DE69814133T2

DE69814133T2 - Zusammensetzung um die löslichkeit von igf-i zu erhöhen

Info

Publication number: DE69814133T2
Application number: DE69814133T
Authority: DE
Inventors: A. Bret SHIRLEY; Kamaljit Bajwa
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1997-11-07
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2018-11-07
Also published as: EP1028748B1; DE69814133D1; WO1999024063A9; ATE238807T1; WO1999024063A1; JP2001522814A; EP1028748A1; AU1519399A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf pharmazeutische Zusammensetzungen. Genauer bezieht sich die Erfindung auf IGF-I-Zusammensetzungen, die hohe Konzentrationen an löslichem IGF-I bei wünschenswerten pHs bieten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Insulin-artiger Wachstumsfaktor-I (IGF-I) gehört zu einer Familie von Polypeptiden, die als Somatomedine bekannt ist. IGF-I ist Insulin strukturell und funktionell ähnlich, unterscheidet sich aber antigenisch davon. In dieser Hinsicht ist IGF-I ein einzelkettiges Polypeptid mit drei Disulfidbrücken innerhalb der Kette und mit vier Domänen, die als die A-, B-, C bzw. D-Domänen bekannt sind. Die A- und B-Domänen sind über die C-Domäne verbunden und sind den entsprechenden Domänen von Proinsulin homolog. Die D-Domäne, eine carboxyterminale Verlängerung, ist in IGF-I vorhanden, aber fehlt in Proinsulin. IGF-I hat 70 Aminosäurereste und eine molekulare Masse von ungefähr 7,5 kDa (siehe Rinderknecht, J. Biol. Chem. (1978) 253: 2769; und Rinderknecht, FEBS Lett. (1978) 89: 283). Für einen Überblick bezüglich IGF siehe Humbel, Eur. J. Biochem. (1990) 190. 445–462.
IGF-I stimuliert Wachstum und Teilung einer Vielzahl von Zelltypen, insbesondere während der Entwicklung. Siehe z. B. EP 560 723 A und 436 469B . Daher werden Prozesse, wie Skelettwachstum und Zellreplikation durch IGF-I-Spiegel beeinflusst.
Aufgrund der unterschiedlichsten klinischen Anwendungen für IGF-I besteht eine große Nachfrage nach Zusammensetzungen mit erwünschten Eigenschaften und es wurden einige IGF-I-Formulierungen hergestellt. Siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5 126 324. Insbesondere sind Zusammensetzungen mit hohen Konzentrationen von IGF-I für bestimmte Indikationen bevorzugt. Zusätzlich ist es bevorzugt, IGF-I-Zusammensetzungen mit physiologischen pHs zu verabreichen. Es ist außerdem bevorzugt, dass das IGF-I in solchen Zusammensetzungen löslich bleibt und dass die Zusammensetzungen zur Lagerung über längere Zeiträume bei gekühlten Temperaturen geeignet sind.
Physikalische Parameter, wie Temperatur und pH beeinflussen die Löslichkeit von IGF-I. IGF-I ist z. B. unter ungefähr pH 5,0 mit Konzentrationen von ungefähr 80 bis 100 mg/ml löslich, während die Löslichkeit oberhalb von pH 5,5 ungefähr 10fach abfällt. Zusätzlich dazu ist IGF-I bei niedrigeren Temperaturen weniger löslich. Um daher IGF-I-Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die zur gekühlten Lagerung geeignet sind, z. B. um die Stabilität aufrechtzuerhalten, während dabei akzeptable IGF-I-Löslichkeitswerte aufrechterhalten werden, werden Zusammensetzungen im Allgemeinen bei einem pH unter 5,0 gehalten. Bedauerlicherweise verursacht die Verabreichung von IGF-I-Zusammensetzungen bei solchen nicht-physiologischen pHs Schmerzen und Irritationen der Injektionsstelle.
Um dieses Problem zu bewältigen, haben Experimentatoren versucht, IGF-I in verschiedenen Puffern zu formulieren. Fransson und Espander-Jansson, J. Pharm. Pharmacol. (1996) 48: 1012–1015 beschreiben z. B. IGF-I-Zusammensetzungen, die 5 mg/ml IGF-I in isotonischer Kochsalzlösung umfassen, mit Phosphatpufferkonzentrationen im Bereich von 5 bis 50 mM bei pH 6,0 bis 7,0. Die Autoren fanden heraus, dass pH 7,0-IGF-I-Präparate weniger Schmerz als pH 6,0-Präparate verursachen und dass niedrigere Pufferstärken den Schmerz bei nicht-physiologischen pHs reduzierten. Jedoch zogen die Autoren den Schluss, dass IGF-I pH 7,0-Präparate aufgrund der Instabilität von IGF-I bei diesem pH nicht geeignet seien. Die Internationale Veröffentlichung WO 94/15584 beschreibt isotonische IGF-I-Lösungen bei pH 5,5 bis 6,5 mit Phosphatpuffer, der in einer Menge von weniger als 50 mmol/l anwesend ist, von denen berichtet wird, dass sie zu einem verminderten Schmerz nach der Injektion führen.
Nebenbei werden Proteinformulierungen, wie jene, die IGF-I umfassen, oft in gefriergetrockneter Form dargeboten um Stabilitätsprobleme zu vermeiden und die Haltbarkeit zu verlängern. Siehe z. B. U.S. Patent 5 210 074, welches getrocknete IGF-I-Zusammensetzungen beschreibt, die eine starke Säure, wie Salzsäure, umfassen, um die Haltbarkeit der Formulierung zu erhöhen. Jedoch erfordern gefriergetrocknete Formulierungen das Auflösen in Wasser vor der Injektion, was lästig ist und zu Verdünnungsirrtümern führen kann. Zusätzlich ist Gefriertrocknen kostenintensiv und zeitaufwändig. Daher wäre es vorteilhaft, IGF-I-Zusammensetzungen mit erhöhter IGF-I-Löslichkeit bei pHs größer als pH 5,0 und bei gekühlten Temperaturen herzustellen. Formulierte IGF-I-Zusammensetzungen sind auch in der U.S. 5 681 814, gegebenenfalls in Kombination mit Wachstumshormon, offenbart, die nützlich zur Behandlung von Hyperglykämie-Erkrankungen sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend sorgt die vorliegende Erfindung für IGF-I-Zusammensetzungen, bei denen IGF-I bei pHs von 5,5 oder höher und bei Kühltemperaturen in hohem Maße löslich ist. In den hierin beschriebenen erfinderischen Zusammensetzungen liegt IGF-I mit höheren Konzentrationen bei höheren pHs vor als dies zuvor möglich war. Daher können kleinere Volumina von IGF-I bei pHs über 5,5 einem Patienten mit vermindertem Schmerz verabreicht werden.
Dementsprechend bezieht sich die Erfindung in einer Ausführungsform auf eine Zusammensetzung, umfassend:

(a) einen Insulin-artigen Wachstumsfaktor-I (IGF-I) oder ein IGF-I-Analogon, wobei der IGF-I oder das IGF-I-Analogon in der Zusammensetzung in einer Konzentration von mindestens 12 mg/ml löslich ist, wenn die Zusammensetzung eine Temperatur von etwa 4°C hat; und
(b) eine solubilisierende Verbindung, die eine Guanidiniumgruppe umfasst, wobei die solubilisierende Verbindung in einer Menge vorliegt, die ausreicht um den IGF-I oder das IGF-I-Analogon löslich zu machen; und wobei die Zusammensetzung einen pH von mindestens 5,5 hat.

In einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf eine Zusammensetzung gerichtet, umfassend:

(a) einen Insulin-artigen Wachstumsfaktor-I (IGF-I) oder ein IGF-I-Analogon, wobei der IGF-I oder das IGF-I-Analgon in der Zusammensetzung in einer Konzentration von mindestens 12 mg/ml löslich ist, wenn die Zusammensetzung eine Temperatur von etwa 4°C hat;
(b) eine solublisierende Verbindung, ausgewählt aus Arginin, einem Arginin-Analogon und Guanidinhydrochlorid, wobei die solublisierende Verbindung in einer Menge vorliegt, die ausreicht um IGF-I oder das IGF-I-Analogon löslich zu machen; und
(c) einen Puffer, so dass die Zusammensetzung einen pH im Bereich von 5,5 bis 9,0 hat.

In einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer IGF-I-Zusammensetzung gerichtet, umfassend:

(a) Bereitstellen einer Menge eines Insulin-artigen Wachstumsfaktors-I (IGF-I) oder eines IGF-I-Analogons, so dass der IGF-I oder das IGF-I-Analogon in der Zusammensetzung in einer Konzentration von mindestens 12 mg/ml löslich ist, wenn die Zusammensetzung eine Temperatur von ungefähr 4°C hat;
(b) Kombinieren des IGF-I oder IGF-I-Analogons mit einer solubilisierenden Verbindung, die eine Guanidiniumgruppe umfasst, wobei der pH der Zusammensetzung 5,5 bis 9,0 ist, wobei die solubilisierende Verbindung in einer Menge vorliegt, die ausreicht um den IGF-I oder das IGF-I-Analogon löslich zu machen.

In noch einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf die Verwendung von IGF-I bei der Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren der Chirurgie, Therapie oder Diagnose bei einem Vertebraten-Subjekt, das die Verabreichung der Verbindung an das Subjekt umfasst, gerichtet.
In einer anderen Ausführungsform ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Verstärkung der Löslichkeit eines IGF-I oder eines IGF-I-Analogons in einer Zusammensetzung mit einem pH von 5,5 bis 9,0 gerichtet, wobei das Verfahren Kombinieren des IGF-I oder eines IGF-I-Analogons mit einer ausreichenden Menge einer solubilisierenden Verbindung, die eine Guanidiniumgruppe umfasst, um die Löslichkeit von IGF-I oder des IGF-I-Analogons, verglichen mit der Löslichkeit von IGF-I oder des IGF-I-Analogons in Abwesenheit der solubilisierenden Verbindung zu erhöhen, umfasst.
Diese und weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden den Fachleuten im Lichte der hierin enthaltenen Offenbarung einfach erscheinen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Löslichkeit von rekombinantem humanem IGF-I („rhIGF-I") als Funktion der Arginin-Konzentration in einem 10 mM Natriumcitratpuffer, pH 6,0, bei 4°C.
2 zeigt rhIGF-I-Löslichkeit als Funktion der Arginin-Konzentration in einem 10 mM Natriumcitratpuffer, der mit Natriumchlorid isotonisch gemacht wurde, pH 6,0, bei 4°C.
3 zeigt die rhIGF-I-Löslichkeit als Funktion der Konzentration von Arginin oder einer von mehreren Verbindungen ähnlicher Struktur, von denen einige eine Guanidiniumgruppe enthalten und einige nicht.
4 zeigt die rhIGF-I-Löslichkeit in einem Citrat/Phosphat-Puffer, der mit Natriumchlorid isotonisch gemacht wurde, als Funktion des pH.
5 zeigt die Wirkung von Arginin (0 mM oder 50 mM) in Lösung auf die Löslichkeit von rhIGF-I (anfängliche Konzentration 7,4 mg/ml) nach Einfrieren und Auftauen zwischen –20°C und 4°C.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet, wenn nicht anders angegeben, konventionelle Verfahren der Proteinchemie, Biochemie, rekombinanter DNA-Techniken und der Pharmakologie, die im Bereich des Fachwissens liegen. Derartige Techniken sind in der Literatur vollständig erklärt. Siehe z. B. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, New York, 1993); Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., New York, 1975); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989); und Colowick und Kaplan, Hrsg., Methods in Enzymology (Academic Press, New York).
Die folgenden Aminosäure-Abkürzungen werden im Text verwendet:

Alanin: Ala (A)	Arginin: Arg (R)
Asparagin: Asn (N)	Asparaginsäure: Asp (D)
Cystein: Cys (C)	Glutamin: Gln (Q)
Glutaminsäure: Glu (E)	Glycin: Gly (G)
Histidin: His (H)	Isoleucin: Ile (I)
Leucin: Leu (L)	Lysin: Lys (K)
Methionin: Met (M)	Phenylalanin: Phe (F)
Prolin: Pro (P)	Serin: Ser (S)
Threonin: Thr (T)	Tryptophan: Trp (W)
Tyrosin: Tyr (Y)	Valin: Val (V)

I. Definitionen

Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet und es wird beabsichtigt, dass sie so definiert sind, wie unten angegeben.
Der Ausdruck „Insulin-artiger Wachstumsfaktor-I" oder „IGF-I", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Verbindung, die die primäre, sekundäre und/oder tertiäre Molekularstruk tur von nativem IGF-I besitzt und welche mindestens eine IGF-I-Aktivität hat, einschließlich der Aktivität, wie sie in Standard-IGF-I-Bioassays gemessen wird, und/oder der Fähigkeit, an IGF-Rezeptoren zu binden. Das IGF-I-Molekül kann posttranslationale Modifikationen, wie beispielsweise Glykosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung etc., umfassen. Darüber hinaus kann eine IGF-I-Verbindung zu Zwecken der vorliegenden Erfindung von jedem von zahlreichen Geweben und von jeder Säugerquelle abgeleitet sein, wie beispielsweise humaner, boviner, von Hunden, Pferden, Schafen, Schweinen etc. Die IGF-I-Verbindung kann direkt vom Quellenorganismus gereinigt werden oder sie kann rekombinant oder synthetisch produziert werden (ferner siehe unten).
Der Ausdruck „IGF-I-Analogon" bezieht sich auf biologisch aktive Derivate oder Fragmente von IGF-I, die IGF-I-Aktivität und/oder die Fähigkeit, an IGF-Rezeptoren zu binden, behalten. Solche Verbindungen können Aminosäure-Additionen, -Substitutionen (in der Natur im Allgemeinen konservative) und -Deletionen gegenüber dem nativen Molekül umfassen, solange die Modifikationen, die IGF-I-Aktivität, einschließlich der Aktivität, wie sie in Standard-IGF-I-Bioassays gemessen wird, und/oder die Fähigkeit des Moleküls, an IGF-Rezeptoren zu binden, nicht zerstören. Charakteristiche Assays umfassen bekannte Radiorezeptorassays unter Verwendung von plazentalen Membranen (siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5 324 639; Hall et al., J. Clin. Endocrinol. and Metab. (1974) 39: 973–976; und Marshall et al., J. Clin. Endocrinol. And Metab. (1974) 39: 283–292), einen Bioassay, der die Fähigkeit des Moleküls misst, den Einbau von Tritium-markiertem Thymidin in einer Dosis-abhängigen Art und Weise in die DNA von BALB/c 3T3-Fibroblasten zu verstärken misst (siehe z. B. Tamura et al., J. Biol. Chem. (1989) 262: 5616–5621) und ähnliche. Bevorzugt besitzt das Analogon zumindest dieselbe Aktivität wie das native Molekül.
IGF-I-Analoga haben im Allgemeinen mindestens 60%, bevorzugt 70%, bevorzugter 80%, bevorzugt 90% bis 95% oder mehr, und am meisten bevorzugt 98% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz des Referenz-IGF-I-Moleküls. Ein Analogon kann sich durch eine so geringe Anzahl wie 10, 5, 4, 3, 2 oder sogar 1 Aminosäurerest(e) unterscheiden. "Sequenzidentität" soll bedeuten, dass dieselben Aminosäurereste innerhalb der IGF-I-Variante und des Referenz-IGF-I-Molekül gefunden werden, wenn ein spezifiziertes zusammenhängendes Segment der Aminosäuresequenz der Variante mit der Aminosäuresequenz des Referenz-Moleküls vergleichend angeordnet und verglichen wird. Verfahren zur Bestimmung der Identität zwischen Sequenzen sind im Stand der Technik wohlbekannt. Siehe z. B. das ALIGN-Programm (Dayhoff, in Atlas of Protein Sequence and Structur 5: Ergänz. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C., 1978)) und Programme im Wisconsin-Sequenzanalyse-Packet, Version 8 (erhältlich von Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), z. B. das GAP-Programm. Für Zwecke der optimalen vergleichenden Anordnung der zwei Sequenzen kann das zusammenhängende Segment der Aminosäuresequenz der Variante im Vergleich zu der Aminosäuresequenz des Referenz-Moleküls zusätzlich Aminosäurereste oder deletierte Aminosäurereste aufweisen. Das zusammenhängende Segment, das für den Vergleich mit der Referenz-Aminosäuresequenz verwendet wird, wird mindestens zwanzig (20) zusammenhängende Nukleotide umfassen und kann 30, 40, 50, 100 oder mehr Nukleotide umfassen. Korrekturen für eine erhöhte Sequenzidentität, die mit der Einbeziehung von Lücken in der Aminosäuresequenz der Variante verbunden sind, können vorgenommen werden, indem Strafpunkte für Lücken („gap penalties") festgesetzt werden. Verfahren der vergleichenden Anordnung von Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt.
Bei der Beurteilung der prozentualen Aminosäuresequenz-Identität können einige Aminosäurerest-Positionen als Ergebnis von konservativen Aminosäure-Substitutionen differieren, welche die Eigenschaften der Proteinfunktion nicht beeinflussen. In diesen Fällen kann die prozentuale Sequenzidentität nach oben korrigiert werden um die Ähnlichkeit bei konservativ substituierten Aminosäuren zu berücksichtigen. Solche Anpassungen sind im Stand der Technik wohlbekannt. Siehe z. B. Meyers und Miller, Computer Applic. Biol. Sci. (1988) 4: 11–17.
Der Stand der Technik bietet wesentliche Hilfen in Bezug auf die Herstellung und Verwendung von solchen IGF-I-Analoga, wie im Folgenden weiter erläutert wird. Ein Fragment von IGF-I wird im Allgemeinen mindestens ungefähr 10 zusammenhängende Aminosäurereste des Volllängen-Moleküls, bevorzugt ungefähr 15 bis 25 zusammenhängende Aminosäurereste des Volllängen-Moleküls, und am meisten bevorzugt ungefähr 20 bis 50 oder mehr zusammenhängende Aminosäurereste des Volllängen-IGF-I umfassen. Der Ausdruck „IGF-I-Analogon" umfasst auch Peptide, die ein oder mehrere Peptid-Mimikrys („peptide mimics") („Peptoide") aufweisen, wie jene, die in der Internationalen Veröffentlichung WO 91/04282 beschrieben sind.
Es sind mehrere IGF-I-Analoga und -Fragmente im Stand der Technik bekannt und sie umfassen jene, die z. B. beschrieben sind in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 4904–4907; Biochem. Biophys. Res. Commun. (1987) 149: 398–404; J. Biol. Chem. (1988) 263: 6233–6239; Biochem. Biophys. Res. Commun. (1989) 165: 766–771; Forsberg et al., Biochem. J. (1990) 271: 357–363; in den U.S. Patenten Nrn. 4 876 242 und 5 077 276; und den Internationalen Veröffentlichungen Nrn. WO 87/01038 und WO 89/05822. Charakteristische Analoga umfassen eines mit einer Deletion des Glu-3 des reifen Moleküls, Analoga mit bis zu fünf Aminosäureverkürzungen am N-Terminus, ein Analogon mit einer Verkürzung im Hinblick auf die ersten drei N-terminalen Aminosäuren und ein Analogon, das die ersten 17 Aminosäuren der B-Kette von humanem Insulin anstelle der ersten 16 Aminosäuren von humanem IGF-I umfasst.
Der Ausdruck „solubilisierende Verbindung", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Verbindung, die eine Guanidiniumgruppe umfasst und die in der Lage ist, die Löslichkeit von IGF-I oder einem IGF-I-Analogon wie unten definiert zu erhöhen. Beispiele solcher solubilisierender Verbindungen umfassen die Aminosäure Arginin sowie Aminosäure-Analoga von Arginin, die die Fähigkeit behalten, die Löslichkeit von IGF-I bei einem pH von 5,5 oder höher zu erhöhen. Solche Analoga umfassen ohne Einschränkung Dipeptide und Tripeptide, die Arginin enthalten. Andere solubilisierende Verbindungen zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen umfassen jede der verschiedenen Guanidinverbindungen, die unten weiter beschrieben sind.
Mit „Verbessern/Erhöhen der Löslichkeit" von IGF-I ist eine Erhöhung der Menge von IGF-I, die in einer Lösung bei pH 5,5 oder höher in Anwesenheit einer Guanidinium-enthaltenden Verbindung gelöst werden kann, verglichen mit der Menge von IGF-I, die bei pH 5,5 oder höher in einer Lösung mit denselben Komponenten, aber ohne die Guanidinium-enthaltende Verbindung, gelöst werden kann. Die Fähigkeit einer Guanidinium-enthaltenden Verbindung, die Löslichkeit von IGF-I zu erhöhen, kann unter Verwendung von Methoden bestimmt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind.
Die IGF-I-Löslichkeit kann z. B. bestimmt werden, indem eine konzentrierte oder gesättigte IGF-I-Lösung, z. B. 50 bis 200 mg/ml, pH 4,0, verwendet wird und indem die IGF-I-Lösung gegen eine Pufferlösung, pH 5,5 oder höher, mit und ohne die fragliche solubilisierende Verbindung dialysiert wird. Nachdem der Pufferaustausch vollendet ist, bildet IGF-I zwei getrennte Phasen, eine Lage unlöslichen (präzipitierten) IGF-I und eine Lösungsphase, die eine gesättigte Lösung von IGF-I enthält. Eine Probe der Lösungsphase wird gefiltert um jegliches unlösliches Material zu entfernen und die Konzentration der Lösung wird durch UV-Spektroskopie bestimmt, und zwar unter Verwendung des bekannten IGF-I-Absorptionskoeffizienten, d. h. 0,62 Extinktionseinheiten bei 277 nm bei 1 mg/ml-Lösung.
Die Menge von IGF-I, die in einem vorgegebenen Lösungsmittel unter Bildung einer gesättigten Lösung gelöst werden kann, kann auch visuell bestimmt werden, indem steigende Mengen von IGF-I zum Lösungsmittel gegeben werden, bis sich das IGF-I nicht mehr vollständig löst. Dies kann mit und ohne die fragliche solubilisierende Verbindung vorgenommen werden. Die Löslichkeit von IGF-I oder eines IGF-I-Analogons hängt natürlich von der Umgebung und dem jeweiligen untersuchten IGF-I ab. Viele Parameter beeinflussen die Löslichkeit von Polypeptiden einschließlich der Temperatur, der Elektrolyt-Umgebung und der Natur des Lösungsmittels.
„Pharmazeutisch oder therapeutisch effektive Dosis oder Menge" bezieht sich auf ein nicht-toxisches Dosierungsniveau, das ausreicht um ein gewünschtes biologisches Ergebnis herbeizuführen. Dieses Ergebnis kann eine Verminderung und/oder Linderung der Anzeichen, Symptome oder Gründe einer Erkrankung sein oder jede andere erwünschte Veränderung eines biologischen Systems sein. Derartige Mengen sind unten beschrieben.
Mit „Vertebraten-Subjekt" ist jedes Mitglied des Stammes Cordata gemeint, ohne Einschränkungen einschließlich der Menschen und anderer Primaten einschließlich nicht-humaner Primaten, wie Schimpansen oder anderer Menschenaffen- und Affen-Arten; landwirtschaftlichen Nutztieren, wie Rindern, Schafen, Schweinen, Ziegen und Pferden; Haussäugetieren, wie Hunden und Katzen; Labortieren einschließlich Nagetieren, wie Mäusen, Ratten und Meerschweinchen; Vögeln einschließlich domestizierter Vögel, Wild- und Jagdvögel, wie Hühner, Truthähnen und anderen hühnerartigen Vögeln, Enten, Gänsen und ähnlichen. Der Ausdruck bezeichnet kein bestimmtes Alter. Es ist daher beabsichtigt, dass sowohl erwachsene als auch neugeborene Individuen erfasst sein sollen.
II. Ausführungsarten der Erfindung
Die vorliegende Erfindung gründet auf der Entdeckung, dass Guanidinium-enthaltende Verbindungen in der Lage sind, die Löslichkeit von IGF-I bei einem pH über 5,5 zu erhöhen und dabei für stabile IGF-I-Zusammensetzungen mit höheren Konzentrationen an IGF-I zu sorgen, als dies zuvor möglich war. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch vorteilhaft bei Kühltemperaturen über längere Zeiträume gelagert werden, z. B. über mindestens 6 Monate, und dennoch adäquate Löslichkeitsniveaus aufrecht halten. Die Möglichkeit, Zusammensetzungen zu kühlen, in denen IGF-I hoch löslich bleibt, verlängert die Aktivität des IGF-I. Zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung bei einem pH gehalten werden, der für die Verabreichung eher erwünscht ist um Schmerzen zu vermeiden.
Wie 1 zeigt, ist IGF-I bei pH 6,0 in Abwesenheit einer Guanidinium-enthaltenden Verbindung nur mit 3 bis 4 mg/ml bei 4°C löslich. Darüber hinaus ist, wie unten in Tabelle 1 gezeigt, die IGF-I-Löslichkeit bei pH 6,0 bei 4°C auch stark reduziert im Vergleich mit der Löslichkeit bei Raumtemperatur. Daher sorgt die Zugabe einer solubilisierenden Verbindung, die eine Guanidiniumgruppe besitzt, zu einer IGF-I-Zusammensetzung für verbesserte Löslichkeit, sogar bei niedrigen Temperaturen. Dementsprechend hat die vorliegende Erfindung die kombinierten Vorteile, für eine stabile Lagerung von IGF-I-Lösungen mit IGF-I-Konzentrationen, die größer als 12 mg/ml sind, und für pH-Werte, die höher als pH 5,5 sind, und zwar für längere Zeitspannen bereitzustellen.
IGF-I und dessen Analoga können zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen über eine Vielzahl von Wegen hergestellt werden, welche im Stand der Technik wohlbekannt sind. Z. B. können die IGF-I-Polypeptide direkt aus Blut, beispielsweise aus Serum oder Plasma, mittels bekannter Verfahren isoliert werden. Siehe z. B. U.S. Patent Nr. 4 769 361; Svoboda et al., Biochemistry (1980) 19: 790–797; Cornell und Boughdady, Prep. Biochem. (1982) 12: 57 und Cornell und Boughdady, Prep. Biochem. (1984) 14: 123. Alternativ dazu kann IGF-I chemisch synthetisiert werden, und zwar mittels jeder von verschiedenen Techniken, die dem Fachmann im Bereich der Peptid-Wissenschaft bekannt sind. Siehe z. B. Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, 1984) und Barany und Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Hrsg. Gross und Meienhofer, Bd. 2 (Academic Press, New York, 1980), S. 3–254, für Festphasen-Peptidsynthesetechniken; und Bodansky, Principles of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Berlin, 1984); und Gross und Meienhofer, Hrsg., The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Bd. 1 (Academic Press, New York, 1980), für klassische Lösungssynthese. Die IGF-I-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch chemisch mittels des Verfahrens der simultanen multiplen Peptidsynthese hergestellt werden. Siehe z. B. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1985) 82: 5131–5135; U.S. Patent Nr. 4 631 211.
Alternativ dazu und bevorzugt können die IGF-I-Polypeptide erhalten werden, indem rekombinante Verfahren angewandt werden. Diesbezüglich wurde die rekombinante Herstellung von IGF-I in bakteriellen und Hefe-Wirten und deren Aufreinigung beschrieben. Siehe z. B. Internationale Offenlegungsschriften WO 96/40776, WO 96/07744, WO 95/06059, WO 95/06064, WO 95/16777, WO 93/11240 und WO 92/04363; EP 567 554B ; U.S. Patent Nrn. 5 650 496, 5 612 198, 5 407 810, 5 410 026, 5 288 931, 5 324 639 und 5 231 178; Chang und Swartz, Protein Folding: In Vivo and In Vitro (American Chemical Society, 1993); S. 178–188; Elliott et al., J. Protein Chem. (1990) 9: 95–104.
Zum Beispiel kann IGF-I in transformierten methylotrophen Hefen, wie beispielsweise in einem Protease-defizienten Pichia pastoris-Stamm sowie in Saccharomyces cerevisiae hergestellt werden (siehe z. B. U.S. Patente Nrn. 5 231 178, 5 324 639, 5 612 198 und 5 650 496; Internationale Offenlegungsschriften Nrn. WO 96/40776, WO 96/07744 und WO 92/04363; und EP 567 554B ).
Der IGF-I wird entweder sezerniert, wenn geeignete Leitsequenzen verwendet werden, oder er wird intracellulär hergestellt und die Zellen werden so manipuliert, dass dies eine gute Isolierung eines IGF-I-enthaltenden Produktes erlaubt. Besonders bevorzugte Methoden zur Herstellung von IGF-I, z. B. in Hefen, verwenden im Allgemeinen eine Sekretionsleitsequenz, wie beispielsweise eine Leitsequenz, die von der Signalsequenz des Hefe-α-Faktors abgeleitet ist, wie beschrieben in der EP 128 733 . Die Herstellung in Hefe umfasst im Allgemeinen einen Wachstums- und Vermehrungsschritt für die Zellvermehrung, gefolgt von der Aufreinigung und Rückfaltung unter Erhalt eines authentischen, richtig gefalteten Proteins. Methoden für Wachstum und Vermehrung der Kultur, Aufreinigung und Rückfaltung sind im Stand der Technik wohlbekannt. Siehe z. B. U.S. Patente Nrn. 5 324 639 und 5 650 496 und Internationale Offenlegungsschriften WO 96/07744 und WO 96/40776.
Nach Erhalt wird das IGF-I mit einer oder mehreren solubilisierenden Verbindungen, die eine Guanidiniumgruppe umfassen, formuliert um die Löslichkeit von IGF-I bei pH 5,5 oder höher zu verbessern um eine Zusammensetzung bereitzustellen, die IGF-I mit einer Konzentration von 12 mg/ml oder höher umfasst, und die bei 4°C gelagert werden kann. Alternativ dazu können konzentrierte Formen von IGF-I, wie beispielsweise gefriergetrocknete Formulierungen, wieder gelöst werden oder verdünnt werden, und zwar mit einer Lösung, die eine Verbindung mit einer Guanidiniumgruppe enthält, um eine Konzentration von IGF-I über 12 mg/ml und eine Lösung mit einem pH höher als pH 5,5 bereitzustellen.
Geeignete solubilisierende Verbindungen umfassen ohne Beschränkung Arginin, Arginin-Analoga, Guanidin-enthaltende Verbindungen, wie Guanidincarbaniedin, Guanidinacetat, Guanidinamin, Guanidincarbonat, Guanidin-1-cyano, Guanidin-1,3-diphenyl, Guanidin-1,3-di-(2-tolyl), Guanidinhydrochlorid, Guanidinnitrat, 1-Nitroguanidin, Guanidinpicrat, Guanidinthi ocyanat, Guanidintetraphenyl, Guanidin-1,1,3-triphenyl, Guanidin-1,2,3-triphenyl, Guanidin-1-ureido, Agmatin, 4-Guanidinbenzoesäure, Guanidinoessigsäure, Guanidinobernsteinsäure, Guanethidin, 4'-Acetamidophenyl-4-guanidinobenzoat, 2-Iminobiotin, N-(2-Guanidinoethyl)-5-isochinolinsulfonamid, Guanidinobuttersäure, Guanidinopropionsäure und ähnliche, kommerziell erhältlich von beispielsweise Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Von diesen Verbindungen sind Arginin, Guanidinhydrochlorid, Agmatin, 4-Guanidinobenzoesäure, Guanidoessigsäure und Guanidinobernsteinsäure besonders bevorzugt.
In den meisten Fällen werden die Konzentrationen der solubilisierenden Verbindung die verfügbare Konzentration des IGF-I beeinflussen, beispielsweise derartig, dass je größer die Konzentration der solubilisierenden Verbindung ist, umso größer die maximal mögliche Konzentration von IGF-I ist. Die Temperatur der IGF-I-Zusammensetzung wird ebenfalls einen Einfluss auf die Löslichkeit des IGF-I haben, und zwar derartig, dass eine höhere Temperatur die Löslichkeit des IGF-I erhöht. Daher wird die Menge an solubilisierender Verbindung von den Eigenschaften der Guanidiniumgruppenverbindung, ihrer Löslichkeit, ihres Einflusses auf die Löslichkeit von IGF-I, der erwünschten Konzentration von IGF-I, die in der Zusammensetzung erreicht werden soll, und der Temperatur, bei der die Zusammensetzung gehalten wird, abhängen. Die optimale Konzentration für jede solubilisierende Verbindung kann differieren, sie wird aber von einem Fachmann einfach bestimmt.
Im Allgemeinen wird die Konzentration der solubilisierenden Verbindung, die in der Zusammensetzung vorliegt, im Bereich von ungefähr 10 mM bis ungefähr 1 M, bevorzugt von ungefähr 15 mM bis ungefähr 500 mM, und bevorzugter, beispielsweise im Falle der Verbindung Arginin, in einem Konzentrationsbereich von ungefähr 20 mM bis ungefähr 200 mM liegen. Bei 200 mM Arginin kann beispielsweise die Konzentration von IGF-I einen so hohen Wert wie 200 mg/ml oder mehr annehmen.
Die erfindungsgemäßen IGF-I-Zusammensetzungen können auch Puffer umfassen, die einen pH höher pH 5,5, bis zu einem pH von ungefähr 9,0, bevorzugter bis zu einem pH von ungefähr 7,5, aufrechterhalten. Der bevorzugte pH der Zusammensetzung liegt, mit oder ohne einen Puffer, in einem Bereich von ungefähr pH 5,7 bis ungefähr pH 6,3, und bevorzugt ungefähr pH 6,0. Aufgrund der Anwesenheit eines oder mehrerer der solubilisierenden Agentien, die oben diskutiert sind, liegt die erreichbare Konzentration von IGF-I höher als dies vorher bei pH 5,5 möglich war, und daher bieten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine Konzentration von IGF-I, die geeignet und optimal für die therapeutische Verwendung ist.
Der Puffer, der verwendet wird um den pH der IGF-I-Zusammensetzung zu erreichen, kann jeder annehmbare Puffer sein, der in der Lage ist, den pH nach Zugabe von Säure oder Alkali im gewünschten Bereich zu halten und der nicht biologisch oder auf sonstige Weise unerwünscht ist, d. h. der Puffer verursacht keine unerwünschten biologischen Wirkungen und wechselwirkt nicht in einer zerstörerischen Art und Weise mit einer der anderen Komponenten der Zusammensetzung. Wenn z. B. die Zusammensetzung einem Menschen verabreicht wird, sollte der Puffer nicht-toxisch für Menschen sein (zumindest nicht-toxisch bei den verwendeten Dosierungen). Geeignete Puffer umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Phosphorsäurepuffer, Carbonsäurepuffer einschließlich z. B. Glutarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Imidazol oder Histidin, und zwar in Konzentrationen, die geeignet sind um den erwünschten pH zu erreichen, z. B. im Bereich von 5 bis 50 mM.
Wenn die Zusammensetzung gefriergetrocknet oder konzentriert ist, kann das Wiederlösen bzw. die Rekonstitution der Zusammensetzung unter Verwendung eines Puffers, wie er oben beschrieben ist, erreicht werden, so dass die Zusammensetzung den erwünschten pH hat. Zusätzlich können die Pufferkomponenten auch gefriergetrocknet oder konzentriert sein und sorgen nach dem Wiederlösen für den für die Zusammensetzung erwünschten pH.
Zusätzlich zum Aufrechterhalten eines annehmbaren und erwünschten pH ist auch die Isotonizität der Zusammensetzung von Belang, wenn die IGF-I-Zusammensetzung zur Verabreichung an einen Säuger, wie beispielsweise einen Menschen, verwendet wird. Daher wird die bevorzugte Zusammensetzung für eine injizierbare Lösung von IGF-I eine Isotonizität bieten, die dieselbe ist wie die von Patientenserum oder Körperflüssigkeiten, oder ähnlich dazu. Um die Isotonizität herzustellen, kann ein Salz, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, ein Phosphatpuffer, Glucose oder Saccharose in einer geeigneten Konzentration zu der Lösung zugefügt werden. Wenn z. B. Natriumchlorid verwendet wird, wird ungefähr eine 150 mM Natriumchloridlösung eine adäquate Isotonizität liefern. Die Isotonizität kann auch zum Teil durch die Guanidinium-enthaltende Verbindung hergestellt werden um beispielsweise eine Lösung mit einer Salz-Endkonzentration von ungefähr 150 mM bereitzustellen.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist ihre Eignung für stabile Langzeitlagerung, und zwar so, dass die IGF-I-Aktivität bewahrt wird. Im Allgemeinen wird die Zusammensetzung in Lösung im Bereich von ungefähr 2°C bis ungefähr 40°C, bevorzugter bei Kühltemperaturen, z. B. von ungefähr 2°C bis ungefähr 8°C, und am meisten bevorzugt bei ungefähr 4°C gelagert, so dass die IGF-I-Lösung für eine eventuelle Verabreichung an einen Patienten stabil und sicher bleibt. Wenn der IGF-I in gefriergetrockneter Zusammensetzung hergestellt wird, kann er bei Raumtemperatur gelagert werden und für die unmittelbare Verwendung oder auch für die Lagerung bei Kühltemperaturen für zukünftige Verwendungen wieder gelöst werden. Bei Kühltemperaturen und bei einem pH von ungefähr pH 6,0 ist die erfindungsgemäße IGF-I-Zusammensetzung für mindestens 6 Monate stabil.
Die IGF-I-Konzentration, die durch die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erreichbar ist, umfasst eine IGF-I-Konzentration, die größer als ungefähr 12 mg/ml bis zu ungefähr 200 mg/ml, bevorzugt größer als ungefähr 15 mg/ml, bevorzugter größer als ungefähr 20 mg/ml, noch bevorzugter größer als ungefähr 25 mg/ml, und insbesondere größer als ungefähr 50 mg/ml bis zu ungefähr 200 mg/ml ist. Wie oben erklärt, wird die erreichbare IGF-I-Konzentration von der Konzentration der solubilisierenden Verbindung abhängen, und auch zu einem gewissen Ausmaß von dem isotonischen Charakter der Lösung, dem pH und der Tempe ratur der Lösung abhängen. Ein Fachmann kann geeignete Konzentrationen von IGF-I für vorgegebene Verwendungen bestimmen und IGF-I-Zusammensetzungen mit jeder erwünschten IGF-I-Konzentration innerhalb dieses Bereichs einfach herstellen.
Die IGF-I-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind im Allgemeinen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipiens oder Vehikel formuliert einschließlich Flüssigkeiten, wie Wasser oder Kochsalzlösung. Geeignete Exzipientien für nicht-flüssige Formulierungen sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Zusätzlich können in solchen Vehikeln Hilfssubstanzen, wie beispielsweise Benetzungs- oder Emulsionsmittel, pH-Puffersubstanzen, grenzflächenaktive Mittel und ähnliche vorhanden sein.
Die Zusammensetzungen können auch Trägerstoffe umfassen. Geeignete Trägerstoffe können große, gel- oder schaumähnliche Zusammensetzungen sein, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere, Poly(ethylenglykol) oder PEG, Hydrogele und inaktive Viruspartikel. Solche Trägerstoffe sind dem Fachmann wohlbekannt. Liposomen können ebenfalls als Trägerstoffe verwendet werden, wie z. B. die Liposomen-Zusammensetzungen, die im U.S. Patent Nr 5 422 120, den Internationalen Offenlegungsschriften Nrn. WO 95/13796, WO 94/23697 und WO 91/14445 und in der EP 524 968B1 beschrieben sind.
Pharmazeutisch annehmbare Salze können in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden und umfassen z. B. Mineralsalze, wie Hydrochloride, Hydrobromide, Phosphate, Sulfate und ähnliche; und die Salze von organischen Säuren, wie Acetate, Propionate, Malonate, Benzoate und ähnliche. Eine gründliche Diskussion von pharmazeutisch annehmbaren Exzipientien ist in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., New Jersey, 1991) verfügbar.
Typischerweise werden die Zusammensetzungen als Injektionsmittel, entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen, hergestellt. Feste Formen, die zur Lösung in oder Suspension in flüssigen Vehikeln vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Die IGF-I-Zusammensetzungen können auch in einem Implantat oder in einer Formulierung mit langsamer Ausschüttung formuliert sein. Liposomen-Trägerstoffe oder andere Gelkomponenten können beispielsweise verwendet werden um diese Arten der Verabreichung zu erleichtern.
Eine pharmazeutisch oder therapeutisch wirksame Menge von IGF-I wird dem Subjekt verabreicht. Die genaue effektive Menge wird von Subjekt zu Subjekt variieren und wird von der Art, dem Alter, der Größe des Subjektes und der Gesundheit, der Natur und dem Ausmaß des zu behandelnden Krankheitszustandes, den Empfehlungen des behandelnden Arztes und den Therapeutika oder der Kombination von Therapeutika, die zur Verabreichung ausgewählt wurden, abhängen. Daher kann die effektive Menge für eine vorgegebene Situation durch Routineexperimente bestimmt werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird eine therapeutische Menge einer IGF-I-Zusammensetzung im Allgemeinen im Bereich von ungefähr 0,1 μg/kg bis ungefähr 100 mg/kg, bevorzugter ungefähr 1 μg/kg bis ungefähr 1 mg/kg, und insbesondere ungefähr 2 μg/kg bis ungefähr 100 μg/kg, in mindestens einer Dosis liegen. Dem Subjekt können so viele Dosen verabreicht werden, wie erforderlich ist um die Anzeichen, Symptome oder Ursachen der fraglichen Krankheit zu reduzieren und/oder zu lindern oder um jede andere erwünschte Veränderung eines biologischen Systems hervorzurufen.
Die Verabreichung des formulierten IGF-I-Polypeptids wird im Allgemeinen parenteral vorgenommen. Parenterale Verabreichung kann z. B. intravenöse, intraarterielle, intraartikuläre, subkutane, intradermale, intramuskuläre, intranasale, mukosale Verabreichung und die durch Aerosol umfassen. Z. B. kann die Zusammensetzung durch Inhalation verabreicht werden, z. B. als Nasen- oder Mundspray oder -aerosol. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann beispielsweise durch Injektion, Katheterisierung, Laser-erzeugte Perfusionskanäle, eine Teilchenkanone und eine Pumpe vorgenommen werden.
Sind die IGF-I-Zusammensetzungen einmal formuliert, können sie für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden. In dieser Hinsicht können die IGF-I-Zusammensetzungen z. B. verwendet werden um Wachstum von Zellen in vitro oder in vivo in einer Vielzahl von Geweben und Zelltypen zu stimulieren. Die Zusammensetzungen können auch verwendet werden für Knochen-Reparatur- und -Ersatz-Therapie, um Osteoporose zu behandeln, um eine inflammatorische Antwort, ein Ischämietrauma und Organabstoßung nach Transplantation zu inhibieren, und um die Laktation und Fleischproduktion bei Rindern und Kühen und anderen landwirtschaftlichen Nutztieren zu erhöhen. Zusätzlich kann IGF-I während Aufreinigungsverfahren mit dem solubilisierenden Agens kombiniert werden um Ausbeuten zu verbessern.
Unten werden Beispiele für spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gegeben. Die Beispiele werden nur für Zwecke der Veranschaulichung gegeben und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise begrenzen.
EXPERIMENTELL
Zur Verwendung in diesen Experimenten wurde IGF-I rekombinant in dem Hefestamm Pichia pastoris hergestellt und im Wesentlichen gereinigt, wie beschrieben in den U.S. Patenten Nrn. 5 324 639, 5 324 660, 5 650 496 und der Internationalen Offenlegungsschrift WO 96/40776.
Beispiel 1: Löslichkeit verschiedener IGF-I-Präparationen
Nach der Isolierung wurde rekombinantes humanes IGF-I (rhIGF-I) mit den verschiedenen Exzipientien, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, formuliert, und die Löslichkeit bei Raumtemperatur und bei 4°C mittels Dialyse bestimmt. Im Einzelnen wurde eine konzentrierte Lösung von rhIGF-I (20 mg/ml bei pH 4,0) gegen jeden der in Tabelle 1 aufgelisteten Puffer dialysiert, wobei Schläuche mit einer Molekulargewichtsgrenze von 3000 Dalton und drei Austausche des 20fachen Volumens verwendet wurden. Nach Vollendung des Pufferaustauschs bildete das rhIGF-I zwei getrennte Phasen, eine Lage mit unlöslichem (präzipitiertem) rhIGF-I und eine Lösungsphase, die eine gesättigte Lösung von rhIGF-I enthielt. Es wurde eine Probe der Lö sungsphase rhIGF-I abgenommen und durch einen 0,22 μm-Filter filtriert um unlösliches Material zu entfernen. Die Konzentration der gefilterten rhIGF-I-Lösung wurde mittels UV-Spektroskopie unter Verwendung des bekannten rhIGF-I-Absorptionskoeffizienten, d. h. 0,62 Extinktionseinheiten bei 277 nm für eine 1 mg/ml-Lösung, bestimmt. Jene, die eine erhöhte Löslichkeit zeigten, wurden dann bei 4°C getestet.
Wie man sehen kann, ist die rhIGF-I-Löslichkeit in Anwesenheit von fast allen der getesteten Substanzen bei 4°C im Vergleich zu Raumtemperatur signifikant erniedrigt. Jedoch erhöhte Arginin die Löslichkeit von rhIGF-I signifikant sowohl bei Raumtemperatur als auch bei 4°C. Da die Experimente, die in Tabelle 1 dokumentiert sind, unter Verwendung von 20 mg/ml rhIGF-I durchgeführt wurden, stellen Werte in Tabelle 1 unter 20 mg/ml die maximale Löslichkeit für diese bestimmte Formulierung dar. Arginin bleibt bei ungefähr 20 mg/ml löslich. Daher liegt die maximale Löslichkeit von rhIGF-I bei einer Arginin-enthaltenden Formulierung ungefähr über 20 mg/ml. Dies trifft auch für Histidin-enthaltende Zusammensetzungen bei Raumtemperatur zu, aber nicht bei 4°C.
Beispiel 2: Wirkung von Arginin auf die IGF-I-Löslichkeit
Um darüber hinaus die Wirkung der Arginin-Konzentration auf die Löslichkeit von IGF-I bei 4°C, pH 6,0, zu testen wurde eine konzentrierte Lösung von rhIGF-I (50 bis 200 mg/ml, pH 4,0) gegen Puffer dialysiert, die zwischen 0 und 115 mM Arginin enthielt, und zwar unter Verwendung von Schläuchen mit einer Molekulargewichtsgrenze von 3000 Dalton und drei Austauschen des 20fachen Volumens. Nach Vervollständigung des Pufferaustauschs bildete das rhIGF-I zwei unterschiedliche Phasen, eine Schicht von unlöslichem (präzipitiertem) rhIGF-I und eine Lösungsphase, die eine gesättigte Lösung von rhIGF-I enthielt. Eine Probe der Lösungsphase rhIGF-I wurde abgenommen und durch einen 0,22 μm-Filter filtriert um unlösliches Material zu entfernen. Die Konzentration der gefilterten rhGF-I-Lösung wurde mittels UV-Spektroskopie unter Verwendung des bekannten IGF-I-Absorptionskoeffizienten, d. h. 0,62 Extinktionseinheiten bei 277 nm für eine 1 mg/ml-Lösung, bestimmt.
Wie in 1 und 2 zu sehen, wenn die Konzentration von Arginin anstieg, tat dies auch die Löslichkeit von rhIGF-I.
Beispiel 3: Wirkung einer Guanidiniumgruppe auf die IGF-I-Löslichkeit
Um zu testen, ob die Anwesenheit einer Guanidiniumgruppe am Arginin für die Erhöhung der rhIGF-I-Löslichkeit verantwortlich war, wurde die Wirkung von Arginin und verschiedenen Verbindungen ähnlicher Struktur auf ihre Fähigkeit getestet, rhIGF-I zu solubilisieren. Es wurden Arginin, N-Acetylarginin, Guanidinhydrochlorid, Lysin, Glycin, Ornithin und Citrullin bis zu einer Konzentration von 200 mM in pH 6,0-Formulierungen untersucht. Um die Konzentration von rhIGF-I zu messen, wurde eine konzentrierte Lösung von rhIGF-I (> 100 mg/ml, pH 4,0) gegen Puffer dialysiert, die zwischen 0 und 200 mM jeder Verbindung enthielten, und zwar unter Verwendung von Schläuchen mit einer Molekulargewichtsgrenze von 3500 Dalton und drei Austauschen des 20fachen Volumens. Nach Vervollständigung des Pufferaustauschs bildete das rhIGF-I zwei unterschiedliche Phasen, eine Phase unlöslichen (präzipitierten) rhIGF-I und eine Lösungsphase, die eine gesättigte Lösung von rhIGF-I enthielt. Es wurde eine Probe der Lösungsphase rhIGF-I abgenommen und durch einen 0,22 μm-Filter filtriert um unlösliches Material zu entfernen. Die Konzentration der gefilterten rhIGF-I-Lösung wurde mittels UV-Spektroskopie unter Verwendung des bekannten rhIGF-I-Absorptionskoeffizienten, d. h. 0,62 Extinktionseinheiten bei 277 nm für eine 1 mg/ml-Lösung, bestimmt.
Wie in 3 zu sehen ist, solubilisierte die Anwesenheit von Verbindungen, die eine Guanidiniumgruppe enthielten (Arginin, N-Acetylarginin und Guanidinhydrochlorid), rhIGF-I sehr stark, während Verbindungen, die in der Struktur ähnlich waren, aber keine Guanidiniumgruppe enthielten (Glycin, Lysin, Ornithin, Citrullin), dies nicht taten.
Beispiel 4: Wirkung des pHs auf die IGF-I-Löslichkeit
Um die Wirkungen des pHs auf die IGF-I-Löslichkeit in Abwesenheit einer Guanidinium-enthaltenden Verbindung zu testen, wurden IGF-I-Zusammensetzungen, die rhIGF-I mit verschiedenen Konzentrationen enthielten, in 20 mM Natriumcitrat, 20 mM Natriumphosphat, 90 mM Natriumchlorid, bei 4°C und bei unterschiedlichen pHs verwendet. Im Einzelnen wurde eine konzentrierte Lösung von rhIGF-I (50 bis 200 mg/ml, pH 4,0) gegen Puffer, die 20 mM Natriumcitrat, 20 mM Natriumphosphat, 90 mM Natriumchlorid zwischen pH 3,0 und 8,0, wie oben beschrieben, enthielten, dialysiert. Nach vollständigem Pufferaustausch bildete das rhIGF-I zwei unterschiedliche Phasen, eine Lage von unlöslichem (präzipitiertem) rhIGF-I und eine Lösungsphase, die eine gesättigte Lösung von rhIGF-I enthielt. Es wurde eine Probe der Lösungsphase rhIGF-I genommen und durch einen 0,22 μm-Filter filtriert um unlösliches Material zu entfernen. Die Konzentration der gefilterten rhIGF-I-Lösung wurde mittels UV-Spektroskopie unter Verwendung des bekannten IGF-I-Absorptionskoeffizienten, d.h. 0,62 Extinktionseinheiten bei 277 nm für eine 1 mg/ml-Lösung, bestimmt.
Wie in 4 gezeigt, hatte der pH einen großen Einfluss auf die rhIGF-I-Löslichkeit. Es wurde eine ungefähr 10fache Verminderung der Löslichkeit beobachtet, wenn der pH von pH 5,0 auf pH 5,5 erhöht wurde. Bei pH 5,5 war rhIGF-I nur bis zu 9 bis 10 mg/ml in einer isotonischen Zusammensetzung bei 4°C löslich. Wie jedoch in Beispielen 1 bis 3 und 1 bis 3 zeigt, blieben in Anwesenheit einer Guanidinium-enthaltenden Verbindung, wie beispielsweise Arginin oder Guanidiniumhydrochlorid, Konzentrationen von rhIGF-I weit oberhalb dieses Wertes löslich.
Beispiel 5: IGF-I-Formulierung mit Arginin für die Injektion
Gereinigtes rhIGF-I wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und wurde mit Arginin unter Verwendung der Dialyse oder Diafiltration wie folgt formuliert.
Zur Dialyse wurde eine Menge rhIGF-I in Dialysenschläuche mit einer Molekulargewichtsgewicht von 1000 bis 3000 Dalton eingebracht und gegen drei 20fache Volumenaustausche Formulierungspuffer, der Arginin mit einer Konzentration von 50 mM, 10 mM Natriumcitrat und 90 mM Natriumchlorid, pH 6,0, enthielt, dialysiert. Jeder 20fache Volumenaustausch wurde für nicht weniger als 3 Stunden und bevorzugt mehr als 12 Stunden dialysiert. Die Dialyse wurde bei 4°C oder bei Raumtemperatur durchgeführt.
Bei der Diafiltration wurde eine Menge rhIGF-I gegen 10 Volumen Formulierungspuffer, der Arginin enthielt, unter Verwendung einer Membran mit einer Molekulargewichtsgrenze von 1000 bis 3000 Dalton diafiltriert und gegen drei 20fache Volumenaustausche Formulierungspuffer, der Arginin mit einer Konzentration von 50 mM, 10 mM Natriumcitrat, 90 mM Natriumchlorid enthielt, diafiltriert. Die Diafiltration wurde bei 4°C oder bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die daraus hervorgehenden Zusammensetzungen enthielten rhIGF-I mit einer Konzentration von ungefähr 12 mg/ml.
Beispiel 6: Stabilität von rhIGF-I, formuliert mit Arginin
Die rhIGF-I-Zusammensetzung aus Beispiel 5 wurde für 6 Monate gekühlt auf 2°C bis 8°C in einer Typ-I-Phiole gelagert. Die Stabilitätsanalyse von rhIGF-I wurde mittels reverse Phase-HPLC und SDS-PAGE durchgeführt. Zusätzlich wurde die Bioaktivität von rhIGF-I mit tels eines Zell-Proliferations-Assays untersucht. Diese Assays zeigten an, dass das rhIGF-I nach 6 Monaten bei 2°C bis 8°C vollständig aktiv war und kein detektierbarer Abbau von rhIGF-I im Vergleich zu einem Kontrollaliquot von rhIGF-I vorlag.
Beispiel 7: Wirkung von Arginin auf die Löslichkeit von IGF-I beim Gefrieren und Auftauen
Wenn eine wässrige Lösung eingefroren wird, kristallisiert Wasser zu Eis und alle gelösten Stoffe zwischen den Eiskristallen werden aufkonzentriert. Daher könnnte während des Gefrierens IGF-I bis jenseits seiner Löslichkeit konzentriert werden, was zur Präzipitation von IGF-I führen würde. Nach dem Auftauen könnte das präzipitierte IGF-I nicht vollständig wieder in Lösung gehen, was zu einer Lösung mit verminderter IGF-I-Konzentration führen würde. Es ist wünschenswert, eine pharmazeutische IGF-I-Zusammensetzung zu haben, die mehrfach ohne Konzentrationsverlust eingefroren und aufgetaut werden kann.
Es wurde die Wirkung von Arginin auf die Löslichkeit von IGF-I beim Frieren und Auftauen zwischen –20°C und 4°C bestimmt. Es wurden isotonische Formulierungen bei pH 6,0 getestet, die 7,4 mg/ml rhIGF-I, 10 mM Natriumcitrat und entweder 0 mM Arginin oder 50 mM Arginin enthielten. Wie in 5 zu sehen ist, stabilisierte die Zugabe von Arginin zu der Lösung die rhIGF-I-Löslichkeit und verhinderte einen Verlust in Bezug auf die rhIGF-I-Konzentration infolge von Gefrieren und Tauen zwischen –20°C und 4°C.
Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in der Beschreibung erwähnt sind, sind Indikativ für den Stand des Fachwissens des Fachmanns in dem Bereich, zu dem diese Erfindung gehört.
Obwohl die vorstehende Erfindung zu Zwecken der Klarheit des Verständnisses recht detailliert mittels Veranschaulichung und Beispiel beschrieben wurde, wird es offensichtlich sein, dass bestimmte Veränderungen und Modififkationen innerhalb des Umfangs der anhängenden Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

Zusammensetzung, umfassend: (a) einen Insulin-artigen Wachstumsfaktor-I (IGF-I) oder ein IGF-I-Analogon, wobei der IGF-I oder das IGF-I-Analogon in der Zusammensetzung in einer Konzentration von mindestens 12 mg/ml löslich ist, wenn die Zusammensetzung eine Temperatur von etwa 4°C hat; und (b) eine solubilisierende Verbindung, die eine Guanidiniumgruppe umfasst, wobei die solubilisierende Verbindung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um den IGF-I oder das IGF-I-Analogon löslich zu machen und wobei die Zusammensetzung einen pH von mindestens 5,5 hat.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die solubilisierende Verbindung Arginin oder ein Arginin-Analogon ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Arginin-Analogon N-Acetylarginin, ein Dipeptid, das Arginin enthält, oder ein Tripeptid, das Arginin enthält, ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die solubilisierende Verbindung Guanidinhydrochlorid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei die solubilisierende Verbindung in einem Bereich der molaren Konzentration von 10 mM bis 1 M vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die solubilisierende Verbindung in einem Bereich der molaren Konzentration von 15 mM bis 500 mM vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die solubilisierende Verbindung in einem Bereich der molaren Konzentration von 20 mM bis 200 mM vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die einen pH von 5,5 bis 9,0 hat.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, die einen pH von 5,7 bis 6,3 hat.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, die einen pH von etwa 6,0 hat.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der IGF-I oder das IGF-I-Analogon in einer Konzentration von 12 bis 200 mg/ml vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei der IGF-I oder das IGF-I-Analogon in einer Konzentration von 15 mg/ml bis 200 mg/ml vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei der IGF-I oder das IGF-I-Analogon in einer Konzentration von 25 mg/ml bis 200 mg/ml vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, die Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 150 mM umfasst.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die einen Puffer, ausgewählt aus Glutarsäurepuffer, Maleinsäurepuffer, Bernsteinsäurepuffer, Citronensäurepuffer, Imidazol- und Histidin-Puffer, umfasst.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das IGF-I-Analogon eine Aminosäuresequenz hat, die min destens 70% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz für humanen IGF-I teilt.
Zusammensetzung, umfassend: (a) einen Insulin-artigen Wachstumsfaktor-I (IGF-I) oder ein IGF-I-Analogon, wobei der IGF-I oder IGF-I-Analogon in der Zusammensetzung in einer Konzentration von mindestens 12 mg/ml löslich ist, wenn die Zusammensetzung eine Temperatur von etwa 4°C hat; und (b) eine solubilisierende Verbindung, die aus Arginin, einem Arginin-Analogon und Guanidinhydrochlorid ausgewählt ist, wobei die solubilisierende Verbindung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um den IGF-I oder das IGF-I-Analogon löslich zu machen, und (c) einen Puffer, so dass die Zusammensetzung einen pH von 5,5 bis 9,0 hat.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, die außerdem Natriumchlorid in einer molaren Konzentration von etwa 150 mM umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer IGF-I-Zusammensetzung, umfassend: (a) Bereitstellen einer Menge eines Insulin-artigen Wachstumsfaktors-I (IGF-I) oder eines IGF-I-Analogons, so dass der IGF-I oder das IGF-I-Analogon in der Zusammensetzung in einer Konzentration von mindestens 12 mg/ml löslich ist, wenn die Zusammensetzung eine Temperatur von etwa 4°C hat; und (b) Kombinieren des IGF-I oder IGF-I-Analogons mit einer solubilisierenden Verbindung, die eine Guanidiniumgruppe umfasst, wobei der pH der Zusammensetzung 5,5 bis 9,0 ist, wobei die solubilisierende Verbindung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um den IGF-I oder das IGF-I-Analogon löslich zu machen.
Verwendung von IGF-I bei der Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Verwendung in einem Verfahren der Chirurgie, Therapie oder Diagnose bei einem Vertebraten-Subjekt, das die Verabreichung der Verbindung an das Subjekt umfasst.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Verabreichung parenteral ist.
Verfahren zur Verstärkung der Löslichkeit eines Insulinartigen Wachstumsfaktors-I (IGF-I) oder eines IGF-I-Analogons in einer Zusammensetzung mit einem pH von 5,5 bis 9,0, wobei das Verfahren Kombinieren des IGF-I oder eines IGF-I-Analogons mit einer ausreichenden Menge einer solubilisierenden Verbindung, die eine Guanidiniumgruppe umfasst, um die Löslichkeit des IGF-I oder des IGF-I-Analogons verglichen mit der Löslichkeit des IGF-I oder des IGF-I-Analogons in Abwesenheit der solubilisierenden Verbindungen zu erhöhen, umfasst.