ES2749716T3 - Métodos de despliegue de proteínas que contienen dominios Fc no covalentes sobre la superficie de células y métodos de selección de las mismas - Google Patents

Métodos de despliegue de proteínas que contienen dominios Fc no covalentes sobre la superficie de células y métodos de selección de las mismas Download PDF

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Abstract

Método para el despliegue de proteínas sobre la superficie de una célula huésped, comprendiendo el método: (a) introducir en una célula huésped al menos uno o más polinucleótidos que codifican una proteína de interés que se desea desplegar sobre la superficie de dicha célula huésped, en el que la proteína de interés comprende al menos un dominio Fc; (b) poner en contacto la superficie de dicha célula huésped con una cebadora etiqueta, donde dicha cebadora etiqueta es biotina, un derivado de biotina o un análogo de biotina o se une covalentemente a la superficie de dicha célula huésped; (c) poner en contacto la superficie de dicha célula huésped de (b) con una segunda etiqueta, donde la segunda etiqueta se une específicamente y no de forma covalente a dicha cebadora etiqueta y a dicha proteína de interés codificada por dichos al menos uno o más polinucleótidos, donde la segunda etiqueta es una proteína multimérica, que es o comprende una de entre proteína A, proteína L, proteína G, fusión de proteínas A-G, dominios E, D, A, B de la proteína A, fusionada con avidina, estreptavidina, neutravidina; (d) expresar dicho al menos uno o más polinucleótidos en dicha célula huésped en condiciones suficientes para la secreción de dicha proteína de interés codificada por el al menos uno o más polinucleótidos; (e) poner en contacto dichas células huésped de la etapa (d) con medios para detectar específicamente dicha proteína de interés unida no covalentemente mediante dicha segunda etiqueta y detectar las células huésped que despliegan la proteína de interés sobre su superficie, donde el medio para detectar específicamente dicha proteína de interés es uno de entre un anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, scFv-Fc, scFv, (Fab')2, Fab, minianticuerpo, dianticuerpo o anticuerpo VHH; opcionalmente acoplado a una etiqueta adicional y donde la etiqueta adicional es una etiqueta fluorescente o radioisótopo.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de despliegue de proteínas que contienen dominios Fc no covalentes sobre la superficie de células y métodos de selección de las mismas.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al despliegue de proteínas como anticuerpos monoclonales sobre la superficie de células huésped y métodos para la selección de las mismas. En particular, la presente invención se refiere a la selección de anticuerpos o bibliotecas de anticuerpos o proteínas de fusión que contienen dominios Fc desplegadas sobre la superficie de células huésped y métodos para la identificación y selección de proteínas que contienen dominios Fc del fenotipo deseado. Los métodos de la invención son especialmente útiles para el cribado de bibliotecas de inmunoglobulinas en células huésped eucariotas que expresan una inmunoglobulina y fragmentos de la misma.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Se utilizan grandes cantidades de recursos a nivel académico y en la industria farmacéutica en el descubrimiento y desarrollo de anticuerpos monoclonales para terapias dirigidas. Entre las tecnologías desarrolladas disponibles hasta el momento, las técnicas de alto rendimiento para el cribado de bibliotecas de anticuerpos han permitido la identificación de nuevas moléculas candidatas y la rápida optimización de los ligantes preseleccionados mediante maduración de la afinidad.
Puesto que la identificación de nuevas moléculas candidatas está impulsada en gran medida por la tecnología, la invención de nuevas y potentes tecnologías de cribado ha demostrado ser una parte fundamental en una estrategia general para acelerar aún más el proceso de descubrimiento y desarrollo de anticuerpos. Han surgido diversas tecnologías de despliegue in vitro desde la aparición de las tecnologías de despliegue de fagos a mediados de los años 80 y su aplicación al despliegue de anticuerpos. Además del despliegue de fagos, existen cuatro tecnologías de despliegue principales referidas al despliegue celular, despliegue ribosómico, despliegue de ARNm y despliegue de ADN, siendo el despliegue de fagos la más establecida.
El despliegue de fagos es en la actualidad el método más extendido para el despliegue y selección de grandes conjuntos de anticuerpos y la manipulación genética adicional de anticuerpos seleccionados. Normalmente los anticuerpos se despliegan en lo que se conoce como el formato «monovalente», en el que el gen de fusión anticuerpo-proteína de recubrimiento se transporta en un vector fagémido y el despliegue se realiza mediante infección de la bacteria portadora del fagémido con un fago auxiliar. Este formato, también conocido como el formato 3 x 3, es el preferido principalmente debido a que la construcción de bibliotecas en vectores fagémidos ofrece una mayor eficiencia de transformación de los vectores fagémidos en comparación con los vectores de fagos, ya que proporciona la selección de los ligantes de mayor afinidad, que no están sesgados por efectos de avidez (Saggy y cols. [2012] Protein Eng. Des. Sel. 25, 539-549).
Entre las aplicaciones más exitosas del despliegue de anticuerpos en fagos se incluyen por ejemplo el aislamiento de novo de anticuerpos humanos de alta afinidad a partir de bibliotecas no inmunes y sintéticas, que incluye anticuerpos frente a autoantígenos, la generación de anticuerpos de alta afinidad con afinidad picomolar mediante maduración de la afinidad in vitro y el descubrimiento de anticuerpos con propiedades exclusivas a partir de bibliotecas no inmunes e inmunes de donantes animales y humanos (Hogenboom [2005] Nat. Biotech 23, 1105­ 1116).
A pesar de las ventajas del despliegue de anticuerpos en fagos, esta tecnología también presenta desventajas que limitan su uso: En E. coli, la secreción eficaz de fragmentos de anticuerpo funcionales en el espacio periplásmico típicamente requiere la expresión conjunta de chaperonas e isomerasas para evitar un mal plegamiento y la agregación de fragmentos de anticuerpo debido a la capacidad de secreción limitada (Bothmann y Plütkthun [2000], J. Biol. Chem. Vol. 275 [22], 17100-17105). Además, parece haber una selección biológica contra un número impar de cisteínas, series de cargas positivas y determinados restos en posiciones fijas dentro del péptido desplegado, lo que tiene como consecuencia una selección de fragmentos de anticuerpos inherentemente sesgada.
La segunda tecnología utilizada con mayor frecuencia es el despliegue de levaduras, que es una tecnología sólida para seleccionar y modificar por ingeniería genética fragmentos de anticuerpos a partir de bibliotecas combinatorias. Las tecnologías de despliegue de levaduras presentan ventajas para la expresión de moléculas oligoméricas, como por ejemplo, las inmunoglobulinas IgG de longitud completa, ya que los anticuerpos tienen que pasar la vía de secreción eucariota en comparación con los anticuerpos expresados en bacterias, lo que tiene como resultado un número total mayor de inmunoglobulinas plegadas correctamente.
El despliegue de levaduras utiliza la presencia de varias proteínas naturales de anclaje a la pared celular que pueden utilizarse para dirigir proteínas heterólogas hacia la superficie celular más externa mediante la unión de una señal de unión glucosilfosfatidilinositol C-terminal denominada normalmente anclaje GPI. Inicialmente, el despliegue de levaduras se basa en la fusión genética de secuencias de ADN que codifican anticuerpos dentro del marco de lectura con la secuencia de una manoproteína de la pared celular de levaduras (Doerner y cols. [2014], FEBS Letters 588, 278-287). El repertorio de proteínas, que se utilizan para el despliegue en superficie se expandió y ahora incluye, por ejemplo aglutinina-a, Flo1p y aglutinina-a. Entre estos, el sistema que utiliza la aglutinina-a es el que se utiliza con mayor frecuencia.
La aglutinina-a es una de las dos aglutininas específicas de tipo de apareamiento que median en el contacto entre células durante el apareamiento de células de levadura apropiadas. Está formada por una subunidad central Aga1p, que se une a una subunidad de unión más pequeña Aga2p a través de dos puentes disulfuro. Debido a la señal de unión GPI de Aga1p la subunidad central ancla covalentemente el complejo Aga a la pared celular. La estructura modular de la aglutinina-a permite además la fusión de la proteína heteróloga que se va a desplegar en los extremos C o N-terminales de Aga2p en comparación con las proteínas ancladas a GPI de unidad sencilla que solo permiten la fusión N-terminal de proteínas heterólogas, debido a la señal de unión GPI C-terminal requerida. Los sistemas basados en Flo1p difieren en que pueden unir e inmovilizar proteínas heterólogas no covalentemente mediante la fusión al dominio funcional de floculación N-terminal que se cree se une a unidades de hidrato de carbono en la superficie celular.
La sobreexpresión de AGA1 codificada a nivel cromosómico y de las proteínas de fusión AGA2 codificadas a nivel del episoma está dirigida típicamente por el promotor Gal10 inducible, lo que explica los niveles de expresión estequiométrica de ambas subunidades que se asocian en el retículo endoplásmico. La expresión inducida por galactosa da lugar al despliegue de aproximadamente 104-105 copias de la proteína de fusión sobre la superficie de una célula huésped (Doerned y cols. [2014], FEBS Letters 588, 278-287, Boder y Witrup [1997] Nat. Biotechnol. 15, 553-557). La detección de proteínas de fusión expuestas en la superficie se produce en virtud de etiquetas epítopo o por medio de su actividad, que en el caso de un anticuerpo es su afinidad de unión a un antígeno soluble. La detección se lleva a cabo típicamente con el antígeno respectivo biotinilado y un reactivo secundario como fluoróforos conjugados a estreptavidina, o un antígeno marcado de cualquier otro modo. En el documento WO2014/106527 A1 se describe un método para la producción de anticuerpos secretables mediante su expresión en Saccharomyces cerevisiae y el despliegue en superficie no covalente utilizando aga1p/aga2p.
El uso de estreptavidina y proteína A para la captura y despliegue de moléculas se ha descrito en la técnica previa, por ejemplo, en el documento WO 97/19957 A1 y en Ohno y cols. (1996) Biochemical and Molecular Medicine Vol.
58, 227-233 se describen sistemas de administración de compuestos usando proteínas de fusión de estreptavidinaproteína A. En el documento US 5328985 se describen proteínas quiméricas recombinantes de estreptavidinaproteína A que permiten la conjugación de moléculas de anticuerpo con materiales biológicos. En Sano y cols. Biotechnology (1991) Vol. 9, 1378-1381 se describe una quimera de estreptavidina-proteína A que permite la producción en una etapa de diversos conjugados de anticuerpo específicos.
En un método se modificó el despliegue de levaduras, lo que se conoce como despliegue de secreción y captura en la superficie celular, para la selección de proteínas de unión a diana (SECANT™, Rakestraw y cols. [2011] Protein Eng Des Sel. Jun;24[6]:525-30). Esta tecnología se utilizó con éxito para desplegar anticuerpos inmunoglobulina G (IgG) de longitud completa sobre la superficie de las células de levadura. En la tecnología SECANT™ la proteína de interés (PDI) se fusiona genéticamente al péptido aceptor de biotina (biotin acceptorpeptide, BAP) pequeño seguido de un sitio de escisión de la proteasa TEV para facilitar su purificación. El péptido TEV-BAP puede fusionarse al extremo N o C-terminal de la PDI. En el extremo de la PDI opuesto a la etiqueta TEV-BAP, la PDI se fusiona genéticamente a una etiqueta, que típicamente es una etiqueta FLAG, por lo cual, el gen completo de BAP, PDI y etiqueta FLAG se localiza en posición 3' con respecto a una señal secretora de levadura, típicamente la secuencia líder genéticamente modificada de aMFpp8, la secuencia líder de la invertasa o una secuencia líder sintética, la cual va seguida de un sitio de escisión proteolítico Kex2 (Rakestraw y cols. [2011] Protein Eng Des Sel. Jun;24[6]:525-30). Para la selección de una PDI, el gen de la PDI se expresa como una fusión N o C-terminal con un BAP, que se expresa conjuntamente con ligasa biotina BirA y chaperonas. La biotina ligasa BirA biotinila la etiqueta BAP de la PDI. Tras la secreción, la PDI se une a la avidina localizada en superficie y puede marcarse con anticuerpos antiepítopo marcados con fluoróforo o un antígeno marcado con fluoróforo para sus posteriores detección y selección.
Aunque la tecnología SECANT permite la secreción y la selección de moléculas complejas como inmunoglobulinas IgG, esta tecnología sigue requiriendo la modificación genética de una PDI y la coexpresión de una biotina ligasa, lo que añade etapas adicionales a los procedimientos de cribado y selección.
Además de la continua demanda de despliegue de levaduras y, en particular, de despliegue de moléculas complejas y su uso en la identificación y maduración de anticuerpos, también existe una continua necesidad de reducción de los costes y del tiempo asociado con el proceso de selección para identificar nuevos candidatos a anticuerpos.
Por tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar un método que permita el despliegue de moléculas complejas sobre la superficie de células huésped para la identificación de una proteína de interés, sin la necesidad de proteínas de anclaje codificadas genéticamente o la modificación intracelular de anticuerpos.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente un método para desplegar, detectar y seleccionar proteínas de interés del fenotipo deseado sobre la superficie de células huésped, en el que el método de la invención no requiere modificación genética de la proteína de interés.
En una primera realización, la presente invención proporciona un método para el despliegue sobre la superficie de una célula huésped, en el que el método comprende las siguientes etapas:
(a) Introducir en una célula huésped al menos uno o más polinucleótidos que codifican una proteína de interés que se quiera desplegar sobre la superficie de dicha célula huésped;
(b) Poner en contacto la superficie de dicha célula huésped con una primera etiqueta;
(c) Poner en contacto la superficie de dicha célula huésped de (b) con una segunda etiqueta, donde la segunda etiqueta se une específicamente y no de forma covalente a dicha primera etiqueta y a dicha proteína de interés codificada por dichos al menos uno o más polinucleótidos;
(d) Expresar dichos al menos uno o más polinucleótidos en dicha célula huésped en condiciones suficientes para la secreción de dicha proteína de interés codificada por el al menos uno o más polinucleótidos;
(e) Poner en contacto dichas células huésped de la etapa (d) con medios para detectar específicamente dicha proteína de interés unida no covalentemente mediante dicha segunda etiqueta y detectar las células huésped que despliegan la proteína de interés en su superficie.
Según una realización de la invención, la proteína codificada por el al menos uno o más polinucleótidos es un monómero o un multímero.
Según una realización de la invención, la proteína codificada por el al menos uno o más polinucleótidos comprende un péptido señal.
En otra realización, la primera etiqueta utilizada en el método de la invención se une covalentemente a la superficie de la célula huésped.
Según una realización, la primera etiqueta utilizada en el método de la invención es biotina o un derivado de biotina. En otra realización, la segunda etiqueta utilizada en el método de la invención es una proteína adicional o un polipéptido adicional.
En una realización, la proteína adicional o el péptido adicional que es la segunda etiqueta del método de la invención es una proteína multimérica.
En una realización, la segunda etiqueta del método de la invención es o comprende uno de entre proteína A, proteína L, proteína G, fusión de proteínas A-G, dominios E, D, A, B de la proteína A, fusionados con la avidina, estreptavidina o sus variantes de secuencia.
Según una realización, la célula huésped del método de la invención se selecciona entre células de mamífero, levadura o insecto como se describe en este documento.
En una realización, los medios para la detección específica de dicha proteína de interés en el método de la invención se seleccionan a partir del grupo que comprende anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, puntos cuánticos, enzimas, fluoróforos o colorantes intercalantes, y gangliósidos.
En una realización, los medios para la detección específica de dicha proteína de interés en el método de la invención pueden ser uno de entre un anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, scFv-Fc, scFv, (Fab')2, Fab, minianticuerpo, dianticuerpo o anticuerpo VHH; todos los cuales pueden estar acoplados opcionalmente a una etiqueta adicional.
En una realización, el método de la invención como se describe anteriormente comprende además la etapa de seleccionar las células huésped, por ejemplo, las células detectadas en la etapa (d) del método de la invención. Según una realización, las células huésped seleccionadas en el método de la invención como se describe anteriormente despliegan una proteína de interés de fenotipo alterado.
Según una realización, el fenotipo alterado de la proteína de interés según la invención es uno de nivel de expresión en superficie, estabilidad de la proteína, plegamiento de proteínas o afinidad.
En una realización, el fenotipo alterado de la proteína de interés en el método de la invención se determina comparando dichas células huésped de la etapa (e) del método de la invención con una muestra de referencia. En una realización, la proteína codificada por el al menos uno o más polinucleótidos de la etapa (a) del método de la invención comprende al menos un dominio Fc como se describe en este documento.
En una realización preferida, el al menos un dominio Fc según la invención como se describe anteriormente es uno de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG2a murina, IgG2b murina o IgG3 murina, o sus variantes de secuencia.
En una realización preferida, la proteína que contiene el dominio Fc según la invención es una proteína de fusión del domino Fc N-terminal, proteína de fusión del dominio Fc C-terminal o un anticuerpo.
En una realización preferida, el anticuerpo codificado por los polinucleótidos de la etapa (a) del método de la invención es un anticuerpo monoclonal, preferiblemente el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal murino, un anticuerpo monoclonal quimérico ratón-humano, un anticuerpo monoclonal humanizado o un anticuerpo monoclonal humano.
Según una realización, la segunda etiqueta del método de la invención se une específicamente a los dominios Fc de la IgG1 humana, IgG2 humana, IgG2a murina, IgG2b murina o IgG3 murina.
En una realización, la segunda etiqueta del método de la invención como se describe anteriormente comprende la secuencia de aminoácidos según la SEC ID N.° 1 y/o la secuencia de aminoácidos según la SEC ID N.° 2.
En una realización, la segunda etiqueta del método de la invención comprende la secuencia de aminoácidos según la SEC ID N.° 3.
En una realización preferida, la etapa (e) del método de la invención como se describe anteriormente comprende además:
(i) poner en contacto dicha célula huésped con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo detectablemente marcado, que se une específicamente a los dominios Fc de la IgG1 humana, IgG2 humana, IgG2a murina, IgG2b murina o IgG3 murina, o sus variantes de secuencia;
(ii) poner en contacto la célula huésped con un antígeno y/o epítopo del anticuerpo unido a la segunda etiqueta, que está acoplada a una etiqueta detectable adicional distinta de la etiqueta utilizada en (i); (iii) detectar las etiquetas de (i) y/o (ii) sobre dichas células huésped;
(iv) seleccionar células huésped que desplieguen cantidades alteradas de la etiqueta utilizada en (i), y/o la etiqueta utilizada en (ii) y/o que desplieguen cantidades alteradas de ambas etiquetas en comparación con una muestra de referencia.
En una realización preferida el anticuerpo o fragmento de anticuerpo detectablemente marcado de la etapa (e) (i) según la invención se une específicamente a las cadenas ligeras kappa o lambda de IgG1 humana o murina, IgG2 humana, IgG2a murina, IgG2b murina o IgG3 murina, o sus variantes de secuencia.
En una realización preferida, las etiquetas de (i) y (ii) y/o la etapa de selección (iv) del método de la invención comprenden citometría de flujo y/o FACS y/o tecnología de microfluidos.
Según una realización, pueden repetirse las etapas (a)-(e) del método de la invención como se describe en este documento.
En una realización, la célula huésped utilizada en el método de la invención es una célula de levadura y la etapa (a) del método de la invención comprende además el apareamiento de al menos una primera y una segunda células de levadura, en el que dicha primera y segunda células huésped comprenden polinucleótidos diferentes de los que al menos uno codifica una proteína de fusión que contiene un dominio Fc y en el que dichos polinucleótidos de dichas primera y segunda células huésped comprenden al menos un marcador seleccionable diferente.
En una realización, dicha primera célula de levadura utilizada en el método de la invención anterior comprende polinucleótidos que codifican cadenas ligeras de inmunoglobulina y/o en el que dicha segunda célula de levadura utilizada en el método de la invención comprende polinucleótidos que codifican cadenas pesadas de inmunoglobulina.
En una realización del método de la invención, dicha primera célula de levadura comprende polinucleótidos que codifican una biblioteca de cadenas ligeras de inmunoglobulina y en el que dicha segunda célula de levadura comprende polinucleótidos que codifican cadenas pesadas de inmunoglobulina de afinidad predeterminada por la proteína de interés.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: (A ) Análisis en gel con azul de Coomassie que muestra el tetrámero SA-ZZ (pocillo 4) y el monómero nativo y el tetrámero (pocillo 3). (B) Análisis por inmunotransferencia que muestra SA-Zz unido a IgG (izquierda) y la proteína biotinilada (derecha). El tamaño aparente del monómero es de 31 kDa (pocillo 3) y el del tetrámero es de 91 kDa (pocillo 2).
Figura 2: Análisis con el sistema Octet para la unión de SA-ZZ a una IgG capturada sobre los extremos de captura anti-Fc humano (extremos AHC) (izquierda) y de SA-ZZ a h Rp biotilinada capturada en los extremos de estreptavidina (derecha).
Figura 3: Ilustración esquemática de células huésped modificadas mediante REAL-Select con el propósito de despliegue en la superficie celular de anticuerpos endógenos. Las células huésped portadoras de plásmidos que codifican un anticuerpo se biotinilan en primer lugar mediante el uso de un reactivo de biotinilación comercial (A). Esta modificación va seguida del marcaje de las células con la proteína de fusión recombinante estreptavidina-ZZ (SA-ZZ) (B), que permite la recaptura de anticuerpos secretados en la superficie celular (C).
Figura 4: Valoración de los reactivos para el marcaje con biotina y la inmovilización de SA-ZZ sobre las células de levadura. Las respectivas señales fluorescentes indirectas se analizaron mediante citometría de flujo. (A) Se marcaron 1 * 107 células con 1 mg a 6 mg de reactivo de biotina y se tiñeron con estreptavidina-Dylight633. (B) Se incubaron 1 * 107 células marcadas con 1 mg de biotina con 2, 3 o 4 pg de SA-ZZ para la inmovilización del resto de captura de Fc. Posteriormente el dominio ZZ en la superficie se detectó usando un anticuerpo de cabra anti-proteína A conjugado con FITC.
Figura 5: Fenotipo de células de levadura funcionalizadas con REAL-Select de tres anticuerpos monoclonales (AcMos) diferentes analizados mediante citometría de flujo. (A) Anti-cMet-B10, (B) adalimumab, (C) matuzumab y los respectivos controles sin (D) cMet, (E) TNFa, (F) EGFR. El despliegue de anticuerpos funcionales se detectó usando el correspondiente anticuerpo marcado con fluorescencia (tabla 1) y un anticuerpo de detección de Fc específicos (despliegue de IgG).
Figura 6: Análisis por citometría de flujo de la saturación del dominio de captura de células de levadura funcionalizadas con REAL-Select. (A) Células recubiertas de SA-ZZ portadoras de plásmidos para las cadenas ligera y pesada de matuzumab, (B) captura en superficie de matuzumab (anticuerpo azul) o golimumab añadido externamente (anticuerpo rojo). (C-E) Análisis de células de levadura recubiertas con la proteína de fusión SA-ZZ con anticuerpo de cabra antiproteína A conjugado con FITC 0, 6 y 20 horas después de recubrir la superficie y de inducir la expresión de matuzumab. (F-H) Detección de dominios de captura de Fc no ocupados mediante incubación de las células con golimumab seguido de marcaje con TNFa-Dylight650 en puntos temporales indicados. (I, J) Control del despliegue en superficie de matuzumab recapturado mediante el marcaje de las células con F(ab')2 de cabra anti-Fc conjugado con AlexaFluor647 a las 6 y 20 horas de expresión.
Figura 7: Análisis por FACS de enriquecimiento REAL-Select de células que despliegan matuzumab. Las células de levadura funcionalizadas que despliegan (A) matuzumab o (B) trastuzumab se mezclaron en una relación 1:1000000 (C) y se marcaron usando EGFR-PE y F(ab')2 de cabra anti-Fc conjugado con AlexaFluor647. (C-F) Las células que despliegan matuzumab se enriquecieron mediante FACS durante cuatro rondas consecutivas de clasificación.
Figura 8: Fenotipo de células de levadura de la biblioteca de CDR-H3 y estrategia de selección para la maduración de afinidad de un anticuerpo específico de cMet durante tres rondas de cribado mediante

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Método para el despliegue de proteínas sobre la superficie de una célula huésped, comprendiendo el método:
(a) introducir en una célula huésped al menos uno o más polinucleótidos que codifican una proteína de interés que se desea desplegar sobre la superficie de dicha célula huésped, en el que la proteína de interés comprende al menos un dominio Fc;
(b) poner en contacto la superficie de dicha célula huésped con una cebadora etiqueta, donde dicha cebadora etiqueta es biotina, un derivado de biotina o un análogo de biotina o se une covalentemente a la superficie de dicha célula huésped;
(c) poner en contacto la superficie de dicha célula huésped de (b) con una segunda etiqueta, donde la segunda etiqueta se une específicamente y no de forma covalente a dicha cebadora etiqueta y a dicha proteína de interés codificada por dichos al menos uno o más polinucleótidos, donde la segunda etiqueta es una proteína multimérica, que es o comprende una de entre proteína A, proteína L, proteína G, fusión de proteínas A-G, dominios E, D, A, B de la proteína A, fusionada con avidina, estreptavidina, neutravidina;
(d) expresar dicho al menos uno o más polinucleótidos en dicha célula huésped en condiciones suficientes para la secreción de dicha proteína de interés codificada por el al menos uno o más polinucleótidos; (e) poner en contacto dichas células huésped de la etapa (d) con medios para detectar específicamente dicha proteína de interés unida no covalentemente mediante dicha segunda etiqueta y detectar las células huésped que despliegan la proteína de interés sobre su superficie, donde el medio para detectar específicamente dicha proteína de interés es uno de entre un anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, scFv-Fc, scFv, (Fab')2, Fab, minianticuerpo, dianticuerpo o anticuerpo VHH; opcionalmente acoplado a una etiqueta adicional y donde la etiqueta adicional es una etiqueta fluorescente o radioisótopo.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la proteína codificada por el al menos uno o más polinucleótidos es un monómero o un multímero.
3. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la proteína codificada por el al menos uno o más polinucleótidos comprende un péptido señal.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la célula huésped se selecciona entre células de mamífero, levadura o insecto.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el método además comprende seleccionar las células huésped, en el que las células huésped seleccionadas despliegan la proteína de interés de fenotipo alterado.
6. Método según la reivindicación 5, en el que el fenotipo alterado es uno de entre nivel de expresión en superficie, estabilidad de la proteína, plegamiento de la proteína o afinidad.
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el fenotipo alterado se determina comparando dichas células huésped de la etapa (e) con una muestra de referencia.
8. Método según la reivindicación 7, en el que el al menos un homodímero del dominio Fc es uno de entre IgG1 humana, IgG2 humana, IgG2a murina, IgG2b murina o IgG3 murina, o sus variantes de secuencia.
9. Método según la reivindicación 7, en el que la proteína que contiene el dominio Fc es una proteína de fusión del dominio Fc N-terminal, proteína de fusión del dominio Fc C-terminal o un anticuerpo.
10. Método según la reivindicación 9, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
11. Método según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal murino, anticuerpo monoclonal quimérico ratón-humano, anticuerpo monoclonal humanizado o anticuerpo monoclonal humano.
12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la segunda etiqueta se une específicamente a los dominios Fc de la IgG1 humana, IgG2 humana, IgG2a murina, IgG2b murina o IgG3 murina.
13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la segunda etiqueta comprende la secuencia de aminoácidos según la SEC ID N.° 1 y/o la secuencia de aminoácidos según la SEC ID N.° 2.
14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la segunda etiqueta comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.° 3.
15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que la detección de la etapa (e) además comprende:
(i) poner en contacto dicha célula huésped con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo detectablemente marcado, que se une específicamente a los dominios Fc de la IgG1 humana, IgG2 humana, IgG2a murina, IgG2b murina o IgG3 murina, o sus variantes de secuencia, o se une específicamente a cadenas ligeras kappa o lambda de IgG1 humana o murina, IgG2 humana, IgG2a murina, IgG2b murina o IgG3 murina, o sus variantes de secuencia; poner en contacto la célula huésped con un antígeno y/o epítopo unido específicamente al anticuerpo unido a la segunda etiqueta, que está acoplada a una etiqueta detectable adicional distinta de la etiqueta utilizada en (i);
(ii) detectar las etiquetas de (i) y/o (ii) sobre dichas células huésped;
(iii) seleccionar células huésped que desplieguen cantidades alteradas de la etiqueta utilizada en (i), y/o la etiqueta utilizada en (ii) y/o que desplieguen cantidades alteradas de ambas etiquetas en comparación con una muestra de referencia.
16. Método según la reivindicación 15, en el que las etiquetas de (i) y (ii) y/o la etapa de selección (iv) comprenden citometría de flujo y/o FACS y/o tecnología de microfluidos, en el que se repiten las etapas (a)-(e).
17. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que la célula huésped es una célula de levadura y en el que la etapa (a) comprende además el apareamiento de al menos una cebadora y segunda célula de levadura, en el que dicha cebadora y segunda célula de levadura comprenden polinucleótidos diferentes de los que al menos uno codifica una proteína de fusión que contiene un dominio Fc y en el que dichos polinucleótidos de dichas cebadora y segunda célula huésped comprenden al menos un marcador seleccionable diferente.
18. Método según la reivindicación 17, en el que dicha cebadora célula de levadura comprende polinucleótidos que codifican cadenas ligeras de inmunoglobulina y/o en el que dicha segunda célula de levadura comprende polinucleótidos que codifican cadenas pesadas de inmunoglobulinas.
19. Método según la reivindicación 18, en el que dicha cebadora célula de levadura comprende polinucleótidos que codifican una biblioteca de cadenas ligeras de inmunoglobulina y en el que dicha segunda célula de levadura comprende polinucleótidos que codifican cadenas pesadas de inmunoglobulina de afinidad predeterminada por la proteína de interés.
20. Uso de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos según la SEC ID N.° 3 en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-19.
21. Método según la reivindicación 1, en el que la segunda etiqueta comprende proteínas de pollo relacionadas con avidina (AVR, p. ej., AVR4), avidina de cadena doble (dcAcd), mutante Y33H de avidina, mutante H117C de avidina, mutante [W110K] [N54A] de avidina, mutante V47G de estreptavidina, mutante S112F de estreptavidina, mutante S112R de estreptavidina o mutante S112K de estreptavidina.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018041740A1 (en) * 2016-09-01 2018-03-08 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Non-covalent display system using fimgt/dsf
WO2020177719A1 (zh) * 2019-03-05 2020-09-10 信达生物制药(苏州)有限公司 展示与分泌目的多肽的酵母展示系统及其用途
WO2021057726A1 (zh) * 2019-09-23 2021-04-01 南开大学 利用哺乳动物展示筛选FcγR特异性结合Fc
CN113136400B (zh) * 2020-01-17 2022-09-09 普莱柯生物工程股份有限公司 一种表达外源蛋白的cho细胞株的构建方法及其应用
WO2023051972A1 (en) 2021-09-29 2023-04-06 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Method for the generation and selection of a producer cell
CN114107390B (zh) * 2021-11-05 2023-10-24 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 一种用于表达抗体IgG1的rAAV载体及其应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5328985A (en) * 1991-07-12 1994-07-12 The Regents Of The University Of California Recombinant streptavidin-protein chimeras useful for conjugation of molecules in the immune system
US6497881B1 (en) * 1995-11-30 2002-12-24 New York University High efficiency tissue specific compound delivery system using streptavidin-protein a fusion protein
BRPI0209933B8 (pt) 2001-05-24 2021-05-25 Zymogenetics Inc proteína de fusão, e, molécula de ácido nucleico
WO2008028218A1 (en) * 2006-09-05 2008-03-13 Innovative Purification Technologies Pty Ltd Affinity separation methods and systems
WO2008118476A2 (en) 2007-03-26 2008-10-02 Codon Devices, Inc. Cell surface display, screening and production of proteins of interest
HUE032930T2 (hu) * 2007-11-12 2017-11-28 Chreto Aps Kettõs affinitású polipeptidek tisztításhoz
US8067339B2 (en) 2008-07-09 2011-11-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Surface display of whole antibodies in eukaryotes
WO2014100913A1 (en) 2012-12-24 2014-07-03 Beijing Anxinhuaide Biotech. Co., Ltd Improving the half life of a therapeutic polypeptide by fusing with a trimeric scaffold protein via a spacer
AU2013372026B2 (en) * 2013-01-03 2018-11-08 Merck Patent Gmbh Method for producing secretable antibodies by expression in saccharomyces cerevisiae

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