptor TACI składa się z sekwencji aminokwasowej wybranej z:

PL 219 013 B1 (i) reszt aminokwasowych 34 do 104 w SEQ ID nr 2;

(ii) reszt aminokwasowych 30 do 110 w SEQ ID nr 2; i (iii) reszt aminokwasowych 30 do 154 w SEQ ID nr 2; przy czym cząstka receptora TACI wiąże co najmniej jeden z ZTNF2 lub ZTNF4; i (b) cząstkę immunoglobuliny.

Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniane białko fuzyjne TACI-immunoglobulina składa się lub zawiera białko fuzyjne TACI-Fc. Bardziej korzystnie wspomniane białko fuzyjne TACI-immunoglobulina jest ludzkim immunoglobulinowym białkiem fuzyjnym Fc.

W następnym korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku wspomniana cząstka immunoglobuliny składa się z regionu zawiasowego ciężkiego łańcucha immunoglobuliny połączonego mostkiem dwusiarczkowym i domen CH2 i CH3, a także korzystnie cząstka immunoglobuliny jest cząstką Fc immunoglobuliny IgG1.

W bardziej korzystnej realizacji sposobu według wynalazku cząstka immunoglobuliny składa się z lub zawiera cząstką Fc immunoglobuliny IgG1 wybraną z grupy składającej się z Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 lub Fc8, korzystnie gdzie wspomniana cząstka immunoglobuliny zawiera cząstkę Fc5 immunoglobuliny.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku białko fuzyjne TACI-immunoglobulina składa się lub zawiera wydzieloną postać którejkolwiek z SEQ ID nr 50, 52, 54 lub 56.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku białko fuzyjne TACI-immunoglobulina korzystnie składa się lub zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 50, 52, 54 lub 56, gdzie sekwencja liderowa (tPA) optymalizowana (otPA) (SEQ ID nr 25) została usunięta.

Sposób według wynalazku korzystnie obejmuje ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego, która koduje wspomniane białko fuzyjne w komórce gospodarza; przy czym również korzystnie jest gdy wspomnianą komórką gospodarza jest komórka jajnika chomika mongolskiego.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku komórka jajnika chomika mongolskiego korzystnie jest pozbawiona funkcjonalnego genu reduktazy dihydrofolianu. Sekwencja nukleotydowa, która koduje białko fuzyjne TACI-immunoglobulina jest transfekowana do komórki gospodarza z wytworzeniem wektora ekspresji. W korzystnym rozwiązaniu ten wektor ekspresji zawiera plazmid ekspresji; gdzie korzystnie plazmid ekspresji zawiera promotor CMV i segment SV40 poliA.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku wzrost komórek gospodarza w obecności wzrastającego stężenia metotreksatu powoduje amplifikację genu reduktazy dihydrofilianu i przyłączonej sekwencji kodującej białko fuzyjne TACI-immunoglobulina.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie białka fuzyjnego aktywator przezbłonowy i modulator wapnia i interaktor ligandu cyklofiliny (TACI)-immunoglobulina do wytwarzania leku do leczenia tocznia rumieniowatego układowego, przy czym białko TACI-immunoglobulina zawiera:

(a) cząsteczkę receptora aktywatora przezbłonowego i modulatora wapnia oraz interaktora ligandu cyklofiliny (TACI) przy czym cząstka receptora TACI składa się z sekwencji aminokwasowej wybranej z:

(i) reszt aminokwasowych 34 do 104 w SEQ ID nr 2;

(ii) reszt aminokwasowych 30 do 110 w SEQ ID nr 2; lub (iii) reszt aminokwasowych 30 do 154 w SEQ ID nr 2; przy czym cząstka receptora TACI wiąże co najmniej jeden z ZTNF2 lub ZTNF4; i (b) cząstkę immunoglobuliny.

Korzystnie wspomniana cząsteczka immunoglobuliny zgodnie z zastosowaniem według wynalazku zawiera region stały domeny immunoglobuliny.

Lek do leczenia tocznia rumieniowatego układowego, zgodnie z zastosowaniem według wynalazku zawiera białko fuzyjne TACI-immunoglobulina i farmaceutycznie akceptowalny nośnik, i taka kompozycja farmaceutyczna jest do stosowania u ssaka.

W zastosowaniu według wynalazku cząstka receptora TACI składa się z reszt aminokwasowych 34 do 104 w SEQ ID nr 2, przy czym białko fuzyjne zawiera ponadto segment szypułowy składający się z ciągłych serii następujących po sobie 2 do 50 reszt aminokwasowych rozpoczynających się od reszty aminokwasowej 105 w SEQ ID nr 2.

W korzystnej realizacji zastosowania według wynalazku cząstka immunoglobuliny zawiera domenę regionu stałego łańcucha ciężkiego, a bardziej korzystnie cząstka immunoglobuliny zawiera domenę regionu stałego ludzkiego łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego korzystnie może być domeną regionu stałego łańcucha ciężkiego IgG1.

PL 219 013 B1

Zgodnie z korzystną postacią zastosowania według wynalazku cząstka immunoglobuliny jest fragmentem Fc IgG1, który zawiera domeny CH2 i CH3, a bardziej korzystnie cząstka immunoglobuliny jest fragmentem Fc IgG1 zawierającym sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 33.

W następnym korzystnym wykonaniu zastosowania, białko fuzyjne TACI-immunoglobulina zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 54.

W zastosowaniu według wynalazku białko fuzyjne TACI-immunoglobulina jest dimerem.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku lek jest do podawania komórkom w hodowli in vitro. Stosowanie prowadzi się także korzystnie w stosunku do ssaka.

W kolejnym wykonaniu zastosowania według wynalazku białko fuzyjne TACI-immunoglobulina składa się lub zawiera białko fuzyjne TACI-Fc; korzystnie gdzie wspomniane białko fuzyjne TACI-Fc jest białkiem fuzyjnym ludzkiej immunoglobuliny Fc.

Wspomniana cząstka immunoglobuliny składa się z regionu zawiasowego ciężkiego łańcucha immunoglobuliny połączonego mostkiem dwusiarczkowym i domen CH2 i CH3, a bardziej korzystnie cząstka immunoglobuliny jest cząstką Fc immunoglobuliny Ig1.

W pewnych wykonaniach zastosowania według wynalazku wspomniana cząstka immunoglobuliny składa się lub zawiera cząstkę Fc immunoglobuliny wybraną z grupy składającej się z Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 lub Fc8; przy czym korzystnie cząstka immunoglobuliny składa się lub zawiera cząstkę Fc5 immunoglobuliny. Także, w innych aspektach zastosowania według wynalazku białko fuzyjne TACI-immunoglobulina składa się lub zawiera wydzielone postacie którejkolwiek z SEQ ID nr 50, 52, 54 lub 56.

Korzystnie, wspomniane białko fuzyjne TACI-immunoglobulina składa się lub zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 50, 52, 54 lub 56, gdzie sekwencja liderowa (tPA) optymalizowana (otPA) (SEQ ID nr 25) została usunięta. Wspomniane białko fuzyjne TACI-immunoglobulina korzystnie może być jest dimerem. Białko fuzyjne w zastosowaniu według wynalazku może być stosowane do podawania do komórek w hodowli in vitro.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik i białko fuzyjne aktywator przezbłonowy i modulator wapnia i interaktor ligandu cyklofiliny (TACI)-immunoglobulina, przy czym białko fuzyjne TACI-immunoglobulina posiada sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 54.

Korzystnie białko fuzyjne TACI-immunoglobulina w kompozycji farmaceutyczna według wynalazku jest dimerem.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 przedstawia sekwencję aminokwasową ludzkiego TACI. Lokalizację bogatych w cysteinę pseudopowtórzeń wskazano przez zacienienie, domenę przezbłonową oznaczono przez ujęcie w ramkę, a region szypułowy wskazano linią przerywaną.

Fig. 2 jest schematycznym przedstawieniem immunoglobuliny należącej do podklasy IgG1. CL: region stały łańcucha lekkiego; CH1, CH2 i CH3: regiony stałe łańcucha ciężkiego, VH: region zmienny łańcucha lekkiego; VH: region zmienny łańcucha ciężkiego; CHO: węglowodan, N: koniec aminowy; C: koniec karboksylowy.

Fig. 3A, 3B, 3C i 3D przedstawiają porównanie ludzkiego regionu stałego γ1 typu dzikiego sekwencji aminokwasowej Fc z wariantami Fc-488, Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 i Fc8. Domena CH1 ludzkiego regionu stałego γ1 nie jest częścią Fc i nie została zatem pokazana. Wskazano lokalizację regionu zawiasowego domen CH2 i CH3. Wskazano reszty Cys, które normalnie uczestniczą w wiązaniu dwusiarczkowym z regionem stałym łańcucha lekkiego (LC) i regionem stałym łańcucha ciężkiego (HC). Symbol „.” wskazuje tożsamość z typem dzikim w tej pozycji, natomiast „*** wskazuje lokalizację końca karboksylowego i ilustruje różnicę końca karboksylowego FC6 w stosunku do innych wersji Fc.

Lokalizację aminokwasów wskazano pozycją indeksu EU.

125

Fig. 4 przedstawia swoiste wiązanie ¹²⁵I-ZTNF4 z różnymi strukturami TACI-Fc. Białka fuzyjne TACI-Fc zawierają cząstki TACI pozbawione pierwszych 29 reszt aminokwasowych sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 2. Jedno z białek fuzyjnych zawiera cząstkę TACI z nienaruszonym regionem szypułowym (TACI (d1-29)-Fc5), natomiast trzy białka fuzyjne TACI-Fc zawierają cząstki TACI z rozmaitymi delecjami w regionie szypułowym (TACI (d1-29, d107-154)-Fc5; TACI (d1-29, d111-154)-Fc5; TACI (d1-29, d120-154)-Fc5). Szczegóły doświadczalne opisano w przykładzie 4.

PL 219 013 B1

Szczegółowy opis wynalazku

1. Omówienie ogólne

Jak to opisano poniżej, przedmiotem niniejszego wynalazku jest białko fuzyjne aktywatora przezbłonowego i modulatora wapnia i interaktora ligandu cyklofiliny (transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand-interactor - TACI) - immunoglobulina i sposób wykorzystywania białek fuzyjnych TACI-immunoglobulina. Na przykład, zgodnie z opisanym wynalazkiem można hamować proliferację komórek nowotworowych, i metoda ta obejmuje podawanie do komórek nowotworowych kompozycji zawierającej białko fuzyjne TACI-immunoglobulina. Kompozycję taką można podawać do komórek hodowanych in vitro. Kompozycja może być także kompozycją farmaceutyczną zawierającą farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i białko fuzyjne TACI-immunoglobulina i tę kompozycję farmaceutyczną można podawać pacjentowi z nowotworem. Pacjentem tym może być ssak. Podawanie kompozycji farmaceutycznej może hamować na przykład proliferację limfocytów-B u pacjenta - ssaka.

W wynalazku omówione są również metody hamowania aktywności ZTNF4 u ssaka, obejmujące podawanie ssakowi kompozycji zawierającej TACI-immunoglobulinę. Aktywność ZTNF4 może być związana z różnymi chorobami i zaburzeniami. Na przykład kompozycję farmaceutyczną zawierającą białko fuzyjne TACI-immunoglobulina można stosować do leczenia choroby autoimmunologicznej, takiej jak: toczeń rumieniowaty układowy, miastenia, stwardnienie rozsiane, cukrzyca insulinozależna, choroba Crohna, reumatoidalne zapalenie stawów, młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów z zajęciem wielu stawów oraz łuszczycowe zapalenie stawów. Kompozycję farmaceutyczną zawierającą TACI-immunoglobulinę można także stosować do leczenia takich chorób, jak: dychawica oskrzelowa (astma), zapalenie oskrzeli, rozedma płuc oraz końcowe stadium niewydolności nerek. Kompozycję farmaceutyczną zawierającą TACI-immunoglobulinę można stosować także do leczenia chorób nerek, takich jak: kłębuszkowe zapalenie nerek, zapalenie naczyń, zapalenie nerek, amyloidoza oraz odmiedniczkowe zapalenie nerek lub zaburzenia, takiego jak: nowotwór, przewlekła białaczka limfocytarna, szpiczak mnogi, chłoniak nieziarniczy, choroba limfoproliferacyjna po przeszczepie oraz gammopatia łańcucha lekkiego. W niektórych przypadkach aktywność ZTNF4 może wiązać się z limfocytami T. Kompozycję farmaceutyczną zawierającą TACI-immunoglobulinę można także stosować do leczenia choroby lub zaburzenia powiązanego z immunosupresją, odrzuceniem przeszczepu, chorobą „przeszczep przeciwko gospodarzowi i procesem zapalnym. Na przykład, kompozycję farmaceutyczną zawierającą TACI-immunoglobulinę można stosować do zmniejszania zapalenia i do leczenia chorób, takich jak: bóle stawów, obrzęki, niedokrwistość i wstrząs septyczny.

W wynalazku opisuje się także sposoby zmniejszania poziomu we krwi krążącego ZTNF4 u pacjenta (ssaka), obejmujące podawanie ssakowi kompozycji farmaceutycznej, w skład której wchodzi farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i białko fuzyjne TACI-immunoglobulina, przy czym podawanie kompozycji farmaceutycznej zmniejsza poziom krążącego ZTNF4 we krwi ssaka. Na przykład, podawanie takiej kompozycji farmaceutycznej może zmniejszać poziom we krwi krążącego ZTNF4 o co najmniej 10%, o co najmniej 20%, o co najmniej 10-60%, o co najmniej 20-50% lub o co najmniej 30-40% w porównaniu z poziomem ZTNF4 we krwi przed podawaniem kompozycji farmaceutycznej. Specjalista jest w stanie zmierzyć poziom krążącego ZTNF4. Przykładowe sposoby opisano w przykładzie 4 i 5.

Jak to opisano poniżej, przykładowe białko fuzyjne TACI-immunoglobulina zawiera:

(a) cząstkę receptora TACI składającą się z fragmentu polipeptydu, którego sekwencja aminokwasowa odpowiada resztom aminokwasowym 30-154 SEQ ID nr 2, przy czym cząstka receptora TACI zawiera co najmniej jedną z (i) reszt aminokwasowych 34-66 SEQ ID nr 2 i (ii) reszty aminokwasowe 71-104 SEQ ID nr 2 i cząstka receptora TACI wiąże się co najmniej z jedną z substancji ZTNF2 lub ZTNF4, i (b) cząstkę immunoglobulinową zawierającą co najmniej region stały immunoglobuliny.

Odpowiednie cząstki receptorowe TACI zawierają: polipeptydy, w skład których wchodzą reszty aminokwasowe 34 do 66 SEQ ID nr 2 i reszty aminokwasowe 71 do 104 SEQ ID nr 2; polipeptydy zawierające reszty aminokwasowe 34 do 104 SEQ ID nr 2; polipeptydy zawierające sekwencje aminokwasowe reszt aminokwasowych 30 do 110 SEQ ID nr 2 i polipeptydy, których sekwencja aminokwasowa odpowiada resztom aminokwasowym 30 do 110 SEQ ID nr 2.

Cząstka immunoglobulinowa białka fuzyjnego TACI-immunoglobulina może zawierać region stały łańcucha ciężkiego, na przykład ludzki region stały łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego IgG1 jest jednym z przykładów korzystnego regionu stałego łańcucha ciężkiego. Przykładem

PL 219 013 B1 regionu stałego łańcucha ciężkiego IgG1 jest fragment Fc IgG1 zawierający domeny CH2 i CH3. Fragment Fc IgG1 może być fragmentem Fc IgG1 typu dzikiego lub zmutowanym fragmentem Fc IgG1, na przykład fragmentem Fc zawierającym sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 33. Przykładem białka fuzyjnego TACI-immunoglobulina jest białko, którego sekwencja aminokwasowa odpowiada sekwencji aminokwasów według SEQ ID nr 54.

Białka fuzyjne TACI-immunoglobulina według niniejszego wynalazku mogą być multimerami, na przykład dimerami.

Przykładem sekwencji nukleotydowej kodującej białko fuzyjne TACI-immunoglobulina jest sekwencja przedstawiona w SEQ ID nr 53.

Rozpuszczalne receptory TACI składają się z fragmentu polipeptydu o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej resztom aminokwasowym 30 do 154 SEQ ID nr 2, przy czym rozpuszczalny receptor TACI zawiera co najmniej jedną z następujących części: (i) reszty aminokwasowe 34 do 66 według SEQ ID nr 2, (ii) reszty aminokwasowe 71 do 104 SEQ ID nr 2, i przy czym rozpuszczalny receptor TACI wiąże się z ZTNF2 i/lub z ZTNF4. Dodatkowe rozpuszczalne receptory TACI opisano w niniejszym opisie jako możliwe korzystne cząstki receptora TACI dla białek fuzyjnych TACIimmunoglobulina. Ponadto, rozpuszczalne receptory TACI można stosować w sposobach opisanych dla białek fuzyjnych TACI-immunoglobulina.

2. Definicje

W poniższym opisie szeroko stosuje się pewną liczbę terminów. Poniżej przedstawiono ich definicje, które mają ułatwić zrozumienie wynalazku.

W rozumieniu niniejszego opisu „kwas nukleinowy lub „cząsteczka kwasu nukleinowego oznacza polinukleotydy, takie jak: kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) lub kwas rybonukleinowy (RNA), oligonukleotydy, fragmenty wytworzone na drodze polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) i fragmenty wytworzone na drodze ligacji, cięcia, działania endonukleazy i działania egzonukleazy. Cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być złożone z monomerów, które są naturalnie występującymi nukleotydami (takimi jak DNA i RNA) lub analogami naturalnie występujących nukleotydów (na przykład α-enancjomeryczne postacie naturalnie występujących nukleotydów), lub połączeniem obu takich substancji. Nukleotydy zmodyfikowane mogą zawierać zmiany w części cukrowej i/lub w części stanowiącej zasadę pirymidynową lub purynową. Do modyfikacji w części cukrowej należą na przykład zastąpienie jednej lub kilku grup hydroksylowych atomami chlorowców, grupami alkilowymi, aminami i grupami azydowymi, lub też funkcjonalizacja cukrów w postaci eterów lub estrów. Ponadto, całą cząstkę cukrową można zastąpić sferycznie i elektronicznie podobnymi strukturami, takimi jak aza-cukry i karbocykliczne analogi cukrów. Do przykładów modyfikacji części zasadowej należą: alkilacja puryn i pirymidyn, acylacja puryn lub pirymidyn oraz inne znane sposoby podstawienia heterocyklicznego. Monomery kwasu nukleinowego mogą być połączone wiązaniami fosfodiestrowymi lub analogami takich połączeń. Do analogów połączeń fosfodiestrowych należą: fosforotioesan, fosforoditioesan, fosforoselenoesan, fosforodiselenoesan, fosforoanilotioesan, fosforoanilidan, fosforoamidan, itp.

Termin „cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje również tak zwane „peptydowe kwasy nukleinowe, do których należą występujące naturalnie lub zmodyfikowane zasady kwasów nukleinowych połączone z rdzeniem poliamidowym. Kwasy nukleinowe mogą być jedno lub dwuniciowe.

Termin „komplement cząsteczki kwasu nukleinowego odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego o komplementarnej sekwencji nukleotydowej i odwrotnej orientacji w porównaniu z referencyjną sekwencją nukleotydową. Na przykład, sekwencja 5' ATGCACGGG 3' (SEQ ID nr 57) jest komplementarna do sekwencji 5' CCCGTGCAT 3' (SEQ ID nr 58).

Termin „ciągły oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego o ciągłej nici o sekwencji identycznej lub komplementarnej do innej cząsteczki kwasu nukleinowego. Sekwencje ciągłe, jak się mówi, nakładają się częściowo na daną nić cząsteczki kwasu nukleinowego w całości lub wzdłuż części nici cząsteczki kwasu nukleinowego.

Termin „zdegenerowana sekwencja nukleotydową oznacza sekwencję nukleotydów zawierającą jeden lub kilka kodonów zdegenerowanych w porównaniu z referencyjną cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd. Kodony zdegenerowane zawierają różne triplety nukleotydów, lecz kodują tę samą resztę aminokowasów (np. zarówno triplet GAV, jak i GAC kodują Asp).

Termin „gen strukturalny oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego transkrybowaną do RNA przekaźnikowego (mRNA), który następnie ulega translacji do sekwencji aminokwasów charakterystycznych dla danego polipeptydu.

PL 219 013 B1 „Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego jest cząsteczką kwasu nukleinowego, która nie jest włączona w DNA genomowe organizmu. Na przykład, izolowaną cząsteczką DNA jest cząsteczka DNA kodująca czynnik wzrostu oddzielona od DNA genomowego komórki. Innym przykładem izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego jest zsyntetyzowana chemicznie cząsteczka kwasu nukleinowego, która nie jest włączona w genom organizmu. Cząsteczka kwasu nukleinowego izolowana z danego gatunku jest mniejsza niż cała cząsteczka DNA chromosomu od tego gatunku.

„Struktura cząsteczki kwasu nukleinowego jest cząsteczką kwasu nukleinowego jedno lub dwuniciową, którą zmodyfikowano na drodze interwencji człowieka tak, aby zawierała segmenty kwasu nukleinowego połączone i ustawione w układzie, który nie istnieje w naturze.

„DNA liniowe oznacza niekoliste cząsteczki DNA posiadające wolne końce 5' i 3'. DNA liniowe można wytwarzać z zamkniętych kolistych cząstek DNA, takich jak plazmidy, na drodze trawienia enzymatycznego lub rozerwania fizycznego.

„DNA komplementarne (cDNA) jest jednoniciową cząsteczką DNA wytworzoną z matrycy mRNA przez enzym odwrotną transkryptazę. Typowo do zapoczątkowania odwrotnej transkrypcji stosuje się primer komplementarny do części mRNA. Specjaliści używają również terminu „cDNA w odniesieniu do dwuniciowej cząsteczki DNA składającej się z takiej jednoniciowej cząsteczki DNA i komplementarnej do niej nici DNA. Termin cDNA odnosi się również do klonów cząstek cDNA zsyntetyzowanych z matrycy RNA.

„Promotor jest sekwencją nukleotydową kierującą transkrypcją genu strukturalnego. Typowo, promotor znajduje się w niekodującym regionie 5' genu, w części bliższej w stosunku do miejsca początku transkrypcji genu strukturalnego. Elementy sekwencji w obrębie promotorów działających w trakcie inicjacji transkrypcji cechują się często konsensusowymi sekwencjami nukleotydowymi. Do takich elementów promotorowych należą miejsca wiązania polimerazy RNA, sekwencje TATA, sekwencje CAAT, elementy swoiste dla różnicowania (differentiation-specific elements - DSE: McGehee i wsp., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), elementy odpowiedzi cyklicznego AMP (CRE), surowicze elementy odpowiedzi (SRE: Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1: 47 (1990)), glukokortykoidowe elementy odpowiedzi (GRE) i miejsca wiązania innych czynników transkrypcji, takie jak CRE/ATF (O'Reilly i wsp., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), AP2 (Ye i wsp., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)), SP1, białko wiążące element odpowiedzi cAMP (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) oraz czynniki oktamerowe (zobacz ogólnie Watson i wsp., red., Molecular Biology of the Gene, wydanie czwarte (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), oraz Lemaigre i Rousseau, Biochem. J. 303:1(1994)). Jeżeli promotor jest promotorem indukowalnym, to prędkość transkrypcji w odpowiedzi na środek indukujący rośnie. Przeciwnie, prędkość transkrypcji nie jest regulowana przez środek indukujący, jeżeli promotor jest promotorem konstytutywnym. Znane są również promotory podatne na represję.

„Promotor rdzeniowy zawiera sekwencję nukleotydów niezbędnych do działania promotora, włączając w to sekwencję TATA i początek transkrypcji. Zgodnie z tą definicją promotor rdzeniowy może wykazywać wykrywalną aktywność lub może jej nie wykazywać w nieobecności swoistych sekwencji, które zwiększają aktywność lub nadają aktywność swoistą dla danej tkanki.

„Element regulacyjny jest to sekwencja nukleotydowa modulująca aktywność promotora rdzeniowego. Na przykład, element regulacyjny może zawierać sekwencję nukleotydową wiążącą się z czynnikami komórkowymi umożliwiającymi transkrypcję wyłącznie lub preferencyjnie w konkretnych komórkach, tkankach lub organellach. Te typy elementów regulacyjnych normalnie wiążą się z genami ulegającymi ekspresji w sposób „swoisty dla komórki, „swoisty dla tkanki lub „swoisty dla organelli.

„Wzmacniacz jest typem elementu regulacyjnego, który może zwiększać skuteczność transkrypcji niezależnie od odległości ani orientacji wzmacniacza w stosunku do miejsca początku transkrypcji.

„DNA heterologiczne oznacza cząsteczkę DNA lub populację cząsteczek DNA, które nie istnieją w warunkach naturalnych w danej komórce-gospodarzu. Cząsteczki DNA heterologiczne do danej komórki-gospodarza mogą zawierać DNA pochodzące z gatunku komórki-gospodarza (tzn. DNA endogenne), o ile to DNA gospodarza jest połączone z DNA niepochodzącym od gospodarza (tzn. z egzogennym DNA). Na przykład, cząsteczkę DNA zawierającą segment DNA niepochodzącego od gospodarza, kodujący polipeptyd połączony w sposób umożliwiający działanie z segmentem DNA gospodarza zawierającym promotor transkrypcji uważa się za heterologiczną cząsteczkę DNA. Przeciwnie, hetereologiczna cząsteczka DNA może zawierać gen endogenny połączony w sposób umożliwiający działanie z promotorem egzogennym. Innym przykładem jest na przykład cząsteczka DNA

PL 219 013 B1 zawierająca gen pochodzący z komórki typu dzikiego, którą uważa się za DNA heterologiczne, jeżeli cząsteczkę DNA wprowadza się do komórki zmutowanej niezawierającej genu typu dzikiego.

„Polipeptyd jest polimerem reszt aminokwasowych połączonym wiązaniami peptydowymi, wytworzonym naturalnie lub syntetycznie. Polipeptydy zawierające mniej niż około 10 reszt aminokwasowych powszechnie nazywa się peptydami.

„Białko jest makrocząsteczką zawierającą jeden lub więcej łańcuchów polipeptydowych. Białko może również zawierać elementy niepeptydowe, na przykład grupy węglowodanowe. Węglowodany i inne składowe niepeptydowe mogą być dodawane do białka przez komórkę, w której białko jest wytwarzane i będą one różne w zależności od typu komórki. Białka, według niniejszego opisu, definiuje się w zależności od struktury ich rdzenia aminokwasowego; zwykle nie uwzględnia się podstawników takich jak grupy węglowodanowe, które jednak mogą być obecne.

Peptyd lub polipeptyd kodowany przez cząsteczkę DNA niepochodzącego od gospodarza jest peptydem lub polipeptydem „heterologicznym.

„Zintegrowany element genetyczny jest to segment DNA, który włączono do chromosomu komórki gospodarza po wprowadzeniu elementu do komórki na drodze manipulacji człowieka. Według niniejszego wynalazku zintegrowane elementy genetyczne najczęściej pochodzą z linearyzowanych plazmidów, które wprowadza się do komórek poprzez elektroporację lub innymi sposobami. Zintegrowane elementy genetyczne przechodzą z pierwszej komórki gospodarza na jej potomstwo.

„Wektor klonujący jest cząsteczką kwasu nukleinowego, taką jak plazmid, kosmid lub bakteriofag, posiadającą zdolność do autonomicznej replikacji w komórce-gospodarzu. Wektory klonujące typowo zawierają jedno lub niewiele miejsc rozpoznawania przez endonukleazę restrykcyjną umożliwiających wprowadzenie cząsteczki kwasu nukleinowego w sposób przewidywalny bez utraty zasadniczej biologicznej funkcji wektora, jak również sekwencje nukleotydowe kodujące gen markerowy, nadające się do zastosowania przy identyfikowaniu i wybieraniu komórek transformowanych wektorem klonującym. Do genów markerowych typowo należą geny nadające oporność na tetracyklinę lub oporność na ampicylinę.

„Wektor ekspresji jest cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą gen ulegający ekspresji w komórce-gospodarzu. Typowo, wektor ekspresji zawiera promotor transkrypcji, gen i terminator transkrypcji. Ekspresję genu umieszcza się zwykle pod kontrolą promotora i o takim genie mówi się, że jest „połączony w sposób umożliwiający działanie z promotorem. Podobnie, element regulacyjny i promotor rdzeniowy są połączone w sposób umożliwiający działanie, jeżeli element regulacyjny moduluje aktywność promotora rdzeniowego.

„Rekombinacyjny gospodarz jest to komórka zawierająca heterologiczną cząsteczkę kwasu nukleinowego taką jak wektor klonujący lub wektor ekspresji. W kontekście niniejszego wynalazku przykładem rekombinacyjnego gospodarza jest komórka wytwarzająca białko fuzyjne TACI-Fc z wektora ekspresyjnego.

„Integracyjne transformanty są to rekombinacyjne komórki-gospodarze, w których DNA heterologiczne zostało zintegrowane do DNA genomowego komórek.

„Białko fuzyjne jest białkiem hybrydowym ulegającym ekspresji przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencje nukleotydowe z co najmniej dwóch genów. Na przykład białko fuzyjne TACI-immunoglobulina zawiera cząstkę receptora TACI i cząstkę immunoglobuliny. W rozumieniu niniejszego opisu „cząstka receptora TACI jest częścią domeny zewnątrzkomórkowej receptora TACI wiążącą się z ZTNF2 i/lub ZTNF 4. Zwrot „cząstka immunoglobulinowa odnosi się do polipeptydu zawierającego region stały immunoglobuliny. Na przykład, cząstka immunoglobulinowa może zawierać region stały łańcucha ciężkiego. Termin „białko fuzyjne TACI-Fc odnosi się do białka fuzyjnego TACI-immunoglobulina, w którym cząstka immunoglobulinowa zawiera regiony stałe łańcuchów ciężkich immunoglobuliny CH2 i CH3.

Termin „receptor oznacza białko związane z komórkami wiążące się z cząsteczką bioaktywną zwaną ligandem. Ta interakcja pośredniczy w oddziaływaniu ligandu na komórkę. W kontekście wiązania receptora TACI zwrot „wiąże się swoiście lub „wiązanie swoiste odnosi się do zdolności ligandu do kompetycyjnego wiązania z receptorem. Na przykład, ZTNF4 swoiście wiąże się z receptorem TACI, co można wykazać poprzez obserwowanie kompetycji o receptor TACI między wykrywalnie oznakowywanym ZTNF4 i niewyznakowanym ZTNF4.

Receptory mogą być związane z błoną, cytozolowe lub jądrowe; monomeryczne (np. receptor hormonu stymulującego tarczycę, receptor beta adrenergiczny) lub multimeryczne (np. receptor PDGF, receptor hormonu wzrostu, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor erytro10

PL 219 013 B1 poetynowy i receptor IL-6). Receptory związane z błonami cechują się strukturą wielodomenową zawierającą pozakomórkową domenę wiążącą ligand i wewnątrzkomórkową domenę efektorową, która typowo uczestniczy w przekazywaniu sygnałów. W pewnych receptorach związanych z błonami pozakomórkowa domena wiążąca ligand i wewnątrzkomórkowa domena efektorowa znajdują się w odrębnych polipeptydach składających się na pełny receptor funkcjonalny.

Ogólnie, w wyniku wiązania ligandu z receptorem, dochodzi do zmian konformacji w receptorze powodujących interakcję między domeną efektorową a innymi cząsteczkami w komórce, co z kolei prowadzi do zmiany metabolizmu komórki. Do zmian metabolicznych, często związanych z interakcjami receptor - ligand, należą: transkrypcja genu, fosforylacja, defosforylacja, zwiększenie wytwarzania cyklicznego AMP, mobilizacja wapnia komórkowego, mobilizacja lipidów błonowych, adhezja komórek, hydroliza lipidów inozytolowych i hydroliza fosfolipidów.

Termin „wydzielnicza sekwencja sygnałowa oznacza sekwencję DNA kodującą peptyd („peptyd wydzielniczy), który jako składnik większego polipeptydu kieruje ten większy polipeptyd przez szlak wydzielniczy komórki, w której ulega syntezie. Większy polipeptyd często ulega cięciu celem usunięcia peptydu wydzielniczego w czasie przechodzenia przez szlak wydzielniczy.

„Izolowany polipeptyd jest to polipeptyd w zasadzie wolny od zanieczyszczających składników komórkowych takich jak węglowodany, lipidy lub inne zanieczyszczenia białkowe z natury związane z polipeptydem. Typowo, preparat izolowanego polipeptydu zawiera polipeptyd w postaci wysoce oczyszczonej, to znaczy o czystości co najmniej około 80%, co najmniej około 90%, co najmniej około 95%, większej niż 95% lub ponad 99%. Jednym ze sposobów wykazania, że dany preparat białka zawiera izolowany polipeptyd, jest pojawienie się pojedynczego prążka w elektroforezie na żelu poliakrylamidowym z solą sodową siarczanu dodecylowego (SDS) preparatu białka i barwieniu białkiem Coomassie Brilliant żelu. Jednakże termin „izolowany nie wyklucza obecności tego samego polipeptydu w innych postaciach fizycznych takich jak dimery lub postacie glikozylowane lub pochodne.

Terminy „końca aminowego i „końca karboksylowego stosowane są w niniejszym opisie w celu oznaczenia usytuowania w obrębie polipeptydów. Jeżeli pozwala na to kontekst, terminów tych używa się w odniesieniu do konkretnej sekwencji lub części polipeptydu w celu zaznaczenia proksymalności lub pozycji względnej. Na przykład, pewna sekwencja umieszczona w kierunku końca karboksylowego w odniesieniu do sekwencji referencyjnej w obrębie polipeptydu usytuowana jest proksymalnie do końca karboksylowego sekwencji referencyjnej, jednak niekoniecznie na końcu karboksylowym całości polipeptydu.

Termin „ekspresja odnosi się do biosyntezy produktu genowego. Na przykład, w przypadku genu strukturalnego, ekspresja obejmuje transkrypcję genu strukturalnego do mRNA i translację mRNA do jednego lub kilku polipeptydów.

Termin „wariant rozszczepieniowy w niniejszym opisie oznacza alternatywne postacie RNA transkrybowanego z genu. Odmiany rozszczepieniowe powstają naturalnie poprzez zastosowanie innych miejsc rozcinania w obrębie transkrybowanej cząsteczki RNA lub, rzadziej, pomiędzy oddzielnie transkrybowanymi cząsteczkami RNA i mogą skutkować powstaniem kilku mRNA transkrybowanych z tego samego genu. Warianty rozszczepieniowe mogą kodować polipeptydy o zmienionej sekwencji aminokwasów. Termin „odmiana rozszczepieniowa w niniejszym opisie oznacza również polipeptyd kodowany przez odmianę rozszczepieniową mRNA transkrybowanego z genu.

W rozumieniu niniejszego opisu termin „immunomodulator obejmuje cytokiny, czynniki wzrostu komórek macierzystych, limfotoksyny, cząsteczki kostymulujące, czynniki hematopoetyczne i syntetyczne analogi tych cząsteczek.

Termin „para komplement/antykomplement oznacza nieidentyczne cząstki tworzące w odpowiednich warunkach połączoną niekowalencyjnie stabilną parę. Na przykład, prototypem pary komplement/antykomplement jest biotyna i awidyna (lub streptawidyna). Do innych przykładów par komplement/antykomplement należą: pary receptor/ligand, przeciwciało/antygen (lub hapten, lub epitop), pary polinukleotydów sensownych/antysensownych itp. Jeżeli pożądane jest następnie rozszczepienie pary komplement/antykomplement, powinowactwo wiązania pary komplement/antykomplement wyno9 -1 si korzystnie poniżej 10⁹ M^-1.

„Fragment przeciwciała jest częścią przeciwciała taką jak F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab itp. Niezależnie od struktury fragment przeciwciała wiąże się z tym samym antygenem, który jest rozpoznawany przez nienaruszone przeciwciało.

Termin „fragment przeciwciała obejmuje również polipeptyd syntetyczny lub wytworzony technikami inżynierii genetycznej, wiążący się ze swoistym antygenem, taki jak polipeptydy składające się

PL 219 013 B1 z regionów zmiennych łańcucha lekkiego, fragmenty „Fv, składające się z regionów zmiennych łańcuchów ciężkiego i lekkiego, rekombinacyjne cząsteczki polipeptydów jednołańcuchowych, w których regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego połączone są łącznikiem peptydowym („białka scFv) i minimalne jednostki rozpoznawania, składające się z reszt aminokwasowych naśladujących region hiperzmienny.

„Przeciwciało chimeryczne jest to białko rekombinacyjne zawierające domeny zmienne i regiony determinujące komplementarność pochodzące z przeciwciał gryzoni, podczas gdy reszta cząsteczki przeciwciała pochodzi z przeciwciała ludzkiego.

„Przeciwciała humanizowane są to białka rekombinacyjne, w których mysie regiony determinujące komplementarność przeciwciała monoklonalnego przeniesiono z regionów zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego immunoglobuliny mysiej do ludzkiej domeny zmiennej.

W rozumieniu niniejszego opisu „środek terapeutyczny jest cząsteczką lub atomem sprzężonym z cząstką przeciwciała w celu wytworzenia koniugatu użytecznego w terapii. Przykładami środków terapeutycznych są: leki, toksyny, immunomodulatory, chelatory, związki boru, środki lub barwniki fotoaktywne lub radioizotopy.

„Wykrywalny znacznik jest to cząsteczka lub atom, który można sprzęgać z cząstką przeciwciała w celu wytworzenia cząsteczki użytecznej do diagnostyki. Przykładami wykrywalnych wyznakowań są: chelatory, środki fotoaktywne, radioizotopy, środki fluorescencyjne, jony paramagnetyczne lub inne cząstki znakujące.

Termin „etykieta powinowactwa w rozumieniu niniejszego opisu oznacza segment polipeptydowy, który można przyłączać do drugiego polipeptydu w celu umożliwienia oczyszczania lub wykrywania drugiego polipeptydu lub zapewnienia miejsc do przyczepienia drugiego polipeptydu do substratu. Ogólnie, jako etykietę powinowactwa można wykorzystywać dowolny peptyd lub białko, dla którego dostępne jest przeciwciało lub inny swoisty środek wiążący. Do etykiet powinowactwa należą: szlak polihistydynowy, białko A (Nilsson i wsp., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson i wsp., Methods Enzymol. 198:3 (1991)), glutationo-S-transferaza (Smith i Johnson, Gene 67:31 (1988)), etykieta powinowactwa Glu-Glu (Grussenmeyer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)), substancja P, peptyd FLAG (Hopp i wsp., Biotechnology 6:1204 (1998)), peptyd wiążący streptawidynę lub inne epitopy antygenowe lub domeny wiążące (zob. ogólnie, Ford i wsp., Protein Expression and Purification 2:95 (1991)). Cząsteczki DNA kodujące etykiety powinowactwa są dostępne w handlu (np. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Stany Zjednoczone).

„Przeciwciało nagie jest to całe przeciwciało, w przeciwieństwie do fragmentu przeciwciała, które nie jest sprzężone ze środkiem terapeutycznym. Do przeciwciał nagich należą zarówno przeciwciała poliklonalne, jak i monoklonalne, jak również pewne przeciwciała rekombinacyjne, na przykład chimeryczne i humanizowane.

W rozumieniu niniejszego opisu termin „składowa przeciwciała obejmuje zarówno przeciwciała całe, jak i fragmenty przeciwciał.

„Koniugat immunologiczny jest to koniugat składowej przeciwciała ze środkiem terapeutycznym lub wykrywalnym znacznikiem.

„Polipeptyd docelowy lub „peptyd docelowy jest to sekwencja aminokwasowa obejmująca co najmniej jeden epitop, ulegająca ekspresji na komórce docelowej, takiej jak komórka nowotworowa, lub na komórce zawierającej antygen środka zakaźnego. Limfocyty te rozpoznają epitopy peptydowe prezentowane przez cząsteczki głównego układu zgodności tkankowej do polipeptydu docelowego lub peptydu docelowego i typowo powodują lizę komórki docelowej lub rekrutują inne komórki immunologiczne do miejsca komórki docelowej, poprzez co zabijają komórkę docelową.

„Peptyd antygenowy jest to peptyd, który będzie wiązał się z cząsteczką głównego układu zgodności tkankowej, tworząc kompleks MHC-peptyd, rozpoznawany przez limfocyt T, poprzez co indukuje się reakcja limfocytu cytotoksycznego po prezentacji limfocytowi T. Tak więc peptydy antygenowe są zdolne do wiązania się z odpowiednią cząsteczką głównego układu zgodności tkankowej i do indukowania reakcji cytotoksycznych limfocytów T takich jak liza komórkowa lub uwolnienie swoistej cytokiny przeciwko komórce docelowej, która wiąże się lub wykazuje ekspresję antygenu. Peptyd antygenowy może być związany w obecności cząsteczki należącej do klasy I lub klasy II głównego układu zgodności tkankowej na komórce prezentującej antygen lub na komórce docelowej.

U Eucaryota polimeraza II RNA katalizuje transkrypcję genu strukturalnego do wytworzenia mRNA. Cząsteczkę kwasu nukleinowego można wytworzyć tak, aby zawierała matrycę polimerazy II RNA, w której transkrypt RNA zawiera sekwencję komplementarną do sekwencji swoistego mRNA.

PL 219 013 B1

Transkrypt RNA zwany jest „RNA antysensownym, natomiast cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca RNA antysensowne zwana jest „genem antysensownym. Cząsteczki RNA antysensownego są zdolne do wiązania z cząsteczkami mRNA, przez co uzyskuje się zahamowanie translacji mRNA.

Ze względu na nieprecyzyjność standardowych metod analitycznych, masę cząsteczkową i długość polimerów podano jako wartości przybliżone. Gdy wartość taką wyraża się jako „około X, należy rozumieć, że jest to wartość X ± 10%.

3. Wytwarzanie cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących białka TACI-immunoglobulina

Na Fig. 1 przedstawiono przewidywaną sekwencję aminokwasową ludzkiego TACI (von B^ow i Bram, Science 278:138 (1997)). Polipeptyd TACI zawiera następujące przewidywane elementy: (a) dwie bogate w cysteinę struktury pseudopowtórzeń charakterystyczne dla domen wiążących ligand czynnika martwicy nowotworów, (b) „region szypułowy o długości 62 aminokwasów położony między domenami wiążącymi ligand a domeną przezbłonową, (c) domenę przezbłonową o długości 20 aminokwasów i (d) domenę wewnątrzkomórkową o długości 127 aminokwasów. Sekwencja aminokwasowa nie zawiera przewidywanej hydrofobowej sekwencji sygnałowej końca aminowego.

W celu wytworzenia rozpuszczalnej postaci ludzkiego TACI do zastosowania jako inhibitor interakcji ligand natywny:receptor natywny wytworzono domenę pozakomórkową TACI - białko fuzyjne ludzkiej immunoglobuliny Fc. Dostępną sekwencję ludzkiego TACI zastosowano jako punkt wyjścia do opracowania cząsteczki białka fuzyjnego (von B^ow i Bram, Science 278:138 (1997)). Ta początkowa konstrukcja oznaczona jako „TACI-Fc4 zawierała reszty aminokwasowe od 1 do 154 polipeptydu TACI i opisany poniżej zmodyfikowany region ludzki Fc. Punkt fuzyjny reszty 154 wybrano w celu uwzględnienia jak największej części regionu szypułowego TACI bez uwzględniania potencjalnej części przewidywanej domeny przebłonowej.

Ponieważ natywny polipeptyd TACI nie zawiera amino końcowej sekwencji sygnałowej, do TACI dodano aminokońcową sekwencję sygnałową w celu wytworzenia wydzielanej postaci białka fuzyjnego TACI-Fc. Sekwencja sygnałowa była zmodyfikowaną sekwencją pre-pro ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu. Uwzględniono modyfikacje służące wzmocnieniu rozcinania przez peptydazę sygnałową i obróbki swoistej dla proteazy furynowej, dlatego też sekwencję tę nazywa się „zoptymalizowaną liderową tPA (otPA). Sekwencję otPA (SEQ ID nr 25) zilustrowano poniżej; zmodyfikowane reszty aminokwasowe zaznaczono zacienieniem. Sekwencję kodującą rekombinacyjne białko fuzyjne TACI-Fc wprowadzono do ekspresyjnego, który transfekowano do komórek jajników chomików chińskich.

-35 -30

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys miejsce rozcinania przez peptydazę sygnałową

-20 | -10

Gly Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu;

miejsce rozcinania przez furynę |

Arg Arg Phe Arg Arg

Transfekowane komórki jajników chomików chińskich wytwarzały białko TACI-Fc4 na niskim poziomie ok. 0,3 pg na komórkę dziennie. Analiza techniką Western blot białka TACI-Fc z kozią surowicą odpornościową, skierowaną przeciwko ludzkiemu Fc IgG, uwidoczniła dwa prążki, przy czym jeden prążek był mniejszy niż oczekiwana wielkość ok. 48 kDa. Analiza sekwencji aminokwasowej oczyszczonych białek wykazała, że mniejszy prążek odzwierciedlał rozcięcie białek fuzyjnych TACI w różnych miejscach w obrębie regionu szypułowego TACI. W odniesieniu do SEQ ID nr 2 stwierdzono, że główne końce znajdują się na resztach aminokwasowych 118 i reszty i 123, jakkolwiek białka były również rozcięte w pozycjach aminokwasowych 110, 139 i 141.

Oprócz heterogenności spowodowanej rozcinaniem w regionach szypułowych, heterogenność obserwowano również na końcach aminowym i karboksylowym. W odniesieniu do SEQ ID nr 2 stwierdzono, że główne końce aminowe znajdowały się na resztach aminowych 1, 10 i 13. Różnice w końcu karboksylowym odzwierciedlają naturalną heterogenność immunoglobulin rekombinacyjnych i immunoglobulinowych białek fuzyjnych, uwzględniającą niepełne usunięcie reszty lizynowej kodowanej na końcu karboksylowym. Stwierdzono, że innym źródłem heterogenności była zmienna natura struktury węglowodanowej połączonej z domeną CH2 immunoglobuliny kodowanej przez Fc.

PL 219 013 B1

W związku z obserwowaną heterogennością wytworzono nowe wersje TACI-Fc. Opracowano struktury zawierające co najmniej jedną z następujących odmian cząstki TACI: (1) delecja części regionu szypułowego TACI, (2) zastąpienie części regionu szypułowego TACI częścią regionu szypułowego BCMA, (3) poddanie mutacji reszty argininowej w pozycji 119 w celu wyeliminowania potencjalnego miejsca rozcinania przez furynę, (4) poddanie mutacji reszty glutaminowej w pozycji 121 w celu wyeliminowania potencjalnego miejsca rozcinania przez furynę, (5) poddanie mutacji reszty argininowej w pozycji 122 w celu wyeliminowania potencjalnego miejsca rozcinania przez furynę, (6) poddanie mutacji reszty aminowej w pozycjach 123 i 142 do reszt aminowych znajdujących się w odpowiednich pozycjach mysiego TACI, (7) zastąpienie sekwencji sygnałowej ludzkiego otPA ludzką sekwencją sygnałową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego, (8) poddanie mutacji reszty walinowej w pozycji 29 do metioniny i przyłączenie sekwencji sygnałowej otPA w pozycji końca aminowego do tej reszty oraz (9) przyłączenie sekwencji sygnałowej otPA umiejscowionej na końcu aminowym do reszty alaninowej w pozycji 30.

Wprowadzono również modyfikacje do cząstki immunoglobuliny. U wyższych kręgowców zidentyfikowano pięć klas immunoglobulin: IgG, IgA, IgM, IgD i IgE. Białka IgG, IgD i IgE są charakterystycznie połączonymi mostkami dwusiarczkowymi heterotetramerami, utworzonymi z dwóch identycznych łańcuchów ciężkich i dwóch identycznych łańcuchów lekkich. Typowo, IgM występuje w postaci pentameru tetrameru, natomiast IgA występuje w postaci dimeru tetrameru.

Najważniejszą klasą jest IgG; jest w normalnych warunkach drugą co do liczebności frakcją białek znajdującą się w osoczu. U ludzi IgG utworzone jest z czterech podklas oznaczanych jako IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Jak to ukazano na Fig. 2, każdy łańcuch ciężki immunoglobuliny zawiera region stały utworzony z domen białkowych regionów stałych (CH1, zawias, CH2 i CH3), które są niezmienne dla danej podklasy. Regiony stałe łańcuchów ciężkich klasy IgG identyfikowane są greckim symbolem γ. Na przykład, immunoglobuliny podklasy IgG1 zawierają region stały łańcucha ciężkiego γ1.

Fragment Fc lub domena Fc składa się z połączonych wiązaniami dwusiarczkowymi regionów zawiasowych łańcucha ciężkiego domen CH2 i CH3. W immunoglobulinowych białkach fuzyjnych domeny Fc podklasy IgG1 stosuje się często jako cząstkę immunoglobulinową, ponieważ czas półtrwania w surowicy IgG1 jest najdłuższy ze wszystkich białek surowicy. Długi czas półtrwania w surowicy może być korzystną cechą białka w badaniach zwierzęcych i w potencjalnym zastosowaniu terapeutycznym u człowieka. Ponadto, podklasa IgG1 wykazuje największą zdolność do przenoszenia czynności efektorowych związanych z przeciwciałami. Podstawową czynnością efektorową, która może być najbardziej użyteczna w białku fuzyjnym immunoglobulinowym, jest zdolność przeciwciała IgG1 do pośredniczenia w cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał. Z drugiej strony, może to być cechą niekorzystną w przypadku białka fuzyjnego działającego głównie jako antagonista. Zidentyfikowano kilka swoistych reszt aminokwasowych o dużym znaczeniu dla aktywności zależnej od stałego regionu przeciwciał w podklasie IgG1. Włączenie lub wykluczenie tych swoistych aminokwasów umożliwia zatem włączenie lub wykluczenie swoistej aktywności zależnej od regionu stałego immunoglobuliny.

W celu stworzenia białek fuzyjnych Fc wytworzono sześć wersji zmodyfikowanego ludzkiego Fc IgG1. Fc-488 opracowano do dogodnego klonowania białka fuzyjnego zawierającego ludzki region γ1 Fc i skonstruowano go, stosując region stały γ1 ludzkiej immunoglobuliny typu dzikiego jako matrycę. Ze względu na możliwość szkodliwego wpływu związanego z istnieniem nieparzystej reszty cysteiny, zadecydowano o zastąpieniu cysteiny (reszta aminokwasowa 24 według SEQ ID nr 6), która normalnie wiąże się z mostkiem dwusiarczkowym z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny, resztą serynową. Dodatkową zmianę wprowadzono na kodonie kodującym indeks EU pozycję 218 (reszta aminokwasowa 22 według SEQ ID nr 6): wprowadzono miejsce rozpoznawania enzymu restrykcyjnego BglII w celu ułatwienia późniejszych manipulacji DNA. Zmiany te wprowadzono do produktu PCR kodowanego na primerach PCR. Ze względu na lokalizację miejsca BglII i w celu pozyskania kompletnego regionu zawiasowego Fc do sekwencji partnerowych białka fuzyjnego wprowadzono kodony dla indeksu EU pozycji 216 i 217 (reszty aminokwasowe 20 i 21 w SEQ ID nr 6).

Fc4, Fc5 i Fc6 zawierają mutacje służące zmniejszeniu czynności efektorowych związanych z Fc poprzez zmniejszenie wiązania FcγRI i wiązania komplementu C1q. Fc4 zawiera te same substytucje aminokwasowe, które wprowadzono do Fc 488. Wprowadzono dodatkowe podstawienia aminokwasowe w celu zmniejszenia możliwych funkcji efektorowych związanych z Fc. Bardziej szczegółowo, wprowadzono trzy sekwencje aminokwasowe w celu zmniejszenia wiązania FcγRI. Były to podstawienia w pozycjach 234, 235 i 237 indeksu EU (reszty aminokwasowe 38, 39 i 41 SEQ ID nr 6).

PL 219 013 B1

Wykazano, że podstawienia w tych pozycjach zmniejszają wiązanie z FcyRI (Duncan i wsp., Nature 332:563 (1988)). Te podstawienia aminokwasowe mogą także zmniejszać wiązanie FcyRIIa, jak również wiązanie FcyRIII (Sondermann i wsp., Nature 406:267 (2000); Wines i wsp., J. Immunol. 164: 5313 (2000)).

Kilka grup badawczych opisywało znaczenie pozycji 330 i 331 indeksu EU (reszty aminokwasowej 134 i 135 SEQ ID nr 6) w wiązaniu C1q komplementu i w późniejszym ufiksowaniu komplementu (Canfield i Morrison, J. Exp. Med. 173: 1483 (1991); Tao i wsp., J. Exp. Med., 178:661 (1993)). Do Fc4 wprowadzono podstawienia aminokwasowe w tych pozycjach w celu zmniejszenia ufiksowania komplementu. Domena CH3 Fc4 jest identyczna z domeną znajdowaną w odpowiednim peptydzie typu dzikiego, z wyjątkiem kodonu stop, który zmieniono z TGA na TAA w celu wyeliminowania potencjalnego miejsca metylacji dam, gdy klonowane DNA hoduje się w szczepach E. coli dam plus.

W Fc5 resztę argininową w pozycji 218 indeksu EU zmutowano z powrotem do lizyny, ponieważ w białkach fuzyjnych zawierających to konkretne Fc nie stosowano schematu klonowania BglII. Pozostała część sekwencji Fc5 odpowiada powyższemu opisowi dla Fc4.

Fc6 jest identyczne jak Fc5, poza tym że wyeliminowano kodon lizynowy na zakończeniu karboksylowym. Lizyna z końca C dojrzałych immoglobulin ulega często usunięciu z dojrzałych immunoglobulin po translacji przed wydzieleniem limfocytów-B lub usunięciu w czasie krążenia w surowicy. W wyniku tego typowo w krążących przeciwciałach nie ma reszty lizynowej na końcu C. Podobnie jak w powyższych Fc4 i Fc5, kodon stop w sekwencji Fc6 zmieniono na TAA.

Fc7 jest identyczny z Fcy1 typu dzikiego, z wyjątkiem podstawienia aminokwasu w pozycji 297 indeksu EU umiejscowionego w domenie CH2. Pozycja Asn-297 indeksu EU (reszta aminokwasowa 101 SEQ ID nr 6) jest miejscem przyłączenia N-sprzężonego węglowodanu. N-sprzężony węglowodan wprowadza potencjalne źródło zmienności do ulegającego ekspresji rekombinacyjnej białka ze względu na możliwą zmienność między poszczególnymi partiami w odniesieniu do struktury węglowodanu. Usiłując wyeliminować tę możliwość zmienności, Asn-297 poddano mutacji do reszty glutaminowej w celu zapobieżenia przyłączaniu się N-sprzężonego węglowodanu w tej pozycji reszty. Węglowodan w reszcie 297 uczestniczy również w wiązaniu Fc z FcyRIII (Sondermann i wsp., Nature 406:267 (2000)). Usunięcie węglowodanu powinno zatem zmniejszać wiązanie białek fuzyjnych zawierających rekombinacyjne Fc7 do FcyRs. Jak wyżej, kodon stop w sekwencji Fc7 poddano mutacji do TAA.

Fc8 jest identyczne z regionem γ1 immunoglobuliny typu dzikiego przedstawionym w SEQ ID nr 6 z tym wyjątkiem, że resztę cysteinową w pozycji 220 indeksu EU (resztę aminokwasową 24 w SEQ ID nr 6) zastąpiono resztą serynową. Ta mutacja wyeliminowała resztę cysteinową, która w normalnych warunkach łączy się mostkiem dwusiarczkowym z regionem stałym łańcucha lekkiego immunoglobuliny.

Przykładowe struktury TACI-Fc przedstawiono w Tabeli 1.

T a b e l a 1

Przykłady struktur białka fuzyjnego TACI-Fc

Sekwencja TACI^a	Wersja Fc
1	2
TACI^b	Fc4
TACI^b	Fc5
TACI^b	Fcγ1
TACI (d107-154)	Fc5
TACI (R119Q)	Fc4
TACI (1-104)-BCMA (42-54)^c	Fc5
TACI (d143-150)	Fc5
TACI (R142G, d143-150)	Fc5
TACI (R119G, Q121P, R122Q, S123A)	Fc5
TACI (R119G, R122Q)	Fc5
TACI (d1-28, V29M)	Fc6

PL 219 013 B1 cd. tabeli 1

1	2
TACI (d1-29)	Fc6
TACI (d1-29)	Fc5
TACI (d1-29, d107-154)	Fc5
TACI (d1-29, d111-154)	Fc5
TACI (d1-29, d120-154)	Fc5

^aInformacje o umiejscowieniu, mutacjach i delecjach sekwencji aminokwasowych podano w nawiasach w odniesieniu do sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 2.

^bObejmuje reszty aminokwasowe 1 do 154 SEQ ID nr 2.

^cStruktura ta obejmuje reszty aminokwasowe 1 do 104 SEQ ID nr 2 (TACI) i aminokwasy 42 do 54 z SEQ ID nr 27 (BCMA).

W rekombinacyjnych komórkach jajnika chomików chińskich uzyskano produkcję białek TACI-Fc, po czym izolowano je i poddano analizie techniką Western blot i analizie sekwencji aminokwasowej. Nieoczekiwanie, delecja pierwszych 29 aminokwasów z końca N polipeptydu TACI spowodowała 10-krotne zwiększenie wytwarzania białek fuzyjnych TACI Fc przez komórki jajników chomików chińskich. Delecja ta zmniejszyła również rozszczepianie regionu szypułowego o pełnej długości. Ponadto, rozcinanie w obrębie regionu szypułowego TACI ulegało supresji poprzez zmniejszenie długości regionu szypułowego TACI lub poprzez zastąpienie regionu szypułowego TACI inną sekwencją aminokwasową (na przykład sekwencją aminokwasową regionu szypułowego BCMA).

Jak to opisano w Przykładzie 4, analizy funkcjonalne struktur TACI-Fc wskazują, że białka fuzyjne TACI (d1-29)-Fc5, TACI (d1-29, d107-154)-Fc5, TACI (d1-29, d111-154)-Fc5 oraz TACI (d1-29, d120-154)-Fc5 wykazują podobne powinowactwo wiązania w stosunku do ZTNF4. Jednakże, jak się wydaje, struktury TACI (d1-29)-Fc5, TACI (d1-29, d111-154)-Fc5 i TACI (d1-29, d120-154)-Fc5 wiążą więcej ZTNF4 na mol TACI-Fc niż struktura TACI (d1-29, d107-154)-Fc5. W zależności od zamierzonego przeznaczenia (to znaczy do leczenia, diagnostyki lub badań naukowych) można wykorzystywać białka fuzyjne TACI-Fc o dużej wydajności lub o małej wydajności. Ponadto, połączenie białek fuzyjnych TACI-Fc o dużej i o małej wydajności umożliwia miareczkowanie ZTNF2 lub ZTNF4.

Przedmiotem niniejszego wynalazku są białka fuzyjne TACI-immunoglobulina zawierające cząstkę receptorową TACI utworzoną z reszt aminokwasowych 30 do 106 według SEQ ID nr 2, 30 do 110 według SEQ ID nr 2, 30 do 119 według SEQ ID nr 2 lub 30 do 154 według SEQ ID nr 2. Przedmiotem niniejszego wynalazku są również białka fuzyjne TACI-immunoglobulina zawierające cząstkę receptorową TACI utworzoną z reszt aminokwasowych 31 do 106 według SEQ ID nr 2, 31 do 110 według SEQ ID nr 2, 31 do 119 według SEQ ID nr 2 lub 31 do 154 według SEQ ID nr 2.

Bardziej ogólnie, przedmiotem niniejszego wynalazku są białka fuzyjne TACI-immunoglobulina, w których cząstka receptorowa TACI składa się z fragmentu reszt aminokwasowych 30 do 154 według SEQ ID nr 2, i w których cząstka receptorowa TACI wiąże co najmniej jedną z substancji ZTNF2 lub ZTNF4. Takie fragmenty zawierają bogaty w cysteinę region pseudopowtórzeń i ewentualnie mogą zawierać co najmniej jeden segment N-końcowy, który położony jest w pozycji aminokońcowej w stosunku do bogatego w cysteinę regionu pseudopowtórzeń oraz segment szypułowy, który znajduje się w położeniu w kierunku końca karboksylowego w stosunku do bogatego w cysteinę regionu pseudopowtórzeń. Korzystne, bogate w cysteinę regiony pseudopowtórzeń zawierają polipeptydy, które: (a) zawierają co najmniej jedną z reszt aminokwasowych 34 do 66 według SEQ ID nr 2 i reszty aminokwasowe 71 do 104 według SEQ ID nr 2, (b) zawierają zarówno reszty aminokwasowe 34 do 66 SEQ ID nr 2, jak i reszty aminokwasowe 71 do 104 SEQ ID nr 2 lub (c) zawierają reszty aminokwasowe 34 do 104 według SEQ ID nr 2.

Korzystne segmenty N-końcowe zawierają następujące elementy (w odniesieniu do SEQ ID nr 2): resztę aminokwasową 33, reszty aminokwasowe 32-33, reszty aminokwasowe 31-33 i reszty aminokwasowe 30-33. Korzystne segmenty szypułowe zawierają jeden lub więcej aminokwasów spośród reszt aminokwasowych 105-154 według SEQ ID nr 2. Na przykład, segment szypułowy może składać się z następujących elementów (w odniesieniu do SEQ ID nr 2): reszta aminokwasowa 105, reszty aminokwasowe 105-106, reszty aminokwasowe 105-107, reszty aminokwasowe 105-108, reszty aminokwasowe 105-109, reszty aminokwasowe 105-110, reszty aminokwasowe 105-111, reszty aminokwasowe 105-112, reszty aminokwasowe 105-113, reszty aminokwasowe 105-114, reszty aminokwasowe 105-115, reszty aminokwasowe 105-116, reszty aminokwasowe 105-117, reszty aminokwasowe 105-118, reszty aminokwasowe 105-119, reszty aminokwasowe 105-120, reszty aminokwasowe 105-121, reszty aminokwasowe

PL 219 013 B1

105-122, reszty aminokwasowe 105-123, reszty aminokwasowe 105-124, reszty aminokwasowe 105-125, reszty aminokwasowe 105-126, reszty aminokwasowe 105-127, reszty aminokwasowe 105-128, reszty aminokwasowe 105-129, reszty aminokwasowe 105-130, reszty aminokwasowe 105-131, reszty aminokwasowe 105-132, reszty aminokwasowe 105-133, reszty aminokwasowe 105-134, reszty aminokwasowe 105-135, reszty aminokwasowe 105-136, reszty aminokwasowe 105-137, reszty aminokwasowe 105-138, reszty aminokwasowe 105-139, reszty aminokwasowe 105-140, reszty aminokwasowe 105-141, reszty aminokwasowe 105-142, reszty aminokwasowe 105-143, reszty aminokwasowe 105-144, reszty aminokwasowe 105-145, reszty aminokwasowe 105-146, reszty aminokwasowe 105-147, reszty aminokwasowe 105-148, reszty aminokwasowe 105-149, reszty aminokwasowe 105-150, reszty aminokwasowe 105-151, reszty aminokwasowe 105-152, reszty aminokwasowe 105-153 i reszty aminokwasowe 105-154.

Dodatkowe korzystne segmenty szypułowe obejmują jeden lub kilka aminokwasów z regionu szypułowego BCMA (tzn. reszty aminokwasowe 42 do 54 według SEQ ID nr 27). Na przykład, segment szypułowy może składać się z następujących elementów w odniesieniu do SEQ ID nr 27: reszta aminokwasowa 42, reszty aminokwasowe 42-43, reszty aminokwasowe 42-44, reszty aminokwasowe 42-45, reszty aminokwasowe 42-46, reszty aminokwasowe 42-47, reszty aminokwasowe 42-48, reszty aminokwasowe 42-49, reszty aminokwasowe 42-50, reszty aminokwasowe 42-50, reszty aminokwasowe 42-51, reszty aminokwasowe 42-52, reszty aminokwasowe 42-53, reszty aminokwasowe 42-54.

Bardziej ogólnie, segment szypułowy może składać się z 2-50 reszt aminokwasowych.

Cząstka immunoglobulinowa białka fuzyjnego według niniejszego wynalazku zawiera co najmniej jeden region stały immunoglobuliny. Korzystnie, cząstka immunoglobuliny stanowi segment immunoglobuliny ludzkiej. Ludzka sekwencja immunoglobuliny może być sekwencją aminokwasową typu dzikiego lub zmodyfikowaną sekwencją aminokwasową typu dzikiego zawierającą co najmniej jedną z mutacji aminokwasowych opisanych powyżej.

Ludzka sekwencja aminokwasowa immunoglobulin może również wykazywać różnice w porównaniu z typem dzikim, mianowicie zawierać jedną lub kilka mutacji charakterystycznych dla znanej determinanty allotypowej. W tabeli drugiej ukazano determinanty allotypowe ludzkiego regionu stałego IgGy1 (Putman, The Plasma Proteins, Vol. V, strony 49-140 (Academic Press, Inc. 1987)). Pozycje 214, 356, 358 i 431 indeksu EU definiują znane allotypy IgGy1. Pozycja 214 znajduje się w domenie C_H1 regionu stałego IgGy1, zatem nie znajduje się w obrębie sekwencji Fc. Sekwencja Fc typu dzikiego SEQ ID nr 6 obejmuje allotypy Glm(1) i Glm(2-). Jednakże, część Fc białka TACI-Fc można modyfikować dla odzwierciedlenia dowolnej kombinacji tych allotypów.

T a b e l a 2

Determinanty allotypowe regionu stałego ludzkiej immunoglobuliny γ!

Allotyp	Reszta aminokwasowa	Pozycja aminokwasu
		Indeks EU	SEQ ID nr 6
Glm(1)	Asp, Leu	356, 358	160, 162
Glm(1-)	Glu, Met	356, 358	160, 162
Glm(2)	Gly	431	235
Glm(2-)	Ala	431	235
Glm(3)	Arg	214	-
Glm(3-)	Lys	214	-

Przykładowe białka TACI-Fc według niniejszego wynalazku obejmują regiony stałe ludzkiego IgG1. Jednakże, korzystne cząstki immunoglobulinowe mogą również obejmować polipeptydy zawierające co najmniej jeden region stały, taki jak region stały łańcucha ciężkiego z dowolnej z następujących immunoglobulin: IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE i IgM. Korzystnie, cząstki immunoglobulinowe pochodzące z IgG2 typu dzikiego lub IgG4 typu dzikiego zapewniają zmniejszenie funkcji efektorowej w porównaniu z IgG1 typu dzikiego lub IgG3 typu dzikiego. Przedmiotem niniejszego wynalazku są również białka fuzyjne zawierające cząstkę receptora TACI, jak to opisano powyżej, oraz albuminę lub 32-makroglobulinę.

Innym typem białka fuzyjnego receptora wiążącego się z ZTNF2 lub ZTNF4 jest białko fuzyjne BCMA-immunoglobulina. Przeprowadzono badania z białkiem fuzyjnym BCMA-Fc4, w których cząstka

PL 219 013 B1

BCMA składała się z reszt aminokwasowych 1-48 według SEQ ID nr 27. Nieoczekiwanie, badania farmakokinetyczne u myszy wykazały, że czas półtrwania białka fuzyjnego BCMA-Fc4 wynosił około 101 godzin, natomiast czas półtrwania białka TACI-Fc wynosił 25 godzin. Tak więc, w niektórych sytuacjach klinicznych podawanie białka fuzyjnego BCMA-immunoglobulina może być korzystne. Ponadto, w leczeniu niektórych chorób korzystne może być łączenie białek fuzyjnych TACI-immunoglobulina i BCMA-immunoglobulina. Takie leczenie łączone można osiągnąć poprzez podawanie białek fuzyjnych TACI-immunoglobulina i BCMA-immunoglobulina lub poprzez podawanie heterodimerów białek fuzyjnych TACI-immunoglobulina i BCMA-immunoglobulina.

Innym typem białka fuzyjnego receptora wiążącego się z ZTNF4 jest białko fuzyjne immunoglobuliny zawierające domenę zewnątrzkomórkową receptora oznaczoną jako „Ztnfr12. Sekwencje aminokwasowe i nukleotydowe Ztnfr12 przedstawiono odpowiednio jako SEQ ID nr 59 i SEQ ID nr 60. Korzystne cząstki receptorowe Ztnfr12 obejmują polipeptydy, w których znajdują się reszty aminokwasowe 1-69 według SEQ ID nr 60 lub reszty aminokwasowe 19-35 według SEQ ID nr 60.

Białka fuzyjne według niniejszego wynalazku mogą mieć postać jednołańcuchowych polipeptydów, dimerów, trimerów lub wielokrotności dimerów lub trimerów. Dimery mogą być homodimerami lub heterodimerami, a trimery mogą być homotrimerami lub heterotrimerami. Przykładami heterodimerów są: polipeptyd TACI-immunoglobulina z polipeptydem BCMA-immunoglobulina, polipeptyd TACI-immunoglobulina z polipeptydem Ztnfr12-immunoglobulina oraz polipeptyd BCMA-immunoglobulina z polipeptydem Ztnfr12-immunoglobulina. Przykładami heterotrimerów są: polipeptyd TACI-immunoglobulina z dwoma polipeptydami BCMA-immunoglobulina, polipeptyd TACI-immunoglobulina z dwoma polipeptydami Ztnfr12-immunoglobulina polipeptyd BCMA-immunoglobulina z dwoma polipeptydami Ztnfr12-immunoglobulina, dwa polipeptydy TACI-immunoglobulina z polipeptydem BCMA-immunoglobulina, dwa polipeptydy TACI-immunoglobulina z polipeptydem Ztnfr12-immunoglobulina, dwa polipeptydy BCMA-immunoglobulina z polipeptydem Ztnfr12-immunoglobulina oraz trimer polipeptydu TACI-immunoglobulina, polipeptydu BCMA-immunoglobulina i polipeptydu Ztnfr12-immunoglobulina.

W takich białkach fuzyjnych cząstka receptorowa TACI może zawierać co najmniej jedną spośród następujących sekwencji aminokwasowych według SEQ ID nr 2: reszty aminokwasowe od 30 do

154, reszty aminokwasowe od 34 do 66, reszty aminokwasowe od 71 do 104, reszty aminokwasowe od 47 do 62 i reszty aminokwasowe od 86 do 100. Cząstka receptora BCMA może zawierać co najmniej jedną z następujących sekwencji aminokwasowych według SEQ ID nr 27: sekwencje aminokwasowe 1-48, sekwencje aminokwasowe 8-41 i sekwencje aminokwasowe 21-37. Cząstka receptora Ztnfr12 może zawierać co najmniej jedną z następujących sekwencji aminokwasowych SEQ ID nr 60: reszty aminokwasowej 1 do 69 i reszty aminokwasowej 19 do 35.

Z zastosowaniem metod PCR wykorzystywanych do wytworzenia przykładowych cząsteczek TACI-Fc można wytwarzać białka fuzyjne opisane w przykładach. Jednak specjalista może stosować inne standardowe metody. Na przykład, cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące TACI, BCMA, Ztnfr12 lub polipeptydy immunoglobulin można wytwarzać poprzez screening bibliotek cDNA lub bibliotek genomowych człowieka za pomocą sond polinukleotydowych na podstawie sekwencji według niniejszego wynalazku. Techniki te są standardowe i znane (zob. np. Ausubel i wsp. (red.), Short Protocols in Molecular Biology, wydanie trzecie, strony 4-1 do 4-6 (John Wiley & Sons 1995) („Ausubel (1995)); Wu i wsp., Methods in Gene Biotechnology, strony 33-41 (CRC Press, Inc. 1997) („Wu (1997)); Ausubel (1995), strony 5-1 do 5-6; Wu (1997), strony 307-327)).

Zamiast tego, cząsteczki do wytwarzania białek fuzyjnych immunoglobulin można wytwarzać poprzez syntezę cząsteczek kwasu nukleinowego za pomocą wzajemnie primujących się długich oligonukleotydów i sekwencji nukleotydowych według niniejszego wynalazku (zob. np. Ausubel (1995) str. 8-8 do 8-9). Znane techniki z zastosowaniem polimerazowej reakcji łańcuchowej dostarczają możliwości syntezy cząsteczek DNA o długości co najmniej dwóch kilozasad (Adang i wsp., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot i wsp., PCR Metiods and Applications 2:266 (1993), Dillon i wsp., „Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes, w Methods in Molecular Biologhy, Vol. 15; PCR Protocols; Current Methods and Applications, White (red.), str. 263-268, (Humana Press, Inc. 1993) i Holowachuk i wsp., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)).

Cząsteczki kwasów nukleinowych opisanych w niniejszym wynalazku można również wytwarzać za pomocą „maszyn genowych, stosując takie metody, jak metodę fosforoamidytową. Jeżeli do zastosowania takiego, jak synteza genu lub fragmentu genowego, konieczne jest zsyntetyzowane chemicznie dwuniciowe DNA, to każdą nić komplementarną wytwarza się oddzielnie. Wytwarzanie

PL 219 013 B1 genów krótkich (60 do 80 par zasad) jest technicznie proste i można go dokonać poprzez syntezę nici komplementarnych, i następnie ich annealing. Przy wytwarzaniu genów dłuższych (powyżej 300 par zasad), niezbędne może być jednak zastosowanie specjalnych metod, ponieważ skuteczność sprzęgania każdego cyklu przy chemicznej syntezie DNA rzadko osiąga 100%. W celu przezwyciężenia tego problemu łączy się geny syntetyczne (dwuniciowe) w postaci modularnej z fragmentów jednoniciowych o długości od 20 do 100 nukleotydów. Przegląd syntezy polinukleotydów można znaleźć na przykład w: Glick i Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura i wsp., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984) oraz Climie i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633 (1990).

4. Wytwarzanie polipeptydów TACI-immunoglobulina

Polipeptydy omówione w wynalazku można wytwarzać w rekombinacyjnych komórkach-gospodarzach konwencjonalnymi sposobami. W celu uzyskania ekspresji sekwencji kodującej TACI-immunoglobulinę konieczne jest połączenie w sposób umożliwiający działanie cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd z sekwencjami regulacyjnymi kontrolującymi transkrypcyjną ekspresję w wektorze ekspresyjnym, i następnie wprowadzenie do komórki gospodarza. Oprócz sekwencji regulujących transkrypcję, takich jak promotory i wzmacniacze, wektory ekspresyjne mogą zawierać translacyjne sekwencje regulacyjne i gen markerowy nadający się do selekcji komórek, w których znajduje się wektor ekspresyjny.

Wektory ekspresyjne korzystne do wytwarzania obcego białka w komórkach eukariotycznych typowo zawierają: (1) prokariotyczne elementy DNA kodujące bakteryjny początek replikacji i marker oporności na antybiotyki umożliwiające uzyskanie wzrostu i selekcji wektora ekspresyjnego w gospodarzu bakteryjnym, (2) elementy DNA eukariotycznego kontrolujące zapoczątkowanie transkrypcji, takie jak promotor i (3) elementy DNA kontrolujące obróbkę transkryptów, takie jak sekwencja zakończenia transkrypcji/poliadenylacji.

Wektory ekspresyjne mogą również zawierać sekwencje nukleotydowe kodujące sekwencje wydzielnicze kierujące polipeptyd heterologiczny na szlaki wydzielnicze komórki gospodarza. Na przykład, wektor ekspresyjny może zawierać sekwencję nukleotydową kodującą TACI-immunoglobulinę i sekwencję wydzielniczą pochodzącą z jakiegokolwiek wydzielanego genu. Jak to omówiono powyżej, jedną z korzystnych sekwencji sygnałowych jest sekwencja sygnałowa tPA. Przykład sekwencji sygnałowej tPA podano w SEQ ID nr 25. Inną korzystną sekwencją sygnałową jest mysia sekwencja sygnałowa 26-10 VH. Mysie przeciwciało 26-10 opisano na przykład w: Near i wsp., Mol. Immunol. 27:901 (1990). Przykłady sekwencji aminokwasowej i nukleotydowej mysiej sekwencji sygnałowej 26-10 VH podano odpowiednio w SEQ ID nr 61 i w SEQ ID nr 65. W SEQ ID nr 62 ukazano sekwencję aminokwasową białka fuzyjnego TACI-Fc5 zawierającego mysią sekwencję sygnałową 26-10 VH.

Białka TACI-immunoglobulinowe według niniejszego wynalazku mogą ulegać ekspresji w komórkach ssaków. Przykładami korzystnych komórek-gospodarzy ssaków są komórki nerek afrykańskiej małpy zielonej (Vero; ATCC CRL 1587), ludzkie komórki nerek zarodków (293-HEK; ATCC CRL 1573), komórki nerek noworodków chomików (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), komórki nerek psów (MDCK; ATCC CCL 34), komórki jajników chomików chińskich (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin i wsp., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), komórki przysadek szczurów (GH1; ATCC CCL82), komórki HeLa S3 (ATCC CCL2.2), komórki raka wątroby szczurów (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), transformowane wirusem SV40 komórki nerek małp (COS-1; ATCC CRL 1650) i komórki zarodków mysich (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).

W przypadku gospodarza-ssaka sekwencje regulacyjne transkrypcji i translacji mogą pochodzić z wirusów, takich jak adenowirus, wirus brodawczaka bydła, wirus małpi lub tym podobnych, w których sygnały regulacyjne wiążą się z danym genem wykazującym wysoki poziom ekspresji. Korzystne sekwencje regulatorowe transkrypcji i translacji można również wytwarzać z genów ssaków, takich jak geny: aktyny, kolagenu, miozyny i metalotioneiny.

Sekwencje regulacyjne transkrypcji obejmują region promotora wystarczający do ukierunkowania zapoczątkowania syntezy RNA. Do korzystnych promotorów eukariotycznych należą: promotor mysiego genu metalotioneiny 1 (Hamer i wsp., J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), promotor TK wirusa opryszczki (McKnight, Cell 31:355 (1982)), wczesny promotor SV40 (Benoist i wsp., Nature 290:304 (1981)), promotor wirusa mięsaka Rous (Gorman i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)), promotor cytomegalowirusa (Foecking i wsp., Gene 45:101 (1980)) i promotor mysiego wirusa guza sutka (zob. ogólnie Etcheverry, „Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture, w: Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland i wsp., (red.), str. 163-181 (John Wiley & Sons,

PL 219 013 B1

Inc. 1996)). Korzystne połączenie promotora i wzmacniacza zapewnia promotor wirusowy mięsaka mieloproliferacyjnego i wzmacniacz cytomegalowirusa człowieka.

Zamiast tego, do kontrolowania wytwarzania białek TACI-immunoglobuliny w komórkach ssaków można stosować promotor prokariotyczny, taki jak promotor polimerazy RNA bakteriofaga T3, jeżeli promotor prokariotyczny jest regulowany przez promotor eukariotyczny (Zhou i wsp., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990) i Kaufman i wsp., Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991)).

Wektor ekspresyjny można wprowadzać do komórek-gospodarzy wieloma standardowymi sposobami, takimi jak transfekcja z zastosowaniem fosforanu wapnia, transfekcja z zastosowaniem liposomów, mikrowstrzeliwanie, elektroporacji itp. Transfekowane komórki można selekcjonować i rozprzestrzeniać w celu wytworzenia rekombinacyjnych komórek gospodarzy zawierających wektor ekspresyjny stabilnie zintegrowany do genomu komórki gospodarza. Techniki wprowadzania wektorów do komórek eukariotycznych i selekcjonowania takich stabilnych transformantów z zastosowaniem dominującego markera możliwego do selekcji opisali na przykład Ausubel (1995) i Murray (red.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991).

Na przykład, korzystnym markerem nadającym się do selekcji jest gen zapewniający oporność na antybiotyk neomycynę. W tym przypadku selekcję prowadzi się w obecności leku typu neomycyny, takiego jak G-418 lub podobnego. Systemy selekcji można również stosować do zwiększania poziomu ekspresji danego genu - proces ten nazywa się „powieleniem. Powielenie prowadzi się poprzez hodowanie transfektantów w obecności niskiego poziomu czynnika selekcjonującego, i następnie poprzez zwiększanie ilości środka selekcjonującego w celu dokonania selekcji pod kątem komórek wytwarzających duże ilości produktów wprowadzonych genów. Korzystnym, nadającym się do powielenia markerem, który można selekcjonować jest reduktaza dihydrofolanu nadająca oporność na metotreksat. Można również stosować również geny oporności na inne leki (na przykład oporności na hygromycynę, oporności wielolekowej i oporności na acetylotransferazę puromycyny). Zamiast tego można stosować markery wprowadzające zmieniony fentotyp, takie jak zielone fluoryzujące białko lub białka powierzchni komórkowej, takie jak: CD4, CD8, klasa I MHC, łożyskowa fosfataza zasadowa w celu oddzielenia komórek transfekowanych od komórek nietransfekowanych sposobami, takimi jak sortowanie FACS lub technika rozdzielania paciorków magnetycznych.

Polipeptydy TACI-immunoglobulina mogą być także wytwarzane w hodowanych komórkach ssaków przy zastosowaniu wirusowego systemu dostarczania. Przykładami wirusów, które można zastosować w tym celu, są adenowirusy, wirusy opryszczki, wirus krowianki i wirus związany z adenowirusami (AAV). Adenowirus, wirus zawierający dwuniciowe DNA, jest obecnie najlepiej zbadanym wektorem transferu genów służącym do dostarczania heterologicznego kwasu nukleinowego (przegląd można znaleźć w publikacji Beckera i wsp., Meth. Cell. Biol. 43:161 (1994) oraz Douglasa i Curiela, Science & Medicine 4:44 (1997)). Do korzyści ze stosowania systemu adenowirusowego należą: wprowadzenie względnie dużej ilości insertów DNA, zdolność wzrostu do wysokiego miana, zdolność do zakażania szerokiego spektrum typów komórek ssaków i elastyczność umożliwiająca zastosowanie z wieloma dostępnymi wektorami zawierającymi różne promotory.

Poprzez delecję części genomu adenowirusa można wprowadzać większe inserty (do 7 kb) heterologicznego DNA. Inserty te można włączać do wirusowego DNA poprzez bezpośrednią ligację lub rekombinację homologiczną z kotransfekowanym plazmidem. Pewnym sposobem jest delecja zasadniczego genu E1 z wektora wirusowego powodująca niezdolność do replikacji, jeżeli komórka-gospodarz nie dostarczy genu E1. Ludzkie komórki 293 zakażone wektorem adenowirusowym (ATCC nr CRL-1573, 45504, 45505) można na przykład hodować jako komórki adherencyjne lub w hodowli w postaci zawiesiny przy względnie dużej gęstości komórek, wytwarzając białko w znacznej ilości (zob. Garnier i wsp., Cytotechnol. 15:145 (1994)).

Specjalista może opracować korzystne wektory ekspresyjne do wytwarzania białek fuzyjnych według niniejszego wynalazku w komórkach ssaków. W przykładzie 4 opisano cechy jednego z wektorów ekspresyjnych. Jako inny przykład można podać wektor ekspresyjny zawierający bicystronową kasetę ekspresji obejmującą część wzmacniacza cytomegalowirusa człowieka, promotor wirusa mięsaka mieloproliferacyjnego, sekwencję nukleotydową kodującą białko fuzyjne, wewnętrzne miejsca wprowadzenia rybosomów poliowirusa, sekwencję nukleotydową kodującą mysią reduktazę dihydrofolanu i następnie sekwencję addycyjną poli A SV40. Sekwencja nukleotydowa według SEQ ID nr 69 wykazuje obecność struktury promotora LTR, wzmacniacza cytomegalowirusa/mieloproliferacyjnego wirusa mięsaka, przy czym w strukturze tej wzmacniacz cytomegalowirusowy rozciąga się od nukleotydu 1 do 407. Promotor LTR wirusa mięsaka mieloproliferacyjnego nieobecny w ujemnym regionie

PL 219 013 B1 kontrolnym rozciąga się od nukleotydu 408 do nukleotydu 884 SEQ ID nr 69. Sekwencję nukleotydową promotora LTR wirusa mięsaka mieloproliferacyjnego bez ujemnego regionu kontrolnego podano w SEQ ID nr 70.

W przykładzie 1 opisano wektor ekspresyjny zawierający promotor cytomegalowirusowy do ukierunkowania ekspresji trans genu białka rekombinacyjnego, intronu immunoglobulinowego i sekwencji sygnałowej tkankowego aktywatora plazminogenu. Korzystnym intronem immunoglobulinowym jest mysi intron 26-10 VH. W SEQ ID nr 66 podano przykład sekwencji nukleotydowej mysiego intronu 26-10 VH. Wektor ekspresyjny może również zawierać niepoddany translacji region 5' (UTR) znajdujący się w kierunku końca 5' sekwencji nukleotydowej kodującej białko TACI-immunoglobulinę. Korzystne 5' UTR może pochodzić z mysiego genu 26-10 VH. W SEQ ID nr 63 opisano sekwencję nukleotydową korzystnego natywnego mysiego 5' UTR 26-10 VH, przy czym SEQ ID nr 64 ukazuje sekwencję nukleotydową mysiego 5' UTR 26-10 VH zoptymalizowaną na końcu 3'.

Jako przykład przedstawiono SEQ ID nr 67 ukazującą sekwencję nukleotydową obejmującą następujące elementy: natywny mysi 5' UTR 26-10 VH (nukleotydy 1-51), mysią sekwencję sygnałową 26-10 VH (nukleotydy 52-97 i 182-192), mysi intron 26-10 VH (nukleotydy 98-181), sekwencję nukleotydową kodującą cząstkę TACI (nukleotydy 193 do 435) i sekwencję nukleotydową kodującą cząstkę Fc5 (nukleotydy 436-1131). Sekwencja nukleotydową SEQ ID nr 68 różni się od SEQ ID nr 67 zastąpieniem sekwencji natywnej przez zoptymalizowany mysi 26-10 VH (nukleotydy 1-51).

Białka TACI-immunoglobulina mogą również ulegać ekspresji w innych komórkach wyższych Eucaryota, takich jak: komórki ptaków, grzybów, owadów, drożdży lub roślin. System bakulowirusowy zapewnia skuteczny sposób wprowadzania klonowanych genów do komórek owadów. Korzystne wektory ekspresyjne oparte są na wirusie wielokrotnej polihedrozy jądrowej Autographa californica (AcMNPV) i zawierają znane promotory, takie jak: promotor białka wstrząsu cieplnego Drosophila (hsp) 70, promotor genu natychmiastowego i wczesnego wirusa polihedrozy jądrowej Autograha californica (ie-1) i opóźniony wczesny promotor 39K, promotor p10 bakulowirusa i promotor metalotioneiny drozofila. W drugim sposobie wytwarzania kombinacyjnych bakulowirusów wykorzystuje się system oparty na transpozonach opisany przez Luckowa (Luckow i wsp., J. Virol. 67:4566 (1993)). Ten system wykorzystujący wektory transferowe sprzedawany jest w zestawie BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD, Stany Zjednoczone). W systemie tym wykorzystuje się wektor transferowy PFASTBAC (Life Technologies) zawierający transpozon Tn7 do przesuwania DNA kodującego polipeptyd TACI-immunoglobuliny do genomu bakulowirusa znajdującego się w E. coli w postaci dużego plazmidu zwanego „bakmidem. Zobacz na przykład Hill-Perkins i Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning i wsp., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994) i Chazenbalk i Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543 (1995). Ponadto, wektory transferowe mogą zawierać fuzje wewnątrz ramki z DNA kodującym tag epitopu na zakończeniu C lub N- ulegającego ekspresji polipeptydu TACI-immunoglobuliny, na przykład tag epitopu Glu-Glu (Grussenmeyer i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82:7952 (1985)). Stosując sposoby znane ze stanu techniki, dokonuje się transformacji wektora transferowego zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą białko TACI-immunoglobulinę do E. coli i screeningu pod końcem bakmidów zawierających nieprzerwany gen lacZ, wskazujący na bakulowirus rekombinacyjny. Następnie, powszechnie znanymi sposobami izoluje się DNA bakmidu zawierające rekombinacyjny genom bakulowirusa.

Przykładowy wektor PFASTBAC można w znacznym stopniu modyfikować. Na przykład można usuwać promotor polihedrynowy i podstawiać go promotorem zasadowego białka bakulowirusa (znanym również jako promotor Pcor, p6.9 lub MP), który wcześniej ulega ekspresji przy zakażeniu bakulowirusem i dla którego wykazano korzystny wpływ na ekspresję wydzielanych białek (zobacz na przykład Hill-Perkins i Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning i wsp., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994) oraz Chazenbalk i Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). W takich strukturach wektora transferowego można stosować krótką lub długą wersję promotora zasadowego białka. Ponadto, można sporządzać wektory transferowe z wydzielniczymi sekwencjami sygnałowymi pochodzącymi z białek owadów. W strukturach takich można wykorzystywać na przykład wydzielniczą sekwencję sygnałową glukozylotransferazy Ecdysteroid (EGT), pszczoły miodnej Melittin (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA, Stany Zjednoczone) lub bakulowirusa gp67 (PharMingen: San Diego, CA, Stany Zjednoczone).

Do transfekowania komórek gospodarzy stosuje się rekombinacyjny wirus lub bakmid. Do korzystnych komórek gospodarzy owadów należą linie komórkowe pochodzące z IPLB-Sf21-linii komórkowej jajników poczwarek Spodoptera frugriperda takie jak Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE i Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA, Stany Zjednoczone), jak również komórki Schneider-2 DroPL 219 013 B1 sophila oraz linię komórkową HIGH FIVEO (Invitrogen) pochodzącą z Trichoplusia ni (patent Stanów Zjednoczonych nr 5,300,435). Do uzyskiwania wzrostu i podtrzymania komórek można stosować dostępne w handlu pożywki bez surowicy. Korzystnymi pożywkami są: Sf900 II^TM (Life Technologies) i ESF 921^TM (Expression Systems) dla komórek Sf9; natomiast dla komórek T. ni - Ex cell O405^TM(JRH Biosciences, Lenexa, KS, Stany Zjednoczone) lub Express FiveO^TM (Life Technologies). Jeżeli stosuje się wirus rekombinacyjny, komórki typowo hoduje się z gęstości posiewu wynoszącej około

2-5 x 10⁵ do gęstości 1-2 x 10⁶ komórek i w tym czasie dodaje się pewną ilość rekombinacyjnego wirusa przy wielokrotności zakażenia (MOI) wynoszącej od 0,1 do 10, typowo około 3.

Znane techniki wytwarzania białek rekombinacyjnych w systemach bakulowirusowych opisał Bailey i wsp., „Manipulation of Baculovirus Vectors w: Methods in Molecular Biology, Volume 7; Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (red.), str. 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991), Patel i wsp., „The baculovirus expression system, w: DNA Cloning 2; Expression Systems, wydanie drugie, Glover i wsp., (red.), str. 205-244 (Oxford University Press 1995), Ausubel (1995) na str. 16-37 do 16-57, pod red. Richardsona, Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995) oraz Lucknow, „Insect Cell Expression Technology, w: Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland i wsp., (red.), str. 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996).

Do ekspresji genów według niniejszego wynalazku można również stosować komórki grzybów, w tym komórki drożdży. Do gatunków drożdży szczególnie korzystnych w tym zakresie należą: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris oraz Pichia methanolica. Do korzystnych promotorów do ekspresji w drożdżach należą promotory z GAL1 (galaktoza), PGK (kinaza fosfoglicerynianu), ADH (dehydrogenaza alkoholowa), AOX1 (oksydaza alkoholowa), HIS4 (dehydrogenaza histydynolowa) itp. Znanych jest wiele drożdżowych wektorów klonujących, które można łatwo nabyć. Wektor może być tak opracowany, aby wytwarzał struktury wykorzystujące niezbędne elementy do przeprowadzenia rekombinacji homologicznej w drożdżach (zob. np. Raymond i wsp., BioTechiniques 26:134 (1999)). Taki wektor ekspresyjny może na przykład zawierać sekwencję URA3 i CENARS (sekwencje autonomicznie replikujące się) niezbędne do selekcji i replikacji w S. cerevisiae. Innymi korzystnymi wektorami są wektory oparte na YIp takie jak YIp5, wektory Yrp, takie jak YRp17, wektory YEp takie jak wektory YEp13 oraz wektory YCp takie jak YCp19. Sposoby transformowania komórek S. cerevisiae. egzogennym DNA i wytwarzania z tych komórek polipeptydów rekombinacyjnych opisano na przykład w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4.599.311 na nazwisko Kawasaki, patencie Stanów Zjednoczonych nr 4.931.373 na nazwisko Kawasaki i wsp., patencie Stanów Zjednoczonych nr 4.870.008 na nazwisko Brake, patencie Stanów Zjednoczonych nr 5.037.743 na nazwisko Welch i wsp. oraz w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4.845.085 na nazwisko Murray i wsp. Komórki stransformowane selekcjonuje się według fenotpu określonego przez marker nadający się do selekcji, typowo poprzez badanie oporności na leki lub zdolności do wzrostu czy nieobecności danego składnika odżywczego (np. leucyny). Korzystnym systemem wektorów do stosowania w Saccharomyces cerevisiae jest system wektora POT1 opisany przez Kawasaki i wsp. (patent Stanów Zjednoczonych nr 4.931.373), umożliwiający selekcję stransformowanych komórek poprzez wzrost w pożywkach zawierających glukozę. Dodatkowymi korzystnymi promotorami i terminatorami do zastosowania w drożdżach są promotory i terminatory z genów enzymów glikolitycznych (zob. np. patent Stanów Zjednoczonych nr 4.599.311 na nazwisko Kawasaki, patent Stanów Zjednoczonych nr 4.615.974 na nazwisko Kingsman i wsp. oraz patent Stanów Zjednoczonych nr 4.977.092 na nazwisko Bitter) oraz geny dehydrogenazy alkoholowej. Zobacz również patenty Stanów Zjednoczonych nr 4.990.446, 5.063.154, 5.139.936 oraz 4.661.454).

Ze stanu techniki znane są systemy transformacji dla innych drożdży, takich jak: Hansenula

Polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii i Candida maltosa). Zobacz na przykład Gleeson i wsp., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986) i Cregg, patent Stanów Zjednoczonych nr 4.882.279. Można stosować komórki Aspregillus sposobami opisanymi przez McKnighta i wsp., patent Stanów Zjednoczonych nr 4.935.349. Sposoby transformacji Acremonium chrysogenum opisali Sumino i wsp. w patencie Stanów Zjednoczonych nr 5.162.228. Sposoby transformowania Neurospora opisał Lambowitz w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4.486.533.

Raymond w patencie Stanów Zjednoczonych nr 5.716.808 opisał na przykład Pichia methanolica jako gospodarza do wytwarzania białek rekombinacyjnych (Raymond, patent Stanów Zjednoczonych nr 5.736.383, Raymond i wsp., Yeast 14:11-23 (1998), międzynarodowe publikacje patentowe o numerach: WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 oraz WO 98/02565. Cząsteczki DNA do

PL 219 013 B1 zastosowania w transformacji P. methanolica wytwarza się zwykle w postaci dwuniciowych kolistych plazmidów korzystnie linearyzowanych przed transformacją. Do wytwarzania polipeptydów P. methanolica jako promotor i terminator w plazmidzie można stosować promotor i terminator genu P. methanolica, na przykład gen wykorzystania alkoholu P. methanolica (AUG1 lub AUG2). Do innych korzystnych promotorów należą promotory syntazy dihydroksyacetonu (DHAS), dehydrogenazy mrówczanu (FMD) i katalazy (CAT). W celu ułatwienia integracji DNA do chromosomu gospodarza korzystne jest, aby cały segment ekspresyjny plazmidu był otoczony po obu końcach sekwencjami DNA gospodarza. Korzystnym markerem nadającym się do selekcji do zastosowania w Pichia methanolica jest gen ADE2 P. methanolica kodujący karboksylazę fosforybozylo-5-aminoimidazolu (AIRC; EC 4.1.1.21) umożliwiający komórkom gospodarza ade2 wzrost przy braku adeniny. Przy procesach przemysłowych na dużą skalę, gdy korzystne jest zminimalizowanie zużycia metanolu, można stosować komórki gospodarzy, w których delecji uległy oba geny wykorzystania metanolu (AUG1 lub AUG2). Komórki-gospodarze wykorzystywane do wytwarzania wydzielanych białek mogą wykazywać niedobór genów proteazy wodniczkowej (PEP4 i PRB1). W celu ułatwienia wprowadzenia plazmidu zawierającego DNA kodującego dany peptyd do komórek P. methanolica stosuje się ełektroporację. Komórki P. methanolica można poddawać transformacji na drodze elektroporacji, stosując zanikające wykładniczo pulsujące pole elektryczne o sile pola od 2,5 do 4,5 kV/cm, korzystnie około 3,75 kV/cm i stałą czasową (t) od 1 do 40 milisekund, korzystnie około 20 milisekund.

Wektory ekspresji można również wprowadzać do protoplastów roślinnych, nienaruszonych tkanek roślinnych lub izolowanych komórek roślinnych. Do sposobów wprowadzania wektorów ekspresji do tkanki roślinnej należą: bezpośrednie zakażenie lub jednoczesna hodowla tkanki roślinnej z Agrobacterium tumefaciens, podawanie przez mikrowstrzeliwanie, wstrzykiwanie DNA, elektroporacja itp. Zobacz na przykład Horsch i wsp., Science 227:1229 (1985), Klein i wsp., Biotechnology 10:268 (1992) oraz Miki i wsp., „Procedures for Introducing Foereign DNA into Plants, w: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick i wsp. (red.), str. 67-88 (CRC Press, 1993).

Białka TACI-immunoglobulina można także wytwarzać w komórkach-gospodarzach Procaryota. Korzystne promotory, które można wykorzystać do wytwarzania polipeptydów TACI-immunoglobulina w gospodarzach prokariotycznych, są znane specjalistom i należą do nich promotory zdolne do rozpoznawania polimerazy T4, T3, Sp6 i T7, promotory PR i PL bakteriofagu lambda, promotory trp, recA, wstrząsu cieplnego, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA i lacZ E. coli, promotory B. subtilis, promotory bakteriofagów Bacillus, promotory Streptomyces, promotor int bakteriofagu lambda, promotor bla pBR322 i promotor CAT genu transferazy acetylowej chloramfenikolu. Omówienie promotorów prokariotycznych można znaleźć w publikacji Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson i wsp., Molecular Biology of the Gene, czwarte wydanie (Benjamin Cummins 1987) oraz Ausubel i wsp. (1995).

Do korzystnych gospodarzy prokariotycznych należą E. coli i Bacillus subtilus. Korzystnymi szczepami E. coli są: BL21(DE), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 i ER1647 (zob. na przykład Brown (red.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Korzystnymi szczepami Bacillus subtilis są: BR151, YB886, MI119, MI120 i B170 (zobacz na przykład Hardy, „Bacillus Cloning Methods, w: DNA Cloning; A Practical Approach, Glover (red.) (IRL Press 1985)).

Przy ekspresji białka TACI-immunoglobulina w bakteriach, takich jak E. coli, polipeptyd może być zatrzymywany w cytoplazmie, typowo w postaci nierozpuszczalnych granulek, lub skierowany do przestrzeni peryplazmatycznej przez bakteryjną sekwencję wydzielniczą. W tym pierwszym przypadku komórki ulegają lizie, granulki odzyskuje się i denaturuje za pomocą na przykład izotiocyjanianu guanidyny lub mocznika. Zdenaturowany polipeptyd można następnie ponownie sfałdować i dimeryzować poprzez rozcieńczenie środka denaturującego, na przykład przez dializę wobec roztworu mocznika i połączenia glutationu zredukowanego i utlenionego, i następnie przez dializę wobec zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej. W drugim przypadku polipeptyd odzyskuje się z przestrzeni peryplazmatycznej w postaci rozpuszczalnej i funkcjonalnej poprzez rozerwanie komórek. Na przykład, poprzez sonikację lub wstrząs osmotyczny w celu uwolnienia zawartości przestrzeni peryplazmatycznej i odzyskania białka, co pozwala uniknąć konieczności denaturowania i ponownego fałdowania.

Sposoby ekspresji białek w komórkach prokariotycznych są dobrze znane specjalistom. Zob. na przykład Williams i wsp., „Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies w: DNA Cloning 2; Expression Systems, wydanie drugie, Glover i wsp. (red.), str. 15 (Oxford University Press 1995), Ward i wsp., „Genetic Manipulation and ExpresPL 219 013 B1 sion of Antibodies, w: Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, str. 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995) i Georgiou, „Expression of Proteins in Bacteria, w: Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland i wsp. (red.), str. 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).

Standardowe sposoby wprowadzania wektorów ekspresji do komórek bakterii, drożdży, owadów i roślin opisał na przykład Ausubel (1995).

Ogólne sposoby ekspresji i odzyskiwania obcego białka wytwarzanego przez system komórek ssaka opisano na przykład w publikacji Etcheverry, „Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture, w: Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland i wsp. (red.), str. 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Standardowe sposoby odzyskiwania białka wytwarzanego przez system bakteryjny opisali, na przykład, Grisshammer i wsp. „Purification of over-produced proteins from E. coll cells, w: DMA Cloning 2; Expression Systems, wydanie drugie, Glover i wsp. (red.), str. 59-92 (Oxford University Press 1995). Uznane sposoby izolowania białek rekombinacyjnych z sytemu bakulowirusowego opisał Richardson (red.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995).

Zamiast tego, polipeptydy według niniejszego wynalazku można syntetyzować poprzez wyłączającą syntezę fazy stałej, częściowe sposoby fazy stałej, kondensację fragmentów lub klasyczną syntezę z roztworu. Te sposoby syntezy są znane specjalistom (zobacz, na przykład, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart i wsp., „Solid Phase Peptide Synthesis (wydanie drugie), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer i Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton i wsp., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields i Colowick, „Solid-Phase Peptide Synthesis, Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997) i Lloyd-Williams i wsp., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)). Odmiany strategii syntezy całkowicie chemicznej, takiej jak „natywna ligacja chemiczna i „ligacja białka po ekspresji są również znane (zobacz, na przykład, Dawson i wsp., Science 266:776 (1994), Hackeng i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol., 287:34 (1997), Muir i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998) oraz Severinov i Muir, J. Biol. Chem. 278:16205 (1998)).

5. Testy białek fuzyjnych TACI-immunoglobulina

Czynność białek fuzyjnych TACI-immunoglobulina można badać wieloma sposobami, tak aby ocenić zdolność białek fuzyjnych do wiązania ZTNF4 lub ZTNF2. Na przykład w Przykładzie 4 opisano sposoby pomiaru powinowactwa i zdolności do wiązania ZTNF4.

Zamiast tego, białka fuzyjne TACI-immunoglobulina można scharakteryzować poprzez zdolność do hamowania pobudzenia ludzkich limfocytów-B przez rozpuszczalne ZTNF4, jak to opisali Gross i wsp. w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 00/40716. Pokrótce, z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej izoluje się ludzkie limfocyty B za pomocą paciorków magnetycznych CD19 i systemu separacji magnetycznej VarioMacs (Miltenyi Biotec Auburn, CA, Stany Zjednoczone) zgodnie z zaleceniami producenta. Oczyszczone limfocyty B miesza się z rozpuszczalnym ZTNF4 (25 ng/ml) i rekombinacyjną ludzką IL-4 (10 ng/ml, Pharmingen) i komórki posiewa się na płytki 96-studzienkowe ₅ o okrągłym dnie z gęstością 1 x 10⁵ komórek na studzienkę.

Rozpuszczalne białka TACI-immunoglobulina można rozcieńczać od około 5 μg/ml do około ng/ml i inkubować z limfocytami B przez pięć dni, z pulsem przez noc w dniu czwartym z zastoso₃ waniem 1 LiCi H-tymidyny na studzienkę. Jako kontrolę można inkubować także białko TACI-immunoglobulina z limfocytami B i IL-4 bez ZTNF4. Zawartość płytek zbiera się, stosując urządzenie do zbierania z płytek Packard i zlicza się czytnikiem firmy Packard.

Ten ogólny sposób zastosowano do zbadania trzech białek fuzyjnych TACI-Fc. Wszystkie białka fuzyjne hamowały proliferację limfocytów-B, jednak struktury TACI (d1-29, d111-154)-Fc5 i TACI (d1-29, d120-154)-Fc5 miały działanie silniejsze niż TACI (d1-29, d107-154)-Fc5.

Do badania skuteczności białek TACI-immunoglobulina in vivo w pewnych stanach chorobowych można stosować znane modele zwierzęce. Na przykład białka TACI-immunoglobulina można badać w kilku modelach zwierzęcych chorób autoimmunologicznych, na przykład, w szczepach spokrewnionych myszy MRL lpr/lpr i NZB x NZW F1, które są modelem SLE (ogólnoustrojowego tocznia trzewnego). Takie modele zewnętrzne są znane ze stanu techniki (zob. np. publikację pod red. Cohena i Millera, Autoimmune Disease Models; A Guidebook (Academic Press, Inc. 1994).

U potomstwa krzyżówki między myszami szczepu New Zealand Black (NZB) i New Zealand White (NZW) rozwija się samoistna postać SLE bardzo przypominająca SLE u ludzi. U potomstwa tych myszy, określanego skrótem NZBW, w wieku jednego miesiąca zaczynają powstawać autoprzeciwciała IgM skierowane przeciwko limfocytom T, natomiast w wieku od pięciu do siedmiu miesięcy autoprzeciwciała skierowane przeciwko DNA stają się dominującymi immunoglobulinami. Nadmierna

PL 219 013 B1 aktywność poliklonalnych limfocytów-B prowadzi do nadmiernej produkcji autoprzeciwciał. Odkładanie się tych autoprzeciwciał, zwłaszcza skierowanych przeciwko jednoniciowemu DNA, wiąże się z rozwojem kłębkowego zapalenia nerek, które klinicznie objawia się jako białkomocz, azotemia i zgon z powodu niewydolności nerek.

Główną przyczyną zgonów u myszy z samoistnym SLE jest niewydolność nerek; w szczepie NZBW proces ten jest przewlekły i obliteracyjny. Choroba postępuje szybciej i ma większe nasilenie u samic niż u samców, a średni czas przeżycia wynosi zaledwie 245 dni w porównaniu z 406 dniami dla samców. Podczas gdy u wielu samic objawy są już obecne (białkomocz) w wieku od siedmiu do dziewięciu miesięcy u niektórych objawy te pojawiają się znacznie wcześniej lub później. Prowadzące do zgonu autoimmunologiczne zapalenie nerek obserwowane u myszy NZBW jest bardzo podobne do kłębkowego zapalenia nerek w ludzkim SLE, dlatego też model samoistnego SLE u myszy bardzo dobrze nadaje się do badania potencjalnych leków przeciwko SLE (Putterman i Naparstek, „Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus w: Autoimmune Disease Models; A Guidebook, str. 217-234 (Academic Press, Inc., 1994); Mohan i wsp., J. Immunol. 154:1470 (1995) i Daikh i wsp., J. Immunol. 159:3104 (1997)).

Jak to opisali Gross i wsp. w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 00/40716, myszom NZBW można podawać białka TACI-immuloglobulina w celu monitorowania hamującego wpływu tego białka na limfocyty B w okresie pięciu tygodni, w którym, jak się uważa, wytwarzanie autoprzeciwciał przez limfocyty B jest zwykle u tych myszy duże. Pokrótce, 100 samic myszy (NZB x NZW) F1 w wieku 8 tygodni dzieli się na sześć grup po 15 zwierząt. Przed podaniem leczenia u myszy raz w miesiącu prowadzi się analizy pod kątem zawartości białka w moczu i pobiera się krew na pełne badanie elementów morfotycznych i w celu zdeponowania surowicy. Surowicę można badać przesiewowo pod kątem autoprzeciwciał. Ponieważ białkomocz jest najważniejszym objawem kłębkowego zapalenia nerek, monitoruje się poziom białka w moczu poprzez badanie testem paskowym w regularnych odstępach czasu przez cały czas trwania doświadczenia. Leczenie rozpoczyna się, kiedy myszy osiągną wiek około pięciu miesięcy. Myszom podaje się dootrzewnowo samą zaróbkę (sól fizjologiczną buforowaną fosforanem), ludzką TACI-immunoglobulinę (białko kontrolne) lub białko TACI-immunoglobulinę (na przykład od 20 do 100 μg białka badanego na dawkę) trzy razy w tygodniu przez pięć tygodni.

Krew pobiera się dwukrotnie w czasie trwania leczenia i jeszcze co najmniej dwa razy po jego zakończeniu. Co dwa tygodnie po rozpoczęciu leczenia wykonuje się badanie paskowe moczu pod kątem białkomoczu oraz oznaczenie masy ciała. Tuż przed uśmierceniem zwierząt pobiera się krew, wykonuje się test paskowy z moczu i oznacza się masę ciała zwierząt. Śledzionę i grasicę dzieli się na dwie części. Jedną poddaje się analizie z sortowaniem komórek aktywowanych środkami fluorescencyjnymi, a drugą poddaje się badaniom histopatologicznym. Przeprowadza się również badanie histopatologiczne podżuchwowych gruczołów ślinowych, krezkowych grup węzłów chłonnych, płata wątroby z pęcherzykiem żółciowym, jelita ślepego i jelita grubego, żołądka, jelita cienkiego, trzustki, prawej nerki, gruczołu nadnerczowego, języka z tchawicą i przełykiem, serca i płuc.

Do badania zarówno mechanizmów chorób immunologicznych, jak i sposobów potencjalnej interwencji terapeutycznej, stosowano modele mysie doświadczalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego. Model ten przypomina stwardnienie rozsiane u człowieka i wywołuje demielinizację w wyniku pobudzenia limfocytów T do białek układu nerwowego takich jak zasadowe białko mieliny lub białko proteolipidów. Wszczepienie antygenu prowadzi do pobudzenia CD4+ - limfocytów T zależnych od klasy II MHC (Th1). Zmiany protokołu doświadczalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego mogą spowodować uzyskanie odmian tego modelu z przebiegiem choroby ostrym, przewlekłym z nawrotami lub z przekazywaniem biegłym choroby (Weinberg i wsp., J. Immunol. 162:1818 (1999); Mijaba i wsp., Cell. Immunol. 156:94 (1999) i Glabiński, Meth. Enzym. 288:182 (1997)).

Gross i wsp., w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 00/40716 opisali jeden ze sposobów oceniania skuteczności białek TACI-immunoglobulina w zakresie łagodzenia objawów związanych z doświadczalnym alergicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego. Pokrótce, 25 samicom myszy PLxSJL F1 (w wieku 12 tygodni) podawano podskórnie wstrzyknięcie 25 μg antygenu/zwierzę (białko proteolipidowe mieliny, PLP, reszty 139-151) w preparacie z kompletnym adiuwantem Freunda. Myszy dzielono na pięć grup po pięć zwierząt. W dniach 0 i 2 podawano dootrzewnowo wstrzyknięcia toksyny krztuśca (400 ng). Grupom podawano 1x, 10x lub 100x dawkę białka TACI-immunoglobulina, jedna grupa otrzymywała tylko zaróbkę, a jedna grupa nie otrzymywała żadnych

PL 219 013 B1 leków. Leczenie zapobiegawcze rozpoczynano w dniu 0, leczenie interwencyjne w dniu 7 lub po pojawieniu się objawów klinicznych. Objawy choroby (utrata masy ciała i porażenia) pojawiają się po około 10 do 14 dniach i trwają przez około tydzień. Zwierzęta ocenia się codziennie, odnotowując masę ciała i dokonując ich oceny w skali klinicznej odpowiadającej nasileniu objawów. Objawy kliniczne doświadczalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego pojawiają się po 10 do 14 dniach od podania antygenu i utrzymują się przez około tydzień. Na zakończenie badania wszystkie zwierzęta uśmierca się przez przedawkowanie gazu i wykonuje się sekcję. Mózg i rdzeń kręgowy pobiera się do badań histopatologicznych lub zamraża do analizy mRNA. Sporządza się wykresy masy ciała i danych uzyskanych w wyniku oceny w skali klinicznej dla każdego zwierzęcia osobno i dla każdej z grup terapeutycznych.

W modelu zapalenia stawów wywołanego podaniem kolagenu u myszy rozwija się przewlekłe zapalenie stawów bardzo przypominające reumatoidalne zapalenie stawów u człowieka. Ponieważ wywołane kolagenem zapalenie stawów ma cechy immunologiczne i patologiczne podobne do reumatoidalnego zapalenia stawów, czyni to z niego idealny model badań przesiewowych potencjalnych leków przeciwzapalnych dla człowieka. Inną korzyścią z zastosowania modelu indukowanego kolagenem zapalenia stawów jest to, że znane są mechanizmy patogenezy. Zidentyfikowano epitopy limfocytów T i B na kolagenie typu II oraz różne parametry immunologiczne (nadwrażliwość typu późnego i przeciwciała przeciwko kolagenowi) i zapalne (cytokiny, chemokiny i enzymy powodujące rozpad macierzy) związane z immunologicznym zapaleniem stawów; parametry te można wykorzystać do oceny skuteczności związku badanego w modelach (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407 (1999); Williams i wsp., Immunol. 89:9784 (1992); Myers i wsp., Life Sci. 61:1861 (1997) i Wang i wsp., Immunol. 92:8955 (1995)).

Gross i wsp., w międzynarodowym zgłoszeniu nr WO 00/40716 opisują sposób oceny skuteczności białek TACI-immunoglobulina w łagodzeniu objawów związanych z zapaleniem stawów wywołanym podaniem kolagenu. Pokrótce, samce myszy DBA/1J w wieku ośmiu tygodni dzieli się na grupy po pięć zwierząt i podaje im się dwa wstrzyknięcia podskórne 50-100 μΐ po 1 mg/ml kolagenu (kurzego lub bydlęcego) w odstępach trzech tygodni. Jedna grupa kontrolna nie otrzymuje wstrzyknięć kolagenu. Pierwszą dawkę podaje się z kompletnym adiuwantem Freunda, natomiast drugie w niekompletnym adiuwancie Freunda. Białko TACI-immunoglobulina podaje się zapobiegawczo w momencie wykonywania drugiego wstrzyknięcia lub przed wykonaniem drugiego wstrzyknięcia lub po tym, jak u zwierzęcia pojawią się objawy oceniane na 2 punkty lub więcej w skali klinicznej, utrzymujące się przez co najmniej 24 godziny. U zwierząt objawy zapalenia stawów zaczynają się pojawiać po drugim wstrzyknięciu kolagenu, zwykle w ciągu dwóch do trzech tygodni. Na przykład TACI-Fc białko kontrolne, IgFc ludzkie lub sól fizjologiczną zbuforowaną fosforanem (zaróbkę) można podawać zapobiegawczo, poczynając od siedmiu dni przed drugim wstrzyknięciem (dzień -7). Białka można podawać w dawce 100 μg trzy razy w tygodniu w postaci 200 μl wstrzyknięcia dootrzewnowego i leczenie prowadzić przez cztery tygodnie.

W modelu zapalenia stawów wywołanego podaniem kolagenu zasięg choroby ocenia się w każdej łapie, stosując cyrkiel do pomiaru grubości łapy i oceniając każdą łapę w skali klinicznej. Na przykład wynik „0 w skali klinicznej oznacza mysz zdrową, wynik „1 wskazuje, że co najmniej jeden palec objęty jest procesem zapalnym, wynik „2 oznacza łagodne zapalenie łapy, wynik „3 oznacza umiarkowane zapalenie łapy, a wynik „4 oznacza ciężkie zapalenie łapy. Zwierzęta uśmierca się po czasie trwania choroby przez ustalony z góry czas, który zwykle wynosi siedem dni. Pobiera się łapy do badań histopatologicznych lub analizy mRNA i surowicę do testów immunoglobulin i cytokin.

Inną chorobą autoimmunologiczną, dla której dostępne są modele mysie, jest miastenia. Miastenia jest zaburzeniem transmisji nerwowo-mięśniowej, w której dochodzi do wytworzenia autoprzeciwciał skierowanych przeciwko nikotynowemu receptorowi acetylocholinergicznemu. Choroba ta jest nabyta lub dziedziczna, a do obrazu klinicznego należy patologiczne osłabienie oraz zmęczenie przy wykonywaniu wysiłków fizycznych.

Opracowano mysi model miastenii (Christadoss i wsp., „Establisment of a Mouse Model of Myasthenia gravis Which: Mimics Human Myasthenia gravid Pahtogenesis for Immune Intervention, w: Immunobiology of Proteins and Peptides VIII, Atassi i Bixler (red.), str. 195-199 (1995)). Doświadczalna miastenia autoimmunologiczna jest chorobą związaną z wytwarzaniem przeciwciał cechującą się obecnością przeciwciał skierowanych przeciwko receptorowi acetylocholinergicznemu. Przeciwciała te niszczą receptor, prowadząc do zaburzeń przekazywania impulsów elektrycznych na złączu nerwowo-mięśniowym, czego wynikiem jest osłabienie mięśni. W doświadczalnym modelu autoimmuno26

PL 219 013 B1 logicznej miastenii myszy immunizuje się nikotynowym receptorem acetylocholinergicznym. Objawy kliniczne miastenii ujawniają się w ciągu kilku tygodni po drugiej immunizacji. Doświadczalną miastenię autoimmunologiczną ocenia się kilkoma metodami obejmującymi oznaczanie poziomu przeciwciał skierowanych przeciwko receptorowi acetylocholinergicznemu w surowicy przez test radioimmunologiczny (Christadoss i Dauphinee, J. Immunol. 136:2437 (1986); Lindstrom i wsp., Methods Enzymol. 74:432 (1981)), przez oznaczanie receptora acetylocholinergicznego w mięśniach lub badanie elektromiograficzne (Coligan i wsp. (red.), Protocols in Immunology. Vol. 3, page 15.8.1. (John Wiley & Sons, 1997)).

Wpływ TACI-immunoglobuliny na doświadczalną miastenię autoimmunologiczną można określać poprzez podawanie białek fuzyjnych w czasie trwania miastenii z objawami klinicznymi u myszy B6. Na przykład, 100 myszy B6 immunizuje się 20 μg receptora acetylocholinergicznego w kompletnym adiuwancie Freunda w dniach 0 i 30. U około 40 do 60% myszy rozwija się miastenia z objawami klinicznymi o nasileniu umiarkowanym (stopień 2) lub ciężkim (stopień 3) po szczepieniu przypominającym receptorem acetylocholinergicznym. Myszy z nasileniem choroby stopnia 2 i 3 dzieli się na trzy grupy (o równym stopniu osłabienia) i waży (myszy z osłabieniem tracą także na wadze, ponieważ mają trudności z przyjmowaniem pokarmu i wody), pobiera się im krew i izoluje surowicę (w celu obróbki wstępnej przeciwciał przeciwko receptorowi acetylocholinergicznemu i oznaczeniu poziomu izotypu). Grupa A otrzymuje dootrzewnowo sól fizjologiczną zbuforowaną fosforanem, a grupa B otrzymuje dootrzewnowe wstrzyknięcia ludzkiego IgG-Fc jako białka kontrolnego (100 μg), a grupa C wstrzyknięcia 100 μg TACI-Fc trzy razy w tygodniu przez cztery tygodnie. Myszy ocenia się przesiewowo pod kątem objawów klinicznych osłabienia mięśniowego dwa razy w tygodniu, waży się je i pobiera się krew do odwirowania na surowicę 15 i 30 dni po rozpoczęciu leczenia. W dniu 15 pobiera się krew pełną w celu oznaczenia stosunku limfocytów T do B w analizie z sortowaniem komórek aktywowanych fluorescencyjnie przy zastosowaniu markerów B220 i CD5. Myszy, które przeżyły, uśmierca się 30 do 45 dni po rozpoczęciu leczenia, a ich ciała zamraża się do późniejszej ekstrakcji receptora acetylocholinergicznego z mięśni - głównej zmiany patologicznej w miastenii (zobacz, na przykład, Coligan i wsp., (red.), Protocols in Immunology. Vol. 3, str. 15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)).

Poziom przeciwciał w surowicy przeciwko mysiemu receptorowi acetylocholinergicznemu z mięśni oznacza się w uznanym teście radioimmunologicznym, natomiast izotypy przeciwciał przeciwko receptorowi acetylocholinergicznemu (IgM, IgG1, IgG2b i IgG2C) oznacza się metodą ELISA. Metody te są znane. Ustala się wpływ TACI-immunoglobuliny na przebieg objawów klinicznych miastenii, poziom przeciwciał przeciwko receptorowi acetylocholinergicznemu i poziom izotypów, jak również utratę receptora acetylocholinergicznego z mięśni.

Około 100 myszy immunizowano, podając 20 μg receptora acetylocholinergicznego w kompletnym adiuwancie Freunda w dniach 0 i 30. Myszy z klinicznymi objawami miastenii dzielono na cztery grupy. Grupie A podawano we wstrzyknięciu dootrzewnowym 100 μg Fc kontrolnego, grupie B - 20 μg Fc kontrolnego, grupie C - 100 μg TACI-Fc, a grupie D - 20 μg TACI-Fc trzy razy w tygodniu przez cztery tygodnie. Myszy ważono i pobierano im krew do odwirowania surowicy przed rozpoczęciem leczenia oraz 15 i 30 dni po rozpoczęciu leczenia. W surowicy, w sposób opisany powyżej, oznaczono poziom przeciwciał przeciwko receptorowi acetylocholinergicznemu i poziom izotypów. Można również oznaczać utratę receptora acetylocholinergicznego w mięśniach.

Specjalista może ustalić inne korzystne testy białek fuzyjnych TACI-immunoglobulina.

6. Wytwarzanie koniugatów TACI-immunoglobulina

Przedmiotem niniejszego wynalazku są zmodyfikowane chemicznie kompozycje TACI-immunoglobuliny, w których polipeptyd TACI-immunoglobulina jest sprzężony z polimerem. Typowo, polimer jest rozpuszczalny w wodzie, tak że koniugat TACI-immunoglobulina nie ulega strąceniu w środowisku wodnym, na przykład, w środowisku fizjologicznym. Przykładem korzystnego polimeru jest polimer zmodyfikowany tak, aby zawierał jedną grupę reakcyjną, na przykład aktywny ester do acylacji lub aldehyd do alkilacji. W ten sposób można kontrolować stopień polimeryzacji. Przykładem aktywnego aldehydu jest propionoaldehyd glikolu polietylenowego, lub jego pochodna mono-(C1-C10)aloksylowa lub aryloksylowa (zobacz, na przykład, Harris i wsp., patent Stanów Zjednoczonych nr 5.252.714). Polimer może być rozgałęziony lub nierozgałęziony. Ponadto do wytwarzania koniugatów TACI-immunoglobulina można stosować mieszaninę polimerów.

Koniugaty TACI-immunoglobulina stosowane w leczeniu mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne rozpuszczalne w wodzie cząstki polimerów. Do korzystnych polimerów rozpuszczalnych

PL 219 013 B1 w wodzie należą: glikol polietylenowy(PEG), monometoksy-PEG, mono (C1-C10)alkoksy-PEG, aryloksy-PEG, poli-(N-winylopyrolidono) PEG, tresylomonometoksy PEG, aldehyd propionowy PEG, węglan bis-sukcynoimidylowy PEG, homopolimery glikolu propylenowego, kopolimer tlenku polipropylenu/tlenku etylenu, poliole polioksyetylowane (np. glicerol), alkohol poliwinylowy, dekstran, celuloza lub inne polimery węglowodanowe. Masa cząsteczkowa korzystnych PEG może wynosić od około 600 do około 60000, na przykład 5000, 12000, 20000 i 25000. Koniugat TACI-immunoglobulina może również zawierać mieszaninę takich rozpuszczalnych w wodzie polimerów.

Przykładowy koniugat TACI-immunoglobulina zawiera cząstkę TACI-immunoglobuliny i cząstkę tlenku polialkilowego przyłączoną do końca N TACI-immunoglobuliny. Jednym z korzystnych tlenków polialkilowych jest PEG. Jako ilustrację można podać przykład modyfikacji TACI-immunoglobuliny za pomocą PEG w procesie zwanym „PEGilacją. PEGilację TACI-immunoglobuliny można prowadzić na drodze dowolnych reakcji PEGilacji znanych ze stanu techniki (zob. np. EP 0 154 316, Delgado i wsp., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan i Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994) oraz Francis i wsp., Int J Hematol 68:1 (1998)). PEGilację można przeprowadzić na przykład poprzez reakcję acylacji lub reakcję alkilakcji reaktywną cząsteczką glikolu polietylenowego. W innym sposobie koniugaty TACI-immunoglobuliny tworzy się poprzez kondensację aktywowanego PEG, w którym końcową grupę hydroksylową lub aminową PEG zastąpiono aktywowanym linkerem (zob. np. Karasiewicz i wsp., patent Stanów Zjednoczonych nr 5.382.657).

PEGilacja przez acylację typowo wymaga poddania reakcji czynnej pochodnej estrowej PEG z polipeptydem TACI-immunoglobulina. Przykładem aktywowanego estru PEG jest PEG zestryfikowany do N-hydroksysukcynimidu. W rozumieniu niniejszego opisu termin „acylacja obejmuje następujące typy wiązania między TACI-immunoglobuliną a polimerem rozpuszczalnym w wodzie: amid, karbaminian, uretan itp. Sposoby wytwarzania PEGilowanej TACI-immunoglobuliny przez acylację będą typowo obejmować etapy: (a) poddawania reakcji polipeptydu TACI-immunoglobulina z PEG (takim jak na przykład reaktywny ester pochodnej aldehydowej PEG) w warunkach, w których jedna lub więcej grup PEG przyłącza się do TACI-immunoglobuliny i (b) uzyskiwania produktu lub produktów reakcji. Ogólnie, optymalne warunki reakcji acylacji będzie się wyznaczać na podstawie znanych parametrów i pożądanych wyników. Na przykład, im większy jest stosunek PEG:TACI-immunoglobulina, tym większy jest odsetek poliPEGilowanego produktu TACI-immunoglobuliny.

Produkt PEGilacji przez acylację jest typowo poliPEGilowanym produktem TACI-immunoglobuliny, w którym grupy ε-aminowe lizyny są PEGilowane za pośrednictwem acylowej grupy sprzęgającej. Przykładem sprzężenia jest amid. Typowo, powstała TACI-immunoglobulina będzie w co najmniej w 95% mono, di lub tri-PEGilowana, choć, w zależności od warunków reakcji, mogą wytwarzać się substancje o większym stopniu PEGilacji. Produkty PEGilowane można oddzielić od niesprzężonych peptydów TACI-immunoglobulina standardowymi sposobami oczyszczania, takimi jak dializa, ultrafiltracja, chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa itp.

PEGilacja przez aklilację obejmuje zwykle poddanie reakcji końcowej aldehydowej pochodnej PEG z TACI-immunoglobuliną w obecności środka redukującego. Grupy PEG mogą być przyłączane do polipeptydu za pośrednictwem grupy - CH2-NH.

Przy wytwarzaniu pochodnych na drodze alkilacji redukcyjnej z wytwarzaniem monoPEGilowanego produktu wykorzystuje się różnicę w reaktywności różnych typów pierwszorzędowych grup aminowych dostępnych do wytwarzania pochodnych. Typową reakcję prowadzi się przy pH umożliwiającym wykorzystanie różnic pKa między grupami ε-aminowymi reszt lizynowych a grupą a-aminową N-końcowej reszty białka. Przez takie selektywne wytwarzanie pochodnych kontroluje się przyłączanie rozpuszczalnego w wodzie polimeru zawierającego grupę reaktywną, taką jak aldehyd do białka. Sprzęganie polimeru zachodzi głównie na końcu N białka bez istotnych modyfikacji w innych grupach reaktywnych takich jak grupy aminowe bocznego łańcucha lizyny. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest w zasadzie homogenny preparat koniugatów monopolimeru TACI-immunoglobulina.

Alkilacja redukcyjna z wytwarzaniem w zasadzie homogennej populacji cząsteczek koniugatu monopolimeru TACI-immunoglobulina może obejmować etapy: (a) poddawania reakcji polipeptydu TACI-immunoglobulina z reaktywnym PEG w warunkach alkilacji redukcyjnej przy pH odpowiednim do umożliwienia selektywnej modyfikacji grupy a-aminowej na końcu aminowym TACI-immunoglobuliny i (b) uzyskiwania produktu lub produktów reakcji. Środek redukujący stosowany do alkilacji redukcyjnej powinien zachowywać stabilność w roztworze wodnym i wykazywać zdolność do redukowania tylko zasady Schiffa wytworzonej w początkowym procesie alkilacji redukcyjnej. Przykładami środków redu28

PL 219 013 B1 kujących są: borowodorek sodu, cyjanoborowodorek sodu, boran dimetyloaminowy, boran trimetyloaminowy i boran pirydynowy.

W przypadku w zasadzie homogennej populacji koniugatów monopolimeru TACI-immunoglobulina, warunki reakcji redukcyjnej alkilacji powinny umożliwiać wybiórcze przyłączanie cząstki polimeru rozpuszczalnego w wodzie do zakończenia N TACI-immunoglobuliny. Takie warunki reakcji zwykle zapewniają różnice pKa między grupami aminowymi lizyny a grupą α-aminową na końcu N. pH wpływa również na stosunek polimeru do stosowanego białka. Ogólnie, jeżeli pH jest niższe, pożądany będzie większy nadmiar polimeru w stosunku do białka, ponieważ im mniejsza jest zdolność do reakcji N-końcowej grupy a, tym więcej polimeru potrzeba do uzyskania optymalnych warunków. Jeżeli pH jest wyższe, stosunek polimer: TACI-immunoglobulina nie musi być tak duży, ponieważ dostępnych jest więcej grup reaktywnych. Typowo, pH będzie pozostawać w granicach od 3 do 9 lub od 3 do 6.

Innym czynnikiem, który należy uwzględnić, jest masa cząsteczkowa polimeru rozpuszczalnego w wodzie. Ogólnie, im większa jest masa cząsteczkowa polimeru, tym mniej cząsteczek polimeru można przyłączyć do białka. W przypadku reakcji PEGilacji typowa masa cząsteczkowa wynosi od około 2 kDa do około 100 kDa, od około 5 kDa do około 50 kDa lub od około 12 do około 25 kDa. Stosunek molowy polimeru rozpuszczalnego w wodzie do TACI-immunoglobuliny będzie zwykle wynosił od 1:1 do 100:1. Typowo, stosunek molowy polimeru rozpuszczalnego w wodzie do TACI-immunoglobuliny będzie wynosił od 1:1 do 20:1 w przypadku poliPEGilacji i od 1:1 do 5:1 w przypadku monoPEGilacji.

Ogólne sposoby wytwarzania koniugatów zawierających cząstki polipeptydu i polimeru rozpuszczalnego w wodzie są znane ze stanu techniki. Zobacz, na przykład, Karasiewicz i wsp., patent Stanów Zjednoczonych nr 5.382.657, Greenwald i wsp., patent Stanów Zjednoczonych nr 5.738.846,

Nieforth i wsp., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh i wsp., Anal. Biochem. 247:434 (1997)).

Przedmiotem niniejszego wynalazku są kompozycje zawierające peptyd lub polipeptyd według niniejszego wynalazku. Takie kompozycje mogą zawierać także nośnik. Nośnik może być konwencjonalnym nośnikiem organicznym lub nieorganicznym. Przykładami nośników są: woda, roztwór buforu, alkohol, glikol propylenowy, Macrogol, olej sezamowy, olej kukurydziany itp.

7. Izolowanie polipeptydów TACI-immunoglobulina

Polipeptydy według niniejszego wynalazku można oczyszczać do czystości do co najmniej około 80%, co najmniej około 90%, co najmniej około 95% lub ponad 95% w odniesieniu do zanieczyszczających makrocząsteczek, szczególnie innych białek i kwasów nukleinowych, tak aby były wolne od czynników zakaźnych i pirogennych. Polipeptydy według niniejszego wynalazku można również oczyszczać do stanu farmaceutycznie czystego, to znaczy do czystości powyżej 99,9%. W niektórych preparatach oczyszczony polipeptyd jest w zasadzie wolny od innych polipeptydów, szczególnie od innych polipeptydów pochodzenia zwierzęcego.

Do wytwarzania preparatów syntetycznych polipeptydów TACI-immunoglobulina i rekombinacyjnych polipeptydów TACI-immunoglobulina oczyszczanych z rekombinacyjnych komórek gospodarzy, można wykorzystywać frakcjonowanie i/lub konwencjonalne metody oczyszczania. Ogólnie, do frakcjonowania próbek można stosować strącanie siarczanem amoniowym i kwasem lub ekstrakcję chaotropową. Przykładowymi etapami oczyszczania są: chromatografia cieczowa z hydroksyapatytem, chromatografia cieczowa z wyłączaniem cząstek według ich wielkości, FPLC i chromatografia cieczowa wysokosprawna z odwróceniem faz. Korzystnymi środkami do chromatografii są pochodne dekstranów, agaroza, celuloza, poliakrylamid, specjalne krzemionki itp. Korzystne są: PEI, DEAE, QAE i pochodne Q. Środkami do chromatografii mogą być na przykład środki będące pochodnymi z grupami fenylowymi, butylowymi lub oktylowymi, takie jak: Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA, Stany Zjednoczone), Octyl-Sepharose (Pharmacia) itp. lub żywice polikakrylowe takie jak Amberchrom CG 71 (Toso Haas) itp. Do korzystnych podłoży stałych należą paciorki szklane, żywice krzemionkowe, żywice celulozowe, paciorki agarozowe, paciorki z usieciowaną agarozą, paciorki polistyrenowe, żywicę z usieciowanym poliakrylamidem itp., nierozpuszczalne w warunkach, w których się je stosuje. Podłoża te można modyfikować grupami reaktywnymi umożliwiającymi przyłączanie białek przez grupy aminowe, karboksylowe, sulfhydrylowe, hydroksylowe i/lub przez cząstki węglowodanowe.

Przykładami reakcji sprzęgania są aktywacja bromkiem cyjanowym, aktywacja N-hydroksysukcynymidem, epoksydem, sulfhydrylem, hydrazydem oraz zastosowanie pochodnych karboksyloPL 219 013 B1 wych i amidowych do reakcji sprzęgania karbodiimidów. Te i inne środki stałe są znane ze stanu techniki i szeroko stosowane, można je nabyć na rynku. Doboru konkretnej metody izolowania i oczyszczania polipeptydów dokonuje się rutynowo, w zależności między innymi od właściwości wybranego podłoża. Zobacz, na przykład, Affinity Chromatography; Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988) oraz Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996).

Specjalista może dokonać dodatkowych zmian w sposobach izolowania i oczyszczania TACI-immunoglobuliny. Może na przykład zastosować przeciwciała przeciwko TACI lub przeciwko Fc w celu wyizolowania dużej ilości białek na drodze oczyszczania przez immunopowinowactwo.

Polipeptydy według niniejszego wynalazku można również izolować, wykorzystując ich szczególne właściwości. Na przykład, do oczyszczania białek bogatych w histydynę, także białek zawierających etykiety polihistydynowe, można wykorzystywać chromatografię z absorbcją unieruchomionych jonów metalu (IMAC). Pokrótce, na żel najpierw nakłada się dwuwartościowe jony metalu w celu wytworzenia chelatu (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). Białka bogate w histydynę będą adsorbowane do tej macierzy z różnym powinowactwem, w zależności od zastosowanego jonu metalu i będą ulegały elucji poprzez elucję kompetycyjną, obniżanie pH lub zastosowanie silnych środków chelatujących. Innymi sposobami oczyszczania są: oczyszczanie białek glikozylowanych na drodze chromatografii powinowactwa lektyny, chromatografii białka A i chromatografii jonowymiennej (M. Deutscher (red.), Meth. Enzymol. 132:529 (1990)).

Polipeptydy TACI-immunoglobulina lub ich fragmenty można również wytwarzać na drodze syntezy chemicznej, jak to opisano powyżej. Polipeptydy TACI-immunoglobulina mogą być monomerami lub multimerami; glikozylowanymi lub nieglikozylowanymi; PEGilowanymi lub niePEGilowanymi i mogą zawierać lub nie zawierać początkowej reszty aminokwasu metioniny. Białko fuzyjne TACI-immunoglobulina może być nieglikozylowane, glikozylowane lub glikozylowane jedynie w cząstce TAC lub w cząsteczce immunoglobuliny. Cząstkę immunoglobuliny można wytwarzać z przeciwciała ludzkiego, przeciwciała chimerycznego lub przeciwciała humanizowanego.

8. Zastosowanie terapeutyczne polipeptydów TACI-immunoglobulina

Białka TACI-immunoglobulina można stosować do modulowania układu immunologicznego poprzez wiązanie ZTNF4 lub ZTNF2, i poprzez to przez uniemożliwienie wiązania tych ligandów z endogennymi receptorami TACI lub BCMA. Zgodnie z tym, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie białek TACI-immunoglobulina u pacjentów nie posiadających dostatecznej ilości receptorów TACI ani BCMA lub wytwarzających nadmiar ZTNF4 lub ZTNF2. Cząsteczki te można podawać każdemu pacjentowi wymagającemu leczenia, a przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie terapeutyczne, zarówno w medycynie weterynaryjnej, jak i medycynie ludzkiej. Przykładami pacjentów są ssaki takie jak zwierzęta gospodarskie, zwierzęta domowe oraz ludzie.

Polipeptydy TACI-immunoglobulina można stosować w leczeniu chorób autoimmunologicznych, nowotworów z limfocytów-B, do immunomodulacji w zespole jelita drażliwego i we wszelkich chorobach związanych z wytwarzaniem przeciwciał (takich jak ITCP, miastenia itp.), w chorobach nerek, w pośredniej reakcji immunologicznej limfocytów T, przy odrzucaniu przeszczepów i w chorobie „przeszczep przeciwko gospodarzowi. Polipeptydy według niniejszego wynalazku można ukierunkowywać do swoistej regulacji reakcji limfocytów-B w przebiegu reakcji immunologicznej. Dodatkowo, polipeptydy według niniejszego wynalazku można stosować do modulowania rozwoju limfocytów-B, rozwoju innych komórek, wytwarzania przeciwciał i wytwarzania cytokin. Polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą także modulować komunikację limfocytów T i B poprzez neutralizację proliferacyjnego wpływu ZTNF4.

Polipeptydy TACI-immunoglobulina według niniejszego wynalazku mogą być korzystne w neutralizowaniu wpływu ZTNF4 na leczenie białaczek pre B lub białaczek z limfocytów-B takich jak białaczka z komórek plazmatycznych, przewlekła lub ostra białaczka limfocytarna; szpiczaków, takich jak: szpiczak mnogi, szpiczak z komórek plazmatycznych, szpiczak śródbłonkowy i szpiczak z komórek olbrzymich; oraz chłoniaków takich jak chłoniaki nieziarnicze, z którymi wiąże się zwiększenie poziomu polipeptydów ZTNF4.

ZTNF4 ulega ekspresji w komórkach CD8⁺, monocytach, komórkach dendrytycznych, aktywowanych monocytach, co wskazuje, że w pewnych zaburzeniach autoimmunologicznych, cytotoksyczne limfocyty T mogą pobudzać wytwarzanie limfocytów-B poprzez wytwarzanie nadmiernych ilości ZTNF4. Białka immunosupresyjne wybiórczo blokujące działanie limfocytów-B mogłyby być korzystne w leczeniu chorób. Wytwarzanie autoprzeciwciał jest cechą wspólną kilku chorób autoimmunologicznych i przyczynia się do niszczenia tkanek i zaostrzenia choroby. Autoprzeciwciała mogą również

PL 219 013 B1 prowadzić do wystąpienia odkładania kompleksów immunologicznych i związanych z tym powikłań i wiązać się z powstawaniem objawów ogólnoustrojowego tocznia trzewnego, takich jak niewydolność nerek, objawy nerwobólu i zgon. Modulacja wytwarzania przeciwciał niezależnie od reakcji komórkowej byłaby również korzystna w wielu stanach chorobowych. Wykazano także, że limfocyty B odgrywają rolę w wydzielaniu immunoglobulin sprzyjających powstaniu zapalenia stawów w reumatoidalnym zapaleniu stawów. W związku z tym hamowanie wytwarzania przeciwciał ZTNF4 byłoby korzystne w leczeniu chorób autoimmunologicznych, takich jak: miastenia, reumatoidalne zapalenie stawów, wielostawowe młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów i łuszczycowe zapalenie stawów. W takich przypadkach korzystne byłyby leki immunosupresyjne, takie jak białka TACI-immunoglobulina, wybiórczo blokujące lub zobojętniające działanie limfocytów-B.

Przedmiotem niniejszego wynalazku są sposoby wykorzystania białek TACI-immunoglobulina do wybiórczego blokowania lub neutralizowania działania limfocytów-B w związku z końcowym stadium chorób nerek, związanym lub niezwiązanym z chorobami autoimmunologicznymi. Sposoby te byłyby również korzystne w leczeniu immunologicznych chorób nerek. Sposoby te byłyby korzystne w leczeniu kłębkowego zapalenia stawów w przebiegu takich chorób, jak: nefropatia błoniasta, nefropatia IgA, choroba Bergera, nefropatia IgM, choroba Goodpasture'a, pozakaźne kłębkowe zapalenie nerek, choroba mezangioproliferacyjna, przewlekła białaczka limfoidalna, zespół nerczycowy z minimalnymi zmianami. Sposoby te można by również wykorzystać w terapii wtórnego kłębkowego zapalenia nerek lub zapalenia naczyń w przebiegu takich chorób, jak: toczeń trzewny, zapalenie wielostawowe, zespół Henocha-Schonleina, twardzina, zakażenia HIV, amyloidoza oraz zespół hemolityczno-mocznicowy. Sposoby według niniejszego wynalazku byłyby także korzystne jako część terapii śródmiąższowego zapalenia nerek lub odmiedniczkowego zapalenia nerek w przebiegu przewlekłego odmiedniczkowego zapalenia nerek, nadużywania środków przeciwbólowyh, kamicy nerkowej, nefropatii spowodowanej innymi środkami, wapnicy nerek oraz przewlekłego lub ostrego śródmiąższowego zapalenia nerek.

Sposoby według niniejszego wynalazku mogą również obejmować zastosowanie białek TACI-immunoglobulina w leczeniu chorób związanych z nadciśnieniem tętniczym lub chorób dużych naczyń, w tym do leczenia zwężenia tętnicy nerkowej lub jej zamknięcia oraz do leczenia zatorów cholesterolowych lub zatorów w nerkach.

Przedmiotem niniejszego wynalazku są także sposoby leczenia nowotworów nerek lub dróg moczowych, szpiczaka mnogiego, białaczek, neuropatii łańcuchów lekkich lub amyloidozy.

Przedmiotem niniejszego wynalazku są także sposoby blokowania lub hamowania aktywowanych limfocytów-B z zastosowaniem białek TACI-immunoglobulina w leczeniu astmy i innych przewlekłych chorób dróg oddechowych takich jak zapalenie oskrzeli i rozedma płuc. Białka TACI-immunoglobulina według niniejszego wynalazku można także stosować do leczenia zespołu Sjogrena.

Przedmiotem niniejszego wynalazku są również sposoby hamowania lub neutralizowania efektorowej reakcji limfocytów T z zastosowaniem białek TACI-immunoglobulina w immunosupresji, zwłaszcza do zastosowania w terapii choroby „przeszczep przeciwko gospodarzowi i odrzucenia przeszczepu. Ponadto białka TACI-immunoglobulina byłyby użyteczne w protokołach leczenia chorób autoimmunologicznych, takich jak cukrzyca insulinozależna i choroba Crohna. Sposoby według niniejszego wynalazku zapewniają dodatkową korzyść terapeutyczną w leczeniu przewlekłych chorób zapalnych, zwłaszcza w zakresie zmniejszania bólu stawów, obrzęków, niedokrwistości i innych objawów towarzyszących, jak również w leczeniu wstrząsu septycznego.

Dostępne są uznane modele zwierzęce do badania in vivo skuteczności białek TACI-immunoglobulina według niniejszego wynalazku w pewnych stanach chorobowych. W szczególności, białka TACI-immunoglobulina można badać in vivo w kilku modelach zwierzęcych chorób autoimmunologicznych, takich jak w szczepach spokrewnionych myszy MRL-lpr/lpr lub NZB x NZW F1 służących jako modele SLE (ogólnoukładowego tocznia trzewnego). Takie modele zwierzęce są znane ze stanu techniki.

U potomstwa krzyżówki myszy New Zealand Black (NZB) i New Zealand White (NZW) rozwija się samoistna postać SLE bardzo przypominająca SLE u ludzi. Potomstwo tych myszy zwane NZBW zaczyna produkować autoprzeciwciała IgM przeciwko limfocytom T w wieku jednego miesiąca, a do 5-7 miesiąca życia autoprzeciwciała Ig przeciwko DNA stają się dominującymi immunoglobulinami. Nadaktywność poliklonalnych limfocytów-B prowadzi do nadmiernego wytwarzania autoprzeciwciał. Odkładanie się tych autoprzeciwciał, zwłaszcza skierowanych przeciwko jednoniciowemu DNA, wiąże się z powstawaniem kłębkowego zapalenia nerek, klinicznie objawiającego się jako białkomocz, azoPL 219 013 B1 temia i zgon z powodu niewydolności nerek. Niewydolność nerek jest główną przyczyną zgonów u myszy z samoistnym SLE, a w szczepie NZBW proces ten jest przewlekły i obliteracyjny. Choroba rozwija się szybciej i ma większe nasilenie u samic niż u samców, a średni czas przeżycia wynosi zaledwie 245 dni w porównaniu z 406 dniami w przypadku samców. Podczas gdy większość samic myszy rozwija objawy (białkomocz) do 7-9 miesiąca życia, u niektórych objawy mogą pojawić się znacznie wcześniej lub później. Śmiertelne immunologiczne zapalenie nerek obserwowane u myszy NZBW jest bardzo podobne do kłębkowego zapalenia nerek w ludzkim SLE, dlatego też ten samoistny model mysi nadaje się do badania potencjalnych leków przeciwko SLE.

Do badania zarówno mechanizmów chorób immunologicznych, jak i sposobów potencjalnej interwencji terapeutycznej, stosowano modele mysie doświadczalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE). Model ten przypomina stwardnienie rozsiane u człowieka i wywołuje demielinizację w wyniku pobudzenia limfocytów T do białek układu nerwowego takich jak zasadowe białko mieliny (MBP) lub białko proteolipidów. Wszczepienie antygenu prowadzi do pobudzenia CD4+ limfocytów T zależnych od klasy II MHC (Th1). Zmiany protokołu doświadczalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego mogą spowodować uzyskanie odmian tego modelu z przebiegiem choroby ostrym, przewlekłym z nawrotami lub z przekazywaniem biegłym choroby.

W modelu zapalenia stawów wywołanego podaniem kolagenu (CIA) u myszy rozwija się przewlekłe zapalenie stawów bardzo przypominające reumatoidalne zapalenie stawów u człowieka. Ponieważ wywołane kolagenem zapalenie stawów ma cechy immunologiczne i patologiczne podobne do reumatoidalnego zapalenia stawów, czyni to z niego idealny model badań przesiewowych potencjalnych leków przeciwzapalnych dla człowieka. Inną korzyścią z zastosowania modelu indukowanego kolagenem zapalenia stawów jest to, że znane są mechanizmy patogenezy. Zidentyfikowano epitopy limfocytów T i B na kolagenie typu II oraz różne parametry immunologiczne (nadwrażliwość typu późnego i przeciwciała przeciwko kolagenowi) i zapalne (cytokiny, chemokiny i enzymy powodujące rozpad macierzy) związane z immunologicznym zapaleniem stawów; parametry te można wykorzystać do oceny skuteczności związku badanego w modelach.

Inną chorobą autoimmunologiczną, dla której dostępne są modele mysie, jest miastenia. Miastenia jest zaburzeniem transmisji nerwowo-mięśniowej, w której dochodzi do wytworzenia autoprzeciwciał skierowanych przeciwko nikotynowemu receptorowi acetylocholinergicznemu (AchR). Choroba ta jest nabyta lub dziedziczna, a do obrazu klinicznego należy patologiczne osłabienie oraz zmęczenie przy wykonywaniu wysiłków fizycznych. Opracowano mysi model miastenii. Doświadczalna miastenia autoimmunologiczna (EAMG) jest chorobą związaną z wytwarzaniem przeciwciał cechującą się obecnością przeciwciał skierowanych przeciwko receptorowi acetylocholinergicznemu. Przeciwciała te niszczą receptor, prowadząc do zaburzeń przekazywania impulsów elektrycznych na złączu nerwowo-mięśniowym, czego wynikiem jest osłabienie mięśni. W doświadczalnym modelu autoimmunologicznej miastenii myszy immunizuje się nikotynowym receptorem acetylocholinergicznym. Objawy kliniczne miastenii ujawniają się w ciągu kilku tygodni po drugiej immunizacji. Doświadczalną miastenię autoimmunologiczną ocenia się kilkoma metodami obejmującymi oznaczanie poziomu przeciwciał skierowanych przeciwko receptorowi acetylocholinergicznemu w surowicy przez test radioimmunologiczny, oznaczanie receptora acetylocholinergicznego w mięśniach lub badanie elektromiograficzne.

Ogólnie, dawka podawanego białka TACI-immunoglobulina będzie różna w zależności od czynników, takich jak: wiek pacjenta, masa ciała, wzrost, płeć, ogólny stan zdrowia i dotychczasowe choroby. Typowo korzystne jest, aby biorca otrzymał białko TACI-immunoglobulina w dawce wynoszącej od około 1 pg/kg do 10 mg/kg (ilość środka na masę ciała pacjenta), chociaż w zależności od okoliczności można lek podawać również w mniejszych lub większych dawkach.

Białko TACI-immunoglobulina można podawać pacjentowi drogą dożylną, dotętniczą, dootrzewnową, domięśniową, podskórną, doopłucnową, dokanałową, poprzez perfuzję przez cewnik założony do dużej żyły lub poprzez wstrzykiwanie bezpośrednio do zmiany chorobowej. Przy podawaniu białek terapeutycznych przez wstrzyknięcie można stosować ciągłe wlewy, lub pojedyncze lub wielokrotne bolusy.

Dodatkowymi drogami podawania są drogi: doustna, przez błony śluzowe, do płuc i przezskórna. Podawanie doustne można wykorzystywać w przypadku mikrosfer poliestrowych, mikrosfer zeinowych, mikrosfer protenoidowych, mikrosfer policyjanoakrylanowych i systemów lipidowych (zobacz, na przykład, DiBase i Morrel, „Oral Delivery of Microencapsulated Proteins w: Protein Delivery; Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), str. 255-288 (Plenum Press 1997)). Możliwości podawania donosowego dowodzi taki sposób podawania insuliny (zobacz, na przykład, Hinchcliffe i Illum,

PL 219 013 B1

Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). Suche lub ciekłe cząstki zawierające TACI-immunoglobulinę można wytwarzać i przyjmować wziewnie za pomocą aparatów do rozpraszania suchego proszku, generatorów aerozolu ciekłego lub nebulizatorów (np., Pettit i Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton i wsp., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). Przykładem takiego sposobu jest system leczenia cukrzycy AERX, to znaczy nadający się do trzymania w ręku inhalator elektroniczny podający insulinę w postaci aerozolu do płuc. Badania wykazały, że można podawać przez skórę białka o wielkości aż 48000 kDa w stężeniu terapeutycznym za pomocą ultradźwięków o małej częstotliwości, co dowodzi możliwości podawania przezskórnego (Mitragotri i wsp., Science 269:850 (1995)). Innym sposobem podawania białka TACI-immunoglobuliny jest podawanie przezskórne za pomocą elektroporacji (Potts i wsp., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).

Kompozycję farmaceutyczną zawierającą białko TACI-immunoglobulina można wytwarzać znanymi sposobami wytwarzania kompozycji użytecznych farmaceutycznie, w których białka terapeutyczne łączy się w mieszaninę z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. O kompozycji mówi się, że stanowi „nośnik dopuszczalny farmaceutycznie, jeżeli jej podawanie jest tolerowane przez pacjenta. Przykładem farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika jest jałowy zbuforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej. Ze stanu techniki znane są inne korzystne nośniki. Zobacz, na przykład, Gennaro (red.), Remmington's Pharmaceutical Sciences, wydanie dziewiętnaste (Mack Publishing Company 1995).

W celach terapeutycznych białka TACI-immunoglobulina podaje się pacjentowi w ilości terapeutycznie skutecznej. Mówi się, że białko TACI-immunoglobulina i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik jest podawany w „terapeutycznie skutecznej ilości, jeżeli podawana ilość jest istotna fizjologicznie. Środek jest fizjologicznie istotny, jeżeli jego obecność powoduje wykrywalną zmianę w fizjologii pacjenta, który otrzymał dany środek. Na przykład, środek stosowany do leczenia zapalenia jest fizjologicznie istotny, jeżeli jego obecność łagodzi reakcję zapalną. Innym przykładem jest środek stosowany do hamowania wzrostu komórek nowotworowych, który jest fizjologicznie istotny, jeżeli jego podawanie powoduje zmniejszenie liczby komórek nowotworowych, zmniejszenie powstawania przerzutów, zmniejszenie wielkości guza litego lub nasilenie martwicy nowotworu. Ponadto, środek stosowany do leczenia ogólnoukładowego tocznia trzewnego jest fizjologicznie istotny, jeżeli jego podawanie powoduje zmniejszenie poziomu przeciwciał przeciwko dwuniciowemu DNA w krążeniu lub złagodzenie co najmniej jednego z następujących objawów: gorączka, bóle stawów, zmiany skórne o typie rumienia lub inne cechy ogólnoukładowego tocznia trzewnego. Przykładem ogólnego wskaźnika, że białko TACI-immunoglobulina podaje się w ilości terapeutycznie skutecznej jest to, że po podaniu pacjentowi tego białka stwierdza się zmniejszenie poziomu ZTNF4 (BLyS) w krążeniu.

Kompozycję farmaceutyczną zawierającą białko TACI-immunoglobulina można wytwarzać w postaci ciekłej, w aerozolu lub w postaci stałej. Przykładami postaci ciekłych są roztwory do wstrzyknięć i zawiesiny do podawania doustnego. Przykładami postaci stałych są kapsułki, tabletki i postacie o kontrolowanym uwalnianiu. Przykładem tych ostatnich są pompy miniosmotyczne i wszczepy (Bremer i wsp., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, „Implants in Drug Delivery, w: Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (red.), str. 95-123 (CRC Press 1995); Bremer i wsp., „Protein Delivery with Infusion Pumps, w: Protein Delivery; Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), str. 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey i wsp., „Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant, w: Protein Delivery; Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), str. 93-117 (Plenum Press 1997)).

Innym sposobem podawania polipeptydów terapeutycznych pacjentowi dożylnie, dootrzewnowo, dokanałowo, domięśniowo, podskórnie lub przez podawanie doustne, wziewne lub donosowe, są liposomy. Liposomy są to mikroskopijne pęcherzyki składające się z jednej lub więcej podwójnych warstw lipidowych otaczających przedziały wodne (zobacz ogólnie, Bakker-Woudenberg i wsp., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1): S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993) i Ranade, „Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers w: Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (red.), str. 3-24 (CRC Press 1995)). Liposomy mają podobny skład, co błony komórkowe, dlatego też można je podawać bezpiecznie i ulegają one rozpadowi biologicznemu. W zależności od sposobu wytwarzania, liposomy mogą być jednoblaszkowe lub wieloblaszkowe, a ich rozmiary mogą być różne: średnica może wynosić od 0,02 μm do ponad 10 μm. W liposomie można zamykać rozmaite środki: środki hydrofobowe w warstwy podwójne, a środki hydrofilowe w wewnętrzne przestrzenie wodne (zobacz, na przykład, Machy i wsp., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987) i Ostro i wsp., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Ponadto, możliwa jest kontrola dostępności

PL 219 013 B1 terapeutycznej zamkniętego w kapsułkę środka poprzez zmianę wielkości liposomów, liczby warstw podwójnych, składu lipidowego, jak również zmiany ładunku i charakterystyki powierzchniowej liposomów.

Liposomy mogą przywierać do wszelkich typów komórek i następnie powolnie uwalniać zamknięty w nich środek. Zamiast tego, liposom może ulegać absorbcji, i następnie endocytozie, w komórkach wykazujących właściwości fagocytowe. Po endocytozie następuje rozpad lipidów liposomu wewnątrz lizosomu i uwolnienie środków, które były zamknięte w liposomie (Scherphof i wsp., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)). Po podaniu dożylnym liposomy drobne (0,1-1,0 μm) są typowo wychwytywane przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego znajdujące się głównie w wątrobie i śledzionie, natomiast liposomy o wielkości powyżej 3,0 μm odkładają się w płucach. Ten preferencyjny wychwyt drobnych liposomów przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego wykorzystuje się do podawania środków chemioterapeutycznych, do makrofagów i do nowotworów wątroby.

Układ siateczkowo-śródbłonkowy można ominąć kilkoma sposobami, np. poprzez nasycenie dużymi dawkami cząstek liposomowych lub wybiórczą inaktywację makrofagów środkami farmakologicznymi (Claassen i wsp., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). Ponadto wykazano, że włączenie pochodnych glikolipidowych lub glikolu polietylenowego fosfolipidów do błon liposomów powoduje znaczne zmniejszenie wychwytu przez układ siateczkowo-śródbłonkowy (Allen i wsp., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen i wsp., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).

Liposomy można także wytwarzać w taki sposób, aby ukierunkowywać je na poszczególne komórki lub narządy poprzez zmianę składu fosfolipidów lub poprzez wprowadzanie do liposomów receptorów lub ligandów. Na przykład, do ukierunkowywania na wątrobę stosowano liposomy wytworzone z dużą zawartością niejonowego środka powierzchniowo czynnego (Hayakawa i wsp., patent Japonii nr 04-244,018; Kato i wsp., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)). Preparaty te wytwarzano poprzez zmieszanie fosfotydylocholiny sojowej, α-tokoferolu i etoksylowanego uwodowionego oleju rycynowego (HCO-60) w metanolu z natężeniem mieszaniny w próżni, i następnie ponowne rozpuszczenie mieszaniny wodą. Wykazano również, że liposomalny preparat dipalmitoilofosfatydylocholiny (DPPC) z sojową mieszaniną steryloglukozydów (SG) i cholesterolu (Ch) ukierunkowuje się na wątrobę (Shimizu i wsp., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)).

Zamiast tego, różne ligandy ukierunkowujące mogą wiązać się z powierzchnią liposomów, na przykład przeciwciała, fragmenty przeciwciał, węglowodany, witaminy i białka transportowe. Na przykład, liposomy można modyfikować rozgałęzionymi pochodnymi galaktozylolipidowymi w celu ukierunkowania na receptory asialoglikoproteinowe (galaktozowe) ulegające ekspresji wyłącznie na powierzchni komórki (Kato i Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi i wsp., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). Podobnie, Wu i wsp., Hepatology 27:772 (1998) wykazali, że wyznakowanie liposomów asialofetuiną powodowało skrócenie czasu półtrwania liposomów w osoczu i znaczne zwiększenie wychwytu zwrotnego wyznakowanych asialofetuiną liposomów przez hepatocyty. Z drugiej strony, nagromadzenie w wątrobie liposomów zawierających rozgałęzione pochodne galaktozynolipidowe można zahamować przez uprzednie wstrzyknięcie asialofetuiny (Murahashi i wsp., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). Innym sposobem ukierunkowywania liposomów na komórki wątroby jest zastosowanie poliakonitylowanych liposomów ludzkiej albuminy surowicy (Kamps i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997)). Ponadto, Geho i wsp. w patencie Stanów Zjednoczonych nr 4.603.044 opisali ukierunkowany na hepatocyty system dostarczania do pęcherzyków liposomów wykazujący swoistość względem receptorów wątroby i dróg żółciowych związanych z wyspecjalizowanymi komórkami metabolicznymi wątroby.

W bardziej ogólnym sposobie ukierunkowywania na tkanki komórki docelowe znakuje się wstępnie biotynolowanymi przeciwciałami swoistymi dla ligandu, który ulega ekspresji na komórce docelowej (Harasym i wsp., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). Po wyeliminowaniu wolnego przeciwciała z osocza podaje się liposomy sprzężone ze streptawidyną. W innym sposobie ukierunkowujące przeciwciała bezpośrednio przyłącza się do liposomów (Harasym i wsp., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)).

Białka TACI-immunoglobulina można zamykać wewnątrz liposomów standardowymi sposobami mikroenkapsulacji białek (zobacz, na przykład, Anderson i wsp., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson i wsp., Cancer Res. 50:1853 (1990) oraz Cohen i wsp., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving i wsp., „Preparation and Use of Liposomes in Iminunological Studies, w: fiposome Technology, wydanie drugie, Vol. III, Gregoriadis (red.), str. 317 (CRC Press 1993), Wassef i wsp., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Jak to wspomniano powyżej, liposomy użyteczne terapeutycznie

PL 219 013 B1 mogą zawierać wiele składników. Na przykład liposomy mogą zawierać ciekłe pochodne poli(glikolu etylenowego) (Allen i wsp., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).

Ulegające rozpadowi mikrosfery polimerowe opracowano tak, aby utrzymać wysoki ogólnoustrojowy poziom białek terapeutycznych. Mikrosfery wytwarza się z ulegających rozpadowi polimerów takich jak poli(laktydokoglikolid) (PLG), wielobezwodniki, poli(ortoestry), nieulegające rozpadowi biologicznemu polimery octanu etylowinylowego, w których białka ulegają zamknięciu w polimerze (Gombotz i Pettit, Bioconjugrate Cham. 6:332 (1995); Ranade, „Role of Polymers in Drug Delivery w: Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (red.), str. 51-93 (CRC Press 1995); Roskos i Maskiewicz, „Degradabie Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery w: Protein Delivery; Physical Systems, Sanders i Hendren (red.), str. 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus i wsp., Science 281:1161 (1998); Putney i Burke Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Nanosfery w powłoce z glikolu polietylenowego (PEG) mogą również dostarczyć nośników do dożylnego podawania białek terapeutycznych (zob. np. Gref i wsp., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)).

Przedmiotem niniejszego wynalazku są również zmodyfikowane chemicznie białka TACI-immunoglobulina, w których polipeptyd sprzężony jest z polimerem, jak to opisano powyżej.

Specjalista może opracować inne postaci dawkowe, na przykład, jak to opisali Ansel i Popovich, Pharmaceutical Dosagre Forms and Drug Delivery Systems, wydanie piąte (Lea & Febiger 1990), Gennaro (red.), Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie dziewiętnaste (Mack Publishing Company 1995) oraz przez Ranadego i Hollingera, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).

Przykładowo, kompozycje farmaceutyczne można wytwarzać w postaci zestawu zawierającego pojemnik, w którym znajduje się białko TACI-immunoglobulina. Polipeptydy terapeutyczne można wytwarzać w postaci roztworu do wstrzyknięć w jednej lub wielu dawkach lub w postaci jałowego proszku, który rozpuszcza się przed wstrzyknięciem. Zamiast tego, zestaw może zawierać aparat do dyspersji suchego proszku, generator ciekłego aerozolu lub nebulizator do podawania polipeptydu terapeutycznego. Zestaw może ponadto zawierać pisemne informacje na temat wskazań i sposobu zastosowania kompozycji farmaceutycznej. Ponadto, informacja taka może zawierać stwierdzenie, że kompozycja białka TACI-immunoglobulina jest przeciwwskazana u pacjentów ze znaną nadwrażliwością na cząstkę receptora TACI lub na cząstkę immunoglobuliny.

9. Zastosowanie terapeutyczne sekwencji nukleotydowych TACI-immunoglobulin

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących białka fuzyjne TACI-immunoglobulina w celu dostarczenia tych białek fuzyjnych pacjentowi wymagającemu takiego leczenia. W zastosowaniu terapeutycznym w medycynie weterynaryjnej lub ludzkiej takie cząsteczki kwasu nukleinowego można podawać pacjentowi z chorobą lub zaburzeniem wymienionym powyżej. Przykładem omówionym wcześniej jest stosowanie cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących białko fuzyjne TACI-immunoglobulina do długofalowego leczenia ogólnoukładowego tocznia trzewnego.

Istnieje wiele sposobów wprowadzania genów TACI-immunoglobuliny do organizmu pacjenta, na przykład zastosowanie rekombinacyjnych komórek-gospodarzy wykazujących ekspresję genu TACI-immunoglobulina, podawanie nagiego kwasu nukleinowego kodującego TACI-immunoglobulinę, zastosowanie kationowego nośnika lipidowego z cząsteczką kwasu nukleinowego kodującego TACIimmunoglobulinę i zastosowanie wirusów wykazujących ekspresję genu TACI-immunoglobuliny, takich jak: retrowirusów rekombinacyjnych, rekombinacyjnych wirusów związanych z adenowirusami, rekombinacyjnych adenowirusów oraz rekombinacyjnych wirusów Herpes simplex (zobacz, na przykład, Mulligan, Science 260:926 (1993), Rosenberg i wsp., Science 242:1575 (1988), LaSalle i wsp., Science 259:988 (1993), Wolff i wsp., Science 247:1465 (1990), Breakfield i Deluca, The New Biologist 3:203 (1991)). W metodzie ex vivo, na przykład, komórki izoluje się od pacjenta, transfekuje wektorem wykazującym ekspresję genu TACI-immunoglobuliny, po czym przeszczepia pacjentowi.

W celu uzyskania ekspresji genu TACI-immunoglobuliny konstruuje się wektor ekspresyjny, w którym sekwencja nukleotydowa kodująca gen TACI-immunoglobuliny jest połączona w sposób umożliwiający działanie z promotorem rdzeniowym i, ewentualnie, element regulacyjny w celu kontroli transkrypcji genu. Ogólne wymagania dla wektora ekspresyjnego opisano powyżej.

Gen TACI-immunoglobuliny można zamiast tego podawać z zastosowaniem rekombinacyjnych wektorów wirusowych, takich jak na przykład wektory adenowirusowe (np. Kass-Eisler i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:11498 (1993), Kols i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:215 (1994), Li i wsp., Fum. Gene Ther. 4:403 (1993), Vincent i wsp., Nat. Genet. 5:130 (1993) i Zabner i wsp., Cell 75:207 (1993)), wektory wirusów związanych z adenowirusami (Flotte i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA

PL 219 013 B1

90:10613 (1993)), alfawirusy takie jak Semliki Forest Virus i Sindbis Virus (Hertz i Huang, J. Vir. 66:857 (1992), Raju i Huang, J. Vir. 65:2501 (1991) oraz Xiong i wsp., Science 243:1188 (1989)), wektory wirusa opryszczki (np. patenty Stanów Zjednoczonych nr 4.769.331, 4.859.587, 5.288.641 i 5.328.688), wektory parwowirusowe (Koering i wsp., Hum. Gene Therap. 5:457 (1994)), wektory wirusa ospy (Ozaki i wsp., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193:653 (1993), Panicali i Paoletti, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:4927 (1982)), wirusy ospy takie jak wirusy ospy kanarków lub wirus krowianki (Fisher-Hoch i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:317 (1989) i Flexner i wsp., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569:86 (1989)) i retrowirusy (np. Baba i wsp., J. Neurosury 79:729 (1993), Ram i wsp., Cancer Res. 53:83 (1993), Takamiya i wsp., J. Neurosci. Res 33:493 (1992), Vile i Hart, Cancer Res. 53:962 (1993), Vile i Hart, Cancer Res. 53:3860 (1993) oraz Anderson i wsp., patent Stanów Zjednoczonych nr 5.399.346). W wielu wykonaniach sam wektor wirusowy lub cząstka wirusowa zawierająca wektor wirusowy mogą być wykorzystywane w sposobach i kompozycjach opisanych poniżej.

Przykładem systemu jest adenowirus, dwuniciowy wirus DNA, dobrze poznany wektor do transferu genów służący dostarczaniu heterologicznej cząsteczki kwasu nukleinowego (omówienie można znaleźć w Becker i wsp., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994); Douglas i Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). System adenowirusowy wykazuje wiele korzyści, takich jak: (i) zdolność do przyjęcia względnie dużych insertów DNA, (ii) zdolność do wzrostu do wysokiego miana, (iii) zdolność zakażenia szerokiego spektrum typów komórek ssaków i (iv) możliwość wykorzystania z wieloma różnymi promotorami, takimi jak: promotory wszechobecne, swoiste tkankowo i ulegające regulacji. Ponadto, adenowirusy można podawać przez wstrzyknięcie dożylne, ponieważ wirusy zachowują stabilność w krwiobiegu.

Przy stosowaniu wektorów adenowirusowych, w których części genomu wirusa uległy delecji, inserty wprowadza się do wirusowego DNA poprzez bezpośrednią ligację lub rekombinację homologiczną kontransfekowanym plazmidem. W przykładowym systemie zasadniczy gen E1 ulega delecji z wektora wirusowego i wirus nie będzie replikował się, o ile komórka-gospodarz nie dostarczy genu E1. Przy podawaniu dożylnym zwierzętom uprzednio nieleczonym adenowirus ukierunkowuje się głównie na wątrobę. Jakkolwiek adenowirusowy system dostarczania z delecją genu E1 nie jest zdolny do replikacji w komórkach gospodarza, tkanka gospodarza będzie wykazywać ekspresję i będzie obrabiać kodowane białko heterologiczne. Komórki gospodarza będą również wydzielały białko heterologiczne, jeżeli odpowiedni gen zawiera wydzielniczą sekwencję sygnałową. Wydzielane białka będą wchodzić do krążenia z tkanek, w których zachodzi ekspresja genu heterologicznego, na przykład, silnie unaczyniona wątroba.

Ponadto, wektory adenowirusowe zawierające różne delecje genów wirusowych można stosować do zmniejszenia lub eliminowania reakcji immunologicznej na wektor. Takie adenowirusy wykazują delecję E1, a ponadto delecję E2A lub E4 (Lusky i wsp., J. Virol. 72:2022 (1998); Raper i wsp., Human Gene Therapy 9:671 (1998)). Opisywano także, że delecja E2B hamuje reakcje immunologiczne (Amalfitano i wsp., J. Virol. 72:926 (1998)). Poprzez delecję całości genomu adenowirusa można umożliwić wprowadzanie bardzo dużych insertów DNA heterologicznego. Wytwarzanie atenowirusów zwanych „gutless, w których wszystkie geny wirusa uległy delecji, jest szczególnie korzystne przy wprowadzaniu dużych insertów DNA heterologicznego (omówienie można znaleźć w Yeh. i Perricaudet, FASEB J. 11:615 (1997)).

Duże miano wirusów rekombinacyjnych zdolnych do ekspresji genu terapeutycznego można wytworzyć standardowymi sposobami z zakażonych komórek ssaków. Na przykład rekombinacyjny wirus Herpes simplex można wytworzyć w komórkach Vero, jak to opisali Brandt i wsp., J. Gen. Virol.

72:2043 (1991), Herold i wsp., J. Gen. Virol. 75:1211 (1994), Visalli i Brandt, Virology 185:419 (1991), Grau i wsp., Invest. Ophthamol. Vis. Sci. 30:2474 (1989), Brandt i wsp., J. Virol. Meth. 36:209 (1992) oraz Brown i MacLean (red.), HSV Virus Protocols (Humana Press 1997).

Zamiast tego, do komórek gospodarza można wprowadzać gen TACI-immunoglobulina poprzez lipofekcję in vivo z zastosowaniem liposomów. Do wytwarzania liposomów do transfekcji in vivo genu kodującego marker można wykorzystać syntetyczne lipidy kationowe (Felgner i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 54:7413 (1987); Mackey i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:8027 (1988)). Zastosowanie lipofekcji do wprowadzania genów egzogennych do swoistych narządów in vivo wykazuje kilka korzyści praktycznych. Liposomy można stosować do ukierunkowywania transfekcji na dane typy komórek, co jest szczególnie korzystne w tkankach wykazujących heterogenność komórkową takich jak trzustka, wątroba, nerki i mózg. Lipidy można sprzęgać chemicznie z innymi cząsteczkami w celu ukierun36

PL 219 013 B1 kowywania. Ukierunkowane peptydy (np. hormony lub neuroprzekaźniki), białka, takie jak przeciwciała, lub cząsteczki niepeptydowe można sprzęgać chemicznie z liposomami.

Innym sposobem podawania jest elektroporacja. Na przykład Aihara i Miyazaki, Nature Biotechnology 16:867 (1998) udowodnili użyteczność elektroporacji in vivo do przekazywania genów do mięśni.

Ogólnie, dawka kompozycji zawierającej wektor terapeutyczny zawierający sekwencję kwasu nukleotydowego TACI-immunoglobulina taki jak wektor rekombinacyjny, będzie różna w zależności od takich czynników jak wiek pacjenta, masa ciała, wzrost, płeć, ogólny stan zdrowia i choroby współistniejące. Korzystnymi drogami podawania wektorów terapeutycznych są: wstrzyknięcie dożylne, wstrzyknięcie dotętnicze, wstrzyknięcie dootrzewnowe, wstrzyknięcie domięśniowe, wstrzyknięcie do guza nowotworowego i wstrzyknięcie do jamy zawierającej guz. Przykładowo, Horton i wsp. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:1553 (1999) dowiedli, że domięśniowe wstrzyknięcie DNA plazmidowego kodującego interferon a powoduje silne działanie nowotworowe na guzy pierwotne i przerzutowe w modelu mysim.

Kompozycję zawierającą wektory wirusowe, wektory niewirusowe lub połączenie wektorów wirusowych i niewirusowych według niniejszego wynalazku można wytwarzać znanymi sposobami wytwarzania farmaceutycznie użytecznych kompozycji, przy czym wektory lub wirusy łączy się w mieszaninę z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Jak to wspomniano powyżej, o kompozycji takiej jak sól fizjologiczna zbuforowana fosforanem mówi się, że jest „farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, jeżeli pacjent jest w stanie tolerować jej podawanie. Specjaliście znane są inne korzystne nośniki (zobacz, na przykład, Remington's Pharmaceuticla Sciences, wydanie dziewiętnaste (Mack Publishing Co. 1995) oraz Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, wydanie siódme (MacMillan Publishing Col. 1985)).

W celach terapeutycznych wektor ekspresji genu terapeutycznego lub wirus rekombinacyjny zawierający taki wektor oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik podaje się pacjentowi w ilości terapeutycznie skutecznej. Mówi się, że połączenie wektora ekspresji (lub wirusa) i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika podaje się w ilości „terapeutycznie skutecznej, jeżeli podawana ilość jest istotna fizjologicznie. Środek jest istotny fizjologicznie, jeżeli jego obecność powoduje wykrywalną zmianę w fizjologii pacjenta, który go otrzymał. Na przykład środek stosowany do leczenia zapalenia jest fizjologicznie istotny, jeżeli jego obecność łagodzi reakcję zapalną. Innym przykładem jest środek stosowany do hamowania wzrostu komórek nowotworowych; jest on fizjologicznie istotny, jeżeli podanie go powoduje zmniejszenie liczby komórek nowotworowych, powstawania przerzutów wielkości guza litego lub nasilenie martwicy nowotworu.

Kiedy pacjentem leczonym wektorem ekspresji genu terapeutycznego lub wirusem rekombinacyjnym jest człowiek, leczenie, korzystnie, jest terapią genetyczną komórkami somatycznymi. To znaczy, korzystne leczenie człowieka wektorem ekspresji genu terapeutycznego lub wirusem rekombinacyjnym nie obejmuje wprowadzania do komórek cząsteczki kwasu nukleinowego, która mogłaby tworzyć część linii germinalnej człowieka i mogłaby być przekazywana na następne pokolenia (tzn. nie jest to terapia genetyczna linią ludzkich komórek germinalnych).

10. Wytwarzanie myszy transgenicznych

Technikami inżynierii genetycznej można uzyskiwać myszy transgeniczne do nadmiernej ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego, kodującego białka fuzyjne i TACI-immunoglobulina we wszystkich tkankach lub pod kontrolą swoistego tkankowo lub preferowanego w danej tkance elementu regulacyjnego. Te organizmy, produkujące nadmierne ilości białek fuzyjnych TACI-immunoglobulina, można stosować do poznania fenotypu wynikającego z nadmiernej ekspresji; zwierzęta transgeniczne mogą również służyć jako modele chorób człowieka powodowanych przez nadmiar białka receptora TACI. Myszy transgeniczne, wykazujące nadmierną ekspresję białek fuzyjnych TACI-immunoglobulina, zapewniają również bioreaktory modelowe do wytwarzania białek procesowych TACI-immunoglobulina w mleku lub krwi większych zwierząt. Sposoby uzyskiwania myszy transgenicznych są znane specjalistom (zobacz na przykład: Jacob, „Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice w Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (red.), strony 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky and Robl (red.), Strategies i Transgenic-Animal Science (ASM Press 1995), oraz Abbud and Nilson, „Rant Protein Expression in Transgenic Mice w Gene: Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez i Hoeffler (red.), strony 367-397 (Academic Press, Inc. 1999).

PL 219 013 B1

Uzyskiwanie myszy transgenicznych, w których organizmach zachodzi ekspresja sekwencji kwasu nukleinowego kodującego białko fuzyjne TACI-immunoglobulina, można rozpoczynać u dorosłych samców płodnych (B6C3f1, od 2 do 8 miesięcy życia (Taconic Farms, Germantown, NY, Stany Zjednoczone)), samców niepłodnych, po przecięciu nasieniowodów, (B6D2f1, od 2 do 8 miesięcy życia (Taconic Farms)), płodnych samic przed okresem pokwitania (dawczynie) (B6C3f1, od 4 do 5 tygodnia życia (Taconic Farms)), i dorosłych, płodnych samic (biorczynie) (B6D2f1, od 2 do 4 miesięcy życia (Taconic Farms)). Dawcy aklimatyzują się przez 1 tydzień, po czym wstrzykuje im się ok. 8 IU/mysz gonadotropiny z surowicy ciężarnych klaczy (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone) dootrzewnowo, i w 46-48 godzin potem, 8 IU/mysz ludzkiej gonadotrofiny kosmówkowej (hCG (Sigma)), dootrzewnowo, w celu wywołania nadmiernej owulacji. Dawczynie parzy się z płodnymi samcami po wstrzyknięciu hormonów. Jajeczkowanie zwykle występuje w ciągu 13 godzin od wstrzyknięcia hCG. Kopulację potwierdza się przez obecność czopa w pochwie rano po parzeniu.

W czasie zabiegu chirurgicznego pobiera się zapłodnione jaja. Pobiera się jajowody i jaja, umieszcza się na płytkach do badania ogólnego moczu z dodatkiem hialuronidazy (Sigma). Jajeczka płucze się raz w hialuronidazie i dwukrotnie w pożywce Whittena W640 (opisanej na przykład przez Menino i O'Claray, Biol. Reprod. 77:159 (1986), oraz przez Dienharta i Downsa, Zygote 4:129 (1996)), inkubowanej w obecności 5% CO2, 5% O2, i 90% N2 w temperaturze 37°C. Jajeczka następnie przechowuje się w inkubatorze 37°C/5% CO2 aż do mikroiniekcji.

Dziesięć do dwudziestu mikrogramów DNA plazmidowego, zawierającego sekwencję kodującą białko fuzyjne TACI-immunoglobulina, linearyzuje się, oczyszcza na żelu i ponownie zawiesza w 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,25 mM EDTA (pH 8.0), w końcowym stężeniu 5-10 nanogramów na mikrolitr do mikroiniekcji. Sekwencje kodujące białko fuzyjne TACI-immunoglobulina mogą na przykład kodować polipeptyd TACI z delecją reszt aminokwasowych 1-29 i 119-154 według SEQ ID nr 2, i cząstkę immunoglobuliny Fc5.

DNA plazmidowe wstrzykuje się, poprzez mikroiniekcję, do pobranych jajeczek, umieszczanych w kropli pożywki W-640, pokrytej ciepłym, zrównoważonym w CO2 oleju mineralnym. DNA pobiera się do igły do wstrzyknięć (wyciągniętej z kapilary ze szkła borokrzemianowego 0,75 mm ID, 1 mm OD), i wstrzykuje do poszczególnych jajeczek. Każde jajeczko penetruje się igłą do wstrzyknięć do jednego lub obu przedjądrzy haploidalnych.

DNA wielkości rzędu pikolitrów, wstrzykuje się do przedjądrzy, i igłę do wstrzyknięć wyciąga się, bez zetknięcia z jąderkami. Procedurę powtarza się do wykonania wstrzyknięć do wszystkich jajeczek. Jajeczka po skutecznej mikroiniekcji przenosi się do płytki z hodowlą tkanek narządów, z pożywką W640 wzbogaconą w gaz, i przechowuje przez noc w inkubatorze 37°C/5% CO2.

Następnego dnia dwukomórkowe zarodki przenosi się do biorczyń w ciąży rzekomej. Biorczynie rozpoznaje się na podstawie obecności czopów kopulacyjnych po kopulacji z niepłodnymi samcami po wazektomii. Biorczynie znieczula się i goli im lewą stronę grzbietu, po czym przenosi pod mikroskop chirurgiczny. Wykonuje się małe nacięcie na skórze i przez ścianę mięśni, na środku pola brzusznego, ograniczonego żebrami, siodłem i tylną łapą, w połowie odległości między stawem kolanowym a śledzioną. Narządy rozrodcze wydobywa się na zewnątrz, na małą chustę chirurgiczną. Nad chustą chirurgiczną rozpościera się poduszeczkę tłuszczową, po czym do poduszeczki tłuszczowej przymocowuje się małe kleszczyki (Roboz, Rockville, MD, Stany Zjednoczone), i pozostawia się je nad grzbietem myszy, co uniemożliwia wślizgnięcie się narządów z powrotem do wnętrza ciała.

Za pomocą cienkiej pipety transferowej zawierającej olej mineralny, i następnie na zmianę pożywkę W640 i pęcherzyki powietrza, do organizmu biorczyni przenosi się 12-17 zdrowych, dwukomórkowych zarodków z iniekcji wykonanej poprzedniego dnia. Lokalizuje się nabrzmiałą bańkę jajowodu, i przytrzymując jajowód między bańką a torebką, wykonuje się w jajowodzie nacięcie igłą 28 g, blisko torebki, uważając, aby nie zranić bańki jajowodu ani torebki.

Pipetę przenosi się do nacięcia w jajowodzie i wdmuchuje się do niego zarodki, uwalniając najpierw pęcherzyki powietrza z pipety. Poduszeczkę tłuszczową delikatnie umieszcza się z powrotem w jamie otrzewnej i umożliwia się wślizgnięcie do wnętrza ciała narządów rozrodczych. Ścianę otrzewnej zamyka się jednym szwem, po czym zamyka się skórę klipsem do ran. Mysz pozostawia się w spoczynku na płycie ogrzanej do temperatury 37°C co najmniej przez 4 godziny.

Biorczynie umieszcza się z powrotem w klatkach, w parach, i pozostawia na 19-21 dni ciąży. Po porodzie, przed odstawieniem osesków, pozostawia się je z matkami przez 19-21 dni po porodzie. Następnie oseski dzieli się ze względu na płeć i umieszcza w klatkach, oddzielnie samce i oddzielnie samice, a z ich ogonów, czystymi nożyczkami, pobiera się bioptaty po 0,5 cm (do genotypowania).

PL 219 013 B1

Z fragmentów ogona preparuje się DNA genomowe, stosując na przykład zestaw QIAGEN DNEASY, według zaleceń producenta. DNA genomowe poddaje się analizie metodą PCR z zastosowaniem primerów przeznaczonych do powielania sekwencji kwasu nukleinowego, kodującej białko fuzyjne TACI-immunoglobulina lub gen markerowy nadający się do selekcji, wprowadzony do tego samego plazmidu. Po potwierdzeniu, że zwierzęta są transgeniczne, krzyżuje się je z powrotem do szczepu wsobnego poprzez umieszczenie transgenicznej samicy z samcem typu dzikiego, lub transgenicznego samca z jedną lub dwiema samicami typu dzikiego. Po urodzeniu noworodków i okresie karmienia, oseski rozdziela się według płci, a z ich ogonów pobiera się bioptaty do genoptypowania.

W celu potwierdzenia ekspresji transgenu u żywego zwierzęcia dokonuje się częściowej hepatektomii. Preparat chirurgiczny pobiera się poprzez nacięcie w nadbrzuszu bezpośrednio pod wyrostkiem mieczykowatym. W warunkach jałowych, poniżej mostka, wykonuje się małe nacięcie (1,5-2 cm) i wydobywa się na zewnątrz lewy płat boczny wątroby. Wokół dolnego płata zawiązuje się szew nićmi jedwabnymi 4-0 tak, aby utrzymać płat poza jamą ciała. Do podtrzymywania szwu stosuje się atraumatyczny zacisk, natomiast drugą pętlę wykonuje się z wchłanialnych nici Dexon (American Cyanamid; Wayne, N.J, Stany Zjednoczone) i umieszcza się ją proksymalnie do pierwszego szwu. Ze szwu nićmi Dexon dokonuje się dystalnie odcięcia i ok. 100 mg wyciętej tkanki wątrobowej umieszcza się w jałowej płytce Petriego. Wycięty fragment wątroby przenosi się do 14 ml probówki polipropylenowej o okrągłym dnie i natychmast zamraża w ciekłym azocie, po czym przechowuje w suchym lodzie. Miejsce po zabiegu zamyka się szwami i klipsami, a klatkę zwierzęcia umieszcza się na klatce ogrzewającej do temperatury 37°C na 24 godziny po operacji. Zwierzę obserwuje się codziennie po operacji i w 7-10 dni po zabiegu usuwa się klipsy z rany. U każdej myszy transgenicznej bada się poziom ekspresji mRNA białka fuzyjnego TACI-immunoglobulina, stosując test hybrydyzacji roztworu DNA, lub polimerazową reakcję łańcuchową.

Sposobem ogólnym opisanym powyżej uzyskano myszy transgeniczne, u których zachodziła ekspresja istotnego poziomu białka fuzyjnego TACI-immunoglobulina w mleku. W tym szczególnym przypadku sekwencja kodująca białko fuzyjne TACI-immunoglobulina kodowała polipeptyd TACI z delecją reszt aminokwasowych 1-29 oraz 111-154 według SEQ ID nr 2 i cząstkę immunoglobuliny Fc5.

Niniejszy wynalazek, opisany w ten sposób ogólnie, stanie się bardziej zrozumiały przez odniesienie do poniższych przykładów, które przedstawia się celem jedynie ilustracji, nie zaś ograniczenia niniejszego wynalazku.

P r zy k ł a d 1

Wytwarzanie cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących białka TACI-Fc

W czasie klonowania ekspresji receptorów dla ZTNF4 wytworzono cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące ludzkie TACI, jak to opisali Gross i wsp., w Nature 404:995 (2000). Sekwencje kodujące zawarte w strukturach TACI-Fc wytworzono poprzez nałożenie PCR standardowymi technikami (zobacz na przykład Horton i wsp., Gene 77:61 (1989)). Jako matryce początkowe do powielenia PCR stosowano cDNA ludzkiego TACI i cDNA Fc. Primery PCR opracowano tak, aby uzyskać końce 5' i 3' pożądanej sekwencji kodującej, i aby wprowadzić miejsca rozpoznawania enzymów restrykcyjnych w celu ułatwienia insercji tych sekwencji kodujących do wektorów ekspresji. Sekwencje kodujące tacji Fc wprowadzono do wektorów ekspresji, zawierających funkcjonalny gen mysi reduktazy dihydrofolanu. Jeden wektor ekspresji zawierał również promotor cytomegalowirusowy, do kierowania ekspresji transgenu białka rekombinacyjnego, intronu immunoglobuliny, sekwencji sygnałowej tkankowego aktywatora plazminogenu, wewnętrznej sekwencji wyjściowej rybosomu, poddanego delecji cistronu CD8 dla selekcji powierzchniowej dla komórek transfekowanych i elementów ekspresji drożdży do uzyskania wzrostu plazmidów w komórkach drożdży.

Jedną z metod zastosowanych do wytwarzania białek fuzyjnych tacji Fc zilustrowano metodą stosowaną do wytworzenia TACI-Fc4. Inne białka fuzyjne TACI-Fc wytworzono poprzez wprowadzenie sekwencji nukleotydowych kodujących białko fuzyjne TACI-Fc do wektora ekspresji ssaka, i wprowadzenie tego wektora ekspresji do komórek ssaka.

A. Wytwarzanie fragmentu Fc4 ^γ1

W celu wytworzenia białka fuzyjnego TACI-Fc4 zmodyfikowano region Fc ludzkie IgG1 (region zawiasowy i domeny C_H2 i C_H3) tak, aby usunąć receptor Fcγ1 (FcγRI) i funkcję wiązania dopełniacza (C1q). Tę zmodyfikowaną wersję Fc ludzkie IgG1 oznaczono jako „Fc4.

Izolowano region Fc z biblioteki ludzkich wątrób płodowych (Clontech) poprzez PCR z zastosowaniem oligoprimerów 5' ATCAGCGGAA TTCAGATCTT CAGACAAAAC TCACACATGC CCAC 3'

PL 219 013 B1 (SEQ nr 7) i 5' GGCAGTCTCT AGATCATTTA CCCGGAGACA GGGAG 3' (SEQ nr 8). Za pomocą PCR do regionu Fc wprowadzono mutację celem ograniczenia wiązania z FcyRI. Miejsce wiązania FcyRI(Leu-Leu-Gly-Gly; reszty aminokwasowe 38-41 według SEQ nr 6, co odpowiada pozycjom indeksu EU 234 do 237) zmutowano do Ala-Glu-Gly-Ala celem ograniczenia wiązania FcyRI (Duncan, Nature 332:563 (1998); Baum EMBO J. 13:3992 (1994)). Do wprowadzenia mutacji wykorzystano primery oligonukleotydowe 5' CCGTGCCCAG CACCTGAAGC CGAGGGGGCA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC C 3' (CEQ nr 9) i 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3' (SEQ nr 10). Do końcowej objętości 50 pl dodano 570 ng matrycy IgFc, 5 pl buforu reakcyjnego 10x Pfu (Stratagene), 8 pl 1,25 mM dNTP, 31 pl wody destylowanej, 2 pl 20 mM primerów oligonukleotydowych. Dodano równą objętość oleju mineralnego i reakcję ogrzewano do temeratury 94°C przez 1 minutę. Dodano polimerazę Pfu (2,5 jednostki Stratagene) i następnie prowadzono 25 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, w temperaturze 55°C przez 30 sekund, w temparaturze 72°C przez 1 minutę z przedłużeniem przez 7 minut w temperaturze 72°C. Produkty reakcji frakcjonowano przez elektroforezę wykryto prążek odpowiadający przewidywanej wielkości około 676 par zasad. Prążek ten wycięto z żelu i odzyskano, stosując zestaw QIAGEN QIAquickTM Gel Extraction Kit (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta.

Również PCR zastosowano do wprowadzenia mutacji Ala do Ser (reszta aminokwasowa 134 w SEQ nr 6, odpowiadająca pozycji indeksu EU 330) i Pro do Ser (reszta aminokwasowa 135 SEQ nr 6, odpowiadająca pozycji indeksu EU 331) celem zmniejszenia wiązania dopełniacza C1q lub fiksacji dopełniacza (Duncan and Winter, Nature 332:788 (1988)). Dwie pierwsze rundy reakcji przeprowadzono, stosując jako matrycę zmutowaną w miejscu wiązania FcyRI sekwencję IgFc. Do końcowej objętości 50 pl dodano 1 pl matrycy IgFc zmutowanej w miejscu wiązania FcyRI, 5 pg buforu reakcyjnego 10x Pfu (Stratagene), 8 pl 1,25 mM dNTP, 31 pl wody destylowanej, 2 pl 20 mM 5' GGTGGCGGCT CCCAGATGGG TCCTGTCCGA GCCCAGATCT TCAGACAAA CTCAC 3' (SEQ nr 11), primer 5' rozpoczynający się na nukleotydzie 36 SEQ nr 5 i 2 pl 20 mM 5' TGGGAGGGCT TTGTTGGA 3' (SEQ nr 12), primer 3' rozpoczynający się na dopełnieniu nukleotydu 405 SEQ nr 5. Druga reakcja obejmowała po 2 pl 20 mM zapasów primerów oligonukleotydowych 5' TCCAACAAAG CCCTCCCATC CTCCATCGAG AAAACCATCT CC 3' (SEQ nr 13), primer 5' rozpoczynający się na nukleotydzie 388 SEQ nr 5 i 5' GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3' (SEQ nr 14) - primer 3' - w celu wprowadzenia mutacji Ala do Ser, miejsca restrykcyjnego Xbal i kodonu stop. Dodano olej mineralny w równej objętości i reakcję ogrzewano do temperatury 94°C przez 1 minutę. Dodano polimerazę Pfu (2,5 jednostki Stratagene) i następnie prowadzono 25 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund, 72°C przez 2 minuty z wydłużeniem przez 7 minut w temperaturze 72°C. Produkty reakcji frakcjonowano przez elektroforezę i wykryto prążki odpowiadające przewidywanej wielkości, odpowiednio, około 370 i około 395 par zasad. Prążki wycięto z żelu i ekstrahowano stosując zestaw QIAGEN QIAqiuckTM Gel Extraction Kit (Qiuagen) zgodnie z instrukcjami producenta.

Przeprowadzono drugą rundę reakcji w celu połączenia powyższych fragmentów i dodania miejsca restrykcyjnego 5' BamHI i sekwencji sygnałowej z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiej immunoglobuliny JBL 2'CL (Cogne, Eur. J. Immunol. 18:1485 (1988)). Do końcowej objętości 50 pl dodano 30 pl wody destylowanej, 8 pl 1,25 mM dNTP, 5 pl bufora reakcyjnego polimerazy 10x Pfu (Stratagene) i po 1 pl każdego z dwóch produktów PCR. Dodano olej mineralny w równej objętości i reakcję ogrzewano do temperatury 94°C przez 1 minutę. Dodano polimerazę Pfu (2,5 jednostki Stratagene) i następnie przeprowadzono 5 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, w 55°C przez 30 sekund i w 72°C przez dwie minuty. Temperaturę ponownie doprowadzono do 94°C i dodano po pl 20 mM zapasów 5' GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGTC CCAGATG 3' (SEQ nr 14), primera 5' rozpoczynającego się na nukleotydzie 1 SEQ nr 5 i 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3' (SEQ nr 10) po czym przeprowadzono 25 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 2 minuty z końcowym rozszerzeniem się przez 7 minut w temperaturze 72°C. Część reakcji uwidoczniona za pomocą elektroforezy żelowej. Wykryto prążek o długości 789 par zasad, co odpowiada przewidywanej wielkości.

B. Wytwarzanie wektora ekspresji TACI-Fc4

Poprzez homologiczną rekombinację u drożdży wytworzono plazmidy ekspresji zawierające region kodujący białko fuzyjne TACI-Fc4. Izolowano fragment cDNA TACI za pomocą PCR z uwęględnieniem sekwencji polinukleotydowej z nukleotydów 14-475 SEQ nr 1. Dwoma primerami zastosowanymi do wytworzenia fragmentu TACI były: (1) primer zawierający 40 par zasad sekwencji flankują40

PL 219 013 B1 cej wektora 5' i 17 par zasad odpowiadających końcowi aminowemu fragmentu TACI (5' CTCAGCCAGG AAATCCATGC CGAGTTGAGA CGCTTCCGTA GAATGAGTGG CCTGGGCCCG 3' SEQ nr 15; (2) 40 par zasad na zakończeniu 3' odpowiadające sekwencji flankującej Fc4 i 17 par zasad odpowiadające zakończeniu karboksylowemu fragmentu TACI (5' GCATGTGTGA GTTTTGTCTG AAGATCTGGG CTCCTTCAGC CCCGGGAG 3'; SEQ nr 16). Do końcowej objętości 100 μl dodano 10 ng matrycy TACI, 10 μl bufora reakcyjnego polimerazy Taq 10x (Perkin Elmer), 8 μl 2,5 nM dNTP, 78 μl wody destylowanej, po 2 μl zapasu 20 mM primerów oligonukleotydowych oraz polimerazę Taq (2,5 jednostki Life Technology). Dodano olej mineralny w równej objętości i reakcję ogrzewano do 94°C przez 2 minuty po czym przeprowadzono 25 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, w 65°C przez 30 sekund, w 65°C przez 30 sekund, 72°C przez 1 minutę z wydłużeniem do 5 minut w temperaturze 72°C. W podobny sposób wytworzono fragment zawierający cDNA kodujący fragment Fc4. Dwoma primerami zastosowanymi do wytwarzania fragmentu Fc4 były (stronę końca 5' i stronę końca 3'): primer oligonukleotydowy zawierający 40 par zasad sekwencji flankującej 5' TACI, 17 par zasad odpowiadających zakończeniu aminokwasowemu fragmentu Fc4 (5' GCACAGAGGC TCAGAAGCAA GTCCAGCTCT CCCGGGGCTG AAGGAGCCCA GATCTTCAGA 3'; SEQ nr 17) i primer oligonukleotydowy zawierający 40 par zasad końca 3', co odpowiada sekwencji flankującej wektora i 17 par zasad odpowiadające zakończeniu karboksylowemu fragmentu Fc4 (5' GGGGTGGGTA CAACCCCAGA GCTGTTTTAA TCTAGATTAT TTACCCGGAG ACAGGG 3'; SEQ nr 18). Do końcowej objętości 100 μl dodano 10 ng opisanej powyżej matrycy Fc4, 10 μl bufora reakcyjnego polimerazy Taq 10 razy (Perkin Elmer), 8 μl 2,5 nM dNTP, 78 μl wody destylowanej, po 2 μl każdego z 20 mM zapasów oligonukleotydów i polimerazę TAQ (2,5 jednostki Life Technology). Dodano olej mineralny w równej objętości i reakcję ogrzewano do temperatury 94°C przez 2 minuty, po czym przeprowadzono 25 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, 65°C przez 30 sekund, 72°C przez 1 minutę, z wydłużeniem przez 5 minut w temperaturze 72°C.

Przeprowadzono analizę 10 μl każdej ze 100 μl reakcji PCR opisanych powyżej na 0,8% żelu agarazowym LMP (Seaplaque GTG) z 1xbuforem TBE. Pozostałe 90 μl z każdej reakcji PCR strącano dodając 5 μl 1 M chlorku sodowego i 250 μl etanolu bezwzględnego. Plazmid pZMP6 rozszczepiano za pomocą Smal, w celu jego linearyzacji na polilinkerze. Z plazmidu pCZR199 wytwarzano pochodną plazmid pZMP6 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, Stany Zjednoczone, o numerze ATCC 98668); jest to wektor ekspresyjny ssaka zawierający kasetę ekspresyjną, z bezpośrednim wczesnym promotorem cytomegalowirusowym, intron konsensusowy z regionu zmiennego miejsca łańcucha ciężkiego immunoglobuliny mysiej, wiele miejsc restrykcyjnych do wprowadzania sekwencji kodujących, kodon 100 i terminator ludzkiego hormonu wzrostu. Plazmid zawiera również początek replikacji E. coli, jednostkę ekspresji nadającego się do selekcji markera ssaka, zawierającą promotor SV40, wzmacniacz i początek replikacji, gen reduktazy dihydrofolanu i terminator SV40. Poprzez zastąpienie promotora metalotioneiny bezpośrednim wczesnym promotorem cytomegalowirusa wytworzono z pCZR199 wektor pZMP6 i sekwencję Kozac na końcu 5' otwartej ramki odczytu.

100 μl kompetentnych komórek drożdży (S. cerevisiae) połączono z 10 μl zawierającymi około 1 μg domeny zewnątrzkomórkowej TACI i fragmentów PCR Fc4 i 100 ng wektora pZMP6 strawionego Smal i przeniesionego do kuwety elektroporacyjnej 0,2 cm. Mieszaniny drożdży/DNA poddawano elektropulsacji przy 0,75 kV (5 kV/cm), omów, 25 μΡ. Do każdej kuwety dodawano 600 μl 1,2 M sorbitu i drożdże posiewano w dwóch próbkach po 300 μl na próbki URA-D i inkubowano w temperaturze 30°C.

Po około 48 godzinach transformanty drożdży Ura+ z jednej płytki ponownie zawieszano w 1 ml wody i odwirowywano pokrótce, w celu zbicia się komórek drożdży w grudki. Grudki komórek ponownie zawieszano w 1 ml buforu litycznego (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). Pięćset mikrolitrów mieszaniny litycznej dodawano do probówki Eppendorfa, zawierającej 300 μl przepłukanych kwasem paciorków szklanych i 200 μl fenolu - chloroformu, mieszano przez 1 minutę 2 lub 3 razy i następnie odwirowywano przez 5 minut w wirówce Eppendorfa z maksymalną prędkością. Trzysta mikrolitrów fazy wodnej przenoszono do nowej probówki i strącano DNA 600 μl etanolu, po czym całość odwirowywano przez 10 minut w temperaturze 4°C. Grudkę DNA ponownie zawieszano w 100 μl wody.

Przeprowadzano transformację elektrokompetentnych komórek E. coli (DH10B, GibcoBRL), stosując 0,5-2 ml preparatu DNA drożdży i 40 μl komórek DH10B. Komórki poddawano elektropulsacji przy 2,0 kV, 25 mF i 400 omach. Po elektroporacji 1 ml SOC (2% Bacto-Tryptone (Difco, Detroit, MI, Stany Zjednoczone), 0,5% ekstraktu drożdży (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM

PL 219 013 B1

MgSO₄, 20 mM glukozy) posiewano w porcjach po 250 μl na 4 płytki LB AMP (bulion LB (Lennox), 1,8% Bacto-Agar (Difco), 100 mg/l ampicyliny).

Poszczególne klony, w których znajdowała się prawidłowa struktura ekspresyjna dla TACI-Fc4 identyfikowano poprzez trawienie restrykcyjne, w celu potwierdzenia obecności insertu i tego, że poszczególne sekwencje DNA prawidłowo połączyły się ze sobą. Insert klonów dodatnich poddawano analizie sekwencji. DNA plazmidowe na większą skalę izoluje się stosując zestaw Qiagen Maxi (Qiagen), według zaleceń producenta.

C. Wytwarzanie Fc5, Fc6 i Fc7

W Fc5 resztę Arg w pozycji indeksu EU 218 z powrotem zamieniono na resztę Lys. Ludzka ^γ1 typu dzikiego zawiera lizynę w tej pozycji. Pokrótce wytworzono cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące Fc4 stosując primery oligonukleotydowe 5'GAGCCCAAATCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCA 3' (SEQ ID nr 19) i 5'TAATTGGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEQ ID nr 20). Warunki powielenia PCR były następujące: do końcowej objętości 50 μl dodano 236 ng matrycy Fc4, 5 μl buforu reakcyjnego 10 Pfu (Stratagene), 4 μl 2,5 mM dNTP, po 1 μ!, 20 μM każdego z oligonukleotydów i 1 ml polimerazy Pfu (2,5 jednostki, Stratagene). Profil termiczny powielenia był następujący: 94°C przez 2 minuty, 5 cykli w temperaturze 94°C przez 15 sekund, w temperaturze 42°C przez 20 sekund, 72°C przez 45 sekund, 20 cykli w temperaturze 94°C przez 15 sekund, 72°C przez 1 minutę i 20 sekund, z 7 minutowym wydłużeniem w temperaturze 72°C. Produkt reakcji frakcjonowano poprzez elektroforezę na żelu agarozowym i wykryto prążek odpowiadający przewidywanej wielkości około 718 par zasad. Prążek wycinano z żelu i odzyskiwano, stosując zestaw QIAGEN QIAqiuck Gel Extraction Kit (Qiagen), zgodnie z zaleceniami producenta.

Fc6 jest identyczny jak Fc5, z tym wyjątkiem, że wyeliminowano kodon lizyny na końcu karboksylowym. Podobnie jak w powyższych Fc4 i Fc5 kodon stop w sekwencji Fc6 zmieniano na TAA. Fc6 wytworzono z matrycy DNA kodującej Fc5, stosując polimery oligonukleotydowe 5' GAGCCCAAAT CTTCAGACAA AACTCACACA TGCCCA 3' (SEQ ID nr 19) i 5' GGCGCGCCTC TAGATTAACC CGGAGACAGG GAGAGGC 3' (SEQ ID nr 21).

Fc7 jest identyczna z Fcγ1 typu dzikiego, z wyjątkiem podstawienia aminokwasowego w pozycji indeksowej EU Asn 297 znajdującej się w domenie CH2. Asn-297 poddano mutacji do reszty Gln, w celu uniemożliwienia przyłączania N-sprzężonych węglowodanów w tej pozycji reszty. Podobnie jak powyżej, kodon stop w sekwencji Fc7 zmieniono na TAA. Fc7 wytworzono poprzez nałożenie PCR, z zastosowaniem jako matrycy ludzkiego cDNA Fc ^γ1 typu dzikiego i primerów oligonukleotydowych 5' GAGCCCAAATCTTGCGACAAAACTCACA 3' (SEQ ID nr 22) i 5' GTACGTGCTTTGGTACTGCTCCTCCCGCGGCTT 3' (SEQ ID nr 23), w celu wytworzenia połowy 5' Fc7 i primery oligonukleotydowe 5' CAGTACCAAAGCACGTACCGTGTGGTCA 3' (SEQ ID nr 24) i 5' TAATTGGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEQ ID nr 20), w celu wytworzenia połowy 3' Fc7. Oba produkty PCR połączono i powielono stosując primery oligonukleotydowe 5' GAGCCCAAATCTTGCGACAAAACTCACA 3' (SEQ ID nr 22) i 5' TAATTGGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEQ ID nr 20).

Wszystkie uzyskane produkty PCR poddano oczyszczeniu na żelu, klonowaniu i weryfikacji przez analizę sekwencji DNA.

D. Wytwarzanie białek fuzyjnych TACI-Fc okrojonych od końca aminowego

Wytworzono 4 wersje TACI-Fc okrojone od końca aminowego. We wszystkich 4, zmodyfikowana sekwencja sygnałowa tkankowego aktywatora plazminogenu (SEQ ID nr 25) była poddana fuzji z resztą aminokwasową numer 30 SEQ ID nr 2. Cztery białka różniły się jednak w zakresie umiejscowienia punktu fuzji Fc5 z sekwencją aminokwasową TACI SEQ ID nr 2. W tabeli 3 przedstawiono strukturę 4 białek fuzyjnych.

T a b e l a 3

Białka fuzyjne TACI

Oznaczenie TACI-Fc	Reszty aminokwasowe TACI
TACI(d1-29)-Fc5	30-154 SEQ ID nr 2
TACI(d1-29, d107-154)-Fc5	30-106 SEQ ID nr 2
TACI(d1-29, d111-154)-Fc5	30-110 SEQ ID nr 2
TACI(d1-29, d120-154)-Fc5	30-119 SEQ ID nr 2

PL 219 013 B1

Wytworzono kasety ekspresji kodujące białka, poprzez nałożenie PCR standardowymi sposobami (zob. na przykład Horton i wsp., Gene 77:61 (1989)). Jako matryc PCR użyto cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego TACI i cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego Fc5. Primery oligonukleotydowe przedstawiono w tabelach 4 i 5.

T a b e l a 4

Primery oligonukleotydowe stosowane do wytwarzania białek fuzyjnych TACI

Oznaczenie TACI-Fc	Oznaczenia oligonukleotydów
5' TACI	3' TACI	5' Fc5	3' Fc5
TACI (d1-29)-Fc5	ZC24903	ZC24955	ZC24952	ZC24946
TACI (d1-29, d107-154)-Fc5	ZC24903	ZC24951	ZC24949	ZC24946
TACI (d1-29, d111-154)-Fc5	ZC24903	ZC28978	ZC28979	ZC24946
TACI (d1-29, d120-154)-Fc5	ZC24903	ZC28981	ZC28980	ZC24946

T a b e l a 5

Sekwencje oligonukleotydowe

Primer	Sekwencja nukleotydowe	SEQ ID nr
ZC24903	5' TATTAGGCCGGCCACCATGGATGCAATGA 3'	40
ZC24955	5' TGAAGATTTGGGCTCCTTGAGACCTGGGA 3'	41
ZC24952	5' TCCCAGGTCTCAAGGAGCCCAAATCTTCA 3'	42
ZC24946	5' TAATTGGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3'	20
ZC24951	5' TGAAGATTTGGGCTCGTTCTCACAGAAGTA 3'	43
ZC24949	5' ATACTTCTGTGAGAACGAGCCCAAATCTTCA 3'	44
ZC28978	5' TTTGGGCTCGCTCCTGAGCTTGTTCTCACA 3'	45
ZC28979	5' CTCAGGAGCGAGCCCAAATCTTCAGACA 3'	46
ZC28981	5' TTTGGGCTCCCTGAGCTCTGGTGGAA 3'	47
ZC28980	5' GAGCTCAGGGAGCCCAAATCTTCAGACA 3'	48

Pierwsza runda powielenia PCR składała się z dwóch reakcji dla każdego z 4 wersji okrojonych od końca aminowego. Dwie reakcje przeprowadzano oddzielnie, stosując oligonukleotyd 5' i 3' TACI w jednej reakcji, a oligonukleotydy 5' i 3' Fc5 w drugiej reakcji dla każdej wersji. Warunki pierwszej rundy powielenia PCR były następujące. Do końcowej objętości 25 μl dodawano około 200 ng matrycy DNA, 2,5 μl bufora reakcyjnego Pfu 10x (Stratagene), 2 μl 2,5 mM dNTP, po 0,5 μl 20 μM oligonukleotydu 5' i oligonukleotydu 3' i 0,5 μl polimerazy Pfu (2,5 jednostki, Stratagene). Profil termiczny powielenia był następujący: 94°C przez 3 minuty, 35 cykli w temperaturze 94°C przez 15 sekund, 50°C przez 15 sekund, 72°C przez 2 minuty, z wydłużeniem 2 minutowym w temperaturze 72°C. Produkty reakcji frakcjonowano przez elektroforezę na żelu agarozowym i z żelu wycinano prążki odpowiadające przewidywanej wielkości i odzyskiwano je stosując zestaw QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit (Qiagen), zgodnie z zaleceniami producenta.

Przeprowadzono drugą rundę powielenia PCR lub reakcji nałożenia powielenia PCR, stosując fragmenty oczyszczone na żelu z pierwszej rundy PCR jako matryce DNA. Warunki drugiej rundy powielenia PCR były następujące. Do końcowej objętości 25 μl dodawano około 10 ng matrycy DNA dla każdego z fragmentów TACI i Fc5, 2,5 μl bufora reakcyjnego Pfu 10x (Stratagene), 2 μl 2,5 mM dNTP, po 0,5 μ 20 μΜ ZC24903 (SEQ ID nr 40) i ZC24946 (SEQ ID nr 20) oraz 0,5 μί polimerazy Pfu (2,5 jednostki, Stratagene). Profil termiczny powielenia był następujący: 94°C przez 1 minutę, 35 cykli w temperaturze 94°C przez 15 sekund, w temperaturze 55°C przez 15 sekund, 72°C przez 2 minuty, z 2 minutowym wydłużeniem w temperaturze 72°C. Produkty reakcji frakcjonowano przez elektroforezę na żelu agarozowym i z żelu wycinano prążki odpowiadające przewidywanej wielkości i odzyskiwano je stosując zestaw QIAGEN QIAQUICK Gel Extraction Kit (Qiagen), według instrukcji producenta.

PL 219 013 B1

Każdą z 4 wersji produktów PCR TACI-Fc okrojonego od końca aminowego klonowano oddzielnie stosując zestaw do klonowania PCR ZEROBLUNT TOPO firmy Invitrogen, zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. W tabeli 6 podano sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe tych struktur TACI-Fc.

T a b e l a 6

Sekwencje wariantów TACI-Fc

Oznaczenie TACI-Fc	SEQ ID nr
Nukleotyd	Aminokwas
TACI(d1-29)-Fc5	49	50
TACI(d1-29, d107-154)-Fc5	51	52
TACI(d1-29, d111-154)-Fc5	53	54
TACI(d1-29, d120-154)-Fc5	55	56

Po weryfikacji sekwencji nukleotydowych, plazmidy zawierające każdą z 4 wersji białek fuzyjnych TACI-Fc skróconych od końca aminowego, strawiono Fsel i Ascl, w celu uwolnienia segmentów kodujących aminokwasy. Fragmenty Fsel - Ascl poddano ligacji do wektora ekspresji ssaka, zawierającego promotor CMV i segment poli A SV40. Wektory ekspresji wprowadzano do komórek jajnika chomików chińskich w sposób opisany powyżej.

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie białek TACI-Fc przez komórki jajnika chomików chińskich

Do transfekowania przez elektroporację, dostosowanych do zawiesiny komórek DG44 jajników chomików chińskich (CHO), hodowanych w zwierzęcej pożywce bezbiałkowej (Urlaub i wsp., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555 (1986)) zastosowano struktury ekspresji TACI-Fc. Komórki DG44 CHO nie zawierają genu reduktazy dihydrofolanowej z powodu delecji w obu lokalizacjach chromosomalnych genu reduktazy dihydrofolanowej. Wzrost komórek w obecności metotreksatu w zwiększonym stężeniu powoduje powielenie genu reduktazy dihydrofolanowej i sprzężonego rekombinacyjnego genu kodowanego przez białko na strukturze ekspresji.

Komórki DG44 CHO pasażowano w pożywce PFCHO (JRH Biosciences, Lenexa, KS, Stany Zjednoczone) z dodatkiem 4 mM L-glutaminy (JRH Bioscience) i 1x suplementu hipoksantynowo-tymidynowego (Life Technologies) i komórki inkubowano w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 w kolbach do wstrząsania typu Corning przy 120 obr./min, na obracającej się platformie do wstrząsania. Komórki transfekowano oddzielnie linearyzowanymi plazmidami ekspresji. Dla zapewnienia jałowości przeprowadzono pojedynczy etap strącenia etanolem na lodzie przez 25 minut, poprzez połączenie 200 μg DNA plazmidowego w probówce Eppendorfa z 20 pl okrojonego DNA z nośnika spermy łososiowej (5' < 3' Inc. Boulder, CO, Stany Zjednoczone, 10 mg/ml), 22 pl, 3 M NaOAc (pH 5,2) i 484 pl 100% etanolu (Gold Shield Chemical Co., Hayward, CA, Stany Zjednoczone). Po inkubacji probówkę odwirowywano przy 14000 obrotów na minutę w mikrowirówce umieszczonej w komorze zimna (temperatura 4°C), nadsącz usunięto a grudkę przepłukano dwukrotnie 0,5 ml 70% etanolu i pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu.

W czasie wysychania grudki DNA wytworzono komórki DG44 CHO, poprzez odwirowanie w sumie 10⁶ komórek (16,5 ml) w 25 ml stożkowatej probówce do wirowania przy 900 obrotach na minutę przez 5 minut. Komórki DG44 CHO ponownie zawieszono w całkowitej objętości 300 pl pożywki wzrostowej PFCHO i umieszczono w kuwecie Gene-Pulser, z 0,4 cm przerwą międzyelektrodową (Bio-Rad). Po około 50 minutach wysychania, DNA ponownie zawieszono w 500 pl pożywki wzrostowej PFCHO i dodano do komórek w kuwecie, tak aby całkowita objętość nie przekraczała 800 pl i pozostawiano w temperaturze pokojowej przez 5 minut, w celu zmniejszenia wytwarzania pęcherzyków powietrza. Kuwetę umieszczano w jednostce BioRad Gene Pulser 2, przy 0,296 kV i 0,950 HC (wysoka reaktancja pojemnościowa) i natychmiast poddawano elektroporacji.

Komórki inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem w całkowitej objętości 20 ml pożywki PFCHO, w kolbie CoStar T-75. Kolbę umieszczano w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2, na 48 godzin, po czym. komórki zliczano hemocytometrem, stosując wykluczanie przez zastosowanie błękitu trypanowego, i umieszczano w pożywce selekcyjnej PFCHO, bez suplementu hipoksantynowo-tymidynowego, zawierającej 200 mM metrotreksatu (Cal Biochem).

Po przeprowadzeniu procesu selekcji z użyciem metotreksatu, kondycjonowaną pożywkę, zawierającą wydzielone białka TACI-Fc, badano w analizie Western Blot.

PL 219 013 B1

P r z y k ł a d 3

Analiza strukturalna białek TACI-Fc

W niektórych przypadkach, białka fuzyjne TACI-Fc były częściowo oczyszczone przed analizą. Kondycjonowaną pożywkę z hodowli komórek jajników chomików chińskich sfiltrowano w jałowych warunkach przez filtr 0,22 L m i białko TACI-Fc wychwytywano na kolumnie białka A. Materiał związany z białkiem A eluowano i przepuszczano przez kolumnę do chromatografii wykluczającej ze względu na wielkość C-200, celem końcowego oczyszczenia.

Analizę metodą Western blot przeprowadzono, zarówno na kondycjonowanej pożywce komórkowej, jak i na oczyszczonym białku, w celu oceny stabilności strukturalnej białek TACI-Fc. Pokrótce, próbki białka lub nadsączu przenoszono na błony nitrocelulozowe i wykrywano białka TACI-Fc, stosując sprzężone z peroksydazą kozie IgG2a, skierowane przeciwko antygenom mysim (Boehringer Mannheim) lub sprzężone z peroksydazą kozie swoiste surowice odpornościowe skierowane przeciwko ludzkim Fc IgG (Pierce).

Analizę sekwencji aminokwasów na końcu aminowym przeprowadzono na układach Protein

Sequencer, modele 476A i 494, z firmy Perkin Elmer Applied Biosystems Divisions (Foster City, CA,

Stany Zjednoczone). Analizę danych przeprowadzono na systemie do analizy danych sekwencjonowania białek model 610A firmy Applied Biosystems, wersja 2.1a (Applied Biosystems, Inc.). Większość materiałów i odczynników pochodziła z firmy Applied Biosystems, Inc.

P r z y k ł a d 4

Analiza funkcjonalna białek TACI-Fc

Do badania charakterystyki wiązania 4 białek TACI-Fc ZTNF4 zastosowano dwie metody. W jednej z nich, mierzono zdolność struktur TACI-Fc do kompetycji z płytkami powleczonymi TACI o wią125 zanie wyznakowanego ¹²⁵I ZTNF4. W drugiej metodzie, z każdą ze struktur TACI-Fc inkubowano wy125 znakowane ¹²⁵I ZTNF4 w rosnącym stężeniu i oznaczano radioaktywność związaną ze strąconymi kompleksami ZTNF4 TACI-Fc. Białka fuzyjne TACI-Fc zawierały cząstki TACI pozbawione pierwszych reszt aminokwasowych sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 2. Jedno z białek fuzyjnych zawierało cząstkę TACI z nienaruszonym regionem szypułowym (TACI(d1 -29)-Fc5), natomiast trzy białka fuzyjne TACI-Fc zawierały cząstki TACI z rozmaitymi delecjami w regionie szypułowym (TACI(d1-29, d107-154)-Fc5; TACI(d1-29, d111-154)-Fc5; TACI(d1-29, d120-154)-Fc5).

A. Test wiązania kompetycyjnego

ZTNF4 wyznakowano jodem radioaktywnym stosując Iodobeads (Pierce) standardowymi spo125 sobami. Pokrótce, 50 L g ZTNF4 wyznakowano 4 mCi ¹²⁵I stosując pojedynczy Iodobead. Reakcję

125 przerwano dodając 0,25% roztwór bydlęcej albuminy surowicy i usunięto wolny ¹²⁵I przez filtrację że125 lową na kolumnie PD-10 (Pierce). Swoistą radioaktywność preparatu ¹²⁵I ZTNF4 wyznaczano przez strącanie kwasem trójchlorooctowym przed etapem odsalania i po tym etapie.

N-końcowy fragment receptora TACI, oznaczany jako „TACI-N, dodawano do 96-studzienkowych płytek (100 L l, 0,1 L g/ml) i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Płytki płukano, blokowano stosując Superblock (Pierce) i ponownie płukano. Struktury TACI-Fc w różnym stężeniu, od 0 do 11,5 ng/ml

125 mieszano, z ustalonym stężeniem ¹²⁵I ZTNF4 (20 ng/ml) i inkubowano przez dwie godziny w temperaturze 37°C na płytce powleczonej TACI-N. Kontrolę stanowiło TACI-N w roztworze lub TACI-Fc niewyznakowane. Po inkubacji płytki płukano i zliczano. Każde oznaczenie wykonywano trzykrotnie.

Wyniki wykazały, że wszystkie struktury TACI-Fc powodowały całkowite zahamowanie wiązania ¹²⁵I ZTNF4 w stężeniu około 100 ng/ml i większym. Białka TACI-Fc, TACI(d1-29)-Fc5; TACI(d1-29, d111-154)-Fc5; TACI(d1-29, d120-154)-Fc5 były inhibitorami skuteczniejszymi niż struktura TACI-Fc TACI(d1-29, d107-154)-Fc5. Sam fragment Fc nie hamował wiązania. Dla każdej struktury w trzech doświadczeniach obliczano wartość IC50. Średnie wartości dla struktur były następujące: TACI(d1 -29)Fc5: 2,07 nM; TACI(d1-29, d107-154)-Fc5: 4,95 nM; TACI(d1-29, d111-154)-Fc5: 2,31 nM; i dla TACI(d1-29, d120-154)-Fc5:2,21 nM.

B. Test wiązania roztworu

Każdą strukturę TACI-Fc inkubowano w stężeniu 0,05 nM z 0,04 pM - 1,5 nM ¹²⁵I ZTNF4 przez minut w temperaturze pokojowej, w całkowitej objętości 0,25 ml/probówkę. Do każdej probówki dodawano zawiesinę Pansorbin (Staph A) i po 15 minutach próbki odwirowywano, dwukrotnie płukano i zliczano grudki. Wiązanie nieswoiste oznaczano przez dodanie 130 nM niewyznakowanego ZTNF4

125 do mieszaniny ¹²⁵I ZTNF4/TACI-Fc. Wiązanie swoiste obliczano poprzez odjęcie cpm związanych

125 w obecności niewyznakowanego ZTNF4 od całkowitego cpm związanego w każdym ze stężeń ¹²⁵I

PL 219 013 B1

ZTNF4. Wszystkie oznaczenia wykonywano trzykrotnie. Stałe wiązania obliczano stosując oprogramowanie GraphPad Prism (MacIntosh, wersja 3.0).

125

Na Fig. 4 przedstawiono swoiste wiązanie ¹²⁵I ZTNF4 z różnymi strukturami TACI-Fc. W przypadku wszystkich struktur wiązanie, jak się wydawało, zbliżało się do nasycenia i było znamiennie wyższe dla struktur TACI(d1-29)-Fc5; TACI(d1-29, d111-154)-Fc5; TACI(d1-29, d120-154)-Fc5, w porównaniu z wiązaniem dla TACI(d1-29, d107-154)-Fc5. Obliczono wartości Bmax i Kd i wyniki podano w tabeli 7.

T a b e l a 7

Wiązanie ¹²⁵I ZTNF4 ze strukturami TACI-Fc

Struktura TACI-Fc	Kd (nM)	Bmax (nM)
TACI(d1-29)-Fc5	0,134	0,023
TACI(d1-29, d107-154)-Fc5	0,121	0,010
TACI(d1-29, d111-154)-Fc5	0,115	0,018
TACI(d1-29, d120-154)-Fc5	0,092	0,021

P r z y kł ad 5

Oznaczanie krążącego ZTNF4

Oznaczano poziom ZTNF4 u osób z chorobą (taką jak SLE lub reumatoidalne zapalenie stawów) w stosunku do osób zdrowych, za pomocą testu elektrochemiluminescencyjnego. Sporządzono krzywą referencyjną z rozpuszczalnego ludzkiego ZTNF4 w stężeniu 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml i 0 ng/ml w buforze ORIGIN (Igen, Gaithersburg, MD, Stany Zjednoczone). Próbki surowicy rozcieńczono w buforze ORIGIN. Preparaty referencyjne i próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z biotynylowanym króliczym przeciwciałem skierowanym przeciwko ludzkiemu ZTNF4-NF BV, rozcieńczonym do stężenia 1 μg/ml, w buforze testowym ORIGIN (IGEN) i rutenylowanym króliczym przeciwciałem poliklonalnym, skierowanym przeciwko ludzkiemu ZTNF4-NF BV, rozcieńczonym do stężenia 1 μg/ml, w buforze testowym ORIGIN (IGEN). Po inkubacji próbki mieszano i do każdego z preparatów referencyjnych i próbek dodawano 0,4 mg/ml streptawidyny Dynabeads (Dynal, Oslo, Norwegia), w ilości 50 μl na probówkę i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie próbki mieszano i odczytywano na analizatorze Origin (IGEN), zgodnie z instrukcjami producenta. Test Origin opiera się na elektrochemiluminescencji i powoduje odczyt w ECL. W jednym z badań, w próbkach surowicy pochodzących zarówno od myszy NZBWF1/J, jak i MRL/Mpj-Fas^1pr wykryto podwyższenie poziomu ZTNF4; omawiane myszy przeszły do zaawansowanych stadiów kłębkowego zapalenia nerek i chorób autoimmunologicznych.

Test ORIGIN wykorzystano również do oznaczenia poziomu ZTNF4 we krwi pacjentów z SLE w stosunku do poziomu tej substancji w krążeniu osób zdrowych. W buforze ORIGIN (IGEN) sporządzono krzywą referencyjną z rozpuszczalnego ludzkiego ZTNF4 w stężeniu 10 ngl/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml i 0 ng/ml. Wszystkie próbki pobrane od pacjentów analizowano trzykrotnie w końcowej objętości 25 μΚ Preparaty referencyjne i próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z przeciwciałem wychwytującym - biotynylowanym, króliczym przeciwciałem poliklonalnym, skierowanym przeciwko ludzkiemu ZTNF4-NF BV, rozcieńczonym do stężenia 1 μg/ml, w buforze testowym ORIGIN (IGEN) i przeciwciałem wykrywającym - rutenylowanym, króliczym przeciwciałem poliklonalnym, skierowanym przeciwko ludzkiemu ZTNF4-NF BV, rozcieńczonym do stężenia 1 μg/ml, w buforze testowym ORIGIN (IGEN). Po inkubacji próbki zmieszano i do każdego z preparatów referencyjnych i próbek dodano 0,4 mg/ml streptawidyny Dynabeads (Dynal) w ilości 50 μl na probówkę i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie próbki wymieszano i poddano analizie, stosując analizator Origin 1.5 (IGEN), zgodnie z zaleceniami producenta.

W teście tym wykorzystano 28 próbek kontrolnych od osób zdrowych i próbki od 20 pacjentów z rozpoznaniem SLE. W surowicy chorych z rozpoznaniem SLE obserwowano podwyższenie poziomu ZTNF4 w porównaniu z próbkami od zdrowych dawców. Poziom ZTNF4 obliczano jako krotność zwiększenie poziomu ZTNF4 u pacjentów lub w próbkach kontrolnych, w porównaniu z arbitralnie ustaloną próbką referencyjną surowicy człowieka. Średni wynik dla 28 próbek kontrolnych wynosił 1,36 w stosunku do ludzkiej próbki referencyjnej, natomiast średnia dla próbek pobranych od 20 chorych z SLE wynosiła 4,92. Z 20 próbek pobranych od pacjentów z SLE, w 7 poziom ZTNF4 był dwukrotnie wyższy niż średnia z próbek kontrolnych, natomiast u zaledwie jednej osoby z grupy kontrolnej stężenie to było ponad dwukrotnie wyższe od średniej dla grupy kontrolnej.

PL 219 013 B1

Wykaz sekwencji <110> ZymoGenetics. Inc <120> Białko fuzyjne TACI-immunoglobuiina, sposób wytwarzania białka fuzyjnego TACI-immunoglobuiina, zastosowanie białka fuzyjnego TACIimmunoglobulina i kompozycja farmaceutyczna zawierająca to białko fuzyjne. <130> 01-20PC <140> PCT/OS02/15910 <141> 2002-05-20 <150> 60/293,343 <151> 2001-05-24 <160> 70 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0.

<210> 1 <211> 1377 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (14)...(892) <400> 1 agcatcctga gta atg agt ggc ctg ggc cgg agc agg ega ggt ggc cgg 49 Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg 15 10

agc cgt gtg gac cag gag gag

ege ttt

cca cag ggc

ctg tgg acg Leu Trp Thr 25

ggg Gly

97

Ser Arg

Val 15

Asp

Gin

Glu

Arg 20

Phe

Pro

Gin Gly

gtg

get

atg

aga

tcc

tgc

ccc

gaa

gag

cag

tac

tgg

gat

cct

ctg

145

Val

Ala

Met

Arg

Ser

Cys

Pro

Glu

Gin

Tyr

Trp

Asp

Pro

Leu

30

35

40

ggt

acc

tgc

atg

tcc

tgc

aaa

acc

att

tgc

aac

cat

cag

agc

cag

ege

193

Gly

Thr

Cys

Met

Ser

Cys

Lys

Thr

Ile

Cys

Asn

His

Gin

Ser

Gin

Arg

45

50

55

60

acc

tgt

gca

gee

ttc

tgc

agg

tea

ctc

agc

tgc

ege

aag

gag

caa

ggc

241

Thr

Cys

Ala

Phe

Cys

Arg

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly

65

70

75

aag

ttc

tat

gac

cat

ctc

ctg

agg

gac

tgc

atc

agc

tgt

gee

tcc

atc

289

Lys

Phe

Tyr

Asp

His

Leu

Arg

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Ala

Ser

Ile

80

85

90

tgt

gga

cag

cac

cct

aag

caa

tgt

gca

tac

ttc

tgt

gag

aac

aag

ctc

337

Cys

Gly

Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

95

100

105

agg

agc

cca

gtg

aac

ctt

cca

gag

ctc

agg

aga

cag

cgg

agt

gga

385

Arg

Ser

Pro

Val

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

110

115

120

PL 219 013 B1

gaa gtt

gaa Glu

aac aat Asn Asn

tca Ser 130

gac aac tcg gga agg

tac caa

gga Gly

ttg gag Leu Glu 140

433

Glu 125

Val

Asp Asn Ser

Gly

Arg 135

Tyr

Gin

cac

aga

ggc

tca

gaa

gca

agt

cca

gct

ctc

ccg

ggg

ctg

aag

ctg

agt

481

His

Arg

Gly

Ser

Glu

Ala

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

145

150

155

gca

gat

cag

gtg

gcc

ctg

gtc

tac

agc

acg

ctg

ggg

ctc

tgc

ctg

tgt

529

Ala

Asp

Gin

Val

Ala

Leu

Val

Tyr

Ser

Thr

Leu

Gly

Leu

Cys

Leu

Cys

160

165

170

gcc

gtc

ctc

tgc

ttc

ctg

gtg

gcg

gtg

gcc

tgc

ttc

ctc

aag

577

Ala

Val

Leu

Cys

Phe

Leu

Val

Ala

Val

Ala

Cys

Phe

Leu

Lys

175

180

185

agg

ggg

gat

ccc

tgc

tcc

tgc

cag

ccc

cgc

tca

agg

ccc

cgt

caa

agt

625

Arg

Gly

Asp

Pro

Cys

Ser

Cys

Gin

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Arg

Gin

Ser

190

195

200

ccg

gcc

aag

tct

tcc

cag

gat

cac

gcg

atg

gaa

gcc

ggc

agc

cct

gtg

673

Pro

Ala

Lys

Ser

Gin

Asp

His

Ala

Met

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Val

205

210

215

220

agc

aca

tcc

ccc

gag

cca

gtg

gag

acc

tgc

agc

ttc

tgc

ttc

cct

gag

721

Ser

Thr

Ser

Pro

Glu

Pro

Val

Glu

Thr

Cys

Ser

Phe

Cys

Phe

Pro

Glu

225

230

235

tgc

agg

gcg

ccc

acg

cag

gag

agc

gca

gtc

acg

cct

ggg

acc

ccc

gac

769

Cys

Arg

Ala

Pro

Thr

Gin

Glu

Ser

Ala

Val

Thr

Pro

Gly

Thr

Pro

Asp

240

245

250

ccc

act

tgt

gct

gga

agg

tgg

ggg

tgc

cac

acc

agg

acc

aca

gtc

ctg

817

Pro

Thr

Cys

Ala

Gly

Arg

Trp

Gly

Cys

His

Thr

Arg

Thr

Val

Leu

255

260

265

cag

cct

tgc

cca

cac

atc

cca

gac

agt

ggc

ctt

ggc

att

gtg

tgt

gtg

865

Gin

Pro

Cys

Pro

His

Ile

Pro

Asp

Ser

Gly

Leu

Gly

Ile

Val

Cys

Val

270

275

280

cct

gcc

cag

gag

ggg

ggc

cca

ggt

gca

taaatggggg tcagggaggg 912

Pro

Ala

Gin

Glu

Gly

Pro

Gly

Ala

285 290 aaaggaggag ggagagagat ggagaggagg ggagagagaa agagaggtgg ggagagggga 972 gagagatatg aggagagaga gacagaggag gcagaaaggg agagaaacag aggagacaga 1032 gagggagaga gagacagagg gagagagaga cagaggggaa gagaggcaga gagggaaaga 1092 ggcagagaag gaaagagaca ggcagagaag gagagaggca gagagggaga gaggcagaga 1152 gggagagagg cagagagaca gagagggaga gagggacaga gagagataga gcaggaggtc 1212 ggggcactct gagtcccagt tcccagtgca gctgtaggtc gtcatcacct aaccacacgt 1272 gcaataaagt cctcgtgcct gctgctcaca gcccccgaga gcccctcctc ctggagaata 1332 aaacctttgg cagctgccct tcctcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1377 <210> 2 <211> 293 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 219 013 B1

<400> 2	Arg	Ser	Arg Arg	Gly Gly Arg Ser Arg Val	Asp
Met 1	Ser	Gly	Leu	Gly 5
10	15
Gin	Glu	Glu	Arg 20	Phe	Pro	Gin	Gly Leu 25	Trp Thr Gly	Val Ala Met 30	Arg
Ser	Cys	Pro 35	Glu	Glu	Gin	Tyr	Trp Asp 40	Pro Leu Leu	Gly Thr Cys 45	Met
Ser	Cys 50	Lys	Thr	Ile	Cys	Asn 55	His Gin	Ser Gin Arg 60	Thr Cys Ala	Ala
Phe 65	Cys	Arg	Ser	Leu	Ser 70	Cys	Arg Lys	Glu Gin Gly 75	Lys Phe Tyr	Asp 80
His	Leu	Leu	Arg	Asp 85	Cys	Ile	Ser Cys	Ala Ser Ile 90	Cys Gly Gin 95	His
Pro	Lys	Gin	Cys 100	Ala	Tyr	Phe	Cys Glu 105	Asn Lys Leu	Arg Ser Pro 110	Val
Asn	Leu	Pro 115	Pro	Glu	Leu	Arg	Arg Gin 120	Arg Ser Gly	Glu Val Glu 125	Asn
Asn	Ser 130	Asp	Asn	Ser	Gly	Arg 135	Tyr Gin	Gly Leu Glu 140	His Arg Gly	Ser
Glu 145	Ala	Ser	Pro	Ala	Leu 150	Pro	Gly Leu	Lys Leu Ser 155	Ala Asp Gin	Val 160
Ala	Leu	Val	Tyr	Ser 165	Thr	Leu	Gly Leu	Cys Leu Cys 170	Ala Val Leu 175	Cys
Cys	Phe	Leu	Val 180	Ala	Val	Ala	Cys Phe 185	Leu Lys Lys	Arg Gly Asp 190 '	Pro
Cys	Ser	Cys 195	Gin	Pro	Arg	Ser	Arg Pro 200	Arg Gin Ser	Pro Ala Lys 205	Ser
Ser	Gin 210	Asp	His	Ala	Met	Glu 215	Ala Gly	Ser Pro Val 220	Ser Thr Ser	Pro
Glu 225	Pro	Val	Glu	Thr	Cys 230	Ser	Phe Cys	Phe Pro Glu 235	Cys Arg Ala	Pro 240

PL 219 013 B1

Thr

Gin

Glu

Ser

Ala

Val

Thr

Pro

Gly

Thr

Pro

Asp

Pro

Thr

Cys

Ala

245

250

255

Gly

Arg

Trp

Gly

Cys

His

Thr

Arg

Thr

Val

Leu

Gin

Pro

Cys

Pro

260

265

270

His

Ile

Pro

Asp

Ser

Gly

Leu

Gly

Ile

Val

Cys

Val

Pro

Ala

Gin

Glu

275

280

285

Gly

Pro

Gly

Ala

290 <210> 3 <211> 285 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Met 1

Asp

Ser

Thr 5

Glu

Arg

Glu

Gin

Ser 10

Arg

Leu

Thr

Ser

Cys 15

Leu

Lys

Arg

Glu 20

Glu

Met

Lys

Leu

Lys 25

Glu

Cys

Val

Ser

Ile 30

Leu

Pro

Arg

Lys

Glu 35

Ser

Pro

Ser

Val

Arg 40

Ser

Lys

Asp

Gly 45

Lys

Leu

Ala

Ala 50

Thr

Leu

Ala 55

Leu

Ser

Cys

Cys 60

Leu

Thr

Val

Ser 65

Phe

Tyr

Gin

Val

Ala 70

Ala

Leu

Gin

Gly

Asp 75

Leu

Ala

Ser

Leu

Atg 80

Ala

Glu

Leu

Gin

Gly 85

His

Ala

Glu

Lys 90

Leu

Pro

Ala

Gly

Ala 95

Gly

Ala

Pro

Lys

Ala 100

Gly

Leu

Glu

Ala 105

Pro

Ala

Val

Thr

Ala 110

Gly

Leu

Lys

Ile

Phe 115

Glu

Pro

Ala

Pro 120

Gly

Glu

Gly

Asn

Ser 125

Ser

Gin

Asn

Ser

Arg 130

Asn

Lys

Arg

Ala

Val 135

Gin

Gly

Pro

Glu

Glu 140

Thr

Val

Thr

Gin

Asp 145

Cys

Leu

Gin

Leu

Ile L50

Ala

Asp

Ser

Glu

Thr 155

Pro

Thr

Ile

Gin Lys 160

Gly

Ser

Tyr

Thr

Phe 165

Val

Pro

Trp

Leu

Leu 170

Ser

Phe

Lys

Arg

Gly 175

Ser

Ala

Leu

Glu

Glu 180

Lys

Glu

Asn

Lys

Ile 185

Leu

Val

Lys

Glu

Thr 190

Gly

Tyr

Phe

Ile 195

Tyr

Gly

Gin

Val

Leu 200

Tyr

Thr

Asp

Lys

Thr 205

Tyr

Ala

Met

Gly

His 210

Leu

Ile

Gin

Arg

Lys 215

Lys

Val

His

Val

Phe 220

Gly

Asp

Glu

Leu

PL 219 013 B1

Ser 225

Leu

Val

Thr

Leu

Phe 230

Arg

Cys

Ile

Gin

Asn 235

Met

Pro

Glu

Thr

Leu 240

Pro

Asn

Ser

Cys 245

Tyr

Ser

Ala

Gly

Ile 250

Ala

Lys

Leu

Glu

Glu 255

Gly

Asp

Glu

Leu

Gin 260

Leu

Ala

Ile

Pro

Arg 265

Glu

Asn

Ala

Gin

Ile 270

Ser

Leu

Asp

Gly

Asp

Val

Thr

Phe

Gly

Ala

Leu

Lys

Leu

275 280 285 <210> 4 <211> 250 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met 1

Pro

Ala

Ser Ser 5

Pro

Phe

Leu Leu Ala 10

Pro

Lys

Gly Pro

Pro 15

Gly

Asn

Met

Gly

Pro

Val

Arg

Glu

Pro

Ala

Leu

Ser

Val

Ala

Leu

Trp

20

25

30

Leu

Ser

Trp

Gly

Ala

Leu

Gly

Ala

Val

Ala

Cys

Ala

Met

Ala

Leu

35

40

45

Leu

Thr

Gin

Thr

Glu

Leu

Gin

Ser

Leu

Arg

Glu

Val

Ser

Arg

50

55

60

Leu

Gin

Gly

Thr

Gly

Pro

Ser

Gin

Asn

Gly

Glu

Gly

Tyr

Pro

Trp

65

70

75

80

Gin

Ser

Leu

Pro

Glu

Gin

Ser

Asp

Ala

Leu

Glu

Ala

Trp

Glu

Asn

85

90

95

Gly

Glu

Arg

Ser

Arg

Lys

Arg

Ala

Val

Leu

Thr

Gin

Lys

Gin

Lys

100

105

110

Lys

Gin

His

Ser

Val

Leu

His

Leu

Val

Pro

Ile

Asn

Ala

Thr

Ser

Lys

115

120

125

Asp

Ser

Asp

Val

Thr

Glu

Val

Met

Trp

Gin

Pro

Ala

Leu

Arg

130

135

140

Gly

Arg

Gly

Leu

Gin

Ala

Gin

Gly

Tyr

Gly

Val

Arg

Ile

Gin

Asp

Ala

145

150

155

160

Gly

Val

Tyr

Leu

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

Phe

Gin

Asp

Val

Thr

Phe

165

170

175

Thr

Met

Gly

Gin

Val

Ser

Arg

Glu

Gly

Gin

Gly

Arg

Gin

Glu

Thr

180

185

190

Leu

Phe

Arg

Cys

Ile

Arg

Ser

Met

Pro

Ser

His

Pro

Asp

Arg

Ala

Tyr

195

200

205

PL 219 013 B1

Asn Ser

Cys

Tyr

Ser

Ala Gly Val 215

Phe

His

Leu

His 220

Gin Gly

Asp

Ile

210

Leu

Ser

Val

Ile

Pro

Arg

Ala

Arg

Ala

Lys

Leu

Asn

Leu

Ser

Pro

225

230

235

240

His

Gly

Thr

Phe

Leu

Gly

Phe

Val

Lys

Leu

245 250 <210> 5 <211> 762 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (7) . . . (759) <400> 5 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro

	1	5	10
aga	tgg gtc ctg tcc gag	ccc	aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc 96
Arg	Trp Val Leu Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
15	20		25 30
cca	ccg tgc cca gca ect	gaa	ctc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc ctc 144
Pro	Pro Cys Pro Ala Pro	Glu	Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
	' 35		40 45
ttc	ccc cca aaa ccc aag	gac	acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 192
Phe	Pro Pro Lys Pro Lys	Asp	Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
	50		55 60
gtc	aca tgc gtg gtg gtg	gac	gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag 240
Val	Thr Cys Val Val Val	Asp	Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
	65		70 75
ttc	aac tgg tac gtg gac	ggc	gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 288
Phe	Asn Trp Tyr Val Asp	Gly	Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
	80	85	90 '
ccg	cgg gag gag cag tac	aac	age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc 336
Pro	Arg Glu Glu Gin Tyr	Asn	Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
95	100		105 110
acc	gtc ctg cac cag gac	tgg	ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 384
Thr	Val Leu His Gin Asp	Trp	Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
	115 '		120 125
gtc	tcc aac aaa gcc ctc	cca	gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 432
Val	Ser Asn Lys Ala Leu	Pro	Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
	130		135 140 '
gcc	aaa ggg cag ccc ega	gaa	cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 480
Ala	Lys Gly Gin Pro Arg	Glu	Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
	^J 145		150 155

PL 219 013 B1 ugy gal gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 528

Arg Asp 160

Glu

Leu Thr Lys Asn 165

Gin

Val

Ser Leu Thr 170

Cys

Leu

Val

Lys

ggc

ttc

tat

ccc

agc

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

aat

ggg

cag

576

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

175

180

185

190

ccg

gag

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

624

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

195

200

205

tcc

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

672

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

210

215

220

cag

ggg

aac

gtc

ttc

tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

gct

ctg

cac

aac

720

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

225

230

235

cac

tac

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

tct

ccg

ggt

aaa

tga

762

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

240 245 250 <210> 6 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Met 1

Lys

His

Leu

Trp 5

Phe

Leu

Leu 10

Val

Ala

Pro

Arg 15

Trp

val

Leu

Ser

Glu 20

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp 25

Lys

Thr

His

Thr

Cys 30

Pro

Cys

Pro

Ala 35

Pro

Glu

Leu

Gly 40

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 45

Leu

Phe

Pro

Lys 50

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu 55

Met

Ile

Ser

Arg

Thr 60

Pro

Glu

Val

Thr

Cys 65

Val

Asp

Val 70

Ser

His

Glu

Asp

Pro 75

Glu

Val

Lys

Phe

Asn 80

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly 85

Val

Glu

Val

His

Asn 90

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro 95

Arg

Glu

Gin

Tyr 100

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg 105

Val

Ser

Val

Leu 110

Thr

Val

Leu

His

Gin 115

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly 120

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys 125

Lys

Val

Ser

Asn

Lys 130

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro 135

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile 140

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

PL 219 013 B1

145

150

155

160

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

165

170

175

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

180

185

190

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

195

200

205

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

210

215

220

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

225

230

235

240

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

245

250

<210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 7 atcagcggaa ttcagatctt cagacaaaac tcacacatgc ccac 44 <210> 8 <211> 35 <

212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 8 ggcagtctct agatcattta cccggagaca gggag 35 <210> 9 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 9 ccgtgcccag cacctgaagc cgagggggca ccgtcagtct tcctcttccc c 51 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR

PL 219 013 B1 <400> 10 ggattctaga ttatttaccc ggagacaggg a 31 <210> 11 <211> 55 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 11 ggtggcggct cccagatggg tcctgtccga gcccagatct tcagacaaaa ctcac 55 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 12 tgggagggct ttgttgga 18 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 13 tccaacaaag ccctcccatc ctccatcgag aaaaccatct cc 42 <210> 14 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 14 ggatggatcc atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatg 57 <210> 15 <211> 59 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 15

PL 219 013 B1 ctcagccagg aaatccatgc cgagttgaga cgcttccgta gaatgagtgg cctgggccg 59 <210> 16 <2łl> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 16 gcatgtgtga gttttgtctg aagatctggg ctccttcago cccgggag 48 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 17 gcacagaggc tcagaagcaa gtccagctct cccggggctg aaggagccca gatcttcaga 60 <210> 18 <211> 56 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 18 ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa tctagattat ttacccggag acaggg 56 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 19 gagcccaaat cttcagacaa aactcacaca tgccca 36 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 20 taattggcgc gcctctagat tatttacccg gagaca 36 <210> 21 <211> 37 <212> DNA

PL 219 013 B1 <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 21 ggcgcgcctc tagattaacc cggagacagg gagaggc 37 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 22 gagcccaaat cttgcgacaa aactcaca 28 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 23 gtacgtgctt tggtactgct cctcccgcgg ctt 33 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 24 cagtaccaaa gcacgtaccg tgtggtca 28 <210> 25 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> optymalizowany lider tPA <400> 25

Met 1

Asp

Ala

Met

Lys 5

Arg

Gly

Leu

Cys

Cys 10

Val

Leu

Cys 15

Gly

Ala

Val

Phe

Val 20

Ser

Leu

Ser

Gin

Glu 25

Ile

His

Ala

Glu

Leu 30

Arg

Phe

Arg

Arg 35

PL 219 013 B1 <210> 26 <211> 995 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (219) . . . (770) <400> 26 aagactcaaa cttagaaact tgaattagat gtggtattca aatccttacg tgccgcgaag 60 acacagacag cocccgtaag aacccacgaa gcaggcgaag ttcattgttc tcaacattct 120 agctgctctt gctgcatttg ctctggaatt cttgtagaga tattaottgt ccttccaggc 180 tgttctttct gtagctccct tgttttcttt ttgtgatc atg ttg cag atg gct ggg 236

Met Leu Gin Met Ala Gly 1 5

cag Gin	tgc Cys	tcc Ser	caa Gin 10	aat Asn	gaa Glu	tat Tyr	ttt Phe	gac agt ttg ttg cat gct tgc ata Asp Ser Leu Leu His Ala Cys Ile	284
15	20
cct	tgt	caa	ctt	ega	tgt	tet	tet	aat	act cct cct eta aca tgt cag	332
Pro	Cys	Gin	Leu	Arg	Cys	Ser	Ser	Asn	Thr Pro Pro Leu Thr Cys Gin
		25					30		35
cgt	tat	tgt	aat	gca	agt	gtg	acc	aat	tea gtg aaa gga acg aat gcg	380
Arg	Tyr	Cys	Asn	Ala	Ser	Val	Thr	Asn	Ser Val Lys Gly Thr Asn Ala
	40					45			50
att	ctc	tgg	acc	tgt	ttg	gga	ctg	age	tta ata att tet ttg gca gtt	428
Ile	Leu	Trp	Thr	Cys	Leu	Gly	Leu	Ser	Leu Ile Ile Ser Leu Ala Val
55					60				65 70
ttc	gtg	eta	atg	ttt	ttg	eta	agg	aag	ata age tet gaa cca tta aag	476
Phe	Val	Leu	Met	Phe	Leu	Leu	Arg	Lys	Ile Ser Ser Glu Pro Leu Lys
				75					80 85
gac	gag	ttt	aaa	aac	aca	gga	tea	ggt	ctc ctg ggc atg gct aac att	524
Asp	Glu	Phe	Lys	Asn	Thr	Gly	Ser	Gly Leu Leu Gly Met Ala Asn Ile
			90					95	100
gac	ctg	gaa	aag	age	agg	act	ggt	gat	gaa att att ctt ccg aga ggc	572
Asp	Leu	Glu	Lys	Ser	Arg	Thr	Gly Asp	Glu Ile Ile Leu Pro Arg Gly
		105					110		115
ctc	gag	tac	acg	gtg	gaa	gaa	tgc	acc	tgt gaa gac tgc atc aag age	620
Leu	Glu	Tyr	Thr	Val	Glu	Glu	Cys	Thr	Cys Glu Asp Cys Ile Lys Ser
	120					125			130
aaa	ccg	aag	gtc	gac	tet	gac	cat	tgc	ttt cca ctc cca gct atg gag	668
Lys	Pro	Lys	Val	Asp	Ser	Asp	His	Cys	Phe Pro Leu Pro Ala Met Glu
135					140				145 150
gaa	ggc	gca	acc	att	ctt	gtc	acc	acg	aaa acg aat gac tat tgc aag	716
Glu	Gly	Ala	Thr	Ile	Leu	Val	Thr	Thr	Lys Thr Asn Asp Tyr Cys Lys
				155					160 165

PL 219 013 B1 agc ctg cca gct gct ttg agt gct acg gag ata gag aaa tca att tct 7 64 Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu Ile Glu Lys Ser Ile Ser

170 175 180 gct agg taattaacca tttcgactcg agcagtgcca ctttaaaaat cttttgtcag 820 Ala Arg aatagatgat gtgtcagatc tctttaggat gactgtattt ttcagttgcc gatacagctt 880 tttgtcctct aactgtggaa actctttatg ttagatatat ttctctaggt tactgttggg 940 agcttaatgg tagaaacttc cttggtttca tgattaaagt cttttttttt cctga 995 <210> 27 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27

Met 1

Leu

Gin

Met

Ala 5

Gly Gin

Cys

Ser Gin Asn 10

Glu

Tyr

Phe

Asp 15

Ser

Leu

His

Ala

Cys

Ile

Pro

Cys

Gin

Leu

Arg

Cys

Ser

Asn

Thr

20

25

30

Pro

Leu

Thr

Cys

Gin

Arg

Tyr

Cys

Asn

Ala

Ser

Val

Thr

Asn

Ser

35

40

45

Val

Lys

Gly

Thr

Asn

Ala

Ile

Leu.

, Trp

Thr

cys

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

50

55

60

Ile

Ser

Leu

Ala

Val

Phe

Val

Leu

Met

Phe

Leu

Arg

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Glu

Pro

Leu

Lys

Asp

Glu

Phe

Lys

Asn

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

85

90

95

Leu

Gly

Met

Ala

Asn

Ile

Asp

Leu

Glu

Lys

Ser

Arg

Thr

Gly

Asp

Glu

100

105

110

Ile

Leu

Pro

Arg

Gly

Leu

Glu

Tyr

Thr

Val

Glu

Cys

Thr

Cys

115

120

125

Glu

Asp

Cys

Ile

Lys

Ser

Lys

Pro

Lys

Val

Asp

Ser

Asp

His

Cys

Phe

130

135

140

Pro

Leu

Pro

Ala

Met

Glu

Gly

Ala

Thr

Ile

Leu

Val

Thr

Lys

145

150

155

160

Thr

Asn

Asp

Tyr

Cys

Lys

Ser

Leu

Pro

Ala

Leu

Ser

Ala

Thr

Glu

165

170

175

Ile

Glu

Lys

Ser

Ile

Ser

Ala

Arg

180 <210> 28 <211> 762 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

PL 219 013 B1 <221> CDS <222> (7) . . . (759) <400> 28 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro

10

aga Arg 15

tgg Trp

gtc Val

ctg Leu

tcc Ser

gag Glu 20

ccc Pro

aga Arg

tet Ser

tea gac

aaa Lys

act Thr

cac His

aca Thr

tgc Cys 30

96

Ser

Asp 25

cca

ccg

tgc

cca

gca

cct

gaa

ctc

ctg

ggg

gga

ccg

tea

gtc

ttc

ctc

144

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

35

40

45

ttc

ccc

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

192

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

50

55

60

gtc

aca

tgc

gtg

gac

gtg

age

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

240

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

65

70

75

ttc

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

288

Phe

Asn.

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

80

85

90

ccg

cgg

gag

cag

tac

aac

age

acg

tac

cgt

gtg

gtc

age

gtc

ctc

336

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

95

100

105

110

acc

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

384

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

115

120

125

gtc

tcc

aac

aaa

gcc

ctc

cca

gcc

ccc

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

432

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

130

135

140

gcc

aaa

ggg

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tcc

480

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

145

150

155

cgg

gat

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

age

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

528

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

160

165

170

ggc

ttc

tat

ccc

age

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

age

aat

ggg

cag

57 6

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

175

180

185

190

ccg

gag

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

624

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

195

200

205

tcc

ttc

ctc

tac

age

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

age

agg

tgg

cag

672

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

PL 219 013 B1

210

215

220

cag

ggg

aac

gtc

ttc

tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

gct

ctg

cac

aac

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

225

230

235

cac

tac

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

tct

ccg

ggt

aaa

tga

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

240 245 250 <210> 29 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29

Met 1

Lys His

Leu

Trp 5

Phe

Leu

Leu Leu Val 10

Ala

Pro

Arg 15

Trp

Val

Leu

Ser

Glu

Pro

Arg

Ser

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

20

25

30

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

35

40

45

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

50

55

60

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

65

70

75

80

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

85

90

95

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

val

Leu

Thr

Val

100

105

110

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

115

120

125

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

130

135

140

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

145

150

155

160

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

165

170

175

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

180

185

190

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

195

200

205

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

210

215

220

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

PL 219 013 B1

225 230 235 240

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 250 <210> 30 <211> 762 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (7)...(759) <223> Zmodyfikowana cząstka immunoglobuliny <400> 30 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro

1

5

10

aga

tgg

gtc

ctg

tcc

gag

ccc

aga

tet

tea

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

96

Arg 15

Trp

Val

Leu

Ser

Glu 20

Pro

Arg

Ser

Asp 25

Lys

Thr

His

Thr

Cys 30

cca

ccg

tgc

cca

gca

cct

gaa

gcc

gag

ggg

gca

ccg

tea

gtc

ttc

ctc

144

Pro

Cys

Pro

Ala 35

Pro

Glu

Ala

Glu

Gly 40

Ala

Pro

Ser

Val

Phe 45

Leu

ttc

ccc

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

192

Phe

Pro

Lys 50

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu 55

Met

Ile

Ser

Arg

Thr 60

Pro

Glu

gtc

aca

tgc

gtg

gac

gtg

age

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

240

Val

Thr

Cys 65

Val

Asp

Val 70

Ser

His

Glu

Asp

Pro 75

Glu

Val

Lys

ttc

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

288

Phe

Asn 80

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly 85

Val

Glu

Val

His

Asn 90

Ala

Lys

Thr

Lys

ccg

cgg

gag

cag

tac

aac

age

acg

tac

cgt

gtg

gtc

age

gtc

ctc

336

Pro 95

Arg

Glu

Gin

Tyr 100

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg 105

Val

Ser

Val

Leu 110

acc

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

384

Thr

Val

Leu

His

Gin 115

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly 120

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys 125

Lys

gtc

tcc

aac

aaa

gcc

ctc

cca

tcc

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

432

Val

Ser

Asn

Lys 130

Ala

Leu

Pro

Ser

Ser 135

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile 140

Ser

Lys

gcc

aaa

ggg

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tcc

480

Ala

Lys

Gly 145

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro 150

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu 155

Pro

Ser

cgg

gat

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

age

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

528

Arg

Asp 160

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn 165

Gin

Val

Ser

Leu

Thr 170

Cys

Leu

Val

Lys

PL 219 013 B1

ggc Gly 175

ttc tat

ccc Pro

agc Ser

gac Asp 180

atc Ile

gcc Ala

gtg gag

tgg Trp 185

gag Glu

agc Ser

aat Asn

ggg cag Gly Gin 190

576

Phe

Tyr

Val

Glu

ccg

gag

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

624

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

195

200

205

tcc

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

672

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

210

215

220

cag

ggg

aac

gtc

ttc

tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

gct

ctg

cac

aac

720

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

225

230

235

cac

tac

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

tct

ccg

ggt

aaa

tga

762

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

240 245 250 <210> 31 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31

Met Lys 1

His

Leu

Trp 5

Phe

Leu

Leu Leu Val Ala Ala 10

Pro

Arg 15

Trp

Val

Leu

Ser

Glu

Pro

Arg

Ser

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

20

25

30

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Ala

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

35

40

45

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

50

55

60

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

65

70

75

80

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

85

90

95

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

100

105

110

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

115

120

125

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

130

135

140

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

145

150

155

160

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

PL 219 013 B1

165

170

175

Tyr Pro Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

180

185

190

Asn Asn Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

195

200

205

Phe Leu Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

210

215

220

Asn Val Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

225

230

235

240

Thr Gin Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

245

250

<210> 32

<211> 762

<212> DNA

<213> Homo

sapiens

<220>

<221> CDS <222> (7)...(759) <223> Zmodyfikowana cząstką immunoglobuliny <400> 32 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro

10

aga Arg 15

tgg gtc

ctg Leu

tcc gag ccc aaa

tct Ser

tca Ser

gac aaa act

cac His

aca Thr

tgc Cys 30

96

Trp

Val

Ser

Glu 20

Pro Lys

Asp 25

Lys

Thr

cca

ccg

tgc

cca

gca

cct

gaa

gcc

gag

ggg

gca

ccg

tca

gtc

ttc

ctc

144

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Ala

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

35

40

45

ttc

ccc

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

192

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

50

55

60

gtc

aca

tgc

gtg

gac

gtg

agc

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

240

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

65

70

75

ttc

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

288

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

80

85

90

ccg

cgg

gag

cag

tac

aac

agc

acg

tac

cgt

gtg

gtc

agc

gtc

ctc

336

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

95

100

105

110

acc

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

384

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

PL 219 013 B1

125

115

120 gtc tcc aac aaa gcc ctc cca tcc Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser

130 tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa 432 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 135 140 gcc aaa ggg cag ccc ega gaa cca Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro

145 150 cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 480 Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

155 cgg gat gag ctg acc aag aac cag Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 160 165 gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 528 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

170 ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 175 180 gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 576 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin

185 190

ccg

gag

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

624

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

195

200

205

tcc

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

672

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

210

215

220

cag

ggg

aac

gtc

ttc

tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

gct

ctg

cac

aac

720

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

225

230

235 cac tac acg cag aag agc ctc tcc His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 240 245 ctg tct ccg ggt aaa tga Leu Ser Pro Gly Lys

250

762 <210> 33 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33

Met 1

Lys

His

Leu

Trp 5

Phe

Leu

Leu 10

Val

Ala

Pro

Arg 15

Trp

Val

Leu

Ser

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

20

25

30

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Ala

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

50

55

60

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

65

70

75

80

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

85

90

95

PL 219 013 B1

Glu	Glu Gin	Tyr 100	Asn.	Ser Thr Tyr Arg 105	Val	Val	Ser Val	Leu 110	Thr	Val
Leu	His Gin	Asp	Trp	Leu Asn Gly Lys	Glu	Tyr	Lys Cys	Lys	Val	Ser
	115			120			125
Asn	Lys Ala	Leu	Pro	Ser Ser Ile Glu	Lys	Thr	Ile Ser	Lys	Ala	Lys
	130			135			140
Gly	Gin Pro	Arg	Glu	Pro Gin Val Tyr	Thr	Leu	Pro Pro	Ser	Arg	Asp
145				150		155				160
Glu	Leu Thr	Lys	Asn	Gin Val Ser Leu	Thr	Cys	Leu Val	Lys	Gly	Phe
			165		170				175
Tyr	Pro Ser	Asp	Ile	Ala Val Glu Trp	Glu	Ser	Asn Gly	Gin	Pro	Glu
		180		185				190
Asn	Asn Tyr	Lys	Thr	Thr Pro Pro Val	Leu	Asp	Ser Asp	Gly	Ser	Phe
	195			200			205
Phe	Leu Tyr	Ser	Lys	Leu Thr Val Asp	Lys	Ser	Arg Trp	Gin	Gin	Gly
	210			215			220
Asn	Val Phe	Ser	Cys	Ser Val Met His	Glu	Ala	Leu His	Asn	His	Tyr
225				230		235				240
Thr	Gin Lys	Ser	Leu	Ser Leu Ser Pro	Gly	Lys
			245		250
<210> 34
<211> 759
<212> DNA
<213> Homo-	sapiens

<220>

<221> CDS <222> (7)...(756) <223> Zmodyfikowana cząstka immunoglobuliny <400> 34 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro

1

5

10

aga

tgg

gtc

ctg

tcc

gag

ccc

aaa

tet

tea

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

96

Arg

Trp

Val

Leu

Ser

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

15

20

25

30

cca

ccg

tgc

cca

gca

cct

gaa

gcc

gag

ggg

gca

ccg

tea

gtc

ttc

ctc

144

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Ala

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

35

40

45

ttc

ccc

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

192

Phe

Pro

pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

50

55

60

PL 219 013 B1

gtc	aca	tgc	gtg	gtg	gtg	gac	gtg
Val	Thr	Cys 65	Val	Val	Val	Asp	Val 70
ttc	aac	tgg	tac	gtg	gac	ggc	gtg
Phe	Asn 80	Trp	Tyr	Val	Asp	Gly 85	Val
ccg	cgg	gag	gag	cag	tac	aac	agc
Pro 95	Arg	Glu	Glu	Gin	Tyr 100	Asn	Ser
acc	gtc	ctg	cac	cag	gac	tgg	ctg
Thr	Val	Leu	His	Gin 115	Asp	Trp	Leu
gtc	tcc	aac	aaa	gcc	ctc	cca	tcc
Val	Ser	Asn	Lys 130	Ala	Leu	Pro	Ser
gcc	aaa	ggg	cag	ccc	ega	gaa	cca
Ala	Lys	Gly 145	Gin	Pro	Arg	Glu	Pro 150
cgg	gat	gag	ctg	acc	aag	aac	cag
Arg	Asp 160	Glu	Leu	Thr	Lys	Asn 165	Gin
ggc	ttc	tat	ccc	agc	gac	atc	gcc
Gly 175	Phe	Tyr	Pro	Ser	Asp 180	Ile	Ala
ccg	gag	aac	aac	tac	aag	acc	acg
Pro	Glu	Asn	Asn	Tyr 195	Lys	Thr	Thr
tcc	ttc	ttc	ctc	tac	agc	aag	ctc
Ser	Phe	Phe	Leu 210	Tyr	Ser	Lys	Leu
cag	ggg	aac	gtc	ttc	tca	tgc	tcc
Gin	Gly	Asn 225	Val	Phe	Ser	Cys	Ser 230
cac	tac	acg	cag	aag	agc	ctc	tcc
His	Tyr	Thr	Gin	Lys	Ser	Leu	Ser

240 245 agc cac gaa gac cct gag gtc aag 240 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys gag gtg cat aat gcc aag aca aag 288

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc 336

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

105 110 aat ggc aag gag tac aag tgc aag 384

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

120 125 tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa 432

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

135 140 cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 480

Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

155 gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 528

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

170

gtg gag	tgg gag Trp Glu 185	agc Ser	aat Asn	ggg Gly	cag 576 Gin 190
Val	Glu
cct	ccc	gtg	ctg	gac	tcc	gac	ggc	624
Pro	Pro	Val	Leu	Asp	Ser	Asp	Gly
	200					205
acc	gtg	gac	aag	agc	agg	tgg	cag	672
Thr	Val	Asp	Lys	Ser	Arg	Trp	Gin
215					220
gtg	atg	cat	gag	gct	ctg	cac	aac	720
Val	Met	His	Glu	Ala	Leu	His	Asn

235 ctg tct ccg ggt tga 759

Leu Ser Pro Gly

250 <210> 35 <211> 250 <212> PRT

<213> Homo sapiens
<400> 35 Met Lys His Leu Trp	Phe	Phe	Leu
1 5
Val Leu Ser Glu Pro	Lys	Ser	Ser

Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 10 15

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 25 30

PL 219 013 B1

Cys

Pro

Ala 35

Pro Glu Ala Glu

Gly 40

Ala Pro

Ser

Val

Phe 45

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

50

55

60

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

65

70

75

80

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

85

90

95

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

vał

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

100

105

110

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

115

120

125

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

130

135

140

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

145

150

155

160

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

165

170

175

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

180

185

190

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

195

200

205

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

210

215

220

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

225

230

235

240

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

245

250

<210> 36 <211> 762 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (7) . ,. (759) <223> Zmodyfikowana cząstka immunoglobuliny <400> 36 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro

10

PL 219 013 B1

aga Arg 15

tgg gtc Trp Val

ctg Leu

tcc Ser

gag ccc Glu Pro 20

aaa Lys

tet Ser

tgc Cys

gac Asp 25

aaa Lys

act Thr

cac aca

tgc Cys 30

96

His

Thr

cca

ccg

tgc

cca

gca

cct

gaa

ctc

ctg

ggg

gga

ccg

tea

gtc

ttc

ctc

144

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

35

40

45

ttc

ccc

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

192

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

50

55

60

gtc

aca

tgc

gtg

gac

gtg

age

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

240

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

65

70

75

ttc

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

288

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

80

85

90

ccg

cgg

gag

cag

tac

caa

age

acg

tac

cgt

gtg

gtc

age

gtc

ctc

336

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Gin

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

95

100

105

110

acc

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

384

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

115

120

125

gtc

tcc

aac

aaa

gcc

ctc

cca

gcc

ccc

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

432

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

130

135

140

gcc

aaa

ggg

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tcc

480

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

145

150

155

cgg

gat

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

age

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

528

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

160

165

170

ggc

ttc

tat

ccc

age

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

age

aat

ggg

cag

576

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

175

180

185

190

ccg

gag

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

624

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

195

200

205

tcc

ttc

ctc

tac

age

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

age

agg

tgg

cag

672

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

210

215

220

cag

ggg

aac

gtc

ttc

tea

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

gct

ctg

cac

aac

720

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

225

230

235

cac

tac

acg

cag

aag

age

ctc

tcc

ctg

tet

ccg

ggt

aaa

tga

762

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

PL 219 013 B1

240

245

250

<210> 37

<211> 251

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

Met

Lys

His

Leu

Trp

Phe

Leu

Val

Ala

Pro

Arg

Trp

1

5

10

15

Val

Leu

Ser

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

20

25

30

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

35

40

45

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

50

55

60

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

65

70

75

80

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

85

90

95

Glu

Gin

Tyr

Gin

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

100

105

110

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

115

120

125

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

130

135

140

Gly

Gin

Pró

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

145

150

155

160

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

165

170

175

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

180

185

190

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

195

200

205

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

210

215

220

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

225

230

235

240

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

245

250

<210> 38 <211> 762

PL 219 013 B1 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (7) . . .(759) <223> Zmodyfikowana cząstka immunoglobuliny <400> 38 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro

1

5

10

aga

tgg

gtc

ctg

tcc

gag

ccc

aaa

tet

tea

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

96

Arg

Trp

Val

Leu

Ser

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

15

20

25

30

cca

ccg

tgc

cca

gca

cct

gaa

ctc

ctg

ggg

gga

ccg

tea

gtc

ttc

ctc

144

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

35

40

45

ttc

ccc

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

192

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

50

55

60

gtc

aca

tgc

gtg

gac

gtg

age

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

240

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

65

70

75

ttc

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

288

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

80

85

90

ccg

cgg

gag

cag

tac

aac

age

acg

tac

cgt

gtg

gtc

age

gtc

ctc

336

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

95

100

105

110

acc

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

384

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

115

120

125

gtc

tcc

aac

aaa

gcc

ctc

cca

gcc

ccc

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

432

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

130

135

140

gcc

aaa

ggg

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tcc

480

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

145

150

155

cgg

gat

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

age

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

528

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

160

165

170

ggc

ttc

tat

ccc

age

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

age

aat

ggg

cag

576

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

175

180

185

190

ccg

gag

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

624

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

PL 219 013 B1

195

200

205

tcc

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

210

215

220

cag

ggg

aac

gtc

ttc

tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

gct

ctg

cac

aac

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

225

230

235

cac

tac

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

tct

ccg

ggt

aaa

tga

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

240 245 250 <210> 39 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39

Met 1

Lys

His

Leu

Trp 5

Phe

Leu

Leu 10

Val

Ala

Pro

Arg 15

Trp

Val

Leu

Ser

Glu 20

Pro

Lys

Ser

Asp 25

Lys

Thr

His

Thr

Cys 30

Pro

Cys

Pro

Ala 35

Pro

Glu

Leu

Gly 40

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 45

Leu

Phe

Pro

Lys 50

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu 55

Met

Ile

Ser

Arg

Thr 60

Pro

Glu

Val

Thr

Cys 65

Val

Asp

Val 70

Ser

His

Glu

Asp

Pro 75

Glu

Val

Lys

Phe

Asn 80

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly 85

Val

Glu

Val

His

Asn 90

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro 95

Arg

Glu

Gin

Tyr 100

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg 105

Val

Ser

Val

Leu 110

Thr

Val

Leu

His

Gin 115

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly 120

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys 125

Lys

Val

Ser

Asn

Lys 130

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro 135

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile 140

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly 145

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro 150

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu 155

Pro

Ser

Arg

Asp 160

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn 165

Gin

Val

Ser

Leu

Thr 170

Cys

Leu

Val

Lys

Gly 175

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp 180

Ile

Ala

Val

Glu

Trp 185

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin 190

Pro

Glu

Asn

Tyr 195

Lys

Thr

Pro

Pro 200

Val

Leu

Asp

Ser

Asp 205

Gly

Ser

Phe

PL 219 013 B1

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

210

215

220

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

225

230

235

240

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

dy

Lys

245

250

<210> 40 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 40 tattaggccg gccaccatgg atgcaatga 29 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 41 tgaagatttg ggctccttga gacctggga 29 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 42 tcccaggtct caaggagccc aaatcttca 29 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 43 tgaagatttg ggctcgttct cacagaagta <210> 44 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens

PL 219 013 B1 <220>

<223> Primer PCR <400> 44 atacttctgt gagaacgagc ccaaatcttc a 31 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 45 tttgggctcg ctcctgagct tgttctcaca 30 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 46 ctcaggagcg agcccaaatc ttcagaca 28 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Primer PCR <400> 48 gagctcaggg agcccaaatc ttcagaca 28 <210> 49 <211> 1214 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222>

<222> (17)... (1192) <223> Sekwencja kodująca białko fuzyjne <400> 49 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu

10 ctg ctg tgt ggc gcc gtc ttc gtt tcg ctc ago cag gaa atc cat gcc 100

Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gin Glu Ile His Ala

20 25

PL 219 013 B1

gag

ttg

aga

cgc

ttc

cgt

aga

gct

atg

aga

tcc

tgc

ccc

gaa

gag

cag

148

Glu

Leu 30

Arg

Phe

Arg

Arg 35

Ala

Met

Arg

Ser

Cys 40

Pro

Glu

Glrn

tac

tgg

gat

cct

ctg

ggt

acc

tgc

atg

tcc

tgc

aaa

acc

att

tgc

196

Tyr 45

Trp

Asp

Pro

Leu

Leu 50

Gly

Thr

Cys

Met

Ser 55

Cys

Lys

Thr

Ile

Cys 60

aac

cat

cag

agc

cag

cgc

acc

tgt

gca

gcc

ttc

tgc

agg

tca

ctc

agc

244

Asn

His

Gin

Ser

Gin 65

Arg

Thr

Cys

Ala

Ala 70

Phe

Cys

Arg

Ser

Leu 75

Ser

tgc

cgc

aag

gag

caa

ggc

aag

ttc

tat

gac

cat

ctc

ctg

agg

gac

tgc

292

Cys

Arg

Lys

Glu 80

Gin

Gly

Lys

Phe

Tyr 85

Asp

His

Leu

Arg 90

Asp

Cys

atc

agc

tgt

gcc

tcc

atc

tgt

gga

cag

cac

cct

aag

caa

tgt

gca

tac

340

Ile

Ser

Cys 95

Ala

Ser

Ile

Cys

Gly 100

Gin

His

Pro

Lys

Gin 105

Cys

Ala

Tyr

ttc

tgt

gag

aac

aag

ctc

agg

agc

cca

gtg

aac

ctt

cca

gag

ctc

388

Phe,

, Cys 110

Glu

Asn

Lys

Leu

Arg 115

Ser

Pro

Val

Asn

Leu 120

Pro

Glu

Leu

agg

aga

cag

cgg

agt

gga

gaa

gtt

gaa

aac

aat

tca

gac

aac

tcg

gga

436

Arg 125

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly 130

Glu

Val

Glu

Asn

Asn 135

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly 140

agg

tac

caa

gga

ttg

gag

cac

aga

ggc

tca

gaa

gca

agt

cca

gct

ctc

484

Arg

Tyr

Gin

Gly

Leu 145

Glu

His

Arg

Gly

Ser 150

Glu

Ala

Ser

Pro

Ala 155

Leu

cca

ggt

ctc

aag

gag

ccc

aaa

tct

tca

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

cca

532

Pro

Gly

Leu

Lys 160

Glu

Pro

Lys

Ser

Ser 165

Asp

Lys

Thr

His

Thr 170

Cys

Pro

ccg

tgc

cca

gca

cct

gaa

gcc

gag

ggg

gca

ccg

tca

gtc

ttc

ctc

ttc

580

Pro

Cys

Pro 175

Ala

Pro

Glu

Ala

Glu 180

Gly

Ala

Pro

Ser

Val 185

Phe

Leu

Phe

ccc

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

gtc

628

Pro

Pro 190

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr 195

Leu

Met

Ile

Ser

Arg 200

Thr

Pro

Glu

Val

aca

tgc

gtg

gac

gtg

agc

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

676

Thr 205

Cys

Val

Asp 210

Val

Ser

His

Glu

Asp 215

Pro

Glu

Val

Lys

Phe 220

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

ccg

724

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp 225

Gly

Val

Glu

Val

His 230

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys 235

Pro

cgg

gag

cag

tac

aac

agc

acg

tac

cgt

gtg

gtc

agc

gtc

ctc

acc

772

Arg

Glu

Gin 240

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr 245

Arg

Val

Ser

Val 250

Leu

Thr

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

gtc

820

PL 219 013 B1

Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

255

260

265

tcc

aac

aaa

gcc

ctc

cca

tcc

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

gcc

868

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

270

275

280

aaa

ggg

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tcc

cgg

916

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

285

290

295

300

gat

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

agc

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

ggc

964

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

305

310

315

ttc

tat

ccc

agc

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

aat

ggg

cag

ccg

1012

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

320

325

330

gag

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

tcc

1060

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

335

340

345

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

1108

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

350

355

360

ggg

aac

gtc

ttc

tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

gct

ctg

cac

aac

cac

1156

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

365

370

375

380

tac

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

tct

ccg

ggt

aaa

taatetagag

1202

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

385

390

gcgcgecaat ta 1214 <210> 50 <211> 392 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50

Met 1

Asp

Ala

Met

Lys 5

Arg

Gly

Leu

Cys

Cys 10

Val

Leu

Cys 15

Gly

Ala

Val

Phe

Val 20

Ser

Leu

Ser

Gin

Glu 25

Ile

His

Ala

Glu

Leu 30

Arg

Phe

Arg

Arg 35

Ala

Met

Arg

Ser

Cys 40

Pro

Glu

Gin

Tyr 45

Trp

Asp

Pro

Leu

Leu 50

Gly

Thr

Cys

Met

Ser 55

Cys

Lys

Thr

Ile

Cys 60

Asn

His

Gin

Ser

Gin 65

Arg

Thr

Cys

Ala

Ala 70

Phe

Cys

Arg

Ser

Leu 75

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu 80

Gin

Gly

Lys

Phe

Tyr 85

Asp

His

Leu

Arg 90

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys 95

Ala

Ser

Ile

cys

Gly

Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

PL 219 013 B1

100

105

110

Lys

Leu

Arg

Ser

Pro

Val

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

115

120

125

Ser

Gly

Glu

Val

Glu

Asn

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin

Gly

130

135

140

Leu

Glu

His

Arg

Gly

Ser

Glu

Ala

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

145

150

155

160

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

165

170

175

Pro

Glu

Ala

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

180

185

190

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

195

200

205

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

210

215

220

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

225

230

235

240

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

245

250

255

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

260

265

270

Leu

Pro

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

275

280

285

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

290

295

300

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

305

310

315

320

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

325

330

335

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

340

345

350

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

355

360

365

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

370

375

380

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

385

390

<210> 51 <211> 1070 <212> DNA

PL 219 013 B1 <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (17) . . . (1048) <223> Sekwencja kodująca białko fuzyjne <400> 51 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu

1

5

10

ctg

tgt

ggc

gcc

gtc

ttc

gtt

tcg

ctc

agc

cag

gaa

atc

cat

gcc

100

Leu

Cys

Gly

Ala

Val

Phe

Val

Ser

Leu

Ser

Gin

Glu

Ile

His

Ala

15

20

25

gag

ttg

aga

cgc

ttc

cgt

aga

gct

atg

aga

tcc

tgc

ccc

gaa

gag

cag

148

Glu

Leu

Arg

Phe

Arg

Ala

Met

Arg

Ser

Cys

Pro

Glu

Gin

30

35

40

tac

tgg

gat

cct

ctg

ggt

acc

tgc

atg

tcc

tgc

aaa

acc

att

tgc

196

Tyr

Trp

Asp

Pro

Leu

Gly

Thr

Cys

Met

Ser

Cys

Lys

Thr

Ile

Cys

45

50

55

60

aac

cat

cag

agc

cag

cgc

acc

tgt

gca

gcc

ttc

tgc

agg

tca

ctc

agc

244

Asn

His

Gin

Ser

Gin

Arg

Thr

Cys

Ala

Phe

Cys

Arg

Ser

Leu

Ser

65

70

75

tgc

cgc

aag

gag

caa

ggc

aag

ttc

tat

gac

cat

ctc

ctg

agg

gac

tgc

2 92

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly

Lys

Phe

Tyr

Asp

His

Leu

Arg

Asp

Cys

80

85

90

atc

agc

tgt

gcc

tcc

atc

tgt

gga

cag

cac

cct

aag

caa

tgt

gca

tac

340

Ile

Ser

Cys

Ala

Ser

Ile

Cys

Gly

Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

95

100

105

ttc

tgt

gag

aac

gag

ccc

aaa

tct

tca

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

cca

388

Phe

Cys

Glu

Asn

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

110

115

120

ccg

tgc

cca

gca

cct

gaa

gcc

gag

ggg

gca

ccg

tca

gtc

ttc

ctc

ttc

436

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Ala

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

125

130

135

140

ccc

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

gtc

484

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

145

150

155

aca

tgc

gtg

gac

gtg

agc

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

532

Thr

Cys

Val

Asp

vai

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

160

165

170

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

ccg

580

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

175

180

185

cgg

gag

cag

tac

aac

agc

acg

tac

cgt

gtg

gtc

agc

gtc

ctc

acc

628

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

190

195

200

PL 219 013 B1

gtc Val 205

ctg Leu

cac His

cag Gin

gac Asp

tgg Trp 210

ctg Leu

aat Asn

ggc Gly

aag Lys

gag tac aag

tgc Cys

aag Lys

gtc Val 220

676

Glu Tyr 215

Lys

tcc

aac

aaa

gcc

ctc

cca

tcc

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

gcc

724

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

225

230

235

aaa

ggg

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tcc

cgg

772

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

240

245

250

gat

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

agc

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

ggc

820

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

255

260

265

ttc

tat

ccc

agc

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

aat

ggg

cag

ccg

868

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

270

275

280

gag

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

tcc

916

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

285

290

295

300

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

964

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

305 310 315

ggg

aac

gto

ttc

tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

gct

ctg cac aac

cac

1012

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu His Asn

His

320

325

330

tac

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

tct

ccg

ggt

aaa

taatetagag

1058

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

335

340

gcgcgccaat ta 1070 <210> 52 <211> 344 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52

Met

Asp

Ala

Met

Lys

Arg

Gly

Leu

Cys

Val

Leu

Cys

Gly

1

5

10

15

Ala

Val

Phe

Val

Ser

Leu

Ser

Gin

Glu

Ile

His

Ala

Glu

Leu

Arg

20

25

30

Phe

Arg

Ala

Met

Arg

Ser

Cys

Pro

Glu

Gin

Tyr

Trp

Asp

Pro

35

40

45

Leu

Gly

Thr

Cys

Met

Ser

Cys

Lys

Thr

Ile

Cys

Asn

His

Gin

Ser

50

55

60

Gin

Arg

Thr

Cys

Ala

Phe

Cys

Arg

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

70 75 80

PL 219 013 B1

Gin Gly Lys

Phe

Tyr 85

Asp His

Leu Leu Arg 90

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys 95

Ala

Ser

Ile

Cys

Gly

Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

100

105

110

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

115

120

125

Pro

Glu

Ala

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro.

130

135

140

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

145

150

155

160

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

165

170

175

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

180

185

190

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

195

200

205

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

210

215

220

Leu

Pro

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

225

230

235

240

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

245

250

255

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

260

265

270

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

275

280

285

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

290

295

300

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

305

310

315

320

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

325

330

335

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

340

<210> 53 <211> 1082 <212> DNA <213> Homo sapiens
<220> <221>	CDS

PL 219 013 B1 <222> (17). . . (1060) <223> Sekwencja kodująca białko fuzyjne <400> 53 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu

10

ctg ctg

tgt Cys 15

ggc Gly

gcc Ala

gtc Val

ttc Phe

gtt Val 20

teg Ser

ctc age cag gaa atc

cat His

gcc Ala

100

Leu

Ser Gin Glu 25

Ile

gag

ttg

aga

ege

ttc

cgt

aga

gct

atg

aga

tcc

tgc

ccc

gaa

gag

cag

148

Glu

Leu

Arg

Phe

Arg

Ala

Met

Arg

Ser

Cys

Pro

Glu

Gin

30

35

40

tac

tgg

gat

cct

ctg

ggt

acc

tgc

atg

tcc

tgc

aaa

acc

att

tgc

196

Tyr

Trp

Asp

Pro

Leu

Gly

Thr

Cys

Met

Ser

Cys

Lys

Thr

Ile

Cys

45

50

55

60

aac

cat

cag

age

cag

ege

acc

tgt

gca

gcc

ttc

tgc

agg

tea

ctc

age

244

Asn

His

Gin

Ser

Gin

Arg

Thr

Cys

Ala

Phe

Cys

Arg

Ser

Leu

Ser

65

70

75

tgc

ege

aag

gag

caa

ggc

aag

ttc

tat

gac

cat

ctc

ctg

agg

gac

tgc

292

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly

Lys

Phe

Tyr

Asp

His

Leu

Arg

Asp

Cys

80

85

90

atc

age

tgt

gcc

tcc

atc

tgt

gga

cag

cac

cct

aag

caa

tgt

gca

tac

340

Ile

Ser

Cys

Ala

Ser

Ile

Cys

Gly

Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

95

100

105

ttc

tgt

gag

aac

aag

ctc

agg

age

gag

ccc

aaa

tet

tea

gac

aaa

act

388

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

Arg

Ser

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

110

115

120

cac

aca

tgc

cca

ccg

tgc

cca

gca

cct

gaa

gcc

gag

ggg

gca

ccg

tea

436

His

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Ala

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

125

130

135

140

gtc

ttc

ctc

ttc

ccc

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

484

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

145

150

155

acc

cct

gag

gtc

aca

tgc

gtg

gac

gtg

age

cac

gaa

gac

cct

532

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

val

Val

Asp

val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

160

165

170

gag

gtc

aag

ttc

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

580

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

175

180

185

a'ag

aca

aag

ccg

cgg

gag

cag

tac

aac

age

acg

tac

cgt

gtg

gtc

628

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu.

.Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

190

195

200

age

gtc

ctc

acc

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

676

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

205

210

215

220

PL 219 013 B1

aag Lys

tgc Cys

aag Lys

gtc Val

tcc Ser 225

aac Asn

aaa Lys

gcc Ala

ctc Leu

cca Pro 230

tcc Ser

tcc atc gag

aaa Lys 235

acc Thr

724

Ser

Ile

Glu

atc

tcc

aaa

gcc

aaa

ggg

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

772

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

240

245

250

ccc

cca

tcc

cgg

gat

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

agc

ctg

acc

tgc

820

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

255

2 60

265

ctg

gtc

aaa

ggc

ttc

tat

ccc

agc

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

868

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

270

275

280

aat

ggg

cag

ccg

gag

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

916

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

285

290

295

300

tcc

gac

ggc

tcc

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

964

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

305

310

315

agg

tgg

cag

cag ggg aac gtc ttc tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat <

gag gct

101

Arg

Trp

Gin

Gin Gly Asn Val Phe Ser

Cys

Ser

Val

Met

His <

Glu Ala

320

325

330

ctg

cac

aac

cac tac acg cag aag agc

: ctc

tcc

ctg

tct

ccg i

ggt aaa

106

Leu

His

Asn

His Tyr Thr Gin Lys Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro i

Gly Lys

335

340

345

taatetagag.gcgcgecaat ta 1082 <210> 54 <211> 348 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Białko fuzyjne <400> 54

Met 1

Asp

Ala

Met

Lys 5

Arg

Gly

Leu

Cys

Cys 10

Val

Leu

Cys 15

Gly

Ala

Val

Phe

Val 20

Ser

Leu

Ser

Gin

Glu 25

Ile

His

Ala

Glu

Leu 30

Arg

Phe

Arg

Arg 35

Ala

Met

Arg

Ser

Cys 40

Pro

Glu

Gin

Tyr 45

Trp

Asp

Pro

Leu

Leu 50

Gly

Thr

Cys

Met

Ser 55

Cys

Lys

Thr

Ile

Cys 60

Asn

His

Gin

Ser

Gin

Arg

Thr

Cys

Ala

Phe

Cys

Arg

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

70 75 80

PL 219 013 B1

Gin

Gly

Lys

Phe

Tyr 85

Asp His

Leu

Arg 90

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys 95

Ala

Ser

Ile

Cys

Gly

Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

100

105

110

Lys

Leu

Arg

Ser

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

115

120

125

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Ala

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

130

135

140

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

145

150

155

160

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro-

-Glu

Val

Lys

Phe

165

170

175

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

180

185

190

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

195

200

205

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

210

215

220

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

225

230

235

240

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

245

250

255

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

2 60

265

270

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

275

280

285

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

290

295

300

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

305

310

315

320

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

325

330

335

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

340

345

<210> 55 <211> 1109 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS

PL 219 013 B1 <222> (17)...(1090) <223> Sekwencja kodująca białko fuzyjne <400> 55 tattaggccg gccacc atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg 52

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu

10

ctg Leu

tgt Cys 15

ggc Gly

gcc gtc ttc gtt

tcg Ser

ctc agc

cag gaa atc

cat His

gcc Ala

100

Ala

Val

Phe

Val 20

Leu

Ser

Gin

Glu 25

Ile

gag

ttg

aga

cgc

ttc

cgt

aga

gct

atg

aga

tcc

tgc

ccc

gaa

gag

cag

148

Glu

Leu 30

Arg

Phe

Arg

Arg 35

Ala

Met

Arg

Ser

Cys 40

Pro

Glu

Gin

tac

tgg

gat

cct

ctg

ggt

acc

tgc

atg

tcc

tgc

aaa

acc

att

tgc

196

Tyr 45

Trp

Asp

Pro

Leu

Leu 50

Gly

Thr

Cys

Met

Ser 55

Cys

Lys

Thr

Ile

Cys 60

aac

cat

cag

agc

cag

cgc

acc

tgt

gca

gcc

ttc

tgc

agg

tca

ctc

agc

244

Asn

His

Gin

Ser

Gin 65

Arg

Thr

Cys

Ala

Ala 70

Phe

Cys

Arg

Ser

Leu 75

Ser

tgc

cgc

aag

gag

caa

ggc

aag

ttc

tat

gac

cat

ctc

ctg'agg

gac

tgc

292

Cys

Arg

Lys

Glu 80

Gin

Gly

Lys

Phe

Tyr 85

Asp

His

Leu

Arg 90

Asp

Cys

atc

agc

tgt

gcc

tcc

atc

tgt

gga

cag

cac

cct

aag

caa

tgt

gca

tac

340

Ile

Ser

Cys 95

Ala

Ser

Ile

Cys

Gly 100

Gin

His

Pro

Lys

Gin 105

Cys

Ala

Tyr

ttc

tgt

gag

aac

aag

ctc

agg

agc

cca

gtg

aac

ctt

cca

gag

ctc

388

Phe

Cys 110

Glu

Asn

Lys

Leu

Arg 115

Ser

Pro

Val

Asn

Leu 120

Pro

Glu

Leu

agg

gag

ccc

aaa

tct

tca

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

cca

ccg

tgc

cca

436

Arg 125

Glu

Pro

Lys

Ser

Ser 130

Asp

Lys

Thr

His

Thr 135

Cys

Pro

Cys

Pro 140

gca

cct

gaa

gcc

gag

ggg

gca

ccg

tca

gtc

ttc

ctc

ttc

ccc

cca

aaa

484

Ala

Pro

Glu

Ala

Glu 145

Gly

Ala

Pro

Ser

Val 150

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro 155

Lys

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

gtc

aca

tgc

gtg

532

Pro

Lys

Asp

Thr 160

Leu

Met

Ile

Ser

Arg 165

Thr

Pro

Glu

Val

Thr 170

Cys

Val

gtg

gac

gtg

agc

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

aac

tgg

tac

580

Val

Asp 175

Val

Ser

His

Glu

Asp 180

Pro

Glu

Val

Lys

Phe 185

Asn

Trp

Tyr

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

ccg

cgg

gag

628

Val

Asp 190

Gly

Val

Glu

Val

His 195

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys 200

Pro

Arg

Glu

cag

tac

aac

agc

acg

tac

cgt

gtg

gtc

agc

gtc

ctc

acc

gtc

ctg

cac

676

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

205 210 215 220

PL 219 013 B1

cag Gin

gac Asp

tgg Trp

ctg aat Leu Asn 225

ggc Gly

aag Lys

gag tac aag

tgc Cys

aag Lys

gtc Val

tcc aac aaa Ser Asn Lys 235

724

Glu

Tyr

Lys 230

gcc

ctc

cca

tcc tcc

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

gcc

aaa ggg cag

772

Ala

Leu

Pro

Ser Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys Gly Gin

240

245

250

ccc

ega

gaa

cca cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tcc

cgg

gat gag ctg

820

Pro

Arg

Glu

Pro Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp Glu Leu

255

260

265

acc

aag

aac

cag gtc

agc

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

ggc

ttc tat ccc

868

Thr

Lys

Asn

Gin Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe Tyr Pro

270

275

280

agc

gac

atc

gcc gtg

gag

tgg

gag

agc

aat

ggg

cag

ccg

gag aac aac

916

Ser

Asp

Ile

Ala Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu Asn Asn

285

290

295

300

tac

aag

acc

acg cct

ccc

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

tcc

ttc ttc ctc

964

Tyr

Lys

Thr

Thr Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe Phe Leu

305

310

315

tac

agc

aag ctc acc gtg gac aag agc

agg

tgg

cag

ggg aac gtc

1012

Tyr

Ser

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

Arg

Trp

Gin

Gly Asn Val

320

325

330

ttc

tca

tgc tcc gtg atg cat gag gct

ctg

cac

aac

cac

tac acg cag

1060

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin 335 340 345 ' aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taa tctagaggcg cgccaatta 1109

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

350 355 <210> 56 <211> 357 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56

Met

Asp

Ala

Met

Lys

Arg

Gly

Leu

Cys

Val

Leu

Cys

Giy

1

5

10

15

Ala

Val

Phe

Val

Ser

Leu

Ser

Gin

Glu

Ile

His

Ala

Glu

Leu

Arg

20

25

30

Phe Arg Arg Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro 35 40 45

Leu

Gly

Thr

Cys

Met

Ser

Cys

Lys

Thr

Ile

Cys

Asn

His

Gin

Ser

50

55

60

Gin

Arg

Thr

Cys

Ala

Phe

Cys

Arg

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

65

70

75

80

Gin

Gly

Lys

Phe

Tyr

Asp

His

Leu

Arg

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Ala

90 95

PL 219 013 B1

Ser

Ile Cys

Gly Gin His 100

Pro

Lys

Gin 105

Cys Ala

Tyr

Phe Cys Glu 110

Asn

Lys

Leu

Arg

Ser

Pro

Val

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Arg

Glu

Pro

Lys

115

120

125

Ser

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Ala

130

135

140

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

145

150

155

160

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Dal

Val

Asp

Val

165

170

175

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

180

185

190

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

195

200

205

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

210

215

220

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ser

225

230

235

240

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys,

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

245

250

255

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

260

265

270

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

275

280

285

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

290

295

300

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

305

310

315

320

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

325

330

335

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

340

345

350

Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 57 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

PL 219 013 B1 <223> Przykładowa sekwencja nukleotydowa <40G> 57 atgcacggg 9 <210> 58 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223>Przykładowa sekwencja nukleotydowa <400> 58 cccgtgcat 9 <210> 59 <211> 586 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (27)...(578) <400> 59 gcagcttgtg cggcggcgtc ggcacc atg agg ega ggg ccc cgg age ctg cgg 53 Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg

ggc Gly 10

agg Arg

gac Asp

gcg cca

1 gcc ccc acg

5 ccc tgc gtc ccg gcc gag tgc ttc

101

Ala

Pro

Ala 15

Pro

Thr

Pro

Cys

Val 20

Pro Ala

Glu Cys

Phe 25

gac

ctg

gtc

ege

cac

tgc

gtg

gcc

tgc

ggg

ctc

ctg

ege

acg

ccg

149

Asp

Leu

Val

Arg

His

Cys

Val

Ala

Cys

Gly

Leu

Arg

Thr

Pro

30

35

40

cgg

ccg

aaa

ccg

gcc

ggg

gcc

age

cct

gcg

ccc

agg

acg

gcg

ctg

197

Arg

Pro

Lyś

Pro

Ala

Gly

Ala

Ser

Pro

Ala

Pro

Arg

Thr

Ala

Leu

45

50

55

cag

ccg

cag

gag

teg

gtg

ggc

gcg

ggg

gcc

ggc

gag

gcg

ctg

ccc

245

Gin

Pro

Gin

Glu

Ser

Val

Gly

Ala

Gly

Ala

Gly

Glu

Ala

Leu

Pro

60

65

70

ctg

ccc

ggg

ctg

ctc

ttt

ggc

gcc

ccc

gcg

ctg

ggc

ctg

gca

ctg

293

Leu

Pro

Gly

Leu

Phe

Gly

Ala

Pro

Ala

Leu

Gly

Leu

Ala

Leu

75

80

85

gtc

ctg

gcg

ctg

gtc

ctg

gtg

ggt

ctg

gtg

age

tgg

agg

cgg

ega

cag

341

Val

Leu

Ala

Leu

Val

Leu

Val

Gly

Leu

Val

Ser

Trp

Arg

Gin

90

95

100

105

cgg

ctt

ege

ggc

gcg

tcc

gca

gag

gcc

ccc

gac

gga

gac

aag

389

Arg

Leu

Arg

Gly

Ala

Ser

Ala

Glu

Ala

Pro

Asp

Gly

Asp

Lys

110

115

120

gac

gcc

cca

gag

ccc

ctg

gac

aag

gtc

atc

att

ctg

tet

ccg

gga

atc

437

Asp

Ala

Pro

Glu

Pro

Leu

Asp

Lys

Val

Ile

Leu

Ser

Pro

Gly

Ile

125

130

135

PL 219 013 B1

tct

gat

gcc

aca

gct

cct

gcc

tgg

cct

ggg

gaa

gac

cca

gga

Ser

Asp

Ala 140

Thr

Ala

Pro

Ala

Trp 145

Pro

Gly

Glu 150

Asp

Pro

Gly

acc

cca

cct

ggc

cac

agt

gtc

cct

gtg

cca

gcc

aca

gag

ctg

ggc

Thr

Thr 155

Pro

Gly

His

Ser 160

Val

Pro

Val

Pro

Ala 165

Thr

Glu

Leu

Gly

tcc

act

gaa

ctg

gtg

acc

aag

acg

gcc

ggc

cct

gag

caa

Ser

Thr

Glu

Leu

Val

Thr

Lys

Thr

Ala

Gly

Pro

Glu

G)n

Gin

170 175 180 tagcaggg 586 <210> 60 <211> 184 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

Met

Arg

Gly

Pro

Arg

Ser

Leu

Arg

Gly

Arg

Asp

Ala

Pro

Ala

Pro

1

5

10

15

Thr

Pro

Cys

Val

Pro

Ala

Glu

Cys

Phe

Asp

Leu

Val

Arg

His

Cys

20

25

30

Val

Ala

Cys

Gly

Leu

Arg

Thr

Pro

Arg

Pro

Lys

Pro

Ala

Gly

Ala

35

40

45

Ser

Pro

Ala

Pro

Arg

Thr

Ala

Leu

Gin

Pro

Gin

Glu

Ser

Val

Gly

50

55

60

Ala

Gly

Ala

Gly

Glu

Ala

Leu

Pro

Leu

Pro

Gly

Leu

Phe

Gly

65

70

75

80

Ala

Pro

Ala

Leu

Gly

Leu

Ala

Leu

Val

Leu

Ala

Leu

Val

Leu

Val

85

90

95

Gly

Leu

Val

Ser

Trp

Arg

Gin

Arg

Leu

Arg

Gly

Ala

Ser

100

105

110

Ser

Ala

Glu

Ala

Pro

Asp

Gly

Asp

Lys

Asp

Ala

Pro

Glu

Pro

Leu

Asp

115

120

125

Lys

Val

Ile

Leu

Ser

Pro

Gly

Ile

Ser

Asp

Ala

Thr

Ala

Pro

Ala

130

135

140

Trp

Pro

Gly

Glu

Asp

Pro

Gly

Thr

Pro

Gly

His

Ser

145

150

155

160

Val

Pro

Val

Pro

Ala

Thr

Glu

Leu

Gly

Ser

Thr

Glu

Leu

Val

Thr

165

170

175

Lys

Thr

Ala

Gly

Pro

Glu

Gin

180

<210> 61 <211> 19 <212> PRT

PL 219 013 B1 <213> Homo sapiens <220>

<223> Sekwencja sygnałowa 26-10 VH <400> 61

Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 10 15

Val Leu Ser <210> 62 <211> 332 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Białko fuzyjne <400> 62

Met Gly Trp 1

Ser

Trp 5

Ile

Phe

Leu

Phe

Leu 10

Leu

Ser Gly Thr Ala ' 15

Gly

Val

Leu

Ser

Ala

Met

Arg

Ser

Cys

Pro

Glu

Gin

Tyr

Trp

Asp

Pro

20

25

30

Leu

Gly

Thr

Cys

Met

Ser

Cys

Lys

Thr

Ile

Cys

Asn

His

Gin

Ser

35

40

45

Gin

Arg

Thr

Cys

Ala

Phe

Cys

Arg

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

50

55

60

Gin

Gly

Lys

Phe

Tyr

Asp

His

Leu

Arg

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Ala

65

70

75

80

Ser

Ile

Cyś

Gly

Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

85

90

95

Lys

Leu

Arg

Ser

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

100

105

110

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Ala

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

115

120

125

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

val

130

135

140

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

145

150

155

160

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

165

170

175

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

180

185

190

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

195

200

205

PL 219 013 B1

Ser

Asn 210

Lys

Ala

Leu

Pro

Ser 215

Ser

Ile

Glu Lys

Thr 220

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

225

230

235

240

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

245

250

255

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

260

265

270

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

275

280

285

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

290

295

300

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

305

310

315

320

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

dy

Lys

325

330

<210> 63 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223>-26-10 VH 5' UTR <400> 63 aacatatgtc caatgtcctc tccacagaca ctgaacacac tgactccaac g 51 <210> 64 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Zmodyfikowane 26-10 VH 5' UTR <400> 64 aacatatgtc caatgtcctc tccacagaca ctgaacacac tgactgccac c 51 <210> 65 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1) - · - (57) <223> Sekwencja sygnałowa 26-10 VH <400> 65 atg gga tgg agc tgg atc ttt ctc ttt ctt ctg tca gga act gca ggt 48

PL 219 013 B1

Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 10 15 gtc ctc tct

Val Leu Ser 57 <210> 66 <211> 84 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Intron 26-10 VH <400> 66 gtaaggggct ccccagttcc aaaatctgaa gaaaagaaat ggcttgggat gtcacagata 60 tccactctgt ctttctcttc acag 84 <210> 67 <211> 1135 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Białko fuzyjne <400> 67 aacatatgtc caatgtcctc tccacagaca ctgaacacac tgactccaac gatgggatgg 60 agctggatct ttctctttct tctgtcagga actgcaggta aggggctccc cagttccaaa 120 atctgaagaa aagaaatggc ttgggatgtc acagatatcc actctgtctt tctcttcaca 180 ggtgtęctct ctgctatgag atcctgcccc gaagagcagt actgggatcc tctgctgggt 240 acctgcatgt cctgcaaaac catttgcaac catcagagcc agcgcacctg tgcagccttc 300 tgcaggtcac tcagctgccg caaggagcaa ggcaagttct atgaccatct cctgagggac 360 tgcatcagct gtgcctccat ctgtggacag caccctaagc aatgtgcata cttctgtgag 420 aacaagctca ggagcgagcc caaatcttca gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 480 gcacctgaag ccgagggggc accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 540 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 600 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccatcc 780 tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 840 ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 960 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1020 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1080 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa ataaa 1135 <210> 68 <211> 1135 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Białko fuzyjne <400> 68 aacatatgtc caatgtcctc tccacagaca ctgaacacac tgactgccac catgggatgg 60 agctggatct ttctctttct tctgtcagga actgcaggta aggggctccc cagttccaaa 120 atctgaagaa aagaaatggc ttgggatgtc acagatatcc actctgtctt tctcttcaca 180 ggtgtcctct ctgctatgag atcctgcccc gaagagcagt actgggatcc tctgctgggt 240 acctgcatgt cctgcaaaac catttgcaac catcagagcc agcgcacctg tgcagccttc 300 tgcaggtcac tcagctgccg caaggagcaa ggcaagttct atgaccatct cctgagggac 360

PL 219 013 B1 tgcatcagct gtgcctccat ctgtggacag caccctaagc aatgtgcata cttctgtgag 420 aacaagctca ggagcgagcc caaatcttca gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 480 gcacctgaag ccgagggggc accgtcagtct tcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 540 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 600 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccatcc 780 tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 840 ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 960 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1020 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1080 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa ataaa 1135 <210> 69 <211> 884 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> struktura wzmacniacz CMV/promotor MPSV LTR <400> 69 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 120 caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 180 ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 240 tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 300 accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 360 ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttgaat gaaagacccc 420 acctgtaggt ttggcaagct agcttaagta acgccatttg caaggcatgg aaaaatacat 480 aactgagaat agagaagttc agatcaaggt caggaacaga gaaacaggag aatatgggcc 540 aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccgctcag ggccaagaac agttggaaca 600 ggagaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgc tcagggccaa 660 gaacagatgg tccccagatc ggtcccgccc tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt 720 tccagggtgc cccaaggacc tgaaatgacc ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt 780 cgcttctcgc ttctgttcgc gcgcttctgc tccccgagct caataaaaga gcccacaacc 840 cctcactcgg cgcgccagtc ctccgataga ctgcgtcgcc cggg 884 <210> 70 <211> 455 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<223> Promotor MPSV LTR bez regionu kontroli ujemnej <400> 70 aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagaaggt taggaacaga gagacagcag 60 aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca gggccaagaa 120 cagatggtcc ccagatgcgg tcccgccctc agcagtttct agagaaccat cagatgtttc 180 cagggtgccc caaggacctg aaaatgaccc tgtgccttat ttgaactaac caatcagttc 240 gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc aataaaagag cccacaaccc 300 ctcactcggc gcgccagtcc tccgatagac tgcgtcgccc gggtacccgt gttctcaata 360 aaccctcttg cagttgcatc cgactcgtgg tctcgctgtt ccttgggagg gtctcctctg 420 agtgattgac tacccgtcag cgggggtctt tcagt 455

Claims

1. Białko fuzyjne aktywatora przezbłonowego i modulatora wapnia i interaktora ligandu cyklofiliny (TACI)-immunoglobulina, znamienne tym, że białko TACI-immunoglobulina zawiera:

(i) reszt aminokwasowych 34 do 104 w SEQ ID nr 2;

2. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że cząstka immunoglobuliny zawiera region stały domeny immunoglobuliny.

3. Białko fuzyjne według zastrz. 2, znamienne tym, że cząstka receptora TACI składa się z reszt aminokwasowych 34 do 104 w SEQ ID nr 2, i przy czym białko fuzyjne zawiera ponadto segment szypułowy składający się z ciągłych serii następujących po sobie 2 do 50 reszt aminokwasowych rozpoczynających się od reszty aminokwasowej 105 w SEQ ID nr 2.

4. Białko fuzyjne według zastrz. 2 lub 3, znamienne tym, że cząstka immunoglobuliny zawiera domenę regionu stałego łańcucha ciężkiego.

5. Białko fuzyjne według zastrz. 4, znamienne tym, że cząstka immunoglobuliny zawiera domenę regionu stałego ludzkiego łańcucha ciężkiego.

6. Białko fuzyjne według zastrz. 5, znamienne tym, że region stały łańcucha ciężkiego jest domeną regionu stałego łańcucha ciężkiego IgG1.

7. Białko fuzyjne według zastrz. 6, znamienne tym, że cząstka immunoglobuliny jest fragmentem Fc IgG1, który zawiera domeny CH2 i CH3.

8. Białko fuzyjne według zastrz. 7, znamienne tym, że cząstka immunoglobuliny jest fragmentem Fc IgG1 zawierającym sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 33.

9. Białko fuzyjne według zastrz. 2, znamienne tym, że białko fuzyjne TACI-immunoglobulina posiada sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 54.

10. Białko fuzyjne według zastrz. 2-9, znamienne tym, że białko fuzyjne TACI-immunoglobulina jest dimerem.

11. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że białko fuzyjne TACI-immunoglobulina składa się lub zawiera wydzielaną postać którejkolwiek z SEQ ID nr 50, 52, 54 lub 56.

12. Biało fuzyjne według zastrz. 11, znamienne tym, że białko fuzyjne TACI-immunoglobulina składa się lub zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 50, 52, 54 lub 56, gdzie sekwencje liderowa (tPA) optymalizowana (otPA) (SEQ ID nr 25) została usunięta.

13. Cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje białko fuzyjne jak zdefiniowano w zastrz. 1, 11 lub 12.

14. Cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje białko fuzyjne jak zdefiniowano w zastrz. 2-10.

15. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 14, znamienna tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego ma sekwencję nukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydową SEQ ID nr 53.

16. Sposób wytwarzania białka fuzyjnego aktywatora przezbłonowego i modulatora wapnia i interaktora ligandu cyklofiliny (TACI)-immunoglobulina, znamienny tym, że sposób ten obejmuje ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową, która koduje wspomniane białko fuzyjne, przy czym to wspomniane białko fuzyjne zawiera:

(i) reszt aminokwasowych 34 do 104 w SEQ ID nr 2;

17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że wspomniane białko fuzyjne TACI-immunoglobulina składa się lub zawiera białko fuzyjne TACI-Fc.

18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że wspomniane białko fuzyjne TACI-immunoglobulina jest ludzkim immunoglobulinowym białkiem fuzyjnym Fc.

PL 219 013 B1

19. Sposób według zastrz. 16-18, znamienny tym, że cząstka immunoglobuliny składa się z regionu zawiasowego ciężkiego łańcucha immunoglobuliny połączonego mostkiem dwusiarczkowym i domen CH2 i CH3.

20. Sposób według zastrz. 16-18, znamienny tym, że cząstka immunoglobuliny jest cząstką Fc immunoglobuliny IgG1.

21. Sposób według zastrz. 16-18, znamienny tym, że cząstka immunoglobuliny składa się z lub zawiera cząstką Fc immunoglobuliny IgG1 wybraną z grupy składającej się z Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 lub Fc8, korzystnie gdzie wspomniana cząstka immunoglobuliny zawiera cząstkę Fc5 immunoglobuliny.

22. Sposób według zastrz. 16-21, znamienny tym, że białko fuzyjne TACI-immunoglobulina składa się lub zawiera wydzieloną postać którejkolwiek z SEQ ID nr 50, 52, 54 lub 56.

23. Sposób według zastrz. 16-21, znamienny tym, że białko fuzyjne TACI-immunoglobulina składa się lub zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 50, 52, 54 lub 56, gdzie sekwencja liderowa (tPA) optymalizowana (otPA) (SEQ ID nr 25) została usunięta.

24. Sposób według zastrz. 16-23, znamienny tym, że sposób ten obejmuje ekspresje sekwencji kwasu nukleinowego, która koduje wspomniane białko fuzyjne w komórce gospodarza; przy czym korzystnie wspomnianą komórką gospodarza jest komórka jajnika chomika mongolskiego.

25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że komórka jajnika chomika mongolskiego pozbawiona jest funkcjonalnego genu reduktazy dihydrofolianu.

26. Sposób według zastrz. 24 lub 25, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa, która koduje białko fuzyjne TACI-immunoglobulina jest transfekowana do komórki gospodarza z wytworzeniem wektora ekspresji.

27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że wektor ekspresji zawiera plazmid ekspresji; gdzie korzystnie plazmid ekspresji zawiera promotor CMV i segment SV40 poliA.

28. Sposób według zastrz. 24-27, znamienny tym, że wzrost komórek gospodarza w obecności wzrastającego stężenia metotreksatu powoduje amplifikację genu reduktazy dihydrofilianu i przyłączonej sekwencji kodującej białko fuzyjne TACI-immunoglobulina.

29. Zastosowanie białka fuzyjnego aktywator przezbłonowy i modulator wapnia i interaktor ligandu cyklofiliny (TACI)-immunoglobulina do wytwarzania leku do leczenia toczenia rumieniowatego układowego, przy czym białko TACI-immunoglobulina zawiera:

(i) reszt aminokwasowych 34 do 104 w SEQ ID nr 2;

30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że cząsteczka immunoglobuliny zawiera region stały domeny immunoglobuliny.

31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że lek zawiera białko fuzyjne TACI-immunoglobulina i farmaceutycznie akceptowalny nośnik, i przy czym ta kompozycja farmaceutyczna jest do stosowana u ssaka.

32. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że cząstka receptora TACI składa się z reszt aminokwasowych 34 do 104 w SEQ ID nr 2, przy czym białko fuzyjne zawiera ponadto segment szypułowy składający się z ciągłych serii leczenia tocznia rumieniowatego układowego, następujących po sobie 2 do 50 reszt aminokwasowych rozpoczynających się od reszty aminokwasowej 105 w SEQ ID nr 2.

33. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że cząstka immunoglobuliny zawiera domenę regionu stałego łańcucha ciężkiego.

34. Zastosowanie według zastrz. 33, znamienne tym, że cząstka immunoglobuliny zawiera domenę regionu stałego ludzkiego łańcucha ciężkiego.

35. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że region stały łańcucha ciężkiego jest domeną regionu stałego łańcucha ciężkiego IgG1.

36. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że cząstka immunoglobuliny jest fragmentem Fc IgG1, który zawiera domeny CH2 i CH3.

PL 219 013 B1

37. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że cząstka immunoglobuliny jest fragmentem Fc IgG1 zawierającym sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 33.

38. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że białko fuzyjne TACI-immunoglobulina zawiera sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 54.

39. Zastosowanie według zastrz. 30-38, znamienne tym, że białko fuzyjne TACI-immunoglobulina jest dimerem.

40. Zastosowanie według zastrz. 30-39, znamienne tym, że lek jest do podawania komórkom w hodowli in vitro.

41. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że stosowanie prowadzi się w stosunku do ssaka.

42. Zastosowanie według zastrz. 29 i 41, znamienne tym, że białko fuzyjne TACI-immunoglobulina składa się lub zawiera białko fuzyjne TACI-Fc; korzystnie gdzie wspomniane białko fuzyjne TACI-Fc jest białkiem fuzyjnym ludzkiej immunoglobuliny Fc.

43. Zastosowanie według zastrz. 29, 41 i 42, znamienne tym, że wspomniana cząstka immunoglobuliny składa się z regionu zawiasowego ciężkiego łańcucha immunoglobuliny połączonego mostkiem dwusiarczkowym i domen CH2 i CH3.

44. Zastosowanie według zastrz. 29, 41, 42 lub 43, znamienne tym, że cząstka immunoglobuliny jest cząstką Fc immunoglobuliny Ig1.

45. Zastosowanie według zastrz. 29, 41-44, znamienne tym, że wspomniana cząstka immunoglobuliny składa się lub zawiera cząstkę Fc immunoglobuliny wybraną z grupy składającej się z Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 lub Fc8; przy czym korzystnie cząstka immunoglobuliny składa się lub zawiera cząstkę Fc5 immunoglobuliny.

46. Zastosowanie według zastrz. 29, 41-45, znamienne tym, że białko fuzyjne TACI-immunoglobulina składa się lub zawiera wydzielone postacie którejkolwiek z SEQ ID nr 50, 52, 54 lub 56.

47. Zastosowanie według zastrz. 29, 41-46, znamienne tym, że białko fuzyjne TACI-immunoglobulina składa się lub zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 50, 52, 54 lub 56, gdzie sekwencje liderowa (tPA) optymalizowana (otPA) (SEQ ID nr 25) została usunięta.

48. Zastosowanie według zastrz. 29, 41-47, znamienne tym, że białko fuzyjne TACI-immunoglobulina jest dimerem.

49. Zastosowanie według zastrz. 29, 41-48, znamienne tym, że białko fuzyjne jest do podawania do komórek w hodowli in vitro.

50. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie akceptowalny nośnik i białko fuzyjne aktywator przezbłonowy i modulator wapnia i interaktor ligandu cyklofiliny (TACI)-immunoglobulina, przy czym białko fuzyjne TACI-immunoglobulina posiada sekwencję, aminokwasową zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 54.

51. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 50, znamienna tym, że białko fuzyjne TACI-immunoglobulina jest dimerem.