BR112015009948B1

BR112015009948B1 - Uso de um inibidor de actrii

Info

Publication number: BR112015009948B1
Application number: BR112015009948-3A
Authority: BR
Inventors: Victor Schorr Sloan; Keith Hruska; Yifu Fang; Victoria Sung; Randall Stevens; Willian Smith
Original assignee: Celgene Corporation; Washington University
Priority date: 2012-11-02
Filing date: 2013-11-01
Publication date: 2022-12-06
Also published as: BR112015009948A8; JP6714646B2; AU2018236696A1; IL238443B; RU2018145985A; US20230293634A1; CA2890217A1; IL238443A0; JP2020143164A; AU2013337677B2; US20150283209A1; HK1214525A1; KR102279522B1; EP2914277B1; JP2023011741A; AU2013337677A1; JP2016504275A; KR20210091358A; IL267066B; CA3120678A1

Abstract

ANTAGONISTAS DE ATIVINA-ACTRII, USOS DOS MESMOS PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS ÓSSEAS E OUTROS DISTÚRBIOS E MÉTODO PARA MONITORAR A EFICÁCIA DO TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE UMA DOENÇA ÓSSEA E OUTROS DISTÚRBIOS Neste documento são descritos métodos para o tratamento de distúrbios ósseos que estão associados com doença renal, no qual os métodos compreendem a administração de inibidores de Ativina-ActrIIA em um individuo que necessita de tratamento. Encontram-se também fornecidos neste documento métodos e composições para o tratamento de distúrbios ósseos de baixo turnover no qual os métodos compreendem a administração de inibidores de Ativina- ActrIIA para um indivíduo que necessita de tratamento. Encontram-se ainda fornecidas neste documento composições para o tratamento de distúrbios ósseos que estão associados à doença renal e composições para o tratamento de distúrbios ósseos de baixo turnover e calcificação vascular.

Description

[001] O presente pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório US N ° 61/721,898, depositado em 2 de novembro de 2012 e do Pedido de Patente Provisório US N ° 61/740.665, depositado em 21 de dezembro de 2012, cuja divulgação em sua totalidade é aqui incorporada para referência.

INTRODUÇÃO

[002] São fornecidos neste pedido métodos para o tratamento de doenças ósseas que estejam associadas à doença renal, tal como doença renal crônica com distúrbio ósseo e mineral ("CKD-MBD"), em que os métodos compreendem a administração de inibidores da Ativina-ActRII para um indivíduo com necessidade do tratamento. Além disso, proporcionam-se aqui métodos e composições para o tratamento de distúrbios ósseos de baixa rotatividade em que os métodos compreendem a administração de inibidores da Ativina-ActRII a um indivíduo com necessidade do tratamento. Além disso, proporcionam-se aqui composições para o tratamento de doenças ósseas que estejam associadas com a doença renal e composições para o tratamento de distúrbios ósseos de baixa rotatividade e calcificação vascular.

ESTADO DA TÉCNICA

[003] O crescimento ósseo e mineralização dependem das atividades dos dois tipos celulares, os osteoclastos e os osteoblastos, condrócitos e ainda células vasculares também participam em aspectos críticos destes processos. Do ponto de vista do desenvolvimento, a formação de osso ocorre por meio de dois mecanismos, ossificação endocondral e ossificação intramembranosa, sendo a primeira responsável pela formação de osso longitudinal e a última responsável pela formação dos ossos topologicamente planos, tais como os ossos do crânio. A ossificação endocondral necessita da formação e da degradação sequencial das estruturas cartilaginosas em placas de crescimento que servem como moldes para a formação de osteoblastos, osteoclastos, a vasculatura e subsequente mineralização. Durante a ossificação intramembranosa, o osso é formado diretamente nos tecidos conjuntivos. Ambos os processos requerem a infiltração de osteoblastos e deposição de matriz subsequente.

[004] A doença renal crônica está associada a uma deterioração progressiva na homeostase mineral, com uma interrupção das concentrações séricas e teciduais normais de fósforo e cálcio, e mudanças nos hormônios, como o hormônio da paratireóide em circulação, 25-hidroxivitamina D, 1,25- hidroxivitamina D, outros metabólitos da vitamina D, fator de crescimento de fibroblastos-23, e hormônio de crescimento. Vide, Chronic Kidney DiseaseMineral and Bone Disorder (DRC-MBD), Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) CKD-MBD Grupo de Trabalho, Em: Kidney Int Suppl. (2009) 76 (Suppl 113): S1-130, página S3. A homeostase mineral e hormonal que é interrompida na doença renal crônica é fundamental para a formação inicial óssea durante o crescimento (modelação óssea) e estrutura óssea e função durante a idade adulta (remodelação óssea). Como um resultado, alterações ósseas são encontradas em pacientes com doença renal crônica. Além disso, da mesma forma devido à interrupção das funções endócrinas e minerais, a calcificação extraesquelética pode ser encontrada em pacientes com doença renal crônica. Essas síndromes são denominadas distúrbios ósseo minerais da doença renal crônica ("CDK-MBD ou DRC-DMO).

[005] O osso sofre uma rotação contínua. A modificação óssea é o processo de reabsorção seguido de substituição do osso. Osteoblastos e osteoclastos são as células necessárias para a remodelação óssea. O baixo turnover ósseo e doenças ósseas adinâmicas são caracterizados pela redução ou ausência de reabsorção e substituição de osso. A CDK-MBD pode ser caracterizada por baixo turnover ósseo e doenças ósseas adinâmicas. (Distúrbio Ósseo Mineral da Doença Renal Crônica (CDK-MBD), a doença Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) CKD-MBD Trabalho em Grupo, em: Kidney Int Suppl (2009) 76 (Suppl 113): S1-130, página S34).

[006] O aumento dos níveis de cálcio no sistema vascular pode conduzir à calcificação vascular, uma condição caracterizada por uma maior rigidez do vaso. Os pacientes com calcificação vascular têm um risco acrescido de enfarte do miocárdio, e calcificação vascular é particularmente prevalecente em pacientes que sofrem de doença renal, por exemplo, CKD-MBD. Vide, por exemplo, Shanahan et al., 2011, Circ. Res. 109: 697-711.

[007] Dois receptores de tipo II e afins, ActRIIA ActRIIB, têm sido identificados como receptores do tipo II para as ativinas (Mathews e Vale, 1991, Cell. 65: 973-982; Attisano et al , 1992, Cell 68: 97-108 ). Além das ativinas, ActRIIA e ActRIIB podem interagir bioquimicamente com várias outras proteínas da família TGF-beta, incluindo BMP7, Nodal, GDF8, e GDF11 (Yamashita et al , 1995, J. Cell Biol 130:.. 217-226; McPherron e Lee, , 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:. 9306-9311; Yeo e Whitman, 2001, Mol Cell. 7: 949-957; Oh et al, 2002, Genes Dev 16: 2749-54)..ALK4 é o principal tipo I receptor para ativinas, particularmente para a ativina A e ALK-7 pode servir como um receptor para as ativinas, bem como, em particular para a ativina B.

RESUMO

[008] Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento de um distúrbio ósseo adinâmica num indivíduo, em que o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII a um indivíduo com necessidade de tratamento da doença óssea adinâmica. Além disso, são fornecidos aqui métodos para o tratamento de uma forma de distúrbio ósseo adinâmico de CKD-MBD num indivíduo, em que o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII a um indivíduo com necessidade de tratamento de forma a distúrbio ósseo adinâmico de CKD-MBD.

[009] Em certas formas de realização mais específicas, o distúrbio ósseo adinâmico é caracterizado pela ausência de incorporação de tetraciclina ao osso mineralizado.

[010] Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento de uma forma de baixo turnover ósseo de CKD-MBD num indivíduo, em que o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII a um indivíduo com necessidade de tratamento de uma forma de baixo turnover ósseo da CKD-MBD. Numa forma de realização mais específica, a forma de baixo turnover ósseo da CKD-MBD é osteomalacia.

[011] Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento de um distúrbio caracterizado por hiperfosfatemia óssea num indivíduo, em que o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII a um indivíduo com necessidade de tratamento da doença óssea caracterizado por hiperfosfatemia.

[012] Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento da calcificação aterosclerótica num indivíduo, em que o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII a um indivíduo com necessidade de tratamento da calcificação aterosclerótica.

[013] Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento de uma doença renal num indivíduo, em que o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII a um indivíduo com necessidade de tratamento da doença renal. Numa forma de realização mais específica, a doença renal é a fibrose renal.

[014] Numa forma de realização específica, é aqui proporcionado um método para o tratamento da calcificação extraesquelética num indivíduo, em que o referido método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII ao indivíduo. Numa outra forma de realização específica, é aqui proporcionado um método para a prevenção da calcificação extraesquelética num indivíduo, em que o referido método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII ao indivíduo. Numa forma de realização específica, a calcificação extraesquelética tratada ou prevenida num paciente pelos métodos aqui descritos é a calcificação vascular, isto é, a acumulação de sais de cálcio nos vasos do indivíduo, por exemplo, a calcificação das artérias do indivíduo.

[015] Em certas formas de realização, o inibidor de ActRII que pode ser usado com os métodos aqui proporcionados é um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: 90% idênticas à SEQ ID NO: 2; 95% idênticas à SEQ ID NO: 2; 98% idênticas à SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 2; 90% idênticas à SEQ ID NO: 3; 95% idênticas à SEQ ID NO: 3; 98% idênticas à SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 3; 90% idênticas à SEQ ID NO: 6; 95% idênticas à SEQ ID NO: 6; 98% idênticas à SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 6; 90% idênticas à SEQ ID NO: 7; 95% idênticas à SEQ ID NO: 7; 98% idênticas à SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 7; 90% idênticas à SEQ ID NO: 12; 95% idênticas à SEQ ID NO: 12; 98% idênticas à SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 12; 90% idênticas à SEQ ID NO: 17; 95% idênticas à SEQ ID NO: 17; 98% idênticas à SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 17; 90% idênticas à SEQ ID NO: 20; 95% idênticas à SEQ ID NO: 20; 98% idênticas à SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 20; 90% idênticas à SEQ ID NO: 21; 95% idênticas à SEQ ID NO: 21; 98% idênticas à SEQ ID NO: 21; e SEQ ID NO: 21. Numa forma de realização mais específica, o inibidor de ActRII é um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Numa forma de realização mais específica, o inibidor de ActRII é administrado parentericamente.

[016] Numa forma de realização específica, o inibidor de ActRII que pode ser usado com os métodos aqui proporcionados é um inibidor ActRIIA, em que o inibidor de ActRIIA compreende ou é constituído por um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: a. um polipeptídeo, pelo menos, 90% idêntico à SEQ ID NO: 2; b. um polipeptídeo, pelo menos, 95% idêntico à SEQ ID NO: 2; c. um polipeptídeo, pelo menos, 98% idêntico à SEQ ID NO: 2; d. SEQ ID NO: 2; e. um polipeptídeo, pelo menos, 90% idêntico à SEQ ID NO: 3; f. um polipeptídeo, pelo menos, 95% idêntico à SEQ ID NO: 3; g. um polipeptídeo, pelo menos, 98% idêntico à SEQ ID NO: 3; h. SEQ ID NO: 3; eu. um polipeptídeo, pelo menos, 90% idêntico à SEQ ID NO: 6; j. um polipeptídeo, pelo menos, 95% idêntico à SEQ ID NO: 6; k. um polipeptídeo, pelo menos, 98% idêntico à SEQ ID NO: 6; l. SEQ ID NO: 6; m. um polipeptídeo, pelo menos, 90% idêntico à SEQ ID NO: 7; n. um polipeptídeo, pelo menos, 95% idêntico à SEQ ID NO: 7; o. um polipeptídeo, pelo menos, 98% idêntico à SEQ ID NO: 7; p. SEQ ID NO: 7; q. um polipeptídeo, pelo menos, 90% idêntico à SEQ ID NO: 12; r. um polipeptídeo, pelo menos, 95% idêntico à SEQ ID NO: 12; s. um polipeptídeo, pelo menos, 98% idêntico à SEQ ID NO: 12; e t. SEQ ID NO: 12. Numa forma de realização específica, o inibidor ActRIIA é um polipeptídeo que compreende ou consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

[017] Numa outra forma de realização específica, o inibidor de ActRII que pode ser usado com os métodos aqui proporcionados é um inibidor de ActRIIB, em que o inibidor de ActRIIB compreende ou é constituído por um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: a. um polipeptídeo, pelo menos, 90% idêntico à SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, ou 43; b. um polipeptídeo, pelo menos, 95% idêntico à SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, ou 43; c. um polipeptídeo, pelo menos, 98% idêntico à SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, ou 43; d. SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 ou 43; e. um polipeptídeo de 90% idênticos à SEQ ID NO: 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, ou 47; f. um polipeptídeo de 95% idênticos à SEQ ID NO: 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, ou 47; g. um polipeptídeo de 98% idênticos à SEQ ID NO: 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, ou 47; e h. SEQ ID NO: 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, ou 47. Numa forma de realização específica, o inibidor de ActRIIB é um polipeptídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 23. Numa outra forma de realização específica, o inibidor de ActRIIB é um polipeptídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 25.

[018] Numa outra forma de realização específica, um inibidor ActRIIA e um inibidor de ActRIIB podem ser utilizados nos métodos aqui proporcionados (por exemplo, uma composição que compreende um inibidor de ActRIIA e um inibidor de ActRIIB pode ser usada, ou um inibidor de um inibidor de ActRIIA e pode tanto a ActRIIB ser administrada, separadamente, a um indivíduo a ser tratado de acordo com os métodos aqui descritos), em que o inibidor de ActRIIA compreende ou consiste em um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: a. um polipeptídeo, pelo menos, 90% idêntico à SEQ ID NO: 2; b. um polipeptídeo, pelo menos, 95% idêntico à SEQ ID NO: 2; c. um polipeptídeo, pelo menos, 98% idêntico à SEQ ID NO: 2; d. SEQ ID NO: 2; e. um polipeptídeo, pelo menos, 90% idêntico à SEQ ID NO: 3; f. um polipeptídeo, pelo menos, 95% idêntico à SEQ ID NO: 3; g. um polipeptídeo, pelo menos, 98% idêntico à SEQ ID NO: 3; h. SEQ ID NO: 3; eu. um polipeptídeo, pelo menos, 90% idêntico à SEQ ID NO: 6; j. um polipeptídeo, pelo menos, 95% idêntico à SEQ ID NO: 6; k. um polipeptídeo, pelo menos, 98% idêntico à SEQ ID NO: 6; l. SEQ ID NO: 6; m. um polipeptídeo, pelo menos, 90% idêntico à SEQ ID NO: 7; n. um polipeptídeo, pelo menos, 95% idêntico à SEQ ID NO: 7; o. um polipeptídeo, pelo menos, 98% idêntico à SEQ ID NO: 7; p. SEQ ID NO: 7; q. um polipeptídeo, pelo menos, 90% idêntico à SEQ ID NO: 12; r. um polipeptídeo, pelo menos, 95% idêntico à SEQ ID NO: 12; s. um polipeptídeo, pelo menos, 98% idêntico à SEQ ID NO: 12; e t. SEQ ID NO: 12; e em que o inibidor de ActRIIB compreende ou consiste em um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: a. um polipeptídeo, pelo menos, 90% idêntico à SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, ou 43; b. um polipeptídeo, pelo menos, 95% idêntico à SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, ou 43; c. um polipeptídeo, pelo menos, 98% idêntico à SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, ou 43; d. SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 ou 43; e. um polipeptídeo de 90% idênticos à SEQ ID NO: 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, ou 47; f. um polipeptídeo de 95% idênticos à SEQ ID NO: 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, ou 47; g. um polipeptídeo de 98% idênticos à SEQ ID NO: 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, ou 47; e h. SEQ ID NO: 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, ou 47. Numa forma de realização específica, o inibidor ActRIIA é um polipeptídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 7 e o inibidor de ActRIIB é um polipeptídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 23. Numa outra forma de realização específica, o inibidor ActRIIA é um polipeptídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 7 e o inibidor de ActRIIB é um polipeptídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 25.

[019] Em certas formas de realização, o indivíduo a ser tratado com os métodos aqui proporcionados tem menos de 18 anos de idade. Em certas formas de realização, o indivíduo a ser tratado com os métodos aqui proporcionados tem a doença renal em fase terminal. Em certas formas de realização, o indivíduo a ser tratado com os métodos aqui proporcionados sofre diálise. Em certas formas de realização, é aqui proporcionado um método para aumentar a altura do objeto.

[020] Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento ou prevenção de hiperfosfatemia, hiperparatiroidismo secundário (devido ao aumento em fósforo), calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular e doença óssea adinâmica num indivíduo, em que o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII a um indivíduo com necessidade de tratamento de hiperfosfatemia, hiperparatiroidismo secundário (devido ao aumento em fósforo), calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, e osso adinâmico.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[021] Figura 1: Peso corporal de camundongo após nefrectomia parcial.

[022] Figura 2: Alterações no BMD por DEXA Scan após nefrectomia parcial em camundongos.

[023] Figura 3: A duplicata murina de SEQ ID NO 7 ("mActRIIA-FC") alterações do hematócrito após nefrectomia parcial em ratos.

[024] Figura 4: Imagem 3D MicroCT de ossos representativos após nefrectomia parcial em camundongos.

[025] Figura 5: tratamento mActRIIA-Fc aumenta os hematócritos.

[026] Figura 6: mActRIIA-Fc aumenta a densidade mineral óssea.

[027] Figura 7: Scans microCT representativos de fêmures.

[028] Figura 8: mActRIIA-Fc aumenta a espessura cortical do fêmur MidShaft.

[029] Figura 9: mActRIIA-Fc aumenta o volume do osso trabecular.

[030] Figura 10: mActRIIA-Fc aumenta a espessura trabecular no fêmur distal.

[031] Figura 11: mActRIIA-Fc provoca uma redução nos níveis de cálcio aórtico num modelo de camundongo CKD.

DESCRIÇÃO DETALHADA PANORAMA

[032] É fornecido aqui, num aspecto, um método para o tratamento de Doença Renal Crônica-Distúrbio Ósseo Mineral (CKD-MBD), em que o método compreende a administração de um inibidor de ActRII a um paciente em necessidade de tratamento. O inibidor de ActRII pode ser um inibidor de ActRIIA e/ou de ActRIIB.

[033] A CKD-MBD pode ser diagnosticada como um distúrbio sistêmico de metabolismo ósseo e mineral devido á doença renal crônica e que se manifesta seja por um apenas ou uma combinação de (1) anormalidade de cálcio; fósforo; produto fósforoso de cálcio x; fosfatase alcalina (total ou óssea específica); bicarbonato; paratormônio ("PTH"); PTH 1-84, PTH 1-84-/ 7-84 proporção de PTH; osteocalcina; osteoprotegrina; resistente ao tartarato 5b da fosfatase ácida isoform ("trap-5b"); piridinolina e desoxipiridinolina; Tipo de procolágeno uma péptidos de extensão amino-terminal; Reticulações C-terminal; Reticulações de colagéno C-terminais; fator de crescimento de fibroblastos 23 ("FGF23"); Fetulin-A; ou o metabolismo da vitamina D; (2) alterações de remodelação óssea, a mineralização, o volume, o crescimento linear, ou força; e (3) vascular ou outra calcificação de tecidos moles. Vide Nickolas, 2008, Kidney International 74: 721-731; .e Moe et al , 2006, Kidney International 69: 1945-1953. Diretrizes para o diagnóstico da CKD-MBD podem ser encontradas, por exemplo, no KDIGO diretrizes de prática clínica para a prevenção, diagnóstico, avaliação e tratamento da Doença Renal Crônica-Mineral e doença óssea (CKD-MBD), a Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) CKD- MBD Trabalho em Grupo, em: Kidney Int Suppl. (2009) 76 (Suppl 113): S1-130.

[034] Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento de formas de baixo turnover ósseo de CKD-MBD em que o método compreende a administração de um inibidor de ActRII a um paciente em necessidade de tratamento. Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento de CKD-MBD caracterizado por hiperfosfatemia e/ou hipercalcemia. Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento de CKD-MBD caracterizada por calcificação extraesquelética, tais como, mas não limitados a calcificação aterosclerótica.

[035] Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento de CKD-MBD, em que a doença renal crônica tenha atingido o estágio 3, etapa 4, fase 5, ou fase 5D. Numa forma de realização específica, a doença renal é a doença renal em estágio final. Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento de CKD-MBD caracterizado por uma taxa de filtração glomerular de menos do que 60 ml/min/1.73m2 em adultos ou menos do que 89 ml/min/1.73m2 em pacientes pediátricos. .Vide, Moe et al , 2006, Kidney International 69: 1945-1953. Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento em adultos de CKD- MBD caracterizado por uma taxa de filtração glomerular de menos do que 50 ml/min/1,73m2, 40 mL/min/1,73m2, 30 ml/min/1,73m2, 20 mL/min /1,73m2, ou menos do que 10 ml/min/1.73m2. Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento em pacientes pediátricos de CKD- MBD caracterizado por uma taxa de filtração glomerular de menos do que 80 ml/min/1,73m2, 70 mL/min/1,73m2, 60 ml/min/1,73m2, 50ml/min/1,73m2, 40 mL/min/1,73m2, 30 ml/min/1,73m2, 20 mL/min/1,73m2, ou menos do que 10 ml/min/1.73m2.

[036] Sem estar limitado pela teoria, uma taxa de filtração glomerular de menos do que 60 ml/min/1.73m2 em doentes adultos e menos do que 89 ml/min/1.73m2 em pacientes pediátricos resulta em anormalidades detectáveis em níveis de cálcio, os níveis de fósforo, Os níveis de PTH, e metabolismo da vitamina D; e níveis anormais destes marcadores resultam em doença óssea.

[037] Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento de uma patologia de massa óssea associada com doença renal crônica, ou seja, CKD-MBD. Ver Moe et al , 2006, Kidney International 69:. 19451953. Em certas formas de realização, a CKD-MBD é uma CKD-MBD de baixo turnover. A CKD-MBD de baixo turnover pode ser diagnosticada pelas características histológicas estabelecidas na Tabela 1 abaixo. Vide National Kidney Foundation, Doença Renal Resultado das Diretrizes de Iniciativa de Qualidade no site da National Kidney Foundation.Tabela 1. Recursos histológicos do Baixo-Turnover CKD-MBD

[038] Numa forma de realização específica, é aqui proporcionado um método para o tratamento da calcificação extraesquelética num indivíduo, em que o referido método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII ao indivíduo. Numa outra forma de realização específica, é aqui proporcionado um método para a prevenção da calcificação extraesquelética num indivíduo, em que o referido método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII ao indivíduo. Em formas de realização específicas, a calcificação extraesquelética tratadas ou prevenidas num paciente pelos métodos aqui descritos é a calcificação vascular, isto é, a acumulação de sais de cálcio na vasculatura do indivíduo, por exemplo, a calcificação das artérias do indivíduo.

[039] Em certas formas de realização, os métodos de tratamento ou de prevenção da calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, aqui proporcionados são realizados num indivíduo que esteja em risco de sofrer de calcificação extraesquelética, por exemplo, a calcificação vascular (isto é, é administrado ao indivíduo em risco um inibidor de ActRII de acordo com os métodos aqui descritos). Numa forma de realização específica, o indivíduo em risco de sofrer de calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, tem hipercolesterolemia. Numa outra forma de realização específica, o indivíduo em risco de sofrer de calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, tem hipertensão. Numa outra forma de realização específica, o indivíduo em risco de sofrer de calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, tem diabetes. Numa outra forma de realização específica, o indivíduo em risco de sofrer de calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, tem doença renal (por exemplo, fase final da doença renal). Numa outra forma de realização específica, o indivíduo em risco de sofrer de calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, tem a doença renal crônica. Numa outra forma de realização específica, o indivíduo em risco de sofrer de calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, tem aumentado o estresse oxidativo, por exemplo, um desequilíbrio entre a produção e a atividade antioxidante oxidante na vasculatura. Numa outra forma de realização específica, o indivíduo em risco de sofrer de calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, tem uma deficiência inibidora de calcificação (por exemplo, uma deficiência em uma ou mais de fetuína-A, proteína gla da matriz (MGP) e osteoprotegerina (OPG )).

[040] Em certas formas de realização, os indivíduos que sofrem de calcificação vascular, tratadas de acordo com os métodos aqui descritos, têm calcificação da camada média (também conhecida como esclerose de Monckeberg ou calcinose da camada média). Calcificação da camada média é caracterizada pela difusão de depósitos minerais dentro da túnica média arterial. Numa forma de realização específica, os indivíduos que sofrem de calcificação da camada média são idosos. Numa forma de realização específica, os indivíduos que sofrem de calcificação da camada média têm uma doença que provoca a calcificação da camada média, por exemplo, diabetes, doença renal (por exemplo, DRC).

[041] Em certas formas de realização, os indivíduos que sofrem de calcificação vascular tratadas de acordo com os métodos aqui descritos têm Calcificação da camada íntima. Calcificação da camada íntima está associada com aterosclerose e progride como as placas ateroscleróticas progridem.

[042] Em certas formas de realização, um indivíduo que sofre de, ou em risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, tem aumentados os níveis de FGF23, um hormônio produzido pelo osteócitos em resposta a diminuição da carga mecânica, que diminui a formação de osso e o excesso de fósforo no grupo cambiável (Vide, por exemplo, Hruska e Mathew, 2011, Advances in Chronic Renal Disease 18 (2): 98-104), em relação aos níveis de FGF23 em indivíduos que não estão sofrendo de, ou não tem risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, a calcificação vascular. Os níveis de FGF23 podem ser detectados utilizando métodos conhecidos na arte, por exemplo, ELISA, utilizando amostras de indivíduos, por exemplo, sangue, soro. Numa forma de realização específica, o nível de FGF23 (por exemplo, o nível detectável no soro) num indivíduo que sofre de, ou tem risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, é de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, ou maior do que 50%, maior do que o nível de FGF23 (por exemplo, o nível detectável no soro) num indivíduo que não sofre de, ou não tem risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, a calcificação vascular. Numa outra forma de realização específica, o nível de FGF23 (por exemplo, o nível detectável no soro) num indivíduo que sofre de, ou em risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, é cerca de 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 50-75%, ou 75-100%, maior do que o nível de FGF23 (p.ex. , o nível detectável no soro) num indivíduo que não sofre de, ou não tem risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, a calcificação vascular.

[043] Em certas formas de realização, os níveis de FGF23 de um indivíduo sofrendo de, ou com risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, podem ser usados para monitorar a eficácia de um método aqui descrito, por exemplo, um método de tratamento de uma forma de CKD-MBD e/ou um método de tratamento de calcificação extraesquelética (por exemplo, calcificação vascular), em que esses métodos compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII aqui descrito. Numa forma de realização específica, um indivíduo tratado de acordo com um ou mais dos métodos aqui descritos, tem um nível diminuído de FGF23 (por exemplo, tal como detectado no soro do indivíduo), em comparação com o nível de FGF23 detectado no indivíduo antes de ser tratado com um processo aqui descrito. Numa outra forma de realização específica, o nível de FGF23 (por exemplo, o nível detectável no soro) num indivíduo que sofre de, ou com risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, tratada com um método aqui descrito é diminuído em cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, ou superior a 50%, em relação ao nível de FGF23 (por exemplo, o nível detectável no soro) detectado no indivíduo antes do tratamento com um processo aqui descrito. Numa outra forma de realização específica, o nível de FGF23 (por exemplo, o nível detectável no soro) num indivíduo que sofre de, ou com risco de sofrer de uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, é diminuído em cerca de 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 50-75%, ou 75-100%, em relação ao nível de FGF23 (por exemplo, o nível detectável no soro) detectado no indivíduo antes do tratamento com um processo aqui descrito.

[044] Numa forma de realização específica, é aqui proporcionado um método de tratamento de uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, compreendendo: (i) administração de um inibidor de ActRII a um indivíduo que tem uma forma de CKD- MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, a calcificação vascular; (Ii) determinação de uma quantidade de FGF23 numa amostra de tecido (por exemplo, soro) do referido indivíduo, após a administração de inibidor de ActRII; e (iii) se a quantidade de FGF23 na referida amostra de tecido é diminuída em não mais do que cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25%, ou cerca de 5-10%, 10-20%, 20 -30%, em comparação com a quantidade de FGF23 determinado numa amostra do mesmo tipo de tecido a partir do referido indivíduo (por exemplo, uma amostra diferente de soro a partir do mesmo indivíduo), antes da administração do inibidor de ActRII, repetindo-se a administração do ActRII inibidor. Em certas formas de realização, se a quantidade de FGF23 não é diminuída depois da administração do inibidor de ActRII, a dose dos ActRII inibidor administrado pode ser aumentada. Em certas formas de realização, se a quantidade de FGF23 não é diminuída depois da administração do inibidor de ActRII, a frequência de administração do inibidor de ActRII administrada pode ser aumentada.

[045] Em certas formas de realização, um indivíduo que sofre de, ou com risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, teve aumentada a esclerostina, uma proteína aumentada em indivíduos que sofrem de, ou com risco de sofrer de, CKD-MBD (Vide, por exemplo, Graciolli et al , 2010, J Am Soc Nephrol 21: 774a) em relação aos níveis de esclerostina em indivíduos que não sofrem de, ou não tem risco de sofrer de , uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, a calcificação vascular. Níveis de esclerostina podem ser detectados utilizando métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, ELISA, utilizando amostras de indivíduos, por exemplo, sangue, soro. Numa forma de realização específica, o nível de esclerostina (por exemplo, o nível detectável no soro) num indivíduo que sofre de, ou com risco de sofrer de, uma forma de CKD- MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, é de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, ou maior do que 50%, maior do que o nível de esclerostina (por exemplo, o nível detectável em o soro) num indivíduo que não sofre de, ou não tem risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, a calcificação vascular. Numa outra forma de realização específica, o nível de esclerostina (por exemplo, o nível detectável no soro) num indivíduo que sofre de, ou com risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, é de cerca de 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 50-75%, ou 75-100%, maior do que o nível de esclerostina (p.ex. , o nível detectável no soro) num indivíduo que não sofre de, ou não tem risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, a calcificação vascular.

[046] Em certas formas de realização, os níveis de esclerostina num indivíduo sofrendo de, ou com risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, podem ser utilizados para monitorar a eficácia de um método aqui descrito, por exemplo, um método de tratamento de uma forma de CKD-MBD e/ou um método de tratamento de calcificação extraesquelética (por exemplo, calcificação vascular), em que esses métodos compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII aqui descrito. Numa forma de realização específica, um indivíduo tratado de acordo com um ou mais dos métodos aqui descritos, tem um nível diminuído de esclerostina (por exemplo, tal como detectado no soro do indivíduo), em comparação com o nível de esclerostina detectado no indivíduo antes de ser tratado com um processo aqui descrito. Numa outra forma de realização específica, o nível de esclerostina (por exemplo, o nível detectável no soro) num indivíduo que sofre de, ou com risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, tratada com um método aqui descrito é diminuído em cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, ou superior a 50%, em relação ao nível de esclerostina (por exemplo, o nível detectável no soro) detectado no indivíduo antes do tratamento com um processo aqui descrito. Numa outra forma de realização específica, o nível de esclerostina (por exemplo, o nível detectável no soro) num indivíduo que sofre de, ou com risco de sofrer de, uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, é diminuído em cerca de 510%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 50-75%, ou 75-100%, em relação ao nível de esclerostina (por exemplo, o nível detectável no soro) detectado no indivíduo antes do tratamento com um processo aqui descrito.

[047] Numa forma de realização específica, é aqui proporcionado um método de tratamento de uma forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, compreendendo: (i) administração de um inibidor de ActRII a um indivíduo que tem uma forma de CKD- MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, a calcificação vascular; (Ii) determinação de uma quantidade de esclerostina numa amostra de tecido (por exemplo, soro) do referido indivíduo, após a administração de inibidor de ActRII; e (iii) se a quantidade de esclerostina na referida amostra de tecido é diminuída em não mais do que cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25%, ou cerca de 5-10%, 10-20%, 20 -30%, em comparação com a quantidade de esclerostina determinado numa amostra do mesmo tecido a partir do referido indivíduo (por exemplo, uma amostra diferente de soro a partir do mesmo indivíduo), antes da administração do inibidor de ActRII, repetindo-se a administração do inibidor de ActRII . Em certas formas de realização, se a quantidade de esclerostina não é diminuída depois da administração do inibidor de ActRII, a dose dos ActRII inibidor administrado pode ser aumentada. Em certas formas de realização, se a quantidade de esclerostina não é diminuída depois da administração do inibidor de ActRII, a frequência de administração do inibidor de ActRII administrada pode ser aumentada.

[048] Em certas formas de realização, o indivíduo que sofre de calcificação vascular tratada de acordo com os métodos aqui descritos tem menos de 18 anos de idade. Numa forma de realização específica, o indivíduo que sofre de calcificação vascular tratada de acordo com os métodos aqui descritos tem menos de 13 anos de idade. Numa outra forma de realização específica, o indivíduo sofre de calcificação vascular tratada de acordo com os métodos aqui descritos tem menos de 12, menos de 11, menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, de 6, ou menos de 5 anos de idade. Numa outra forma de realização específica, o indivíduo que sofre de calcificação vascular tratada de acordo com os métodos aqui descritos tem de 1-3 anos, 3-5 anos, 5-7 anos, 7-9 anos, 9-11 anos, 11-13 anos, 13-15 anos, 15-20 anos, 20-25 anos, 25-30 anos, ou mais de 30 anos de idade. Numa outra forma de realização específica, o indivíduo que sofre de calcificação vascular tratada de acordo com os métodos aqui descritos tem 30-35 anos, 35-40 anos, 40-45 anos, 45-50 anos, 50-55 anos de idade, 55-60 anos de idade, ou mais de 60 anos de idade. Numa outra forma de realização específica, o indivíduo que sofre de calcificação vascular tratada de acordo com os métodos aqui descritos tem 60-65 anos, 65-70 anos, 70-75 anos, 75-80 anos, ou mais de 80 anos de idade.

[049] Em certas formas de realização, o indivíduo que sofre de calcificação vascular tratada de acordo com os métodos aqui descritos tem a doença renal em fase terminal. Em certas formas de realização, o indivíduo que sofre de calcificação vascular tratada em conformidade com os métodos descritos no presente documento é submetido à diálise.

[050] Em certas formas de realização, a eficácia de tratamento ou prevenção da calcificação extraesquelética, por exemplo, calcificação vascular, é avaliada utilizando um ou mais ensaios conhecidos dos peritos na técnica. Os ensaios exemplificativos estão descritos na Seção 5.3 (a) (iv). De acordo com tais formas de realização, um perito na arte compreenderá que um indivíduo a ser tratado com um inibidor de ActRII como aqui descrito, pode ter o seu regime de tratamento ajustado com base nos resultados dos ensaios. Por exemplo, um indivíduo a ser tratado por um método aqui descrito mostra que para aumentos nos níveis de cálcio, por exemplo, cálcio vascular (por exemplo, cálcio arterial) pode ser administrada uma dose aumentada do inibidor de ActRII, ou um pode ser administrado um inibidor de ActRII mais frequentemente (ou seja, o tempo entre administrações de dose pode ser diminuído). Por outro lado, um indivíduo a ser tratado por um método aqui descrito que exibe diminuição dos níveis de cálcio, por exemplo, cálcio vascular (por exemplo, cálcio arterial) pode ser administrada uma dose reduzida de inibidor de ActRII, ou um pode ser administrado um inibidor de ActRII menos frequentemente (ou seja, o tempo entre administrações de dose pode ser aumentado).

[051] Em certas formas de realização, os métodos aqui proporcionados resultam na melhoria dos sintomas de um ou mais dos seguintes procedimentos: a hiperfosfatemia, hiperparatiroidismo secundário (devido ao aumento em fósforo), e calcificação extraesquelética, por exemplo, a calcificação vascular. Qualquer método conhecido dos peritos na arte para determinar o grau de estes sintomas pode ser usado com os métodos aqui fornecidos. Em formas de realização específicas, os métodos aqui descritos resultam na melhoria de um ou mais sintomas de calcificação vascular. Sintomas exemplificativos incluem, sem limitação, os aumentos nos níveis de vascular (por exemplo, arterial) de cálcio, aumento de apoptose de células musculares lisas vasculares, perda da elasticidade arterial, o aumento da VOP (velocidade da onda de pulso), o desenvolvimento de hipertrofia ventricular esquerda, decréscimo na perfusão coronária, e isquemia do miocárdio.

[052] Em certas formas de realização, os métodos aqui descritos resultam numa diminuição dos níveis de cálcio vascular, por exemplo, cálcio arterial, num indivíduo em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% , 35%, 40%, 45% ou 50%. Em certas formas de realização, os métodos aqui descritos resultam numa diminuição dos níveis de cálcio vascular, por exemplo, cálcio arterial, num indivíduo em 5% -10%, 10% -15%, 15% -20%, 20% -25 %, 25% -30%, 30% -35%, 35% -40%, 40% -45%, ou 45% -50%.

[053] Numa forma de realização específica, é aqui proporcionado um método de reduzir os níveis de cálcio vascular num indivíduo, que compreende: (i) administração de um inibidor de ActRII a um indivíduo com necessidade de redução de níveis de cálcio vascular (por exemplo, um indivíduo com um forma de CKD-MBD e/ou calcificação extraesquelética, por exemplo, a calcificação vascular); (Ii) determinar uma quantidade de cálcio vascular numa amostra de tecido (por exemplo, soro) do referido indivíduo, após a administração de inibidor de ActRII; e (iii) se a quantidade de cálcio no vascular referida amostra de tecido é diminuída em não mais do que cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25%, ou cerca de 5-10%, 10-20%, 20-30%, em comparação com a quantidade de cálcio vascular determinado numa amostra do mesmo tecido a partir do referido indivíduo (por exemplo, uma amostra diferente de soro a partir do mesmo indivíduo), antes da administração do inibidor de ActRII, repetindo-se a administração do inibidor ActRII. Em certas formas de realização, se a quantidade de cálcio vascular não é diminuída depois da administração do inibidor de ActRII, a dose dos ActRII inibidor administrado pode ser aumentada.Em certas formas de realização, se a quantidade de cálcio vascular não é diminuída depois da administração do inibidor de ActRII, a frequência de administração do inibidor de ActRII administrada pode ser aumentada.

[054] Em certas formas de realização, os métodos aqui descritos resultam numa diminuição na progressão da escala de Agatston de um indivíduo possuindo, ou em risco de desenvolver a calcificação vascular. Numa forma de realização específica, os métodos aqui descritos resultam numa diminuição de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, ou inferior a 30% na escala de Agatston de um indivíduo possuindo, ou em risco de desenvolvimento de calcificação vascular, em comparação com a escala Agatston do indivíduo antes da administração de um inibidor de ActRII de acordo com os métodos aqui descritos (Vide, por exemplo, Seção 5.3 (a) (iv)). Numa outra forma de realização específica, os métodos aqui descritos resultam numa redução de 5% -10%, 10% -15%, 15% - 20%, 20% -25%, 25% -30%, 30% -35%, 35% -40%, 40% -45%, ou 45% -50% na escala de Agatston de um indivíduo possuindo, ou em risco de desenvolver a calcificação vascular, em comparação com a escala de Agatston do indivíduo antes da administração de um inibidor de ActRII conforme os métodos aqui descritos (Vide, por exemplo, Seção 5.3 (a) (iv)).

[055] Numa outra forma de realização específica, os métodos aqui descritos resultam numa diminuição dos níveis de cálcio na vasculatura de um indivíduo, por exemplo, uma diminuição nos níveis de cálcio em uma ou mais artérias do indivíduo, por exemplo, um indivíduo que tem ou está em risco de desenvolver a calcificação vascular. Numa outra forma de realização específica, os métodos aqui descritos resultam numa diminuição dos níveis de fósforo na vasculatura de um indivíduo, por exemplo, uma diminuição nos níveis de fósforo em uma ou mais artérias do indivíduo, por exemplo, um indivíduo com ou em risco de desenvolvimento de calcificação vascular.

[056] Em certas formas de realização, são fornecidos aqui métodos para o tratamento de doenças ósseas de baixo turnover. Baixo turnover ósseo pode ser diagnosticado usando os testes previstos na Seção 5.3 (a) abaixo. Marcadores bioquímicos de remodelação óssea incluem: soro ou urina de colágeno ligamentos cruzados (N-telopéptido ou C-telopeptídeo), fosfatase alcalina óssea, a osteocalcina no soro e/ou propeptídeo colágeno tipo 1, 25 hidroxivitamina D e paratormônio ("PTH "). Numa forma de realização específica, o distúrbio ósseo de baixo turnover é distúrbio ósseo adinâmico. Em certas formas de realização, um paciente a ser tratado com os métodos aqui proporcionados tem uma redução no volume de osso, pelo menos, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75% , 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100%. Em certas formas de realização, um paciente a ser tratado com os métodos aqui proporcionados tem uma redução no volume de osso, de no máximo, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75% , 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100%. Em certas formas de realização, um paciente a ser tratado com os métodos aqui proporcionados tem uma redução no volume de osso entre 10% e 25%, 20% e 35%, 30% e 45%, 40% e 55%, 50% e 65%, 60% e 75%, 70% e 85%, 80% e 95%, 90% e 100%. Em certas formas de realização, a redução do volume do osso é comparada com dados históricos do mesmo paciente. Em outras formas de realização, a redução do volume do osso é comparada com o volume ósseo médio numa população sem distúrbios ósseos. A população sem distúrbios ósseos pode ser da mesma idade e/ou mesmo sexo do paciente.

[057] Numa forma de realização específica, é aqui proporcionado um método de tratamento de um distúrbio ósseo de baixo turnover, por exemplo, doença óssea adinâmica, compreendendo: (i) administração de um inibidor de ActRII a um indivíduo tendo um distúrbio ósseo de baixo turnover; (Ii) determinação do nível de turnover ósseo no referido indivíduo após a administração de inibidor de ActRII (por exemplo, utilizando um ou mais dos testes apresentados na Seção 5.3 (a) e/ou medindo um ou mais marcadores bioquímicos de remodelação óssea); e (iii) se o nível de renovação óssea no indivíduo é diminuído em não mais do que cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25%, ou cerca de 5-10%, 10-20%, 20 -30%, em comparação com o nível de renovação óssea no indivíduo antes da administração do inibidor de ActRII, repetindo-se a administração do inibidor de ActRII. Em certas formas de realização, se o nível de renovação óssea não é diminuído depois da administração do inibidor de ActRII, a dose do inibidor de ActRII administrado pode ser aumentada. Em certas formas de realização, se o nível de renovação óssea não é diminuído depois da administração do inibidor de ActRII, a frequência de administração do inibidor de ActRII administrada pode ser aumentada.

INIBIDORES DE ActRII INIBIDORES DE ActRII A

[058] Tal como aqui utilizado, o termo "ActRIIA" refere-se a uma família proteínas receptoras de ativina tipo IIa (ActRIIA) de todas as espécies e variantes derivadas de tais proteínas ActrIIa por mutagênese ou outra modificação. Referência a ActRIIA aqui entende-se por uma referência a qualquer uma das formas atualmente identificadas. Os membros da família ActRIIA são geralmente proteínas transmembranares, compostas por um domínio de ligação ao ligante extracelular com uma região rica em cisteína, um domínio transmembranar, e um domínio citoplasmático, com a atividade prevista da cinase de serina/treonina.

[059] Os inibidores de ActrIIA para serem usados nas composições e métodos aqui descritos incluem, sem limitação, os polipeptídeos solúveis ActrIIA de ligação a ativina; Os anticorpos que se ligam a ativina (particularmente as subunidades ativina A ou B, também conhecidas como βA ou βB) e interromper a ligação ActrIIA; anticorpos que se ligam a ActrIIA e interrompem a ligação a ativina; proteínas não-anticorpo selecionadas para ativina ou ligação de ActrIIA (Vide, por exemplo, WO/2002/088171, WO/2006/055689, WO/2002/032925, WO/2005/037989, US 2003/0133939, e US 2005/0238646, cada dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade, para exemplos de tais proteínas e métodos para a criação e seleção dos mesmos); e peptídeos selecionadas para ligação a ativina ou ActrIIA, que podem ser conjugados com um domínio Fc randomizados.

[060] Em certas formas de realização, duas ou mais proteínas diferentes (ou outras partes) com a ativina ou a atividade de ligação a ativina ActrIIA, especialmente agentes ligantes que bloqueiam o tipo I (por exemplo, um tipo de receptor de ativina solúvel I) e tipo II (por exemplo, um polímero solúvel receptor de ativina de tipo II) os locais de ligação, respectivamente, podem ser ligados em conjunto para criar uma molécula de ligação bifuncional ou multifuncional que inibe ActrIIA e, portanto, pode ser usado nas composições e métodos aqui descritos. Em certas formas de realização, o eixo de sinalização de antagonistas Ativina-ActrIIA que inibem a ActrIIA incluem aptâmeros de ácido nucleico, moléculas pequenas e outros agentes que são utilizados nas composições e métodos aqui descritos.

Inibidores de ActRIIA Compreendendo polipeptídeos de ActRIIA

[061] O termo "polipeptídeo ActrIIA " inclui polipeptídeos que compreendem qualquer polipeptídeo que ocorre naturalmente de um membro da família ActrIIA, bem como quaisquer variantes do mesmo (incluindo mutantes, fragmentos, fusões e formas de peptidomiméticos) que retêm uma atividade útil. Por exemplo, polipeptídeos ActrIIA incluem polipeptídeos derivados da sequência de qualquer ActrIIA conhecida possuindo uma sequência de, pelo menos, cerca de 80% idêntica à sequência de um polipeptídeo ActrIIA, e opcionalmente, pelo menos, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% , 99% ou mais de identidade. Por exemplo, um polipeptídeo ActrIIA pode ligar-se a e inibir a função de uma proteína ActrIIA e/ou ativina. Um polipeptídeo de ActRIIB pode ser selecionado pela sua capacidade de promover o crescimento ósseo e mineralização óssea. Exemplos de polipeptídeos ActrIIA incluem ActrIIA precursor polipeptídico humano (SEQ ID NO: 1) e polipeptídeos solúveis ActrIIA humanos (por exemplo, SEQ ID NOs: 2, 3, 7 e 12). No que diz respeito ao precursor polipeptídeo ActrIIA cuja sequência de aminoácidos é representada na SEQ ID NO: 1, o peptídeo de sinal do polipeptídeo precursor ActrIIA humano localizado nas posições de aminoácidos 1 a 20; o domínio extracelular está localizado nas posições dos aminoácidos 21-135 e os locais de glicosilação ligados a N do polipeptídeo precursor ActrIIA humana (SEQ ID NO: 1) estão localizados nas posições dos aminoácidos 43 e 56 da SEQ ID NO: 1. A sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo precursor de ActRIIB humano de SEQ ID NO: 1 é divulgada como SEQ ID NO: 4 (nucleótidos 164-1705 de entrada no Genbank NM_001616). A sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo ActrIIA humana solúvel de SEQ ID NO: 2 é divulgada como SEQ ID NO: 5. Ver Tabela 6 para uma descrição das sequências.

[062] Em formas de realização específicas, os polipeptídeos ActrIIA utilizados nas composições e métodos aqui descritos são polipeptídeos ActrIIA solúveis. Um domínio extracelular de uma proteína ActrIIA pode ligar-se a ativina e é geralmente solúvel, e, portanto, pode ser denominado um solúvel, polipeptídeo de ligação a ativina ActrIIA. Assim, tal como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo ActrIIA solúvel" refere-se geralmente a polipeptídeos que compreendem um domínio extracelular de uma proteína ActrIIA, incluindo qualquer domínio extracelular de ocorrência natural de uma proteína ActrIIA, bem como quaisquer suas variantes (incluindo mutantes, fragmentos e formas peptidomiméticos). ActrIIA polipeptídeos solúveis se podem ligar à ativina; no entanto, a proteína de tipo selvagem ActrIIA não exibe seletividade significativa na ligação a ativina contra GDF8/11. Proteínas nativas ActrIIA ou alteradas podem ser dadas adicionando especificidade para ativina acoplando-as com um segundo agente de ligação a ativina-seletiva. Exemplos de solúveis, polipeptídeos de ligação a ativina ActrIIA incluem os polipeptídeos solúveis ilustrados nas SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 e 13. Outros exemplos de solúveis, polipeptídeos de ligação a ativina ActrIIA compreendem uma sequência de sinal, para além do domínio extracelular de uma proteína ActrIIA, por exemplo, a sequência líder de melitina do mel de abelha (SEQ ID NO: 8), o líder ativador do plasminogênio tissular (TPA) (SEQ ID NO: 9) ou o líder ActrIIA nativo (SEQ ID NO: 10). O polipeptídeo ActrIIA-hFc ilustrada na SEQ ID NO: 13 usa um líder TPA.

[063] Em certas formas de realização, os inibidores de ActrIIA utilizados nas composições e nos métodos aqui descritos compreendem um conjugado de proteína/de fusão compreendendo um domínio de ligação a ativina de ActrIIA ligada a uma porção Fc de um anticorpo. Em certas formas de realização, o domínio de ligação a ativina é ligada a uma porção Fc de um anticorpo através de um ligante, por exemplo, um ligante peptidico. Opcionalmente, o domínio Fc tem uma ou mais mutações nos resíduos, tais como Asp-265, lisina 322 e Asn- 434. Em certos casos, o domínio Fc mutante possuindo uma ou mais destas mutações (por exemplo, uma mutação de Asp-265) tem uma capacidade reduzida para se ligar ao receptor Fcy em relação a um domínio Fc de tipo selvagem. Em outros casos, o domínio Fc mutante possuindo uma ou mais destas mutações (por exemplo, uma mutação Asn-434) tem uma capacidade aumentada para se ligar a MHC de classe I - Fc associado - receptor (FcRn) relativo a um domínio Fc de tipo selvagem. Exemplos de proteínas de fusão compreendendo um domínio extracelular solúvel de ActrIIA fundido com um domínio Fc são as estabelecidas em SEQ ID NOs: 7, 12, e 13. Exemplo de domínio Fc é estabelecido na SEQ ID NO: 6.

[064] Numa forma de realização específica, os inibidores ActrIIA utilizados nas composições e nos métodos aqui descritos compreendem o domínio extracelular de ActrIIA, ou uma porção do mesmo, ligado a uma porção de Fc de um anticorpo, em que o referido inibidor de ActrIIA compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID NOs: 6, 7, 12 e 13. Numa outra forma de realização específica, os inibidores ActrIIA utilizados nas composições e nos métodos aqui descritos compreendem o domínio extracelular de ActrIIA, ou uma porção do mesmo, ligado a uma porção de Fc de um anticorpo, em que o referido inibidor de ActrIIA compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID NOs: 6, 7, 12, e 13.

[065] Em certas formas de realização, os inibidores de ActrIIA utilizados nas composições e nos métodos aqui descritos compreendem uma forma truncada de um domínio extracelular de ActrIIA. A truncagem pode estar no terminal carboxilo e/ou o terminal amino do polipeptídeo ActrIIA. Em certas formas de realização, a truncagem pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos de comprimento em relação ao domínio extracelular maduro polipeptídeo ActRIIB. Em certas formas de realização, a truncagem pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos N-terminal do polipeptídeo domínio extracelular maduro ActrIIA. Em certas formas de realização, a truncagem pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos C-terminal do polipeptídeo domínio extracelular maduro ActrIIA. Por exemplo, formas truncadas de ActrIIA incluem polipeptídeos com aminoácidos 20-119; 20-128; 20-129; 20-130; 20-131; 20-132; 20-133; 20-134; 20-131; 21-131; 22-131; 23-131; 24-131; 25-131 e, em que as posições de aminoácidos referem-se às posições de aminoácidos em SEQ ID NO: 1.

[066] Em certas formas de realização, os inibidores de ActrIIA utilizados nas composições e nos métodos aqui descritos compreendem um domínio extracelular de ActrIIA com uma ou mais substituições de aminoácidos. Em certas formas de realização, os inibidores de ActrIIA utilizados nas composições e métodos aqui descritos compreendem uma forma truncada de um domínio extracelular de ActrIIA que também transporta uma substituição de aminoácido.

[067] Numa forma de realização específica, o inibidor ActrIIA para ser usado nas composições e métodos aqui descritos é uma proteína de fusão entre o domínio extracelular do receptor humano de ActrIIA e a porção Fc de IgG1. Numa outra forma de realização específica, o inibidor ActrIIA para ser usado nas composições e métodos aqui descritos é uma proteína de fusão entre um domínio extracelular do receptor truncado ActrIIA humano e a porção Fc da IgG1. Numa outra forma de realização específica, o inibidor ActrIIA para ser usado nas composições e métodos aqui descritos é uma proteína de fusão entre um domínio extracelular do receptor truncado ActrIIA humano e a porção Fc da IgG1, em que o domínio extracelular do receptor truncado humano possui ActrIIA uma ou mais substituições de aminoácidos.

[068] Os fragmentos funcionalmente ativos dos polipeptídeos ActrIIA podem ser obtidos, por exemplo, por rastreio de polipeptídeos produzidos de forma recombinante a partir do fragmento correspondente do ácido nucleico codificando um polipeptídeo ActrIIA. Em adição, os fragmentos podem ser sintetizados quimicamente utilizando técnicas conhecidas na arte, tais como a química convencional da fase sólida f-Moc ou t-Boc de Merrifield. Os fragmentos podem ser produzidos (recombinantemente ou por síntese química) e testados para identificar aqueles fragmentos peptidilos que podem funcionar como antagonistas (inibidores) de proteína ActrIIA ou sinalização mediadas por ativina.

[069] Além disso, as variantes funcionalmente ativas de polipeptídeos ActrIIA podem ser obtidas, por exemplo, por rastreio de bibliotecas de polipeptídeos modificados produzidos de forma recombinante a partir dos correspondentes ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo ActrIIA mutagenizado. As variantes podem ser produzidas e testadas para identificar aqueles que podem funcionar como antagonistas (inibidores) de proteína ActrIIA ou sinalização mediada por ativina. Em certas formas de realização, uma variante funcional dos polipeptídeos ActrIIA compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID NOs: 2 ou 3. Em certos casos, a variante funcional tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 2 ou 3.

[070] As variantes funcionais podem ser geradas, por exemplo, pela modificação da estrutura de um polipeptídeo ActrIIA para propósitos tais como melhorar a eficácia terapêutica, ou a estabilidade (por exemplo, a vida de prateleira ex vivo e resistência à degradação proteolítica in vivo). Tais polipeptídeos modificados ActrIIA quando selecionados para reter ativina de ligação, podem ser considerados equivalentes funcionais dos polipeptídeos de ocorrência natural ActrIIA. Polipeptídeo ActrIIAs modificados também podem ser produzidos, por exemplo, por substituição de aminoácidos, deleção ou adição. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, ou uma substituição semelhante de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado (por exemplo, mutações conservativas) não terá um efeito importante sobre a atividade biológica da molécula resultante. Substituições conservativas são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionados nas suas cadeias laterais. Se uma alteração na sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ActrIIA resulta num homólogo funcional pode ser prontamente determinada por avaliação da capacidade da variante polipeptídeo ActrIIA para produzir uma resposta nas células de forma semelhante à polipeptídeo ActrIIA de tipo selvagem.

[071] Em certas formas de realização, o inibidor de ActrIIA para ser usado nas composições e métodos aqui descritos pode compreender um polipeptídeo ActrIIA tendo um ou mais mutações específicas que podem alterar a glicosilação do polipeptídeo. Tais mutações podem introduzir ou eliminar um ou mais sítios de glicosilação, tal como locais de glicosilação ligados em N ou ligados em O. Os locais de reconhecimento de glicosilação ligados a asparagina compreendem geralmente uma sequência de tripeptídeo, asparagina-X-treonina (ou asparagina-X-serina) (em que "X" é qualquer aminoácido) que é especificamente reconhecida por enzimas de glicosilação celular apropriadas. A alteração pode também ser feita pela adição de, ou substituição por um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do polipeptídeo ActrIIA do tipo selvagem (para locais de glicosilação ligados em O). Uma variedade de substituições ou deleções de aminoácidos em uma ou ambas a primeira ou terceira posições de aminoácido de um local de reconhecimento de glicosilação (e/ou cancelamento de aminoácidos na segunda posição) resulta na não glicosilação na sequência tripeptídica modificada. Outro meio de aumentar o número de porções hidrato de carbono em um polipeptídeo ActrIIA é por acoplamento químico ou enzimático de glicósidos ao polipeptídeo ActrIIA. Dependendo do modo de acoplamento utilizado, o(s) açúcar (es) podem ser ligados a (a) arginina e histidina; (B) grupos carboxilo livres; (C) grupos sulfidrilo livres tais como os de cisteína; (D) grupos hidroxilo livres tais como os de serina, treonina, ou hidroxiprolina; (E) resíduos aromáticos tais como os de fenilalanina, tirosina, ou triptofano; ou (f) o grupo amida de glutamina. Estes métodos são descritos em WO 87/05330 publicado em 11 de setembro de 1987, e em Aplin e Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., Pp. 259-306, aqui incorporada por referência. A remoção de uma ou mais porções de hidrato de carbono presentes no polipeptídeo um ActrIIA pode ser realizadas quimicamente e/ou enzimaticamente. A desglicosilação química pode envolve, por exemplo, a exposição do polipeptídeo ActrIIA ao composto ácido trifluorometanossulfónico ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou de todos os açúcares, exceto o açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N- acetilgalactosamina), deixando a sequência de aminoácidos intacta. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin ainda et al .(1987) Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 e por Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118: 131. A clivagem enzimática de porções hidrato de carbono em polipeptídeos ActrIIA pode ser alcançada através da utilização de uma variedade de endo- e exo- glicosidases como descrito por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138: 350. A sequência de um polipeptídeo ActrIIA pode ser ajustada, conforme apropriado, dependendo do tipo de sistema de expressão usado, como células de mamíferos, de leveduras, de insetos e de plantas podem todos apresentar padrões de glicosilação diferentes que podem ser afetados pela sequência de aminoácidos do peptídeo. Em geral, as proteínas ActrIIA para utilização em seres humanos podem ser expressas numa linha celular de mamífero que fornece glicosilação adequada, tal como CHO ou HEK293 linhas celulares, embora outros sistemas de expressão, tais como outras linhas de células de expressão de mamífero, linhas de células de levedura com enzimas de glicosilação modificadas e células de inseto, são esperadas como sendo igualmente úteis.

[072] Além disso, encontram-se fornecidos neste documento, métodos de geração de mutantes, em particular conjuntos de mutantes combinatórias de um polipeptídeo ActrIIA, bem como mutantes truncados; piscinas de mutantes combinatórios são especialmente úteis para a identificação de sequências variantes funcionais. O objetivo do rastreio de tais bibliotecas combinatórias pode ser para gerar, por exemplo, ActrIIA variantes de polipeptídeos que podem atuar como agonistas ou antagonista, ou, em alternativa, que possuem novas atividades de todos juntos. Uma variedade de ensaios de rastreio é fornecida abaixo, e estes ensaios podem ser utilizados para avaliar as variantes. Por exemplo, uma variante de polipeptídeo ActrIIA pode ser rastreada quanto à capacidade de se ligar a um ligante de ActrIIA, para impedir a ligação de um ligante de ActrIIA a um polipeptídeo ActrIIA ou para interferir com a sinalização causado por um ligante ActrIIA.

[073] As variantes derivadas combinatórias podem ser geradas, o que tem uma potência seletiva ou geral, aumentado em relação a um polipeptídeo ActrIIA que ocorre naturalmente. Da mesma forma, a mutagênese pode dar origem a variantes que possuem semi-vida intracelular dramaticamente diferentes do que o Polipeptídeo ActrIIA correspondente de tipo selvagem. Por exemplo, a proteína alterada pode ser tornada mais ou menos estável ou estável à degradação proteolítica ou outros processos celulares que resultam em destruição de, ou de outra forma de inativação de um polipeptídeo ActrIIA nativo. Estas variantes, e os genes que as codificam, podem ser utilizados para alterar os níveis de polipeptídeo ActrIIA modulando a semi-vida dos polipeptídeos ActrIIA. Por exemplo, uma semivida curta pode dar origem a efeitos biológicos mais transitórios e pode permitir um controle mais apertado dos níveis de polipeptídeos recombinantes ActrIIA dentro do paciente. Numa proteína de fusão de Fc, as mutações podem ser efetuadas no ligante (se houver) e/ou a porção Fc para alterar a meia-vida da proteína.

[074] Uma biblioteca combinatória pode ser produzida por meio de uma biblioteca degenerada de genes que codificam uma biblioteca de polipeptídeos que incluem cada um, pelo menos, uma porção de potenciais sequências polipeptídicas ActrIIA. Por exemplo, uma mistura de oligonucleótidos sintéticos pode ser ligada enzimaticamente em sequências de genes de tal modo que o conjunto de degenerado de potenciais sequências de nucleótidos de polipeptídeo ActrIIA é expresso como polipeptídeos individuais, ou alternativamente, como um conjunto de proteínas de fusão maiores (por exemplo, para exibição em fagos).

[075] Existem muitas maneiras pelas quais a biblioteca de potenciais homólogos pode ser geradas a partir de uma sequência oligonucleotídica degenerada. A síntese química de uma sequência genética degenerada pode ser realizada num sintetizador automático de DNA, e os genes sintéticos, em seguida, ser ligado num vetor apropriado para a expressão. A síntese de oligonucleótidos degenerados é bem conhecida na arte (ver por exemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al , (1981) Recombinant DNA,Proc 3rd Cleveland Sympos Macromolecules, ed AG Walton , Amsterdam: Elsevier pp 273-289; Itakura et al , (1984) Annu Rev. Biochem 53:... 323; Itakura et al , (1984) Science 198:.. 1056; Ike et al , (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477). Tais técnicas têm sido empregadas na evolução dirigida de outras proteínas (Vide, por exemplo, Scott et al , (1990) Science 249: 386-390; Roberts et al , (1992) PNAS EUA 89:.. 2429-2433; Devlin et al , (1990) Science 249:.. 404-406; Cwirla et al, (1990) PNAS EUA 87:.. 6.378-6.382; assim como Patente N° US 5.223.409, 5.198.346, e 5.096.815).

[076] Em alternativa, outras formas de mutagênese podem ser utilizadas para gerar uma biblioteca combinatória. Por exemplo, as variantes de polipeptídeo ActrIIA podem ser geradas e isoladas a partir de uma biblioteca de rastreio, utilizando, por exemplo, escaneamento por mutagênese de alanina e similares (Ruf et al , (1994) Biochemistry 33:.. 1565-1572; Wang et al , (1994 ) J. Biol Chem 269:.. 3095-3099; Balint et al, (1993) Gene. 137: 109-118; Grodberg et al, (1993) Eur J. Biochem 218:... 597-601; Nagashima et al , (1993) J. Biol Chem 268:... 2888-2892; Lowman et al , (1991) Biochemistry. 30: 10.832-10.838; e Cunningham et al, (1989) Science 244:. 1081-1085), por escaneamento por mutagênese de ligante (Gustin et al, (1993) Virology 193: 653-660; Brown etal , (1992) Mol Cell Biol. 12: 2644-2652; McKnight et al, (1982) Science 232: 316); por saturação de mutagênese (Meyers et al , (1986) Science 232:. 613); por mutagênese por PCR (Leung et al , (1989) Cell Mol Biol Método 1:. 11-19); ou por mutagênese aleatória, incluindo mutagênese química, etc. (Miller et al, (1992) A Short Course in bacteriana Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY;. e Greener et al, (1994) Mol Biol Estratégias em 7. : 32-34). Escaneamento por mutagênese de Linker, particularmente num ambiente combinatória, é um método atraente para a identificar (bioativos) formas truncadas de polipeptídeos ActrIIA.

[077] Uma ampla variedade de técnicas são conhecidas na técnica para o rastreio de produtos de genes de bibliotecas combinatoriais efetuadas por mutações pontuais e truncagens, e, para esse efeito, para o rastreio de bibliotecas de cDNA para produtos de genes tendo uma determinada propriedade. Tais técnicas serão geralmente adaptáveis para o rastreio rápido de bibliotecas de genes geradas por mutagênese combinatória a polipeptídeos de ActrIIA. As técnicas mais amplamente utilizadas para o rastreio de grandes bibliotecas de genes tipicamente compreendem a clonagem da biblioteca de genes em vetores de expressão replicáveis, a transformação de células apropriadas com a biblioteca de vetores resultante e expressão dos genes combinatórios em condições em que a detecção de uma atividade desejada facilita o isolamento relativamente fácil de o vetor que codifica o gene cujo produto foi detectado. Os ensaios preferidos incluem ensaios de ligação a ativina e de sinalização celular em ensaios com a ativina.

[078] Em certas formas de realização, os polipeptídeos ActrIIA utilizados nos inibidores dos métodos e composições aqui descritos podem ainda compreender a modificações pós-translacionais, em adição às que estão naturalmente presentes nos polipeptídeos ActrIIA. Tais modificações podem incluir, mas não estão limitadas a acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Como resultado, os polipeptídeos ActrIIA modificados podem conter elementos não aminoácidos, tais como polietileno glicóis, lípidos, poli- ou mono-sacarídeo, e fosfatos. Efeitos de tais elementos não aminoácidos sobre a funcionalidade de um polipeptídeo ActrIIA podem ser testados por qualquer método conhecido dos peritos na técnica. Quando um polipeptídeo ActrIIA é produzido em células por clivagem de uma forma do polipeptídeo ActrIIA nascente, o processamento pós-translacional também pode ser importante para a dobragem e/ou a função da proteína correta. Diferentes células (tais como CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 ou células HEK293) tem maquinaria celular específica e mecanismos característicos para as tais atividades pós-translacionais e podem ser escolhidas para assegurar a modificação correta e processamento dos polipeptídeos ActrIIA.

[079] Em certos aspectos, variantes funcionais ou as formas modificadas dos polipeptídeos ActrIIA utilizados nos inibidores dos métodos e composições aqui descritos incluem proteínas de fusão que possuem pelo menos uma porção dos polipeptídeos ActrIIA e um ou mais domínios de fusão. Exemplos bem conhecidos de tais domínios de fusão incluem, mas não estão limitados a poli- histidina, Glu-Glu, glutationa S-transferase (GST), tioredoxina, proteína A, proteína G, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (Fc), proteína de ligação a maltose (MBP), ou albumina de soro humano. Um domínio de fusão pode ser selecionado de modo a conferir uma propriedade desejada. Por exemplo, alguns domínios de fusão são particularmente úteis para o isolamento das proteínas de fusão por cromatografia de afinidade. Para efeitos de purificação por afinidade, são usadas matrizes relevantes para cromatografia de afinidade, tais como resinas conjugadas de glutationa, amilase, e de níquel ou de cobalto. Muitas destas matrizes estão disponíveis em forma de "kit", tal como o sistema de purificação de Pharmacia GST e o QIAexpress.TM. Sistema (Qiagen) usado com parceiros (His6) fusão. Como outro exemplo, um domínio de fusão pode ser selecionado de modo a facilitar a detecção dos polipeptídeos ActrIIA. Exemplos de tais domínios de detecção incluem as várias proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP), assim como "marcadores de epítopo", que são geralmente sequências peptídicas curtas para as quais um anticorpo específico está disponível. Marcadores de epitopo bem conhecidos para o qual os anticorpos monoclonais específicos estão prontamente disponíveis incluem FLAG, hemaglutinina do vírus influenza (HA), e as tags c-myc. Em alguns casos, os domínios de fusão tem um local de clivagem por proteases, tais como para o Fator Xa ou de trombina, o que permite que a protease relevante digira parcialmente as proteínas de fusão e, assim, libertar as proteínas recombinantes deste. As proteínas liberadas podem então ser isoladas a partir do domínio de fusão por subsequente separação cromatográfica. Em certas formas de realização preferidas, um polipeptídeo ActrIIA é fundido com um domínio que estabiliza o polipeptídeo ActrIIA in vivo (um domínio de "estabilizador"). Por "estabilização" entende-se qualquer coisa que aumenta a semi-vida do soro, independentemente do fato de isto é por causa da diminuição da destruição, por diminuição da depuração renal, ou outro efeito farmacocinético. Fusões com a porção Fc de uma imunoglobulina são conhecidas para lhes conferir propriedades farmacocinéticas desejáveis em uma ampla gama de proteínas. Da mesma forma, fusões com albumina do soro humano pode conferir propriedades desejáveis. Outros tipos de domínios de fusão que podem ser selecionados incluem multimerização (por exemplo, dimerização tetramerização), domínios e domínios funcionais (que conferem uma função biológica adicional, tal como a estimulação adicional do crescimento do osso ou crescimento muscular, como desejado).

[080] Entende-se que os diferentes elementos das proteínas de fusão podem ser dispostos de qualquer maneira que seja consistente com a funcionalidade desejada. Por exemplo, um polipeptídeo ActrIIA pode ser colocado C-terminal a um domínio heterólogo, ou, alternativamente, um domínio heterólogo pode ser colocado no terminal C de um polipeptídeo ActrIIA. O domínio polipeptídeo ActrIIA heterólogo e o domínio não precisam ser adjacentes numa proteína de fusão, e os domínios complementares ou sequências de aminoácidos podem ser incluídos terminal C- ou N- de qualquer um dos domínios ou entre os domínios.

[081] Em certas formas de realização, os polipeptídeos ActrIIA utilizados nos inibidores dos métodos e composições aqui descritos podem conter um ou mais modificações que são capazes de estabilizar os polipeptídeos ActrIIA. Por exemplo, tais modificações podem aumentar a semi-vida in vitro dos polipeptídeos ActrIIA, aumentar a meia vida em circulação dos polipeptídeos ActrIIA ou reduzir a degradação proteolítica dos polipeptídeos ActrIIA. Tais modificações podem incluir estabilizantes, mas não estão limitados a proteínas de fusão (incluindo, por exemplo, proteínas de fusão que compreendem um polipeptídeo e um domínio ActrIIA estabilizador), modificações de um local de glicosilação (incluindo, por exemplo, adição de um sítio de glicosilação para um polipeptídeo ActrIIA), e modificações da porção hidrato de carbono (incluindo, por exemplo, a remoção de porções hidrato de carbono a partir de um polipeptídeo ActrIIA). No caso de proteínas de fusão, um polipeptídeo ActrIIA é fundido com um domínio de estabilizador, tal como uma molécula de IgG (por exemplo, um domínio Fe). Tal como aqui utilizado, o termo "domínio estabilizador" refere-se não só a um domínio de fusão (por exemplo, Fc), como no caso das proteínas de fusão, mas também inclui modificações não proteináceos, tais como uma fração de hidrato de carbono, ou um polímero não proteico, tal como o polietileno-glicol.

[082] Em certas formas de realização, formas isoladas e/ou purificadas de polipeptídeos ActrIIA, que são isolados a partir de, ou de outra forma substancialmente isenta de outras proteínas, podem ser utilizados com os métodos e composições aqui descritos. Polipeptídeos ActrIIA podem geralmente ser produzidos pela expressão de ácidos nucleicos recombinantes.

[083] Em certos aspectos, os polipeptídeos ActrIIA utilizados nas composições e métodos aqui descritos são gerados usando ácidos nucleicos isolados e/ou recombinados que codificam quaisquer dos polipeptídeos ActrIIA (por exemplo, polipeptídeos solúveis ActrIIA), incluindo fragmentos, variantes funcionais e proteínas de fusão aqui divulgadas. Por exemplo, SEQ ID NO: 4 que ocorre naturalmente codifica o polipeptídeo precursor ActrIIA humano, enquanto a SEQ ID NO: 5 codifica o domínio extracelular de ActrIIA processado. Tais ácidos nucleicos podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla. Tais ácidos nucleicos podem ser moléculas de DNA ou RNA. Estes ácidos nucleicos podem ser utilizados, por exemplo, em métodos para fazer polipeptídeos ActrIIA ou como agentes terapêuticos diretos (por exemplo, em uma abordagem de terapia de genes).

[084] Certos aspectos, os ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos ActrIIA podem incluir ácidos nucleicos que são variantes de SEQ ID NO: 4 ou 5. Sequências de nucleótidos incluem sequências de variantes que diferem por uma ou mais substituições, adições de nucleótidos ou cancelamentos, tais como variantes alélicas.

[085] Em certas formas de realização, as sequências de ácidos nucleicos isolados ou recombinados que codificam polipeptídeos ActrIIA podem ser pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 4 ou 5. Um perito na técnica apreciará que sequências de ácido nucleico complementares a SEQ ID NO: 4 ou 5, e as variantes de SEQ ID NO: 4 ou 5, podem ser utilizadas na produção de polipeptídeos ActrIIA adequados para utilização nos métodos e composições aqui descritos. Noutras formas de realização, tais sequências de ácidos nucleicos podem ser isoladas, recombinadas e/ou fundidas a uma sequência de nucleótidos heteróloga, ou seja a partir de uma biblioteca de DNA.

[086] Em outras formas de realização, os ácidos nucleicos utilizados na fabricação de polipeptídeos ActrIIA adequados para utilização nos métodos e composições aqui descritos podem incluir sequências de nucleótidos que hibridam sob condições altamente rigorosas com a sequência de nucleótidos designada por SEQ ID NO: 4 ou 5, sequência complementar da SEQ ID NO: 4 ou 5, ou seus fragmentos. Um perito na técnica compreenderá que as condições de estringência adequadas que promovem a hibridação de DNA podem ser variadas. Por exemplo, é possível realizar a hibridação a citrato/cloreto de sódio 6,0 vezes de sódio (SSC) a cerca de 45 graus Celsius, seguido de uma lavagem de SSC 2,0 vezes a 50 graus Celsius. Por exemplo, a concentração de sal no passo de lavagem pode ser selecionada de uma baixa estringência de cerca de 2,0 vezes SSC a 50 graus Celsius para uma estringência elevada de cerca de 0,2 vezes SSC a 50 graus Celsius. Além disso, a temperatura no passo de lavagem pode ser aumentada desde condições de baixa estringência à temperatura ambiente, cerca de 22 graus Celsius, com as condições de elevada estringência a cerca de 65 graus Celsius. Tanto a temperatura como o sal podem ser variados ou a temperatura ou a concentração de sal pode ser mantida constante enquanto a outra variável é alterada. Numa forma de realização, os ácidos nucleicos que hibridam em condições de estringência baixa de SSC 6 vezes, à temperatura ambiente, seguido por uma lavagem em duas vezes SSC à temperatura ambiente pode ser utilizado com os métodos e composições aqui descritos.

[087] Os ácidos nucleicos isolados, que diferem dos ácidos nucleicos, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 4 ou 5, devido à degenerescência do código genético, também pode ser utilizado na produção de polipeptídeos ActrIIA adequados para utilização nos métodos e composições aqui descritos. Por exemplo, um número de aminoácidos é designado por mais de um tripleto. Os codões que especificam o mesmo aminoácido, ou sinônimos (por exemplo, CAU e CAC são sinônimos para a histidina) podem resultar em mutações "silenciosas" que não afetam a sequência de aminoácidos da proteína. No entanto, espera-se que polimorfismos de sequência de DNA que conduzam a alterações nas sequências de aminoácidos das proteínas sujeitas a existir entre células de mamífero. Um perito na técnica apreciará que estas variações em um ou mais nucleótidos (até de cerca de 3-5% dos nucleótidos) dos ácidos nucleicos que codificam para uma proteína particular podem existir entre indivíduos da mesma espécie, devido à variação alélica natural.

[088] Em certas formas de realização, os ácidos nucleicos recombinados podem ser operacionalmente ligados a uma ou mais sequências de nucleótidos de regulação de um construto de expressão. Sequências de nucleótidos reguladoras serão geralmente apropriadas à célula hospedeira utilizada para expressão. Numerosos tipos de vetores de expressão apropriados e sequências reguladoras adequadas são conhecidos na técnica para uma variedade de células hospedeiras. Tipicamente, a referida uma ou mais sequências de nucleótidos reguladoras podem incluir, mas não se limitam a, sequências promotoras, sequências líder ou de sinal, locais de ligação ribossomal, de início da transcrição e sequências de terminação, sequências de início e de terminação da tradução, e sequências estimuladoras ou ativadoras. Os promotores constitutivos ou indutíveis como conhecidos na técnica são aqui contempladas. Os promotores podem ser promotores que ocorrem naturalmente ou promotores híbridos, que combinam elementos de mais de um promotor. Uma construção de expressão pode estar presente numa célula em um epissoma, tal como um plasmídeo, ou a construção de expressão pode ser inserida num cromossoma. Numa forma de realização preferida, o vetor de expressão contém um gene marcador selecionável para permitir a seleção de células hospedeiras transformadas. Os genes marcadores selecionáveis são bem conhecidos na técnica e variarão com a célula hospedeira utilizada.

[089] Em certos aspectos, um ácido nucleico utilizado na produção de polipeptídeos ActrIIA adequados para utilização nos métodos e composições aqui descritos podem ser proporcionados num vetor de expressão compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um polipeptídeo ActrIIA e operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência reguladora. As sequências reguladoras são reconhecidas na técnica e são selecionadas para expressão do polipeptídeo ActrIIA dirigir. Assim, o termo sequência reguladora inclui promotores, potenciadores e outros elementos de controle da expressão. Exemplos de sequências reguladoras estão descritas em Goeddel; Gene Expression Technology:. Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, na Califórnia (1990). Por exemplo, qualquer um de uma ampla variedade de sequências de controle de expressão que controlam a expressão de uma sequência de DNA quando operacionalmente ligada a ela pode ser utilizada nestes vetores para expressar sequências de DNA que codificam um polipeptídeo ActrIIA. Tais sequências de controle da expressão úteis, incluem, por exemplo, os promotores precoce e tardio de SV40, o promotor tet, adenovirus ou o promotor precoce imediato de citomegalovírus, promotores RSV, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, promotor T7 cuja expressão é dirigida por RNA polimerase T7, as principais regiões operadoras e promotoras de fago lambda, as regiões de controle da proteína de revestimento fd, o promotor para 3-fosfoglicerato-quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de fosfatase ácida, por exemplo, Pho5, os promotores dos fatores de levedura α-acasalamento, o promotor do poliedro do sistema de baculovírus e outras sequências que se sabe controlarem a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou os seus vírus, e várias combinações destes. Deve ser entendido que a concepção do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada e/ou o tipo de proteína que se deseja expressar. Além disso, o número de cópias do vetor, a capacidade de controlar esse número de cópias e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tais como marcadores de antibióticos, devem também ser consideradas.

[090] Um ácido nucleico recombinado utilizado na produção de Polipeptídeos ActrIIA adequados para utilização nos métodos e composições aqui descritos pode ser produzido ligando o gene clonado, ou uma sua porção, num vetor adequado para expressão em células procarióticas, eucarióticas (células de levedura, aves, insetos ou mamíferos), ou ambos. Os veículos de expressão para a produção de um polipeptídeo recombinado ActrIIA incluem plasmídeos e outros vetores. Por exemplo, vetores adequados incluem plasmídeos dos tipos: plasmídeos derivados de pBR322, plasmídeos pEMBL, plasmídeos derivados de pEX, plasmídeos derivados pBTac e plasmídeos derivados de pUC-derivado para a expressão em células procarióticas, tais como E. coli.

[091] Alguns vetores de expressão de mamífero contêm sequências procarióticas para facilitar a propagação do vetor em bactérias, e uma ou mais unidades de transcrição eucarióticas que são expressas em células eucarióticas. O pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTK2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, vetores PKO-neo e pHyg são exemplos de vetores de expressão de mamífero adequado para transfecção de células eucarióticas. Alguns destes vetores são modificados com sequências de plasmídeos bacterianos, como pBR322, para facilitar a replicação e seleção de resistência a drogas em células procarióticas e eucarióticas. Alternativamente, derivados de vírus tais como o vírus do papiloma bovino (BPV-1), ou vírus de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP e p205) podem ser usados para a expressão transitória de proteínas em células eucarióticas. Exemplos de outros sistemas virais (por exemplo retroviral) expressão pode ser encontrada abaixo na descrição de sistemas de entrega de terapia genética. Os vários métodos empregados na preparação dos plasmídeos e transformação de organismos em hospedeiros são bem conhecidos na técnica. Para outros sistemas de expressão adequados para células procarióticas e eucarióticas, bem como procedimentos recombinados gerais, ver Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., Ed. por Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Em alguns casos, pode ser desejável expressar os polipeptídeos recombinados através da utilização de um sistema de expressão de baculovírus. Exemplos de tais sistemas de expressão de baculovírus incluem vetores derivados de pVL (como pVL1392, pVL1393 e pVL941), vetores derivados de pAcUW (tais como pAcUW1), e vetores derivados de pBlueBac (tais como o β-gal contendo pBlueBac III).

[092] Os vetores podem ser concebidos para a produção do citado polipeptídeos ActrIIA em células CHO, tal como um vetor pCMV-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), os vetores de pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) e vetores de pCI-neo (Promega, Madison, Wis.). Como será evidente, as construções dos citados genes podem ser usadas para causar a expressão dos citados polipeptídeos ActrIIA em células propagadas em cultura, por exemplo, para a produção de proteínas, incluindo proteínas de fusão ou proteínas variantes, para purificação.

[093] As células hospedeiras transfectadas com um gene recombinado que inclui uma sequência de codificação (por exemplo, SEQ ID NO: 4 ou 5) para um ou mais dos polipeptídeos ActrIIA pode ser utilizada na produção de polipeptídeos ActrIIA adequados para utilização nos métodos e das composições aqui descritas. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, um polipeptídeo ActrIIA aqui proporcionado pode ser expresso em células bacterianas tais como E. coli, células de inseto (por exemplo, utilizando um sistema de expressão de baculovírus), leveduras, ou células de mamíferos. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas dos peritos na técnica.

[094] Por conseguinte, são fornecidos aqui métodos para produzir os polipeptídeos ActrIIA. Por exemplo, uma célula hospedeira transfectada com um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo ActrIIA pode ser cultivada sob condições adequadas para permitir que ocorra a expressão do polipeptídeo ActrIIA. O polipeptídeo ActrIIA pode ser segregado e isolado a partir de uma mistura de células e meio contendo o polipeptídeo ActrIIA. Alternativamente, o polipeptídeo ActrIIA pode ser retido citoplasmaticamente ou numa fração de membrana e as células colhidas, lisadas e a proteína isolada. A cultura de células inclui células hospedeiras, mídia e outros subprodutos. Os meios adequados para a cultura de células são bem conhecidos na técnica. Os polipeptídeos ActrIIA podem ser isolados a partir de meio de cultura celular, células hospedeiras, ou ambos, utilizando técnicas conhecidas na técnica para a purificação de proteínas, incluindo cromatografia de permuta iónica, cromatografia de filtração em gel, ultrafiltração, electroforese, purificação por imunoafinidade com anticorpos específicos para epitopos particulares do Polipeptídeos ActrIIA e purificação de afinidade com um agente que se liga a um domínio fundido com o polipeptídeo ActrIIA (por exemplo, uma coluna de proteína A pode ser utilizada para purificar uma fusão ActrIIA-Fc). Numa forma de realização preferida, o polipeptídeo ActrIIA é uma proteína de fusão contendo um domínio que facilita a sua purificação. Numa forma de realização, a purificação é conseguida por uma série de passos de cromatografia de coluna, incluindo, por exemplo, três ou mais dos seguintes, por qualquer ordem: cromatografia em proteína A cromatografia, cromatografia em Q-Sepharose, cromatografia fenilsefarose, cromatografia de exclusão de tamanho e de permuta catiónica. A purificação pode ser completada com filtração viral e troca de tampão. Tal como aqui demonstrado, as proteínas de ActrIIA-hFc foram purificadas para uma pureza> 98%, como determinado por cromatografia de exclusão de tamanho e> 95%, como determinado por SDS- PAGE. Este nível de pureza era suficiente para atingir os efeitos desejados sobre o osso em ratos e um perfil de segurança aceitável em camundongos, ratos e primatas não-humanos.

[095] Numa outra forma de realização, um gene que codifica a fusão de uma sequência líder de purificação, tais como um poli- (His)/local de clivagem de enteroquinase sequência na extremidade N-terminal da parte desejada de um polipeptídeo recombinado ActrIIA, pode permitir a purificação do expressa a proteína de fusão por cromatografia de afinidade utilizando uma resina do metal Ni2 +. A sequência líder de purificação pode então ser subsequentemente removida por tratamento com enterocinase para fornecer o polipeptídeo ActrIIA purificado (por exemplo, ver Hochuli et al , (1987) J. Chromatography 411:. 177; e Janknecht et al , PNAS EUA 88:. 8972).

[096] As técnicas para fazer genes de fusão são bem conhecidas. Essencialmente, a junção de vários fragmentos de DNA que codificam para diferentes sequências polipeptídicas é realizada de acordo com técnicas convencionais, empregando terminais com extremidades cegas ou afiadas para ligação, digestão com enzimas de restrição para proporcionar terminais apropriados, preenchimento de extremidades coesivas como adequado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar ligações indesejáveis, e ligação enzimática. Numa outra forma de realização, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizadores de DNA automatizados. Em alternativa, a amplificação por PCR de fragmentos de genes pode ser realizada utilizando iniciadores de ancoragem que dão origem a saliências complementares entre dois fragmentos de genes consecutivos que podem subsequentemente ser emparelhados para gerar uma sequência de genes quimérica (Vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. . Ausubel et al, John Wiley & amp; Sons: 1992).

[097] A proteína de fusão ActrIIA-Fc pode ser expressa em células CHO- DUKX Bl 1 estavelmente transfectadas de um vetor pAID4 (ori/potenciador de SV40, promotor de CMV), utilizando uma sequência de comando de plasminogênio de tecido de SEQ ID NO: 9. A porção Fc é uma sequência de Fc IgGl humano, como apresentado na SEQ ID NO: 7. Em certas formas de realização, após expressão, a proteína contida tem, em média, entre cerca de 1,5 e 2,5 moles de ácido siálico por molécula de proteína de fusão de ActrIIA-Fc.

[098] Em certas formas de realização, a meia-vida longa no soro de uma fusão ActrIIA-Fc pode ser 25-32 dias em pacientes humanos. Além disso, o material expresso da célula CHO pode ter uma maior afinidade para o ligante de ativina B do que a relatada para uma proteína de fusão ActrIIA-hFc expressa em 293 células humanas (del Re et al , J Biol Chem 17 de Novembro 2004;.. 279 (51) : 53.126-35). Além disso, sem estar limitado pela teoria, o uso da sequência de comando TPA pode fornecer uma maior produção do que outras sequências líder e, ao contrário ActrIIA-Fc expressa com um líder nativa, podem proporcionar uma sequência N-terminal altamente puro. O uso de uma sequência líder nativa pode resultar em duas espécies principais de ActrIIA-Fc, cada uma tendo uma sequência N-terminal diferente.

INIBIDORES DA ACTRIIB

[099] Tal como aqui utilizado, o termo "ActRIIB" refere-se a uma família de receptor de tipo IIB da ativina (proteínas ActRIIB) de quaisquer espécies e variantes derivadas a partir de tais proteínas ActRIIB por mutagênese ou outra modificação. Referência a ActRIIB aqui entende-se uma referência a qualquer uma das formas do receptor atualmente identificados. Os membros da família de ActRIIB são geralmente proteínas transmembranares, compostas por um domínio extracelular de ligação ao ligante com uma região rica em cisteína, um domínio transmembranar, e um domínio citoplasmático, com a atividade da cinase de serina/treonina prevista.

[100] Inibidores ActRIIB para serem usados nas composições e métodos aqui descritos incluem, sem limitação, os polipeptídeos solúveis ActRIIB de ligação a ativina; Os anticorpos que se ligam a ativina (particularmente as subunidades ativina A ou B, também conhecidos como SSA ou SSB) e interromper a ligação ActRIIB; anticorpos que se ligam a ActRIIB e interrompem ligação a ativina; proteínas que não anticorpos selecionados para ligação de ativina ou de ActRIIB; e peptídeos selecionados para ligação a ativina ou a ActRIIB, que podem ser conjugados com um domínio Fc randomizados.

[101] Em certas formas de realização, duas ou mais proteínas diferentes (ou outras partes) com a ativina ou a atividade de ligação, especialmente ativina ActRIIB Aglutinantes que bloqueiam o tipo I (por exemplo, um tipo de receptor de ativina solúvel I) e tipo II (por exemplo, um polímero solúvel receptor de ativina de tipo II) os locais de ligação, respectivamente, podem ser ligados em conjunto para criar uma molécula de ligação bifuncional ou multifuncional que inibe a ActRIIB e, portanto, pode ser usada nas composições e métodos aqui descritos. Em certas formas de realização, antagonistas de sinalização do eixo de Ativina-ActrIIAB que inibem a ActRIIB incluem aptâmeros de ácido nucleico, moléculas pequenas e outros agentes são utilizados nas composições e métodos descritos e aqui inclusos.

Inibidores deActRIIB CompreendendoPolipeptídeos ActRIIB

[102] Conforme aqui utilizado, o termo "Polipeptídeo ActrIIB" refere-se a polipeptídeos que compreendem qualquer polipeptídeo que ocorre naturalmente de um membro da família de ActRIIB, bem como quaisquer suas variantes (incluindo mutantes, fragmentos, fusões e formas de peptidomiméticos) que retêm uma atividade útil. Por exemplo, polipeptídeos ActRIIB incluem polipeptídeos derivados da sequência de qualquer receptor de ActRIIB conhecido possuindo uma sequência, pelo menos, cerca de 80% idêntica à sequência de um polipeptídeo de ActRIIB, e opcionalmente, pelo menos, 85%, 90%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% ou mais de identidade. Por exemplo, um polipeptídeo de ActRIIB podem ligar-se e inibir a função de uma proteína de ActRIIB e/ou ativina. Um exemplo de um polipeptídeo de ActRIIB inclui o polipeptídeo precursor de ActRIIB humana (SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28). No que diz respeito ao precursor de polipeptídeo de ActRIIB cuja sequência de aminoácidos é representada como SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 (ou seja, o polipeptídeo precursor de ActRIIB humano), o peptídeo de sinal do polipeptídeo precursor de ActRIIB está localizado nos aminoácidos 1 a 18; o domínio extracelular está localizado nos aminoácidos 19-134 e os potenciais locais de glicosilação ligada a N estão localizados nas posições dos aminoácidos 42 e 65. A sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo precursor de ActRIIB humano de SEQ ID NO: 16 é revelada como SEQ ID NO: 19 (SEQ ID NO: 19 fornece uma alanina no codão correspondente à posição de aminoácido 64, mas poderia ser facilmente modificados por um perito na técnica usando métodos conhecidos na técnica para proporcionar uma arginina no codão correspondente a amino posição ácido em vez de 64). Ver Tabela 6 para uma descrição das sequências.

[103] A numeração dos aminoácidos para todos os polipeptídeos relacionados com ActRIIB aqui descritos baseia-se na numeração de aminoácidos para a SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 28 (que só diferem no aminoácido expresso na posição 64), a menos que especificado de outro modo especificamente. Por exemplo, se for um polipeptídeo de ActRIIB é descrito como tendo uma substituição/mutação na posição de aminoácido 79, em seguida, é para ser entendido que a posição 79 refere-se ao aminoácido 79 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28, a partir de que o polipeptídeo é derivado de ActRIIB. Da mesma forma, se for um polipeptídeo de ActRIIB é descrito como tendo uma alanina ou uma arginina na posição de aminoácido 64, em seguida, é para ser entendido que a posição 64 refere-se ao ácido amino 64a na SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28, a partir de que o polipeptídeo é derivado de ActRIIB.

[104] Em certas formas de realização, os inibidores de ActRIIB utilizados nas composições e nos métodos aqui descritos compreendem os polipeptídeos que compreendem um domínio de ligação a ativina de ActRIIB. Em algumas formas de realização, os domínios de ligação a ativina de ActRIIB compreendem o domínio extracelular de ActRIIB, ou uma porção sua. Em concretizações específicas, o domínio extracelular ou uma porção sua de ActRIIB é solúvel. Formas modificadas de polipeptídeos ilustrativos ActRIIB são reveladas na Publicação dos Pedidos de Patente n° US 20090005308 e 20100068215, as revelações das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[105] Em formas de realização específicas, os polipeptídeos ActRIIB utilizados nas composições e métodos aqui descritos são polipeptídeos solúveis ActRIIB. O termo "polipeptídeo de ActRIIB solúvel" refere-se geralmente a polipeptídeos que compreendem um domínio extracelular de uma proteína de ActRIIB, incluindo qualquer domínio extracelular de ocorrência natural de uma proteína de ActRIIB, bem como quaisquer de suas variantes (incluindo mutantes, fragmentos e formas peptidomiméticos). Polipeptídeo ActrIIBs solúveis podem ligar-se à ativina; no entanto, a proteína ActRIIB de tipo selvagem não exibe seletividade significativa na ligação a ativina contra GDF8/11. Em certas formas de realização, formas alteradas de ActRIIB com diferentes propriedades de ligação podem ser usadas nos métodos aqui fornecidos. Tais formas alteradas são divulgadas, por exemplo, na publicação dos pedidos de patente internacional Nos. WO 2006/012627 e WO 2010/019261, as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Proteínas ActRIIB nativas ou alteradas podem ser dadas adicionando especificidade para ativina acoplando-as com um segundo, agente de ligação a ativina-seletiva. Exemplos de polipeptídeos ActRIIB solúveis incluem o domínio extracelular de um polipeptídeo de ActRIIB humano (por exemplo, SEQ ID NOs: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, e 43).

[106] Uma proteína de fusão Fc que possui a sequência extracelular ActRIIB divulgada por Hilden et al . (Blood, 1994, 83 (8): 2163-70), que possui uma alanina na posição correspondente ao aminoácido 64 da sequência precursora de aminoácido de ActRIIB, isto é, SEQ ID NO: 16 (aqui referida como "A64" ), tem sido demonstrado que possuem uma afinidade relativamente baixa para a ativina e GDF-11. Em contraste, uma proteína de fusão Fc com uma arginina na posição 64 da sequência precursora de aminoácido ActRIIB (aqui referido como "R64") tem uma afinidade para a ativina e GDF-11 na baixa gama nanomolar a picomolar elevada (Vide, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US No. 20100068215, a descrição da qual é aqui incorporada na sua totalidade). Uma sequência precursora de aminoácido ActRIIB com uma arginina na posição 64 é apresentada na SEQ ID NO: 28. Como tal, em determinadas formas de realização, os polipeptídeos ActRIIB utilizado de acordo com as composições e métodos aqui descritos podem compreender ou (i) uma alanina na posição correspondente ao aminoácido 64 da sequência de ActRIIB precursor de aminoácido, isto é, SEQ ID NO: 16; ou (ii) uma arginina na posição 64 da sequência precursora de aminoácido ActRIIB, isto é, SEQ ID NO: 28. Noutras formas de realização, os polipeptídeos ActRIIB utilizados de acordo com as composições e métodos aqui descritos podem compreender um aminoácido que não está alanina ou arginina na posição correspondente ao aminoácido 64 da sequência de ActRIIB precursor de aminoácido, isto é, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28.

[107] Foi demonstrado que o cancelamento do nó prolina na extremidade C-terminal do domínio extracelular de ActRIIB reduz a afinidade do receptor para ativina (Vide, por exemplo, Attisano et al., Cell, 1992, 68 (1 ): 97-108). Uma proteína de fusão ActRIIB-Fc contendo os aminoácidos 20-119 da SEQ ID NO: 28 (isto é, SEQ ID NO: 32), "ActRIIB (20-119) -Fc" reduziu a ligação a GDF-11 e ativina em relação a uma proteína de fusão ActRIIB-Fc contendo aminoácidos 20-134 de SEQ ID NO: 28 (isto é, SEQ ID NO: 31), "ActRIIB (20-134) -Fc", que inclui a região do nó prolina e o domínio justamembrana completa. No entanto, uma proteína de fusão de ActRIIB-Fc contendo os aminoácidos 20-129 da SEQ ID NO: 28, "ActRIIB (20-129) -Fc" retém uma atividade similar, mas um tanto reduzida em relação ao domínio extracelular não truncado de ActRIIB, embora região de nó de prolina seja interrompida. Assim, os polipeptídeos que compreendem domínios extracelulares ActRIIB que param no aminoácido 134, 133, 132, 131, 130 e 129 de SEQ ID NO: 28 (ou SEQ ID NO: 16) são esperados para ser ativados, mas construções parar no aminoácido 134 ou 133 pode ser mais ativo. Do mesmo modo, não se espera que mutações em qualquer um dos resíduos 129134 alterem a afinidade de ligação ao ligante por uma larga margem, tal como indicado pelo fato de que as mutações de P129 e P130 de SEQ ID NO: 28 sem diminuir substancialmente a ligação do ligando. Portanto, os polipeptídeos ActRIIB utilizados de acordo com os métodos e composições aqui descritos podem terminar tão cedo como o aminoácido 109 (isto é, a cisteína final) de SEQ ID NO: 28 (ou SEQ ID NO: 16), no entanto, terminando em forma ou entre as posições de aminoácidos 109 e 119 da SEQ ID NO: 28 (ou SEQ ID NO: 16) espera- se que tenham a capacidade de ligação do ligante reduzida.

[108] O aminoácido 29 da SEQ ID NO: 16 e a SEQ ID NO: 28 representam a cisteína inicial da sequência precursora de ActRIIB. Espera-se que um polipeptídeo de ActRIIB começando no aminoácido 29 do terminal N da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28, ou antes destas posições de aminoácidos, retenha a atividade de ligação do ligante. Uma mutação de alanina para asparagina na posição 24 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 apresenta uma sequência de glicosilação N-ligada, sem afetar substancialmente a ligação do ligante. Isto confirma que as mutações na região de clivagem entre o peptídeo de sinal e a região de cisteína reticulada, correspondente aos aminoácidos 20-29 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28, são bem toleradas. Em particular, os polipeptídeos ActRIIB começando na posição do aminoácido 20, 21, 22, 23 e 24 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 reterão atividade, e polipeptídeos ActRIIB início nas posições de aminoácidos 25, 26, 27, 28 e 29 de SEQ ID NO: 28, também se espera que mantenham a atividade de: 16 ou SEQ ID NO. Um polipeptídeo de ActRIIB começando na posição do aminoácido 22, 23, 24 ou 25 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 terá a maior parte da atividade.

[109] Em conjunto, as partes ativas (isto é, polipeptídeos ActRIIB) da proteína precursora de ActRIIB (isto é, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28) para serem utilizadas de acordo com os métodos e composições aqui descritos compreendem geralmente os aminoácidos 29-109 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28, e os citados polipeptídeos ActRIIB podendo, por exemplo, começar num resíduo correspondente a qualquer um dos aminoácidos 19-29 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 e no fim, numa posição correspondendo a qualquer um dos aminoácidos 109-134 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28. Exemplos específicos de polipeptídeos ActRIIB aqui englobadas incluem aquelas que começam a uma posição de aminoácido 19-29, 20-29 ou 21-29 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 e terminam numa posição de aminoácido de 119- 134, 119-133 ou 129-134, 129-133 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28. Outros exemplos específicos de polipeptídeos ActRIIB aqui englobadas incluem aquelas que começam a uma posição de aminoácido 20-24 (ou 21-24, ou 22-25) da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 e no fim de um aminoácido posição 109-134 (ou 109-133), 119-134 (ou 119-133) ou 129-134 (ou 129-133) da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28. Os polipeptídeos variantes de ActRIIB que se inserem nestas gamas são também contemplados, particularmente aqueles possuindo pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência ou homologia de sequência com a parte correspondente da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28.

[110] Em certas formas de realização, os inibidores de ActRIIB utilizados nas composições e nos métodos aqui descritos compreendem uma forma truncada de um domínio extracelular de ActRIIB. A truncagem pode estar no terminal carboxilo e/ou o terminal amino do polipeptídeo de ActRIIB. Em certas formas de realização, a truncagem pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos de comprimento em relação ao domínio extracelular maduro polipeptídeo ActrIIB. Em certas formas de realização, a truncagem pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos N-terminal do domínio extracelular maduro polipeptídeo ActrIIB. Em certas formas de realização, a truncagem pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou C-terminal aminoácidos do domínio extracelular maduro polipeptídeo ActrIIB. Por exemplo, formas truncadas de ActRIIB incluem polipeptídeos com aminoácidos 20-119; 20-128; 20-129; 20-130; 20-131; 20-132; 20-133; 20-134; 20-131; 21-131; 22-131; 23-131; 24-131; 25-131 e, em que as posições de aminoácidos referem-se às posições de aminoácidos em SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28.

[111] Formas truncadas exemplares adicionais de ActRIIB incluem (i) polipeptídeos que começam nos aminoácidos em qualquer um dos aminoácidos 21-29 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 (opcionalmente começando a 22-25 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28) e terminando em qualquer um dos aminoácidos 109-134 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28; (Ii) polipeptídeos começando em qualquer um dos aminoácidos 20-29 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 (opcionalmente começando a 22-25 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28) e terminando em qualquer de aminoácidos 109-133 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28; (Iii) polipeptídeos começando em qualquer um dos aminoácidos 20-24 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 (opcionalmente começando a 22-25 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28) e terminando em qualquer de aminoácidos 109-133 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28; (Iv) os polipeptídeos começando em qualquer um dos aminoácidos 21-24 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 e terminando em qualquer um dos aminoácidos 109-134 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28; (V) os polipeptídeos começando em qualquer um dos aminoácidos 20-24 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 e terminando em qualquer um dos aminoácidos 118-133 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28; (Vi) os polipeptídeos começando em qualquer um dos aminoácidos 21-24 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 e terminando em qualquer um dos aminoácidos 118-134 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28; (Vii) os polipeptídeos começando em qualquer um dos aminoácidos 20-24 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 e terminando em qualquer um dos aminoácidos 128-133 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28; (Viii) os polipeptídeos começando em qualquer um dos aminoácidos 20-24 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 e terminando em qualquer um dos aminoácidos 128-133 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28; (Ix) os polipeptídeos começando em qualquer um dos aminoácidos 21-29 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 e terminando em qualquer um dos aminoácidos 118-134 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28; (X) polipeptídeos começando em qualquer um dos aminoácidos 2029 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 e terminando em qualquer um dos aminoácidos 118-133 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28; (Xi) polipeptídeos começando em qualquer um dos aminoácidos 21-29 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 e terminando em qualquer um dos aminoácidos 128-134 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28; e (xii) os polipeptídeos começando em qualquer um dos aminoácidos 20-29 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 e terminando em qualquer um dos aminoácidos 128-133 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28. Numa forma de realização específica, uma polipeptídeos ActRIIB compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em uma sequência de aminoácidos começando no aminoácido da posição 25 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 e terminando no aminoácido da posição 131 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28. Numa outra forma de realização específica, um polipeptídeo de ActRIIB consiste em, ou consiste essencialmente da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, ou 43.

[112] Qualquer um dos polipeptídeos ActRIIB utilizados nas composições e métodos aqui descritos podem ser produzidos como um homodímero. Qualquer um dos polipeptídeos ActRIIB utilizados nas composições e métodos aqui descritos podem ser formulados na forma de uma proteína de fusão que tem uma porção heteróloga que compreende uma região constante de uma cadeia pesada de IgG, tal como um domínio Fc. Qualquer um dos polipeptídeos ActRIIB utilizados nas composições e métodos aqui descritos podem compreender um aminoácido acídico na posição correspondente à posição 79 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28, opcionalmente em combinação com uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais, deleções ou inserções relativamente à SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28.

[113] Em formas de realização específicas, os inibidores de ActRIIB utilizados nas composições e nos métodos aqui descritos compreendem um domínio extracelular de ActRIIB com uma ou mais substituições de aminoácidos/mutações. Tal substituição/mutação de aminoácidos pode ser, por exemplo, uma troca de leucina na posição do aminoácido 79 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28, a um aminoácido acídico, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico. Por exemplo, a posição L79 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 podem ser alteradas domínio extracelular do Polipeptídeo ActrIIBs para conferir propriedades de ligação ativina-miostatina alterada (GDF-11). As mutações L79A e L79P reduzem o ligante a GDF-11 se ligar a um maior grau do que ativina de ligação. L79E e L79D são mutações retém GDF-11 de ligação, ao mesmo tempo demonstrando bastante ativin vinculativo reduzido.

[114] Em certas formas de realização, os inibidores de ActRIIB utilizados nas composições e métodos aqui descritos compreendem uma forma truncada de um domínio extracelular de ActRIIB que também transporta uma substituição de aminoácido, por exemplo, uma troca de leucina na posição do aminoácido 79 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28, a um aminoácido acídico, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico. Numa forma de realização específica, a forma truncada de um domínio extracelular do polipeptídeo de ActRIIB que também transporta uma substituição de aminoácido utilizados nas composições e métodos aqui descritos é a SEQ ID NO: 23. Formas de ActRIIB que são truncados e/ou transportam uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser ligadas a um domínio Fc de um anticorpo, como discutido acima.

[115] Fragmentos funcionalmente ativos de polipeptídeos de ActRIIB podem ser obtidas, por exemplo, por rastreio de polipeptídeos produzidos de forma recombinada a partir do fragmento correspondente do ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de ActRIIB. Em adição, os fragmentos podem ser sintetizados quimicamente utilizando procedimentos conhecidos na técnica, tais como a química convencional da fase sólida f-Moc ou t-Boc de Merrifield. Os fragmentos podem ser produzidos (recombinadamente ou por síntese química) e testados para identificar aqueles fragmentos peptidilos que podem funcionar como antagonistas (inibidores) de proteína de ActRIIB ou de sinalização mediadas por ativina.

[116] Em adição, as variantes funcionalmente ativas de polipeptídeos de ActRIIB podem ser obtidas, por exemplo, por rastreio de bibliotecas de polipeptídeos modificados produzidos de forma recombinada a partir dos correspondentes ácidos nucleicos mutagenizados codificam um polipeptídeo de ActRIIB. As variantes podem ser produzidas e testadas para identificar aqueles que podem funcionar como antagonistas (inibidores) de proteína de ActRIIB ou sinalização mediada por ativina. Em certas formas de realização, uma variante funcional dos polipeptídeos ActRIIB compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, e 43. Em certas formas de realização, a variante funcional tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99 % idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, e 43.

[117] Variantes funcionais podem ser geradas, por exemplo, modificando a estrutura de um polipeptídeo de ActRIIB para propósitos tais como melhoria da eficácia terapêutica, ou da estabilidade (por exemplo, a vida de prateleira ex vivo e resistência à degradação proteolítica in vivo). Tais polipeptídeos ActRIIB modificados quando selecionados para reter ligação a ativina, são considerados equivalentes funcionais dos polipeptídeos de ocorrência natural ActRIIB. Polipeptídeo ActrIIBs modificados também podem ser produzidos, por exemplo, por substituição de aminoácidos, cancelamento ou adição. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, ou uma substituição semelhante de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado (por exemplo, mutações conservativas) não tenha um efeito importante sobre a atividade biológica da molécula resultante. Substituições conservativas são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionados nas suas cadeias laterais. Se uma alteração na sequência de aminoácidos de um ActRIIB polipeptídico resultante de um homólogo funcional pode ser prontamente determinado por avaliação da capacidade da variante de Polipeptídeo ActrIIB para produzir uma resposta nas células de forma semelhante à do polipeptídeo ActrIIB do tipo selvagem.

[118] Polipeptídicos mutantes ActRIIB, em particular conjuntos de mutantes combinatórias de um polipeptídeo de ActRIIB, bem como mutantes truncados; conjuntos de mutantes combinatórios são especialmente úteis para a identificação de sequências variantes funcionais podendo ser usados nos métodos e composições aqui descritos. O objetivo do rastreio de tais bibliotecas combinatórias pode ser para gerar, por exemplo, variantes de polipeptídeos ActRIIB que podem atuar como agonistas ou antagonista, ou, em alternativa, que possuem novas atividades de todos juntos.

[119] Foi demonstrado que o bolso de ligação ao ligante de ActRIIB é definido por resíduos Y31, N33, N35, L38 através de T41, E47, E50, Q53, através de K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 através de N83, Y85, R87, A92, E94 e F101 através de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28. Nestas posições, espera-se que as mutações conservativas sejam toleradas, apesar de uma mutação K74A é bem tolerado, como são R40A, K55A, F82A e as mutações na posição L79. O símbolo R40 representa um K em Xenopus, indicando que os aminoácidos básicos nesta posição serão tolerados. Q53 é R em bovinos ActRIIB e K em Xenopus ActRIIB, e, portanto, os aminoácidos incluindo R, K, Q, N e H serão tolerados nesta posição. Assim, uma fórmula geral para um polipeptídeo de ActRIIB para utilização nos métodos e composições aqui descritos é uma que compreenda aminoácidos 29-109 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28, opcionalmente mas começando numa posição de aminoácidos que vão desde 20-24 ou 22-25 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 e terminando na posição de aminoácidos que varia 129-134 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28, e que compreende não mais do que 1 , 2, 5, ou 15 alterações conservadoras de aminoácidos na bolsa de ligação ao ligante, e zero, um ou mais alterações não-conservadoras nas posições de aminoácidos 40, 53,55, 74, 79 e/ou 82 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 no bolso de ligação ao ligante. Um determinado polipeptídeo pode reter ActRIIB maior do que 80%, 90%, 95% ou 99% com relação à identidade de sequência ou de homologia de sequência com a sequência de aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28. Locais fora da bolsa de ligação, em que a variabilidade pode ser particularmente bem tolerada, incluem terminais amino e carboxi do domínio extracelular de ActRIIB, e posicionam 42-46 e 65-73. Uma alteração de alanina para asparagina na posição 65 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 (N65A) melhora realmente ligação no fundo A64 ligante, e é, portanto, espera-se que não têm nenhum efeito prejudicial sobre a ligação no fundo R64 ligante. Esta mudança provavelmente elimina a glicosilação em N65 no fundo A64, demonstrando, assim, que uma mudança significativa nesta região é susceptível de ser tolerada. Enquanto uma mudança R64A é mal tolerada, R64K é bem tolerada, e, portanto, um outro resíduo básico, tal como H, pode ser tolerados na posição 64.

[120] Como um exemplo específico de um polipeptídeo de ActRIIB com uma mutação no domínio de ligação ao ligante, o resíduo de aminoácido positivamente carregado Asp (D80) do domínio de ligação do ligante de ActRIIB pode sofrer mutação para um resíduo de aminoácido diferente tal que a variante de Polipeptídeo ActrIIB liga-se preferencialmente a GDF8, mas não ativina. Numa forma de realização específica, o resíduo D80 é alterado para um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em: um resíduo de aminoácido não carregado, um resíduo de aminoácido negativo, e um resíduo de aminoácido hidrofóbico. Como um exemplo mais específico, a L79 resíduo hidrofóbico pode ser alterado para os aminoácidos acídicos, ácido aspártico ou ácido glutâmico, para reduzir grandemente a ativina de ligação, mantendo a ligação GDF11. Como será reconhecido por um perito na técnica, a maioria das mutações descritas, variantes ou modificações podem ser feitas ao nível do ácido nucleico ou, em alguns casos, por modificação pós-tradução ou síntese química. Tais procedimentos são bem conhecidos na técnica.

[121] Em formas de realização específicas, os inibidores de ActRIIB utilizados nas composições e métodos aqui descritos compreendem um conjugado de proteína/de fusão compreendendo um domínio extracelular (por exemplo, um domínio de ligação a ativina) de um receptor de ActRIIB ligado a uma porção Fc de um anticorpo. Tais proteínas de conjugado/fusão podem compreender qualquer dos polipeptídeos ActRIIB aqui descritos (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, ou 43), quaisquer polipeptídeos ActRIIB conhecidos na técnica, ou quaisquer polipeptídeos ActRIIB gerados usando métodos conhecidos na técnica e/ou aqui proporcionados.

[122] Em certas formas de realização, o domínio extracelular está ligado a uma porção Fc de um anticorpo através de um ligante, por exemplo, um ligante peptidico. Ligantes exemplificativos incluem sequências de polipeptídeo curtas, tais como 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 resíduos de aminoácidos (por exemplo, resíduos de glicina), tais como, por exemplo, um ligante Gly-Gly-Gly. Numa forma de realização específica, o ligante compreende a sequência de aminoácidos Gly-Gly- Gly (GGG). Numa outra forma de realização específica, o ligante compreende a sequência de aminoácidos Thr-Gli-Gli-Gli (TGGG). Opcionalmente, o domínio Fc tem uma ou mais mutações nos resíduos, tais como Asp-265, lisina 322 e Asn- 434. Em certos casos, o domínio Fc mutante possuindo uma ou mais destas mutações (por exemplo, uma mutação de Asp-265) tem uma capacidade reduzida para se ligar ao receptor Fcy em relação a um domínio Fc de tipo selvagem. Em outros casos, o domínio Fc mutante possuindo uma ou mais destas mutações (por exemplo, uma mutação Asn-434) tem uma capacidade aumentada para se ligar a MHC de classe I-receptor relacionado - de Fc (FcRN) em relação a um domínio Fc de tipo selvagem. Exemplos de proteínas de fusão compreendendo um domínio extracelular solúvel de ActRIIB fundido com um domínio Fc são as estabelecidas em SEQ ID NOs: 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, e 47Em certas formas de realização, o domínio extracelular está ligado a uma porção Fc de um anticorpo através de um ligante, por exemplo, um ligante peptidico. Ligantes exemplificativos incluem sequências de polipeptídeo curtas, tais como 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 resíduos de aminoácidos (por exemplo, resíduos de glicina), tais como, por exemplo, um ligante Gly-Gly-Gly. Numa forma de realização específica, o ligante compreende a sequência de aminoácidos Gly- Gly-Gly (GGG). Numa outra forma de realização específica, o ligante compreende a sequência de aminoácidos Thr-Gli-Gli-Gli (TGGG). Opcionalmente, o domínio Fc tem uma ou mais mutações nos resíduos, tais como Asp-265, lisina 322 e Asn- 434. Em certos casos, o domínio Fc mutante possuindo uma ou mais destas mutações (por exemplo, uma mutação de Asp-265) tem uma capacidade reduzida para se ligar ao receptor Fcy em relação a um domínio Fc de tipo selvagem. Em outros casos, o domínio Fc mutante possuindo uma ou mais destas mutações (por exemplo, uma mutação Asn-434) tem uma capacidade aumentada para se ligar a MHC de classe I-receptor relacionado - de Fc (FcRN) em relação a um domínio Fc de tipo selvagem. Exemplos de proteínas de fusão compreendendo um domínio extracelular solúvel de ActRIIB fundido com um domínio Fc são as estabelecidas em SEQ ID NOs: 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, e 47.

[123] Numa forma de realização específica, os inibidores de ActRIIB utilizados nas composições e nos métodos aqui descritos compreendem o domínio extracelular de ActRIIB, ou uma porção do mesmo, ligado a uma porção Fc de um anticorpo, em que o referido inibidor de ActRIIB compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID NOs: 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, e 47. Numa outra forma de realização específica, o inibidores ActRIIB utilizados nas composições e nos métodos aqui descritos compreendem o domínio extracelular de ActRIIB, ou uma porção do mesmo, ligado a uma porção Fc de um anticorpo, em que o referido inibidor de ActRIIB compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID NOs: 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46 e 47.

[124] Numa forma de realização específica, o inibidor de ActRIIB para ser usado nas composições e métodos aqui descritos é uma proteína de fusão entre o domínio extracelular do receptor humano de ActRIIB e a porção Fc de IgG1. Numa outra forma de realização específica, o inibidor de ActRIIB para ser usado nas composições e métodos aqui descritos é uma proteína de fusão entre um domínio extracelular truncado do receptor de ActRIIB humano e a porção Fc da IgG1. Numa outra forma de realização específica, o inibidor de ActRIIB para ser usado nas composições e métodos aqui descritos é uma proteína de fusão entre um domínio extracelular truncado do receptor de ActRIIB humano e a porção Fc da IgG1, em que o domínio extracelular do receptor truncado humano possui ActRIIB uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido 79 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28. Numa concretização, a substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido 79 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 é a substituição de leucina por ácido aspártico (isto é, uma mutação L79D).

[125] Numa forma de realização específica, o inibidor de ActRIIB para ser usado nas composições e métodos aqui descritos é a SEQ ID NO: 24 ou 25, que representa uma proteína de fusão entre o domínio extracelular do receptor humano de ActRIIB e a porção Fc de IgG1, em que o referido ActRIIB domínio extracelular compreende aminoácidos 25-131 da SEQ ID NO: 28 com uma mutação L79D. A sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão ActRIIB-Fc de SEQ ID NO: 24 é apresentada na SEQ ID NO: 45.

[126] Numa outra forma de realização específica, o inibidor de ActRIIB para ser usado nas composições e métodos aqui descritos é a SEQ ID NO: 34 ou 35, que representa uma proteína de fusão entre o domínio extracelular do receptor humano de ActRIIB e a porção Fc de IgG1 , em que o referido ActRIIB domínio extracelular compreendos aminoácidos 25-131 da SEQ ID NO: 16 com uma mutação L79D.

[127] Os locais de reconhecimento de glicosilação ligados a asparagina compreendem geralmente uma sequência de tripeptídeo, asparagina-X- treonina (ou asparagina-X-serina) (em que "X" é qualquer aminoácido) que é especificamente reconhecida por enzimas de glicosilação celular apropriadas. A alteração pode também ser feita pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência de Polipeptídeo ActrIIB do tipo selvagem (para locais de glicosilação ligados em O-). Uma variedade de substituições ou deleções de aminoácidos em uma ou ambas da primeira ou terceira posições de aminoácido de um local de reconhecimento de glicosilação (e/ou deleção de aminoácidos na segunda posição) resulta na não glicosilação na sequência tripeptídica modificada. Outro meio de aumentar o número de porções hidrato de carbono em um polipeptídeo de ActRIIB é por acoplamento químico ou enzimático de glicósidos ao polipeptídeo de ActRIIB. Dependendo do modo de acoplamento utilizado, o(s) açúcar (es) podem ser ligados a (a) arginina e histidina; (B) grupos carboxilo livres; (C) grupos sulfidrilo livres tais como os de cisteína; (D) grupos hidroxilo livres tais como os de serina, treonina, ou hidroxiprolina; (E) resíduos aromáticos tais como os de fenilalanina, tirosina, ou triptofano; ou (f) o grupo amida de glutamina. Estes métodos são descritos no Pedido de Patente Internacional N ° WO 87/05330 publicada 11 de setembro de 1987, e em Aplin e Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., Pp. 259-306, aqui incorporada por referência. A remoção de uma ou mais porções hidrato de carbono presentes no polipeptídeo ActRIIB um pode ser realizada quimicamente e/ou enzimaticamente. A desglicosilação química pode envolver, por exemplo, a exposição do polipeptídeo ActRIIB ao composto ácido trifluorometanossulfónico ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou de todos os açúcares, exceto o açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N- acetilgalactosamina), deixando a sequência de aminoácidos intacta. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin ainda et al .(1987) Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 e por Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118: 131. A clivagem enzimática de porções hidrato de carbono em polipeptídeos ActRIIB pode ser alcançada através da utilização de uma variedade de endo- e exo- glicosidases como descrito por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138: 350. A sequência de um polipeptídeo de ActRIIB pode ser ajustada, conforme apropriado, dependendo do tipo de sistema de expressão usado, como células de mamíferos, de leveduras, de insetos e de plantas podem todos apresentar padrões de glicosilação diferentes que podem ser afetados pela sequência de aminoácidos do peptídeo. Em geral, as proteínas ActRIIB para utilização em seres humanos vão ser expressas numa linha celular de mamífero que fornecem glicosilação adequada, tal como CHO ou HEK293 linhas celulares, embora outros sistemas de expressão, tais como outras linhas de células de expressão de mamífero, linhas de células de levedura com enzimas de glicosilação modificadas e células de inseto, são esperadas como sendo igualmente úteis.

[128] Em formas de realização específicas, os polipeptídeos mutantes ActRIIB compreendendo a adição de um novo local de glicosilação ligada a N (NXS/T) que aumenta a semi-vida no soro de uma proteína de fusão de ActRIIB- Fc, em relação ao ActRIIB (R64)-Fc forma podem ser utilizados nos métodos e composições aqui descritos. Numa forma de realização específica, a introdução de uma asparagina na posição 24 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28 (A24N) resulta na criação de uma sequência de NXT que confere uma meia-vida mais longa. Outras sequências NX (T/S) podem ser encontradas em 42-44 (SNQ) e 65-67 (NSS), embora este último não pode ser eficientemente glicosilada com o R na posição 64 (isto é, em polipeptídeos R64). Sequências NXS/T podem ser geralmente introduzidas em posições fora do bolso de ActRIIB, que está detalhado acima de ligação do ligante. Locais particularmente adequado para a introdução de sequências NXS/T não endógenos incluem os aminoácidos 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 ou 129-134 da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO : 28. Sequências NXS/T também pode ser introduzida no ligante entre a sequência de ActRIIB e Fc ou outro componente de fusão. Tal local pode ser introduzido com um mínimo de esforço através da introdução de um N na posição correta com respeito a um S ou T pré-existente, ou através da introdução de um S ou T na posição correspondente a um pré-existente N. Assim, alterações desejáveis que iria criar um local de glicosilação ligada a N são: A24N, R64N, S67N (eventualmente em combinação com uma alteração N65A), E106N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S e R112T (com todas as posições de aminoácidos correspondentes às posições eles podem ser encontrados na SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 28). Qualquer S, que está previsto para ser glicosilado pode ser alterado para um T, sem criar um sítio imunogénico, por causa da proteção conferida pela glicosilação. Do mesmo modo, todo o T que é previsto para ser glicosilado pode ser alterado para um S. Assim, as alterações S67T e S44T são aqui englobadas. Da mesma forma, em uma variante A24N, uma alteração S26T pode ser usado. Assim, um polipeptídeo de ActRIIB pode incluir um ou mais adicionais, sequências de consenso de glicosilação não-endógenos ligados a N.

[129] Uma variedade de ensaios de rastreio pode ser utilizada para avaliar as variantes polipeptídicas ActRIIB. Por exemplo, uma variante de polipeptídeo de ActRIIB podem ser rastreadas quanto à capacidade de se ligar a um ligante de ActRIIB, para impedir a ligação de um ligante ActRIIB a um polipeptídeo ActRIIB ou para interferir com a sinalização causada por um ligante de ActRIIB. A atividade de um polipeptídeo ActRIIB ou suas variantes podem também ser testadas numa base de células ou no ensaio in vivo.

[130] Variantes combinatórias derivados podem ser geradas, que tem uma potência seletiva ou geralmente aumentada em relação a um polipeptídeo de ocorrência natural de ActRIIB. Da mesma forma, a mutagênese pode dar origem a variantes que possuem semi-vida intracelular dramaticamente diferentes do correspondente de Polipeptídeo ActrIIB de tipo selvagem. Por exemplo, a proteína alterada pode ser tornada mais ou menos estável ou estável à degradação proteolítica ou outros processos celulares que resultam em destruição de, ou de outra forma de inativação de um polipeptídeo nativo ActRIIB. Estas variantes, e os genes que as codificam, podem ser utilizados para alterar os níveis de polipeptídeo ActrIIB por modulação da meia-vida dos polipeptídeos ActRIIB. Por exemplo, uma semivida curta pode dar origem a efeitos biológicos mais transitórios e pode permitir um controle mais apertado dos níveis de Polipeptídeo ActrIIB recombinado dentro do paciente. Numa proteína de fusão de Fc, as mutações podem ser efetuadas no ligante (se houver) e/ou a porção Fc de alterar a meia-vida da proteína.

[131] Uma biblioteca combinatória pode ser produzida por meio de uma biblioteca degenerada de genes que codificam uma biblioteca de polipeptídeos que incluem cada um, pelo menos, uma porção de potenciais sequências polipeptídicas ActRIIB. Por exemplo, uma mistura de oligonucleótidos sintéticos pode ser ligada enzimaticamente em sequências de genes de tal modo que o conjunto degenerado de potenciais sequências de nucleótidos são de Polipeptídeo ActrIIB expresso como polipeptídeos individuais, ou alternativamente, como um conjunto de proteínas de fusão maiores (por exemplo, para exibição em fagos).

[132] Existem muitas maneiras pelas quais a biblioteca de potenciais homólogos pode ser gerada a partir de uma sequência oligonucleotídica degenerada. A síntese química de uma sequência genética degenerada pode ser realizada num sintetizador automático de DNA, e os genes sintéticos, em seguida, serem ligados num vetor apropriado para a expressão. A síntese de oligonucleótidos degenerados é bem conhecida na técnica (ver por exemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al , (1981) Recombinant DNA,Proc 3rd Cleveland Sympos Macromolecules, ed AG Walton , Amsterdam: Elsevier pp 273-289; Itakura et al , (1984) Annu Rev. Biochem 53:... 323; Itakura et al , (1984) Science 198:.. 1056; Ike et al , (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477). Tais técnicas têm sido empregues na evolução dirigida de outras proteínas (Vide, por exemplo, Scott et al , (1990) Science 249: 386-390; Roberts et al , (1992) PNAS EUA 89:.. 2429-2433; Devlin et al , (1990) Science 249:.. 404-406; Cwirla et al, (1990) PNAS EUA 87:.. 6.378-6.382; assim como Patente N ° US 5.223.409, 5.198.346, e 5.096.815).

[133] Em alternativa, outras formas de mutagênese podem ser utilizadas para gerar uma biblioteca combinatória. Por exemplo, as variantes de polipeptídeos ActRIIB podem ser geradas e isoladas a partir de uma biblioteca de rastreio, utilizando, por exemplo, escaneamento por mutagênese de alanina e similares (Ruf et al , (1994) Biochemistry 33:.. 1565-1572; Wang et al , (1994 ) J. Biol Chem 269:.. 3095-3099; Balint et al, (1993) Gene. 137: 109-118; Grodberg et al, (1993) Eur J. Biochem 218:... 597-601; Nagashima et al , (1993) J. Biol Chem 268:... 2888-2892; Lowman et al , (1991) Biochemistry. 30: 10.832-10.838; e Cunningham et al, (1989) Science 244:. 1081-1085), por escaneamento por mutagênese de ligante (Gustin et al, (1993) Virology 193: 653-660; Brown et al , (1992) Mol Cell Biol. 12: 2644-2652; McKnight et al, (1982) Science 232: 316); por mutagênese de saturação (Meyers et al , (1986) Science 232:. 613); por mutagênese por PCR (Leung et al , (1989) Cell Mol Biol Método 1:. 11-19); ou por mutagênese aleatória, incluindo mutagênese química, etc. (Miller et al, (1992) A Short Course in bacteriana Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY;. e Greener et al, (1994) Mol Biol Estratégias em 7. : 32-34). Escaneamento por mutagênese de Linker, particularmente num ambiente combinatório, é um método atraente para a identificação truncada (bioativos) formas de polipeptídeos ActRIIB.

[134] Uma ampla variedade de técnicas são conhecidas na técnica para o rastreio de produtos de genes de bibliotecas combinatoriais efetuadas por mutações pontuais e truncagens, e, para esse efeito, para o rastreio de bibliotecas de cDNA para produtos de genes tendo uma determinada propriedade. Tais técnicas serão geralmente adaptáveis para o rastreio rápido de bibliotecas de genes geradas por mutagênese combinatória a polipeptídeos de ActRIIB. As técnicas mais amplamente utilizadas para o rastreio de grandes bibliotecas de genes tipicamente compreende a clonagem da biblioteca de genes em vetores de expressão replicáveis, a transformação de células apropriadas com a biblioteca de vetores resultante e expressão dos genes combinatórios em condições em que a detecção de uma atividade desejada facilita o isolamento relativamente fácil de o vetor que codifica o gene cujo produto foi detectado. Os ensaios preferidos incluem ensaios de ligação a ativina e de sinalização celular em ensaios com a ativina.

[135] Em certas formas de realização, os polipeptídeos ActRIIB utilizados nos métodos e composições aqui descritos podem ainda compreender a modificações pós-translacionais, em adição às que estão naturalmente presentes nos polipeptídeos ActRIIB. Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Como resultado, os polipeptídeos ActRIIB modificados podem conter elementos não aminoácidos, tais como polietileno glicóis, lípidos, poli- ou mono- sacarídeo, e fosfatos. Efeitos de tais elementos não aminoácidos sobre a funcionalidade de um polipeptídeo de ActRIIB pode ser testada por qualquer método conhecido dos peritos na técnica. Quando um polipeptídeo de ActRIIB é produzido em células por clivagem de uma forma do polipeptídeo nascente de ActRIIB, o processamento pós-translacional também pode ser importante para a dobragem e/ou a função da proteína correto. Diferentes células (tais como CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 ou células HEK293) tem maquinaria celular específica e mecanismos característicos para as atividades tais pós-traducionais e podem ser escolhidos para assegurar a modificação correta e processamento dos polipeptídeos ActRIIB.

[136] Em certos aspectos, variantes funcionais ou as formas modificadas dos polipeptídeos ActRIIB incluem proteínas de fusão que possuem pelo menos uma porção dos polipeptídeos ActRIIB e um ou mais domínios de fusão. Exemplos bem conhecidos de tais domínios de fusão incluem, mas não estão limitados a, poli-histidina, Glu-Glu, glutationa S-transferase (GST), tioredoxina, proteína A, proteína G, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (Fc), proteína de ligação a maltose ( MBP), ou albumina de soro humano. Um domínio de fusão pode ser selecionado de modo a conferir uma propriedade desejada. Por exemplo, alguns domínios de fusão são particularmente úteis para o isolamento das proteínas de fusão por cromatografia de afinidade. Para efeitos de purificação por afinidade, são usadas matrizes relevantes para cromatografia de afinidade, tais como glutationa, amilase-, e resinas de níquel ou de cobalto-conjugado. Muitas destas matrizes estão disponíveis em "kit" forma, tal como o sistema de purificação de Pharmacia GST e o sistema QIAexpressTM (Qiagen) útil (His6) com parceiros de fusão. Como outro exemplo, um domínio de fusão pode ser selecionado de modo a facilitar a detecção dos polipeptídeos ActRIIB. Exemplos de tais domínios de detecção incluem as várias proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP), assim como "marcadores de epítopo", que são geralmente sequências peptídicas curtas para as quais um anticorpo específico está disponível. Marcadores de epitopo bem conhecidos para o qual os anticorpos monoclonais específicos estão prontamente disponíveis incluem FLAG, hemaglutinina do vírus influenza (HA), e as tags c-myc. Em alguns casos, os domínios de fusão tem um local de clivagem por proteases, tais como para o Fator Xa ou de trombina, o que permite que a protease relevante para digerir parcialmente as proteínas de fusão e, assim, libertar as proteínas recombinados deste. As proteínas liberadas podem então ser isoladas a partir do domínio de fusão por subsequente separação cromatográfica. Em certas formas de realização preferidas, um polipeptídeo de ActRIIB é fundido com um domínio que estabiliza a Polipeptídeo ActrIIB in vivo (um domínio de "estabilizador"). Por "estabilização" entende-se qualquer coisa que aumenta a semi-vida do soro, independentemente do fato de isto é por causa da diminuição da destruição, por diminuição da depuração renal, ou outro efeito farmacocinético. Fusões com a porção Fc de uma imunoglobulina são conhecidas para lhes conferir propriedades farmacocinéticas desejáveis em uma ampla gama de proteínas. Da mesma forma, fusões com albumina do soro humano podem conferir propriedades desejáveis. Outros tipos de domínios de fusão que podem ser selecionados incluem multimerização (por exemplo, dimerização tetramerização), domínios e domínios funcionais (que confere uma função biológica adicional, tal como mais a estimulação do crescimento do osso ou crescimento muscular, como desejado).

[137] Entende-se que os diferentes elementos das proteínas de fusão podem ser dispostos de qualquer maneira que seja consistente com a funcionalidade desejada. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser colocado num C-terminal de ActRIIB de um domínio heterólogo, ou, em alternativa, um domínio heterólogo pode ser colocado no terminal C de um polipeptídeo de ActRIIB. O domínio de polipeptídeo de ActRIIB e o domínio heterólogo não precisa ser adjacente numa proteína de fusão, e os domínios complementares ou sequências de aminoácidos podem ser incluídos C- ou N-terminal a qualquer um dos domínios ou entre os domínios.

[138] Em certas formas de realização, os polipeptídeos ActRIIB utilizados nos métodos e composições aqui descritos contêm uma ou mais modificações que são capazes de estabilizar os polipeptídeos ActRIIB. Por exemplo, as modificações aumentam a meia vida in vitro dos polipeptídeos ActRIIB, aumentam a meia vida em circulação dos polipeptídeos ActRIIB ou reduzem a degradação proteolítica dos polipeptídeos ActRIIB. Tais modificações de estabilização incluem, mas não estão limitadas a, proteínas de fusão (incluindo, por exemplo, proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo de ActRIIB e um domínio estabilizador), modificações de um local de glicosilação (incluindo, por exemplo, adição de um local de glicosilação de um Polipeptídeo ActrIIB), e modificações do radical de hidrato de carbono (incluindo, por exemplo, a remoção de porções hidrato de carbono a partir de um polipeptídeo de ActRIIB). No caso de proteínas de fusão, um polipeptídeo de ActRIIB é fundido com um domínio de estabilizador, tal como uma molécula de IgG (por exemplo, um domínio Fc). Tal como aqui utilizado, o termo "domínio estabilizador" refere-se não só a um domínio de fusão (por exemplo, Fc), como no caso das proteínas de fusão, mas também inclui modificações não proteináceos, tais como uma fração de hidrato de carbono, ou um polímero não proteico, tal como o polietileno- glicol.

[139] Em certas formas de realização, os métodos e composições aqui descritos utilizam polipeptídeos ActRIIB isolados ou purificados, ou seja, polipeptídeos ActRIIB que são isolados a partir de, ou de outra forma substancialmente isenta de outras proteínas, podem ser utilizados com os métodos e composições aqui descritos. Polipeptídeos ActRIIB serão geralmente produzidos por expressão de ácidos nucleicos recombinados.

[140] Em certos aspectos, os polipeptídeos ActRIIB utilizados nos métodos e composições aqui descritos são codificados por ácidos nucleicos isolados e/ou recombinados, incluindo fragmentos, variantes funcionais e proteínas de fusão aqui descritas. Por exemplo, SEQ ID NO: 19 codifica a que ocorre naturalmente polipeptídeo ActRIIB precursor humano. Os ácidos nucleicos em questão podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla. Tais ácidos nucleicos podem ser moléculas de DNA ou RNA. Estes ácidos nucleicos podem ser utilizados, por exemplo, em métodos para fazer Polipeptídeo ActrIIBs ou como agentes terapêuticos diretos (por exemplo, em uma abordagem de terapia de genes).

[141] Em certos aspectos, os ácidos nucleicos que podem ser utilizados para produzir polipeptídeos ActRIIB adequados para utilização nos métodos e composições aqui descritas são adicionalmente entendidos como incluindo ácidos nucleicos que são variantes de SEQ ID NO: 19, bem como as variantes dessas sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos ActRIIB solúveis (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam para SEQ ID NOs: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, e 43). Sequências de nucleótidos incluem variantes de sequências que diferem por uma ou mais substituições de nucleótidos, adições ou deleções, tais como variantes alélicas.

[142] Em certas formas de realização, as sequências de ácidos nucleicos isoladas ou recombinadas que podem ser utilizadas para produzir polipeptídeos ActRIIB adequados para utilização nos métodos e composições aqui descritos são, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 19 ou as sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos ActRIIB solúveis (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam para SEQ ID NOs: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 e 43). Alguém com conhecimento razoável na técnica notará que sequências de ácido nucleico complementares a SEQ ID NO: 19 ou as sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos ActRIIB solúveis (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam para SEQ ID NOs: 17, 18, 23, 26, 27 , 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, e 43), e as variantes de SEQ ID NO: 19 ou as sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos ActRIIB solúveis (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam para SEQ ID NOs: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, e 43) podem ser usadas com os métodos e composições aqui descritos. Noutras formas de realização, as sequências de ácidos nucleicos podem ser isoladas, recombinadas e/ou fundidas com uma sequência de nucleótidos heteróloga, ou numa biblioteca de DNA.

[143] Em outras formas de realização, os ácidos nucleicos que podem ser utilizados para produzir polipeptídeos ActRIIB adequados para utilização nos métodos e composições aqui descritos incluem sequências de nucleótidos que hibridam sob condições altamente rigorosas com a sequência de nucleótidos designada por SEQ ID NO: 19 ou os nucleico sequências de ácidos que codificam polipeptídeos ActRIIB solúveis (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam para SEQ ID NOs: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, e 43), complementar a sequência de SEQ ID NO: 19 ou as sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos ActRIIB solúveis (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam para SEQ ID NOs: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37 , 42, e 43), ou os seus fragmentos. Um perito na técnica compreenderá que as condições de estringência adequadas que promovem a hibridação de DNA podem ser variadas. Por exemplo, é possível realizar a hibridação a citrato/cloreto de sódio 6,0 vezes de sódio (SSC) a cerca de 45 graus Celsius, seguido de uma lavagem de SSC 2,0 vezes a 50 graus Celsius. Por exemplo, a concentração de sal no passo de lavagem pode ser selecionada de uma baixa estringência de cerca de 2,0 vezes SSC a 50 graus Celsius para um rigor elevado de cerca de 0,2 vezes SSC a 50 graus Celsius. Além disso, a temperatura no passo de lavagem pode ser aumentada desde condições de baixa estringência à temperatura ambiente, cerca de 22 graus Celsius, com as condições de elevado rigor a cerca de 65 graus Celsius. Tanto a temperatura como o sal podem ser variados ou a temperatura ou a concentração de sal pode ser mantida constante enquanto a outra variável é alterada. Numa forma de realização, os ácidos nucleicos que hibridam em condições de estringência baixa de SSC 6 vezes, à temperatura ambiente, seguido por uma lavagem em duas vezes SSC à temperatura ambiente pode ser utilizado com os métodos e composições aqui descritos.

[144] Os ácidos nucleicos isolados, que diferem dos ácidos nucleicos, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 19 ou as sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos ActRIIB solúveis (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam para SEQ ID NOs: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, e 43) devido à degenerescência no código genético pode também ser usadas para produzir polipeptídeos ActRIIB adequados para utilização nos métodos e composições aqui descritos. Por exemplo, um número de aminoácidos é designado por mais de um tripleto. Os codões que especificam o mesmo aminoácido, ou sinônimos (por exemplo, CAU e CAC são sinônimos para a histidina) podem resultar em mutações "silenciosas" que não afetam a sequência de aminoácidos da proteína. No entanto, espera-se que polimorfismos de sequência de DNA que conduzam a alterações nas sequências de aminoácidos das proteínas sujeitas a existir entre células de mamífero. Um perito na técnica apreciará que estas variações em um ou mais nucleótidos (até de cerca de 3-5% dos nucleótidos) dos ácidos nucleicos que codificam para uma proteína particular podem existir entre indivíduos da mesma espécie, devido à variação alélica natural. Qualquer e todas as variações de nucleótidos e de aminoácidos resultantes polimorfismos podem ser utilizados com os métodos e composições aqui descritos.

[145] Em certas formas de realização, os ácidos nucleicos recombinados que podem ser utilizados para produzir polipeptídeos ActRIIB adequados para utilização nos métodos e composições aqui descritos podem ser operacionalmente ligados a uma ou mais sequências de nucleótidos de regulação de um construto de expressão. Sequências de nucleótidos reguladoras serão geralmente apropriadas à célula hospedeira utilizada para expressão. Numerosos tipos de vetores de expressão apropriados e sequências reguladoras adequadas são conhecidos na técnica para uma variedade de células hospedeiras. Tipicamente, a referida uma ou mais sequências de nucleótidos reguladoras pode incluir, mas não se limita a, sequências promotoras, sequências líder ou de sinal, locais de ligação ribossomal, de início da transcrição e sequências de terminação, sequências de início e de terminação da tradução, e sequências estimuladoras ou ativadoras. Os promotores constitutivos ou indutíveis como conhecidos na técnica podem ser utilizados com os métodos e composições aqui descritos. Os promotores podem ser promotores que ocorrem naturalmente ou promotores híbridos, que combinam elementos de mais de um promotor. Uma construção de expressão pode estar presente numa célula num epissoma, tal como um plasmídeo, ou a construção de expressão pode ser inserida num cromossoma. Numa forma de realização preferida, o vetor de expressão contém um gene marcador selecionável para permitir a seleção de células hospedeiras transformadas. Os genes marcadores selecionáveis são bem conhecidos na técnica e variarão com a célula hospedeira utilizada.

[146] Em certos aspectos, os ácidos nucleicos que podem ser utilizados para produzir polipeptídeos ActRIIB adequados para utilização nos métodos e composições aqui descritos são fornecidos num vetor de expressão compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um polipeptídeo de ActRIIB e operacionalmente ligado a pelo menos um regulador sequência. As sequências reguladoras são reconhecidas na técnica e são selecionadas para a expressão do polipeptídeo de ActRIIB dirigir. Assim, o termo sequência reguladora inclui promotores, potenciadores e outros elementos de controle da expressão. Exemplos de sequências reguladoras estão descritas em Goeddel; Gene Expression Technology:. Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, na Califórnia (1990). Por exemplo, qualquer um de uma ampla variedade de sequências de controle de expressão que controlam a expressão de uma sequência de DNA quando operacionalmente ligada a ela pode ser utilizada nestes vetores para expressar sequências de DNA que codificam um polipeptídeo de ActRIIB. Tais sequências de controle da expressão úteis, incluem, por exemplo, os promotores precoce e tardio de SV40, o promotor tet, adenovirus ou o promotor precoce imediato de citomegalovírus, promotores RSV, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, promotor T7 cuja expressão é dirigida por RNA polimerase T7, as principais regiões operadoras e promotoras de fago lambda, as regiões de controle da proteína de revestimento fd, o promotor para 3-fosfoglicerato-quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de fosfatase ácida, por exemplo, Pho5, os promotores dos fatores de levedura α-acasalamento, o promotor do poliedro do sistema de baculovírus e outras sequências que se sabe controlarem a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou os seus vírus, e várias combinações destes. Deve ser entendido que a concepção do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada e/ou o tipo de proteína que se deseja expressar. Além disso, o número de cópias do vetor, a capacidade de controlar esse número de cópias e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tais como marcadores de antibióticos, devem também ser considerados.

[147] Um ácido nucleico recombinado pode ser produzido ligando o gene clonado, ou uma porção sua, num vetor adequado para expressão em células procarióticas, células eucarióticas (de levedura, aves, insetos ou de mamífero), ou em ambos. Os veículos de expressão para a produção de um polipeptídeo recombinado de ActRIIB incluem plasmídeos e outros vetores. Por exemplo, vetores adequados incluem plasmídeos dos tipos: plasmídeos derivados de pBR322, plasmídeos pEMBL, plasmídeos derivados de pEX, plasmídeos derivados pBTac e plasmídeos derivados de pUC-derivado para a expressão em células procarióticas, tais como E. coli.

[148] Alguns vetores de expressão de mamífero contêm sequências procarióticas para facilitar a propagação do vetor em bactérias, e uma ou mais unidades de transcrição eucarióticas que são expressas em células eucarióticas. O pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTK2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, vetores PKO-neo e pHyg são exemplos de vetores de expressão de mamífero adequado para transfecção de células eucarióticas. Alguns destes vetores são modificados com sequências de plasmídeos bacterianos, como pBR322, para facilitar a replicação e seleção de resistência a drogas em células procarióticas e eucarióticas. Alternativamente, derivados de vírus tais como o vírus do papiloma bovino (BPV-1), ou vírus de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP e p205) podem ser usados para a expressão transitória de proteínas em células eucarióticas. Exemplos de expressão de outros sistemas virais (por exemplo retroviral) pode ser encontrada abaixo na descrição de sistemas de entrega de terapia genética. Os vários métodos empregues na preparação dos plasmídeos e transformação de organismos em hospedeiros são bem conhecidos na técnica. Para outros sistemas de expressão adequados para células procarióticas e eucarióticas, bem como procedimentos recombinados gerais, ver Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., Ed. por Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Em alguns casos, pode ser desejável expressar os polipeptídeos recombinados através da utilização de um sistema de expressão de baculovírus. Exemplos de tais sistemas de expressão de baculovírus incluem vetores derivados de pVL (como pVL1392, pVL1393 e pVL941), vetores derivados de pAcUW (tais como pAcUW1), e vetores derivados de pBlueBac (tais como o β-gal contendo pBlueBac III).

[149] Numa forma de realização, um vetor pode ser concebido para a produção dos polipeptídeos ActRIIB utilizados nos métodos e composições aqui descritos em células CHO, tal como um vetor pCMV-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), os vetores de pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) e pCI-neo vetores (Promega, Madison, Wis.). Como será evidente, as construções de genes no indivíduo podem ser usadas para provocar a expressão dos polipeptídeos de ActRIIB em células propagadas em cultura, por exemplo, para a produção de proteínas, incluindo proteínas de fusão ou proteínas variantes, para purificação.

[150] As células hospedeiras transfectadas com um gene recombinado que inclui uma sequência de codificação (por exemplo, SEQ ID NO: 19 ou as sequências de ácido nucleico que codificam polipeptídeos ActRIIB solúveis (por exemplo, ácidos nucleicos que codificam para SEQ ID NOs: 17, 18, 23, 26 , 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, e 43)) para um ou mais dos polipeptídeos ActRIIB pode ser usado para produzir polipeptídeos ActRIIB adequados para utilização nos métodos e composições aqui descritos. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, um polipeptídeo de ActRIIB pode ser expresso em células bacterianas tais como E. coli, células de inseto (por exemplo, utilizando um sistema de expressão de baculovírus), leveduras, ou células de mamíferos. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas dos peritos na técnica.

[151] Deste modo, são fornecidos aqui métodos para produzir os polipeptídeos ActRIIB utilizados nos métodos e composições aqui descritos. Por exemplo, uma célula hospedeira transfectada com um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo ActRIIB podem ser cultivadas sob condições adequadas para permitir a expressão do polipeptídeo ActRIIB a ocorrer. O polipeptídeo de ActRIIB podem ser segregados e isolados de uma mistura de células e meio contendo o polipeptídeo ActRIIB. Alternativamente, o polipeptídeo ActRIIB pode ser retido citoplasmaticamente ou numa fração de membrana e as células colhidas, lisadas e a proteína isolada. A cultura de células inclui células hospedeiras, mídia e outros subprodutos. Os meios adequados para a cultura de células são bem conhecidos na técnica. Os polipeptídeos ActRIIB pode ser isolado a partir de meio de cultura celular, células hospedeiras, ou ambos, utilizando técnicas conhecidas na técnica para a purificação de proteínas, incluindo cromatografia de permuta iónica, cromatografia de filtração em gel, ultrafiltração, electroforese, purificação por imunoafinidade com anticorpos específicos para epitopos particulares do Polipeptídeo ActrIIBs e purificação de afinidade com um agente que se liga a um domínio fundido com o polipeptídeo de ActRIIB (por exemplo, uma coluna de proteína A pode ser utilizada para purificar uma fusão de ActRIIB-Fc). Numa forma de realização preferida, o polipeptídeo é de ActRIIB uma proteína de fusão contendo um domínio que facilita a sua purificação. Numa forma de realização preferida, a purificação é conseguida por uma série de passos de cromatografia de coluna, incluindo, por exemplo, três ou mais dos seguintes, por qualquer ordem: proteína A cromatografia, cromatografia de Q-Sepharose, cromatografia phenylsepharose, cromatografia de exclusão de tamanho, e de troca catiónica cromatografia. A purificação pode ser completada com filtração viral e troca de tampão. Tal como aqui demonstrado, a proteína ActRIIB -hFc foi purificadao para uma pureza> 98%, como determinado por cromatografia de exclusão de tamanho e> 95%, como determinado por SDS-PAGE. Este nível de pureza era suficiente para atingir os efeitos desejados sobre o osso em ratos e um perfil de segurança aceitável em camundongos, ratos e primatas não-humanos.

[152] Numa outra forma de realização, um gene que codifica a fusão de uma sequência líder de purificação, tais como um poli- (His)/local de clivagem de enteroquinase sequência na extremidade N-terminal da porção desejada do polipeptídeo recombinado ActRIIB, pode permitir a purificação da proteína de fusão expressa por cromatografia de afinidade utilizando uma resina do metal Ni2 +. A sequência líder de purificação pode então ser subsequentemente removida por tratamento com enterocinase para fornecer o polipeptídeo de ActRIIB purificada (por exemplo, ver Hochuli et al , (1987) J. Chromatography 411:. 177; e Janknecht et al , PNAS EUA 88:. 8972).

[153] As técnicas para fazer genes de fusão são bem conhecidas. Essencialmente, a junção de vários fragmentos de DNA que codificam para diferentes sequências polipeptídicas é realizada de acordo com técnicas convencionais, empregando extremidades cegas ou extremidades afiadas para ligação, digestão com enzimas de restrição para proporcionar terminais apropriados, preenchimento de extremidades coesivas como adequada , tratamento com fosfatase alcalina para evitar ligações indesejáveis, e ligação enzimática. Numa outra forma de realização, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizadores de DNA automatizados. Em alternativa, a amplificação por PCR de fragmentos de genes pode ser realizada utilizando iniciadores de ancoragem que dão origem a saliências complementares entre dois fragmentos de genes consecutivos que podem subsequentemente ser emparelhados para gerar uma sequência de genes quimérica (Vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. . Ausubel et al, John Wiley & amp; Sons: 1992).

[154] A proteína de fusão ActRIIB-Fc pode ser expressa em células CHO estavelmente transfectadas DUKX-Bl uma célula a partir de um vetor pAID4 (ori de SV40/potenciador, promotor de CMV), utilizando uma sequência de comando de plasminogênio de tecido de SEQ ID NO: 8. A poro Fc pode compreender uma sequência de Fc IgGl humano, como apresentado na SEQ ID NO: 7. Em certas formas de realização, após expressão, a proteína contida tem, em média, entre cerca de 1,5 e 2,5 moles de ácido siálico por molécula de proteína de fusão ActRIIB -Fc.

[155] Em certas formas de realização, a meia-vida longa no soro de uma fusão de ActRIIB-Fc pode ser de 25-32 dias em pacientes humanos. Além disso, o material expresso da célula CHO pode ter uma maior afinidade para o ligante de ativina B do que a relatada para uma proteína de fusão de ActRIIB-hFc expresso em células 293 humanas (del Re et al , J Biol Chem 17 de Novembro 2004;.. 279 (51) : 53.126-35). Além disso, sem estar limitado pela teoria, o uso da sequência de comando TPA fornecida uma maior produção do que outras sequências líder e, ao contrário de ActRIIB-Fc expressa com um líder nativa, podem proporcionar uma sequência N-terminal altamente puro. A utilização da sequência líder nativa pode resultar em duas espécies principais de ActRIIB-Fc, cada um tendo uma sequência N-terminal diferente.

Outros inibidores do receptor de ActRII

[156] Certas formas de realização, os inibidores de receptores ActRII utilizados nas composições e métodos aqui descritos são compostos de ácidos nucleicos.

[157] Exemplos de categorias de compostos de ácidos nucleicos que inibem receptores ActRII incluem ácidos nucleicos anti-sentido, siRNAi ou RNAi construções e construções de ácidos nucleicos catalíticos. Um composto de ácido nucleico pode ser simples ou de cadeia dupla. Um composto de cadeia dupla pode também incluir regiões de saliência ou não-complementaridade, em que um ou o outro dos cordões é de cadeia simples. Um composto de cadeia simples pode incluir as regiões de auto-complementaridade, o que significa que o composto pode formar uma assim chamado "gancho de cabelo" ou estrutura de "haste-laçada", com uma região de estrutura helicoidal dupla.

[158] Em certas formas de realização, os compostos de ácidos nucleicos que inibem receptores ActRII pode compreender uma sequência de nucleótidos que é complementar a uma região que consiste em não mais do que 1000, não mais do que 500, mais do que 250, mais do que 100 ou mais de 50, 35, 30, 25, 22, 20 ou 18 nucleótidos da sequência de ácido nucleico do receptor ActRII de comprimento completo ou uma sequência de ácido nucleico de ativina (por exemplo, a sequência de ácido nucleico de uma ativina A ou a ativina subunidade B, também referida como βA ou βB). Em formas de realização específicas, a região de complementaridade será de, pelo menos, 8 nucleótidos, e de, opcionalmente, pelo menos 10 ou pelo menos 15 nucleótidos, e, opcionalmente, entre 15 e 25 nucleótidos. Uma região de complementaridade pode cair dentro de um intron, uma sequência de codificação ou uma sequência não codificadora do transcrito alvo, tal como a porção da sequência de codificação. Geralmente, um composto de ácido nucleico que inibe um receptor de ActRII terá um comprimento de cerca de 8 a cerca de 500 nucleótidos ou pares de bases em comprimento, e, opcionalmente, o comprimento será de cerca de 14 a cerca de 50 nucleótidos. Um composto de ácido nucleico que inibe um receptor de ActRII pode ser um DNA (em particular para utilização como um anti-sentido), um RNA, ou um RNA: DNA híbrido. Qualquer uma cadeia pode incluir uma mistura de DNA e RNA, bem como formas modificadas que não pode ser prontamente classificados como DNA ou RNA. Do mesmo modo, um composto de ácido nucleico de cadeia dupla pode ser DNA: DNA, DNA: RNA, ou RNA: RNA, e qualquer um filamento pode também incluir uma mistura de DNA e RNA, bem como formas modificadas que não podem ser facilmente classificados como DNA ou RNA.

[159] Os compostos de ácidos nucleicos que inibem um receptor de ActRII podem incluir qualquer uma das variedades de modificações, incluindo uma ou várias modificações à cadeia principal (a porção de açúcar-fosfato num ácido nucleico natural, incluindo ligações internucleótidos) ou a porção de base (o purina ou pirimidina porção de um ácido nucleico natural). Em certas formas de realização, um composto de ácido nucleico anti-sentido terá um comprimento de cerca de 15 a cerca de 30 nucleótidos e, muitas vezes, conterá uma ou mais modificações para melhorar certas características, tais como estabilidade no soro, estabilidade numa célula, ou a sua estabilidade num lugar em que o composto é susceptível de ser entregue, tais como, por exemplo, o estômago, no caso de compostos por via oral e entregues no pulmão para compostos inalados. No caso de uma construção de RNAi, a cadeia complementar ao transcrito alvo será geralmente RNA ou suas modificações. A outra cadeia pode ser RNA, DNA, ou qualquer outra variação. A porção dúplex de cadeia dupla ou de cadeia simples "hairpin" constructo de RNAi pode, em certas formas de realização, ter um comprimento de 18 a 40 nucleótidos de comprimento e, opcionalmente, cerca de 21 a 23 nucleótidos de comprimento, desde que sirva como um substrato Dicer. Ácidos nucleicos catalíticos ou enzimáticos podem ser ribozimas ou enzimas de DNA e podem também conter formas modificadas. Em certas formas de realização, os compostos de ácidos nucleicos que inibem receptores ActRII podem inibir a expressão do seu alvo em cerca de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, ou mais sob condições fisiológicas e numa concentração onde um controle com ou sem sentido tem pouco ou nenhum efeito. As concentrações para testar o efeito de compostos de ácidos nucleicos incluem 1, 5, 10 micromolar, ou mais.

[160] Em outras formas de realização, os inibidores de receptores ActRII utilizados nas composições e métodos aqui descritos são anticorpos. Tais anticorpos incluem anticorpos que se ligam a ativina (particularmente as subunidades ativina A ou B, também conhecidos como βA ou βB) e interromper o receptor ActRII vinculativo; e anticorpos que se ligam a polipeptídeos receptores ActRII (por exemplo, um polipeptídeo solúvel ou ActrIIA ActRIIB solúvel) e interromper a ligação de ativina.

[161] Ao utilizar imunogênios derivados de um polipeptídeo ActRII receptor de ativina ou um polipeptídeo, anti-proteína/anti-soros anti-peptídeo ou anticorpos monoclonais podem ser feitos por protocolos padrão (Vide, por exemplo, Antibodies:. A Laboratory Manual ed por Harlow e Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Um mamífero, tal como um camundongo, um hamster ou coelho pode ser imunizado com uma forma imunogenética do polipeptídeo ActRII receptor, um fragmento antígeno que é capaz de induzir uma resposta de anticorpos, ou uma proteína de fusão. Técnicas para conferir imunogenicidade numa proteína ou peptídeo incluem a conjugação a transportadores ou outras técnicas bem conhecidas na técnica. Uma porção imunogenética de um receptor de ativina ou de polipeptídeo ActRII pode ser administrado na presença de adjuvante. O progresso da imunização pode ser monitorizado por detecção dos títulos de anticorpo no plasma ou no soro. O padrão ELISA ou outros imunoensaios podem ser utilizados com o imunogênio como antígeno para determinar os níveis de anticorpos.

[162] A seguir à imunização de um animal com uma preparação antigenética de um polipeptídeo ActRII receptor, anti-soro pode ser obtido e, se desejado, os anticorpos policlonais podem ser isolados a partir do soro. Para produzir anticorpos monoclonais, as células produtoras de anticorpos (linfócitos) podem ser colhidas de um animal imunizado e fundidas através de procedimentos de fusão de células somáticas padrão com células tais como imortalizando as células de mieloma para produzir células de hibridoma. Tais procedimentos são bem conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, a técnica do hibridoma (originalmente desenvolvida por Kohler e Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497)., A técnica do hibridoma B humana de células (Kozbar et al , (1983) Immunology Today, 4: 72), e a técnica do hibridoma de EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al , (1985.) Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp 77-96). As células de hibridoma podem ser pesquisadas imunoquimicamente quanto à produção de anticorpos especificamente reativos com um polipeptídeo receptor de ActRII e anticorpos monoclonais isolados a partir de uma cultura compreendendo estas células de hibridoma.

[163] O termo "anticorpo" tal como aqui utilizado, pretende incluir os seus fragmentos que também são especificamente reativos com um determinado polipeptídeo. Os anticorpos podem ser fragmentados utilizando técnicas convencionais e os fragmentos rastreados quanto à utilidade do mesmo modo que descrito acima para anticorpos inteiros. Por exemplo, F(ab)2 podem ser gerados por tratamento do anticorpo com pepsina. O F(ab)2 resultante pode ser tratado para reduzir as pontes persulfureto para produzir fragmentos Fab. Um anticorpo pretende ainda incluir moléculas biespecífica, de cadeia simples, quiméricas, humanizadas e totalmente humanas com afinidade para um receptor ActRII de ativina ou polipeptídeo conferido por pelo menos uma região CDR do anticorpo. Um anticorpo pode compreender ainda um marcador a ele ligado e capaz de ser detectadp (por exemplo, o marcador pode ser um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou uma enzima co-fator).

[164] Em certas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo recombinado, cujo termo abrange qualquer anticorpo gerado, em parte, por meio de técnicas de biologia molecular, incluindo os anticorpos enxertados com CDR ou quiméricos, anticorpos humanos ou outros montados a partir de domínios de anticorpo selecionadas-biblioteca, de cadeia simples anticorpos e anticorpos de domínio único (por exemplo, proteínas humanas VH ou VHH de proteínas dos Camelídeos). Em certas formas de realização, um anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, e em certas formas de realização. Por exemplo, um método para a geração de um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um polipeptídeo receptor ActRII ou polipeptídeo de ativina pode compreender a administração a um rato de uma quantidade de uma composição imunogenética compreendendo o polipeptídeo antígeno eficaz para estimular uma resposta imune detectável, a obtenção de células produtoras de anticorpos (por exemplo, células do baço) do rato e fundindo as células produtoras de anticorpos com células de mieloma para obter hibridomas que produzem anticorpos, e testando os hibridomas produtores de anticorpos para identificar um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao antígeno . Uma vez obtido, um hibridoma podem ser propagado numa cultura de células, opcionalmente, em condições de cultura em que as células de hibridoma derivadas de produzir o anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao antígeno. O anticorpo monoclonal pode ser purificado a partir da cultura celular.

[165] O adjetivo "especificamente reativo com" como usado em referência a um anticorpo pretende significar, como é geralmente entendido na técnica, que o anticorpo é suficientemente seletivo entre o antígeno de interesse (por exemplo, um polipeptídeo receptor de ActRII) e outros antígenos que não são de interesse que o anticorpo é útil para, no mínimo, detectando a presença do antígeno de interesse, em particular de um tipo de amostra biológica. Em certos métodos que empregam o anticorpo, tais como aplicações terapêuticas, um maior grau de especificidade na ligação pode ser desejável. Os anticorpos monoclonais têm, geralmente, uma maior tendência (em comparação com anticorpos policlonais) para discriminar efetivamente entre os antígenos desejados e polipeptídeos de reação cruzada. Uma característica que influencia a especificidade de um anticorpo: antígeno interação é a afinidade do anticorpo para o antígeno. Embora a especificidade desejada possa ser alcançada com uma gama de afinidades diferentes, os anticorpos geralmente preferidos terão uma afinidade (uma constante de dissociação) de cerca de 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 ou menos. Dada a extraordinariamente forte ligação entre a ativina e um receptor de ativina ActRII, espera-se que neutralizando um anticorpo de receptor de anti- ativina ou anti-receptor de ActRII tenha uma dissociação de de 10-10 ou menos.

[166] Além disso, as técnicas utilizadas para rastrear anticorpos, a fim de identificar um anticorpo desejável podem influenciar as propriedades do anticorpo obtido. Por exemplo, se um anticorpo é para ser utilizado para se ligar a um antígeno em solução, pode ser desejável a solução de ensaio de ligação. Uma variedade de diferentes técnicas está disponível para testar a interação entre anticorpos e antígenos para identificar anticorpos particularmente desejáveis. Tais técnicas incluem ensaios ELISA, ensaios de ligação de ressonância de plasmon de superfície (por exemplo, o Biacore.TM. Ensaio de ligação, Biacore AB, Uppsala, Suécia), ensaios em sanduíche (por exemplo, o sistema conta paramagnética de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Md.) , Western blot, ensaios de imunoprecipitação e imuno-histoquímica.

[167] Em certas formas de realização, os inibidores do receptor de ActRII para serem usados nas composições e métodos aqui descritos incluem formas alternativas de ativina, em particular aquelas com alterações no domínio do receptor de tipo I de ligação podem ligar-se a receptores de tipo II e não conseguem formar um ternário ativa complexo. Em certas formas de realização, os ácidos nucleicos, tais como moléculas anti-sentido, RNAsi ou ribozimas que inibam a ativina A, B, C ou E, ou, em particular, a expressão do receptor de ActRII, pode ser usada nas composições e métodos aqui descritos.

[168] Em outras formas de realização, os inibidores de receptores ActRII utilizados nas composições e métodos aqui descritos são proteínas não- anticorpo com atividade antagonista do receptor de ActRII, incluindo a inibina (isto é, da inibina sub-unidade alfa), folistatina (por exemplo, a folistatina-288 e folistatina -315), Cerberus, relacionados com a proteína de foliestatina ("FSRP"), endoglina, ativina C, alfa (2) macroglobulina, e uma M108A (metionina a mudança de alanina na posição 108) mutante ativina A.

[169] Numa forma de realização específica, o inibidor do receptor de ActRII para ser usado nas composições e métodos aqui descritos é um polipeptídeo de foliestatina que antagoniza bioatividade ativina e/ou liga-se a ativina. O termo "polipeptídeo folistatina" inclui polipeptídeos que compreendem qualquer polipeptídeo que ocorre naturalmente da folistatina, bem como quaisquer suas variantes (incluindo mutantes, fragmentos, fusões e formas de peptidomiméticos) que retêm uma atividade útil, e inclui ainda qualquer monómero ou multimero funcional de foliestatina. As variantes de polipeptídeos de foliestatina que retêm as propriedades de ligação a ativina podem ser identificados com base em estudos anteriores envolvendo folistatina e a ativina interacções. Por exemplo, WO2008/030.367, que é aqui incluído por referência na sua totalidade, divulga folistatina domínios específicos ("FSDS") que são mostrados como sendo importantes para a ligação ativina. Polipeptídeos de foliestatina incluem polipeptídeos derivados da sequência de qualquer folistatina conhecida possuindo uma sequência de, pelo menos, cerca de 80% idêntica à sequência de um polipeptídeo folistatina, e opcionalmente, pelo menos, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% ou mais de identidade. Exemplos de polipeptídeos de foliestatina isoformas incluem o polipeptídeo maduro folistatina ou mais curtos ou outras variantes do polipeptídeo precursor folistatina humana, tal como descrito, por exemplo, no documento WO2005/025.601, que é aqui incluído por referência na sua totalidade.

[170] Numa forma de realização específica, o inibidor do receptor de ActRII para ser usado nas composições e métodos aqui descritos é um gene relacionado com folistatina-like (FLRG) que antagoniza bioatividade ativina e/ou liga-se a ativina. O termo "polipeptídeo FLRG" inclui polipeptídeos que compreendem qualquer polipeptídeo que ocorre naturalmente de FLRG, bem como quaisquer variantes suas (incluindo mutantes, fragmentos, fusões e formas de peptidomiméticos) que retêm uma atividade útil. As variantes de polipeptídeos FLRG que retêm propriedades de ligação a ativina podem ser identificadas utilizando métodos de rotina de ensaio e ativina FLRG interações. Vide, por exemplo, Pat N ° US 6.537.966, que é aqui incluída por referência na sua totalidade. FLRG polipeptídeos incluem polipeptídeos derivados da sequência de qualquer FLRG conhecida possuindo uma sequência de, pelo menos, cerca de 80% idêntica à sequência de um polipeptídeo FLRG, e opcionalmente, pelo menos, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade.

[171] Em certas formas de realização, as variantes funcionais ou as formas modificadas dos polipeptídeos de foliestatina e FLRG polipeptídeos incluem proteínas de fusão que possuem pelo menos uma porção dos polipeptídeos ou polipeptídeos de foliestatina FLRG e um ou mais domínios de fusão, tais como, por exemplo, domínios que facilitam isolamento, detecção, a estabilização ou a multimerização do polipeptídeo. Domínios de fusão adequados são discutidos em detalhe acima com referência aos polipeptídeos ActrIIA e ActRIIB. Numa forma de realização, um inibidor do receptor de ActRII é uma proteína de fusão compreendendo uma porção de ligação a ativina de um polipeptídeo fundido com folistatina um domínio de Fe. Numa outra forma de realização, um inibidor do receptor de ActRII é uma proteína de fusão compreendendo uma porção de ligação de um polipeptídeo de ativina FLRG fundido com um domínio Fc.

ENSAIOS ENSAIOS DE DIAGNÓSTICO TURNOVER ÓSSEO

[172] Diversos marcadores circulantes de remodelação óssea podem ser usados para diagnosticar doenças ósseas, tais como baixo turnover ósseo. Marcadores circulantes de turnover ósseo são marcadores de formação óssea tais como a fosfatase alcalina específica do osso (BAP), osteocalcina, pró- colagênio tipo I de propeptídeo de terminal-C (PICP) e alguns marcadores, sendo a insulina-like growth fator-1 (IGF-1) de reabsorção óssea tais como piridinolina, desoxipiridinolina, fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP), tipo de TRAP 5b, piridinolina, desoxipiridinolina e procolágeno tipo I C-terminal telopeptídeo (ICTP), soro ou ligações cruzadas de colágeno na urina (N-telopeptídeo ou C- telopeptídeo), e 25-hidroxivitamina D. Os ensaios para medir toda a molécula de hormônio paratiróide (PTH) pode também ser usados. O especialista na técnica está ciente dos métodos de imagem, permitindo a avaliação de densidade mineral óssea (DMO). Vide, por exemplo, Tilman B. Drueke e Sharon M. Moe, Disturbances of bone and mineral metabolism in chronic kidney disease: an international initiative to improve diagnosis and treatment, Nephrol Dial Transplant (2004) 19: 534-536; Okuno S, Inaba M., Biochemical markers of bone turnover. New aspect. Dialysis and bone metabolic marker, Clin Calcium. 2009 agosto; 19 (8): 1084-1091; Herberth J, Monier-Faugère MC, Mawad HW, Branscum AJ, Herberth Z, Wang G, T Cantor, Malluche HH, Os cinco testes de hormônio paratireoide intacto mais usados são úteis para o rastreio, mas não para o diagnóstico de anormalidades no turnover ósseo em pacientes DRC-5, Clin Nephrol. 2009 julho; 72 (1): 5-14; Lehmann G, Ott U, Kaemmerer D, Schuetze J, Wolf G., Bone histomorphometry and biochemical markers of bone turnover in patients with chronic kidney disease Stages 3 - 5, Clin Nephrol. 2008 outubro; 70 (4): 296-305; Drueke TB., Is parathyroid hormone measurement useful for the diagnosis of renal bone disease?, Kidney Int. 2008 Mar; 73 (6): 674-6; Yamada S, M Inaba, Kurajoh M, Shidara K, Y Imanishi, Ishimura E, Nishizawa Y., Utility of serum tartrate-resistant acid phosphatase (TRACP5b) as a bone resorption marker in patients with chronic kidney disease: independence from renal dysfunction. Clin Endocrinol (Oxf). 2008 agosto; 69 (2): 189-96. Epub 2008 Jan 23. Vide também, Paul D. Miller, Diagnosis and Treatment of Osteoporosis in Chronic Renal Disease de 2009.

[173] Outro marcador para monitorar a reabsorção óssea em pacientes com DRC com disfunção renal leve é concentração sérica de colágeno tipo I N- telopeptídeo (S-NTX). Vide, por exemplo, Hamano T, N Fujii, Nagasawa Y, Isaka Y, Moriyama T, N Okada, Imai E, M Horio, Ito T., Serum NTX is a practical marker for assessing antiresorptive therapy for glucocorticoid treated patients with chronic kidney disease, Bone. 2006 Nov; 39 (5): 1067-1072. Epub 16 de junho de 2006.

[174] Tomografia computorizada quantitativa (QCT) também pode ser utilizado para determinar o turnover ósseo.

MODELO DE DESORDEM ÓSSEA ADINÂMICA

[175] Um modelo de rato para uma doença óssea adinâmica num ambiente renal é a utilização de um modelo de nefrectomia do rato, tal como o modelo de nefrectomia 5/6 utilizados nas Secções 6.2 e 6.3, em que os ratos são alimentados com uma dieta de baixo fosfato.

[176] Em outro modelo de rato, os ratos são submetidos a electrocauterização de uma nefrectomia do rim e do outro rim. Os ratos são alimentados com ração de baixo fosfato suplementado com calcitriol. Vide-se, por exemplo, Lund et al, 2004, J Am Soc Nephrol 15: 349-369.

MARCAÇÃO ÓSSEA POR TETRACICLINA

[177] Um teste de diagnóstico que pode ser usado para determinar o tipo de doença óssea associada à DRC é abiópsia óssea da crista ilíaca com a marcação com tetraciclina dupla e histomorfometria óssea. Vide, por exemplo, National Kidney Foundation: NKF KDOQI Guidelines.

CALCIFICAÇÃO VASCULAR

[178] A tomografia computadorizada (TC) sem contraste para gerar imagens da extensão da calcificação arterial coronariana (CAC) e contraste CT para a angiografia coronária não invasiva (CTA) são desenvolvimentos geralmente utilizados para diagnosticar a doença coronariana obstrutiva. Testes de estresse de radionuclídeos, digitalização de cálcio da artéria coronária, angiografia coronária e não-invasivo para avaliação cardíaca de diagnóstico e prognóstico também pode ser usado. Vide: Berman DS, Shaw LJ, Hachamovitch R, Friedman JD, Polk DM, Hayes SW, Thomson LE, Germano G, Wong ND, Kang X, A. Rozanski, Comparative use of radionuclide stress testing, coronary artery calcium scanning, and noninvasive coronary angiography for diagnostic and prognostic cardiac assessment, Semin Nucl Med. 2007 Jan; 37 (1): 2-16.

[179] Os resultados de rastreio de cálcio coronários de pacientes assintomáticos podem ser utilizados como uma comparação. Por exemplo, os resultados da triagem de cálcio obtido antes do início da doença renal podem ser utilizados como uma comparação quando a calcificação vascular está relacionada com a doença renal.

[180] Os métodos possíveis para detectar e quantificar a calcificação arterial coronária (CAC) incluem, mas não estão limitados a raios-X e tomografia computorizada de perfusão miocárdica de emissão de fóton único tomografia computorizada (SPECT). Moser KW, O'Keefe JH Jr, Bateman TM, McGhie IA., O exame do cálcio coronário em pacientes assintomáticos como um guia para modificação dos fatores de risco e estresse de perfusão miocárdica imagiologia, J Cardiol Nucl. 2003 Nov-Dec; 10 (6): 590-8. Múltiplos detectores de tomografia computadorizada (MDCT) também pode ser utilizado para detectar a calcificação vascular (Vide, por exemplo, Burrill et al , 2007, Postgrad Med J. 83 (985): 698704).

[181] Outro método de diagnóstico para a calcificação vascular é a absorção fluorodeoxyglucose 18 (FDG) de flúor na parede da aorta torácica na tomografia por emissão de pósitrons combinado (PET)/tomografia computadorizada (TC). Vide: Tatsumi M, Cohade C, Y Nakamoto, Wahl RL, Fluorodeoxyglucose uptake in the aortic wall at PET/CT: possible finding for active atherosclerosis, Radiology. Dezembro de 2003; 229 (3): 831-7. Epub 30 de outubro de 2003.

[182] Em outra forma de realização, CT ultrarápida pode ser usada para detectar a presença da doença coronária aterosclerótica. Vide, por exemplo, Breen JF, segundo Sheedy PF, Schwartz RS, Stanson AW, Kaufmann RB, Moll PP, Rumberger JA, Coronary artery calcification detected with ultrafast CT as an indication of coronary artery disease, Radiology. 1992 Nov; 185 (2): 435-9.

[183] A tomografia computadorizada pó feixe de Electron também pode ser usada para diagnosticar a doença arterial coronariana. Vide: Schmermund A, D Baumgart, Sack S, S Mohlenkamp, Gronemeyer D, R Seibel, Erbel R., Assessment of coronary calcification by electron-beam computed tomography in symptomatic patients with normal, abnormal or equivocal exercise stress test, Eur Heart J . 2000 outubro; 21 (20): 1674-1682.

[184] Outro teste para a calcificação vascular que diz respeito à composição da placa na hipertensão pulmonar tromboembólica e plexogênica. Hipertensão pulmonar tromboembólica crônica está associada com placas ateroscleróticas com núcleos pultaceous rico em glicoforina e hipertensão pulmonar plexogênica com placas fibrosas. Material de tromboembólica desempenha um papel crítico na formação de núcleos de pultaceous, dos quais a membrana do eritrócito glicoforina derivado é um componente importante. Desse modo, a hipertensão pulmonar tromboembólica crônica e plexogênica (primária e secundária (síndrome de Eisenmenger) são investigadas. Vide: Arbustini E, Morbini P, D'Armini AM, Repetto A, Minzioni G, Piovella F, Viganó M, L Tavazzi, Plaque composition in plexogenic and thromboembolic pulmonary hypertension: the critical role of thrombotic material in pultaceous core formation, Heart. Aug 2002; 88 (2): 177-82.

[185] A pontuação de Agatston, um sistema de pontuação de cálcio com base em medições de densidade de placas de cálcio depositado, pode ser usado para quantificar a calcificação vascular. Neste sistema, os níveis de calcificação vascular podem ser medidos por múltiplos detectores de tomografia computadorizada (MDCT) e atenuações da taxa de progressão na escala de Agatston pode ser avaliada (Vide, por exemplo, Sharma et al., 2010, Vasc. Health Risk Manag. 6: 603-611).

[186] Além disso, a calcificação vascular pode ser avaliada utilizando os métodos descritos em Adragao et al., 2004, Nephrol. Dial. Transplant 19: 14801488.

[187] Um outro ensaio para utilização na quantificação da calcificação vascular num indivíduo é a pontuação de cálcio específicos de lesão, a qual compreende um método de medição de cálcio que resulta de um exame CT para a calcificação arterial coronária. Este método é descrito por, por exemplo, Akram e Voros, 2008, Int. J. cardiovac. Imaging 14: 743-749.

DOENÇA RENAL

[188] A taxa de filtração glomerular pode ser determinada por qualquer método conhecido dos peritos na técnica para determinar a doença renal. Consulte o site da National Kidney Foundation.

PARATIREOIDISMO SECUNDÁRIO

[189] O hiperparatireoidismo secundário ocorre quando as glândulas paratireóides produzem muito hormônio da paratireóide (PTH) por causa de níveis de cálcio muito baixos ou do aumento dos níveis de fósforo. Cálcio, fósforo, e os níveis de PTH podem ser determinados a partir de amostras de sangue.

HIPERFOSFATEMIA

[190] Os níveis anormalmente elevados de fosfato no sangue podem ser determinados por qualquer método conhecido dos peritos na técnica.

Ensaios de Rastreio

[191] Várias variantes do polipeptídeo ActRII, ou variantes de polipeptídicos ActRII solúveis, podem ser testadas quanto à sua capacidade para inibir a ActRII. Além disso, os compostos podem ser testados quanto à sua capacidade para inibir a ActRII. Uma vez que os inibidores da atividade de ActRII são confirmadas, estes compostos podem ser utilizados com os métodos aqui fornecidos. ActRII pode ser ActrIIA ou ActRIIB. Os ensaios estão descritos abaixo para ActrIIA mas podem ser realizados de forma análoga para a ActRIIB.

[192] Por exemplo, o efeito de uma variante de polipeptídeo ActrIIA sobre a expressão de genes envolvidos na produção do osso ou da destruição óssea pode ser avaliado. Isto pode, se necessário, ser realizado na presença de uma ou mais proteínas ActrIIA recombinadas ligando (por exemplo, ativina), e as células podem ser transfectadas de modo a produzir um polipeptídeo ActrIIA e/ou variantes dos mesmos, e, opcionalmente, um ligante ActrIIA. Do mesmo modo, um polipeptídeo ActrIIA pode ser administrado a um camundongo ou outro animal, e uma ou mais propriedades do osso, tais como a densidade de volume ou podem ser avaliadas. A taxa de cicatrização de fraturas ósseas pode também ser avaliadas. Dual-absorciometria de raios-x (DEXA) é uma técnica bem estabelecida, não invasiva, para a avaliação quantitativa da densidade óssea num animal. Nos seres humanos podem ser utilizados sistemas de DEXA central para avaliar a densidade óssea da coluna vertebral e da bacia. Estes são os melhores preditores de densidade óssea total. Sistemas periféricos DEXA podem ser utilizados para avaliar a densidade óssea nos ossos periféricos, incluindo, por exemplo, os ossos da mão, pulso, pé e tornozelo. Os sistemas tradicionais de imagem de raios-x, incluindo tomografia computadorizada, podem ser usadoss para avaliar o crescimento do osso e a cura da fratura. Além disso, a densidade óssea pode ser medida por meio de tomografia computadorizada quantitativa (QCT). A resistência mecânica do osso pode também ser avaliada.

[193] Em certos aspectos, é aqui proporcionada a utilização de polipeptídeos ActrIIA (por exemplo, polipeptídeos solúveis ActrIIA) e polipeptídeos de ativina para identificar compostos (agentes) que são agonistas ou antagonistas da via de sinalização de Ativina-ActrIIAA. Os compostos identificados por este rastreio podem ser testados para avaliar a sua capacidade para modular o crescimento do osso ou mineralização in vitro. Opcionalmente, estes compostos podem ainda ser testados em modelos animais para avaliar a sua capacidade para modular o crescimento de tecido in vivo.

[194] Existem inúmeras abordagens para a triagem de agentes terapêuticos para modular o crescimento de tecidos, visando ativina e polipeptídeos ActrIIA. Em certas formas de realização, o rastreio de alto rendimento de compostos pode ser efetuado para identificar os agentes que interrompem a ativina ou efeitos mediados ActrIIA sobre o osso. Em certas formas de realização, o ensaio é realizado para rastrear e identificar compostos que inibem especificamente ou reduzem a ligação de um polipeptídeo ActrIIA à ativina. Alternativamente, o ensaio pode ser utilizado para identificar compostos que aumentam a ligação de um polipeptídeo ActrIIA à ativina. Numa outra forma de realização, os compostos podem ser identificados pela sua capacidade para interagir com uma ativina ou Polipeptídeo ActrIIA.

[195] Uma variedade de formatos de ensaio será suficiente e, à luz da presente divulgação, aqueles que não estejam expressamente descritas aqui serão, no entanto, compreendidos por alguém com razoável conhecimento da técnica. Tal como aqui descrito, os compostos de teste (agentes) usados aqui podem ser criados por qualquer método químico combinatório. Alternativamente, os compostos em questão podem ser biomoléculas sintetizadas in vivo ou in vitro que ocorrem naturalmente. Os compostos (agentes) para serem testados para a sua capacidade de atuar como moduladores de crescimento de tecido podem ser produzidos, por exemplo, por bactérias, leveduras, plantas ou outros organismos (por exemplo, produtos naturais), produzidos quimicamente (por exemplo, moléculas pequenas, incluindo peptidomiméticos), ou produzidos de forma recombinada. Os compostos de teste aqui contemplados incluem moléculas não-peptidil orgânicos, peptídeos, polipeptídeos, peptidomiméticos, açúcares, hormônios e moléculas de ácido nucleico. Numa forma de realização específica, o agente de teste é uma pequena molécula orgânica que possui um peso molecular inferior a cerca de 2.000 daltons.

[196] Os compostos de teste podem ser fornecidos como entidades discretas, individuais, ou fornecida em bibliotecas de maior complexidade, tais como feitas por química combinatória. Estas bibliotecas podem compreender, por exemplo, álcoois, halogenetos de alquilo, aminas, amidas, ésteres, aldeídos, éteres e outras classes de compostos orgânicos. Apresentação dos compostos de teste para o sistema de teste podem estar em qualquer forma isolada ou na forma de misturas de compostos, especialmente nos passos iniciais de rastreio. Opcionalmente, os compostos podem ser derivatizados com outros compostos e ter grupos de derivatização que facilitam o isolamento dos compostos. Exemplos de grupos de derivatização não limitativos incluem biotina, fluoresceína, digoxigenina, proteína fluorescente verde, isótopos, poli-histidina, esferas magnéticas, glutationa S-transferase (GST), agentes de reticulação photoativatible ou quaisquer combinações dos mesmos.

[197] Em muitos programas de rastreio de drogas que testam bibliotecas de compostos e extratos naturais, os ensaios de alta produtividade são desejáveis a fim de maximizar o número de compostos pesquisadas em um determinado período de tempo. Os ensaios que são realizados em sistemas livres de células, tais como podem ser derivados com proteínas purificadas ou semi-purificadas, são frequentemente preferidos como pesquisas "primárias" uma vez que podem ser geradas para permitir rápido desenvolvimento e detecção relativamente fácil de uma alteração numa alvo molecular que é mediado por um composto teste. Além disso, os efeitos de toxicidade celular ou biodisponibilidade do composto teste podem ser geralmente ignorados no sistema in vitro, o ensaio em vez de ser focado primariamente no efeito do fármaco no alvo molecular, como pode ser manifesto numa alteração de afinidade de ligação entre um polipeptídeo ActrIIA e ativina.

[198] Apenas para ilustrar, num ensaio de rastreio exemplificativo, o composto de interesse é posto em contato com um isolado e purificado polipeptídeo ActrIIA que normalmente é capaz de se ligar à ativina. À mistura do composto e polipeptídeo ActrIIA é, em seguida, adicionada uma composição que contém um ligante ActrIIA. A detecção e quantificação de complexos ActrIIA/ativina fornece um meio para determinar a eficácia do composto na inibição (ou potenciadora) a formação do complexo entre o polipeptídeo ActrIIA e ativina. A eficácia do composto pode ser avaliada através da geração de curvas de resposta à dose a partir de dados obtidos usando várias concentrações do composto de teste. Além disso, um ensaio de controle pode também ser realizado para fornecer uma linha de base para comparação. Por exemplo, em um ensaio de controle, isolada e purificada a ativina é adicionada a uma composição contendo o polipeptídeo ActrIIA, e a formação do complexo/ativina ActrIIA é quantificada na ausência do composto de teste. Deve entender-se que, em geral, a ordem pela qual os reagentes podem ser misturados pode ser variada, e pode ser misturado em simultâneo. Além disso, em lugar de proteínas purificadas, extratos celulares, os lisados podem ser utilizados para processar um sistema de ensaio apropriado livre de células.

[199] A formação de complexos entre o polipeptídeo ActrIIA e ativina podem ser detectados por uma variedade de técnicas. Por exemplo, a modulação da formação de complexos pode ser quantificada utilizando, por exemplo, proteínas tais como radiomarcado (por exemplo, 32P, 35S, 14C ou 3H), marcado por fluorescência (por exemplo, FITC), ou enzimaticamente marcado polipeptídeo ActrIIA ou ativina detectavelmente marcado, por imunoensaio ou por detecção cromatografica.

[200] Em certas formas de realização, é aqui contemplada a utilização de ensaios de polarização de fluorescência e transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) em ensaios de medição, quer direta ou indiretamente, o grau de interação entre um polipeptídeo ActrIIA e sua proteína de ligação. Além disso, outros modos de detecção, tais como os baseados em guias de ondas ópticos (Publicação PCT WO 96/26432 e Pat. No. US 5.677.196), de ressonância de plasmon de superfície (SPR), os sensores de carga de superfície, e sensores de força de superfície, são compatíveis com muitas formas de realização aqui descritas.

[201] Além disso, um ensaio de armadilha de interação, também conhecido como o "ensaio de dois híbridos", pode ser usado para agentes que interrompem ou potencializam a interação entre um polipeptídeo ActrIIA e sua proteína de ligação de identificação. Vide, por exemplo, Pat. No. US 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268: 12.046-12.054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920-924; e Iwabuchi et al . (1993) Oncogene 8: 1693-1696). Numa forma de realização específica, é aqui contemplada a utilização de dois sistemas híbridos reversa para identificar compostos (por exemplo, moléculas pequenas ou peptídeos) que se dissociam as interações entre um polipeptídeo ActrIIA e sua proteína de ligação. Vide, por exemplo, Vidal e Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27: 919-29; Vidal e Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17: 374-81; e Pat. Nos US 5.525.490.; 5.955.280; e 5.965.368.

[202] Em certas formas de realização, os compostos da presente invenção são identificados pela sua capacidade de interagir com uma ativina ou polipeptídeo ActrIIA. A interação entre o composto e a ativina ou polipeptídeo ActrIIA pode ser covalente ou não-covalente. Por exemplo, esta interação pode ser identificada ao nível da proteína usando métodos bioquímicos in vitro, incluindo foto-reticulação, a ligação do ligante marcado radioativamente, e cromatografia de afinidade (Jakoby WB et al , 1974, Methods in Enzymology 46:. 1). Em certos casos, os compostos podem ser rastreados num ensaio baseado mecanismo, tal como um ensaio para detectar os compostos que se ligam a um ou ativina Polipeptídeo ActrIIA. Isto pode incluir uma fase sólida ou evento de ligação em fase fluida. Alternativamente, o gene que codifica para uma ativina ou polipeptídeo ActrIIA pode ser transfectado com um sistema repórter (por exemplo, β-galactosidase, luciferase ou proteína verde fluorescente) em uma célula e pesquisada na biblioteca de preferência por um rastreio de alto rendimento ou com cada um dos membros a biblioteca. Os ensaios de ligação baseados em outro mecanismo podem ser utilizados, por exemplo, ensaios que detectam alterações na energia livre de ligação. Os ensaios de ligação podem ser realizados com o alvo fixado para um bem, grânulo ou pastilha ou capturado por um anticorpo imobilizado ou resolvidos por electroforese capilar. Os compostos ligados podem ser detectados utilizando normalmente a ressonância de fluorescência ou colorimétrico ou o plasmon de superfície.

[203] Em certos aspectos, aqui são proporcionados métodos e agentes para modular (estimular ou inibir) a formação do osso e aumento da massa óssea. Portanto, qualquer composto identificado pode ser testado em células inteiras ou tecidos, in vitro ou in vivo, para confirmar a sua capacidade para modular o crescimento do osso ou mineralização. Vários métodos conhecidos na técnica podem ser utilizados para este fim. Em particular, os compostos podem ser testados quanto à sua capacidade para aumentar o turnover ósseo.

[204] Por exemplo, o efeito da ativina ou polipeptídeos ActrIIA ou compostos de teste sobre o osso ou crescimento de cartilagem pode ser determinado pela medição da indução de Msx2 ou diferenciação de células osteoprogenitoras em osteoblastos em ensaios baseados em células (Vide, por exemplo, Daluiski et al . , Nat Genet 2001, 27 (1):.. 84-8; Hino et al , Front Biosci 2004, 9: 1520-9). Outro exemplo de ensaios baseados em células inclui analisar a atividade osteogenética da ativina ou polipeptídeos ActrIIA em questão e compostos de teste em células progenitoras mesenquimais e osteoblásticas. Para ilustrar, os adenovírus recombinados que expressam a ativina ou Polipeptídeo ActrIIA podem ser construídos de modo a infectar progenitoras mesenquimais pluripotentes C3H10T1/2, células C2Cl2 preosteoblastic, e osteoblásticas TE-85 células. A atividade osteogenética é então determinada medindo a indução de fosfatase alcalina, a osteocalcina, e mineralização da matriz (Vide, por exemplo, Cheng et al , J. Bone Joint Surg Am 2003, 85-A (8): 1544-1552).

[205] São também proporcionados no presente documento ensaios in vivo para medir o crescimento do osso ou cartilagem. Por exemplo, Namkung- Matthai et al, Osso, 28:. 80-86 (2001) descreve num modelo ratos com osteoporose em que a reparação óssea durante o período inicial após a fratura é estudado. Kubo et al, Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68: 197-202 (1999) também divulga um modelo osteoporótico de rato em que a reparação óssea durante o período tardio após a fratura é estudado. Andersson et al., J. Endocrinol. 170: 529-537 descrevem num modelo de osteoporose em ratos com no qual os ratos são ovariectomizados, o que faz com que os camundongos percam o conteúdo mineral substancial do osso e a densidade mineral do osso, com o osso trabecular perdendo cerca de 50% da densidade mineral óssea. A densidade óssea pode ser aumentada nos ratos ovariectomizados por administração de fatores tais como a hormônio paratireoidei. Em certos aspectos, os ensaios de cura da fratura que são conhecidos na técnica podem ser utilizados. Estes ensaios incluem técnica de fratura, a análise histológica e análise biomecânica, os quais são descritos em, por exemplo, Pat. N ° US 6.521.750, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade para a sua divulgação de protocolos experimentais para causar assim como medir o grau de fraturas, e o processo de reparação.

DOSE

[206] São fornecidos neste pedido métodos para o tratamento da CKD- MBD e/ou doença de baixo turnover ósseo, em que os métodos compreendem a administração a um paciente em necessidade de tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII (ver Seção 5.2). Em certas formas de realização, um inibidor de ActRII é um inibidor de ActrIIA como definido na Seção 5.2 (a). Em outras formas de realização, um inibidor de ActRII é um inibidor de ActRIIB como definido na Seção 5.2 (b). Em certas formas de realização, um inibidor de ActRII é uma combinação de um inibidor de ActrIIA e um inibidor de ActRIIB.

[207] Em certas formas de realização, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII é suficiente para melhorar um sintoma de CKD- MBD. Em certas formas de realização, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII é suficiente para impedir, pelo menos, um sintoma de CKD-MBD de se agravar.

[208] Em certas formas de realização, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII melhora ou estabiliza a função renal. A função renal pode ser medida pela taxa de filtração glomerular. Vide, por exemplo, Seção 5.4 (a) (iv). Em certas formas de realização, uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII é uma dose diária que é suficiente para estabilizar a taxa de filtração glomerular de um paciente CKD- MBD para a duração do tratamento com inibidor de ActRII e durante pelo menos 3 meses, 6 meses, 9 meses, ou 12 meses. Em certas formas de realização, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActrIIA é uma dose diária que é suficiente para aumentar a taxa de filtração glomerular de pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40 %, 45%, ou, pelo menos, 50%.

[209] Em certas formas de realização, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII aumenta o nível de células vermelhas do sangue e/ou os níveis de hemoglobina no paciente.

[210] Em certas formas de realização, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII é efetiva para (a) aumentar células vermelhas do sangue e/ou os níveis de hemoglobina no paciente; (b) melhorar a qualidade óssea e/ou densidade mineral óssea no doente; e (c) melhorar a função renal, no paciente.

[211] Em certas formas de realização, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ActRII é efetiva para (a) aumentar células vermelhas do sangue e/ou os níveis de hemoglobina no paciente; (b) aumentar o volume de negócios óssea no paciente; e (c) melhorar a função renal, no paciente.

[212] Em certas formas de realização, o inibidor de ActRII é dosado a intervalos e quantidades suficientes para atingir as concentrações séricas de 0,2 microgramas/kg ou superior, e níveis de soro de 1 micrograma/kg ou 2 microgramas/kg ou maiores são desejáveis para alcançar efeitos significativos na densidade óssea e força. Os regimes de dosagem podem ser concebidOs para atingir as concentrações plasmáticas de entre 0,2 e 15 microgramas/kg, e, opcionalmente, entre 1 e 5 microgramas/kg. Em humanos, os níveis séricos de 0,2 microgramas/kg podem ser conseguidos com uma dose única de 0,1 mg/kg ou superior e níveis séricos de 1 micrograma/kg pode ser conseguido com uma dose única de 0,3 mg/kg ou superior. O soro, observada a meia-vida da molécula que é de entre cerca de 20 e 30 dias, substancialmente mais longo do que a maioria das proteínas de fusão Fc e, assim, pode ser atingido um nível eficaz sustentado de soro, por exemplo, por administração de 0,2-0,4 mg/kg numa doses semanais ou quinzenais de base, ou mais altos podem ser usados com intervalos mais longos entre dosagens. Por exemplo, as doses de 1-3 mg/kg podem ser utilizadas numa base mensal ou quinzenal, e o efeito sobre o osso pode ser suficientemente duradouro que a dosagem é necessária apenas uma vez a cada 3, 4, 5, 6, 9, 12 ou mais meses.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[213] Em certas formas de realização, os antagonistas de Ativina-ActrIIA (por exemplo, polipeptídeos de ActRII) são formulados com um veículo farmaceuticamente aceitável para utilização com os métodos aqui descritos. Por exemplo, um polipeptídeo ActRII pode ser administrado sozinho ou como um componente de uma formulação farmacêutica (composição terapêutica). Os compostos em questão podem ser formulados para administração em qualquer forma conveniente para uso em medicina humana ou veterinária. ActRII pode ser ActrIIA ou ActRIIB.

[214] Em certas formas de realização, os métodos terapêuticos aqui descritos incluem a administração da composição sistemicamente, ou localmente como um implante ou dispositivo. Quando administradas, as composições terapêuticas aqui utilizadas podem ser, uma forma fisiologicamente aceitável isenta de pirogênios. Agentes terapueticamente úteis que não sejam os antagonistas ActrIIA que podem também opcionalmente ser incluídos na composição como descrito acima, podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente com os compostos em questão (por exemplo, polipeptídeos, tais como ActRII ActrIIA e/ou polipeptídeos ActRIIB (ver Seção 5.2)).

[215] Tipicamente, os antagonistas ActrIIA irão ser administrados por via parentérica. As composições farmacêuticas adequadas para administração parentérica podem compreender um ou mais polipeptídeos de ActRII em combinação com uma ou mais soluções aquosas estéreis isotónicas farmaceuticamente aceitáveis ou soluções não aquosas, dispersões, suspensões ou emulsões, ou pós estéreis que podem ser reconstituídas em soluções injetáveis estéreis ou dispersões imediatamente antes da usar, que pode conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos, solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do receptor pretendido ou agentes de suspensão ou espessantes. Exemplos de transportadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregues nas composições farmacêuticas utilizadas nos métodos aqui descritos incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etilo. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pela utilização de tensioativos.

[216] Além disso, a composição pode ser encapsulada ou injetada numa forma para a entrega a um local do tecido alvo (por exemplo, osso). Em certas formas de realização, as composições utilizadas nos métodos aqui descritos podem incluir uma matriz capaz de entregar um ou mais compostos terapêuticos (por exemplo, polipeptídeos ActrIIA) para um local de tecido alvo (por exemplo, osso), proporcionando uma estrutura para o desenvolvimento de tecido e optimamente capaz de ser reabsorvida pelo corpo. Por exemplo, a matriz pode proporcionar uma libertação lenta dos polipeptídeos ActrIIA. Tais matrizes podem ser formadas de materiais presentemente em utilização para outras aplicações médicas implantadas.

[217] A escolha do material da matriz baseia-se na biocompatibilidade, biodegradabilidade, propriedades mecânicas, aparência cosmética e propriedades de interface. A aplicação particular das composições em questão irá definir a formulação apropriada. As matrizes potenciais para as composições podem ser biodegradáveis e quimicamente definidas sulfato, fosfato tricálcico, hidroxiapatite, ácido poliláctico e polianidridos cálcio. Outros materiais potenciais são biodegradáveis e biologicamente bem definidos, tais como osso ou colágeno dérmico. Matrizes adicionais são compostas por proteínas puras ou componentes de matriz extracelulares. Outras matrizes potenciais são não- biodegradáveis e quimicamente definidas, tais como hidroxiapatite sinterizada, biovidro, aluminatos, ou outras cerâmicas. As matrizes podem ser constituídas por combinações de quaisquer dos tipos de materiais, acima mencionados, tais como ácido poliláctico e hidroxiapatite ou colágeno e fosfato tricálcico. Os biocerâmicos podem ser alterados na composição, tal como em cálcio- aluminato-fosfato e processamento para alterar o tamanho do poro, tamanho da partícula, forma da partícula, e biodegradabilidade.

[218] Em certas formas de realização, as composições utilizadas nos métodos aqui descritos podem ser administradas oralmente, por exemplo, sob a forma de cápsulas, hóstias, pílulas, comprimidos, pastilhas (usando uma base aromatizada, normalmente sacarose e acácia ou tragacanto), pós , grânulos, ou como uma solução ou uma suspensão num líquido aquoso ou não-aquoso, ou como uma emulsão óleo-em-água ou água-em-óleo líquido, ou como um elixir ou xarope, ou como pastilhas (utilizando uma inerte base, tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia) e/ou como lavagens da boca e semelhantes, cada uma contendo uma quantidade predeterminada de um agente, como um ingrediente ativo. Um agente pode também ser administrado na forma de bolus, electuário ou pasta.

[219] Em formas de dosagem sólidas para administração oral (cápsulas, comprimidos, pílulas, drágeas, pós, grânulos, e semelhantes), um ou mais compostos terapêuticos usados nos métodos aqui descritos podem ser misturados com um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis, tal como citrato de sódio ou fosfato dicálcico, e/ou qualquer um dos seguintes: (1) enchimentos ou extensores, tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol, e/ou ácido silícico; (2) ligantes, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e/ou acácia; (3) humectantes, tais como glicerol; (4) agentes de desintegração, tais como ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou de tapioca, ácido algínico, certos silicatos, e carbonato de sódio; (5) solução de agentes, tais como parafina de retardamento; (6) aceleradores de absorção, tais como compostos de amónio quaternário; (7) agentes umectantes, tais como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol; (8) absorventes, tais como caulino e argila de bentonite; (9) lubrificantes, tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietilenoglicóis sólidos, lauril sulfato de sódio, e suas misturas; e (10) agentes corantes. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as composições farmacêuticas também podem compreender agentes tamponantes. As composições sólidas de um tipo semelhante podem também ser empregues como agentes de enchimento em cápsulas de gelatina mole e dura, utilizando excipientes tais como lactose ou açúcares do leite, bem como polietilenoglicóis de elevado peso molecular e semelhantes.

[220] As formas de dosagem líquidas para administração oral incluem emulsões farmaceuticamente aceitáveis, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Em adição ao ingrediente ativo, as formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertes vulgarmente utilizados na técnica, tais como água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsionantes, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, álcool benzílico, benzoato de benzilo, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, óleos (em particular, de semente de algodão, amendoim, milho, germe, azeitona, rícino, e sésamo), glicerol, álcool tetra-hidrofurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácidos gordos de sorbitano, e suas misturas. Para além dos diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes tais como agentes umectantes, agentes emulsionantes e de suspensão, edulcorantes, aromatizantes, corantes, perfumantes e agentes conservantes.

[221] As suspensões, em adição aos compostos ativos, podem conter agentes tais como álcoois isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonite, ágar-ágar e tragacanto, e suas misturas suspensão.

[222] As composições utilizadas nos métodos aqui descritos podem também conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. A prevenção da ação de microorganismos pode ser assegurada pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e semelhantes. Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e outros semelhantes nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

[223] Entende-se que o regime de dosagem será determinado pelo médico assistente considerando vários fatores que modificam a ação dos compostos da invenção utilizados nos métodos aqui descritos (por exemplo, polipeptídeos, tais como ActRII ActrIIA e/ou polipeptídeos ActRIIB (ver Seção 5.2)). Os vários fatores incluem, mas não estão limitados a, quantidade de peso do osso que se deseja formar, o grau de perda de densidade óssea, o local da lesão do osso, a condição do osso danificado, a idade do paciente, sexo, e dieta, a severidade de qualquer doença que podem estar contribuindo para a perda óssea, o tempo de administração e outros fatores clínicos. Opcionalmente, a dosagem pode variar com o tipo de matriz utilizada na reconstituição e os tipos de compostos na composição. A adição de outros fatores de crescimento conhecidos para a composição final, podem também afetar a dosagem. O progresso pode ser monitorado através de avaliação periódica do crescimento do osso e/ou de reparação, por exemplo, raios-X (incluindo DEXA), determinações histomorfométricas e marcação com tetraciclina.

[224] Em certas formas de realização, os métodos aqui descritos compreendem a terapia genética para a produção in vivo de polipeptídeos ActRII. Tal terapia alcançaria o seu efeito terapêutico através da introdução das sequências de polinucleótidos ActRII em células ou tecidos que tenham as desordens acima referidas. A entrega de sequências polinucleotídicas ActRII podem ser conseguidas utilizando um vetor de expressão recombinado tal como um vírus quimérico ou um sistema de dispersão coloidal. Preferidos para a entrega terapêutica de sequências polinucleotídicas ActRII é a utilização de lipossomas direcionados. Os polipeptídeos ActRII pode ser ActrIIA e/ou Polipeptídeo ActrIIBs (ver Seção 5.2).

[225] Vários vetores virais que podem ser utilizados para terapia genética tal como aqui ensinado incluem adenovírus, vírus do herpes, vaccinia, ou, de preferência, um vírus de RNA tal como um retrovírus. De um modo preferido, o vetor retroviral é um derivado de um retrovírus murino ou aviário. Exemplos de vetores retrovirais em que um único gene estranho pode ser inserido incluem, mas não estão limitados a: o vírus da leucemia murina de Moloney (MoMuLV), vírus do sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), vírus do tumor mamário murino (MuMTV), e Virus do Sarcoma de Rous ( RSV). Um certo número de vetores retrovirais adicionais pode incorporar múltiplos genes. Todos estes vetores podem transferir ou incorporar um gene para um marcador selecionável, de modo que as células transduzidas possam ser identificadas e geradas. Os vetores retrovirais podem ser tornados específicos do ligante-alvo, por exemplo, um açúcar, um glicolípido ou uma proteína. O direcionamento preferido é alcançado através da utilização de um anticorpo. Os peritos na técnica reconhecerão que as sequências polinucleotídicas específicas podem ser inseridas no genoma retroviral ou ligadas a um envelope viral para permitir a distribuição específica alvo do vetor retroviral contendo o polinucleótido ActrIIA. Numa forma de realização preferida, o vetor é direcionado ao osso ou cartilagem.

[226] Em alternativa, as células de cultura de tecidos podem ser diretamente transfectadas com plasmídeos que codificam os genes estruturais retrovirais gag, pol e env, através de transfecção de fosfato de cálcio convencional. Estas células são então transfectadas com o plasmídeo vetor contendo os genes de interesse. As células resultantes libertam o vetor retroviral no meio de cultura.

[227] Outro sistema de distribuição direcionada para polinucleótidos ActrIIA é um sistema de dispersão coloidal. Os sistemas de dispersão coloidais incluem complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microsferas, esferas e sistemas de base lipídica, incluindo emulsões óleo-em-água, micelas, micelas mistas e lipossomas. Um sistema coloidal que pode ser utilizado é um lipossoma. Os lipossomas são vesículas membranares artificiais que são úteis como veículos de distribuição in vitro e in vivo. RNA, DNA e viriões intactos podem ser encapsulados dentro do interior aquoso e ser entregue às células numa forma biologicamente ativa (Vide, por exemplo, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Os métodos para a transferência eficiente de genes que utilizam um veículo de lipossoma, são conhecidos na técnica, ver por exemplo, Mannino et al , Biotechniques, 6:. 682, 1988. A composição do lipossoma é normalmente uma combinação de fosfolípidos, normalmente em combinação com esteróides , especialmente colesterol. Podem também ser utilizados outros fosfolípidos ou outros lípidos. As características físicas dos lipossomas dependem do pH, força iónica e da presença de cations divalentes.

[228] Como exemplos de lípidos úteis na produção de lipossomas incluem os compostos de fosfatidilo, tais como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos e gangliósidos. Fosfolípidos ilustrativos incluem fosfatidilcolina do ovo, dipalmitoilfosfatidilcolina e diestearoilfosfatidilcolina. O direcionamento de lipossomas também é possível com base em, por exemplo, especificidade de órgão, especificidade celular, e especificidade do organelo é conhecida na técnica.

[229] Em certas formas de realização, o inibidor de ActrIIA é substancialmente puro numa composição farmacêutica. Especificamente, no máximo, 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,1%, ou, no máximo, 0,05% dos compostos na composição farmacêutica são outros do que o inibidor de ActRII e o transportador farmacêutico aceitável compostos.

EXEMPLOS Exemplo 1 Proteínas de Fusão ActRIIA-Fc

[230] Uma proteína de fusão solúvel ActrIIA que tem o domínio extracelular de ActrIIA humano fundido com um domínio Fc de camundongo ou humano com um ligante mínimo é descrito. As construções são referidas como ActrIIA-hFc e mActrIIA-Fc, respectivamente. ActrIIA-hFc são fornecidas como SEQ ID NO: 7. A mActrIIA-Fc é a contraparte murino à SEQ ID NO: 7.

[231] As proteínas ActrIIA-hFc e mActrIIA-Fc foram expressas em linhas de células CHO. Três sequências líder diferentes foram consideradas: (i) Mel de abelha melitina (HBML): SEQ ID: 8 (ii) Ativador de Plasminogênio de Tecidos (TPA): SEQ ID NO: 9 (iii) ActrIIA nativa: SEQ ID NO: 10

[232] A forma selecionada emprega o líder TPA e tem a seguinte sequência não processada de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13. Este polipeptídeo é codificado por SEQ ID NO: 14.

Proteínas de Fusão ActRIIB-Fc

[233] Estrutura co-cristalina de um domínio extracelular de ActRIIB humano fundido com um domínio Fc humano e Ativina não mostraram qualquer papel para os 15 finais ácidos (C-terminal) amino (referida como a "cauda" aqui) do domínio extracelular de ligação do ligante. Esta sequência não conseguiu resolver a estrutura cristalina, o que sugere que estes resíduos estão presentes em um loop flexível que não embalam uniformemente o cristal. Thompson et al . EMBO J. Abr 2003 1; 22 (7): 1555-1566. Esta sequência também é malconservada entre ActRIIB e ActrIIA. Assim, estes resíduos foram omitidos na base, ou fundo, ActRIIB-Fc de construção de fusão. Além disso, a posição 64 sob a forma do fundo é ocupada por uma alanina, que é geralmente considerada a forma de "tipo selvagem", embora um alelo A64R ocorre naturalmente. Assim, o fundo de ActRIIB-Fc de fusão tem a sequência descrita como SEQ ID NO: 21.

[234] Surpreendentemente, a cauda C-terminal foi encontrada para melhorar a ativina e GDF-11 de ligação, portanto, uma versão preferida de ActRIIB-Fc tem uma sequência de SEQ ID NO: 20.

[235] Uma variedade de variantes ActRIIB que podem ser utilizados de acordo com os métodos descritos no presente documento encontram-se descritos no Pedido de Patente Internacional publicado como documento WO2006/012627 (Vide, por exemplo, pp. 59-60), aqui incorporada por referência na sua totalidade.

DA INIBIÇÃO mACTRIIA EM UM RATO MODELO DE DOENÇA RENAL CRÔNICA

[236] Este estudo foi feito para estudar os efeitos de ActrIIA solúvel de rato fundido com Fc de rato através de um ligante mínimo (SEQ ID NO: 15) em tratamento de parâmetros sanguíneos e ossos em um modelo de rato com doença renal crônica e CKD-MBD.

[237] Pacientes com doença renal crônica (CKD) podem tornar-se anêmicos e também osteopenicos. Os camundongos com ablação parcial renal (nefrectomia 5/6) foram usados como um modelo de CKD para testar os efeitos do polipeptídeo com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 neste modelo. Os camundongos receberam duas cirurgias para 1) remover um rim completamente e 2) para ligar dois das três artérias renais no rim remanescente. Ratos com operação simulada também foram incluídos como controles. As cirurgias simuladas ou nefrectomia 5/6 foram realizadas no Jackson Laboratories.

[238] Depois de recebidos os ratos foram colocados em dieta rica em gordura durante a duração do estudo. Duas semanas depois da cirurgia os ratos finais foram divididos em grupos (tanto SHAM e CKD) e começou a dosagem com veículo (PBS) ou mActrIIA-Fc a 10 mg/kg duas vezes por semana durante 8 semanas. Hemograma completo (CBC) foram realizados periodicamente durante o estudo para avaliar a anemia.

[239] A densidade mineral óssea foi determinada utilizando dupla absorção de raios-x de energia (DEXA, PIXIMus). Na conclusão das necropsias de estudos foram conduzidos para recolher os ossos longos dos membros traseiros e principais órgãos. O rim remanescente foi enviado para processamento histológico e coloração com H & E ou corante Tricromo. Fêmures foram digitalizados por UCT (Scanco) para determinar microarquitetura óssea.

[240] Os ratos pareciam normais e saudáveis durante todo o período de estudo e colocados para pesagem conforme o estudo progrediu (Figura 1). A densidade mineral óssea aumentou em todos os quatro grupos de ratos, mas camundongos tratados mActrIIA-Fc (SHAM e CKD) apresentaram aumentos maiores do que qualquer um dos grupos tratados com veículo (Figura 2). O tratamento mActrIIA-Fc em ratos com IRC tinha densidade mineral óssea que seja igual ou superior SHAM-VEH camundongos tratados até ao final do estudo. CKD camundongos também se tornaram anêmicos até ao final do estudo (HCT <40%), mas o tratamento mActrIIA-Fc impediu a anemia no grupo DRC (HCT> 40%; Figura 3). Camundongos mActrIIA-Fc tratados no grupo SHAM também mostraram aumentos de HCT quando comparados aos controles VEH. Análise Micro CT dos fêmures após dissecção apresentaram aumentos no osso trabecular nos ratos tratados mActrIIA-Fc, mas não houve grandes diferenças entre os grupos tratados com veículo SHAM e CKD neste momento na progressão da doença. Na necropsia, não foram observadas grandes diferenças no peso dos órgãos, embora ratos mActrIIA-Fc tratados tiveram um ligeiro aumento de peso das camadas de gordura. Cortes tricrômicos histológicos corados do rim remanescente não indicam fibrose generalizada neste momento no estudo em ratos com IRC.

INIBIÇÃO mACTRIIA PREVINE ANEMIA E PERDA ÓSSEA EM UM MODELO TERAPÊUTICO DA DOENÇA RENAL ESTABELECIDO

[241] A cirurgia nefrectomia 5/6 em roedores é um protocolo experimental comumente realizada usado para modelar doença renal crônica.Nesta cirurgia de duas fases 2/3 de um rim e rim completa sobre o lado contralateral são removidos usando procedimentos cirúrgicos assépticos. Como resultado da cirurgia a função renal prejudicada experiências animais e exibe um comportamento fisiológico análogo para os seres humanos com doença renal crônica.

[242] A cirurgia simulada ou 5/6 nefrectomia foi realizada n Jackson Laboratories de acordo com procedimentos operacionais padrão. Os animais foram liberados para se recuperar da cirurgia e, em seguida, enviados. Os animais foram aclimatados às condições laboratoriais durante um mínimo de 48 horas antes de as primeiras medições serem feitas. Durante este período foram observados todos os animais para detectar quaisquer sinais de anormalidades clínicas que excluí-los do estudo. Aos animais foram atribuídos um número de estudo em seus cartões de gaiola e exclusivamente identificado por incisão na orelha.

[243] ActrIIA-mIgG2aFc foi diluída com PBS estéril a uma concentração de 2,0 mg/ml. A concentração de dosagem: foi de 2,0 mg/ml. ActrIIA-mIgG2aFc foi armazenado a -65 ° C ± 15 ° C, o material pode ser descongelado à temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C. A proteína descongelada foi mantida em gelo úmido até à sua utilização.

[244] Trinta camundongos fêmea C57BL/6 (10 semanas de idade) foram submetidos a uma cirurgia nefrectomia 5/6 em que um rim é completamente removido seguido por ligação de 2 de 3 veias renais ligados no rim remanescente duas semanas mais tarde. Cirurgias Sham foram também realizados em trinta fêmeas C57BL/6 em que os animais são sujeitos ao mesmo procedimento cirúrgico abdominal sem remoção dos rins. Após a recuperação da cirurgia, os animais do segundo foram enviados e deixados a aclimatizar às condições do laboratório durante um período mínimo de 48 horas. Dois meses após a segunda cirurgia os ratos foram distribuídos aleatoriamente para um de quatro grupos de tratamento com 15 camundongos por grupo (Tabela 2). Os camundongos foram pesados e dosados com ou mActrIIA-Fc ou PBS duas vezes por semana para um total de 8 semanas. Medições longitudinal da densidade mineral óssea (DMO) e os parâmetros hematológicos foram feitas na linha de base, um ponto de tempo intercalar e na conclusão do estudo. Na necropsia ossos foram recolhidos e armazenados para exame histológico ou para análise por digitalização microCT.Tabela 2:

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS Alteração Cirúrgica

[245] A fêmeas C57BL/6 com idade de 10 semanas, foram dadas uma cirurgia de duas fases para realizar a 5/6 nefrectomima ou uma cirurgia simulada equivalente.

Dosagem em animais

[246] A dosagem no presente estudo iniciado um mês após a conclusão da cirurgia nefrectomia 5/6. Os ratos foram pesados e administrou PBS ou mActrIIA-Fc a 10 mg/kg duas vezes por semana por injeção subcutânea.

Escaneamento DXA

[247] Medições longitudinais de DMO foram feitas mensalmente em ratos anestesiados utilizando digitalização DXA (Lunar PIXIMus, GE Medical Systems). Durante a análise de varrimento de DXA DMO da cabeça do rato foi eliminado da região de interesse evitar artefatos de quantificação associados com o crânio.

Coleta de sangue

[248] Medições longitudinais de hemogramas completos (HM2, VetScan) foram feitas em sangue coletado pelo sangramento mensal submandibular. Ao término do estudo um sangramento terminal foi realizado, o sangue foi recolhido e dividido em qualquer um tubo contendo EDTA para análise CBC ou em um tubo de separação do soro para a coleta de soro. O soro foi congelado a -80 ° para análises futuras.

Análises de soro

[249] Soro congelado foi descongelado e 100 microlitros foram analisados utilizando um analisador de VetScan VS2 (Abaxis, Inc.). Um rotor de diagnóstico abrangente foi usada para analisar as amostras de albumina sérica (ALB), fosfatase alcalina (ALP), alanina aminotransferase (ALT), amilase (AMY), bilirrubina total (TBIL), uréia (BUN), cálcio total (Ca ++), fósforo (PHOS), creatinina (CRE), glucose (GLU), sódio (Na +), potássio (K +), proteína total (TP) e globulina (GLOB).

Necropsia

[250] Na conclusão do estudo os ratos foram sacrificados por inalação de CO2. Os rins e os baços foram removidos, pesados e armazenados em 10% de formalina. As tíbias e fêmures foram coletadas e armazenadas em etanol 70%.

Análise microCT

[251] No fim da experiência do fêmur e da tíbia esquerda de cada camundongo foram dissecadas e fixadas em etanol a 70%. Os ossos foram digitalizados usando um Scanco microCT (VivaCT75, Scanco) a 55 kV, 145 microA e um tamanho de voxel de 20 mícrons. As imagens digitalizadas foram reconstruídas usando o software Scanco incorporada. Volume do osso trabecular (BV/TV), espessura trabecular e (Tb.Th) foram avaliados numa Seção 400 microM do osso que foi posicionada 200 microM a partir da ponta distai do fêmur. Espessura cortical foi medida em uma seção de 200 mícrons do osso centrado na linha média do fêmur.

ANÁLISE DE DADOS

[252] As comparações entre mActrIIA-Fc e ratos tratados com veículo e os tecidos foram realizadas pelo teste t de Student usando o Microsoft Excel. Os dados são expressos como média ± SEM.

Resultados

[253] Nós investigamos a possibilidade de mActrIIA-Fc para prevenir a anemia e perda óssea em um modelo do rato da doença renal crônica. Após 2 meses de progressão da doença após a cirurgia nefrectomia 5/6 (dia 0), os ratos sujeitos à nefrectomia 5/6 (DRC) exibiram uma diminuição significativa do hematócrito em comparação com os grupos placebo (-5,4%, P <0,01). Amostragem de sangue longitudinal e subsequente análise CBC mostrou que mActrIIA-Fc em ratos tratados tanto o DRC e coortes sham exibia aumentos significativos no hematócrito em comparação com os seus homólogos VEH tratados após 4 e 8 semanas de tratamento (Figura 5).

[254] Após 2 meses de progressão da doença seguidos à cirurgia de nefrectomia 5/6 (dia 0), os ratos indivíduos a nefrectomia 5/6 (CKD) apresentaram uma diminuição significativa na densidade mineral óssea em relação aos grupos placebo (-5,4%, P <0,01). Através de 6 semanas de tratamento os tratados com simulação mActrIIA-Fc e coortes DRC tinham significativamente maior densidade mineral óssea em comparação com as suas contrapartes VEH tratadas (Figura 6).

[255] Na conclusão do estudo, os membros posteriores foram coletados e fixados em etanol a 70%. O fêmur direito foi microCT digitalizada (VivaCT 75, Scanco) para quantificar a estrutura óssea cortical e trabecular. A Figura 7 mostra imagens em corte transversal de fémures em cada grupo de tratamento. Ratos sujeitos a nefrectomia apresentaram diminuição da espessura cortical e sem mudanças óbvias para estrutura óssea trabecular.

[256] Na conclusão do estudo, os membros posteriores foram coletados e fixados em etanol a 70%. O fêmur direito foi microCT digitalizada (VivaCT 75, Scanco) para quantificar a estrutura óssea cortical e trabecular. A Figura 7 mostra imagens em corte transversal de fémures em cada grupo de tratamento. Ratos sujeitos a nefrectomia apresentaram diminuição da espessura cortical e sem mudanças óbvias para estrutura óssea trabecular

[257] Camundongos tratados com mActrIIA-Fc exibiram aumentos tanto espessura trabecular e o volume ósseo cortical. Análises do fémur meados de eixo foram usadas para quantificar a espessura cortical significativo em cada coorte (Figura 8). Os camundongos tinham DRC ossos corticais mais finos do que os seus homólogos sham em ambos os VEH (P <0,01) e mActrIIA-Fc (p <0,01) coortes. mActrIIA-Fc camundongos tratados tiveram um aumento significativo na espessura cortical, tanto no tratamento simulado (+ 17%, P <0,01) e DRC (+ 19,2%, P <0,01) em comparação com coortes seus respectivos camundongos tratados-VEIC. Como evidenciado pelas imagens de exemplo na Figura 7, análises do fêmur distal revelou um aumento dramático no volume do osso trabecular e espessura em mActrIIA-Fc camundongos tratados. mActrIIA-Fc foi capaz de aumentar significativamente o volume do osso trabecular (Figura 9) e espessura trabecular (Figura 10) ao longo de VEIC camundongos tratados em ambos os grupos sham e CKD. As medições de volume ósseo trabecular demonstrado na semana 8 que mActrIIA-Fc camundongos tratados tiveram um aumento significativo do volume ósseo trabecular em ambos a tratamento simulado (+ 549%, P <0,001) e DRC (+ 827%, P <0,001) em comparação com coortes seus respectivos camundongos tratados-VEIC. As medições de espessura demonstraram trabecular na semana 8 que mActrIIA-Fc camundongos tratados tiveram um aumento significativo na espessura trabecular no DRC (+ 62%, p <0,001) em comparação com coortes seus respectivos camundongos tratados- VEIC.

[258] No momento do sacrifício terminal de sangue total foi retirado de todos os animais e processados para soro. As amostras de soro foram analisadas utilizando um analisador de VS2 VetScan (Abaxis, Inc) usando um rotor perfil global. Os valores médios para os analyates de cada grupo são apresentados na Tabela 3. A comparação do SHAM e grupos de controle de veículo DRC mostraram aumentos do azoto da ureia no sangue (BUN) e creatinina (CRE) como seria de esperar devido a insuficiência da função renal. Além disso, o ALT e amilase (AMY) foram aumentadas em camundongos com DRC devido à função renal alterada ou sugestivo da nefrectomia também alterar a função hepática. Os níveis de cálcio (Ca ++) e fosfatase alcalina total (ALP) também aumentou à medida que o esperado devido ao aumento do metabolismo ósseo. tratamento mActrIIA-Fc aumentou os níveis de ALP em ambos os ratos SHAM e CKD devido às propriedades anabólicas ósseas da droga. Em camundongos DRC tratamento mActrIIA-Fc diminuiu de albumina (ALB), a proteína total (TP) e os níveis de CRE, em comparação com os controles DRC-VEH, mas não foi diferente do que os ratos SHAM. Estas alterações não são consideradas relevantes para o modelo ou o tratamento neste momento. Tabela 3

CONCLUSÕES

[259] O tratamento com mActrIIA-Fc foi capaz de prevenir a anemia e perda de massa óssea em um modelo de nefrectomia 5/6 da doença renal crônica. Camundongos CKD eram anêmicos, apresentaram menor DMO e estrutura óssea cortical mais fina no fêmur quando comparado com os homólogos sham. Tratamento com mActrIIA-Fc em ratos com CKD aumentaram o hematócrito, BMD e estrutura óssea cortical significativamente comparados com camundongos tratados com VEH. Além disso, mActrIIA-Fc foi capaz de aumentar o volume do osso trabecular e a espessura trabecular nos camundongos DRC para valores maiores do que os camundongos tratados com VEH em ambos os grupos sham e CKD. Estes dados demonstram que o bloqueio do receptor de Ativina IIA sinalizado pela administração de mActrIIA-Fc pode prevenir a anemia e perda de massa óssea no modelo de nefrectomia 5/6 de doença renal crônica.

EXEMPLO PROFÉTICO INIBIÇÃO DE -mACTRIIA PARA TRATAR A DOENÇA ÓSSEA ADINÂMICA NO CONTEXTO CDK

[260] Os camundongos são submetidos a electrocauterização de uma nefrectomia do rim e do outro rim. Os ratos são alimentados com ração de baixo fosfato suplementado com calcitriol. Vide-se, por exemplo, Lund et al, 2004, J Am Soc Nephrol 15: 349-369.

[261] O presente estudo foi concebido para estudar os efeitos de ActrIIA solúvel do rato que está fundido com Fc de camundongo através de um ligante mínimo (SEQ ID NO: 15) no tratamento de parâmetros do sangue e osso num modelo de rato da doença óssea adinâmica.

[262] Os camundongos com electrocauterização de uma nefrectomia do rim e do outro rim são utilizados como um modelo do osso adinâmico na DRC ("ADB") de contexto para testar os efeitos do polipeptídeo com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 em este modelo. Ratos receber duas cirurgias para 1) remover um rim completamente e 2) eletrocautério do outro rim. Camundongos com cirurgia simulada são também incluídos como controles. As cirurgias podem ser realizadas como descrito em Lund et al , 2004, J Am Soc Nephrol. 15: 349-369.

[263] Um grupo de camundongos é colocado em dieta de Chow de baixo fosfato com suplementada com calcitriol. Outro grupo de camundongos é colocado em dieta normal de comida. Duas semanas depois da cirurgia os ratos finais são divididos em grupos (tanto SHAM e ADB) e inicia-se com a administração de veículo (PBS) ou mActrIIA-Fc a 10 mg/kg duas vezes por semana durante 8 semanas. Hemograma completo (CBC) são realizados periodicamente durante o estudo para avaliar a anemia.

[264] A densidade mineral óssea é determinada utilizando dupla absorção de raios-x de energia (DEXA, PIXIMus). Na conclusão das necropsias de estudos são realizados para recolher os ossos longos dos membros traseiros e principais órgãos. O rim remanescente é enviado para processamento histológico e coloração com H & E ou corante Tricromo. Fêmures são digitalizados por UCT (Scanco) para determinar microarquitetura óssea. Tomografia computadorizada quantitativa (QCT) também pode ser utilizado para determinar o turnover ósseo.

EFEITOS DA ACTRIIA NA INIBIÇÃO DA CALCIFICAÇÃO VASCULAR

[265] O presente Exemplo demonstra que a inibição da ActrIIA é eficaz na redução dos níveis de cálcio na vasculatura de indivíduos, e representa, assim, um meio para o tratamento da calcificação vascular.

[266] A fase 3 da doença renal crônica (DRC) foi induzida em 14 semanas de idade LDLR -/- camundongos (C57BL fundo/6J; Jackson Laboratory) que foram alimentados com dietas ricas em gordura ("ratos DRC"). O receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR) é conhecido por estar envolvido na depuração de lípidos, e murganhos com o LDLR representam um modelo de aterosclerose. Os camundongos com alimentação deficiente de LDLR que são as dietas ricas em gordura/colesterol desenvolveram aterosclerose e placa aórtica associada a calcificação que é estimulada pela DRC induzida por ablação renal. DRC foi induzida no LDLR -/- ratos por nefrectomia 5/6 (ver acima). Como descrito acima, a nefrectomia 5/6 compreende a remoção completa de um rim seguido por ligação de dois das três veias renais no rim remanescente.

[267] Na semana 22, a calcificação vascular é estabelecida nos ratos com IRC, tal como foi confirmado por quantificação calcificação química. Resumidamente, coração e aorta de camundongos são dissecados na altura do sacrifício, e todo o tecido estranho é removido por dissecção sob um microscópio de dissecação. Os tecidos são dessecados durante 20-24 horas a 55 ° C, pesados e esmagada num pó com um almofariz e pilão. O cálcio é eluído em 10% de ácido fórmico (10: 1 v/w) durante 24 horas a 4 ° C. O teor em cálcio do eluato é analisado utilizando um método cresolftaleína complexona (Sigma, St. Louis), de acordo com as instruções do fabricante, e os resultados foram corrigidos para o peso do tecido seco.

[268] Os camundongos IRC foram divididos em dois grupos experimentais (i) mActrIIA-Fc camundongos tratados; e (ii) a camundongos IRC-3-veículo, que foram administrados o veículo só porção da composição mActrIIA-Fc (isto é, os ratos foram administrados uma composição de solução salina sem mActrIIA-Fc). camundongos mActrIIA-Fc-tratados (n = 5) foram administrados 10 mg/kg de mActrIIA-Fc duas vezes por semana durante 6 semanas. Camundongos DRC-3- Veículo (n = 6; = veículo salino) foram administradas apenas veículo nos mesmos dias que mActrIIA-Fc foi administrado aos camundongos tratados com mActrIIA- Fc. Os camundongos do tipo selvagem (n = 6; C57Bl/6J de fundo) e os camundongos simulada (n = 8; C57Bl/6J de fundo) foram utilizados como controles negativos. Ratos SHAM consistiu de LDLR -/- ratos que foram operados, mas em que não foi induzida CKD (por exemplo, a nefrectomia não foi realizado).Todos os camundongos foram sacrificados na semana 28 para avaliação dos níveis de cálcio da aorta em cada um dos quatro grupos de tratamento (DRC-3- veículo; mActrIIA-Fc-tratados; SHAM e de tipo selvagem).

[269] A Tabela 4, abaixo, fornece os níveis de cálcio da aorta observada em cada um dos murganhos utilizado no estudo (coluna 2), bem como os níveis médios de cálcio para cada um dos SHAM, DRC-3-veículo, mActrIIA-Fc, e grupos de estudo do tipo selvagem (coluna 3). Os resultados são apresentados na forma de gráfico na Figura 11. Tal como demonstrado pelos dados, uma clara redução de cálcio aórtico foi observada nos ratos que pertencem ao grupo tratado mActrIIA-Fc em comparação com o grupo tratado com veículo. Em quatro dos cinco camundongos que foram tratados com DRC com mActrIIA-Fc, os níveis de cálcio da aorta foram comparáveis aos níveis observados nos dois grupos de controle negativo (tipo selvagem e ratos SHAM).

[270] Níveis de cálcio vascular elevados (por exemplo, arterial) são conhecidos por estarem associados com a calcificação vascular (Vide, por exemplo, Raggi P et al, Clin J Am Soc Nephrol 2008; 3:. 836-843). Assim, os resultados anteriores indicam que inibição de ActrIIA representa uma abordagem adequada para o tratamento e prevenção da calcificação vascular.Table 4: Níveis de Cálcio da Aorta

EFEITOS DA INIBIÇÃO DE ACTRIIA NA CALCIFICAÇÃO VASCULAR

[271] Este Exemplo descreve um estudo sobre o efeito de inibição de ActRII na calcificação vascular em pacientes com doença renal crônica.

[272] Modelo de rato de início de CKD-MBD descrito nos exemplos precedentes pode ser utilizado. Neste modelo, a ablação renal é adicionada a uma deficiência genética do receptor de LDL, LDLR, e os ratos são alimentados com uma dieta de colesterol elevado teor de gordura elevado. No estágio 3 da DRC, os animais têm CKD a estimulação induzida de calcificação vascular, diminuição da formação óssea, níveis elevados de FGF23, hiperfosfatemia, e os níveis de PTH elevados.

Materiais e Métodos

[273] Animais e dietas: receptor nulo de LDL (LDLR -/-) camundongos em um/6J fundo C57Bl ou tipo selvagem camundongos C57BL/6J pode ser comprado do Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) e criados em um ambiente livre de patógenos. Os animais podem ser desmamados com três semanas de uma dieta de ração com 6,75% de calorias como gordura. Às 10 semanas, alguns animais pode ser iniciados com uma dieta de colesterol elevado (0,15%) contendo 42% de calorias como gordura (Harlan Teklad, Madison WI, Produto No. TD88137), uma dieta que tem sido mostrado para gerar aterosclerose com calcificação vascular este fundo genético (Vide, por exemplo, Towler et al , 1998, J Biol Chem 273:. 30.427-30.434). O teor em cálcio em todas as dietas pode ser de 0,6%. Os animais podem ter acesso a água ad libitum, e mantido de acordo com as diretrizes de cuidados de animais locais e nacionais. A mActrIIA-Fc pode ser administrada IP (10 mg/kg) duas vezes por semana.

[274] Procedimentos Cirúrgicos: Procedimentos Cirúrgicos: Um procedimento de duas etapas pode ser utilizado para criar CKD como anteriormente descrito (Vide, por exemplo, Davies et al , 2003, J Am Soc Nephrol 14:.. 1559-1567; e Davies et al , 2005, J Am Soc Nephrol 16: 917-928). Resumidamente, a electrocauterização pode ser aplicada para o rim direito através de uma incisão no flanco 2 centímetros em 10 semanas pós-natais, seguido por nefrectomia esquerda através de uma incisão semelhante 2 semanas mais tarde. Os animais de controle podem receber operações simuladas, em que o rim é exposto e apropriado mobilizados mas não tratados de qualquer outra forma. Anestesia intraperitoneal (xilazina 13 mg/kg de cetamina e 87 mg/kg) pode ser usado para todos os procedimentos. Amostras de sangue de veia safena podem ser tomadas em uma semana após a segunda cirurgia para avaliar a função renal pós-cirúrgico inicial. Os animais podem ser sacrificados sob anestesia por facada intracardíaca com 20 semanas ou 26 semanas, dependendo do grupo de sangue. O coração e a aorta podem ser dissecados em bloco.

[275] Preparação de tecidos: espécimes ressecados podem ser fixados em formol, e em seguida divididos da seguinte forma: o coração, aorta ascendente e arco aórtico pode ser separada da aorta descendente, e dividido em dois sagital através da via de saída aórtica. A aorta descendente pode ser cortada coronalmente, aproximadamente a meio caminho ao longo do seu comprimento. Todas as quatro peças podem ser incorporadas no mesmo bloco de cera. Fatias (5 mm de espessura) podem ser cortadas e coradas com hematoxilina, tricrômio, Alizarin Vermelho e von Kossa.

[276] A imuno-histoquímica: As secções de tecido podem ser preparados como acima, desparafinados em xileno e re-hidratadas em etanóis graduadas. A atividade da peroxidase endógena podem ser bloqueadas por incubação em 3% de peróxido de hidrogênio (Sigma, St Louis MO), e ligação não específica pode ser bloqueada com uma incubação de 10 minutos com uma solução de propriedade de caseína em PBS ('ATIRADOR fundo ", BioCare Médico, Walnut Creek CA). Recuperação de antígenos pode ser realizada com uma incubação de 5 minutos com tampão de citrato ('Decloaker' BioCare médica, Walnut Creek CA) a 1003 C. As secções podem ser incubadas com o anticorpo policlonal purificado por afinidade de cabra contra rato osteocalcina (OC) (Biogenesis Inc , Brentwood NH) durante a noite, em seguida, incubadas com o rato biotinilado anti- anticorpo secundário de cabra durante 10 minutos antes da coloração com estreptavidina-peroxidase conjugada (todos os reagentes, BioCare médicos, Walnut Creek CA) e contrastadas com hematoxilina de 0,1% (Sigma)

[277] RT-PCR: o RNA pode ser extraído de amostras de tecido utilizando o kit RNAqueous-4PCR (Ambion), de acordo com as instruções do fabricante. RT- PCR pode ser realizada utilizando o One-step RT-PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As condições podem ser: 50°C durante 30 min, 95°C durante 15 min, depois 35-40 ciclos de 94°C durante 1 min, 60°C durante 1 min & 72°C durante 1 min, em seguida, para 72°C 10 min. Um primer específico para osteocalcina murino e murino GAPDH podem ser selecionados.

[278] Quantificação de calcificação química: Corações e aorta podem ser dissecados em sacrifício, e todo o tecido estranho removido por dissecção romba sob um microscópio de dissecação. Os tecidos podem ser dessecados durante 20-24 horas a 55°C, pesados e esmagados num pó com um almofariz e pilão. O cálcio pode ser eluída em 10% de ácido fórmico (10: 1 v/w) durante 24 horas à 4°C. O teor em cálcio do eluato pode ser ensaiado utilizando um método cresolftaleína complexona (Sigma, St. Louis), de acordo com as instruções do fabricante, e os resultados podem ser corrigidos para o peso do tecido seco.

[279] Histomorfometria do osso: A taxa de formação óssea pode ser determinada por marcação dupla fluorescência. Todos os camundongos podem receber calceína intraperitoneal (20 mg/kg) e 7d 2d antes de serem sacrificados. Ambos os fémures podem ser dissecados na altura os animais são sacrificados e colocados em etanol a 70%. Os espécimes podem ser implantados descalcificado em um H7000 kit incorporação de plástico (Energia Ciências feixe). Os ossos podem ser seccionados longitudinalmente através do plano frontal nas seções 10 mícrons com JB-4 microtome (Energia Ciências feixe). Não coradas secções pode ser utilizado para análise de fluorescência marcada com calceina. Slides podem ser examinadas com uma ampliação X400 com um microscópio Leitz ligado a um analisador Osteomeasure Imagem (Osteometrics, Atlanta GA). Dez campos contíguos 0,0225-mm2 do fêmur distal, 150 um proximal à placa de crescimento, pode ser examinado por animal.

[280] As medições de Paratormônio e Química do Soro: As amostras de sangue podem ser obtidas aos 2 e 8 semanas de DRC por aspiração tubo capilar da veia safena, e com um processo diferente (punção intracardíaca) no momento do sacrifício (12 semanas DRC ) e transferidas para tubos heparinizados. Após centrifugação (400 X g durante 5 minutos), o plasma pode ser removido, dividido em alíquotas e congelado a -800C. Os níveis de PTH intacto (executadas apenas com sacrifício por causa do volume de sangue necessário) podem ser medidos por ensaio de dois locais imunorradiométrico (IRMA), utilizando um kit disponível comercialmente (Immutopics, San Clemente, Califórnia). Azoto da ureia no sangue (BUN), de cálcio e fósforo no soro podem ser medidos utilizando as técnicas padrão do analisador multicanal.

[281] As medições de FGF23: Um ensaio ELISA murino FGF23 pode ser adquirido da empresa Kainos.

[282] Medidas de DKK1 e osteocalcina: ensaios de ELISA comercial para DKK1 e osteocalcina subcarboxilada pode ser usado.

[283] As medições de OPG e sRANKL: A taxa de OPG de RANKL pode ser determinada em ensaios de soro. Estes ensaios têm sido mostrados para correlacionar bem com o turnover ósseo e o excesso de reabsorção óssea (Vide, por exemplo, Geusens et al , 2006, Arthritis & Rheumatism. 54: 1772-17775). Os níveis de sRANKL no soro podem ser determinados por um radioimunoensaio (Linco Research, St. Louis, MO). Os níveis de soro de OPG pode ser medido por um método ELISA (Osteomedical NL, Marishof, NL). Os coeficientes intra e interensaio de variação (CV) são inferiores a 10% para ambos os testes, de acordo com os fabricantes. O limite de detecção para sRANKL é 0,08 pmol/L, e para a OPG é de 0,14 pmol/l.

[284] Medidas de marcadores de Turnover ósseo: Soro P1NP e osteocalcina podem ser usados como marcadores de atividade dos osteoblastos e tartarato de forma fosfatase ácida resistente 5b (TRACP 5b) (Ratoeira, IDS Ltd, Bolden, UK) podem ser usados como um marcador de níveis dos osteoclastos.

[285] Medições de marcadores de inflamação: Ensaios séricos de TNF alfa e de proteína C reativa podem ser utilizados para seguir os níveis de inflamação e a resposta a mActrIIA-Fc.

[286] Análise estatística: Os dados podem ser analisados para significância estatística (P <0,05) utilizando a ANOVA. A comparação pode ser feita entre os animais tratados com veículo (grupo controle) e aqueles tratados com mActrIIA-Fc. A comparação também pode ser feita entre os ratos operados por simulação e camundongos tratados com veículo com DRC e mActrIIA-Fc. Estas análises podem ser realizadas com o pacote estatístico SPSS 11.0 (Needham Heights, MA).

Parâmetros do Estudo

[287] Os ratos utilizados no estudo podem ser colocados em um dos oito grupos como mostrado na Tabela 5, abaixo.Tabela 5

[288] Um grupo de animais (Grupo H na Tabela 5) podem ser sacrificados em 14 semanas para medir a calcificação vascular de base e histomorfometria no momento de se iniciar o tratamento. Grupos C e E podem ser utilizados para avaliar a eficácia do tratamento com mActrIIA-Fc em comparação com os grupos que receberam o veículo (grupos B e D) durante períodos variáveis de DRC. Grupos F e G são em geral combinados com operação simulada alto teor de gordura de animais alimentados que podem ser utilizados como controle para os efeitos DRC. Tamanhos de grupos de 10 animais por grupo após a randomização para os grupos de tratamento podem ser suficientes para obter significância estatística.

[289] Em 16-18 semanas, a taxa de filtração glomerular (TFG) pode ser medida por injeção de inulina para os ratos e medição do seu desaparecimento. Na eutanásia, o sangue pode ser sacado pela facada intracardíaca, e DKK1 soro, FGF23, osteocalcina, PTH e os níveis de calcitriol pode ser determinado, juntamente com o cálcio sérico, Pi, uréia (BUN), glicose e os níveis de colesterol.

[290] Aortas do ldlr-/- elevado teor de gordura de animais alimentados com DRC pode ser analisado. Os níveis totais de cálcio da aorta de Von Kossa e secções microscópicas coradas podem ser obtidas. Aortas podem ser processadas para obter RNA para a análise da expressão do gene da aorta. Aortas podem ser processadas para imuno-histoquímica. Na 22^ semana no modelo de DRC descrito acima, a idade eutanásia para os grupos B e C, calcificação vascular é estabelecida e doença óssea adinâmica está presente apesar hiperparatiroidismo secundário. Entre 22 e 28 semanas, calcificação vascular é progressiva e os efeitos da presença do hormônio paratireoide começam a aumentar superfícies osteoblásticas.

[291] O estudo descrito neste exemplo pode ser usado para determinar os efeitos da inibição de ActRII na calcificação vascular, as taxas de remodelação óssea, e hiperparatiroidismo secundário observado em indivíduos com CKD.Tabela 6: Informação da Sequência

EQUIVALENTES

[292] Embora a invenção seja descrita em pormenor com referência a formas de realização específicas da mesma, será entendido que as variações que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do âmbito da presente invenção. De fato, várias modificações da invenção em adição às apresentadas e descritas aqui serão evidentes para os peritos na técnica a partir da descrição anterior e desenhos anexos. Tais modificações destinam-se a cair dentro do âmbito das reivindicações anexas. Os peritos na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das concretizações específicas do invento aqui descrito. Tais equivalentes destinam-se a ser englobados pelas seguintes reivindicações.

[293] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesta especificação são aqui incorporadas por referência na especificação para a mesma extensão como se cada aplicação de publicação, patente ou patente individuais foi específica e individualmente indicada para ser aqui incorporada por referência na sua totalidade.

Claims

1. Uso de um inibidor de ActRII, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento ou a prevenção da calcificação vascular em um indivíduo em necessidade de tratamento da calcificação aterosclerótica, em que o referido inibidor de ActRII é um polipeptídeo compreendendo: (i) um fragmento do domínio extracelular de ActRIIB, em que o fragmento consiste na sequência dos aminoácidos 25 a 131 da SEQ ID NO: 28 e em que o fragmento carrega uma substituição de aminoácido L79D; (ii) um ligante; e (iii) um Fc de uma IgG.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido inibidor de ActRII é um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é para reduzir os níveis de cálcio vascular no indivíduo.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido inibidor de ActRII reduz ou melhora um ou mais sintomas de calcificação vascular, em que o(s) referido(s) um ou mais sintoma(s) é/são um aumento nos níveis de cálcio vascular, aumento de apoptose de células musculares lisas vasculares, perda de elasticidade arterial, aumento na velocidade da onda de pulso, desenvolvimento de hipertrofia ventricular esquerda, diminuição na perfusão arterial coronariana e isquemia do miocárdio.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ActRII é administrado por via parenteral.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem menos de 18 anos de idade.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma doença renal em fase terminal.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo passa por diálise.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem doença renal crônica.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem hipertensão.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem hipercolesterolemia.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem diabetes.