ES2202729T3

ES2202729T3 - Hormona paratiroidea cristalina.

Info

Publication number: ES2202729T3
Application number: ES98123878T
Authority: ES
Inventors: Faming Zhang
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1997-12-18
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2018-12-16
Also published as: PE20000056A1; AR038648A1; DK0926158T3; DE69816409T2; EP0926158A1; AU748271B2; JP2002508395A; BR9813740A; CA2315103A1; AU1632699A; TR200002179T2; ZA9811407B; US6590081B1; IL136824A0; NO20003131L; DE69816409D1; NO20003131D0; PL341209A1; ATE245165T1; EA200000672A1

Abstract

SE DESCRIBEN FORMAS CRISTALINAS, PURAS, ESTABLES DE UNA HORMONA PARATIROIDEA, EN PARTICULAR TERIPARATIDA, ASI COMO PROCEDIMIENTOS PARA SU PREPARACION Y PURIFICACION.

Description

Hormona paratidoidea cristalina.

Campo técnico

La presente invención trata de una forma cristalina pura de hormona paratiroidea. Más especialmente, la invención trata de la forma cristalina de teriparatide, PTH(1-34), y los procedimientos de preparación y purificación de la hormona fragmentada.

Antecedentes de la invención

La hormona paratiroidea (PTH) es un producto de 84 aminoácidos, secretado por la glándula paratiroidea del mamífero que controla los niveles de calcio en suero a través de su acción sobre diversos tejidos, incluyendo el óseo. Los estudios en humanos con ciertas formas de PTH han demostrado un efecto anabólico en hueso, y han incitado un interés significativo en su uso para el tratamiento de la osteoporosis y de los trastornos óseos relacionados.

Usando, por ejemplo, los 34 aminoácidos del extremo N-terminal de la hormona bovina y humana que, de acuerdo con todos los informes publicados, son considerados biológicamente equivalentes a la hormona completa, se ha demostrado en humanos que la hormona paratiroidea aumenta el crecimiento óseo, particularmente cuando se administra a modo de pulsos por vía subcutánea e intravenosa. Una forma de PTH ligeramente diferente, PTH(1-38) humana, ha mostrado resultados similares.

Las preparaciones de PTH han sido reconstituidas a partir de hormona fresca o liofilizada, e incorporan diversas formas de portadores, excipientes o vehículos. La mayoría son preparadas en vehículos basados en agua como disolución salina o agua acidificada típicamente con ácido acético para disolver la hormona. La mayoría de las formulaciones descritas también incorporan albúmina como estabilizador (véase, por ejemplo, Reeve y col., Br. Med. J., 1980, 280:6228; Reeve y col., Lancet, 1976, 1:1035; Reeve y col., Calcif. Tissue Res., 1976, 21:469; Hodsman y col., Bone Miner, 1990, 9(2):137; Tsai y col., J. Clin. Endocrinol Metab., 1989, 69(5):1024; Isaac y col., Horm. Metab. Res., 1980, 12(9):487; Law y col., J Clin Invest. 1983, 72(3):1106; and Hulter, J. Clin Hypertens, 1986, 2(4):360). Otras formulaciones descritas han incorporado un excipiente como manitol, que se encuentra con la hormona liofilizada o en el vehículo de reconstitución.

Las formulaciones representativas de las empleadas para estudios en humanos incluyen una preparación de PTH(1-34) (SEC ID Nº2) humana formada por, después de su reconstitución, manitol, albúmina sérica humana inactivada por calor, y ácido caproico (un inhibidor de proteasa) como intensificador de absorción (véase Reeve y col., 1976, Calcif. Tissue Res., 21, Suppl., 469-477); una preparación de PTH(1-38) humana reconstituida en un vehículo salino (véase Hodsman y col., 1991, 14(1), 67-83); y una preparación de PTH(1-34) bovina en un vehículo acuoso de pH ajustado con ácido acético que contiene albúmina. Existe también una preparación de Referencia Internacional para PTH(1-84) (SEC ID Nº:1) humana formada por 100 ng de hormona fraccionada en ampollas con 250 \mug de albúmina sérica humana y 1,25 mg de lactosa (1981), y para PTH(1-84) bovina está formada por 10 \mug de hormona liofilizada en ácido acético 0,01 M y 0,1% p/v de manitol (véase Martindale, The Extra Pharmacoepia, The Pharmaceutical Press, London, 29th Edition, 1989 pág. 1338).

La explotación comercial de la hormona paratiroidea requiere el desarrollo de una formulación que sea aceptable en términos de estabilidad de almacenamiento y facilidad de preparación. Debido a que es una proteína es, en consecuencia, más lábil que los fármacos tradicionalmente de bajo peso molecular; no obstante, la formulación de la hormona paratiroidea presenta desafíos a los que no se ha enfrentado la industria farmacéutica. Además, como otras proteínas que han sido formuladas con éxito, la PTH es particularmente sensible a la oxidación, deamidación e hidrólisis, y además requiere que sus secuencias N-terminal y C-terminal permanezcan intactas para conservar su bioactividad.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona procedimientos para la preparación de formas cristalinas de una hormona paratiroidea (PTH) fragmentada que hasta ahora no habían sido descritos. Las ventajas de una forma cristalina para la hormona son la pureza del producto y la estabilidad de almacenamiento. Así, por ejemplo, una forma cristalina de PTH puede ser fácilmente disuelta en una disolución estéril en viales para administración por vía parenteral. Como material cristalino, la PTH puede también ser formulada, si se desea, en otras composiciones como, por ejemplo, comprimidos, cápsulas o supositorios.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención es una nueva forma cristalina de una hormona paratiroidea seleccionada del grupo formado por PTH(1-34), PTH(1-37), PTH(1-38), y PTH(1-41), y, en especial, PTH(1-34) (SEC ID Nº2), genéricamente conocida como teriparatide, en la forma de placas tetragonales o cristales cúbicos, ambos con un grupo espacial P422 y las siguientes constantes de unidad celular: a = b = 91,071 \ring{A}, c = 37,665 \ring{A}, \alpha = \beta = \gamma =90º.

\newpage

Un segundo aspecto de la presente invención es un procedimiento para purificar una hormona paratiroidea que incluye estas etapas:

(a) proporcionar una disolución acuosa de dicha hormona a una concentración de 5 a 40 mg por ml;

(b) mezclar dicha disolución con una disolución de reserva que comprende un disolvente orgánico a una concentración de 5 a 50 volúmenes por ciento y un tampón a una concentración que mantenga el pH entre 6,0 y 12,0; y

(c) permitir que la disolución resultante repose un tiempo predeterminado a una temperatura entre temperatura ambiente y 4ºC hasta que se formen cristales de tipo placas.

Un tercer aspecto de la presente invención es un procedimiento para purificar una hormona paratiroidea donde las etapas incluyen:

(a) proporcionar una disolución acuosa de dicha hormona a una concentración de 5 a 40 mg/ml;

(b) mezclar dicha disolución con una disolución de reserva que comprenda una sal precipitante de fosfato o formato a una concentración 0,5 M a 2,5 M y, opcionalmente, una disolución acuosa tampón, o una mezcla de ellas, a una concentración que mantenga un pH entre 4,0 y 6,0; y

(c) permitir que la disolución resultante repose un tiempo predeterminado a una temperatura entre temperatura ambiente y 4ºC hasta que se formen cristales cúbicos.

Un cuarto aspecto de la presente invención es una nueva forma cristalina de una hormona paratiroidea seleccionada del grupo formado por PTH(1-34), PTH(1-37), PTH(1-38), y PTH(1-41), y, en particular, PTH(1-34) (SEC ID Nº:2) cristalina humana en forma de cristales hexagonales con un grupo espacial P622 y las siguientes constantes celulares: a = b = 30,169 \ring{A}, c = 110,597 \ring{A}, \alpha = \beta = 90º, \gamma = 120º.

Finalmente, como un quinto aspecto, la presente invención es un procedimiento para purificar una hormona paratiroidea que comprende:

(a) proporcionar una disolución de una hormona paratiroidea seleccionada del grupo formado por PTH(1-34), PTH(1-37), PTH(1-38), y PTH(1-41) a una concentración de 5 a 40 mg/ml en 10 a 30 volúmenes por ciento de glicerol;

(b) mezclar dicha disolución con una disolución de reserva que comprende un disolvente orgánico a una concentración de 5 a 50 volúmenes por ciento, sulfato de amonio a una concentración 0,5 a 3,0 M, y un tampón a una concentración que mantenga el pH de la disolución entre 3,0 y 7,0; y

(c) permitir que la disolución resultante repose un tiempo predeterminado a una temperatura entre temperatura ambiente y 4ºC hasta que se formen cristales hexagonales.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una fotografía que muestra los cristales de PTH(1-34) desarrollados en el Ejemplo 1.

La Figura 2 es una fotografía que muestra los cristales de PTH(1-34) desarrollados en el Ejemplo 4.

Descripción detallada

La invención trata de una forma cristalina pura de hormona paratiroidea fragmentada en su forma más estable, para almacenamiento y uso directo en composiciones farmacéuticas para ser administradas a pacientes humanos.

El material cristalino puede incorporar como ingrediente activo fragmentos o variantes de fragmentos de PTH humana o PTH de rata, porcina o bovina que actúen como la PTH humana, como determina el modelo de osteoporosis en rata ooforectomizada informado por Kimmel y col., Endocrinology, 1993, 32 (4): 1577.

Los fragmentos de hormona paratiroidea preferentemente incorporan al menos los primeros 34 residuos del extremo N-terminal, como PTH(1-34), PTH(1-37), PTH(1-38) y PTH(1-41). Algunas alternativas en la forma de las variantes de PTH incorporan la sustitución de 1 a 5 aminoácidos que mejoran la estabilidad y vida media de la PTH, como el reemplazo de residuos de metionina en posiciones 8 y/o 18 con leucina u otro aminoácido hidrofóbico que mejora la estabilidad de PTH contra la oxidación, y el reemplazo de aminoácidos en la región 25-27 con aminoácidos no sensibles a la tripsina, como histidina, u otro aminoácido que mejore la estabilidad de la PTH contra proteasas. Estas formas de PTH son comprendidas por el término "hormona paratiroidea" usado genéricamente en la presente invención. La hormona preferida es la PTH(1-34) (SEC ID Nº:2) humana, también conocida como teriparatide. Las hormonas pueden obtenerse a través de los procedimientos recombinantes o sintéticos conocidos, como se describe en el documento U.S. Pat. No. 4.086.196, incorporado en la presente invención como referencia.

En la forma de realización de la invención, los cristales de PTH pueden prepararse o desarrollarse en una disolución de reserva o precipitante que contiene un tampón y, opcionalmente, un disolvente orgánico o sal, con la concentración de reactivos y pH cuidadosamente controlados dentro de límites prescritos. Cualquiera de las técnicas básicas de cristalización bien conocidas se puede usar para el desarrollo de los cristales de hormona. Los cristales pueden desarrollarse, por ejemplo, a temperatura ambiente o hasta 4ºC, usando un instrumento de gota posada (sitting drop), gota suspendida (hanging drop), siembra (seeding) y/o cristalización discontinua (batch). El procedimiento discontinuo es obviamente preferido para preparaciones en gran escala.

En el procedimiento de gota suspendida, una gota pequeña de disolución proteica se coloca sobre un cubreobjeto o placa de vidrio, que se invierte sobre un pocillo con disolución y se sella. La disolución en el pocillo contiene un agente precipitante, que está presente también en una cantidad menor en la gota de proteína. La función del agente precipitante es doble. Primero, la disolución en el pocillo está inicialmente a una presión de vapor más baja que la gota de proteína para que la evaporación progrese a una velocidad fija por la diferencia en las presiones de vapor y la distancia por la cual el vapor (normalmente agua) debe difundirse. Segundo, el agente precipitante disminuye la solubilidad de la proteína en disolución por competir con la proteína por el disolvente disponible, y así a medida que se produce la evaporación de la gota de la proteína, la disolución se torna sobresaturada en proteína. Bajo condiciones apropiadas que incluyen pH, concentración de proteína y temperatura, se produce entonces la cristalización de la proteína o macromolécula.

Los procedimientos discontinuos (batch) generalmente incluyen el agregado lento de un agente precipitante a una disolución acuosa de proteína hasta que la disolución apenas se convierte en turbia; en este punto el recipiente es sellado y dejado en reposo por un tiempo predeterminado.

Los cristales de PTH pueden obtenerse usando condiciones básicas o condiciones ácidas con cualquiera de los procedimientos anteriores.

Bajo condiciones básicas, primero se obtiene el fragmento de PTH en forma purificada y liofilizada. La proteína se disuelve en agua a una concentración de 5 mg/ml a 40 mg/ml, preferentemente 5 mg/ml a 20 mg/ml. La disolución proteica acuosa se mezcla después con una disolución de reserva que contiene de 5 a 50 volúmenes por ciento, preferentemente 10 a 20 volúmenes por ciento de un disolvente orgánico y un tampón en una cantidad que mantenga un intervalo de pH entre 6,0 y 12,0. La disolución acuosa y la disolución de reserva son preferentemente mezcladas en una proporción 1:1.

El disolvente orgánico usado puede ser, por ejemplo y sin limitaciones, metanol, etanol, isopropanol, polietilenglicol, etilenglicol, o una mezcla de ellos. Cualquier tampón puede ser usado, preferentemente cualquier tampón biológico, por ejemplo las sales tris (hidroximetil) aminometano, por ejemplo maleato o clorhidrato, o un tampón de glicina. Las sales metal-álcali pueden ser usadas también dependiendo del pH deseado. Por ejemplo, puede usarse una fuente de citrato, como citrato sódico, como un tampón ligeramente básico.

La cristalización en condiciones básicas produce cristales de tipo placas. Particularmente, por ejemplo, los cristales teriparatide de tipo placas se han desarrollado usando las condiciones básicas descritas anteriormente, en el término de aproximadamente 48 horas, a temperatura ambiente y a 4ºC, con un tamaño aproximado de 0,1 mm x 0,1 mm x 0,05 mm.

En condiciones ácidas, el fragmento de PTH es preparado de la misma manera en una disolución acuosa a una concentración de 5 mg/ml a 40 mg/ml, preferentemente 5 mg/ml a 20 mg/ml. La disolución acuosa que contiene la proteína es mezclada con una disolución de reserva que contiene una sal y/o tampón en una cantidad que mantenga un pH entre 4,0 y 6,0. Las soluciones de proteína y tampón se mezclan preferentemente en una proporción 1:1.

La disolución de reserva contiene una sal precipitante como, por ejemplo, fosfato o formato a una concentración 0,5 M a 2,5 M.

El tampón empleado en la disolución de reserva puede ser cualquier tampón biológicamente aceptable con un intervalo de pH de 4,0-6,0. Estos tampones son, por ejemplo, diversos fosfatos, formatos, acetatos, tartratos y similares, incluyendo las mezclas de ellos, en la forma de sus respectivas sales metal-álcali, por ejemplo sodio y/o potasio. Cuando una sal de fosfato o formato se usa como sal precipitante, puede agregarse un tampón adicional sólo si se desea.

La cristalización en un medio ácido produce cristales cúbicos. De este modo, por ejemplo, los cristales cúbicos de teriparatide han sido desarrollados en aproximadamente 48 horas usando las condiciones ácidas descritas anteriormente, a temperatura ambiente y a 4ºC, con un tamaño aproximado de 0,1 mm x 0,1 mm x 0,1 mm.

La forma de realización preferida de la presente invención es la forma cristalina de teriparatide, PTH(1-34) (SEC ID Nº:2) humana. Se ha caracterizado por cristalografía de rayos-X que la teriparatide cristalina preparada a través de los procedimientos descritos anteriormente, tiene un sistema de cristales de placas tetragonales o cristales cúbicos con una simetría o grupo espacial de P422 y la dimensión celular siguiente que tiene estas constantes de unidad celular:

a = b = 91,071 Angstroms (\ring{A}),

c = 37,665 \ring{A},

\alpha = \beta = \gamma = 90º

En una forma de realización alternativa, el fragmento de PTH obtenido como se describe anteriormente, se disuelve en una disolución que contiene de 10 a 30 volúmenes por ciento de glicerol, preferentemente 20 volúmenes por ciento, donde la concentración de proteína es de 5 mg a 40 mg/ml, preferentemente 5 mg/ml a 2 mg/ml. La disolución de proteína-glicerol es después mezclada con una disolución de reserva que contiene de 5 a 50 volúmenes por ciento, preferentemente 5 a 20 volúmenes por ciento de un disolvente orgánico, y un tampón en una cantidad que mantenga un intervalo de pH de 3,0 a 7,0. La disolución de proteína y la disolución de reserva se mezclan preferentemente en una proporción 1:1.

Los disolventes orgánicos son aquellos descritos previamente. Se prefiere isopropanol. También se pueden usar los tampones descritos previamente dependiendo del pH deseado dentro del intervalo 3-7. Se prefiere como tampón una sal citrato, por ejemplo citrato sódico. Además de las anteriores soluciones disolvente y tampón, la disolución de reserva contiene una sal precipitante como sulfato de amonio a una concentración 0,5 a 3,0 M.

La cristalización en un medio de glicerol produce cristales hexagonales. Así, por ejemplo, los cristales hexagonales de PTH(1-34) (SEC ID Nº:2) humana, han sido desarrollados en aproximadamente 12-24 horas usando las condiciones descritas anteriormente, a temperatura ambiente y a 4ºC, con un tamaño aproximado de 0,2 mm x 0,2 mm x 0,6 mm. La cristalografía de rayos-X de los cristales hexagonales, muestra un sistema de cristales con una simetría o grupo espacial P622 y la dimensión celular siguiente que tiene constantes de unidad celular: a = b = 30,169 \ring{A}, c = 110,597 \ring{A}, \alpha = \beta = 90º, \gamma = 120º.

Las ventajas de una forma cristalina para PTH fragmentada y especialmente para teriparatide, es que el material cristalino una vez obtenido proporciona el ingrediente terapéutico activo en su forma más pura y estable. De este modo, el material cristalino puede ser almacenado por un período de tiempo más prolongado que las formas previas de la hormona o soluciones de ella. El material cristalino puede ser después directamente usado para preparar formulaciones farmacéuticas para administración a pacientes. Así, por ejemplo, la PTH cristalina puede ser disuelta directamente con soluciones estériles en viales o cartuchos para administración por vía parenteral.

La disolución de PTH incorpora PTH en una cantidad médicamente efectiva, un término usado en referencia a cantidades útiles terapéuticamente o en el diagnóstico médico. La cantidad particular de hormona paratiroidea incorporada en la preparación puede ser predeterminada en base al tipo de PTH seleccionada y en el uso final proyectado de la preparación. En una solicitud, las preparaciones son explotadas para propósitos terapéuticos, y particularmente para el tratamiento de osteoporosis. El tratamiento de la osteoporosis implica la administración de la preparación reconstituida por inyección, preferentemente inyección subcutánea, en unidades de dosis que reflejen el régimen de tratamiento prescrito, que son, a modo de ejemplo, para PTH(1-34) (SEC ID Nº:2), entre 25 \mug de PTH/ml de disolución inyectada a 1000 \mug/ml de disolución inyectada por paciente, con volúmenes de inyección preferentemente entre 0,02 y 1,3 ml. Por lo tanto, es deseable que la PTH(1-34) (SEC ID Nº:2) humana cristalina sea preparada con un agente tampón y un excipiente para formar una disolución acuosa que contenga PTH en una concentración de 25 \mug/ml a 1000 \mug/ml, preferentemente de 100 \mug/ml a 500 \mug/ml.

En una forma de realización, las preparaciones se proveen en la forma de un envase unitario que rinde 100-500 \mug de PTH(1-34) (SEC ID Nº:2) humana después de la reconstitución con aproximadamente 1 ml (0,8-1,2 ml) del vehículo para reconstitución; por lo tanto, los viales son cargados con aproximadamente 1 ml de la preparación acuosa de PTH, para su posterior secado en frío.

Una vez que se obtiene la preparación como una disolución acuosa que contiene las cantidades y concentraciones deseadas del agente tampón, el excipiente y la PTH, se llenan los viales individuales con la disolución al volumen deseado. La ventaja de la presente invención es que la disolución anterior puede ser preparada con agua estéril sin la necesidad de someterla a un proceso de secado en frío.

Además de su uso terapéutico, la presente composición de PTH puede ser formulada y administrada para colaborar en el diagnóstico médico y, particularmente, para ayudar a establecer el diagnóstico de hipoparatiroidismo y seudo-hipoparatiroidismo en pacientes hipocalcémicos. Excepto la dosis de PTH, la composición de la preparación de PTH permanecerá como se describe en la presente invención para uso terapéutico. Una dosis única infundida por vía intravenosa de PTH(1-34) (SEC ID Nº:2) humana, que es igual a 200 Unidades Internacionales de actividad de PTH, es apropiada para este propósito diagnóstico. El diagnóstico se realiza entonces a través de la determinación del efecto de la PTH administrada o los niveles urinarios de AMPc, siendo la elevación de AMPc indicativa de la condición de hipoparatiroidismo, en lugar de su seudo-forma.

Dado que la PTH fragmentada está disponible ahora en una forma pura cristalina, otras formas de dosificación como comprimidos, cápsulas o supositorios y similares pueden ser preparados también para administración terapéutica o diagnóstica.

Los ejemplos siguientes son ilustrativos de la invención y no pretenden ser limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1

La rhPTH(1-34) (Sec. Id. Nº 2) recombinante humana fue preparada a partir de material previamente purificado y liofilizado. La proteína liofilizada fue disuelta en agua, a una concentración de 5 mg/ml a 20 mg/ml. La proteína fue mezclada con disolución de reserva (isopropanol al 20%, citrato sódico 0,2 M, tampón Tris.ClH 0,1 M, pH = 8,0) en una proporción 1:1 sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos de silicona. Estos cubreobjetos fueron invertidos y sellados sobre pocillos que contenían 1 ml de disolución de reserva. Los cristales aparecieron como placas tetragonales dentro de las 48-96 horas con un tamaño de 0,1 mm x 0,1 mm x 0,05 mm. El producto fue confirmado por espectroscopia de masa. En la Figura 1 se muestra una fotografía de los cristales desarrollados.

La cristalografía de rayos X en placas tetragonales mostró un grupo espacial P422 y las siguientes constantes de unidad celular: a = b = 91,071 \ring{A}, c = 37,665 \ring{A}, \alpha = \beta = \gamma = 90º.

Ejemplo 2

El mismo experimento fue repetido como en el Ejemplo 1 y mezclado con disolución de reserva de isopropanol al 10%, polietilenglicol al 10%, tampón de glicina 0,1 M a pH = 8,5.

Ejemplo 3

Cristalización en serie: rhPTH (SEC ID Nº:1) se mezcló a una concentración de 10 mg/ml con isopropanol al 50%, Tris 100 mM, pH = 7,5, citrato sódico 0,2 M en una proporción 1:1 en el tubo de ensayo. Los cristales aparecieron dentro de las 48-96 horas con un tamaño de 0,1 mm x 0,1 mm x 0,05 mm.

Ejemplo 4

La proteína fue preparada de la misma manera que en el Ejemplo 1 y mezclada en una proporción 1:1 con la disolución de reserva (fosfato potásico 0,8 M, fosfato sódico 0,8 M, pH = 5,0). Aparecieron cristales cúbicos dentro de las 48 horas a temperatura ambiente con un tamaño de 0,1 mm x 0,1 mm x 0,1 mm. La Figura 2 muestra una fotografía de los cristales desarrollados.

La cristalografía de rayos-X de los cristales cúbicos mostró un grupo espacial P422 y las siguiente constantes de unidad celular: a = b = 91,071 \ring{A}, c = 37,665 \ring{A}, \alpha = \beta = \gamma = 90º.

Ejemplo 5

La proteína fue preparada de la misma manera que en el Ejemplo 1 y mezclada en una proporción 1:1 con disolución de reserva (tampón de formato sódico 0,8 M, acetato sódico 0,1 M y pH = 4,5). Aparecieron los mismos cristales que en el Ejemplo 4.

Ejemplo 6

Se preparó rhPTH(1-34) (SEC ID Nº:2) a partir de material previamente purificado y liofilizado. La proteína liofilizada fue disuelta en glicerol al 20%, a una concentración de 5 mg/ml a 20 mg/ml. La proteína de mezcló con disolución de reserva (tampón de sulfato de amonio 2,4 M, isopropanol al 5%, citrato sódico 0,2 M, pH = 5,0) en una proporción 1:1 sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos de silicona. Estos cubreobjetos fueron invertidos y sellados sobre pocillos que contenían 1 ml de disolución de reserva. Aparecieron cristales hexagonales dentro de las 12-24 horas con un tamaño de 0,2 mm x 0,2 mm x 0,6 mm.

La cristalografía con rayos-X de los cristales hexagonales mostró un grupo espacial P622 y las siguientes constantes de unidad celular: a = b = 30,169 \ring{A}, c = 110,597 \ring{A}, \alpha = \beta = 90º, \gamma = 120º.

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<110> Eli Lilly and Company

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<120> TERIPARATIDE CRISTALINA

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<130> 3797.17WO01

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<140> NUEVA PRESENTACIÓN

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<141> 1998-12-08

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<150> 60/069.875

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<151> 1997-12-18

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<160> 2

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<170> Patent In Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 84

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

1

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<210> 2

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<211> 34

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

2

Claims

1. Una hormona paratiroidea en forma cristalina seleccionada del grupo formado por PTH(1-34), PTH(1-37), PTH (1-38), y PTH(1-41).

2. La hormona cristalina de la reivindicación 1, siendo dicha hormona PTH(1-34) (SEC ID Nº:2) humana.

3. La hormona cristalina de la reivindicación 2, en forma de placas tetragonales con un grupo espacial P422 y las siguientes constantes de unidad celular: a = b = 91,071 \ring{A}, c = 37,665 \ring{A}, \alpha = \beta = \gamma = 90º.

4. La hormona cristalina de la reivindicación 2, en forma cúbica cristalina que tiene un grupo espacial P422 y las siguientes constantes de unidad celular: a = b = 91,071 \ring{A}, c = 37,665 \ring{A}, \alpha = \beta = \gamma = 90º.

5. La hormona cristalina de la reivindicación 2, en forma cristalina hexagonal con un grupo espacial P622 y las siguientes constantes de unidad celular: a = b = 30,169 \ring{A}, c = 110,597 \ring{A}, \alpha = \beta = 90º, \gamma = 120º.

6. Un procedimiento para purificar una hormona paratiroidea que comprende:

(a) el suministro de una disolución acuosa de una hormona paratiroidea seleccionada del grupo formado por PTH(1-34), PTH(1-37), PTH (1-38), y

\hbox{PTH(1-41)}

a una concentración de 5 a 40 mg por ml;

(b) la mezcla de dicha disolución con una disolución de reserva que comprende un disolvente orgánico a una concentración de 5 a 50 volúmenes por ciento y un tampón a una concentración que mantenga el pH de la disolución entre 6,0 y 12,0; y

(c) permitir que la disolución resultante repose un tiempo predeterminado a una temperatura entre temperatura ambiente y 4ºC hasta que se formen cristales de tipo placa.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la hormona es PTH(1-34) humana.

8. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el disolvente orgánico es un miembro seleccionado del grupo formado por metanol, etanol, isopropanol, polietilenglicol, etilenglicol y una mezcla de ellos.

9. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la concentración de la hormona es de 5 a 20 mg/ml.

10. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el disolvente orgánico está a una concentración de 10 a 20 volúmenes por ciento.

11. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la disolución acuosa y la disolución de reserva se mezclan en una proporción 1:1.

12. Un procedimiento para purificar una hormona paratiroidea que comprende:

(a) el suministro de una disolución acuosa de una hormona paratiroidea seleccionada del grupo formado por PTH(1-34), PTH(1-37), PTH(1-38), y PTH(1-41) a una concentración de 5 a 40 mg/ml;

(b) la mezcla de dicha disolución con una disolución de reserva que comprende una sal precipitante de fosfato o formato a una concentración 0,5 M a 2,5 M y, opcionalmente, una disolución acuosa tampón, o una mezcla de ellas, a una concentración que mantenga un pH entre 4,0 y 6,0; y

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la hormona es PTH(1-34) (SEC ID Nº:2) humana.

14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el tampón es seleccionado del grupo formado por fosfatos, formatos, acetatos, tartratos y mezcla de ellos.

15. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la concentración de la hormona es de 5 a 20 mg/ml.

16. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la disolución acuosa de la hormona y la disolución tampón se mezclan en una proporción 1:1.

17. Un procedimiento para purificar una hormona paratiroidea que comprende:

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(a) el suministro de una disolución de una hormona paratiroidea seleccionada del grupo formado por PTH(1-34), PTH(1-37), PTH (1-38), y PTH(1-41) a una concentración de 5 a 40 mg/ml en 10 a 30 volúmenes por ciento de glicerol;

(b) la mezcla de dicha disolución con una disolución de reserva que comprende un disolvente orgánico a una concentración de 5 a 50 volúmenes por ciento, sulfato de amonio a una concentración 0,5 M a 3,0 M, y un tampón a una concentración que mantenga el pH de la disolución entre 3,0 y 7,0; y

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que la hormona es PTH(1-34) (SEC ID Nº:2) humana.

19. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el disolvente orgánico es un miembro seleccionado del grupo formado por metanol, etanol, isopropanol, polietilenglicol, etilenglicol y una mezcla de ellos.

20. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que la concentración de la hormona es de 5 a 20 mg/ml.

21. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el tampón es un citrato.

22. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que la disolución de la hormona y la disolución tampón se mezclan en una proporción de 1:1.