DE60018105T2

DE60018105T2 - Polypeptidzusammensetzungen mit verbesserter stabilität

Info

Publication number: DE60018105T2
Application number: DE60018105T
Authority: DE
Inventors: Rosario Michael DEFELIPPIS; Allen Michael DOBBINS; David Alby SHARKNAS; Mark Alex PROKAI; Vincent Joseph RINELLA
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1999-12-16
Filing date: 2000-12-05
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2020-12-06
Also published as: ATE288765T1; DK200000375U1; CN1409640A; IL150129A0; WO2001043762A3; PT1242121E; AU2049301A; AU777570B2; PL355378A1; EA004631B1; EP1242121B1; CA2394213A1; ES2236010T3; BR0016334A; JP2003523972A; EP1242121A2; DE20021079U1; DE60018105D1; WO2001043762A2; EA200200684A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung liegt im Gebiet der Humanmedizin. Insbesondere liegt die Erfindung im Gebiet der pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von verschiedenen Erkrankungen, einschließlich Diabetes und Hyperglycämie.
Hintergrund der Erfindung
Viele pharmazeutische Polypeptidzusammensetzungen werden für die Behandlung von Erkrankungen bei Menschen und anderen Säugern verwendet. Aufgrund ihrer hohen Labilität nach der oralen Verabreichung müssen Polypeptidarzneimittel im allgemeinen auf parenteralen Wegen verabreicht werden. Hauptsächlich sind diese Wege subkutan, intramuskulär und intravenös.
Polypeptidarzneimittelprodukte werden traditionell als Lösungen, Suspensionen oder lyophilisierte Produkte an Apotheken, Krankenhäuser und Patienten geliefert. In flüssiger Form erfordert jede Polypeptidarzneimittelformulierung ein bestimmtes Mindestmaß an chemischer und physikalischer Stabilität für einen definierten Zeitraum, der bestimmt wird durch den Behandlungsplan, die Bequemlichkeit für den Patienten, die Sicherheit für den Patienten und regulatorische Vorschriften.
Um Schmerz oder mögliche Gewebezerstörungen zu vermeiden, werden flüssige Polypeptidarzneimittelzusammensetzungen so gestaltet, dass sie eine Tonizität oder Osmolarität bereitstellen, die eng an der von Körperflüssigkeiten an oder um die Verabreichungsstelle liegen. Hilfsstoffe, wie Glycerin, Dextrose, Mannit, Lactose und Salze, wie Natriumchlorid, werden oft für diesen Zweck verwendet. Beispiele für Polypeptidarzneimittelprodukte, die Glycerin als isotonisches Mittel verwenden, umfassen die, die als Wirkstoff Humaninsulin, Insulin-Lispro, Insulin-Aspart und Glucagon enthalten.
Glycerin wurde in pharmazeutischen Zusammensetzungen als Löslichkeitsvermittler, Netzmittel, Emulgator, Lösemittel, Füllstoff, Antioxidans, Chelatmittel und Konservierungsstoff verwendet [A.J. Spiegel et al., J. Pharm. Sci.52: 917–927 (1963), Y-C. J. Wang et al., J. Parenteral Drug Assoc. 34: 452–462 (1980), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company 18. Ausgabe, Seite 1316 (1990), S. Li et al., J. Pharm. Sci. 85: 868–872 (1996), G.M. Sieger et al., US 4 016 273 A vom 5. April 1977, D.N. Heinz WO 98/29131 A vom 9. Juli 1998].
Für einige Polypeptidformulierungen schließt die physikalische Instabilität die Verwendung von Salzen für die Isotonizität aus, ein Problem, das oft durch die Verwendung von Glycerin gelöst wird. Von Glycerin ist jedoch bekannt, dass es zur chemischen Instabilität in Polypeptidprodukten beiträgt. Insbesondere dürften Verunreinigungen, die im Glycerin vorkommen, wie Aldehyde, kovalente Quervernetzungsreaktionen starten, die zu Polypeptiddimeren und Polymeren führen. Siehe beispielsweise J. Bello et al., [Arch. Biochem. Biophys. 172: 608–610 (1976)]. Für Insulinprodukte wurden solche Dimere und Polymere mit Antigenizität und Hautallergie in Zusammenhang gebracht, wie dies in D.C. Robbins et al. [Diabetes 36: 838–841 (1987)], D.C. Robbins et al., [Diabetes 36: 147–151 (1987)] und R.E. Ratner et al., [Diabetes 39: 728–732 (1990)] beschrieben ist. J. Brange et al. [Pharm. Res. 9: 727–734 (1992)] zogen die Schlussfolgerung, dass kovalente Insulindimere und -polymere minimiert werden sollten, um diese allergischen Reaktionen zu vermeiden, aber es wurden keine Verfahren beschrieben oder vorgeschlagen, um dieses Ziel zu erreichen.
Drei Beobachtungen können zum Problem der Herstellung von verlässlich stabilen Polypeptidzusammensetzungen gemacht werden, die Glycerin für die parenterale Verabreichung enthalten. Zuerst fehlte ein einfacher aber genauer Test zur Bestimmung der Menge an reaktiven Aldehyden, die in Glycerin vorkommt und zu quervernetzten Polypeptidverunreingungen führt. Zweitens existierte keine Beschreibung oder ein Vorschlag im Stand der Technik, dass im Handel erhältliche Glycerinchargen, die aus unterschiedlichen Quellen hergestellt werden, evaluiert werden sollten, um zu bestimmen, ob bestimmte Quellen besser als andere bei der Minimierung von Polypeptidquervernetzungsreaktionen sind. Jede dieser Beobachtungen wird nun ausführlicher im Detail beschrieben.
Messung der reaktiven Aldehyde in Glycerin Das Fehlen einer einfachen, verlässlichen Methode zur Messung der reaktiven Aldehydverunreinigungen in Glycerin, die zur Bildung von quervernetzten Polypeptidverunreingungen führt, hat die Lösung des Polypeptidquervernetzungproblems in Formulierungen behindert, die Glycerin enthalten.
Formaldehyd kann die Quervernetzung von Polypeptiden durch eine reaktive Imminbindung auslösen (S.P. Schwendeman et al., PNAS 92: 11234–11238 (1995) und H. Fraenkel-Conrat et al., JACS 70: 2673–2684 (1948)). Glycerinaldehyd und Glycolaldehyd reagieren mit Aminogruppen in Polypeptidlösungen unter Bildung von quervernetzten Polypeptiden, wie dies in A.S. Acharya et al., (PNAS 80: 3590-3594 (1983)] und A.S., Acharya et al [Biochemistry 27: 4522–4629 (1988)] beschrieben wurde.
Eine Beteiligung von Aldehydverunreinigungen in Glycerin bei der Bildung von hochmolekularen Polymeren in Insulinformulierungen wurde vermutet [J. Brange et al., Pharm. Res. 9: 727–734 (1992), J. Brange, Stability of Insulin, Kluwer Academic Publishers, Boston, Seiten 23–36 (1994), J. Brange et al., Hormone Drugs, veröffentlicht von der US Pharmacopoeial Convention, Rockville, Maryland, Seiten 95-105 (1982)], es wurden aber keine Verfahren zur Quantifizierung oder Entfernung der Aldehydverunreinigungen zur Verbesserung der chemischen Stabilität der Insulinformulierungen beschrieben.
Es gibt viele Tests für Aldehyde in der Literatur, aber ihre Anwendbarkeit zur Messung des reaktiven Aldehydgehalts von Glycerin als bestimmendes Element der Polypeptidquervernetzung in pharmazeutischen Formulierungen ist fraglich.
Das European Pharmacopoeia Supplement 2000 [Council of Europe, Strasbourg, Frankreich, Seiten 747–751 (1999)] beschreibt einen Aldehydtest in der Glycerinmonographie. Dieser Test verwendet Pararosanilinhydrochloridreagenz und eine 5 ppm Formaldehydstandardlösung als Vergleich.
Die British Pharmacopoeia 1999 [British Pharmacopoeia Commission, London, Seiten 710–711 (1999)] beschreibt einen Test für Aldehyde und reduzierende Substanzen in Glycerin mittels Pararosanilinhydrochlorid und einem visuellen Vergleich mit einer Standardlösung, die 5 ppm Formaldehyd enthält.
Das "Purpaldreagenz" 4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol [R.G. Dickinson et al., Chem. Commun. Seite 1719 (1970)) reagiert mit Aldehyden und wurde zur Bestimmung von Formaldehyd in Luft, Glycolen, Impfstoffen, Harzen und Plastikprodukten und zur Detektion von Acetaldehyd in Lebergewebeschnitten und Früchten verwendet [Aldrich Technical Information Bulletin Nr. AL-145, Aldrich Chemical Co., H.B. Hopps, Aldrichimica Acta 33: 28–29 (2000)].
Die Reaktion von Formaldehyd mit Acetylaceton unter Bildung eines gefärbten Produkts wurde von T. Nash beschrieben [Biochem. J. 55: 416–425 (1953)]. Dieses Reagenz scheint ziemlich spezifisch für Formaldehyd zu sein, da die Beeinträchtigung von Acetaldehyd nur 1 % auf molarer Basis ist.
Die Glycerinmonographie in The International Pharmacopoeia (Dritte Ausgabe, WHO, 4: 176–181 (1994)] beschreibt einen Test für Aldehyde und reduzierende Substanzen mittels einer Lösung aus Fuchsin/Schwefliger Säure. Die Farbintensität wird mit einer 0,2 M Lösung Kaliumpermanganat verglichen.
In einem Werbeblatt mit der Überschrift "Discover the Origins of Some of the World's Most Consistently Pure Products; Synthetic Glycerine Products" von Dow Chemical Company (Freeport, TX, USA), Seiten 10–11, wird die UV Spektrometrie verwendet, um OPTIM^® Glycerin 99,7 % USP mit weniger reinen Glycerinproben zu vergleichen. Es wird keine quantitative Untersuchung der Menge an Aldehyden oder anderer organischer Verunreinigungen geliefert.
Glycerinaldehyd reagiert mit 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid (MBTH). In E.Sawicki et al., [Anal. Chem.33: 93–96 (1961)] wird gezeigt, dass dieses Reagenz mit D,L-Glycerinaldehyd reagiert, es wurde aber nur die Messung von Formaldehyd in Autoabgasen und verschmutzter Luft beschrieben. M.A. Paz et al., [Arch. Biochem. Biophys. 109: 548–559 (1965)] zeigen, dass L-Glycerinaldehyd mit MBTH reagiert und beschreiben einen Test zur Detektion von Spurenmengen von Aldehyden in Gegenwart von Ketonen, Ketosäuren und verschiedenen Typen von Pyranosekohlenhydraten während biochemischer Reaktionen. M.A. Eberhardt et al. [Marine Chemistry 17: 199–212 (1985)] beschreiben die Verwendung von MBTH zur Messung von Aldehyden, speziell Formaldehyd, in Meerwasser und bakteriellen Kulturen. MBTH wird in einem im Handel erhältlichen Test mittels Glutaraldehyd oder 1,5-Pentandial als Standard verwendet [Glutaraldehyde Test Kit Model GT-1, Hach (Loveland, CO, USA)]. Dieser Test verwendet eine Farbskala zur Messung von Glutaraldehydmengen bis 1 mg/l.
B.W. Bailey et al. [Anal. Chem. 43: 782–784 (1971)] zeigen, dass das Reagenz p-Phenylendiamin mit Formaldehyd, Acetaldehyd und Benzaldehyd reagiert aber sehr selektiv für Formaldehyd ist. Es wird zur Messung von niedrigen Konzentrationen von Formaldehyd in Luft verwendet.
Man gelangte nun überraschenderweise zu der Erkenntnis, dass ein neuer MBTH Test mittels Glycerinaldehyd als Standard effektiv zur Messung der reaktiven Aldehyde verwendet werden kann, die in Glycerinproben vorhanden sind. Man gelangte ebenfalls zu der Erkenntnis, dass das Ausmaß an Quervernetzung in Polypeptidformulierungen, die Glycerin enthalten, stark in einer linearen Beziehung mit der Menge an reaktivem Aldehyd im Glycerin korreliert, das zur Herstellung der Formulierungen verwendet wird, wie dies durch den vorher erwähnten Test gemessen wird. Daher kann der neue MBTH Test verwendet werden, um leicht die relative chemische Stabilität von wässrigen, parenteralen Polypeptidzusammensetzungen vorherzusagen, die Glycerin enthalten, und kann auch verwendet werden, um geeignete Glycerinchargen zur Verwendung bei der Herstellung solcher Zusammensetzungen auszuwählen.
Glycerin, das aus verschiedenen Quellen stammt
Ein weiterer Hinderungsgrund zur Lösung des Polypeptidquervernetzungsproblems in Formulierungen, die Glycerin enthalten, ist das Versagen zur Anerkennung der Wichtigkeit der Quelle, aus der das im Handel erhältliche Glycerin hergestellt wird und des Verfahrens, durch das das Glycerin hergestellt wird. Genauer gesagt existierte keine Beschreibung oder Empfehlung, dass im Handel erhältliche Glycerinchargen, die aus verschiedenen Quellen hergestellt werden, evaluiert werden sollten, um zu bestimmen, ob bestimmte Quellen besser sind als andere bei der Minimierung der Polypeptidquervernetzungsreaktionen.
Aldehyde werden im Glycerin durch autokatalytische oder thermische Oxidation gebildet, wie dies in J. Mohr et al. [CA 2 242 591 A vom 13. Juli 1998] bemerkt wird. Wie von N.W. Ziels berichtet [J. Amer. Oil Chemists' Soc. 33: 556–565 (1956)] haben die zur Herstellung und Reinigung von Glycerin verwendeten Verfahren einen großen Einfluss auf die schließliche Reinheit des Glycerins unabhängig vom Ausgangsmaterial. Glycerin wird aus vielen Quellen hergestellt, einschließlich Tierfett, Pflanzen, Fermentation, chemische Synthese von kleineren organischen Molekülen und von Propylen. Verfahren zur Herstellung von Glycerin aus diesen und anderen Quellen sind dem Fachmann gut bekannt. Welchen Einfluss jedoch die Quelle auf den Gehalt an reaktiven Aldehyden hat, der in im Handel erhältlichen Glycerinchargen gefunden wird, und auf die schließliche chemische Stabilität von wässrigen, parenteralen Polypeptidzusammensetzungen, die Glycerin enthalten, wurde nicht untersucht oder bestimmt.
T.D. Rohde et al. [Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 33: 316–318 (1987)] beschreiben eine neue Insulinformulierung zur Verwendung in implantierbaren Pumpen, die etwa 80 % Glycerin enthalten, worin das von Tieren stammende Glycerin, das in früheren Formulierungen verwendet wurde, durch Glycerin aus einer nicht spezifizierten synthetischen Quelle ersetzt wurde, das von den Autoren mittels einer gemischten Ionenaustauschersäule weiter gereinigt wurde. Die neuen und vorherigen Formulierungen unterscheiden sich auch im pH, einem Schlüsselfaktor, der das Ausmaß der Quervernetzungsreaktionen in Insulinformulierungen beeinflusst. Bei der Behandlung von diabetischen Patienten legt eine längere Verweilzeit und eine geringe Insulinverwendung bei der neuen Formulierung eine verbesserte Stabilität nahe, was auf den Unterschied im pH und der zusätzlichen Reinigung des synthetischen Glycerins zurückgeführt wird.
Mittels des hierin beschriebenen MBTH Tests wurde überraschenderweise festgestellt, dass im Handel erhältliche Glycerinchargen, die aus nicht-tierischen Quellen hergestellt wurden, geringere Mengen an reaktiven Aldehyden aufweisen, als von Tieren stammendes Glycerin. Dies wurde für Glycerin gezeigt, das von Pflanzen und Propylen stammt. Glycerin, das von Propylen stammt, hat besonders niedrige Mengen an reaktiven Aldehyden. Es wurde auch festgestellt, dass im Handel hergestellte Glycerinchargen, die von Pflanzen- und Propylenquellen stammen, einen viel geringeren mittleren Gehalt an reaktiven Aldehyden pro Alter in Monaten aufweisen, als Glycerinchargen, die von tierischen Quellen stammen, was nahelegt, dass die Menge an reaktiven Aldehyden in Glycerin von Tieren über die Zeit schneller zunimmt als in Glycerin, das von Pflanzen und Propylen stammt.
Darüberhinaus wurde festgestellt, dass wässrige, parenterale pharmazeutische Zusammensetzungen von Polypeptiden, die Glycerin enthalten, das von Propylen stammt, eine verbesserte chemische Stabilität im Vergleich zu ähnlichen Zusammensetzungen aufweisen, die mit Glycerin hergestellt wurden, das aus Tieren stammt.
[Verringerung der reaktiven Aldehydmengen in Glycerin
Schließlich wurde kein einfaches wirksames Verfahren zur Verringerung der Menge an reaktiven Aldehyden in Glycerin zur Verbesserung der chemischen Stabilität von pharmazeutischen Polypeptidzusammensetzungen beschrieben, die Glycerin enthalten.
J. Bello [Biochemistry 8: 4535–4541 (1969)] und J. Bello et al. [Arch. Biochem. Biophys. 172: 608-610 (1976)] versuchten die Quervernetzung in einer Proteinlösung, die Glycerin enthält, durch die Reinigung des Glycerins zu verhindern. Das Glycerin wird zuerst mit dem reduzierenden Mittel Natrium borhydrid behandelt. Dem Reduktionsschritt folgt eine Behandlung des Glycerins mit MB-3 Harz zur Entfernung der anorganischen Salze und schließlich eine Destillation im Vakuum. Es existiert kein Hinweis auf die Menge der reaktiven Aldehyde vor oder nach der Behandlung. Die verringerte Quervernetzung, die durch diese Glycerinreinigung erreicht wurde, ist kurzlebig.
Es werden auch verschiedene Glycerinreinigungsverfahren beschrieben in J.A. Riddick et al., [Techniques of Chemistry II: Organic Solvents, Physical Properties and Methods of Purification, Wiley-Interscience, New York, Seiten 689–690 (1970)], Z. Diaz et al. [ US 4 683 347 A vom 28. Juli 1987], D.M. Stromquist et al. [Ind. Eng. Chem. 43: 1065–1070 (1951)] und Ziels, siehe vorheriges Zitat, aber keine umfasst die Verringerung der Menge an reaktiven Aldehyden durch das Zusammenbringen des Glycerins mit einem polymeren Harz, das freie Aminogruppen enthält.
M.W. Washabaugh et al., [Anal. Biochem. 134: 144–152 (1983)] beschreiben ein unhandliches Verfahren zur Verringerung von Aldehydmengen in Ethylenglycol, das die Reduktion mit Natriumborhydrid, eine vierfache Verdünnung mit Wasser und eine Passage der wässrigen Lösung durch vier Chromatographiesäulen umfasst, die verschiedene Harze enthalten. Die Aldehyde in der]
Die oben beschriebenen Entwicklungen wurden kombiniert, um neue Präparationen an Glycerinenthaltenden Polypeptidzusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung mit verbesserter chemischer Stabilität im Vergleich zu vorher bekannten Polypeptidzusammensetzungen bereitzustellen. Diese stabilisierten Polypeptidzusammensetzungen liefern eine erhöhte Sicherheit für Patienten, die sie zur Behandlung ihrer Erkrankung oder ihres Zustands verwenden.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Demnach ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung von nicht aus Tieren stammendem Glycerin als Glycerinkomponente in einer wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Polypeptid und Glycerin enthält, um die chemische Stabilität der Zusammensetzung zu verbessern. Die verbesserte chemische Stabilität betrifft die Verringerung der Menge an kovalent quervernetzten Polypeptiden, weil ein geringerer Gehalt an reaktiven Aldehyden im Glycerin vorkommt, das bei der Herstellung der Zusammensetzung verwendet wird. Genauer gesagt liefert die vorliegende Erfindung die Verwendung von Glycerin, das aus Pflanzen oder Propylen stammt, um die chemische Stabilität von wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Zusammensetzungen zu verbessern, die ein Polypeptid und Glycerin enthalten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von Glycerin, das einen reaktiven Aldehydgehalt von weniger als 8 ppm aufweist, als Glycerinkomponente in einer wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Polypeptid und Glycerin enthält, um die chemische Stabilität der Zusammensetzung zu verbessern.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine wässrige, parenterale pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid und Glycerin enthält, worin das Glycerin von einer nicht tierischen Quelle stammt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Zusammensetzung, das gekennzeichnet ist durch die Kombination von Wasser, einem Polypeptid und einem nicht-tierischen Glycerin.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in Form einer Lösung oder einer Suspension vorliegen, worin das Polypeptid in der Zusammensetzung teilweise oder vollständig unlöslich ist. Die Zusammensetzungen können auch aus Produkten mit zwei Packungen hergestellt werden, worin vor der parenteralen Verabreichung ein Polypeptid in fester Form mit einer getrennten Verdünnungslösung vereinigt wird, die Glycerin enthält.
Das Polypeptid in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung kann chemisch synthetisiert oder biosynthetisch mittels rekombinanter DNA Techniken hergestellt werden.
Die Erfindung umfasst die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung als Arzneimittel oder zur Verwendung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen bei Säugern.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Die 1 zeigt die lineare Beziehung (R² = 0,90) zwischen Analysen im Handel erhältlicher Chargen von Glycerin, das nicht aus Tieren stammt, die durch den MBTH Test der vorliegenden Erfindung und dem modifizierten 10x-GST Test bestimmt wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Ausdruck "Glycerin" bezieht sich auf die Chemikalie Propan-1,2,3-triol mit der CAS Registriernummer [56-81-5]. Die empirische Formel für Glycerin ist C₃H₈O₃ und es hat die Struktur OH-CH₂-CH(OH)-CH₂-OH. In einigen Literaturberichten wird der Ausdruck "Glycerol" verwendet, um die chemische Verbindung zu bezeichnen, wobei "Glycerin" sich auf im Handel erhältliche gereinigte Produkte bezieht, die 95 % oder mehr Glycerol enthalten und "Glycerine" als Handelsname für Produkte verwendet wird, deren Hauptkomponente Glycerol ist. Für die vorliegende Beschreibung kann Glycerin, was die Chemikalie Propan-1,2,3-triol bezeichnet, in die wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch Verwendung jeder Lösung, die die Chemikalie Propan-1,2,3-triol enthält, eingearbeitet werden. Die Glycerinkonzentration in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Polypeptidzusammensetzungen wird in Milligramm Propan-1,2,3-triol pro Milliter der Zusammensetzung angegeben und beträgt weniger als 500mg/ml.
Glycerin wurde zuerst 1779 von Carl W. Scheele entdeckt, der es durch Erhitzen von Olivenöl mit Bleioxid herstellte. Seit der Zeit wurden zumindest fünf unterschiedliche Rohstoffquellen verwendet, um Glycerin herzustellen.
Eine Glycerinquelle sind die Tiere. Talg oder Fett von Tieren, wie Rinder und Schafe, wird verestert und dann in einem Verfahren verseift, das Glycerin als Nebenprodukt der Seifenherstellung erzeugt. Tierfette werden auch direkt hydrolysiert oder verseift, um Glycerin zu erzeugen.
Eine zweite im Handel erhältliche Glycerinquelle sind Pflanzen. Im allgemeinen werden Öle, die von Kokusnuss, Palmen, Canola, Soja oder anderen Pflanzen stammen, zur Herstellung von Glycerin durch Verfahren verwendet, die mit denen von tierischen Fetten vergleichbar sind.
Eine dritte Quelle für Glycerin ist die Fermentation. Glycerin wird aus natürlichen Quellen, wie Zuckerrübenmelassen oder mittels modifizierter Mikroorganismen mit rekombinanter DNA Technologie fermentiert, wie dies von B.A. Bulthuis et al. [WO 98/21340 A vom 22. Mai 1998] und von R.V. Nair et al [WO 98/28480 A vom 10. Juni 1999] beschrieben ist.
Eine vierte Quelle für Glycerin ist die chemische Synthese, die von organischen Molekülen ausgeht, die weniger als drei Kohlenstoffatome enthalten. Ein solches Verfahren mittels Methanol ist in D.C. Owsley et al., [ US 4 076 758 A vom 28. Februar 1978] beschrieben.
Eine fünfte Glycerinquelle ist Propylen, das selbst aus Erdölprodukten hergestellt wird. Glycerin, das aus Propylen hergestellt wird, wurde etwa 1948 verfügbar. Es sind viele Synthesewege verfügbar, die Propylen zu Glycerin umwandeln, einschließlich die, die beschrieben sind in D.C. Owsley et al., siehe vorherige Literaturstelle, in Kirk-Othmer [Encylopedia of Chemical Technology 12: 681–694 (1994)] und in Remington's Pharmaceutical Sciences [Mack Publishing Company, 18. Ausgabe, Seite 1316 (1990)]. In einem Syntheseweg wird Propylen beispielsweise zum Allylchlorid chloriert, wonach eine Umwandlung mit hypochloriger Säure unter Bildung von Dichlorhydrin, eine Umsetzung mit Calciumhydroxid unter Bildung von Epichlorhydrin und schließlich die Hydrolyse zu Glycerin erfolgt.
Glycerin ist im Handel von einer Vielzahl an Quellen, Herstellern und Händlern erhältlich [siehe Chemical Week, Special Issue Buyer's Guide, 159: 321–322 (1997) und Chemical Industry Europe 93, The Leading Guide for Today's European Chemical Industry (1993)].
Glycerinprodukte, die von Pflanzen stammen, umfassen Pricerine 9091 [Unichema North America, Chicago, IL. USA], Kosher Superol Glycerine [Procter and Gamble Chemicals, Cincinnati, OH, USA], Glycerine 99,7 % [Chemical Associates of Illinois, Inc. Copley, OH, USA], Emery^® Glycerine 99,7 % Kosher [Henkel Corporation, Cincinnati, OH, USA und Glycerol anhydrous extra pure [EM Industries, Hawthorne, NY, USA].
Glycerinprodukte, die von Propylen stammen, sind unter anderem Optim^® Glycerine 99,7 % USP [Dow Chemical Company, Freeport, TX, USA], Glycerin, synthetisch [Solvay Fluorides, Inc., Greenwich, CT, USA] und Optim^® Glycerine 99,7 % [Dow Chemical Company, Stade, Deutschland]. Glycerin, das von Propylen stammt, wurde als Aromavermittler für die Beschichtung von Popcorn [S.R. Schellhaass, US 5 750 166 A vom 12. Mai 1998] und in einer geringen Konzentration in einer Operationslotion verwendet [M.T. Scholz et al., US 5 951 993 A vom 14. September 1999]. Glycerin, das von Propylen stammt, wurde in Präparationen für Nahrungsmittel und Pharmazeutika verwendet [Food Engineering, International Edition (Chilton Company), Seite 14, (1997)].
Der Ausdruck "nicht von Tieren stammendes Glycerin" bezieht sich auf Glycerin, das nicht aus dem Fett oder einer anderen Bulk-Komponente eines Tieres stammt. Herstellungsquellen für nicht von Tieren stammendes Glycerin sind unter anderem Pflanzen, Propylen, Fermentation und die chemische Synthese aus kleineren organischen Molekülen.
Die vorliegende Erfindung liefert wässrige, parenterale pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Polypeptid und Glycerin enthalten, worin die Glycerinkonzentration der Zusammensetzung weniger als 500 mg/ml beträgt. Die Glycerinkonzentration bezieht sich auf die Konzentration der Chemikalie Propan-1,2,3-triol. Vorzugsweise beträgt die Glycerinkonzentration in der pharmazeutischen Zusammensetzung etwa 1 mg/ml bis etwa 300 mg/ml. Bevorzugter beträgt die Glycerinkonzentration in der Zusammensetzung etwa 3 mg/ml bis etwa 100 mg/ml. Noch bevorzugter beträgt die Glycerinkonzentration in der wässrigen, pharmazeutischen Polypeptidzusammensetzung etwa 10 mg/ml bis etwa 30 mg/ml. Noch bevorzugter beträgt die Glycerinkonzentration in der Zusammensetzung etwa 20 mg/ml bis etwa 25 mg/ml. Noch bevorzugter beträgt die Glycerinkonzentration in der Zusammensetzung etwa 22 mg/ml. Ein weiterer bevorzugter Bereich der Glycerinkonzentration in der Zusammensetzung beträgt etwa 15 mg/ml bis etwa 18 mg/ml. Noch bevorzugter beträgt die Glycerinkonzentration in der Zusammensetzung etwa 16 mg/ml.
Der Ausdruck "Aldehyd" bezieht sich auf die Klasse der organischen Verbindungen die den CHO Rest oder eine funktionelle Gruppe aufweisen.
Der Ausdruck "reaktives Aldehyd" bezieht sich auf die Aldehyde, die a) als Verunreinigung in im Handel erhältlichen Glycerinchargen vorkommen und b) mit Aminogruppen reagieren, die in Polypeptiden in wässrigen pharmazeutischen Zusammensetzungen vorkommen, was zur Bildung von kovalenten Polypeptiddimeren und/oder -polymeren führt. Ein Beispiel für einen reaktiven Aldehyd ist Glycerinaldehyd.
Der Ausdruck "MBTH" bezieht sich auf die Chemikalie 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid mit der CAS Registriernummer [14448-67-0].
Der Ausdruck "MBTH Test" bezieht sich auf ein Verfahren zur Messung des reaktiven Aldehydgehalts in Glycerinproben mittels Glycerinaldehyd als Standard, wie dies im Detail in Verfahren 1 beschrieben ist.
Die Abkürzung "ppm" bezieht sich auf Teile pro Million auf der Grundlage der Masse. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezieht sich ppm auf Teile pro Million reaktiver Aldehyd, die in einer Glycerinprobe enthalten sind. Genauer gesagt bezieht sich ppm auf die Masse eines reaktiven Aldehyds relativ zur Masse des Glycerins. Beispielsweise bedeutet ein MBTH Testwert von 2 ppm für eine bestimmte Glycerincharge, dass sie 2 Massenteile reaktiven Aldehyds pro Million Massenteile des Glycerins enthält. Dies entspricht einer Konzentration von 2 μg/g oder 2 mg/kg im Glycerin. Falls eine Glycerinprobe mit einem weiteren Lösemittel vor der Analyse verdünnt wird, dann müssen die ppm Ergebnisse des Tests mit der Verdünnung multipliziert werden, um die Teile an reaktivem Aldehyd pro Million Teile des ursprünglichen, unverdünnten Glycerins widerzuspiegeln.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liefert wässrige pharmazeutische Polypeptidzusammensetzungen, die Glycerin enthalten, das nicht aus Tieren stammt. Man kann pharmazeutische Zusammensetzungen in der erfindungsgemäßen Ausführungsform herstellen, ohne den Aldehydgehalt des Glycerins vor der Verwendung zu messen. Jedoch wird das zur Herstellung einer Polypeptidzusammensetzung verwendete Glycerin vorzugsweise vor der Verwendung getestet und weist einen reaktiven Aldehydgehalt von weniger als 33 ppm auf. Noch bevorzugter weist das Glycerin einen reaktiven Aldehydgehalt von weniger als 24 ppm auf. Noch bevorzugter weist das Glycerin einen reaktiven Aldehydgehalt von 15 ppm oder weniger auf. Noch bevorzugter weist das Glycerin einen reaktiven Aldehydgehalt von weniger als 8 ppm auf. Am bevorzugtesten weist das in den erfindungsgemäßen Polypeptidzusammensetzungen verwendete Glycerin einen reaktiven Aldehydgehalt von 3 ppm oder weniger auf.
Wenn man entscheidet, den reaktiven Aldehydgehalt des Glycerins zu messen, das zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Polypeptidzusammensetzung verwendet wird, kann eine Vielzahl an Tests verwendet werden. Ein solcher Test ist das neue HPLC Verfahren, das hierin als Verfahren 4 beschrieben ist. Alternativ dazu kann ein dem Fachmann bekannter Aldehydtest verwendet werden. Vorzugsweise wird der reaktive Aldehydgehalt des Glycerins, das zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptidzusammensetzungen verwendet wird, mit einem Test gemessen, worin Glycerinaldehyd als Standard verwendet wird. Noch bevorzugter wird der reaktive Aldehydgehalt des Glycerins mit dem hierin beschriebenen MBTH Test gemessen.
Der Ausdruck "10x-GST" bezieht sich auf einen Glycerinstresstest, der etwa zehnmal mehr Glycerin als normal in eine lösliche Insulinpräparation einarbeitet und entworfen ist, um die Bildung von kovalenten Dimeren und Polymeren des Insulins zu beschleunigen. Dieser Test ist im Detail später als Verfahren 2 beschrieben.
Der Ausdruck "mod. 10x-GST" bezieht sich auf einen Glycerinstresstest, der etwa zehnmal mehr Glycerin als normal in eine Insulinsuspension einarbeitet und entworfen ist, um die Bildung von kovalenten Dimeren und Polymeren des Insulins zu beschleunigen. Dieser Test ist im Detail später als Verfahren 3 beschrieben.
Der Ausdruck "Polypeptid" bezieht sich auf eine Verbindung, die drei oder mehr Aminosäuren und zumindest eine freie Aminogruppe aufweist und Analoga und Derivate hiervon umfasst. Polypeptide können durch chemische Synthese und/oder durch Biosynthese mittels rekombinanter DNA Technologie hergestellt werden. Polypeptide können einen oder mehrere Aminosäurestränge umfassen, die miteinander durch kovalente Bindungen verbunden sind, wie Disulfidbindungen oder durch nicht-kovalente Wechselwirkungen. Kleine Polypeptide können auch hierin als "Peptide" bezeichnet werden. Große Polypeptide können hierin auch als "Proteine" bezeichnet werden.
Polypeptide, die in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eingearbeitet werden, können natürlich vorkommende L-Aminosäuren oder unnatürliche Aminosäuren enthalten, wie D-Aminosäuren. Die Aminosäuresequenz der Polypeptide kann identisch zu denen sein, die natürlicherweise in Tieren oder anderen Organismen vorkommen oder können Analoga sein, worin die Sequenz auf verschiedene Arten verändert ist. In Polypeptidanaloga können eine oder mehrere Aminosäuren in den N-terminalen, C-terminalen oder internen Teilen des Polypeptids angefügt, deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt sein. Analoga von Polypeptiden sind in der Technik gut bekannt.
Polypeptide, die in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eingearbeitet werden können, können auch eine Anbindung von organisch chemischen Gruppen an den Aminosäureseitenketten, an der N-terminalen Aminogruppe oder an der C-terminalen Carboxylgruppe des Polypeptids aufweisen. Solche Verbindungen sind Beispiele für Polypeptid-"Derivate". Andere Beispiele für Polypeptidderivate sind unter anderem Glycopeptide, worin natürlich vorkommende Polysaccharide an die Seitenketten der Aminosäuren Asparagin oder Threonin angehängt sind. Andere derivatisierende Gruppen, die an Polypeptide angehängt werden können, sind unter anderem Acylgruppen und Polyethylenglycol. Derivate von Polypeptiden sind in der Technik gut bekannt.
Ein Polypeptid, das in die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingearbeitet wird, kann in einer Vielzahl an Formen vorkommen, einschließlich einer pharmazeutisch annehmbaren Salzform. Ein pharmazeutisch annehmbares Salz eines Polypeptids meint ein Salz, das zwischen einer beliebigen oder mehreren der geladenen Gruppen in dem Polypeptid und einem beliebigen oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Kationen oder Anionen gebildet wird. Organische und anorganische Salze sind unter anderem Ammonium, Natrium, Kalium, Tris, Calcium, Zink oder Magnesium und die, die aus Säuren hergestellt werden, wie Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Sulfon-, Wein-, Fumar-, Glycol-, Citronen-, Malein-, Phosphor-, Bernstein-, Essig-, Salpeter-, Benzoe-, Ascorbin-, p-Toluolsulfon-, Benzolsulfon-, Naphthalinsulfon-, Propion-, Kohlensäure und dergleichen.
Die in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eingearbeiteten Polypeptide können aus Quellen isoliert werden, wie transgenen Pflanzen oder transgenen Tieren oder können durch chemische Synthesetechniken hergestellt werden, wie klassische Verfahren (Lösungsphase), Festphasenverfahren, semisynthetischen Verfahren oder anderen Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Die in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eingearbeiteten Polypeptide können auch biosynthetisch mittels rekombinanter DNA Technologie hergestellt werden. Siehe beispielsweise R.E. Chance, et al. US 5 514 646 A vom 7. Mai 1996, R.E. Chance et al. EP 0 383 472 A vom 7. Februar 1996, J. Brange et al., EP 0 214 826 A vom 18. März 1987 und R.M. Belagaje US 5 304 473 A vom 19. April 1994. Mittels rDNA Technologie können Polypeptide oder Vorläufer hiervon in einer Vielzahl an Wirtszellen biosynthetisiert werden, wie Bakterien, Säugerzellen, Insektenzellen, Hefen oder Pilzen. Bevorzugter ist die Biosynthese in Bakterien, Hefen oder Säugerzellen. Am meisten bevorzugt ist die Biosynthese in E. coli oder Hefen. Beispiele für die Biosynthese in Säugerzellen und transgenen Tieren sind in K. Hakola beschrieben [Molecular and Cellular Endocrinology, 127: 59–69 (1997)].
Spezifisch von der Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ausgeschlossene Polypeptide sind natürlich vorkommende Polypeptide, die aus Geweben, Drüsen, Organen, Blut, Urin oder jeder anderen Bulkkomponente von nicht-transgenen Tieren isoliert werden. Ein Beispiel für ein ausgeschlossenes Polypeptid ist Schweineinsulin, das aus dem Pankreas von Schweinen hergestellt wird.
Die vorliegende Erfindung dürfte sich auf alle Polypeptide anwenden lassen und umfasst unter anderem Antikörper, Cytokine, Rezeptoren, Polypeptidhormone und Fragmente hiervon. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch mehr als ein Polypeptid enthalten. Ohne die Allgemeingültigkeit des Umfangs der vorliegenden Erfindung zu beschränken werden einige spezifische Polypeptide und Polypeptidgruppen genannt, um den Leser besser zu unterweisen.
Eine bevorzugte Gruppe an Polypeptiden für die Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht aus rekombinantem Humaninsulin, rekombinantem Schweineinsulin und rekombinantem Rinderinsulin.
Eine weitere bevorzugte Polypeptidgruppe für die Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht aus monomeren Insulinanaloga. Siehe beispielsweise P. Balschmidt et al., US 5 164 366 A vom 17. November 1992, J. Brange et al., US 5 618 913 A vom 8. April 1997, R.E. Chance et al., US 5 514 646 A vom 7. Mai 1996 und J. Ertl et al., EP 0 885 961 A vom 23. Dezember 1998. Besonders bevorzugt sind die monomeren Insulinanaloga, worin der Aminosäurerest an der Position B28 Asp, Lys, Ile, Leu, Val oder Ala ist und der Aminosäurerest an der Position B29 Lys oder Pro ist. Die am meisten bevorzugten monomeren Insulinanaloga sind Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulin, Asp(B28)-Humaninsulin und Lys(B3)-Ile(B28)-Humaninsulin.
Eine weitere bevorzugte Gruppe an Polypeptiden zur Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht aus Insulinanaloga, worin der isoelektrische Punkt des Insulinanalogons zwischen etwa 7,0 und etwa 8,0 liegt. Diese Analoga werden als pl-verschobene Insulinanaloga bezeichnet. Eine am meisten bevorzugte Gruppe der pl-verschobenen Analoga besteht aus Arg(B31)-Arg(B32)-Humaninsulin und Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-Humaninsulin.
Eine weitere bevorzugte Gruppe an Polypeptiden für die Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht aus Insulinderivaten und Insulinanalogaderivaten. Eine bevorzugtere Gruppe an Polypeptiden für die Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht aus acylierten Insulinderivaten und acylierten Derivaten von Insulinanaloga. Eine bevorzugtere Gruppe von Polypeptiden besteht aus acylierten Insulinderivaten und acylierten Derivaten von Insulinanaloga, worin die Acylgruppe aus geradkettigen, gesättigten Fettsäuren besteht. Beispiele für geradkettige, gesättigte Fettsäuren umfassen die Kohlenstofflängen C4, C6, C8, C10, C12, C14, C16 und C18. Die am meisten bevorzugte Gruppe an Polypeptiden zur Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht aus Palmitoyl-ε-Lys(B29)-Humaninsulin und Myristoyl-ε-Lys(B29)-des(B30)-Humaninsulin, worin die geradkettigen Palmitoyl(C16)- und Myristoyl(C14)-Fettsäuren an die Epsilon (ε) Aminogruppe des Lys(B29) Rests angehängt sind.
Eine weitere bevorzugte Gruppe von Polypeptiden zur Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht aus Glucagon ähnlichen Peptid-1 (GLP-1), GLP-1 Analoga, Derivaten von GLP-1 und Derivaten von GLP-1 Analoga. Wie es in der Technik üblich ist, hat der Aminoterminus von GLP-1(7-37)OH die Nummer 7 bekommen und der Carboxylterminus die Nummer 37. Eine detailliertere Beschreibung von GLP-1 Analoga und Derivaten findet man in J.A. Hoffmann [WO 99/29336 vom 17. Juni 1999] und in L.B. Knudsen et al., [J. Med. Chem. 43: 1664–1669 (2000)]. Ein Beispiel für ein Derivat eines GLP-1 Analogons ist Arg(34)-N-ε-(γ-Glu(N-α-Hexadecanoyl))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH, das von J. Nielson et al beschrieben wurde [W0 00/07617 vom 17. Februar 2000]. Eine bevorzugtere Gruppe an Polypeptiden zur Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht aus nativem GLP-1(7-36)NH₂, nativem GLP-1(7-37)OH, Val(8)-GLP-1(7-37)OH, Gly(8)-GLP-1(7-37)OH und Arg(34)-N-ε-(γ-Glu(N-α-Hexadecanoyl))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH.
Eine weitere bevorzugte Gruppe an Polypeptiden zur Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht aus Exendin, Exendinanaloga, Derivaten von Exendin und Derivaten von Exendinanaloga. Exendinpolypetide und Analoga umfassen Exendin-3 und Exendin-4, wie sie von A. Young et al [WO 00/41546 A vom 20. Juli 2000] beschrieben wurden. Beispiele für Derivate von Exendin und Derivate von Exendinanaloga sind die, wie sie von Knudsen et al. beschrieben wurden [WO 99/43708 A vom 2. September 1999]. Ein bevorzugteres Polypeptid zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ist Exendin-4.
Eine weitere bevorzugte Gruppe an Polypeptiden zur Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht aus Granulocytenkolonie-stimulierendem Faktor (G-CSF), der von M.S. Goldenberg beschrieben ist [WO 00/38652 A vom 6. Juli 2000], G-CSF Analoga, G-CSF Derivaten und Derivaten von G-CSF Analoga. Die G-CSF Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können vorliegen in Form einer Lösung oder Suspension. Eine Suspensionszusammensetzung von G-CSF ist bevorzugt.
Eine weitere bevorzugte Gruppe an Polypeptiden zur Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht aus Leptin, Leptinanaloga, Derivaten von Leptin und Derivaten von Leptinanaloga. Eine bevorzugtere Gruppe an Polypeptiden besteht aus glycosilierten Leptinanaloga. Eine detailliertere Beschreibung der Sequenz von nativem Leptin und Beispiele für Leptinanaloga finden sich in J.M. Beals et al. [ EP 0 849 276 A vom 24. Juni 1998].
Eine weitere bevorzugte Gruppe an Polypeptiden zur Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht aus dem Parathyreoidhormon in voller Länge PTH(1–84), Fragmenten, wie PTH(1–38) und PTH(1–34) und Analoga und Derivaten hiervon [siehe C-M. Chang et al. WO 99/29337 A vom 17. Juni 1999]. Eine bevorzugtere Gruppe an Polypeptiden besteht aus humanem PTH(1–34) und humanem PTH(1–84).
Eine weitere bevorzugte Gruppe an Polypeptiden zur Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht aus rekombinantem Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) und rekombinanten Analoga und Derivaten hiervon. FSH ist ein heterodimeres Glycoproptein, worin die α- und β-Untereinheiten nicht-kovalent gebunden sind, wie dies in Shome et al. beschrieben ist [J. Prot. Chem. 7: 325–339 (1988)]. Eine bevorzugtere Gruppe an Polypeptiden besteht aus dem rekombinanten humanen FSH und rekombinanten Analoga von FSH, worin ein, zwei, drei oder mehr C-terminale Aminosäurereste der natürlich kodierten β-Einheit deletiert sind und Glycosylierungsderivaten hiervon.
Eine weitere bevorzugte Gruppe an Polypeptiden zur Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besteht aus rekombinantem humanem Wachstumshormon (HGH), rekombinantem Rinderwachstumshormon (BGH) und Analoga und Derivaten hiervon. Eine bevorzugtere Gruppe an Polypeptiden besteht aus rekombinantem HGH und rekombinantem BGH.
Ein bevorzugtes Polypeptid, das in die wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingearbeitet werden kann, ist FSH oder ein Analogon oder Derivat hiervon, PTH oder ein Fragment, Analogon oder Derivat hiervon, HGH oder ein Analogon hiervon, Humanleptin oder ein Analogon oder Derivat hiervon, GLP-1 oder ein Analogon oder Derivat hiervon, Humaninsulin oder ein Analogon oder Derivat hiervon, oder ein Derivat eines Humaninsulinanalogons.
Es kann mehr als ein Polypeptid in die wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingearbeitet werden. Beispiele für solche Kombinationen sind unter anderem Gemische aus Amylin oder einem Amylinagonistpeptid und einem Insulin, wie dies von G.J.S. Cooper [ US 5 124 314 A vom 23. Juni 1992] und J. L'Italien et al. beschrieben wurde [ US 6 136 784 A vom 24. Oktober 2000].
Die Polypeptide in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind biologisch aktiv. Diese Aktivität kann in vitro oder in vivo gezeigt werden und resultiert aus der Wechselwirkung des Polypeptids mit Rezeptoren und/oder anderen intrazellulären oder extrazellulären Stellen, die zu einer biologischen Wirkung führen.
Der Ausdruck "wässrig" beschreibt ein flüssiges Lösemittel, das Wasser enthält. Wässrige Lösemittelsysteme können nur aus Wasser bestehen oder können aus Wasser plus ein oder mehreren mischbaren Lösemitteln bestehen und können gelöste Solute enthalten, wie Zucker oder andere Hilfsstoffe.
Der Ausdruck "wässrige, parenterale pharmazeutische Zusammensetzung", der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, meint eine pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung, worin der Wassergehalt 500 mg/ml oder größer ist.
Der Ausdruck "Pharmazeutikum" umfasst eine medizinische Substanz oder Präparation, die zur Behandlung einer Erkrankung verwendet wird. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten Polypeptide mit biologischer Aktivität. Die Zusammensetzungen werden in einer Weise hergestellt, die für ihre pharmazeutische Verwendung geeignet und konsistent ist.
Der Ausdruck "parenteral" meint eine Abgabe oder Verabreichung eines Arzneimittels an einen bedürftigen Patienten auf andere Weise, als über den Darm. Bevorzugte Arten der parenteralen Verabreichung der Polypeptidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind subkutan, intramuskulär, intravenös, bukkal, nasal, pulmonal, intraokular und transdermal.
Der Ausdruck "chemische Stabilität" bezieht sich auf die relative Geschwindigkeit der Bildung von kovalent gebundenen Polypeptiddimeren und Polymeren, die durch reaktive Aldehyde in einer Polypeptidzusammensetzung ausgelöst werden. Eine "stabile" Formulierung ist eine, worin die Geschwindigkeit der Bildung von kovalenten Polypeptiddimeren und -polymeren akzeptabel kontrolliert wird und über die Zeit nicht unannehmbar zunimmt. Der Ausdruck "verbessert" meint in Bezug auf die chemische Stabilität einer bestimmten Zusammensetzung, dass die Menge an hinzugekommenen hochmolekularen Polypeptiddimeren und -polymeren nach einer Zeitspanne kleiner ist als die Menge in einer vergleichbar hergestellten und behandelten Zusammensetzung. Die chemische Stabilität kann durch Verfahren untersucht werden, die in der Technik gut bekannt sind. Beispiele zum Messen der chemischen Stabilität durch HPLC Größenausschlusschromatographie sind im 10x-GST und im modifizierten 10x-GST Verfahren hierin beschrieben.
Früh in der Entwicklung einer Polypeptidformulierung zur pharmazeutischen Verwendung werden Versuche ausgeführt, um zu bestimmen, welche Hilfsstoffe in die Formulierung einbezogen werden sollen. Die Formulierungen werden gewöhnlich entworfen, um die geringste Anzahl und Menge an erforderlichen Hilfsstoffen zu enthalten, um ein wirksames Produkt bereitzustellen, das die Sicherheits- und Stabilitätsanforderungen für den Patienten und die Zulassungsbehörden erfüllt. Stabilitätsanforderungen umfassen physikalische Stabilität und chemische Stabilität.
In Formulierungen, die Glycerin verwenden, muss die von reaktiven Aldehyden hervorgerufene kovalente Quervernetzung von Polypeptiden während der normalen Lagerung des hergestellten Produkts minimiert werden. Als Beispiel für Insulinlösungen muss die Menge an hochmolekularem Protein während der Produktlebenszeit im Kühlschrank unter 1,5 % bleiben [USP 2000, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD, USA (1999)]. Die Hersteller bemühen sich stetig diese Definition der Haltbarkeitsspezifikation zu erfüllen, um den Patienten die Sicherheit des Produkts zu garantieren.
Für Glycerin-enthaltende Polypeptidzusammensetzungen ist die durch reaktive Aldehyde hervorgerufene kovalente Polymerisationsreaktion ein Sorgenbereich. Es wäre nicht umsichtig, einfach jede Charge von im Handel erhältlichem Glycerin in die Polypeptidformulierungen für die Verwendung am Menschen ohne einer richtigen Reaktivitätstestung einzuarbeiten. Tatsächlich könnte jede Glycerincharge, die von einer im Handel erhältlichen Quelle stammt, auf eine Weise evaluiert werden, um sicherzustellen, dass Polypeptidprodukte, die hiermit formuliert werden, die Stabilitätsspezifikationen erfüllen.
Eine Möglichkeit, die Eignung von Glycerin zu testen, ist die Herstellung von kleinen Ansätzen des tatsächlichen pharmazeutischen Produkts und die anschließende Evaluierung der Polymerbildung, im allgemeinen gemäß HPLC, während der normalen Haltbarkeitszeit und unter normalen Lagerbedingungen. Eine Vielzahl von Trenn- und Detektionstechniken zur Analyse der Polypeptide in Stabilitätsuntersuchungen ist beschrieben von W.J.M. Underberg et al [J. Chromatography B 742: 401–409 (2000)]. Dieser Testansatz ist jedoch unpraktisch, da er zu lange dauert und übermäßig analytische Ressourcen benötigt.
Ein besserer Weg zur Untersuchung der Eignung von im Handel erhältlichen Glycerinchargen ist die Beschleunigung der Geschwindigkeit an kovalenter Polypeptidpolymerbildung. Diese Reaktionen können durch Erhöhung der Lagertemperatur [J. Brange, Galenics of Insulin, Springer Verlag (1987)] durch Erhöhung der Glycerinmenge über die normale Menge oder beides beschleunigt werden. Zwei Beispiele für beschleunigte "Stresstests" sind der 10x-GST Test und der modifizierte 10x-GST Test, die später als Verfahren 2 und 3 beschrieben sind.
In typischen U100 Insulinprodukten kommt Insulin in einer Konzentration von 3,5 mg/ml oder etwa 600 nmol/ml vor. Die Glycerinmenge, die in normalen Insulinformulierungen gefunden wird, beträgt 16 mg/ml oder etwa 174000 nmol/ml. Falls die Menge des reaktiven Aldehyds in einer Glycerincharge beispielsweise 10 ppm beträgt, dann beträgt die Konzentration des reaktiven Aldehyds in normalen Insulinformulierungen nur etwa 1,74 nmol/ml oder 345 fach weniger als das Insulin. Die Erhöhung dieser Glycerinmenge um das Zehnfache liefert eine Zusammensetzung, worin die reaktiven Aldehyde immer noch 34 fach weniger vorhanden sind als Insulin auf einer molaren Basis, sie wird aber die Reaktionsgeschwindigkeit zwischen den reaktiven Aldehyden und den Insulinmolekülen erhöhen. Für die in Verfahren 2 und Verfahren 3 beschriebenen beschleunigten Tests werden sowohl erhöhte Temperatur (30°C) und erhöhte Glycerinmengen (zehnfach) verwendet.
Unter gut kontrollierten Bedingungen sagen die beschleunigten Stabilitätstests die relative Stabilität der hergestellten Polypeptidformulierungen verlässlich voraus. Dies kommt daher, da alle Bestandteile, die in der schließlichen Formulierung verwendet werden, in den Testlösungen enthalten sind.
Aus den Ergebnissen der beschleunigten Stabilitätstests werden die relativen Raten der kovalenten Polymerbildung mit den Raten der Bildung unter normalen Lagerbedingungen korreliert. Diese Korrelation basiert auf analytischen Betrachtungen, beispielsweise mittels der Arrheniusgleichung für einen Temperaturbereich, durch Verwendung quantitativer Berechnungen auf der Grundlage des vorgeschlagenen Reaktionsmechanismus jedes Moleküls an reaktivem Aldehyd mit bis zu zwei Molekülen Polypeptid und/oder durch Vergleich der relativen Polymerbildungsraten in den Formulierungen. Verfahren zur Etablierung eines Spezifikationslimits für die Stabilität von Polypeptidzusammensetzungen sind dem Fachmann gut bekannt. Aus diesen Betrachtungen kann ein maximales Maß an Polymerbildung in einem beschleunigten Test, beispielsweise 1 % pro Woche bei 30°C, als Spezifikationslimit etabliert werden, das erreicht werden muss, um ein hohes Maß an Sicherheit bereitzustellen, dass unter normalen Lagerbedingungen eine befriedigende Stabilität erreicht wird.
Trotz der erhaltenen verlässlichen Ergebnisse bestehen viele Nachteile bei den beschleunigten Verfahren der Formulierungschargenevaluierung. Zuerst benötigt die Herstellung von mehreren Proben der pharmazeutischen Zusammensetzungen viel Zeit, insbesondere falls sie in einer Weise hergestellt werden müssen, die zu dem Verfahren identisch ist, das zur Herstellung der industriell gefertigten Zusammensetzungen verwendet wird. Da die Reaktionsgeschwindigkeiten der reaktiven Aldehyde mit jedem Polypeptid in jeder unterschiedlichen Formulierung nicht vorhersagbar sind, muss jede Polypeptidformulierung unabhängig getestet werden. Zweitens verschwendet die Herstellung von mehrfachen Proben der Polypeptidzusammensetzungen wertvolles Material und ist besonders verschwenderisch beim therapeutischen Polypeptid selbst. Drittens kann, obwohl die Quervernetzungsreaktionen beschleunigt werden können, die Zeit, die zur Herstellung von ausreichend quervernetzender Verunreinigung erforderlich ist, um eine verlässliche Quantifizierung zu erlauben, eine Woche oder länger sein. Viertens sind die Testbedingungen zur Bestimmung des Ausmaßes an quervernetzten Produkten in den Polypeptidzusammensetzungen komplex, zeitaufwendig und teuer. Die Testverfahren umfassen typischerweise eine Analyse durch HPLC, die spezialisierte Säulen, spezielles Training der Operatoren und eine beträchtliche Zeitdauer für die Durchführung der Tests, dem Sammeln der Daten und der Interpretation der Ergebnisse erfordern.
Eine direkte Analyse jeder Glycerincharge umgeht die Nachteile der beschleunigten Stabilitätstests.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Identität und der Menge an reaktiven Aldehyden in Glycerin. Insbesondere wurde ein neues HPLC Verfahren (Verfahren 4) entwickelt, um zu bestimmen, welche Aldehyde in im Handel erhältlichen Glycerinchargen vorkommen und ihre relativen Konzentrationen. Die Ergebnisse zeigen, dass für alle getesteten Glycerinquellen Glycerinaldehyd die Hauptaldehydverunreinigung ist, wobei viel geringere Mengen an Formaldehyd und sogar noch geringere Mengen an Glycolaldehyd vorkommen. Formaldehydmengen sind in Glycerin, das von Pflanzen stammt, etwas höher, als in Glycerin, das von Tieren und Propylen stammt.
Als Screeningtest für Glycerinchargen hat dieses Verfahren jedoch die oben beschriebenen Nachteile, die mit einer HPLC Analyse verbunden sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen kolorimetrischen Tests mittels Glycerinaldehyd als Standard, der einfach und verlässlich den reaktiven Aldehydgehalt von im Handel erhältlichen Glycerinchargen quantifiziert. Dieser Test ist der MBTH Test, der im Detail als Verfahren 1 später beschrieben wird. Wie in Beispiel 1 gezeigt, liefert dieser Test eine sehr hohe molare Absorption bei einer Reaktion mit Glycerinaldehyd, den der HPLC Test (Verfahren 4) als den vorwiegenden Aldehyd in im Handel erhältlichen Glycerinchargen identifiziert.
Am brauchbarsten ist, dass der MBTH Test eine ausgezeichnete lineare Korrelation zwischen dem Gehalt an reaktiven Aldehyden des Glycerins und der erhöhten Menge an kovalenten Dimeren und Polymeren zeigt, die in einem beschleunigten Stabilitätstest gemessen werden, nämlich dem modifizierten 10x-GST Test (siehe Beispiel 2 und 1). Es werden gute Korrelationsfaktoren mit den Glycerinchargen erhalten, die aus Tieren, Pflanzen und Propylen stammen. Es wurde eine einfache direkte Analyse der Glycerinchargen mittels des MBTH Tests entwickelt, um die uneffizienten Beschleunigungstests zu ersetzen, die Polypeptidformulierungen, ausgedehnte Inkubationszeiten und komplexe HPLC Systeme verwenden.
Um eine Spezifikationsgrenze für den durch den MBTH Test bestimmten reaktiven Aldehydgehalt zu erhalten, muss man nur die Korrelationslinie verwenden, wie sie beispielsweise in 1 gezeigt ist, um den reaktiven Aldehydgehalt im MBTH Test zu finden, der sich an der Linie mit dem Spezifikationslimit schneidet, das durch den beschleunigten Stabilitätstest bestimmt wurde. Beispielsweise führt in 1 ein Spezifikationslimit von 1 % Polymerzunahme, das durch den modifizierten 10x-GST Test bestimmt wurde, zu einer Spezifikationsgrenze von 14 ppm für den MBTH Test. Die Spezifikationsgrenze ist die größte Menge an reaktivem Aldehyd (wie dies beispielsweise durch den MBTH Test gemessen wird), die in Glycerinchargen erlaubt ist, welche zur Herstellung der industriell gefertigten Polypeptidzusammensetzungen verwendet werden. Falls geringere Mengen an quervernetzten Polypeptiden oder eine größere Sicherheit gewünscht wird, dass die Zusammensetzungen den erforderlichen Haltbarkeitstest passieren, dann müssen niedrigere Spezifikationsgrenzen etabliert werden.
Auf der Grundlage dieser Betrachtungen ist das maximale allgemeine Spezifikationslimit für den reaktiven Aldehydgehalt in Glycerin, das nicht aus Tieren stammt, zur Verwendung bei der Herstellung von wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Polypeptidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bei einem Test 33 ppm. Ein bevorzugteres Spezifikationslimit für Glycerin, das nicht aus Tieren stammt, ist 24 ppm. Ein bevorzugteres Spezifikationslimit ist 15 ppm. Ein noch bevorzugteres Spezifikationslimit ist 8 ppm. Das am meisten bevorzugte Spezifikationslimit ist 3 ppm. Vorzugsweise verwendet der Test Glycerinaldehyd als Standard, falls der reaktive Aldehydgehalt des Glycerins vor der Verwendung zur Herstellung einer Zusammensetzung gemessen wird. Noch bevorzugter ist der verwendete Test der hierin beschriebene MBTH Test, falls der reaktive Aldehydgehalt des Glycerins vor der Verwendung zur Herstellung einer Zusammensetzung gemessen wird.
Es wird der MBTH Test verwendet, um frische und gealterte im Handel erhältliche Glycerinchargen von mehreren Herstellern zu evaluieren. Sehr überraschend wurde festgestellt, dass von Tieren stammendes Glycerin einen höheren Bereich an reaktivem Aldehydgehalt aufweist (10 – 1069 ppm, n = 19), als Glycerin; das von Pflanzen (4–153 ppm, n = 29) oder von Propylen stammt (0 – 169 ppm, n = 41). Der mittlere reaktive Aldehydgehalt von Glycerinchargen, die von Tieren stammen, ist auch höher als von Glycerinchargen, die von nicht-tierischen Quellen stammen.
Der hierin beschriebene MBTH Test wird zu Evaluierung von im Handel erhältlichen Glycerinchargen verwendet, deren Herstelldatum bekannt ist und von 1–48 Monaten bis zum Test reicht. Diese Tests, die in Beispiel 3 beschrieben sind, zeigen deutlich, dass bei vergleichbarem Alter die Glycerinchargen, die von Pflanzen oder Propylen stammen, im Mittel viel geringere Mengen an reaktiven Aldehyden aufweisen, als Glycerinchargen, die aus Tieren hergestellt wurden. Aufgrund der inhärenten Ungewissheiten in den Herstellverfahren und der Lagerzeit und Lagerbedingungen, die von Glycerinherstellern, -händlern und -transporteuren verwendet werden, zeigen diese Daten einen klaren Vorteil für die Auswahl von nicht von Tieren stammenden Quellen für Glycerin zur Herstellung von Polypeptidzusammensetzungen für eine parenterale Verwendung. Da die reaktiven Aldehydmengen mit dem Alter auch für Glycerine steigen, die nicht von Tieren stammen (siehe Tabelle 2), ist es auch vorteilhaft, die frischesten verfügbaren im Handel erhältlichen Glycerinchargen zur Verwendung zur Herstellung der Polypeptidzusammensetzungen auszuwählen.
Bei der Betrachtung von verschiedenen im Handel erhältlichen Glycerinquellen zur Herstellung von Polypeptidzusammensetzungen ist Glycerin klar bevorzugt, das nicht aus Tieren stammt. Noch bevorzugter sind im Handel erhältliche Glycerinchargen, die von Propylen oder Pflanzen stammen. Die Verwendung von nicht von Tieren stammendem Glycerin anstelle von Glycerin, das von Tieren stammt, in wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Polypeptidzusammensetzungen führt im allgemeinen zu einer verbesserten chemischen Stabilität aufgrund eines geringeren reaktiven Aldehydgehalts im Glycerin. Die Korrelation der verbesserten chemischen Stabilität mit dem geringeren reaktiven Aldehydgehalt im Glycerin ist für Zusammensetzungen eines Leptinanalogons, Humaninsulins und Insulinanaloga in den hierin beschriebenen Beispielen 4–8 erläutert.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von nicht aus Tieren stammendem Glycerin als Glycerinkomponente in einer wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Polypeptid und Glycerin enthält, um die chemische Stabilität der Zusammensetzung zu verbessern. Eine bevorzugtere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von Glycerin, das aus einer Propylen- oder Pflanzenquelle stammt als Glycerinkomponente in einer wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Polypeptid und Glycerin enthält, um die chemische Stabilität der Zusammensetzung zu verbessern. Eine am meisten bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung von Glycerin, das aus Propylen stammt, als Glycerinkomponente in einer wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Polypeptid und Glycerin enthält, um die chemische Stabilität der Zusammensetzung zu verbessern. Die Beispiele 9–26 und 28–34 beschreiben die Herstellung von Polypeptidzusammensetzungen, die Glycerin einarbeiten, das von nichttierischen Quellen stammt.
Die verbesserte chemische Stabilität einer erfindungsgemäßen Polypeptidzusammensetzung meint, dass der Gehalt an zugenommenen hochmolekularen Polypeptiddimeren und -polymeren nach einer bestimmten Zeitspanne geringer ist , als der Gehalt in einer ähnlich behandelten Vergleichszusammensetzung. Die Bildung von kovalenten Dimeren und Polymeren kann in Tests quantifiziert werden, die unter einer Vielzahl an Bedingungen, Zeiten und Temperaturen ausgeführt werden. Die Beispiele 4 bis 8 der vorliegenden Beschreibung liefern Ergebnisse von Tests, worin geringere Mengen an zugenommenen hochmolekularen Dimeren und Polymeren in den erfindungsgemäßen Polypeptidzusammensetzungen nach bestimmten Zeitspannen und Temperaturen evident sind. Vorzugsweise führt die verbesserte chemische Stabilität der erfindungsgemäßen Polypeptidzusammensetzungen zu einem Gehalt an zugenommenen hochmolekularen Dimeren und Polymeren, der zumindest 3 % geringer ist, als der Gehalt in vorher bekannten vergleichbaren Zusammensetzungen. Noch bevorzugter ist der Gehalt an zugenommener Dimer- und Polymerbildung zumindest 10 % geringer. Noch bevorzugter ist der Gehalt an zugenommener Dimer- und Polymerbildung zumindest 30 % geringer. Am bevorzugtesten ist der Gehalt an zugenommenen hochmolekularen Dimeren und Polymeren in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zumindest 60 % geringer als der Gehalt in vorher bekannten vergleichbaren Zusammensetzungen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine wässrige, parenterale Zusammensetzung, die ein Polypeptid und Glycerin enthält, worin das Glycerin von einer nicht-tierischen Quelle stammt. Eine noch bevorzugtere Ausführungsform ist eine Polypeptidzusammensetzung, die Glycerin enthält, worin das Glycerin von Pflanzen oder Propylen stammt. Die am meisten bevorzugte Ausführungsform ist eine Polypeptidzusammensetzung, die Glycerin enthält, worin das Glycerin von Propylen stammt.
Wie es aus den Daten in Tabelle 2 ersichtlich ist, garantiert die Auswahl einer im Handel erhältlichen Glycerincharge, die von nicht-tierischen Quellen stammt, nicht, dass ein extrem niedriger Aldehydgehalt erhalten wird, beispielsweise 3 ppm oder weniger. Für jede pharmazeutische Polypeptidzusammensetzung, die hergestellt wird, können die bezogenen Glycerinchargen sowohl von tierischen als auch nicht-tierischen Quellen einen Gehalt an reaktivem Aldehyd aufweisen, der nicht niedrig genug ist, um das gewünschte Spezifikationslimit zu erreichen.
[große Volumina an Glycerin mit geringeren Gehalten an reaktivem Aldehyd schnell und effizient erhalten werden.
Alternativ dazu kann der Kontakt in einem Batchverfahren bewirkt werden, worin das feste Trocknungsmittel und das Polymerharz zum Glycerin unter Bildung einer Suspension zugegeben werden. Im Batchverfahren umfassen die bevorzugten nachfolgenden Schritte das Erhitzen der Suspension zwischen etwa 40°C und etwa 100°C, das Rühren der erhitzten Suspension für etwa 1 Minute bis etwa 100 Stunden, die Passage der Suspension durch ein Filter, das das feste Trocknungsmittel und das Polymerharz zurückhält und die anschließende Gewinnung des durch den Filter gegangenen Glycerins. Glycerin, das durch das Batchverfahren gegangen ist, hat einen verringerten Gehalt an reaktivem Aldehyd. Dieses Batchverfahren kann auch verwendet werden, um den Gehalt an reaktivem Aldehyd sehr schnell und effizient von sehr großen Glycerinvolumina zu verringern.
Es funktionieren viele Techniken zur Abtrennung des Polymers und Trocknungsmittels aus dem gereinigten Glycerin. Die Phasentrenntechniken, die für diesen Aspekt der Erfindung verwendet werden können, umfassen Zentrifugation und Filtration. Filtration ist ein bevorzugtes Verfahren. Eine Vielzahl von Filtrationsausrüstungen und -verfahren ist für die Phasentrennung geeignet, einschließlich Filter, die aus Cellulose oder Fiberglas bestehen. Ein Fiberglasfilter ist bevorzugt. Ein bevorzugteres Filter ist eine Corning 5 μm Fiberglasmembran, Teilenummer 25981-PF (Corning Inc., Corning, NY, USA).
Im Batchverfahren ist es nicht notwendig, aber bevorzugt, dass eine nicht-oxidierende Umgebung um das zu reinigende Glycerin so weit wie möglich aufrechterhalten wird, speziell während der Erhitzungs- und Rührschritte. Diese nicht-oxidierende Umgebung kann durch Bereitstellung einer inerten Atmosphäre über dem Glycerin, beispielsweise durch die Verwendung einer Schützhülle oder der Spülung des Glycerins mit Argon oder Stickstoff, oder durch Bereitstellung einer reduzierten Atmosphäre oder teilweisem Vakuum erhalten werden.]
Daher kann nach der Auswahl einer im Handel erhältlichen Glycerincharge, die von nichttierischen Quellen stammt, vorzugsweise frisch hergestelltes Glycerin, das von Pflanzen oder Propylen und bevorzugter von Propylen stammt, der reaktive Aldehydgehalt durch einen geeigneten Test gemessen werden. Falls der reaktive Aldehydgehalt unter dem Spezifikationslimit liegt, das für eine bestimmte pharmazeutische Polypeptidzusammensetzung festgelegt wurde, kann das Glycerin direkt in die Zusammensetzung mit der Versicherung eingearbeitet werden, dass das gewünschte Maß an chemischer Stabilität erreicht wird.
Die wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können Glycerin enthalten, das von nicht-tierischen Quellen stammt, um deren chemische Stabilität zu verbessern. Die Beispiele 5–7 der vorliegenden Beschreibung zeigen deutlich die verbesserte chemische Stabilität für Lösungs- und Suspensionszusammensetzungen der pharmazeutischen Polypeptide, die. Glycerin enthalten, das von nicht-tierischen Quellen stammt, im Vergleich zu ähnlichen Polypeptidzusammensetzungen, die Glycerin enthalten, das von Tieren stammt.
Die wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können Glycerin enthalten, das von nicht-tierischen Quellen stammt. Falls der reaktive Aldehydgehalt des Glycerins gemessen wird, soll das Glycerin vorzugsweise einen Gehalt an reaktivem Aldehyd von weniger als 33 ppm aufweisen, um die chemische Stabilität der Polypeptidzusammensetzungen weiter zu verbessern. Die Beispiele 4 und 8 der vorliegenden Beschreibung zeigen eine deutlich verbesserte chemische Stabilität für Lösungs- und Suspensionszusammensetzungen pharmazeutischer Polypeptide, die Glycerin aus nicht-tierischen Quellen mit einem Gehalt an reaktivem Aldehyd von weniger als 33 ppm enthalten im Vergleich zu ähnlichen Polypeptidzusammensetzungen, die ein nicht von Tieren stammendes Glycerin mit einem Gehalt an reaktivem Aldehyd von mehr als 33 ppm aufweisen.
Um die chemische Stabilität zu verbessern, können die wässrigen, parenteralen pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung alternativ Glycerin enthalten, das aus einer beliebigen Quelle stammt, einschließlich Glycerin, das von Propylen oder Pflanzen stammt, und einen reaktiven Aldehydgehalt von weniger als 8 ppm aufweist. Die Beispiele 4, 5 und 8 der vorliegenden Beschreibung zeigen deutlich die verbesserte chemische Stabilität für Lösungs- und Suspensionszusammensetzungen pharmazeutischer Polypeptide, die Glycerin mit einem reaktiven Aldehydgehalt von weniger als 8 ppm aufweisen im Vergleich zu ähnlichen Polypeptidzusammensetzungen, die Glycerin mit einem reaktiven Aldehydgehalt von 8 ppm oder mehr aufweisen.
Die vorliegende Erfindung dürfte sich auf jede wässrige Polypeptidzusammensetzung anwenden lassen, die Glycerin enthält. Solche Polypeptidzusammensetzungen enthalten oft andere Komponenten und Hilfsstoffe und werden auf eine Weise hergestellt, die normalerweise zur Herstellung solcher Zusammensetzungen verwendet wird. Ohne die Allgemeingültigkeit der vorliegenden Erfindung zu beschränken, werden die folgenden Zusammensetzungen, Hilfsstoffe und Verfahren zu deren Herstellung beschrieben, um den Leser besser zu unterweisen.
Die vorliegende Erfindung liefert Zusammensetzungen, die Wasser, ein Polypeptid und ein nicht von Tieren stammendes Glycerin oder Glycerin aus jeder Quelle enthalten, das einen Gehalt an reaktiven Aldehyden von weniger als 8 ppm aufweist. Genauer gesagt liefert die Erfindung Zusammensetzungen, die zumindest ein Polypeptid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon enthalten. Der Bereich an Polypeptidkonzentrationen, die in der Erfindung verwendet werden können, reicht in Abhängigkeit des Verabreichungswegs von etwa 1,0 μg/ml bis etwa 100 mg/ml, obwohl geringere und höhere Konzentrationen funktionsfähig sind. Die Polypeptidkonzentrationen betragen vorzugsweise etwa 5,0 μg/ml bis etwa 20 mg/ml und am bevorzugtesten etwa 20 μg/ml bis etwa 10 mg/ml. Auf der Grundlage der erforderlichen Dosis, der Stärke des Polypeptids und der Stabilität des Polypeptids in der Formulierung kennt der Fachmann die richtigen Polypeptidkonzentrationen, die in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
Andere Hilfsstoffe, wie Isotonizitätsmittel zusätzlich zu Glycerin, Konservierungsstoffe, Protamin, Puffer, Löslichkeitsvermittler, Detergenzien, Antioxidationsmittel, Lösungsstabilisatoren und Metallkationen können in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen gemäß den Formulierungen verwendet werden die herkömmlich für Polypeptide verwendet werden. Es sind noch andere Hilfsstoffe zur Verwendung in den Polypeptidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung erhältlich.
Der Wassergehalt der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen beträgt 500 mg/ml oder mehr. Die Glycerinkonzentration der erfindungsgemäßen Polypeptidzusammensetzungen beträgt weniger als 500 mg/ml.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können durch eine Vielzahl an Verfahren hergestellt werden, die in der Technik bekannt sind. Die vorliegende Erfindung erfordert keine vorgeschriebene Reihenfolge der Zugabe der Komponenten in die Zusammensetzung, um zu funktionieren. Auf der Grundlage der Art des Peptids, der therapeutischen Anwendung und der gewünschten Formulierung, kennt der Fachmann die richtigen Verfahren und die Reihenfolge der Zugabe zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Glycerin, das aus Pflanzen oder Propylen stammt, falls ausreichend frisch, direkt mit großer Zuversicht zur Verbesserung der chemischen Stabilität von Polypeptidzusammensetzungen im Vergleich zu der bekannten Verwendung von Glycerin, das von Tieren stammt, in derselben Zusammensetzung verwendet werden. Jedoch wird die volle Breite der vorliegenden Erfindung realisiert, falls der Gehalt an reaktivem Aldehyd des in einer Polypeptidzusammensetzung zu verwendenden Glycerins zuerst gemessen wird. Vorzugsweise wird der Gehalt an reaktivem Aldehyd des Glycerins innerhalb von zwei Wochen vor der Einarbeitung in die Polypeptidzusammensetzung bestimmt. Noch bevorzugter wird der reaktive Aldehydgehalt des Glycerins innerhalb drei Tagen vor dessen Einarbeitung in eine Zusammensetzung gemessen. Vorzugsweise beträgt der Gehalt an reaktivem Aldehyd des nicht von Tieren stammenden Glycerins weniger als 33 ppm, falls dies vor der Verwendung zur Herstellung einer Polypeptidzusammensetzung gemessen wird. Noch bevorzugter hat das Glycerin einen reaktiven Aldehydgehalt von weniger als 24 ppm. Noch bevorzugter hat das Glycerin einen reaktiven Aldehydgehalt von weniger als 15 ppm. Noch bevorzugter hat das Glycerin einen reaktiven Aldehydgehalt von weniger als 8 ppm. Am bevorzugtesten hat das Glycerin einen reaktiven Aldehydgehalt von 3 ppm oder weniger. Vorzugsweise verwendet der Test zum Messen des reaktiven Aldehydgehalts des Glycerins Glycerinaldehyd als Standard. Noch bevorzugter ist der zum Messen des reaktiven Aldehydgehalts des Glycerins verwendete Test der hierin beschriebene MBTH Test.
Daher liefert die Erfindung in einem Aspekt parenterale, pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Polypeptid und Glycerin enthalten, worin das Glycerin von jeder Quelle stammt, einschließlich Glycerin, das von Propylen oder Pflanzen stammt, worin das Glycerin einen reaktiven Aldehydgehalt von weniger als 8 ppm aufweist. Vorzugsweise beträgt der reaktive Aldehydgehalt des Glycerins 3 ppm oder weniger. Vorzugsweise verwendet der Test zum Messen des reaktiven Aldehydgehalts des Glycerins Glycerinaldehyd als Standard. Noch bevorzugter ist der zum Messen des reaktiven Aldehydgehalts des Glycerins verwendete Test der hierin beschriebene MBTH Test.
Die wässrigen, pharmazeutischen Polypeptidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden als Arzneimittel oder zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen in Säugern verwendet. Genauer gesagt wenn Insulin oder ein Analogon oder Derivat von Insulin oder GLP-1 oder ein Analogon oder Derivat von GLP-1 das Polypeptid ist, kann das Arzneimittel zur Behandlung von Diabetes oder Hyperglykämie verwendet werden.
Die beanspruchten Polypeptidzusammensetzungen können Patienten als klare Lösungen, Suspensionsgemische oder als Zweifachgläschenpackungen zugänglich gemacht werden, die ein Gläschen mit einem lyophilisierten oder trockenen Polypeptid umfassen, das mit einem Verdünnungsmittel vom zweiten Gläschen rekonstituiert wird. Bevorzugte Polypeptidzusammensetzungen sind klare Lösungen und Suspensionsgemische.
Die beanspruchten Zusammensetzungen können einem behandlungsbedürftigen Patienten durch eine Vielzahl an parenteralen Verabreichungsverfahren verabreicht werden, die der Facharzt kennt. Bevorzugte Verfahren sind unter anderem subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion, intravenöse Injektion oder Infusion, pulmonale Verabreichung, bukkale, nasale, intraokulare oder transdermale Verabreichung und Verabreichung durch interne oder externe Pumpen. Bevorzugtere Verabreichungsarten sind subkutane und intramuskuläre Injektionen.
Während der Lagerung sind die beanspruchten Zusammensetzungen überraschenderweise chemisch stabiler als bisher bekannte Zusammensetzungen.
Verfahren 1
MBTH Test
"MBTH Lösung wird durch Lösen von etwa 250 mg eines festen Gemisches aus etwa 20–25 Gewichtsprozent an 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid (MBTH) und etwa 75–80 Gewichtsprozent Natriumchlorid in 100 ml Gesamtvolumen Wasser hergestellt.
"Eisen-(III)-chloridlösung" wird hergestellt, indem man etwa 5,4 g einer Lösung nimmt, die etwa 20–35 Gewichtsprozent Eisen-(III)-chlorid (FeCl₃) und etwa 5 Gewichtsprozent Chlorwasserstoffsäure in Propylenglycol und etwa 1,5 g Sulfaminsäure zugibt. Dieses Gemisch wird dann mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml verdünnt.
Etwa 50 mg bis etwa 400 mg Proben an zu testenden Glycerinchargen werden genau in ein 15 ml Teströhrchen eingewogen. Es wird 1,0 ml Wasser zugegeben. Dann werden 4,0 ml MBTH Lösung zugegeben und die Präparation wird sorgfältig gemischt. Die Lösung wird dann in einem siedenden Wasserbad für 60 ± 5 Sekunden erhitzt. Nach 5 Minuten Abkühlung bei Umgebungstemperatur werden 5,0 ml Eisen-(III)-chloridlösung zugegeben und sorgfältig gemischt.
Nach etwa 30 oder mehr Minuten Abkühlung bei Umgebungstemperatur wird die Absorption der Lösung bei 624 nm auf einem Spektrophotometer gemessen.
Es wird wie oben eine Nulltestlösung hergestellt, außer dass das Glycerin weggelassen wird. Man erhält eine Standardkurve, indem man eine 100 μg/ml Lösung Glycerinaldehyd mit zusätzlich Wasser unter Bildung von Glycerinaldehydstandards von etwa 0,5 μg/ml bis etwa 10 μg/ml verdünnt. Die Standardlösungen werden dann mit den Testreagenzien behandelt.
Nach der Subtraktion der Absorption der Nullprobe von den Absorptionswerten der Standard- und Testlösungen wird die Menge an reaktivem Aldehyd in der Glycerinprobe aus der Glycerinaldehydstandardkurve quantifiziert. Für Glycerinproben, in denen der Gehalt an reaktivem Aldehyd unter dem 0,5 μg/ml Glycerinaldehydstandard liegt, wird der Gehalt an reaktivem Aldehyd durch die Extrapolation der am besten passenden Kurve bestimmt, die mit den Glycerinaldehydstandards erhalten wurde. Die Proben werden im allgemeinen dreifach bestimmt. Das gesamte in diesem Test verwendete Wasser ist vorzugsweise Aldehyd-frei.
Verfahren 2
10x Glycerinstresstest (10x-GST)
Der 10x Glycerinstresstest (10x-GST) misst die Bildung von kovalenten Dimeren und Polymeren in einer Insulinzusammensetzung. Das zu testende Glycerin wird zu Humulin^® R (U40, Eli Lilly & Co., Indianapolis IN, USA) bis zu einer Endkonzentration von 160 mg/ml Glycerin gegeben, das heisst dem Zehnfachen der Menge an Glycerin die normalerweise in dieser Formulierung verwendet wird. Ein Aliquot dieser entstehenden Formulierung wird bei 30°C für 7 Tage inkubiert, während ein zweites Aliquot im selben Zeitraum gefroren gelagert wird. Dann wird die Menge an Protein mit hohem Molekulargewicht (HMWP) der zwei Aliquots durch HPLC Größenausschlusschromatographie unter denaturierenden Bedingungen gemessen (beispielsweise Zorbax GF 250 Special Säule, mobile Phase 65 Teile 0,1 M Am moniumphosphatpuffer bei pH 7,5 und 35 Teile Acetonitril, Detektion bei 214 nm). Die Zunahme an HMWP in der Testformulierung ist die Konzentration an HMWP in der 30°C Probe minus der Konzentration an HMWP in der gefrorenen Kontrolle.
Verfahren 3
Modifizierter 10x Glycerinstresstest (Mod. 10x-GST)
Ein Milliliter Humulin^® N (U40, Eli Lilly & Co., Indianapolis IN, USA) wird mit etwa 160 mg (etwa 128 μl) zu testendem Glycerin versetzt. Die Glycerinmenge beträgt etwa das Zehnfache der normalen Menge, die man in kommerziellen Produkten findet. Ein weiterer Milliliter Humulin^® N U40 wird mit 128 μl Wasser versetzt. Beide Proben werden bei 30°C für 7 Tage gelagert. Die Menge an hochmolekularem Protein (HMWP) der zwei Proben wird dann durch HPLC Größenausschlusschromatographie unter denaturierenden Bedingungen gemessen [beispielsweise Waters Säule mit der Aufschrift "Protein-Pak 125 insulin assay certified" Waters Corporation (Milford, MA, USA) Teilenummer 20574, mobile Phase 65 Teile einer 1 mg/ml L-Argininlösung, 20 Teile Acetonitril und 15 Teile Eisessig]. Die Testproben werden durch Ansäuern mit einem kleinen Volumen an 9,6 N HCl vor der Analyse angesäuert.
Die HMWP Zunahme in der Probe wird als HMWP Menge in der 30°C Testprobe abzüglich der HMWP Menge in der mit Wasser versetzten Kontrolle berechnet. Die prozentuale Zunahme wird pro 7 Tage Periode aufgezeichnet.
Verfahren 4
HPLC Analyse der derivatisierten Aldehyde in Glycerin
Eine 160 mg Probe einer zu testenden Gylcerincharge wird mit 1ml 0,5 mg/ml 2-Diphenylacetyl-1,3-indandion-1-hydrazon [(DPIH), siehe J.M. Rideout et al., Clin. Chim. Acta 161: 29–35 (1986) und S. Swarin et al., J. Liquid Chromatography 6: 425–444 (1983)] in Acetonitril in einem 3,5 ml Glasröhrchen derivatisiert. Zehn μl Trifluoressigsäure werden zum Gläschen gegeben und das Gläschen wird dicht verschlossen und bei 20 U/min für 3 Stunden bei Umgebungstemperatur gedreht. Das Glycerin ist mit der Acetonitril-DPIH Reagenzlösung nicht mischbar, aber die Rotation des Gläschens verteilt das Glycerin in eine dünne Schicht über die Oberfläche des Gläschens, was den Oberflächenkontakt der beiden Phasen maximiert. Die Aldehyde und Ketone des Glycerins reagieren mit DPIH unter Bildung von Azinen, die dann in die Acetonitril-DPIH Reagenzlösung extrahiert werden.
Die Lösung wird dann in eine Zorbax Rx C8 HPLC Säule (Mac-Mod Analytical Inc., Chadds Ford, PA, USA) injiziert. Die Azine werden durch einen Stufengradienten getrennt, der aus einer Lösung A (0,1 % TFA in Wasser) und einer Lösung B (0,1 % TFA in Acetonitril) besteht und von 48 % B bis 66 % B Gemischen während eines 30 minütigen Laufs geht. Die Derivate werden mittels eines Spektrophotometers bei 290 nm oder mittels eines Spektrofluorimeters bei einer Anregung von 425 nm und einer Emission bei 525 nm detektiert. Die Aldehydstandards Glycerinaldehyd, Glycolaldehyd, Hydroxypropionaldehyd, Formaldehyd, Acetaldehyd und Propionaldehyd werden in dieser Reihenfolge durch Elution getrennt.
Die folgenden Beispiele werden nur zur weiteren Erläuterung der Erfindung bereitgestellt. Der Schutzumfang der Erfindung soll nicht so aufgefasst werden, dass er hauptsächlich aus den folgenden Beispielen besteht.
Beispiel 1
Selektivität von Aldehydtests
Eine Probe aus von Pflanzen-stammendem Glycerin wird mit definierten Mengen an Aldehyden versetzt, wie sie in Tabelle 1 gezeigt sind. Die versetzten Glycerinproben werden dann mit dem hierin beschriebenen MBTH Test (Verfahren 1) und drei anderen Tests getestet.
Für den "Nash" Test werden die Aldehyde im Glycerin in einen Phosphatpuffer mit pH 7,5 extrahiert und dann mit Acetylaceton in Gegenwart von überschüssigem Ammoniumacetat derivatisiert [du Chatiner et al., Analytical Letters 22: 875–883 (1989)]. Die gefärbten Reaktionsprodukte werden mittels eines Spektrophotometers bei 415 nm quantifiziert.
Für den "Purpald" Test wird das Reagenz 4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol [Aldrich Chemical Company] in 1 N NaOH gelöst. Diese Lösung wird dann zu Glycerinlösungen gegeben, die mit Wasser verdünnt wurden. Nach der Belüftung werden die Absorptionen der Lösungen bei 401 nm mittels eines Spektrophotometers gemessen.
Für den Test der Europäischen Pharmakopöe (Ph. Eur.) werden die Glycerinlösungen mit Pararosanalinhydrochloridlösung gemischt [Europäische Pharmakopöe 1997, Seiten 906–907, Council of Europe, Strasbourg]. Nach einer Stunde wird die Absorption bei 550 nm mittels eines Spektrophotometers gemessen.
Die Absorptionswerte für jeden Test werden durch Subtraktion der Reaktionen der nicht-versetzten Glycerinprobe von der Reaktion des versetzten Glycerins für jede zugegebene Verbindung berechnet. Die Absorptionen werden auf einer molaren Grundlage für jedes Aldehyd berechnet und sind in Tabelle 1 gezeigt. Ein negativer Wert bedeutet, dass die Absorption durch die Zugabe des Aldehyds tatsächlich verringert wurde.
Tabelle 1 Molare Absorption der zu Glycerin gegebenen Aldehyde
Die Nash Methode erzeugt mit keinem der Aldehyde eine große Absorption. Die Purpald Methode ist sehr sensitiv gegenüber Glycolaldehyd, bildet aber keine Absorption mit Glycerinaldehyd. Das Verfahren der Europäischen Pharmakopöe erzeugt eine mittlere Absorption mit Formaldehyd, ist aber für die Messung des Glycerinaldehyds relativ unempfindlich.
Dieses Experiment zeigt deutlich, dass bei den vier Tests, die verglichen wurden, das größte Absorptionssignal pro Mol Glycerinaldehyd mit dem MBTH Test erhalten wird. Glycerinaldehyd ist gemäß HPLC Analyse (Verfahren 4) der vorwiegende Aldehyd, den man in im Handel erhältlichen Glycerinchargen findet. Im MBTH Test erhält man auch große Absorptionswerte für Formaldehyd und Glycolaldehyd, reaktive Aldehyde, von denen gemäß HPLC Analyse (Verfahren 4) gezeigt wird, dass sie in geringen Mengen in im Handel erhältlichen Glycerinchargen vorkommen. Daher ist der MBTH Test ein empfindliches Verfahren zur Bestimmung der Menge an reaktiven Aldehyden in Glycerin.
Beispiel 2
Korrelation des MBTH Tests mit dem modifizierten 10x-GST Test
Der reaktive Aldehydgehalt von frischen und gealterten im Handel erhältlichen Glycerinchargen wird durch den hierin beschriebenen MBTH Test gemessen. Jede Glycerinprobe wird auch mittels des modifizierten 10x-GST Tests (Verfahren 3) evaluiert. Für die vereinigten von Propylen und Pflanzen stammenden Glycerinproben (jeweils n = 39 und n = 25) zeigen die Ergebnisse, die in 1 dargestellt sind, eine starke lineare Korrelation (R² = 0,90 für die am besten passende durch den Ursprung gehende Kurve) zwischen dem Gehalt an reaktivem Aldehyd, wie er durch den MBTH Test gemessen wird (< 100 ppm) und den erhöhten kovalenten HMWP Peaks, die in Humulin^® N Insulin Formulierungen durch den modifizierten 10x-GST Test gemessen wurden. Von Tieren stammende Glycerinproben (n = 19) zeigten auch eine starke lineare Korrelation zwischen diesen Tests (R² = 0,93, Daten nicht gezeigt).
Beispiel 3
Gehalt an reaktivem Aldehyd von gealterten im Handel erhältlichen Glycerinchargen
Im Handel erhältliche Glycerinchargen, deren Herstelldaten bekannt sind, werden bei Umgebungstemperatur für 1 bis 48 Monate von ihrem Herstelldatum ab gelagert. Für jede Glycerincharge wird der Gehalt an reaktivem Aldehyd durch den hierin beschriebenen MBTH Test gemessen. Die Daten aus diesen Chargen sind in der folgenden Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2 Analysen von reaktivem Aldehyd in Glycerinchargen, die von drei Quellen stammen
Diese Daten zeigen deutlich, dass gealterte Glycerinchargen, die von Propylen und Pflanzen stammen, einen geringeren Bereich an reaktiven Aldehydmengen aufweisen, als das Glycerin, das von Tieren stammt. Diese Daten zeigen auch, dass Glycerinchargen, die von Pflanzen und Propylenquellen stammen, einen viel geringeren mittleren Gehalt an reaktiven Aldehyden pro Altersmittel aufweisen, als Glycerinchargen, die von tierischen Quellen stammen.
Die Daten in der letzten Zeile der Tabelle 2 werden durch Dividieren des Gehalts an reaktiven Aldehyden jeder Glycerincharge durch ihr Alter seit der Herstellung erhalten. Diese Berechnungen zeigen, dass nicht von Tieren stammendes Glycerin eine statistisch signifikant geringere Menge an reaktivem Aldehyd pro Alter in Monaten aufweist, als Glycerin, das von Tieren stammt. Eine sinnvolle Erklärung dieser Daten ist, dass der Gehalt an reaktivem Aldehyd von Glycerin, das von Tieren stammt schneller über die Zeit zunimmt, als der reaktive Aldehydgehalt von Glycerin, das von Pflanzen oder Propylen stammt.
Aufgrund dieser Untersuchung wird angenommen, dass bei einer Lagerung von Glycerin mit gleichem Gehalt an reaktiven Aldehydäquivalenten, das von Pflanzen, Propylen oder Tieren stammt, der Gehalt an reaktivem Aldehyd des von Tieren stammenden Glycerins mit der Zeit schneller zunimmt, als der reaktive Aldehydgehalt des von Pflanzen und Propylen stammenden Glycerins.
Beispiel 4
Stabilität von Leptinformulierungen
Humanes Leptinanalogon Asp(72)-Asp(100)-Ob [SEQ ID 6 in J.M. Beals et al., WO 98/28335 A, veröffentlicht am 24. Juni 1998] wird zur Herstellung von Formulierungen verwendet, die Glycerin in einer Konzentration von 220 mg/ml enthalten. Die Glycerinprobe 1 (reaktive Aldehyde = 1 ppm gemäß MBTH Test) stammt von Propylen und die Glycerinprobe 2 (reaktive Aldehyde = 85 ppm gemäß MBTH Test) stammt von einer Pflanzenquelle. Jede Formulierung enthält 15,2 mg/ml des Proteins in 10 mM Phosphatpuffer, der auf pH 7,8 eingestellt ist.
Ein 50 ml Volumen von jeder der Probenformulierungen wird gleichzeitig hergestellt und sterilfiltriert. Aliquots (3 ml) werden dann aseptisch in sterile 5 ml Glasröhrchen gefüllt, verschlossen, verschweißt und dann bei 5°C und 25°C für 3, 7, 10 und 24 Tage gelagert. Die Lösungen werden unter dissoziierenden Bedingungen durch Größenausschluss HPLC mittels einer TosoHaas TSK-GEL G3000SW-XL Säule (TosoHaas, Montgommeryville, PA, USA) und einer mobilen Phase aus 0,1 M Natriumphosphat, 0,1 M Natriumsulfat und 0,6 % Natriumdodecylsulfat bei pH 8,5 analysiert. Die eluierenden Polypeptidpeaks werden durch eine Ultraviolettabsorption bei 214 nm detektiert.
Zusätzlich zum Hauptproteinpeak beobachtet man zwei früher eluierende Peaks (das heißt mit größerem Molekulargewicht). Einer von diesen ist ein kovalentes Dimer, das mehr als 90 % der Fläche der früher eluierenden Peaks ausmacht. Der andere früher eluierende Peak enthält kovalentes Proteinpolymer, das größer als das Dimer ist. Am Tag der Probenherstellung stellt die Fläche der früher eluierenden Peaks 0,31 % bis 0,33 % der Peakfläche des Gesamtchromatogramms dieser Proben dar, während der Dimerpeak 0,30 % bis 0,32 % der Fläche des Gesamtchromatogramms darstellt.
Alle Proben bleiben während der Untersuchung klar und farblos. Die Zunahmen der Proteinpeaks mit hohem Molekulargewicht (Dimer und höhermolekulare Peaks zusammengenommen) sind als Prozentsatz des Gesamtproteins in der folgenden Tabelle 3 angegeben. Wie bei den Ausgangsproteinlösungen beruhen die früher eluierenden Peaks in allen Proben hauptsächlich auf dem Dimer.
Tabelle 3 Zunahme an Proteinpeaks mit hohem Molekulargewicht (% des Gesamtproteins)
Dieses Experiment zeigt, dass bei dem humanen Leptinanalogon Asp(72)-Asp(100)-Ob Formulierungen, die Glycerin mit einem geringeren Gehalt an reaktivem Aldehyd (Probe 1) enthalten eine geringere Bildung an Proteinverunreinigungen mit höherem Molekulargewicht während einer Lagerung sowohl bei 5°C als auch bei 25°C auftritt, als bei einer vergleichbaren Zusammensetzung, die Glycerin mit einem höheren Gehalt an reaktivem Aldehyd aufweist (Probe 2). Nach 24 Tagen bei 5°C ist die Menge an Protein mit erhöhtem Molekulargewicht in der Zusammensetzung, die mit dem Glycerin mit einem reaktiven Aldehydgehalt von 1 ppm (Probe 1) hergestellt wurde, etwa 50 % niedriger als in der Zusammensetzung, die mit dem Glycerin hergestellt wurde, das einen reaktiven Aldehydgehalt von 85 ppm aufweist (Probe 2). Nach 24 Tagen bei 25°C ist die Menge an Protein mit erhöhtem Molekulargewicht in der Zusammensetzung, die mit der Glycerinprobe 1 hergestellt wurde, etwa 67 % niedriger als in der Zusammensetzung, die mit der Glycerinprobe 2 hergestellt wurde.
Beispiel 5
Stabilität von Insulin und Insulinanalogonformulierungen
Der reaktive Aldehydgehalt von drei unterschiedlichen im Handel erhältlichen Glycerinchargen wird durch den MBTH Test quantifiziert. Die Glycerinprobe 3 stammt aus Propylen (1 ppm reaktiver Aldehyd) und die Glycerinproben 4 und 5 stammen von Tieren (jeweils 45 und 156 ppm reaktiver Aldehyd).
Zwei hergestellte Formulierungen von Humaninsulin (lösliches Humulin^® R und kristalline Suspension Humulin^® N) und vier hergestellte Formulierungen von Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulin [lösliches Humalog^®, kristalline Suspension Humalog^® NPL und fixierte Gemische hiervon, die LisPro Low Mix (25:75, Humalog^® : Humalog^® NPL, siehe P. Roach et al., Diabetes Care 22: 1258–1261 (1999) und LisPro Mid Mix (50 : 50) Humalog^® : Humalog^® NPL) genannt werden] mit jeweils 100 Einheiten pro ml Gehalt werden mit den Glycerinproben 3, 4 und 5 auf eine Glycerinendkonzentration von 160 mg/ml gebracht.
Nach 7 Tagen bei 30°C wird die prozentuale Zunahme des hochmolekularen Proteins (HMWP) jeder Formulierung wie in Verfahren 3 bestimmt. Die Zunahme der HMWP Mengen ist in der folgenden Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4 Erhöhung der hochmolekularen Proteinpeaks nach 7 Tagen bei 30°C (% Gesamtprotein)
Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen deutlich, dass die Verwendung von Glycerin, das nicht von Tieren stammt, Lösungen, Suspensionen und gemischte Lösungen/Suspensionen von Polypeptiden mit erhöhter chemischer Stabilität im Vergleich zu ähnlichen Zusammensetzungen liefert, die mit Glycerin hergestellt sind, das aus Tieren stammt. Nach 7 Tagen bei 30°C reichen die Mengen an erhöhtem hochmolekularem Protein in den Zusammensetzungen, die mit Glycerin hergestellt wurden, das aus Propylen stammt (Probe 3) von etwa 87 % geringer für LisPro Low Mix (verglichen mit der aus Tieren stammenden Glycerinprobe 4) bis etwa 99 % geringer für Humulin^® N (verglichen mit der aus Tieren stammenden Glycerinprobe 5).
Beispiel 6
Herstellung von Lys(B28)Pro(B29)-Humaninsulinsuspensionen
Zusammensetzungen, die Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulin Analogonsuspensionen (Humalog^® NPL, Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN, USA) mit einer U100 Stärke entsprechen, werden unter Verwendung von vier im Handel erhältlichen Glycerinchargen hergestellt, die nicht weiter gereinigt wurden.
Zuerst wird der Gehalt an reaktivem Aldehyd von drei der Glycerinchargen durch den in Verfahren 1 beschriebenen MBTH Test bestimmt. Die Glycerinchargen werden auch mittels des 10x Glycerinstresstests (Verfahren 2) und dem modifizierten 10x Glycerinstresstest (Verfahren 3) evaluiert. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in der folgenden Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5 Analysen von Glycerinchargen, die zur Herstellung von Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinsuspensionen verwendet werden
Um die Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinformulierungen herzustellen, werden mehrere Zwischenlösungen hergestellt.
Eine "Konservierungsstammlösung", die 3,52 mg/ml m-Cresol und 1,43 mg/ml Phenol enthält (berechnet auf 89 Gewichtsprozent) wird in entionisiertem Wasser hergestellt.
"Glycerinstammlösungen" werden für jede Glycerinprobe mit 160 mg/ml in Wasser hergestellt. Es wird eine "Zinkstammlösung" durch die Ansäuerung von Zinkoxid mit 10 % HCl hergestellt.
Es werden "Konservierungs-Glycerin-Zink-Lösungen" durch die Kombination von geeigneten Volumina der "Konservierungsstammlösung", der "Glycerinstammlösungen" und der "Zinkstammlösung" so hergestellt, dass sie im Ergebnis zu einer Lösung führen, die 1,76 mg/ml m-Cresol, 0,715 mg/ml Phenol, 16 mg/ml Glycerin und eine Zinkkonzentration enthält, die bei einer Kombination mit dem im Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinchargenmaterial vorkommenden Zink insgesamt 25 μg/ml beträgt. Zu diesem Zeitpunkt haben die "Konservierungs-Glycerin-Zink" Lösungen etwa pH 4,7.
Dann werden Mengen an Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulin (Bulkzinkkristalle) zu den Konservierungsstoff-Glycerin-Zink Lösungen in einem Ausmaß gegeben, das zum Erreichen einer Konzentration von 200 Einheiten (E) pro ml oder etwa 7,0 mg/ml in den "U200 Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinlösungen" ausreicht, wie dies im folgenden beschrieben ist. Die Auflösung von Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulin wird bei Raumtemperatur durch Verringerung des pH auf etwa 2,8 durch die Zugabe von kleinen Mengen an 10 % HCl bewirkt. Nachdem die Lösungen klar sind, wird der pH von jeder durch die Zugabe von kleinen Aliquots an 10 % NaOH erneut auf etwa 7,3 eingestellt. Es werden Volumina einer dibasischen Natriumphosphatheptahydratlösung mit 75,6 mg/ml in entionisiertem Wasser in Mengen zugegeben, die zu einer Konzentration von 3,78 mg/ml dibasischem Natriumphosphatheptahydrat in dieser Lösung führen. Nach dem Rühren zur vollständigen Auflösung aller Materialien in dieser Lösung wird 10 % NaOH zugegeben, um jede der vier Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinlösungen auf etwa pH 7,4 zu bringen. Es wird entionisiertes Wasser unter Bildung von 200 E/ml Lösungen an Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulin zugegeben, die dann durch 0,22 μm Sterivex GV Filter filtriert werden (Millipore Products Division, Bedford, MA, USA). Diese vier Lösungen werden "U200 Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinlösungen" genannt.
Die "Protaminstammlösung" wird durch Lösen von festem Protaminsulfat (Ketalachs) in "Konservierungsstammlösung" hergestellt, um eine Konzentration zu erreichen, die 0,6 mg/ml Protamin als freie Base in den schließlichen "Protamin-Konservierungsstoff-Glycerin-Lösungen" entspricht, die im folgenden beschrieben sind. Nach dem Rühren für 45 Minuten wird ein Volumen einer dibasischen Natriumphosphatheptahydratlösung mit 75,6 mg/ml in entionisiertem Wasser unter Bildung einer Konzentration von 3,78 mg/ml an dibasischem Natriumphosphatheptahydrat in der schließlichen "Protamin-Konservierungsstoff-Glycerinlösung" zugegeben. Die Lösung wird dann durch die Zugabe von kleinen Aliquots an 10 % Chlorwasserstoffsäure auf pH 7,4 eingestellt. Es werden Volumina der 160 mg/ml "Glycerinstammlösung" unter Bildung von Lösungen zugegeben, die 16 mg/ml Glycerin in jeder Lösung enthalten. Es wird entionisiertes Wasser zugegeben, um das Endvolumen einzustellen und die vier "Protamin-Konservierungsstoff-Glycerin" Lösungen werden durch 0,22 μm Sterivex GV Filter filtriert.
Nach der Äquilibrierung jeder der vier U200 Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinlösungen und jeder der vier Protamin-Konservierungsstoff-Glycerin-Lösungen bei 15°C werden gleiche Volumina jeder Lösung vereinigt und für 61 Stunden bei 15°C inkubiert.
Jeder ml der entstehenden vier Suspensionsformulierungen, die in diesem Experiment hergestellt wurden, enthält etwa 3,5 mg Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulin, 3,78 mg dibasisches Natriumphosphatheptahydrat, 16 mg Glycerin, 1,76 mg m-Cresol, 0,715 mg Phenol, 25 μg Zink und 0,3 mg Protamin.
Beispiel 7
Stabilität von Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinsuspensionen
Die vier Suspensionsformulierungen von Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulin, die mit verschiedenen Chargen Glycerin hergestellt wurden, wie dies in Beispiel 6 beschrieben ist, werden für bis zu 12 Wochen bei 30°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeiten wird der hochmolekulare Proteingehalt (HMWP) in den Proben als Prozentsatz des Gesamtproteins durch das HPLC Größenausschlusschromatographieverfahren gemessen, das für den modifizierten 10x-GST Test (Verfahren 3) beschrieben wurde. Die Ergebnisse des Stabilitätstests sind in der folgenden Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6 HMWP Mengen in Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinsuspensionen, die mit verschiedenen Glycerinchargen hergestellt wurden
Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen deutlich, dass das von Propylen stammende Glycerin die chemische Stabilität von Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinsuspensionsformulierungen im Vergleich zu Suspensionen verbessert, die mit Glycerin aus Tieren hergestellt wurden. Nach 12 Wochen bei 30°C ist die Menge an erhöhtem hochmolekularem Protein in den mit Glycerin hergestellten Suspensionsformulierungen , das aus Propylen stammt (Proben 6 bis 8) im Mittel etwa 39 % niedriger als die Menge des erhöhten HMWP in der Formulierung, die mit Glycerin hergestellt wurde, das aus Tieren stammt (Probe 9).
Beispiel 8
Verringerung der Menge an reaktiven Aldehyden in Glycerin
Glycerin (3,0 g) aus einer Charge, die aus Propylen stammt, wird in jeden von fünf Bechern gegeben, die Rührfische enthalten. Es werden ähnlich fünf Becher mittels einer Glycerincharge präparisert, die aus Pflanzen stammt. Etwa 50 mg festes wasserfreies Magnesiumsulfat (MgSO₄) wird in jedem An satz zu vier Bechern gegeben. Zu drei Bechern in jedem Ansatz, zu denen das Magnesiumsulfat gegeben wurde, wird eine abgewogene Menge eines der folgenden Polymerharze von Advanced ChemTech Inc. (Louisville, KY, USA) gegeben: Harz A 0,1 g Tris-(2-aminoethyl)aminharz (0,7 mmol/g, 100–200 Mesh), Harz B, 0,2 g TantaGel^® S NH₂ Harz (0,3 mmol/g, 90 μm, Harz C, 0,1 g Aminomethylpolystyrolharz (0,7 mmol/g, 100–200 Mesh).
Alle zehn Becher werden auf eine Rührplatte in eine Schutzhaube unter einer Stickstoffatmosphäre gestellt und auf etwa 60°C erhitzt. Nach dem Rühren für 24 Stunden werden die Proben durch eine Cellulosemembran filtriert und auf ihren reaktiven Aldehydgehalt (ppm) durch den MBTH Test analysiert, der in Verfahren 1 beschrieben ist. Einige der Glycerinproben werden auch im modifizierten 10x-GST Test (Verfahren 3) evaluiert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in der folgenden Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7 Ergebnisse der Behandlung von Glycerinproben mit polymeren Aminharzen
Diese Daten zeigen deutlich, dass die verwendeten Reinigungsverfahren großteils die Konzentration der reaktiven Aldehyde in im Handel erhältlichen Glycerinchargen verringern. In Insulinsuspensionen, die im modifizierten 10x-GST Test untersucht werden, führen die Glycerinchargen, die mit Aminomethylpolystyrol (Harz C) gereinigt wurden, zu keiner Erhöhung der HMWP Peaks während die ungereinigten Glycerinchargen zu einer signifikant erhöhten Menge der HMWP Peaks führen.
Beispiel 9
Humaninsulinlösung
Rekombinantes Humaninsulin (35 mg) wird in etwa 5 ml 0,01 N HCl gelöst. Zinkoxidlösung (1 ml, 0,17 mg/ml Zink als Zinkoxid gelöst in 0,1 N HCl) wird gefolgt von 25 mg m-Cresol zugegeben. Dann werden 160 mg frisch hergestelltes Glycerin, das aus Propylen stammt, zugegeben. Die Lösung wird mit 1 N NaOH auf pH 7,4 eingestellt und auf etwa 10 ml Gesamtvolumen mit Wasser verdünnt. Jeder ml dieser Polypeptidzusammensetzung enthält etwa 3,5 mg Humaninsulin, etwa 16 mg Glycerin, etwa 2,5 mg m-Cresol und etwa 0,017 mg Zink.
Beispiel 10
Humaninsulinlösung
Rekombinantes Humaninsulin (35 mg) wird in etwa 5 ml 0,01 N HCl gelöst. Zinkoxidlösung (1 ml, 0,17 mg/ml Zink als Zinkoxid gelöst in 0,1 N HCl) wird gefolgt von 16 mg m-Cresol, 6,5 mg Phenol und 1 ml 140 mM Natriumphosphatpuffer in Wasser zugegeben. Dann werden 160 mg frisch hergestelltes Glycerin, das aus Propylen stammt, zugegeben. Die Lösung wird mit 1 N NaOH auf pH 7,4 eingestellt und auf etwa 10 ml Gesamtvolumen mit Wasser verdünnt. Jeder ml dieser Polypeptidzusammensetzung enthält etwa 3,5 mg Humaninsulin, etwa 16 mg Glycerin, 14 mM Natriumphosphat, etwa 1,6 mg m-Cresol, etwa 0,65 mg Phenol und etwa 0,017 mg Zink.
Beispiel 11
Humaninsulinsuspension
Eine Suspension von Humaninsulinprotaminkristallen wird zuerst durch Lösen von 35 mg rekombinantem Humaninsulin in 5 ml 0,01 N HCl gefolgt von der Zugabe von 16 mg m-Cresol und 6,5 mg Phenol hergestellt. Dann wird 1 ml einer wässrigen 160 mg/ml Glycerinlösung, die aus Propylen stammt, 1 ml einer Zinkoxidlösung (0,25 mg/ml Zink) in 0,1 N HCl und 2,7 mg Protamin (auf der Grundlage der freien Base) zugegeben, wonach eine Verdünnung auf etwa 9 ml Gesamtvolumen mit Wasser erfolgt. Eine Lösung (1 ml) einer 38 mg/ml dibasischen Natriumphosphatheptahydratlösung wird dann zugegeben, was zu einem pH von etwa 8 führt. Die entstehende Lösung wird auf pH 7,4 eingestellt und die Kristallisation läuft für etwa 24 Stunden bei etwa 19°C ab. Jeder ml dieser Suspension enthält etwa 3,5 mg Humaninsulin, etwa 16 mg Glycerin, etwa 0,27 mg Protamin (auf der Grundlage der freien Base), etwa 0,025 mg Zink, etwa 1,6 mg m-Cresol, etwa 0,65 mg Phenol und etwa 3,78 mg dibasisches Natriumphosphat.
Beispiel 12
70/30 Humaninsulingemisch
Ein Gemisch, das 70 Teile der in Beispiel 11 beschriebenen Suspension enthält, wird mit 30 Teilen der in Beispiel 10 beschriebenen Humaninsulinlösung vereinigt. Beide Präparationen verwenden Glycerin, das aus Propylen stammt.
Beispiel 13
50/50 Humaninsulingemisch
Ein Gemisch, das 50 Teile der in Beispiel 11 beschriebenen Suspension enthält, wird mit 50 Teilen der in Beispiel 10 beschriebenen Humaninsulinlösung vereinigt. Beide Präparationen verwenden Glycerin, das aus Propylen stammt.
Beispiel 14
30/70 Humaninsulingemisch
Ein Gemisch, das 30 Teile der in Beispiel 11 beschriebenen Suspension enthält, wird mit 70 Teilen der in Beispiel 10 beschriebenen Humaninsulinlösung vereinigt. Beide Präparationen verwenden Glycerin, das aus Propylen stammt.
Beispiel 15
Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinlösung
Rekombinantes Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulin (35 mg) wird in etwa 5 ml 0,01 N HCl gelöst. Eine 1 ml Lösung Zinkoxid (0,2 mg/ml Zink) gelöst in 0,1 N HCl wird gefolgt von 31,5 mg m-Cresol und 1 ml 70 mM Phosphatpufferlösung in Wasser zugegeben. Dann werden 160 mg Glycerin, das aus Propylen stammt, zugegeben. Die Lösung wird mit 1 N NaOH auf etwa pH 7,4 eingestellt und auf etwa 10 ml Gesamtvolumen mit Wasser verdünnt. Jeder ml dieser Polypeptidzusammensetzung enthält etwa 3,5 mg Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulin, etwa 16 mg Glycerin, 7 mM Natriumphosphat, etwa 3,15 mg m-Cresol und etwa 0,02 mg Zink.
Beispiel 16
Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinlösung
Rekombinantes Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulin (35 mg) wird in etwa 5 ml 0,01 N HCl gelöst.
Eine 1 ml Lösung Zinkoxid (0,2 mg/ml Zink) gelöst in 0,1 N HCl wird gefolgt von 16 mg m-Cresol, 6,5 mg Phenol und 1 ml einer 140 mM Phosphatpufferlösung in Wasser zugegeben. Dann werden 160 mg Glycerin, das aus Propylen stammt, zugegeben. Die Lösung wird mit 1 N NaOH auf etwa pH 7,4 eingestellt und auf etwa 10 ml Gesamtvolumen mit Wasser verdünnt. Jeder ml dieser Polypeptidzusammensetzung enthält etwa 3,5 mg Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulin, etwa 16 mg Glycerin, 14 mM Natriumphosphat, etwa 1,6 mg m-Cresol, etwa 0,65 mg Phenol und etwa 0,02 mg Zink.
Beispiel 17
Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinsuspension
Eine Suspension aus NPH-ähnlichen Kristallen von Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulin wird mittels Glycerin, das aus Propylen stammt, unter Verwendung des in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrens hergestellt.
Beispiel 18
75/25 Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulingemisch
Ein Gemisch, das 75 Teile der in Beispiel 17 beschriebenen Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinsuspension enthält, wird mit 25 Teilen der in Beispiel 16 beschriebenen Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinlösung vereinigt. Beide Präparationen verwenden Glycerin, das aus Propylen stammt.
Beispiel 19
50/50 Lys(B28)-Pro(BZ9)-Humaninsulingemisch
Ein Gemisch, das 50 Teile der in Beispiel 17 beschriebenen Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinsuspension enthält, wird mit 50 Teilen der in Beispiel 16 beschriebenen Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinlösung vereinigt. Beide Präparationen verwenden Glycerin, das aus Propylen stammt.
Beispiel 20
25/75 Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulingemisch
Ein Gemisch, das 25 Teile der in Beispiel 17 beschriebenen Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinsuspension enthält, wird mit 75 Teilen der in Beispiel 16 beschriebenen Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulinlösung vereinigt. Beide Präparationen verwenden Glycerin, das aus Propylen stammt.
Beispiel 21
Asp(B28)-Humaninsulinlösung
Rekombinantes Asp(B28)-Humaninsulin (35 mg) wird in etwa 5 ml 0,01 N HCl gelöst. Eine 1 ml Lösung Zinkoxid (0,2 mg/ml Zink) gelöst in 0,1 N HCl wird gefolgt von 17 mg m-Cresol und 15 mg. Phenol zugegeben. Dann werden 160 mg Glycerin, das aus Propylen stammt, zugegeben, gefolgt von 1 ml einer 70 mM Phosphatpufferlösung in Wasser. Die Lösung wird dann mit 1 N NaOH auf pH 7,4 eingestellt und auf etwa 10 ml Gesamtvolumen mit Wasser verdünnt. Jeder ml dieser Polypeptidzusammensetzung enthält etwa 3,5 mg Asp(B28)-Humaninsulin, etwa 16 mg Glycerin, etwa 7 mM Phosphat, etwa 1,7 mg m-Cresol, etwa 1,5 mg Phenol und etwa 0,02 mg Zink.
Beispiel 22
70/30 Asp(B28)-Humaninsulingemisch
Eine Lösung aus Asp(B28)-Humaninsulin wird durch Lösen von 76,5 mg Asp(B28)-Humaninsulin in Wasser, das etwa 0,32 ml 0,2 N HCl enthält, und der Zugabe von etwa 0,16 ml einer 0,4 mg/ml Zinkchloridlösung hergestellt. Dann wird Protaminsulfat (Äquivalent zu etwa 4,5 mg Protamin als freie Base) in Wasser zugegeben, gefolgt von einem Gemisch, das aus 17,2 mg m-Cresol, 15 mg Phenol und 160 mg Glycerin besteht, das aus Propylen stammt, wobei alles in Wasser gelöst ist. Die entstehende Lösung, die etwa pH 2,7 aufweist, wird mit Wasser auf 10 ml verdünnt und auf etwa 30°C äquilibriert. Zu dieser Lösung werden 10 ml einer Lösung gegeben, die 17,2 mg m-Cresol, 15 mg Phenol, 25 mg Dinatriumphosphatdihydrat und 160 mg von Propylen stammendes Glycerin bei pH 9 enthält und auf etwa 30°C äquilibriert. Nach 2 Tagen bei etwa 30°C ist die Kristallisation vollständig, was zu einem Suspensionsgemisch führt, in dem etwa 70 % des Asp(B28)-Humaninsulins in den unlöslichen NPH-ähnlichen Kristallen und 30 % in Lösung vorkommen.
Beispiel 23
50/50 Asp(B28)-Humaninsulingemisch
Eine Lösung aus Asp(B28)-Humaninsulin wird durch Lösen von 76,5 mg Asp(B28)-Humaninsulin in Wasser, das etwa 0,32 ml 0,2 N HCl enthält, und der Zugabe von etwa 0,16 ml einer 0,4 mg/ml Zinkchloridlösung hergestellt. Dann wird Protaminsulfat (Äquivalent zu etwa 3,2 mg Protamin als freie Base) in Wasser zugegeben, gefolgt von einem Gemisch, das aus 17,2 mg m-Cresol, 15 mg Phenol und 160 mg Glycerin besteht, das aus Propylen stammt, wobei alles in Wasser gelöst ist. Die entstehende Lösung, die etwa pH 2,7 aufweist, wird mit Wasser auf 10 ml verdünnt und auf etwa 30°C äquilibriert. Zu dieser Lösung werden 10 ml einer Lösung gegeben, die 17,2 mg m-Cresol, 15 mg Phenol, 25 mg Dinatriumphosphatdihydrat und 160 mg von Propylen stammendes Glycerin bei pH 9 enthält und auf etwa 30°C äquilibriert. Nach 2 Tagen bei etwa 30°C ist die Kristallisation vollständig, was zu einem Suspensionsgemisch führt, in dem etwa 50 % des Asp(B28)-Humaninsulins in den unlöslichen NPH-ähnlichen Kristallen und 50 % in Lösung vorkommen.
Beispiel 24
30/70 Asp(B28)-Humaninsulingemisch
Eine Lösung aus Asp(B28)-Humaninsulin wird durch Lösen von 76,5 mg Asp(B28)-Humaninsulin in Wasser, das etwa 0,32 ml 0,2 N HCl enthält, und der Zugabe von etwa 0,16 ml einer 0,4 mg/ml Zinkchloridlösung hergestellt. Dann wird Protaminsulfat (Äquivalent zu etwa 2,0 mg Protamin als freie Base) in Wasser zugegeben, gefolgt von einem Gemisch, das aus 17,2 mg m-Cresol, 15 mg Phenol und 160 mg Glycerin besteht, das aus Propylen stammt, wobei alles in Wasser gelöst ist. Die entstehende Lösung, die etwa pH 2,7 aufweist, wird mit Wasser auf 10 ml verdünnt und auf etwa 30°C äquilibriert. Zu dieser Lösung werden 10 ml einer Lösung gegeben, die 17,2 mg m-Cresol, 15 mg Phenol, 25 mg Dinatriumphosphatdihydrat und 160 mg von Propylen stammendes Glycerin bei pH 9 enthält und auf etwa 30°C äquilibriert. Nach 2 Tagen bei etwa 30°C ist die Kristallisation vollständig, was zu einem Suspensionsgemisch führt, in dem etwa 30 % des Asp(B28)-Humaninsulins in den unlöslichen NPH-ähnlichen Kristallen und 70 % in Lösung vorkommen.
Beispiel 25
Myristoyl-ε-Lys(B29)-des(B30)-Humaninsulinlösung
Das Insulinanalogonderivat Myristoyl-ε-Lys(B29)-des(B30)-Humaninsulin (37 mg) wird in etwa 5 ml 0,01 N HCl gelöst. Eine 1 ml Lösung Zinkoxid (0,17 mg/ml Zink) gelöst in 0,1 N HCl wird gefolgt von 32 mg m-Cresol, 1 ml einer 70 mM Phosphatpufferlösung in Wasser und dann 160 mg Glycerin, das aus Propylen stammt, zugegeben. Die Lösung wird auf etwa pH 7,9 eingestellt und auf etwa 10 ml Gesamtvolumen mit Wasser verdünnt. Jeder ml dieser Polypeptidzusammensetzung enthält etwa 3,7 mg Myristoyl-ε-Lys(B29)-des(B30)-Humaninsulin, etwa 16 mg Glycerin, 7 mM Natriumphosphat, etwa 3,2 mg m-Cresol und etwa 0,017 mg Zink.
Beispiel 26
Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-Humaninsulinlösung
Das Insulinanalogon Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-Humaninsulin (37 mg) wird in etwa 5 ml 0,01 N HCl gelöst. Eine 1 ml Lösung Zinkoxid (0,80 mg/ml Zink) gelöst in 0,1 N HCl wird zugegeben. Benzylalkohol (100 mg) wird gefolgt von 188 mg Glycerin zugegeben, das aus Pflanzen stammt. Die Lösung wird auf etwa pH 4,0 eingestellt und auf etwa 10 ml Gesamtvolumen mit Wasser verdünnt. Jeder ml dieser Polypeptidzusammensetzung enthält etwa 3,7 mg Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-Humaninsulin, etwa 16 mg Glycerin, etwa 0,08 mg Zink und 10 mg Benzylalkohol.
Beispiel 27
Humanleptinlösung
Rekombinantes Humanleptin (10 mg) wird in etwa 5 ml 0,01 N NaOH gelöst. Dann wird m-Cresol (30 mg) gefolgt von 160 mg Glycerin, das aus Pflanzen stammt, und 1 ml 70 mM Phosphatpufferlösung in Wasser zugegeben. Die Lösung wird auf pH 8,0 eingestellt und mit Wasser auf 10 ml Gesamtvolumen verdünnt. Jeder ml dieser Polypeptidzusammensetzung enthält etwa 1 mg Humanleptin, etwa 16 mg Glycerin, 7 mM Natriumphosphat und 3 mg m-Cresol.
Beispiel 28
Human-FSH-Lösung
Rekombinantes humanes FSH (5 mg) wird in 10 mM Natriumphosphatlösung mit pH 7,4 gelöst.
Zu dieser Lösung werden 30 mg m-Cresol gefolgt von 160 mg Glycerin gegeben, das von Propylen stammt. Die Lösung wird mit 10 mM Natriumphosphatlösung mit pH 7,4 auf 10 ml Gesamtvolumen verdünnt. Jeder ml dieser Polypeptidzusammensetzung enthält 0,5 mg FSH, etwa 10 mM Natriumphosphat, 3 mg m-Cresol und 16 mg Glycerin.
Beispiel 29
Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-Humaninsulinlösung
Das Inslinanalogon Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-Humaninsulin (36 mg) wird in etwa 5 ml 0,01 N HCl gelöst. Eine Lösung aus Zinkoxid (0,30 mg/ml Zink) gelöst in 0,1 N HCl wird zugegeben. Dann wird m-Cresol (27 mg) gefolgt von 200 mg einer 85 % Glycerin – 15 % Wasser-Lösung zugegeben, in der das Glycerin von Propylen stammt. Die Lösung wird auf pH 4,0 eingestellt und mit Wasser auf etwa 10 ml Gesamtvolumen verdünnt. Jeder ml dieser wässrigen Polypeptidzusammensetzung enthält etwa 3,6 mg Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-Humaninsulin, etwa 17 mg Glycerin, das von Propylen stammt, etwa 0,03 mg Zink und etwa 2,7 mg m-Cresol.
Beispiel 30
Asp(B28)-Humaninsulinlösung
Rekombinantes Asp(B28)-Humaninsulin (35 mg) wird in etwa 5 ml 0,01 N HCl gelöst. Eine 1 ml Lösung Zinkoxid (0,2 mg/ml Zink) gelöst in 0,1 N HCl wird gefolgt von 17 mg m-Cresol und 15 mg Phenol zugegeben. Dann werden 160 mg Glycerin, das aus Propylen stammt, zugegeben, gefolgt von 1 ml einer 70 mM Phosphatpufferlösung in Wasser, die 5,8 mg/ml Natriumchlorid (NaCl) enthält. Die Lösung wird dann mit 1 N NaOH auf pH 7,4 eingestellt und auf etwa 10 ml Gesamtvolumen mit Wasser verdünnt. Jeder ml dieser Polypeptidzusammensetzung enthält etwa 3,5 mg Asp(B28)-Humaninsulin, etwa 16 mg Glycerin, etwa 7 mM Phosphat, etwa 1,7 mg m-Cresol, etwa 1,5 mg Phenol, etwa 0,58 mg NaCl und etwa 0,02 mg Zink.
Beispiel 31
Arg(34)-N-ε-(γ-Glu(N-α-hexadecanoyl))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH-Lösung
Arg(34)-N-ε-(γ-Glu(N-α-hexadecanoyl))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH (10 mg) wird in etwa 5 ml 0,01 N NaOH gelöst. Dann wird m-Cresol (20 mg) gefolgt von 160 mg Glycerin zugegeben, das aus Propylen stammt. Die Lösung wird auf pH 8,0 eingestellt und auf 10 ml Gesamtvolumen mit Wasser verdünnt. Jeder ml dieser Polypeptidzusammensetzung enthält etwa 1 mg Arg(34)-N-ε-(γ-Glu(N-α-hexadecanoyl))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH, etwa 16 mg Glycerin und etwa 2 mg m-Cresol.
Beispiel 32
Exendin-4-Zusammensetzung
Exendin-4 (1 mg) wird zu 5 ml einer pH 4,5 Lösung gegeben, die 5 mg/ml Natriumacetat enthält.
Dann wird m-Cresol (27 mg) gefolgt von 160 mg Glycerin zugegeben, das aus Propylen stammt. Die entstehende Zusammensetzung wird erforderlichenfalls auf pH 4,5 eingestellt und mit Wasser auf 10 ml Gesamtvolumen verdünnt. Jeder ml dieser Polypeptidzusammensetzung enthält etwa 0,1 mg Exendin-4, etwa 2,5 mg Natriumacetat, etwa 16 mg Glycerin und etwa 2,7 mg m-Cresol.
Beispiel 33
Lys(B3)-Ile(B28)-Humaninsulinlösung
Rekombinantes Lys(B3)-Ile(B28)-Humaninsulin (35 mg) wird in etwa 5 ml 0,01 N HCl gelöst. 1 ml einer Lösung aus Zinkoxid (0,2 mg/ml Zink) gelöst in 0,1 N HCl wird gefolgt von 31,5 mg m-Cresol und 1 ml einer 70 mM Phosphatpufferlösung in Wasser zugegeben. Dann werden 160 mg Glycerin, das aus Propylen stammt, zugegeben. Die Lösung wird mit 1 N NaOH auf pH 7,8 eingestellt und auf etwa 10 ml Gesamtvolumen mit Wasser verdünnt. Jeder ml dieser Polypeptidzusammensetzung enthält etwa 3,5 mg Lys(B3)-Ile(B28)-Humaninsulin, etwa 16 mg Glycerin, etwa 7 mM Natriumphosphat, etwa 3,15 mg m-Cresol und etwa 0,02 mg Zink.
Die Prinzipien, bevorzugten Ausführungsformen und Durchführungsarten der vorliegenden Erfindung wurden in der vorangehenden Beschreibung beschrieben. Die Erfindung, die hierin geschützt werden soll, soll jedoch nicht durch die im einzelnen beschriebenen Formen beschränkt werden, da sie als erläuternd und nicht als beschränkend gesehen werden sollen. Variationen und Veränderungen können durch den Fachmann vorgenommen werden, ohne sich vom Schutzumfang der Erfindung zu entfernen.

Claims

Wässrige, parenterale pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid und Glycerin enthält, worin die Glycerinkonzentration weniger als 500 mg/ml beträgt und worin das Glycerin von einer nicht von Tieren stammenden Quelle stammt, um die chemische Stabilität der Zusammensetzung zu verbessern.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung eine Lösung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung eine Suspension ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Glycerinkonzentration in der pharmazeutischen Zusammensetzung etwa 1 mg/ml bis etwa 300 mg/ml beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die Glycerinkonzentration etwa 3 mg/ml bis etwa 100 mg/ml beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin die Glycerinkonzentration etwa 10 mg/ml bis etwa 30 mg/ml beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin die Glycerinkonzentration etwa 15 mg/ml bis etwa 18 mg/ml beträgt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Glycerin von Pflanzen oder Propylen stammt.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, worin das Glycerin von Propylen stammt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Polypeptid biosynthetisch hergestellt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin das Polypeptid in Bakterien oder Hefe synthetisiert wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin das Polypeptid in E. coli synthetisiert wird.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Polypeptid FSH oder ein Analogon oder ein Derivat hiervon, PTH oder ein Fragment oder ein Analogon hiervon, HGH oder ein Analogon hiervon, humanes Leptin oder ein Analogon oder Derivat hiervon, GLP-1 oder ein Analogon oder Derivat hiervon, Humaninsulin oder ein Analogon oder Derivat hiervon oder ein Derivat eines humanen Insulinanalogons ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin das Polypeptid Humaninsulin oder ein Analogon oder Derivat hiervon oder ein Derivat eines humanen Insulinanalogons ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, worin das Polypeptid Humaninsulin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, worin das Polypeptid ein Analogon von Humaninsulin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin das Analogon Lys(B28)-Pro(B29)-Humaninsulin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin das Analogon Asp(B28)-Humaninsulin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin das Analogon Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-Humaninsulin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, worin das Polypeptid ein Derivat von Humaninsulin oder ein Derivat eines humanen Insulinanalogons ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin das Derivat eines humanen Insulinanalogons Myristoyl-ε-Lys(B29)-des(B30)-Humaninsulin ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin das Derivat von Humaninsulin Palmitoyl-ε-Lys(B29)-Humaninsulin ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, worin das Glycerin einen reaktiven Aldehydgehalt von weniger als 33 ppm aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, worin das Glycerin einen reaktiven Aldehydgehalt von weniger als 24 ppm aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 24, worin das Glycerin einen reaktiven Aldehydgehalt von weniger als 15 ppm aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 25, worin das Glycerin einen reaktiven Aldehydgehalt von weniger als 8 ppm aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 26, worin das Glycerin einen reaktiven Aldehydgehalt von 3 ppm oder weniger aufweist.
Verwendung eines nicht von Tieren stammenden Glycerins als Glycerinkomponente in der wässrigen, parenteralen, pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Verbesserung der chemischen Stabilität der Zusammensetzung.
Verfahren zur Herstellung der wässrigen, parenteralen, pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 27, das die Vereinigung von Wasser, dem Polypeptid und dem nicht von Tieren stammenden Glycerin umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer wässrigen, parenteralen, pharmazeutischen Zusammensetzung, das die Vereinigung von Wasser, einem Polypeptid und Glycerin umfasst, worin der reaktive Aldehydgehalt des Glycerins vor dessen Verwendung zur Herstellung der Zusammensetzung durch das Zusammenbringen von Glycerin mit einem festen Trocknungsmittel und einem Polymerharz verringert wird, das freie Aminogruppen aufweist.